Influencia de bioestimulantes sobre la accesibilidad microbiana de hidrocarburos aromáticos policíclicos

INFLUENCIA DE BIOESTIMULANTES SOBRE LA ACCESIBILIDAD MICROBIANA DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS Sevilla, Diciembre de 2011 Memoria que presenta Mª del Carmen Tejeda Agredano para optar al título de Doctora en Química - 2 - - 3 - INFLUENCIA DE BIOESTIMULANTES SOBRE LA ACCESIBILIDAD MICROBIANA DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS Visado en Sevilla, a de Diciembre de 2011. LOS DIRECTORES EL TUTOR Memoria que presenta: D. Mª del Carmen Tejeda Agredano para optar al grado de Doctora en Química Director Dr D. José Julio Ortega Calvo Investigador científico del CSIC Departamento de Agroquímica y Conservación de Suelos del IRNAS Co - director Dr. D. Manuel Cantos Barrag án Científico titular del CSIC Departamento de Biotecnología Vegetal del IRNAS Dr. D. Antonio Jordán López Profesor contratado doctor Departamento de Edafología y Química Agrícola de la Facultad de Química, Universidad de Sevilla - 4 - - 5 - DOCTOR D. Jose Manuel Pardo Prieto DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Influencia de bioestimulantes sobre la accesibilidad microbiana de hidrocarburos aromáticos policíclicos.”, presentada por Dª. Mª del Carmen Tejeda Agredano para optar al grado de Doctor en Química, ha sido realizada en el Departamento de Agroquímica y conservación de suelos, bajo la dirección de los Drs. D. José Julio Ortega Calvo y D. Manuel Cantos Barragán reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a de Diciembre de 2011. - 6 - - 7 - El presente trabajo se ha realizado en el marco del proyecto CGL2007-64199 del Plan Nacional de I +D (CYCIT), dentro del Programa Nacional de Formación de Personal Investigador (FPI). - 8 - - 9 - Agradecimientos Quisiera expresar mis agradecimientos a todos los que de una forma más o menos directa, han contribuido a la realización de mi Tesis Doctoral . Muchísimas gracias al Dr. José Julio Ortega Calvo por brindarme la oportunidad de formar parte de su grupo de investigación y poder desarrollar mis conocimientos en este ámbito. Gracias por su labor como director de esta tesis y por saber transmitir sus conocimientos tan necesarios para mi formación. Sinceramente, gracias. Al Dr. Manuel Cantos Barragán por co-dirigir esta Tesis Doctoral . Gracias por su apoyo, tanto por sus correcciones como por sus charlas. Muchas gracias por introducirme en su grupo, al cual también le quiero hacer partícipe de mis agradecimientos. A María del Mar y Javier, siempre me acordaré del congreso en Murcia. Gracias al Dr. Antonio Jordán López por aceptar ser el tutor de esta Tesis Doctoral y facilitarme en todo momento el desarrollo de la misma. Debo de agradecer también al Dr. D. José Manuel Pardo Prieto, director del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla por las facilidades prestadas para realizar esta Tesis. Agradecer a Philipp Mayer, por hacer posible mis estancias en su centro, en NERI, Roskilde (Dinamarca). Muchas gracias por introducirme al apasionante mundo del passive dosing, gracias por su calidad humana y la de su grupo de investigación por acogerme y tratarme como uno más. Muchas gracias a Marguit, Kilian, Stin, Geoffrey, Tina, Tea, Naja y sobre todo a Varvara. También a ti, Eli que te conocí allí y hemos pasado unos momentos inolvidables junto a Maria y Almu. - 16 - ÍNDICE GENERAL - 17 - ÍNDICE GENERAL PREFACIO…………………………………………………….……….…..13 ÍNDICE GENERAL……………………………...………………..………17 ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………….………...22 ÍNDICE DE TABLAS…………………………………..……….………..27 LISTA DE ACRÓNIMOS...........................................................30 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …. .… …. .… …… …… …. .33 I.1. INTRODUCCIÓN……………………………………….…….….35 I.2. HAPs: DISTRIBUCIÓN Y TOXICIDAD……………………...39 I.3. BIORREMEDIACIÓN: CONCEPTO, TIPOS Y FACTORES LIMITANTES………………………………………………..……..…..49 I.4. INFLUENCIA DE LOS LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs) EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPs………………….56 I.5. BIODISPONIBILIDAD, BIOACCESIBILIDAD Y ACTIVIDAD QUÍMICA……………………..…………………………………………61 I.6. MÉTODOS DE REPARTO DE HAPs EMPLEANDO POLIDIMETILSILOXANO……………………………………..……..65 I.7. TÉCNICAS DE BIOESTIMULACIÓN……………………......74 I.7.1. Fertilizantes oleofílicos……………………………..……..74 I.7.2. Fitorremediación y rizorremediación……………….….76 I.7.3. Materia orgánica disuelta: Ácidos húmicos……….…86 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II I. . O OB BJ JE ET TI IV VO OS S… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …. .. .91 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II II I. . M MA AT TE ER RI IA AL LE ES S Y Y M ME ET TO OD DO OL LO OG GÍ ÍA A ................... 95 III.1. REACTIVOS ................................................................................... 97 ÍNDICE GENERAL - 18 - III.2. LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs).......................... 98 III.3. SUELOS .......................................................................................... 99 III.4. BACTERIAS, MEDIOS, CONDICIONES DE CULTIVO Y PREPARACIÓN DE INÓCULOS........................................................ 101 III.5. ANÁLISIS DE HAPs POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).............................................................. 104 III.6. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL FERTILIZANTE OLEOFÍLICO EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPS................. 106 III.6.1. Experimentos de mineralización con el método de la interfase constante.......................................................................... 106 III.6.2. Experimentos de reparto con el método del área interfásica constante....................................................................... 109 III.7. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LAS RAÍCES DE PLANTAS Y SUS EXUDADOS EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPs ......................................................................................................... 110 III.7.1. Producción in vitro de exudados.................................. 110 III.7.2. Mineralización de pireno en cultivos líquidos en presencia y ausencia de exudados de raíces de girasol ...... 115 III.7.3. Ensayo en invernadero .................................................... 116 III.7.4. Extracción de los HAPs del suelo y purificación de la muestra............................................................................................... 120 III.7.5. Experimentos de mineralización de pireno en suspensiones de suelo contaminado con creosota en presencia y ausencia de exudados de girasol............................................. 122 III.8. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE ÁCIDOS HÚMICOS EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPS ......................................................... 123 III.8.1. Preparación de ácidos húmicos..................................... 123 ÍNDICE GENERAL - 19 - III.8.2. Mineralización de pireno y fenantreno en cultivos líquidos en presencia o ausencia de ácidos húmicos .......... 123 III.8.3. Experimentos de disolución de pireno en presencia y ausencia de ácidos húmicos. Control de la concentración libre disuelta................................................................................................ 124 III.9. ENSAYOS CON TÉCNICAS DE DOPAJE PASIVO CON POLIDIMETILSILOXANO.................................................................... 127 III.9.1. Preparación de viales con polidimetilsiloxano empleados en dopaje pasivo............................................................................... 127 III.9.2. Estudio de la mineralización y disolución de pireno en presencia y ausencia de ácidos húmicos en viales con PDMS128 III.9.3. Estudio de la difusión de PAHs en presencia de los 3 bioestimulantes empleados en biodegradación...................... 130 III.9.4. Ensayos de dopaje pasivo en el estudio de la capacidad extractora de HAPs por los bioestimulantes empleados en biodegradación.................................................................................. 133 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I IV V. . R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S..............................................137 IV.1. FERTILIZANTE OLEOFÍLICO................................................. 139 IV.1.1. Caracterización del fertilizante oleofílico S-200....... 