Estructura tridimensional de inositol fosfoglicanos mediante rmn, mecánica y dinámica molecular

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICAS. CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS “ISLA DE LA CARTUJA”. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE INOSITOL FOSFOGLICANOS MEDIANTE RMN, MECÁNICA Y DINÁMICA MOLECULAR. MEMORIA presentada para aspirar al grado de Doctor en Ciencias Químicas por Jesús Angulo Álvarez Sevilla, 2002 MEMORIA presentada para aspirar al grado de Doctor en Ciencias Químicas por José Luis Muñoz Ponce Sevilla, 2015 D. PEDRO MANUEL NIETO MESA, Científico Titular del C.S.I.C. CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado: “ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE INOSITOL FOSFOGLICANOS MEDIANTE RMN, MECÁNICA Y DINÁMICA MOLECULAR” ha sido realizado bajo mi dirección y asesoramiento, en el Grupo de Carbohidratos, en el Instituto de Investigaciones Químicas, del Centro de Investigaciones Científicas Isla de La Cartuja (Sevilla) durante los años académicos 1999-2000, 2000-2001, 2001-2002 y 2002-2003, constituyendo la Memoria que presenta el Lcdo. José Luis Muñoz Ponce para aspirar al Grado de Doctor en Ciencias Químicas. Sevilla, 28 de Septiembre de 2015 Director Tesis: Doctorando: Fdo.: Pedro M. Nieto Mesa Fdo. José Luis Muñoz Ponce Esta tesis doctoral se ha llevado a cabo gracias a la ayuda de las becas predoctorales, que se enumeran a continuación: Beca predoctoral del grupo Rademacher Group Limited (Octubre1999-Diciembre2000). Beca para formación y especialización en líneas de investigación de interés para el sector industrial del CSIC (Enero 2001-Diciembre 2001). Beca para formación y especialización en líneas de investigación de interés para el sector industrial del CSIC- I3P del CSIC (Febrero 2002-Enero 2003). Beca Instituto “Reina Sofía” de la Fundación RENAL (Febrero 2003-Junio 2003). "La ciencia se compone de errores, que a su vez son los pasos hacia la verdad". Julio Verne. “No creo que haya otra cualidad tan esencial para el éxito de cualquier tipo que la perseverancia. Supera a casi todo, incluso a la naturaleza”. John D. Rockefeller. El actual trabajo que presento, se ha realizado en el Instituto de Investigaciones Químicas del Consejo Superior de Investigaciones Químicas, bajo la dirección del Investigador Científico, el Dr. Pedro Manuel Nieto Mesa. Han sido muchos años de tutela, dirección, apoyo y palabras de comprensión en los malos momentos y agradezco de todo corazón que no haya perdido la esperanza y la constancia, para que este proyecto conjunto pueda cerrarse con la consecución de mi tesis doctoral. Sé que ha luchado contra todo y todos, y que a veces los proyectos tienen un recorrido más corto del que querríamos, por eso te doy las gracias y por los buenos momentos y horas de RMN donde he podido aprender con uno de los grandes de este país. No me gustaría olvidar a la gente que ocuparon un trocito de mi vida y a las que quiero expresar mi profundo y sincero agradecimiento: Sin la ayuda de la financiación que recibí durante los años que realicé la parte experimental de la tesis, no hubiera podido existir, al menos impresa con mi nombre. Por eso y en primer lugar, agradecer al Profesor Manuel Martín Lomas, por buscarme y encontrarme en aquel laboratorio del CSIC en Madrid en 1999 cuando finalizaba mi Tesis de Licenciatura y ofrecerme la posibilidad de ir a un grupo especialista donde realizar la tesis. Estoy orgulloso de haber compartido grupo con una de las personas más prolíferas de este país, referencia de investigadores. A las becas disfrutadas y a las instituciones públicas y privadas que posibilitaron esta tesis: Beca predoctoral del grupo Rademacher Group Limited (Octubre1999-Diciembre2000). Beca para formación y especialización en líneas de investigación de interés para el sector industrial del CSIC (Enero 2001-Diciembre 2001). Beca para formación y especialización en líneas de investigación de interés para el sector industrial del CSIC- I3P del CSIC (Febrero 2002-Enero 2003).Beca Instituto “Reina Sofía” de la Fundación RENAL (Febrero 2003-Junio 2003). A los tutores que con amabilidad aceptaron la tutela en la presente tesis doctoral del Programa Estudios Avanzados en Química; en primer lugar al Dr. José Fuentes Mota hasta la fecha de su jubilación y en el último año y con cierta premura el Dr. José Luis Jiménez Blanco, Profesor Titular Universidad en Universidad de Sevilla. A los entonces Doctores y hoy en día pilares en diversas ramas de investigación y con cargos institucionales bien diferentes: Soledad Penedés, Julio Delgado, Luz Cadenas, Francisco Pinto, Javier Rojo, Eva Arce, Ricardo Pérez. A los que fueron compañeros durante la realización de mi tesis con los que tantas aventuras, dichas y desdichas compartí: África, Ricardo, Oli, Paco, Niels, Javier Lopez, Julia, Sara, Juan Antonio, Jesús, Cristina, Belén, Félix, Stephan, Florence, Mª José, Marcelo, Mercedes, Tere, Lizeth, Natalia, José Luis de Paz, Rafael Ojeda, Silvia. Mención especial con mucho cariño para mis “chicos de los espines orientados con el campo”, con los que pasé muchas horas de mi vida, debatiendo, discutiendo, ampliando conocimientos, realizándome como doctorando y aprendiendo: Dr. Franck Chevalier y Dr. Jesús Angulo Álvarez. A mi familia, por el cariño. A mis padres adoptivos, nunca la palabra suegros tuvo un significado tan grande y próximo, gracias por vuestra paciencia, apoyo infinito y demostración de afecto día a día, en los buenos y sobre todo en los malos momentos, y sabéis que también existieron en una tesis tan larga. Os debo mucho y nunca podré pagároslo. A mi amor, Patricia Mora, un apoyo básico sin el que no hubiera podido resistir. Su confianza y palabras de ánimo, su alegría y positividad, su amor sin condiciones, hicieron de mi mejor persona e investigador. El motor de mi vida. Te quiero. Cuando inicié la presente tesis no entraban ni en mis pensamientos y hoy en día son realidad de mi vida e indispensables, mis dos hijos: Israel y Cecilia, quienes con seguridad se aburrirán en la defensa de mi tesis, pero que el día de mañana agradecerán a buen seguro haber podido asistir. Son mi sangre y carne, y a ellos les pertenece todo lo que tengo y soy; una parte de esta tesis va por vosotros. También dedicar al aún non nato, aún tiene tiempo para que podamos explicarle que aportó su padre a la ciencia. INDICE PREFACIO 1.-INTRODUCCION 1.1.- INOSITOL DISTRIBUCCIÓN, ACTIVIDAD Y SIGNIFICANCIA BIOLÓGICA. Pag 5-6. 1.2.- MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INSULINA. Pag 7-11. 1.2.1.-La cascada de fosforilación. Pag 7-8. 1.2.2.-La hipótesis del segundo mensajero. Pag 8-10. 1.2.3.-Inositolfosfoglicanos como segundos mensajeros: IPGs tipo A y tipo P. Pag 10-11. 1.3.- ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE CARBOHIDRATOS. Pag 11-26. 1.3.1.- Caracteristicas estructurales de carbohidratos. Pag 12-14. 1.3.2.- RMN de carbohidratos. Pag 14-19. 1.3.3.- Modelado molecular de carbohidratos: métodos de campos de fuerzas. Pag 19-26. 1.4.- OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL. Pag 26-27. 1.5.-BIBLIOGRAFIA. Pag 28-32. 2.- ESTUDIOS DE PSEUDODISACÁRIDOS MIMÉTICOS DE IPG. 2.1.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. Pag 35-38. 2.2.- METODOLOGÍA Pag 38-42. 2.2.1.- Resonancia Magnética Nuclear. Pag 38-39. 2.2.2.- Cálculos teóricos de campos de fuerzas. Pag 40-42. 2.3.- RESULTADOS Y DISCUSION. Pag 42-75. 2.3.1.- Motivo estructural glucosamina  (1→6) mio-inositol. Pag 43-48. 2.3.2.- Motivo estructural glucosamina  (1-6) mio-inositol. Pag 48-51. INDICE 2.3.3.- Motivo estructural glucosamina  (1-6) quiro-inositol. Pag 52-56. 2.3.4.- Motivo estructural glucosamina  (1-6) quiro-inositol. Pag 57-59. 2.3.5.- Motivo estructural hexosamina 16) Pinitol Pag 60-66. 2.3.6.- Motivo estructural hexosamina (16) pinitol. Pag 66-70. 2.3.7.- Modelado Molecular de los grupos Hidroximetilo. Pag 71-75. 2.4.- CONCLUSIONES. Pag 75-78. 2.5.- BIBLIOGRAFIA. Pag 79-83. 3.- ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE POTENCIALES INHIBIDORES DE PKA. 3.1.- DISEÑO RACIONAL DE NUEVOS IPGs. Pag 86-89. 3.2.- METODOLOGÍA Pag 89-91. 3.2.1.- Resonancia Magnética Nuclear. Pag 89 3.2.2.- Cálculos Teóricos. Pag 89-91 3.3.- RESULTADOS Y DISCUSION. Pag 91-120. 3.3.1.- Pseudodisacáridos fosfato. Pag 91-97 3.3.2.- Pseudotrisacáridos no fosfatados. Pag 97-105 3.3.4.- Pseudotrisacárido di-fosfato. Pag 105-116 3.4.- ESTUDIO DE PROTONES HIDROXÍLICOS POR RMN. Pag 120-126. 3.5.- CONCLUSIONES Pag 126-128. 3.6.- BIBLIOGRAFIA. Pag 129-133. 4.- PARTE EXPERIMENTAL 4.1.- RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. Pag 136-140. 4.2.- CALCULOS TEÓRICOS DE CAMPOS DE FUERZAS. Pag 141-144. APENDICE 1.- Estudio comparativo de las parametrizaciones para carbohidratos del campo de fuerzas AMBER. Pag 145-146. APENDICE 2.- Valoraciones ácido-base. Pag 147-148. CAPITULO 1 INTRODUCCION. 8│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce Figura 3. Mecanismo de acción de la insulina. Paralelamente, se produce la transducción de la señal que produce los efectos metabólicos a través una ruta diferente que está aún menos definida. Las proteínas IRSs interaccionan con la enzima fosfatidilinositol 3 quinasa (PI-3K) que a su vez activa el transporte de glucosa al interior de la célula, por el transportador GLUT4. 17 Para ello, la PI-3K produce la fosforilación de un fosfatidilinositol de membrana que por efecto de una fosfolipasa C (PLC), incrementa los niveles de los fosfatidilinositoles PI-(3)P, PI-(3,4)-P2 y PI-(3,4,5)-P3. 18 Estos fosfatidilinositoles activan la proteína quinasa B (PKB) que está aparentemente implicada tanto en la estimulación del transporte de glucosa al interior de la célula, como en la activación de la glucógeno sintasa (GS). 19 Sin embargo, la ruta y mecanismos que rigen la estimulación de la síntesis de glucógeno y la lipogénesis permanecen aún desconocidos. 1.2.2.-LA HIPÓTESIS DEL SEGUNDO MENSAJERO. El concepto de mediador para la acción de la insulina fue introducido por Larner en 1972, 20 que, apoyado en evidencias bioquímicas, propuso que la interacción de la insulina con su receptor daría lugar a la producción intracelular de una molécula capaz de propagar la acción de la misma. RECEPTOR INSULINA GLUCOSA RAS Dominio unión insulina Dominio transmembrana Dominio unión ATP Dominio tirosina/quinasa ATP ADP P P PI SOS GAP P62 SOS Grb2 Shc P P SOS Grb2 IRS-1,2,3,4 COMPLEJO RAS PI-3-K Raf-1-quinasa MAP-quinasa-quinasa MAP-quinasa pp90-S6-quinasa PDK1 PKB GSK3 GS PLC IP3+ DAG PI-(3,4)-P2 PI-(3,4,5)-P3 ? GLUT4 PPG1 ? EFECTOS METABÓLICOS EFECTOS MITOGÉNICOS RECEPTOR INSULINA GLUCOSA RAS Dominio unión insulina Dominio transmembrana Dominio unión ATP Dominio tirosina/quinasa ATP ADP P P PI SOS GAP P62 SOS Grb2 Shc P P SOS Grb2 IRS-1,2,3,4 COMPLEJO RAS PI-3-K Raf-1-quinasa MAP-quinasa-quinasa MAP-quinasa pp90-S6-quinasa PDK1 PKB GSK3 GS PLC IP3+ DAG PI-(3,4)-P2 PI-(3,4,5)-P3 ? GLUT4 PPG1 ? EFECTOS METABÓLICOS EFECTOS MITOGÉNICOS Capítulo 1: Introducción 9│ Debido a su escasez, no se ha podido aislar y determinar la estructura exacta de estos mediadores, y sólo ha sido posible proponer unas estructuras parciales que tienen en común el poseer un residuo de inositol. La similitud entre estas estructuras y los GPIs de anclaje han hecho considerar a los GPI de anclaje como posibles precursores (vía la acción de fosfolipasas (GPI-PLC y/o GPI-PLD) de estos mediadores. Esta línea ha sido objeto de numerosos trabajos de investigación recogidos en un gran número de revisiones 21 . La terminología que describe las características químicas de los compuestos relacionados con estos mediadores es: prGPI, proteína unida a glicosilfosfatidil inositol y GPI, glicosilfosfatidil inositol, como lípidos intactos a los cuales está unida la proteína anclada o no respectivamente. IPGpr, proteína unida a inositol fosfoglicano e IPG, inositol fosfoglicano como moléculas solubles en agua derivadas de prGPI y GPI respectivamente. La hipótesis de los segundos mensajeros consiste básicamente en que la insulina, tras interaccionar con su receptor, produce la activación de una fosfolipasa (C o D), la cual hidroliza una molécula de GPI liberando al medio extracelular un IPG (con o sin fosfato respectivamente), que es capaz de introducirse al interior de la célula y, mediante la modulación de enzimas claves, ejercer los efectos de la hormona (Figura 4). La existencia de un mecanismo de este tipo no excluye la existencia simultánea de otros más ampliamente admitidos, a los que se ha hecho referencia en el apartado anterior. Figura 4. Hipótesis del segundo mensajero para la acción de la insulina. 10│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce La hipótesis de los segundos mensajeros, explicaría los efectos de la administración exogénea de IPGs. Estos constituirían una familia de compuestos diferentemente glicosidados y fosforilados, de alguna manera análoga a la familia de los inositolfosfatos (IP, IP2 y IP3) 22 . Presenta un atractivo indudable en el potencial tratamiento de aquellas enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina, debido a la posibilidad de acceder a sustancias que mimetizan sus efectos. Sin embargo, el que aun no se conozca la estructura exacta de los IPGs liberados y que no se hayan establecido los mecanismos de su incorporación a la célula son sus principales puntos débiles. 1.2.3.-INOSITOLFOSFOGLICANOS COMO SEGUNDOS MENSAJEROS: IPGs TIPO A y TIPO P. Las investigaciones realizadas por Larner, 23 Mato 24 y Rademacher, 25 permiten clasificar los IPGs en dos grupos en función de su estructura básica y sus actividades biológicas. Los IPG de tipo P estarían compuestos por quiro-inositol y galactosamina y serían capaces de activar a la PDHP entre otras fosfoproteinfosfatasas relacionadas con el metabolismo de la glucosa y reguladas por al insulina. 26 , 27 Los IPG de tipo A, además de inhibir la PKA, son capaces de estimular la lipogénesis, activar la acetilcoenzima A carboxilasa y modificar las actividades de la adenilato ciclasa y fosfodiesterasa de AMP cíclico y estarían constituidos por mio-inositol, glucosamina, galactosa y fosfato. Los IPG tipo A y los GPIs de anclaje tienen una alta similitud estructural lo que ha inducido a proponer que estos IPGs provienen de la hidrólisis de GPIs de anclaje mediante la acción secuencial de una proteasa y una fosfolipasa. 28 Por el contrario la estructura parcial de los IPGs tipo P, al presentar un anillo de quiro-inositol y galactosamina, implicaría a un GPI o prGPI precursor diferente. 29 Debido a las dificultades inherentes al aislamiento y determinación estructural de estos segundos mensajeros una estrategia alternativa para profundizar en su caracterización es el estudio de los enzimas clave de esta ruta de transducción, que en este caso serian la PKA y la PDH fosfatasa. La PKA es la más simple de las proteínas quinasas y la más completamente caracterizada 30 . El haloenzima inactiva PKA consiste en 2 subunidades reguladoras y 2 catalíticas que se disocian en respuesta de niveles elevados de cAMP intracelular. Una descripción tridimensional de esta subunidad catalítica es obtenida cuando la primera estructura cristalina de una proteína quinasa fue resuelta como un complejo PKA-inhibidor y con Mg+2 y ATP. 31 El conocimiento detallado de las interacciones entre PKA y los inhibidores sintéticos de tipo IPG formarán una de las bases en el diseño de fármacos basados en la estructura de IPGs (véase capitulo 3). Capítulo 1: Introducción 11│ La PDH fosfatasa, por otra parte no ha sido cristalizada. Sin embargo clonando su subunidad catalítica 32 ha demostrado un 22% de aminoácidos idénticos con la "glycogen synthase phosphatase” (fosfatasa 2C). La estructura cristalina de la fosfatasa 2C ha sido determinada y su centro catalítico es considerado como un modelo estructural para la secuencia relativa a los dominios de la PDH fosfatasa. El estudio de las interacciones específicas incluyendo la activación de la fosfatasa 2C por moléculas sintéticas de tipo IPGs, podría constituir otra de la bases para el diseño de fármacos de tipo IPG. Otras enzimas que podrían ser consideradas como dianas u objetivos convenientes en estas relaciones estructura-actividad relacionados con los IPGs, incluyen la fructosa 1,6- bisfosfatasa (FBP) que representa un fármaco diana altamente atractivo para la diabetes de tipo II y cuya estructura ha sido resuelta por rayos X 33 . 1.3.- ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE CARBOHIDRATOS. Los carbohidratos participan activamente en funciones biológicas muy diversas: energéticas (glucosa), estructurales (celulosa), inmunológicas y reconocimiento celular (antígenos oligosacarídicos), constituyen el esqueleto de los ácidos nucleicos (ribosa) y están implicados en procesos infecciosos. Gran parte de estos fenómenos están fundamentados en procesos de reconocimiento molecular en los que la estructura tridimensional y disposición espacial de grupos funcionales y átomos juega un papel esencial como transmisor de información. En este sentido es necesario destacar que los carbohidratos, por su estructura y composición, proporcionan a la naturaleza una amplia variedad de códigos, muy superior por unidad constitutiva a otros biopolímeros como ácidos nucleicos o proteínas. Continuando esta línea de argumentos se comprende fácilmente la relevancia de los estudios estructurales en carbohidratos. Aunque existen más métodos de análisis conformacional de carbohidratos, sin duda los más poderosos son la espectroscopia de RMN y la cristalografía de rayos X, ambas en combinación con técnicas de modelado molecular. 34 La gran dificultad que presenta la cristalización de estos compuestos ha restringido la aplicación de los métodos de difracción de rayos X, al menos en relación a otras biomoléculas. Por el contrario, el estudio de conformación adoptada en disolución, es abordada a menudo empleando las técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN). 35 12│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 1.3.1.- CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DE CARBOHIDRATOS. Los estructura tridimensional de los carbohidratos se puede describir, además de por las características derivadas de su composición como la configuración de los centros quirales propia de cada residuo, por ciertos parámetros conformacionales específicos. Para la descripción de los monómeros que constituyen los oligosacáridos es necesario determinar la conformación del ciclo de 6 miembros que origina (formas de piranosa). En la mayoría de los casos las piranosas presentan un comportamiento monoconformacional observando una de las dos posibles formas de silla (habitualmente la 1C4), aunque es posible encontrar excepcionalmente otras formas. También es posible encontrar anillos de 5 miembros como la ribosa a pesar de que no sean termodinámicamente estables. La descripción de la estructura de los monosacáridos se completaría con la definición la orientación de los grupos exocíclicos. Estos, mayoritariamente grupos hidroxilos secundarios, se presentan en disposiciones alternadas siendo más estables aquellas que generen redes de enlaces de hidrogeno cíclicos, lo que corresponde a situaciones clockwise (c) y anticlowise (r). O HO HO O OH R O HO HO O OH R O HO HO O OH OH R HO gt gg tg HHH HS HR OH O6 H5 H4 O4 RH HS HR HS HR RH HO OH HS HR O6 H5 H4 O4 HR HO HS O6 H5 H4 O4  Figura 5. Definición de las tres conformaciones alternadas para el grupo hidroximetilo en D- hexapiranosas. Un caso especial es la conformación del grupo hidroximetilo en hexapiranosas definida por los rotámeros del enlace C5-C6 (denominado  O5-C5-C6-O6). El grupo hidroxilo se puede disponer en 3 orientaciones alternadas, denominadas gauche-gauche (gg), gauche-trans (gt) y trans-gauche (tg) (figura 5). La distribución de las poblaciones de estos rotámeros depende de una compleja combinación de efectos, siendo el factor determinante la orientación relativa del sustituyente en la posición 4. Una amplia recopilación de datos experimentales indica, que para azucares de la serie D, las poblaciones relativas de los rotámeros gg:gt:tg para configuraciones tipo gluco y galacto se encuentran en torno a 60:40:0 y Capítulo 1: Introducción 13│ 20:60:20, respectivamente. Sin embargo, estos equilibrios se ven modificados por efectos de solvatación. No obstante el factor más influyente en la conformación de carbohidratos es la geometría del enlace glicosídico, ya que esta define la orientación relativa de dos unidades monosacarídicas consecutivas. Esta geometría viene definida por la rotación de dos enlaces: el glicosídico C1-O1, caracterizada por la torsión  (H1’-C1’-O1’-Cx) y el aglicónico O1-Cx, definida por la torsión  (C1’-O1’-Cx-Hx). La estructura tridimensional de estos compuestos depende fundamentalmente de la rotación alrededor de estos enlaces, denominados enlaces de torsión glicosídicos. O HO HO OH O OH O OH OH OH HO   1' 1 Figura 6. Representación de la estructura de un disacárido. Las fuerzas que intervienen en la estabilización de las conformaciones de los carbohidratos en disolución, al igual que para otras moléculas, son: los enlaces de hidrógeno, las interacciones estéricas, las fuerzas de van der Waals y electrostáticas junto con otros factores, como la solvatación. 