Inhibición de la actividad ATPasa del complejo SWI/SNF: cambios cromatínicos y de la expresión génica

Inhibición de la actividad ATPasa del complejo SWI/SNF: cambios cromatínicos y de la expresión génica Laura Basurto Cayuela Tesis Doctoral Universidad de Sevilla 2023 AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS En primero lugar, agradecer al Dr. José Carlos Reyes su confianza depositada en mí, así como, su gran ayuda para llevar a cabo y hacer posible el trabajo presentado en esta tesis doctoral. Agradecer también al Dr. Mario García su ayuda, seguimiento y participación en este proyecto. Seguidamente, agradecer a todos mis compañeros del laboratorio de epigenética y expresión génica, ya que sin ellos este trabajo tampoco hubiera sido posible. Gracias a Elena Gómez y María Cevallos por ayudarme a aprender muchas de las técnicas aquí realizadas, dedicándome su tiempo y paciencia. Gracias a Elena Sánchez por compartir conmigo sus conocimientos de bioinformática. Y finalmente, agradecer a José Guerrero su participación en este proyecto de tesis, ya que, sin él y sus conocimientos en bioinformática, no hubiera sido posible. Seguidamente, agradecer también a todos y cada uno de los compañeros de otros laboratorios que me han acompañado durante el desarrollo de esta tesis, así como a todos los técnicos de las distintas Unidades de Apoyo de CABIMER, especialmente a la Unidad de Genómica. Darles las gracias también a los compañeros del Dto. de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia, con los que aprendí y disfruté de la enseñanza, y especialmente a mi tutor el Dr. Miguel Á. Caviedes. Finalmente, este trabajo ha sido posible gracias a que me concedieron la ayuda FPU, así como a la financiación por parte del Ministerio de Economía y Competitividad de España MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ (subvención número PID2020-118516GB- I00), la Junta de Andalucía (subvención P18-FR-1962 y BIO-321), “Fundación Vencer El Cáncer” (VEC) y el programa FEDER de la Unión Europea “Una forma de construir Europa”. Además, CABIMER es un Centro financiado parcialmente por la Junta de Andalucía. RESUMEN RESUMEN Los complejos SWI/SNF fueron la primera maquinaria de remodelación de cromatina dependiente de ATP descubierta y están compuestos por 11-15 proteínas diferentes en mamíferos. Su actividad enzimática la llevan a cabo dos ATPasas mutuamente excluyentes, denominadas BRM (SMARCA2) y BRG1 (SMARCA4). Recientemente se ha desarrollado una nueva molécula que inhibe la actividad de BRG1 y BRM, denominada BRM014, y que, por lo tanto, inhibe a todos los complejos SWI/SNF. Sorprendentemente, este inhibidor solo afecta la expresión de aproximadamente el 10% de los genes expresados en la línea no cancerosa de epitelio mamario de ratón NMuMG. Hemos investigado las características estructurales y transcripcionales, así como el entorno cromatínico de los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. Se ha mostrado que la accesibilidad del 90% de los promotores de genes activos de la línea NMuMG no se ve afectada tras el tratamiento con BRM014, mientras que aproximadamente el 56% de elementos regulatorios distales en cis si cambian. Describimos que en ausencia de la actividad SWI/SNF ocurre una fuerte ocupación nucleosomal de elementos regulatorios con claras características de enhancers. En un pequeño grupo de promotores la inhibición de SWI/SNF provoca un uso alternativo de inicios de la transcripción y un aumento de la transcripción antisentido a partir de promotores. Por otro lado, nuestros datos no muestran un defecto general en la eficiencia de splicing en ausencia de de la actividad SWI/SNF. Finalmente, observamos que, BRM014 afecta el nivel basal de expresión de genes relacionados con la transición de epitelio a mesénquima (EMT) y las vías de transducción de señales RAS. Además, BRM014 afecta fuertemente la inducción dependiente de TGFβ de la EMT, proceso implicado en la formación de metástasis. SWI/SNF complexes were the first discovered ATP-dependent chromatin remodeling machinery and are composed of 11-15 different proteins in mammals. Their enzymatic activity is carried out by two mutually exclusive ATPases, called BRM (SMARCA2) and BRG1 (SMARCA4). A new molecule has recently been developed that inhibits the activity of BRG1 and BRM, called BRM014, and therefore inhibits all SWI/SNF complexes. Surprisingly, this inhibitor only affects the expression of approximately 10% of the genes expressed in the NMuMG mouse mammary epithelial non-cancerous line. We have investigated the structural and transcriptional features, as well as the chromatin environment of SWI/SNF-dependent and independent genes. It has been shown that the accessibility of 90% of the active gene promoters of the NMuMG line are not affected after treatment with BRM014, while approximately 56% of other distal cis-regulatory elements are changed. We describe that in the absence of SWI/SNF activity, a strong nucleosomal occupancy of regulatory elements with clear characteristics of enhancers occurs. In a small set of promoters, SWI/SNF inhibition causes alternative use of transcription starts and increased antisense transcription from promoters. On the other hand, our data do not show a general defect in splicing efficiency in the absence of SWI/SNF activity. Finally, we observed that BRM014 affects the basal level of expression of genes related to epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and RAS signal transduction pathways. In addition, BRM014 strongly affects the TGFβ-dependent induction of EMT, a process implicated in metastasis formation. ABREVIATURAS ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucléico ARN Ácido ribonucleico ARNe ARN del enhancer ARNlnc ARN largo no codificante ARNm ARN mensajero ARNt ARN transferente ATAC Ensayo para cromatina accesible por transposasa (del inglés, Assay for Transposase-Accessible Chromatin) BSA Seroalbúmina bobina (del inglés, Bovine Serum Albumin) ChrRNA ARN de la fracción cromatínica (del inglés, Chromatin-RNA) CPM Cuentas por millón (del inglés, Counts Per Million) dCREs Elementos regulatorios distales en cis (del inglés, distal cisregulatory elements) DEU Uso diferencial de exones (del inglés, Differential Exon Usage DPE Del inglés, Downstream Promoter Element EMT Transición de epitelio a mesénquima (del inglés, Epithelial to Mesenchymal Transition) FBS Suero fetal bovino (del inglés, Fetal Bovine Serum) FC Veces de cambio (del inglés, Fold-Change) GTFs Factores de transcripción generales (del inglés, General Transcription Factors) IDR Tasa de descubrimiento irreproducible (del inglés, Irreproducible Discovery Rate) IF Inmunofluorescencia kb kilobase mESC Células troncales embrionarias de ratón (del inglés, mouse Embryonic Stem Cells) NFR Región libre de nucleosomas (del inglés, Nucleosome Free Region) NMuMG Línea celular no cancerosa de epitelio mamario de ratón (del inglés, Normal Murin Mammary Gland) pb par de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés, Polymerase Chain Reaction) PIC Complejo de preiniciación (del inglés, Preinitiation Complex) Pol II ARN polimerasa II PROMPT Del inglés, Promoter Upstream Transcripts SMAD Del inglés, Mothers Against Decantaplegic homolog TAD Dominio de asociación topológica (del inglés, Topologically- Associating Domain) TF Factor de transcripción (del inglés, Transcription Factor) TGFβ Factor de crecimiento transformante β (del inglés, Transforming Growth Factor β) TSS Sitio de inicio de la transcripción (del inglés, Transcription Start Site) uaRNA Del inglés, Upstream Antisense RNA WB Western blot ÍNDICE DE FIGURAS Figura I1. Posicionamiento de los nucleosomas a lo largo de un gen codificante. ........ 7 Figura I2. Tipos de promotores. ................................................................................... 8 Figura I3. Modelo de la interacción enhancer-promotor. ............................................ 11 Figura I4. Estructura de las ATPasas remodeladoras de la cromatina más estudiadas. ................................................................................................................................... 19 Figura I5. Funciones de los remodeladores de la cromatina. ..................................... 21 Figura I6. Tipos de complejos SWI/SNF. .................................................................... 25 Figura I7. Esquema de la transición epitelio mesénquima (EMT). .............................. 31 Figura I8. Ruta de señalización del TGFβ. ................................................................. 34 Figura M1. Selección de células mediante citometría de flujo. ................................... 40 Figura M2. Gráfica donde se muestra un ejemplo de un fraccionamiento tipo de ChrRNA. ..................................................................................................................... 47 Figura M3. Gel de fraccionamiento resultante del protocolo de ChrRNA. ................... 48 Figura M4. Patrón de picos de la librería de CUT&Tag generada usando anti- H3K27me3. ................................................................................................................. 50 Figura M5. Patrón de digestión de la MNAsa. Digestión realiza a distintos tiempos (3, 5, 10 y 15 minutos). El tamaño en pb se muestra en el lado derecho. ........................ 51 Figura R1. Curvas de crecimiento en la línea celular NMuMG tratada con BRM014. . 65 Figura R2. Estudio del ciclo celular. ........................................................................... 66 Figura R3. Estudio de apoptosis. ............................................................................... 68 Figura R4. Análisis de componentes principales. ....................................................... 69 Figura R5. Cambios en la expresión génica tras el tratamiento con BRM014. ........... 70 Figura R6. Análisis de los genes expresados diferencialmente en la línea NMuMG mediante Ontología génica (GO). ............................................................................... 72 Figura R7. Análisis de los genes expresados diferencialmente mediante GSEA (análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes). ................................................. 74 Figura R8. Análisis de los genes expresados diferencialmente en la línea mESC mediante Ontología génica (GO). ............................................................................... 75 Figura R9. Solapamiento entre los genes de “mantenimiento” y los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. ............................................................. 76 Figura R10. Características cromatínicas de la región TSS, en ausencia de BRM014, para los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. ..................................... 79 Figura R11. Ocupación nuclesomal alrededor del TSS de genes activos e inactivos. 80 Figura R12. Ocupación nucleosomal alrededor del TSS de genes dependientes e independientes de SWI/SNF. ...................................................................................... 81 Figura R13. Enriquecimiento en cajas TATA. ............................................................. 82 Figura R14. Solapamiento de los genes regulados por SWI/SNF en la línea NMuMG y mESC. ........................................................................................................................ 83 Figura R15. Características del entorno cromatínico de los dCREs. .......................... 87 Figura R16. Características cromatínicas de los dCREs en la línea mESC. ............... 88 Figura R17. dCREs alrededor de los genes dependientes de SWI/SNF. ................... 90 Figura R18. Ocupación nucleosomal de los dCREs tras tratamiento con BRM014. ... 92 Figura R19. Eventos de splincing tras tratamiento con BRM14. ................................. 93 Figura R20. Tipos de cambios de splicing. ................................................................. 94 Figura R21. Splincing alterativo en el gen Cd44. ........................................................ 95 Figura R22. Uso de TSSs alternativos tras el tratamiento con BRM014. .................... 97 Figura R23. Ocupación nucleosamal del nucleosoma +1. .......................................... 98 Figura R24. Ejemplos de TSSs que disminuyen su expresión. ................................ 100 Figura R25. Cambios de expresión de los PROMPTs tras inhibición de SWI/SNF. ( 102 Figura R26. Caracterización de los PROMPTs afectados tras la inhibición de SWI/SNF. .................................................................................................................. 103 Figura R27. Cambios fenotípicos durante la EMT de células tratadas con BRM014. 106 Figura R28. Análisis de componentes principales. ................................................... 107 Figura R29. Cambios de expresión de genes involucrados en EMT en células tratadas con BRM014. ............................................................................................................ 109 Figura R30. Genes que cambian su expresión durante la EMT en presencia de BRM014. ................................................................................................................... 110 Figura R31. Efectos de BRM014 sobre los niveles de fosforilación de SMAD2/3 por TGFβ. ....................................................................................................................... 111 Figura D1. Esquema modelo de los cambios en la NFR tras la inhibición de SWI/SNF. ................................................................................................................................. 119 Figura D2. Esquema modelo de las características de los genes independientes y dependientes de SWI/SNF........................................................................................ 120 INTRODUCCIÓN 1 INTRODUCCIÓN 1. CROMATINA. ASPECTOS GENERALES La información genética de los organismos vivos está almacenada en largas cadenas de ADN, concretamente en humanos de unos 2 m de longitud alojados en un núcleo de aproximadamente 10 μm de diámetro, lo cual requiere un alto grado de compactación. Ello es posible gracias a la interacción del ADN con proteínas para formar un complejo que se conoce como cromatina. La unidad básica que se repite a lo largo de la cromatina se denomina nucleosoma, una estructura en la que un octámeros de histonas, formado por un tetrámero de dos histonas H3 y dos H4, y dos heterodímeros de las histonas H2A y H2B, está rodeado por aproximadamente 147 pb de ADN, lo que supone unas dos vueltas casi completas del mismo (Luger et al.,1997). Entre un nucleosoma y el adyacente, hay entre 10 y 60 pb de ADN, conocido como ADN espaciador (en inglés, linker DNA) (Kornberg & Thomas, 1974). El conjunto de los nucleosomas unidos entre si mediante el ADN espaciador da lugar a una fibra de 11 nm de diámetro, con forma de collar de perlas, que constituye el nivel de menor organización de la cromatina (Luger et al., 1997). Además de las histonas ya mencionadas, otra histona, la H1, se localiza en la entrada y salida del ADN a los nucleosomas, favoreciendo un mayor grado de compactación de la fibra nucleosomal, originando, in vitro, una estructura más rígida de 30 nm de diámetro (Hübner et al., 2013; Thoma et al, 1979). La existencia de la fibra de 30 nm se ha puesto en duda dado que no se ha conseguido observar en el núcleo en interfase (Maeshima et al., 2014; Ricci et al., 2015). Aunque la estructura de los nucleosomas parece rígida, estas subunidades repetidas de la cromatina son muy dinámicas, de manera que no solo ayudan a empaquetar y almacenar todo el ADN nuclear de eucariotas, sino que también permite a las células regular las principales funciones genómicas del núcleo como son la transcripción, replicación, reparación y recombinación (Luger et al, 2012). Las histonas son proteínas nucleares pequeñas y muy básicas altamente conservadas en eucariotas, las cuales poseen un dominio globular, a través del cual interaccionan con otras histonas, y extremos amino- y carboxilo terminales flexible y cargados que sobresalen hacia la periferia del nucleosoma, los cuales denominaremos a partir de ahora como las “colas” de las histonas (del inglés, histone tails) (Luger et al., 1997). A través de estos dominios, dichas proteínas son susceptibles a modificaciones 2 postraduccionales (en inglés, post-translational modifications, PTMs). Las PTMs de histonas son modificaciones covalentes que consisten en la adición de pequeños grupos químicos, como metilos y acetilos. Por otro lado, las variantes de histonas son proteínas muy homólogas a las histonas, que reemplazan a las histonas canónicas en regiones específicas del genoma, dando lugar a modificaciones estructurales y funcionales de la cromatina. Las variantes más comunes son la H3.3, que sustituye a las H3 en genes activos, y la Proteína A centromérica (CENP-A) localizada en los centrómeros (Palmer et al, 1987). De esta forma el grado de compactación de los nucleosomas, las modificaciones postraduccionales de las histonas y las variantes de histonas definen tres tipos de cromatinas: eucromatina, heterocromatina y cromatina centromérica. La eucromatina es la conformación menos compactada de la cromatina, con mayor espacio entre los nucleosomas, mayor accesibilidad y con variantes y modificaciones de histonas que facilitan la transcripción activa (Venkatesh & Workman, 2015). Las regiones más abiertas y desplegadas de la eucromatina facilitan la unión a la misma de la maquinaria transcripcional, facilitando así la transcripción. Además, se caracteriza por tener la fracción más alta de nucleosomas con un posicionamiento nucleosomal más estable y exacto con relación al ADN subyacente (Radman-Livaja & Rando, 2010). Este posicionamiento facilita que las proteínas implicadas en la transcripción, como los factores de transcripción (en inglés, transcription factor, TF), reconozcan fácilmente los motivos de unión al ADN, jugando así un papel importante en su regulación (Struhl & Segal, 2013). La mayor parte de la cromatina se encuentra en forma de heterocromatina, una conformación menos activa asociada al silenciamiento de los genes, siendo mucho menos accesible que la eucromatina. Fue definida por primera vez por Emil Heitz tras visualizar en muestras citológicas de cromosomas regiones que permanecían fuertemente teñidas a los largo del ciclo celular en comparación con otras que se volvías invisibles durante la interfase (Heitz, 1928). La heterocromatina está separada espacialmente de la eucromatina en el núcleo, localizándose mayoritariamente en zonas periféricas y en regiones que rodean a los nucléolos. Se clasifica en facultativa y constitutiva. La heterocromatina facultativa se localiza en regiones que contienen genes, pudiendo pasar de estados transcripcionalmente activo a inactivos durante la diferenciación celular y desarrollo (Wutz, 2011). Por el contrario, la heterocromatina constitutiva posee una estructura más estática con una mayor compactación de la misma, siendo transcripcionalmente menos activa. Se caracteriza por presentar marcas de histonas de represión, como la trimetilación de la histona H3 en la lisina 9 (H3K9me3), y se encuentra en regiones altamente repetitivas y pobre en genes, como regiones 3 pericéntricas, subteloméricas o elementos transponibles (Jing et al., 2020; Warecki & Sullivan, 2022). Por otro lado, a diferencia de la eucromatina donde existe un posicionamiento característico de los nucleosomas que permie la fácil interacción ADN- proteína en los promotores, la heterocromatina se define en gran medida por no poseer un claro posicionamiento nucleosomal (Struhl & Segal, 2013). Por último, la cromatina centromérica se localiza en los centrómeros de los cromosomas. Durante la meiosis y mitosis celular el huso mitótico se une a los centrómeros para la separación de las cromátidas hermanas o los cromosomas homólogos durante la segregación cromosómica. Esta cromatina se caracteriza por ser altamente especializada y poseer nucleosomas donde la histona canónica H3 ha sido reemplazada por su variante CENP-A, la cual entre otras funciones, permite la unión del cinetocoro, una estructura multiproteica sobre la que se ancla los microtúbulos del huso mitótico (Yatskevich et al., 2022). Aunque inicialmente se pensaba que los nucleosomas se repartían por todo el ADN dando lugar a un recubrimiento universal, inespecífico y aleatorio, hoy en día sabemos que éstos presentan localizaciones preferentes. Los análisis de alta resolución aplicados hasta el momento muestran un patrón común, donde regiones promotoras, terminadoras y potenciadoras están mayoritariamente, aunque no siempre, desprovistas de nucleosomas; y ocupan normalmente regiones intergénicas y el interior de los genes (Struhl & Segal, 2013). La tendencia da mapear la ubicación de los nucleosomas a lo largo del genoma se remonta a más de dos décadas, comenzando con S. cerevisiae. El análisis genómico del posicionamiento de los nucleosomas requiere la digestión de la cromatina con la enzima nucleasa microccocal (MNasa), la cual corta en la zona del ADN conector (Kornberg & Lorch, 1999); el aislamiento de la fracción mononucleosómica generada de interés mediante fraccionamiento por tamaño o extracción de sal; y finalmente la determinación del ADN recuperando mediante hibridación con micromatrices o secuenciación. El estudio de muchos organismos modelos y humanos ha permitido abordar más en profundidad una serie de cuestiones básicas relacionadas con la forma de organización de los nucleosomas a lo largo del genoma como veremos en las siguientes secciones. 