139 IV.1.2. Influencia del fertilizante oleofílico en la biodegradación de los componentes del fuel ......................................................... 139 IV.1.3. Estudio del reparto del fenantreno desde los NAPLs148 IV.1.4. Efecto de las condiciones de agitación y de los nutrientes en la biodegradación.................................................. 155 IV.2. RIZOSFERA Y EXUDADOS DE RAÍZ................................... 156 IV.2.1. Caracterización de los exudados de raíz.................... 156 ÍNDICE GENERAL - 20 - IV.2.2. Influencia de la rizosfera de girasol sobre la eliminación de HAPs procedentes de un suelo contaminado con creosota162 IV.2.3. Influencia de exudados de raíces de girasol sobre la biodegradación de HAPs presentes en un suelo contaminado con creosota....................................................................................... 168 IV.2.4. Efecto de los exudados de raíces de girasol sobre la biodegradación de pireno .............................................................. 173 IV.3. ÁCIDOS HÚMICOS.................................................................... 175 IV.3.1. Caracterización de los ácidos húmicos....................... 175 IV.3.2. Estudio físico-químico de los HAPs en presencia de ácidos húmicos mediante ensayos de reparto con polidimetilsiloxano........................................................................... 176 IV.3.3. Estimación de la velocidad de degradación de fenantreno y pireno en cultivos líquidos en presencia de ácidos húmicos............................................................................................... 178 IV.3.4. Caracterización de la concentración total y libre disuelta de pireno en presencia de ácidos húmicos.............................. 185 IV.3.5. Evolución de la concentración de pireno libre disuelta durante su biodegradación en presencia y ausencia de ácidos húmicos............................................................................................... 190 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V V. . D DI IS SC CU US SI IÓ ÓN N...................................................195 V.1. FERTILIZACIÓN DIRIGIDA DE LA INTERFASE NAPL/AGUA MEDIANTE FERTILIZANTES OLEOFÍLICOS............................... 197 V. 2. EFECTO ECOFISIOLÓGICO DE LA RIZOSFERA DEL GIRASOL ................................................................................................. 201 V.3. PAPEL DE LA ACTIVIDAD QUÍMICA EN EL EFECTO BIOESTIMULANTE DE LOS ÁCIDOS HÚMICOS ....................... 207 V.4. VISIÓN GENERAL Y COMPARACIÓN ENTRE LOS BIOESTIMULANTES UTILIZADOS.................................................. 211 ÍNDICE GENERAL - 21 - C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V VI I. . C CO ON NC CL LU US SI IO ON NE ES S ..........................................217 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V VI II I. . B BI IB BL LI IO OG GR RA AF FÍ ÍA A...........................................223 ÍNDICE DE FIGURAS - 22 - ÍNDICE DE FIGURAS Figura I. 1.- Contaminación del suelo en Europa en el año 2006 ...................................................................................................37 Figura I. 2.- Contaminantes presentes en Europa en el año 2006 ...................................................................................................37 Figura I. 3.- Asignación presupuestal del gasto público y privado para la gestión de de emplazamientos contaminados del año 2006.....................................................................................39 Figura I. 4.- Reparto de los contaminantes hidrófobos desde el NAPL hacia la fase acuosa, en ausencia y presencia de microorganismos.............................................................................61 Figura I. 5.- Esquema donde se ilustra la fracción biodisponible y la bioaccesible de un contaminante en el suelo, tal y como se definen estos términos mediante la ubicación física ................................................................................63 Figura I. 6.- Esquema de un sistema con varias fases.....675 Figura I.7.- Esquema representativo de la formación de la capa de difusión limitante (UBL) entre la fuente de contaminación y los microorganismos en un medio acuoso………………………………………………………………66 Figura I. 8.- Esquema de los 3 pasos en el proceso de difusión de los PAHs en las microcámaras desde el disco contaminado al disco sin PAHs.............................................................................69 Figura I. 9.- Fundamento de la técnica de dopaje pasivo..72 Figura I. 10.- Mecanismos envueltos en la fitorremediación de hidrocarburos aromáticos policíclicos......................................79 Figura I. 11.- Rizorremediación de HAP..................................85 ÍNDICE DE FIGURAS - 23 - Figura I. 12.- Estructura de los ácidos húmicos..................87 Figura III. 1.- Emplazamiento contaminado con creosota. Fotos de la zona y del muestreo de suelo. ............................100 Figura III. 2.- Tubos de ensayo de 150 x 25 mm de capacidad para el primer ensayo de cultivo in vitro ...............................111 Figura III. 3.- Sistema utilizado para la obtención de exudados de girasol in vitro. ..........................................................................113 Figura III. 4.- Diseño experimental del ensayo realizado en invernadero .....................................................................................118 Figura III. 5.- Esquema del proceso de extracción y cuantificación de HAPs de suelos............................................121 Figura III. 6.- Viales de dopaje pasivo con PDMS fijados en su base para la mineralización de 50 µg·mL -1 de pireno por Mycobacterium gilvum VM552 en presencia de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos extraidos de Santa Olalla, Huelva. ..........129 Figura III. 7.- Sección transversal del diseño experimental de las microcámaras empleadas en el estudio del aumento de difusión en presencia de los diferentes bioestimulantes utilizados. ........................................................................................131 Figura IV. 1.- Efecto del bioestimulante oleofílico (S-200) sobre la mineralización de (A) fenantreno, (B) pireno, y (C) fluoranteno presente en fuel/HMN por Mycobacterium gilvum VM552...............................................................................................141 Figura IV. 2.- Áreas normalizadas con hopano (A/A HOP ) de los n-alcanos (m/z 85) detectados por el análisis GC-MS en el fuel/HMN residual de los controles abióticos (barras de color negro) y con cultivo de Mycobacterium gilvum VM552 (barras con rayas), con S-200..................................................................143 ÍNDICE DE FIGURAS - 24 - Figura IV. 3.- Concentraciones de HAPs recuperadas del NAPL de los controles y matraces inoculados, tanto con o sin bioestimulante S-200...................................................................144 Figura IV. 4.- Cromatogramas típicos con GC-MS del extracto neutro (arriba) y del ácido (abajo) de las fases acuosas de los cultivos con Mycobacterium gilvum VM552 en la presencia de bioestimulantes con los picos identificados.........................145 Figura IV. 5.- Reparto de fenantreno desde el fuel/HMN en presencia y ausencia del bioestimulante oleofílico S-200148 Figura IV. 6.- Efecto del bioestimulante oleofílico (S-200) sobre la mineralización del fenantreno presente en el NAPL (fuel/HMN) por Mycobacterium gilvum VM552 en presencia del tensioactivo Brij 35.......................................................................150 Figura IV. 7.- Efecto del bioestimulante oleofílico (S-200) sobre la mineralización de fenantreno presente en difereentes NAPLs puros.................................................................................................152 Figura IV. 8.- Efecto del bioestimulante oleofílico (S-200) sobre la mineralización del fenantreno presente en fuel/HMN libremente, con el área interfacial constante (con cilindros) y añadiendo diferentes nutrientes ..............................................156 Figura IV. 9.- Sistema radicular de Festuca y Lolium.......157 Figura IV. 10.- Detalle de la calidad del sistema radicular in vitro de Helianthus, Lolium y Festuca.....................................159 Figura IV. 11.- Desarrollo del sistema radicular del girasol en una maceta con suelo contaminado.......................................163 Figura IV. 12.