36 Sin embargo, existen dos importantes efectos peculiares de los carbohidratos y que se deben tener en cuenta en los carbohidratos y que son los denominados efectos anomérico y exo-anomérico. 37 El efecto anomérico, propuesto por Lemieux 38 , se refiere a la preferencia que muestra cualquier sustituyente electronegativo en el carbono 1 de un anillo de piranosa por una configuración axial, en contra de lo que cabría esperar considerando criterios exclusivamente estéricos. De la misma naturaleza, el efecto exo-anomérico se manifiesta como una preferencia del enlace exocíclico O1-R por adoptar una orientación gauche respecto al enlace C1-O5 (figura 7). O OOO O O R O OR Efecto exo-anomérico Efecto endo-anomérico Dipolos eléctricos Figura 7. Representación de los efectos endo- y exo-anomérico. 14│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce Para justificar estos efectos se han propuesto dos explicaciones alternativas. Una de ellas considera a las interacciones electrostáticas entre los dipolos asociados a los enlaces C-O, principales responsables de estos efectos: predominancia del isómero axial frente al ecuatorial (efecto anomérico) y del confórmero gauche (efecto exoanomérico). Otra explicación, basada en la teoría de orbitales moleculares fronteras, atribuye la estabilización anomérica a un fenómeno de hiperconjugación n, sólo posible en disposiciones anti-periplanar entre el par solitario sobre el oxígeno y el orbital tipo  (figura 8). Esta interacción supone la transferencia electrónica parcial entre el orbital n que aloja el par solitario de electrones sobre el átomo de oxígeno y el orbital antienlazante  del enlace C-O adyacente, como consecuencia del solapamiento favorable entre dichos orbitales (figura 8). Figura 8. Representación esquemática del origen electrónico de los efectos endo- y exoanomérico. Durante años la controversia entre ambas explicaciones no ha podido ser claramente resuelta. Sin embargo, estudios recientes 39 han demostrado que este tipo de interacciones orbitálicas son más frecuentes y generales de lo que se pensaba. Así, se ha podido demostrar que la mayor estabilidad de las conformaciones alternadas del etano, respecto de las eclipsadas, no resulta, como tradicionalmente ha sido aceptado, de las repulsiones estéricas por el solapamiento de los orbitales de enlace C-H que tiene lugar en éstas últimas, sino que es una consecuencia de las interacciones hiperconjugativas que se originan, en el caso de las conformaciones alternadas, entre los orbitales ocupados de baja energía C-H y los orbitales vacíos, de mayor energía, C-H39, 40 1.3.2.- RMN DE CARBOHIDRATOS. A pesar de su relativa sencillez, los espectros de RMN de los oligosacáridos presentan una elevada complejidad debida a la poca dispersión que presentan los protones de los anillos. O OO O O O O ROR C5 H1 O C2 C5 O H1 C2 1 2 3 45 1 2 3 451 2 3 45 1 2 3 45 C1 O5 C1 O5 R O5 H1 C2 C1 O R O5 H1 C2 C1 O Efecto endo-anomérico Efecto exo-anomérico ** ** ** ** Capítulo 1: Introducción 15│ Así, la mayor parte de las señales aparecen en un rango que oscila entre 4,5 y 3,5 ppm dando lugar a frecuentes solapamientos y situaciones de acoplamiento fuerte. Afortunadamente las señales de los protones anoméricos aparecen en el rango de 4,4-5,5 ppm constituyendo un buen punto de partida para el análisis estructural ya que, además, sus valores de desplazamiento químico tanto de 1H como de 13C y de acoplamiento escalar permiten determinar la configuración anomérica con relativa facilidad. 41 , 42 , 43 Para aquellas señales localizadas fuera de la región de mayor solapamiento, Vliegenthart et al. 44 introdujeron la denominación de “grupoinformador-estructural” (structural-reporter-group), o “huella dactilar”, ya que los desplazamientos químicos de dichas señales dependen fuertemente de la estructura del carbohidrato. Mediante esta aproximación es posible identificar azúcares individuales, de residuos, motivos estructurales o azúcares específicos y composiciones de enlaces glicosídicos por comparación con bases de datos adecuadas. 45 , 46 , 47 Los métodos de asignación se basan frecuentemente en la determinación de sistema de spín de cada residuo mediante la combinación de experimentos de acoplamiento escalar homonucleares como DQF-COSY y TOCSY. En este punto ya se habrá obtenido información, al menos parcial de la configuración de los residuos. Para completar la asignación es necesario establecer la conectividad entre determinados sistemas de espines. Para esta fase generalmente se emplean experimentos NOESY capaces de establecer conectividades a través del espacio entre los distintos residuos. Sin embargo en el contexto del análisis de oligosacáridos, se han propuesto otros métodos basados en acoplamientos escalares a largo alcance 1H-13C o en el efecto de la glicosilación sobre el desplazamiento químico del carbono más próximo. Los desplazamientos químicos de 13C se obtienen fácilmente mediante los experimentos HSQC ó HMQC, que además se benefician de una mayor dispersión espectral que simplifica su análisis. Esta mejora de la dispersión se puede emplear en combinación con transferencias homonucleares para solventar las dificultades asociadas solapamientos graves. Así, en combinación con transferencias TOCSY los experimentos 2D HSQC-TOCSY 48 , HMQC-TOCSY, 49 han sido ampliamente utilizados. Similarmente, los espectros 2D HMQCNOESY 50 y HSQC-NOESY proporcionan conectividades entre la unión glicosídica y pueden ser útiles en casos con solapamiento severos. Debido a sus características espectrales: tiempos de relajación relativamente largos y un número moderado de señales algunas de las cuales aparecen típicamente fuera de la zona de solapamiento los análogos monodimensionales de los experimentos bidimensionales son especialmente útiles en carbohidratos. 51 En este sentido es conveniente destacar las ventajas de la implementación de esquemas de selectivos mediante gradientes de campo magnético como 16│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce dpfgse (Double Pulse Field Gradient Spin Echo) 52 que proporciona una >gran sensibilidad y limpieza en los espectros sin implicar un excesivo aumento de la complejidad experimental. Elucidación estructural por RMN: Al menos, son tres los parámetros espectrales que contienen información estructural y son utilizados en el análisis conformacional de oligosacáridos 53 : el desplazamiento químico, que aunque es muy sensible a la estructura del entorno resulta difícil de interpretar cuantitativamente; 54 las constantes de acoplamiento vecinales, que se relacionan con ángulos de torsión, mediante ecuaciones de tipo Karplus; 55 y el Efecto Nuclear Overhauser 56 que permite extraer distancias interprotónicas experimentales. Recientemente, se ha explorado con éxito la aplicación de constantes dipolares residuales en medios parcialmente orientados en estudios estructurales de oligosacáridos. 57 Constantes de acoplamiento escalares: Las constantes de acoplamiento homonucleares caracterizan la disposición relativa axial ó ecuatorial de los sustituyentes en un residuo de piranosa o furanosa de manera que es posible determinar su configuración y conformación. Desde una óptica estructural, conocida la configuración del monosacárido, los valores de 3JH-H, deben permitir determinar la conformación o conformaciones preferentes del anillo de cinco o seis miembros del residuo. Otro elemento estructural para el que son clave estos acoplamientos es la evaluación de la disposición del grupo hidroximetilo entre las posibles conformaciones alternadas (gg/gt/tg) mediante las constantes 3JH5-H6proR y 3JH5-H6proS. Por último, las constantes de acoplamiento 1H- 13C pueden utilizarse para determinar los ángulos de torsión glicosídicos, en particular entre el protón anomérico y el carbono aglicónico. Sin embargo, la dificultad que implica su obtención, prácticamente limitada a muestras isotópicamente marcadas, restringe su utilización. Efecto Nuclear Overhauser (NOE): El Efecto Overhauser Nuclear (NOE) es el cambio en la intensidad neta de una señal de un determinado núcleo como consecuencia de una perturbación de la resonancia de otro núcleo que se encuentra próximo en el espacio a éste primero. Su origen está en la redistribución de poblaciones producida como consecuencia de la relajación cruzada dipolodipolo entre estos dos núcleos. 58 La importancia del NOE en análisis estructural y conformacional reside en su dependencia de la distancia entre los átomos, y por lo tanto, en la información sobre la estructura tridimensional de las biomoléculas que los contienen. Al tratarse de un fenómeno de relajación tiene una compleja dependencia del movimiento molecular lo que dificulta la extracción directa de distancias interprotónicas. Para emplear la información implícita en el NOE en la determinación de estructuras tridimensionales, se pueden emplear varias aproximaciones. La más sencilla es el análisis Capítulo 1: Introducción 17│ cualitativo, para el que se asume que la observación de NOE implica una distancia menor de una dada (3-3,5 A en oligosacáridos), en el que por confrontación del patrón de NOEs observado con posibles estructuras candidatas permite evaluar la bondad del modelo empleado para el pronóstico de esas estructuras. La otra posibilidad consiste en realizar un análisis cuantitativo de las constantes de velocidad de relajación cruzada longitudinal  ijNOE, con el fin de derivar las distancias internucleares correspondientes. 59 Debido a la propia naturaleza de los oligosacáridos, con escasos NOEs estructuralmente relevantes, considerable flexibilidad y tamaño moderado, la información experimental suele ser insuficiente como para definir por sí misma la estructura. Por ello se recurre habitualmente a la obtención de distancias experimentales muy precisas y a combinar el análisis con cálculos teóricos. Acoplamiento dipolar residual. La necesidad de mejorar la precisión de las estructuras calculadas por RMN en disolución ha estimulado la búsqueda de nuevas restricciones geométricas, especialmente a largo alcance. Entre estas es necesario destacar a las constantes de acoplamiento dipolares residuales (RDC) que se observan cuando las moléculas están parcialmente ordenadas respecto al campo magnético de forma que la magnitud de este acoplamiento refleja la orientación de los núcleos acoplados respecto del campo. Aunque originalmente el método se desarrolló para proteínas ha sido también aplicado también a carbohidratos: Prestegard et al. 60 Tjandra  Bax 61 . Determinación Experimental de Distancias interprotónicas a partir del NOE Las intensidades de un espectro 2D NOESY para un tiempo de mezcla tm (periodo de evolución del NOE) están representadas por la matriz V(tm) según: (0))··texp(-)(t mm VRV  donde R es la matriz de relajación constituida por los elementos:   i ji ijijijii JJJQ ,1 , ,2,1,0 )(6)(3)(·      )()(6· ,0,2  ijijij JJQ  24│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce puede encontrarse tres posibles conformaciones alternadas, sería necesario generar 3N conformaciones diferentes para cada punto del espacio (,), siendo N el número de grupos exocíclicos. Esta estrategia exhaustiva resultará en un tiempo computacional excesivo, siendo aconsejable reducir éste considerando únicamente las orientaciones a priori más estables como las gg, gt, tg del grupo hidroximetilo o las disposiciones clockwise o anticlockwise que maximizan el número de enlaces de hidrógeno. Búsqueda conformacional no sistemáticos: métodos MonteCarlo. Entre los métodos no sistemáticos, el más ampliamente utilizado es el método de Metrópolis Monte Carlo (MMC). 65 Esencialmente consiste en generar configuraciones del sistema de forma aleatoria, mediante la variación de aquellos grados de libertad que se consideren más relevantes para la molécula objeto de estudio, y posteriormente aplicar criterios energéticos para aceptar o rechazar una determinada configuración nueva. Si este procedimiento es aplicado durante un número estadísticamente significativo de etapas, se genera un colectivo en el que cada conformación se repetirá según su factor de probabilidad de Boltzmann. Simulaciones de tipo MMC permiten la obtención de propiedades moleculares promediadas en colectivo (espacio configuracional), pero, si queremos obtener propiedades dinámicas del sistema (espacio de fases) deberemos recurrir a otras técnicas de simulación estadísticas, tales como la dinámica molecular. Dinámica Molecular Newtoniana (DM): Este es un método determinista, que consiste, básicamente, en calcular la evolución en intervalos de tiempo t de las posiciones y momentos de todas las partículas del sistema considerado, conociendo tanto los valores iniciales de ellos como la totalidad de las fuerzas del sistema de partículas. Para ello se aplican las leyes de la dinámica de Newton empleando las fuerzas que se determinan a partir de las funciones matemáticas que definen el campo de fuerzas. i i im F dt dv  i i F dr dV  El resultado final es un conjunto de puntos que describen una trayectoria determinada sobre el espacio de fase. Los tiempos de simulación empleados están en el orden de decenas de pisosegundos (ps) a varios nanosegundos (ns), dependiendo del tamaño del sistema estudiado. Existen diferentes algoritmos para llevar a cabo el proceso de integración de las ecuaciones newtonianas en incrementos finitos de tiempo t, siendo los más utilizados el de Verlet 66 y el de “leapfrog”. Estos métodos, además, suelen incorporar algoritmos para acoplamientos a Capítulo 1: Introducción 25│ “baños térmicos” o “pistones” para llevar a cabo simulaciones a temperatura (NTV) o a presión (NTP) constante, respectivamente. En dinámica molecular, a partir de las trayectorias obtenidas, se pueden calcular los promedios termodinámicos de cualquier propiedad molecular, A, como promedios temporales (hipótesis ergódica): Dinámicas Moleculares de Langevin ó Estocásticas: En contraste con las dinámicas moleculares Newtonianas (DM), están basadas en las ecuaciones de Langevin del movimiento, caracterizándose porque incorporan explícitamente el control de temperatura y los efectos amortiguantes del disolvente en la simulación. Esta aproximación genera conjuntos rigurosamente canónicos (NVT). Los efectos amortiguantes se consideran imponiendo una fuerza friccional al el movimiento del soluto a través del disolvente. (Ffriccional). La temperatura del sistema es controlada incluyendo colisiones aleatorias con el disolvente, R(t), en la ecuación básica. Así, la ecuación del movimiento para una partícula i puede ser escrita ahora como: En muchas simulaciones de sistemas soluto-disolvente, sobre todo en las regiones lejanas de la molécula de soluto. Entre las técnicas que incorporan los efectos del disolvente sin requerimiento de moléculas de disolvente explícitas, se encuentran las de “potencial de campo promedio” (PMF) y los modelos de “dinámicas estocásticas” (SD). Una de las principales ventajas de los métodos estocásticos es el ahorro de tiempo computacional, frente a simulaciones con disolvente explícito. Por ello son útiles en aquellos sistemas en los que el principal aspecto de atención es el comportamiento del soluto mientras que el disolvente es de poco interés. Este ahorro posibilita realizar simulaciones mucho más largas. Por ejemplo, Widmalm y Pastor 67 llevaron a cabo dinámicas moleculares y estocásticas de 1 ns, de una molécula de etilenglicol en disolución acuosa con el soluto y 259 moléculas de agua. Las simulaciones de dinámica molecular tardaron 300 horas mientras que las dinámicas estocásticas sólo llevaron 24 minutos. La reducción en la duración de las simulaciones de SD Ecuación de Langevin )(R )( ξ)}({F )( 2 2t dt tdx tx dt txd mi i ii i i    M i N i N irpA M A 1 ),( 1 26│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce no solamente se debe al menor número de moléculas presentes sino también al hecho de que pueden ser usados tiempos de integración mayores. 1.4.- OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL. El punto débil de la hipótesis del segundo mensajero es el que a pesar de los esfuerzos realizados aun no se han aislado y caracterizado adecuadamente desde el punto de vista químico estos segundos mensajeros o IPGs. Nuestro laboratorio, dentro de una aproximación encuadrada dentro de la química biológica, pretende contribuir a la elucidación de estas estructuras. Para ello, la investigación básica realizada, ha estado orientada a establecer una química que funcione eficazmente para preparar posteriormente librerías de compuestos de las que pudieran resultar moléculas activas. Concretamente, los resultados de los trabajos relacionados con el diseño, la síntesis y la actividad biológica de IPGs de tipo A, P y GPIs han sido recogidos en las Tesis doctorales de María Flores, Javier López Prados, Julia Bonilla Carmona, Francisco Alfonso Pérez y Niels Reichardt. Paralelamente, se han efectuado estudios estructurales de los compuestos sintetizados con el fin de contribuir, conjuntamente con las medidas de actividad biológica, a definir y delimitar los requerimientos estructurales de los IPGs. Los resultados de los estudios estructurales se recogen en esta Tesis, y parcialmente en las de Juan Félix Espinosa y Franck Chevalier. El principal objetivo de la presente tesis doctoral, ha sido la realización de un estudio estructural de una serie de compuestos sintéticos, potenciales (figura 9), mediadores de IPGs de tipo A y P, a través de espectroscopia de RMN y de cálculos teóricos de campo de fuerzas. El trabajo realizado se presenta en esta Memoria como se indica a continuación: En el capítulo 2 se presentan los estudios de pseudodisacáridos que contienen como ciclitol: quiro-inositol, mio-inositol y de O-metil-quiro-inositol. Estos productos fueron diseñados a partir de la información fragmentada de la estructura de los compuestos naturales combinada con los posibles mecanismos propuestos para su generación de acuerdo con esta hipótesis. A partir de los resultados obtenidos sobre los compuestos anteriores y basadas en unos estudios de docking sobre el sitio de unión del ATP en la subunidad catalítica de la quinasa dependiente de AMP cíclico, realizados en nuestro laboratorio por el Dr. Félix Cuevas, se establecieron unas nuevas premisas para el diseño racional de potenciales IPGs. Los estudios realizados sobre los compuestos sintetizados bajo este nuevo modelo se presentan en el capítulo 3. A destacar el estudio en disolución realizado 68 sobre un pentasacárido (figura 9) que constituye la estructura lineal conservada de los GPIs de anclaje. Capítulo 1: Introducción 27│ HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH HO HO HO O O HO O OH NH3 HO O PO O HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OP OOH O HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OP O OH O O HO O OH NH3OH HO O O HO OH PO -O O HO O OH NH3 OH HO O O HO OH PO -O O HO O OH NH3 OH HO OH HO OH HO OHO O OH NH3OHHO OH HO OHHO + + + + + - + 9 10 - - + + + 13 12 11 15 14 78 O HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH 16 + O HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH 18 + H3C CH3O HO HO OH O HO O OH NH3 OH 17 + H3C OH O HO HO OH O HO O OH NH3 OH 19 + CH3 OH HO3PO O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO HO O HO O NH3 HO3PO HO HO OH OH HO HO O HO3PO O NH3 OH HO HO OH OH HO 25 26 27 O HO HO HO O O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO O HO HO HO O OH O HO O NH2 OH HO HO OH OH HO O HO O OH O HO O NH2 OH HO HO OH OH HO HO OH 20 21 22 OPOH OO O HO O O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO HO OH 23 O HO O O HO O NH3HO HO OH OH HO HO OH 24 OPOH OOOPOH OO OPOH OO Figura 9. Estructura de los compuestos 7-27 modelos de IPGs que se estudiarán en la presente tesis doctoral. 