Estructura y estabilidad en plastocianinas de cianobacterias

Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, Universidad de Sevilla – CSIC ESTRUCTURA Y ESTABILIDAD EN PLASTOCIANINAS DE CIANOBACTERIAS Trabajo presentado por la Licenciada Dª. Estrella Frutos Beltrán para optar al título de Doctor en Bioquímica por la Universidad de Sevilla. Sevilla, 2015 Directores Dr. D. Miguel Ángel De la Rosa Acosta Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de Sevilla Dr. D. Antonio Jesús Díaz Quintana Profesor Titular de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de Sevilla AGRADECIMIENTOS El presente trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía (P06CVI-01713, BIO-198 y P011-CVI-7216) y por el Ministerio de Economía y Competividad (BFU2009-07190). En su mayor parte, la investigación descrita en la presente memoria ha sido realizada en el Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja (cicCartuja), centro mixto entre la Universidad de Sevilla y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y cofinanciado por la Consejería de Economía, Innovación Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucía. Las estructuras cristalográficas de los mutantes de plastocianina se han resuelto a lo largo de dos estancias de tres meses en Diamond Light Source Ltd. (Reino Unido) bajo la supervisión del Dr. Armin Wagner, financiadas por dicha institución a través de acuerdo con la Universidad de Sevilla. En este instante, me gustaría agradecer a mis directores de tesis, Miguel Ángel De la Rosa y Antonio Díaz, la oportunidad, la paciencia y la dedicación durante estos, a veces, muy largos años. A Armin Wagner, por toda su atención durante mis estancias y mi introducción en la hermosa materia que es la cristalografía de proteínas. No puedo dejar pasar esta oportunidad sin agradecer también a mis compañeros del L1 y L5, a todos, porque gracias a ellos los buenos momentos fueron mejores, y los duros, más livianos. A Francisco Muñoz, por introducirme en todas las técnicas que posteriormente se convertirían en rutinarias; A Jonathan, por compartir este camino desde el primer día, aunque al final me acabara sacando mucho trecho (qué alto pusiste el listón); A Katiuska Gonález, por toda su ayuda durante mis últimos meses; A Blas Moreno, por toda su preocupación hacia mí (por fin Blas, por fin); A Cristina Albarrán, a quien debería haber hecho mucho más caso; A Pilar Alcántara, porque sin ella el trabajo se hubiera hecho aún más duro. Agradezco también a mis padres, que me han mostrado con sus acciones que lo peor de caerse es no intentar por todos los medios el volverse a levantar, y a Víctor, que ha soportado tantos momentos de desesperación por mi parte, a lo que ha respondido siempre con su incondicional apoyo y un fuerte abrazo. A ellos les dedico este trabajo. ÍNDICE Índice ÍNDICE AGRADECIMIENTOS ........................................................................... 3 ÍNDICE ............................................................................................ 7 ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................... 13 ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................... 19 LISTADO DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS .................................... 21 1. INTRODUCCIÓN ............................................................... 27 1.1. Las proteínas de cobre azul ............................................... 29 1.1.1. Las proteínas de cobre ...................................................... 29 1.1.2. Las proteínas de cobre azul ............................................... 35 1.1.2.1. El centro de cobre tipo-1 .................................................... 36 1.1.2.2. El dominio de unión a cobre azul: características y evolución............................................................................ 39 1.1.2.3. Cupredoxinas ..................................................................... 42 1.1.2.3.1. Plastocianina ..................................................................... 42 1.2. Aplicaciones biotecnológicas de las proteínas de cobre azul: biosensores electroquímicos ........................... 45 1.3. Termoestabilidad proteica .................................................. 47 1.3.1. Termoestabilidad termodinámica y termoestabilidad cinética .............................................................................. 47 1.3.2. Organismos mesofílicos y termofílicos ............................... 49 1.3.3. Mecanismos de termoestabilización proteica ..................... 50 1.3.4. Estabilidad térmica en cupredoxinas .................................. 61 1.3.4.1. Estabilidad térmica en plastocianinas ................................ 63 1.3.4.1.1. Comparación entre las plastocianinas de Synechocystis sp. PCC6803 y Phormidium Laminosum ........................................................................ 64 Índice 2. OBJETIVOS ...................................................................... 71 3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................. 75 3.1. Programas informáticos ..................................................... 77 3.2. Diseño de los mutantes ..................................................... 77 3.2.1. CUPSAT (“Cologne University Protein Stability Analysis Tool”) ................................................................... 78 3.2.2. Dinámicas moleculares ...................................................... 78 3.2.2.1. Análisis de componentes principales ................................. 83 3.2.2.2. Análisis de contenidos coseno ........................................... 85 3.3. Análisis de la termoestabilidad de Syn – Pc mediante mutagénesis dirigida .......................................................... 86 3.3.1. Organismos y condiciones de cultivo ................................. 86 3.3.2. Obtención de ADN de plastocianinas mutantes ............... 86 3.3.3. Expresión y purificación de plastocianinas silvestres y mutantes ............................................................................ 90 3.3.3.1. Producción de las plastocianinas recombinantes ............... 90 3.3.3.2. Purificación de las plastocianinas recombiantes ................ 91 3.3.3.3. Obtención de las formas apo de la plasctocianina ............. 93 3.3.4. Caracterización proteica .................................................... 93 3.3.4.1. Espectroscopía de dicroísmo circular ................................ 93 3.3.4.2. Medidas potenciométricas ................................................. 95 3.3.4.3. Espectrofotometría cinética inducida por láser ................... 96 3.3.5. Medidas de estabilidad térmica .......................................... 98 3.3.5.1. Estudios de fluorescencia .................................................. 98 3.3.5.1.1. Fluorimetría Diferencial de barrido (DSF; Differential Scanning Fluorymetry) ....................................................... 98 3.3.5.1.2. Espectroscopía de fluorescencia ..................................... 100 Índice 3.3.5.2. Dicroísmo circular ............................................................ 102 3.3.5.3. Análisis de las rampas de temperatura y obtención de la temperatura de desnaturalización ................................ 102 3.4. Caracterización estructural de las plastocianinas mutantes mediante difracción de rayos X......................... 104 3.4.1. Cristalización ................................................................... 109 3.4.1.1. Syn–A44D/D49P/A62L..................................................... 109 3.4.1.2. Syn-V48I .......................................................................... 110 3.4.1.3. Pho-P49G/G50P .............................................................. 111 3.4.2. Colección de datos de difracción y refinamiento .............. 111 4. RESULTADOS................................................................. 113 4.1. Diseño de los mutantes de la plastocianina de Synechocystis sp. PCC6803 ............................................ 115 4.1.1. Mutaciones introducidas en la zona de interacción del lazo L5 con el barril: cluster hidrofóbico ........................... 115 4.1.1.1. Sustitución V48I. .............................................................. 117 4.1.1.2. Sustituciones L56I, T52Y y T52I ...................................... 118 4.1.1.3. Mutantes en las hebras β5 y β6: G60A, K59S y V42I ....... 120 4.1.1.4. Sustitución A3F ................................................................ 121 4.1.1.5. Mutantes múltiples. .......................................................... 122 4.1.2. Análisis de las mutaciones mediante el programa CUPSAT .......................................................................... 124 4.2. Simulaciones de dinámica molecular de corta duración ........................................................................... 125 4.3. Análisis de la termoestabilidad de Syn-Pc mediante mutagénesis dirigida ........................................................ 128 4.3.1. Expresión y purificación de plastocianinas silvestres y mutantes. ...................................................................... 128 Índice de figuras Figura 39. Aportaciones a la estabilidad de la matriz y el centro de cobre para cada uno de los mutantes de Syn-Pc respecto al silvestre. ........................................................ 155 Figura 40. Tendencias en la Tm respecto a los valores de potenciales rédox............................................................. 157 Figura 41. Tendencias de la diferencia de Tm (ΔTm) entre las diferentes formas respecto a E0. ..................................... 159 Figura 42. Desviaciones medias (RMSDs) a lo largo de las trayectorias de larga duración calculadas a (A) 298 y (B) 498K. ......................................................................... 161 Figura 43. Radio de giro (Rg) a lo largo de las trayectorias de larga duración calculadas a (A) 298 y (B) 498K. .............. 163 Figura 44. Fluctuaciones cuadráticas medias (RMSF) a lo largo de las trayectorias de larga duración calculadas a 298 K para las formas holo de Syn-Pc y sus mutantes. .......... 166 Figura 45. Fluctuaciones cuadráticas medias (RMSF) a lo largo de las trayectorias de larga duración calculadas a 298 K para las formas apo de Syn-Pc y sus mutantes. ........... 168 Figura 46. Fluctuaciones cuadráticas medias a 298 K. ..................... 169 Figura 47. Fluctuaciones cuadráticas medias (RMSF) a lo largo de las trayectorias de larga duración calculadas a 498 K de las formas holo y apo de Syn-Pc y sus mutantes. 172 Figura 48. Fluctuaciones cuadráticas medias a 498 K. ..................... 173 Figura 49. Evolución de la estructura secundaria de las formas holo a 298 K .................................................................... 175 Figura 50. Cambios estructurales experimentados por las formas holo de Syn-Pc y sus mutantes V48I y A44D/D49P/A62L a lo largo de la trayectoria a 298K. ...... 176 Índice de figuras Figura 51. Evolución de la estructura secundaria de las formas apo a 298 K ..................................................................... 177 Figura 52. Cambios estructurales experimentados por las formas apo de Syn-Pc y sus mutantes V48I y A44D/D49P/A62L a lo largo de la trayectoria a 298K. .......................................................................... 178 Figura 53. Evolución de la estructura secundaria de las formas (A) holo y (B) apo a 498 K ................................................ 181 Figura 54. Cambios estructurales experimentados por las formas holo de Syn-Pc y sus mutantes V48I y A44D/D49P/A62L a lo largo de la trayectoria a 498K. ...... 182 Figura 55. Cambios estructurales experimentados por las formas apo de Syn-Pc y sus mutantes V48I y A44D/D49P/A62L a lo largo de la trayectoria a 498K. ...... 183 Figura 56. Representación de los valores propios frente a sus respectivos vectores propios. ........................................... 185 Figura 57. Representaciones gráficas de los movimientos concertados a lo largo de los cinco primeros vectores propios para Syn-Pc, Syn-V48I y SynA44D/D49P/A62L a 298K. ............................................... 188 Figura 58. Cristal obtenido para el mutante Syn-V48I de la plastocianina. ................................................................... 190 Figura 59. Cristal obtenido para el mutante Pho-P49G/G50P de la plastocianina. ............................................................... 191 Figura 60. Detalles de los lazos L1 y L5 de Syn-V48I ........................ 194 Figura 61. Detalle de la Ile48 y el centro de cobre de Syn-V48I ........ 195 Figura 62. Alineamiento de las estructuras (A) y de los centros metálicos (B) de Syn-V48I y Syn_A44D/D49P/A62L. ....... 196 Índice de figuras Figura 63. Detalle de la interfase entre los lazos L5 y L7 de SynPc (A) y Syn-V48I (B). ..................................................... 198 Figura TMS 1. Espectros de desnaturalización de la forma reducida de Syn-Pc mediante DSF. ................................. 258 Figura TMS 2. Captura de pantalla de los espectros de desnaturalización de la apo-Pc de Syn-Pc mediante DSF. ................................................................................ 258 Figura TMS 3. Ejemplos del espectro de emisión de fluorescencia y de la curva de desnaturalización de la apo-Pc de Syn-Pc mediante espectroscopía de fluorescencia. ......... 259 Figura TMS 4. Cristales obtenidos para el triple mutante SynA44D/D49P/A62L de la plastocianina. ............................. 260 Figura TMS 5. Alineamiento de las estructuras cristalográficas del mutante Syn-A44D/D49P/A62L ya publicada (1PCS.pdb,(Romero et al., 1998)) y la obtenida en este trabajo. ..................................................................... 260 Índice de tablas ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Valores de Tm de diferentes cupredoxinas. .......................... 61 Tabla 2. Oligonucleótidos empleados para introducir las diferentes mutaciones dirigidas en el gen petE. ................ 88 Tabla 3. Valores de ∆∆Gc calculadas mediante CUPSAT para los mutantes diseñados ........................................................ 124 Tabla 4. Rendimientos de producción de las distintas plastocianinas usadas para este trabajo. ........................ 128 Tabla 5. Porcentaje de recuperación de proteína en cada uno de los procesos de purificación hasta la obtención de la proteína pura. ................................................................. 129 Tabla 6. Constantes bimoleculares de la reacción de reducción del PSI por las distintas Pcs en condiciones estándar (k2). ................................................................................ 136 Tabla 7. Valores de Tm de las formas oxidada y reducida de SynPc y sus mutantes, así como de Pho-Pc y su mutante Pho-P49G/G50P. ............................................................ 149 Tabla 8. Valores de Tm de las apo-Pc de Syn-Pc y sus mutantes, así como de Pho-Pc y su mutante Pho-P49G/G50P. ...... 154 Tabla 9. Información estadística derivada de los ajustes lineales de los mostrados en la figura 41. .................................... 158 Tabla 10. Valores promedios de los RMSDs para Syn-Pc y sus mutantes. ........................................................................ 162 Tabla 11. RMSD entre la estructura inicial y la final de cada una de las trayectorias. .......................................................... 179 Tabla 12. Contenido coseno de los cinco primeros componentes principales (CP) de Syn-Pc y sus mutantes Syn-V48I y Syn-A44D/D49P/A62L a temperatura ambiente. .......... 187 Índice de tablas Tabla 13. Estadísticas correspondientes al proceso de la colección de datos y procesamiento ............................... 192 Tabla 14. Estadísticas correspondientes al proceso de refinamiento .................................................................... 193 Tabla 15. Comparación de las longitudes de los enlaces entre el cobre y sus ligandos entre Syn-V48I y SynA44D/D49P/A62L. .......................................................... 196 Tabla 16. Valores de Tm y longitud del enlace Cu-Sγ,Cys en distintas plastocianinas. .................................................. 197 Tabla TMS 1 .................................................................................... 261 Tabla TMS 2. Composiciones de las soluciones precipitantes usadas en el test 1 de cristalización de PhoP49G/G50P. ................................................................... 263 Tabla TMS 3. Composiciones de las soluciones precipitantes usadas en el test 2 de cristalización de PhoP49G/G50P.. .................................................................. 264 Tabla TMS 4 Composiciones de las soluciones precipitantes usadas en el test 4 de cristalización de PhoP49G/G50P. ................................................................... 