- Recuento de poblaciones del suelo contaminado con creosota (mezcla, 1:1) con los diferentes tratamientos realizados en el invernadero………………..162 ÍNDICE DE FIGURAS - 25 - Figura IV. 13.- Abundancia relativa de los grupos filogenéticos de las eubacterias identificados en los diferentes tratamientos realizados en invernadero............................................ 167 Figura IV. 14.- Mineralización de 14 C-pireno en suspensiones de suelo contaminado con creosota por bacterias autóctonas, en presencia y ausencia de exudados de raíces de girasol169 Figura IV. 15.- Perfil del DGGE de fragmentos del gen 16S rRNA amplificados con PCR de las suspensiones de suelo contaminado con creosota .........................................................172 Figura IV. 16.- Mineralización de pireno puro en presencia y ausencia de exudados de raíces de girasol...........................174 Figura IV. 17.- Mineralización de pireno y de fenantreno a una concentración de 50 µg·mL -1 en presencia de 100 µg·mL -1 de ácidos húmicos ........................................................................180 Figura IV. 18.- Mineralización de pireno a 50 µg·mL -1 en presencia y ausencia de ácidos húmicos a 10 µg·mL -1 Diferenciándose los siguientes tratamientos: sin equilibrar, equilibrando y en presencia de PDMS. ..................................182 Figura IV. 19.- Estudio de la disolución de 50 µg·L -1 de pireno a 80 rpm y 25ºC: A) concentración de pireno total disuelto, B) concentración de pireno libre disuelto y C) concentración de pireno total con dopaje pasivo..................................................188 Figura IV. 20.- Concentraciones libres disueltas medidas en la biodegradación de pireno en ausencia y en presencia de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos por espectrofotómetro sincrónico de fluorescencia.. ..........................................................................191 Figura IV. 21.- Variación de la intensidad de fluorescencia mediante espectrofotómetro de fluorescencia sincrónica de las medidas de biodegradación en cubeta de pireno a 53.4 ng·mL - 1 y en ausencia (A) y presencia (B) de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos............................................................................................193 LISTA DE ACRÓNIMOS - 32 - PDA: Partitioning Driven Administering PDMS: Polidimetilsiloxano PRTR-España: Registro Estatal de Emisiones y Fuentes Contaminantes de España SH: Sustancias Húmicas SPME: Microextracción en Fase Sólida SW: Medio Suiza Tr: Tiempos de Retención TSA: Agar, Soja y Triptona UBL: Ustirred Boundary Layer C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I I Introducción - “Los imposibles de hoy serán posibles mañana”. Konstantin Tsiolkovsky (1857-1935). CAPÍTULO I: Introducción - 34 - CAPÍTULO I: Introducción - 35 - I.1. INTRODUCCIÓN A través del desarrollo industrial en todo el mundo podemos hacernos idea de la generación de un amplio número de compuestos naturales y sintéticos perjudiciales para el medio ambiente debido a negligencias realizadas en el tratamiento de residuos, vertederos ilegales de desechos industriales provocados tal vez, por ignorancia o falta de recursos y derrames accidentales. Como consecuencia de la producción de estos contaminantes, existen numerosos sitios que requieren una limpieza de estos residuos tanto en suelos, como en lodos o aguas superficiales. Sólo en Estados Unidos se ha calculado alrededor de 1.7 trillones de dólares invertidos en los últimos 30 años para tratar estos lugares contaminados (Yu, 2006). Por todo ello, se ha desarrollado una conciencia social para establecer una legislación adecuada que reduzca la producción de residuos contaminantes y prevenir el escape de los mismos al medio circundante. Algunos accidentes han supuesto un elevado impacto ambiental como el vertido de combustible del Exxon Valdez, la liberación de productos radiactivos tras el accidente de la central nuclear de Chernobil, la rotura de la presa de Aznalcóllar o la catástrofe ecológica producida por el vertido del petrolero Prestige frente a las costas gallegas. Más recientemente, se ha tenido constancia del derrame de petróleo de uno de los pozos de la empresa British Petroleum (BP) en el Golfo de México y la crisis nuclear en la central de Fukushima tras el terremoto y tsunami en Japón, todos estos desastres ecológicos han puesto de manifiesto la justificada preocupación y alarma que estos temas suscitan en el conjunto de la población y lo mucho que queda por hacer para prevenir o resolver adecuadamente este tipo de situaciones. El empleo de la biorrecuperación o biorremediación, es decir, la recuperación de terrenos y acuíferos contaminados mediante procesos biológicos, en el tratamiento de residuos peligrosos supone un concepto relativamente nuevo que se está convirtiendo en una tendencia importante y de rápido CAPÍTULO I: Introducción - 36 - crecimiento dentro de la legislación ambiental. Desde 1970, en la gran mayoría de los países industrializados se ha venido dando una gran importancia al tratamiento de emplazamientos contaminados y se ha comprobado que los tratamientos biológicos son más económicos que los procedimientos químicos o físicos (Eweis y col. , 1998). El campo de actuación para la biorremediación es bastante amplio. Por ejemplo, de las setecientas cincuenta mil instalaciones de depósitos subterráneos de almacenamiento existentes en Estados Unidos, más de trescientas mil han tenido fugas y se producen aproximadamente treinta mil nuevas emisiones cada año. Más de la mitad de estas instalaciones se destinan al almacenamiento de hidrocarburos derivados del petróleo, contaminantes que se han comprobado que son biodegradados con relativa facilidad (Nikolaou y col. , 2009). Actualmente no se conoce con exactitud el número de emplazamientos tratados mediante biorrecuperación. Se sabe que en California los depósitos de almacenamiento subterráneo con fugas constituyen la mayor fuente de terrenos y aguas subterráneas contaminados. Hasta el 1 de enero de 1991, se ha ubicado más de diecisiete mil de estos depósitos (Wosika, 1991). La gran mayoría de los emplazamientos de los depósitos de almacenamiento subterráneo con fugas eran de productos derivados del petróleo. La contaminación del suelo en Europa afecta a casi doscientos cincuenta mil espacios, y se espera que continúe creciendo. Se estiman actividades potencialmente contaminantes en cerca de 3 millones de emplazamientos en toda la Unión Europea (UE), muchos de los cuales es preciso seguir investigando para establecer el daño y si se requiere la recuperación del suelo (proceso de limpieza). A pesar de los esfuerzos que se han realizado en algunos países, pasarán décadas para limpiar el legado de la contaminación del suelo. Durante los últimos 30 años, aproximadamente ochenta mil CAPÍTULO I: Introducción - 37 - emplazamientos se han tratado en aquellos países que disponen de medidas de recuperación (Figura I.1). 2965 1824 246 81 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Emplazamientos con actividad potencialmente contamiante (estimados) Emplazamientos contaminados potencialmente (identificados) Emplazamientos contaminados (estimados) Emplazamientos recuperados Número de lugares contaminados en el año 2006 (x 1000) Figura I. 1.- Contaminación del suelo en Europa en el año 2006 (European Environment Agency, 2006). La Agencia Europea de Medio Ambiente (EEA, siglas en inglés de European Environment Agency) proporcionó datos del 2006 afirmando que los contaminantes más frecuentes encontrados en el suelo son los metales pesados y aceites minerales que son obtenidos en el proceso de refinación del petróleo, siendo estos últimos junto a los hidrocarburos clorados los más frecuentes en aguas subterráneas. Otros contaminantes presentes fueron hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), BTEX (que es el acrónimo de benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) y fenoles (Figura I.2). 37% 4% 2% 4% 6% 13% 34% Metales pesados Aceites minerales HAPs BTEX Fenoles Hidrocarburos clorados Otros Figura I. 2.