28│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 1.5.-BIBLIOGRAFIA. a) Reports issued by iupac-iub commission on biochemical nomenclature. Pure Appl Chem. 1974, 40, (3), 277-331. b) Report of iupac commission on nomenclature of organic-chemistry and iupac-iub commission on biochemical nomenclature. Pure Appl Chem. 1974, 37, (1-2), 283-297. 2 Posternak, S. Compt. Rend. Acad. Sci. 1919, 169, 138_140. b). Posternak, Th. Chemistry of the Cyclitols_The Cyclitols 1965, Hermann, Paris. c) Billington, D.C. The Inositol Phosphates, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1993. 3 a) Ferguson, M.A.J.; Williams, A.F. Annu Rev Biochem. 1988, 57, 285-320 b) Ferguson, M.A.J. Curr. Opin. Struct. Biol. 1991, 1, 522-529. c) Mcconville, M.J.; Ferguson, M.A.J. Biochem J. 1993, 294, 305-324 d) Ferguson, M.A.J.; Homans, S. W.; Dwek, R.A.; Rademacher, T.W. Science. 1988, 239, 4841, 753-759. 4 Ikezawa, H. 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J. Magn. Reson. 1997, 129, 125-129. c) de Beer, T.; van Zuylen, C.W.E.M.; Hard, K.; Boelens, R.; Kaptein, R.; Kamerling, J.P.; Vliegenthart, J.F.G. FEBS Lett. 1984, 348, 1-6. 49 a) Lerner, L.; Bax, A. J. Magn. Reson. 1986, 69, 375-380. b) Cavanagh, J.; Palmer, A.G.; Wright, P.E.; Rance, M. J. Magn. Reson. 1991, 91, 429-436. 50 de Vaard, P.; Boelens, R.; Vuister, G.W.; Vliegenthart, J.F.G. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 3232-3234. 51 a) Bricher, H.R.; Müller, C.; Bigler, P. J. Magn. Reson. 1990, 89, 146-152. b) Sabesan, S.; Duus, J.Ø.; Fukunaga, T.; Bock, K.; Ludvigsen, S. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 3236-3246. c) Scott, K.; Keeler, J.; Van, Q.N.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1997, 125, 302-324. 52 Stott, K.; Keeler, J. Magn. Reson. Chem. 1996, 34, (7), 554-558.. 32│ Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 53 a) Bush, C.A.; Cagas, P. Adv. Biophys. Chem. Vol 2. JAI Press 1991. b) Poppe, L.; Von der Lieth, C.W.; Dabrowski, J. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 7762. c) Scardale, J.N.; Prestegard, J.H.; Yu, R.K. Biochemistry. 1990, 29, 9843. d) Bock, K. Pure. App. Chem. 1983, 55, 605. 54 Dios, A.C.; Pearson, J.G.; Oldfield, E. Science. 1993, 55, 1491. 55 a) Karplus, M. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2870. b) Tvaroska, I.; Hricovini, M.; Petrakova, E. Carbohydr. Res. 1989, 189, 359. c) Tvaroska, I.; Taravel, F.R. J. Biomol. NMR. 1992, 2, 421. d) Haasnoot, C.A.G.; de Leeuw, F.A.A.M.; Altona, C. Tetrahedron. 1980, 36, 2783. 56 Neuhaus, D.; Williamson, M.P. The Nuclear Overhauser Effect in Structural and Conformational Analysis. VCH Publisher, New York, 1989. 57 Canales, A.; Jiménez-Barbero, J.; Martín-Pastor, M. Magn. Reson. Chem. 2012, 50, (1), 80- 85. 58 Macura, S. Ernst, R.R. Mol. Phys. 1980, 41, 95-117. 59 Ernst, R.R.; Bodenhausen, G. Wokaun, A. Principles of Nmr in one and two dimensions. Clarendon Press, Oxford. 1987. 60 Aubin, Y.; Prestegard, J. H. Biochemistry. 1993, 32, 3422-28. 61 Tjandra, N.; Bax, A. Science. 1997, 278, 1111-14. 62 Bock, K. Pure. Appl.Chem. 1983, 55, 605. 63 a) Asensio, J. L.; Jiménez-Barbero, J. Biopolymers. 1995, 35, 55. b) Homans, S.W. Biochemistry. 1990, 29, 9110. c) Acquott,i D.; Cantu, L.; Ragg, E.; Sonnino, S. Eur. J. Biochem. 1994, 225, 271. 64 Edinger, S.R.; Cortis, C.; Shenkin, P.S.; Friesner, R.A. J. Phys. Chem B. 1997, 101, 1190- 1197. 65 Metropolis, N.; Rosenbluth, A.W. Rosenbluth, M.N.; Teller, A.H.; Teller, E. J. Chem. Phys. 1953, 21, 1087-1092. 66 a) Verlet, L. Phys. Rev. 1967, 159, 98. b) Harvey, S.C.; McCammon, J.A. Dynamics of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, 1987. 67 Widmalm, G.; Pastor, R.W. J. Chem. Soc. Faraday. Transactions. 1992, 88, 1747-1754 68 Martín-Lomas, M.; Khiar, N.; García, S.; Koessler, J-L.; Nieto, P.M.; Rademacher, T.W. Chem. Eur. J. 2000, 6, (19), 3608-3621. CAPITULO 2 ESTUDIOS DE PSEUDODISACÁRIDOS MIMÉTICOS DE IPG. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 40│ 2.2.2.- CALCULOS TEÓRICOS DE CAMPOS DE FUERZAS. Los análisis conformacionales teóricos de los compuestos 7-19, se realizaron mediante cálculos de campos de fuerza empleando técnicas de mecánica y dinámica molecular. Estos compuestos, además de un esqueleto de tipo carbohidrato, contienen grupos cargados, lo supone una dificultad añadida a este tipo de análisis. Estas restricciones limitaban la elección del campo de fuerzas ya que éste debería modelar adecuadamente características propias de los carbohidratos, 34 al mismo tiempo que deberían estar adecuadamente parametrizados los grupos fosfato y amonio. Por lo tanto, de los campos de fuerza accesibles en nuestro grupo en el momento de la realización de esta tésis: MM2* (modificación MM2 de 1987),35 MM3* (modificación MM3 de 1991),36-39 AMBER* (modificación AMBER de 1984 y 1986),40-43 OPLSA* (modificación OPLS/A de 1991)44-46 y por último MMFF implementados en Macromodel (versiones 5.5 y 6.0);47-53 MM2, MM3, MMFF9447-53, AMBER36, 42 y TRIPOS54 incluidos originalmente en Sybyl, y otros adaptados por Imberty et al. ,55 para el análisis conformacional de carbohidratos, pocos eran validos en nuestro caso. Únicamente AMBER* presentaba simultáneamente parámetros específicos de alta calidad para carbohidratos y ésteres fosfóricos. Por otro lado, el campo de fuerzas AMBER (incluyendo parámetros de Homans) en su adaptación a Insight II/DISCOVER 94.0, se había empleado previamente en el estudio de las estructuras 1-32 aunque no estaba disponible en nuestro grupo. Dados estos antecedentes se decidió utilizar MACROMODEL con el campo de fuerzas AMBER*. Esta implementación permitía optar entre dos reparametrizaciones específicas para carbohidratos: la de Homans de 199056 y la más moderna de Still et al.40, 57. La primera fue generada ampliando los parámetros de Ha et al.58 existentes para monosacáridos, basándose en cálculos ab initio del dimetoximetano59. La segunda es mucho más moderna (1996), ha sido desarrollada de novo a partir de cálculos de orbitales moleculares ab initio sobre modelos de piranosas,40, 60, 61 y optimizada para el modelo contínuo de disolvente GB/SA62, 63. En general se empleó la versión de Still debido a que fue la más precisa en un estudio comparativo previo (Apéndice 1) probablemente por derivar de métodos de cálculo más sofisticados. En ciertos casos en los que se consideró interesante, se contrastaron los resultados de esta parametrización con la de Homans. Los cálculos de mecánica molecular consistieron en el estudio sistemático del espacio conformacional usando mapas adiabáticos de tipo Ramachandran del enlace glicosídico o mediante simulaciones de dinámica molecular examinando esencialmente el mismo elemento. Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 41│ Mapas Adiabáticos Al ser el enlace glicosídico el principal punto de flexibilidad de los carbohidratos y asumiendo que los residuos que forman parte de un determinado enlace glicosídico son rígidos, se puede suponer que la geometría global de los confórmeros de baja energía, dependera principalmente de las rotaciones en torno a los enlaces glicosídicos (). Por ello, para explorar el espacio conformacional accesible de los disacáridos objeto de nuestro estudio 7-19, se realizado una búsqueda sistemática alrededor de estos enlaces.64-66 Se han generado el colectivo de confórmeros representativos de todo el espacio conformacional () mediante la variación sistemática de dichas torsiones, en pequeños incrementos  sobre el intervalo total de 360º (mapas rígidos). Posteriormente, se obtuvieron los mapas relajados por minimización de la energía de todos los grados de libertad excepto en las torsiones directoras (). Estos describen más ampliamente la superficie de energía potencial accesible, disminuyendo las barreras entre mínimos relativos, y localizando mínimos de energía menores que la/s estructura/s de partida. Sin embargo, a pesar de la mayor eficacia en la localización de las regiones de mínima energía, los mapas no consideran el problema de “mínimos múltiples” (ver capitulo 1), y para un punto dado () del espacio conformacional descrito por el mapa relajado es posible que se puedan producir aún, conformaciones de menor energía por rotación de los grupos exocíclicos. Por esto se han construido los correspondientes mapas adiabáticos, mediante una variación sistemática de todas las posibles combinaciones de orientaciones de todos los grupos exocíclicos presentes en los compuestos analizados. Si asumimos que cada grupo exocíclico puede encontrarse mayoritariamente en cada una de las 3 conformaciones “alternadas”, habría que generar 3N conformaciones diferentes para cada punto del espacio (), siendo N el número de grupos exocíclicos. En general, se han considerado los rotámeros (gg, gt, y tg) del grupo hidroximetilo de la hexosamina y también posibles orientaciones de los grupos fosfato y metilo. En nuestro caso, para reducir el coste computacional, se han considerado solo las disposiciones de los grupos hidroxilos secundarios que den lugar a un mayor número de enlaces de hidrógeno, y para ello, los OH- secundarios se orientan bien en sentido de las manecillas del reloj (sentido clockwise) o bien en sentido contrario (anticlockwise). Se ha empleado este tipo de aproximación, porque al tratarse de carbohidratos de un tamaño y flexibilidad limitados, el tiempo computacional no es excesivo y en este tipo de aproximaciones constituye una de las formas más eficaces de reducir el coste computacional, manteniendo la seguridad de que se exploraran las configuraciones del sistema de mayor sentido físico-químico. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 42│ Dinámicas Moleculares (DM). Como complemento al análisis sistemático empleando mapas adiabáticos (,), se realizaron en los casos de los compuestos 18-21 simulaciones de dinámica molecular. Esta alternativa, al permitir la obtención de información adicional acerca de la dinámica y flexibilidad de los compuestos estudiados, resultaba atractiva en las estructuras estudiadas en esta tesis doctoral. En primer lugar se realizaron simulaciones de dinámica molecular clásica, NVT in vacuo,67, 68 de los compuestos 18-21, empleando como estructuras de partida aquellas de mínima energía encontradas mediante búsqueda sistemática. Pero, sin duda como se describe más adelante, los mejores resultados se obtuvieron empleando dinámicas estocásticas o de Langevin.69, 70 2.3.- RESULTADOS. El estudio conformacional de los disacáridos 7-19 en disolución se ha llevado a cabo3 mediante una combinación de métodos experimentales de RMN y de cálculos teóricos de campos de fuerzas (mecánica y dinámica molecular). Ambas técnicas han sido completamente independientes en su adquisición. Es decir, en la realización de los cálculos no se han empleado restricciones derivadas de los datos experimentales. Durante el análisis de los resultados, las descripciones teóricas se han empleado para interpretar los resultados experimentales, y recíprocamente, los datos de RMN han sido utilizados para validar los resultados teóricos. Para la presentación y discusión de los resultados que sigue, se han agrupado los pseudodisacáridos 7-19 de acuerdo con ‘motivos estructurales’ característicos, basándose en la estereoquímica del enlace glicosídico y en el isómero de inositol que lo compone. Así, la aplicación estos criterios produce seis motivos estructurales: motivo estructural compuestos D-glucosamina  (1→6) D-mio-inositol D-glucosamina  (1→6) D-mio-inositol D-glucosamina  (1→6) D-quiro-inositol D-glucosamina  (1→6) D-quiro-inositol D-hexosamina  (1→6) D-pinitol D-hexosamina  (1→6) D-pinitol 9 y 10 11 y 12 13, 14 y 15 16 y 17 18 y 19 20 y 21 Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 43│ 2.3.1.- Motivo estructural glucosamina  (1→6) mio-inositol. O HO O OH NH3 OH HO O O HO OH PO -O O HO O OH NH3 OH HO OH HO OH HO + + 9 10 La asignación completa de los espectros 1H-RMN y 13C-RMN, de los disacáridos 9 y 10, se muestra en la tabla 1. Tabla 1. Desplazamientos químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y constantes de acoplamiento 3JH-H (Hz), en D2O, de los compuestos 9 y 10 a 25ºC y a 500 MHz. 9 10 9 10  [1H] 3JH-H  [1H] 3JH-H  [13C]  [13C] Glucosamina H-1 5,16 3,67 5,63 3,76 C-1 100,3 95,5 H-2 2,72 3,70/10,25 3,33 3,67/10,66 C-2 55,5 54,6 H-3 3,54 9,70 4,01 9,14/10,69 C-3 74,0 69,8 H-4 3,37 9,62 3,43 10,14/9,22 C-4 70,0 70,3 H-5 3,95 9,55 4,24 2,68/5,75 C-5 72,8 72,3 H-6 3,73 - 3,74 12,51/2,32 C-6 60,7 61,0 H-6’ 3,73 - 3,95 12,55/5,70 Ciclitol H-1 3,67 2,60/9,74 3,56 3,04/9,92 C-1 71,9 70,9 H-2 3,94 2,75/2,80 4,34 2,74/2,74 C-2 72,8 71,4 H-3 3,45 2,80/10,05 4,09 8,72/2,68 C-3 71,3 73,6 H-4 3,57 - 3,99 9,83/9,67 C-4 72,5 76,8 H-5 3,29 9,11 3,55 9,47/9,47 C-5 73,3 75,3 H-6 3,63 8,80 3,68 9,82/9,58 C-6 80,9 72,9 Los valores en las constantes de acoplamiento, indican que el anillo de piranosa de ambos compuestos se encuentra en conformación de silla canónica 4C1. Por el contrario, para el anillo de ciclitol del compuesto 10 indican una distorsión producida por el anillo de cinco miembros fusionado del fosfato cíclico. Las superficies adiabáticas de los enlaces glicosídicos de 9 y 10 fueron construidas a partir de los correspondientes mapas relajados (36 y 12 respectivamente), siguiendo la metodología descrita en el apartado 2.2. Estos junto con los mapas de población y la superposición de las regiones de proximidad interprotónica predichos para los compuestos 9 y 10 se muestran en las figuras 2.2 y 2.3. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 44│ Figura 2.2. Mapa de energía adiábatico (izda) calculado para el compuesto 9 y superposición de los NOEs predichos en el mapa de distribución de probabilidad conformacional (derecha). Los niveles de contornos se muestran cada 5KJ mol-1 para la energía, las distancias interprotónicas a 2,5 y 3 Å y los de probabilidad a 10, 5.5 y 1%. Figura 2.3. Mapa de energía adiábatico (izda) calculado para el compuesto 10 y superposición de los NOEs predichos en el mapa de distribución de probabilidad conformacional (derecha). Los niveles de contornos se muestran cada 5KJ mol-1 para la energía, las distancias interprotónicas a 2,5 y 3 Å y los de probabilidad a 10, 5.5 y 1%. En ambos casos las superficies adiabáticas predicen dos mínimos locales, uno absoluto situado en la zona central del mapa adiabático, de tipo syn-, y otro de menor energía en la zona anti-±180º)Ambos están de acuerdo con la orientación predicha por el efecto exo-anomérico. Los mapas de distancias interprotónicas inferiores a 3Å indican que mientras que el mínimo syn-se encontraría caracterizado por el NOE exclusivo H1’-H6; el mínimo anti-por su parte lo sería por los NOEs H1’-H5 y H1’-H1. En los experimentos NOESY y ROESY registrados para 9 y 10, se aprecian simultaneamente los NOEs H1’-H6 y H1’-H5, indicando la coexistencia de ambos mínimos en disolución. El NOE H1’-H1, se pudo observar en el caso del compuesto 10, pero no en el de 9 debido a solapamiento de señales. La mayor intensidad del NOE H1’-H6 respecto a H1’-H1 y Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 45│ H1’-H5 para 10 indican una mayor población del mínimo syn-. En el caso de 9 la diferencia de desplazamiento químico entre las señales correspondientes a H1 y H6 es comparable a la constante de acoplamiento entre ambos lo que complicó este análisis. Con el fin de determinar cualitativamente cual de los dos NOEs exclusivos era mayoritario, se realizó un experimento HMQC-NOESY. Mediante este experimento (Figura 2.4) se pudo separar los picos de cruce por su frecuencia de carbono determinando sin dudas, la mayor intensidad del NOE H1’-H6 con respecto a H1’-H1. De esta manera, al menos cualitativamente se puede establecer que los compuestos 9 y 10, presentan estructuras muy similares y sus estructuras tridimensionales, estarían descritas por un confórmero mayoritario de tipo syn- en rápido intercambio con un confórmero anti- minoritario. Figura 2.4. Secciones del espectro 2D-HMQC-NOESY (tiempo de mezcla 400 ms) a 500 MHz, 298 K, para 9. Para cuantificar las distancias interprotónicas clave se realizaron series de experimentos 1D-NOESY y 1D-ROESY a distintos tiempos de mezcla. Los valores de las constantes de velocidad de relajación cruzada y de las distancias derivadas de éstas se recogen H-1’ C-6 C-1 H-1’ C-6 C-1 Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 46│ en la tabla 2. En el caso de 9 no fue posible el cálculo preciso de todas las distancias interprotónicas debido al solapamiento espectral. Las distancias experimentales se compararon con las estimadas a partir de los cálculos de mecánica molecular (tabla 2) con el fin de comprobar la calidad de estos. Estas distancias teóricas se calcularon como el promedio <r-6> de las distancias de todos los confórmeros empleados para la construcción de los correspondientes mapas adiabáticos ponderadas en la probabilidad de cada confórmero (véase parte experimental). Tanto en el caso de 9 como de 10, se observa una ligera desviación sistemática de las distancias teóricas respecto a las experimentales. Esta discrepancia tiene su origen en una subestimación de la población del mínimo anti- que produce una sobreestima las distancias características de la estructura syn, H1’-H1 y H1’-H5. Estos resultados no mejoraron en nuestras manos a pesar de repetir los cálculos empleando otros campos de fuerza u otros tratamientos electrostáticos. Tabla 2. Constantes de velocidad de relajación cruzada  y distancias interprotónicas experimentales calculadas para 9 y 10 en D2O y a 25º C. NOESY ROESY Teórica Pareja de Protones  s-1 d (Å)  s-1 d (Å) d (Å) 9 H1’-H2’ 0,081 0,093 H1’-H6 + H1’-H1 0,112 0,058 H1’-H5 0,014 3,41 0,009 3,23 3,72 10 H1’-H2’ 0,074 0,078 H1’-H5 0,018 3,00 0,076 2,38 4,51 H1’-H6 0,077 2,35 0,189 2,05 2,28 H1’-H1 0,011 3,24 0,010 3,35 3,86 Esta desviación en la estimación de las poblaciones relativas de los dos confórmeros está en aparente contradicción con trabajos previos sobre 1 y 2 en los que se predice una población apreciable del mínimo anti-  en 1.2 Esta divergencia puede ser atribuida al empleo de otra forma del campo de fuerzas AMBER según su implementación en DISCOVER33. Además debido a que en los dos estudios se emplearon técnicas de diferente sensibilidad (2D- NOESY o 1D-NOESY) para la obtención los datos experimentales, no es posible valorar si esta aparente discrepancia en los resultados teóricos refleja o no una realidad demostrable. El estudio del Prof. Jiménez-Barbero, atribuye un papel conformacional clave a la interacción electrostática de los grupos amonio y fosfato.2 Estos grupos se encuentran próximos en el espacio en el mínimo syn- en el compuesto 2 estabilizándolo respecto a la posibilidad tipo anti- que no fue detectado. Por el contrario, en el caso de 1 el fosfato cíclico no es capaz de producir esta estabilización y se observan las dos conformaciones syn y anti- en equilibrio. Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 47│ En nuestro caso, el comportamiento de 9, que carece de grupo fosfato y por tanto no puede establecer interacciones con el grupo amonio, es similar a 10, lo que confirmaría esta explicación. Por otro lado, se podría esperar que en el caso de 10 la configuración opuesta del ciclitol pudiera dar lugar a una estabilización electrostática de la forma anti. Sin embargo, el estudio de los modelos moleculares correspondientes a los dos mínimos calculados para esta serie revela, que la distancia entre los grupos cargados no es la adecuada para ello. El establecimiento de interacciones electrostáticas implicaría una importante desviación de los valores Φ/Ψ del mínimo. El que no se aprecie una gran modificación de las proporciones de las dos especies, vendría a señalar que esta interacción electrostática no es capaz por si sola, de dirigir la conformación alrededor del enlace glicosídico. Serían los efectos estereoelectrónicos característicos de carbohidratos (efecto gauche y exo-anomérico) los principales responsables de su geometría, que la interacción electrostática modularía en un cierto grado. El solapamiento impide la cuantificación del NOE exclusivo de la conformación syn en el caso de 7. Por ello, para comparar las poblaciones relativas de 9 y 10 es necesario analizar las proporciones del NOE exclusivo del conformero minoritario H1’-H5 entre ambos compuestos. Para ello se ha empleado el cociente con una distancia fija, H1’-H2’ / H1’-H5, (tabla 3) que indica que la proporción de la conformación minoritaria es mayor para el compuesto con fosfato cíclico Tabla 3. Proporción de NOE para 9 y 10, obtenidas a partir de los datos de  NOE procedentes de la tabla 4. 