4 2. TRANSCRIPCIÓN La transcripción es el proceso mediante el cual se produce la síntesis del ARN utilizando como molde el ADN. Aunque la transcripción del ADN es un proceso que ocurre en todos los seres vivos, ésta es considerablemente más compleja en organismos eucariotas que en procariotas. Esto se debe, en primer lugar, a la ARN polimerasa, mientras que en seres procariotas sólo hay un tipo, en eucariotas existen múltiples tipos. Y, en segundo lugar, en eucariotas, la unión de la ARN polimerasa al promotor requiere la interacción con una gran variedad de proteínas adicionales para iniciar específicamente la transcripción (Li et al, 2007). Este aumento de la complejidad del proceso en organismos eucariotas presumiblemente facilita una regulación más sofisticada de la expresión génica necesaria para el control de la misma en los distintos tipos de células presente en los organismos pluricelulares. El proceso de transcripción en eucariotas se lleva a cabo por tres ARN polimerasas (Pol) nucleares: RNA Pol I, II y III. Pol I transcribe el precursor del ARN ribosómico (ARNr) mientras que Pol III transcribe el ARN transferente (ARNt) y otros pequeños ARNs no codificantes (ARNnc). Por otro lado, Pol II está constituida por 12 subunidades y transcribe genes que codifican proteínas a través del ARN mensajero (ARNm), así como ARNs largos no codificantes (ARNlnc). La regulación de ésta última tiene lugar durante todo el proceso de transcripción siendo determinante en el inicio, ya que éste es un punto clave para el control de la expresión génica. El inicio de la transcripción comienza con la unión de Pol II a los factores generales de transcripción (en inglés, general transcription factors, GTFs) en la región promotora de los genes, formando lo que se conoce como complejo de preiniciación (en inglés, pre-initiation complex, PIC). Dicho complejo permite la apertura del ADN y el inicio de la síntesis del ARN (Sainsbury et al, 2015). La transcripción es por tanto un proceso complejo que requiere la cooperación de numerosas proteínas y que posee diversos elementos regulatorios entre los que se encuentran principalmente los promotores y los elementos distales regulatorios en cis (o enhancers, en inglés) entre otros. A partir de ahora usaremos la palabra enhancer para referirnos a estos elementos distales reguladores en cis. 5 2.1. Promotores Los promotores son elementos regulatorios que se encuentran al comienzo de los genes y permiten el inicio de la transcripción a través de la interacción con otros elementos regulatorios, factores transcripcionales o la propia maquinaria transcripcional. De forma general, los promotores se han dividido en promotor basal (o central) y proximal, según su distancia al sitio de inicio de la transcripción (TSS). El promotor basal tiene una extensión aproximada de 50 pb, se localiza en torno al TSS y es el punto de anclaje del PIC (Kadonaga, 2012). Mientras que el promotor proximal, también conocido como enhancer proximal, posee una extensión de unas 250 pb, carece de capacidad de unión a PIC pero posee secuencias de ADN activadoras que favorecen el comienzo de la transcripción mediante la unión de factores de transcripción específicos y no se encuentra en todos los promotores (Arnold et al., 2017). 2.1.1. Características generales de los promotores Los promotores basales presentan motivos de secuencia similar en muchos de los genes que codifican proteínas y se ha conservado a lo largo de la evolución. Estos motivos favorecen el reclutamiento de los GTFs y de Pol II, así como el ensamblaje del PIC. Entre ellos se encuentran la caja TATA, el motivo INR (o Iniciator) y el motivo DPE (del inglés, Downstream Promoter Element, DPE). La caja TATA fue el primer elemento que se identificó, ubicada a unas 20-30 pb aguas arriba del TSS, y aunque se ha conservado muy bien desde levaduras hasta humanos, sólo está presente en una fracción de los promotores basales. Otro elemento sería el motivo INR que solapa directamente con el TSS, éste es mucho más abundante que la caja TATA pero no es universal ya que su secuencia consenso varía entre organismos. Y, por último, el motivo DPE localizado aguas abajo del TSS. Todos ellos no son excluyentes, pudiendo estar presentes en un mismo promotor, y de forma general sirven como sitio de unión para distintos componentes del complejo del factor de transcripción IID (del inglés, Transcription Factor IID, TFIID). Además, otra característica presente en muchos promotores es la existencia de un alto contenido de C y G, formando las llamadas islas CpG (Haberle & Stark, 2018). 6 2.1.2. Características de la cromatina de las regiones promotoras Los promotores poseen características cromatínicas particulares. El perfil promedio de ocupación de los nucleosomas muestra que las regiones promotoras están relativamente desprovistas de nucleosomas si se comparan con otras regiones circundantes. Estas regiones libres de nucleosomas (en inglés, nucleosome free region, NFR) están presentes en todos los organismos eucariotas estudiados hasta el momento. En mamíferos se ha descrito principalmente en promotores activos, y se corresponde con la localización del TSS (Mavrich et al., 2008). La ubicación de los nucleosomas a lo largo del genoma no está definida por un único factor, sino por el efecto de la combinación de varios de ellos, que incluye la secuencia del ADN, las proteínas de unión al ADN, los remodeladores de la cromatina y la maquinaría de transcripción de la ARN Pol II (Struhl & Segal, 2013). Típicamente, los nucleosomas se distribuyen alrededor de la región promotora, de manera que el TSS quedaría en la región libre de nucleosomas (NFR) flanqueada por los nucleosomas +1 y -1, en una posición altamente definida. Dicha posición definida va disminuyendo gradualmente para los nucleosomas contiguos, como se muestra en la Figura I1 (Mavrich et al., 2008). La carencia completa de nucleosomas de la NFR es un tema controvertido. Algunos estudios sugieren que la NFR no carece de forma general de nucleosomas si no que está formada por nucleosomas que poseen las variantes de histonas H2A.Z o/y H3.3. Estas variantes hacen que estas zonas sean más dinámicas, disminuyendo la afinidad del octámero de histonas por el ADN, haciéndolas mucho más accesible (Jin et al., 2009). Las chaperonas de histonas también son determinantes ya que regulan el ensamblaje y desensamblaje del núcleo de histonas del nucleosoma. No obstante, son los relomodeladores de la cromatina dependientes de ATP los principales reguladores de la ocupación nucleosomal. Éstos usan la energía de la hidrólisis del ATP para eliminar o depositar físicamente las histonas, incluso en contra de los gradientes termodinámicos (Lai & Pugh, 2017) y serán descritos en detalle en próximas secciones. 7 Figura I1. Posicionamiento de los nucleosomas a lo largo de un gen codificante. La región TSS de los genes se superpone con la 5’NFR, la cual está flanqueada por dos nucleosomas que poseen una posición altamente definida (nucleosomas -1 y +1). Dicha posición definida va disminuyendo gradualmente para los nucleosomas contiguos hasta llegar a la 3’NFR. En la parte inferior de la figura se muestra el perfil de picos correspondiente a la ocupación nucleosomal tras una digestión de la cromatina con MNasa. Otra característica de la cromatina asociada a regiones promotoras son las modificaciones postraduccionales presentes en las histonas que constituyen los nucleosomas contiguos a ellas, como son la trimetilación de la histona H3 en la lisina 4 (H3K4me3) y la acetilación de la histona H3 en la lisina 27 H3K27ac (Barski et al., 2007). Aún se desconoce si estas marcas contribuyen a la regulación del promotor o si son consecuencia de la transcripción (Millán-Zambrano et al., 2022). Por ejemplo, se ha propuesto que la H3K4me3 actúa como “memoria” transcripcional reciente, facilitando de esta forma procesos de transcripción posteriores (Ng et al., 2003). Por otro lado, la marca H3K27Ac facilitaría la accesibilidad al ADN ya que la acetilación de las histonas disminuye las interacciones de los extremos amino terminales de estas con el ADN, favoreciendo de esta forma la unión de la maquinaría transcripcional, o bien mediante la unión de cofactores específicos que reconocen estas marcas, como BRD4 (Dey et al., 2003). 14 siendo transcrito tienen también un papel fundamental en la regulación del proceso de splicing alternativo (Merkhofer et al., 2014). 4. FACTORES REMODELADORES DE LA CROMATINA Como ya hemos comentado anteriormente la cromatina no solo sirve para empaquetar el ADN gracias a su alta capacidad de compactación, sino que también se trata de un sistema dinámico el cual permite a las células controlar las principales funciones genéticas que tienen lugar en el núcleo. Y es que cuando la cromatina se encuentra condensada se vuelve inaccesible para las diferentes maquinarias enzimáticas implicadas en dichos procesos, de manera que se han desarrollado una serie de mecanismos que permiten modificar su grado de compactación en cualquier región del genoma. El remodelado de la cromatina es un concepto amplio donde se engloba a todos aquellos mecanismos que permiten regular la accesibilidad de la cromatina, los cuales no solo están implicados en las principales funciones nucleares como son la replicación, transcripción, reparación y recombinación, sino que también juegan un papel importante en otros proceso celulares como la reparación del ADN o la división celular (Ikura et al., 2000). Existen principalmente tres mecanismos para llevar a cabo el remodelado de la cromatina: (1) la sustitución de alguna de las histonas que normalmente forman el nucleosoma, también conocidas como histonas canónicas, por otra variante de las mismas las cuales presentan diferentes funciones; (2) múltiples modificaciones covalentes y reversibles de los exp las “colas” de las histonas que constituyen los nucleosomas; y (3) una gran variedad de complejos multiproteicos con la capacidad de modificar la localización de los nucleosomas empleando para ello la energía procedente de la hidrólisis de ATP. En la introducción de esta tesis doctoral nos vamos a centrar mayoritariamente en el tercer mecanismo, concretamente en uno de estos complejos conocidos como complejos SWI/SNF, pero es importante tener claro que esta clasificación es ficticia y que todos ellos están estrechamente relacionados y funcionan de forma conjunta y coordinada. 15 4.1. Variantes de histonas Existen numerosas variantes de las histonas nucleosomales normales o canónicas (H2A, H2B, H3 y H4). Estas histonas alternativas pueden ser incorporadas independientemente de la replicación del ADN y de manera transitoria o permanente con el fin de modular el grado de compactación de la cromatina para el desarrollo de procesos concretos o de alguna función específica en diferentes regiones del genoma. Entre ellas se encuentran por ejemplo algunas variantes de la histona H2A, como la histona H2A.Z, la cual está involucrada en la regulación de la transcripción (Bönisch & Hake, 2012), se acumula predominantemente aguas arriba y aguas abajo de la NFR alrededor de los TSSs de los genes activos, haciendo que los nucleosomas de esta región sean más lábiles y accesibles (Soboleva et al., 2012); la histona H2A.X que se fosforila en regiones del ADN dañado, por lo que tiene un papel importante en la reparación (van Attikum & Gasser, 2009); o la histona Macro-H2A que se localiza en regiones de la cromatina silenciadas transcripcionalmente donde suprime la transcripción al inhibir el reclutamiento de la RNA pol II, remodeladores de la cromatina y factores de transcripción (Angelov et al., 2003). En eucariotas tiene un papel importante en la inactivación del cromosoma X (Nusinow et al., 2007). También se han identificado algunas variantes para la histona H3, como la histona CENP-A (del inglés, CENtromeric Protein A) la cual reemplaza a la histona H3 en el centrómero, y es necesaria para el reclutamiento del cinetocoro durante el proceso de meiosis y mitosis (Yatskevich et al., 2022). De igual forma la H3.3 también reemplaza a la H3 en ciertas regiones, la cual, al igual que la variante de histona H2A.Z, se asocia con una mayor accesibilidad de la cromatina y también se localiza en enhancers y promotores (Shi et al., 2017). 4.2. Modificaciones postraduccionales de las histonas Las modificaciones postraduccionales (en inglés, post-translational modifications, PTMs) de las histonas son múltiples modificaciones covalentes y reversibles entre las que se encuentran principalmente la metilación, acetilación, fosforilación, sumoilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, isomerización y deiminación. En la mayoría de los casos las PTMs ocurren en las colas N-terminales, aunque también se han descrito modificaciones en la región globular de las histonas (Audia & Campbell, 2016). Estas modificaciones también se conocen como marcas epigenéticos y están involucradas en diversos proceso biológicos como la activación/represión de la transcripción, el 16 empaquetamiento cromosómico, la meiosis, mitosis y en la señalización y reparación del daño del ADN (Banerjee & Chakravarti, 2011; Kaimori et al., 2016). La hipótesis por la cual el conjunto combinatorio de modificaciones postraduccionales de las histonas constituyen un código que determina o influencia la expresión génica se conoce como el Código de las Histonas (Jenuwein & Allis, 2001; Strahl & Allis, 2000; Turner, 1993) De todas las PTMs, la metilación, acetilación y fosforilación son las más ampliamente estudiadas en el contexto de la regulación de la expresión génica, de manera que a continuación se hará una breve descripción de las mismas, indicando las marcas más estudiadas, su papel en la regulación de la transcripción, así como los factores encargados de introducir estas marcar (conocidos como writers), de eliminarlas (conocidos como erasers) y de reconocerlas, participando por lo tanto en su propagación y procesos posteriores (conocidos como readers). 4.2.1. Metilación La metilación de las histonas ha sido una de las modificaciones más estudiadas. Se produce principalmente en residuos de lisina (Lys o K) y arginina (Arg o R) y existen tres estados de metilación para la lisina: mono, di y trimetilada (me, me2 y me3, respectivamente), y dos para la arginina. Ninguno de estos estados de metilación, a diferencia de otras modificaciones, como por ejemplo la acetilación, cambia la carga eléctrica de la cadena lateral del aminoácido, pero sí tienen consecuencias sobre la expresión génica. Dichos efectos son muy variables ya que dependen del residuo que se modifica, el grado y patrón de metilación, así como el contexto genómico en el que se dé la metilación (Jambhekar et al., 2019). Las metilaciones ocurren con mayor frecuencia en residuos de Lys y se pueden clasificar en aquellas que inhiben la expresión génica y las que la activan. Entre las marcas represoras destacan H3K9me2/3 y H3K27me2/3 (Wang et al., 2008). H3K9me2 se localiza en genes silenciados o con una baja expresión génica en diferentes regiones de la eucromatina, al contrario que H3K9me3 la cual es característica de la heterocromatina (Peters et al., 2003). Por su parte, H3K27me2/3 es una marca dinámica y fácilmente reversible, que tiene un papel muy importante durante el proceso de desarrollo donde se requiere que los genes se activen o inactiven de forma muy dinámica según las señales del desarrollo. Es el complejo PRC2 (por las siglas en inglés, Polycomb Repressive Complex 2) el encargado de la di y trimetilación de H3K27 (Margueron & Reinberg, 2011). Dentro de las marcas activadoras se encuentran la 17 metilación en H3K36, H3K79 y H3K4. Las marcas H3K36me3 y H3K79me3 se localizan en el cuerpo de los genes que son transcripcionalmente activos, mientras que H3K4me es típica de enhancers (Heintzman et al., 2007), y H3K4me3 es típica de promotores, aunque ésta última también aparece en algunos enhancers que poseen actividad transcriptional (Barski et al., 2007; Henriques et al., 2018). Las metiltransferasas son las encargadas de incorporar los grupos metilos y se caracterizan por ser muy específicas. Así, las proteínas de la familia SETD1/MLL se encargan de la metilación de H3K4. G9a (también conocida como EHMT2) y GLP (también conocida como EHMT1) regulan H3K9me1/2 en la eucromatina, mientas que SUV39H1/2 produce la marca H3K9me3 en la heterocromatina. De igual modo, las metiltransferasas EZH1/2, las cuales forman parte del complejo PRC2, regulan la marca H3K27me3 (Jambhekar et al., 2019). Por el contrario, la eliminación de los grupos metilos la llevan a cabo las demetilasas, las cuales también son muy específicas. Entre ellas cabe destacar las proteínas que poseen el dominio JmJC, divididas en 6 grupos en función del sustrato diana de demetilación (Tsukada et al., 2006) y las proteínas de la familia KDM1, entre las que se encuentran KDM1A (LSD1) y KDM1B (LSD2) (Shi et al., 2004). Las proteínas que actúan como readers de estas marcas de metilación contienen dominios estructurales capaces de reconocer de forma específica lisinas o argininas metiladas o bien, esos mismos residuos sin modificar, en el contexto concreto de las histonas. Entre estos dominios se incluyen los dominios PHD, zn-CW, MBT, ADD, WD40, BAH, PWWP, tudor y chromodomain (Hyun et al., 2017). 