- Contaminantes presentes en Europa en el año 2006 (European Environment Agency, 2006). CAPÍTULO I: Introducción - 38 - La limpieza de emplazamientos contaminados es una actividad costosa. Sin embargo, en los países donde las estimaciones son posibles, el gasto anual sigue siendo relativamente pequeño, con promedio del 2% de los costos estimados necesarios para la gestión global de los espacios contaminados. Aunque la mayoría de los países de Europa tienen una legislación para la gestión de emplazamientos contaminados, donde se aplica que "quien contamina paga", se siguen utilizando grandes sumas de dinero público para financiar las actividades de remediación, con un promedio del 35% del gasto total. Esto se debe principalmente al alcance limitado de la legislación, especialmente en el caso de la remediación de la contaminación histórica, donde muchos de los responsables de la contaminación legalmente ya no existen, no pueden ser identificados o son insolventes. Según NICOLE (las siglas en inglés de Network for Industrially Contaminated Land in Europe) se ha destinado para la recuperación de zonas contaminadas a través de los Fondos Estructurales Europeos, un presupuesto total de dos mil doscientos cincuenta millones de euros para los años 2005 al 2013 (Network for Industrially Contaminated Land in Europe, 2009). Lamentablemente ésta es una tendencia común en toda Europa. La proporción de los fondos públicos utilizados para recuperar emplazamientos contaminados oscila entre el 100% en la República Checa, ex República Yugoslava de Macedonia y en España, siendo un mínimo del 7% en Francia, donde una gran proporción de los fondos proviene del sector privado (Figura I.3). Pero al igual que muchos aspectos de la información del suelo, sólo los datos aproximados sobre el gasto público están disponibles, mientras que la información sobre el gasto privado sigue siendo irregular. CAPÍTULO I: Introducción - 39 - Figura I. 3.- Asignación presupuestal del gasto público y privado para la gestión de de emplazamientos contaminados del año 2006 (European Environment Agency, 2006). Para reducir los gastos en la recuperación de suelos contaminados, se han estado desarrollando y mejorando técnicas de biorremediación. La mayoría de los HAPs, como por ejemplo, naftaleno, fenantreno, fluoranteno, antraceno, pireno, benzo[a]antraceno y benzo[a]pireno han sido descritos como una fuente energética de carbono, o bien son degradados cometabólicamente por diversos grupos de bacterias (Miyata y col. , 2004). La biodegradación es una herramienta significativa para eliminar estos contaminantes del medio ambiente, pero su baja disponibilidad hace que sean necesarios estudios centrados en este factor limitante. I.2. HAPs: DISTRIBUCIÓN Y TOXICIDAD Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son producidos en diversas operaciones industriales a altas temperaturas tales como el refinado de petróleo, producción de coque y conservación de maderas, también pueden ser sintetizados por algunas plantas o por formación natural durante fuegos en bosques o praderas. Son contaminantes comunes en este tipo de industrias (Wilson y Jones, 1993) y en vertederos incontrolados de residuos peligrosos. También CAPÍTULO I: Introducción - 40 - se pueden encontrar en la atmósfera, medios acuáticos, en el suelo, en la biota, en comidas, etc. (Eiroa y col. , 1998). Este grupo de compuestos consisten en dos o más anillos de benceno condensados, dispuestos en diferentes configuraciones, pero siempre con la presencia exclusiva de carbono e hidrógeno. Los HAPs raramente suelen encontrarse de manera individual, sino que normalmente se encuentran en forma de mezclas complejas con otros hidrocarburos, lo cual dificulta aún más su eliminación del suelo (Nikolaou y col. , 2009). Son termodinámicamente estables debido a la energía de resonancia asociada a la deslocalización de los electrones [ en los anillos bencénicos frente a otros compuestos no aromáticos (Mastandrea y col. , 2005). Estos compuestos aromáticos son el mayor constituyente de la creosota (alrededor del 85% es su contenido en PAHs), que es un producto típico utilizado en la preservación de la madera (Eweis y col. , 1998) y cuyo uso y comercialización se prohibió en España al entrar en vigor la nueva normativa europea (Directiva 2001/90/CE, el 30 de junio de 2003). Esta nueva normativa prohibió el uso y comercialización de maderas tratadas con creosota por el daño que este producto puede ocasionar tanto al medio ambiente como a la salud humana. Debido a su baja solubilidad y alta hidrofobicidad, los HAPs tienden a adherirse a la superficie de partículas como las constituidas por la materia orgánica del suelo, haciendo que estos compuestos tengan una importante persistencia en condiciones naturales (Bamforth y Singleton, 2005). La adsorción de los HAPs en el suelo se ve afectada por varios factores, de los cuales, los más importantes son las propiedades del compuesto contaminante (estructura molecular y solubilidad en agua) y las propiedades del terreno (contenido en arcillas y materia orgánica, pH, humedad y temperatura). Organismos oficiales de prestigio científico internacional, incluyendo la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA), aseveran la peligrosidad de estos CAPÍTULO I: Introducción - 41 - compuestos, y recomiendan su control, reducción y a ser posible su eliminación. Existe una lista confeccionada por la EPA en la que figuran los 129 compuestos orgánicos que deben ser monitorizados en los vertidos industriales y municipales, dentro de la cual hay recogidos 16 HAPs, que serían los más peligrosos para la salud. Además, son considerados por la EPA, la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Comunidad Económica Europea (CEE), como contaminantes prioritarios debido a sus efectos carcinogénicos. El benzo(a)pireno está incluido como uno de los 12 compuestos diana en una estrategia de la EPA para controlar la persistencia y bioacumulación de contaminantes tóxicos (Renner, 1999). En la Tabla I. 1 aparecen las propiedades físicoquímicas y estructurales de 16 HAPs prioritarios, donde se observa la disminución de la volatilidad y la solubilidad en agua a medida que aumenta el peso molecular (Wilson y Jones, 1993). El aumento del número de anillos hace que estos compuestos orgánicos sean menos solubles en agua y se incremente su resistencia a la degradación biológica. El coeficiente de reparto octanol-agua (K ow ) es una forma de medir la hidrofobicidad de los compuestos químicos orgánicos. Los HAPs tienen un coeficiente relativamente alto, lo cual indica que tienen una afinidad mayor por las partículas orgánicas del suelo que por el agua. El coeficiente de reparto sólido-agua (K oc ) es un factor a tener en cuenta para saber la tendencia de estos compuestos a ser relativamente inmóviles y persistentes en el suelo. En general, los HAPs de bajo peso molecular (como el naftaleno) son más volátiles, solubles en agua y menos lipofílicos que los compuestos de alto peso molecular. Estas características físicas y químicas determinan en gran medida su comportamiento en el ambiente. Los HAPs de bajo peso molecular al ser más volátiles, se encuentran principalmente en la fase de vapor en el aire, donde son susceptibles a la descomposición (fotoquímica y térmica), lo que restringe sus tiempos de residencia en la atmósfera a un par de días. Los que no son degradados, son transferidos a aguas superficiales o a suelos por deposición CAPÍTULO I: Introducción - 48 - - Para los seres humanos, La Agencia de Sustancias Tóxicas y Registro de Enfermedades de Estados Unidos (ATSDR por sus siglas en inglés) explica que podemos exponernos a los HAPs respirando aire contaminado si se trabaja en fábricas que producen coque, alquitrán y asfalto, plantas donde se fabrican productos ahumados y en instalaciones donde quemen residuos municipales. También respirando aire del humo de cigarrillos, humo de madera, emisiones del tubo de escape de automóviles, caminos de asfalto, o humo de la combustión de productos agrícolas, a través del contacto con aire, agua o tierra cerca de sitios de residuos peligrosos; comiendo carnes preparadas en la parrilla, cereales, harina, pan, hortalizas, frutas, alimentos en escabeche o tomando leche de vaca o agua contaminadas. Las madres que lactan y que viven cerca de sitios con residuos peligrosos pueden transmitir los HAPs a los niños a través de la leche (ATSDR, 1995). El naftaleno, miembro del grupo de HAPs prioritarios, es un contaminante común en el agua potable. El envenenamiento agudo con naftaleno en humanos puede dar como resultado anemia hemolítica y nefrotoxicidad. Adicionalmente, se han observado cambios dermatológicos y oftalmológicos en trabajadores expuestos a naftaleno en el ambiente ocupacional. El fenantreno es conocido por ser un fotosensibilizador de la piel humana, un alérgeno moderado y mutagénico para sistemas bacterianos en condiciones específicas (Mastrangelo y col. , 1996). Hay poca información disponible para otros HAPs como el acenafteno, fluoranteno y fluoreno, respecto