9 10 H1’-H2’ / H1’-H5 5,8 4,0 Figura 2.5. Estructuras de mínima energía para 9 (superior) y 10 (inferior), en sus conformaciones syn-  (izda) y anti-  (derecha). Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 48│ El análisis de las estructuras de mínima energía de los dos conformeros syn- y anti-  entre 9 y 10 (Figura 2.5), sugiere la presencia de interacciones estabilizantes en 10 debidas al grupo fosfato cíclico. Por un lado, el grupo fosfato de 10 podría permitir establecerse un enlace de hidrógeno entre uno de sus oxígenos y el grupo hidroxilo en posición 6 del residuo de glucosamina que estabilizaría la estructura syn- respecto a 9. Por otro lado la interacción electrostática amonio fosfato lo haria para la estructura anti-. El predomino de la segunda interacción explicaría el aumento de la población del mínimo anti- en 10 con respecto a 9. 2.3.2.- Motivo estructural glucosamina  (1-6) mio-inositol. O HO O OH NH3OH HO O O HO OH PO O OHO O OH NH3OHHO OH HO OHHO ++ 11 12 - Los espectros de RMN han sido asignados como se ha indicado en el apartado anterior. Sus espectros, tanto de 1H como de 13C son característicos de un enlace glicosídico  con desplazamientos a campo alto de las señales y acoplamientos JH1-H2 ~ 8Hz. Tabla 4. Desplazamientos químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y constantes de acoplamiento 3JH-H (Hz), en D2O, de los compuestos 11 y 12 a 25ºC y a 500 MHz. 11 12 11 12  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H  (13C)  (13C) Glucosamina H-1 4,63 8,3 4,91 8,4 C-1 106,1 100,6 H-2 2,67 8,9 2,96 10,3/10,3 C-2 58,9 56,4 H-3 3,92 9,1 3,61 8,9/9,1 C-3 77,9 43,2 H-4 3,36 9,9 3,44 9,6/9,9 C-4 71,7 69,8 H-5 3,45 2,2/6,0/11,7 3,51 2,9/2,2 C-5 78,4 76,5 H6a/H6b 3,89 2,0 12,3 3,73 5,5/5,4 C-6 62,8 60,7 3,70 6,1/12,3 3,90 12,5/12,5 Ciclitol H-1 3,59 2,8/9,9 3,75 5,3 C-1 71,9 69,8 H-2 4,05 2,8 4,17 4,2/4,7 C-2 74,1 77,3 H-3 3,50 2,8 4,56 8,3/8,3 C-3 73,2 79,4 H-4 3,62 9,6 4,06 10,3/9,2 C-4 74,6 82,3 H-5 3,44 9,4 3,40 9,9/9,9 C-5 76,1 70,5 H-6 3,79 9,6 3,68 9,7 C-6 84,6 71,7 En este caso para el cálculo de los correspondientes mapas adiabáticos y de distribución de poblaciones (Figura 2.6) se consideraron un total de 12 mapas relajados en el Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 49│ caso de 11 y 36 para 12, lo cual supuso un total de 7200 y 2400 confórmeros estudiados respectivamente. Tal y como cabe esperar para estructuras con enlaces glicosídicos de tipo , se observan tres mínimos locales en los mapas relajados, los ya conocidos syn-, anti-, y aparece el denominado mínimo anti-valores deenº). Entre estas, como cabía esperar la conformación syn- es la energéticamente favorecida. Los NOE exclusivos que caracterizarían estos mínimos son el H1’-H6 acompañado por contactos débiles H1’-H1 para el syn-; H1’-H1 y H1’-H5 para la orientación anti-, mientras que H2’-H6 sería el NOE exclusivo para la conformación anti-. Figura 2.6. Mapas de energía adiabáticos calculados para el compuesto 11 (superior derecha) y 12 (inferior derecha) y superposición de los NOEs predichos en los mapas de distribución de probabilidad conformacional (superior izda para 11 e inferior izda para 12). Los niveles de contornos se muestran cada 5KJ mol-1 para la energía, las distancias interprotónicas a 2,5 y 3 Å y los de probabilidad a 10, 5.5 y 1% para ambos compuestos. El espectro NOESY de 11 mostró picos de cruce intensos entre H1’-H6 y débiles para H1’-H1 (Figura 2.7) indicando el predominio de estructuras de tipo syn-. Desafortunadamente el contacto exclusivo de la conformación anti-Ψ (H1’-H5), no puede ser cuantificado directamente debido al solapamiento con el NOE intra-residuo H1’-H5’. Dado que tanto H3’ como H5’ se encuentran a una distancia equivalente de H1’ y experimentan similares movimientos internos la comparación entre las intensidades de los picos H1’-H3’ y la suma de Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 56│ Figura 2.11. Estructuras minimizadas para el motivo estructural  (1-6) quiro-inositol, submínimo A1(arriba) para el compuesto 13 (izquierda) y 14 (derecha) y submínimo A2 (abajo) para los compuestos 15 (izquierda) y 14 (derecha). Figura 2.12. Red de enlaces de hidrógeno que muestra el compuesto 14 únicamente a través del submínimo de tipo A1. Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 57│ 2.3.4.- Motivo estructural glucosamina  (1-6) quiro-inositol. HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OP OOH O HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH + - + 17 16 Los compuestos 16 y 17, son los representantes del patrón estructural  (1→6) quiro-inositol. Los espectros de 1H-RMN de ambos fueron asignados (tabla 8), aunque en este caso la escasa cantidad de material disponible impidió el registro y asignación de los espectros de 13C. Como se observó para los derivados  (1→6) quiro-inositol, las constantes de acoplamiento indican que los anillos de los residuos de glucosamina y ciclitol tienen un comportamiento monoconformacional. Tabla 8. Desplazamientos químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y constantes de acoplamiento 3JH-H (Hz), en D2O, de los compuestos 16 y 17 a 25ºC y a 500 MHz. 16 17  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H Glucosamina H-1 4,57 8,2 4,66 8,2 H-2 2,71 9,9 2,77 8,7/10,3 H-3 3,41 9,5 3,45 9,4 H-4 3,37 9,3 3,36 9,4 H-5 3,47 2,3/9,3 3,47 2,2/ 5,5/9,9 H6a/H6b 3,74 2,3/12,3/5,6 3,90 2,2/12,7/5,7 3,92 10,7 3,71 10,4 Ciclitol H-1 4,26 3,6 4,58 3,0/4,2/8,5 H-2 3,77 3,2/9,5 3,68 2,6/9,8 H-3 3,57 9,4 3,62 8,8 H-4 3,62 9,5 3,54 9,4 H-5 3,84 3,3/ 9,7 3,93 10,0 H-6 4,06 3,7 4,19 3,8 Las superficies de energía y mapas de probabilidad globales de los derivados de - quiro-inositol 16 y 17 calculadas siguiendo el mismo protocolo empleado con resto de compuestos presentan un único mínimo syn- a  56±5, 17 (Figura 2.13). Esta predicción se encuentra de acuerdo con el efecto exo-anomérico para una disposición  para la unión glicosídica. En estos mapas se aprecia claramente que aunque la posición del mínimo global es muy similar en ambos casos, la región accesible del derivado con fosfato 17 está mucho más restringida que para 16. Al igual que en el caso de los anómeros  de la serie quiro en los Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 58│ mapas / se aprecia una considerable disminución de la flexibilidad con respecto a análogos en la serie mio-inositol. Figura 2.13. Mapas de energía adiabáticos calculados para el compuesto 16 (superior derecha) y 17 (inferior derecha) y superposición de los NOEs predichos en los mapas de distribución de probabilidad conformacional (superior izda para 16 e inferior izda para 17). Los niveles de contornos se muestran cada 5KJ mol-1 para la energía, las distancias interprotónicas a 2,5 y 3 Å y los de probabilidad a 10, 5.5 y 1% para ambos compuestos. Experimentalmente se detectan dos NOEs glicosídicos intensos: H1’-H6 y H1’-H1, este último con menor intensidad. De acuerdo con los mapas de distancias interprotónicas  (Figura 2.13) estos corresponden a los NOEs exclusivos de la única conformación predicha por los cálculos. No se encuentra, incluso a tiempos de mezcla largos, ninguna evidencia de otros NOEs interglicosídicos como H1’-H4 ó H1’-H2, que serían representativos de una hipotética situación anti-. Los resultados experimentales confirman cualitativamente las predicciones teóricas, definiendo el enlace glicosídico de 16 y 17 como un único mínimo de tipo syn- A partir de las constantes de relajación cruzada (tabla 9) se calcularon las distancias experimentales para 17. Desafortunadamente esto no fue posible para 16 debido a la ausencia de un valor fiable para la constante NOE de una distancia de referencia porque H1’-H3’ y H1’-H5’ están solapadas y H1’-H2’, contaminado por acoplamiento escalar. Tampoco se puede considerar como referencia el promedio de distancias H1’-H3’ y H1’-H5’, puesto que debido a Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 59│ un acoplamiento escalar fuerte de H3’ con H4’ se produce una pérdida de NOE de H3’ a H4’ por esta vía indirecta. A pesar de no poder disponer de distancias experimentales fiables la similitud de los valores de NOE para H1’-H6 y H1’-H1, entre los compuestos 16 y 17 permite suponer un gran parecido de su estructura en disolución. Para 17 al igual que ocurrió con el motivo β miose observa una buena concordancia entre los resultados experimentales y la predicción, que es mejor en el caso de las distancias calculadas sobre el espacio Φ,Ψ completo que sobre las estructuras relajadas. Esta observación es indicativa de la flexibilidad del enlace glicosídico dentro de este mínimo como predice el mapa adiabático (Figura 2.13). En este compuesto aparece también un pico de cruce H1’-H4’ originado por fuerte acoplamiento entre H3’-H4’. Tabla 9. Constantes de velocidad de relajación cruzada  , y distancias interprotónicas experimentales para 16 y 17 calculadas en D2O y a 25ºC. Las distancias teóricas están calculadas sobre de mapas adiabáticos. Exp. Teórica Teórica< r > Par Protones  [s.1] d [Å] d [Å] d [Å] 16 H1’-H3’ + H1’-H5’ (referencia solapada) 0,117 H1’-H4’ 0,060 H1’-H6 0,156 2,30 2,30 H1’-H1 0,029 3,77 3,43 H1’-H2’ 0,023 H1’-H3’ (referencia) 0,121 17 H1’-H5’ (referencia) 0,134 H1’-H6 0,121 2,49 2,36 2,28 H1’-H1 0,023 3,29 3,87 3,47 Figura 2.14. Estructuras de mínima energía para los compuestos 16 (izda) y 17 (derecha). Cuando se compararon las estructuras relajadas de 16 y 17, representadas en la figura 2.14, se pudo apreciar un enlace de hidrógeno estabilizante entre protón del fosfato y el oxígeno del anillo de piranosa O-5 Glc, en 17. Esta interacción inter-resíduo, ausente en 16, Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 60│ podría explicar la menor dispersión del mínimo syn- para 17 que reflejan los cálculos teóricos. 2.3.5.- Motivo estructural hexosamina (16) Pinitol HO HO OH O HO O OH NH3 HO OMe + 18 OH HO HO OH O HO O OH NH3 OH OMe + OH 19 Las razones por las que se diseñaron y sintetizaron los compuestos 18 a 21, se alejan en cierto modo de la busqueda sistemática en la que se basaron los modelos de IPGs de tipo A y de tipo P. Como consecuencia de este cambio aparecieron dos nuevos componentes, los residuos de pinitol y de galactosamina. Aunque ambos implican nuevas características estructurales a la hora de la interacción con potenciales receptores, no deberian suponer una gran alteración de la geometría del enlace glicosídico, puesto que las diferencias con inositol y glucosamina están alejadas de él. Por ello, es especialmente interesante determinar si estos cambios no alteran en esencia la geometría del esqueleto común con respecto a los derivados de quiro-inositol 13 a 17. De ser así, mediante la comparación de las actividades biológicas, se podría deducir la importancia relativa de los grupos en posición 4 de la hexosamina y del pinitol en su función como IPGs. Coincidiendo con esta modificación, también se decidió ampliar los cálculos teóricos incluyendo simulaciones de dinámica molecular para complementar los mapas adiabáticos ya que estas consideran más adecuadamente la flexibilidad de los pseudodisacáridos. Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 61│ Empleando la metodología habitual fue posible realizar asignación inambigua de los compuestos 18 y 19 (tabla 10). Los anillos de piranosa y pinitol adoptaron la esperada conformación 4C1 como indican los valores de las constantes de acoplamiento. Tabla 10. Desplazamientos químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y constantes de acoplamiento 3JH-H (Hz), en D2O, de los compuestos 18 y 19 a 25ºC y a 500 MHz. 18 19  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H Hexosamina H-1 5,07 3,5 5,31 3,85 H-2 2,97 - 3,54 11,2 H-3 3,70 9,4 4,11 3,3 H-4 3,43 10,4 4,02 2,0 H-5 3,99 4,2 4,26 6,5 H6a/H6b 3,77 2,7 3,74 2,5 3,77 - 3,74 - Ciclitol H-1 4,12 3,5 4,16 3,4 H-2 3,74 10,1 3,74 10,0 H-3 3,31 9,4 3,34 9,3 H-4 3,65 10,4 3,68 10,5 H-5 3,85 3,7 3,89 3,5 H-6 4,02 3,8 4,11 3,8 El análisis conformacional de 18 y 19 mediante las superficies de energía adiabáticas de los ángulos de torsión glicosídicos empleando AMBER* y el modelo GB/SA predice, para ambos compuestos, un único mínimo del tipo sin- con población detectable (Figuras 2.15). Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 62│ Figura 2.15. Mapa de energía adiábatico (derecha) y mapa de distribución de probabilidad (izquierda), calculados para 18 (arriba) y para 19 (abajo). El comportamiento de ambos compuestos es similar al de los derivados de quiroinositol con enlaces α 13-15; se distinguen dos subminimos locales en los mapas adiabáticos de 18 y 19. Por lo tanto parece que, como cabia esperar, la inclusión del grupo metoxilo en el anillo de inositol no afecta apreciablemente a la disposición adoptada por los enlaces glicosídicos. La semejanza entre los mapas de 18 y 19 también indicó que la estereoquímica de la posición 4 de la hexosamina no altera el comportaminento del enlace glicosídico, conclusión que por las mismas razones también era presumible. Los potenciales NOE exclusivos deducidos de los mapas de distancias interprotónicos son similares a los de los compuestos análogos 13-15: H1’-H6 para la conformación syn-, y H1’-H5, para la anti-. El NOE H1’-H1 intersecta con ambas regiones y por lo tanto no se puede emplear con carácter de diagnostico. Experimentalmente se observaron para 18 y 19 los NOEs entre H1’-H6 y H1’-H1, mientras que en ningún caso se pudo detectar la presencia del NOE H1’-H5. Por lo tanto, cualitativamente se puede concluir que los compuestos con el motivo hexosamina  (1-6) pinitol se presentan en disolución como un único tipo de conformación del tipo syn-. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 63│ Simulaciones de dinámica molecular A lo largo de los estudios anteriores se habia observado que al considerar todo el espacio Φ/Ψ para la estimación de distancias teoricas, el ajuste con los datos experimentales mejoraba. Esta observación indica que estos compuestos poseen una flexibilidad apreciable, incluso aquellos considerados como semirigidos, tal y como corresponde a su naturaleza glucídica. Por esta razón se decidió ampliar el estudio teórico incluyendo simulaciones de dinámica molecular para mejorar la descripción de la flexibilidad. En el momento de comenzar este estudio no había antecedentes en el empleo en simulaciones de dinámica molecular de la modificación de Senderowitz et al. al campo de fuerzas AMBER, que había sido seleccionada por sus mejores resultados en las simulaciones de mecánica molecular. Por esta razón se decició realizar otro estudio comparativo de sus resultados en simulaciones de dinámica molecular con la alternativa clásica de Homans. En primer lugar se realizaron dinámicas moleculares de 2 ns de los compuestos 18-21 partiendo de estructuras generadas mediante minimización exhaustiva de los mínimos absolutos determinados a partir de los mapas adibáticos y empleando condiciones típicas: acoplamiento a baño térmico de 0,1 ps, =80 y el algoritmo SHAKE71. Los resultados no fueron en absoluto satisfactorios. Se observó un fuerte amortiguamiento de las oscilaciones de los ángulos de torsión  al avanzar la simulación (Figura 2.16). Figura 2.16. Valores del angulo de torsión  y energía total durante simulaciones de dinámica molecular de 2ns con ε=80 y a 25ºC del 18. 0 500 1000 1500 2000 -180 -120 -60 0 60 120 180 t(ps)  0500 1000 1500 2000 400 410 420 430 440 450 460 470 ETOTAL (KE+PE) t (ps) Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 64│ Se pensó que o bien el acoplamiento al baño térmico era excesivo o que la estructura de partida no era estable. Sin embargo, ni la cuidadosa minimización de la geometría inicial, ni la relajación del acoplamiento al baño térmico (desde 0,1 hasta 5 ps), evitaron el efecto amortiguante, aunque lo disminuyeron. Tampoco se consiguieron simulaciones aceptables ni incluyendo protocolos de equilibración con etapas de calentamiento progresivo (desde 0ºC hasta 25ºC), ni variando las constante dielectrica del medio (desde 1 a 80) 56, 72 para modular el peso de las interacciones electrostáticas. Con el fin mejorar el control sobre el balance energético se emplearon dinámicas estocásticas o de Langevin (SD). Estas incluyen la regulación de la energía cinética en las ecuaciones básicas de la simulación por lo que proporcionan, entre otras innovaciones, una mejora en el comportamiento de la temperatura durante la trayectoria. Las inestabilidades e imperfecciones observados anteriormente se evitaron completamente al emplear la dinámicas estocasticas tal y como se implementan en el programa Macromodel. Tras establecer las condiciones óptimas de simulación se procedió a calcular las trayectorias durante 5 ns de los derivados 18-19 considerando dos tratamientos electrostáticos (=80, GB/SA) y dos parametrizaciones (Senderowitz et al/ Homans) diferentes. Los resultados de las simulaciones (Figura 2.17), indicaron la presencia de un único mínimo de tipo syn-, en la zona central del mapa (, ) no observándose interconversiones hacia regiones de tipo anti- . Estos resultados, presentan un acuerdo cualitativo con los mapas adiabáticos calculados mediante MM (Figura 2.15). Dados los errores observados en las dinámicas newtonianas se tuvo especial precaución en comprobar que en las nuevas condiciones el sistema era simulado de forma realista. Para ello, se repitieron las simulaciones partiendo de estructuras con diferentes orientaciones del grupo hidroxílo primario (gg, gt y tg) o metilo en posición 3 del residuo de inositol. En todos los casos se comprobó que tras un periodo de equilibración los resultados eran independientes de la estructura de partida. Las trayectorias de los ángulos torsionales  y  fueron similares, independientemente de la parametrización empleada y de si el carbohidrato en posición no reductora, era glucosamina o galactosamina. Los valores (, ) promedio obtenidos tras 5 ns de simulación fueron (-41º, -21º) y (-45º, -26º) para 18 y (-42º, - 21º) y (-45º, 26º) para 19, empleando respectivamente los parámetros de Homans y Stille. Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 65│ Figura 2.17. Mapas de la distribución de los ángulos de torsión glicosídicos durante simulaciones de 5ns mediante dinámica estocástica, de los compuestos 18 (arriba) y 19 (abajo) empleando las parametrizaciones de Senderowitz et al (izda) y Homans (derecha), junto con la superposición de los NOEs exclusivos para la conformación syn-  (H1’-H6 y H1’-H1). Las distancias interprotónicas experimentales se calcularon a partir de las velocidades de relajación cruzada obtenidas a su vez del análisis de la velocidad de crecimiento de los NOEs. En la tabla 11 se comparan estas distancias con las teóricas calculadas a partir de las estructuras relajadas de mecánica molecular (MM) o de los promedios a lo largo de las simulaciones de dinámica molecular (MD). -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 72│ mecanocuanticos, semiempíricos o ab initio, tampoco reproduce adecuadamente los resultados experimentales. Durante la realización de la presente tesis doctoral R.Woods demostró, empleando parámetros de campo de fuerzas derivados de datos mecanocuanticos36 e incluyendo las interacciones explícitas con el disolvente, que simulaciones de dinámica molecular, reproducen correctamente la estabilidad relativa de los rotámetos.77 El inconveniente de la aproximación de Woods es que necesita de simulaciones extraordinariamente largas (50 ns, para compuestos sencillos) por lo que no se deben descartar aproximaciones menos precisas pero más rápidas. En el momento de comenzar estos trabajos no se habia descrito la fiabilidad de la parametrización de Senderowitz en este aspecto, por lo que se decidió evaluar sus cualidades en el caso de los compuestos 18-21. Figura 2.22. Mapas del perfil rotacional  , para los compuestos 18-21, con los parámetros de Senderowitz (izda) y Homans (derecha) y con tratamiento electrostático de  =80. Para ello, en primer lugar se calculó la variación de la energía con el angulo diedro  para los compuestos 18-21 empleando los campos de fuerzas de Senderowitz et al. y Homans (Figura 2.22). Estos perfiles energéticos corresponden con las poblaciones a 298 K reflejadas en la tabla 14. 