Preparación de conjugados alérgeno-adyuvante para el desarrollo de vacunas sintéticas

PREPARACIÓN DE CONJUGADOS ALÉRGENO-ADYUVANTE PARA EL DESARROLLO DE VACUNAS SINTÉTICAS Jorge Losada Méndez Sevilla, 2021 Instituto de Investigaciones Departamento de Químicas Química Orgánica Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja PREPARACIÓN DE CONJUGADOS ALÉRGENO-ADYUVANTE PARA EL DESARROLLO DE VACUNAS SINTÉTICAS Memoria presentada por el Graduado Jorge Losada Méndez para optar al Grado de Doctor en Química Sevilla, 2021 Dr. Francisco Javier Rojo Marcos, Investigador Científico (CSIC). CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado “Preparación de conjugados alérgenoadyuvante para el desarrollo de vacunas sintéticas” ha sido realizado bajo mi dirección y asesoramiento en los laboratorios del Instituto de Investigaciones Químicas (CSICUniversidad de Sevilla) del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja, constituyendo la Memoria que presenta el Graduado Jorge Losada Méndez para optar al grado de Doctor en Química. Sevilla, 2021 Fdo.: Francisco Javier Rojo Marcos Director del trabajo El presente trabajo ha sido realizado por Jorge Losada Méndez con un contrato asociado al proyecto RD16/0006/0011, Instituto de Salud Carlos III, Red ARADyAL, en el Laboratorio de Glicosistemas del Instituto de Investigaciones Químicas (CSICUniversidad de Sevilla) bajo la dirección del Dr. Francisco Javier Rojo Marcos. El trabajo ha sido tutelado por la Profesora María del Carmen Ortiz Mellet en el marco del Programa de Doctorado en Química de la Universidad de Sevilla. Fdo.: Jorge Losada Méndez Fdo.: Francisco Javier Rojo Marcos Fdo.: María del Carmen Ortiz Mellet Director del trabajo Tutora del trabajo Agradecimientos Atención, esta sección puede contener trazas de historias emotivas, leer con precaución. Echar la vista atrás para recordar todo lo sucedido en estos últimos cuatro años en el que se ha desarrollado esta Tesis Doctoral me hace recordar y agradecer a todos los miembros del grupo de investigación en el que se ha desarrollado y a la gente que realmente ha contribuido a llevarla a cabo, muchas veces de una forma no científica. En primer lugar, me gustaría agradecer al Dr. Francisco Javier Rojo Marcos la oportunidad que me brindó al permitir unirme a su grupo de investigación, así como la confianza depositada para poder desarrollar investigaciones por mí mismo y trabajar con autonomía. Sin olvidar tampoco, su gran hospitalidad en las barbacoas celebradas en su casa, dónde nunca faltaron las risas regadas con excelentes vinos. A la profesora María del Carmen Ortiz por aceptar ser la tutora de esta Tesis Doctoral. A la Red ARADyAL por la financiación, por todo lo aprendido en mis numerosos viajes a Madrid para asistir a sus reuniones y las colaboraciones realizadas en los ensayos biológicos, especialmente a la Dra. Cristobalina Mayorga y la Dra. Francisca Palomares. A los miembros de mi grupo de investigación, con los que compartí una ingente cantidad de horas en el laboratorio. No puedo evitar destacar a mis dos principales compañeros de laboratorio que se convirtieron en grandes amigos (los Mosqueteros!), está claro que esto sólo pudo ser pura química. A Antonio Di Maio, por todo lo que aprendí de él, su voluntad inquebrantable hacia los amigos, nuestras numerosas conversaciones desde mecánica de bombas de vacío a historia clásica griega, compartimos buenos tiempos trabajando y estoy convencido que continuarán en el futuro, aunque nos separen países independizados de la UE o la Ronda de Triana. A Pedro Domínguez, por darme siempre calma, su gran corazón e instruirme sobre finanzas, gracias por estar siempre dispuesto a compartir una buena comida y una buena música. A ti pude disfrutarte algo más de tiempo, ya que volviste al laboratorio, renacido como post-doc. Adicionalmente, gracias por permitirme conocer a Anna e Inma, con las que compartimos buenos momentos juntos. A Noelia, otra gran compañera, por mostrarme el sacrificio, la dedicación de un trabajo bien hecho y tu gran disponibilidad para ayudar siempre que fuera necesario. Está claro que solo podías venir de tierras palentinas. Abreviaturas, Siglas y Acrónimos μg Microgramo μL Microlitro μM Micromolar Ac Acetilo ACN Acetonitrilo ADN Ácido desoxirribonucleico AIT Inmunoterapia específica con alérgenos Anh. Anhidro APC Célula presentadora de antígeno Ar Aromático ARADyAL Red de Asma, Reacciones Adversas y Alérgicas ARN Ácido ribonucleico Asc Ascorbato Células B Células B específicas derivadas de la médula ósea BCR Receptores de células B Boc tert-Butiloxicarbonilo BODIPY Boro-dipirrometeno Bu Butilo CD Clúster de diferenciación CITIUS Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrreUniversidad de Sevilla CLR Lectina tipo C CRD Dominio de reconocimiento de carbohidratos CuAAC Cicloadición 1,3-dipolar entre alquinos y azidas catalizada por k Cu(I) Cuant. Cuantitativo CTL Linfocito T citotóxico CpG Motivos citosina desmetilada-guanosina de ADN DC Célula dendrítica DCC N,N’-diciclohexil carbodiimida DCM Diclorometano DC-SIGN Lectina no integrina presente en células dendríticas que k reconoce ICAM-3 selectivamente DIPEA N,N’-diisopropiletilamina DMF N,N’-dimetilformamida DMEN N,N´-dimetiletilendiamina DMSO Dimetilsulfóxido DOX Doxorrubicina DTX Docetaxel DPTS p-Toluensulfonato de (N,N´-dimetilamino)piridinio ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas EPIT Inmunoterapia epicutánea ESI-MS Espectrometría de masas con ionización por electrospray Et Etilo et. al. et alii (locución latina, traducido como “y otros”) EtOAc Acetato de etilo FDA Administración de alimentos y medicamentos Fmoc Fluorenilmetoxicarbonilo g Gramo GDP Glicodendropéptido h Hora HATU Hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3ddddddddddddddddddd tetrametiluronio HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia HRMS Espectrometría de masas de alta resolución HSQC Correlación heteronuclear de nivel cuántico individual HTS Cribado de alta eficacia IC50 Concentración para una inhibición del 50% ICAM-3 Molécula de adhesión intercelular-3 IFN Interferón Ig Inmunoglobulina IgE Inmunoglobulina específica IL Interleucina o interleuquina J Constante de acoplamiento K Kelvin kDa Kilodalton L Litro LBP Proteína de unión a lipopolisacáridos LPS Lipopolisacárido LRR Repeticiones ricas en leucina LTC4 Leucotrieno C4 LTD4 Leucotrieno D4 LTP Proteína transportadora de lípidos M Molaridad m/z Relación masa/carga MALDI-TOF Desorción/ionización láser asistida por matriz con detección tttttttttttttttttttttttttttttttttttt por tiempo de vuelo MAPS Sistemas múltiples de péptidos antigénicos MD-2 Factor de diferenciación mieloide 2 Me Metilo mg Miligramo MHC Complejo mayor de histocompatibilidad MHz Megahercio min Minuto mL Mililitro mM Milimolar mmol Milimol moDC DCs derivadas de monocitos MPL Lípido A monofosforilado MR Receptor de manosa MS Espectrometría de masas MW Microondas MWCO Límite de peso molecular MyD88 Factor de diferenciación mieloide 88 NBS N-bromosuccinimida NHS N-hidroxisuccinimida Células NK Células naturales asesinas nM Nanomolar ODN Oligodesoxirribonucleótido OIT Inmunoterapia oral OMS Organización Mundial de la Salud OVA Ovoalbúmina PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos PBS Tampón fosfato salino PBMC Célula mononuclear de sangre periférica PEG Polietilenglicol Ph Fenilo PI Índice de proliferación ppm Partes por millón PRRs Receptores de reconocimiento de patrones PTX Paclitaxel Keq Constante de equilibrio Rf Factor de retención RMN Resonancia magnética nuclear RP Fase reversa SAR Relación estructura-actividad SCIT Inmunoterapia subcutánea SFN Sulforafano SLIT Inmunoterapia sublingual rpm Revoluciones por minuto SPAAC Cicloadición 1,3-dipolar entre ciclooctinos y azidas ñlllllllllllllllllllllllllllllllllllllllpromovida por la tensión SNAr Sustitución nucleófila aromática SPPS Síntesis de péptidos en fase sólida t Tiempo Células T Células T derivadas del timo t.a. Temperatura ambiente TBAF Fluoruro de tetrabutilamonio TBAI Yoduro de tetrabutilamonio TBTA Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]aminatert-butilo TC Linfocitos T citotóxicos TCR Receptores de células T TES Trietilsililo TFA Ácido trifluoroacético TH Linfocitos T colaboradores THF Tetrahidrofurano TIPS Triisopropopilsililo TLC Cromatografía en capa fina TLR Receptor de tipo Toll TMS Trimetilsililo TNF Factor de necrosis tumoral Treg Linfocito T regulador TRIF Adaptador que contiene el domino TIR inductor de fffffffffffffffffffffffffffffffff interferón-β UHPLC Cromatografía líquida de ultra alta eficacia UV Ultravioleta Vis. Visible Índice 1. Introducción 1 1.1. La Alergia 1 1.1.1. Alergia alimentaria 4 1.2. El sistema inmune 6 1.2.1. Leucocitos 8 1.2.1.1. Linfocitos 9 1.2.2. Células Dendríticas: Entre la Inmunidad Innata y la Inmunidad Adaptativa 15 1.2.2.1. DC-SIGN 17 1.2.2.2. Receptores de tipo Toll (TLRs) 19 1.3. Inmunoterapia 21 1.3.1. Péptidos sintéticos en el desarrollo de vacunas contra la alergia 25 1.3.2. El papel de los adyuvantes en las vacunas 27 2. Objetivos 33 3. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 37 3.1. Introducción 37 3.2. TLR4 como diana terapéutica en alergia 38 3.2.1. Ligandos lipídicos de TLR4 39 3.2.2. Ligandos no lipídicos de TLR4 42 3.3. Objetivos 47 3.4. Síntesis del ligando de TLR4 47 3.5. Conjugación del ligando de TLR4 a distintos péptidos alergénicos 59 3.6. Evaluación biológica de los conjugados péptido-pirimido[5,4-b]indol 65 4. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 75 4.1. Introducción 75 4.2. TLR7 como diana terapéutica en alergia 78 4.2.1. Ligandos de TLR7 79 4.3. Objetivos 83 4.4. Síntesis del ligando de TLR7 84 4.5. Conjugación del ligando de TLR7 a distintos péptidos alergénicos 96 4.6. Evaluación biológica de los conjugados péptido-8-oxoadenina 104 5. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alérgenos y estudio de su actividad biológica 117 5.1. Introducción 117 5.2. Combinación covalente de agonistas de TLR 120 5.2.1. 1,3,5-Triazinas como plataformas 123 5.3. Objetivos 127 5.4. Síntesis de homodímeros de TLR4, TLR7 y del heterodímero (TLR7/TLR4) conjugados al péptido Pru p 3 128 5.4.1. Síntesis de homodímeros de ligandos de TLR4 y 7 a partir de triazinas bifuncionales 129 5.4.2. Síntesis del heterodímero de ligandos de TLR4 y TLR7 a partir de triazinas trifuncionales 149 5.5. Conjugación de los dímeros de ligandos de TLR con el péptido de Pru p 3 163 5.6. Evaluación biológica de los conjugados dímero-péptido 169 6. Síntesis de conjugados alérgeno-glicodendrón y estudio de su actividad biológica 177 6.1. Introducción y antecedentes 177 6.2. Objetivos 194 6.3. Estudios complementarios de glicodendrones conjugados 194 6.4. Presentación de moléculas de interés terapéutico o drug delivery 201 6.4.1. Espaciadores sensibles al medio ácido 205 6.5. Síntesis de glicodendrones con un espaciador sensible al medio ácido 208 6.6. Conjugación del péptido de Pru p 3 al glicodendrón con un espaciador de tipo hidrazona 230 6.7. Evaluación biológica del conjugado con un espaciador de tipo hidrazona 232 7. Conclusiones 237 7.1. Capítulo 3 237 7.2. Capítulo 4 237 7.3. Capítulo 5 238 7.4. Capítulo 6 238 8. Experimental section 243 8.1. Reagents, solvents and analytical techniques 243 8.2. Synthesis of TLR4 ligand conjugates 245 8.3. Synthesis of TLR7 ligand conjugates 253 8.4. Synthesis of TLR ligand dimer conjugates 262 8.5. Synthesis of conjugated glycodendrons 284 8.6. Evaluation of hydrazone 62 hydrolysis at different pH 293 8.7. Biological assays 294 8.7.1. Allergic patients and torelant controls 294 8.7.2. Generation of moDCs 294 8.7.3. Florescent labelling of Pru p 3 conjugates 295 8.7.4. Studies by flow cytometry and confocal microscopy 295 8.7.5. moDC maturation studies 296 8.7.6. Specific proliferative response of different cell subpopulations 296 8.7.7. Cytokine determination 297 8.7.8. Statistic 297 Appendix 1. Selection of spectra and chromatograms 301 Appendix 2. Structure and abbreviations of essential amino 33 acids 323 Capítulo 1 4 1.1.1. Alergia alimentaria Como se ha comentado previamente, una de las fuentes de origen de alérgenos son los alimentos. Se estima que del 4-8% de la población mundial tiene al menos algún tipo de alergia alimentaria. 15 Las tasas de alergia alimentaria varían según la edad, la dieta, la región y muchos otros factores. Son más comunes en niños que en adultos y se observa un incremento en la frecuencia. Un informe de 2008 del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades señala un aumento del 18% en la alergia alimentaria infantil en el periodo de 1997 a 2007. 16 Aunque una alergia puede ser provocada por prácticamente cualquier alimento, los responsables de las reacciones más importantes son la leche, el huevo, los frutos secos, el cacahuete (no es un fruto seco, sino una legumbre), los mariscos, los pescados, el trigo y la soja. A menudo, se hace referencia a ellos como “los ocho grandes alérgenos”. Por el contrario, la alergia a los aditivos y conservantes alimentarios es generalmente poco común. 17 La alergia alimentaria puede ser confundida fácilmente con otros trastornos que también involucran alimentos y provocan síntomas iguales o parecidos. La intolerancia alimentaria y la intoxicación alimentaria son afecciones distintas, cuyo origen no se debe a una respuesta inmunitaria. 18 En particular, la intolerancia alimentaria puede ser especialmente difícil de diferenciar de la alergia, que se distingue de ésta en que el tiempo de aparición de los síntomas desde la exposición al alimento suele ser mayor. 19 Otra diferencia es que las intolerancias suelen estar ocasionadas por la ausencia de enzimas o mecanismos digestivos, por ejemplo, la intolerancia a la lactosa se debe a la ausencia de la enzima lactasa, lo que impide descomponer el disacárido de lactosa (el azúcar de la leche), provocando síntomas gastrointestinales. 20 Es importante no confundir con la alergia a la leche, que es ocasionada por una o varias proteínas presentes en la misma que actúan como alérgenos. La OMS recomienda denominar a las comúnmente llamadas intolerancias, como hipersensibilidad alimentaria no alérgica. 21 (Esquema 1.1.) 15 Sicherer, S.H.; Sampson, H.A.; J. Allergy Clin. Immunol. 2014, 133, 291-307. 16 Branum, A.M.; Lukacs, S.L.; NCHS. Data Brief 2008, 10, 1-8. 17 Randhawa, S.; Bahna, S.L.; Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2009, 9, 278-283. 18 Sicherer, S.H.; Sampson, H.A.; J. Allergy Clin. Immunol. 2014, 133, 291-307. 19 Ozdemir, O.; Mete, E.; Catal, F.; Ozol, D.; Dig. Dis. Sci. 2009, 54, 8-14. 20 Heine, R.G.; et al.; World Allergy Organ. J. 2017, 10, 41-50. 21 Johansson, S.G.O.; et al.; J. Allergy Clin. Immunol. 2004, 113, 832-836. Introducción 5 Esquema 1.1. Representación de los tipos de hipersensibilidad alimentaria. El proceso de desaparición de la alergia alimentaria ha sido estudiado recientemente. 22 En general, las alergias alimentarias a la leche, el huevo, el trigo y la soja suelen resolverse por sí mismas durante la infancia, mientras que las alergias al cacahuete, los frutos secos, el pescado y los mariscos son persistentes. Es importante destacar también que la alergia a los alimentos está influida por el grado de cocción de los mismos. Generalmente, una mayor cocción se relaciona con una mayor tolerancia a dicho alimento, ya que da lugar a la degradación de sus proteínas, entre las que se encuentran los alérgenos. 23 Por ejemplo, en un estudio del 2012 se observó que la mayoría de los niños con alergia al huevo pueden tolerar alimentos que contienen huevo en productos de panadería, entre otros, si son procesados térmicamente. 24 Sin embargo, hay que remarcar que los procesos térmicos no afectan por igual a todos los alérgenos alimentarios, ni eliminan por completo el riesgo de sufrir una reacción alérgica. También se han realizado una gran cantidad de estudios relacionando diferentes alergias en un mismo paciente. 25 Por ejemplo, las reacciones alérgicas a frutas suelen estar asociadas con el síndrome polen-fruta-verdura, desencadenado por el consumo de verduras crudas o frutas frescas. Esto se atribuye comúnmente a proteínas homólogas de 22 Burks, A.W.; et al.; J. Allergy Clin. Immunol. 2012, 129, 906-920. 23 Chandan, R.C.; Kilara, A.; Dairy Ingredients for Food Processing, 2011, Wiley-Blackwell. 24 Leonard, S.A.; et al.; J. Allergy Clin. Immunol. 2012, 130, 473-480. 25 Hassan, A.K.G.; Venkatesh, Y.P.; Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol. 2015, 47, 180-187. Hipersensibilidad alimentaria Alergia alimentaria Leche Huevo Cacahuete Hipersensibilidad alimentaria no alérgica Intolerancia a la lactosa Intolerancia a la fructosa Capítulo 1 6 reactividad cruzada que se encuentran en los alimentos vegetales y en el polen. Dado que los distintos epítopos de las proteínas se encuentran en todo el reino vegetal, la aparición de diferentes alérgenos vegetales con estructuras similares no es sorprendente. En un estudio llevado a cabo en Inglaterra en 274 adultos alérgicos al menos a un tipo de polen (abedul, hierba y/o artemisa), el 34% resultó también sensibles a la manzana, el 25% a la patata, el 23% a la zanahoria y el apio, el 22% al melocotón y el 16% al melón. 26 Además, se observó una gran variabilidad con la región geográfica, por ejemplo, el melocotón es la fruta más común que causa alergia en España. 27 En los países del área mediterránea se ha observado la incidencia en alergias a frutas de la familia de las rosáceas que incluyen, melocotón, manzana, pera y almendra, siendo las dos primeras las más mayoritarias. Sus alérgenos están relacionados con un grupo de proteínas vegetales conocidas como proteínas transportadoras de lípidos (LTPs, del inglés Lipid Transfer Proteins). 28 Concretamente, en una serie de estudios sobre esta familia, se ha demostrado que el melocotón es el primer alimento desencadenante que se asocia posteriormente con otras frutas de las rosáceas como la manzana, debido a la gran reactividad cruzada de sus alérgenos, denominados panalergenos. 29 1.2 El sistema inmune En este apartado se hace una revisión de los aspectos más importantes relacionados con el sistema inmunitario, ya que resulta fundamental para poder comprender los mecanismos implicados en las reacciones alérgicas, así como los tratamientos terapéuticos de las mismas. El sistema inmune humano agrupa una gran cantidad de células, tejidos y órganos repartidos por todo el organismo. Su función es el reconocimiento y la generación de la correspondiente respuesta frente agentes externos, llamados antígenos, que en el caso de la alergia son los denominados alérgenos. El término antígeno originalmente se atribuía a una molécula capaz de promover la producción de anticuerpos específicos, pero 26 Bircher, A.J.; Van Melle. G.; Haller, E.; Curty, B.; Frei, P.C.; Clin. Exp. Allergy 1994, 24, 367-74. 27 Cuesta-Herranz, J.; et al.; J. Allergy Clin. Immunol. 1999, 104, 688-694. 28 García-Casado G.; et al.; J. Allergy Clin. Immunol. 2003, 112, 599-605. 29 Asero R., Pravettoni V.; Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2013, 13, 379-385. Introducción 7 actualmente su significado es más completo y agrupa a cualquier molécula que pueda ser reconocida por el sistema inmune. Las respuestas del sistema inmunitario pueden dividirse en dos grupos: las innatas o no específicas y las adaptativas o adquiridas. 30 (Figura 1.2.) Figura 1.2. Inmunidad innata y adaptativa, en función de sus componentes y del tiempo. Abreviaturas: DCs (Células dendríticas) y NK (Células asesinas naturales). Imagen modificada de la referencia 30.  La respuesta inmune innata proporciona la primera respuesta frente a los agentes externos o incluso antes de que exista este contacto. Se puede clasificar en función del tipo de barrera: mecánica (la piel y las mucosas), química (moléculas como las defensinas, lisosomas, pH y enzimas digestivas) y biológica (flora intestinal). Por tanto, esta respuesta frente a patógenos destaca por ser genérica. 31  La respuesta inmune adaptativa transcurre después de la anterior y destaca porque está mediada por linfocitos con receptores específicos para antígenos. Por lo tanto, es una respuesta altamente específica y es la parte que proporciona la adaptación. 30 A. A. Abbas, A. H. Lichtman, S. Pillai; Cellular and Molecular Immunology, 2017, 9th Edition, Elsevier. 31 Alberts, B. et al.; Molecular Biology of the Cell, 2002, 4th Edition, Elsevier. Capítulo 1 8 Esto se debe a que, tras sucesivas exposiciones al antígeno, las respuestas inmunes mejoran tanto en intensidad como en tiempo, es la llamada memoria inmunológica que es la base de la vacunación. Esta respuesta es posible debido a dos activaciones bien diferenciadas. Por un lado, la inmunidad humoral mediada por linfocitos B y anticuerpos y por otro, la inmunidad celular mediada por linfocitos T. 32 A pesar de que el sistema inmune da lugar a estas respuestas bien diferenciadas, existe una gran cooperación y modulación entre ellas para la protección del organismo. 1.2.1 Leucocitos Los leucocitos, también denominados glóbulos blancos, nombre dado debido a la ausencia de pigmentos, son un conjunto heterogéneo de células sanguíneas mediadoras de la respuesta inmunitaria y que, por tanto, participan en la defensa del organismo frente a los agentes patógenos. Formados en la médula ósea a partir de células madre hematopoyéticas, tienen la característica de ser las únicas células sanguíneas que se encuentran tanto en la sangre como en el sistema linfático. 33 Su recuento suele encontrarse en valores entre 4.000-11.000 leucocitos por microlitro y un aumento de estos valores es un claro indicio de una infección en el organismo. 34 Existen cinco tipos de leucocitos, clasificados en dos grandes grupos: los agranulocitos (linfocitos y monocitos) que son aquellos que presentan orgánulos en su citoplasma y los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) que son aquellos que carecen de los mismos. 35 (Esquema 1.2.) 32 Cooper. M.D.; Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 191-195. 33 Maton, D., et al.; Human Biology and Health, 1997, Englewood Cliff, Prentice Hall. 34 Hollowell, J.G.; et al.; Vital and Health Statistics Series, 2005, 11, 247-249. 35 Orkin, S.H.; Zon, L.I.; Cell 2008, 4, 712. Introducción 9 Esquema 1.2. Clasificación de los diferentes tipos de leucocitos. 1.2.1.1 Linfocitos Son el principal tipo de leucocitos, circulan por todo el organismo a través del aparato circulatorio y el sistema linfático, provienen de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas de la médula ósea y se desarrollan en diversos órganos linfáticos (timo, bazo, ganglios linfáticos y mucosas), dando lugar a diversos tipos, como se describe a continuación. Células o linfocitos B La activación de este tipo de linfocito tiene lugar en el bazo y los ganglios linfáticos. Destacan por poseer en su membrana celular receptores denominados BCR (del inglés B-Cell Receptor), 36 que poseen una alta especificidad por un único antígeno. Cada linfocito B tiene un solo tipo de BCR haciendo, por tanto, que cada una de las células reconozca un antígeno de forma exclusiva. Cuando se produce este reconocimiento, los linfocitos B se multiplican y secretan grandes cantidades de unas glicoproteínas denominadas anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig). 37 Estos anticuerpos no se unen de forma homogénea al agente externo. De hecho, pueden existir diversos anticuerpos frente a un mismo patógeno, cada uno de los cuales se unirá a un antígeno diferente que forma 36 Owen, J.; Punt, J.; Stranford, S; Jones, P.; Kuby, J.; Kuby Immunology, 2013, 7th Edition, New York: W.H. Freeman and Company. 37 Eisen, H.N.; Siskind, G.W.; Biochemistry 1964, 3, 996-1008. Leucocitos Granulocitos Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Agranulocitos Linfocitos Monocitos Capítulo 1 10 parte de la superficie del mismo. (Figura 1.3) Como se mencionó previamente, la acción de este linfocito se corresponde con la respuesta humoral del sistema inmune. Figura 1.3. Representación de la especificidad de los anticuerpos por sus antígenos (rojo y azul) de un agente externo. Dado que estos anticuerpos son específicos para un solo tipo de antígeno, se denominan monoclonales. Esta adhesión y reconocimiento del antígeno permite su neutralización con la ayuda de otros agentes como neutrófilos, macrófagos y otros fagocitos que se describirán más adelante. Por tanto, una vez eliminada la infección, una fracción de estos linfocitos B persisten como células de memoria, a veces durante el resto de la vida del organismo, y son importantes porque en caso de reinfección del mismo antígeno, la respuesta mediada por anticuerpos es más rápida y eficaz. Este proceso es conocido como memoria inmunológica 38 y es precisamente el proceso que se induce con la vacunación. Células o linfocitos T Estas células se denominan así porque su maduración tiene lugar en el timo. 39 Este proceso de maduración produce una diferenciación en la que se forman linfocitos T CD4+, 38 Airoldi, I.; et al.; Clin. Cancer Res. 2004, 10, 144-154. 39 Hivroz, C.; Saitakis, M.; Front. Immunol. 2016, 7, 46. Introducción 11 también llamados linfocitos T cooperadores o linfocitos TH (del inglés T helper). Este nombre es debido a que estas células por sí mismas no pueden aniquilar una célula infectada o un patógeno, sino que están involucradas en la activación de otras células inmunitarias, por lo tanto, su papel es fundamental en la defensa del organismo. Una vez activadas estas células, se distinguen tres subgrupos principales: las células TH1, cooperan con los macrófagos, potenciando su actuación y las respuestas inflamatorias; las células TH2, que colaboran con la activación de linfocitos B y en la secreción de anticuerpos y son particularmente importantes en el transcurso de reacciones alérgicas, como se hablará más adelante. Por último, las células TH17, que fundamentalmente median en la respuesta de neutrófilos. En el timo también se produce una diferenciación hacia otro tipo de células, los llamados linfocitos T CD8+ o linfocitos T citotóxicos (CTL, del inglés Cytotoxic T Lymphocyte), cuya función es el reconocimiento y eliminación de células infectadas por patógenos. Cabe destacar que los linfocitos T solo reconocen a los antígenos por medio de las células presentadoras de antígeno o APCs (del inglés Antigen-Presenting Cells). 