a su toxicidad en mamíferos. Sin embargo, la toxicidad del benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, dibenzo(a,h)- antraceno e indeno (1,2,3-cd)pireno ha sido muy estudiada y existe suficiente evidencia experimental para demostrar que son carcinogénicos (Mastrangelo y col. , 1996). CAPÍTULO I: Introducción - 49 - I.3. BIORREMEDIACIÓN: CONCEPTO, TIPOS Y FACTORES LIMITANTES La biorremediación es una tecnología que utiliza el potencial metabólico de microorganismos degradadores (fundamentalmente bacterias, pero también hongos y levaduras) para transformar contaminantes orgánicos en compuestos más simples, poco o nada contaminantes, como dióxido de carbono, agua y biomasa celular. Esta tecnología puede realizarse en condiciones aerobias y anaerobias y se puede emplear para limpiar terrenos o aguas contaminadas. En condiciones aerobias, los microorganismos degradadores disponen de oxígeno atmosférico como aceptor de electrones, mientras que, en condiciones anaerobias, la actividad biológica está respaldada por la presencia de otros aceptores de electrones. A veces durante el proceso aerobio o anaerobio, los productos intermedios que se forman son menos, igual o mas tóxicos que el contaminante original de partida. Entre las posibles técnicas de tratamiento aplicables para la descontaminación de un determinado espacio natural, merecen especial atención los procesos de degradación biológica ya que son útiles para muchos tipos de residuos orgánicos. Son procesos naturales que no suponen un impacto adicional significativo sobre los ecosistemas y que se pueden realizar a un bajo coste. En muchos casos, pueden llevarse a cabo en el sitio donde se ha producido la contaminación, con lo cual se elimina la necesidad de transportar materiales peligrosos. El resultado final de un tratamiento de biorremediación depende en gran medida de la toxicidad y la concentración inicial de los contaminantes, su biodegradabilidad, las propiedades del suelo contaminado y el sistema de tratamiento seleccionado. Entre los contaminantes tratados habitualmente por estos métodos se encuentran los compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles no halogenados CAPÍTULO I: Introducción - 50 - y los derivados del petróleo cuyos componentes prioritarios son los HAPs. Cuando la contaminación se debe a altas concentraciones de metales, compuestos orgánicos con alta proporción de cloro o sales inorgánicas, la eficacia del tratamiento se reduce debido a la toxicidad de estos compuestos para los microorganismos. Como es evidente, el proceso biológico para tratar los compuestos tóxicos debe competir con los métodos existentes en términos de economía y eficiencia. Los procesos biológicos tienen las ventajas de requerir inversiones de capital moderadas, bajo consumo de energía, ser ambientalmente seguros y no generar residuos. En los últimos años, se han creado una serie de empresas para desarrollar y comercializar tecnologías de biodegradación. La existencia de estas compañías se justifica desde el punto de vista económico por el aumento del coste de los tratamientos tradicionales y del rechazo social a los mismos, así como por el endurecimiento de la normativa en materia de residuos y medio ambiente. El desarrollo futuro de las técnicas de recuperación biológica de espacios contaminados, requiere la adecuada integración de microbiología molecular e ingeniería de sistemas. El tratamiento de recuperación biológica fue ya ensayado a gran escala, con motivo de la contaminación por petróleo ocasionada por el vertido al mar del buque petrolero Exxon Valdez en Alaska (Gallego y col. , 2006). Muchos microorganismos pueden producir tensioactivos, que pueden emulsionar los aceites en el agua y facilitar su eliminación. A diferencia de los tensioactivos químicos, los de origen microbiológico son inocuos y biodegradables. También se han utilizado, en ocasiones, fertilizantes para incrementar la tasa de crecimiento de las poblaciones autóctonas capaces de degradar compuestos derivados del petróleo, por ejemplo en el desastre ocasionado por el petrolero Exxon Valdez en Alaska, donde se aplicaron fertilizantes oleofílicos como el INIPOL o el S-200, utilizado en esta tesis, y del que se hablará más detenidamente en el apartado I.7.1. CAPÍTULO I: Introducción - 51 - El uso de microorganismos no está restringido únicamente al tratamiento de compuestos orgánicos. En algunos casos, los organismos seleccionados pueden también reducir los cationes tóxicos de los metales pesados (como el selenio), a la forma elemental menos soluble y menos tóxica. Por lo tanto, el tratamiento biológico puede también aplicarse a las aguas superficiales contaminadas por metales pesados. Para realizar la recuperación de un espacio contaminado, podemos realizar diferentes estrategias (Conde, 2000) que, en general, se pueden agrupar en tres categorías: confinamiento, limpieza y estrategia de respuesta. El confinamiento tiene como finalidad el aislamiento de la fuente contaminante, evitando la salida de líquidos (lixiviados), polvo o gases; es decir controlando la dispersión de la contaminación. Es el tratamiento que se aplica habitualmente en el caso de contaminaciones provocadas por los vertederos incontrolados de residuos industriales. Las medidas que incluye generalmente este tipo de actuación son: recubrimiento, revegetación, control de aguas de escorrentía superficial y control de lixiviados y aguas subterráneas. La limpieza incluye la aplicación de una o varias tecnologías para eliminar los contaminantes del suelo. Se distinguen tres tipos de tratamiento: 1) tratamiento in situ del suelo contaminado, 2) excavación del emplazamiento contaminado, retirada del suelo afectado y tratamiento ex situ del mismo y por último, 3) excavación, retirada y depósito en vertedero controlado. En el primer caso, la contaminación se trata en el lugar en el que se ha producido y en el segundo caso hay que proceder a una excavación del suelo contaminado o a un bombeo del agua contaminada antes de proceder a su tratamiento. En general, el tratamiento in situ es menos costoso y permite que se utilice el espacio durante el mismo, por lo que se aplica cada vez con más frecuencia a pesar de que habitualmente requiere largos períodos de tiempo (Roote y col. , 1997). CAPÍTULO I: Introducción - 52 - La estrategia de respuesta es un tratamiento a largo plazo que incluye actuaciones diversas y modificables en función de una primera evaluación de la situación y de la evolución de la misma durante el tratamiento. Se suele elegir cuando las aguas subterráneas ya se han contaminado. Las aguas contaminadas pueden tratarse mediante: a) extracción por bombeo seguida de tratamiento en el propio emplazamiento, por técnicas convencionales aplicables a aguas residuales industriales, b) tratamiento in situ mediante muros de tratamiento y c) dilución o desvío de la contaminación, mediante inyección de agua limpia utilizando sistemas de pozos. Los métodos existentes para tratar los suelos contaminados pueden ser de naturaleza física, química o biológica y tanto unos como otros pueden aplicarse en el lugar de la contaminación o como tratamiento ex situ, ver tabla I. 4. Tabla I. 4.- Clasificación de las diferentes técnicas empleadas para tratar los suelos contaminados, agrupadas según su naturaleza y forma de aplicación. Tratamientos in situ Tratamientos ex situ – Fisicoquímicos: a) Extracción con vapor b) Lavado c) Solidificación y estabilización d) Separación electrocinética – Biológicos: a) Biorremediación b) Fitorremediación – Térmicos: a) Desorción térmica b) Incineración – Fisicoquímicos: a) Extracción con disolventes b) Lavado c) Oxido-reducción d) Deshalogenación química e) Solidificación y estabilización – Biológicos: a) Laboreo agrícola b) Biopilas c) Biodegradación en reactor El objetivo de las técnicas de biorrecuperación es la creación de las condiciones ambientales óptimas para que los microorganismos se puedan desarrollar adecuadamente y CAPÍTULO I: Introducción - 53 - provocar la máxima descontaminación.La tecnología específica empleada en cada caso depende del tipo de microorganismos de que se trate, de las condiciones del espacio contaminado y de la naturaleza y cantidad de contaminante o contaminantes. Distintos microorganismos degradan diferentes tipos de compuestos y sobreviven en diferentes condiciones. Debemos recalcar que el tratamiento in situ no requiere excavar y retirar el suelo contaminado, por lo cual provoca una menor liberación de polvo y contaminantes, permitiendo descontaminar un