060 120 180 240 300 360 0 6 12 18 24 30  E(kJ/Mol) Compuesto 17 Compuesto 16 Compuesto 18 Compuesto 19 060 120 180 240 300 360 0 6 12 18 24 30  Compuesto 17 Compuesto 16 Compuesto 18 Compuesto 19 E(kJ/Mol) Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 73│ Tabla 14. Distribución de poblaciones de rotámeros de los compuestos 18-21 durante dinámicas estocásticas de 5 ns, realizadas con idéntica estructura de partida empleando diferentes parametrizaciones Rotámero     Homans Sender. Homans Sender. Homans Sender. Homans Sender. tg 60º  60 12 88 6 81 13 92 11 89 gt 300º  60 54 9 56 14 50 6 39 7 gg 180º  60 34 3 38 6 37 2 50 4 Como cabia esperar por el nivel de la aproximación teórica empleada, ninguna de las dos parametrizaciones fue capaz de reproducir la diferencia en el perfil energético de esta torsión ni para configuraciones gluco ni galacto. Los parámetros de Homans fueron los que proporcionaron un mejor ajuste con el comportamiento esperado para estos compuestos. Ello se debe a que, aunque estos son los parámetros más antiguos, se parametrizaron directamente a los datos experimentales por lo que contienen implícitamente los efectos de solvatación. Por otro lado los parámetros de Senderowitz están basados en cálculos ab initio por lo que sería necesario incluir el efecto del disolvente en los calculos para considerar todos los factores que intervienen en la estabilidad de los rotámeros. Con el objeto de evaluar el efecto de la aplicación de modelos sencillos de disolvente implícito se realizaron simulaciones de dinámica molecular estocastica para los compuestos 18-21, partiendo de los confórmeros más estables y empleando ambos campos de fuerzas, y en el caso de los parámetros de Senderowitz dos tratamientos alternativos, =80 y GB/SA, véase tabla 15. Tabla 15. Proporción de rotámeros de los compuestos con motivo estructural GlcNH2 (1→6) D-quiro-inositol, 18 y 19, analizados de las simulaciones de 5ns de dinámicas estocásticas, con diferentes condiciones; en negrita la conformación inicial del hidroximetilo de las hexosaminas. % gg % gt % tg 18 Sender.  = 80. gg 9 14 77 Sender.  = 80. tg 2 8 90 Sender. GB/SA. gg 8 20 72 Homans  = 80. gg 36 53 11 Homans  = 80. tg 22 71 7 19 Sender.  = 80. gt 0 19 82 Sender.  = 80. tg 0 2 98 Sender. GB/SA. gg 0 21 79 Homans  = 80. gt 13 76 11 Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 74│ Del análisis de los compuestos con residuos de glucosamina, (18 y 19) destaca la preponderancia de los rotámeros tg sobre los otros, cuando se utiliza la parametrización de Senderowitz et al. y de manera independiente al tratamiento electrostático escogido (=80 ó GB/SA). Las simulaciones de Homans fueron realizadas únicamente sobre las estructuras de mínima energía predichas mediante los cálculos previos de MM y reflejaron siempre un mayor peso de los rotámeros gt. En los compuestos con residuo de galactosamina 20 y 21, se observa una tendencia similar a la de los análogos de glucosamina: predominancia de los rotámeros tg para parametrizaciones de Senderowitz y de los gt si se utiliza Homans. Tabla 16. Proporción de rotámeros de los compuestos con motivo estructural GalNH2 (1→6) D-quiro- inositol, 20 y 21, analizados de las simulaciones de 5ns de dinámicas estocásticas, con diferentes condiciones; en negrita la conformación inicial del hidroximetilo de las hexosaminas; en el caso de 21 se describen los ángulos  del grupo metoxilo de partida. % gg % gt % tg 20 Sender.  = 80. gg 11 5 84 Sender.  = 80. tg 0 4 96 Sender. GB/SA. gg 3 13 84  = 80. gg 23 56 21 21 Sender.  = 80. gg +60º 14 12 74 Sender.  = 80. gg -60º 13 6 81 Sender.  = 80. gg 180º 13 6 82 Sender.  = 80. gt -60º 0 2 98 Sender.  = 80. gt +60º 0 3 97 Sender.  = 80. gt 180º 0 5 95 Sender.  = 80. tg +60º 5 7 88 Sender.  = 80. tg -60º 24 5 71 Sender.  = 80. tg 180º 5 3 92 Sender. GB/SA. gt 0 3 97 Homans  = 80. gg 20 67 13 La presencia del rotámero tg en galactopiranósidos a veces es explicada como proveniente de los efectos del disolvente13a ó interacciones 1,3-diaxiales14 (repulsión estérica y electrónica entre O4 y O6 desestabilizaría el rotámero gg). Una interacción equivalente en glucopiranósidos ha sido utilizada para explicar la pequeña población que representa los rotámeros tg.78 Como hemos visto a lo largo del presente estudio, los parámetros de Homans son los que mejor se ajustan a los datos experimentales, aunque la modificación de Senderowitz esté parametrizada en principio a un mayor nivel teórico. Este resultado refleja la importancia del disolvente en la conformación de los carbohidratos ya que los parámetros de Homans, de por su naturaleza, consideran implícitamente los efectos del disolvente. Por tanto, la realización de Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 75│ futuras simulaciones con estos compuestos debería incluir moléculas de agua explícita que a buen seguro mejorarán los resultados. El comportamiento dinámico de los compuestos 18-21, respecto al ángulo torsional  y con parametrización de Homans queda debidamente reflejado en la figura 24. A lo largo de la trayectoria se observan fluctuaciones entre los rotámeros . Figura 2.23. Mapas de trayectorias y distribución de poblaciones en % del ángulo  a lo largo de las simulaciones de SD con parámetros de Homans y ε=80, para los compuestos 18 (arriba izda), 20 (arriba derecha), 19 (abajo izda) y 21 (abajo derecha). 2.4.- DISCUSIÓN. En este capítulo se describe el estudio estructural en disolución de los compuestos disacarídicos 9-21, mediante la combinación de datos experimentales de RMN y cálculos teóricos basados en campos de fuerza realizados sin restricciones experimentales explícitas. En general el acuerdo entre ambos métodos es bueno. Lo que permite, comparaciones cualitativas, correspondiendo los NOEs exclusivos observados con la predicción del cálculo. Esta correlación es también satisfactoria cuantitativamente para los compuestos poco flexibles, en los que el método permite detectar diferencias en detalles sutiles como el desplazamiento de la geometría del mínimo en la serie 13-17. Sin embargo, en el caso de los compuestos más flexibles la evaluación de la diferencia de energía entre mínimos relativos no es tan adecuada y se sobreestima sistemáticamente la población del confórmero syn-, sin que variaciones en el campo de fuerzas o condicciones de cálculo empleadas den una solución totalmente satisfactoria. En cualquier caso, la discrepancia sólo afecta a la energía relativa entre ambas 0 1000 2000 3000 4000 5000 -180 -120 -60 0 60 120 180 0 1000 2000 3000 4000 5000 -150 -100 -50 0 50 100 150 0 1000 2000 3000 4000 5000 -180 -120 -60 0 60 120 180 0 1000 2000 3000 4000 5000 -180 -120 -60 0 60 120 180 t (ps) t (ps) % poblacion     t (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60 t (ps)    % poblacion  -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60 % poblacion -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60 % poblacion -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60 Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 76│ formas y no a las geometrías predichas. Por lo tanto combinado con datos experimentales, permite realizar análisis comparativos entre compuestos que tengan estructuras similares. También, se ha realizado paralelamente un análisis de las dos parametrizaciones del campo de fuerzas AMBER* disponibles para carbohidratos en MACROMODEL: Homans y Senderowitz-Parish–Still. En nuestras manos, y para estos compuestos, hemos apreciado que la segunda, más moderna, mejora el balance de energía entre las conformaciones syn- y anti-Ψ. Por el contrario, en cuanto a la distribución de rotámeros de los grupos hidroximetilo la parametrización Homans coincide mejor con los datos experimentales. Esta discrepancia tiene su origen en la influencia de los efectos de solvatación, no considerados a este nivel de cálculo. Por ello, el campo de fuerzas más antiguo es, paradójicamente, el que mejores resultado proporciona puesto que fue ajustado directamente a datos experimentales. En cuanto a las estructuras de estos pseudodisacáridos, el estudio comparativo de los compuestos 9-21 permite establecer algunas conclusiones generales. En primer lugar, es posible distinguir dos tipos básicos de comportamiento conformacional bien diferenciados a lo largo de la serie: unos compuestos existen como un único confórmero syn-Ψ, distribuido alrededor de un mínimo más o menos amplio, mientras que otros presentan una mayor flexibilidad y se encuentran en un equilibrio entre dos confórmeros, uno syn-Ψ, mayoritario, y otro anti- minoritario. El tipo de ciclitol parece ser determinante en la aparición de uno u otro comportamiento. Así los derivados de mio-inositol (9-12) son flexibles y presentan dos estructuras (syn-anti-, experimentalmente observables a través de contactos NOE exclusivos. Tanto los compuestos con quiro-inositol como pinitol (3-metil-quiro-inositol) (13-21) muestran el comportamiento opuesto y se encuentran como un único confórmero syn- Ψ. Es importante destacar que esta división de comportamientos no parece verse alterada ni por la estereoquímica  o β, del carbono anomérico, o D- o L- del ciclitol, ni por la presencia de sustituyentes, cargados o no. Por ello, parece lógico atribuir mayoritariamente la causa de tal comportamiento a la estereoquímica axial o ecuatorial del enlace glicosídico respecto al ciclitol. En segundo lugar, dentro de cada tipo general de comportamiento, algunos detalles estructurales concretos parecen poder ser modulados por la presencia y disposición de los sustituyentes cargados, como se habia hipotetizado en el planteamiento de esta memoria. Por ejemplo, la presencia y estructura del grupo fosfato en 13-15 es capaz de desplazar la posición del mínimo absoluto, dentro de la misma estructura general. Tambien, como en el caso de 9 y 10 o 11 y 12, puede variar las proporciones de los mínimos syn- y anti-Ψ. Sin embargo, no se han encontrado en ningun caso un efecto tan acusado como el descrito para 2, en el que no se observa la conformación anti porque la interacción fosfato-amonio estabiliza la forma opuesta. Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 77│ Esto se debe probablemente a que la topología del enlace glicosídico no permite que en el caso de los compuestos estudiados en este capítulo el acceso a la geometría en la que la interacción amonio-fosfato sea óptima. Por último, se deduce de la comparación entre compuestos con diferencias estructurales lejanas al enlace glicosídico (glucosamina frente a galactosamina, o quiro-inositol frente a pinitol) que estas no parecen afectar apreciablemente a la estructura tridimensional de estos disacáridos. Figura 2.24. Superposición de los esqueletos correspondientes a estructuras de minima energia de las configuraciones glucosamina (1-6) mio-inositol (izquierda)  (rojo) y β (azul) y glucosamina  (1- 6) inositol (derecha) mio- (rojo) y chiro- (verde). Desde el punto de vista del estudio de las bases estructurales del mecanismo de activación de la insulina via IPGs es destacable la cantidad de diferentes geometrias relativas de los dos anillos que pueden ser generadas por pequeñas variaciones estereoquímicas de sus componentes (Figura 2.24). En este contexto, si se considera este disacárido como el esqueleto sobre el que se situan los grupos cargados, supuestos puntos de unión, da lugar a una muy amplia dispersión de geometrías (Figura 2.25). Por otro lado, el estudio descrito en este capítulo, describe la variabilidad de estructuras y comportamientos dinámicos que proporcionan los diferentes motivos químicos considerados con potencial actividad. Esta colección de estructuras fue esencial para realizar los estudios de docking con PKA, realizados en nuestro grupo de investigación, que dirieron lugar a nuevos diseños de potenciales insulinomiméticos (Véase Capítulo 3). Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 78│ Figura 2.25. Superposición de las estructuras de mínima energía de los compuestos 10, 12, 14, 16 y 17 que contienen algun grupo fosfato. La superposición se ha realizado sobre los átomos pesados del anillo de glucosamina. La figura muestra la dispersión de disposiciones relativas amonio – fosfato originadas por cambios en la estereoquímica del esqueleto. Capítulo 2: Estudios de Pseudodisacáridos miméticos de IPG 79│ 2.4.- BIBLIOGRAFIA. 1 Ferguson, M.A.J.; Homans, S.W.; Dwek, R.A.; Rademacher, T.W. Science. 1988, 239, (4841), 753-759. 2 Dietrich, H.; Espinosa, J.F.; Chiara, J.L.; Jimenez-Barbero, J.; Leon, Y.; Varela-Nieto, I.; Mato, J.M.; Cano, F.H.; Foces-Foces, C.; Martin-Lomas, M. Chem-Eur. 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Chem. 1989, 10, (8), 982-1012. 55 Imberty, A.; Hardman, K.D.; Carver, J.P.; Perez, S. Glycobiology. 1991, 1, (6), 631-642. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 88│ O HO HO HO O OH O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OPOH OO 23 24 25 26 27 O HO O OH O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OH O HO HO HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OPOH OO O HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OH OH OH OPOH OO O HO OO HO O NH3 HO HO OH OH HO OH OH OPOH O O O HO O NH3 HO3PO HO OH OH OH HO 20 21 22 HO O HO O NH3 OPO3H HO OH OH OH HO OH O HO3PO O NH3 HO OH OH OH HO OH OH Figura 3.3. Estructuras de los disacáridos y trisacáridos estudiados en este capítulo. Estas conclusiones se aplicaron en el diseño de una nueva serie de pseudodi- y trisacáridos, 20, 21, 22, 25, 26 y 27, que contienen grupos fosfato; también se sintetizaron productos análogos sin grupos fosfato 23 y 24, por motivos de comparación (figura 3.3).24,29,30 En este capítulo de describe el estudio estructural en disolución de estos compuestos mediante RMN y dinámica molecular. El objeto de este estudio es fundamentalmente Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 89│ comprobar que las estructuras de estos compuestos concuerdan con las predichas por y para el estudio de docking. Simultaneamente también se propone analizar la posible influencia sobre la estructura tridimensional del GPI de la presencia de grupos O-fosfato en otros residuos distintos del inositol. 3.2.- METODOLOGÍA 3.2.1.- Resonancia Magnética Nuclear. Los pseudodisacaridos y pseudotrisacaridos 20-27 han sido estudiados en disolución mediante espectroscopía de RMN. En primer lugar, la asignación inambigua de sus espectros de 1H y 13C, se realizó empleando técnicas habituales para oligosacáridos.31-36 Se usaron esencialmente los siguientes tipos de experimentos DQF-COSY,37 TOCSY,38 NOESY39 y HSQC40. Posteriormente se extrajeron restricciones experimentales basadas en constantes de acoplamiento (torsiones) o de distancia calculadas a partir de la velocidad de relajación cruzada (NOE). Debido a que los métodos son comunes, se remite al capítulo 2 para una descripción más exhaustiva de estas técnicas. En este capítulo tambien se exploró la observación de los protones hidroxílicos como potencial fuente de nuevas restricciones experimentales (véase apartado 3.4). 3.2.2.- Cálculos Teóricos. La metodología empleada inicialmente en los estudios de modelado molecular en este capítulo fue en general similar a la descrita en el capítulo anterior. En primer lugar, se estudiaron las superficies de energía de los enlaces glicosídicos mediante métodos sistemáticos, calculando los mapas rígidos, relajados y adiabáticos.41 En el caso de los trisacáridos, se asumió que no había interacciones significativas a largo alcance y que, por lo tanto, las propiedades conformacionales de una unión dada son independientes de que forme parte de di- o tri-sacáridos. Por ello, teniendo en cuenta los mapas elaborados en el capítulo 2 sólo fue necesario considerar tres disacáridos independientes: Gal-(1→6)-GlcN-1-OMe, Man- (1→6)-GlcN-1-OMe y GlcN-(1→6)-mio-inositol (figura 3.4). De acuerdo con la evaluación de los campos de fuerza realizada en el capítulo anterior se empleó AMBER*42 Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 90│ incluyendo la parametrización de Stille,43 y aplicando el método GB/SA44 como modelo continuo de disolvente. Figura 3.4. Disacáridos modelos de las uniones glicosídicas de los trisacáridos 23-27 empleados en los cálculos de MM. El estudio conformacional se completó mediante simulaciones de dinámica molecular en las condiciones optimizadas para los compuestos 7-19 descritas en capítulo 2. En este caso, se decidió aplicar sistemáticamente esta metodología a todos los compuestos ya que deberia proporcionar una descripcion mas realista que la busqueda sistemática complementando sus conclusiones. De acuerdo con las condicciones de simulacion optimizadas en el capítulo anterior para los derivados de pinitol 16-19, se emplearon dinámicas moleculares de Langevin45 partiendo de las estructuras de mínima energía inferidas de los estudios sistemáticos de mecánica molecular. Por último, en un intento por avanzar en la comprensión de las propiedades dinámicas de las estructuras se han evaluado simulaciones de dinámica molecular empleando modelos de disolvente explícito.46 Modelización molecular con inclusión de agua explícita. Este procedimiento se basa en la consideración explícita de moléculas del disolvente en las simulaciones, de forma que solvaten a dicho soluto, permitiendo calcular las interacciones soluto-disolvente de manera más adecuada. Sin embargo tiene el inconveniente de generar asimetrías en las interfases “solutovacío” que deben ser tratadas adecuadamente. Ello se resuelve de forma sencilla mediante la aplicación de condiciones de frontera periódicas (PBC; Periodic Boundary Conditions)47. Las simulaciones se llevaron a cabo a 298 K, con una constante de acoplamiento al baño térmico de 0.2 ps, una constante dieléctrica de 1, y aplicando una distancia de truncado para las interacciones de no-enlace de 9 Å. Con el objeto de realizar las simulaciones con el mayor rigor posible, se calcularon las cargas atomicas puntuales especificas para las estructuras Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 91│ simuladas48 y se cuidó el proceso de solvatación y equilibración empleando protocolos suficientemente contrastados.49 3.3.- RESULTADOS. 3.3.1.- PSEUDODISACÁRIDOS FOSFATO. Estudio por RMN de los disacáridos 20-22 (ver figura 3.3). Los compuestos 20-22 han sido asignados (tabla 3.1) mediante las técnicas de RMN descritas en el apartado de metodología. Tabla 3.1. Desplazamientos químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) en D2O, de los compuestos 20, 21 y 22 a 25ºC y a 500 MHz, a valores de pH de 6.3 para 22, 5.5 para 21 y 5.6 para 20. 20 21 22 20 21 22  (1H)  (1H)  (1H)  (13C)  (13C)  (13C) Glucosamina H-1 5,39 5,40 5,39 C-1 96,6 96,2 96,5 H-2 3,40 3,37 3,36 C-2 54,3 54,3 54,4 H-3 4,36 4,07 3,90 C-3 73,1 69,2 69,4 H-4 3,64 3,98 3,63 C-4 68,9 72,7 68,8 H-5 4,07 4,10 4,14 C-5 71,6 71,3 71,4 H6a/H6b 3,82 3,88 4,11 C-6 59,8 59,8 63,1 3,77 3,73 3,98 mio-inositol H-1 3,73 3,71 3,70 C-1 71,6 71,6 71,6 H-2 3,98 3,99 3,99 C-2 72,4 72,4 72,4 H-3 3,50 3,49 3,49 C-3 70,9 70,9 70,9 H-4 3,60 3,61 3,62 C-4 72,6 72,5 72,6 H-5 3,40 3,36 3,35 C-5 72,5 72,6 72,6 H-6 3,69 3,69 3,70 C-6 80,5 80,4 80,6 En el caso de estos compuestos (20-22), y a diferencia de lo observado para los pseudodisacáridos estudiados en el capítulo 2, los nuevos productos presentaron espectros 1D- 1H con señales muy anchas en un amplio rango de pH. Esto dificultó la estimación directa de las constantes de acoplamiento 3JH-H y hubo que recurrir para su medida a los experimentos 2D-DQF-COSY. Los valores de las constantes de acoplamiento 3JH,H, confirmaron que, como era previsible, ambos residuos se encontraban en una conformación de tipo silla en los tres compuestos, concretamente del tipo 4C1 para el anillo de glucosamina. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 92│ Para el análisis cualitativo de los datos de RMN para los disacaridos 20-22 se empleó el mismo mapa de distancias que el calculado para los compuestos 9-10 (capítulo 2) que contienen el mismo esqueleto básico. Ello, implica asumir que la presencia del grupo fosfato en posiciones alejadas del enlace glicosídico no debería producir grandes modificaciones en la estructura de los compuestos. La validez de esta suposición quedó confirmada por las simulaciones de dinámica molecular realizadas posteriormente. Por lo tanto, y tal y como se encontró para los compuestos 7 y 8, la presencia de las conformaciones de tipo syn- quedaría determinada por la observación del NOE H1’-H6, mientras que las disposiciones tipo anti-, lo serían por los NOEs H1’-H5 y H1’-H1. De nuevo, este último contacto NOE (H1’-H1) no es exclusivo de la conformación anti, puesto que solapa parcialmente con la región central, asignada a la conformación syn (ver figuras 2.9 y 2.10). En los experimentos NOESY de los compuestos 20-21 (figura 3.5), se observó un fuerte NOE entre H1’-H6, característico de disposiciones de tipo syn-. Por otra parte, también se apreció un NOE débil entre H1’-H5, en este caso, exclusivo de la conformación anti- Por último, el NOE entre H1’-H1, sólo pudo detectarse de manera inambigua para 20 y 21, mientras que en el caso de 22 el solapamiento H1 y H6 no permitió una caracterización indiscutible. La presencia simultánea de NOEs exclusivos de conformaciones diferentes (H1’- H6 y H1’-H5), es incompatible con la formulación de un comportamiento monoconformacional, lo que implica la existencia de un equilibrio conformacional. La mayor intensidad relativa del NOE exclusivo de la conformación syn (H1’-H6) respecto a los característicos de la disposición anti (H1’-H5) indica la forma syn es la mas poblada en dicho equilibrio. Este comportamiento no difiere cualitativamente del presentado por los compuestos 7 y 8 que poseen el mismo esqueleto básico GlcN--mio-inositol. Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 93│ Figura 3.5. NOEs relevantes de la región anomérica de experimentos NOESY para 20 (superior), 21 (central) y 22 (inferior), a 500 MHz y 298K, en D2O y registrados con un tiempo de mezcla de 500 ms. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 94│ El análisis cuantitativo de las distancias interprotónicas experimentales parece reflejar ligeras diferencias con el disacárido básico 7 (tabla 3.2). La menor distancia calculada entre H1’-H5 para el caso de 7 y 22, frente a 20 y 21, indicaría una mayor proporción de la conformación anti en el equilibrio conformacional para los primeros. Tabla 3.2. Distancias interprotónicas experimentales determinadas a partir de NOE para los compuestos 7, 20, 21 y 22. Compuesto Distancias Interprotónicas Distancias Experimentales 20 H1’-H6 2,3 H1’-H1 3,0 H1’-H5 3,8 21 H1’-H6 2,3 H1’-H1 2,9 H1’-H5 3,7 22 H1’-H6 Solap. H1’-H1 Solap. H1’-H5 3,3 7 H1’-H6 Solap. H1’-H1 Solap. H1’-H5 3,41 Estudio Teórico de los pseudodisacáridos fosfato 20-22. Los estudios teóricos de los pseudodisacáridos fosfato 20-22, se realizaron empleando simulaciones de dinámica molecular de Langevin (dinámicas estocásticas) y el método GB/SA para la simulación del disolvente. Estas condiciones fueron las más adecuadas para estructuras similares como se ha descrito en el capítulo 2. En este estudio también se incluyo el compuesto 7 con fines comparativos. Como punto de partida de estas simulaciones se eligieron las estructuras relajadas correspondientes a confórmeros de tipo syn- y anti-, construidas a partir de los resultados de los mapas adiabáticos previamente calculados para el compuesto 7. Los resultados obtenidos para 7 (figura 3.6), no consiguieron reproducir satisfactoriamente los resultados experimentales ya que no se observaron visitas a regiones anti- durante la dinámica y éstas fueron demostradas experimentalmente por la observación del NOE H1’-H5 (cap. 2). Este resultado fue independiente de la geometría de la estructura de partida, y se reprodujo tanto partiendo de mínimos syn ó anti, demostrando que en estas condiciones de simulación, el mínimo anti- no era estable. Esta anomalía es análoga a la infravaloración del mínimo anti- observada en el análisis de las superficies adiabáticas de energía realizado en el capítulo 2. Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 95│ Figura 3.6. Trayectorias del ángulo  1 y valores instantáneos de  ,  durante las dinámicas estocásticas (50ns) para el compuesto 7 partiendo desde el mínimo syn-  . En el caso de los compuestos 20-22, el comportamiento durante las simulaciones fue diferente, observándose transiciones esporádicas hacia regiones anti- tanto partiendo desde estructuras tipo syn- (figura 3.7) como desde anti-(datos no mostrados). Por lo tanto, al menos cualitativamente, las simulaciones de los derivados sustituidos fueron capaces de reproducir el equilibrio conformacional determinado experimentalmente. En este sentido es interesante destacar que este comportamiento depende cualitativamente de la posición del grupo fosfato en el residuo glucosamina (figura 3.7 y tabla 3.3)). Figura 3.7. Simulaciones de dinámicas estocásticas (50ns) para el compuesto 20 (izda), 21 (centro) y 22 (derecha), con el campo de fuerzas AMBER*, parametrización de Senderowitz et al. y método electrostático GB/SA, partiendo desde el mínimo syn-  . En la parte inferior se muestra las interconversiones del ángulo  a lo largo de la simulación. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   0 10000 20000 30000 40000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180  t (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   05000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180  t (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   04000 8000 12000 16000 20000 24000 28000 32000 36000 40000 -180 -120 -60 0 60 120 180  t (ps) 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180  t (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 96│ Tabla 3.3. Proporción de confórmeros de tipo syn- / anti-, obtenidos de las simulaciones de SD (50 ns), para los compuestos 20-22. Compuesto SD % syn-  % anti-  20 SD syn-  98,4 1,6 SD anti-  99,1 0,9 21 SD syn-  99,1 0,9 SD anti-  99,7 0,3 22 SD syn-  91,7 8,3 SD anti-  97,3 2,7 El estudio teórico continuó con un análisis cuantitativo de las distancias interprotónicas significativas calculadas a lo largo de las simulaciones y su comparación con las derivadas de los datos de RMN. En la tabla 3.4 se muestran las distancias interprotónicas teóricas y experimentales para los compuestos 7, 20-21. Tabla 3.4. Promedios en <r-6> y en <r-3>2 de las distancias interprotónicas significativas calculadas a partir de las simulaciones de SD, y comparación con las experimentales para los compuestos 20-22, y 7. Compuesto Distancias Interprotónicas Exp. SD syn-  <r-6> / <r-3>2 20 H1’-H6 2,3 2,28/2,30 H1’-H1 3,0 >4 H1’-H5 3,8 3,81/ 3,86 21 H1’-H6 2,3 2,27 / 2,29 H1’-H1 2,9 3,86 / 3,92 H1’-H5 3,7 4,10 / 4,31 22 H1’-H6 Solap. 2,33 /2,37 H1’-H1 Solap. 3,80 /3,88 H1’-H5 3,3 3,41 /3,84 7 H1’-H6 Solap. 2,28/2,31 H1’-H1 Solap. >4 H1’-H5 3,41 3,81/3,86 En general, el acuerdo entre las distancias experimentales y los promedios durante las trayectorias de las dinámicas moleculares son buenos para la distancia promedio más corta (H1’-H6). Que es la que caracteriza al mínimo más poblado, syn-. En las distancias correspondientes a los NOEs exclusivos de los confórmeros anti- (H1’-H5), se observa una subestimación de los valores teóricos que corresponde a la infravaloración de la contribución de estas estructuras ya comentada. Por lo tanto atribuíble a los campos de fuerza usados. La Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 97│ diferencias en las poblaciones del conformero minoritario observadas en las simulaciones de los compuestos 7, 20-22, y reflejada en las distancias interprotónicas calculadas, no parecen concordar con los datos experimentales, que son similares (tabla 3.4). Sin embargo, en el caso del compuesto 22 y sustituido en posición 6, para el que se predice una mayor población anti-  se observó una distancia experimental H1’-H5 mas corta. Desafortunadamente el resto de las distancias interglicosídicas no pudo ser estimado y no es posible tomar esta observación como una conclusión definitiva. En cualquier caso, e independientemente de la valoración de la analogía con los datos experimentales, es interesante la observación de diferencias en la evaluación de los conformeros en función del patrón de sustitución de compuestos con el mismo esqueleto básico. Mientras que para los compuestos 7-10 no ha sido posible reproducir la existencia de las formas anti observadas, en el caso de los análogos fosforilados en el residuo de glucosamina (20-22) estas estructuras son estables durante las simulaciones de dinámica molecular. Estas consideraciones parecen indicar que la distribución de cargas en la estructura global resulta determinante en la evaluación del peso relativo del mínimo anti en este tipo de estructuras desde el punto de vista de la parametrización del campo de fuerza AMBER*, Este aspecto deberá ser estudiado más exhaustivamente con el fin de mejorar el comportamiento de este campo de fuerzas. 3.3.2.- PSEUDOTRISACÁRIDOS NO FOSFATADOS. Los estudios estructurales de los pseudotrisacáridos 23 y 24 tienen el interés adicional de permitir determinar la posible influencia de la elongación de la cadena sacarídica en las propiedades conformacionales de la estructura glucosamina-mio-inositol. Si esta influencia no fuera importante sería posible extender las conclusiones obtenidas en el capítulo anterior acerca del comportamiento de disacáridos hexosamina-inositol a otras estructuras más complejas que contengan este motivo, como los GPIs de anclaje. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 104│ 0 10000 20000 30000 40000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180 t (ps)  0 10000 20000 30000 40000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180 t (ps)  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Figura 3.13. Trayectorias del ángulo glicosídico  durante las simulaciones de SD de 23, con  =80 (izquierda) y GB/SA (derecha). Figura 3.14. Mapas de distribución de valores  durante dinámicas estocásticas de 90 ns para 24 en la conformación de partida anti-  , con el modelo solvatación GB/SA. Las distancias interglicosidicas calculadas a lo largo de las simulaciones reflejan una gran semejanza entre 23 y 24 para un mismo tipo de tratamiento electrostático independientemente de la estructura de partida empleada. Se observaron discrepancias entre los resultados experimentales y las simulaciones con respecto a las distancias caracteristicas de los conformeros minoritarios debidas a la subestimación de la población de estos minimos. Por el contrario en las distancias exclusivas de los confórmeros tipo syn- el acuerdo con los resultados experimentales es mejor. Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 105│ Tabla 3.7. Distancias interprotónicas experimentales y teóricas para 23 y 24. Par de Protones Exp. SD =80 <r-6> SD GB/SA <r-6> syn- SD GB/SA <r-6> anti- 23 H1’-H6 2,1* 2,34 2,29 2,29 H1’-H5 3,1 3,78 3,82 3,80 H1’’-H3’ 3,1 3,22 3,41 3,34 H1’’-H5’ 3,2 3,97 3,77 3,62 H1’’-H4’ 2,7 2,53 2,38 2,39 24 H1’-H6 2,1* 2,34 2,29 2,30 H1’-H5 3,2 4,37 3,82 3,75 H1’’-H3’ 3,3 3,20 3,63 3,73 H1’’-H5’ 3,8 3,83 4,11 4,40 H1’’-H4’ 2,5 2,50 2,30 2,29 * Solapado en los espectros de RMN H1’-H6 con H1’-H1. De este estudio se puede concluir que el empleo de la metodología GB/SA permite reproducir cualitativamente el comportamiento dinámico de estos compuestos en cuanto a la estabilidad de las formas anti-. Sin embargo la población estos conformeros es subestimada sistemáticamente, hecho que queda reflejado en los análisis cuantitativos de distancias. 3.3.3.- PSEUDOTRISACÁRIDOS MONO-FOSFATO. Estudios por RMN de los trisacáridos 25 y 26. (Ver figura 3.3). En este caso, al igual que ocurrió con los pseudodisacáridos 20-22 además de los cambios lógicos en el desplazamiento químico en función del pH, se aprecian ensanchamientos acusados de las señales de grupos cercanos a los centros ionizables a valores próximos al pKa para 25 y 26 (figura 3.15). Este comportamiento difiere del de aquellos oligosacáridos en los que el grupo fosfato se encontraba en el anillo de inositol, para los que las señales se desplazaban sin ensanchamientos tan acusados. Esta observación simplemente refleja diferentes cinéticas de los equilibrios ácido-base. En cualquier caso, y desde un punto de vista práctico, este efecto dificultó la realización de los experimentos al limitar el rango de pH de trabajo para resolver el solapamiento de señales clave. La asignación de los compuestos 25 y 26 a pH próximo a 7.0 se realizó por la metodología 2D habitual y se muestra en la tabla 3.8. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 106│ Figura 3.15. Espectros de RMN 1D 1H del compuesto 22 en D2O y 25ºC, realizados en función del pH. Tabla 3.8. Desplazamientos químicos δ (ppm) de 1H y 13C y valores de las constantes de acoplamiento 3JH-H (Hz), para los trisacáridos 22 y 23 en D2O, a 500 MHz y 298K. 25 26 25 26  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H  (13C)  (13C) Hexosa (Man ó Gal) H-1 5,17 2,0 5,39 3,9 C-1 101,2 98,4 H-2 3,94 - 3,85 3,8/ 10,4 C-2 70,4 57,0 H-3 3,71 - 3,85 3,3/ 10,5 C-3 70,4 71,9 H-4 3,66 - 4,04 - C-4 66,3 78,2 H-5 3,72 5,5 / 7,0 4,15 - C-5 73,0 72,5 H6a/H6b 4,01 - 3,94 - C-6 64,2 62,3 3,94 3,94 Glucosamina H-1 5,33 3,5 5,40 3,4 C-1 96,4 100,8 H-2 3,28 3,5/10,5 3,34 3,7/ 10,3 C-2 54,7 70,8 H-3 4,03 9,5/ 10,5 4,26 10,4/11,2 C-3 69,9 66,2 H-4 3,70 9,5 3,78 9,8 /10,2 C-4 76,1 73,0 H-5 4,10 3,0/ 10,0 4,24 3,1/10,2 C-5 70,9 71,3 H6a/H6b 3,78 12,5/ 2,5 3,90 - C-6 60,1 71,5 3,73 12,5/ 3,5 3,84 - mio-inositol H-1 3,63 - 3,84 C-1 71,8 74,0 H-2 3,91 2,5 3,99 2,5 C-2 72,6 74,8 H-3 3,41 3,0/ 10,0 3,49 2,8/ 10,0 C-3 71,0 73,4 H-4 3,53 9,5 3,61 9,8 C-4 72,8 75,0 H-5 3,27 9,5 3,37 C-5 72,8 75,0 H-6 3,62 - 3,83 C-6 80,6 82,7 Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 107│ Los experimentos NOESY (figuras 3.16 y 3.17), indican que el comportamiento conformacional de los compuestos 25 y 26 puede describirse en términos generales como un equilibrio entre conformaciones syn-/anti- con predominio de las formas syn- para los dos enlaces glicosídicos. En el caso de la unión GlcN-(1→6)-mio-inositol se aprecia intensamente el NOE exclusivo del mínimo syn-, H1’-H6, mientras que los que caracterizan las formas anti- H1’-H1 (ligeramente solapado con H1’-H6) y H1’-H5, son de menor intensidad. En el caso del compuesto 25 el NOE H1’-H5, no se pudo detectar inequivocamente debido a que aparece solapado con el correspondiente a H1’-H2’. No obstante la forma compleja del pico de cruce H1’-H2 que sugiere una contribución de H1’-H5 y el pico H1’-H1 se puede considerar un argumento a favor de la detección de la forma anti- La geometría de la segunda unión glicosídica entre la hexosa correspondiente y la glucosamina queda definida en ambos compuestos por los NOE característicos de las formas syn- (H1’’-H4’) con mayor intensidad que los propios de las formas anti (H1’’-H3’ junto a H1’’-H5’). Figura 3.16. NOEs significativos de 25 a 500 MHz, pH 6,8 y 500 ms de tiempo de mezcla; 2D- NOESY (derecha) y 1D-dpfgse-NOESY (izquierda). H1+H6 mioIns H5 mioIns+H2 GlcN H6 GlcN H2 Man H5 GlcN H3 GlcN H4 GlcN H1Man H1GlcN H5 mioIns + H2 GlcN H4 GlcN H2 Man H5GlcN H3GlcN Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 108│ Figura 3.17. NOEs significativos de 26 a 500MHz, pH 9,2 y 500 ms de tiempo de mezcla; 2D- NOESY (derecha) y 1D-dpfgse-NOESY (izquierda). Los experimentos NOESY empleados para el cálculo de las distancias interprotónicas de 26, se realizaron a un pH de 9,2; diferente del de los experimentos de asignación para evitar el solapamiento de señales clave. Este hecho debe ser considerado en el análisis de los resultados puesto que indica la forma ácido-base predominante es la amino y que es diferente al amonio sobre la que se han realizado todos los estudios anteriores. Cálculos teóricos de los trisacáridos 25 y 26. OPOH OO 25 26 O HO HO HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OPOH OO O HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OH OH Asumiendo el comportamiento monoconformacional de los monosacáridos caracterizado experimentalmente un análisis conformacional sistemático debería considerar a Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 109│ los dos enlaces glicosidicos: hexosa-glucosamina y glucosamina-inositol y a los grupos exocíclicos, especialmente al ester fosfórico en la posición 6 del resíduo del terminal no reductor. Al igual que se hizo para los trisacáridos 23 y 24, no se consideraron relevantes los potenciales efectos de largo alcance, de manera que se asumió que las superficies de energía en función de los ángulos de torsión eran equivalentes en el trisacárido o en el disacárido. Por lo tanto, se analizaron las superficies de energía adiabáticas en función de los ángulos de torsión para 4-O-metil-glucosamina-(1→6)-mio-inositol (previamente calculado), 6-O- fosfatidilmanosa-(1→4)-1-O-metil-glucosamina y 6-O-fosfatidilgalactosa-(1→4)- 1-O- metil-glucosamina. Los mapas adiabáticos para los enlaces manosa-glucosamina y galactosa-glucosamina (figuras 3.18 y 3.19) se calcularon considerando los tres rotámeros posibles de los grupos hidroximetilo y un único conformero para el grupo fosfato 1 empleando AMBER* con la modificación de Senderowitz et al y el método de solvatación GB/SA. Figura 3.18. Mapas de energía adiabático (izda) y de distribución de probabilidad (derecha) para el disacárido 6-fosfato-D-manopiranosil-  (1→4)-[2-amino-2-desoxi]-D-glucopiranósido. 1 Con el fin de optimizar el número de estructuras a considerar en el cálculo de los mapas adiabáticos, se realizó un análisis prévio de la estructura hidroximetilfosfato en manosa y galactosa para descartar aquellos rotámeros no probables. Los resultados de este análisis indicaron que mientras que son probables todos los conformeros gg, gt y tg el ángulo  1 presenta un único rotámero estable a 60º. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 110│ Figura 3.19. Mapas de energía adiabático (izda) y de distribución de probabilidad (derecha) para el disacárido 6-fosfato-D-galactopiranosil-  (1→4)-[2-amino-2-desoxi]-D-glucopiranósido. Los mapas adiabáticos calculados fueron semejantes para los dos tipos de enlace. En ambos casos se observa un mínimo absoluto de tipo syn- a valores para la unión Man-(1→4)-GlcN, compuesto 25, figura 3.18) y a  -36.0,  -18.0 para Gal- (1→4)-GlcN, compuesto 26, figura 3.19) junto con un mínimo relativo tipo anti- a  -50,  160 y a  -36.0,  180.0 para 25 y 26 respectivamente. Ambos tipos de conformeros fueron detectados experimentalmente por la observación de sus correspondientes NOE exclusivos (figura 3.16 y 3.17), véase apartado de RMN, por lo que cuantitativamene se puede concluir que al igual que 23 y 24 también la segunda unión glicosídica presenta un comportamiento apreciablemente flexible consistente con un equilibrio entre una disposición syn, mayoritaria, y otra anti, minoritaria. Para el análisis de la otra unión disacarídica, GlcN-(1→6)-mio-inositol, se emplearon los mapas adiabáticos obtenidos para los compuestos 7, 23 y 24. Los datos experimentales de RMN confirman cualitativamente estas predicciones observandose un patrón de NOEs exclusivos propio de la presencia simultánea de dos conformaciones syn y anti siendo mayoritaria la primera, como en los compuestos análogos 7, 23 y 24. El estudio estructural de 25 y 26 fue ampliado con el análisis de su comportaminento dinámico mediante simulaciones de dinámica molecular estocástica (SD). Estos cálculos se realizaron de manera similar a la de los otros trisacáridos ya estudiados, 23 y 24, empleando los parámetros específicos de Senderowitz et al para AMBER* y tanto =80 como GB/SA para considerar los efectos del disolvente. Se prepararon dos estructuras de partida construidas a partir de los mapas adiabáticos, con el objeto de comprobar si en las condiciones de simulación -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 111│ el sistema alcanzaba el equilibrio. Los resultados (figuras 3.20 y 3.21), obtenidos para las SD indican, en general, un acuerdo razonable con los resultados experimentales y las superficies energéticas calculadas.