4.2.2. Acetilación Identificada por primera vez en 1964 (Allfrey et al., 1964), la acetilación de histonas se produce principalmente en residuos de lisina localizados en las colas amino-terminales de las histonas, aunque también se encuentran en el dominio globular de las mismas. Esta modificación de histonas se ha asociado desde el principio con activación transcripcional por su capacidad de neutralizar la carga positiva de las histonas, modificando de esta manera su afinidad por el ADN (Barnes et al., 2019). Dentro de estas modificaciones cabe destacar las marcas H3K9ac y H3K27ac localizadas en los TSSs de genes transcripcionalmente activos, además, ésta última también se ha correlacionado con enhancers; y las marcas H4K16ac y H4K12ac que no solo se encuentran entorno a los TSSs, como las anteriores, sino que también se localizan a lo 18 largo del cuerpo de genes transcripcionalmente activos (Creyghton et al., 2010; Rada- Iglesias et al., 2011; Wang et al., 2008). La acetilación de las histonas está regulada por la acción antagonista de las enzimas HATs (de las siglas en inglés Histone Acetyltransferases) y HDACs (de las siglas en inglés Histone Deacetylases). De forma general, la acetilación se asocia con activación transcripcional y existen varias proteínas HATs que se han identificado como coactivadores de la transcripción, entre las que destacan GCN5, p300 o CBP (de las siglas en inglés, CREB Binding Protein). Por el contrario, la desacetilación de histonas generalmente se asocia con la represión transcripcional y las HDACs se han identificados como co-represores transcripciones, entre las más conocidas se encuentran dos proteínas que forman parte del complejo LSD1/CoREST, denominadas HDAC1/2 (Wang et al., 2009). Pero esto no siempre es así, ya que en algunos casos es necesario el reclutamiento de proteínas HDACs para la activación transcipcional de determinados genes (Greer et al., 2015). Entre las proteínas que actúan como readers de esta marca se encuentran las de la familia de proteínas BRD caracterizadas por poseer bromodominios capaces de interaccionar con lisinas acetiladas. Además de los bromodominios otros dominios que permiten el reconocimiento y unión a estas marcas son los dominios YEATS y los dominios dobles de dedos PHD (Barnes et al., 2019) 4.2.3. Fosforilación La fosforilación de histonas puede ocurrir en residuos de serina, treonina y tirosina localizadas principalmente, aunque no de forma exclusiva, en el extremo aminoterminal. Esta modificación, al igual que la acetilación, está asociada con activación transcripcional, concretamente con genes relacionados con proliferación que se activan en respuesta a EGF (de las siglas en inglés, Epidermal Growth Factor) y con la expresión de protooncogenes de respuesta inmediata como c-MYC, c-FOS y c-JUN (Rossetto et al., 2012). Las marcas más estudiadas implicadas en la regulación transcripcional son: H3S10ph, H3S28ph y H3S32ph (Chadee et al., 1999; Choi et al., 2005; Lau et al., 2011). Además, se ha descubierto una interrelación entre la fosforilación y la acetilación de histonas, de esta manera, por ejemplo, la fosforilación en H3S10 promueve la acetilación de H3K14 por la acetiltransferasa Gcn5, lo que relaciona aún más estas modificaciones con la activación de la transcripción (Lo et al., 2000). 19 Varias quinasas han sido relacionadas con la fosforilación de histonas, siendo las más estudiadas las proteínas MSK1/2. Mucho menos conocidas son las fosfatasas implicadas en la eliminación del grupo fosfato, dada la baja especificidad de estas enzimas. Hasta el momento, solo se han identificado unas pocas proteínas que actúan como readers de esta marca, principalmente miembros de la familia 14–3–3 y proteínas BRCT (Sawicka & Seiser, 2014). 4.3. Complejos remodeladores de la cromatina dependientes de ATP Los remodeladores de la cromatina dependientes de ATP engloban a un gran número de complejos multiproteicos los cuales aprovechan la energía generada tras la hidrólisis de ATP para establecer y reorganizar los patrones de distribución de los nucleosomas dentro del genoma, especialmente en las regiones reguladoras (Clapier & Cairns, 2009; Clapier et al., 2017; Hargreaves & Crabtree, 2011). Todos estos complejos contienen una subunidad catalítica perteneciente a la superfamilia de helicasas SF2, y concretamente dentro de ella a la familia SNF2. El genoma de mamíferos codifica para más de 30 proteínas de la familia SNF2 implicadas en muchos aspectos de la fisiología de la cromatina (Flaus et al, 2006). Todas ellas comparten un dominio ATPasa consistente en un dominio bipartito constituido por las regiones DExx y HELICc (Fairman-Williams et al., 2010) (Figura I4). Figura I4. Estructura de las ATPasas remodeladoras de la cromatina más estudiadas. Los remodeladores de la cromatina se clasifican según la ATPasa que contienen. Todas estas ATPasas poseen dos dominios comunes: DEXX (rojo) y HELICc (amarillo). Éstos se encuentran 20 separados por una inserción corta (gris) en las subfamilias SWI/SNF, ISWI y CHD, mientras que en la subfamilia INO80 están separados por una inserción de mayor tamaño (verde). A su vez, cada una de estas subfamilias poseen dominios específicos, así la subfamilia SWI/SNF posee un bromodominio (azul oscuro) y un dominio HSA (del inglés, Helicase-SANT) (azul claro), éste último presente también en la subfamilia INO80; la subfamilia ISWI posee el dominio SANTSLIDE (rosa); y la subfamilia CHD presenta cromodominios en tándem (naranja). Figura adaptada de (Clapier & Cairns, 2009) y realizada utilizando la web online BioRender. Los complejos remodeladores dependientes de ATP más estudiados se clasifican según las relaciones filogenéticas de su subunidad catalítica y/o por sus diferencias funcionales en: ISWI, INO80, CHD y SWI/SNF (Clapier & Cairns, 2009). Cada uno de ellos está especializado para un propósito particular y contexto biológico, dado por los dominios únicos que residen en sus ATPasas catalíticas y sus subunidades asociadas de forma específica. De esta manera, la mayoría de los remodeladores de la cromatina dependientes de ATP realizan preferentemente una de estas tres funciones (Clapier et al., 2017) (Figura I5): Ensamblaje y organización de nucleosomas: Tras la replicación, las chaperonas de histonas transportan las histonas canónicas (tetrámeros de H3-H4 y dímeros de H2A y H2B) hacia el ADN naciente. En este proceso, los remodeladores de ensamblaje, entre los que se encuentran remodeladores de las subfamilias ISWI y CHD, llevan a cabo dos funciones: (1) ayudar a estos complejos iniciales de histona-ADN (prenucleosomas) a madurar hacia los nucleosomas octaméricos canónicos, y posteriormente, (2) formar los alineamientos de nucleosomas donde los nucleosomas están separados en distancias relativamente fijas. Estas funciones de ensamblaje y espaciado también las llevan a cabo durante la transcripción en aquellas regiones donde el paso de la RNA pol II durante la elongación ha eliminado los nucleosomas de forma transitoria. Modificación de la accesibilidad de la cromatina: conseguir que la cromatina se vuelva más accesible implica deslizar los nucleosomas a lo largo del ADN, eliminar alguno de los componentes de los nucleosomas (como por ejemplo los dímeros H2A-H2B) o eliminar los nucleosomas completamente. Estas funciones son llevadas a cabo principalmente (aunque no exclusivamente) por remodeladores de la subfamilia SWI/SNF. Estos remodeladores pueden, por lo tanto, exponer los sitios de unión de activadores y represores de la transcripción, así como aumentar la accesibilidad de la maquinaría de reparación y/o recombinación del ADN. 21 Edición de nucleosomas: independientemente del proceso de replicación, remodeladores de la subfamilia INO80 llevan a cabo la eliminación de una histona dentro de un nucleosoma particular y su reemplazo por otra histona canónica o variante de la misma. Así, por ejemplo, remodeladores de edición, como Swr1 de levaduras y las proteínas SRCAP (Snf2 related CREBBP activator protein) y p400 en mamíferos, permiten el reemplazo de las histonas canónica H3 y H2A por sus respectivas variantes. Esta sustitución puede modificar la afinidad del ADN por el octámero de histonas modificando así la accesibilidad a la cromatina. Figura I5. Funciones de los remodeladores de la cromatina. Esquema de las funciones principales llevadas a cabo por las subfamilias de remodeladores más estudiadas. Figura adaptada de (Clapier et al., 2017). Figura realizada utilizando la web online BioRender. Es bien conocido que el posicionamiento de los nucleosomas tiene un gran impacto sobre la expresión génica al afectar a procesos como el inicio de la transcripción (Kornberg & Lorch, 1999; Lorch et al., 1987; Radman-Livaja & Rando, 2010; Rhee & Pugh, 2012), la elongación (Bondarenko et al., 2006; Weber et al, 2014), la terminación (Chiu et al., 2018; Spies et al., 2009), el splicing (Jimeno-González et al., 2015; Spies et al., 2009; Tilgner et al., 2009) y la actividad de los enhancers (Kim & Wysocka, 2023). Dado que los remodeladores de la cromatina, como ya se ha comentado, tienen un papel muy importante en el mantenimiento y modificación de este posicionamiento de los nucleosomas, se les ha relacionado con todos estos procesos. Todo esto hace que una mutación o alteración en la expresión de los genes que codifican estos remodeladores de la cromatina den lugar a numerosos síndromes y enfermedades 22 congénitas humanas, particularmente cáncer (Hoffmann & Spengler, 2019; Masliah- Planchon et al., 2015; Pierre & Kadoch, 2017; Ronan et al., 2013). Esta introducción se va a centrar en la subfamilia de complejos SWI/SNF, ya que el trabajo llevado a cabo en esta tesis doctoral está relacionado con estos complejos. No obstante, se hará a continuación un breve resumen de las características más importantes del resto de las subfamilias. 4.3.1. Subfamilia ISWI Los complejos de remodelación de la familia ISWI (Imitation SWItch) se descubrieron por primera vez en Drosophila melanogaster (Tsukiyama & Wu, 1995), y posteriormente se demostró que se conservan en muchos otros organismos. Hasta el momento, se han descrito 7 complejos diferentes de este tipo en mamíferos: WICH, NoRC, RSF, ACF, CHRAC, NURF y CERF. Cada uno de ellos formados por el emparejamiento de una de las dos subunidades de ATPsas, SMARCA1 (SNF2L) o SMARCA5 (SNF2H), con una de las seis subunidades reguladoras: BAZ1A (ACF1), BAZ1B (WSTF), BAZ2A (TIP5), BPTF, CECR2, o RSF (Erdel & Rippe, 2011). SMARCA5 se encuentra en todos los complejos ISWI excepto en CERF y NURF, que contienen SMARCA1, aunque esta selectividad de ATPasa puede ser en parte específica del tipo de célula (Thompson et al., 2012). El dominio ATPasa de ambas ATPasas está compuesto por las regiones DExx y HELICc, común a todos los remodeladores de la cromatina dependientes de ATP, ubicados en este caso en la mitad N-terminal de las proteínas. Además, ambas proteínas contienen un dominio HAND-SANT-SLIDE en el extremo C-terminal, que permite establecer contactos esenciales con la cola de la histona H4 y el ADN espaciador, y son fundamentales para la reacción de remodelación (ver Figura I4) (Grüne et al., 2003; Mueller-Planitz et al., 2013). Funcionalmente, la mayoría de los complejos de la subfamilia ISWI ensamblan y espacian regularmente los nucleosomas de manera que limitan la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica; sin embargo, el complejo NURF (de las siglas en inglés, NUcleosome Remodelling Factor), tiene subunidades accesorias que favorecen el acceso y promueven la transcripción mediante interacciones con factores de transcripción específicos de secuencia e histonas modificadas (Clapier et al., 2017; Xiao et al., 2001). Recientemente se ha puesto de manifiesto que SMARCA5 es esencial para el mantenimiento del posicionamiento nucleosomal en insulators ocupados por CTCF (Barisic et al., 2019; Bomber et al., 2023). 23 4.3.2. Subfamilia INO80 Los complejos de la subfamilia INO80 contienen 15 subunidades diferentes, incluyendo las ATPasas INO80 o SWR1, y fueron purificados por primera vez de S. cerevisiae. Sus homólogos en humanos incluyen hINO80, hSRCAP y p400. Se caracterizan por tener el dominio ATPasa “dividido” por una larga inserción, a la cual se unen las proteínas RVB1/2 relacionadas con helicasas (AAA-ATPasa). Estos complejos también contienen actina y proteínas relacionadas con la actina tales como ARP4 o ARP8 (ARP, de las siglas en inglés Actine-Related Proteins) (Gerhold & Gasser, 2014). Los remodeladores de la subfamilia INO80 están involucrados en una gran variedad de transacciones nucleares, incluida la regulación de la transcripción, la replicación y la reparación del ADN (Conaway & Conaway, 2009; Morrison & Shen, 2009; Watanabe & Peterson, 2010). Desempeñan un papel en la edición de nucleosomas mediante el intercambio de variantes de histonas, así por ejemplo, tienen la capacidad de reestructurar el nucleosoma al eliminar los dímeros H2A-H2B canónicos y reemplazarlos con dímeros H2A.Z-H2B, insertando así la variante H2A.Z de la histona H2A (Brahma et al., 2017; Mizuguchi et al., 2004). 4.3.3. Subfamilia CHD La subfamilia de remodeladores de cromatina dependientes de ATP CHD (de las siglas en inglés Chromodomain-Helicase-DNA Binding) se caracteriza por incluir ATPasas de la familia SNF2 con dos cromodominios dispuestos en tándem en la mitad N-terminal de la subunidad catalítica. La presencia de dominios estructurales adicionales específicos se utiliza para dividir aún más la familia CHD en tres subfamilias (Hall & Georgel, 2007; Marfella & Imbalzano, 2007). Así, brevemente, la subfamilia I, incluye Chd1 de levadura (ScChd1), que es el único miembro de la familia CHD presente en la levadura, y las proteínas CHD1 y CHD2 de eucariotas superiores. Las proteínas CHD1 y CHD2 comparten dominios de unión al ADN ubicado en la mitad C-terminal, los cuales se unen preferentemente a motivos de ADN ricos en AT (Delmas et al., 1993; Mills, 2017). La subfamilia II, incluye CHD3-5, no contienen dominios de unión a ADN, pero sí presentan dos motivos de dedos de zinc PHDs (de las siglas en inglés Plant HomeoDomains) en el extremo N-terminal capaces de reconocer ciertas modificaciones postraduccionales de colas de histonas. Un ejemplo significativo es la interacción entre CHD3/4 y la histona desacetilasa, que forma parte 30 en cáncer, mientras que BRM se subexpresa, asociándose ambos comportamientos a un mal pronóstico. Esto sugiere que BRM se comporta como un supresor de tumores, mientras que BRG1 tendría también papeles como oncogén (Guerrero-Martínez & Reyes, 2018; Wu et al., 2017). Estos resultados han sido confirmados por otros grupos (Peng et al., 2021; Wu et al., 2017; Xiao et al., 2022). Por qué la deficiencia o/y la sobreexpresión de alguna subunidad de los complejos SWI/SNF provocan cáncer es complejo, a ello se le suma el hecho de que, dicha deficiencia o/y la sobreexpresión, da lugar a respuestas específicas para cada tipo de tumor. Sin embargo, teniendo en cuenta los importantes papeles de SWI/SNF en diferenciación celular es muy posible que la alteración de SWI/SNF provoque desdiferenciación celular y alteración en varias rutas de señalización (Basta et al., 2020; Romero & Sanchez-Cespedes, 2014; Ruijtenberg & Van Den Heuvel, 2015). De especial importancia es la asociación entre la deficiencia en algunas subunidades de SWI/SNF y la adquisición de fenotipos migratorios y la transición de epitelio a mesénquima en ciertos modelos celulares, procesos esenciales para la formación de metástasis (Kim et al., 2021; Li et al., 2021; Moreno et al., 2021; Roy et al., 2015; Tomihara et al., 2021; Varela et al., 2011; Wenjia Wang et al., 2019). En la siguiente sección introduciremos este importante proceso. 6. Transición de epitelio a mesénquima (EMT) La transición de epitelio a mesénquima o EMT (por sus siglas en inglés) es el proceso mediante el cual una célula epitelial sufre una serie de cambios morfológicos y metabólicos que le permiten asumir un fenotipo de célula mesenquimal. Este proceso implica la activación de TFs que promueven la EMT, cambios en las proteínas de la superficie celular, así como una reorganización de la matriz extracelular y el citoesqueleto. Esta transición también se puede dar a la inversa, conocido como transición de mesénquima a epitelio o MET (por sus siglas en inglés) (Kalluri & Weinberg, 2009). Las células epiteliales y mesenquimales poseen diferentes características funcionales y fenotípicas. Así, las células epiteliales se localizan formando capas de células las cuales están estrechamente unidas mediante estructuras de membrana especializadas, como uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y uniones gap. Además, éstas presentan una polaridad ápico-basal con una distribución localizada de moléculas de adhesión, se organizan lateralmente mediante uniones célula-célula, presentan una lámina basal en su superficie y poseen una distribución polarizada del citoesqueleto. Por 31 el contrario, las células mesenquimales no forman una estructura organizada y presentan una polarización delantero-trasera. Se caracterizan por ser alargadas, con forma fusiforme, y por presentar una mayor capacidad migratoria, de invasión y resistencia a la apoptosis. A nivel molecular, el fenotipo mesenquimal implica una disminución de los niveles de proteínas típicas epiteliales, como la E-cadherina (también llamada CDH1), lo que provoca una pérdida de la adhesión célula-célula, así como un aumento de proteínas típicas mesenquimales, como vimentina, y N-cadherina. Además, también se incrementan las proteasas de la matriz extracelular que favorecen el remodelado de la matriz y la capacidad migratoria, al mismo tiempo que se produce un aumento de la síntesis de componentes de la matriz, como el colágeno o la fibronectina (Thiery & Sleeman, 2006) (Figura I7). Figura I7. Esquema de la transición epitelio mesénquima (EMT). La EMT es el paso de células epiteliales a mesenquimales, pasando entre ambos extremos por estadios celulares intermedios. Las células epiteliales están fuertemente unidas entre sí a través de diferentes uniones intercelulares, mientras que las células mesenquimales tienen formas fusiformes y la capacidad de desplazarse. Existen marcadores característicos de cada uno de estos estadios, cuya expresión está regulada por los llamados EMT-TFs. La EMT está implicado en numerosos procesos, pudiéndose dar también a la inversa (MET). Figura realizada utilizando la web online BioRender. Se han descrito tres tipos de EMT en función del contexto biológico en el que ocurren. De esta manera, estaría la EMT de tipo I, la cual se lleva a cabo durante el desarrollo. Ésta tiene la capacidad de generar células mesenquimales (mesénquima primario) las 32 cuales tienen el potencial de revertir el proceso mediante MET para generar epitelios secundarios. La EMT tipo II está asociada a la cicatrización de heridas, la regeneración de tejidos y la fibrosis de órganos. Está asociado a la inflamación y desaparece una vez disminuye dicha inflamación. Y finalmente, la EMT de tipo III es la que tiene lugar en células tumorales, las cuales previamente han sufrido cambios genéticos y epigenéticos, especialmente en genes que favorecen el crecimiento y desarrollo de tumores localizados, como son los oncogenes y los supresores de tumores. Estas células tienen la capacidad de invadir y hacer metástasis en otros tejidos, provocando consecuencias potencialmente mortales en la progresión del cáncer (Derynck et al., 2014; Kalluri & Weinberg, 2009). La reprogramación de la expresión génica que tiene lugar durante la EMT es posible gracias a la acción de los factores de transcripción inductores de EMT, denominados EMT-TFs. Entre estos EMT-TF se incluyen miembros de la familia ZEB (ZEB1 y ZEB2), SNAIL (SNAI1, SNAI2 o SLUG y SNAI3) y hélice-giro-hélice (TWIST1 y TWIST2). Todos ellos promueven de una forma u otra la expresión de genes asociados al fenotipo mesenquimal y reprimen aquellos característicos del fenotipo epitelial. Así, ZEB1 inhibe la expresión de E-cadherina e induce la transcripción de genes que codifican proteínas típicas mesenquimales, como vimentina o N-cadherina, a través del reclutamiento a sus promotores de modificadores de la cromatina como los complejos SWI/SNF o el complejo Polycomb (Sánchez-Tilló et al., 2010; Yang et al., 2010). De manera similar, SNAIL inhibe al gen de la E-cadherina a través de su unión a la caja E del promotor del mismo y mediante el reclutamiento del complejo de represión Polycomb (Cano et al., 2000; Herranz et al., 2008) y el complejo demetilasa de H3K4me1/me2 LSD1/CoREST (Ferrari-Amorotti et al., 2013; Lin et al., 2010; Rivero et al., 2015). Los EMT-TFs también controlan directamente la expresión de genes relacionados con la polaridad celular. De esta manera, ZEB1 y SNAI1 reprimen la expresión de proteínas que son importantes para la formación de las uniones estrechas y para mantener la polaridad apico-basal, como PARTJ (proteínas de uniones estrechas asociadas a PALS1), CBS (proteínas transmembrana) y LGL (proteínas del citoesqueleto) (Aigner et al., 2007; Spaderna et al., 2008). Además, ZEB2 y SNAI1 activan la expresión de proteínas MMPs (por las siglas en inglés, Matrix Metallo-Proteinases) las cuales facilitan la degradación de la lámina basal, facilitando así la movilidad celular (Dongre & Weinberg, 2019; Miyoshi et al., 2004). 