volumen mayor de suelo por tratamiento que las técnicas ex situ. En este caso, el propio suelo funciona como un reactor biológico. Tiene otros inconvenientes como mayor lentitud, dificultad de mantener las condiciones y dependencia del tipo de suelos, que deben ser permeables si se quiere asegurar un buen rendimiento del proceso. Para paliar los inconvenientes referidos a la lentitud del tratamiento in situ se han desarrollado técnicas como bioestimulación o bioaumento, las cuales se definirán a continuación pero antes se debe definir qué es la atenuación natural o biorremediación intrínseca: • La atenuación natural o biorremediación intrínseca se lleva a cabo por microorganismos autóctonos, principalmente bacterias del medio afectado que utilizan los nutrientes y aceptores de electrones del medio, que crecen mineralizando y cometabolizando los contaminantes hasta su desaparición. Tiene una ventaja evidente que es su bajo coste pero necesita una evaluación previa del riesgo. La biorremediación intrínseca puede requerir que la fuente de contaminación sea, en primer lugar, extraída para prevenir una entrada adicional y que se extienda por los alrededores o que exista algún sistema que prevenga la migración de una pluma de contaminación en un acuífero. Se necesita un programa de monitorización a largo plazo para confirmar que la biodegradación se está realizando correctamente y que no se está produciendo el desplazamiento de los contaminantes. Este programa CAPÍTULO I: Introducción - 54 - puede conllevar medidas de contaminantes para demostrar la actividad microbiana, para mostrar que los niveles de O 2 o nitratos disueltos son menores que la concentración inicial de fondo o que los productos de biorremediación están apareciendo. • Bioaumento. Consiste en introducir microorganismos no autóctonos en el medio a descontaminar con el fin de mejorar la biodegradación. No obstante, estudios recientes han demostrado que la adición de una mezcla comercial de microorganismos degradadores de contaminantes o cultivos enriquecidos por microorganismos autóctonos no aumenta necesariamente la tasa de biodegradación en el medio natural por encima de la lograda mediante la adición de nutrientes (bioestimulación). Los microorganismos no autóctonos parecen no ser capaces de competir con la microflora natural ya que las condiciones ambientales son distintas y dificultan su adaptación al medio donde los microorganismos indígenas están perfectamente aclimatados (Lee y Merlin, 1999). Existen en el mercado productos comerciales, ensayados en el laboratorio que reúnen microorganismos con gran potencial biodegradador, pero la reintroducción de microorganismos autóctonos, aislados del sistema contaminado y cultivados posteriormente, es más efectiva, especialmente cuando se acompaña de un suplemento nutricional y oxígeno. • La bioestimulación radica en la introducción de modificaciones en el medio, mediante el aporte de nutrientes, aireación y otros procesos. En ocasiones será suficiente añadir oxígeno mediante aireación, aunque en otros casos se podría requerir la adición de nutrientes o ajustes de pH. En todo caso estas aproximaciones son válidas siempre y cuando los microorganismos autóctonos sean capaces de degradar el contaminante tras un proceso más o menos largo de aclimatación previa (Nikolopoulou y Kalogerakis, 2008). CAPÍTULO I: Introducción - 55 - En lo que se refiere a la adición de nutrientes, la biorremediación requiere que éstos entren en contacto con el área contaminada y que su concentración sea suficiente para soportar el crecimiento máximo previsto de la población degradadora en el transcurso de las operaciones de remediación. Estudios experimentales han demostrado que el uso de fertilizantes de liberación lenta de nitrógeno y fósforo ofrece una sólida alternativa para combatir los derrames de petróleo en el medio ambiente y definir la relación óptima de biorremediación de carbono, nitrógeno y fósforo, 100:10:1 (Leys y col., 2005). En cuanto a los factores que afectan a la biorremediación de los HAPs, se conoce que existen muchos ejemplos que consiguen el éxito en la aplicación de tecnologías de biorremediación para descontaminar sitios usando métodos como el compostaje o biopilas. Muchos estudios publicados han investigado la eficacia de la biorremediación a pequeña escala y bajo condiciones ideales en el laboratorio tales como a pH neutro y temperaturas mesofílicas (entre 25ºC y 45ºC). No obstante, está claro que los factores ambientales que varían de un sitio a otro, tales como el pH del suelo, la disponibilidad de los nutrientes y de los contaminantes, pueden afectar los procesos de biorremediación, inhibiendo el crecimiento de los microorganismos degradadores. Los principales factores que intervienen en la viabilidad de la biorremediación son: Temperatura: Tiene un considerable efecto sobre la capacidad de los microorganismos para degradar los HAPs in situ. En general, la mayoría de los lugares contaminados no tienen una temperatura óptima durante todo el año. La solubilidad de los HAPs aumenta con la temperatura, así como la biodisponibilidad de las moléculas de HAPs. Además, la solubilidad del oxígeno disminuye con el aumento de la temperatura, lo que reduce la actividad metabólica de los microorganismos aerobios (Bamforth y Singleton, 2005). CAPÍTULO I: Introducción - 56 - La biodegradación de HAPs puede ocurrir en un amplio rango de temperaturas. En la mayoría de los estudios hay una tendencia a centrarse en temperaturas mesofílicas (entre 25 y 35ºC) porque la mayoría de los microorganismos del suelo presentan su actividad óptima en este intervalo de temperatura. pH: Se ha demostrado que el proceso de mineralización de los hidrocarburos es más rápido a valores de pH comprendidos entre 6.5 y 8.0. El ajuste del pH en suelos ácidos y alcalinos dentro de este rango hace que aumente la tasa de degradación por los microorganismos (Morgan y Watkinson, 1989b). El pH influye además en la solubilidad de fósforo, que es uno de los nutrientes de especial importancia para el desarrollo microbiológico, y también afecta en la solubilización y transporte de metales pesados en el suelo. Humedad: Cuando el contenido de agua en suelo se encuentra entre un 50% y 80% de la capacidad de campo, la actividad microbiológica es generalmente óptima. Los poros existentes en el suelo húmedo tienen poco o ningún espacio para los gases, generándose condiciones anaerobias. Los hidrocarburos derivados del petróleo tienden a distribuirse en la fase sólida del suelo, por lo que en la fase acuosa habrá unas concentraciones de contaminantes muy bajas. Debido a que los microorganismos toman nutrientes de la fase líquida, la tasa de biorremediación puede verse limitada por la velocidad con que se produce la desorción, por lo que el agua debe de estar en contacto con los contaminantes y en cantidades que permitan el desarrollo de las comunidades microbianas (Morgan y Watkinson, 1989a). Los valores de humedad óptima para la biorremediación de terrenos no saturados están comprendidos entre 150 y 250 gramos de agua/kg de terreno seco. En la biorremediación de acuíferos contaminados, el mayor problema se debe al suministro de oxígeno a causa de su baja solubilidad en el agua (7.5 y 9 mg·L -1 en aguas subterráneas). CAPÍTULO I: Introducción - 57 - El oxígeno es, en general, el aceptor de electrones más empleado en la respiración microbiana. Para los terrenos no saturados, el suministro de oxígeno no constituye un problema pero su baja solubilidad en agua y la heterogeneidad de los acuíferos hacen que el transporte del oxígeno a través de las zonas contaminadas sea muy difícil. Existen otros aceptores de electrones más fáciles de suministrar como son nitratos, nitritos, sulfatos, Fe(III) y CO 2 . Nutrientes: Además de degradar fácilmente las fuentes de carbono, los microorganismos requieren nutrientes tales como nitrógeno, fósforo y potasio para su metabolismo celular y su crecimiento. En las zonas contaminadas donde los niveles de carbono orgánico son altos debido a la naturaleza del contaminante, la disponibilidad de los nutrientes puede llegar a agotarse rápidamente durante el metabolismo microbiológico. Para evitar este agotamiento, se puede añadir un suplemento de nutrientes para estimular la comunidad bacteriana y aumentar la biorremediación in situ. Se utiliza generalmente una relación molar C:N:P de 100:10:1 para la biorremediación de suelos (Gallego y col. , 2006). Concentración de los contaminantes: Se conoce que los HAPs tienen una gran afinidad por