268 Tabla TMS 5. Composiciones de las soluciones precipitantes usadas en el test 5 de cristalización de PhoP49G/G50P. ................................................................... 269 Tabla TMS 6. Composiciones de las soluciones precipitantes usadas en el test 6 de cristalización de PhoP49G/G50P .................................................................... 270 LISTADO DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS Listado de abreviaturas y símbolos LISTADO DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS A || Constante de acoplamiento hiperfino Am Amicianina Apo Apoproteína Apo-Pc Apoproteína de la plastocianina Az Azurina BCB Plegamiento tipo cupredoxina o de unión a cobre azul BCP Proteína de cobre azul CD Circular Dichroism ADN Ácido desoxirribonucleico ADNasa Desoxirribonucleasa DSC Calorimetría diferencial de barrido Em Potencial redox ε Coeficiente de absorción en el visible ε s Constante dieléctrica del agua ε p Constante dieléctrica del interior de una proteína ΔΔG c Diferencia en energía libre de desplegamiento entre la proteína silvestre y la mutante calculada por CUPSAT g Aceleración gravitatoria terrestre Holo-Pc Holoproteína de la plastocianina LB Medio Luria-Bertani MCBP Proteínas de multicobre azul Listado de abreviaturas y símbolos MCO Oxidasa multicobre NMR Nuclear magnetic resonance p/p Relación peso-peso p/v Relación peso-volumen pBS Plásmido pBluescript II SK+ PDB Protein data bank Pc Plastocianina PCA Análisis de componentes principales PCR Polymerase chain reaction PhoPc Plastocianina silvestre de Phormidium laminosum Pho-P49G/G50P Plastocianina de Phormidium laminosum con la doble mutación pBS-WT Plásmido pBluescript II SK (+) con el gen petE clonado bajo el promotor lacZ PSI Fotosistema I Rg Radio de giro RMSD Root mean square deviation RMSF Root mean square fluctuation Rpm Revoluciones por minuto Rc Rusticianina RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SDS Sodium dodecyl sulphate SynPc Plastocianina silvestre de Synechocystis sp. 6803 Listado de abreviaturas y símbolos Syn-A44D/D49P/A62L Plastocianina de Synechocystis sp. 6803 con la triple mutación Syn-A44D/D49P/A62L Syn-G60A Plastocianina de Synechocystis sp. 6803 con la mutación G60A Syn-V48I Plastocianina de Synechocystis sp. 6803 con la mutación V48I Syn-V48I/G60A Plastocianina de Synechocystis sp. 6803 con la dobre mutación T m Temperatura de desplegamiento o fusión de la proteína TOC Temperatura óptima de crecimiento Tris Tris(hidroximetil)aminometano UV Luz ultravioleta v/v Relación volumen-volumen Vis Luz visible XANES X-ray absorption near edge structure XAS X-ray absorption spectroscopy Introducción 32 Figura 1. Centros de cobre tipo-1, tipo-2, tipo-3 y trinuclear Representaciones gráficas de los centros de cobre tipo-1 clases I (plastocianina de Synechocystis sp. PCC 6803; 1JXD.pdb; Bertiniª et al., 2001), II (estelacianina de Cucumis Sativus; 1JER.pdb; Hart et al., 1996) y III (azurina de Pseudomonas Aeruginosa; 1AZU.pdb; Adman y Jensen, 1981); tipo-2 (Cu, Zn superóxido dismutasa de Bos Taurus; 2ZOW.pdb; Ito et al., pendiente de publicación); tipo3 (hemocianina de Limulus Polyphemus; 2OXY.pdb; Battistutta et al., 2007); y centro trinuclear (bilirrubina oxidasa de Myrothecium Verrucaria; 2XLL.pdb; Cracknell et al., 2011). El patrón de colores para los átomos es: azul se para el nitrógeno, rojo para el oxígeno, amarillo para el azufre, y marrón para el cobre. Introducción 33 4. Centros de cobre trinucleares, resultado de la combinación de un tipo-2 y un tipo-3. Los tres átomos de cobre se encuentran ligados por 8 residuos de histidina (figura 1). En este tipo de agrupación exclusiva de oxidasas multicobre [Augustine et al., 2010], los cuatro electrones necesarios para la reducción del oxígeno molecular a agua son transferidos de uno en uno desde un sustrato orgánico o metálico al centro de cobre tipo-3 del centro trinuclear vía un centro de cobre tipo-1. 5. Centros de cobre Cu A [Farrar et al., 1998; Andrew et al., 1994] (figura 2): • Dos átomos de cobre enlazados mediante dos residuos de cisteína, ambos en una geometría tetrahédrica. Uno de los átomos de cobre se coordina también por una histidina y una metionina, mientras que el otro lo hace por una histidina y el oxígeno carbonilo de un residuo de glutamato. • Bandas a 480, 540, y 780 nm en el espectro de absorción de la N 2 O reductasa. En la citocromo oxidasa gran parte del espectro se encuentra ocultado por la presencia del grupo hemo, detectándose únicamente una amplia banda de absorción entorno a los 800 nm [von Wachenfeldt et al, 1994]. • Presenta un espectro de EPR con siete picos, así como un característico color morado. 6. Centros de cobre Cu B [Calhoun et al., 1993; Kim et al., 2004] (figura 2): - Un átomo de cobre, coordinado por tres residuos de histidina en una geometría trigonal piramidal. - Carece de señal EPR debido a acoplamiento antiférrico con el grupo hemo situado en las proximidades. Introducción 34 Figura 2. Centros de cobre Cu A , Cu B y Cu Z. Representaciones gráficas de los diversos tipos de centros de cobre Cu A (Cox2 de Rhodobacter Sphaeroides; 1M56.pdb; Svensson-EK et al., 2002), Cu B (Cox1 de Rhodobacter sphaeroides; 1M56.pdb; Svensson-EK et al., 2002); y Cu Z (N 2 O reductasa; 2IWK.pdb; Paraskevopoulos et al., 2006). El patrón de colores para los átomos es: azul se para el nitrógeno, rojo para el oxígeno, amarillo para el azufre, morado para yodo, y marrón para el cobre. 7. Centros de cobre Cu Z [Dell'Acqua et al, 2011; Farrar et al, 1998] (figura 2): - Cuatro átomos de cobre coordinados por siete histidinas y enlazados mediante un ión de azufre inorgánico. - Amplia banda de absorción con un máximo a 640 nm, cuando el centro de cobre se encuentra reducido. - Espectro de EPR con cuatro picos. Introducción 35 Los centros de cobre Cu A y Cu B forman parte de los dominios Cox2 y Cox1, respectivamente, de la citocromo c oxidasa (COX). Los centros de cobre Cu B forman parte de la superfamilia de las oxidasas respiratorias de hemo-cobre. La N 2 O reductasa cuenta en su estructura con los centros de cobre Cu A y Cu Z . 1.1.2. Las proteínas de cobre azul Las proteínas de cobre azul (BCPs, del inglés “Blue Copper Proteins”) o de cobre tipo-1 [Nersissian y Shipp, 2002; Nakamura y Go, 2005; Kosman, 2010] constituyen un amplio grupo dentro de las proteínas de cobre. Esta familia proteica se caracteriza por presentar el centro de cobre tipo-1, además, del plegamiento conocido como tipo cupredoxina o de unión a cobre azul (BCB, del inglés “Blue Copper-Binding”) [Nersissian y Shipp, 2002], similar al de los dominios de las inmunoglobulinas. Dentro de esta clase se encuentran las cupredoxinas, [Adman, 1991; Dennison, 2005], consistentes en un único dominio con plegamiento BCB. A ella pertenecen la plastocianina (Pc), la azurina (Az), la pseudoazurina, la rusticianina (Rc), la amicianina (Am) o la halocianina. También son miembros de la familia de las BCPs las proteínas azules de multicobre o MCBPs (del inglés “Multicopper blue proteins”), las cuales descienden de las BCPs de dominio único por duplicación génica de estos dominios BCB [Ryden, 1988; Ryden y Hunt, 1993; Murphy et al., 1997; Nakamura et al., 2003; Stevens, 2008; Ji y Zhang, 2008]. Las MCBPs incluyen a la nitrito reductasa y a oxidasas multicobre (MCOs) como la lacasa, la ascorbato oxidasa, la ceruloplasmina o la bilirrubina oxidasa. Introducción 36 1.1.2.1. El centro de cobre tipo-1 Como ya se mencionó en el apartado 1.1.1, el centro de cobre tipo-1 o de cobre azul se caracteriza por presentar una serie de propiedades espectroscópicas únicas derivadas de la coordinación particular que el cobre presenta en la proteína [Solomon et al., 2004]. De hecho, en disolución acuosa y en presencia de los ligandos adecuados, el cobre forma complejos en diferentes estados de reducción que difieren tanto en geometría como en número de ligandos. Sin embargo, en sistemas biológicos, el cobre se ha encontrado sólo como cobre reducido Cu(I) y como oxidado Cu(II). En las proteínas de cobre azul, el plegamiento de la cadena polipeptídica crea una esfera de coordinación inusual que, según la teoría “unión inducida por armazón/ soporte” [Malmström y Vänngård, 1960; Lumry y Eyring, 1954; Malmström, 1994], estabiliza un complejo de cobre forzado. Cuando no existe impedimento estérico, las coordinaciones preferentes para Cu(I) y Cu(II) son la tetraédrica regular y la plana cuadrada, respectivamente. Sin embargo, en los centros de cobre tipo-1, tanto los ligandos como sus conformaciones adoptan generalmente, aunque no siempre, una disposición en tetraedro distorsionado, intermedia entre las coordinaciones predilectas para Cu(I) y Cu(II) [Gray et al., 2000]. Esta conformación permite que la energía de reorganización se reduzca y, por lo tanto, se facilite el intercambio entre ambos estados de oxidación, imprescindible para la catálisis dependiente de cobre [Guss y Freeman, 1983; Garrett et al., 1984; Guss et al., 1986; Shepard et al., 1990; Ryde et al., 1996]. La estabilidad de los complejos metálicos depende de la naturaleza y disposición de los ligandos y del estado de oxidación del metal. Según el concepto pesado-ligero, ácido-base de Pearson [Pearson, 1963] el Cu(I) en las proteínas prefiere los átomos de azufre o iones de los aminoácidos cisteína y metionina. El Cu(II), sin embargo, Introducción 37 puede encontrarse coordinado por átomos de oxígeno y nitrógeno o iones de residuos de tirosina, treonina, histidina, anión hidroxilo y agua. Por tanto, para mantener estable el centro de cobre distorcionado de las BCPs el metal se encuentra coordinado tanto por ligandos que favorecen al Cu(I) como por ligandos que favorecen al Cu(II). De hecho, como ya se mencionó en el apartado 1.1.1, dos nitrógenos imidazoles de dos residuos de histidina y el tiolato de un residuo de cisteína se encuentran siempre ligando fuertemente al cobre en una coordinación prácticamente trigonal plana (figura 1). El cuarto ligando varía entre distintas BCPs, pudiendo tratarse o de un residuo de glutamina (Tipo-1 clase II, figura 1), que también une al cobre fuertemente o bien del tioéster de un residuo de metionina que une al cobre de una forma más débil que los otros tres ligandos (Tipo-1 clase I, figura 1) [Hart et al., 1996]. Por otra parte, mientras que la Az presenta un segundo ligando axial consistente en un oxígeno carbonilo del esqueleto de la proteína (Tipo-1 clase III, figura 1) [Baker, 1988; Crane et al., 2001; Nar et al., 1991], otras BCPs o dominios BCBs carecen de ligando axial [Ducros et al., 1998]. De los ligandos del cobre, una de las dos histidinas, la cisteína y, en caso de existir, el ligando axial se sitúan en el lazo que une las dos hebras β del extremo C-terminal [Dennison, 2008] (figura 3). Parte de este lazo está expuesto a la superficie de la proteína y contribuye a la formación de un área normalmente hidrofóbica que rodea a la histidina y que está implicada en la asociación con sus parejas [Durley et al., 1993; Díaz-Moreno et al., 2005]. La longitud, la secuencia y la estructura de este lazo varían entre los diferentes dominios BCBs, sobre todo en cupredoxinas, siendo la longitud la que define su conformación [Li et al., 2007; Sato et al., 2009]. Además, la estructura y dinámica de este lazo es uno de los factores que influyen en el proceso conocido como transición ácida [Li et al., 2007; Paltrinieri et al., 2013], consistente en la protonación de la histidina en la proteína reducida, con rango de pKa Introducción 38 aproximadamente entre 5 y 7. Este fenómeno conduce a la disociación reversible de este ligando del cobre y a la inactivación biológica de la cupredoxina debido a un drástico incremento del potencial de reducción [Battistuzzi et al., 2002]. La transición ácida se observa en muchas de las BCPs, como la Pc, la amicianina, la pseudoazurina, y la estelacianina [Guss et al., 1986; Zhu et al., 1998; Vakoufari et al., 1994; Merchant et al., 1991]. Figura 3. Estructura de Syn-Pc y de su centro de cobre (A) Estructura de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al. 2001) donde se muestra en morado el lazo L4 y en celeste el L8, así como el centro de cobre. El lazo L8 une las dos hebras β del extremo C-terminal y en él se encuentran tres de los ligandos del cobre: His86, Cys83 y Met39. La His39, cuarto ligando del metal, se sitúa en el lazo L4. En verde se muestran los puentes de hidrógeno en los que participan los ligandos del cobre. (B) Mayor detalle del centro de cobre. Los ligandos del metal se representan como palos (“stick”) y el cobre se colorea de marrón. La numeración de los ligandos del cobre se corresponde a la de la misma Syn-Pc. El centro de cobre se encuentra estabilizado por una extensa red de puentes de hidrógeno (figura 3) esencial para mantener la integridad Introducción 39 del sitio activo [Dong et al., 1999; Li et al., 2004; Dennison, 2008], además de ejercer una clara influencia sobre los potenciales redox [Botuyan et al., 1996; Li et al., 2004]. Un puente de hidrógeno característico de las BCPs, es el que se forma entre el átomo de azufre de la cisteína que liga al cobre (L8) y el protón del grupo amida del esqueleto perteneciente a la Asn40, residuo inmediatamente adyacente al ligando histidina, situado en el lazo L4 [Musiani, 2004]. Este enlace resulta fundamental para la estabilidad del centro metálico [Dong et al., 1999]. Mutaciones en los ligandos del cobre modifican las propiedades espectroscópicas de la proteína sin alterar su estructura global [Canters y Gilardi, 1993]. Mientras que el residuo de cisteína es el único ligando esencial en el mantenimiento de las características del cobre azul [Mizoguchi et al., 1992; Lancaster et al., 2009], el ligando histidina más cercano al extremo C-terminal resulta fundamental para las transferencias electrónicas. Los tres residuos restantes, aparte de estar implicados en la unión al cobre, mantienen la integridad del sitio activo, excluyen ligandos exógenos y modulan el potencial redox [Canters y Gilardi, 1993; Hall ª et al., 1999]. 1.1.2.2. El dominio de unión a cobre azul: características y evolución El dominio BCB o dominio cupredoxina consiste en un barril β formado por entre 6 y 13 hebras β antiparalelas organizadas en dos láminas β y en un motivo en greca [Guss y Freeman, 1983; Ji y Zhang, 2008; Lindleyª, 2001] (figuras 4 y 6). Sin embargo, el contenido en hélices α es bajo o nulo. Los dominios BCB son pequeños, entre 90 y 150 aminoácidos, y su número varía entre las diversas BCPs: las cupredoxinas presentan uno, pero las MCBPs contienen dos (nitrito reductasa), tres (ascorbato oxidasa, lacasa) o seis (ceruloplasmina, Introducción 40 bilirrubina oxidasa) repeticiones de estos dominios BCB ensamblados en una única cadena polipeptídica (figura 4). Aunque la homología entre los diversos dominios BCB existentes en la naturaleza es de sólo el 10% (figura 5), la estructura tridimensional del mismo se mantiene altamente conservada [Nersissian y Shipp, 2002] (figura 4B). Figura 4. Conservación de la estructura de los dominios BCB entre Syn-Pc y la bilirrubina oxidasa (A) Estructura tridimensional de la bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria (código pdb: 2XLL; Cracknell et al., 2011). Se muestra en diferentes colores cada uno de los tres dominios BCB que forman la proteína. Los átomos de cobre están coloreados en marrón. (B) Superposición de las estructuras de Syn-Pc, en magenta, (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al., 2001), y de uno de los dominios BCBs de la bilirrubina oxidasa, en azul. Los átomos de cobre se colorean en marrón y en azul para Syn-Pc y para la bilirrubina oxidasa, respectivamente. Introducción 41 Figura 5. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de algunos representantes de la familia de las proteínas de cobre azul. Pc-1: plastocianina de álamo (P. nigra), Pc-2: plastocianina de espinaca (S.oleracea), Pc-3: plastocianina de Phormidium laminosum (P. laminosum), Pc4: plastocianina de Synechocystis sp.PCC6803, y Pc-5: plastocianina de Anabaena variabilis (A. variabilis), Az: Azurina de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Rc: rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans (T. ferrooxidans), y BOX-D1: dominio 1 de la billirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria (M. verrucaria), y CP-D1: dominio 1 de la ceruloplasmina humana. Introducción 48 como la calorimetría diferencial de barrido (DSC) o técnicas espectroscópicas como el dicroísmo circular (CD) o la espectroscopía de fluorescencia. Mientras que por DSC se obtiene el cambio de entalpía de desplegamiento (∆H cal ), el CD o la espectroscopía de fluorescencia permiten la obtención de la entalpía de van´t Hoff (∆H vH ): dlnKd1  ⁄ =−∆H   ⁄⁄ Ambos parámetros son complementarios, de forma que ∆H cal /∆H Vh ≈ 1 apoya el modelo en dos estados [Privalov, 1979]. Para la determinación de ΔG FU para un proceso de desplegamiento térmico en dos estados, se aplica la ecuación de GibbsHelmholtz: ∆G  =∆H  1−T   ⁄ −∆C    −T+TlnT   ⁄  Siendo ∆H m el valor de ∆H a la temperatura de desplegamiento (T m ) y ∆C p la capacidad calorífica. T m es un parámetro ampliamente usado para comparar las termoestabilidades de diferentes proteínas. Se define como la temperatura a la que el 50% de la población proteica se encuentra en su estado desplegado. Por tanto, a esta temperatura K U =1 y ΔG FU = 0. Sin embargo, la mayor parte de las proteínas mesofílicas y termofílicas se despliegan de un modo irreversible, debido a que la forma desplegada de la proteína puede sufrir procesos de proteolisis o agregación [Sanchez-Ruiz, 2010]. Según el modelo de Lumry–Eyring, la proteína acabará cayendo en un estado final y no funcional: F↔U↔I, donde I representa dicho estado final e irreversible. La estabilidad cinética se basa en la existencia de una barrera energética entre los estados nativo y desplegado, necesaria para que la función proteica se mantenga en una escala de tiempo fisiológicamente Introducción 49 relevante. La termoestabilidad cinética se expresa frecuentemente con el tiempo de vida media (t 1/2 ) a una temperatura determinada. Se considera normalmente que los parámetros termodinámicos no se pueden obtener para las proteínas que muestran un desplegamiento irreversible, siendo sólo posible la consideración de estabilidad cinética. Sin embargo, si se asume que el paso irreversible es mucho más lento que el proceso reversible inicial y que tiene lugar principalmente a una temperatura muy superior a la T m , se pueden obtener los parámetros termodinámicos del paso reversible [SanchezRuiz, 1992; Milardi et al., 1994]. 1.3.2. Organismos mesofílicos y termofílicos La importancia de entender las bases moleculares responsables de la estabilidad térmica en proteínas termofílicas en comparación con sus homólogas mesofílicas se ha convertido en una de las tareas más importantes para la comunidad científica, ya que permite conocer cuáles son los mecanismos usados por la naturaleza para estabilizar proteínas en general. Además, la adquisición de tales conocimientos resulta esencial para el desarrollo de aplicaciones médicas o biotecnológicas que precisen del diseño de enzimas capaces de trabajar a temperaturas elevadas [Haki y Rakshit, 2003]. Según la temperatura óptima de crecimiento (TOC), los organismos tolerantes al calor se separan frecuentemente en dos clases: termófilos (moderados), con una TOC entre 45 y 80 ºC, e hipertermófilos (o termófilos extremos) con una TOC superior a 80 ºC. Los organismos mesofílicos se definen como aquellos que muestran una TOC entre 15 y 45 ºC, y los psicrófilos presentan una TOC inferior a 15 º C [Vieille y Zeikus, 2001; Li et al., 2005]. Los organismos hipertermófilos pertenecen principalmente al reino biológico Archea, aunque existen dos géneros de Introducción 50 Eubacterias hipertermófilas: Thermotoga [Zhaxybayeva et al., 2009] y Aquifex [Deckert et al., 1998]. Los organismos termófilos se reparten entre los reinos Eubacteria, Archea, y algunos hongos [Luke et al., 2007]. Las proteínas termofílicas y sus homólogas mesofílicas comparten una homología de secuencia entre el 40 y 85%. Igualmente, sus estructuras tridimensionales son superponibles y comparten el plegamiento básico y característico de la familia proteica a la que pertenecen. Además, el punto de máxima estabilidad para proteínas homólogas provenientes de organismos psicrófilos, mesofílicos y termófilos se alcanza alrededor de los 20 ºC [Feller, 2010]. Sin embargo, las proteínas de los organismos termófilos e hipertermófilos presentan una mayor resistencia a la proteolisis y a la desnaturalización química, además de una estabilidad intrínseca a temperaturas elevadas que les permite mantener su estructura y función bajo estas condiciones. De hecho, las enzimas termoresistentes son normalmente activas entre 60 y 80 ºC, dejando de funcionar de forma apropiada a temperaturas inferiores a 40 ºC. 1.3.3. Mecanismos de termoestabilización proteica En 1975 se publicó el primer análisis de las posibles causas de la mayor estabilidad de las proteínas provenientes de organismos termófilos [Perutz y Raidt, 1975]. Desde entonces, muchos han sido los estudios teóricos y experimentales que han tenido como finalidad aclarar las bases que determinan la termoestabilidad. Sin embargo, esta cuestión sigue siendo una materia comprendida parcialmente. Los dististintos estudios pueden clasificarse en dos grupos: aquellos que examinan una única proteína termofílica, comparando su estructura con la de uno o más homólogos mesofílicos, y aquellos análisis computacionales que utilizan datos de un grupo de proteínas con la finalidad de obtener conclusiones Introducción 51 generales [Greaves y Warwicker, 2007]. De todos ellos se concluye que no existen aminoácidos nuevos, ni modificaciones covalentes o motivos estructurales únicos en las proteínas de organismos termófilos y extremófilos que expliquen su alta estabilidad respecto a sus homólogas mesofílicas. De hecho, la mayor estabilidad de las proteínas termofílicas se debe a la existencia de sutiles redistribuciones de las mismas interacciones intramoleculares requeridas para la estabilización proteica a temperaturas moderadas. Las diferentes familias de proteínas adoptan distintos mecanismos para adaptarse a las altas temperaturas. Estudios computacionales englobando grandes grupos de proteínas pertenecientes a diversas familias proteicas indican que la única regla es el incremento en el número de pares iónicos al aumentar la temperatura de crecimiento del organismo [Pack y Yoo, 2004; Szilagyi y Zavodszky, 2000]. Esta afirmación contrasta con un gran número de estudios comparativos entre una proteína termofílica concreta y su homóloga mesofílica. De ellos se deriva que la termoestabilidad es una propiedad adquirida por algunas proteínas mediante la combinación de varias y muy pequeñas modificaciones estructurales resultado de la sustitución de algunos aminoácidos por otros y por la modulación de las interacciones comunes a todas las proteínas [Matsumura et al., 1989]. Las aparentes contradicciones de tales conclusiones refleja el hecho de que los diferentes mecanismos de estabilización adoptados por cada familia se compensan entre sí dando lugar a una diferencia estadísticamente no significativa cuando se considera un grupo de proteínas de diversas familias [Pack y Yoo, 2004]. Los mecanismos implicados en la estabilización proteica engloban, entre otros a: 1. Interacciones hidrofóbicas: El efecto hidrofóbico se considera como la principal contribución al plegamiento y a la estabilidad proteica Introducción 52 [Yang et al., 2013]. La hidrofobicidad de una proteína se expresa como la razón entre la superficie no polar enterrada y el total de superficie no polar de la molécula [Goodenough y Jenkins, 1991]. Las proteínas homólogas de organismos termófilos y mesófilas comparten una estabilidad basal originada por el núcleo proteico hidrofóbico, normalmente mucho más conservado que las zonas expuestas al solvente. Por tanto, las interacciones estabilizantes en proteínas termofílicas se localizan principalmente en las zonas en contacto con el solvente, menos conservadas [Vieille y Zeikus, 2001]. Sin embargo, existe una correlación directa entre la hidrofobicidad total de una proteína y su termoestabilidad. De hecho, cada grupo metilo adicional enterrado en el interior de la molécula supone un incremento medio estimado en estabilidad de 5,44 ± 2,09 kJ mol -1 [Pace, 1992]. Es por ello que el contenido en aminoácidos hidrofóbicos es ligeramente mayor en proteínas termofílicas [Chakravarty y Varadarajan, 2000]. 2. Interacciones electrostáticas: Las fuerzas electrostáticas son principalmente de tres tipos: carga-carga, carga-dipolo y dipolo-dipolo. Las típicas interacciones carga-carga entre residuos de cargas opuestas son conocidas como puentes salinos [Li et al., 2005]. La contribución de los puentes salinos a la energía libre de la estabilidad proteica está sujeta a controversia [Ge et al., 2008; Kumar y Nussinov, 1999; Marqusee y Sauer, 1994]. Por una parte, existen estudios que apoyan la teoría de que los puentes salinos expuestos al solvente parecen tener poca participación en la estabilización proteica [Sun et al., 1991], mientras que aquellos que se encuentran parcial o totalmente inaccesibles muestran una mayor capacidad de estabilización [Kumar y Nussinov, 1999; Marqusee y Sauer, 1994]. Por otro lado, en la bibliografía se pueden encontrar excepciones a estas afirmaciones [Makhatadze et al., 2003; Waldburger et al., 1995]. De hecho, en la superficie de las proteínas termofílicas e hipertermofílicas existe una Introducción 53 mayor proporción de residuos cargados en comparación con sus homólogas mesofílicas. La existencia de redes [Zhou, 2002; Horovitz et al., 1990], también es un importante factor a la hora de definir el papel que los puentes salinos tienen en la estabilidad proteica. A temperatura ambiente, para un único par iónico, el coste de la desolvatación es ligeramente mayor o igual que la energía libre de la interacción electrostática [Zhou, 2002]. Por tanto, el par iónico solitario desestabiliza la estructura plegada, o no tiene efecto alguno. Sin embargo, cuando se añade un segundo par iónico, la energía de las interacciones electrostáticas supera el coste de desolvatación, y la red de puentes salinos estabiliza la estructura. Dichas redes de puentes salinos se han observado con mayor frecuencia en las proteínas termofílicas e hipertermofílicas [Priyakumar et al., 2010] porque resultan energéticamente más favorables que un número equivalente de pares iónicos aislados [Yip et al., 1995]. Por tanto, la mayor proporción de residuos cargados en la superficie de las proteínas termofílicas e hipertermofílicas suele implicar una mayor formación de redes, en comparación con sus homólogas mesofílicas [Jelesarov y Karshikoff, 2009; Alsop et al., 2003; Karshikoff y Ladenstein, 2001; Szilagyi y Zavodszky, 2000]. Se ha especulado que ello se debe a la caída de la constante dieléctrica del agua (ε s ) a altas temperaturas. Dado que la constante dieléctrica de la proteína (ε p ) permanece constante [Karshikoff y Ladenstein, 2001], ello se traduce en un menor coste de desolvatación y un incremento de la fuerza de las interacciones entre cargas a temperaturas elevadas en comparación con a temperatura ambiente [Salari y Chong, 2012; Priyakumar et al., 2010; Ge et al., 2008; Elcock, 1998]. Por otro lado, existen también estudios que determinan que el incremento en interacciones electrostáticas en la superficie de las proteínas termofílicas crea una barrera entrópica para el Introducción 54 desplegamiento, debido a una reducción de la capacidad calorífica de desplegamiento (∆Cp) [Chan et al., 2011; Missimer et al., 2007; Luke et al., 2007; Zhou, 2002]. En el trabajo realizado por Zhou (2002) ambas afirmaciones son unificadas. Como ya se mencionó, las fuerzas electrostáticas incluyen también a las interacciones dipolo-dipolo y carga-dipolo. Las hélices presentan un momento dipolar que viene dado por la suma de los momentos dipolares microscópicos, μ i , de cada uno de los enlaces peptídicos que contiene [Hol et al., 1978]. Por tanto, la magnitud del dipolo de la hélice en vacío es directamente proporcional al número de enlaces peptídicos que la forman. Las proteínas termofílicas presentan hélices más largas que contribuyen a la cohesión de la matriz proteica [Vieille y Zeikus, 2001]. De la misma forma, la introducción de residuos con carga negativa cerca del extremo N-terminal de la hélice y de cargas positivas cerca del C-terminal estabilizan las hélices mediante interacciones dipolocarga [Vieille y Zeikus, 2001]. Las hebras β también presentan un momento dipolar, con un extremo C-terminal parcialmente negativo y un N-terminal parcialmente positivo. Un incremento del momento dipolar en estas estructuras secundarias se puede conseguir posicionando un residuo cargado positivamente en el extremo N-terminal y negativamente en el C-terminal, con lo que se aumentaría las interacciones dipolares entre hojas β o entre estas y hélices α [Farzadfard et al., 2008]. 3. Puentes de hidrógeno: Los puentes de hidrógeno clásicos se forman entre un átomo de hidrógeno unido a un átomo electronegativo (donador de puentes de hidrógeno) y otro átomo electronegativo (aceptor de puentes de hidrógeno). Se establecen tanto entre cadenas laterales de la proteína como entre estas y las moléculas de agua del solvente, así Introducción 55 como entre los grupos amino y carbonilo del esqueleto polipeptídico. Están normalmente definidos por una distancia inferior a 0,3 nm entre el donador y el aceptor, y por un ángulo donador-hidrógeno-aceptor menor a 90 ºC [Vieille y Zeikus, 2001]. El valor de la contribución media de un puente de hidrógeno entre cadenas laterales proteicas se encuentra en torno a 2,09 ± 2,9 kJ mol -1 [Takano et al., 2003], mientras que los puentes de hidrógeno en el esqueleto de una hélice y de una hebra β contribuyen respectivamente con 5,4 y 5,8 kJ mol -1 [Fu et al., 2006; Gao y Kelly, 2008; Bowie, 2011]. La fuerza de un puente de hidrógeno depende del microambiente en el que se encuentra [Gao et al., 2009; Gromiha et al., 2013], de forma que su energía libre puede verse incrementada hasta en 5,0 kJ mol -1 al pasar de estar expuesto al solvente a enterrado en un ambiente hidrofóbico [Gao et al., 2009]. Junto con el efecto hidrofóbico, los puentes de hidrógeno son las principales fuerzas estabilizantes [Pace, 2009], de forma que la termoestabilidad de las proteínas se correlaciona con el número de puentes de hidrógeno [Vogt et al., 1997]. De hecho, proteínas termofílicas presentan un mayor número de puentes de hidrógeno que las mesofílicas [Gromiha et al., 2013]. Sin embargo, existen estudios computacionales comparados que discrepan, indicando que entre proteínas mesofílicas y termofílicas no hay diferencia en el número de puentes de hidrógenos, sino que es el número de donadores y aceptores insatisfechos lo que disminuye ligeramente en proteínas de organismos termófilos [Szilagyi y Zavodszky, 2000]. 4. Puentes disulfuro: La introducción de un puente disulfuro en una proteína incrementa la energía libre del estado desplegado, conduciendo a un aumento en la energía libre de la proteína haciéndola conformacionalmente más estable [Trivedi et al., 2009]. Se ha propuesto Introducción 56 que el efecto estabilizador de los puentes disulfuro se debe principalmente a un efecto entrópico, de forma que la eliminación de un puente disulfuro por reducción o por mutación resulta en un incremento de la entropía del estado desplegado según la relación: ∆S=−2,1−3 2 ⁄ lnn donde n es el número de residuos entre las dos Cys que forman el enlace [Pace et al., 1988; Matsumura et al., 1989; Trivedi et al., 2009]. El papel que los puentes disulfuros juegan en la estabilización de las proteínas termofílicas se sustenta en la existencia de una mayor proporción de estos enlaces covalentes en proteínas de organismos termófilos [Beeby et al., 2005]. 5. Unión de un metal: Los centros metálicos aportan nuevos enlaces, con energía variable, a la topología de la molécula y, por tanto, estabilizan las proteínas. La eliminación del metal de la estructura proteica conlleva una disminución en la temperatura de desplegamiento [Noyer y Putnam, 1981; Keating et al., 1988; Feio et al., 2004; Feio et al., 2006; Avvaru et al., 2009; Teilum et al., 2009]. De hecho, proteínas pertenecientes a la familia de proteínas intrínsecamente desordenadas se pliegan sólo cuando se les une su cofactor [Permyakov, 2008]. Algunas enzimas mesofílicas carecen de átomos metálicos presentes en sus homólogas termofílicas. Estos metales no son necesarios para ejercer su función y su eliminación supone una menor temperatura de desplegamiento [Fujii et al., 1997]. 6. Mayor empaquetamiento: El empaquetamiento se considera un importante indicador de la estabilidad de una proteína. Dicho empaquetamiento se refleja en la existencia de espacios no ocupados por ningún átomo de la proteína ni por su radio atómico [Rother et al., 2009; Coleman, 2010]. Estos espacios vacíos pueden encontrarse cerrados en el interior de la matriz proteica, constituyendo cavidades, o Introducción 57 abiertas al exterior, formando los denominados bolsillos [Liang y Dill, 2001]. Un mejor empaquetamiento proteico conlleva un incremento tanto las interacciones hidrofóbicas como las atracciones de van der Waals en el núcleo de la proteína. De la misma forma, un mayor empaquetamiento se traduce también en una menor razón entre el área accesible al solvente (SAS) de la proteína y el área accesible al solvente de una esfera con el mismo volumen que la proteína [Querol et al., 1996; Vogt y Argos, 1997; Sterner y Liebl, 2001; Pace, 2009]. En las proteína termofílicas se ha observado que la mayor compactación en comparación con sus homólogas mesofílicas se consigue mediante el acortamiento de uno o más lazos; incrementando el número de átomos enterrados en el interior de la molécula y, por lo tanto, inaccesibles para el solvente; optimización del empaquetamiento de las cadenas laterales en el interior; y eliminación de cavidades innecesarias [Sen y Nilsson, 2012]. 