- Los dos enlaces glicosídicos oscilan principalmente alrededor de mínimos de tipo syn. Los resultados convergen independientemente de la estructura de partida, syn-2 o anti-2, lo que indica que la duración de la simulación es suficiente como para alcanzar el estado estacionario. Al emplear el método GB/SA se mejora el comportamiento de las simulaciones al aumentar las transiciones hacia regiones anti especialmente en el caso del enlace glicosídico GlcN-(1→6)-mio-inositol. En cualquier caso, como se discutirá mas adelante la población de estas estructuras en el equilibrio esta infravalorada. Figura 3.20. Distribución de los angulos de torsión  1,  1,  2 y  2 de 25 durante dinámicas estocásticas (60ns), partiendo de una conformación syn-  con  =80 (superior) y GB/SA (centro) y de una conformación anti-  2, GB/SA (inferior). -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 112│ Figura 3.21. Distribución de los angulos de torsión  1,  1,  2 y  2 de 26 durante dinámicas estocásticas (60ns), partiendo de una conformación syn-  2  con  =80 (superior) y GB/SA (centro) y de una conformación anti-  2 y GB/SA (inferior). El análisis cuantitativo de las simulaciones empleando las distancias interprotónicas experimentales presenta en este caso la dificultad de la escasez de restriciones de distancia debido a los problemas encontrados en la obtención de los datos experimentales. Este problema es especialmente acusado en el caso del trisacárido 25 para en que no se puede describir cuantitativamente el enlace glucosamina inositol. En líneas generales, las distancias correspondientes a los NOEs exclusivos de las conformaciones mayoritarias son más cortas que para los conformeros anti. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 113│ Tabla 3.9. Distancias interprotónicas teóricas calculadas como promedios <r-6> para 25, a partir de simulaciones de SD, y comparadas con las experimentales. Las comillas se refieren a los residuos de manosa ó galactosa (‘‘); glucosamina (‘); mio-inositol (sin comillas). 25 Exp. RMN SD =80 < r-6> SD GB/SA <r-6> syn- SD GB/SA <r-6> anti- H1’-H6* - 2,34 2,29 2,29 H1’-H5 no 4,35 4,14 4,05 H1’’-H3’ 3,5 3,09 3,07 3,37 H1’’-H5’ 3,4 3,63 3,27 3,97 H1’’-H4’ 2,3 2,54 2,46 2,41 Tabla 3.10. Distancias interprotónicas teóricas calculadas como promedios <r-6> para 26, a partir de simulaciones de SD, y comparadas con las experimentales. Las comillas se refieren a los residuos de manosa ó galactosa (‘‘); glucosamina (‘); mio-inositol (sin comillas). 26 Exp. RMN SD =80 < r-6> SD GB/SA <r-6> syn- SD GB/SA <r-6> anti- H1’-H6* 2,2 2,35 2,28 2,29 H1’-H5 3,9 4,38 4,18 3,95 H1’’-H3’ - 3,35 3,50 3,37 H1’’-H5’ 3,2 3,65 3,65 2,96 H1’’-H4’ 2,4 2,47 2,32 2,36 * Solapamiento de H1 y H6 de mio-inositol. Los resultados reflejan un acuerdo razonable entre las distancias experimentales y las simulaciones partiendo de estructuras syn-que es mejor al emplear condicciones GB/SA para simular el efecto del disolvente. En el caso de las uniones GlcN - myoIns se aprecia en el único caso cuantificado, compuesto 26, una infravaloración de la población de las formas anti minoritarias. Dinámicas Moleculares en agua explícita. Con el propósito de intentar mejorar la descripción de las formas minoritarias anti-, se decidió elevar el nivel de teoria de las simulaciones de dinámica molecular con la inclusión de agua explícita en estos sistemas. El principal motivo de esta decisión fue la sensibilidad demostrada por estos compuestos a cambios en los modelos de solvatación empleados, ya que el empleo explícito de moléculas de agua supondría una evaluación más completa de las interacciones electrostáticas y enlaces de hidrógeno entre el soluto y el disolvente. En primer lugar fue necesario evaluar las cargas puntuales para estos compuestos. Se siguieron los procedimientos habituales,50 y se empleó el método RESP (Restrained ElectroStatic Potencial fit).24 Para ello, primero se realizó el cálculo mediante mecánica Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 120│ En este caso el análisis de las trayectorias de SD partiendo de mínimos tipo syn- o anti-  muestran un apreciable nivel de conversión conformacional en ambos (Figura 3.27). La población de las formas anti fue superior al 5% para ambos enlaces cualquiera que fuese la estructura de partida. Las distancias interprotónicas teóricas (tabla 2.13), calculadas como promedio en <r6> a lo largo de dinámicas estocásticas reflejan un buen acuerdo con las experimentales. Tabla 3.12. Distancias interprotónicas teóricas calculadas como promedios <r > para 27, a partir de simulaciones de SD, y comparadas con las experimentales. Las comillas se refieren a los residuos de manosa ó galactosa (‘‘); glucosamina (‘); mio-inositol (sin comillas). * Solapamiento de H1 y H6 de mio-inositol. Destaca de los datos calculados a partir de las simulaciones de SD el excelente ajuste para las distancias correspondientes a la unión Gal-(1→4)-GlcN, incluso para aquellas que caracterizan al mínimo anti-. Desafortunadamente no se pudo calcular experimentalmente la distancia H1’-H5 para la unión GlcN-(1→6)-mio-inositol, para poder realizar una comparación similar. 3.4.- ESTUDIO DE PROTONES HIDROXÍLICOS POR RMN. Un factor determinante de la precisión con la que es posible definir estructuras tridimensionales basadas en RMN es el número de restricciones experimentales significativas accesibles.53 Esta es la principal causa de la diferencia en la definición de estructuras obtenidas mediante RMN para proteinas, con un gran número de NOEs, frente a las de carbohidratos, peor definidas. En el caso de carbohidratos, debido a su propia naturaleza, sólo es posible observar un número limitado de NOEs estructuralmente relevantes en disoluciones de 2H2O. Como consecuencia de este inconveniente, la precisión y resolución con la que es posible realizar la determinación estructural de carbohidratos ha sido menos satisfactoria que en el caso de otras biomoleculas. Este hecho ha estimulado la búsqueda de metodos alternativos de obtención de restricciones complementarias al NOE, como son las constantes de acoplamiento escalar o dipolar residual.54 Otra estrategia se ha basado en ampliar el conjunto de restricciones derivadas de NOEs a los protones hidroxílicos para obtener más restricciones significativas. 27 Exp. SD <r-6> syn- SD <r-6> anti- H1’-H6* 2,2* 2,35 2,30 H1’-H5 Solap. 3,83 3,77 H1’-H1 3,7 3,30 3,92 H1’’-H3’ 3,4 3,33 3,13 H1’’-H5’ 3,1 3,31 3,08 H1’’-H4’ 2,5 2,39 2,43 Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 121│ Así la estudio de los protones hidroxílicos ha sido empleado para obtener información estructural en términos de estereoquímica55, distancias interprotónicas56,57, enlaces de hidrógeno58, etc. Requisitos para la observación de los hidroxilos en agua: El primer requisito es obviamente realizar los experimentos en H2O para evitar el intercambio de los protones lábiles con los deuterones del disolvente habitualmente empleado. En estas condiciones es necesario observar las señales del soluto (~1mM) en presencia de las de H2O (~50M). Esta relación sobrepasa el rango dinámico de los ADCs empleados en RMN, lo que implica usar algun tipo de supresión de señal del disolvente para observar las del soluto, como por ejemplo, presaturación59, Jump-Return60, NOHOSS61, 1-1 Echo62, Spin-Lock63 o empleando gradientes de campo, watergate64 o excitation sculpting65. Por otro lado, el esquema empleado para eliminar la señal debe ser más rápido que la velocidad de intercambio entre los protones lábiles y el disolvente para evitar destruir las señales de interés. Este es el inconveniente de la presaturación, que es el método más común para suprimir la señal del disolvente. Durante el proceso de saturación los protones lábiles se intercambian con los del disolvente magnéticamente inactivos, produciendo la perdida de las señales de interés. El módulo Watergate (Water Supresion by Gradient Tailored Excitation), utiliza una combinación de pulsos de radiofrecuencia selectivos y pulsos de gradientes para conseguir una supresión de agua del rango necesario (104-105) y es suficientemente rápido como para permitir la observación de señales con velocidades de intercambio relativamente altas. Además, es sencillo de adaptar a la mayoria de experimentos de RMN. Estas características le han convertido en la técnica de elección para la supresión de disolventes cuando se desea observar señales de protones intercambiables con el agua.66 Los protones hidroxílicos tienen velocidades intrínsecas de intercambio con el agua mucho mayores que otros protones intercambiables, como los protones de amida de las proteinas. Por ello la observación de las señales de los grupos hidroxilo de carbohidratos es mucho más difícil. Su éxito depende en gran medida de la disminución de la cinética del intercambio en la muestra. Para ello se disminuye la temperatura lo máximo posible, incluso empleando mezclas crioscópicas como H2O / Acetona o Metanol 9:1 que congela entre -10 a - 15º C67 o DMSOd6: H2O 1:3 (v/v) que congela a – 62º C68 o métodos de agua superenfriada.69 Como el mecanismo de intercambio presenta un mecanismo de catálisis acido-base general, tambien es de vital importancia el ajuste del pH de la muestra en torno a la neutralidad con el fin de minimizar este intercambio.70 Finalmente, es igualmente importante limitar la presencia de trazas ionicas que de la misma manera actuan como catalizadores del proceso.71 Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 122│ Resultado con los pseudooligosacáridos 25 y 26. Con el fin de optimizar las condicciones experimentales, preparación de la muestra, optimización de las secuencias de pulsos, etc, se eligió como compuesto modelo la sacarosa que ha sido frecuente objeto de este tipo de estudios . Figura 3.28. Espectros de RMN para una muestra de sacarosa en H2O/(CD3)2CO, en proporción 85% / 15%, 20mM realizado a -7ºC y pH 6.75; en la parte superior se muestra el espectro de TOCSY, a  m de 40ms, en la inferior el espectro 1D 1H ambos con módulo WATERGATE. Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 123│ Los experimentos se realizaron con una muestra de sacarosa y utilizando condiciones establecidas por estudios precedentes:pH próximo a la neutralidad (6,75), temperaturas por debajo de -7ºC empleando una mezcla agua y acetona y el módulo de supresión de agua tipo Watergate, con el tren de pulsos 3-9-19. Los resultados fueron buenos pudiendo realizar experimentos bidimensionales (TOCSY y NOESY) y fue posible realizar una completa asignación de las resonancias de los hidroxilos (figura 3.28). También se pudo establecer que la influencia de la concentración es apreciable aunque no trascendental realizando los experimentos a concentraciones entre 2 y 20mM. A continuación realizamos los experimentos para detectar los hidroxilos de los trisacáridos 25 y 26. Después de varios ensayos se determino que en nuestro caso, la mezcla de disolventes optima fué agua / acetona 85:15, lo que permitió alcanzar temperaturas de -17ºC para una concentración de azúcar del orden de 10mM. En primer lugar, se realizo una evaluación detallada de la influencia del pH en las señales de los hidroxilos (Figura 3.29). Tal y como se esperaba, los pH próximos a la neutralidad, son los más apropiados para la observación de estas señales, siendo los optimos: 7,17 para 25 y de 7,12 para 26. A valores por debajo de pH 5,0 y por encima de 8,0 se observa un ensanchamiento notable de las señales, como consecuencia de la aceleración de procesos de intercambio químico. Otro de los factores que influye en el aspecto de los espectros, concretamente en la forma de los protones lábiles intercambiables, es la temperatura. Por un lado su disminución favorece la observación de las señales al disminuir la velocidad del intercambio químico con el agua, por otro su influencia en la movilidad del soluto y viscosidad del disolvente a temperaturas próximas a la congelación produce un ensanchamiento generalizado de las señales. Aunque se había descrito la utilización de resinas de intercambio iónico72,71e para eliminar posibles trazas de las impurezas iónicas que catalizan el intercambio, en nuestro caso debido a la presencia de grupos cargados fosfato y amino en los pseudotrisacaridos 25 y 26 esto no fue posible. Por ello, se efectuó la purificación previa empleando cromatografía en fase reversa. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 124│ Figura 3.29. Espectros de RMN para una muestra de 25 (izda) en H2O/(CD3)2CO, en proporción 85%:15%, realizado a -7ºC y 500 MHz y variando el pH para observar el rango óptimo de observación de las señales de hidroxilo (desapantalladas) y de 26 (drcha)con variaciones de la temperatura desde 273K (inferior) hasta 262 K(superior) para un pH óptimo fijo de 7,12. Finalmente, las condiciones optimas encontradas para la de preparación de las muestras fueron: el empleo de agua y acetona (85:15) como disolvente, a pH de 7,17 para 22 y de 7,12 para 23 y una temperatura entre 0ºC hasta –15ºC. La asignación de las señales de los protones hidroxílicos se realizó mediante experimentos TOCSY realizados a diferentes tiempos de mezcla (15-60 ms) y experimentos NOESY y ROESY todos ellos empleando el módulo watergate (figura 3.30). Se pudieron detectar e identificar las señales correspondientes al residuo del ciclitol (mio-inositol), no identificándose las correpondientes a los otros anillos de piranosa (ver figura 3.31). La señal más desapantallada y estrecha del espectro se corresponde con los protones del grupo amino, en posición 2 de los residuos de glucosa. Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 125│ Figura 3.30. Espectros TOCSY con módulo WATERGATE a  m de 40 ms para una muestra de 26 en H2O/ (CD3)2CO, a -11ºC y 500MHz y realizados a pH óptimo de 7,17. Figura 3.31. Ampliación de los espectros TOCSY con módulo WATERGATE a  m de 15 ms (centro) y 40 ms (abajo) para una muestra de 25 (izda) y 26 (derecha) en H2O/ (CD3)2CO, a -11ºC y 500MHz y realizados a sus pH óptimos. El diagrama superior derecho muestra una ampliación del 2D- NOESY para 26 con WATERGATE a 300 ms. En cualquier caso y a pesar de haber conseguido observar y asignar las señales de algunos hidroxilos, no se pudo extraer información estructuralemente relevante como constantes de acoplamiento o NOEs interglicosidicos. En nuestras manos y para estos compuestos no fue posible reducir suficientemente las velocidades de intercambio con el disolvente y las señales observadas eran aun demasiado anchas como para poder medir las Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 126│ constantes de acoplamiento. El mismo intercambio quimico domina los experimentos NOESY y ROESY de forma tal que no permite obtener picos NOE de valor estructural debido a que las transferencias secuenciales generan un alto número de permutaciones. Una posible explicación para la diferencia de comportamiento de 25 y 26 con la sacarosa empleando el mismo sistema, equipo y laboratorio, podria residir en la influencia de los grupos ionizados presentes en los pseudotrisacaridos como autocatalizadores de los procesos de intercambio con el disolvente. Como consecuencia de los estos resultados se decidió no continuar el estudio con el resto de los compuestos. 3.5.- DISCUSIÓN Se ha llevado a cabo el estudio estructural en disolución de las estructuras pseudodisacarídicas 20-22, y pseudotrisacarídicas 23-27, mediante la combinación de RMN y métodos de cálculo teóricos: MM y dinámicas moleculares estocásticas. Los estudios se han realizado con el campo de fuerzas AMBER* y parametrizaciones de Senderowitz-Parish–Still, de manera similar a la presentada en el capítulo 2 de esta tesis doctoral. Respecto a los compuestos 20-22, caracterizados por poseer grupos fosfato en los anillos de GlcN, se ha comprobado experimentalmente (a través de NOEs exclusivos) que existen en disolución como un equilibrio entre dos confórmeros: uno mayoritario syn-, y otro minoritario del tipo anti-. Con el objeto de poder realizar un estudio comparativo del efecto de la sustitución del grupo fosfato, en las simulaciones teóricas se realizó la comparación con el compuesto base 7 (que no posee grupo fosfato). Las trayectorias de las dinámicas estocásticas (SD) de los compuestos 20-22, visitaron las regiones anti-mientras esto no sucedió para 7. La comparación entre las distancias promedio a lo largo de las trayectorias y las experimentales, fueron buenos para la distancia que caracteriza al mínimo más poblado syn-, mientras que las correspondientes a la contribución de confórmeros anti-, fueron en general, sobreestimadas en todos los casos. El estudio de los pseudotrisacáridos 23-27 requirió analizar separadamente las dos uniones glicosídicas, a saber, Hexosa-(1→4)-GlcN y GlcN-(1→6)-mio-inositol. Con respecto al enlace GlcN-(1→6)-mio-inositol para 23, 24, 25, 26 y 27, la observación simultánea de NOE exclusivos de las conformaciones syn-yanti-, incompatibles entre sí, indicó que para este enlace debe existir un equilibrio conformacional entre ambas situaciones. La mayor intensidad de los mínimos syn-, frente a los anti-nos señala la menor distancia de los primeros. Respecto al otro enlace glicosídico, hexosa-(1→4)-GlcN, ocurre algo Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 127│ similar; todos los compuestos presentan un equilibrio conformacional entre un mínimo anti- minoritario y otro syn- mayoritario. Los mapas de energía adiabáticos y mapas de distribución de probabilidad conformacional calculados concuerdan aceptablemente con las distancias experimentales para la unión Hexosa-(1→4)-GlcN de los compuestos 23-27. Así se predicen los mínimos syn- y los anti- que antes habían sido detectados experimentalmente por RMN, validando esta metodología empleada. Respecto a la unión GlcN-(1→6)-mio-inositol, que ya había sido analizada en el capítulo 2, el modelo empleado no predice los mínimos anti-. La metodología de dinámicas estocásticas fue empleada a continuación con dos tratamientos del disolvente implícito diferentes: =80 y GB/SA, con el objeto de comprobar cuál reproducía con mayor fiabilidad los datos experimentales hallados mediante los experimentos de RMN. De manera general se puede decir que el empleo de SD mejoró los ajustes entre las distancias experimentales y las teóricas calculadas como promedio de las estructuras en las simulaciones, con respecto a las simulaciones de MM. En ambas uniones glicosídicas, las distancias relativas a conformaciones syn-, fueron mejor reproducidas por las simulaciones, especialmente al emplear el método de GB/SA. Por otro lado, las distancias anti-  fueron sistemáticamente sobreestimadas independientemente de las condiciones utilizadas. Es destacable el caso del compuesto 27, en donde el ajuste experimentado en las distancias que caracterizaban los dos mínimos conformacionales syn-/ anti-, entre los experimentos de RMN y las simulaciones de SD, fue casi perfecto para ambas uniones glicosídicas. Con los objetivos propuestos en el apartado 3.3.4 del presente capítulo, se realizaron experimentos con H2O como disolvente, a bajas temperaturas y utilizando los métodos actuales para supresión de disolventes mediante técnicas de RMN (secuencias de watergate), en los compuestos 25 y 26. A pesar del enorme esfuerzo empleado para la detección de los OH- de estos compuestos en H2O, apenas algunos hidroxilos de los residuos de mio-inositol pudieron ser claramente detectados, mientras que aquéllos de los residuos de hexosa y de glucosamina permanecieron ocultos. Puesto que empleando como modelo sacarosa pudimos detectar satisfactoriamente los hidroxilos utilizando las mismas condiciones que con 25 y 26 (campo magnético, temperatura, etc.) se puede concluir que la naturaleza intrínseca de estos potenciales mediadores de IPGs (más concretamente, la presencia de los grupos fosfato y amonio) es la que impide la plena observación de los hidroxilos en H2O. También se ha evaluado el uso de disolvente explícito en los estudios de modelado molecular empleando el compuesto 25 como modelo. El cálculo de cargas atómicas válidas Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 128│ para este compuesto 25 y extrapolables a los demás, hizo que se empezara por el residuo de ciclitol (mio- y quiro-inositol común en todas los compuestos), tanto en sus versiones libre como metilados en posición 6. Nos hemos concentrado en los métodos de cargas basadas en el potencial electrostático (RESP) y nuestro criterio de calidad clave fue el cálculo de las energías de interacción electrostática total de las simulaciones. Tras el cálculo específico de las cargas basadas en el potencial electrostático, las dificultades en estas simulaciones empezaron con la equilibración del sistema, tras incluir el soluto 25 en la caja rectangular de agua (TIP3P), donde se producían continuos errores debidos al reescalado de las velocidades atómicas. Tras superar estos problemas, la dinámica productiva (10 ns en aproximadamente 6 meses de simulación) tampoco mejoró la descripción del equilibrio observado experimentalmente entre los mínimos syn- y anti-. Por esto y a falta de datos que inviertan esta opinión, no parece demasiado adecuado emplear esta metodología en el estudio de pseudooligosacáridos mediadores de IPGs, dado la elevada exigencia requerida en coste computacional y los resultados obtenidos. Capítulo 3: Estudio de IPGs potenciales inhibidores de la cPKA 129│ 3.6.