la fase sólida del suelo tanto a arcillas como a la materia orgánica, dando como resultado una baja concentración de estos compuestos en la fase acuosa del suelo. De esta manera se puede considerar un factor limitante ya que al ser tan baja esta concentración de contaminantes en la fase acuosa, no podrá soportar el crecimiento y desarrollo de una población microbiana capaz de metabolizarlo. Mientras que si nos encontramos en una situación con altas concentraciones de contaminante en la fase acuosa del suelo puede que no se produzca biodegradación por parte de los microorganismos debido a que esta alta concentración les provoque un efecto de toxicidad. CAPÍTULO I: Introducción - 64 - débil/reversiblemente). Cuando los microorganismos captan la concentración de COH libremente disuelta, esta concentración disminuye e inmediatamente es repuesta por la fracción de COH que estaba sorbida débil y reversiblemente. De esta manera, la fracción rápidamente desorbida puede representar mejor esa cantidad que es accesible a un organismo en una escala de tiempo relevante, mientras que la fracción de COH que está fuertemente sorbida al suelo o sedimento generalmente no se considera bioaccesible. • Actividad química. Es el potencial que posee un compuesto para experimentar procesos espontáneos tales como difusión y reparto. Está relacionada con la fuerza de sorción de los COHs. Una fuerte sorción implica una disminución de la actividad química y por tanto una disminución en la biodisponibilidad de los COHs. En matrices ambientales, los COHs se mueven desde áreas de alta actividad química hacia áreas de baja actividad, hasta alcanzar el equilibrio. En el equilibrio la actividad química es la misma en cada compartimento de una matriz (por ejemplo, en partículas sólidas, materia orgánica disuelta, fase acuosa, biota, etc) (Ditoro y col. , 1991). De esta manera, las concentraciones de COH en el equilibrio para cada compartimento, incluyendo la biota, son proporcionales entre sí. Si la relación entre las fases se conoce, la fracción de COH en una fase se puede utilizar junto a un apropiado factor de corrección (como K oc ) para estimar la fracción en la otra fase. Esto es la base de la Teoría de reparto en el equilibrio que fue propuesta originalmente como método de medir la biodisponibilidad por Shea (1988), Ditoro y col., (1991). En definitiva, la biodisponibilidad depende de varios factores, donde se incluyen las propiedades del suelo o los sedimentos (como por ejemplo, el contenido de carbono orgánico, el contenido de carbono negro conocido como “black carbon”, su composición física y química, etc), las propiedades CAPÍTULO I: Introducción - 65 - del contaminante (como por ejemplo su solubilidad en agua, K oc , la forma de su molécula, etc), el tiempo de contacto entre el contaminante y el suelo o sedimento y la ruta de captura dentro del organismo. I.6. MÉTODOS DE REPARTO DE HAPs EMPLEANDO POLIDIMETILSILOXANO Debido a su naturaleza hidrofóbica, el reparto de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) se realiza con facilidad en fases orgánicas sólidas ó líquidas, existiendo en la fase acuosa sólo a concentraciones limitadas. Esto hace que la degradación de HAPs por las células bacterianas sea difícil. En cultivos de bacterias degradadoras donde sólo utilizan los compuestos disueltos en medios acuosos, la transferencia de masa o la velocidad de desorción controlan las tasas de crecimiento y degradación (Alexander, 1999). El uso combinado de la biorremediación con otras tecnologías de remediación de suelos, como el uso de electrorremediación (Niqui-Arroyo y col. , 2006; Niqui-Arroyo y Ortega-Calvo, 2007; Niqui-Arroyo y Ortega-Calvo, 2010), la aplicación de biosurfactantes (Garcia-Junco y col. , 2001; Garcia-Junco y col. , 2003) o la adición de bioestimulantes para suelos contaminados con HAPs (Gallego y col. , 2007; TejedaAgredano y col. , 2011), pueden ayudar a superar esta limitación, lo que aumenta la eficacia de la biorremediación como una opción de tratamiento. El destino y transporte de los contaminantes orgánicos hidrofóbicos pueden ser influidos notablemente por los procesos de sorción. La cuestión de si la sorción inhibe la biodisponibilidad de los contaminantes orgánicos es de gran importancia para el éxito de la biorremediación tanto de suelos como de acuíferos. Las concentraciones biodisponibles de COHs en medios acuosos, a menudo decrecen como resultado de procesos de (bio)sorción, volatilización o degradación. Para mantener constante la exposición de niveles de estos contaminantes en CAPÍTULO I: Introducción - 66 - medios acuosos se introdujo el reparto administrado conocido como “partitioning driven administering” (PDA, Figura I.6), cuyo principio consiste en controlar las concentraciones disueltas de estos contaminantes mediante reparto desde una fase sólida dominante (Mayer y col. , 1999). Figura I. 6.- Esquema de un sistema con varias fases. El PDA controla las concentraciones disueltas de los HAPs contra una serie de procesos de reducción degradativos (líneas discontinuas) y no degradativos (líneas continuas) mediante reparto desde una fase sólida dominante (Variante del esquema de Mayer y col., 1999). Basados en este principio se desarrollaron nuevos métodos para determinar la transferencia de masa por difusión mediante microcámaras y medir de la capacidad de solubilización de medios acuosos (dopaje pasivo) utilizando polidimetilsiloxano como fase sólida dominante en ambos métodos: a) Estudio de la transferencia de masa de contaminantes mediante difusión. Debido a las propiedades hidrófobas de los HAPs, las concentraciones de estos contaminantes se encuentran generalmente a menores órdenes de magnitud en el medio acuoso que en partículas del suelo, de sedimentos o en organismos acuáticos. Esto tiene CAPÍTULO I: Introducción - 67 - importantes implicaciones para su intercambio por difusión entre distintos compartimentos ambientales, donde una fina película acuosa puede actuar como una barrera eficaz para la transferencia de masa por difusión (Mayer y col. , 2005) (Figura I.7). Figura I. 7.- Esquema representativo de la formación de la capa de difusión limitante (UBL) entre la fuente de contaminación y los microorganismos en un medio acuoso. El transporte de los contaminantes se produciría desde la fuente de contaminación hacia los microorganismos a través de la capa de difusión limitante (Mayer y col. , 2005). La difusión molecular de estos contaminantes a través de estas capas limitantes conocidas como Unstirred boundary layers (UBL)" a menudo constituye el paso limitante de su desorción desde matrices del suelo y de sedimentos, así como para su captación por los organismos (Johnsen y Karlson, 2004). La primera ley de Fick de la difusión es directamente aplicable para describir una transferencia de masa mediante difusión a través de UBLs homogéneos. También puede aplicarse en modelos que describen transporte por difusión a través de medios heterogéneos y el intercambio mediante difusión en las interfases. Sin embargo, estos modelos generalmente se basan en supuestos (como por ejemplo, que el transporte se limita por la difusión de moléculas disueltas libremente) que pueden ser bastante difíciles de confirmar por tratar con productos químicos orgánicos hidrofóbicos (Wells y col., 2004). Esto hace que la determinación directa de la CAPÍTULO I: Introducción - 68 - transferencia de masa por difusión a través de una UBL tenga tanta importancia. Para medir la velocidad de difusión de los contaminantes en un medio, se utilizaron unas microcámaras que consistían en dos discos de polidimetilsiloxano (PDMS), uno de ellos limpio y el otro donde se fija el contaminante hidrófobo en estudio (HAPs). La transferencia de masa del disco contaminado (que sería la fuente de contaminación en la Figura I.7) al disco limpio (que sería la bacteria) se realiza a una distancia de 100 µm de cada uno. El medio que se coloca entre ambos discos, es el factor variable de este diseño experimental ya que dependiendo de las características del medio se obtendrá una mayor o menor difusión de los contaminantes. El fundamento básico de este sistema experimental consiste en ver la transferencia de las moléculas HAPs desde el disco contaminado al disco limpio que requiere 3 pasos (Figura I.8): 1.- Reparto de las moléculas de HAPs en la interfase entre el disco contaminado y el medio, el cual está gobernado por el coeficiente de reparto K PDMS,Medio . MedioPDMS Cont Medio K C C , = 2.