33 6.1. EMT inducida por TGFβ La familia de citoquinas TGFβ está implicada en una gran variedad de proceso celulares como proliferación, diferenciación, movilidad, adhesión, comunicación o apoptosis. Estas citoquinas desempeñan un papel clave en el desarrollo embrionario, la inflamación y la reparación de tejidos, así como en el mantenimiento de la homeostasis de diferentes tejidos. Dada su amplia gama de respuestas en función del contexto biológico, las alteraciones en la ruta de señalización mediada por TGFβ se han relacionado con muchas patologías, entre ellas cáncer. Se ha descrito que TGFβ puede participar en procesos de reprogramación celular tanto fisiológica (EMT) como inducida (reprogramación de células iPS, por sus siglas en inglés induced Pluripotent Stem Cells) (Hao et al., 2019; Morikawa et al., 2016). La inducción de EMT por TGFβ se descubrió por primera vez en cultivo celular, donde tras el tratamiento con TGFβ, las células epiteliales cambiaron de cuboidales a una forma de huso alargado y mostraron una disminución de la expresión de marcadores epiteliales y un aumento de los marcadores mesenquimales (Miettinen et al., 1994). 6.1.1. Ruta de señalización del TGFβ El TGFβ ejerce sus efectos celulares a través de la interacción con receptores de membrana de tipo I o II, denominados respectivamente TβRI y TβRII. A pesar de la gran variedad de procesos en los que está implicado el TGFβ, la transducción de su señalización es mediada por un número reducido de proteínas SMAD. En vertebrados, las proteínas SMAD se dividen en SMAD regulada por receptores (R-SMAD), SMAD1, -2, -3, -5 y -8, las cuales interactúan y son fosforiladas por quinasas receptoras de tipo I; la Co-SMAD (de las siglas en inglés, Common-SMAD), SMAD4, que forma complejos heteroméricos con las R-SMAD; y los inhibidores de las SMAD (I-SMAD), SMAD6 y SMAD7, que antagonizan el efecto de las anteriores (Wrana, 2013). De manera muy resumida, la unión del TGFβ a su receptor TGFβRI y TGFβRII, conduce a la fosforilación de SMAD2/3, que proceden a formar complejos triméricos con SMAD4. Estos complejos pueden ser homodímeros para SMAD2 o SMAD3 (por ejemplo, SMAD3-SMAD3-SMAD4) o hereterodímeros (SMAD2-SMAD3-SMAD4). Una vez formados, estos complejos migran al núcleo, donde funcionan como factores de transcripción para regular la expresión de grandes grupos de genes implicados en la adquisición del estado mesenquimal. El TGFβ también puede emitir señales a través de vías no SMAD. Este proceso puede ser directo o indirecto. De forma directa puede 34 ocurrir aguas abajo del receptor TGFβ mediante la activación de varias ramas de la vía de las MAP quinasas (MAPKs), las vías de señalización de la GTPasa tipo Rho y la vía de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K)/AKT. También se puede dar indirectamente a través de la expresión de factores de crecimiento estimulada por TGF-β/SMAD, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), que posteriormente darían lugar a respuestas de tipo no SMAD (Lamouille et al., 2014; Zhang, 2017) (Figura I8). Figura I8. Ruta de señalización del TGFβ. La ruta principal de señalización del TGFβ es la vía de las proteínas SMAD. Tras la unión del TGFβ al receptor, se activa esta ruta que comienza con la fosforilación de las proteínas SMAD2 y/o SMAD3, para la posterior formación del complejo SMAD2/3-SMAD4 y su reclutamiento al interior del núcleo. Por otro lado, existen otras vías alternativas, conocidas como vías no SMAD. Esquema realizado utilizando la web online BioRender. OBJETIVOS OBJETIVOS 35 OBJETIVOS Durante los últimos años, los complejos SWI/SNF han sido ampliamente estudiados, pero hasta ahora solo se había conseguido alterar los niveles total o parcialmente de alguna de sus subunidades. Recientemente, se ha desarrollado un nuevo inhibidor, denominado BRM014, que ha demostrado inhibir completa y específicamente a las ATPasas BRM y BRG1, y, por lo tanto, a todos los complejos SWI/SNF. Los objetivos propuestos para este trabajo de tesis son: 1. Caracterizar ampliamente qué elementos reguladores y qué genes son dependientes o independientes de SWI/SNF. Determinar cuáles son las características que les hacen ser susceptibles de depender de la actividad remodeladora de estos complejos. Determinar qué efectos tiene inhibir la actividad de los complejos SWI/SNF en la estructura de la cromatina de promotores y enhancers. 2. Dado que este inhibidor ha sido propuesto como posible terapia contra el cáncer, hemos querido además estudiar los efector de eliminar la actividad SWI/SNF sobre la transición de epitelio a mesénquima (EMT), proceso ampliamente estudiado por su implicación en metástasis. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 36 MATERIALES Y MÉTODOS 1. MÉTODOS DE CULTIVO CELULAR 1.1. Línea celular y condiciones de cultivo Toda esta tesis doctoral ha sido realizada en la línea celular de epitelio mamario de ratón (NMuMG), procedente del grupo del Dr. José Antonio Pintor Toro (CABIMER), cultivada en Dulbecco’s Modified Eagle (DMED) (Sigma) suplementado con insulina 10 μg/ml (Sigma), antibióticos (Estreptomicina 100 μg/ml y Penicilina 100 U/ml, GibcoBRL) y suero fetal bovino 10% (FBS, GibcoBRL). Los cultivos se mantenían en incubadores HEPA Class 100 (Thermo) en atmósfera de humedad a 37°C y con 5% CO2, asegurándose en todo momento que los materiales y soluciones en contacto con las células eran totalmente estériles. Además, se hacían comprobaciones rutinarias de ausencia de micoplasma mediante el test comercial MycoAlertTM PLUS Mycoplasma Detection Kit (Lonza). Estas células adherentes se cultivaban en placas de 100 mm de diámetro con 10 ml de medio. Cada 2-3 días se subcultivaban, al alcanzar una confluencia de aproximadamente el 80%, para ello: A. Se lavaban con tampón salino de fosfato (PSB) 1X usando el mismo volumen que de medio (10 ml). B. Luego se levantaban las células usando una décima parte del volumen de medio en el que estaban las células (1 ml), de tripsina al 0.05% en PBS-EDTA (Sigma). Se incubaban durante 5 min a 37°C C. Para neutralizar la tripsina se usaba al menos un volumen (1 ml) de medio completo. D. Para realizar un nuevo cultivo de mantenimiento partiendo de una suspensión celular de 10 ml, se diluían 1/10 para dos días y 1/20 para 3 días. En el caso de necesitar subcultivar un número concreto de células, se cogían 15 μl de la suspensión de células resultantes tras neutralizar la tripsina, y se calculaba la MATERIALES Y MÉTODOS 37 concentración necesaria mediante el empleo en una cámara de Neubauer, siguiendo las indicaciones del fabricante y con ayuda de un microscopio invertido. 1.2. Conservación de la línea Antes de comenzar este trabajo se amplificaron y congelaron varios viales de células, los cuales se han ido usando durante el desarrollo del mismo. Para ello, por vial, se cultivaban las células hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 70% de una placa de 10 mm de diámetro, luego se lavaban y tripsinizaban, como se indica en el apartado anterior. Tras esto, se centrifugaban a 500 g durante 5 min en un tubo de 15 ml y se resuspendían en 1 ml de medio completo con 10% DMSO. El proceso de congelación se comenzaba a -80°C en un contenedor con isopropanol (Mr. Frosty, Nalgene) durante 2-3 días, pasándolas a continuación a tanque de nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo. Para descongelarlas, se colocaba el vial con las células en un baño de 37°C durante unos segundos, luego se añadía el contenido del mismo a un tubo de 15 ml con 9 ml de medio completo, y se homogenizaba bien con ayuda de una pipeta. Se centrifugaba a 500 g durante 5 min y resuspendía el sedimento de células en 10 ml de medio completo que se vertía sobre una placa de 100 mm de diámetro. 1.3. Tratamiento con el Inhibidor BRM014 y/o TGFβ Para el tratamiento de las células NMuMG con el inhibidor BRM014 (MedChemExpress, Cat#HY-119374), se sembraban 24 horas antes el número de células necesario según el tipo de experimento y los tiempos del mismo. Con la placa a un 50-60% de confluencia se le añadía el inhibidor disuelto en DMSO (Signa, D4540), hasta alcanzar una concentración en placa de 2 μM. Para todos los experimentos se añadía el mismo volumen de DMSO puro como vehículo. En el caso del tratamiento con TGFβ (Biomol, #240-B-010), el procedimiento era el mismo que el anterior, pero en este caso, se añadía la cantidad necesaria para alcanzar en placa una concentración de 5 ng/ml de TGFβ disuelto en seroalbúmina bovina (BSA) 1 mg/ml en 4 mM de HCl. Para todos los experimentos se añadía el mismo volumen de una solución de BSA 1 mg/ml en HCl 4 mM como vehículo. MATERIALES Y MÉTODOS 44 System (Applied Biosystem), siguiendo en ambos casos el protocolo por defecto. Igualmente, durante el desarrollo de la tesis se tuvo que cambiar la marca del producto SYBR Green de ahí que usáramos dos mezclas de reactivos diferentes: A. 2 μl de ADNc 8 μl de agua MiliQ 1.25 μl de oligonucleótido cebador directo a 10 μM 1.25 μl de oligonucleotido cebador reverso a 10 μM 12.5 μl de Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem) B. 2 µl de ADNc 0.75 µl de mix de oligonucleótidos (directo y reverso) 10 µM 2.25 µl de H2O 5 µl de iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Con el fin de asegurar que la eficiencia de la amplificación fuese adecuada se realizaba, en todos los casos, una recta de calibrado a partir de diluciones seriadas 1/10 de una muestra de ADNc, asegurándonos de que las pendientes de las rectas de los genes a comparar eran paralelas entre sí. Por otro lado, la expresión de todos los genes cuantificados se relativizaba a un gen control, en este caso Chd8, un gen constitutivo cuyos niveles de expresión no cambiaba tras el tratamiento con el inhibidor o TGFβ (valores no mostrados). Se comprobaba además que todos tenían un único producto de amplificación mediante las curvas de disociación. Se incluían siempre 3 réplicas técnicas para cada muestra y pareja de oligonucleótidos cebadores. Los resultados se analizaban con los programas 7500 system sotfware v1.4.0 o QuantStudioTM Design & Analysis sotfware, en función de la máquina utilizada. En la Tabla M4 se muestran todos los pares de oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta tesis. Tabla M5. Listado de oligonucleótidos cebadores empleados en las RT-qPCR Gen Cebador directo (5’3’) Cebador reverso (5’3’) Snai1 CTTGTGTCTGCACGACCTGT AGGAGAATGGCTTCTCACCA Cdh1 AGCCATTGCCAAGTACATCC AAAGACCGGCTGGGTAAACT Zeb1 GCCAGCAGTCATGATGAAAA TATCACAATACGGGCAGGTG MATERIALES Y MÉTODOS 45 Foxq1 CGAGTACCTCATGGGCAAGT TGACGAAACAGTCGTTGAGC Tgfβr1 TGACAACATCAGGGTCTGGA AATGGTCCTGGCAATTGTTC Col7a1 GATGTTCGAGCTGGGCTTAG AGTCCTGGGACAACAAGTGG Krt20 GAACACGGAGGAGCTGAAAG ACGAGCCTTGACGTCCTCTA Chd8 GAGACCAGGCAGAGA CCATGCTTAAAAACG Pard6b CTGTGTTCTGTTCCCCCAGT CTCCTAGCACCAGCAAGACC Asap1 ACCATGCTGGGAACTGAAAC CCAGCTTGGAGCTTTACCTG Spaca7 ATGGCAGTCAGGGTTACCG ATTCTTGCTAAAGGGCAGCA Slc29a2 TCTTCCTCTTGGCGTGTTCT CACTGGCTTCTTCCTTCTGG RelA CCAATGAGGAAAGCGTTTGT CCAGAGTCCCCACACTCAAT Cd44_corto AGCCAGTGACAGGTTCCATT CTGTAGCGGCCATTTTTCTC Cd44_largo CTTCCGTTGGCTGCTTAGTC GGAAGTTGGCTGTGGTTTTT Clu_corto CACGCCATGAAGATTCTCCT ATGTGCTTCACTCCCTGGAC Clu_largo GGGGTGTACTTGAGCAGAGC GCCTCCTTGGAATCTGGAGT Lgals9_corto CTCTTCAGTGCCCAGTCTCC CCACATACCCTCCTTCCTCA Lgals9_largo AGCTCCTCCCCTTGAAGAAG CAGGGCTGAGCTAGGAAACA Spp1_corto CTCCTGGCTGAATTCTGAGG TCTGCTTCTGAGATGGGTCA Spp1_largo CACTCCACCTCCTGATTGGT CTTCAGTGTGAGCTGCTGGT Xist TCATCACAACAGCAGTTCTC CAGGAGCACAAAACAGACTC Hprt GGACTAATTATGGACAGGACTG TCCAGCAGGTCAGCAAAGAA 4.3.4. Diseño de los oligonucleótidos cebadores El diseño de los oligonucleótidos cebadores se llevaba a cabo empleando el programa on-line primer3plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Para ello se copiaba en el programa la secuencia de ADNc del gen de interés y se especificaba en ajustes la temperatura de fusión (Tm, 59-61°C), el tamaño de los oligonucleótidos (18-20 pares de bases (pb)) y del tamaño del fragmento amplificado (60-150 pb). Siempre que fuese posible se intentaba que el cebador directo y reverso hibridaran en exones diferentes o en la unión entre dos exones, para evitar así amplificar ADNg en caso de contaminación. MATERIALES Y MÉTODOS 46 4.4. RNA-seq La extracción del ARN total necesario para el RNA-seq se llevaba a cabo como se indica en el apartado anterior. Una vez obtenido, se trataba con TURBO DNA-free kit (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las recomendaciones del fabricante, y se entregaba para secuenciar a la Unidad de Génomica de CABIMER (CABIMER, Sevilla), donde primero se realizaba un análisis de calidad en BioanalyzerTM (Agilent) y QubitTM (Thermo Fisher Scientific). Las librerías se hacían utilizando el kit TruSeq Stranded mRNA (Illumina) y la secuenciación en el secuenciador NovaSeq S1 (Illumina). El ADNc se secuenciaba por ambos extremos (paired-end) dando lecturas de 2 x 50 pb. 4.5. Aislamiento y secuenciación del ARN unido a la cromatina (ChrRNA- seq) Para la extracción del ARN cromatínico se llevaba a cabo un fraccionamiento del ARN total en ARN citoplasmático, del nucleoplasma y cromatínico, siguiendo el protocolo descrito en (Conrad & Ørom, 2017). Las células se cultivaban en placas de 100 mm y se trataban con inhibidor durante 6 y 30 horas, como ya se ha descrito en apartados anteriores. Tras alcanzar una confluencia del 70-80%, se lavaban con PBS 1X, tripsinizaron y recogían en un tubo de 15 ml. Para comenzar con el fraccionamiento, el tubo con las células se centrifugaba a 200 g durante 5 minutos, se lavaba de nuevo con PBS 1X y centrifugaba a 200 g durante 5 minutos. El pellet de células se resuspendía en 1 ml de PBS-EDTA que se pasaba a un tubo de 1.5 ml y centrifugaba a 200 g durante 5 min, se retiraba el sobrenadante y resuspendía en solución de lisis que se incubaba en hielo durante 5 minutos. El lisado resultante se vertía con cuidado sobre 1 ml de solución de sacarosa y se centrifugaba a 3500 g durante 10 minutos. Como resultado de esta centrifugación quedaría el sobrenadante con la fracción citoplasmática, que se pasaba a otro tubo de 1.5 ml, se centrifugaba de nuevo a 14000 g durante 1 minuto y almacenaba a 4°C; y el pellet con los núcleos, con el que se continuaba el protocolo. El pellet se lavaba con 1 ml de PBS-EDTA y se resuspendía en 250 μl de solución de glicerol, seguidamente se le añadía 250 ml de solución de lisis nuclear. Esta solución contenía urea, que quedaba a una concentración final de 0.5 M y otras sales que extraían los ARNs del nucleoplasma, no fuertemente unidos a la cromatina. Tras homogenizar bien, se incubaba durante 2 min en hielo y centrifugaba a 13000 g durante 2 min, dando lugar, por un lado, al sobrenadante con el ARN presente en el nucleoplasma y al pellet con el ARN cromatínico, éste último se resuspendía en 50 μl de PBS-EDTA. La purificación del ARN de cada fracción se hacía a continuación con MATERIALES Y MÉTODOS 47 TRIZOL (invitrogen), siguiendo las indicaciones del fabricante, para ello se añadía 1 ml de TRIZOL a 200 μl de ARN citoplasmático, a 200 μl de ARN del citosol y a los 50 μl de ARN cromatínico. Todas las centrifugaciones se hacían a 4°C y las soluciones se empleaban previamente enfriadas. Como control de que el fraccionamiento había ocurrido de forma correcta, se hacía, por un lado, una RT-qPCR, como ya se ha descrito en el apartado 4.3, donde se cuantificaba la expresión de un ARN mayoritario en la cromatina, como es Xist, y de un ARNm predominante en el citoplasma, como es Hprt. De manera que si el fraccionamiento había sido correcto aparecía una alta expresión de Xist en la fracción cromatínica y muy poco en la citoplasmático, y lo contrario ocurriría con Hprt (Figura M2). Figura M2. Gráfica donde se muestra un ejemplo de un fraccionamiento tipo de ChrRNA. Los datos son el promedio de tres experimentos independientes. La significación con respecto a la fracción cromatínica se probó mediante el uso de la prueba t de Student de dos colas. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p<0.001. Por otro lado, se migraba en un gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X a 120V durante 25 minutos para ver que el patrón de bandas era el característico de cada una de las fracciones. En el ARN cromatínico debían aparecer las bandas correspondientes al ARN ribosómico sin procesar (Figura M3). La composición de las soluciones empleados en este protocolo se muestra en la Tabla M6. Antes de usar dichas soluciones se añadía por cada ml, 1 μl de inhibidor de ARNsas (ARNse OUT, Thermo Fisher Scientific), para asegurar que el ARN no se degradaba. Todas las soluciones se preparaban en agua de DEPC y almacenados a 4°C. MATERIALES Y MÉTODOS 48 Figura M3. Gel de fraccionamiento resultante del protocolo de ChrRNA. Se muestran las tres fracciones, indicadas en la parte superior, de tres experimentos distintos. El significado de cada banda se especifica en la parte derecha. Tabla M6. Composición de las soluciones empleadas en el protocolo de ChrRNA-seq. Soluciones Composición PBS-EDTA PBS 1X, 0.5 mM EDTA. Solución de lisis celular 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.15% NP40, 150 mM NaCl, Solución de sacarosa 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 24% Sacarosa, 150 mM NaCl. Solución glicerol 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.5 M EDTA, 50% Glicerol, 75 mM NaCl. Solución de lisis nuclear 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 7.5 mM MgCl2, 1 M Urea, 0.2 mM EDTA, 1% NP40, 0.3 M NaCl. Finalmente, el ARN cromatínico resultante, se trataba con DNaseI (TURBO DNA-free kit, Thermo Fisher Scientific) siguiendo las recomendaciones del fabricante, y se entregaba para secuenciar a la Unidad de Génomica de CABIMER (CABIMER, Sevilla). Primero se hacía un análisis de calidad en BioanalyzerTM (Agilent) y QubitTM (Thermo Fisher Scientific), donde se veían en todas las muestras los dos picos característicos de los ARN ribosómicos 18S y 28S en torno a 1800 y 4000 respectivamente. La eliminación de este ARN ribosómico y las librerías se llevaban a cabo empleando el kit Illumina Stranded TOTAL RNA preparation RIBO-ZERO PLUS (illumina) y la secuenciación en el secuenciador NextSeq High-Output (Illumina). El ADNc se secuenciaba por un extremo (single-end) dando lecturas de 75 pb. MATERIALES Y MÉTODOS 49 5. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE ADN 5.1. Electroforesis de DNA en gel de agarosa Las electroforesis de ADN se realizaban de la misma forma que las de ARN (apartado 4.2.), aunque el porcentaje de agarosa de los geles vario entre 0.7-2% (p/v) en función del tamaño de los fragmentos de ADN a analizar. Y para determinar el tamaño de cada uno de los fragmentos de ADN migrados durante la electroforesis, se utilizaba el patrón comercial 1 Kb Plus Ladder (Invitrogen). 