7. Mayor rigidez: La estabilidad de proteínas termofílicas están, por lo general, ligada a una mayor rigidez estructural a temperatura ambiente [Bonisch et al., 1996; Gershenson et al., 2000; Manco et al., 2000; Radestock y Gohlke, 2008]. Dado que la función de una proteína requiere cierta flexibilidad, dicha rigidez a temperatura ambiente explica porqué las enzimas termofílicas se inactivan a bajas temperaturas. Sin embargo, cuando la temperatura ambiente se acerca a la temperatura a la que el enzima muestra su mayor actividad, la proteína es suficientemente flexible como para llevar a cabo su función [Beaucamp et al., 1997]. Por tanto, este incremento en la rigidez es esencial para mantener su estructura catalíticamente activa a alta temperatura. El incremento en la rigidez se consigue mediante la estabilización de las hélices α, optimización de las interacciones electrostáticas, reducción de la tensión conformacional, etc. Introducción 64 aplicable a todas las cupredoxinas. Por tanto, el proceso de desplegamiento térmico en condiciones aeróbicas se puede ajustar al esquema general de Lumry-Eyring, explicado ya previamente en el apartado 2.1: F↔U↔I, donde F es la proteína plegada, U es la proteína desplegada de forma reversible, y siendo I la proteína desplegada de forma irreversible. 1.3.4.1.1. Comparación entre las plastocianinas de Synechocystis sp. PCC6803 y Phormidium Laminosum Pho-Pc muestra valores de T m de 83,1 ºC y de 76,4 ºC para las formas oxidada y reducida, respectivamente, a pH 5,5 y en aerobiosis [Feio et al., 2004]. De hecho, esta proteína es más estable en su forma oxidada independientemente del pH ensayado. Sin embargo, las plastocianinas de plantas superiores y de cianobacterias mesófilas presentan valores de T m para las formas reducidas superiores a los de las oxidadas (Tabla 1). Tal es el caso de Syn-Pc, con valores de T m de 66,1 ºC para la especie oxidada y de 71,9 ºC para la reducida a pH 5,5 y en presencia de oxígeno [Feio et al., 2006]. Esta tendencia es también independiente del pH. Tal como sucede con otras metaloproteínas, el cobre tiene gran importancia en la estabilización de la conformación nativa de estas Pcs. La eliminación del metal conduce a una drástica caída de entre 20 y 25 ºC en los valores de T m para ambas proteínas. Pero, aún así, la T m de la apo-Pc de P. laminosum sigue siendo 8,5 ºC más estable que la de Synechocystis [Feio et al., 2006]. Este hecho indica el papel que otras interacciones tienen en la estabilización de la matriz proteica, de la misma forma que sucede en otras proteínas termofílicas [Vieille y Zeikus, 2001; Li et al., 2005]. Introducción 65 Figura 9. Alineamiento de las secuencias de Pho-Pc y Syn-Pc. Los asteriscos rojos marcan los ligandos del cobre. Los residuos idénticos o similares se hallan encuadrados. La estabilización de Pho-Pc parece ser principalmente hidrofóbica, mientras que en Syn-Pc las fuerzas electrostáticas parecen tener un mayor papel, tal como se puede deducir por su diferente comportamiento frente a la presencia de sal [Feio et al., 2006]. Al comparar la estructura de ambas Pc llama la atención que no se cumplan algunas de las reglas comunes en la estabilización de proteínas termofílicas. Existe la tendencia general al acortamiento de los lazos en proteínas termofílicas; sin embargo, Pho-Pc tiene lazos más largos que Syn-Pc. De hecho, dos de ellos (L5 y L7) presentan inserciones de secuencia (Figuras 9 y 10). En cuanto a la composición en aminoácidos, sólo se observa una diferencia apreciable en los aminoácidos aromáticos, correspondiente a la existencia de dos residuos de fenilalanina (Phe3 y Phe80) en Pho-Pc involucrados en dos agrupaciones hidrofóbicas distintas. La Phe3 interacciona con Val21 y la Introducción 66 Val23 mediante interacciones de Van der Waals. En Syn-Pc, en lugar de la Phe3, hay un residuo de alanina, disminuyéndose así la interacción entre las hebras β1 y β2. Además, no existe una diferencia significativa en el número de enlaces de hidrógeno o puentes salinos cuando se considera la totalidad de ambas Pc. Sin embargo, esta razón cambia cuando se considera únicamente la región de la proteína que engloba las hebras β5 y β6, el lazo L5 y la hélice a (Figura 11). Esta región constituye la conocida cara este en Pcs, implicada en la interacción de esta proteína con sus parejas fisiológicas. Las dos proteínas presentan una homología de secuencia del 63%, llegando a ser del 92% en el entorno del metal. Por el contrario, se reduce hasta un 43% cuando sólo se tiene en cuenta la cara este [Muñoz-López b et al., 2010]. La mayor estabilidad de Pho-Pc con respecto a Syn-Pc, y su diferente dependencia con el estado redox, se debe a diferencias en la cara este y en el lazo L7, que forma parte del barril de la Pc. De hecho, cuando sólo se considera la cara este se detecta un incremento en las interacciones hidrófobas y puentes de hidrógeno y salinos, otorgando a esta región una importancia determinante en la estabilidad de las Pc. Cabe resaltar que uno de los residuos de histidina que liga al cobre se encuentra precisamente al inicio de la hebra β5, mientras que el lazo L7 da paso a la hebra β en cuyo extremo se sitúa otro ligando del cobre: la cisteína [Muñoz-López b et al., 2010]. La composición en estructura secundaria también se ve afectada en diferente medida en ambas Pcs. Las hebras β1, β2, β5 y β6 de Pho-Pc muestran una mayor estabilidad que las respectivas de Syn-Pc [Feio et al., 2006]. El diseño de mutantes siempre ha sido una herramienta muy útil para analizar la medida en la que un residuo en concreto podría contribuir a una propiedad determinada. Para el caso concreto de Pho-Pc, se diseñaron diversos mutantes: Pho-F3A, situado en la hebra β1; PhoF80A, situado en el lazo L7, y Pho-P49G/G50P, localizado en el lazo L5 Introducción 67 [Muñoz-Lópezª et al., 2010]. Dichos cambios desestabilizaron ambos estados redox, aunque de forma más evidente en la especie oxidada. Además, el doble mutante Pho-P49G/G50P mostró una dependencia de la T m respecto al estado redox del cobre igual al exhibido por Syn-Pc, con una T m a pH 6 de 72,5 ºC para la forma reducida y de 69 ºC para la oxidada. La disminución en composición en hebras β y la pérdida de la interacción que se establece en Pho-Pc entre la Pro49 y la Tyr85, situada esta última en el lazo L7 se consideraron los motivos de la disminución en la termoestabilidad. Figura 10. Alineamiento de las estructuras de Syn-Pc y de Pho-Pc. La estructura de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al., 2001) se representa en magenta, y la de Pho-Pc (código pdb: 1BAW; Bond et al., 1999), en azul. Se han señalado las caras norte y este, así como las hebras β 1, β 2, β 5 y β 6 y los lazos L1, L2, L5 y L7. Introducción 68 Figura 11. Diferencias en las interacciones intramoleculares de la cara este de Syn-Pc y Pho-Pc. A la izquierda de la figura se representa Syn-Pc y, a la derecha, Pho-Pc. (A) Agrupación hidrofóbica formada entre el lazo L5 y el barril β . (B) Puentes de hidrógeno entre las hebras β 5 y β 6. (C) Puentes salinos establecidos en el lazo L5. Figura adaptada de Muñoz-López b et al . , 2010. Introducción 69 Esta doble mutación, aún encontrándose a 20 Å del centro de cobre, induce una alteración en el mismo centro metálico visible por estudios de espectroscopía de absorción de rayos X (XAS) [MuñozLópez b et al., 2010; Chaboy et al., 2011]. Los espectros de las formas reducidas de Syn-Pc, Pho-Pc y Pho-P49G/G50P no muestran diferencia alguna. Notablemente, las tres Pcs muestran T m similares para esta forma redox (alrededor de 73 ºC). Sin embargo cuando se consideran las formas oxidadas, el espectro de Pho-Pc muestra claras diferencias con los de Syn-Pc y Pho-P49G/G50P, los cuales resultan superponibles. En el espectro de Pho-Pc, el umbral de la región XANES (“X-ray absortion near edge structure”) se desplaza 0,6 eV hacia energías inferiores con respecto al umbral de las otras dos Pcs [Muñoz-López b et al., 2010], lo cual es indicativo de una diferencia en la distribución electrónica del centro de cobre [Chaboy et al., 2009]. Estudios computacionales ab initio de la región XANES de las formas oxidadas indicaron que es la distancia entre el átomo de cobre y el azufre tiolato de la cisteína que lo liga el determinante de las diferencias entre Syn-Pc y Pho-Pc en el espectro de XAS [Chaboy et al., 2009]. Esto unido al hecho de que las formas oxidadas de Syn-Pc y Pho-P49G/G5P presentan T m notablemente inferiores (65,0 y 69,0 ºC, respectivamente) que Pho-Pc (81,8 ºC), llevó a la hipótesis de que una menor T m de la forma oxidada está ligada a una mayor longitud de dicho enlace. De hecho, Syn-Pc muestra un valor de 0,225 nm para la longitud de este enlace [Romero et al., 1998], mientras que en Pho-Pc este valor es de 0,210 nm [Bond et al., 1999]. 2. OBJETIVOS En los últimos años se ha investigado en nuestro grupo las características estructurales que rigen la mayor estabilidad de la plastocianina de la cianobacteria termófila Phormidium laminosum respecto a su homóloga mesófila en la cianobacteria Synechocystis sp. PCC6803, así como la distinta dependencia que los puntos de fusión de las dos proteínas muestran respecto al estado redox del metal. Los análisis computacionales realizados sugieren que la región comprendida entre los residuos 39 y 65 determina las diferencias en la termoestabilidad entre ambas proteínas. Asimismo, sustituciones de aminoácidos en dicha región disminuyen la estabilidad de la proteína termorresistente y alteran la relación entre el estado redox del metal y el punto de fusión de la proteína. Sin embargo, se desconoce por qué los residuos situados en una región flexible (residuos 44 - 56) y distante del centro metálico modulan la estabilidad térmica. Para contrastar la hipótesis de que dicha región es la que determina las diferencias entre las dos proteínas y comprender el vínculo entre su comportamiento y el del centro metálico, se ha procedido a la estabilización de la plastocianina de Synechocystis sp. PCC6803 mediante mutagénesis dirigida. Los objetivos del presente trabajo, en concreto, son los siguientes: 1. Determinar las diferencias en las rutas de desnaturalización térmica entre las plastocianinas cianobacterianas mesófila (Synechocystis sp PCC6803) y termófila (Phormidium laminosum). 2. Comprender cómo la región comprendida entre los residuos 39 y 65 modula las diferencias de estabilidad entre los estados oxidado y reducido de la plastocianina mesófila. 3. Mejorar la estabilidad de la cuproproteina mesófila mediante mutagénesis dirigida aplicando criterios normalmente asumidos para la estabilización de proteínas. Materiales y Métodos 80 Figura 12. Representación del centro de cobre de la forma oxidada de SynPc. Se detallan los valores de carga atómica para los átomos de la primera esfera de ligandos del cobre según Muñoz-López b et al., 2010. El patrón de color usado es: azul para nitrógeno, amarillo para azufre, rojo para oxígeno, y marrón para cobre. La minimización de energía de las cadenas laterales de las proteínas se realizó en 1.500 ciclos, de los cuales 100 fueron del método de máxima pendiente (“steepest descent”), para aliviar al sistema de posibles colisiones, y el resto de gradientes conjugados (“conjugate gradient”). El proceso se prolongó hasta que se alcanzó el criterio de convergencia del sistema (0,04 kJ mol –1 nm –1 ). El solvente se sometió a un total de 5.000 ciclos de minimización de energía, de los cuales 100 fueron del método de máxima pendiente, seguido de un paso de dinámica molecular en el colectivo isobárico-isotérmico (NPT) usando un escalado isotrópico de la posición molecular con un tiempo de relajación bárica de Materiales y Métodos 81 2 ps a 298 K, controlándose la temperatura mediante el algoritmo de Berendsen [Berendsen et al., 1984]. Posteriormente, se realizó la minimización de la energía de todo el sistema en 5.000 ciclos, con 300 del método de máxima pendiente. La temperatura del sistema se incrementó gradualmente de 200 a 298 K o a 498 K, según el caso, manteniendo en todo momento constante la presión del sistema. Las simulaciones se llevaron a cabo en el colectivo microcanónico (NVE) durante 1 o 10 ns usando 1,5 fs como tiempo de integración. La temperatura se mantuvo constante a 298K y, en el caso de la las dinámicas de larga duración, también a 498 K. En los casos de Syn-A44D/D49P/A62L y Syn-V48I/G60A a temperatura ambiente fue necesario alargar la duración de la dinámica hasta los 20ns. Los fotogramas se grabaron con una frecuencia de 2,5 ps. Para restringir los modos de vibración de los enlaces de los átomos de hidrógeno empleamos el algoritmo SHAKE [Rychaert et al., 1977]. Minimización, equilibrado y dinámicas fueron realizadas con el módulo PMEMD de AMBER. Los archivos de coordenadas se procesaron mediante el módulo PTRAJ de AMBER. Los archivos de RMSD, RMSF y radio de giro generados se exportaron al programa OriginLab Versión 8.0 [May y Stevenson, 2009] para su análisis. La desviación de la media cuadrática o RMSD (del inglés “Root Mean Square Deviation”) permite conocer la similitud entre dos estructuras proteicas. Se define RMSD como: !"#=$1 %&|( ) −* ) | + , )-. Siendo N el número de átomos, y x i e y i las coordenadas de cada uno de los átomos correspondientes a cada estructura a comparar. El Materiales y Métodos 82 RMSD presenta un valor igual a 0 para estructuras idénticas y va incrementando a medida que las dos estructuras o conformaciones se van diferenciando. Cuando lo que se desea es conocer la estabilidad de una determinada proteína a lo largo de una trayectoria de dinámica molecular, se procede a la determinación de los RMSDs de cada una de las conformaciones proteicas obtenidas durante la simulación respecto a la estructura inicial. Para macromoléculas del tamaño de la Pc, se considera que la conformación proteica en cuestión mantiene un estado plegado cuando el RMSD tiene un valor inferior a 0,22 nm, mientras que valores superiores a 0,5 nm son indicativos de un estado desplegado [Deng et al., 2013]. Las fluctuaciones cuadráticas medias o RMSF (del inglés (“Root Mean Square Fluctuation”) reflejan la motilidad interna de la proteína, permitiendo la identificación de regiones con alta o baja movilidad. Se define como la desviación entre la posición de los átomos a tiempo t y la posición promedio durante la simulación: !"/=$1 &|0 1 −0| + 2 1-. Siendo T el número de conformaciones monitorizadas, r t el vector coordenada para el átomo ia tiempo t yr el vector promediado en el tiempo para ese mismo átomo. El radio de giro (Rg) permite conocer el grado de compactación de una estructura proteica [Lobanov et al., 2008]. Se define como la distancia media al cuadrado de cada átomo de la proteína hacia su centro de gravedad. Materiales y Métodos 83 3=$1 !& 4 ) |0 ) −| + , )-. Siendo N el número de átomos, M la masa de los átomos en la proteína, m i y r i son la masa y las coordenadas para el átomo -i, y R las coordenadas del centro de masa. 3.2.2.1. Análisis de componentes principales Para separar los movimientos interrelacionados de las fluctuaciones locales armónicas en la molécula proteica, se llevó a cabo el análisis de componentes principales (PCA), también conocido como dinámica esencial o análisis de covarianza. Mediante PCA, los datos de coordenadas para cada período de tiempo, obtenidos a partir de las trayectorias de dinámica molecular se ajustan mediante mínimos cuadrados a una estructura de referencia para eliminar los movimientos translacionales y rotacionales. Para ello se construye la matrix de covarianza de las fluctuaciones atómicas (C) de los C α , incluyendo el átomo de cobre: C 56 =〈8X 5 −X 5,: ;8X 6 −X 6,: ;〉 Donde X son las coordenadas x-, yy zde los átomos fluctuando alrededor de su posición promedio (X 0 ). C es una matrix simétrica 3N x 3N, donde N es el número de C α incluyendo el átomo de cobre. Esta matrix puede ser diagonalizada a través de una matrix de transformación ortonormal, dando como resultado un conjunto de valores y vectores propios: C=TDT > Materiales y Métodos 84 Siendo C la matriz de covarianza, D la matriz diagonal formada por los valores propios (λ) de C, T la matrix de base ortonormal cuyos vectores columna son vectores propios de C, y T t es la matrix traspuesta de T. El proceso de diagonalización resulta, por tanto, en un conjunto de 3N valores propios o amplitudes con su respectivo grupo de 3N vectores propios. Los valores propios representan las RMSF del sistema a lo largo del correspondiente vector propio, y, por tanto, contienen la contribución de cada componente principal a la fluctuación total. Al ordenar los vectores propios de mayor a menor valor propio, el primero en la lista describe el movimiento correlacionado de mayor escala, mientras que el último se corresponde con vibraciones de pequeña amplitud [Hayward y L. de Groot, 2008]. La proyección de todas las configuraciones originales de la trayectoria de dinámica molecular sobre un vector propio genera una nueva trayectoria que revela los desplazamientos correlacionados por la componente principal, es decir, los modos en que una parte de la proteína tiende a actuar de una forma concertada con otra parte. p 5 =μ 5 8X 5 −X 5,: ; Siendo p i las coordenadas principales y µ i el vector propio que ocupa la columna número i de T. Para el análisis de componentes principales se emplearon los módulos PCAzip y PCZdump, englobados en el programa PCAsuite (http://mmb.pcb.ub.es/software/ pcasuite). Mediante el módulo PCAzip se computan la matrix de covarianza, los vectores y valores propios, así como las proyecciones para las trayectorias [Meyer et al., 2006], resultando en un archivo comprimido. Como estructura promedio se eligió la calculada por el módulo PTRAJ de AMBER a partir de las coordenadas de todos los átomos a lo largo de la trayectoria, excluyéndose las Materiales y Métodos 85 moléculas de agua e iones de sodio. El resto de parámetros usados fueron los otorgados por defecto por el programa. Los vectores y valores propios, proyecciones y animaciones a lo largo de cada vector propio son extraídos del archivo comprimido originado por el módulo PCAzip mediante la aplicación PCZdump. 