40 Estas células internalizan antígenos extraños por medio de endocitosis y los procesan para presentar moléculas antigénicas sobre su propia membrana en forma de péptidos a través de unas moléculas especializadas llamadas complejo principal de histocompatibilidad o MHC (del inglés Major Histocompatibility Complex). 41 Estas APCs involucran diversos tipos de células del sistema inmunitario algunas de las cuales, así como el proceso de presentación de antígenos, se describirán más adelante. Por lo tanto, una vez presentados estos fragmentos peptídicos por parte de las APCs, estos son reconocidos por los linfocitos T a través de sus receptores específicos, denominados TCR (del inglés T Cell Receptor), iniciándose su activación (TH1, TH2 y TH17). Adicionalmente, existe otra subpoblación de linfocitos T conocidos como células T reguladoras o Treg que tiene un papel fundamental en las enfermedades autoinmunes y en la alergia. 42 Estos linfocitos suprimen la actividad del sistema inmune por medio de la actuación sobre los linfocitos TH y las APCs siendo, por lo tanto, fundamentales para el 40 Wang, J.-H.; Reinherz, E.L.; Immunol. Rev. 2012, 250, 102-119. 41 Yokosuka, T.; Saito, T.; Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2010, 340, 81-107. 42 Agarwal, A.; Singh, M.; Chatterjee, B.P.; Chauhan, A.; Chakraborti, A.; Int. J. Pediatr. 2014, 636238. Capítulo 1 12 mantenimiento de la homeostasis y la generación de tolerancia frente a antígenos. 43 De esta forma, se evita una respuesta exagerada del sistema inmune que podría dañar al propio organismo. Los procesos detallados de cómo se produce esta modulación del sistema inmune no son bien conocidos y continúan bajo una intensa investigación. 44 Células NK Las células NK (del inglés Natural Killer) o células asesinas constituyen el tercer tipo de linfocitos. Su función es la destrucción de células infectadas por patógenos o de células cancerosas por medio de la lisis de las mismas, participando en la respuesta inmunitaria innata, dado que no precisan de antígenos sensibilizantes. 45 Las células NK presentan receptores en su superficie que detectan cambios en el MHC de las células dañadas. Este proceso de reconocimiento de células infectadas frente a células sanas es muy eficaz. El gran control y modulación entre diferentes células del sistema inmune se produce gracias a la secreción por parte de las mismas de citocinas o citoquinas, que son proteínas o glicoproteínas de pequeño tamaño que desempeñan diversas funciones como la regulación de la proliferación y diferenciación celular, la quimiotaxis, la modulación de la secreción de Ig y la regulación del mecanismo de la inflamación. Existen citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias. Las secretadas por los leucocitos se denominan interleucinas o interleuquinas (IL), de las cuales se han identificado 33 (IL-1 a IL-33). 46 Dentro de esta familia de mediadores solubles como son las citoquinas, destaca también otro subgrupo por su importancia, los interferones (IFNs), dado que participan en el proceso de presentación de antígenos, así como en la activación de células NK y de macrófagos (ver a continuación). Las citoquinas poseen características muy marcadas como es su redundancia, muchas citoquinas diferentes comparten funciones análogas; su pleiotropismo, una misma citoquina tiene efectos distintos sobre diferentes células diana; o su antagonismo, el efecto de una citoquina anula o revierte el efecto de otra. Sin embargo, una sobre-estimulación de citoquinas es contraproducente, dado que se puede originar un peligroso síndrome 43 Chen, W.; Immunotherapy 2011, 3, 911–914. 44 Wieczorek G.; et al.; Cancer Res. 2009, 69, 599-608. 45 Xu, Y.; Zhou, S.; Wah Lam, Y.; Pang, S.W.; Front. Immunol. 2017, 8, 998. 46 Schmitz, J.; et al.; Immunity 2005, 23, 479-490. Introducción 13 llamado tormenta de citoquinas, 47 ocasionado por una respuesta exagerada del sistema inmune que puede resultar mortal. Una vez descritos estos linfocitos, es importante destacar el papel que juegan en las reacciones alérgicas, ya que estas están mediadas principalmente por inmunoglobulina específica o IgE, nombre que se debe a que son específicas para cada alérgeno. Como se mencionó anteriormente, las IgE son secretadas por las células B, que a su vez han sido estimuladas por las células TH2, por eso la respuesta alérgica es conocida también como respuesta de tipo TH2. El mecanismo mediado por la IgE consta de dos etapas diferenciadas. (Figura 1.4) Primeramente, al generarse la IgE, esta se adhiere a la superficie de los granulocitos como los mastocitos y los basófilos. 48 , 49 Se dice entonces que los mastocitos y basófilos recubiertos por IgE desarrollan una sensibilización. Es importante remarcar que este proceso no provoca ningún tipo de reacción adversa en el organismo; sin embargo, la exposición posteriormente al mismo alérgeno da lugar a la unión de este a las IgE ya unidas a la superficie celular. Este reconocimiento provoca la ruptura de sus orgánulos, liberando su contenido al exterior, en un proceso que se conoce como desgranulación. Las moléculas liberadas son farmacológicamente activas como la histamina, leucotrienos (LTC4 y LTD4) y prostaglandinas, que actúan sobre los tejidos circundantes provocando la sintomatología clásica de las reacciones alérgicas. 47 Lee, D.W.; Blood 2014, 124, 188-195. 48 Muehling, L.M.; Lawrence, M.G.; Woodfolk, J.A.; J. Allergy Clin. Immunol. 2017, 140, 1523-1540. 49 Noval, R.M.; Burton, O.T.; Oettgen, H.C.; Chatila, T.; J. Allergy Clin. Immunol. 2016, 138, 801-811. Capítulo 1 20 mientras que TLR3, 7, 8 y 9 se expresan en orgánulos intracelulares, principalmente endosomas y en el retículo endoplasmático. Este tipo de receptores están expresados fundamentalmente en macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células epiteliales y células endoteliales. Cada uno de estos receptores reconoce diversos PAMPs de microorganismos o derivados de estos. (Figura 1.7.) Por ejemplo, TLR3 reconoce ARN de doble cadena (dsADN) en virus, TLR4 reconoce lipopolisacáridos (LPS) presentes en bacterias Gram-negativas, TLR7 y TLR8 reconocen ARN monocatenario (ssARN), TLR9 reconoce exclusivamente ADN con motivos CpG no metilados, encontrados en procariotas y virus. 69 Aún no se ha encontrado el PAMP que reconoce el TLR10 humano aunque se sabe que es un receptor funcional. 70 Figura 1.7. Representación de la localización celular de los TLRs humanos y sus PAMPs. Imagen modificada de la referencia 69. Cuando se produce este reconocimiento, estos receptores homodimerizan o heterodimerizan entre ellos, provocando cascadas de señalización con efectos muy variados como la migración y maduración de las DCs y el aumento en la expresión de citoquinas, imprescindibles para la respuesta inmune adaptativa, como por ejemplo IL10, IL-12 y las requeridas para la presentación de antígenos (moléculas MHC-II y 69 Kanzler, H.; Barrat, F.J.; Hessel, E.M.; Coffman, R.L.; Nat. Med. 2007, 13, 552-559. 70 Hasan, U. et al.; J. Immunol. 2005, 174, 2942-2950. Introducción 21 moléculas co-estimuladoras como CD80 y CD86). 71 Como ya se ha comentado anteriormente, las células dendríticas son cruciales en el inicio de la respuesta inmune adaptativa, ya que conducen a la diferenciación de las CD4+ en diferentes fenotipos de células T efectoras (TH1, TH2 o TH17) o reguladoras (Treg). 72 Por lo tanto, la activación de los TLRs es fundamental en el control y modulación de las respuestas del sistema inmune, siendo de gran interés para el tratamiento de enfermedades inmunitarias como la alergia. Este concepto será ampliado más adelante. 1.3 Inmunoterapia Si bien una de las formas de prevenir una reacción alérgica es evitar el contacto con el alérgeno en cuestión, muchas veces esto no es trivial. En el caso de alergias alimentarias es necesario llevar a cabo una dieta restrictiva que evite el alérgeno. Sin embargo, existen problemas asociados como la contaminación cruzada 73 y la presencia de trazas del alérgeno en cuestión suficientes para provocar una reacción. Por otro lado, no es posible evitar satisfactoriamente alérgenos estacionales (como el polen), ácaros o el veneno de himenópteros (abejas, avispas, etc.). Aunque pueden ser administrados antiinflamatorios y antihistamínicos, estos tratamientos únicamente consiguen aliviar temporalmente los síntomas de la alergia. Actualmente, los esfuerzos en la búsqueda de un tratamiento contra las enfermedades alérgicas se centran en la inmunoterapia específica con alérgenos (AIT, del inglés Allergen-specific ImmunoTherapy), siendo este el único tratamiento eficaz hasta el momento. 74 La inmunoterapia consiste en la administración de dosis crecientes del alérgeno causante de la alergia con el objetivo de inducir un efecto protector de inmunidad es decir, generar tolerancia frente al alérgeno en cuestión. El primer estudio sobre inmunoterapia específica se remonta a principios del siglo XX (1911), cuando Noon 75 inyectó un extracto de polen de gramíneas en un paciente cuyos síntomas alérgicos coincidían con la polinización de gramíneas. Noon observó que los 71 Rassa, J.C.; Ross, S.R.; Microb. Infect. 2003, 5, 961-968. 72 Gangloff, S.; Guenounou, M.; Clinic. Rev. Allerg. Immunol. 2004, 26, 115-125. 73 Silvester, J.A.; Graff, L.A.; Rigaux, L.; Walker, J.R.; Duerksen, D.R.; Aliment. Pharmacol. Ther. 2016, 44, 612-619. 74 Incorvaia, C.; Gritti, B.L.; Ridolo, E.; Med. Econ. 2018, 21, 553-555. 75 Noon, L.; Cantab, B.C.; Lancet 1911, 177, 1572-1573. Capítulo 1 22 pacientes inoculados presentaban una mayor resistencia al alérgeno, concluyendo que se generaba una respuesta protectora o inmunidad. Por lo tanto, los tratamientos basados en AIT son considerados vacunas, ya que su finalidad es la generación de inmunidad y tienen un carácter profiláctico. El mecanismo de acción consiste en generar la tolerancia al alérgeno reduciendo la producción de IgE que, como se comentó previamente, es la responsable de la sintomatología alérgica al unirse a mastocitos y basófilos, provocando su desgranulación. Las personas se desensibilizan mediante la administración de dosis crecientes del alérgeno, disminuyendo gradualmente la respuesta dominada por IgE. El objetivo de la inmunoterapia es alejar la respuesta inmune de la inmunidad humoral (mediada por linfocitos B y anticuerpos) y dirigirla hacia la inmunidad celular (mediada por linfocitos T), disminuyendo la producción de anticuerpos IgE y produciendo más células Treg que secretan IFN-γ, IL10 y TNF-β, contrarrestando así la producción de IgE. 76 Por lo tanto, esta modulación se puede resumir como un cambio de respuesta de tipo TH2 (alérgica) hacia una respuesta de tipo TH1 (no alérgica), ya que como se explicó previamente, la diferenciación de los linfocitos colaboradores T CD4+ en linfocitos TH1 o TH2 condicionan el mecanismo de la respuesta inmunitaria. (Figura 1.8) 76 Murphy, K.; Weaver, C.; Janeway´s Immunobiology, 2014, 8th Edition. Introducción 23 Figura 1.8. Representación de los tipos de diferenciación de linfocitos TH1 y TH2 y las citoquinas implicadas. Es importante señalar que el descenso de IgE no implica que el organismo que desarrolla tolerancia (pacientes no alérgicos) no presente ningún anticuerpo específico a los alérgenos, sino que este es de otro tipo llamado IgG, que no da lugar a procesos de inflamación alérgicos al unirse a sus alérgenos. 77 La AIT se aplica usando distintas vías de administración del alérgeno. (Figura 1.9) Las más importantes son: - Inmunoterapia oral (OIT, del inglés Oral ImmunoTherapy): el alérgeno es ingerido vía oral. Esta AIT se ha mostrado efectiva fundamentalmente en el caso de alérgenos ambientales. 78 Aunque esta es la vía de administración más sencilla; sin embargo, no resulta muy efectiva para alérgenos alimentarios, ya que muchos son resistentes a los procesos de digestión y pueden producir graves efectos secundarios. Por lo tanto, esta vía está muy limitada. - Inmunoterapia sublingual (SLIT, del inglés SubLingual ImmunoTherapy): el alérgeno se administra en disolución como gotas que se mantienen debajo de la lengua durante unos minutos, produciéndose la absorción. Esta vía ha sido la más 77 Huang, X.; et al.; Allergy 2018, 73, 421-430. 78 Möller, C.; Dreborg, S.; Lanner, A.; Björkstén, B.; Allergy 1986, 41, 271-279. Capítulo 1 24 estudiada de todas durante los últimos 30 años debido a sus escasos efectos secundarios y su éxito en el tratamiento de la rinitis alérgica. 79 - Inmunoterapia subcutánea (SCIT, del inglés SubCutaneous ImmunoTherapy): el alérgeno se inyecta bajo la piel. Esta vía, que fue de las primeras estudiadas, tiene la ventaja con respecto a las otras que puede usarse con una gran variedad de alérgenos, no indicados para las anteriores, como el veneno de himenópteros; sin embargo, se han detectado algunos efectos secundarios. 80 - Inmunoterapia epicutánea (EPIT, del inglés EpiCutaneous ImmunoTherapy): el alérgeno se administra por absorción a través de la piel, por ejemplo, con el uso de parches. Es una de las vías más recientes, estudiada desde hace 10 años. Su objetivo es ser una evolución de la SCIT, evitando el uso de la inyección. Sin embargo se han encontrado también efectos secundarios y de momento sus resultados no son significativamente mejores que los encontrados en el caso de la SCIT. 81 Figura 1.9. Representación de las diversas vías de administración de la AIT. 79 Passalacqua, G.; Bagnasco, D.; Canonica, G.W.; Allergy 2020, 75, 1107-1120. 80 Dorofeeva, Y.; et al.; Allergy 2021, 76, 131-149. 81 Kim, E.H.; Patel, C.; Burks, A.W.; Expert Rev. Clin. Immunol. 2020, 1, 1-8. Introducción 25 1.3.1 Péptidos sintéticos en el desarrollo de vacunas contra la alergia Todas las vacunas basadas en AIT utilizan extractos alergénicos, conteniendo las proteínas enteras, obtenidos de sus fuentes naturales. Esto provoca enormes diferencias entre las vacunas de las diferentes compañías farmacéuticas. Además, debido a la heterogeneidad de las fuentes naturales, también surgen problemas de reproducibilidad entre diferentes lotes de los extractos. Esta variabilidad de extractos, dependiendo de la pureza y calidad de las fuentes de partida, plantea serios inconvenientes. 82 , 83 En este contexto, el uso de péptidos sintéticos se posiciona como una alternativa eficaz y fiable. 84 Dentro de la estructura proteica del alérgeno se pueden definir diferentes regiones denominadas epítopos. Un mismo alérgeno puede tener diferentes epítopos o un conjunto de epítopos repetidos. La idea que subyace es el empleo de fragmentos sintéticos de estas regiones proteicas, lo que garantiza la reproducibilidad y la monodispersidad de los distintos lotes de vacunas, así como la reducción del riesgo de reacción alérgica, al ser el péptido menos inmunogénico que la proteína entera. Adicionalmente, la generación de estos péptidos de forma sintética abre nuevos e interesantes retos en el diseño racional de vacunas peptídicas, como es la presentación simultánea de diferentes epítopos de un mismo alérgeno o la introducción de aminoácidos no naturales que puedan, entre otras cosas, aumentar la estabilidad del péptido. 85 De los métodos establecidos para la síntesis de péptidos, destaca la síntesis en fase sólida (SPPS, del inglés Solid-Phase Peptide Synthesis), centrada en el trabajo pionero de Merrifield. 86 Este método consiste en el ensamblaje de una cadena peptídica, a través de sucesivas reacciones de derivados de aminoácidos, sobre una resina insoluble funcionalizada con grupos amino o hidroxilo. El procedimiento general de la SPPS consiste en sucesivos ciclos de reacciones alternas de desprotección y acoplamiento Nterminal. (Figura 1.10A) Primero se acopla un aminoácido a la resina, posteriormente, la 82 Focke, M.; Marth, K.; Flicker, S.; Valenta, R.; Clin. Exp. Allergy 2008, 38, 1400-1408. 83 Curin, M.; Reininger, R.; Swoboda, I.; Focke, M.; Valenta, R.; Spitzauer, S.; Int. Arch. Allergy Immunol. 2011, 154, 258-263. 84 Purcell, A. W.; et al.; J. Pept. Sci. 2003, 9, 255-281. 85 Seebach, D.; Beck, A.K.; Bierbaum; D.J.; Chem. Biodivers. 2004, 1, 1111-1239. 86 Merrifield, R.B.; J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154. Capítulo 1 26 amina se desprotege y luego se acopla con el ácido libre del segundo aminoácido. Este ciclo se repite hasta que se sintetiza la secuencia deseada, creciendo la cadena del extremo C-terminal al N-terminal. Al final de la síntesis, el péptido se escinde del soporte sólido mientras que simultáneamente se eliminan todos los grupos protectores usando un ácido fuerte como el ácido trifluoroacético (TFA). El péptido obtenido de esta forma suele purificarse por medio de HPLC de fase reversa (RP-HPLC). 87 La SPPS permite la síntesis de péptidos de hasta 70 aminoácidos con buenos rendimientos. Esta síntesis se puede llevar a cabo de forma eficiente y en relativamente poco tiempo usando los sintetizadores de péptidos comerciales. (Figura 1.10B) 87 Mant, C.T.; et al.; Meth. Mol. Biol. 2007, 386, 3-55. Introducción 27 Figura 1.10. A) Representación esquemática de la SPPS. B) Imagen del sintetizador automático de péptidos Liberty Blue HT12™ (CEM Corporation), uno de los más avanzados del mercado. Uno de los problemas del uso de péptidos sintéticos es su baja inmunogenicidad. Por ello, es necesario combinar su administración con adyuvantes que mejoren la respuesta inmune. 1.3.2 El papel de los adyuvantes en las vacunas Los adyuvantes son todas aquellas sustancias que potencian, aceleran y prolongan la respuesta inmune frente a los antígenos de una vacuna. 88 Entre las ventajas del uso de los adyuvantes cabe destacar: la mejora de la inmunogenicidad de los antígenos; la reducción 88 Sasaki, S.; Okuda, K.; Meth. Mol. Biol. 2000, 29, 241-250. Capítulo 1 28 de la cantidad de antígeno necesaria para alcanzar una inmunización exitosa; la reducción de la frecuencia de inmunización de refuerzo necesarias; y una mejor respuesta inmune en ancianos y pacientes inmunodeprimidos. Los adyuvantes se han utilizado como aditivos en las vacunas durante décadas. Actualmente, solo hay cuatro compuestos aprobados que se usan como adyuvantes en la AIT: hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, tirosina microcristalina y el Lípido A monofosforilado (MPL). 89 Los tres primeros tienen una función principalmente de liberación lenta y prolongada del antígeno, siendo el hidróxido de aluminio el más utilizado desde hace casi un siglo. 90 En cuanto al MPL, es considerado un adyuvante de “segunda generación”, ya que tiene una función inmunomoduladora. El MPL es un derivado de los LPS, que como se comentó previamente, es el PAMP natural del TLR4. Concretamente, el MPL es el primer adyuvante aprobado basado en un agonista de TLR. 91 Además, desde 1999 los pacientes que han recibido una vacuna contra la alergia incorporan el MPL como adyuvante, 92 ya que se ha demostrado que la interacción del MPL con TLR4 estimula la maduración de las DCs y estas activan a los linfocitos T, fomentando la producción de citoquinas, especialmente IL-12, dando una respuesta de tipo TH1 (no alérgica). 93 Actualmente, existe una multitud de adyuvantes de segunda generación en diversas fases de desarrollo e investigación que están basados en ligandos de PRR. (Tabla 1.1.) 89 Zubeldia, J.M.; Ferrer, M.; Dávila, I.; Justicia, J.L.; J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2019, 29, 103-111. 90 Gamazo, C.; D’Amelio, C.; Gastaminza, G.; Ferrer, M.; Irache, J.M.; Hum. Vaccin. Immunother. 2017, 13, 2416-2427. 91 Luchner, M.; Reinke, S.; Milicic, A.; Pharmaceutics 2021, 13, 142. 92 Rosewich, M.; Lee, D.; Zielen, S.; Hum. Vaccin. Immunother. 2013, 9, 1523-1531. 93 Ismaili, J.; et al.; J. Immunol. 2002, 168, 926-932. Introducción 29 Tabla 1.1. Ejemplos de adyuvantes basados en ligandos de PRR en diversas fases de desarrollo. Por lo tanto, hay un creciente interés en la aplicación de estos adyuvantes combinados con alérgenos para su uso en la AIT, (Figura 1.11) debido a su capacidad de modular la respuesta inmune desde un patrón TH2 hacia uno TH1. 94 Es importante destacar que ni todos los PRRs, ni todos sus ligandos, pueden fomentar esta modulación por lo tanto, es necesario una profunda investigación sobre los mecanismos que rigen estos procesos inmunológicos. 94 Puggioni, F.; Durham, S.R.; Francis, J.N.; Allergy 2005, 60, 678-684. Adyuvante Descripción Fase de desarrollo Liposomas (AS01) Vesículas lipídicas que contienen un ligando de TLR4 y saponina. Fase III Crema tópica w/TLR7 Ungüento tópico basado en un ligando de TLR7 (Aldara) en combinación con una vacunación intradérmica. Fase III para Influenza IC31 Péptido catiónico complejando a un ligando de TLR9 (CpG ssADN). Fase II Poly(I:C) (Ampligen) Análogo de polímero de ARN bicatenario (PolyI:C12U), ligando de TLR3. Fase II Delta inulin (Advax) Polisacárido derivado de plantas, microparticulado y cristalizado. Fase II CAF01 Liposoma catiónico que incluye un ligando sintético de CLR. Fase I Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 37 3. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4b]indol para el receptor TLR4 3.1 Introducción El primer trabajo relacionado con los receptores TLR fue el descubrimiento de la proteína transmembrana TLR4 en la mosca de la fruta, poniéndose de manifiesto que la mutación del gen que expresa dicha proteína se asociaba a una disminución de su respuesta inmunitaria frente a patógenos.66 Por estos hallazgos, Bruce A. Beutler y Jules A. Hoffmann fueron galardonados con el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 2011. El TLR4 es una proteína con un peso molecular de aproximadamente 95 KDa que se encuentra en el exterior de la membrana celular, por lo tanto, se clasifica como un receptor extracelular. TLR4 reconoce diversos lipopolisacaráridos (LPS), que son el componente mayoritario de la membrana de las bacterias Gram-negativas. 96 El mecanismo por el que tiene lugar el reconocimiento implica a una proteína accesoria, el Myeloid Differentiation factor 2 (MD-2), formando un complejo heterodimérico. 97 Cabe destacar que este receptor es el único de todos los TLRs que necesita de una proteína accesoria para su activación. Sin embargo, en este reconocimiento también pueden participar otras proteínas como la proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP, del inglés, Lipopolysaccharide Binding Protein), 98 que se une a LPS y lo transporta a una proteína CD14 (del inglés, Cluster of Differentiation), que a su vez lo presenta al MD-2, induciendo la formación del heterodímero TLR4 / MD-2 / TLR4* / MD-2*. (Figura 3.1) Por lo tanto, por medio de este complejo se produce el reconocimiento de los LPS debido a que este se une a una proteína MD-2 provocando una dimerización de otro complejo TLR4/MD-2. Este proceso de dimerización (Figura 3.1) induce la activación de cascadas de señalización del sistema inmune innato. 99 Los estudios de los mecanismos de 96 Brubaker, S.W.; Bonham, K.S.; Zanoni, I.; Kagan, J.C.; Annu. Rev. Immunol. 2015, 33, 257290. 97 Shimazu, R.; Akashi, S.; Ogata, H.; Nagai, Y.; Fukudome, K.; Miyake, K.; Kimoto, M.; J. Exp. Med. 1999, 189, 1777-1782. 98 Schumann, R.; Leong, S.; Flagg, G.; Gra, P.; Wright, S.; Mathison, J.; Tobias, P.; Ulevitch, R.; Science 1990, 249, 1429-1431. 99 Beom, S. P.; Lee, J.; Exp. Mol. Med. 2013, 45, e66. Capítulo 3 38 activación de este receptor son muy recientes y continúan en la actualidad. No fue hasta 2009 cuando se publicó la estructura cristalina del complejo heterodimérico TLR4/MD2/LPS, 100 considerándose esta estructura como la conformación activa de TLR4. Figura 3.1. Representación del reconocimiento de LPS por TLR4/MD-2 originando una dimerización. Figura modificada de la referencia 99. La activación de TLR4 desencadena la liberación de citoquinas pro-inflamatorias que provocan fuertes respuestas inmunes a través de la maduración de las células dendríticas y la secreción de IFN de tipo 1. 101 Es importante destacar que TLR4 difiere del resto de la familia de los TLRs al tener dos vías de señalización intracelular distintas que dan lugar a estas respuestas. La vía dependiente de MyD88 (del inglés, Myeloid Differentiation Factor 88) 102 que culmina con la secreción de citoquinas pro-inflamatorias y, por otro lado, la vía dependiente de TRIF (del inglés, TIR-domain-containing adapter inducing interferon-β) 103 que genera IFN de tipo 1. 3.2 TLR4 como diana terapéutica en alergia La activación de algunos TLRs puede modular la respuesta inmune desde una respuesta celular tipo TH2 (alérgica) a una de tipo TH1 (no alérgica), como se ha comentado anteriormente. En el caso concreto del receptor TLR4 se están llevando a cabo muchos esfuerzos para entender los mecanismos inmunitarios asociados a su activación. Los primeros estudios se centraron en la interacción con su PAMP original. A partir de estos 100 Park, B.; Song, D.; Kim, H.; Choi, B.; Lee, H.; Lee, J.; Nature 2009, 458, 1191-1195. 101 Richez, C.; et al.; J. Immunol. 2009, 182, 820-828. 102 Medzhitov, R.; et al.; Mol. Cell. 1998, 2, 253-258. 103 Yamamoto, M.; et al.; J. Immunol. 2002, 169, 6668-6672. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 39 estudios se concluyó que los LPS son capaces de activar las DCs y la secreción de IL12p70 e IL-10, que producen una diferenciación de las células CD4+, fundamentalmente a células TH. 104 Estos resultados tan prometedores abrieron el camino al diseño de una gran variedad de vacunas basadas en la activación de TLR4. Este creciente interés por parte de la comunidad científica se ha visto reflejado en la publicación de un gran número de estudios relacionados con TLR4 como diana terapéutica. 105 Tanto es así que actualmente existen algunos candidatos para vacuna basados en esta estrategia que se encuentran en diversas fases de investigación preclínica. La idea fundamental es el uso de agonistas de TLR4 como adyuvantes en AIT, debido al potencial de la activación de este receptor sobre el sistema inmune. Sin embargo, el uso de adyuvantes para vacunas sintéticas basados en LPS está muy limitado debido a la toxicidad asociada a estos compuestos. Por lo tanto, muchos de los estudios que se han comentado previamente se basan en la búsqueda de nuevos ligandos para TLR4 que sean eficaces y seguros. A continuación, se detallan estos nuevos ligandos y los estudios llevados a cabo para evaluar su actividad inmunológica. 3.2.1 Ligandos lipídicos de TLR4 Debido a la toxicidad de los LPS, se ha realizado una extensiva investigación sobre otros compuestos que también son reconocidos por TLR4. En una primera aproximación, se plantearon estructuras similares a las de los LPS. Los LPS son grandes moléculas constituidas por un polisacárido y una parte lipídica. Dentro de esta estructura, una de las regiones más conservadas y la responsable de la activación del sistema inmune es el llamado lípido A, si bien también lleva asociada la actividad tóxica. Este lípido A está formado por un disacárido de glucosamina que presenta dos ésteres fosfato cargados negativamente en los carbonos C1 y C4’ y 6 cadenas de ácidos grasos unidos en las posiciones C2, C3, C2’ y C3’. (Figura 3.2) Se han realizado numerosas modificaciones sobre las distintas partes de la estructura del lípido A, evaluando si dichos cambios afectaban a su capacidad de interaccionar con 104 Re, F.; Strominger, J.L.; J. Biol. Chem. 2001, 40, 37692–37699. 105 Kirtland, M.E.; Tsitoura, D.C.; Durham, S.R.; Shamji, M.H.; Front. Immunol. 2020, 11, 599083. Capítulo 3 40 TLR4, intentando reducir su toxicidad. 106 Estas investigaciones iniciales culminaron con el MPL, que cumple estas condiciones y que como se comentó en la Introducción de la presente Tesis Doctoral, es el único compuesto aprobado actualmente para AIT basado en un agonista de TLR. La estructura del MPL es la misma que la del lípido A pero sin un grupo fostato y cambios en las cadenas lipídicas Las modificaciones químicas de la estructura del lípido A se extendieron a más variantes (Figura 3.2). Por ejemplo, la eliminación de dos ácidos grasos lleva a la estructura Eritoran. La modificación en el número de ácidos grasos de estas variantes de lípidos A, naturales o sintéticas, pueden bloquear o inhibir la activación de TLR4, actuando así como antagonistas. Este hecho se confirmó al analizar la estructura cristalina del homodímero TLR4/MD-2 unido al Eritoran, 107 ya que se observa que este compuesto inserta todas las cadenas de ácidos grasos en el bolsillo hidrofóbico de MD-2; sin embargo, a diferencia del lípido A, el Eritoran no puede inducir la dimerización ni la activación de TLR4, por lo que actúa como un antagonista de TLR4. Curiosamente, otras variantes estructurales siguen encerrando sorpresas, por ejemplo, el lípido IVa, un precursor biosintético tetraacilado del lípido A, actúa como antagonista en humanos pero como un agonista en ratones. Este resultado se ha atribuido a las diferencias encontradas en la forma del bolsillo hidrofóbico del MD-2 de humano y ratón, así como a los efectos electrostáticos. Este hecho pone de manifiesto la crucial importancia de esta unión, dando unos resultados tan dispares incluso entre diferentes especies de mamíferos. 108 También, se ha investigado la influencia de la parte disacarídica encontrándose efectos antagonistas. 106 Peri, F.; Calabrese, V.; J. Med. Chem. 2014, 57, 3612-3622. 107 Kim, H.; et. al.; Cell 2007, 130, 906-917. 108 Ohto, U.; Fukase, K.; Miyake, K.; Shimizu, T.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, 74217426. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 41 Figura 3.2. Estructura del lípido A y ejemplos de algunas de sus modificaciones estudiadas. Figura modificada de la referencia 106. Estas estructuras derivadas del lípido A presentan algunos inconvenientes serios ya que, debido a sus regiones polares y apolares, son moléculas anfifílicas. Esto implica que en disolución forman agregados, produciendo también una baja solubilidad en agua, lo que a veces complica su manipulación tanto in vitro como in vivo, así como unas pobres propiedades farmacodinámicas. Por lo tanto, es fundamental el desarrollo de nuevas estructuras moleculares inspiradas por compuestos naturales activos para TLR4 con mejores propiedades como solubilidad, biodisponibilidad y toxicidad, en comparación con los compuestos basados en el lípido A. A continuación, se expondrá de forma resumida la búsqueda de estos nuevos ligandos que constituyen una de las vías más prometedoras en el uso de la AIT basadas en TLR4. Capítulo 3 42 3.2.2 Ligandos no lipídicos de TLR4 La modelización computacional es una poderosa herramienta en la búsqueda de nuevos ligandos de TLR4 para el diseño racional de fármacos. 109 Por medio de estas técnicas, recientemente se han identificado algunas moléculas pequeñas que son ligandos para TLR4. Estos estudios se han centrado en el mecanismo de acción y en la interacción con proteínas específicas (TLR4, MD-2 y CD14). (Figura 3.3) La enorme variedad de estructuras basadas en estas pequeñas moléculas es sorprendente debido a su gran diferencia estructural con el ligando natural lipídico, los LPS. Además, estos compuestos interaccionan de distintas formas con TLR4 y/o a MD-2 y CD14. Por otro lado, algunas moléculas pequeñas que eran capaces de interaccionar con TLR4 provenían de fuentes naturales e incluso eran fármacos para el tratamiento de otras enfermedades. Uno de estos compuestos es el paclitaxel (PTX), (Figura 3.3) un potente agente anticancerígeno extraído del tejo del Pacífico, que actúa mediante la sobre-estabilización de los microtúbulos celulares. Aunque el mecanismo de acción del PTX contra el cáncer se ha atribuido durante mucho tiempo a los efectos a nivel de la β-tubulina, posiblemente la activación de una respuesta inmune innata y algunas de las propiedades antitumorales del PTX estén relacionadas con el complejo TLR4/MD-2. Esta afirmación se apoya en el hecho de que la unión del PTX a MD-2 se ha demostrado mediante experimentos in vitro. 110 De forma análoga, también se ha identificado otro producto natural, la Laprocianidina B1, que se encuentra en el árbol de la canela. (Figura 3.3) Su capacidad de unirse a TLR4 se demostró por medio de estudios de docking. 111 En la misma línea, estas técnicas computacionales demostraron la capacidad de unión a TLR4 de moléculas tan diversas como el Xanthohumol (un tipo de Chalcona) o la Curcumina (el principio activo de la Cúrcuma), si bien todas estas moléculas presentan fundamentalmente propiedades antagonistas. 112 (Figura 3.3) Por otro lado, utilizando la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas se puso de manifiesto que el Sulforafano (SFN) forma un enlace covalente con el residuo Cys133 del MD-2. Los autores propusieron, apoyándose en estudios de docking, un modelo en el que el SFN, una vez 109 Billod, J.M.; Lacetera, A.; Guzmán-Caldentey, J.; Martín-Santamaría, S.; Molecules 2016, 21, 994. 110 Resman, N.; Gradisar, H.; Vasl, J.; Keber, M.; Pristovsek, P.; Jerala, R.; FEBS Lett. 2008, 582, 3929-3934. 111 Xing, J.; et al.; Mol. Cell. Biochem. 2015, 407, 89-95. 112 Fu, W.; et al.; Drug Des. Dev. Ther. 2016, 10, 455-463. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 43 unido covalentemente a la Cys133, ocupa la misma posición que una de las cadenas lipídicas del LPS. Este modelo sugiere que el SFN evita estéricamente que otros LPS / lípido A se acerquen y se asienten dentro del bolsillo hidrofóbico del MD-2 y al competir con ellos presenta, por tanto, una propiedad antagonista. 113 Figura 3.3. Ligandos no lipídicos del complejo TLR4/MD-2. Imagen modificada de la referencia 109. Es necesario comentar que, una de las técnicas más recientes y poderosas en el descubrimiento de nuevos fármacos es el cribado de alta eficacia (HTS, del inglés HighThroughput Screening). 114 Mediante una combinación de robótica, software de control / procesamiento de datos, dispositivos de manipulación de líquidos y detectores, la HTS permite realizar rápidamente millones de pruebas químicas, genéticas o farmacológicas. A través de este proceso, se pueden identificar rápidamente compuestos activos, anticuerpos o genes que modulan una vía biomolecular particular. Los resultados de estos experimentos proporcionan puntos de partida para el diseño de fármacos y para comprender la falta de interacción o el papel de un sitio de unión en particular. Debido al 113 Koo, J.E.; Park, Z.Y.; Kim, N.D.; Lee, J.Y.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013, 434, 600605. 114 Macarron, R.; et al.; Nat. Rev. Drug Discov. 2011, 10,188-195. Capítulo 3 44 elevado grado de automatización de todo el proceso, se pueden analizar hasta 100000 moléculas de una quimioteca al día. 115 A pesar de ello, se siguen realizando avances para mejorar más aún este proceso, por ejemplo, desarrollando un HTS que permite un análisis 1.000 veces más rápido (100 millones de reacciones en 10 horas) a una millonésima parte del coste (utilizando 10-7 veces el volumen de reactivo) en comparación con las técnicas convencionales que utilizan microfluidos basados en gotas. 116 La HTS necesita un laboratorio de detección altamente especializado y costoso para ejecutar una operación, por lo que su uso no está del todo extendido. El grupo de investigación de Howard B. Cottam (Universidad de California), utilizando HTS, realizó un amplio análisis de una quimioteca de más de 170.000 compuestos, seleccionándose 225 compuestos para pruebas in vitro con células del sistema inmune. De estos 225 candidatos, 39 estimularon células humanas y de ratón mediante la expresión de citoquinas IL-6 y IL-8. De este análisis, las 4-aminoquinazolinas sustituidas aparecieron como la clase de compuestos más potentes para la activación de células humanas. Por medio de estudios in vitro, se identificó esta familia de compuestos como agonistas del receptor TLR4. 117 Es necesario destacar que no hay muchos ejemplos en la literatura que describan moléculas pequeñas sintéticas no lipídicas que sean agonistas de TLR4. Otra familia de compuestos identificados, los pirimido[5,4-b]indoles, surgió del mismo estudio de HTS. 118 La quimioteca primaria de HTS contenía una familia de 452 compuestos de la clase pirimido[5,4-b]indol. Por este motivo, se pudo identificar las características importantes de estas estructuras para la activación de NFκB, un complejo proteico que está implicado, entre otras funciones, en la expresión de citoquinas. Por lo tanto, para esta familia se realizó un estudio de relación estructura-actividad (SAR, del inglés Structure-Activity Relationship). En estos estudios, se identificaron los fragmentos de estas moléculas que estaban implicados en la interacción con TLR4 mediante el análisis de la inducción de citoquinas implicadas en su activación. (Figura 3.4) TLR4 envía señales a través de dos vías distintas que conducen a las citoquinas dependientes de NFκB y a la producción de IFN tipo I. Los ensayos anteriores se utilizaron para comparar la actividad de los derivados de pirimidoindol para activar TLR4 humano y de ratón. La 115 Caraus, I.; Alsuwailem, A. A.; Nadon, R.; Makarenkov, V.; Brief. Bioinform. 2015, 16, 974986. 116 Inglese, J.; et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006. 103, 11473-11478. 117 Nour, A.; et al.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 4931-4938. 118 Chan, M.; et al.; J. Med. Chem. 2013, 56, 4206-4223. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 45 activación de TLR4 de ratón se evaluó por medio de la expresión de IL-6. Se realizaron modificaciones en las regiones de interés del pirimidoindol y se compararon todas estas modificaciones entre sí para observar el grado de interacción con TLR4 humano y de ratón mediante el análisis de las citoquinas liberadas. Figura 3.4. Representación de un derivado de pirimido[5,4-b]indol y regiones que influyen en la producción de citoquinas. A partir de este estudio SAR, se extrajeron las siguientes conclusiones: la posición N-3 (región en amarillo) debe incluir un grupo hidrófobo, preferiblemente un anillo de fenilo no sustituido, para maximizar esa actividad; las sustituciones en la posición N-5 del indol (región en azul) dieron lugar a la pérdida de la actividad y finalmente, la amida terminal (región en rojo) requirió un sustituyente altamente hidrófobo para evitar la disminución de la actividad, siendo un residuo de ciclohexilo el sustituyente óptimo. Es interesante destacar que, generalmente estas modificaciones estructurales de cada molécula mostraban una mayor actividad en células murinas que en células humanas. Aunque el sistema inmunológico innato está altamente conservado entre las especies, hay algunas pequeñas diferencias entre el TLR4 humano y de ratón, como se comentó previamente, que explica esta variabilidad. Una vez identificado el ligando más adecuado, aunque ya había sido demostrada su actividad mediante estudios in vitro, se procedió a estudiar su interacción con TLR4 por medio de técnicas computacionales. Para ello, se examinaron los modos de unión del ligando al complejo TLR4/MD-2 murino por medio de docking. Se seleccionaron las configuraciones del ligando unidas a este complejo basándose en criterios de complementariedad de la forma de la superficie y la energía intermolecular de interacciones más favorable, generándose el modelo de acoplamiento óptimo. (Figura 3.5) En este modelo se observa que hay un conjunto de interacciones electrostáticas Capítulo 3 52 Figura 3.8. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) del compuesto 5. A partir de este punto, se realiza una variación de la síntesis original planteada por el grupo de Cottam, ya que se continúa sin la metilación del nitrógeno del indol. (Esquema 3.4.) Como se comentó previamente, esta modificación no afecta a la capacidad de unión con TLR4 y de esta forma se evitan etapas de protección y desprotección siendo, por tanto, una ruta sintética más simple y adecuada. Esquema 3.4. Estrategia para la síntesis del compuesto 7 sin metilación del nitrógeno del indol. Así, el siguiente paso consistió en el tratamiento del bromo derivado 5 con ácido bromoacético en presencia de KOH a reflujo de etanol toda la noche para obtener el derivado de ácido carboxílico 6 de forma cuantitativa. Este compuesto fue satisfactoriamente caracterizado por espectroscopía de RMN y espectrometría de masas. (Figura 3.9) En el espectro de 1H-RMN se observa claramente la desaparición del protón del NH de la tiona a campo bajo, así como la aparición de un singulete a 3.96 ppm, que corresponde al metileno del tioéter. Estos datos son consistentes con los datos de espectrometría de masas (ESI), observándose la señal correspondiente al ión molecular protonado ([M + H]+: m/z 432.1) con la correspondiente distribución isotópica debido a la presencia del átomo de bromo. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 53 Figura 3.8. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (arriba) y de ESI-MS (abajo) del compuesto 6. La amidación del ácido carboxílico 6 se llevó a cabo por medio del agente de acoplamiento hexafluorofosfato de 1-óxido-3-(bis(dimetilamino)metilen)-3H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]piridina (HATU) y ciclohexilamina, en condiciones anhidras, formándose el derivado 7 con rendimiento cuantitativo. La estructura del compuesto 7 pudo ser verificada mediante el análisis de su espectro de 1H-RMN, por medio de las señales de los cinco metilenos de la ciclohexilo a campo alto entre 1.75-1.25 ppm, así como del metino a 3.54 ppm. Todas estas señales guardan la correcta relación de integración con el resto de protones del compuesto 7. De la misma forma, en el espectro de 13C-RMN se corroboró la aparición de la señal del carbono de la amida a 166.3 ppm y las señales a campo alto correspondientes a los carbonos de la ciclohexilo. (Figura 3.10) Capítulo 3 54 Figura 3.10. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (arriba) y 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6, 298 K) (abajo) del compuesto 7. En este punto de la síntesis, una vez formada completamente la estructura del pirimido[5,4-b]indol, es necesaria la derivatización a través del bromo de la posición C8. Para ello, la química organometálica exhibe una gran variedad de reacciones para halogenuros de arilo como las típicas reacciones de acomplamiento C-C (reacciones de cross-coupling) catalizadas por paladio, como son las reacciones de Heck, 122 Suzuki, 123 122 Heck, R. F.; Nolley, Jr., J. P.; J. Org. Chem. 1972, 37, 2320-2322. 123 Miyaura, N.; Suzuki, A.; Chem. Commun. 1979, 866-867. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 55 Negishi, 124 y Sonogashira, 125 entre muchas otras. Una de las estrategias planteadas fue la transformación en un derivado de anilina, es decir, la conversión de Br-Ar a NH2-Ar, a través de una variante de la reacción de tipo Ullmann catalizada por Cu(I). (Esquema 3.5) Esquema 3.5. Síntesis del derivado de anilina 8. Por lo tanto, se hizo reaccionar el compuesto bromado 7 en presencia de CuI, azida sódica y ascorbato sódico como agente reductor, añadiendo también una diamina, la N,Ndimetiletilendiamina (DMEN), en una mezcla DMSO/H2O y calentando a 90ºC durante toda la noche. En estas condiciones, se obtuvo el derivado de anilina 8 con un rendimiento del 72%. Aunque aparentemente parezca un cambio pequeño de la estructura química del compuesto 8 con respecto al 7, debido a este cambio, las señales aromáticas del anillo aparecen más separadas. Además, aparece un singulete ancho a 4.90 ppm correspondiente a los protones del nuevo grupo amino, que no presenta correlación con ninguna señal del espectro de carbono, como se puede observar en el espectro HSQC. (Figura 3.11) 124 King, A.O.; Okukado, N.; Negishi, E.; Chem. Commun. 1977, 683-684. 125 Sonogashira, K.; Tohda, Y.; Hagihara, N.; Tetrahedron Lett. 1975, 50, 4467-4470. Capítulo 3 56 Figura 3.10. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (arriba) y de HSQC (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (abajo) del compuesto 8. Por espectrometría de masas ESI se observan las señales m/z correspondientes a la masa del compuesto 8, así como la pérdida del perfil isotópico característico del átomo de bromo. (Figura 3.12) Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 57 Figura 3.12. Espectro de ESI-MS del derivado 8. Una vez sintetizada la amina 8, fue necesario la introducción del grupo maleimido para la conjugación de los péptidos. Para ello, se llevó a cabo la amidación con el ácido 3maleimidopropiónico (9), sintetizado a partir de anhídrido maleico y β-alanina, siguiendo las condiciones descritas en la bibliografía. 126 (Esquema 3.6) Esquema 3.6 Síntesis del derivado de maleimida 10. Para este acoplamiento, se usaron las condiciones ya establecidas para la reacción de amidación, como es el empleo de HATU como agente de acoplamiento, DIPEA (N,N’- diisopropiletilamina) como base y DMF en condiciones anhidras. De esta forma, se obtuvo el derivado de malemida 10 con un buen rendimiento (73%). Para confirmar la completa amidación del compuesto 8, dicho compuesto fue caracterizado por RMN y espectrometría de masas. En el espectro de 1H-RMN, se observa la aparición de un 126 Mantovani, G.; et al.; J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2966-2973. Capítulo 3 58 singulete a campo bajo a 10.06 ppm que corresponde al protón de la amida generada, así como un singulete a 7.05 ppm característico de los protones olefínicos de la malemida. En el espectro de ESI-MS se detecta la señal correspondiente al ión molecular más sodio ([M + Na]+: m/z 621.2). (Figura 3.12) Figura 3.12. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (arriba) y de ESI-MS (abajo) del compuesto 10. Una vez sintetizado el pirimido[5,4-b]indol 10, funcionalizado con el grupo maleimido, se puede llevar a cabo la conjugación con diferentes péptidos alergénicos. Estas estructuras son muy interesantes dado que, a partir de un mismo intermedio sintético común, pueden conjugarse diferentes péptidos con aplicaciones como vacunas frente a diferentes alergias. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 59 3.5. Conjugación del ligando de TLR4 a distintos péptidos alergénicos Como se comentó en la Introducción de la presente tesis doctoral, el melocotón es la fruta que más alergia produce en España,27 con una gran predominancia también en el resto del área mediterránea. Su alérgeno principal es una proteína LTP (del inglés Lipid Transfer Protein) llamada Pru p 3. Se ha demostrado que estas LTPs están ampliamente conservadas y presentan una gran similitud con otras LTPs del reino vegetal como las encontradas en otras frutas y en pólenes como la artemisa (Artemisa vulgaris, alérgeno Pla a 3) 127 y el plátano de sombra (Platanus acerifolia, alérgeno Art v 3), 128 ocasionando reacciones alérgicas cruzadas entre diferentes vegetales. El único tratamiento actual para la alergia al melocotón consiste en una vacuna de AIT basada en el extracto de esta proteína (SLIT Melocotón Alk-Abelló Labs) con todos los problemas de reproducibilidad asociados al uso de estos extractos que se comentaron previamente. En base a los estudios sobre alérgenos vegetales de la Prof. Díaz Perales (Universidad Politécnica de Madrid), se identificaron las regiones alergénicas de la proteína Pru p 3. 129 , 130 De esta forma pudo desarrollarse un péptido sintético basado en uno de los epítopos seleccionados, concretamente la región que comprende desde el aminoácido 26 al 46. Se realizaron algunas modificaciones de esta estructura original como fue la sustitución de los aminoácidos cisteína (C) por serina (S) para evitar reacciones de crosslinking, teniendo como secuencia final ASSNGIRNVNNLARTPDRQA. Por último, se añadió a esta secuencia una cisteína terminal, para utilizar el grupo tiol de la cadena lateral en la conjugación a un grupo maleimido, a través de la reacción tiol-eno (un tipo de adición de Michael). En la bibliografía se pueden encontrar numerosos ejemplos de este tipo de conjugaciones de péptidos debido a sus múltiples ventajas como son: su gran selectividad, la ortogonalidad de los grupos implicados, la ausencia de formación de productos secundarios, la compatibilidad con medios acuosos, la ausencia de otros reactivos o catalizadores metálicos. Todas estas ventajas hacen que este tipo de 127 Lombardero, M.; et al.; Clin. Exp. Allergy 2004, 34, 1415-1421. 128 Lauer, I.; et al.; Clin. Exp. Allergy 2007, 37, 261-269. 129 Tordesillas, L.; et al.; Mol. Immunol. 2009, 46, 722-728. 130 Tordesillas, L.; et al.; Mol. Immunol. 2009, 47, 534-540. Capítulo 3 60 conjugaciones estén consideradas como reacciones de tipo click. 131 En primer lugar, se abordó la conjugación de la malemida 10 con este péptido sintético (Pru p 3-SH) a través de la adición tiol-eno. Debido a la insolubilidad del ligando 10 y para evitar la precipitación de los reactivos durante la reacción, se realizó una cuidadosa optimización de los disolventes y las concentraciones que se debían utilizar, siendo una mezcla de DMSO y tampón fosfato (50 mM, pH= 7.4) como la más adecuada. (Esquema 3.7). Esquema 3.7. Síntesis del conjugado 11 con el péptido Pru p 3-SH. Siguiendo la metodología establecida para la conjugación de péptidos, la maleimida y el péptido Pru p 3-SH fueron disueltos en DMSO y tampón fosfato (50 mM, pH 7.4), respectivamente, en proporciones equimoleculares. Seguidamente, se mezclaron por medio de agitación orbitálica durante 25 min a temperatura ambiente. El avance de la reacción fue monitorizado por RP-HPLC, confirmando la desaparición de los productos de partida y formándose exclusivamente el conjugado 11. Por lo tanto, solamente fue necesario una ultrafiltración a través de una membrana de corte molecular de 3 KDa para eliminar las sales presentes en la reacción, obteniéndose el conjugado 11 con un rendimiento excelente (85%). Este conjugado fue caracterizado satisfactoriamente por medio de RP-HPLC mostrando una única señal y por espectrometría de masas (ESI), donde se observó la presencia de dos señales correspondientes a la del conjugado con dos y tres cargas, demostrando su pureza y monodispersidad. (Figura 3.13) 131 Nolan, M.D.; Scanlan, E.M.; Front. Chem. 2020, 8, 583272. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 61 Figura 3.13. Caracterización del conjugado 11 por medio de su cromatograma de RP-HPLC (arriba) y su espectro de ESI-MS (abajo). Una vez caracterizado este conjugado, se consideraron otros péptidos alergénicos con el objetivo de desarrollar vacunas frente a diferentes alergias a partir de un intermedio común. Como se comentó en la Introducción de la presente Tesis Doctoral, el pescado se corresponde con uno de los ocho alérgenos principales. Los alérgenos del pescado principalmente se relacionan con unas proteínas llamadas parvalbúminas, que se localizan en los músculos de dichos pescados. Dentro de esta familia existen dos tipos: αparvalbúmina, encontrada en peces cartilaginosos (cazón, raya, etc.) y β-parvalbúmina, asociada a peces óseos (bacalao, sardina, salmón, etc.). Sin embargo, los principales alérgenos alimentarios se corresponden con la β-parvalbúmina, cuya ingestión por parte de pacientes alérgicos provoca síntomas como dolor abdominal, rinitis, angioedema, asma y en algunos casos puede provocar síntomas mortales como anafilaxia. 