5.2. CUT&Tag El CUT&Tag (del inglés Cleavage Under Targets and Tagmentation) es una nueva técnica para estudiar la localización genómica de proteínas descrita en 2019 por el grupo de Steve Henikoff (Kaya-Okur et al., 2019) Esta técnica se llevaba a cabo empleando el kit CUT&Tag-IT™ Assay Kit (Active motif), siguiendo las indicaciones del fabricante. Se partía de 500000 células, las cuales se levantaban y separaban entre sí usando la solución salina Enzyme Free Cell Dissociation Solution Hank's Based (1X) (Sigma- Aldrich, Cat#S-004-C), no con tripsina, ya que en este caso es muy importante preservar las proteínas de la superficie de la membrana celular que son las que van a permitir que las células se unieran a las partículas de concanavalina A. Para aumentar la permeabilidad de las células durante todo el protocolo se usaba entre 0.01-0,05% de digitonina. Tras la unión de las células con las partículas de concanavalina A, y la permeabilización, se incubaba con una dilución 1:50 del anticuerpo primario anti-H3K27me3 (ver tabla de anticuerpos (Tabla M11)) en rotación a 4°C durante toda la noche. Al día siguiente, se incubaba con una dilución 1:100 del anticuerpo secundario (incluido en el kit), durante 1 hora a temperatura ambiente. Seguidamente, tendría lugar la unión de los transposomas pA-Tn5 ensamblados a los adaptadores para secuenciación (incluidos en el kit CUT&Tag-ITTM), que reconocían y se unían al anticuerpo secundario. La actividad transposasa de Tn5 se activaba mediante la adición de Mg 2+, la cual, tras cortar e incorporar los adaptadores, se inactivaba; todo ello se realiza en presencia de la solución de tagmentación (incluida en el kit) a 37°C durante 1 hora. Además, la incorporación de estos adaptadores a los fragmentos cortados facilitaba la generación MATERIALES Y MÉTODOS 50 de las librerías. Los fragmentos de ADN liberados se aislaban mediante columnas de purificación del ADN. Finalmente se hacían las librerías, siguiendo el protocolo del kit, y el ADN amplificado resultante tras la PCR, se purificaba mediante partículas SPRI (incluidas en el kit). La secuenciación de las muestras se hizo en la unidad de Genómica de CABIMER (Sevilla). Primero se hacía un análisis de calidad en BioanalyzerTM (Agilent) y QubitTM (Thermo Fisher Scientific), en el que se observaron dos picos de tamaños en torno a 300 y 500, que correspondían con el patrón característico de una librería de CUT&Tag usando anticuerpos anti-H3K27me3 según Active Motif (Figura M4). Finalmente, las librerías se secuenciaban usando el secuenciador NovaSeq6000 SP (Illumina). El ADN se secuenciaba por ambos extremos (paired-end) dando lecturas de 2 x 50 pb. Figura M4. Patrón de picos de la librería de CUT&Tag generada usando anti-H3K27me3. 5.3. Digestión con la enzima Microccocal Nuclease (MNasa) y secuenciación de los fragmentos resultantes (MNasa-seq) Para el diseño del experimento nos basábamos en protocolos ya publicados en otros artículos (McKnight et al., 2021; Subtil-Rodríguez & Reyes, 2010). Se partía de una placa de 100 mm de diámetro con una confluencia del 70-80%. Seguidamente se llevaba a cabo el crosslinking en las células en suspensión, para ello, se lavaban las células, se tripsinizaban, se llevaban a un volumen de 10 ml con medio completo y se pasaban a un tubo de 15 ml. A estos 10 ml con las células separadas y en suspensión, se le añadía la solución de crosslinking complementado con formaldehido para una concentración final en el tubo de 0.9%, se incubaban 10 minutos a temperatura ambiente. Este proceso se paraba con glicina a una concentración de 0.11 M en el tubo, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, se centrifugaba a 3200 g 5 minutos y el MATERIALES Y MÉTODOS 51 pellet se lavaba dos veces con PBS 1X suplementado con inhibidores de proteasas (cOmplete, Roche). Para la lisis celular, se resuspendía el pellet de células en 500 μl de solución de lisis suplementado con inhibidores de proteasas (cOmplete, Roche), se pasaba a un tubo de 1.5 ml y se incubaba 15 minutos en hielo, tras este tiempo se centrifugaba a 3200 g 5 minutos. Se eliminaba el sobrenadante y el pellet se resuspendía en 200 μl de solución de lisis suplementado con 3 mM CaCl2 suplementado con inhibidores de proteasa (cOmplete, Roche), ya que la enzima MNasa necesitaba iones de calcio para su actividad. Sobre los 200 μl del paso anterior, se añadía 1 μl de enzima MNasa 1 U/μl (Sigma, Cat#N3755) y se apartaban alícuotas de 50 μl, a tiempos 3, 5, 10 y 15 minutos de digestión con la enzima, a otro tubo de 1.5 μl donde ya se habían añadido previamente 2 μl de solución de STOP. Tras la digestión, todas las muestras se trataban con 3 μl de RNAse A 10 mg/ml (Thermo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, con el fin de deshacer el crosslinking, se eliminaban las proteínas e inactivaban la RNAse A, se añadiá a cada tubo 1,5 μl de Proteinasa K 10 mg/ml (Promega) y SDS para una concentración final de 0.01%, todo ello se incubaba durante toda la noche a 65°C. Al día siguiente, se purificaban los fragmentos de ADN con el método tradicional de fenol/cloroformo, donde se precipitaba el ADN con dos volúmenes de etanol absoluto y 3 M AcNa2 durante mínimo 1 hora a -80°C. Finalmente, se resuspendía el ADN en 20 μl de H2O miliQ. Para comprobar el rendimiento de aislamiento del ADN, así como el patrón de digestión de la enzima MNAsa, se migraban 3 μl de cada muestra en un gel al 1% en TBE 0.5X a 90V durante 1 hora y media (Figura M5). Se seleccionaban aquellas muestras donde, apareciendo varias bandas, había una mayor densidad de ADN en la banda entre 200-100 pb, correspondiente al mononucleosoma. Figura M5. Patrón de digestión de la MNAsa. Digestión realiza a distintos tiempos (3, 5, 10 y 15 minutos). El tamaño en pb se muestra en el lado derecho. MATERIALES Y MÉTODOS 52 Una vez seleccionadas las muestras, se migraba todo el volumen de las mismas en un gel al 1% en TBE 0.5X a 90V durante 1 hora y media. Para aislar la banda del gel se usaba el kit FavorPrep™ Gel/PCR Purification Kit (Favorgen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Dado que las muestras eran para secuenciar, se purificaba aun más el ADN para asegurar la eliminación de todos los residuos que pudieran interferir en la secuenciación, para ello se pasaban por las columnas del kit MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las centrifugaciones realizadas durante este protocolo se hacían a 4°C. También se realizaba el mismo protocolo, pero sin el paso de crosslinking. En este caso las células se lavaban, se tripsinizaban y llevaban a un volumen de 10 ml de medio que se pasaba a un tubo de 15 ml. Tras centrifugar a 250 g durante 5 minutos, se lavaban con PBS y el pellet se resuspendía en 500 μl de solución de lisis II, que se pasaba a un tubo de 1.5 ml. Éste se incubaba 15 minutos en hielo, luego se centrifugaba a 3000 g durante 5 minutos y el pellet resultante se resuspendía en 200 μl de solución de lisis II. A partir de aquí el protocolo seguiría igual que el ya descritos anteriormente. La composición de las soluciones empleados se muestra en la Tabla M7. Tabla M7. Composición de las soluciones empleadas en el protocolo de MNAsa-seq. Soluciones Composición Solución de crosslinking 50 mM Hepes pH 8.0, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM EGTA. Añadir Formaldehido en el momento de uso a una concentración final del 11% Solución de lisis 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.3 M sacarosa, 0.2% NP-40 Solución de STOP EDTA 10 mM, EGTA 5 mM Solución de lisis II 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.3 M sacarosa, 60 mM KCl, 0.2% NP- 40 La secuenciación de las muestras se hacía en la unidad de genómica de CABIMER (Sevilla), donde primero se realizaba un análisis de calidad en BioanalyzerTM (Agilent) y QubitTM (Thermo Fisher Scientific), observándose un único pico en torno a 200 pb, correspondiente a la banda de los mononucleosomas aislada. Las librerías se hacían utilizando el kit ThruPLEX DNA-Seq Kit (Takara Bio Europe) y la secuenciación en el MATERIALES Y MÉTODOS 53 secuenciador NovaSeq SP (Illumina). El ADN se secuenciaba por ambos extremos (paired-end) dando lecturas de 2 x 50 pb. 5.4. ATAC-seq El ensayo para cromatina accesible por transposasa (del inglés, Assay for Transposase- Accessible Chromatin) se llevaba a cado siguiendo lo descrito en (Buenrostro, Wu, Chang, & Greenleaf, 2015). Se partía en todos los casos de 150000 células, se elegía este número de células porque se comprobó previamente en el grupo que con 150000 células se obtenían aproximadamente 50000 núcleos, suficientes para continuar con el protocolo. Para ello se subcultivaban las células en placas de 6 pocillo hasta conseguir una confluencia del 70-80%. Tras los tratamientos, se lavaban con PBS, se levantaban usando la solución salina Enzyme Free Cell Dissociation Solution Hank's Based (1X) (Sigma-Aldrich, Cat#S-004-C) y se llevaban a una concentración de 1.5x105 células/ml. Posteriormente, se apartaba 1 ml en un tubo de 1.5 ml que se centrifugaba a 1000 g durante 5 minutos, se aspiraba el sobrenadante con cuidado y se resuspendía en 50 μl de PBS frío, se volvía a centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. El pellet resultante se resuspendía en 50 μl de solución de lisis y se incubaba en hielo durante 5 minutos. Tras esto, se centrifugaba a 1000 g durante 10 minutos y el pellet se resuspendía en 50 μl de mezcla de transposición (preparada en el momento) que se incubaba a 37°C durante 30 minutos. Una vez terminada la transposición, los fragmentos de ADN liberados se purificaban usando el kit MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las soluciones se usaban frías y las centrifugas a 4°C. La composición de las soluciones se muestra en la Tabla M8. Tabla M8. Composición de las soluciones empleadas en el protocolo de ATAC-seq. Soluciones Composición Solución de lisis 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 3 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 0.1% IGEPAL. Almacenada a 4°C Solución de transposición (Tn5 Buffer) 5x 50 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM MgCl2, 50% v/v DMF. Almacenada a -20°C. Mezcla de transposición 25 μl Tn5 Buffer 2x + 2.5 μl Tn5 A/B* + 22.5 μl agua MiliQ *La transposasa Tn5 A/B fue preparada por La Unidad de Proteómica del Centro Andaluz de Biología del Desarrollo. (CADB, Sevilla). MATERIALES Y MÉTODOS 60 v.3.28.1 de Bioconductor. El análisis diferencial de expresión génica se llevaba a cabo con los paquetes DESeq2 v.1.26.0 y edgeR v.3.28.1 de Bioconductor. Se analizaban aquellos genes que contenían ≥ 0.5 CPM (del inglés, counts per million) en al menos las dos réplicas biológicas consideradas para cada condición, y entre ellos se seleccionaban aquellos genes con un valor de P ajustado <0.05 y |log2(FC)|> 1. Para los gráficos de MA (en inglés, MA plots) se representaba el cambio de expresión (log2FC) frente a la media de expresión (log2CPM) de las dos réplicas de cada condición, mientras que para los gráficos de volcán (en inglés, volcano plots) se representaba la significación del cambio (log10P-value) frente al cambio de expresión (log2FC). También se representaba, mediante una gráfica de cajas y bigotes, la distribución media de expresión mediante el log2(CPM). El mapa de calor de expresión de algunos genes seleccionados se llevaba a cabo mediante el programa online heatmapper (http://www.heatmapper.ca). Los diagramas de Venn se realizaban con Venny 2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) Además, las categorías funcionales de la ontología génica (GO) se analizaban utilizando DAVID (D. W. Huang, Sherman, & Lempicki, 2009). Se usaban los valores P ajustados por Bonferroni de la prueba exacta de Fisher para determinar la importancia del enriquecimiento. GSEA se realizaba utilizando el software GSEA v2.0.14 (GSEA, Broad Institute, Cambridge, MA,USA) con 1000 permutaciones de fenotipo (Subramanian et al., 2005). Los conjuntos de genes relacionados con la vía EMT se descargaban de MSigDB (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb). 7.3. Análisis de los datos de ChrRNA-seq Los experimentos de ChrRNA-seq que se realizaban, constan de dos replicas biológicas para cada condición, las cuales eran previamente filtradas usando el programa FASTQ toolkit (v1.0.0). Tras ello, se llevaba a cabo el alineamiento con el genoma de referencia de ratón mm9, usando para ello la función subjunc() del paquete de Bioconductor RSubread con las opciones TH1 = 2 y unique = TRUE, así, se seleccionaban aquellas lecturas que mapeaban en un único sitio de genoma. Los análisis posteriores se llevaban a cabo empleando los archivos alineados (bam), siendo éstos realizados por José Antonio Guerreo Martínez. Para la cuantificación de los PROMPTs, las lecturas del ChrRNA-seq se contaban 200 pb aguas arriba del TSS de los genes utilizando regionCounts(). MATERIALES Y MÉTODOS 61 7.4. Análisis de los datos de CUT&Tag Los experimentos que se realizaban de CUT&Tag, constan de dos replicas biológicas para cada condición, las cuales eran previamente filtradas usando el programa FASTQ toolkit (v1.0.0). Tras ello, se llevaba a cabo el alineamiento con el genoma de referencia de ratón mm9, usando para ello la función align() del paquete de Bioconductor RSubread con las opciones type=1, TH1 = 2 y unique = TRUE, indicando así que eran muestras de ADN y que solo mantuvieran aquellas lecturas que mapeaban en un único sitio del genoma. Los análisis posteriores se llevaban a cabo empleando los archivos alineados (bam), siendo éstos realizados por José Antonio Guerreo Martínez. Se utilizaba el paquete Shushi (v.1.16.0) para la visualización de datos. 7.5. Análisis de los datos de MNAsa-seq Los experimentos de MNAsa-seq, se realizaban mediante dos replicas biológicas para cada condición, las cuales eran previamente filtradas usando el programa FASTQ toolkit (v1.0.0). Tras ello, se llevaba a cabo el alineamiento con el genoma de referencia de ratón mm9, usando para ello la función align() del paquete de Bioconductor RSubread con las opciones type=1, TH1 = 2 y unique = TRUE, indicándose así que eran muestras de ADN y que solo mantuvieran aquellas lecturas que mapeaban en un único sitio del genoma . Los análisis posteriores se llevaban a cabo empleando los archivos alineados (bam). La cobertura se obtenía a partir de lecturas mapeadas usando Bedtools. La cobertura media se calculaba por región y los perfiles se suavizaban utilizando la función frollmean de R data.table, con una ventana deslizante de 10. Los demás análisis realizados se llevaban a cabo por José Antonio Guerreo Martínez. La predicción del posicionamiento del nucleosoma se realizaba utilizando el paquete Bioconductor nuCpos, utilizando parámetros predeterminados (Kato et al., 2021). 7.6. Análisis de los datos de ATAC-seq Los datos de ATAC-seq fueron procesados por José Antonio Guerrero Martínez como se describe en (Guerrero-Martinez et al., 2020). Resumidamente, se procesaban las lecturas de secuenciación de ATAC-seq de dos experimentos independientes (recortadas, alineadas, filtradas y con control de calidad) para cada condición de forma independiente, utilizándose el paquete de procesamiento del laboratorio de Kundaje (https://github.com/ENCODE-DCC/atac-seq-pipeline). Se utilizaba el análisis basado en modelos de ChIP-seq macs2 (v2.1.2) para identificar las regiones de pico con las MATERIALES Y MÉTODOS 62 opciones -B, -q 0.01–nomodel, -f BAM, -g mm9. Se utilizaba el método estadístico denominado Tasa de Descubrimiento Irreproducible o IDR (por sus siglas en inglés) para identificar picos reproducibles entre dos réplicas biológicas. Solo se conservaban los picos reproducibles entre las dos réplicas biológicas (con IDR ≤ 0,05) para los análisis posteriores. Luego, los picos para todas las condiciones de cada experimento se combinaban en una lista estándar. Luego se refinaban los conjuntos para cada condición. Todos los picos de menos de 150 pb se descartaban y los de menos de 1000 pb se fusionaron usando csaw (v1.12.0) (Lun & Smyth, 2015), obteniendo 44984. En todos los casos, las cumbres se recalculaban utilizando MACS2 refinepeak con opciones predeterminadas. Aquellos picos que se superponían con TSS +/- 1000 pb de cualquier transcrito de mm9 UCSC KnownGene, se consideraban TSSs, mientras que el resto se consideraban RRAs (Regiones Reguladoras Accesibles) usando bedtools (v.2.27.1). La correlación entre réplicas se calculaba usando multiBamSummary y plotCorrelation de deeptools (v3.1.3) usando opciones predeterminadas. 7.7. Análisis de enriquecimiento de motivos El análisis de enriquecimiento de motivos de unión se realizaba mediante FIMO (suite MEME). Como secuencia de fondo, las secuencias RRA se aleatorizaban 5 veces utilizando la función scrambleFasta.pl disponible en el software Homer. El enriquecimiento se calculaba como: Enr= (RRA[motivo]/RRA[total])/(RRA_bg[motivo]/RRA_bg[total]), donde RRA[motivo] es el número de RRA con una secuencia de unión a motivo específica; RRA[total] es el número de secuencias RRA totales; RRA_bg[motif] y RRA_bg[total] son RRA con una secuencia de unión específica o número total de RRA en el conjunto de secuencias de fondo. El valor q se calculaba utilizando Fisher.text() del paquete R stats. Los datos se filtraban con un enriquecimiento FC > 1.5 y un valor de p < 0.05 y se representaban en un gráfico de volcán. 7.8. Análisis de eventos de splincing La determinación del evento de splicing durante 6 y 30 horas de las condiciones de DMSO y BRM014 se realizaba con el paquete DEXSeq (Anders et al., 2012) para RStudio (R versión 4.0.5) con datos de RNA-seq. Después del alineamiento con STAR, mm9 GTF de ENSEML las lecturas se asignaron a listas de coordenadas MATERIALES Y MÉTODOS 63 correspondientes a los exones usando el paquete de programación dexseq_prepare_annotation.py de DEXSeq, y las lecturas se contaban usando el script dexseq_count.py con las opciones -p= yes y s= reverse. Los recuentos de lectura se cargaban en Rstudio y se creó un objeto DEXSeqDataSet a partir de los datos de recuento y la lista de exones generada, utilizando la función DEXSeqDataSetFromHTSeq() de DEXSeq. Se realizaba un análisis de uso de exón diferencial estándar utilizando la función DEXSeq() y los eventos se consideraban significativos cuando |FC| > 1 y p-adj < 0,05. La clasificación de eventos de splicing se realizaba utilizando las funciones findDEXexonType() y summariseExonTypes() del paquete GeneStructureTools R (Signal, 2022). La distancia TSS para las dos réplicas de las cuatro condiciones (6 y 30 horas de DMSO y BRM014) se determinaba utilizando el punto de referencia de la matriz de cálculo con las opciones -a= 100 -b= 100 - referencePoint= TSS. 7.9. Análisis estadístico Los análisis de datos estadísticos y gráficos se realizaron utilizando el software Prism 5, o Prism 9 (Graphpad) o el paquete R. Para determinar la importancia de las diferencias entre los grupos, se calculaban la prueba t de Student de dos colas con un intervalo de confianza del 95 %. La importancia de los enriquecimientos se calculaba con la prueba exacta de Fisher usando la función fisher.test() de R. Las probabilidades de superposición se calculaban usando la distribución hipergeométrica usando la calculadora en línea de Keisan (https://keisan.casio.com/exec/system/1180573201 ). Se consideraba que los datos eran estadísticamente significativos cuando el valor de p era menos de 0,05 en los análisis estadísticos aplicados. La línea negra horizontal del diagrama de cajas representaba el valor de la mediana, las cajas abarcaban los percentiles 25 y 75, y los bigotes indicaban los percentiles 5 y 95. RESULTADOS RESULTADOS 64 RESULTADOS 1. CARACTERIZACIÓN DEL INHIBIDOR DE LOS COMPLEJOS SWI/SNF (BRM014) EN LA LÍNEA NMuMG Hasta ahora no se había conseguido inactivar los complejos SWI/SNF por completo dada su complejidad y la gran cantidad de subunidades que lo forman. Recientemente, se ha desarrollado una nueva droga que inhibe la actividad ATPasa tanto de BRG1 como de BRM de forma específica y aparentemente sin afectar la actividad de otros miembros de la familia SNF2, denominada BRM014 (Iurlaro et al., 2021; Papillon et al., 2018; Schick et al., 2021). Antes de comenzar a trabajar con este nuevo inhibidor de los complejos SWI/SNF, nunca antes utilizado en nuestro modelo, la línea no cancerosa de epitelio mamario de ratón NMuMG (por las siglas en inglés, Normal Murin Mammary Gland), se llevó a cabo una caracterización general del mismo. Para ello se realizaron curvas de crecimiento a distintos tiempos y concentraciones, así como un análisis del ciclo celular y la apoptosis a distintos tiempos de tratamiento con la droga. 