3.2.2.2. Análisis de contenidos coseno Los respectivos componentes o contenidos coseno (ci) de cada vector propio (i) se obtienen con la finalidad de determinar la medida en la que los principales modos esenciales del análisis de covarianza siguen un comportamiento estocástico, o si el muestreo es o no representativo de un estado. c 5 =2 TBCcosi π p ) t dt J : K + BCp 5+ t J : dtK L. Donde pi(t) es la amplitud del movimiento a lo largo del vector propio i a tiempo t. El contenido coseno puede tomar valores entre 0 (no coseno) y 1 (coseno perfecto). Un alto contenido coseno indica que la trayectoria no ha alcanzado la convergencia, por lo que es recomendable alargar su duración [Hess, 2000; Hess, 2002]. Sin embargo, una falta de convergencia no implica necesariamente que las direcciones de los modos o componentes principales no estén claramente definidos [Hayward y de Groot, 2008]. Materiales y Métodos 86 3.3. Análisis de la termoestabilidad de Syn – Pc mediante mutagénesis dirigida 3.3.1. Organismos y condiciones de cultivo Tanto para los trabajos de manipulación de ADN como para la producción de proteínas recombinantes de Synechocystis se empleó la cepa transformable DH5α de Escherichia coli (E. coli; Hanahan, 1983; Bethesda Research Laboratories), mientras que para la expresión de Pho-Pc se eligió E. coli K12. Las células competentes fueron preparadas por el Servicio Técnico de Cultivos del Centro de Investigaciones Científicas “Isla de la cartuja” siguiendo el procedimiento descrito por Hanahan, (1983). El medio de crecimiento habitual para los cultivos líquidos o sólidos de E. coli fue el de Luria-Bertani (LB; Sambrook et al., 1989), suplementado con ampicilina (100 mg L –1 ) para la selección de plásmidos con resistencia a este antibiótico, y sulfato de cobre (100 μM) como fuente de cobre para la plastocianina. Para preparar medio sólido se añadió agar hasta una concentración final de 15 g L –1 . La esterilización de los medios e instrumental se llevó a cabo por autoclavado, a 1 atmósfera de sobrepresión y 120 °C durante 20 minutos. Los cultivos en medio sólido se realizaron en cajas de Petri incubadas a 37 °C. Los cultivos líquidos rutinarios se realizaron en tubos de ensayo y matraces Erlenmeyer de 250 mL o 5 L, según uso. 3.3.2. Obtención de ADN de plastocianinas mutantes Las mutaciones puntuales introducidas en el gen petE silvestre, que codifica para Syn-Pc, se llevaron a cabo mediante reacciones de Materiales y Métodos 87 PCR (Polimerase Chain Reaction) mutagénicas utilizando el juego de reactivos “Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit” (Stratagen Inc, La Jolla, CA). Como ADN molde o parental de doble cadena se usó el gen petE clonado bajo el promotor lacZ en el plásmido pBluescript II SK (+), construcción denominada como pBS-WT a partir de ahora. Para amplificar pBS-WT a la vez que se introduce la mutación deseada en el gen fueron necesarios pares de oligonucleótidos o cebadores de ADN complementarios a la doble cadena de ADN a excepción de aquéllas bases a mutar (Tabla 2). Para el diseño de los cebadores nos ceñimos en lo posible a las indicaciones del manual de instrucciones del kit (http://sevierlab.vet.cornell.edu/resources/Stratagene-Quikchange Manual.pdf): 1. La longitud de los cebadores depende del número de bases a mutar, pero debe encontrarse entre los 25 y 45 nucleótidos. 2. Deben ser complementarios e inversos. 3. Ambos cebadores deben contener las mutaciones deseadas, estando estas lo más centradas posible en la secuencia. 4. La temperatura de fusión (T m ) del par de oligonucleótidos debe ser igual o superior a 78 ºC. Para su cálculo se emplea la relación:  M =81,5+0,41%GC−675 N−%M ⁄ Siendo N el número de bases del oligonucleótido y %M el porcentaje de bases desapareadas. 5. Evitar en lo posible la formación de estructuras secundarias. 6. El contenido en G + C debe mantenerse entre el 40 y el 60%. Los extremos deben contener una o más G o C. 7. Deben estar fosforilados en su extremo 5´. Materiales y Métodos 88 Para obtener el mutante doble Syn-V48I/G60A se empleó el plásmido que contenía el gen mutante Syn-V48I, y los cebadores arriba mencionados para la mutación Syn-G60A. Todos los oligonucleótidos se adquirieron a Sigma-Aldrich. Para las reacciones de PCR se utilizó la polimerasa termorresistente de Pyrococcus furiosus (Pfu), portadora de actividad correctora 3´ 5´. El programa de amplificación consistió en un paso inicial de 2 minutos a 95 °C, seguido de 30 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 94 °C, 1 minuto de hibridación o de unión de los cebadores, y 1 minuto a 72 °C para la amplificación de dichos cebadores en un termociclador MJ-Mini (Biorad). La temperatura de hibridación difiere según la mutación, ya que depende de la T m de los cebadores usados. Por lo general, se eligieron temperaturas de entre 55 y 65 °C. Tabla 2. Oligonucleótidos empleados para introducir las diferentes mutaciones dirigidas en el gen petE. Se muestran los oligonucleótidos en sentido 5´ 3´, así como sus temperaturas de fusión. En magenta se marcan las bases inductoras de las correspondientes mutaciones. A3F CGCTGCCAATTTTACAGTGAAAATGGG 71,70 ºC G60A CTCTCCCACAAAGCCTTGGCCTTTGC 75,35 ºC K59S GCTGCTAAGCTCTCCCACTCAGGCTTGG 78,30 ºC L56I CACCGCTGCTAAGATCTCCCACAAAGG 75,55 ºC T52I GTGGATGCTGACATCGCTGCTAAGCTC 75,55 ºC T52Y GTGTGGATGCTGACTACGCTGCTAAGCTCTC 76,79 ºC V42I CTCTCCCCTCATAACATTATTTTTGCCGCCGATGGTG 77,78 ºC V48I GCCGATGGTATTGATGCTGACACC 79,92 ºC Materiales y Métodos 89 Entre el producto de las reacciones de amplificación se encuentra, por una parte, ADN sin metilar de doble cadena idéntica al molde salvo por las modificaciones introducidas y, por otra, ADN híbrido, con una cadena parental no metilada y otra metilada con la mutación. El tratamiento con la endonucleasa DpnI elimina el ADN metilado y hemimetilado mediante cortes en las secuencias GATC metiladas. El producto final, libre de cadenas parentales, se usó para transformar células de E.coli DH5α mediante choque térmico con el fin de amplificar aquéllos plásmidos que no habían sido cortados por DpnI y que contenían el gen con la mutación deseada. El plásmido pBluescript II SK (+), y por tanto el pBS-WT y sus mutantes, presenta el gen de resistencia a ampicilina. Las colonias individuales que crecieron tras unas 16 horas de incubación a 37 °C en placas de Petri con medio sólido LB suplementado con ampicilina (100 mg L –1 ) se picaron y crecieron en agitación over night a 37 °C en tubos con 5 mL de LB líquido suplementado con ampicilina (100 mg L –1 ). La purificación del ADN plasmídico se realizó con la ayuda de kits comerciales basados en lisis alcalina (Fastplasmid Mini Kit, de Eppendorf). En todos los casos, para comprobar que las sustituciones eran correctas y que las secuencias carecían de errores, los resultados de las PCRs mutagénicas se secuenciaron en el Servicio de Secuenciación del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO). El plásmido con el gen que codifica el triple mutante SynA44D/D49P/A62L [Romero et al., 1998] fue cedido por la doctora Berta de la Cerda Haynes, entonces miembro del equipo de investigación. Las tres sustituciones, localizadas en los extremos de las hebras quinta y sexta, restablecen residuos conservados en la mayor parte de las Pc salvo en Syn-Pc. Este mutante, a diferencia del silvestre, es capaz de mantenerse estable durante días en su forma oxidada, lo cual permitió obtener una solución homogénea para su cristalización (pdb: 1PCS). Materiales y Métodos 96 a 597 y 600 nm se registraron mientras se añadía de forma gradual ferricianuro potásico 50 mM. La variación de la diferencia entre estas dos medidas de absorbancia (A 600 - A 597 ) se empleó para determinar la fracción de proteína oxidada a lo largo de la valoración, la cual se representó frente al potencial. El ajuste de la curva obtenida a la ecuación de Nernst proporciona los valores de potencial redox de cada una de las proteínas ensayadas: W M =W : − XF YXZ[ \(]^_^_ Z[ 0`^a[]^_ Siendo E m el potencial detectado, E 0 el potencial en condiciones estándar, R la constante de los gases, T la temperatura absoluta (Kelvin), n el número de electrones que participan en la reacción y F la constante de Faraday (96.485 C mol –1 ). 3.3.4.3. Espectrofotometría cinética inducida por láser La funcionalidad de las proteínas modificadas más relevantes se analizó mediante el seguimiento de los cambios de absorbancia dependiente del estado de óxido-reducción del fotosistema I (PSI, a partir de ahora) a 820 nm, con un coeficiente de extinción de 6,5 mM -1 cm -1 [Mathis y Sétif, 1981], por espectrometría cinética inducida por láser, tal como se explica en Hervás (1995), con algunas modificaciones. El PSI se excitó con un pulso de luz a 532 nm de 4 ns de duración generado por un láser INDI-HG Nd:YAG (Spectra-Physics) (Hervás y Navarro, 2011) y atenuado con filtros neutros hasta justo la intensidad lumínica saturante para evitar sobreexcitar el PSI a lo largo del experimento. Entonces el PSI reduce a un aceptor exógeno, el metilviológeno, y recibe un electrón Materiales y Métodos 97 de la Pc, que vuelve a ser reducida por el ascorbato presente en la mezcla de reacción. La luz de análisis procede de un láser contínuo de diodo (modelo LQN830-150C, de Newport). Tras atravesar la cubeta, su intensidad se midió con un fotodiodo de sílice (Melles Griot 13DSI009), protegido de la luz de activación por un filtro de vidrio con un máximo de transmisión a 820 nm y una banda ancha de 9,4 nm. La señal procedente del fotodiodo se amplificó en un amplificador de alta impedancia Melles Griot 13AMP005 y se registró en un osciloscopio digital Nicolet 450. La mezcla de reacción contiene, en un volumen final de 0,25 mL, 20 mM de tampón Tricina-KOH pH 7,5, β -dodecilmaltósido 0,03%, una cantidad de PSI equivalente a 0,35 mg de clorofila mL -1 , 0,1 mM metilviológeno, 10 mM MgCl 2 y 1 mM ascorbato sódico. La concentración de plastocianina se hizo variar de 0 a 100 μM. Los experimentos cinéticos se hicieron en condiciones de pseudo-primer-orden, al estar la plastocianina en exceso respecto al PSI. Todos los experimentos se realizaron en una cubeta con 0,1 cm de paso de luz y a temperatura ambiente. Para cada traza cinética se promediaron 6 medidas, espaciadas 30 segundos entre destellos. Las trazas cinéticas se ajustaron a sumas de exponenciales para calcular las constantes de reacción, para lo cual se usó el método Marquardt con el programa informático diseñado y cedido por el Dr. P. Sétif (Saclay, Francia). El error estimado en los valores de las constantes cinéticas de pseudo-primer-orden (k obs ) determinadas en la mayoría de los experimentos es inferior al 10%, según la relación señal/ruido y la repetitividad de los datos. El proceso se ha realizado en colaboración con los doctores Manuel Hervás Morón y José Antonio Navarro Carruesco. Materiales y Métodos 98 3.3.5. Medidas de estabilidad térmica La monitorización de la desestabilización térmica de las Pc para la obtención de las curvas de desplegamiento y sus valores de T m se llevó a cabo mediante estudios de fluorescencia (fluorimetría diferencial de barrido y espectroscopía de fluorescencia), y de espectroscopía de CD en el visible. 3.3.5.1. Estudios de fluorescencia El uso de la fluorescencia para la monitorización del desplegamiento proteico está ampliamente extendido. Esto se debe a que los fluoróforos usados son altamente sensibles a los cambios de su entorno durante la desnaturalización proteica, y a la alta relación señalruido de la técnica. Los fluoróforos útiles en los estudios de fluorescencia con proteínas pueden ser intrínsecos (residuos aromáticos, coenzimas) o extrínsecos (fluoresceína, Sypro Orange, naranja de acridina). 3.3.5.1.1. Fluorimetría Diferencial de barrido (DSF; Differential Scanning Fluorymetry) En la técnica de fluorimetría diferencial de barrido o DSF (del inglés, “Differential Scanning Fluorymetry”), el despliegue de la proteína se manifiesta con un incremento de la fluorescencia de un fluoróforo cuyo rendimiento cuántico se potencia en un ambiente hidrofóbico. A medida que una proteína se va desplegando por efecto del incremento de temperatura, el fluoróforo se va uniendo a las regiones hidrofóbicas de la misma, incrementando su fluorescencia [Niesen et al., 2007]. Materiales y Métodos 99 De los fluoróforos que pueden ser empleados en esta técnica, el Sypro Orange es el que presenta mejores propiedades por su alta relación señal-ruido y porque la longitud de onda necesaria para su excitación (exactamente a 492 nm) disminuye la probabilidad de que alguna molécula pequeña de la disolución pueda interferir con las propiedades ópticas del mismo. Esta técnica permite ensayar múltiples condiciones a la vez en poco tiempo y precisa muy pequeñas cantidades (1-15 µg) y concentraciones de proteína. Es por ello que fue empleada en este trabajo para una determinación preliminar de la T m de los diversos mutantes diseñados. En los ensayos se emplearon placas de PCR de 96 pocillos, en cada uno de los cuales se mezclaron 2,5 o 5 µg de plastocianina oxidada o reducida en tampón fosfato 10 mM pH 7,0 con una dilución de Sypro Orange (Invitrogen) 5X, en un volumen total de 25 μl [Niesen et al., 2007]. En los ensayos iniciales, para mantener la proteína en su estado totalmente reducido u oxidado, se añadieron concentraciones equimolares de ascorbato sódico o de ferricianuro potásico, respectivamente. En sucesivos intentos con la proteína reducida se sumó un paso previo de filtración en gel a través de una columna PD-10 Sephadex G-25M para eliminar el agente reductor. Para la determinación de los valores de T m de las formas oxidadas respecto a un gradiente de pH, se recurre a tampón citrato en un intervalo de pH entre 4,5 y 7,5, tal como se describe en la bibliografía [Feio et al, 2006]. Las medidas se registraron en un sistema RT-PCR (iQ5 Real time PCR detection System, Bio-Rad) programado para que la temperatura aumentara gradualmente a razón de 1 °C min -1 desde los 20 hasta los 95 °C. Los cambios en la intensidad de la fluorescencia del Materiales y Métodos 100 Sypro Orange se midieron excitando las muestras a 492 nm y observando la emisión de fluorescencia a 575 nm. Los valores de T m se calcularon a partir del primer mínimo negativo en la derivada de las trazas de fluorescencia registradas, usando el programa Bio-Rad IQ5. 3.3.5.1.2. Espectroscopía de fluorescencia Los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina, son intrínsicamente fluorescentes. Entre ellos, el triptófano presenta un mayor rendimiento cuántico y coeficiente de extinción, unido a que los residuos de tirosina y fenilalanina le transmiten por resonancia su excitación. Por ello, este aminoácido es el más adecuado para seguir el desplegamiento de una proteína [Royer, 2006]. Figura 13. Detalle del residuo Trp31 en la estructura tridimensional de SynPc. La estructura de Syn-Pc se corresponde con el código pdb: 1JXD [Bertiniª et al., 2001. El átomo de cobre se muestra en naranja y sus residuos ligandos en gris. Materiales y Métodos 101 La intensidad de la fluorescencia emitida por el fluoróforo está altamente influenciada por el entorno. El único residuo de triptófano presente en la molécula de Syn-Pc es el residuo 31, localizado en el núcleo de la proteína (figura 13). En el estado nativo, el máximo de emisión se da a 320 nm cuando las muestras son excitadas a 275 nm. El despliegue de la proteína hace que el triptófano se exponga al solvente, por lo que se atenúa su emisión y el máximo se ve desplazado a alrededor de los 350 nm. Gracias a ello se puede seguir el desplegamiento proteico mediante el incremento de fluorescencia a 350 nm. Para la obtención de la curva de desestabilización de las Pcs por espectroscopía de fluorescencia se siguió el protocolo previamente descrito [Feio et al, 2004] con mínimas modificaciones. Las medidas se realizaron en un fluorímetro Cary (Varian) acoplado a un baño Polystat cc2 (Huber) para el control de la temperatura. La temperatura de la muestra se registró utilizando un sistema Digitron 2008 dotado de un termopar flexible que se insertaba en el interior de la cubeta y en contacto con la muestra. La solución de proteína se encuentraba a una concentración de 20 µM en tampón fosfato 10 mM, pH 7. Para mantener la proteína en un único estado redox a lo largo del experimento, se añadieron concentraciones equimolares de ascorbato sódico o de ferricianuro potásico. La temperatura en la cubeta se programó para que aumentara a razón de 1 °C min -1 desde los 20 hasta los 95 °C. La muestra estuvo sometida a agitación continua durante todo el proceso para la homogeneización de la temperatura. Las muestras se excitaron con luz de longitud de onda de 275 nm y se monitorizó la emisión de fluorescencia a 350 nm. Como control, antes y después de cada rampa de temperatura se realizó un espectro de emisión desde 300 hasta 600 nm, mientras se excitaba la muestra con luz ultravioleta a 275 nm de Materiales y Métodos 102 longitud de onda. Los datos de fluorescencia y temperatura se registraron cada 30 segundos y se exportaron al programa Origin Versión 8.0 para su análisis. 