132 En un estudio publicado en 2019 por el grupo de la Dra. Carrera (Instituto de Investigaciones Marinas-CSIC), analizando quince especies de pescados y usando técnicas de proteómica, 132 Kuehn, A.; Swoboda, I.; Arumugam, K.; Hilger, C.; François, H.; Front. Immunol. 2014, 5, 179. Capítulo 3 68 Figura 3.19. Las barras representan la mediana y el error estándar de la media del índice de maduración (A) para los diferentes marcadores de superficie en moDC (CD80, CD83, CD86 y PD-L1) (B) y de la producción de citoquinas (IL-4, IL-5, IL-10 and IFN) en los sobrenadantes de los ensayos de moDC para Pp3, TLR4lig, TLR4lig-Pp3 y TLR4lig+Pp3 de pacientes alérgicos (n= 9) y controles (n= 9) a 10 nM. La prueba U de Mann-Whitney se usó para comparaciones por pares entre grupos no relacionados y la prueba de rango con signo de Wilcoxon se usó para comparaciones por pares en muestras relacionadas, mostrando diferencias significativas como **, (p <0.0125, corrección de Bonferroni. La línea de puntos representa el índice de maduración> 2. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 69 La evaluación de los cambios fenotípicos de maduración inducidos por TLR4lig-Pp3 en la expresión de marcadores de activación/regulación (CD83 y PD-L1) y marcadores de la superficie celular de maduración (CD80 y CD86) puso de manifiesto que, en comparación con los controles, tuvo lugar un aumento significativo de CD83 en pacientes alérgicos. (Figura 3.19A) El análisis del efecto provocado únicamente por el compuesto TLR4lig (8) indicó que también era capaz de estimular CD80 en pacientes alérgicos en comparación con los controles. Este efecto ya ha sido reportado en estudios previos en los que se demostró que diferentes adyuvantes de TLR (sin alérgenos) eran capaces de modular la actividad y/o maduración de las moDC. 136 De este estudio, también se desprende el hecho de que los cambios en la expresión del marcador CD83 discriminan mejor la respuesta específica inducida por TLR4lig-Pp3, hecho que no ocurre con el ligando TLR sin péptido. Además, esto se confirmó por el hecho de que el péptido Pp3 incluido como control también indujo un aumento significativo de la expresión de CD83 en pacientes alérgicos en comparación con los controles. Por otro lado, se estudió el efecto de la inserción del péptido Pp3 conjugado covalentemente al ligando (TLR4lig-Pp3) comparado con el efecto de usar estos elementos de forma conjunta pero no unidos covalentemente (TLR4lig+Pp3). Los datos mostraron que TLR4lig-Pp3 condujo a un aumento significativo de los marcadores CD80, CD83 y PD-L1 en comparación con la estimulación provocada con TLR4lig+Pp3 (Figura 3.19A). Estos resultados demostraron que se produce una respuesta inmunológica más eficiente cuando tanto el alérgeno como el adyuvante interactúan conjuntamente con las DCs. La captación de TLR4lig-Pp3 se correlaciona con cambios funcionales en las moDC, por tanto, una presentación eficaz del antígeno requiere la activación de moléculas co-estimuladoras. 137 En este estudio, TLR4lig-Pp3 activa, regula y madura la expresión del marcador de superficie de las moDC, lo que demuestra que la activación de TLR4 es importante para iniciar la respuesta inmunitaria. Para estudiar el patrón de respuesta durante la maduración de las moDCs después de la incubación con TLR4lig-Pp3, se analizó la liberación de citoquinas en el sobrenadante del cultivo. (Figura 3.19B) El análisis en pacientes alérgicos, en comparación con los 136 Kaisho, T. & Akira, S.; Curr. Mol. Med. 2003, 3, 373-385. 137 Guermonprez, P.; Valladeau, J.; Zitvogel, L.; Thery, C; Amigorena, S.; Ann. Rev. Immunol. 2002, 20, 621-667. Capítulo 3 70 controles, demostró aumentos significativos de IL-5 en los primeros, al estimular tanto con TLR4lig-Pp3 como con TLR4lig+Pp3. Además, no se observaron diferencias en la inducción de la producción de IL-10 en pacientes alérgicos en comparación con los controles para cualquiera de las estructuras probadas. Tampoco se observaron diferencias en la producción de citoquinas después de la estimulación con TLR4lig-Pp3 y TLR4lig+Pp3, mientras que los niveles de IFNγ fueron similares. En resumen, TLR4lig-Pp3 (11) produjo una maduración diferencial de las moDCs (CD83) en pacientes alérgicos con una reducción de la expresión de citoquinas de tipo TH2 en comparación con el péptido, aunque sin cambios en los niveles de IFN e IL-10. Esta leve respuesta en la producción de citoquinas (IFN e IL-10) podría estar asociada con la etapa de maduración de las moDCs, ya que los ligandos TLR pueden influir de diferente manera en la activación de las moDCs, en la presentación de antígenos, en la co-estimulación y también en la producción de citoquinas. 138 El conjugado TLR4lig-Pp3 fue captado por las moDCs, afectando a su activación y maduración, influyendo en los siguientes pasos de la respuesta inmunológica, donde las moDCs maduras presentan el alérgeno a los linfocitos TH. Para evaluar este proceso, se determinó la proliferación de linfocitos utilizando moDCs homólogas pre-estimuladas con los ligandos y se analizó el perfil de la respuesta en términos de producción de citoquinas. Para ello, se analizaron diferentes subpoblaciones de linfocitos T (CD3+, CD4+ y CD8+), linfocitos B (CD19+) y linfocitos NK (CD56+) que dan forma a las respuestas inmunológicas de diferente manera. Estos resultados y su análisis se detallan a continuación. (Figura 3.20) 138 Re, F.; Strominger, J. L.; J. Biol. Chem. 2001, 276, 37692-37699. Síntesis de conjugados alérgeno-pirimido[5,4-b]indol para el receptor TLR4 71 Figura 3.20. Las barras representan la mediana y el error estándar de la media de (A) índice de proliferación (PI) de las células T (CD3+ y CD4+), (B) de la producción de citoquinas en los sobrenadantes del ensayo de proliferación de linfocitos (IL-4, IL-5 e IFN) y (C) de los porcentajes de células Treg y la producción de IL-10; para Pp3, TLR4lig, TLR4lig-Pp3 y TLR4lig+Pp3 de pacientes alérgicos (n= 9) y controles (n= 9) a 10 nM. La prueba U de MannWhitney se usó para comparaciones por pares entre grupos no relacionados y la prueba de rango con signo de Wilcoxon se usó para comparaciones por pares en muestras relacionadas, mostrando diferencias significativas como **, (p <0.0125, corrección de Bonferroni). La línea de puntos representa el PI> 2. Capítulo 3 72 Los resultados encontrados en estos estudios indicaron que TLR4lig-Pp3 parecía estimular la proliferación de células T sin inducir una diferencia significativa entre los distintos grupos de células. (Figura 3.20A) Es destacable que en pacientes alérgicos hubo un aumento significativo en la proliferación de células T CD3+ y CD4+ después de la estimulación con TLR4lig-Pp3 frente a TLR4lig y frente a TLR4lig+ Pp3. (Figura 3.20A) Estos resultados sugieren que TLR4lig-Pp3 (11) induce una respuesta proliferativa específica para Pru p 3 en los linfocitos T. No se encontró diferencia en la respuesta proliferativa para otras subpoblaciones como células B y células NK con TLR4lig-Pp3 entre pacientes alérgicos y controles, ya que la proliferación de esa subpoblación celular fue negativa (índice de proliferación <2). En cuanto al perfil de citoquinas durante la respuesta proliferativa, los resultados señalaban que TLR4lig-Pp3 (11) producía una disminución del nivel de IL-5, en comparación con el péptido Pp3 únicamente (Figura 3.20B). Estos cambios, que se observan solo en pacientes alérgicos, indicaron que este compuesto, que combina el péptido alergénico y el adyuvante, tenía la capacidad de modular la respuesta TH2 de manera específica, siendo un resultado muy prometedor para el desarrollo de vacunas en alergia. Por último, se estudió la capacidad de las moDCs tratadas con TLR4lig-Pp3 a la hora de inducir células Treg. Se realizaron experimentos de co-cultivo y se analizaron los porcentajes de células Treg producidas. Los resultados indicaron porcentajes significativamente más altos de células Treg; sin embargo, la producción de IL-10 no fue significativa en ningún caso (Figura 3.20C). Estos bajos niveles de IL-10 no deben ser considerados como una baja activación, ya que cada TLR produce señalizaciones diferentes. 139 Estos datos sugieren que las moDCs activadas por TLR4lig-Pp3 (11) promovieron la presentación del alérgeno y generaron una respuesta inmunológica específica con un patrón inmunológico de tipo TH1 / Treg y la supresión de las células efectoras TH2. Por lo tanto, es un resultado muy prometedor para el desarrollo y posteriores estudios in vivo usando este conjugado como vacuna frente a enfermedades alérgicas en el marco de la AIT. 139 Deifl, S.; et al.; Allergy 2014, 69, 1602-1609. Capítulo 4 Síntesis de conjugados alérgeno-8oxoadenina para el receptor TLR7 Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 75 4. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 4.1 Introducción Dentro de la familia de los TLRs, TLR7 se clasifica como un receptor intracelular (junto a los TLR3, 8 y 9), ya que se expresa en la superficie de compartimentos celulares como los endosomas. TLR7 es uno de los receptores mejor estudiados, poniéndose de manifiesto su papel esencial en la activación del sistema inmune innato. Los principales esfuerzos por parte un gran número de grupos de investigación se han centrado fundamentalmente en el estudio de su papel en los procesos de infección viral, como los causados por el VIH o el virus influenza. 140 Desde el 2002, se han ido realizando de forma continuada numerosos avances para establecer los mecanismos moleculares de los procesos biológicos en los que está involucrado TLR7. En el año 2002, se demostró que algunas pequeñas moléculas antivirales eran capaces de activar TLR7; 141 sin embargo, no fue hasta 2004 cuando se identificó el PAMP natural para TLR7, ARN monocatenario (una sola cadena de nucleótidos) rico en guanina y uridina. 142 Sin embargo, el reconocimiento de ácidos nucleicos no es exclusivo de este receptor, TLR8 también reconoce ARN monocatenario y TLR9 reconoce ADN con motivos CpG no metilados. 143 Además, todos ellos son receptores intracelulares y se encuentran estrechamente relacionados, formando una subfamilia (TLR7-8-9). Para entender la estructura y actividad de TLR7 es necesario, por tanto, un conocimiento de TLR8 y 9 ya que, gracias a los estudios previos de esta subfamilia, se realizaron los descubrimientos de los mecanismos que involucran a TLR7. 140 Barchet, W.; et al.; Eur. J. Immunol. 2005, 35, 236-242. 141 Hoshino, K.; Horiuchi, T.; Tomizawa, H.; Takeda, K.; Akira, S.; Nat. Immunol. 2002, 3, 196200. 142 Diebold, S.S.; Kaisho, T.; Hemmi, H.; Akira, S.; Reis e Sousa, C.; Science 2004, 303, 152931. 143 Martínez-Campos, C.; Burguete-García, A.I.; Madrid-Marina, V.; Viral Immunol. 2017, 30, 98-105. Capítulo 4 76 La primera estructura cristalina del dominio extracelular de TLR8 fue obtenida en 2013 utilizando un sistema de expresión de Drosophila. 144 Posteriormente en 2015, se determinó la estructura cristalina de TLR9. 145 TLR7 está especialmente relacionado con TLR8, ya que ambos receptores reconocen ARN monocatenario. TLR8 reconoce productos degradados, tanto uridina como oligonucleótidos cortos derivados de ARN, a través de dos sitios de reconocimiento diferentes. Este hecho proporciona un contexto importante para comprender la estructura de TLR7. 146 Estudios preliminares demostraron que TLR7 es capaz de reconocer al nucleósido guanosina y sus derivados. 147 Por lo tanto, resulta muy interesante destacar que, aunque TLR7 y TLR8 poseen una estructura similar, pueden reconocer diferentes ligandos. Una característica clave de TLR7 es el llamado bucle Z (o Z-loop en inglés), que se localiza en la región entre LRR14 y LRR15 de su estructura proteica. Esta porción se conserva dentro de la subfamilia TLR7-8-9 y se escinde proteolíticamente, provocando su activación. A través de un estudio del grupo de Shimizu en 2016, 148 se puso de manifiesto que TLR7 presentaba una conformación de monómero en ausencia de ligandos; sin embargo, la unión por medio de guanosina y motivos de uridina producía la dimerización. Así, TLR7 formaba un dímero activado de forma similar a los observados para TLR8 y TLR9. De manera análoga a la estructura de TLR8 que reconoce uridina y ARN monocatenario en distintos lugares, se encontró que TLR7 interactúa con guanosina y repeticiones de uridina en dos regiones diferentes siendo, por tanto, un receptor dual. (Figura 4.1) 144 Tanji, H.; Ohto, U.; Shibata, T.; Miyake, K.; Shimizu, T.; Science 2013, 339, 1426-1429. 145 Ohto, U.; et al.; Nature 2015, 520, 702-705. 146 Kazuhiko, M.; Shizuo, A.; Immunity 2016, 45, 705-707. 147 Shibata, T.; et al.; Int. Immunol. 2016, 28, 211-222. 148 Zhang, Z.; et al.; Immunity 2016, 45, 737-748. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 77 Figura 4.1. Representación esquemática de la subfamilia TLR7-8-9 que muestra la escisión de su región de bucle Z (en rojo), necesaria para la dimerización en su forma activa. Además, se representan sus correspondientes PAMPS y sus diferentes sitios de unión. Figura modificada de la referencia 146. A través de este estudio del grupo de Shimizu, llegaron a la conclusión de que el segundo sitio de TLR7 se une a residuos de uridina truncados, con al menos tres bases. Estos resultados mostraban que TLR7 contiene dos sitios distintos de unión a ligandos, uno para ligandos pequeños y otro para ARN monocatenario. De estos dos sitios, el primero es fundamental para reconocer ligandos pequeños. Este hecho, fue confirmado a través de un estudio en el que se demostró que un pequeño ligando derivado de guanosina se unía al primer sitio de TLR7 y que esta unión era suficiente para inducir la formación de un dímero activo. Por tanto, la unión de ligandos al primer sitio de reconocimiento podría inducir la dimerización de TLR7 en ausencia de un ligando para el segundo sitio. Curiosamente, la estructura de bucle Z en el TLR7 es diferente a la presente en los otros dos miembros de la subfamilia. De hecho, los bucles Z de TLR7 y TLR8 están involucrados en el reconocimiento de ARN monocatenario, pero sus orientaciones son muy diferentes. 149 149 Tanji, H.; et al.; Nat. Struct. Mol. Biol. 2015, 22, 109-115. Capítulo 4 84 de unión al receptor TLR7. Posteriormente, estos conjugados adyuvante-alérgeno serán evaluados en ensayos in vitro mediante colaboraciones con diferentes grupos biomédicos. Para conseguir este objetivo general, se definen a continuación una serie de objetivos específicos: - Síntesis de una estructura basada en un derivado de 8-oxoadenina convenientemente funcionalizada para su conjugación. - Conjugación de esta estructura con diferentes péptidos inmunogénicos sintéticos de forma rápida, sencilla y eficaz. - Evaluación biológica de estos conjugados péptido-adyuvante. 4.4 Síntesis del ligando de TLR7 Atendiendo a los estudios SAR descritos en la bibliografía para estas estructuras, se decidió llevar a cabo la derivatización de la 8-oxoadenina en la posición para del anillo aromático presente en el N9 de la estructura. El grupo de Isobe había demostrado anteriormente que esta posición era adecuada para la derivatización sin una pérdida de la capacidad de unión al TLR7. 177 (Figura 4.5) Figura 4.5. Estructura de un derivado de 8-oxoadenina con la posición para marcada (R), donde es posible la derivatización sin pérdida de su actividad. El grupo malemido, necesario para la conjugación del alérgeno vía reacción de tipo tioleno, como se ha visto a lo largo de la presente Tesis Doctoral, se unió a la posición indicada a través de un espaciador de etilenglicol. Esta elección se debe a que se ha demostrado que este espaciador ofrece un impedimento estérico mínimo, de tal forma que no influye negativamente en el reconocimiento del ligando por parte de TLR7, además de proporcionar una mejor solubilidad en medios acuosos. 178 En el Esquema 4.1 se 177 Kurimoto, A.; et al.; J. Med. Chem. 2010, 53, 2964–2972. 178 Chan, M.; et al.; Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1194-1200. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 85 presenta el esquema retrosintético propuesto para la síntesis de este nuevo derivado de 8oxoadenina, incorporando un grupo maleimido. Esquema 4.1. Ruta retrosintética del derivado de 8-oxoadenina objetivo 22 (en rojo). Una vez establecida una ruta retrosintética, se abordó la síntesis del compuesto objetivo. En primer lugar, se llevó a cabo la preparación del espaciador de etilenglicol funcionalizado en sus extremos con un grupo azido y otro amino, siguiendo las condiciones descritas en la bibliografía. 179 (Esquema 4.2) 179 Bakleh, M.E. et al.; Tetrahedron 2009, 36, 7385-7392. Capítulo 4 86 Esquema 4.2. Síntesis del espaciador aminoazida 15. Para ello, se llevó a cabo la azidación del espaciador comercial bis[2-(2cloroetoxi)etil]eter en DMF a 60ºC durante dos días, obteniéndose la diazida 14 con buen rendimiento (87%). El siguiente paso consistió en la reducción selectiva de una de las azidas mediante una reacción de Staudinger, en una mezcla de dietiléter, tetrahidrofurano y HCl 1M, usando como agente reductor trifenilfosfina, obteniéndose el espaciador aminoazida 15 con un rendimiento del 85%. El compuesto fue caracterizado fundamentalmente por su espectro de 13C-RMN donde se observó la aparición de una señal a 41.7 ppm, característica del metileno unido a la amina formada, así como por espectrometría de masas (ESI-MS), donde se pudo detectar la señal correspondiente al ión molecular protonado (Figura 4.6). Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 87 Figura 4.6. Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3, 298 K) (arriba) y ESI-MS (abajo) del compuesto 15. La siguiente etapa consistió en la modificación de la estructura de la adenina, siguiendo las condiciones descritas en la bliblografía.177 (Esquema 4.3) Esquema 4.3. Síntesis del derivado de adenina 16. Para ello, se hizo reaccionar el compuesto comercial 2-amino-6-cloropurina con sodio metálico y butanol anhidro, calentado toda la noche a 140ºC para generar la sal del butóxido in situ y desplazar el átomo de cloro de la estructura. Así se obtuvo el derivado Capítulo 4 88 16 con buen rendimiento (84%) y se confirmó su estructura por medio de 1H-RMN, donde se observó la aparición de las señales características del grupo butóxido, así como su relación de integración con el resto de señales. (Figura 4.7) Figura 4.7. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) del compuesto 16. Según lo establecido en la ruta retrosintética, el siguiente paso consistió en la formación de una amida entre el espaciador 15 y el ácido 4-bromometilbenzoico comercial. (Esquema 4.4) Esquema 4.4. Preparación del compuesto 17. En primer lugar, se hizo reaccionar el ácido 4-bromometilbenzoico con cloruro de tionilo a reflujo durante 3 horas para formar el correspondiente cloruro de acilo, que fue inmediatamente añadido a la amina 15 disuelta en diclorometano anhidro para formar la amida 17. El análisis por espectroscopía de 1H-RMN mostraba dos señales del metileno unido al halógeno, una a 4.63 y otra a 4.52 ppm, lo que indicaba la existencia de una mezcla de dos compuestos, uno con Cl y otro con Br, respectivamente, debido a una cloración parcial por el cloruro de tionilo. Esta mezcla con una relación aproximadamente (60:40, Br:Cl), que posee el mismo Rf, también fue identificada por medio de Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 89 espectrometría de masas (ESI) en el que se observa el ión molecular de cada uno con el patrón isotópico correspondiente. (Figura 4.8) Figura 4.8. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3, 298 K) (arriba) y de ESI-MS (abajo) del compuesto 17. A la vista de este resultado, se intentaron otras alternativas de amidación que evitaran esta cloración parcial, como el uso de HATU como agente de acoplamiento; sin embargo, esta alternativa fue infructuosa, ya que no se formó el producto buscado. Por tanto, se decidió continuar con la síntesis, ya que la siguiente etapa, consistente en la N-alquilación del derivado de adenina 16, era posible con los dos halogenuros 17. (Esquema 4.5) Esquema 4.5. N-alquilación para la formación del compuesto 18. Capítulo 4 90 Para ello, se usaron unas condiciones similares a las descritas para la N-alquilación de otras adeninas. 180 El compuesto 16 fue disuelto en DMF anhidra y tratado con K2CO3, seguidamente se añadió el espaciador 17 y la reacción se agitó a t.a. durante 72 h, obteniéndose el derivado 18 con buen rendimiento (69%). Este compuesto fue satisfactoriamente caracterizado por RMN, así como por espectrometría de masas (ESI). (Figura 4.9) Figura 4.9. Espectro de ESI-MS del compuesto 18. Llegados a este punto, se abordó la síntesis de la estructura de la 8-oxoadenina, siendo necesario en primer lugar la bromación de la posición C8, usando las condiciones descritas para otros derivados similares. 181 (Esquema 4.6) Esquema 4.6. Síntesis del derivado bromado 19. Sobre el compuesto 18 en cloroformo, se adicionó bromo y la mezcla fue agitada protegida de la luz. Después de la purificación por medio de una cromatografía en columna de gel de sílice, se obtuvo el derivado bromado 19. El compuesto fue identificado por medio de su espectro de 1H-RMN, en el que se observa claramente la desaparición de la señal a 7.62 ppm correspondiente al protón en la posición C8. En su espectro de masas (ESI) se pudo observar la señal correspondiente al ion molecular más 180 Siah, H.S.M.; Gundersen, L.L.; Synth. Commun. 2013, 43, 1469-1476. 181 Meszarosova, K.; Holy, A.; Masojidkova, M.; Collect. Czech. Chem. Commun. 2000, 65, 1109-1125. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 91 sodio, el cual presenta el característico perfil isotópico de compuestos que contienen bromo. (Figura 4.10) Figura 4.10 Comparación de espectros de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3, 298 K) de los compuestos 18 y 19 (arriba) y de ESI-MS (abajo) del compuesto 19. El siguiente paso para la formación de la estructura de la 8-oxoadenina consistió en la hidrólisis del bromo en la posición C8. (Esquema 4.7) Capítulo 4 92 Esquema 4.7. Síntesis del derivado de 8-oxoadenina 20. Esta reacción requiere de condiciones muy energéticas como es el tratamiento con ácido fórmico a reflujo durante una noche. De esta forma se obtuvo el compuesto 20 con un rendimiento moderado (47%). Este compuesto fue satisfactoriamente caracterizado por 1H-RMN, en el que se observa la aparición de una nueva señal a campo bajo (10.00 ppm) correspondiente a la formación del protón unido al nitrógeno de la imidazolina. En su espectro de ESI se observó la señal correspondiente al ion molecular con sodio del compuesto 20. (Figura 4.11) Figura 4.11. Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (arriba) y de ESI-MS (abajo) del compuesto 20. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 93 Una vez sintetizado el derivado 20, fue necesaria la introducción del grupo maleimido para la conjugación de los péptidos. Para ello, la maleimida 9 (Capítulo 3) fue derivatizada para poder incorporar un grupo alquino mediante esterificación con el alcohol propargílico usando las condiciones descritas en la bibliografía. 182 Una vez sintetizado este alquino-maleimida 21, fue utilizado en la reacción click CuAAC junto a la azida 20. Esta reacción click tuvo que ser optimizada debido a una serie de inconvenientes encontrados. En primer lugar, no se pudo usar el TBTA como estabilizante de Cu(I), ya que tenía un Rf idéntico al del producto de la reacción, a pesar de la gran variedad de eluyentes y/o condiciones de precipitación probadas. Tampoco fue posible el uso del ascorbato sódico, para reducir in situ el Cu(II) a Cu(I), ya que como se ha comentado previamente, este puede reaccionar con el grupo maleimido. Por lo tanto, la única alternativa plausible consistió en el uso de CuBr como fuente de Cu(I), añadido a lo largo de la reacción bajo condiciones anhidras. Se probaron distintas condiciones, variando el número de equivalentes, el tiempo entre cada adición e incluso el calentamiento mediante el uso de un reactor de microondas; sin embargo, todos estos esfuerzos fueron infructuosos. Otra dificultad añadida podría ser que la azida 20 y el alquino 21, al ser insolubles en medios acuosos, tenían que ser disueltos en una mezcla acetonitrilo/DMSO y, por lo tanto, esto imposibilitaba el uso de disoluciones tampón ligeramente básicas, dificultando la desprotonación del alquino, imprescindible para iniciar el ciclo catalítico de la reacción CuAAC. Debido a que este intermedio era el último de la síntesis del ligando objetivo, se buscaron otras posibles modificaciones de la reacción CuAAC. Dado que esta reacción click ha tenido una gran aplicabilidad, en la bibliografía se recoge una amplia variedad de condiciones de reacción. Por ejemplo, el grupo de Fokin fue el primero en inmovilizar el TBTA sobre una resina de TentaGel, 183 (Figura 4.12) demostrando que era capaz de quelar el Cu(I) y por lo tanto, de estabilizarlo frente a la oxidación de una forma más eficiente que el TBTA monomérico en disolución. Esto es debido a la gran concentración local de TBTA sobre la superficie de la resina, que ejerce un importante efecto estérico sobre el Cu(I), protegiéndolo más eficientemente contra la oxidación. 182 Rodriguez, M. J. et al.; Mol. Nutr. Food Res. 2017, 10, 1700110. 