1.1. BRM014 provoca cambios en la proliferación celular Con el objetivo de determinar las condiciones óptimas de trabajo, así como conocer cómo afecta el uso de este inhibidor a las células NMuMG, se realizaron curvas de crecimiento. Para ello se tomaron puntos cada 24 horas durante 5 días a concentraciones creciente de BRM014: 0.5, 1, 2 y 10 μM; usando como control DMSO, vehículo en el cual va diluida la droga (Figura R1). El análisis de los datos demostró que BRM014 disminuye drásticamente la proliferación celular, siendo este efecto mayor conforme aumenta la concentración de la droga. Tras estos resultados y teniendo en cuenta los resultados en otras líneas celulares previamente publicados (Jagani et al., 2019) se eligió una concentración de 2 μM de BRM014 como tratamiento para todos los experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de esta tesis doctoral. Dado que la mayor parte de los experimentos se pretenden realizar a cortos tiempos elegimos una concentración relativamente alta esperando observan efectos rápidos. RESULTADOS 65 Figura R1. Curvas de crecimiento en la línea celular NMuMG tratada con BRM014. Curvas de crecimiento en la línea NMuMG tratada con concentraciones crecientes de BRM014 (0.5, 1, 2 y 10 μM) y DMSO como control. Los datos son el promedio de tres experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar. La significación con respecto al control (DMSO) se probó mediante el uso de la prueba de t de Student de dos colas. *p < 0.05; **p < 0.01.; ***p<0.001. 1.2. El ciclo celular no se ve fuertemente afectado por el tratamiento con BRM014 Continuando con la caracterización de BRM014 en este modelo, se determinó cómo afectaba la droga BRM014 (2 µM) al ciclo celular tras 0, 6 y 30 horas de tratamiento. Para ello las células fueron teñidas con ioduro de propidio y el contenido de ADN fue determinado mediante citometría de flujo. En este caso, no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de células en las diferentes etapas del ciclo, entre la condición control y la tratada con la droga, para cada uno de los tiempos dados. No obstante, sí se observó una acumulación de las células en G1 de más del 80% del total de las células contadas a las 30 horas de tratamiento, tanto con la droga como con el DMSO (Figura R2). Esto indica que el DMSO podría estar teniendo un efecto a este nivel, por lo que decidimos llevarlo como control para todos los experimentos presentados en esta tesis. RESULTADOS 66 Figura R2. Estudio del ciclo celular. Porcentaje de células NMuMG en fase G1, G2/M y S tras 0, 6 y 30 horas de tratamiento con BRM014 o DMSO como control. Se realizó mediante citometría de flujo. Los datos son el promedio de dos experimentos independientes. 1.3. Efecto de BRM014 en apoptosis celular Para complementar lo visto anteriormente, se estudió la apoptosis celular. Para ello se determinó mediante citometría de flujo la señal de ioduro de propidio, que aparece antes del pico correspondiente a G1 (sub-G1). Dicho estudio se realizó a tiempos 0, 6, 30, 48 y 72 horas de tratamiento con la droga o con DMSO. Se observó que, tras 6 horas de tratamiento, el BRM014 no provocaba ningún efecto en muerte celular. Después de 30 horas en presencia de la droga la muerte celular fue tan solo del 5%. Por el contrario, tratamientos más largos (48 o 72 horas) resultaban en un aumento progresivo de la apoptosis en comparación con la condición control, sin superar en ningún caso el 30% del total de las células contadas (Figura R3). Tras estos resultados, decidimos investigar el efecto en la cromatina y la expresión génica de BRM014 a una concentración de 2 μM y a dos tiempos diferentes, 6 horas y 30 horas. RESULTADOS 67 A RESULTADOS 68 Figura R3. Estudio de apoptosis. (A) Citometría de flujo de la línea celular NMuMG tratada con BRM014 o DMSO, como control, durante 0, 6, 30, 48 y 72 horas. Se muestran experimentos representativos. (B) El nivel de apoptosis se determinó tras 0, 6, 30, 48 y 72 horas de tratamiento con BRM014 o DMSO como control, midiendo el porcentaje de células que contenían ADN en subG1 mediante citometría de flujo. Los datos son el promedio de dos experimentos independientes. 2. EFECTO DE BRM014 EN LA ACCESIBILIDAD DE LA CROMATINA Y EN LA EXPRESIÓN GÉNICA Con objeto de determinar qué genes requieren de la actividad de los complejos SWI/SNF para su expresión génica, el primer paso de nuestro estudio fue investigar qué efecto tenía inhibir estos complejos sobre el transcriptoma de las células NMuMG en condiciones normales de proliferación. 2.1. Modificaciones de la expresión génica debido a BRM014 Con el fin de investigar la lógica molecular de la actividad SWI/SNF en mamíferos y sus dianas genómicas, hemos utilizado el inhibidor BRM014 en NMuMG. Las células NMuMG se trataron durante 6 o 30 horas con BRM014 o con el vehículo DMSO, como control, y el transcriptoma se analizó utilizando experimentos duplicados de RNA-seq y RNA-seq asociado a cromatina (ChrRNA-seq). El ChrRNA-seq es una técnica que permite analizar el ARN asociado a la cromatina, el cual está constituido principalmente por ARN naciente asociado a RNAPII en elongación, así como transcritos que no han completado el proceso de splicing o bien RNAlncs con funciones nucleares (Bhatt et al, 2012; Wuarin & Schibler, 1994). Las librerías y posterior secuenciación se realizaron en B RESULTADOS 75 Figura R8. Análisis de los genes expresados diferencialmente en la línea mESC mediante Ontología génica (GO). Categorías de Proceso Biológico enriquecidas entre los genes expresados diferencialmente regulados negativamente (izquierda) y regulados positivamente (derecha) tras el tratamiento con BRM014 durante 24 horas en la línea mESC. Los datos sin procesar de mESC se descargaron de GEO referencia GSE158345 (Iurlaro et al., 2021). Estos resultados nos hicieron sospechar que los genes de mantenimiento (en inglés, housekeeping genes) podrían no depender de los complejos SWI/SNF. Los genes de “mantenimiento” son genes constitutivos que se expresan en todos los tejidos, siendo necesarios para el mantenimiento de las funciones básicas de las células y, por lo tanto, en general, se asocian con promotores con cromatina muy accesible (Hounkpe, Chenou, de Lima, & de Paula, 2021). Como muestran los diagramas de Venn de la Figura R9, tanto en las NMuMG como en células troncales de ratón, la gran mayoría (más del 98%) de los genes de mantenimiento (3277 genes según lo definido por Hounkpe et al, 2021 (Hounkpe et al., 2021)) no fueron afectados por el compuesto BRM014 y los consideramos independientes de SWI/SNF. RESULTADOS 76 Figura R9. Solapamiento entre los genes de “mantenimiento” y los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. (A) Solapamiento entre genes de “mantenimiento” según lo definido por (Hounkpe et al., 2021) y genes dependientes o independientes de la actividad SWI/SNF, tras 6 horas de tratamiento con BRM014 (panel superior) o 30 horas de tratamiento con BRM014 (panel inferior), en la línea NMuMG. (B) Solapamiento entre genes de “mantenimiento” según lo definido por (Hounkpe et al., 2021) y genes dependientes o independientes de la actividad SWI/SNF, tras 24 horas de tratamiento con BRM014, en la línea mESC. (A, B) También se indica el porcentaje de genes de “mantenimiento” coincidentes con los genes dependientes o independientes de SWI/SNF, el enriquecimiento con respecto a los valores esperados aleatoriamente y la probabilidad del resultado (p) suponiendo una distribución hipergeométrica. Los datos sin procesar de mESC se descargaron de GEO referencia GSE158345 (Iurlaro et al., 2021). A B RESULTADOS 77 2.1.1. Características cromatínicas de los pormotores de los genes dependientes o independientes de SWI/SNF Con el objetivo de comprender el motivo de por qué unos genes son dependientes de la actividad de SWI/SNF y otros no, decimos analizar las características transcripcionales y de cromatina asociadas a los promotores de todos los genes expresados en condiciones normales de cultivo, clasificados en aquellos que aumentan su expresión (activados), la disminuyen (reprimidos) y los que no la cambian (Noregulados) tras 6 o 30 horas de tratamiento con BRM014. Para ello se utilizaron datos de accesibilidad (determinados mediante ATAC-seq) y de modificaciones postraduccionales de histonas asociadas a la activación, como H3K4me3 y H3K27Ac (determinados mediante ChIP-seq) en células NMUMG en condiciones normales de cultivo, previamente obtenidos en nuestro grupo (Guerrero-Martínez et al., 2020). Para tener datos de una modificación postraduccional represiva, llevamos a cabo experimentos de CUT&Tag con un anticuerpo que detecta la modificación H3K27me3 introducida por el complejo PRC1 (Polycomb repressive complex 1), más conocido como complejo Polycomb. El ADN inmunoprecipitado se secuenció en la Unidad de Genómica de CABIMER. Las lecturas se procesaron como se indica en el apartado Materiales y Métodos. La Figura R10A muestra mapas de calor y gráficos de densidad alrededor de los sitios de inicio de la transcripción (TSS) de los genes indicados. Coincidiendo con lo indicado en el apartado anterior, los genes que disminuían su expresión tras el tratamiento y tienen de partida medios/bajos niveles de mRNA, tienen TSSs poco accesibles y presentan bajos niveles de modificaciones postraduccionales de histonas asociadas a la activación, como H3K4me3 y H3K27Ac (Figuras R10A y R10B). A su vez, los genes que se inducían, se expresan muy poco y tienen los TSSs poco accesibles, pero en este caso poseen altos niveles de la marca represora, H3K27me3, y bajos niveles de las marcas de activación, H3K4me3 y H3K27Ac. Por el contrario, los genes que no se ven afectados por BRM014, y que, por tanto, no dependen de los complejos SWI/SNF, se expresan mucho de media y en relación a los anteriores, tienen los TSSs mucho más accesibles y son genes muy activos ya que tienen altos niveles de H3K4me3 y H3K27Ac, y bajos niveles de H3K27me3. Nuestro análisis de los datos publicados por Iurlaro et al. en mESC tratadas con BRM014 (Iurlaro et al., 2021) muestra resultados muy similares para los genes dependientes o independientes de la actividad de SWI/SNF en esta línea celular, corroborando nuestros resultados (Figura R10C). RESULTADOS 78 RESULTADOS 79 Figura R10. Características cromatínicas de la región TSS, en ausencia de BRM014, para los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. (A) Mapa de calor que muestra, en condiciones normales de cultivo, accesibilidad (datos de ATAC-seq), señales H3K4me3, H3K27ac (datos de ChIP-seq) y H3K27me3 (datos de CUT&Tag), señal de RNA-seq asociada a cromatina (datos de ChrRNA-seq) y porcentaje C+G de regiones TSS de genes regulados al alza, a la baja o no regulados por inhibición de SWI/SNF durante 6 horas (panel superior) o 30 horas (panel inferior). También se muestra el cambio de los niveles de transcritos (Log2(FC), tras el tratamiento con BRM014 durante 6 horas (panel superior) o 30 horas (panel inferior). El número de genes para cada condición se muestra a la izquierda de cada panel. (B) Gráficas de densidad que muestran la cobertura media, en condiciones normales de cultivo, de accesibilidad (datos de ATAC-seq), H3K4me3, H3K27ac (datos de ChIP-seq) y H3K27me3 (datos de CUT&Tag) alrededor de las regiones TSS de genes regulados al alza, a la baja o no regulados por la inhibición de SWI/SNF durante 6 horas (panel izquierdo) o 30 horas (panel derecho). (C) Gráficas de densidad que muestran la cobertura, en condiciones normales de cultivo, de accesibilidad (datos de ATAC-seq), H3K4me3, H3K27Ac y H3K27me3 (datos de ChIP-seq) alrededor de las regiones TSS de genes regulados al alza, a la baja o no regulados por la inhibición de SWI/SNF durante 24 horas en mESC. Los datos sin procesar de mESC se descargaron de GEO referencia GSE158345 (Iurlaro et al., 2021). A continuación, determinamos la ocupación nucleosomal de los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. Para ello llevamos a cabo experimentos de secuenciación de los fragmentos mononucleosomales producidos por una digestión de la cromatina con nucleasa micrococal (MNase-seq) en células no tratadas con BRM014. Se ha descrito anteriormente (Mavrich et al., 2008) que la ocupación media de nucleosomas en TSSs de genes transcripcionalmente activos tiene un patrón muy distintivo con una región clara libre de nucleosomas (NFR) la cual se superpone al TSS, y nucleosomas flanqueantes +1 y -1 aguas abajo y aguas arriba de la NFR, respectivamente. Por el contrario, los genes inactivos exhiben un perfil mucho menos periódico indicando que los nucleosomas están poco posicionados, y estando la NFR ocupada por nucleosomas. Para verificar esto en nuestro experimento, se representó el patrón de ocupación nucleosomal medio de todos los genes que se expresan en la línea NMuMG frente a aquellos que no se expresan, en condiciones normales de cultivo, observándose claramente la NFR para aquellos genes que se expresan y la ausencia de la misma para aquellos genes que no se expresan. Este resultado confirma que el experimento de MNasa-seq se realizó correctamente (Figura R11). RESULTADOS 80 Figura R11. Ocupación nuclesomal alrededor del TSS de genes activos e inactivos. Gráfico que muestra la ocupación nucleosomal, en condiciones normales de cultivo, alrededor de las regiones TSS de genes transcripcionalmente activos o inactivos, en la línea NMuMG. Datos obtenidos a partir de MNAse-seq. A continuación, comparamos la ocupación nucleosómica en condiciones normales de cultivo, de los genes activos independientes y dependientes de SWI/SNF. Curiosamente, los TSSs de los genes dependientes de SWI/SNF tenían un patrón poco periódico sugiriendo que los nucleosomas están menos posicionados y mostraban una NFR menos pronunciada que los independientes de SWI/SNF (Figura R12A). Se obtuvieron resultados similares cuando se analizaron datos de la línea mESC (Figura R12B). Estos datos son consistentes con la accesibilidad limitada del TSS de genes dependientes de SWI/SNF anteriormente descrita (Figura R10). También de acuerdo con estos datos, la predicción del posicionamiento nucleosomal basado en la secuencia utilizando el software nuCpos (Kato et al., 2021), demostró que los promotores de genes regulados a la baja por BRM014 presentan una mayor tendencia a posicionar los nucleosomas en la región TSS que los promotores de genes regulados al alza o independientes de SWI/SNF (Figura R12C). RESULTADOS 81 Figura R12. Ocupación nucleosomal alrededor del TSS de genes dependientes e independientes de SWI/SNF. (A, B) Ocupación nucleosomal, en condiciones normales de cultivo, alrededor de las regiones TSS de genes regulados al alza, a la baja o no regulados por la inhibición de SWI/SNF, en la línea NMuMG (A) o en la línea mESC (B). Datos obtenidos a partir de MNase-seq. Los datos sin procesar de mESC se descargaron de GEO referencia GSE158345 (Iurlaro et al., 2021). (C) Tendencia a posicionamiento nucleosomal basada en la secuencia. Puntuación media de afinidad de unión a histonas de las regiones TSS de genes regulados al alza, a la baja o no regulados por la inhibición de la actividad SWI/SNF. La predicción de tendencia al posicionamiento nucleosomal realizada utilizando el software nuCpos (Kato et al., 2021). La significación de las diferencias entre las distribuciones indicadas se determinó utilizando la prueba de t de Student de dos colas. *** p <0.001. RESULTADOS 82 También se realizó una búsqueda de motivos típicos de promotores en los TSSs de los genes dependientes o no de SWI/SNF. Los TSS de los genes que bajan su expresión con BRM014, presentan bajos porcentajes de guanina y citosina (%GC) (Figura R10A) y un elevado enriquecimiento de motivos de secuencia “TATA” (Figura R13), mientras que no se encontraron enriquecimientos de otros motivos típicos de promotores. El alto porcentaje de “GC” es característico, aunque no excluyente, de los genes de mantenimiento, lo cual es consistente con el hecho de que estos genes no son dependientes de SWI/SNF. Figura R13. Enriquecimiento en cajas TATA. Enriquecimiento de caja TATA en los promotores de genes regulados al alza, a la baja o no regulados por la inhibición de SWI/SNF. La similitud de características cromatínicas entre los TSSs de los genes dependientes de SWI/SNF en NMuMG y mESC nos llevó a investigar si se trataba de los mismos genes. Mediante un diagrama de Venn (Figura R14) se representaron los genes que cambian su expresión tras el tratamiento con BRM014 y que, por lo tanto, son dependientes de SWI/SNF, para la línea NMuMG y la línea de mESC. Muy pocos genes eran coincidentes entre ambas líneas celulares (alrededor de un 10%). Esto indica que la identidad de los genes dependientes de SWI/SNF es diferente para cada tipo celular, pese a que sus características cromatínicas son similares. RESULTADOS 83 Figura R14. Solapamiento de los genes regulados por SWI/SNF en la línea NMuMG y mESC. Diagrama de Venn donde se superponen los genes expresados diferencialmente tras la inhibición de la actividad SWI/SNF en células NMuMG y mESC. En resumen, nuestro análisis sugiere que la actividad SWI/SNF es necesaria para la expresión de genes de señalización y desarrollo, los cuales son diferentes según la línea celular, pero todos ellos presentan promotores no muy fuertes que con frecuencia contienen cajas “TATA” y nucleosomas poco posicionados. Por el contrario, estos complejos serían prescindibles para genes de mantenimiento con promotores altamente activos y nucleosomas bien posicionados. 