3.3.5.2. Dicroísmo circular Tal como se expuso en el apartado 3.3.4.1, la espectroscopía de CD es una herramienta extremadamente útil para la monitorización de los cambios estructurales causados durante la desnaturalización proteica. Para monitorizar los cambios de estructura secundaria durante el desplegamiento se registraron espectros de CD en el ultravioleta lejano (190-240 nm) a la vez que se incrementaba la temperatura de los 25 a los 95 °C a razón de 1 °C min -1 . Se registraron 3 espectros cada 5 °C con una velocidad de barrido de 200 nm min -1 , siendo el espectro final a cada punto el promedio de dichas medidas. Las muestras contenían 15 μM de proteína en 10 mM de tampón fosfato pH 7. La curva de desplegamiento fue obtenida siguiendo los valores de dicroísmo circular a 219 nm. 3.3.5.3. Análisis de las rampas de temperatura y obtención de la temperatura de desnaturalización La rampa de desnaturalización térmica se puede obtener representando frente a la temperatura directamente la propiedad observada experimentalmente (en este trabajo elipticidad o emisión de fluorescencia) o bien la fracción de proteína desplegada (X U ) o plegada (X F ), calculadas a su vez a partir de dicha propiedad. En una reacción de desplegamiento F ↔ U, siendo F y U las especies plegada y desplegada, respectivamente, se determina la fracción de proteína plegada: Materiales y Métodos 103 b c =dd+/ e =* 2 −* f * c −* f  e ecuación 1 Y la desplegada: b f =* 2 −* c * f −* c  e ecuación 2 Donde [F] y [U] son respectivamente las concentraciones de as formas plegadas y desplegadas, y T , y F y y U son, respectivamente, la propiedad observada experimentalmente (elipticidad o emisión de fluorescencia) a cualquier temperatura T (Kelvin), y las observadas antes y después de la transición. Para obtener el valor de la T m se realiza el ajuste de la curva de desnaturalización a la ecuación resultante de la adaptación realizada por Bolen y Santoro (1988) a los procesos de desnaturalización térmica [Sinha et al, 2000], y en la que se asume que el valor de ΔCp entre las formas plegada y desplegada es cero: * 2 = g h ig j k l∆∆mnopq rlpqm rs e .ik l∆∆mnopq rlpqm rs e ecuación 3 Aunque se intentó en un inicio ajustar la dependencia de y F e y U con respecto a la temperatura a una función parabólica [Sinha et al, 2000], el resultado final no se amoldó a los datos experimentales. Esto se solucionó usando una dependencia lineal de y F e y U respecto a la temperatura. De la misma forma, si se realiza la normalización de la curva respecto a la ecuación 1 y la curva de desplegamiento consiste en la Materiales y Métodos 104 fracción de proteína desplegada frente a la temperatura, el ajuste de la ecuación se realiza respecto a la misma ecuación 3. En este caso, y T se corresponde a la fracción de proteína desplegada a cualquier temperatura, y F e y U son, respectivamente, la fracción de plastocianina desplegada medida antes y después de la transición. Independientemente de la escala usada, T m es la temperatura de desnaturalización, definida como la temperatura a la cual la mitad de la población proteica está nativa y el otro 50% como desplegada; es decir X U = 0,5. R es la constante universal de los gases y ΔH m es ΔH vH , el cambio en la entalpía de van´t Hoff a temperatura igual a T m . 3.4. Caracterización estructural de las plastocianinas mutantes mediante difracción de rayos X Los rayos X abarcan longitudes de onda desde los 0,1 y 10 Å, estando por tanto en el mismo orden que la longitud de los enlaces moleculares (entre 0,8 y 1,8 Å). Es por ello que los rayos X se pueden usar para la elucidación de estructuras a nivel molecular. La determinación estructural de una molécula proteica mediante difracción de rayos X se puede dividir en una serie de etapas. La primera de ellas consiste en la obtención de cristales a partir de una muestra soluble y pura de proteína. Un cristal consiste en una red tridimensional, denominada red cristalina, en la que átomos y moléculas se organizan de forma repetitiva y periódica, con solvente entre ellas. Esta red cristalina se forma a partir de la repetición y translación ordenada de unidades más pequeñas denominadas celdilla unidad. En un cristal proteico, una celdilla unidad contiene, de promedio, una o más copias de la proteína de interés. Es la Materiales y Métodos 105 estructura de una celdilla unidad lo que se desea obtener. Una celdilla unidad se define por sus ejes (a, b, c) y sus ángulos ( α , β , γ ). A su vez, la celdilla unidad se puede reducir hasta unidades asimétricas, que se relacionan entre sí mediante un elemento de simetría. Todo lo anterior se localiza en el denominado espacio real o espacio directo. Las condiciones en las que una proteína cristaliza son muy precisas, por lo que los experimentos de cristalización implican el escrutinio de multitud de condiciones. Los métodos de cristalización por difusión de vapor son las técnicas de cristalización más empleadas, entre las que se encuentran las técnicas de gota colgante (hanging drop) y gota sentada (sitting drop). En ellas, la solución de proteína se mezcla con un tampón y una solución precipitante, y se coloca en una cámara cerrada donde hay también un reservorio de la solución precipitante. Por equilibrio de vapor, el agua pasará de la gota al reservorio, resultando en un gradual incremento de la concentración de solución precipitante y proteína en la gota. Como resultado, la solubilidad de la proteína puede reducirse y dar lugar a una solución súper saturada. Durante dicho proceso, se puede producir la nucleación y posterior crecimiento de cristales. Una vez obtenido un cristal adecuado, éste se saca de la solución de cristalización con ayuda de un lazo o loop de nylon y se introduce inmediatamente en nitrógeno líquido si la solución madre dispone de suficiente crioprotector. En caso contrario, el cristal debería pasarse brevemente por un crioprotector y rápidamente introducirse en nitrógeno líquido. Los cristales deben permanecer recubiertos de la solución madre durante el proceso de montaje y colección de datos para evitar su secado y desintegración. El lazo de nylon con el cristal es entonces montado directamente en el difractómetro y sometido a una Materiales y Métodos 112 Los datos de difracción fueron registrados en la línea de haz (beamline) I04 del sincrotrón, perteneciente a la sección de cristalografía macromolecular, del Diamond Light Source de Didcot, (Oxfordshire, UK). Mientras que para el cristal del triple mutante Syn-A44D/D49P/A62L se usó sulfato amónico 1 M como crioprotector, en el caso del cristal del mutante simple Syn-V48I no fue necesario crioprotector. El experimento fue llevado a cabo estando en todo momento los cristales sometidos a una corriente de nitrógeno gas a -170 ºC. La integración de las intensidades de los patrones de difracción y la obtención de los índices de Miller se realizaron mediante el paquete informático XDS [Kabsch, 2010]. Para resolver el problema de las fases se recurrió al método de remplazamiento molecular, para lo cual las fases iniciales fueron extraídas de la estructura previamente publicada del triple mutante Syn-A44D/D49P/A62L (código pdb: 1PCS; Romero et al., 1998) usando el programa Phaser [McCoy et al., 2007]. Para evitar obtener un modelo final sesgado, todos los residuos de la estructura fueron sustituidos por alanina como paso previo al refinamiento. Para el mutante Syn-V48I fue necesario, además, eliminar las secuencias entre los residuos 7 y 11 y los residuos 44 y 50. Fueron necesarios sucesivos pasos de refinamiento y modelado manual de la molécula, realizados con los programas PHENIX [Adams et al., 2002; Adams et al., 2011] y COOT [Emsley et al., 2010]. Todas las cadenas laterales se añadieron y ajustaron siguiendo como guías los mapas 2Fo-Fc y Fo-Fc. Las moléculas de agua se añadieron manualmente en las regiones donde el mapa Fo-Fc presentaba máximos de 3.0 σ. 4. RESULTADOS Resultados 115 4.1. Diseño de los mutantes de la plastocianina de Synechocystis sp. PCC6803 4.1.1. Mutaciones introducidas en la zona de interacción del lazo L5 con el barril: cluster hidrofóbico Los lazos L1 y L5 son las zonas de mayor fluctuación en todas las Pc [Bertiniª et al., 2001; Arcangeli et al., 2001; Feio et al., 2006; Muñoz-López b et al., 2010], inclusives Syn-Pc y Pho-Pc. Por tanto, incrementar las interacciones hidrofóbicas entre los lazos vecinos L5 y L7 puede dar lugar a la estabilización de Syn-Pc. Figura 14. Estructura tridimensional de Syn-Pc y detalle de la interfase entre los lazos L5 y L7. (A) Estructura tridimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al., 2001) mostrando en magenta los residuos implicados en la formación de la agrupación hidrofóbica entre el lazo L5 y el barril, y, en naranja, el átomo de cobre. Las moléculas de agua fueron introducidas con el módulo “Solvate” de Chimera. (B) Detalles de la interfase entre los lazos L5 y L7 de Syn-Pc mostrando la cavidad hidrofóbica, calculada usando la aplicación “CASTp” [Binkowski et al., 2003]. Resultados 116 Figura 15. Estructura tridimensional de Pho-Pc y detalle de la interfase entre los lazos L5 y L7. (A) Estructura tridimensional de Pho-Pc (código pdb: 1BAW; Bond et al., 1999) donde se muestran en color magenta los residuos implicados en la formación de la agrupación hidrofóbica entre el lazo L5 y el barril. El átomo de cobre se muestra en naranja. (B) Detalles de la interfase entre los lazos L5 y L7 de PhoPc mostrando la cavidad hidrofóbica calculada usando la aplicación “CASTp” [Binkowski et al., 2003]. En el entorno del lazo L5 de Syn-Pc existe una cavidad en la que se intercalan dos moléculas de agua (figura 14) que participan, junto con residuos de los lazos L5 y L7 en la formación de una red de puentes de hidrógeno. En su homóloga termorresistente, Pho-Pc, el lazo L5 presenta una inserción de tres residuos que permite la formación de una agrupación hidrofóbica constituida por los residuos de Phe80, Val48, Ile55, Pro81, Pro49 y Tyr85 (figura 15). En Syn-Pc dicha agrupación se reduce a la Tyr79, la Val48 y la Pro76 [Muñoz-López b et al., 2010]. La importancia de esta región en la estabilidad térmica de Pho-Pc se demuestra en mutantes en los que la Phe80 se cambia a alanina y la Resultados 117 Pro49 se intercambia con la Gly50, siguiente residuo en la secuencia [Muñoz-Lópezª et al., 2010]. 4.1.1.1. Sustitución V48I. La valina 48 se localiza en el lazo L5, participando en su interacción con el barril (figura 16). Se espera que la adición de un grupo metilo mediante la sustitución de este residuo por una isoleucina reduzca el hueco entre el lazo L5 y el barril, incrementando las interacciones hidrofóbicas de la agrupación, disminuyendo la solvatación, así como reforzando las interacciones de Van der Waals entre los residuos de este área. Figura 16. Mutación V48I en Syn-Pc. (A) Estructura tridimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al., 2001) donde se ha mutado el residuo Val48 a Ile. (B) Representación a mayor escala la interfase entre los lazos L5 y L7 de la Pc mutada. El residuo Ile48 se encuentra coloreado en verde. Se muestran en magenta los residuos que, junto al 48, forman la agrupación hidrofóbica en Syn-Pc. Resultados 118 4.1.1.2. Sustituciones L56I, T52Y y T52I La Leu56 (figura 17) se localiza en el inicio de la hélice α de SynPc. Su reemplazo por un residuo de isoleucina, más voluminoso, pretende incrementar las interacciones hidrofóbicas de esta región. Este residuo también se encuentra en Pho-Pc (Ile55). Figura 17. Mutación L56I. (A) Estructura tridimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al., 2001) donde se ha mutado el residuo Leu56 a Ile. (B) Representación a mayor escala la interfase entre los lazos L5 y L7 de la Pc mutada. El residuo reemplazado se colorea en verde. Se muestra en magenta los residuos que, junto al 48, forman la agrupación hidrofóbica en Syn-Pc. La treonina 52 se localiza en la zona intermedia de la hélice α de Syn-Pc (figura 18A). Pho-Pc presenta en esa misma posición un residuo más voluminoso (Ile55), implicado en la formación de la agrupación hidrofóbica (figura 15). Por tanto, el cambio T52I se consideró razonable para estabilizar esta región. Resultados 119 Figura 18. Mutaciones T52I y T52Y. Estructura tridimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al., 2001) donde se han mutado el residuo Thr52 a Ile (A) o a Tyr (B). A la derecha de la figura se muestran a mayor escala la interfase entre los lazos L5 y L7 de cada uno de los mutantes. Los residuos reemplazados se colorean en verde. Se muestran en magenta los residuos que, junto al 48, forman la agrupación hidrofóbica en Syn-Pc. Las proteínas termoresistentes suelen usar los residuos aromáticos como parte de sus agrupaciones porque su empaquetamiento Resultados 120 da lugar a regiones relativamente rígidas [Kannan, 2000]. De hecho, PhoPc muestra un residuo aromático (Phe80) en el lazo L7 que se encuentra ausente en Syn-Pc. El cambio T52Y (figura 18B) en el lazo L5 pretende aliviar en parte esta falta creando una interacción de este residuo con Tyr79. 4.1.1.3. Mutantes en las hebras β5 y β6: G60A, K59S y V42I Syn-Pc y Pho-Pc difieren en los patrones de puentes de hidrógeno entre las hebras β5 y β6 a temperatura ambiente [MuñozLópez b et al., 2010]. Esta desigualdad se debe posiblemente a la presencia de una glicina en posición 60 en Syn-Pc en lugar de un residuo de glutamina en la posición correspondiente de Pho-Pc (figura 11B). Como ya se mencionó en la introducción, los residuos de glicina presentan una elevada entropía conformacional y dan también lugar a volúmenes vacíos o cavidades en el interior de la estructura proteica [Creighton, 1997], por lo que en proteínas termofílicas suelen ser sustituidos normalmente por alanina (figura 19). Otra diferencia en la secuencia entre ambas proteínas radica en la lisina 59, que en Pho-Pc, es una serina (figura 11). Por tanto, se introduce el cambio K59S en Syn-Pc (figura 13). La Val42 en Syn-Pc se corresponde con un residuo de leucina en la proteína termofílica (figura 11). Aunque este residuo no parece ser el responsable de la diferente proporción de puentes de hidrógeno entre ambas proteínas, el programa CUPSAT [Parthiban et al., 2006] indica que la mutación V42I sería la más estabilizante dentro de la cara este. Según esta aplicación, la mutación V42I muestra un valor de ΔΔG c de 1,27 kJ mol -1 . Resultados 121 Figura 19. Mutaciones V42I, K59S y G60A Estructura tridimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Bertiniª et al., 2001) donde se marcan en verde las mutaciones V42I, G60A y K59S. 4.1.1.4. Sustitución A3F Cálculos previos de dinámica molecular realizados por miembros del grupo muestran que las hebras β1 y β2 de Syn-Pc son menos estables que en Pho-Pc, lo que a su vez repercute en la estabilidad de la tercera hebra β. De hecho, la movilidad de toda esta región en Syn-Pc es elevada [Feio et al., 2006]. Sin embargo, en Pho-Pc esta misma región se muestra más rígida en las simulaciones bajo idénticas condiciones. Como ya se adelantó en la introducción, Pho-Pc tiene un residuo de Phe en la posición 3 (hebra β1) que interacciona mediante contactos de Van der Waals con las Val21 y Val23 (Ile23 en Syn-Pc) (hebra β3). En Syn-Pc hay una alanina en lugar de Phe3 (figura 20). Cabe además Resultados 128 Ninguna de las mutaciones ha incrementado el RMSF correspondiente al lazo L6 respecto a la forma silvestre (máximo en el residuo 65). 