- BIBLIOGRAFIA 1 Jones, D.R.; Varela-Nieto, International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 1998, 30, (3), 313-326. 2 Field, M. C. Glycobiology. 1997, 7, (2), 161-168. 3 Stralfors, P. Bioessays. 1997, 19, (4), 327-335. 4 Cohen, P. Nature Reviews Drug Discovery. 2002, 1, (4), 309-315. 5 Knighton, D.R.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Ashford, V.A.; Xuong, N.H.; Taylor, S.S.; Sowadski, J.M. Science 1991, 253, (5018), 407-414. 6 Knighton, D.R.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Xuong, N.H.; Taylor, S.S.; Sowadski, J. M. Science 1991, 253, (5018), 414-420. 7 Zheng, J.H.; Knighton, D.R.; Parello, J.; Taylor, S.S.; Sowadski, J.M. Methods in Enzymology 1991, 200, 508-521. 8 Knighton, D.R.; Bell, S.M.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Xuong, N.H.; Taylor, S.S.; Sowadski, J.M. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 1993, 49, 357-361. 9 Zheng, J.H.; Knighton, D.R.; Teneyck, L. F.; Karlsson, R.; Xuong, N.H.; Taylor, S.S.; Sowadski, J.M. Biochemistry. 1993, 32, (9), 2154-2161. 10 Zheng, J.H.; Knighton, D.R.; Xuong, N.H.; Taylor, S.S.; Sowadski, J.M.; Teneyck, L.F. Protein Science. 1993, 2, (10), 1559-1573. 11 Zheng, J.H.; Trafny, E.A.; Knighton, D.R.; Xuong, N. .; Taylor, S.S.; Teneyck, L.F.; Sowadski, J.M. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 1993, 49, 362-365. 12 Madhusudan; E.A.;Trafny, E.A.; Xuong, N.H.; Adams, J.A.; Teneyck, L.F.; Taylor, S.S.; Sowadski, J.M. Protein Science. 1994, 3, (2), 176-187. 13 Karlsson, R.; Zheng, J.H.; Xuong, N.H.; Taylor, S.S.; Sowadski, J.M. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 1993, 49, 381-388. 14 Gassel, M.; Breitenlechner, C.B.; Konig, N.; Huber, R.; Engh, R.A.; Bossemeyer, D. Journal of Biological Chemistry. 2004, 279, (22), 23679-23690. 15 Prade, L.; Engh, R.A.; Girod, A.; Kinzel, V.; Huber, R.; Bossemeyer, D. Structure. 1997, 5, (12), 1627-1637. 16 Engh, R.A.; Girod, A.; Kinzel, V.; Huber, R.; Bossemeyer, D. Journal of Biological Chemistry. 1996, 271, (42), 26157-26164. 17 Bossemeyer, D.; Engh, R.A.; Kinzel, V.; Ponstingl, H.; Huber, R. Embo Journal. 1993, 12, (3), 849-859. 18 Toledo, L.M.; Lydon, N.B.; Elbaum, D. Current Medicinal Chemistry. 1999, 6, (9), 775-805. Capítulo 4: Parte experimental 136│ 4 PARTE EXPERIMENTAL 4.1.- RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. Los espectros de RMN se han registrado en el espectrómetro Bruker AVANCE 500 DPX del servicio de RMN del Centro de Investigaciones Químicas Isla de la Cartuja. Los espectros han sido asignados utilizando técnicas bidimensionales convencionales, COSY, 2 TOCSY, 3 NOESY 4 , ROESY, 5 y HMQC 6 o HSQC 7 , La concentración de las muestras de oligosacáridos para RMN, estuvo siempre en el entorno de 3-1 mM (disueltos en 600-500 L de disolvente). Las muestras se liofilizaron al menos 3 veces con D2O, y posteriormente se disolvieron en D2O del 99.97 %D (euriso-top). El valor de pH* se ajustó en todos los casos mediante adición de pequeñas cantidades de DCl o NaOH (referecia). Todos los espectros de RMN se registraron en D2O a 25º C, salvo en casos concretos en los que se especifique otra temperatura, en espectrómetros Bruker AVANCE DRX-500 (sonda de detección inversa de 5mm doble 1H/Banda-ancha, con gradientes en Z), y 2 Griesinger, C.; Sørensen, O.W.; Ernst, R.R. J. Magn. Reson. 1987, 75, (3), 474- 492. b) Mueller, L. J. Magn. Reson. 1987, 72, (1), 191-196. c) Kim, Y.; Prestegard, J.H. J. Magn. Reson. 1989, 84, (1), 9-13. 3 a) Braunschweiler, L.; Ernst, R.R.; J. Magn. Reson. 1983, 53, 521-528. b) Bax, A.D. Davis, G.; J. Magn. Reson. 1985, 65, 355-360. c) Bax, A.; Methods Enzymol. 1989, 176, 151-168 4 Jeener, J.; Meier, B.H.; Bachmann, P.; Ernst, R.R.; J. Chem. Phys. 1979, 71, 4546- 4553. 5 a) Farmer, B. T.; Macura, S.; Brown, L. R. J. Magn. Reson. 1987, 72, 2, 347-352. b) Bull. T.E. J. Magn. Reson. 1988, 80, (3), 470-481. c) Poppe, L.; van Halbeek. H. J. Magn. Reson. 1992, 96, (1), 185-190. 6 a) Kessler, H.; Schmieder, P.; Kurz, M. J. Magn. Reson. 1989, 85, (2), 400-405. b) Crouch, R.C.; McFadyen, R.B.; Daluge, S.M.; Martin, G.E. Magn. Reson. Chem. 1990, 28, (9), 792-796. 7 a) Marion, D.; Wüethrich, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980, 95, 1. b) Müller, L. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 4481-4484. c) Willker, W.; Leibfritz, D.; Kerssebaum, R.; Bermel, W. J. Magn. Reson. 1993, 31, 287-292. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 137│ Bruker AVANCE DRX-400 (sonda directa 5mm QNP). Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón (ppm) respecto a la frecuencia de resonancia del DSS como referencia primaria, aunque la calibración de los desplazamientos químicos se realizó a partir de la frecuencia base absoluta del núcleo correspondiente y la relación de frecuencias, de acuerdo con el software del fabricante. Los experimentos 2D DQF-COSY 8 , TOCSY, NOESY, ROESY y TROESY 9 se registraron en el modo sensible a la fase con el método TPPI (Time Proportional Phase Increment) para la detección en cuadratura en F1. Los experimentos HMQC se llevaron a cabo en modo magnitud, y los experimentos HSQC en el modo sensible a la fase con detección “eco-antieco”. Para los espectros COSY, NOESY HMQC, y HSQC, se utilizaron programas de pulsos con gradientes en Z para selección o purga. En los experimentos DQF-COSY se utilizaron típicamente matrices de datos de 4 K x 1 K, para anchuras espectrales de 5000 Hz, y 16-32 acumulaciones por incremento, dependiendo de la muestra. Se aplicaron funciones sen2x desplazadas, en ambas dimensiones, y se aplicó zero-filling en F1 para aumentar la resolución digital expandiendo los datos a una matriz de 8 K x 2 K. Esta importante expansión de los datos confiere mayor precisión en la obtención de las constantes 3JH,H por desconvolución recursiva en el dominio de frecuencias de los picos de cruce. Para tal efecto se hizo uso del programa DECO implementado en el programa de procesado de RMN XWINNMR. Las constantes de acoplamiento teóricas se 8 a) Rance, M.; Sørensen, O.W.; Bodenhausen, G.; Wagner, G.; Ernst, R.R.; Wüthrich, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983, 117, 479-485. b) Piantini, U.; Sørensen, O.W.; Ernst, R.R. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 6800-6801. c) Davis, A.L.; Laue, E.D.; Keeler, J.; Moskau, D.; Lohman, J. J. Magn. Reson. 1991, 94, 637- 644. 9 a) Brüschweiler, R.; Griesinger, C.; Ernst, R.R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, (20), 8034-8035. b) Brüschweiler, R. Structural dynamics in biomolecules monitored by nuclear magnetic resonance relaxation (Doctoral dissertation, Diss. Naturwiss. ETH Zürich, Nr. 9466, 1991. c) Hwang, T.L., Shaka, A.J. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, (8), 3157-3159. Capítulo 4: Parte experimental 138│ obtuvieron por aplicación de las ecuaciones tipo Karplus modificadas por Haasnoot et al. 10 ¡Error! Marcador no definido. implementadas en Macromodel 6.0. Las constantes de acoplamiento interprotónicas fueron obtenidas por medida directa del desdoblamiento cuando fue posible ó por desconvolución de los picos en antifase en los experimentos DQF-COSY (Double-Quantum Filtered Correlation Spectroscopy). 11 Para los experimentos TOCSY, se utilizaron generalmente matrices de datos de 2 K x 256-300, y 32 acumulaciones por incremento, dependiendo de la muestra. Se utilizó la secuencia MLEV-17 con 60 ms como período de mezcla isotrópica. Para mejorar la resolución se aplicaron funciones sen2x desplazadas, y predicción lineal en la dimensión F1. Los experimentos 2D-NOESY se registraron a diferentes tiempos de mezcla 200 y 600 ms (típicamente 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, y 600 ms) empleando matrices de datos de 2K x 300, y fueron procesados aplicando funciones sen2x desplazadas y zero-filling durante la transformación. Los experimentos de correlación 1H-13C a un enlace se llevaron a cabo mediante secuencias HMQC o HSQC. En todos los casos se adquirió una matriz de datos de 1 K x 256 para resolver anchuras espectrales de 5000 Hz y 12600 Hz en F2 y F1, respectivamente, realizando 16 acumulaciones por incremento. Se aplicaron funciones sen2x con valores de desplazamiento (SSB) de 2.2 (F2) y 3.5 (F1), se completó con ceros hasta una matriz final de 1K x 1K y se empleó predicción lineal en la dimensión F1. Para la evolución de las constantes de velocidad de relajación cruzada, NOE, ROE, T-ROE, se emplearon siempre que fue posible experimentos 1D selectivos basados en el doble eco de espín propuesto por Shaka (dpfgse: double pulsed field 10 Haasnoot, C.A.G.; de Leeuw, F.A.A.M.; Altona, C. Tetrahedron. 1980, 36, (19), 2783–2792. b) Haasnoot, C.A.G.; De Leeuw, F.A.A.M.; Altona, C. Bull. Soc. Chim. Belges, 1980, 89, 125–131. 11 a) Cavanagh, J.; Waltho, J. P.; Keeler, J. J. Magn. Reson. 1987, 74, (2), 386-393. b) Pons, M.; Feliz, M.; Giralt, E. J. Magn. Reson. 1988, 78, (2), 314-320. c) Derome, A.E; Williamson, M. P. J. Magn. Reson. 1990, 88, (1), 177-185. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 139│ gradients spin echo). En el caso de los experimentos NOESY se empleó un esquema en esencia similar al propuesto por Keeler y Shaka que incluye gradientes bipolares en el tiempo de mezcla para disminuir posibles interferencias de mecanismos no deseados. Para verificar la linealidad del crecimiento en el rango de tiempo de mezcla considerado, se representaron las curvas del volumen normalizado para cada tiempo de mezcla (Vij/Vdiag)t=t frente al tiempo de mezcla. Una vez comprobado, se obtuvieron las constantes de velocidad de relajación cruzada, , como la velocidad inicial de crecimiento del NOE, ROE o TROE calculada por extrapolación a tiempo de mezcla cero de la relación lineal (Vij/[Vdiag·tm]) vs. tm, donde Vij , Vdiag., y tm, son los volúmenes de los picos de cruce y diagonal, y el tiempo de mezcla, respectivamente 12 . Observación de protones lábiles. La concentración de las muestras empleadas fue similar a la de los estudios en D2O, salvo en el caso de los experimentos sobre sacarosa en los que se varió entre 2 y 20mM. También se evaluaron tubos de RMN no convencionales de 1.5 mm que permitieron aumentar la concentración hasta 10 mM. Los tubos de RMN fueron tratados previamente con tampón fosfato a pH neutro o con Cloruro de TMS para evitar interferencias de la superficie del vidrio. 13 , 14 Se emplearon como disolvente mezclas H2O/D2O (90:10), agua / DMSO y agua / acetona en varias proporciones, siendo la optima agua / acetona 85:15 a temperaturas entre 5 y -17C. Los experimentos monodimensionales se registraron empleando los métodos watergate, original o empleando los trenes de pulsos 3-9-19, W3, W4 y W5, 15 o excitation 12 van Halbeek, H.; Poppe, L. Magn. Reson. Chem. 1992, 30, 74-86. 13 Sandström, C.; Baumann, H.; Kenne, L. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1998, 2, 809- 815. 14 Bekiroglu, S.; Sandström, C.; Norberg, T.; Kenne, L. Carbohydr. Res. 2000, 328, 409-418. 15 a) Piotto, M.; Saudek, V.; Sklenar, V. J. Biomol. NMR. 1992, 2, 661. b) Sklenar, V.; Piotto, M.; Leppik, R.; Saudek, V. J. Magn. Reson. A. 1993, 102, 241. Capítulo 4: Parte experimental 140│ sculpting 16 . Para los experimentos bidimensionales TOCSY (15-60 ms de tiempo de mezcla), NOESY o ROESY se emplearon siempre implementaciones del watergate basadas en el tren 3-9-19 sobre los programas de pulsos empleados anteriormente. El resto de las condiciones experimentales: tipo de adquisición, opciones de transformación etc. fueron, en esencia, similares a las descritas para los experimentos en D2O. Finalmente, las condiciones optimas encontradas para la de preparación de las muestras fueron: el empleo de agua y acetona (85:15) como disolvente, a pH de 7,17 para 22 y de 7,12 para 23 y una temperatura entre 0ºC hasta –15ºC. Aunque se había descrito la utilización de resinas de intercambio iónico para eliminar posibles trazas de las impurezas iónicas que catalizan el intercambio. En nuestro caso, debido a la presencia de grupos cargados fosfato y amino en los pseudotrisacaridos 25 y 26 se efectuó la purificación previa empleando cromatografía en fase reversa. Valoraciones ácido-base. Las muestras empleadas en los experimentos de valoración fueron las mismas que se usaron en el resto de los experimentos salvo que se empleó acetona (3-5 L) como referencia interna. El pH* se varió añadiendo pequeñas cantidades de NaOD, o DCl, y se midió después de la medida empleando un pHmetro sin calibración especial para corregir los efectos isotópicos del deuterio. 16 a) Hwang, T-L.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1995, 112, 275. b) Emetarom, C.; Hwang, T.-L.; Mackin, G.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1995, 115, 137. c) Mackin, G.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1996, 118, 247. d) Heikkinen, S.; Rahkamaa, E.; Kilpeläinen, I. J. Magn. Reson. 1997, 127, 80-86. e) Heikkinen, S.; Rahkamaa, E.; Kilpeläinen, I. J. Magn. Reson. 1998, 133, 183-189. Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 141│ 4.2.- CÁLCULOS TEÓRICOS. Los ángulos de torsión han sido definidos como: =H1C1O1Cx, = C1O1CxHx, y =H5C5C6O6. Mapas adiabáticos. En el cálculo de los mapas adiabáticos se empleó el programa Macromodel 6.0 empleando el campo de fuerzas AMBER* con la adaptación de la parametrización de Homans o con la posterior de Stille empleando las cargas puntuales asignadas por el campo de fuerzas e incluyendo los efectos del disolvente empleando una constante dieléctrica de 80 ó el modelo continuo GB/SA. Las estructuras de partida se construyeron, en una primera etapa, manualmente y minimizaron exhaustivamente antes de comenzar la preparación de los mapas rígidos. En todas las minimizaciones se empleó el algoritmo de gradientes conjugados de Polar-Ribiere hasta cumplir el criterio de convergencia (derivadas de rmnd menores de 0.001 hJ/Åmol) hasta un máximo de 9999 iteraciones. Los mapas rígidos se construyeron variando los ángulos de torsión estudiados cada 20º en las estructuras de partida minimizadas. Para la generación de estos mapas se consideraron los tres posibles rotámeros del grupo hidroximetilo: gg, gt, tg; los dos posibles sentidos de las disposiciones cíclicas de los grupos hidroxilo secundarios: “clockwise” o “anticlockwise”. Los mapas relajados se construyeron por minimización de los correspondientes mapas rígidos, según las condiciones citadas manteniendo constante los ángulos torsiones evaluadas. Y finalmente, los mapas adiabáticos se construyeron empleando un programa desarrollado por Manuel Martín Pastor incluidos en NOEPROM de acuerdo con la siguiente expresión, que evalúa la probabilidad en el espacio:                  ii ii RTE RTE P ,,, ,/exp /exp Capítulo 4: Parte experimental 142│ Las distancias interprotónicas sobre el espacio conformacional del mapa adiabático se calcularon como el promedio en <r-6> pesado en la probabilidad de cada punto según:   6/1 66    klkl kl rPr Simulaciones "in vacuo" Para las dinámicas moleculares (newtonianas o estocásticas) se usó el programa Macromodel 6.0, y los mismos campos de fuerzas y asignaciones de cargas que las empleadas en el cálculo de los mapas adiabáticos. Tanto para las dinámicas con  = 80 como para aquellas con GB/SA el protocolo seguido fue el mismo. En primer lugar, la estructura de partida elegida sobre los mapas adiabáticos se sometió a una minimización energética en las condiciones habituales. Posteriormente, tras una fase de equilibración con una asignación de velocidades iniciales según una distribución de Maxwell-Boltzmann a 0K y calentamiento progresivo durante 100-500 ps, se realizó la etapa productiva a temperatura constante de 300K usando un tiempo de integración de 1.0 fs, actualizando la lista de pares de no-enlace cada 25 etapas de integración, con una la distancia límite para el truncado de estas interacciones (cutoff ) de 10 Å, aplicando el algoritmo SHAKE para la restricción de los movimientos de alta frecuencia a los átomos de hidrógeno, y una constante de acoplamiento al baño térmico según el algoritmo de Berendsen de 0.5 ps (dinámicas newtonianas) o una constante de fricción de 2.5 ps (dinámicas estocásticas). Las estructuras intermedias fueron guardadas cada picosegundo. Las distancias promedio calculadas a lo largo de las simulaciones de dinámica molecular fueron calculadas como <r-6> según:   6/1 66 )/1(    kl kl rnr Tesis Doctoral José Luis Muñoz Ponce 143│ Simulaciones con disolvente explícito Para las simulaciones en presencia de disolvente explícito se empleó el programa AMBER 6.0 17 empleando el campo de fuerzas GLYCAM. Los distintos tipos de residuos se construyeron manualmente y se incluyeron en la librería de residuos de AMBER con el módulo PREP, modificando convenientemente los tipos de átomos para compatibilizarlos con las definiciones del campo de fuerzas AMBER-GLYCAM. Se calcularon las cargas puntuales para estos compuestos empleando GAUSSIAN 94 18 ó 98 19 , con el nivel de cálculo HF/6-31G* según el método RESP (Restrained ElectroStatic Potencial fit). 20 Las estructuras de partida se sometieron a una minimización "in vacuo", para eliminar malos contactos iniciales. Esta minimización consistió en 200 etapas de "descenso pronunciado" seguido por minimización con "gradientes conjugados" 17 Case, D.A.; Pearlman, D.A.; Caldwell, J.W.; Cheatham III, T.E.; Ross, W.S.; Simmerling, C.L,; Kollman, P.A. AMBER 6. University of California, San Francisco, 119. 1999. 18 Frisch, M.J.; Trucks, G.W.; Schlegel, H.B.; Gill, P.M.W.; Johnson, B.G.; Robb, M.A.; Cheeseman, J.R.; Keith, T.; Petersson, G.A.; Montgomery, J.A.; Raghavachari, K.; Al-Laham, M.A.; Zakrzewski, V.G.; Ortiz, J.V.; Foresman, J.B.; Cioslowski, J.; Stefanov, B.B.; Nanayakkara, A.; Challacombe, M.; Peng, C.Y.; Ayala, P. Y.; Chen, W.; Wong, M.W.; Andres, J.L.; Replogle, E.S.; Gomperts, R.; Martin, R.L.; Fox, D.J.; Binkley, J.S.; Defrees, D.J.; Baker, J.; Stewart, J.P.; Head- Gordon, M.; Gonzalez, C.; Pople, J.A. Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 1995. 19 Frisch, M.J.; Trucks, G.W.; Schlegel, H.B.; Scuseria, G.E.; Robb, M.A.; Cheeseman, J.R.; Zakrzewski, V.G.; Montgomery Jr, J.A.; Stratmann, R.E.; Burant, J.C.; Dapprich, S.; Millam, J.M.; Daniels, A.D.; Kudin, K.N.; Strain, M.C.; Farkas, O.; Tomasi, J.; Barone, V.; Cossi, M.; Cammi, R.; Mennucci, B.; Pomelli, C.; Adamo, C.; Clifford, S.; Ochterski, J.; Petersson, G.A.; Ayala, P.Y.; Cui, Q.; Morokuma, K.; Salvador, P.; Dannenberg, J.J.; Malick, D.K.; Rabuck, A.D.; Raghavachari, K.; Foresman, J.B.; Cioslowski, J.; Ortiz, J.V.; Baboul, A.G.; Stefanov, B.B.; Liu, G.; Liashenko, A.; Piskorz, P.; Komaromi, I.; Gomperts, R.; Martin, R.L.; Fox, D.J.; Keith, T.; Al-Laham, M.A.; Peng, C.Y.; Nanayakkara, A.; Gonzalez, C.; Challacombe, M.; Gill, P.M.W.; Johnson, B.; Chen, W.; Wong, M.W.; Andres, J.L.; Gonzalez, C.; Head-Gordon, M.; Replogle, E.S.;. Pople. J.A. Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA, 1998. 20 Bayly, C.I.; Cieplak, P.; Cornell, W.; Kollman, P.A. J. Phys. Chem-Us. 1993, 97, (40), 10269-10280.