2.2. Cambios en la accesibilidad de la cromatina tras el tratamiento con BRM014 Decidimos explorar más en profundidad los cambios que se producen en la accesibilidad de la cromatina tras la inhibición de la actividad de SWI/SNF. En la bibliografía ya se ha descrito un cierre masivo de la cromatina tras el tratamiento con BRM014 (Iurlaro et al., 2021; Schick et al., 2021), sin embargo, en estos artículos no se describe con claridad qué regiones se afectan y cuales no se afectan por el inhibidor. Por ello, quisimos caracterizar en detalle el efecto del inhibidor sobre la accesibilidad de nuestro modelo. Para eso, realizamos ATAC-seq en células NMuMG tratadas con DMSO (control) o BRM014 durante 6 o 30 horas. BRM014 provocó una disminución de la accesibilidad en tan solo alrededor del 2,5% (249) y el 10% (1161) de los TSSs accesibles (9896) después de 6 y 30 horas de tratamiento con BRM014, respectivamente. En claro contraste, la accesibilidad aumentó en solo 34 y 3 TSSs después de 6 y 30 horas de tratamiento con BRM014, respectivamente (Figura R15A). Por lo tanto, aproximadamente el 90% de los TSSs fueron en gran medida insensibles a BRM014, RESULTADOS 84 incluso después de 30 horas de tratamiento. Si bien la mayoría de los TSS con accesibilidad disminuida correspondían a genes regulados negativamente por BRM014 (Figura R15A), aproximadamente 2/3 y 1/3 de los genes regulados negativamente en los puntos de tiempo de 6 h y 30 h, respectivamente, no presentaron una disminución significativa de accesibilidad en sus promotores. De manera similar, los genes regulados al alza por BRM014 no mostraron cambios significativos en la accesibilidad. A continuación, mapeamos el resto de regiones accesibles no TSS detectadas en el ATAC-seq (35088), las cuales denominaremos a partir de ahora como elementos regulatorios distales en cis (en inglés, distal cis-regulatory elements, dCREs). Alrededor del 30% (10389) y el 54% (19027) de estas regiones mostraron una disminución de la accesibilidad 6 y 30 horas después de la inhibición de SWI/SNF, respectivamente (Figura R15B). Mientras que, aproximadamente el 6% (2071) y el 1,5% (552) de dCREs mostraron un aumento de la accesibilidad 6 y 30 horas después de la inhibición de SWI/SNF, respectivamente (Figura R15B). Para intentar comprender las características de las regiones sensibles o insensibles al inhibidor, quisimos comprobar las características cromatínicas en condiciones normales de cultivo, previo al tratamiento con BRM014, de todos estos dCREs, utilizando para ello los datos de accesibilidad (ATAC-seq) y de modificaciones postraduccionales de histonas asociadas a enhancers activos (H3K4me1 y H3K27Ac) o reprimidos (H3K27me3) previamente obtenidos en el grupo (Guerrero-Martínez et al., 2020) o en esta tesis. De esta manera, los dCREs que disminuyen su accesibilidad tras el tratamiento con el inhibidor mostraron de partida niveles más altos de señal ATAC-seq, H3K27Ac, H3K4me1 y niveles más bajos de señal H3K27me3, que los dCREs no afectados o los que aumentan su accesibilidad (Figura R15C). Estos dCREs estaban muy enriquecidos en sitios de unión de los factores de transcripción FOXA1, HNF4a, HNF1, KLF4, RREB1, CEBP, RXR; todos ellos factores de transcripción específicos de enhancers bien conocidos (Figura R15D). Lo cual sugiere que estos dCREs se corresponden con enhancers activos. Por otro lado, los dCREs que aumentaron su accesibilidad tras el tratamiento con BRM014 mostraron, en condiciones normales de cultivo, una señal muy baja de ATAC- seq y de la marca activadora H3K27Ac. Por el contrario, se detectó en todos ellos una señal significativa de H3K4me1, aunque más baja que para los dCREs que pierden accesibilidad o los independientes de BRM014. Además, aquellos elementos que mostraron un aumento de la accesibilidad tras 6 horas de tratamiento con BRM014 también presentaron, en condiciones normales de cultivo, altos niveles de H3K27me3. RESULTADOS 91 2.2.2. Ocupación nucleosomal de los dCREs tras la inhibición de SWI/SNF Dado que es conocido que los complejos SWI/SNF son remodeladores de la cromatina, que modifica la accesibilidad de la cromatina mediante el deslizamiento de nucleosomas a lo largo del ADN, eliminando alguno de los componentes de los nucleosomas o eliminando directamente el nucleosoma completo (Clapier et al., 2017), quisimos conocer cómo BRM014 afectaba a la ocupación nucleosomal de los dCREs, ya que se ha descrito en el apartado anterior, que un gran número de estos elementos cambian su accesibilidad tras el tratamiento con el inhibidor. Para ello, se determinó la ocupación nucleosomal en células tratadas con DMSO (como control) y en aquellas tratadas durante 6 y 30 horas con BRM014 mediante MNase-seq. Como se muestra en la Figura R18A, la zona central de aquellos dCREs que perdieron accesibilidad quedó ocupada de manera muy significativa por nucleosomas tras 6 y 30 horas de tratamiento con el inhibidor, lo cual explica dicha disminución de la accesibilidad a los mismos. También de acuerdo con estos datos, la predicción del posicionamiento nucleosomal basado en la secuencia utilizando el software nuCpos (Kato et al., 2021), demostró que los dCREs cuya accesibilidad se ve afectada con la inhibición de SWI/SNF presentan una mayor tendencia a posicionar los nucleosomas que aquellas cuya accesibilidad no se ve afectada (Figura R18B). Resultados similares se obtuvieron con los datos de mESC de Iurlaro et al. (Iurlaro et al., 2021) (Figura R18C). En la Figura R18D se muestran algunos ejemplos de ocupación nucleosomal en dCREs seleccionados al azar tras el tratamiento con BRM014. RESULTADOS 92 Figura R18. Ocupación nucleosomal de los dCREs tras tratamiento con BRM014. (A) Ocupación de nucleosomas (obtenida de MNasa-seq) de dCREs que pierden accesibilidad tras la inhibición de SWI/SNF. Se muestran los datos de las células tratadas con DMSO (control) o BRM014 durante 6 o 30 horas en la línea NMuMG. La ocupación del nucleosoma se determinó en el pico ATAC-seq (centro) ± 1 kb. (B) Puntuación media de afinidad de unión a histonas de los dCREs cuya accesibilidad aumenta, disminuye o no cambia por la inhibición de la actividad SWI/SNF, en la línea NMuMG. La puntuación se calculó utilizando el software nuCpos (Kato et al., 2021). La significación de las diferencias entre las distribuciones indicadas y la de los dCREs no afectados se determinó utilizando la prueba de t de Student de dos colas. *** p <0.001. (C) Ocupación de nucleosomas (obtenida de MNasa-seq) de los dCREs que pierden accesibilidad tras la inhibición de SWI/SNF. Se muestran los datos de las células tratadas con DMSO (control) o BRM014 durante 24 horas, en la línea mESC. La ocupación del nucleosoma se determinó en el pico ATAC-seq (centro) ± 1 kb. Los datos de ATAC-seq y MNAsa-seq se obtuvieron de GSE158345 (Iurlaro et al., 2021). (D) Señal de ATAC-seq y MNasa-seq de tres ejemplos de dCREs que pierden accesibilidad tras la inhibición de SWI/SNF. Los números de abajo se corresponden con las coordenadas cromosómicas. RESULTADOS 93 Todos estos datos indicaron que, si bien la mayoría de los TSSs eran independientes de SWI/SNF, una gran parte de los enhancers eran muy sensibles a la inhibición de los complejos, lo que sugiere que el papel de SWI/SNF en el control de la expresión génica en los mamíferos se debe principalmente a su acción sobre los enhancers, siendo estos complejos muy importantes para el mantenimiento y control de la estructura nucleosómica de los mismos. 2.3. Papel de los complejos SWI/SNF en splicing Ya se ha relacionado anteriormente a BRG1 y BRM con el proceso de maduración del ARN (en inglés, splicing) (Batsché et al., 2006; Gañez-Zapater et al., 2022; Tyagi et al., 2009; Yu et al., 2018). Por ello, nos planteamos la posibilidad de que el splicing alternativo pudiera verse afectado por el inhibidor BRM014. Para investigarlo, determinamos el uso diferencial de exones (en inglés, differential exon usage (DEU)), independientemente de los cambios en el nivel de expresión génica, utilizando el software DEXSeq (Anders et al., 2012). El tratamiento con BRM014 durante 6 horas causó 203 eventos de DEU (valor de p ajustado < 0,05 y |log2FC| > 1), con 59 regulados a la baja y 144 regulados al alza; mientras que el tratamiento durante 30 horas provocó 293 DEU, con 113 regulados a la baja y 179 regulados al alza (Figura R19). Seguidamente, llevamos a cabo una mayor caracterización de dichos eventos. El análisis del tipo de eventos identificados por el programa demostró que en el 83 % (168) y el 60 % (174) de los DEUs a 6 y 30 horas, respectivamente, estaban relacionados con el uso de un TSS alternativo (Figura R20), por lo que no se trataban realmente de defectos de splicing. Figura R19. Eventos de splincing tras tratamiento con BRM14. Diagramas de volcán que muestran el resultado de un uso de exón diferencial (DEU) en células NMuMG tratadas con BRM014 o DMSO (como control), durante 6 horas (izquierda) o 30 horas (derecha). Los DEU que cambian significativamente (valor de P ajustado <0.05 y | log2(fc) |> 1) se representan en RESULTADOS 94 azul (los que bajan) o rosa (los que suben). Los números dentro de los gráficos indican el número de DEU que bajan o que suben Figura R20. Tipos de cambios de splicing. (A) Gráfico de sectores que muestra los tipos de eventos alternativos que produjeron DEU al comparar DMSO, como control, con el tratamiento con BRM014 durante 6 horas (panel izquierdo) o 30 horas (panel derecho), en la línea NMuMG. Por otro lado, como ya se ha comentado anteriormente, se ha relacionado a los complejos SWI/SNF con procesos de splicing alternativo. Sin embargo, nuestros datos no mostraron un defecto general en la eficiencia de splicing alternativo, detectando un pequeño número de eventos de uso alternativo de exones (28%) y retención de intrones (3%), en aproximadamente 60 genes. Un ejemplo claro de splicing alternativo, sería el gen Cd44. Nuestros datos no mostraron ninguna alteración de corte y empalme en la transcripción de Cd44 con el tratamiento con BRM014 (Figura R21), lo que es consistente con los resultados de Batsche et al., donde se mostró que la mutación del dominio ATPasa de Brm no afecta al proceso de splicing alternativo de dicho gen (Batsché et al., 2006). RESULTADOS 95 Figura R21. Splincing alterativo en el gen Cd44. Captura de imagen del programa IGV que muestra que no cambia la expresión de los exones alternativos del gen Cd44, en células NMuMG tratadas con BRM014 o DMSO durante 6 o 30 horas. Se muestran las dos réplicas de cada condición. 2.4. Papel de SWI/SNF sobre la regulación de la región libre de nucleosomas de los promotores. Como hemos visto en el apartado anterior el análisis con el programa DEXSeq reveló la aparición o desaparición de un número elevado de TSS alternativos. A continuación, quisimos profundizar más en conocer a qué se debían estos cambios que afectaban a los promotores, para poder determinar así la función de los complejos SWI/SNF dichos elementos. 2.4.1. Cambios en la preferencia del sitio de inicio de la transcripción En primer lugar, analizamos en detalle todos los eventos DEU asociados al uso de un TSS alternativo cuya expresión aumenta o disminuye tras es tratamiento con BRM014. Así, todos los DEU regulados al alza (97 y 116 DEU en los puntos de tiempo de 6 y 30 horas, respectivamente) incluían un primer exón alternativo con 5'UTR más largo, lo que revela una tendencia de la ARN polimerasa II a comenzar la transcripción dentro de la región libre del nucleosoma en presencia de BRM014. Además, mediante un gráfico de densidad (Figura R22A). de todos los genes expresados se observó de nuevo la presencia de un inicio alternativo con un 5’UTR más largo, con una diferencia de 5 pares de bases (pb) de media, lo que demuestra que la ausencia de SWI/SNF altera el inicio de la transcripción Esto se volvió a confirmar para casos concretos mediante la visualización directa de las lecturas con el programa IGV, encontrándose numerosos ejemplos en los que el origen de transcripción está adelantado (Figura R22B-C). Seguidamente, verificamos mediante RT-qPCR, un aumento en los niveles de 5´UTR largo en los genes Cd44, Lgals9, Spp1 y Clu en presencia de BRM014. Para ello se diseñaron dos pares de oligonucleótidos cebadores, uno que reconoce tanto los transcritos largos como los cortos (denominado amplicón proximal) y otro que reconoce los transcrito más largos (denominado amplicón distal), como se muestra en el esquema de la Figura R22D. El transcrito más largo está presente mayoritariamente en las condiciones de tratamiento con el inhibidor. RESULTADOS 96 Finalmente, se representó el cociente de los niveles del transcrito más largo entre el más corto, mostrándose en todos los casos un aumento de los niveles relativos del transcrito más largo en las condiciones 6 y 30 horas de tratamiento con BRM014 (Figura R22B). No obstante, se trata de valores muy bajos, ya que, en todos los casos, el transcrito largo se expresa pobremente en comparación con el transcrito corto, como se puede observar en las imágenes del IGV (Figura R22B-C), o en los cocientes entre el nivel del amplicón distal versus el proximal (Figura R22D). RESULTADOS 97 Figura R22. Uso de TSSs alternativos tras el tratamiento con BRM014. (A) Lectura de la distribución de densidad alrededor del TSS de todos los genes expresados, utilizando las dos réplicas de los experimentos de RNA-seq de células NMuMG tratadas durante 6 y 30 horas con BRM014 o 6 y 30 horas con DMSO. (B)(C) Capturas de imágenes del programa IGV de la región 5´UTR de cinco genes seleccionados, las cuales muestran lecturas simples de experimentos de secuenciación de ARN (RNA-seq) de células NMuMG tratadas con BRM014 o DMSO, durante 6 horas. Los TSSs alternativos anotados se muestran en la parte superior. (D) Determinación mediante RT-qPCR de la proporción del transcrito 5´UTR largo frente al transcrito 5´UTR corto del ARNm, de cuatro genes seleccionados con uso alternativo de TSS. En la parte superior se muestra un esquema donde se indica la posición de los amplicones distales y proximales utilizados para la qPCR. Los datos son el promedio de tres experimentos independientes. La significación con respecto al control (DMSO) se probó mediante el uso de la prueba de t de Student de dos colas. *p < 0.05; **p < 0.01.; ***p<0.001. Todo esto plantea la posibilidad de que inhibir la actividad de los complejos SWI/SNF produzca pequeños cambios en el nucleosoma +1 cuyo desplazamiento hacia el interior de la NFR obligue a un inicio alternativo de la RNA polimerasa II. Resultados similares han sido publicados tanto en Saccharomyces cerevisiae como en la planta Arabidopsis thaliana (Clapier et al., 2017; Masliah-Planchon et al., 2015). Se pudo observar que el uso de TSSs alternativos a menudo estuvo acompañado por una mayor ocupación nucleosomal de la NFR de los genes correspondientes (Figura R23). Es importante destacar que de los 97 y 116 genes con 5´UTR más largos en los puntos de tiempo de 6 h y 30 h, respectivamente, solo 9 y 20 presentaron niveles más bajos de expresión en el tratamiento BRM014, lo que indica poca superposición entre los genes expresados diferencialmente y los genes con 5´UTR más largas. De hecho, muchos genes con 5'UTR más largos en presencia de BRM014 tienen un promotor de tipo II, como Tuba1a, RESULTADOS 98 Cav1, Tk1, Eno1, etc. (Figura R22C). Estos resultados sugieren que en ciertos genes con fuertes promotores de tipo II, la actividad SWI/SNF no es necesaria para mantener el promotor abierto, pero su inhibición provoca la retracción de TSS posiblemente por desestabilización del nucleosoma +1. Figura R23. Ocupación nucleosamal del nucleosoma +1. Ocupación nucleosomal obtenida a partir de los datos de MNasa-seq de dos ejemplos de genes con uso alternativo de TSS tras tratamiento con DMSO, como control, o inhibición de SWI/SNF durante 6 o 30 horas. Se indica la posición del nucleosoma +1. Seguidamente, se analizaron los eventos de TSS alternativo cuya expresión baja, donde la mayoría de ellos (42 y 58 DEU en los puntos de tiempo de 6 y 30 horas, respectivamente), correspondían a la represión de TSS alternativos apenas utilizados dentro de los cuerpos del gen (consulte las Figuras R24A-C) para ver tres ejemplos), que, de hecho, tuvo poco efecto en el nivel total de ARNm del gen correspondiente (solo 7 y 9 genes con TSS alternativos disminuidos mostraron una reducción significativa de la expresión génica a las 6 y 30 horas, respectivamente). Además, cabe destacar que, todos ellos se expresan muy poco en condiciones normales de cultivo y forman parte de genes con alta tasa de expresión Ello podría sugerir que se trataría de promotores con características SWI/SNF-dependiente, dentro de un gen cuyo promotor principal sería SWI/SNF-independiente. RESULTADOS 99 RESULTADOS 100 Figura R24. Ejemplos de TSSs que disminuyen su expresión. (A)(B)(C) Captura de imagen del programa IGV que muestra la disminución del uso de TSSs alternativos, en tres genes seleccionados, en células NMuMG tratadas con BRM014 o DMSO durante 6 o 30 horas. Todas las transcripciones anotadas que se localizan en dichas regiones se muestran en la parte inferior. Así, nuestros datos sugieren que en algunos genes SWI/SNF tiene un papel en el control de TSS alternativos, si bien cuantitativamente esta regulación tiene pocas consecuencias en la expresión génica. 2.4.2. Papel de los complejos SWI/SNF sobre la transcripción antisentido del promotor Ya hemos descrito en apartados anteriores que la actividad SWI/SNF en mamíferos es necesaria, al menos en algunos TSSs, para mantener la integridad de la NFR. Ello nos hizo plantear la posibilidad de que también pudiera afectar en sentido contrario, durante el proceso conocido como transcripción antisentido que origina ARNs cortos no codificantes, también llamados PROMPTs (del inglés, Promoter Upstream Transcripts) o uaARNs (del inglés, Upstream Antisense RNAs) (Andersson et al., 2015). Se ha descrito que los complejos SWI/SNF tienen un papel importante en el mantenimiento del nucleosoma +1 y -1 en Arabidopsis y levaduras, concretamente en levaduras se ha mostrado que el complejo RSC mantiene inhibida la transcripción antisentido en aquellos genes que presentan transcripción divergente (Diego-Martin et al., 2022; Klein- Brill et al., 2019; Wu et al., 2022). Por lo tanto, decidimos investigar si la inhibición de SWI/SNF en mamíferos causaba una alteración en los niveles de los PROMPTs. El ARN asociado a la cromatina está enriquecido en transcritos nacientes, por lo tanto, utilizamos estos datos, procedentes del ChrRNA-seq, para realizar gráficos de densidad de cobertura de todos los genes expresados en la línea NMuMG (Figura R25A). Este análisis mostró un pequeño aumento de expresión de los PROMPTs tras el tratamiento con BRM014. A continuación, realizamos un análisis diferencial de los niveles de PROMPTs. Con un valor de p ajustado < 0,05 y un |log2FC| > 1, se observó un aumento de la expresión de los PROMPTs para 265 y 251 genes tras 6 y 30 horas de tratamiento con BRM014, respectivamente. Por el contrario, disminuyó la expresión de PROMPTs para 20 y 87 genes tras 6 y 30 horas de tratamiento con BRM014, respectivamente. La Figura R25B muestra mediante un mapa de calor la región TSS más 500 pb aguas arribas y aguas abajo del TSS para cada uno de los PROMPTs diferencialmente expresados. RESULTADOS 107 adición de TGFβ ó vehículo (como control) durante 2 o 24 horas. Las librerías y posterior secuenciación se realizaron en la unidad de Genómica de CABIMER (CABIMER, Sevilla). Tras el alineamiento, y conteo de las lecturas, se analizaron aquellos genes que contenían ≥ 0.5 CPM. Para comprobar la reproducibilidad entre las réplicas y las diferencias entre ellas se realizó un análisis de componentes principales, mediante un diagrama MDS (Figura R28). Figura R28. Análisis de componentes principales. Diagrama MDS donde se lleva a cabo un análisis de componentes principales. Se muestra la reproducibilidad entre las réplicas, así como las diferencias entre las distintas condiciones. Dicho análisis de ha realizado para el experimento de RNA-seq de células NMuMG tratadas con BRM014 a las que se les indujo la EMT mediante la adicción de TGFβ. A la derecha del gráfico se muestra la leyenda. Seguidamente se llevó a cabo un análisis de expresión diferencial. En un diagrama MA se representa el Log2(FC) de los resultados de dicho análisis frente al valor medio de expresión de los genes. En el gráfico se muestra que con un valor de p ajustado < 0,05 y un |log2FC| > 1, en ausencia de BRM014, tras 2 y 24 horas en presencia de TGFβ aumentan su expresión 241 y 1237 genes, respectivamente; mientras que disminuyen su expresión 121 y 1238 genes, respectivamente. En cambio, en presencia de BRM014, tras 2 y 24 horas con TGFβ, tiene lugar un incremento de la expresión de 288 y 481 genes, respetivamente; y una disminución de la expresión de 92 y 518 genes, respectivamente. Por lo tanto, se observan efectos del inhibidor sobre la expresión génica sobre todo a 24 horas con TGFβ, donde en presencia de BRM014 un menor número de genes cambian su expresión (Figura R29A). Ello se confirmó en el diagrama de cajas y bigotes de la Figura R29B, donde se observa que la subida o la bajada de expresión provocada por el TGFb es menor en la condición BRM014 (+) con respecto a la condición ausente de inhibidor BRM014 (-), siendo esto más evidente tras 24 horas de tratamiento con TGFβ. Tras ello, se realizó un mapa de calor empleando para ello RESULTADOS 108 una lista de genes ya definida donde se incluyen la mayoría de los genes implicados en EMT, conocida en inglés como EMT-HALLMARK GENES (lista descargada de la base de datos GSEA) (Figura R29C). En éste se muestra de nuevo que un gran número de estos genes no cambian su expresión tras 2 y 24 horas de tratamiento con TGFβ en presencia del inhibidor, siendo más evidente para la condición 24 horas. RESULTADOS 109 Figura R29. Cambios de expresión de genes involucrados en EMT en células tratadas con BRM014. (A) Gráficos MA que muestran resultados del análisis de expresión diferencial entre la línea NMuMG tratada con DMSO (como control) (paneles izquierdos) o BRM014 (paneles derechos) durante 6 horas, previo a la inducción por TGFβ durante 2 (paneles superiores) o 12 horas (paneles inferiores). Los genes cuya expresión cambia significativamente (valor de P ajustado <0.05 y |log2FC|> 1) se representan en verde (regulado a la baja) o rojo (regulado al alza). Los números dentro de los gráficos indican genes regulados negativa o positivamente. (B) Representación del diagrama de cajas y bigotes del cambio en los niveles de ARNm (RNA-seq) de genes regulados al alza (rojo) o a la baja (verde) durante la EMT inducida durante 2 (panel izquierdo) o 24 horas (panel derecho) en ausencia (-) o presencia (+) de BRM014. La importancia de las diferencias entre las distribuciones indicadas y la condición en ausencia de BRM014 se determinó utilizando la prueba de t de Student de dos colas. **p < 0.01; ****p <0.0001. (C) Mapa de calor que muestra la regulación por TGFβ de genes relacionados con EMT en ausencia o en presencia del inhibidor BRM014. Lista de genes descargada de la base de datos GSEA (EMTHALLMARK GENES). Varios de estos genes, cuya expresión cambió diferencialmente, fueron verificados mediante RT-qPCR (Figura R30). Así, se observó que marcadores típicos epiteliales, como Cdh1, disminuyeron sus niveles durante la EMT en las células control (tratadas con DMSO), siendo esta disminución inhibida por BRM014. Por otro lado, se midieron los niveles de expresión de factores de transcripción inductores de la EMT (EMT-TFs), como Snai1 y Zeb1. Curiosamente, Snai1, un gen que se induce rápidamente tras la adición del TGFβ, no mostró diferencias entre las células control y las tratadas con BRM014. Por el contrario, Zeb1, el cual se induce más tarde, aproximadamente a las 24 horas de tratamiento con TGFβ, mostró diferencias entre las células control y las tratadas con BRM014. Así, los niveles de expresión de Zeb1 aumentaron en las células control (tratadas con DMSO) durante la EMT, siendo este aumento inhibido en las células tratadas con BRM014. Esta inhibición del aumento de expresión durante la EMT, en células tratadas con la droga, también se observó para otros marcadores típicos mesenquimales, como Tgfβr1, Col7a1, Krt20 y Foxq1. Todo ello, muestra de nuevo que la transición EMT no se está dando correctamente ya que un gran número de genes implicados en este proceso no cambian su expresión en presencia del inhibidor, por lo tanto, se puede confirmar la actividad de los complejos SWI/SNF es necesaria para un correcto desarrollo del proceso de EMT. RESULTADOS 110 Figura R30. Genes que cambian su expresión durante la EMT en presencia de BRM014. Análisis mediante RT-qPCR de los niveles de ARNm de diferentes genes típicos de EMT en la línea NMuMG tratada 6 horas con BRM014 antes de inducir EMT por TGFβ. Los valores se normalizaron a los niveles de ARNm de CHD8. Se muestra el promedio de tres réplicas biológicas. Las barras de error representan valores de ± SEM. La significación con respecto al control (DMSO) se probó mediante el uso de la prueba de t de Student de dos colas. *p < 0.05; **p < 0.01. 