4.3. Análisis de la termoestabilidad de Syn-Pc mediante mutagénesis dirigida 4.3.1. Expresión y purificación de plastocianinas silvestres y mutantes. En la tabla 4 se exponen los rendimientos de producción (mg L - 1 ) en E.coli DH5a tanto de la forma silvestre como de los mutantes de Syn-Pc estudiados en este trabajo. La tasa de expresión varía entre 4,16 mg L -1 de Syn-V48I y los 0,6 mg L -1 de Syn-A3F, lo que supone 3,5 mg L - 1 de diferencia. Tabla 4. Rendimientos de producción de las distintas plastocianinas usadas para este trabajo. Los valores se refieren a la concentración de Pc en los extractos de periplasma obtenidos tal como se comenta en el apartado 3.3.3 de materiales y métodos. Proteína Rendimiento (mg L -1 ) Proteína Rendimiento (mg L -1 ) Syn-Pc 2,37 Syn-V42I 1,06 Syn-V48I 4,16 Syn-K59S 1,23 Syn-G60A 1,7 Syn-A3F 0,6 Syn-T52I 1,58 Syn-V48I/G60A 2,66 Syn-T52Y 1,21 SynA44D/D49P/A62L 3,86 Syn-L56I 0,9 Resultados 129 Tabla 5. Porcentaje de recuperación de proteína en cada uno de los procesos de purificación hasta la obtención de la proteína pura. La purificación se llevó de acuerdo al apartado 3.3.3.2 de materiales y métodos. Para los cálculos se tienen en cuenta sólo las fracciones obtenidas con una razón de pureza R inferior a 5, 3 y 2,5 para la cromatografía de intercambio aniónico, cromatoenfoque y filtración en gel, respectivamente. n.a. no se aplica. Proteína Porcentaje de recuperación Cantidad final de proteína (mg L -1 ) Intercambio aniónico (R<5) Cromato enfoque (R<3) Filtración en gel (R<2,5) Syn-Pc 82,0 72,0 55,5 1,3 Syn-V48I 81,5 73,0 59,5 2,5 Syn-G60A 94,0 51,0 49,3 0,8 Syn-T52I 76,0 61,0 46,9 0,7 Syn-T52Y 90,0 58,4 52,6 0,6 Syn-L56I 79,6 46,5 54,2 0,5 Syn-V42I 81,3 55,0 57,0 0,6 Syn-K59S 81,5 45,2 47,7 0,6 Syn-A3F 71,0 26,0 n.a. 0,2 Syn-V48I/G60A 90,0 45,0 53,2 1,4 Syn-A44D/D49P/A62L 82,7 53,5 44,7 1,7 La tabla 5 muestra los rendimientos (%) en los sucesivos pasos de purificación. Los rendimientos medios fueron del 82,7, 53,3 y 48,0% para los pasos de cromatografía de intercambio aniónico, Resultados 130 cromatoenfoque y cromatografía de filtración en gel, respectivamente. El coeficiente de absorción usado fue de 4,5 mM –1 cm –1 a 597 nm para la forma oxidada de la proteína [Hervás et al., 1993]. A diferencia del resto de mutantes, Syn-A3F se producía en baja proporción. Además, precipitaba en los procesos de diálisis y pasos sucesivos de purificación, llegándose a perder hasta la tercera parte de la producción proteica inicial. Debido a ello, se omitió la tercera fase de purificación consistente en la columna de filtración en gel. La alícuota de proteína más pura presentaba una razón R de 2,5, suficiente para los ensayos para los cuales se iba a emplear. Figura 24. Espectros de absorción en el Uv/vis de Syn-Pc, Syn-V48I, SynG60A, Syn-V48I/G60A y Syn-A44D/D49P/A62L. Espectros obtenidos a partir de las proteínas en estado oxidado. Los espectros se obtuvieron en tampón fosfato 10 mM pH 7 y en presencia de ferricianuro potásico para oxidar los centros metálicos de las Pc. Resultados 131 Syn-A44DD49PA62L M 10 µg 15 µg Syn-V48I M 10 µg 15 µg Pho-P49G/G50P M 10 µg 15 µg Figura 25. Gel de electroforesis en acrilamida y condiciones desnaturalizantes de Syn-V48I, Syn-A44D/D49P/A62L y Pho-P49G/G50P. En cada gel se cargaron 10 y 15 μg de plastocianina con una R menor a 2,5 para las Pc de Synechocystis y 3,0 para Pho-P49G/G50P. Los geles se tiñieron con azul de Comassie, según lo descrito en material y métodos. Todos los mutantes presentan espectros de absorción en el UV/Vis idénticos al de la forma silvestre. En la figura 24 se muestra la superposición de los espectros de absorción medidos entre 200 y 750 nm de los mutantes Syn-V48I, Syn-G60A, Syn-V48I/G60A y SynA44D/D49P/A62L, así como de Syn-Pc, en sus formas oxidadas. Las muestras exhiben razones de pureza (R) entre 2,5 y 2,8, lo que se refleja Resultados 132 en la diferencia en el pico a 278 nm. Los máximos a 278 y 597 nm son debidos a la absorción de los residuos aromáticos de la proteína, mayoritariamente del triptófano en posición 31, y del centro de cobre, respectivamente. El pico que aparece a 421 nm corresponde a restos de ferricianuro potásico usado para oxidar las muestras. En la figura 25 se muestran las imágenes de los geles de electroforesis en acrilamida y condiciones desnaturalizantes de las muestras de Syn-A44D/D49P/A62L, Syn-V48I y Pho-P49G/G50P que se utilizaron para la obtención de cristales. Como se demuestra en la figura, las proteínas se purificaron a homogeneidad electroforética. 4.3.2. Análisis funcional. 4.3.2.1. Determinación de la estructura secundaria mediante dicroísmo circular. En la figura 26A se muestra la superposición de los espectros de dicroísmo circular en el UV lejano de Syn-Pc y de todos sus mutantes diseñados y estudiados en este trabajo. Todas las proteínas recombinantes estaban perfectamente plegadas. Al superponer los espectros se observan ligeras diferencias, lo que indica alguna, muy leve, perturbación de la estructura secundaria. Esta apreciación se corrobora con los porcentajes en estructura secundaria obtenidos con el programa CDpro (figura 26B). Todos los mutantes, así como la forma silvestre, y tal como sucede con el resto de plastocianinas [Redinbo, et al. 1994], son proteínas fundamentalmente β, con un contenido mínimo en hélice α. Resultados 133 Figura 26. Espectros de CD en el UV-lejano (A) y contenido en estructura secundaria (B) de Syn-Pc y de los mutantes ensayados en este trabajo. Todas las muestras contenían 3 μM de proteína oxidada en tampón fosfato 10 mM pH 7,0. Las medidas fueron realizadas a 25 ºC, usando una cubeta de cuarzo con un paso de luz de 0,1 cm. Cada uno de los espectros es el resultado de promediar 20 espectros sencillos. El contenido en estructura secundaria se calculó usando el programa CDpro tal y como se detalla en materiales y métodos. 4.3.2.2. Medidas potenciométricas. En la figura 27 se representan las curvas de valoraciones redox de Syn-Pc y de todos sus mutantes, a excepción de T52Y y T52I, cuyos valores de T m no mostraron diferencias significativas con la del silvestre según la técnica de DSF (véase el apartado 4.4.1). También se muestran, como controles, las valoraciones redox de Pho-Pc y su doble mutante, Pho-P49G/G50P. Resultados 134 Figura 27. Valoraciones redox de Syn-Pc y de aquéllos de sus mutantes en los que se observó un cambio considerable en la T m de la forma oxidada según la técnica de DSF. Como controles se muestran también las curvas obtenidas para Pho-Pc y PhoP49G/G50P. Los datos experimentales se muestran con símbolos (triángulos invertidos) y el ajuste a la ecuación de Nernst mediante línea contínua. Para las medidas se siguió el protocolo descrito por Ortega et al. (1988). Las muestras contenían 10 μM de Pc en tampón fosfato 50 mM, pH 7,0, ascorbato sódico 1 mM y 40 μM de cada uno de los mediadores diaminodurol (E m,7 = +240 mV), 1,4– p– benzoquinona (E m,7 = +293 mV) y menadiona (E m,7 = +422 mV), en un volumen final de 3 mL. Resultados 135 Los potenciales redox estándar aparente a pH 7,0 de las proteínas mutadas de Syn-Pc no se afectan en gran medida por los cambios introducidos, a excepción de Syn-A3F. Este mutante mostró un potencial casi 55 mV más reductor. Para Syn-Pc, Syn-A44D/D49P/A62L, Pho-Pc y Pho-P49G/G50P los potenciales redox obtenidos se ajustan a los descritos en la bibliografía [Hervás et al., 1993; Romero et al., 1998; Balme et al., 2001; Muñoz-López a et al., 2010], siendo respectivamente 338,8, 351,3, 323,15 y 323,24 mV. Entre el resto de modificaciones, SynL56I y Syn-K59S experimentan una leve caída de su potencial redox, hasta aproximadamente los 325 mV, acercándose a los de Pho–Pc y su doble mutante. Las restantes proteínas mostraron un potencial ligeramente más negativo (Syn-G60A, 333,23 mV; Syn-V48I-G60A, 335,67 mV) o positivo (Syn-V48I, 344,36 mV) que el de la forma silvestre. Estas variaciones del potencial rédox con las diversas mutaciones introducidas pueden ser indicativas de una alteración del centro de cobre [Li et al., 2004; Si y Li, 2009]. 4.3.2.3. Espectrofotometría cinética inducida por láser. Las mutaciones Syn-V48I, Syn-G60A, Syn-V48I/G60A y PhoP49G/G50P se encuentran localizadas todas ellas en la cara este de la proteína, región implicada en las interacciones electrostáticas que intervienen en la formación de los complejos de las Pcs con sus dianas fisiológicas [Díaz-Moreno et al., 2005]. A pesar de que los cambios a estudiar no supusieron modificaciones de carga, se quiso comprobar si afectaban a la funcionalidad de la proteína. Para ello, se monitorizó el decaimiento monofásico de la absorbancia a 820 nm del P700 + del PSI al ser reducido por la Pc (no mostrado). La constante de pseudo-primer orden k obs para la reducción del PSI depende linealmente de la concentración de proteína (figura 28). Resultados 136 Figura 28. Dependencia de la constante observada (k obs ) respecto a la concentración de Pc para la reducción del PSI. Tabla 6. Constantes bimoleculares de la reacción de reducción del PSI por las distintas Pcs en condiciones estándar (k 2 ). Proteína K 2 x 10 -6 (M -1 s -1 ) Syn-Pc 5,7 Syn-V48I 6,4 Syn-G60A 5,7 Syn-V48I/G60A 8,4 Syn-A44D/D49P/A62L 4,7 Pho-Pc 6,5 Pho-P49G/G50P 6,1 Resultados 137 En la tabla 6 se muestran las constantes de segundo orden (k 2 ) extraídas a partir de las rectas de regresión de la figura 28. Todos los mutantes de Syn-Pc presentan valores de k 2 muy similares al del silvestre, a excepción del doble mutante V48I/G60A, cuya constante bimolecular tiene un valor 1,5 veces superior al de Syn-Pc. La doble mutación P49G/G50P no afecta en ninguna medida a la interacción de la Pc de P. laminosum con el PSI. La reacción entre el PSI y las plastocianinas de Synechocystis y de Phormidium, silvestres y mutantes, se ajusta a un mecanismo de reacción limitada por colisión orientada o cinética tipo I [Hervás et al., 1994; Hervás et al., 1995; Schlarb-Ridley et al., 2002]. 4.3.2.4. Determinación de la estructura del centro de cobre mediante dicroísmo circular. Las variaciones en el espectro de CD en la región del visible se correlacionan con diferencias en la estructura electrónica del centro de cobre [Solomon et al., 1976; Solomon et al., 1980; Gewirth y Solomon, 1988; LaCroix et al., 1996]. En la figura 29 se muestra el espectro de SynPc, donde se señalan las transiciones relacionadas tanto con las transferencias de carga que se dan entre el átomo de cobre y sus cuatro ligandos (λ< 600 nm), como con las transiciones d-d del átomo de cobre (λ>600 nm). En las figuras 30 y 31 se muestran los espectros en el visible de los mutantes de Syn-Pc que mostraron una T m superior e inferior, respectivamente, al silvestre, según DSF (véase el apartado 4.4.1). En cada una de las gráficas se superponen los espectros de uno de los mutantes con los de Pho-Pc y Syn-Pc. Tal como se observa en la imagen, los espectros son, en general, similares, mostrando el perfil típico para Resultados 144 para valores iguales o inferiores a dicho pH, estos mutantes resultan más estables que la forma silvestre. Es interesante señalar que, aún cuando no se observe aumento en la T m en los mutantes Syn-K59S y Syn-A3F, sí parece haber un comportamiento diferente respecto al pH. En el ejemplo de Syn-K59S el cambio tan brusco observado podría explicarse por la vecindad del residuo mutado con la His58, dada la aparición de un pKa alrededor de 6 en el mutante. 4.4.2. Espectroscopía de fluorescencia. En las figuras 35 y 36 se han representado las curvas de desplegamiento normalizadas obtenidas por espectroscopía de fluorescencia de las formas oxidadas y reducidas de Syn-Pc y de aquéllos de sus mutantes que resultaron más estables que el silvestre según la técnica de DSF. Se indican los valores de T m obtenidos a partir del ajuste para cada forma redox, así como la diferencia entre los dos valores de T m . Resulta evidente en todos los casos la aproximación de ambas curvas. Mientras que en Syn-V48I, Syn-V48I/G60A y SynA44D/D49P/A62L este resultado es debido principalmente a un incremento de la estabilidad de la forma oxidada, en Syn-G60A se debe a la desestabilización de la reducida, sin verse prácticamente afectada la proteína oxidada. Ya en Pho-Pc se observó una mayor afectación de la estabilidad de la forma oxidada que de la reducida cuando se realizaban mutaciones puntuales, pero en ningún caso se observó el efecto contrario [Muñoz-Lópezª et al., 2010]. Por tanto, al compararlos con la forma silvestre, las mutaciones múltiples estabilizan el barril en ambas formas redox, mientras que en Syn-V48I sólo se estabiliza en la forma oxidada, sin alterarse en la reducida. Sin embargo, en Syn-G60A el barril de la Pc reducida se desestabiliza, mientras que la forma oxidada no se afecta. Resultados 145 Figura 34. Ejemplos del espectro de emisión de fluorescencia y de la curva de desnaturalización de Syn-Pc mediante espectroscopía de fluorescencia. A) Espectro de emisión de fluorescencia del mutante Syn-V48I en su estado nativo (azul) y desplegado (rojo). Las muestras fueron excitadas a 275 nm. B) Curva de desnaturalización del mutante Syn-V48I oxidado. Las muestras fueron excitadas a 275 nm y el desplegamiento se monitorizó siguiendo el incremento de fluorescencia a 355 nm, tal como se explica en materiales y métodos. De entre todos los mutantes, destaca, por una parte, Syn-V48I. Este cambio supone una enorme capacidad estabilizadora. De hecho, no sólo consigue casi salvar la diferencia en T m entre las formas oxidadas y reducidas de Syn-Pc, sino que además revierte el efecto desestabilizador de la mutación Syn-G60A sobre el barril de la proteína reducida. De hecho, Syn-V48I/G60A muestra un valor de T m en su forma reducida superior al del propio Syn-V48I, y una T m de la proteína oxidada intermedia entre las de Syn-Pc o Syn-G60A y la de Syn-V48I. Por tanto, se necesita del efecto sinérgico de ambas mutaciones para dar lugar a una Pc de Synechocystis cuyo barril sea más estable que el del silvestre independientemente del estado redox. Por otra parte, el triple mutante Syn-A44D/D49P/A62L no sólo experimenta una estabilización de ambas formas redox, sino que, aún continuando siendo la forma reducida la de mayor T m , la proteína oxidada parece alcanzar a una mayor temperatura el estado 100% desplegado. Resultados 146 Esto se debe a la desestabilización tan gradual que sufre la forma oxidada de este mutante, de forma que precisa de un incremento en la temperatura de unos 30 ºC para alcanzar el estado totalmente desplegado. 4.4.3. Dicroísmo circular Como ya se adelantó en el apartado 4.3.2.1, los cambios en el espectro de CD al incrementar la temperatura se puede usar para determinar los efectos de una determinada mutación sobre la estabilidad proteica. Por ello, se miden los cambios en la elipticidad a 219 nm para el seguimiento de la desnaturalización térmica en proteínas con un alto contenido en hebras β [Greenfield; 2006]. En las figuras 35 y 36 se han representado las curvas de desplegamiento ajustadas obtenidas por CD de las formas oxidadas (verde), reducidas (azul) y apo-Pc (magenta) de Syn-Pc y de aquéllos mutantes que resultaron estabilizantes en los ensayos de DSF. Para poder comparar con Pho-Pc y su doble mutante Pho–P49G/G50P, se obtuvieron también sus curvas de desplegamiento por CD (figura 37), no realizado con anterioridad a este trabajo. Las tablas 7 y 8 muestran los valores de T m obtenidos, respectivamente, para las formas oxidada y reducida, y para las apo-Pc. Al igual que se observaba en los ensayos de espectroscopía de fluorescencia, existe una disminución en la diferencia de T m entre formas oxidadas y reducidas de Syn-Pc y sus mutantes. Sin embargo, esta diferencia es prácticamente igual para todos los mutantes (en torno a 6,5 o C) cuando la estabilidad se monitoriza mediante CD. Nuevamente es la forma oxidada la que experimenta una mayor estabilización. Sin embargo, en las formas reducidas se observa una mayor variabilidad, Resultados 147 llegando incluso a ser levemente desestabilizante en el caso de SynG60A. Figura 35. Curvas de desplegamiento normalizadas y ajustadas obtenidas por espectroscopía de fluorescencia y CD de las formas oxidadas y reducidas de Syn–Pc y de aquéllos mutantes simples que resultaron estabilizantes. A la izquierda se muestran las curvas de desplegamiento obtenidas mediante espectroscopía de fluorescencia, y, a la derecha, por CD. Las curvas correspondientes a las formas oxidadas se muestran en verde, las reducidas, en azul y las apo-Pc, en magenta. Acompañando a cada una de ellas y del mismo color se muestran los valores de T m obtenidos del ajuste. En negro se indican las diferencias entre los valores de T m . Los ensayos fueron realizados a pH 7 tal como se explica en materiales y métodos. Resultados 148 Figura 36. Curvas de desplegamiento normalizadas y ajustadas obtenidas por espectroscopía de fluorescencia y CD de las formas oxidadas y reducidas de los mutantes múltiples de Syn–Pc. A la izquierda se muestran las curvas de desplegamiento obtenidas mediante espectroscopía de fluorescencia, y, a la derecha, por CD. Las curvas correspondientes a las formas oxidadas se muestran en verde, las reducidas, en azul y las apo-Pc, en magenta. Acompañando a cada una de ellas y del mismo color