183 Chan, T.R.; Fokin, V.V.; QSAR Comb. Sci. 2007, 26, 1274-1279. Capítulo 4 100 Figura 4.16. Cromatograma de RP-HPLC (arriba) y espectro de ESI-MS (abajo) del conjugado 24. También se llevó a cabo la conjugación de esta maleimida 22 con otro péptido, el Ole109130-SH, que como se ha comentado previamente corresponde a la proteína Ole e 1, el alérgeno más predominante en pacientes alérgicos al polen del olivo. (Esquema 4.11) Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 101 Esquema 4.11. Síntesis del conjugado 25 con el péptido Ole109-130-SH. En este caso, al realizarse la conjugación y monitorizarse por RP-HPLC, se observó la formación mayoritaria de dos señales con intensidades similares. Siguiendo el mismo protocolo establecido, se realizó una ultrafiltración a través de una membrana de corte molecular de 3 KDa, manteniéndose estas dos señales. Sorprendentemente, el análisis por espectrometría de masas reveló que ambas señales correspondían a compuestos con la misma masa correspondiente al conjugado 25, no observándose señales de los productos de partida u otras impurezas. (Figura 4.17) Capítulo 4 102 Figura 4.17. Cromatograma de RP-HPLC con la aparición de dos señales (arriba) y espectro de ESI-MS (abajo) del conjugado 25. Estos resultados ponen de manifiesto la formación de dos conjugados con el mismo peso molecular durante el trascurso de la reacción, así como idénticos espectros de absorción para ambas señales, lo que sugiere la formación de estereoisómeros. Como se comentó previamente, la reacción tiol-eno para la conjugación de tioles a maleimidas tiene lugar mediante una adición de tipo Michael, en la que se produce un ataque nucleófilo de un tiolato al doble enlace de la maleimida. Esta adición no es enantioselectiva ya que no hay ningún tipo de inducción asimétrica (como un catalizador quiral). Es decir, el tiolato se adiciona de forma inespecífica por ambas caras del doble enlace de la maleimida. Concretamente, debido a la estructura de la malemida, en el carbono en el que se produce la adición, se genera un centro quiral. Los protones adyacentes a este punto son diastereotópicos. De esta forma se generarían dos enantiómeros en la misma proporción, lo que es conocido como mezcla racémica o racemato, (Figura 4.18) que resulta ópticamente inactivo. 184 184 Jacques, J.; Collet, A.; Wilen, S.H.; Enantiomers, racemates, and resolutions. 1981, New York: Wiley. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 103 Figura 4.18 Representación del ataque nucleófilo de un tiolato al doble enlace de la maleimida, en la que se generan los dos enantiómeros equimolecularmente (racemato). Sin embargo, en el caso de que el tiol sea quiral, como es el caso de un péptido con una cisteína terminal, no se formaría un racemato, sino una mezcla de epímeros que son diastereoisómeros. Los diastereoisómeros, a priori, 185 pueden ser separados por cromatografía. De hecho, en un trabajo reciente del grupo de Geyer, se estudió la adición tiol-eno entre maleimidas y péptidos en el que demuestra la formación de estos epímeros. En este estudio, también proponen procesos mediados por equilibrios de epimerización, así como la separación de estos epímeros por RP-HPLC. 186 (Figura 4.20) Figura 4.20. Cromatograma de RP-HPLC, en el que se observa la separación de los dos epímeros (DS1 y DS2). Figura extraída de la referencia 186. 185 Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Organic Chemistry, 2th Edition, 2012, Oxford University Press, 1112. 186 Lenz, S.; Horx, P.; Geyer, A.; J. Pep. Sci. 2018, 24, e3075. Capítulo 4 104 A la vista de estos antecedentes y con los datos que disponíamos parecía claro que las dos señales observadas en el cromatograma de la Figura 4.17 se correspondían con los dos epímeros del conjugado 25. Cabe destacar que este conjugado fue el único con el que se consiguió visualizar la separación de sus epímeros de toda la presente Tesis Doctoral. Este hecho se puede atribuir a la secuencia particular del péptido, que puede originar interacciones con el relleno de la columna cromatográfica, favoreciendo esta separación. Los epímeros de péptidos que solamente difieren en la disposición espacial de uno de sus centros quirales, no varían significativamente las propiedades físico-químicas del conjugado, aumentando así la dificultad de la separación cromatográfica. 187 Estos inconvenientes implican que la resolución de epímeros de péptidos constituye todo un desafío en el que actualmente se sigue realizando una intensa investigación. 188 , 189 En este estudio de conjugación del ligando derivado de la 8-oxoadenina 22 a tres péptidos diferentes, se ha demostrado la versatilidad de esta estrategia sintética y el potencial que tiene para el desarrollo de nuevas terapias basadas en AIT frente a diferentes alergias en función del tipo de péptido elegido. 4.6 Evaluación biológica de los conjugados péptido-8oxoadenina Una vez sintetizados y caracterizados los conjugados de los diferentes péptidos alergénicos, se procedió a su evaluación biológica para determinar su capacidad de mediar en el trastorno de enfermedades alérgicas a través de la modulación del sistema inmune. Estas evaluaciones biológicas se realizaron mediante colaboraciones con distintos grupos de investigación. Estos ensayos se realizaron siguiendo el mismo procedimiento que para los conjugados de TLR4 (Capítulo 3). La evaluación biológica de los conjugados del alérgeno del pescado (24) y del olivo (25) se está llevando a cabo actualmente. Los estudios que están más avanzados se corresponden con el conjugado del péptido del alérgeno de melocotón (Pru p 3) 23, que 187 Zhang, B.; Soukup, R.; Armstrong, D.W.; J. Chromatogr. A 2004, 1053, 89-99. 188 Li, G.; DeLaney, K.; Li, K.; Nat. Commun. 2019, 10, 5038. 189 Du, S.; Readel, E.R.; Wey, M.; Armstrong, D.W.; Chem. Commun. 2020, 56, 1537-1540. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 105 se han realizado en el grupo de alergología de la Dra. Cristobalina Mayorga del Hospital Regional Universitario de Málaga. En primer lugar, se llevaron a cabo experimentos de internalización del conjugado 23 en moDCs. Para ello, el conjugado 23 fue marcado fluorescentemente en la región del péptido por medio del reactivo comercial Alexa fluor 647. Con el compuesto marcado, se analizó la interacción e internalización con las moDCs usando citometría de flujo y microscopía confocal. Los resultados de los estudios de citometría de flujo indicaron que el conjugado 23 fue internalizado por las moDCs de una manera dependiente del tiempo (Figura 4.21) Figura 4.21. A) Gráficos de citometría de flujo a diferentes tiempos que muestran los porcentajes del conjugado 23 captado por las moDC CD86+. B) Imágenes confocales de las moDCs incubadas con el conjugado 23 (10 nM) a diferentes tiempos (de 1h a 24h). Los datos son consistentes con el análisis de citometría de flujo, que muestra el conjugado 23 marcado (en rosa) prácticamente sin internalización en la primera hora de la incubación, aumentando en las horas siguientes. En estos estudios se observa que no hay internalización efectiva hasta las 9 h, esto se puede explicar debido a que como se ha comentado previamente, TLR7 es un receptor intracelular, por lo tanto, la internalización no es dependiente del receptor, como ocurría en el caso del TLR4, y tiene lugar mediante otros mecanismos como la endocitosis, siendo un proceso más lento. La captación del conjugado continuó aumentando hasta las 48 horas. Mediante microscopía confocal y la tinción de diferentes estructuras intracelulares se pudo Capítulo 4 106 visualizar el proceso de internalización del compuesto 23 y su co-localización con dichas estructuras. (Figura 4.22) Figura 4.22. Imagen confocal a las 48 h que muestra diversas regiones celulares y el conjugado 23 internalizado (rosa). La actina de la submembrana se tiñó con Atto 488-faloidina (verde) y los núcleos con Hoechst (azul). Estos estudios demuestran que el conjugado 23 es internalizado por parte de las moDCs y se localiza en la zona perinuclear, cerca del aparato de Golgi, ya que hay un alto tráfico de formación de vesículas, entre ellas los endosomas que es donde se expresa el TLR7. A continuación, se analizó el efecto de este conjugado en el proceso de maduración de las DCs, a través de marcadores como son moléculas co-estimuladoras y citoquinas. En estos ensayos se evaluaron el péptido alergénico (Pp3); la estructura de la 8oxoadenina 20 (TLR7lig); el conjugado 23 (TLR7lig-Pp3); y la combinación del ligando 20 y el péptido Pp3 sin estar unidos covalentemente (TLR7lig+Pp3). Esta nomenclatura se utilizará de ahora en adelante para una mayor sencillez. (Figura 4.23) Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 107 Figura 4.23. Las barras representan la mediana y el error estándar de la media del índice de maduración (A) para los diferentes marcadores de superficie en las moDCs (CD80 y CD86) y marcadores de expresión de activación/regulación (CD83 y PD-L1, respectivamente); (B) de la producción de citoquinas (IL-4, IL-5, IL-10 e IFN), en los sobrenadantes de los ensayos de las moDCs para Pp3, TLR7lig, TLR7lig-Pp3 y TLR7lig+Pp3 de pacientes alérgicos (n = 9) y controles (n = 9) a 10 nM. La prueba U de Mann-Whitney se usó para comparaciones por pares entre grupos no relacionados y la prueba de rango con signo de Wilcoxon se usó para comparaciones por pares en muestras relacionadas, mostrando diferencias significativas como **, (p <0.0125, corrección de Bonferroni. La línea de puntos representa el índice de maduración > 2. Para confirmar la maduración de las moDCs se analizaron los marcadores de superficie (CD80 y CD86). TLR7lig-Pp3 induce niveles significativos de estos marcadores en Capítulo 4 108 pacientes alérgicos comparados con los controles. También se realizó esta comparación para los marcadores de expresión de activación/regulación (CD83 y PD-L1, respectivamente), en el que se refleja un aumento significativo de ambos por parte de TLR7lig-Pp3. De este análisis también se concluye que la estructura de la 8-oxoadenina es capaz de inducir la maduración de las moDCs, ya que el compuesto TLR7lig (20) estimula la secreción de CD86 únicamente en pacientes alérgicos. (Figura 4.23A) Este hecho, recogido en la bibliografía anteriormente, demuestra que es posible la activación de DCs provenientes de individuos alérgicos por medio de ligandos sintéticos de TLR sin llevar alérgenos conjugados. 190 Adicionalmente, también se demuestra que el péptido Pru p 3 conjugado estimula la expresión del marcador CD83 en pacientes alérgicos, según lo observado para TLR7ligPp3, cosa que no ocurre con el ligando TLR sin péptido. Además, esto se confirmó por el hecho de que el péptido Pp3, incluido como control, también indujo un aumento significativo de la expresión de CD83 en pacientes alérgicos en comparación con los controles. Por otro lado, se estudió el efecto de la unión entre el ligando y el péptido tanto unidos de forma covalente (TLR7lig-Pp3) como administrados de forma conjunta pero no unidos covalentemente (TLR7lig+Pp3). Los datos mostraron que TLR7lig-Pp3 condujo a un aumento significativo de los marcadores CD83, CD86 y PD-L1 en comparación con la estimulación provocada con TLR7lig+Pp3 (Figura 4.23A). Estos resultados indican que la unión covalente entre el ligando y el péptido es esencial para inducir una respuesta significativa. (Figura 4.24) 190 Goff, P. H; et al.; J. Virol. 2015, 89, 3221-3235. Síntesis de conjugados alérgeno-8-oxoadenina para el receptor TLR7 109 Figura 4.24. Representación de los efectos que inducen en las moDCs el ligando de 8-oxoadenina y el péptido Pru p 3 (unidos covalentemente o combinados) en la expresión de marcadores celulares. Por lo tanto, este conjugado 23 activa, regula y madura la expresión de los marcadores de superficie de las moDCs, siendo estas células esenciales para iniciar la respuesta inmune, lo que demuestra la importancia de la activación de TLR7 en este proceso. Para estudiar el patrón de respuesta durante la maduración de las moDCs después de la incubación con TLR7lig-Pp3, se midió la liberación de citoquinas en el sobrenadante del cultivo. (Figura 4.23B) En el análisis de las células procedente de pacientes alérgicos, en comparación con los controles, se observó aumentos significativos de IL-5 e IFN para todas las estructuras que incorporaban la 8-oxoadenina (TLR7lig, TLR7lig-Pp3 and TLR7lig+Pp3). Además, no se observaron diferencias en la inducción de la producción de IL-10 en pacientes alérgicos en comparación con los controles para cualquiera de las estructuras probadas. Tampoco se observaron diferencias en la producción de citoquinas después de la estimulación con TLR7lig-Pp3 y TLR7lig+Pp3. Curiosamente, se observó que la estructura TLR7lig-Pp3 (23) indujo niveles significativamente más bajos de IL-4 e IL-5, y niveles más altos de IFNγ en comparación con Pp3, solo en pacientes alérgicos, lo que indica la capacidad inmunomoduladora específica de este compuesto. Estos resultados son consistentes con la biblografía, ya que se ha relacionado la activación de TLR7 por parte de ligandos con un aumento de los niveles de IFN. 191 Por lo tanto, estos datos indican que la estimulación con TLR7lig-Pp3 191 Chan, M.; et al.; Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1194-1200. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alérgenos y estudio de su actividad biológica 117 5. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alérgenos y estudio de su actividad biológica 5.1 Introducción En las últimas dos décadas se ha desarrollado una gran actividad en torno a los TLRs. Durante estos años, las investigaciones han ido abordando diferentes aspectos: descubrimiento de nuevos TLRs y sus ligandos, determinación de sus estructuras moleculares, mecanismos de activación, cascadas de señalización, etc. 195 A medida que se conocía más información acerca de estos receptores, se generaban nuevas cuestiones, por ejemplo, qué ocurre cuando se activaban distintos receptores simultáneamente. Debido a la gran similitud estructural que tienen algunos TLRs, por ejemplo, TLR7 y TLR8 (Capítulo 4), estos receptores pueden compartir el mismo ligando, como es el caso del Resiquimod, un ligando tanto para TLR7 como TLR8. De esta forma, el mismo ligando puede activar de forma independiente dos receptores distintos, lo que apunta a una posible redundancia en la actividad de estos dos receptores. 196 En un estudio de 2008, se evaluó la exposición simultánea y secuencial de diferentes ligandos de TLRs, tanto in vitro como in vivo (en ratones). Ese estudio preliminar constató que, a pesar de las diferentes vías de activación de esta familia de receptores, se observaba incrementos en la expresión de citoquinas, dando lugar a un efecto sinérgico, es decir, la cooperación entre diferentes tipos de TLRs, potenciando sus efectos. Por otro lado, en la bibliografía hay descritos numerosos ejemplos en los que se observa el efecto contrario, la activación de varios TLRs que conlleva la secreción de citoquinas que se contrarrestan unas con otras, dando lugar a una inhibición en su actividad. 197 Sin embargo, es importante remarcar que todo el sistema de defensa basado en los TLRs está dirigido claramente a la lucha contra patógenos. La estimulación sinérgica de TLRs es probablemente lo que sucede realmente, ya que los patógenos pueden contener diversos PAMPs que interaccionan con los correspondientes TLRs que se encuentran en diferentes 195 Jiménez-Dalmaroni, M.J.; Gerswhin, M.E.; Adamopoulos, I.E.; Autoimmun. Rev. 2016, 15, 18. 196 Heil, F.; et al.; Science 2004, 303, 1526-1529. 197 Theiner, G.; et al.; Mol. Immunol. 2008, 45, 244-252. Capítulo 5 118 localizaciones celulares. Por ejemplo, se ha descrito que componentes del virus herpes simplex son reconocidos por TLR2 y 9, estimulando respuestas sinérgicas en la lucha contra este virus. 198 Estos componentes virales corresponden a glicoproteínas 199 de su envoltura viral que son PAMP de TLR2 y su ADN que es un PAMP de TLR9. Figura 5.1 Representación del virus herpes simplex que contiene PAMPS reconocidos por TLR2 y 9. Por otro lado, se ha estudiado el efecto de agonistas del receptor TLR2 con otros PAMPs, por ejemplo, con el ARN bicatenario (un intermedio en la replicación viral) como PAMP de TLR3. En un trabajo del grupo de Hirsch, se estudió el efecto de los agonistas de estos receptores en una línea celular de macrófagos de ratón. Se observó que, en comparación con la estimulación de los agonistas por separado, la estimulación de macrófagos con ambos ligandos (ya sea de forma simultánea o secuencial) dio lugar a la expresión sinérgica de mediadores inflamatorios. 200 En la línea de estas investigaciones, se puso de manifiesto que, en función de las concentraciones de los agonistas individuales, estos tienen diferentes umbrales de inducción. Este descubrimiento tiene un claro sentido biológico ya que la presentación de 198 Sørensen, L.N.; Reinert, L.S.; Malmgaard, L.; Bartholdy, L.; Thomsen, A.R.; Paludan, S.R.; J. Immunol. 2008, 181, 8604-8612. 199 Leoni, V.; Gianni, T.; Salvioli, S.; Campadelli-Fiume, G.; J. Virol. 2012, 86, 6555-6562. 200 Ilievski, V.; Hirsch, E.; Biol. Reprod. 2010, 83, 767-773. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alérgenos y estudio de su actividad biológica 119 antígenos promueve adicionalmente la generación de células efectoras potencialmente dañinas y, por lo tanto, este mecanismo debe ser mantenido bajo un estricto control. Por ello, la estimulación sinérgica de TLRs puede representar un “código de seguridad” combinatorio (dos productos microbianos presentes en diferentes compartimentos celulares) que asegura que una potente respuesta del sistema inmune solo se generará frente a una peligrosa invasión de un patógeno. 201 Como se ha comentado en capítulos anteriores, debido al tardío descubrimiento de los TLRs, muchos fármacos utilizados frente a una amplia gama de enfermedades resultaron tener interacción con dichos receptores sin conocerlo previamente. Algo parecido ocurrió con el efecto sinérgico entre los TLRs. Por ejemplo, la vacuna de la fiebre amarilla (YF17D) es considerada una de las vacunas más eficaces de la historia, siendo ampliamente usada desde hace más de 65 años con una tasa de protección mayor del 98%. En muchos pacientes se han encontrado anticuerpos neutralizantes hasta 35 años después de haber recibido una sola dosis de la vacuna. 202 Esta protección no se genera únicamente mediante anticuerpos, también se ha demostrado que esta vacuna es un potente inductor de células T citotóxicas. 203 Esta vacuna está basada en una cepa del propio virus atenuado; 204 sin embargo, a pesar de la eficacia de esta vacuna para controlar la fiebre amarilla, los mecanismos moleculares y celulares involucrados en esta inmunización no estaban del todo claros. En un interesante estudio del grupo de Pulendran, publicado en 2006, se demuestra que esta vacuna YF-17D estimula a las DCs a través de la activación de 4 receptores, TLR2, 7, 8 y 9, provocando la secreción de las citoquinas pro-inflamatorias, IL-12p40, IL-6 e IFN-α. 205 Las respuestas inmunitarias adaptativas resultantes se caracterizaron por una mezcla del perfil de citoquinas de células colaboradoras TH1 y TH2, así como de células T CD8+ específicas de antígeno. El estudio se llevó a cabo con ratones con diversas modificaciones, entre ellas, un grupo que no presentaba la proteína accesoria MyD88, asociada a la activación de todos los TLRs excepto TLR3. 206 También se utilizó un grupo de ratones que no expresaban el receptor TLR2. De esta forma y con 201 Napolitani, G.; Rinaldi, A.; Bertoni, F.; Sallusto, F.; Lanzavecchia, A.; Nat. Immunol. 2005, 6, 769–776. 202 Poland, J.D., C.H. Calisher, T.P. Monath, W.G. Downs, and K. Murphy; Bull. World Health Organ. 1981, 59, 895-900. 203 Co, M.D.; Terajima, M.; Cruz, J.; Ennis, F.A.; Rothman, A.L.; Virology 2002, 293, 151-163. 204 Norrby, E.; J. Exp. Med. 2007, 204, 2779-2784. 205 Querec, T.; et al.; J. Exp. Med. 2006, 203, 413-424. 206 Yamamoto, M.; et al.; Science 2003, 301, 640-643. Capítulo 5 120 el conocimiento del perfil de citoquinas generado por la activación de un TLR en concreto, se consiguió realizar la identificación de los TLRs implicados. Además, distintos TLRs parecen controlar diferencialmente el equilibrio TH1/TH2. Mientras ratones deficientes de la proteína MyD88 muestran un profundo deterioro de las citoquinas asociadas a TH1, los ratones deficientes de TLR2 muestran respuestas TH1 muy mejoradas. Estos estudios demuestran el potencial de las estrategias de vacunación que utilizan combinaciones de diferentes ligandos TLR para estimular respuestas inmunes polivalentes. 5.2. Combinación covalente de agonistas de TLR El efecto sinérgico en el ámbito de los receptores TLR aún sigue siendo un campo por explorar, en el que es necesario una profunda investigación. Muchas combinaciones de agonistas de TLR influyen en la señalización inmunitaria con una dependencia tanto del orden como del tiempo en el que se produce la adición. 207 , 208 La comprensión de cómo la disposición espacial de los agonistas presentes en una única estructura afecta la activación de los TLRs y al sistema inmunológico en general, es muy limitada, siendo un factor crítico en la bioconjugación. 209 Esto es debido a que la búsqueda de sinergias entre distintos agonistas se ha limitado a la combinación de mezclas de agonistas de TLR en disolución. En la bibliografía se encuentran algunos ejemplos interesantes. Se ha descrito el encapsulamiento del Imiquimod (ligando de TLR7) y el GLA (ligando de TLR4) en un liposoma. Esta encapsulación dio lugar a una potente respuesta de tipo TH1, a través de la secreción de IL12p70 e IFNγ en células humanas. Estos marcadores aumentaban su expresión cuando eran activados con el liposoma conteniendo ambos ligandos, en comparación a cuando se probaban los ligandos por separado, demostrándose un claro efecto sinérgico. 210 Como se ha comentado previamente, la presentación más idónea sería una única molécula que contenga covalentemente unidos los agonistas de TLR. De esta forma, la separación 207 Honda, K.; et al.; Nature 2005, 434, 1035-1040. 208 Ghosh, T. K.; Mickelson, D. J.; Solberg, J. C.; Lipson, K. E.; Inglefield, J. R.; Alkan, S. S. Int. Immunopharmacol. 2007, 7, 1111-1121. 209 Liu, H.; Irvine, D. J.; Bioconjugate Chem. 2015, 26, 791-801. 210 Goff, P. H.; et al.; J. Virol. 2015, 89, 3221-3235. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alérgenos y estudio de su actividad biológica 121 espacial entre ambos ligandos siempre sería constante y se consiguiría un mejor control y reproducibilidad de los efectos sinérgicos. Si los estudios sobre los efectos sinérgicos en la activación de TLRs son escasos, los ejemplos sobre estructuras que tengan dichos ligandos de TLR combinados por medio de enlaces covalentes, son aún más limitados, siendo fundamentalmente aquellos desarrollados por el grupo de Esser-Kahn. En 2014, este grupo sintetizó una estructura que combinaba covalentemente un fragmento de ADN con motivos CpG no metilados (PAMP de TLR9) y un ácido lipoteicoico, que es uno de los principales componentes de la pared celular de bacterias gram-positivas (PAMP de TLR2), utilizándose un espaciador bifuncional de PEG. 211 (Figura 5.2) Figura 5.2. Representación de la estructura que combina de forma covalente un ligando de TLR9 y otro de TLR2, a través de un espaciador de tipo PEG. Este compuesto fue capaz de inducir una producción de citoquinas implicadas en una respuesta de tipo TH1 significativamente mayor que la simple combinación de los dos ligandos sin unión covalente. Como conclusión, los autores plantean la hipótesis de que una presentación espacial definida de los agonistas altera drásticamente la estimulación de las células dendríticas. En 2021 se publicó una continuación de este trabajo, ampliando el estudio a más combinaciones de parejas de ligandos TLR, usando la misma estrategia de unión a través de un espaciador de tipo PEG. Con estos dímeros, se realizaron una serie de ensayos in vitro, comparando el marcador NF-κB, así como la expresión del perfil de citoquinas y TNF-α. Estos estudios demostraron la existencia de múltiples factores que afectan en la 211 Mancini, R. J.; Tom, J. K.; Esser-Kahn, A. P; Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 189-192. Capítulo 5 122 actividad de estos sistemas duales, como la cinética de activación inicial, la especificidad del ligando, así como la dosis del agonista. Adicionalmente, también se realizaron estudios sobre el mecanismo de activación de los heterodímeros, sugiriendo que las interacciones ligando-receptor influyen en la cinética transcripcional inicial y, por lo tanto, en la secreción de citoquinas. La respuesta inmune depende de múltiples factores, como interacciones atribuidas a los ligandos que forman los dímeros, la potencia del par agonista, o la vía de señalización que se activa. 212 En 2019 se publicó un sistema en el que se combinó simultáneamente de forma covalente tres agonistas para los receptores TLR4, 7 y 9. Como núcleo de unión se escogió un derivado de 1,3,5-triazina. 213 (Figura 5.3) Figura 5.3. Representación del compuesto trifuncional conteniendo ligandos para los receptores TLR4, 7 y 9 en una única estructura. Esta estructura con tres ligandos, en comparación con sus homólogos dímericos, proporciona una respuesta específica y más equilibrada en los ensayos in vitro, cambiando la polarización de la respuesta tipo TH1 a una más equilibrada TH1/TH2. Este compuesto aumentó la activación del factor de transcripción NF-κB y dio lugar a una producción mejorada de citoquinas, en contraste con las células tratadas con una mezcla no conjugada de los mismos tres agonistas. El uso de inhibidores de la señalización de TLR y estudios in vivo con ratones knock-out confirmaron que esta molécula tri-agonista era capaz de activar múltiples vías de señalización que conducen a la mayor actividad. Para confirmar 212 Kimani, F.W.; et al.; ACS Chem. Biol. 2021, 16, 380-388. 213 Albin, T.J.; et al.; ACS Cent. Sci. 2019, 5, 1137-1145. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alérgenos y estudio de su actividad biológica 123 que se activaban realmente los TLR correspondientes a los ligandos seleccionados, se realizaron estudios mecanicistas con ratones knock-out de la proteína adaptadora y los correspondientes inhibidores y agonistas de TLRs, para mostrar los receptores específicos y las vías a través de las cuales actuaba el compuesto trifuncionalizado. Adicionalmente, estos autores realizaron estudios de inmunización en un modelo de ratón. Los ratones tratados con los agonistas unidos covalentemente mostraron un aumento en la producción de anticuerpos, en comparación con el tratamiento con estos mismos agonistas por separado. Estos estudios demuestran cómo la activación de múltiples TLRs a través de una estructura con una organización espacial bien definida ayuda a guiar las respuestas inmunes, proporcionando la base para el diseño y desarrollo de vacunas más eficaces. 5.2.1 1,3,5-Triazinas como plataformas La necesidad de una disposición espacial bien definida de los agonistas de TLR en una estructura única ha demostrado ser un aspecto esencial para obtener una actividad sinérgica en estos compuestos. Para ello, resulta fundamental el estudio de plataformas que permitan la incorporación selectiva y sencilla de estos ligandos de forma controlada. Como se ha demostrado en el trabajo comentado anteriormente, las triazinas constituyen una alternativa muy atractiva para la conjugación de diversas estructuras. Diferentes derivados de triazinas han sido usados ampliamente como herbicidas, 214 aunque también han demostrado actividad farmacológica como agentes antimicrobianos, 215 anticancerosos 216 o antivíricos contra el VIH. 217 La estructura de la triazina es la de un anillo heterocíclico, análogo al anillo de benceno, pero con tres átomos de carbono reemplazados por átomos de nitrógeno. Los tres isómeros de la triazina se distinguen entre sí por la posición de sus átomos de nitrógeno, 1,2,3-triazina, 1,2,4-triazina y 1,3,5-triazina. (Figura 5.4) 214 Ralebitso, T.K.; Senior, E.; van Verseveld, H.W.; Biodegradation 2002, 13, 11-19. 215 Saleh, M.; Abbott, S.; Perron, V.; Lauzon, C.; Penney, C.; Zacharie, B.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 945-949. 216 Zheng, M.; et al.; Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 1815-1827 217 Xiong, Y.Z.; Chen, F.E.; Balzarini, J.; De Clercq, E.; Pannecouque, C. Eur. J. Med. Chem. 2008, 43, 1230-1236. Capítulo 5 124 Figura 5.4 Isómeros de la triazina. Este capítulo se centrará en la 1,3,5-triazina, que presenta átomos de carbono y de nitrógeno alternados en el anillo, siendo este isómero el más interesante desde el punto de vista de la conjugación. El método más común para obtener derivados de 1,3,5-triazina es a partir de la 2,4,6tricloro-1,3,5-triazina, también conocido como cloruro cianúrico, un producto de partida de bajo coste. 218 Esta triazina puede ser fácilmente funcionalizada de forma secuencial mediante el control de la temperatura de reacción. El primer ataque nucleófilo ocurre a 0ºC, mientras que el segundo requiere de temperatura ambiente y el tercero necesita de calentamiento. 219 (Esquema 5.1) Esquema 5.1. Representación del orden de adición nucleófila a partir del cloruro cianúrico con dependencia de la temperatura en la formación de triazinas trisustituidas. Este control tan marcado en la reactividad se debe a que esta decrece con cada sustitución nucleófila, ya que se produce una ganancia de densidad electrónica en el orbital π, lo que reduce la efectividad de las reacciones de sustitución nucleófila. Es decir, con cada nueva sustitución, el anillo de triazina está cada vez más desactivado y es necesario un incremento de la temperatura. Esto es debido a que las triazinas son funcionalizadas por 218 Haval, K. P.; Synlett. 2006, 13, 2156-2157. 219 Sharma, A.; Sheyi, R..; de la Torre, B.G.; El-Faham, A.; Albericio, F.; Molecules 2021, 26, 864. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alérgenos y estudio de su actividad biológica 125 medio de reacciones de sustitución nucleófila aromática (SNAr). 220 Este tipo de reacciones no ocurren en sus homólogos de benceno, debido a las diferentes zonas de densidad electrónica presentes entre estas dos estructuras. 221 Los anillos de benceno poseen una alta densidad electrónica distribuida homogéneamente en todos sus carbonos, sin embargo, debido a la estructura del cloruro cianúrico, los átomos de cloro retiran densidad de carga del anillo de triazina. Adicionalmente los átomos de nitrógeno atraen densidad electrónica. Estos efectos electrónicos permiten que las posiciones 2, 4 y 6 del cloruro cianúrico sean susceptibles de participar en reacciones de tipo SNAr, al formarse regiones de baja densidad electrónica. A medida que se van intercambiando átomos de cloro en la estructura por diferentes sustituyentes, se incrementa la densidad de carga en el anillo de la triazina debido a la pérdida de estos efectos inductivos negativos. 222 (Figura 5.5) Estos efectos electrónicos explican el hecho de que la energía de activación aumente con cada sustitución en el cloruro cianúrico, requiriéndose cada vez mayores temperaturas en cada etapa. 223 , 224 220 Steffensen, M.B.; Hollink, E.; Kuschel, F.; Bauer, M.; Simanek, E.E.; J. Polym. Sci. A. Polym. Chem. 2006, 44, 3411-3433. 221 Ugozzoli, F.; Massera, C.; CrysEngComm 2005, 7, 121-128. 222 Ramakrishna, S.; Ma, Z.; Matsuura, T.; Polymer Membranes in Biotechnology: Preparation, Functionalization and Application, 2011, London: Imperial College Press. 223 Sharma, A.; Sheyi, R.; Kumar, A.; El-Faham, A.; de la Torre, B.G.; Albericio, F.; Org. Lett. 2019, 21, 7888-7892. 224 Blotny, G.; Tetrahedron 2006, 62, 9507-9522. Capítulo 6 228 Figura 6.30. Superposición de los espectros de absorción de la cetona 61 (en azul) y la hidrazona 62 (en rojo). La ecuación de Lambert-Beer establece que A= lƐC, siendo, A la absorbancia, l es la longitud del camino óptico, Ɛ la absortividad de la sustancia y C la concentración de la misma. 345 Realizando la medición a λ=275.6 nm, podemos establecer que las absortividades de la cetona y la hidrazona son equivalentes, de esta forma se satisface la ecuación de Lambert-Beer. Por lo tanto, a esta longitud de onda es posible cuantificar el porcentaje de hidrólisis de la hidrazona 62 mediante integración de los picos de los dos glicodendrones. Para la co-elución anterior a la misma concentración de ambos analitos, a una λ = 275.6 nm, la integración de cada uno de los picos resultó del 50%. Una vez optimizadas las condiciones para realizar la medición, se prepararon cuatro disoluciones tampón para evaluar el grado de hidrólisis de la hidrazona 62 en cada una de ellas. Un tampón fosfato a pH= 7.4 y tampones citrato a pH= 6, 5 y 3. Una vez preparadas, una disolución de la hidrazona 62 fue diluida en cada una de estas disoluciones tampón y agitadas a una temperatura de 37ºC. Se tomaron alícuotas de las incubaciones de la hidrazona 62 a diferentes intervalos de tiempo (1, 2, 4, 8, 24 y 36 h) y fueron analizadas por RP-HPLC a λ= 275.6 nm. Como se comentó previamente, a partir de la integración de los picos de la hidrazona 62 que se va hidrolizando y de la cetona 61 formándose, se obtuvieron los porcentajes de hidrólisis. Con estos datos se construyó la gráfica mostrada en la figura 6.31. 345 Mayerhöfer, T.G.; Pipa, A.; Popp, J.; ChemPhysChem 2019, 20, 2748-2753. Síntesis de conjugados alérgeno-glicodendrón y estudio de su actividad biológica 229 Figura 6.31. Gráfica que representa el porcentaje de hidrólisis de la hidrazona 62 a diferentes tiempos a pH= 7.4 (azul), 6 (amarillo), 5 (verde) y 3 (rojo). Cómo era previsible, los resultados demuestran una mayor ruptura de la hidrazona a valores de pH más bajos. En todos los casos se observa un valor constante a las 24 horas de la incubación. Desde la primera hora se observa una hidrólisis del 12% para un pH= 7.4 que no progresa, siendo ligeramente superior (15%) para pH= 6. La incubación a pH= 5.0 presenta una hidrólisis progresiva a lo largo del tiempo, siendo constante a las 24 horas, observándose una ruptura del 54%. Por último, en las condiciones más ácidas a pH= 3.0, se observa una rápida hidrólisis de la hidrazona 62, siendo completa a las 8 h. Si bien este último pH es demasiado extremo para el interior celular, es utilizado como control para demostrar las condiciones en la que la hidrazona 62 es completamente hidrolizada. Este experimento se realizó por duplicado observándose el mismo resultado. Cómo se comentó previamente, en compartimentos celulares como los lisosomas se alcanza aproximadamente un pH= 5.0. Con este pequeño ensayo, que replicaría las condiciones en el interior celular, se produciría una ruptura de aproximadamente la mitad de la hidrazona, lo que podría mejorar la presentación del péptido. También se confirma que, en un ambiente fisiológico de pH= 7.4, no se observa una hidrólisis relevante de la hidrazona, por lo que durante las etapas de administración, transporte e internalización celular no se liberaría una proporción significativa de péptido. Capítulo 6 230 Para verificar el grado de hidrólisis durante su almacenamiento, se realizó un experimento adicional con la hidrazona 62 Después de un almacenamiento sin disolvente a -20ºC durante un año y cinco meses, se realizó un análisis por RP-HPLC. (Figura 6.32) Figura 6.32. Cromatograma que muestra la hidrólisis de la hidrazona 62 después de 1 año y 5 meses almacenada a -20ºC. Este análisis por RP-HPLC demostró que durante todo este tiempo, solamente se había producido un 8.5% de hidrólisis de la hidrazona 62, siendo un dato fundamental para su potencial aplicación en el desarrollo de un fármaco. Estos resultados ponen de manifiesto una buena robustez de la hidrazona 62 durante largos períodos de almacenamiento que, junto a su capacidad de hidrólisis en condiciones intracelulares, constituyen unos prometedores resultados. 6.6 Conjugación del péptido Pru p 3 al glicodendrón con un espaciador de tipo hidrazona Como se ha comentado previamente, una vez demostrada las características de hidrólisis ácida de esta hidrazona 62, el siguiente paso consistió en la conjugación del péptido Pru Síntesis de conjugados alérgeno-glicodendrón y estudio de su actividad biológica 231 p 3-SH. Para esta adición tiol-eno se usaron las condiciones puestas a punto a lo largo de la presente Tesis Doctoral. (Esquema 6.13) Esquema 6.13. Síntesis del conjugado 63. El péptido Pru p 3-SH y la hidrazona glicodendrítica 62 fueron disueltos en tampón fosfato (50 mM, pH= 7.4), en proporciones equimoleculares. Seguidamente, se mezclaron por medio de agitación orbitálica durante 25 min a temperatura ambiente. En la monitorización por RP-HPLC se observó la desaparición de la hidrazona 62. Después de una purificación por medio de ultrafiltración, a través de una membrana de corte molecular de 3 KDa, se obtuvo el conjugado 63 con un excelente rendimiento (94%). Este conjugado fue caracterizado satisfactoriamente por espectrometría de masas (ESI), donde se detectó la presencia del conjugado 63 mediante la relación de señales m/z correspondientes. (Figura 6.33) Figura 6.33. Espectro ESI-MS del conjugado 63. Mediante la puesta a punto de este protocolo de conjugación, pudo ser obtenido el conjugado 63 con el enlace hidrazona inalterado. Capítulo 6 232 6.7 Evaluación biológica del conjugado con un espaciador de tipo hidrazona Una vez sintetizado y caracterizado el glicodendrón conjugado 63, se procedió a su evaluación biológica para determinar su capacidad de mediar en el trastorno de enfermedades alérgicas a través de la modulación de la respuesta inmune. Como se ha comentado previamente, se pretende evaluar si el enlace hidrazona entre el glicodendrón y el péptido se hidroliza suficientemente en el interior celular para mejorar la presentación del epítopo de Pru p 3. Estos estudios se están realizando actualmente en el grupo de alergología de la Dra. Cristobalina Mayorga del Hospital Regional Universitario de Málaga. A continuación, se presentan los resultados preliminares de los que disponemos hasta el momento. En primer lugar, se evaluó la capacidad de la hidrazona conjugada 63, para ser internalizada en las moDCs, en comparación con el conjugado de glicodendrón de nueve manosas V, sintetizado previamente, y el péptido Pru p 3-SH como control. Los tres compuestos fueron marcados fluorescentemente en la región del péptido por medio del reactivo comercial Alexa fluor 647. Una vez marcados, se analizó la internalización en las moDCs usando citometría de flujo y microscopía confocal. (Figura 6.34) Síntesis de conjugados alérgeno-glicodendrón y estudio de su actividad biológica 233 Figura 6.34. Estudios de internalización de Pru p 3-SH, glicodendrón V e hidrazona 63 marcados fluorescentemente. Histogramas de cada uno de ellos, así como las imágenes de microscopía confocal a diferentes tiempos (arriba). Gráfico que representa la internalización a diferentes tiempos (abajo). Las mediciones de citometría de flujo indicaron que los glicodendrones conjugados V y 63 eran internalizados por las moDCs de una manera dependiente del tiempo, si bien Capítulo 6 234 presentan diferencias en su velocidad, se observa el mismo grado de internalización a las 48 horas. Estos resultados son consistentes, debido a que ambos glicodendrones están decorados con nueve manosas en su periferia, de forma que son reconocidos por la lectina DC-SIGN de igual forma, lo que induce dicha internalización. Este hecho también explica la baja internalización del péptido Pru p 3-SH, que puede atribuirse a procesos de endocitosis no específicos. La captación de estos compuestos continuó aumentando hasta las 48 horas. Mediante microscopía confocal y la tinción de diferentes estructuras intracelulares se pudo visualizar el proceso de internalización de los tres compuestos marcados. (Figura 6.35) Figura 6.35. Imágenes confocales a las 48 h que muestran diversas regiones celulares (la actina de la submembrana se tiñó con Atto 488-faloidina (verde) y los núcleos con Hoechst (azul)) y los diferentes compuestos marcados con Alexa fluor 647 (rosa). Estos resultados indican que la distribución intracelular de los glicodendrones 63 y V en las moDCs es similar a la del péptido, mostrando una acumulación en la región citoplasmática/perinuclear. Esta zona es especialmente interesante en el caso de la hidrazona 63, pues es aquí donde se encuentran compartimentos celulares como los lisosomas, donde se produce una disminución del pH. Todos estos estudios previos ponen de manifiesto que la hidrazona conjugada 63 es reconocida e internalizada por las moDCs, lo que resulta fundamental para la presentación del péptido. Actualmente se están desarrollando estudios in vitro adicionales, como la expresión de marcadores de moléculas co-estimuladoras y citoquinas para poder comprobar si con este nuevo compuesto se mejora la presentación del péptido. Capítulo 7 Conclusiones Conclusiones 237 7. Conclusiones 7.1 Capítulo 3  Se ha realizado la síntesis de una estructura basada en un pirimido[5,4-b]indol como ligando de TLR4 convenientemente funcionalizado para su conjugación y se ha demostrado su versatilidad para la conjugación de tres péptidos alergénicos diferentes a través de la reacción click tiol-eno, de una forma rápida, simple y eficiente.  Por medio de estudios in vitro se ha evaluado el conjugado del péptido de Pru p 3 con células de pacientes alérgicos al melocotón. Estos estudios han demostrado que este conjugado estimula la maduración y activación de las moDCs de estos pacientes alérgicos. Adicionalmente, se ha demostrado que la activación por parte de las moDCs promueve la presentación del alérgeno y genera una respuesta inmunológica específica con un patrón inmunológico de tipo TH1 / Treg y la supresión de las células efectoras TH2. Estos resultados ponen de manifiesto el uso de este ligando de TLR4, conjugado a péptidos alergénicos, como potenciales vacunas frente a la alergia en el ámbito de la AIT. Sin embargo sin bajos los valores de Treg de 7.2 Capítulo 4  Se ha realizado la síntesis de una estructura basada en un derivado de 8-oxoadenina como ligando de TLR7 convenientemente funcionalizado para su conjugación y se ha demostrado su versatilidad para la conjugación de tres péptidos alergénicos diferentes a través de la reacción click tiol-eno, de una forma rápida, simple y eficiente.  Por medio de estudios in vitro se ha evaluado el conjugado del péptido de Pru p 3 con células de pacientes alérgicos al melocotón. Estos estudios han demostrado que este conjugado estimula la maduración y activación de las moDCs de estos pacientes alérgicos. Adicionalmente se ha demostrado que la activación por parte de las moDCs promueve la presentación del alérgeno y genera una respuesta inmunológica específica con un patrón inmunológico de tipo TH1 / Treg y la supresión de las células efectoras TH2. Estos resultados ponen de manifiesto el uso de este ligando de TLR7, conjugado a péptidos alergénicos como potenciales vacunas frente a la alergia en el ámbito de la AIT. Si bien parece que se observa una menor activación y regulación Capítulo 8 244 ESI Mass spectra were obtained with an Esquire 6000 ESI‐Ion Trap, Bruker Daltonics (Mass Spectrometry Service of the Institute for Chemical Research, IIQ, CSIC-US) and ESI HRMS Mass spectra were obtained with a Q Exactive MS/MS (Thermo Scientific, CITIUS-US). MALDI-TOF MS experiments were carried out in a bench-top Microflex LRF (Bruker Daltonics, Inc., Biomolecular Interactions, Platform at CicCartuja). UHPLC-MS were registered at the Mass Spectrometry Service of the Institute for Chemical Research (unit 824861, IIQ, CSIC-US) using an Elute UHPLC system coupled to a Bruker Amazon SL spectrometer instrument. The reverse phase chromatography was performed with an analytical C18 column (100 × 2.1 mm, 2 µm, ACE Excel). The optimized method used a binary gradient mobile phase with water and 0.1 % formic acid as mobile phase A, and acetonitrile with 0.1% formic acid as mobile phase B. The flow rate was 0.25 mL/min. AmaZon SL Dual Fuel Ion Trap mass spectrometer equipped with Compass HyStar software was used for the detection of the analytes in positive ionization mode Analytical HPLC was carried out on column BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8 or BioZen, 2.6 µm, Peptide XB-C18 with a Waters Aliance 2690. Solvents A and B were Milli-Q H2O (0.05 % TFA) and CH3CN, respectively. Elution was performed with linear gradients of solvent B into A over 15 min, at a 1 mL min-1 flow rate. For HPLC purifications the same conditions were used but with semipreparative columns Luna C8 and Luna C18, over 30 min, at a 3 mL min-1 flow rate. Microwave reactions were performed on a Biotage Initiator EXP US MicrowaveReactor Synthesis System w Robot Sixty/Eight. The reagents and techniques used in biological studies will be detailed in the next section " Biological assays ". Experimental section 245 8.2 Synthesis of TLR4 ligand conjugates 2-Amino-5-bromobenzonitrile (1)121 2-Aminobenzonitrile (8.472 g, 71.71 mmol) was dissolved in anhydrous ACN (72 mL), the solution was then cooled to 0°C with an ice bath and a solution of NBS (12.763 g, 71.71 mmol) in anhydrous ACN (95 mL) was added slowly. The mixture was stirred at r.t. overnight. Then, 15 mL of destilled water was added and the mixture was concentrated under vacuum and purified by column chromatography on silica gel (hexane/ethyl acetate, 3:1⟶ 1: 1) to afford the product as a fluffy yellow solid (9.465 g, 67% yield). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.49 (ArCH, d, J= 2.2 Hz, 1H), 7.45-7.38 (ArCH, m, 1H), 6.66 (ArCH, d, J= 8.8 Hz, 1H), 4.50 (NH2, brs, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 148.7 (CNH2), 137.0 (ArCH), 134.1 (ArCH), 116.8 (ArCH), 116.3 (CCN), 108.7 (CBr), 97.5 (CCN). Ethyl 2-((4-Bromo-2-cyanophenyl)amino)acetate (2) The aniline derivative 1 (8.18 g, 41.51 mmol), ethyl bromoacetate (41.59 g, 249 mmol) and potassium carbonate (6.31 g, 45.66 mmol) were combined in anhydrous DMF at 75°C for 2 days. Then, the solvent was removed under high vacuum and the crude was purifed by column chromatography on silica gel (hexane/ethyl acetate, 8:1) affording 2 (7.37 g, 63%) as a white solid. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.53 (ArCH, d, J= 2.3 Hz, 1H), 7.49 (ArCH, dd, J= 8.9, 2.3 Hz, 1H), 6.47 (ArCH, d, J= 8.9 Hz, 1H), 5.23 (NH, brs, 1H), 4.28 (CH2CH3, q, J= 7.1 Hz, 2H), 3.98 (NHCH2, d, J= 5.5 Hz, 2H), 1.32 (CH2CH3, t, J= Capítulo 8 246 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 169.4 (CO), 148.2 (CNH), 137.2 (ArCH), 134.8 (ArCH), 116.1 (CCN), 112.5 (ArCH), 108.4 (CBr), 98.2 (CCN), 61.9 (OCH2CH2, 45.0 (COCH2NH), 14.2 (OCH2CH2). Ethyl 3-Amino-5-bromo-1H-indole-2-carboxylate (3)120 In a flame-dried flask, a suspension of potassium tert-butoxide (1.72 g, 15.38 mmol) in 8.3 mL anhydrous tetrahydrofuran was stirred and maintained below 30°C with a water bath under argon. To this solution was added a solution of compound 2 (14.35 g, 15.38 mmol) in anhydrous THF (12.3 mL) over 45 min and stirred for an additional 2 h. The reaction was then poured into ice-water (35 mL), extracted with EtOAc (2x100 mL), and dried over anhydrous MgSO4. The solvent was concentrated under vacuum, and the resultant residue was purified by column chromatography on silica gel (hexane/ethyl acetate, 4:1) affording compound 3 (1.61 g, 39%) as a yellow solid. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.99 (NH, brs, 1H), 7.71 (ArCH, s, 1H), 7.40 (ArCH, d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.17 (ArCH, d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.7 (NH2, brs, 2H), 4.43 (CH2CH3, q, J= 7.0 Hz, 2H), 1.44 (CH2CH3, t, J = 7.0 Hz, 3H). Ethyl 5-Bromo-3-(3-phenylthioureido)-1H-indole-2-carboxylate (4)120 To a solution of compound 3 (1.21 g, 4.27 mmol) in warm EtOH (18 mL) was added dropwise under stirring phenyl isothiocyanate (0.56 mL, 4.70 mmol). The reaction was Experimental section 247 refluxed for 6 h and cooled overnight. Solid residues were filtered off, washed with EtOH, and dried overnight under vacuum to give the product as a white solid (1.624 g, 93%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.07 (SCNHC, s, 1H), 9.84 (NH, s, 1H), 9.38 (ArNHCS, s, 1H), 8.46 (ArCH, s, 1H), 7.73 (ArCH, s, 1H), 7.52 (ArCH, d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.51 (ArCH, s, 2H), 7.34 (ArCH, m, 2H), 7.14 (ArCH, m, 1H), 4.34 (CH2CH3, q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.33 (CH2CH3, t, J = 7.0 Hz, 3H). ESI-MS m/z calcd. for C18H17O2N3BrS: 418.3 [M]+; found: 419.9 [M + H]+, 441 [M + Na]+. 8-Bromo-3-phenyl-2-thioxo-2,3-dihydro-1H-pyrimido[5,4-b]-indol-4(5H)-one (5)120 To a sealed flame-dried flask charged with argon, a solution of compound 4 (1.09, 2.61 mmol) in anhydrous EtOH (20 mL) was stored. Separately, in a flask with anhydrous ethanol (27 ml), cooled to 0°C with an ice bath was added acetyl chloride (7.78 mL, 109.44 mmol) dropwise (caution, exothermic reaction) under argon atmosphere. This solution was added dropwise to the first solution under stirring. After completion, the mixture was stirred at reflux overnight. Once completed, the reaction mixture was cooled at 0°C and solids were filtered off and washed with cold EtOH to give compound 5 as a white solid (697 mg, 72%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.70 (NHCS, s, 1H), 12.44 (NH, s, 1H), 8.46 (ArCH, s, 1H), 7.80 (ArCH, d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.59-7.41 (ArCH, m, 2H), 7.29 (ArCH, d, J= 7.4 Hz, 2H). 2-((8-Bromo-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihydro-3H-pyrimido[5,4-b]indol-2-yl)thio)acetic acid (6) Capítulo 8 248 In a schlenk flask, to a solution of bromo derivative 5 (697 mg, 1.87 mmol) in warm EtOH (15 mL) was added potassium hydroxide (210 mg, 3.74 mmol) with stirring. To this solution was added a solution of bromoacetic acid (269 mg, 1.87 mmol) in EtOH (3 mL) and the mixture was refluxed overnight. Then, about half volume of the mixture was removed on a rotavap and the mixture was acidified to pH= 4 with 4M HCl. The solid was filtered off and washed with distilled water and finally with EtOH to give compound 6 as a white solid (810 mg, quant.). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.36 (NH, s, 1H), 8.09 (ArCH, s, 1H), 7.61-7.49 (ArCH, m, 7H), 3.96 (SCH2, s, 2H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 170.3 (CO), 155.3 (NCHS), 153.5 (OCN-Ph), 137.9 (ArC), 136.6 (ArC), 136.3 (ArC), 130.5 (NCCNH), 130.3 (ArC), 130.1 (ArCH), 129.9 (ArCH), 122.7 (ArCH), 122.4 (ArCH), 120.7 (ArC), 115.6 (ArCH), 112.9 (ArCH), 35.7 (SCH2). ESI-MS m/z calcd. for C18H12O3N3BrS: 430.3 [M]+; found: 432.1. [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C18H11O3N3BrNaS: 451.9680; found: 451.9675. 2-((8-Bromo-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihydro-3H-pyrimido[5,4-b]indol-2-yl)thio)-Ncyclohexylacetamide (7) Compound 6 (1.732 g, 4.025 mmol), anhydrous triethylamine (1.12 mL, 8.05 mmol), and cyclohexylamine (0.51 mL, 4.428 mmol) were dissolved in anhydrous DMF (29 mL). To this solution, HATU (823 mg, 2.16 mmol) dissolved in anhydrous DMF (5.7 mL) was added and stirred at room temperature for 6 h. The solvent was removed under high vacuum and the crude material was washed twice with MeOH, yielding compound 7 as a white solid (2.036 g, quant). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.32 (NH, s, 1H), 8.29 (OCNH, s, 1H), 8.22 (ArCH, d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.61-7.49 (ArCH, m, 7H), 3.86 (SCH2, s, 2H), 3.54 (HNCH, m, 1H, overlapped with water signal), 1.75-1.54 (cyclohexyl, m, 5H), 1.25 (cyclohexyl, m, 5H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.3 (CO), 155.3 (NCHS), 153.8 (OCN-Ph), 137.9 (ArC), 136.8 (ArC), 136.4 (ArC), 130.4 (NCCNH), Experimental section 249 130.2 (ArC), 130.0 (ArCH), 129.9 (ArCH), 123.3 (ArCH), 122.5 (ArCH), 120.7 (ArC), 115.4 (ArCH), 112.8 (ArCH), 48.5 (HNCH), 37.2 (SCH2), 33.0 (cyclohexyl-CH2), 25.5 (cyclohexyl-CH2), 25.0 (cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. for C24H23O2N4BrS: 510.1 [M]+; found: 511.1 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C24H23O2N4BrNaS: 533.0623, found: 533.0617. 