3.3. Efectos de BRM014 sobre las vías de señalización de TGFβ Ya se ha descrito en el apartado anterior que el proceso de EMT inducido por TGFβ es parcialmente inhibido por BRM014. Tras ello, quisimos saber si dichos efectos eran debidos en parte a una posible alteración a nivel de la vía de señalización del TGFβ. La principal ruta de señalización del TGFβ está mediada por las proteínas SMAD. Dicha ruta se inicia con la unión del TGFβ a sus receptores TGFβRI y TGFβRII, lo cual conduce a la fosforilación de las proteínas SMAD2/3 (Lamouille et al., 2014; Wrana, 2013). Se determinó y cuantificó mediante WB los niveles de SMAD2/3 fosforilada (SMAD2/3-P), para comprobar si dicha fosforilación tenía lugar en presencia de BRM014. Como control de carga se determinaron los niveles de la misma proteína sin fosforilar. No se observaron diferencias significativas tras 2 y 12 horas de tratamiento con TGFβ, en ausencia y presencia de BRM014 (Figura R31). Esto indica que el comienzo de la RESULTADOS 111 señalización por TGFβ no está afectada y que, por tanto, los efectos de BRM014 son debidos a pasos posteriores a la activación de la misma. Figura R31. Efectos de BRM014 sobre los niveles de fosforilación de SMAD2/3 por TGFβ. (A) Células NMuMG se trataron con DMSO (como control) o BRM014 durante 6 horas antes de inducir EMT con TGFβ. Después de 2 o 24 horas de tratamiento con TGFβ, se preparó un lisado total y se analizó mediante western blot SMAD2/3-P y SMAD2/3 (como control). Se cargaron 20 μg de proteínas total por carril. (B) Cuantificación de los niveles de proteína SMAD2/3-P relativizada a SMAD2/3 total, en células NMuMG tratadas con DMSO (como control) o BRM014 durante 6 horas antes de inducir EMT con TGFβ (2 o 24 horas). Datos obtenidos mediante western blot. Se muestra el promedio de dos réplicas biológicas. Dado que como hemos descrito en esta Tesis BRM014 afecta fuertemente a la accesibilidad de los enhancers, es muy posible que, tras el tratamiento con el inhibidor, los complejos SMAD2/3-SMAD4 sean incapaces de interaccionar directamente con sus dianas en el ADN. Para testar lo cual, se deberían realizar experimentos de ChIP-seq de las proteínas SMAD2/3 o SMAD4 en las condiciones usadas en esta tesis. DISCUSIÓN DISCUSIÓN 112 DISCUSIÓN Los complejos SWI/SNF han sido ampliamente estudiado en los últimos años, pero hasta el momento solo se había conseguido alterar los niveles total o parcialmente de alguna de sus subunidades. Recientemente, se ha desarrolla un nuevo inhibidor, llamado BRM014, que ha demostrado inhibir completa y específicamente a las ATPasas BRM y BRG1 y, por lo tanto, todos los complejos SWI/SNF (Iurlaro et al., 2021; Schick et al., 2021). Ello, junto a que, pese a la gran cantidad de estudios existentes sobre estos complejos, aún hay ciertas controversias en la bibliografía en relación a los genes y regiones de la cromatina dependientes e independientes de SWI/SNF, nos llevó a investigar más sobre este tema. Con este fin, utilizamos este inhibidor en células epiteliales no tumorales, concretamente en células de epitelio mamario de ratón (NMuMG). En este trabajo se han estudiado en profundidad los cambios cromatínicos y de la expresión génica ocasionados tras inhibir la actividad de los complejos SWI/SNF. Se ha mostrado que aproximadamente un 10% de los genes expresados se ven afectado mientras que numerosas regiones de la cromatina, sobre todo enhancers, cambian su accesibilidad. Tras dichos resultados se procedió a una amplia caracterización de los mismos. Finalmente, se mostró también que SWI/SNF regula muchos de los genes implicados en la transición EMT, ya que, al inhibirlo, dicha transición se ve alterada. 1. EFECTO DE BRM014 EN LA ACCESIBILIDAD DE LA CROMATINA Y EN LA EXPRESIÓN GÉNICA 1.1. Cambios en la expresión génica tras el tratamiento con BRM014 Como ya se ha comentado en la Introducción, los complejos SWI/SNF son importantes remodeladores de la cromatina involucrados en un gran número de funciones biológicas (Batsché et al., 2006; Brownlee et al., 2015; Cohen et al., 2010; Dykhuizen et al., 2013; Ray et al., 2009; Zhang et al., 2014), por ello quisimos conocer qué efectos tendría inhibir dichos complejos en la línea NMuMG, con el fin de caracterizar ampliamente qué elementos reguladores y qué genes son dependientes o independientes de SWI/SNF. Todos nuestros datos los hemos comparado con los de Iurlaro et al., 2021 en células DISCUSIÓN 113 troncales embrionarias de ratón (mESC) (Iurlaro et al., 2021). Sorprendentemente, la expresión de solo un pequeño número de genes (menos del 10 % de los genes activos) se vio afectada por este inhibidor en ambos estudios. Se comprobó que dichos genes se expresaban menos en comparación con los genes independientes de SWI/SNF, para ambas líneas celulares. Ya existen otros estudios donde se muestra que pocos genes se ven afectados tras inhibir los complejos SWI/SNF, pero en todos ellos solo se altera la expresión de alguna de las subunidades de complejos, no en su totalidad (Raab et al., 2015; Zhang et al., 2014), es por ello que los efectos observados en dicho estudios podrían ser consecuencia de una compensación por otras subunidades o por la inhibición parcial de los complejos SWI/SNF. Mediante un estudio de Ontología Génica (GO) y GSEA (análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes) se comprobó que dichos genes están implicados en procesos específicos y transitorios que requieren una intensa regulación tales como transducción de señales, diferenciación celular o desarrollo. Estos resultados sugieren que genes que necesitan una regulación específica ante unas condiciones determinadas son los que a priori tienen una mayor dependencia de SWI/SNF. Por el contrario, aquellos genes que tienen una alta tasa de expresión, serían genes independientes de SWI/SNF. De manera general, los genes de “mantenimiento” son aquellos que se expresan de forma continuada y son necesarios para el funcionamiento básico de las células (Eisenberg & Levanon, 2013). Se cruzaron los genes independientes de SWI/SNF de nuestro estudio diferencial con la lista de genes de “mantenimiento” de Hounkpe et al, 2021 (Hounkpe et al., 2021), confirmando así que la gran mayoría (casi la totalidad) de genes de “mantenimiento” eran independientes de SWI/SNF. Ante estos resultados se estudió más en profundidad el entorno cromatínico de estos genes, para poder determinar así las características de los genes que serían dependientes e independientes de los complejos SWI/SNF. 1.2. Entorno cromátinico de los genes dependientes e independientes de SWI/SNF Conocer cuáles son las características cromatínicas de los genes regulados por SWI/SNF es importante para intentar entender por qué dichos genes requieren estos complejos para su transcripción. El análisis de nuestros datos mostró que los promotores de los genes dependientes de SWI/SNF son poco accesibles y presentan bajos niveles de marcas de histonas de activación. Por el contrario, los promotores de DISCUSIÓN 114 los genes independientes de SWI/SNF son muy accesibles y presentan altos niveles de marcas activadoras de histonas. Dichos datos consolidan de nuevo la idea de que aquellos genes que requieren una regulación específica son dependientes de SWI/SNF, mientras que serían independientes de SWI/SNF aquellos genes que tienen una expresión alta y continua. Por otro lado, como ya se ha comentado anteriormente, la ocupación media de nucleosomas en TSSs activos tiene un patrón muy distintivo con una región clara libre de nucleosomas (NFR) la cual se superpone al TSS, y nucleosomas flanqueantes +1 y -1 aguas abajo y aguas arriba de la NFR, respectivamente (Mavrich et al., 2008). Mientras que los genes inactivos exhiben un perfil mucho menos escalonado, estando la NFR ocupada por nucleosomas. Nuestros datos muestran que los TSSs de los genes dependientes de SWI/SNF presentan poco posicionamiento nucleosomal y muestran una NFR menos pronunciada que los independientes de SWI/SNF. Dichos datos están en consonancia con el hecho de que los genes dependientes de SWI/SNF son menos accesibles que los independientes de SWI/SNF. Esto mismo, se reafirmó mediante la predicción del posicionamiento nucleosomal basado en la secuencia, utilizando el software nuCpos (Kato et al., 2021) donde se observó de nuevo, que los promotores de los genes regulados a la baja tras el tratamiento con BRM014, tenían una mayor tendencia a posicionar nucleosomas que aquellos regulados al alza o que no cambian su expresión tras el tratamiento con el inhibidor. Como ya se comentó en la Introducción, en levadura está descrito que los complejos RSC y SWI/SNF se localizan en promotores, donde tienen un papel esencial en el mantenimiento de la NFR (Kubik et al., 2015, 2018; Rawal et al., 2018; Wagner et al., 2020). Sin embargo, para mamíferos, la relación entre SWI/SNF y el mantenimiento de las NFR de promotores es más controvertida. Hay numerosos estudios que ubican a los complejos SWI/SNF tanto en promotores como en enhancers, aunque la función real que ejerce en cada uno de ellos aún no está clara (Alver et al., 2017; Blümli et al., 2021; Kelso et al., 2017; Nakayama et al., 2017; Shi et al., 2013; Tolstorukov et al., 2013; Xiao et al., 2022). Nuestros datos muestran que la accesibilidad a la cromatina de la mayoría de los promotores (90%) no cambia en gran medida tras la inhibición de SWI/SNF, sin embargo, aproximadamente la mitad (56%) del resto de regiones accesibles no TSS o dCREs cambiaron la accesibilidad tras el tratamiento con BRM014. Tras ello, se estudiaron las características cromátinicas de estos dCREs, así como los motivos de unión de TFs presentes en dichas regiones. Se concluyó que, aquellos elementos dCREs que disminuyen su accesibilidad son regiones que de partida tenían altos niveles de marcas de activación (H3K4me1 y H3K27ac) y bajos niveles de marcas de represión DISCUSIÓN 115 (H3K27me3), y que, además, estaban fuertemente enriquecidas en sitios de unión de factores de transcripción específicos de enhancers bien conocidos. Por todo ello, se determinó que se trataban de enhancers activos. Mientras que, los dCREs que aumentan su accesibilidad se corresponderían a de enhancers preactivados, ya que presentan niveles significativos de la marca de activación H3K4me1 y de la marca represiva H3K27me3, y se enriquecieron en sitios de unión de factores de transcripción de la familia TEAD, ya descrito anteriormente que se unen a enhancers preactivados (Huh et al., 2019; Zhang et al., 2009; Zhao et al., 2008). En claro contraste, los dCREs independientes de SWI/SNF mostraron un fuerte enriquecimiento en sitios de unión de CTCF y CTCFL, lo que sugiere que, al menos en su mayoría, se trataba de insulators. Recientemente se ha descrito que otro remodelador dependiente de ATP, SMARCA5 (SNF2H) es necesaria para la unión de CTCF a sus dianas en el ADN (Song et al., 2022) Por lo tanto, los genes dependientes de la actividad SWI/SNF son genes de baja expresión, con baja accesibilidad, bajos niveles de marcas de histonas activas y poca periodicidad nucleosomal en los promotores. Estos genes codifican principalmente genes implicados en transducción de señales, desarrollo e identidad celular y están rodeados de enhancers muy sensibles a la inhibición de SWI/SNF. Las características de los promotores de estos genes se corresponden muy bien con las de los promotores tipo I (promotores que contienen cajas TATA) y III (promotores de islas CpG extendidas) de la clasificación propuesta por Lenhard et al. 2012 (Haberle & Stark, 2018; Lenhard et al., 2012). Por el contrario, los genes independientes de SWI/SNF eran genes altamente expresados, con alta accesibilidad, altos niveles de marcas de histonas de activación, fuerte periodicidad nucleosomasl y promotores sin TATA. Estas características corresponden a los promotores de tipo II (Haberle & Stark, 2018; Lenhard et al., 2012), que son comunes en los genes de “mantenimiento” y que responden menos a los enhancers distales tanto en los experimentos ExPSTARR-seq como en el genoma (Bergman et al., 2022; Osterwalder et al., 2018). Curiosamente, estas características se conservaron en las células mESC y NMuMG, a pesar de que los genes dependientes de SWI/SNF eran diferentes en cada tipo de célula, lo que sugiere que son las características del entorno cromatínico del TSS y las regiones reguladoras circundantes las que determinan que un gen sea SWI/SNF-dependiente o independiente. Mientras preparaba este manuscrito, en octubre de 2022, el grupo de A. Stack publicó resultados muy similares para los genes dependientes de SWI/SNF de Drosophila (Hendy et al., 2022). En este artículo se muestra que los genes de desarrollo dependen específicamente de los complejos SWI/SNF, concretamente porque juegan un papel importante en la accesibilidad de los enhancers que regulan su transcripción. Mientras DISCUSIÓN 122 Finalmente, comprobamos si la señalización a través de la ruta principal de transducción del TGFβ, la vía de las proteínas SMAD, se alteraba por BRM014. Nuestros datos no mostraron efectos a este nivel. Las proteínas SMAD2/3-SMAD4 ejercen su acción mediante su unión a miles de enhancers tras la adición de TGFβ en la línea NMuMG (Guerrero-Martínez et al., 2020). Dado que ya hemos descrito que eliminar la actividad SWI/SNF afecta a la accesibilidad de los enhancers, proponemos que BRM014 evitaría el acceso de los complejos SMAD2/3-SMAD4 a sus sitios de unión en el ADN, bloqueando de esta manera su función, y, por tanto, la transición EMT. Para verificar estas hipótesis sería interesante realizar experimentos de ATAC-seq y ChIP-seq de SMAD2/3-SMAD4 en presencia de BRM014 durante una inducción del proceso EMT mediante TGFβ. Como conclusión podríamos decir que los complejos SWI/SNF tienen un papel importante en la EMT, y que el tratamiento con BRM014 inhibe dicha transición. Este resultado abre la posibilidad a la utilización de este inhibidor como posible droga antimetastática. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 123 CONCLUSIONES 1.- El tratamiento con el inhibidor de la actividad de los complejos SWI/SNF BRM014 afecta la expresión de tan solo el 10% de los genes expresados en la línea no cancerosa de epitelio mamario de ratón NMuMG. 2.- Los genes dependientes de SWI/SNF están enriquecidos fuertemente en las categorías de ontología génica relacionadas con las vías de transducción de señales, diferenciación celular y desarrollo. 3.- La mayoría de los genes de “mantenimiento” son independientes de SWI/SNF. 4.- Los genes independientes de SWI/SNF son genes con una alta tasa de expresión, muy accesibles, ricos en marcas activadoras de histonas (H3K4me3 y H3K27ac), con una fuerte periodicidad nucleosomal y sin cajas TATA, lo que los asemeja a los promotores tipo II según la clasificación de Lenhard et al., 2012. 5.- Los genes dependientes de SWI/SNF presentan una media/baja tasa de expresión, muy poco accesibles, pobres en marca activadoras, con una baja periodicidad nucleosomal, enriquecidos en cajas TATA y cuya expresión estaría influenciada por enhancers distales, lo que los asemeja a promotores tipo I según la clasificación de Lenhard et al., 2012. 6.- El 90% de los promotores de los genes activos en la línea NMuMG no cambia su accesibilidad tras el tratamiento con BRM014, mientras que el 56% correspondiente a otros elementos regulatorios distales en cis (dCREs) sí la cambia. 7.- Los dCREs que disminuyen su accesibilidad tras el tratamiento con BRM014 son muy accesibles, tienen altos niveles de marcas activadoras (H3K27Ac, H3K4me1) y bajos niveles de marcas represoras, y están enriquecidos en motivos de unión de factores de transcripción específicos de enhancers. Todo ello sugiere que se corresponden con enhancers activos. 8.- Los dCREs que aumentan su accesibilidad tras el tratamiento con BRM014 presentan características de enhancers preactivados ya que presentan niveles significativos de la marca de activación H3K4me1 y de la marca represiva H3K27me3, y están enriquecidos en sitios de unión de factores de transcripción de la familia TEAD, ya descrito anteriormente que se unen a enhancers preactivados. CONCLUSIONES 124 9.- Los dCREs independientes de SWI/SNF muestran un fuerte enriquecimiento en los sitios de unión de CTCF y CTCFL, y se distribuyen en los bordes de los TADs lo que sugiere que al menos un gran subconjunto de estos elementos son insulators. 10.- Los dCREs presentan una mayor tendencia al posicionamiento de nucleosomas en las NFRs que los promotores, lo que podría explicar por qué dichos elementos son más sensibles a la carencia de la actividad de los complejos SWI/SNF que la mayoría de los promotores. 11.- Inhibir la actividad de los complejos SWI/SNF no provoca un defecto general en el proceso de splicing alternativo. El análisis de eventos demostró que el 83% de ellos son debidos al uso de un TSS alternativo. 12.- En algunos genes, la inhibición de la actividad de los complejos SWI/SNF produce transcritos con 5’UTRs más lagos, por la utilización de TSSs aguas arriba del TSS principal. 13.- En algunos genes, la inhibición de la actividad de los complejos SWI/SNF provoca un aumento en la expresión de los PROMPTs. 14.- La transcripción de 5’UTRs más largos, así como el aumento en la expresión de los PROMPTs no se correlacionan con los cambios en la expresión génica y sugieren una actividad de SWI/SNF en el mantenimiento de la estructura nucleosomal de la NFR de algunos promotores. 15.- El tratamiento con BRM014 inhibe la normal transición de epitelio a mesénquima inducidas por TGFβ en la línea NMuMG. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 125 BIBLIOGRAFÍA Aigner, K., Dampier, B., Descovich, L., Mikula, M., Sultan, A., Schreiber, M., … Eger, A. (2007). 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