se muestran los valores de T m obtenidos del ajuste. En negro se indican las diferencias entre los valores de T m . Los ensayos fueron realizados a pH 7 tal como se explica en materiales y métodos. De forma análoga a lo observado mediante la técnica de espectroscopía de fluorescencia, mediante CD se observa tambén como la mutación V48I revierte el efecto desestabilizador de la G60A sobre la proteína reducida. El doble mutante Syn-V48I/G60A resulta, de hecho, más estable para ambas formas redox que la propia Syn-V48I. Los valores de T m obtenidos por CD para Pho-Pc (figura 37A) son muy cercanos a los determinados por espectroscopía de Resultados 149 fluorescencia en las mismas condiciones en estudios previos. Sin embargo, las T m obtenidas para Pho-P49G/G50P (figura 37B) en el presente trabajo son ligeramente inferiores (3°C para ambas formas redox) que las obtenidas mediante fluorescencia [Muñoz-Lópezª et al., 2010]. Esta variación puede deberse a diferencias en el pH usado en los dos trabajos. Tabla 7. Valores de T m de las formas oxidada y reducida de Syn-Pc y sus mutantes, así como de Pho-Pc y su mutante Pho-P49G/G50P. Los valores de T m mostrados se obtuvieron a partir del análisis de las curvas resultantes de los ensayos de desnaturalización térmica realizados mediante espectroscopía de fluorescencia y de CD (figuras 35 a 37). Espectroscopía de fluorescencia Espectroscopía de CD Proteína O xidada Reducida Oxidada Reducida Syn-Pc 59,76 ± 0,14 68,53 ± 0,56 63,07 ± 0,12 72,01 ± 0,28 Syn-V48I 67,08 ± 0,03 68,71 ± 0,29 66,97 ± 0,74 73,83 ± 0,28 Syn-G60A 59,81 ± 0,45 62,83 ± 1,10 64,47 ± 0,57 71,34 ± 0,25 Syn-V48I/G60A 63,75 ± 0,24 70,31 ± 0,85 69,12 ± 0,41 75,53 ± 0,44 SynA44D/D49P/A62L 67,15 ± 0,28 70,01 ± 0,65 66,65 ± 0,27 73,12 ± 0,37 Pho-Pc 81,80 ± 0,40 75,70 ± 1,00 76,56 ± 0,52 73,88 ± 0,48 Pho-P49G/G50P 69,10 ± 1,00 72,30 ± 1,10 65,21 ± 0,40 69,41 ± 0,98 a Los valores de T m para Pho-Pc y Pho-P49G/G50P obtenidos por espectroscopía de fluorescencia no se realizaron en este trabajo. Los valores mostrados han sido tomados de la bibliografía [Muñoz-López et al., 2010; Chaboy et al., 2011]. Resultados 150 Figura 37. Curvas de desplegamiento normalizadas y ajustadas obtenidas por CD de las formas oxidadas y reducidas de Pho-Pc y de Pho-P49G/G50P. Curvas de desplegamiento normalizadas CD de las formas oxidadas (verde), reducidas (azul) y apo-Pc (magenta) de Pho-Pc (A) y Pho-P49G/G50P (B). Acompañando a cada una de ellas y del mismo color se muestran los valores de T m obtenidos del ajuste. En negro se indican las diferencias entre los valores de T m . Los ensayos fueron realizados a pH 7 tal como se explica en materiales y métodos. 4.4.4. Diferencias entre los resultados de espectroscopía de fluorescencia y CD. Como ya se ha mencionado, mediante espectroscopía de fluorescencia se monitoriza la exposición del triptófano 31, situado en el núcleo hidrofóbico del barril de la Pc, a un ambiente acuoso [Royer, 2006]. Sin embargo, mediante dicroísmo circular en el UV a 219 nm se sigue el cambio en contenido en hebra β de la proteína al incrementar la temperatura [Greenfield, 2006], que no sólo afecta al barril, sino también a las hebras β5 y β6, en la cara este de la Pc. La existencia de un intermediario en la ruta de desplegamiento se puede detectar cuando las curvas obtenidas mediante diferentes técnicas espectroscópicas no pueden superponerse. Este es el caso de las proteínas estudiadas en este trabajo. En ningún caso, ya se consideren indistintamente las formas oxidadas o reducidas, las curvas Resultados 151 obtenidas por CD se pueden superponer a las resultantes de la espectroscopía de fluorescencia. Esto indica, por tanto, una ruta de desnaturalización de, al menos, tres estados [Sancho, 2013], para SynPc y sus mutantes estudiados en este trabajo. Este hecho difiere de lo propuesto en trabajos anteriores [Feio et al., 2004; Feio et al., 2006; Muñoz-Lópezª et al., 2010]. Los valores de T m , así como la temperatura a la que se alcanza el 100% de proteína desplegada, obtenidos por CD son, en la mayoría de los casos, superiores a los obtenidos por fluorescencia. Este comportamiento hace pensar que la proteína sufre en primer lugar una expansión de la matriz proteica, permitiendo la entrada de moléculas de agua en el interior del barril y la modificación del entorno del triptófano, mientras que la pérdida de estructura secundaria se produce de una forma más gradual. La excepción a lo anteriormente descrito lo plantean Syn-V48I y Syn-A44D7D49P/A62L en sus formas oxidadas. En estos dos casos, tanto por CD como por espectroscopía de fluorescencia se obtienen valores de T m prácticamente idénticos (en torno a 67 ºC para ambos). Sin embargo, las curvas obtenidas por ambas técnicas distan de ser superponibles (figura 38). Esto indica que, aunque sus valores de T m sean similares, el grado de cooperatividad y la entalpía del proceso de desplegamiento son diferentes. En el caso de Syn-V48I la rampa de desplegamiento obtenida por espectroscopía de fluorescencia es muy abrupta, de forma que entre la proteína totalmente plegada y la totalmente desplegada hay sólo 2 ºC de diferencia (de 66 a 68 ºC). Este hecho es indicativo de la existencia de un alto grado de cooperatividad en el desplegamiento de las distintas regiones del barril proteico. Sin embargo, mediante el seguimiento por CD de la pérdida de hebra β, la situación de proteína totalmente desplegada no se alcanza hasta aproximadamente los 75 ºC. Resultados 152 Figura 38. Curvas de desplegamiento normalizadas y ajustadas obtenidas por espectroscopía de fluorescencia y CD de las formas oxidadas de Syn– Pc, Syn–V48I y Syn–A44D/D49P/A62L. Las curvas obtenidas por espectroscopía de fluorescencia y CD se muestran en marrón y violeta, respectivamente. Syn-A44D/D49P/A62L, sin embargo, muestra para su forma oxidada una rampa de deplegamiento por espectroscopía de fluorescencia muy suave, necesitando que la temperatura aumente en 30 Resultados 15 3 ºC (de aproximadamente 50 a 80 ºC) para pasar de totalmente plegada a desplegada. En este caso estamos ante un ejemplo de baja cooperativad en el desplegamiento proteico. Mediante CD el estado desplegado se alcanza a una temperatura inferior (alrededor de los 74 ºC). Por tanto, en base a estos resultados se puede sugerir que a 68 ºC, el entorno del Trp31 en Syn-V48I se encuentra totalmente expuesto a pesar de que la proteína aún sigue manteniendo parte de su estructura secundaria. En Syn-A44D/D49P/A62L, al contrario, la proteína desplegada ha perdido gran parte de sus elementos de estructura secundaria a pesar de que mantiene cierta compactación de su nucleo proteico. 4.4.5. Análisis de la aportación de la matriz proteica y del centro metálico a la estabilidad proteica. Para conocer hasta qué punto los incrementos en la T m observados mediante DSF, espectroscopía de fluorescencia y CD se debían a la estabilización de la matriz proteica o al centro de cobre, se obtuvieron también las curvas de desplegamiento por espectroscopía de CD de las respectivas apo–Pc (figuras 35 a 37). En la tabla 8 se muestran los valores de T m obtenidos. La aportación de la matriz proteica vendrá dada por la T m de la apo-Pc, mientras que la del centro de cobre por la diferencia de T m entre la forma reducida u oxidada y la de la proteína sin el cobre. Las diversas mutaciones ensayadas afectarán por una parte a la matriz proteica, induciendo una estabilización o una desestabilización. Pero, a la vez, parte de los efectos en la cadena polipeptídica pueden transmitir una sutil tensión o alteración en el centro de Cu, afectando a su estabilidad. Por tanto, la estabilidad final de las holoproteínas, oxidadas o reducidas, se Material Suplementario 256 8.1. Material Suplementario 1: Difusión de resultados y publicaciones 8.1.1. Publicaciones en revistas Frutos-Beltrán, E., J. Olloqui, M. Engel, A. Guerra-Castellano, J.J. Calvente, M. A. De la Rosa, R. Andreu, A. Wagner, A. Díaz-Quintana (2015). Interplay between the copper site and the remote east patch in plastocyanin. (en preparación). Olloqui-Sariego, J.L., Frutos-Beltrán, E., Roldán, E., Calvente, J.J., Díaz-Quintana, A., Andreu R. (2012). Voltammetric Study of the Adsorbed Thermophilic Plastocyanin from Phormidium Laminosum. Electrochem. Commun., 19, 105-107. Doi: 10.1016/j.elecom.2012.03.012. Muñoz-López, F.J., Frutos Beltrán, E., Díaz-Moreno, S., Díaz-Moreno, I., Subías, G., De la Rosa, M.A. y Díaz-Quintana, A. (2010) Modulation of copper site properties by remote residues determines the stability of plastocyanins. FEBS Lett. 584, 2346-2350. doi:10.1016/j.febslet.2010.04.013. Díaz-Moreno, I., Muñoz-López, F.J., Frutos-Beltrán, E., De la Rosa, M.A. y Díaz-Quintana, A. (2009). Electrostatic Strain and Concerted Motions in the Transient Complex between Plastocyanin and Cytochrome f from the Cyanobacterium Phormidium laminosum. Bioelectrochemistry 77, 43-52. doi:10.1016/j.bioelechem.2009.06.003. 8.1.2. Comunicaciones a congresos Frutos-Beltrán, E., Muñoz López, F.J., De la Rosa, M.A. y Díaz Quintana, A. Mejora de la Estabilidad Térmica de la Plastocianina de Synechocystis sp. PCC 6803. XXXII Congreso de la SEBBM. Oviedo, 2009 Material Suplementario 257 Frutos-Beltrán, E., Díaz-Moreno, I., Muñoz-López, F.J., Hervás, M., Navarro, J.A., De la Rosa, M.A. y Díaz Quintana, A. Improvement of the Thermostability of Plastocyanin from Synechocystis sp. PCC 6803 by Site Mutations. Workshop on Understanding Transient Interactions in Biology. Sevilla, 2010. Frutos-Beltrán, E., De la Rosa, M. A. y Díaz-Quintana, A.The specific Hbonding and packing at the interface between the -barrel and site 2 are responsible for the different stability of mesoand thermophilic plastocyanins. IV Spanish Portuguese Biophysical Congress. Zaragoza, 2010. Frutos-Beltrán, E., Díaz Moreno, S., Chaboy Nalda, J., Wagner, A., Díaz Moreno, I., Muñoz López, F., Raugei, S., Carloni, P., De la Rosa, M.A. & Díaz Quintana, A. Modulation of a single copper-ligand bond by remote residues determines the stability of plastocyanins. IV Spanish Portuguese Biophysical Congress. Zaragoza, 2010. Díaz-Quintana, A. Wagner, I. Díaz-Moreno, E. Frutos-Beltrán, M. A. De la Rosa, J. Chaboy y S. Díaz-Moreno. Metal-protein interplay in protein function and stability. XXII Congress and General Assembly or the International Union of Crystallography. IUCr. Madrid, 2011. Material Suplementario 258 8.2. Material Suplementario 2: Seguimiento del desplegamiento proteico de la Pc reducida mediante DSF Figura TMS 1. Espectros de desnaturalización de la forma reducida de Syn-Pc mediante DSF. 8.3. Material Suplementario 3: Seguimiento del desplegamiento proteico de la apo-Pc mediante DSF y espectroscopía de fluorescencia Figura TMS 2. Captura de pantalla de los espectros de desnaturalización de la apo-Pc de Syn-Pc mediante DSF. Material Suplementario 259 Figura TMS 3. Ejemplos del espectro de emisión de fluorescencia y de la curva de desnaturalización de la apo-Pc de Syn-Pc mediante espectroscopía de fluorescencia. A) Espectro de emisión de fluorescencia de la apo-Pc de Syn-Pc en su estado nativo (azul) y desplegado (rojo). Las muestras fueron excitadas a 275 nm. B) Curva de desnaturalización de la apo-Pc de Syn-Pc. Las muestras fueron excitadas a 275 nm y el desplegamiento se monitorizó siguiendo el incremento de fluorescencia a 355 nm, tal como se explica en materiales y métodos. 8.4. Material Suplementario 4: Cristalización y obtención de la estructura cristalográfica de Syn-A44D/D49P/A62L 8.4.1. Obtención de los cristales Los cristales de Syn-A44D/D49P/A62L crecieron tras 24 horas de incubación a 19°C (figura TMS 4), independientemente del método de difusión usado (gota colgante o sentada), mientras que a 4°C sólo se observó precipitación proteica. De la misma forma tampoco parecía influir en los resultados el volumen de las gotas. Material Suplementario 260 gota colgante gota sentada temperatura ambiente temperatura ambiente Figura TMS 4. Cristales obtenidos para el triple mutante SynA44D/D49P/A62L de la plastocianina. Los cristales crecieron tanto en condiciones de gota colgante (hanging drop) como en gota sentada (sitting drop) en presencia de 3,2 M de sulfato amónico en 0,1M de tampón fosfato sódico pH 7 como solución precipitante, y a una temperatura de incubación de 19°C. La concentración de Pc usada fue de 10 mg ml -1 , en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7. 8.4.2. Colección de datos de difracción y procesamiento. Figura TMS 5. Alineamiento de las estructuras cristalográficas del mutante Syn-A44D/D49P/A62L ya publicada (1PCS.pdb,(Romero et al., 1998)) y la obtenida en este trabajo. Material Suplementario 261 Tabla TMS 1 Parámetro Valor Grupo espacial P3 2 21 Dimensiones de la celdilla unidad a (Å); b (Å);c (Å) α (º); β (º); γ (º) 34,10; 34,10; 110,46 90,00; 90,00, 120,00 Rango de resolución (Å) 1,513 – 29.531 (1.5821 -1.5132) R work /R free 0,1498/0,1885 Nº de átomos proteína solvente SO 4 800 124 5 Wilson B-factor (Å 2 ) 10,49 Residuos en Ramachandran plot Favorables Valores atípicos 72 (88,9%) 0 (0,0 %) Material Suplementario 262 8.5. Material Suplementario 5: condiciones de cristalización de Pho-P49G/G59P y gotas resultantes Test 1: Aunque las condiciones de cristalización de Pho-Pc y algunos de sus mutantes descritos en la bibliografía [Bond et al., 1999; Crowley et al., 2008] implicaban el uso de cacodilato sódico 0,1 M como tampón, la no disposición del mismo llevó el empleo de un tampón alternativo. Se decidió usar el mismo empleado en la bibliografía para el mutante SynA44D/D49P/A62L: fosfato sódico potásico 0,1 M, pH 6,5. Por ello, las condiciones de partida fueron: gota con 1 μl proteína oxidada 10 mg ml - 1 en MES 0,1 M pH 6,5 mezclada con 1μl de solución precitante. En cada pocillo se depositó 1 ml de solución precipitante. En la tabla TMS 1 se detallan las composiciones de las diferentes soluciones precipitantes usadas en este test. Test 2: Condiciones experimentales de los ensayos de cristalización para Pho-P49G/G50P correspondientes a condiciones del kit “Crystal screen HR2-110” de Hampton Research. Se eligieron aquellas condiciones que o contuvieran cacodilato sódico como tampón o una composición similar a los detallados en la bibliografía para la cristalización de Pho-Pc o alguno de sus mutantes [Bond et al., 1999; Crowley et al., 2008]. Sigiendo las directrices del fabricante se mezclaron 2 μl proteína oxidada 10 mg ml -1 l en agua con 2 μl de solución precitante. En cada pocillo se depositó 1 ml de solución precipitante. En la tabla TMS 2 se detallan las composiciones de las diferentes soluciones precipitantes usadas en este test. Como era de esperar, las mejores condiciones resultaron ser aquellas que contenían Polientilenglicol como solución precipitante y cacodilato sódico trihidrato pH 6,5 como tampón, tal como indica la bibliografía para otros mutantes y la forma silvestre [Bond et al., 1999; Crowley et al., 2008]. Material Suplementario 263 Tabla TMS 2. Composiciones de las soluciones precipitantes usadas en el test 1 de cristalización de Pho-P49G/G50P. Sal Buffer Precipitante Gota 0,2 M Cloruro de magnesio 0,1 M Fosfato de Sorenser, pH 6,5 15% (p/v) PEG 8,0 Cristal de sal (no se tiñe con azul de metileno o Izit) 0,2 M Acetato de zinc 0,1 M Fosfato de Sorenser, pH 6,5 10% (p/v) PEG 8,0 Precipatación de proteína y posible cristal amorfo Test 3: Basándonos en los resultados del Test 2 se decidió testar diferentes concentraciones de polientileglicol (PEG) 8000 (entre 8 y 18 %) y de pH.(entre 5,5 y 6,5). Las condiciones fueron: gota con 1 μl proteína oxidada 10 mg ml -1 en MES 0,1 M pH 6,5 mezclada con 1μl de solución precitante. En cada pocillo se depositó 1 ml de solución precipitante. No se obtuvieron resultados concluyentes de este test. Material Suplementario 264 Tabla TMS 3. Composiciones de las soluciones precipitantes usadas en el test 2 de cristalización de Pho-P49G/G50P. todas las condiciones pertenecen al kit “Crystal screen HR2-110” de Hampton Research. Sal Buffer Precipitante Gota Condición nº 7 0,1 M Cacodilato sódico trihidrato, pH 6,5 1,4 M, Acetato sódico trihidrato Clara Condición nº 8 0,2 M sodium citrate tribasico dihidrato 0,1 M Cacodilato sódico trihidrato, pH 6,5 30% (v/v) 2-propanol Clara Condición nº 15 0,2 M Sulfato amónico 0,1 M Cacodilato sódico trihidrato, pH 6,5 30% (p/v) PEG 8000 Buena precipitación proteica Condición nº 18 0,2 M Acetato de magnesio tetrahidrato 0,1 M Cacodilato sódico trihidrato, pH 6,5 20% (p/v) PEG l 8000 Buena precipitación proteica Material Suplementario 265 Sal Tampón Precipitante Gota Condición nº 21 0,2 M acetato de magnesio tetrahidrato 0,1 M cacodilato sódico trihidrato, pH 6,5 30% (v/v) (+/-)2Metil-2,4pentanodiol Separación de fase Condición nº 25 0,1 M Imidazol pH 6,5 1,0 M acetato sódico trihidrato Clara Condición nº 28 0,2 M acetato sódico trihidrato 0,1 M cacodilato sódico trihidrato, pH 6,5 30% (p/v) PEG 8000 Clara Condición nº 30 0,2 m sulfato amónico 30% PEG 8000 Mala precipitación proteica Una tesis no se termina, se abandona