2-((8-Amino-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihydro-3H-pyrimido[5,4-b]indol-2-yl)thio)-Ncyclohexylacetamide (8) Compound 7 (295 mg, 0.58 mmol), sodium azide (375 mg, 5.77 mmol), copper (I) iodide (549 mg, 2.88 mmol), and sodium ascorbate (286 mg, 1.44 mmol) were combined in a flask under argon atmosphere. A mixture of DMSO:H2O (5:1, 9.1 mL) was degassed with argon and added to the mixture, followed by the addition of N,Ndimethylethylenediamine (310 μL, 2.88 mmol) degassed as well. The reaction was heated to 90°C overnight with stirring. The suspension was extracted with EtOAc and brine. The organic layer was dried over anhydrous MgSO4 and concentrated under vacuum. The crude residue was purified by column chromatography on silica gel (DCM:MeOH, 100/3) affording the amine derivative 8 as a brown solid (185 mg, 72%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 11.61 (NH, s, 1H), 8.12 (OCNH, d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.59 (ArCH, m, 3H), 7.44 (ArCH, m, 2H), 7.24 (ArCH, m, 1H), 7.13 (ArCH, s, 1H), 6.90 (ArCH, d, J= 8.5 Hz, 1H), 4.90 (NH2, brs, 2H), 3.89 (SCH2, s, 2H), 3.50 (HNCH, m, 1H, overlap water signal), 1.74-1.66 (cyclohexyl, m, 4H), 1.52 (cyclohexyl, m, 1H), 1.25-1.11 (cyclohexyl, m, 5H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.1 (CO), 155.4 (NCHS), 151.2 (OCN-Ph), 142.9 (ArC), 136.7 (ArC), 133.3 (NCCNH), 130.3 (ArC), 130.2 (ArC), 130.1 (ArCH), 129.9 (ArCH), 121.7 (ArCH), 119.6 (NCCNH), 119.1 (ArCH), 113.5 (ArCH), 102.0 (ArCH), 48.4 (HNCH), 37.2 (SCH2), 32.7 (cyclohexyl-CH2), 25.6 (cyclohexyl-CH2), 24.9 (cyclohexyl-CH2). ESI-S m/z calcd. for C24H25O2N5S: 447.2 [M]+; found: 448.1 [M + Capítulo 8 250 H]+, 470.1 [M + Na]+, 917.2 [2M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C24H26O2N5S: 448.1807; found: 448.1802. 3-Maleimido-propionic acid (9)126 To a solution of maleic anhydride (5.5 g, 56.12 mmol) in acid acetic acid (70 mL), was added dropwise another solution of β-alanine (5 g, 56.12 mmol) in the same solvent (25 mL). The mixture was kept under stirring at room temperature for 3 hours. Then, acetic acid (50 mL) was added and the mixture was heated at 115°C overnight under stirring. Then, the solvent was removed under high vacuum and the crude was purifed by column chromatography on silica gel (DCM/ethyl acetate, 9:1) affording the acid 9 (3.0 g, 32%) as a white solid. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 6.72 (CH, s, 2H), 3.81 (NCH2CH2, t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.86 (NCH2CH2, t, J= 7.3 Hz, 2H). N-(2-((2-(Cyclohexylamino)-2-oxoethyl)thio)-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihydro-3Hpyrimido[5,4-b]indol-8-yl)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)propanamide (10) Compound 8 (185 mg, 0.41 mmol), anhydrous DIPEA (144 µL, 0.83 mmol), 3maleimidopropionic acid (9) (77 mg, 0.45 mmol) were dissolved in anhydrous DMF (3 mL). To this solution, HATU (173 mg, 0.45 mmol) dissolved in anhydrous DMF (1.7 mL) was added and stirred at room temperature overnight. The solvent was removed under high vacuum and the crude material was washed twice with MeOH yielding compound 10 as a white solid (182 mg, 73%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.05 Experimental section 251 (NH, s, 1H), 10.06 (OCNH-Ar, 1H), 8.49 (OCNH, s, 1H), 8.21 (ArCH, d, J= 6.2 Hz, 1H), 7.60-7.42 (ArCH, m, 7H), 7.05 ((OCCH)2N, s, 2H), 3.94 (SCH2, s, 2H), 3.77 (NCH2CH2, t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.50 (HNCH, m, 1H, overlapped with water signal), 2.64 (NCH2CH2, t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.74-1.54 (cyclohexyl, m, 5H), 1.21-1.10 (cyclohexyl, m, 5H). 13CNMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 171.3 (COmalemide), 168.6 (HNCO-malemide), 165.9 (HNCO), 155.4 (NCHS), 152.7 (OCN-Ph), 137.6 (ArC), 136.6 (ArC), 136.1 (ArC), 135.1 (CHmalemide), 132.54 (NCCNH), 130.3 (ArC), 130.1 (ArCH), 130.0 (ArCH), 121.7 (ArCH), 120.6 (NCCNH), 120.4 (ArCH), 113.4 (ArCH), 110.8 (ArCH), 48.5 (HNCH), 37.5 (SCH2), 35.4 (CH2CH2-maleimide), 34.4 (CH2CH2-maleimide), 32.7 (cyclohexylCH2), 25.6 (cyclohexyl-CH2), 24.9 (cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. for C31H30O5N6S: 598.2 [M]+; found: 621.2 [M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C31H30O5N6NaS: 621.1896; found: 621.1891. RP-HPLC tR= 14.31 min (Column: analytical BioZen, 2.6 µm, Peptide XB-C18; A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B: Acetonitrile; first two minutes with 10% of B, the rest, 10 to 95% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Conjugate of TLR4 ligand, 11 A solution of peptide Pru p 3 SH (2.60 mg, 1.15 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 80 µL) and Milli-Q water (160 µL) was added to a solution of maleimide derivative 10 (0.69 mg, 1.15 µmol) in DMSO (390 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RPHPLC), only a signal corresponding to the final product was observed. To remove salts, the solution was filtered in an Amicon Ultra centrifugal filter (Ultra-15, MWCO 3KDa) and after washing with Milli-Q water in a centrifuge at 4000 rpm, the collected aqueous phase was lyophilized, providing the corresponding conjugate 11 as a white solid (2.79 mg, 85%). ESI-MS m/z calcd.: 2853.8 [M]+, found: 952.5 [M + 3H]3+, 1427.8 [M + 2H]2+. RP-HPLC tR= 10.65 min (Column: analytical BioZen, 2.6 µm, Peptide XB-C18; Capítulo 8 252 A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; first two minutes with 10% of B, the rest, 10 to 95% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Conjugate of TLR4 ligand, 12 A solution of peptide β-PRVB-SH (1.32 mg, 1.37 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 96 µL) and Milli-Q water (192 µL) was added to a solution of maleimide derivative 10 (0.82 mg, 1.37 µmol) in DMSO (464 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RPHPLC), the reaction mixture was purified by semipreparative RP-HPLC (C8 Phenomenex Luna column, 10 × 250 mm, 10 μm; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; 20 to 60% linear gradient of B into A over 30 min, F= 3 mL/min). The corresponding analyzed fractions were collected and lyophilized to afording the corresponding conjugate 12 (1.7 mg, 79%) as a white amorphous solid. ESI-MS m/z calcd.: 1560.94 [M]+; found: 521.3 [M + 3H]3+, 781.3 [M + 2H]2+, 1560.5 [M + H]+ . RPHPLC tR= 10.57 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; 20 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Experimental section 253 Conjugate of TLR4 ligand, 13 A solution of peptide Ole109-130-SH (2.35 mg, 0.93 µmol) in 65 µL of sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 150 µL) and Milli-Q water (180 µL) was added to a solution of maleimide derivative 10 (0.56 mg, 0.93 µmol) in DMSO (317 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RP-HPLC), the reaction mixture was directly purified by semipreparative RPHPLC (C18 Phenomenex Luna column, 10 × 250 mm, 10 μm; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; first four minutes with 30% of B, the rest, 30 to 70% linear gradient of B into A over 30 min, F= 3 mL/min). The corresponding analyzed fractions were collected and lyophilized, affording the corresponding conjugate 13 as a white solid (0.7 mg, 34%). ESI-MS m/z calcd.: 3119.7 [M]+; found: 1040.4 [M + 3H]3+, 1559.3 [M + 2H]2+. RP-HPLC tR= 8.8 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; 20 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). 8.3 Synthesis of TLR7 ligand conjugates 1-Azido-2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethane (14)179 Bis[2-(2-chloroethoxy)ethyl] ether (4.72 g, 20,42 mmol) was diluted into N,Ndimethylformamide (69 mL) and treated with an excess of sodium azide (13,27 g, 204.2 mmol) at 60 °C for 2 days. The solvent was removed under reduced pressure and the resulting mixture was diluted into ether and filtered. The filtrate was again concentrated Capítulo 8 260 = 5.0 Hz, 2H), 3.65 (CH2CH2triazole, t, J= 7.0 Hz, 2H), 3.52-3.38 (CH2PEG, m, 12H, overlap water signal), 2.61 (CH2CH2N, t, J= 7.0 Hz, 2H), 1.61 (CH3CH2CH2CH2, q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.38 (CH3CH2CH2CH2, q, J= 7.2 Hz, 2H), 0.90 (CH3CH2CH2CH2, t, J= 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 171.1 (COmalemide), 170.7 (HNCOmalemide), 166.4 (HNCO), 160.6 (NCNH2), 152.7 (COBu), 149.6 (HNCON), 148.3 (NH2CNHCCN), 141.9 (CHtriazol), 140.6 (ArC), 135.0 (CHmaleimide), 134.0 (ArC), 127.9 (ArCH), 127.6 (ArCH), 125.6 (CHtriazol), 98.7 (NH2CNHCCN), 70.14, 70.06, 69.97, 69.32, 69.06 (CH2PEG), 66.32 (CH3CH2CH2CH2O), 57.9 (triazoleCH2O), 49.8 (triazoleCH2CH2), 42.6 (NCH2Ar), 40.0 (CH2CH2-maleimide, overlapping with DMSO signal), 33.6 (CH2CH2-maleimide), 32.7 (OCNHCH2-PEG), 31.0 (CH3CH2CH2CH2O), 19.2 (CH3CH2CH2CH2O), 14.2 (CH3CH2CH2CH2O). ESI-MS m/z calcd. for C35H44O10N10: 764.6 [M]+; found: 787.2 [M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C35H45O10N10: 765.3320; found:765.3304. RP-HPLC tR= 11.07 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B: Acetonitrile, 10 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Conjugate of TLR7 ligand, 23 A solution of peptide Pru p 3-SH (1.3 mg, 0.59 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 40 µL) and Milli-Q water (80 µL) was added to a solution of maleimide derivative 22 (0.45 mg, 0.59 µmol) in DMSO (195 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RPHPLC), only a signal corresponding to the final product was observed. To remove salts, an Amicon Ultra centrifugal filter (Ultra-15, MWCO 3KDa) was used and after washing with Milli-Q water in a centrifuge at 4000 rpm, the collected aqueous phase was lyophilized, affording the corresponding conjugate 23 as a white solid (1.7 mg, 96%). Experimental section 261 ESI-MS m/z calcd.: 3019.9 [M]+; found: 605.3 [M + 5H]5+, 756.3 [M + 4H]4+, 1007.9 [M + 3H]3+, 1511.0 [M + 2H]2+. RP-HPLC tR= 8.91 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B: Acetonitrile, 10 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Conjugate of TLR7 ligand, 24 A solution of peptide β-PRVB-SH (0.75 mg, 0.78 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 90 µL) and Milli-Q water (150 µL) was added to a solution of maleimide derivative 22 (0.60 mg, 0.78 µmol) in DMSO (200 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RPHPLC), only a signal corresponding to the product was observed. To remove salts, an Amicon Ultra centrifugal filter (Ultra-15, MWCO 3KDa) was used and after washing with Milli-Q water in a centrifuge at 4000 rpm, the aqueous phase collected was lyophilized, affording the corresponding conjugate 24 as a white solid (1.3 mg, 96%). ESI-MS m/z calcd.: 1726.6 [M]+; found: 576.7 [M + 3H]3+, 864.4 [M + 2H]2+, 1726.7 [M + H]+. RP-HPLC tR= 9.42 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile, 20 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Capítulo 8 262 Conjugate of TLR7 ligand, 25 A solution of peptide Ole109-130-SH (3.623 mg, 1.44 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 30 µL) and Milli-Q water (100 µL) was added to a solution of maleimide derivative 22 (1.0 mg, 1.31 µmol) in DMSO (367 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RPHPLC), the solution was filtered using an Amicon Ultra centrifugal filter (Ultra-15, MWCO 3KDa). After washing with Milli-Q water in a centrifuge at 4000 rpm, the aqueous phase collected was lyophilized, providing the corresponding conjugate 25 as a white solid (3.1 mg, 72%). ESI-MS m/z calcd.: 3285.8 [M]+; found: 1095.9 [M + 3H]3+, 1643.6 [M + 2H]2+. RP-HPLC tR= 11.50 and 11.75 min (Column: analytical BioZen, 2.6 µm, Peptide XB-C18; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile, 20 to 70% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). 8.4 Synthesis of TLR ligand dimer conjugates Methyl (4-Chloro-6-((2-oxopropyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)glycinate (26) A suspension of cyanuric chloride (1 g, 4.92 mmol) in 40 mL of acetonitrile was cooled to 0°C. Then, a mixture of glycine methyl ester hydrochloride (1.24 g, 9.85 mmol) and DIPEA (3.43 mL, 19.7 mmol) was added dropwise under stirring. Then, the mixture was allowed to reach room temperature overnight. The solvent was removed under vacuum Experimental section 263 and the solid was washed with destilled water (3x10 mL) and MeOH (3x10 mL) yielding compound 26 as a white solid (1.15 g, 81%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ 4.12 and 4.04 (NHCH2, s, 4H), 3.75 (CH3, s, 6H). ESI-MS m/z calcd. for C9H12N5O4Cl: 289.1 [M]+; found: 290.1 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C9H13N5O4Cl: 290.0656; found: 290.0651. Dimethyl 2,2'-((6-((2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)amino)-1,3,5triazine-2,4-diyl)bis(azanediyl))diacetate (27) A solution of triazine derivative 26 (595.5 mg, 2.06 mmol), DIPEA (1.43 mL, 8.24 mmol) and amine 15 (900 mg, 4.12 mmol) in dioxane (8.24 mL) was heated at 100°C overnight. The solvent was removed under vacuum and purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/MeOH, 20:1) to afford compound 27 as a yellow oil (841 mg, 87%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ: 4.07 (NHCH2, brs, 4H), 3.74 (CH3, s, 6H), 3.70 – 3.61 (m, 14H, CH2PEG), 3.39 (CH2N3, m, 2H). 13C NMR (MeOH-d4, 100 MHz) δ: 171.8 (CO), 165.8 (CNH), 165.6 (CNH), 70.2, 70.1, 69.9, 69.7, 69.5 (CH2PEG), 51.1 (CH3), 50.4 (CH2N3), 42.0, 41.8 (NHCH2PEG), 39.9 (CH2COO). ESI-MS m/z calcd. for C17H29N9O7: 471.2 [M]+; found: 472.2 [M + H]+, 494.2 [M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C17H30N9O7: 472.2268; found: 472.2263. Capítulo 8 264 2,2'-((6-((2-(2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)amino)-1,3,5-triazine-2,4diyl)bis(azanediyl))diacetic acid (28) Triazine 27 (465 mg, 0.99 mmol) was dissolved in THF (10 mL) and LiOH.H2O (207.7 mg, 4.95 mmol) dissolved in 10 mL of distilled water was added to the mixture with stirring at r.t. overnight. The mixture was acidified to pH= 3 with 2M HCl. The solvent was removed under vacuum and the crude was purified by size exclusion chromatography, Sephadex LH20 (100% MeOH), giving the triazine 28 as a white solid (354 mg, 81%). 1H NMR (D2O, 400 MHz) δ: 3.87 (NHCH2, brs, 4H), 3.65 – 3.58 (m, 12H, CH2PEG), 3.51 (HNCH2CH2, m, 2H), 3.41 (CH2N3, m, 2H). 13C NMR (D2O, 100 MHz) δ: 175.9 (CO), 162.7, 156.0, 154.9 (CNH), 69.6, 69.4, 69.2, 68.8, 68.4 (CH2PEG), 50.2 (CH2N3), 43.9, (NHCH2PEG), 42.0 (CH2COO). ESI-MS m/z calcd. for C15H25N9O7: 443.2 [M]+; found: 444.2 [M + H]+.ESI-HRMS m/z calcd. for C15H26N9O7: 444.1955; found: 444.1944. 6-Chloro-N2,N4-di(prop-2-yn-1-yl)-1,3,5-triazine-2,4-diamine (30) A suspension of cyanuric chloride (1.5 g, 7.39 mmol) in acetonitrile (60 mL) was cooled to 0°C. Then, a mixture of propargylamine (0.95 mL, 14.78 mmol) and DIPEA (2.57 mL, 14.78 mmol) was added dropwise with stirring. Then, the mixture was allowed to reach room temperature overnight. The solvent was removed under vacuum and the solid was washed with destilled water (3x10 mL) and MeOH (3x10 mL) yielding compound 30 as a white solid (1.51 g, 92%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 8.30 (NH, t, J= 5.9 Hz, Experimental section 265 1.3H), 8.21 (NH, t, J= 5.9 Hz, 0.5H), 8.07 (NH, t, J= 5.9 Hz, 0.2H), 4.09 and 4.01 (NHCH2, d, J= 5.9 Hz, 4H), 3.09 (CCH, s, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 168.9, 168.5 (CCl), 165.8, 165.5, 165.4 (CNH), 81.4, 81.3, 81.1(CCH), 73.6, 73.5 (CCH), 30.1,30.0 (CH2). ESI-MS m/z calcd. for C9H8N5Cl: 221.6 [M]+; found: 222.1 [M + H]+. tert-Butyl (2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (31)240 To a solution of commercial 2,2'‐(ethane‐1,2‐diylbis(oxy))bis(ethan‐1‐amine) (34 mL, 233.2 mmol) in DCM (80 mL) was cooled to 0°C. Then, di‐tert‐butyl dicarbonate (5.09 g, 23.32 mmol) was added in portions during 2h. After 18h of stirring, the mixture was washed with brine (3x60 mL), destilled water (3x60 mL) and was dried over anhydrous MgSO4 and concentrated under vacuum to afford the amine 31 (4.30 g, 74%). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 5.17 (NH, brs, 1H), 3.63 – 3.54 (CH2PEG, m, 8H), 3.31 (CH2NHBoc, m, 2H), 2.90 (CH2NH2, m, 2H), 1.45 (CH3Boc, s, 9H). tert-Butyl (1-(9H-fluoren-9-yl)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azadodecan-12-yl)carbamate (32)240 To a solution of 31 (4.30 g, 17,33 mmol) in THF (80 mL), Fmoc‐Cl (5.82 g, 22.53 mmol) was added in portions during 30 min. The mixture was stirred at r.t. for 2 h then, the solvent was removed under vacuum and purified by column chromatography on silica gel (hexane/ethyl acetate, 25:1) to afford compound 32 as a yellow oil (3.33 g, 41% yield). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.80 (ArCH, d, J= 7.5 Hz, 2H), 7.62 (ArCH, d, J= 7.5 Hz, 2H), 7.43 (ArCH, t, J= 7.4 Hz, 2H), 7.33 (ArCH, t, J= 7.4 Hz, 2H), 5.71 (s, 1H, NH‐ Fmoc), 5.39 (NHBoc, brs, 1H), 5.02 (NHFmoc, brs, 1H), 4.43 (CH2OCO, d, J= 7.0 Hz, Capítulo 8 266 2H), 4.25 (CHFmoc, t, J= 7.0 Hz, 1H), 3.64 – 3.56 (m, 10H, CH2PEG), 3.45 (CH2Fmoc, m, 2H), 1.45 (CH3Boc, s, 9H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 156.5 (CO‐Fmoc), 155.9 (CO‐Boc), 143.9 (CAr), 141.2 (CAr), 127.6 (CAr), 126.9 (CAr), 125.0 (CAr), 119.8 (CAr), 78.9 (C(CH3)3), 70.1, 69.9, 66.4 (CPEG), 60.2 (CH2‐Fmoc), 47.2 (CHFmoc), 40.8 (CH2NH‐Boc), 40.2 (CH2NHFmoc), 28.3 (CH3). (9H-Fluoren-9-yl)methyl (2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (33)240 To a solution of carbamate derivative 32 (3.33 g, 7.08 mmol) in dichorometane (29.2 mL), TFA (13.3 mL) was added dropwise. The mixture was stirred at r.t. for 1.5 h. Then, the solvent was eliminated under vacuum affording the amine 33 as an orange oil (2.62 g, quant.). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.79 (ArCH, d, J= 7.5 Hz, 2H), 7.58 (ArCH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.43-7.29 (ArCH, m, 4H), 4.51-4.45 (CH2OCO, m, 2H), 4.25 (CHFmoc, brs, 1H), 3.69 (NH2CH2, brs, 2H), 3.62 – 3.21 (CH2PEG, m, 10H). ESI-MS m/z calcd. for C21H26N2O4: 370.2 [M]+; found: 371.3 [M + H]+. (9H-Fluoren-9-yl)methyl (2-(2-(2-((4,6-bis(prop-2-yn-1-ylamino)-1,3,5-triazin-2yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (34) A solution of triazine derivative 30 (71 mg, 0.32 mmol), DIPEA (141 µL, 0.81 mmol), and amine 33 (179 mg, 0.48 mmol) in dioxane (2.6 mL) was irradiated, under microwave activation, for 45 min at 100ºC (closed system). The solvent was removed under vacuum Experimental section 267 and purified by column chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 60:1) to afford compound 34 as a colourless oil (92 mg, 51%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ: 7.80 (ArCH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.64 (ArCH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.39 (ArCH, t, J= 7.3 Hz, 2H), 7.21 (ArCH, t, J= 7.3 Hz, 2H), 4.37 (CH2OCO, d, J= 6.9 Hz, 2H), 4.21 (CHFmoc, t, J= 6.9 Hz, 1H), 3.64 – 3.56 (CH2PEG, m, 12H), 2.51 (CCH, t, J= 2.5 Hz, 1H). 13C NMR (MeOH-d4, 100 MHz) δ: 165.8, 165.4 (CNH), 157.5 (HNCO), 143.9 (CAr), 141.2 (CAr), 127.3 (CAr), 126.7 (CAr), 124.7 (CAr), 119.5 (CAr), 80.6 (CCH), 70.9 (CCH), 69.9, 69.8 69.5 (CH2PEG), 66.3 (CH2CH), 43.1 (CH2CH), 40.4 (CNHCH2), 40.2 (CH2NHCO), 28.3 (CH2CCH). ESI-MS m/z calcd. for C30H33N7O4: 555.2 [M]+; found: 556.2 [M + H]+. ESIHRMS m/z calcd. for C30H34N7O4: 556.2672; found: 556.2667. 2-Azidoacetic acid (35)246 Bromoacetic acid (0.86 g, 6.22 mmol) was dissolved in destilled H2O (12.5 mL). Sodium azide (0.81 g, 12.44 mmol) was added and stirred for 15h. The reaction mixture was acidified with conc. HCl to pH= 1 and extracted with diethyl ether (3x37 mL). The combined organic layers were washed with brine (37 mL). The solvent was dried over Na2SO4 and evaporated at 25°C to obtain the azide 35 (489 mg, 78%) as a colorless oil, which was used without further purification. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.07 (COOH, s, 1H), 3.96 (CH2N3, s, 2H). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.1 (CO), 49.9 (CH2N3). Capítulo 8 268 2-Azido-N-(2-((2-(cyclohexylamino)-2-oxoethyl)thio)-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihydro3H-pyrimido[5,4-b]indol-8-yl)acetamide (36) Compound 35 (175 mg, 0.39 mmol), anhydrous DIPEA (272 µL, 1.56 mmol) and the amine 8 (99 mg, 0.98 mmol) were dissolved in anhydrous DMF (3.67 mL). To this solution, HATU (373 mg, 0.98 mmol) dissolved in anhydrous DMF (1.0 mL) was added and stirred at room temperature overnight. The solvent was removed under high vacuum and the crude material was washed twice with MeOH yielding compound 36 as a brown pale solid (166 mg, 80%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.08 (NH, s, 1H), 10.21 (N3CH2CONH, s, 1H), 8.56 (ArCH, brs, 1H), 8.20 (OCNH, brs, 1H), 7.60-7.42 (ArCH, m, 7H), 4.07 (N3CH2, s, 2H), 3.93 (SCH2, s, 2H), 3.50 (HNCH, m, 1H, overlapped with the water signal), 1.75-1.52 (cyclohexyl, m, 5H), 1.25-1.11 (cyclohexyl, m, 5H). 13CNMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.4 (SCH2CO), 166.0 (N3CH2CO), 155.4 (NCHS), 152.8 (OCN-Ph), 137.6 (ArC), 136.6 (ArC), 136.3 (ArC), 131.9 (NCCNH), 130.3 (ArC), 130.3 (ArC), 130.3 (ArCH), 130.0 (ArCH), 121.5 (ArCH), 120.7 (NCCNH), 120.5 (ArCH), 113.6 (ArCH), 111.0 (ArCH), 49.1 (N3CH2), 48.5 (HNCH), 37.4 (SCH2), 32.7 (cyclohexyl-CH2), 25.6 (cyclohexyl-CH2), 25.0 (cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. for C26H26N8O3S: 530.2 [M]+; found: 553.0 [M + Na]+, 569.0 [M + K]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C26H26N8O3SNa: 553.1746; found: 553.1741. Experimental section 269 TLR4 Ligand dimer with amine, 37 To a solution of triazine 34 (25 mg, 0.45 mmol) and the azide ligand 36 (60 mg, 0.11 mmol) in DMSO (2 mL), CuSO4·5H2O (4.5 mg, 0.02 mmol) and TBTA (19.1 mg, 0.04 mmol) dissolved in DMSO (2 mL) and finally a solution of sodium ascorbate (14.3 mg, 0.07 mmol) in 0.7 mL of phosphate buffer (50 mM, pH 7.4) were added to the mixture. The solution was stirred at room temperature overnight. Then, copper was removed by adding a metal scavenger resin, Quadrasil® Mercaptopropyl (a spatula tip) and stirred for 15 min at room temperature. After that, the mixture was filtered, washed with DMSO and the solvent was removed under high vacuum. The crude material was washed twice with MeOH, the solid was dissolved in a 20% piperidine DMF solution (5 mL) and shaken at r.t. for 30 minutes. Then, the solvent was removed under high vacuum and the solid was washed twice with MeOH, yielding the compound 37 as a white solid (64 mg, 88%, two steps). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 10.51 (OCNH-Ar, brs, 2H), 8.52 (ArCH, s, 2H), 8.16 (OCNHCH, brs, 2H), 7.97 (Htriazole, s, 2H), 7.59-7.44 (ArCH, m, 14H), 5.32 (triazole-CH2CO, brs ,4H), 4.51 (HNCH2-triazole, brs ,4H), 3.90 (SCH2, s, 4H), 3.61 – 3.52 (CH2PEG, m, 12H), 3.17 (HNCH, s, 2H), 1.69-1.47 (cyclohexyl, m, 10H), 1.24-1.17 (cyclohexyl, m, 10H). 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 166.2, 166.1 (CNH), 166.0 (HNCO), 164.4 (HNCO), 155.4 (NCHS), 152.8 (OCN-Ph), 146.6 (Ctriazole), 137.6 (ArC), 136.5 (ArC), 136.3 (ArC), 131.9 (NCCNH), 130.4 (ArC), 130.1 (ArCH), 130.0 (ArCH), 125.0 (CHtriazole), 121.5 (ArCH), 120.6 (ArC), 120.5 (ArCH), 113.6 (ArCH), 110.9 (ArCH), 70.1, 70.0, 69.7 (CH2PEG), 52.6 (triazole-CH2CO), 48.5 (HNCH), 37.4 (SCH2), 36.0 (HNCH2-Triazole), 32.6 (cyclohexyl-CH2), 25.5 (cyclohexyl-CH2), 24.9 (cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. for C67H75N23O8S2: 1393.6 [M]+; found: 465.8 [M Capítulo 8 276 (9H-Fluoren-9-yl)methyl (2-(2-(2-((4-(prop-2-yn-1-ylamino)-6-((4- (trimethylsilyl)but-3-yn-1-yl)amino)-1,3,5-triazin-2yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (45) A solution of triazine derivative 42 (252 mg, 0.47 mmol), DIPEA (205 µL, 1.17 mmol), and 4-(trimethylsilyl)-3-butyn-1-amine (78 mg, 0.61 mmol) in dioxane (3.9 mL) was irradiated, under microwave activation, for 2h at 100ºC (closed system). The solvent was removed under vacuum and purified by column chromatography on silica gel (hexane/THF, 3:2) to afford compound 45 as a colourless oil (123 mg, 41%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ: 7.80 (ArCH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.64 (ArCH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.39 (ArCH, t, J= 7.4 Hz, 2H), 7.31 (ArCH, t, J= 7.4 Hz, 2H), 4.37 (CH2OCO, d, J= 6.9 Hz, 2H), 4.20 (CHFmoc, t, J= 6.9 Hz, 1H), 4.09 (HNCH2CCH, brs, 2H), 3.64-3.40 (CH2PEG, HNCH2CH2, m, 14H), 2.51-2.47 (HNCH2CH2, CCH, m, 3H), 0.12 (SiCH3, m, 9H). 13C NMR (MeOD-d4, 100 MHz) δ: 165.7 (CNH), 157.5 (HNCO), 143.9 (CAr), 141.2 (CAr), 127.34 (CAr), 126.8 (CAr), 124.8 (CAr), 119.5 (CAr), 104.8 (SiCC), 84.8 (SiCC), 80.7 (CCH), 69.9 (CCH), 69.8, 69.6 (CH2PEG), 66.3 (CH2CH), 47.1 (CH2CH), 40.4, 39.9, 39.3 (NHCH2CH2), 29.4 (CH2CCH), 20.3 (NHCH2CH2), -1.2 (SiCH3). ESIMS m/z calcd. for C34H43N7O4Si: 641.3 [M]+; found: 642.4 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C34H44N7O4Si: 642.3224; found: 642.3219. Experimental section 277 Intermediate heterodimer of TLR4/7, 46 A solution of triazine 45 (29, 0.04 mmol) and the azide ligand 36 (15.9, 0.03 mmol) DMSO (1.1 mL) was placed into a flask under argon atmosphere. To this solution, CuBr (0.86 mg, 6 µmol) dissolved in DMSO (0.2 mL) was added and stirred at room temperature for 1h in the dark. Under argon atmosphere and darkness, another portion of CuBr (0.86 mg, 6 µmol) in DMSO (0.2 mL) was added and stirred for 30 minutes. Then, copper was removed by adding a metal scavenger resin, Quadrasil® Mercaptopropyl (a spatula tip) and stirred for 15 min at room temperature. After that, the mixture was filtered, washed with DMSO and the solvent was removed under high vacuum. The crude material was washed twice with cold dichloromethane and the white crystals were dissolved in DMF (2.2 mL). Then, a TBAF solution (1M THF, 55 µL) was added, the mixture was stirred at r.t. for 2 h and the solvent was removed under high vacuum. The crude material was precipitated by adding ACN and cooled to -40ºC (acetone / N2), washed with ACN and filtered to give compound 46 as a white solid (18 mg, 46%, two steps). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 10.58 (OCNH-Ar, brs, 1H), 8.55 (ArCH, s, 1H), 8.20 (OCNHCH, brs, 1H), 7.94 (Htriazole, s, 1H), 7.59-7.45 (ArCH, m, 7H), 5.32 (triazole-CH2CO, brs ,2H), 4.49 (HNCH2-triazole, brs ,2H), 3.91 (SCH2, s, 2H), 3.68 – 3.47 (CH2PEG, HNCH, m, 13H, overlapped with water signal), 3.18-3.13 (HCCCH2CH2, m, 2H), 2.79 (HCCH2CH2, s, 1H), 1.79-1.48 (cyclohexyl, m, 5H), 1.32-1.06 (cyclohexyl, m, 10H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ:166.2, 166.1 (CNH), 165.9 (HNCO), 164.5 (HNCO), 155.4 (NCHS), 152.8 (OCN-Ph), 146.6 (Ctriazole), 137.6 (ArC), 136.6 (ArC), 136.3 (ArC), 132.0 (NCCNH), 130.4 (ArC), 130.1 (ArCH), 130.0 (ArCH), 124.9 (CHtriazole), 121.4 (ArCH), 120.7 (ArC), 120.5 (ArCH), 113.6 (ArCH), 111.8 (ArCH), 83.6 (HCC), 72.4 (HCC), 70.0, 69.7 (CH2PEG), 58.0 (HCCCH2CH2), 52.6 (triazoleCH2CO), 48.5 (HNCH), 37.6 (SCH2), 36.0 (HNCH2-Triazole), 32.6 (cyclohexyl-CH2), Capítulo 8 278 25.6 (cyclohexyl-CH2), 24.9 (cyclohexyl-CH2), 23.5 (cyclohexyl-CH2), 19.7 (cyclohexyl-CH2), 19.5 (HCCCH2). ESI-MS m/z calcd. for C42H51N15O5S: 877.4 [M]+; found: 439.8 [M + 2H]2+, 878.4 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C42H52N15O5S: 878.3997; found: 878.3991. Heterodimer TLR4/7 ligand with amine, 47 To a solution of triazine 46 (24.7 mg, 0.03 mmol) and the azide ligand 20 (17.3 mg, 0.03 mmol) in DMSO (2.3 mL), CuSO4·5H2O (2.8 mg, 0.01 mmol) and TBTA (12.0 mg, 0.02 mmol) were aded in DMSO (2.3 mL) and finally a solution of sodium ascorbate (8.9 mg, 0.04 mmol) in 590 µL of phosphate buffer (50 mM, pH 7.4) were added to the mixture. The solution was stirred at room temperature overnight. Then, copper was removed by adding a metal scavenger resin, Quadrasil® Mercaptopropyl (a spatula tip) and stirred for 15 min at room temperature. After that, the mixture was filtered, washed with DMSO and the solvent was removed under high vacuum. The resulting crude was purified by size exclusion chromatography, Sephadex LH20 (DMF/MeOH, 1:1) and by semipreparative RP-HPLC (C8 Phenomenex Luna column, 10 × 250 mm, 10 μm); A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B: Acetonitrile; 30 to 35% linear gradient of B into A over 30 min, F= 3 mL/min. The corresponding analyzed fractions were collected and lyophilized affording the corresponding compound 47 (6 mg, 15%) as a white amorphous solid. 1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ: 12.10 (NHTLR4, s, 1H), 10.57 (OCNH-ArTLR4, brs, 1H), 10.06 (CNHCONTLR7, brs, 1H), 8.48 (OCNH-PEGTLR7, ArCHTLR4, m, 2H), 8.12 (OCNHCHTLR4, HtriazolTLR7, m, 2H), 7.87 (HtriazolTLR4, m, 1H), 7.77 (ArCHTLR7, d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.59-7.44 (ArCHTLR4, m, 7H), 7.34 (ArCHTLR7, d, J= 8.2 Hz, 2H), 6.49 (NH2TLR7, brs, 2H), 5.36 (triazole-CH2COTLR4, s, 2H), 4.90 (OCH2ArTLR7, s, 2H), 4.61 Experimental section 279 (triazole-CH2CH2TLR7, brs, 2H), 4.45 (HNCH2-triazoleTLR4, brs ,2H), 4.13 (CH3CH2CH2CH2TLR7, t, J= 6.6 Hz, 2H), 3.89 (SCH2TLR4, s, 2H), 3.75 (triazoleCH2CH2TLR7 , m, 2H), 3.75-3.30 (CH2PEGTLR7+triazine, HNCHTLR4, m, 43H, overlapped with water signal), 2.96 (triazole-CH2CH2TLR7 , brs, 2H), 2.89 (CH2CH2NH2triazine, brs, 2H), 1.69-1.46 (CH3CH2CH2CH2TLR7, cyclohexylTLR4, m, 7H), 1.37 (CH3CH2CH2CH2TLR7, q, J= 7.6 Hz, 2H), 1.14-1.06 (cyclohexylTLR4, m, 5H), 0.89 (CH3CH2CH2CH2TLR7, t, J= 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.5 (HNCOTLR7), 166.2, 166.1 (CNHtriazine), 166.0 (HNCOTLR4), 164.4 (HNCOTLR4), 160.5 (NCNH2TLR7),155.4 (NCHSTLR4), 152.8 (OCN-PhTLR4), 152.7 (COBuTLR7), 149.6 (HNCONTLR7), 148.3 (NH2CNHCCNTLR7), 146.5 (Ctriazol), 140.7 (ArCTLR7), 137.6 (ArCTLR4), 136.7 (ArCTLR4), 136.3 (ArCTLR4), 134.0 (ArCTLR7), 132.0 (NCCNHTLR4), 130.4 (ArCTLR4), 130.1 (ArCHTLR4), 130.0 (ArCHTLR4), 127.9 (ArCHTLR7), 127.6 (ArCHTLR7), 123.3 (CHtriazolTLR4/7), 121.4 (ArCHTLR4), 120.7 (ArCTLR4), 120.0 (ArCH TLR4), 113.7 (ArCHTLR4), 110.9 (ArCHTLR4), 98.8 (NH2CNHCCNTLR7), 70.1, 70.0 69.3, 69.2, 68.9, 68.4, 67.2 (CH2PEGTLR7+triazine), 66.3 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 52.7 (triazoleCH2COTLR4), 49.7 (triazole-CH2TLR7), 48.4 (HNCH2CH2TLR7),42.6 (CH2ArTLR7), 40.9 (HNCH2-triazoleTLR4), 39.0 (HNCH2CH2TLR7), 37.4 (SCH2TLR4), 32.6 (cyclohexylCH2TLR4), 31.0 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 25.5 (cyclohexyl-CH2TLR4), 24.9 (cyclohexylCH2TLR4), 19.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 14.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7). ESI-MS m/z calcd. for C67H86N24O11S: 1434.7 [M]+; found: 479.5 [M + 3H]3+, 718.8 [M + 2H]2+, 1436.4 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C67H87N24O11S: 1435.6707; found: 1435.6701. RP-HPLC tR= 8.01 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XBC8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile, 30 to 35% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Capítulo 8 280 Heterodimer TLR4/7 ligand with maleimide, 48 Compound 47 (6 mg, 4.18 µmol), anhydrous DIPEA (2.18 µL, 12.5 µmol), and 3maleimidopropionic acid 9 (1.41 mg, 8.36 µmol) were dissolved in anhydrous DMF (1.2 mL). To this solution, HATU (3.18 mg, 8.36 µmol) dissolved in anhydrous DMF (0.3 mL) was added and stirred at room temperature overnight. The solvent was removed under high vacuum and the crude material was washed twice with MeOH yielding compound 48 as a white solid (5.6 mg, 84%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.08 (NHTLR4, s, 1H), 10.52 (OCNH-ArTLR4, s, 1H), 10.02 (CNHCONTLR7, s, 1H), 8.52 (ArCHTLR4, s, 1H), 8.45 (OCNH-PEGTLR7, s, 1H), 8.16 (OCNHCHTLR4, m, 1H), 8.12 (OCNHCH2triazina, HtriazolTLR7, brs, 2H), 7.84 (HtriazolTLR4, m, 1H), 7.77 (ArCHTLR7, d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.61-7.44 (ArCHTLR4, m, 7H), 7.34 (ArCHTLR7, d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.02 and 6.97 (CHmalemide, s, 2H), 6.47 (NH2TLR7, brs, 2H), 5.34 (triazole-CH2COTLR4, s, 2H), 4.90 (OCH2ArTLR7, s, 2H), 4.54 (triazole-CH2CH2TLR7, brs, 2H), 4.44 (HNCH2-triazoleTLR4, brs ,2H), 4.13 (CH3CH2CH2CH2TLR7, t, J= 6.6 Hz, 2H), 3.90 (SCH2TLR4, s, 2H), 3.75-3.30 (CH2PEGTLR7+triazine, m, 42H, overlapped with water signal), 3.14 (HNCHTLR4, CH2CH2maleimide, m, 3H), 2.86 (triazole-CH2CH2TLR7, brs, 2H), 2.46 (CH2CH2-maleimide, m, 2H), 1.69-1.49 (CH3CH2CH2CH2TLR7, cyclohexylTLR4, m, 7H), 1.37 (CH3CH2CH2CH2TLR7, q, J= 7.6 Hz, 2H), 1.24-1.12 (cyclohexylTLR4, m, 5H), 0.89 (CH3CH2CH2CH2TLR7, t, J= 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 171.2 (COmalemide), 170.0 (HNCO-malemide), 166.5 (HNCOTLR7), 166.0 (CNHtriazine), 164.4 (HNCOTLR4), 163.4 (HNCOTLR4), 160.5 (NCNH2TLR7),155.4 (NCHSTLR4), 152.8 (OCNPhTLR4), 152.7 (COBuTLR7), 149.6 (HNCONTLR7), 148.3 (NH2CNHCCNTLR7), 140.7 (ArCTLR7), 137.6 (ArCTLR4), 136.7 (ArCTLR4), 136.3 (ArCTLR4), 135.0 (CHmaleimide), 134.0 Experimental section 281 (ArCTLR7), 131.9 (NCCNHTLR4), 130.4 (ArCTLR4), 130.1 (ArCHTLR4), 130.0 (ArCHTLR4), 127.9 (ArCHTLR7), 127.7 (ArCHTLR7), 123.3 (CHtriazolTLR4/7), 121.4 (ArCHTLR4), 120.7 (ArCTLR4), 120.0 (ArCH TLR4), 113.7 (ArCHTLR4), 110.9 (ArCHTLR4), 98.7 (NH2CNHCCNTLR7), 70.1, 70.0, 69.3 (CH2PEGTLR7+triazine), 66.3 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 52.6 (triazole-CH2COTLR4), 49.7 (triazole-CH2TLR7), 48.4 (HNCH2CH2TLR7), 43.2 (CH2ArTLR7), (HNCH2-triazoleTLR4, HNCH2CH2TLR7, overlapped with DMSO signal), 39.0 (CH2CH2-maleimide), 37.5 (SCH2TLR4), 34.5(CONHCH2PEG), 34.4 (CH2CH2-maleimide),32.6 (cyclohexyl-CH2TLR4), 31.0 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 25.5 (cyclohexyl-CH2TLR4), 24.9 (cyclohexyl-CH2TLR4), 19.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 14.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7). ESI-MS m/z calcd. for C74H91N25O14S: 1585.7 [M]+; found: 530.0 [M + 3H]3+, 794.3 [M + 2H]2+, 1586.5 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. for C74H91N25O14SNa: 1608.6796; found: 1608.6790. RP-HPLC tR= 12.60 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile, 10 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). TLR4 Ligand dimer conjugate, 49 A solution of peptide Pru p 3 SH (1.2 mg, 0.54 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 37 µL) and Milli-Q water (74 µL) was added to a solution of dimer 38 (0.70 mg, 0.45 µmol) in DMSO (220 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RP-HPLC), 1 ml of Milli-Q water was added until precipitation and the supernatant was removed. The precipitate was dissolved in DMSO and MeOH was added until the solution was cloudy. After Capítulo 8 282 centrifugation at 4000 rpm, the supernatant was concentrated under a flow of N2. The solution was diluted in Milli-Q water and lyophilized to yield conjugate 49 as a white solid (1.2 mg, 70%). ESI-MS m/z calcd.: 3800.9 [M]+; found: 543.9 [M + 7H]7+, 761.2 [M + 5H]5+, 951.0 [M + 4H]4+, 1267.6 [M + 3H]3+. RP-HPLC tR= 11.4 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile, first two minutes with 10% of B, the rest, 10 to 80% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). TLR7 Ligand dimer conjugate, 50 A solution of peptide Pru p 3 SH (1.1 mg, 0.5 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 150 µL) and Milli-Q water (82 µL) was added to a solution of TLR7 ligand dimer 40 (0.8 mg, 0.5 µmol) in DMSO (245 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RP-HPLC), only a signal corresponding to the final product was observed. To remove salts, 1 ml of MilliQ water was added until precipitation and after washing with more Milli-Q water in a centrifuge at 4000 rpm. The precipitate was lyophilized, affording the corresponding conjugate 50 as a white solid (1.7 mg, 88%). ESI-MS m/z calcd.: 3854.9 [M]+, found: 552.1 [M + 7H]7+, 643.8 [M + 6H]6+, 772.3 [M + 5H]5+, 965.0 [M + 4H]4+, 1286.0 [M + 3H]3+. RP-HPLC tR= 10.11 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; 10 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Experimental section 283 Heterodimer TLR4/7 ligand conjugate, 51 A solution of peptide Pru p 3 SH (1.53mg, 0.68 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 46 µL) and Milli-Q water (93 µL) was added to a solution of heterodimer TLR4/7 ligand 48 (0.9 mg, 0.57 µmol) in DMSO (467 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RPHPLC), the reaction mixture was purified by semipreparative RP-HPLC (C8 Phenomenex Luna column, 10×250 mm, 10 μm; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; 25 to 35% linear gradient of B into A over 30 min, F= 3 mL/min). The corresponding analyzed fractions were collected and lyophilized affording the conjugate 51 (1.0 mg, 46%) as a white amorphous solid. ESI-MS m/z calcd.: 3841.9 [M]+, found: 641.7 [M + 6H]6+, 769.7 [M + 5H]5+, 961.8 [M + 4H]4+, 1281.8 [M + 3H]3+. RP-HPLC tR= 6.90 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; 25 to 35% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Capítulo 8 284 8.5 Synthesis of conjugated glycodendrons Conjugated glycodendron 53 A solution of peptide β-PRVB-SH (0.67 mg, 0.69 µmol) in Milli-Q water (338 µL) was added to a solution of glycodendron 52 (2.60 mg, 0.63 µmol) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 476 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature (the progression of the reaction was monitored by analytical RP-HPLC), only a signal corresponding to the final product was observed. To remove salts, the solution was filtered using an Amicon Ultra centrifugal filter (Ultra-15, MWCO 3KDa) and after washing with Milli-Q water in a centrifuge at 4000 rpm, the collected aqueous phase was lyophilized, affording the corresponding conjugate 53 as a white solid (3.2 mg, quant). ESI-MS m/z calcd.: 5091.15 [M]+, found: 1274.2 [M + 4H]4+, 1699.3 [M + 3H]3+. RPHPLC tR= 7.96 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Acetonitrile; 15 to 60% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Experimental section 285 Glycodendron 54 To a solution of mannose nonavalent glycodendron IV (112 mg, 0.030 mmol) and 1phenyl-2-propyn-1-one (19.3 mg, 0.15 mmol) in DMF (1.6 mL), CuSO4·5H2O (3.7 mg, 0.015 mmol) and TBTA (15.7 mg, 0.03 mmol) dissolved in DMF (1.0 mL) and finally sodium ascorbate (9.4 mg, 0.05 mmol) in 0.4 mL of phosphate buffer (50 mm, pH 7.4) were added to the mixture. The solution was stirred at room temperature overnight. Then, copper was removed by adding a metal scavenger resin, Quadrasil® Mercaptopropyl (a spatula tip) and stirred for 15 min at room temperature. After that, the mixture in DMF was filtered and the resulting solution was directly purified by semipreparative RP-HPLC (C18 Phenomenex Luna column, 10×250 mm, 10 μm); A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B: Acetonitrile; 18 to 25% linear gradient of B into A over 40 min, F= 3 mL/min. The corresponding analyzed fractions were collected and lyophilized affording the corresponding glycondendron 54 (43.5 mg, 37%) as a white amorphous solid. 1H NMR (D2O, 400 MHz) δ: 8.59 (Htriazole, s, 1H), 7.92 (Htriazole, s, 9H), 7.88-7.38 (Htriazole, ArCH, m, 5H), 7.53 (ArCH, t, J= 7.53 Hz, 1H), 7.39 (ArCH, t, J= 7.53 Hz, 2H), 4.70 (H1, Capítulo 8 292 µL) was added and the mixture was stirred in the dark at room temperature for 12 h. After that, the solvent was removed under vacuum and the resulting crude was purified by size exclusion chromatography, Sephadex LH20 (100% MeOH), giving the mannose nonavalent dendron 62 as a white foam (9.0 mg, 97%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ: 8.01-7.95 (Htriazole, ArCH, m, 14H), 7.92-7.84 (ArCH, m, 2H), 6.85 and 6.71 (CHmaleimide, s, 2H), 4.70 (H1, overlapped with water signal, 9H), 4.75-4.50 (H11, H8, H7, m, 54H), 4.13 (H2, m, 9H), 3.90-3.78 (H2, H14, CH2CH2-maleimide, m, 30H), 3.70-3.37 (H3, H4, H6, H12, H14, H17, m, 98H). 3.32 (H5, overlapped with methanol signal, 9H), 2.64 (CH2CH2-maleimide, brs, 2H), 2.35 and 2.28 (CH3, s, 3H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 171.2 (COmalemide), 166.9 (NHNCO), 166.3 (Ar-CONH), 155.4 (CH3CNNH), 147.4 (ArC), 147.2 (ArC), 144.5 (C10), 144.4 (C16), 135.0 (CHmaleimide), 127.7 (ArCH), 126.3 (ArCH), 124.5 (C9), 124.4 (C15), 100.3 (C1), 74.6 (C5), 71.5 (C3), 70.9 (C12), 70.5 (C2), 70.2, 69.6, 69.1, (C14), 67.2 (C4), 65.4 (C7), 64.6 (C11), 61.6 (C6), 49.7 (C8), 49.1 (C13), 45.4 (C17), 40.7 (CH2CH2-maleimide), 34.0 (CH2CH2maleimide), 20.1 (NCH3). ESI-MS m/z calcd. for C164H258O80N40: 4070.1 [M]+; found: 815.2 [M +5H]5+, 1018.5 [M + 4H]4+, 1357.4 [M + 3H]3+. RP-HPLC tR= 8.2 min (Column: analytical BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O, B: Acetonitrile; 15 to 35% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min). Experimental section 293 Conjugated glycodendron 63 Peptide Pru p 3-SH (0.65 mg, 0.29 µmol) and glycodendron 62 (1.17 mg, 0.29 µmol) were disolved in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4, 420 µL). After shaking for aprox. 25 min at room temperature, the consumption of glycodendron 62 was monitored by analytical RP-HPLC. The solution was filtered using an Amicon Ultra centrifugal filter (Ultra-15, MWCO 3KDa) and after washing with Milli-Q water in a centrifuge at 4000 rpm, the collected aqueous phase was lyophilized, affording the conjugate 63 as a white solid (1.7 mg, 94%). ESI-MS m/z calcd.: 6325.2 [M]+; found: 792.1 [M + 8H]8+, 905.0 [M + 7H]7+, 1055.5 [M + 6H]6+, 1266.3 [M + 5H]5+, 1582.4 [M + 4H]4+. 8.6 Evaluation of hydrazone 62 hydrolysis at different pH Studies at different pH were performed with hidrazone 62. Four buffer solutions were prepared with a concentration of 50 mM. One phosphate buffer at pH 7.4 and three citrate buffers at pH= 3, 5 and 6. 300 µL of a stock solution of hydrazone 62 in MeOH (0.5 mM) Capítulo 8 294 were diluted 1:2 with each of the buffer solutions. The solutions were incubated in a thermostated bath at 37ºC with stirring. Then, 10 L of sample were analyzed at λ= 275.6 nm by RP-HPLC (analytical column BioZen, 3.6 µm, Peptide XB-C8; A: Milli-Q H2O, B: Acetonitrile; 15 to 35% linear gradient of B into A over 15 min, F= 1 mL/min) every 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h and after 36 h. 8.7 Biological assays All the results of biological studies of the Pru p 3-adjuvant conjugates described in this doctoral thesis were carried out by the allergology group of Dr. Cristobalina Mayorga (Hospital Regional Universitario de Málaga). 8.7.1 Allergic patients and tolerant controls For all these studies were included Pru p 3 (peach) allergic patients. Inclusion criteria were: clear clinical history of peach allergy, a positive skin prick test (SPT), and specific IgE (sIgE) to Pru p 3 or a positive oral food challenge (OFC) to unpeeled-peach. OFC was not performed in patients with a history of more than two episodes of anaphylaxis after peach ingestion in the two years preceding the study. A tolerant control group of subjects with negative SPT and sIgE results, and good tolerance to unpeeled-peach was also included. The study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki. The study was approved by the local ethics committee. All participants signed informed consent forms before the study began. 8.7.2 Generation of moDCs Fresh peripheral blood mononuclear cells, obtained by a ficoll gradient from 40 mL of blood per individual, were used for monocyte purification by means of anti-CD14 microbeads following the manufacturer’s protocol (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). The CD14− cell fraction was placed in 10% DMSO and frozen for a later lymphocyte proliferation test. To generate DCs, monocytes (CD14+ cells) were incubated in complete medium containing Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (Thermo Experimental section 295 Fisher Scientific, Carlslab, CA) supplemented with 10% FBS (Thermo Fisher Scientific), streptomycin (100 μg/mL), and gentamicin (1.25 U/mL), as well as recombinant human rhGM-CSF (200 ng/mL) and rhIL-4 (100 ng/mL) (both from R&D Systems Inc, Mineapolis, MN) for 5 days at 37°C and 5% CO2. 8.7.3 Fluorescent labelling of Pru p 3 conjugates Pru p 3 conjugates were labelled with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) according to the manufacturer’s instructions (Thermo Fisher Scientific). After 1 hour of incubation with constant stirring in the dark, the uncoupled free Alexa Fluor 647 was removed by gel filtration column (PD MiniTRap G-25 column, GE Healthcare, Chicago, IL) with PBS. The conjugates were concentrated with Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). 8.7.4 Studies by flow cytometry and confocal microscopy Immature moDCs were cultured with 10 nM of corresponding compounds at different time points (from 15 min to 48 h) at 37ºC. The moDC were stained with anti-humanCD86 (Becton Dickinson (BD) Bergen, NJ) and analyzed using flow cytometry. Cells were acquired in a FACSCanto II Cytometer (BD) and data analyzed using FlowJo® software (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Results were expressed as mean intensity fluorescence (MIF) and as percentages of double positive cells for CD86 and fluorescent conjugates. Following incubation with the corresponding compunds at different time points, moDCs were fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde for 1 h, washed three times with PBS, and stored protected from light at 4°C until analysis. Submembrane actin and nuclei (DNA) were labeled by 20 min incubations with 10 μM Atto 488-conjugated phalloidin (Sigma-Aldrich, Munich, Germany) and 1 μg/mL Hoechst 33258 (SigmaAldrich), respectively. Once prepared, moDCs were either mounted on glass slides in Fluoroshield mounting medium (Sigma-Aldrich) or transferred to optical bottom 96-well plates (Nunc) in PBS for observation by confocal microscopy. For the lysosome staining, after fixation, cells were permeabilized with saponin (0.1% in PBS with 2% bovine serum albumin V fraction (Sigma-Aldrich) followed by an overnight incubation at 4°C with the Capítulo 8 296 primary rabbit LAMP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) antibody using a 1:25 dilution followed by a 1 h incubation at room temperature with a secondary antirabbit Cy2conjugated antibody (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Cells were washed three times after each antibody incubation and finally mounted on glass slides. Samples were analyzed using a Leica DM6000 inverted microscope connected to a Leica SP5 laser scanning confocal system and Fiji software. 8.7.5 moDC maturation studies To assess changes in the moDC maturation state after stimulation, 105 moDCs /mL were incubated in 96-well plates (Thermo-Fisher Scientific) with the corresponding compounds. All experiments were done at 10 nM (This concentration was shown to be effective in preliminary experiments). Moreover, LPS (Sigma-Aldrich) was included as positive controls (100 µg/mL), and complete medium as negative control, for 48 hours at 37ºC in 5% CO2. After this, moDCs were harvested and their maturation status assessed by analysing the expression of CD80, CD83, CD86 and PD-L1 molecules (BD and Biolegend, San Diego, CA). Cells were acquired in a FACSCanto II Cytometer (BD) and data analyzed using FlowJo® software (Tree Star, Inc). Results were expressed as maturation index (MI). 8.7.6 Specific proliferative response of different cell subpopulations The specific proliferation of different lymphocyte subpopulations was evaluated using, as antigen presenting cells (APC), autologous moDCs pre-stimulated with 10 nM of different experimental combinations for 48 h previously described. Proliferation was determined using a 5,6-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (CFSE) dilution assay (Thermo Fisher Scientific). A total of 1.5x106/mL pre-labelled CD14cells were cultured with different experimental combinations-pre-stimulated-moDC (10:1 ratio) at a final volume of 250 µL of complete medium, in 96-well plates for 6 days at 37ºC and 5% CO2. 10 µg/mL phytohemaglutinin (Sigma-Aldrich) was used as positive proliferative control and unstimulated moDCs as negative proliferative control. The proliferative responses were assessed by flow cytometry, analyzing CFSElow expression in the different cell subsets as lymphocytes T (CD3+T, CD4+T and CD8+T), lymphocytes B (CD19+B) and NK cells (CD56+NK). Results were expressed as proliferation index Experimental section 297 (PI). The PI was calculated for each cell subset as ([% CFSElow stimulated PBMCs+DC]- [% CFSElow stimulated PBMCs)/ (% CFSElow unstimulated PBMCs+DCs). In addition, the percentages of regulatory T (Treg) cells were also evaluated by flow cytometry, analyzing the expression of the CD4+CD127-/lowCD25+FOXP3+ markers. 8.7.7 Cytokine determination To determine cytokine production from the corresponding compounds of specific T lymphocytes, the supernatants from moDC (48 h of culture) and the lymphocyte cultures (6 days) were collected, and cytokine production (IL-4, IL-5, IL-10 and IFNγ) was determined with a human ProcartaPlex Multiplex Immunoassays kit (Thermo Fisher Scientific), following the manufacturer’s indications and detected in a Bio-Plex 200 (BioRad, Hercules, CA). Data were analyzed using Bio-Plex® Data Analysis Software (BioRad, Hercules, CA). 8.7.8 Statistic The data were analyzed using the Shapiro-Wilk test to determine the normal distribution but the most variables were fitted to non-parametric distribution. The Friedman test was used to find significant differences due to the effects of different compounds between subjects from the same group. In the case that the Friedman test indicated the existence of significant differences between treatments, we applied Mann-Whitney U test for pairwise comparisons between unrelated groups and Wilcoxon signed-rank test was used for pairwise comparisons in related samples. Bonferroni correction was used to reduce the threshold for significance as indicated in each study. The Kruskal-Wallis test was used to compare between different groups of subjects (allergic patients vs. tolerant controls). Capítulo 8 298 Appendix 1 Selection of spectra and chromatograms Selection of spectra and chromatograms 301 Appendix 1. Selection of spectra and chromatograms Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K), 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6, 298 K) y de ESI-MS del compuesto 10, según orden de aparición. Appendix 1 308 Espectro de 1H-RMN (400 MHz, MeOH-d4, 298 K), 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6, 298 K) del compuesto 62, según orden de aparición. Selection of spectra and chromatograms 309 Cromatograma y espectro de ESI-MS del compuesto 62, según orden de aparición. Appendix 1 310 Conjugados a péptidos alergénicos Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 11, según orden de aparición. Selection of spectra and chromatograms 311 Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 12, según orden de aparición. Appendix 1 312 Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 13, según orden de aparición. Selection of spectra and chromatograms 313 Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 23, según orden de aparición. Appendix 1 314 Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 24, según orden de aparición. Selection of spectra and chromatograms 315 Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 25, según orden de aparición. Appendix 1 316 Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 49, según orden de aparición. Selection of spectra and chromatograms 317 Cromatograma y espectro de ESI-MS del conjugado 50, según orden de aparición. Appendix 2 324