- Difusión de las moléculas de HAPs (difusión linear) a través del medio, que es función del gradiente de concentración (∆C/ ∆x) y del coeficiente de difusión (D). x CD flujoDifusión ∆ ∆ × −=, 3.- El reparto de las moléculas de HAPs en la interfase entre el medio y el disco limpio está gobernado por K PDMS,Medio . La transferencia de masa por difusión del disco contaminado al disco limpio se controla midiendo el contenido de los HAPs que quedan en el disco contaminado y los que han pasado al disco limpio por unidad de tiempo. La constante de velocidad K (s -1 ) se ajusta a los datos medidos. MedioPDMS Lim Medio K C C , = . CAPÍTULO I: Introducción - 69 - Figura I. 8.- Esquema de los 3 pasos en el proceso de difusión de los PAHs en las microcámaras desde el disco contaminado al disco sin HAPs (Mayer y col. , 2005). La fracción de HAPs presente en el medio es despreciable: V PDMS > V Medio y K PDMS,Medio >>1. Los HAPs están homogéneamente distribuidos en el disco de PDMS debido a la permeabilidad especialmente alta de este polímero. Como consecuencia, los dos discos imponen un gradiente lineal de actividad química (o fugacidad) en la UBL, estas capas limitantes de la difusión (UBLs) actúan a menudo como un cuello de botella para el transporte por difusión de compuestos orgánicos hidrofóbicos (COHs), constituyendo a menudo un paso limitante tanto para su captación desde el suelo o matrices de sedimentos, como para su captación por los organismos. La transferencia de masa por difusión de COHs a través de UBLs se puede aumentar por la presencia de medios que normalmente son considerados para reducir la captación difusa. Bajo el supuesto de que toda la fuga de masa química del disco contaminado se recupera en el disco limpio y que la masa presente entre la fina capa es insignificante, el balance de masa del sistema puede ser descrito por: CAPÍTULO I: Introducción - 70 - LimCont Cont amam dt dm +−= (1) Donde m Cont y m Lim son la masa (kg) en el disco contaminado y limpio respectivamente y a es la constante de la tasa de velocidad (s -1 ). Usando el supuesto de que un balance de masa cerrado produce una condición de simetría m Lim =m 0 –m Cont , donde m Cont y m Lim son la masa del disco contaminado y limpio respectivamente, al tiempo t y m 0 es la masa inicial (en el disco contaminado). De esta manera, la solución analítica de la ecuación 1, nos da: ( ) ( ) ( ) at LimLim e C tC m tm 2 00 1%50 − −⋅== (2) En analogía a la primera Ley de difusión de Fick, se puede expresar la ecuación 2 como: C x DK V A dt dC libre ∆ ∆ × =·· (3) Donde LimCont CCC −=∆ , A es el área superficial efectiva (m 2 ), V es el volumen del disco (m 3 ), ∆ x es el espesor de la capa (m), K es el coeficiente de reparto entre la solución en la capa de difusión y el polímero MedioPDMS PDMSMedio K K , , 1 = y D es el coeficiente de difusión (m 2 ·s -1 ). La tasa de velocidad constante a (s -1 ) de antes puede ser identificada como: MedioPDMS K D xV A a , · ∆× = (4) La constante de tasa de velocidad a describe la cinética del sistema y es proporcional al flujo de difusión. También está linealmente relacionada con otros parámetros de difusión establecidos: [1] el producto ,DK × también para conocer la permeabilidad (P) o conductividad g (m·s -1 ), y [2] el coeficiente de transferencia de transporte por difusión en los modelos de fugacidad (por ejemplo, en el mol·año -1 ·Pa -1 ). Esto está en CAPÍTULO I: Introducción - 71 - contraste con las cámaras de difusión clásica, que tienen por objeto la determinación del coeficiente de difusión (D). Los volúmenes de los dos discos, V Contaminado y V Limpio , se mantienen constante, así como la superficie para el intercambio A y el espesor de la película ∆x. Cualquier diferencia en la constante de la tasa de velocidad a en los dos medios i y j se atribuyen únicamente al producto :DK × j i ij j i D D K a a×= (5) Donde K ij es el coeficiente de reparto entre el medio i y el medio j, D es el coeficiente de difusión para el medio i y para el medio j y a i /a j es la relación entre velocidades que describe una conductividad relativa para la transferencia de masa por difusión. Por ejemplo, el flujo desconocido de HAPs a través del medio i puede expresarse como el flujo de estos HAPs a través del medio j, multiplicado por la relación entre las constantes de velocidad medidas a i /a j . b) Estudio de la capacidad de solubilización de contaminantes en un medio determinado mediante dopaje pasivo. La silicona formada por polidimetilsiloxano (PDMS) ha sido ampliamente utilizada como un material común de recubrimiento para la microextracción en fase sólida (SPME). Esta técnica ha sido empleada para medir concentraciones de analitos disueltos libremente y para estudios de especiación, como por ejemplo: para medir proteínas unidas a tóxicos y a drogas (Vaes y col. , 1996; Musteata y col. , 2006), ácidos húmicos unidos a contaminantes medio ambientales (Poerschmann y col. , 1997; Lutzhoft y col. , 2000) y complejos de inclusión entre compuestos aromáticos y β-ciclodextrinas (Chalumot y col. , 2009). SPME fue introducida por Arthur and Pawliszyn en 1990 (Reichenberg y col. , 2008) y su formato resulta muy atractivo para los dispositivos de muestreo en el equilibrio (o también conocidos como Equilibrium Sampling Device, ESD) porque la fase de muestreo es un volumen pequeño (µL) del CAPÍTULO I: Introducción - 72 - polímero con un área superficial relativamente grande. La micro-extracción se genera por difusión molecular a través de la superficie, la cual está impulsada por la actividad química del analito en la muestra y, de esta manera, la concentración resulta medible en el polímero. SPME es un método poderoso y eficaz pero que no se encuentra exento de problemas y limitaciones como la dificultad de llegar al equilibrio en un período de tiempo práctico, que el contenido de los HAPs en el polímero no sea menor que el contenido de PAHs de la muestra, la adsorción a la superficie del polímero debe ser insignificante porque la fugacidad y la actividad química sólo son proporcionales a la absorción (disolución) de concentración dentro del polímero o asumir que se cumple el balance de masas sin que exista pérdidas tanto en la fijación como en la extracción de los analitos en el polímero. Por esta causa, se ha desarrollado un nuevo método analítico conocido como dopaje pasivo (passive dosing) donde se produce la liberación de los analitos desde un polímero (Figura I.9) en lugar de hacer un muestreo continuo por difusión como se hace con SPME. Este método se basa en los principios de dopaje pasivo desarrollados para el control de la concentración libre disuelta en ensayos de toxicidad. Figura I. 9.- Fundamento de la técnica de dopaje pasivo: A) Los analitos disueltos en metanol se fijan en la silicona formada por polidimetilsiloxano (PDMS) en menos de una hora, B) equilibrio alcanzado con agua donde se controla la concentración libre disuelta de los analitos y C) equilibrio alcanzado con la muestra donde se mide la concentración total del analito (libre y unida a la materia orgánica disuelta, MOD) (Modificación del esquema de Birch y col, 2010). CAPÍTULO I: Introducción - 73 - El primer paso en este método nuevo es controlar la concentración de analito libre disuelto o actividad química por reparto en el equilibrio desde un polímero cargado con el contaminante previamente en viales totalmente cerrados evitando pérdidas a través de la silicona. El segundo paso es medir la concentración total del analito en la muestra una vez alcanzado el equilibrio, mediante la técnica analítica elegida. La concentración medida en la muestra puede combinarse con el correspondiente reparto en el equilibrio con agua pura con el fin de obtener: • La fracción libre de analito en la muestra ( muestra agua C C FL = ). • El aumento de la capacidad ( agua muestra C C AC = , donde libreagua CC =) que cuantifica la capacidad de disolución de un medio para los HAPs con respecto al agua, siendo el dopaje pasivo una buena herramienta para estudiar la especiación de HAPs en muestras acuosas. • Los valores de las tasas de reparto K DOC y K D ( 1· += CODCOD CKAC , donde K COD es la tasa de reparto para el carbono orgánico disuelto y C COD es la concentración de carbono orgánico disuelto)(Birch y col. , 2010). Con este nuevo método se consigue controlar la concentración libre disuelta de cada componente en mezclas de HAPs, se evitan separaciones de fases, no se necesita asumir hipótesis de balance de masas, se requiere un período corto de equilibrio termodinámico, es un método preciso con una desviación estándar del 3%, se reducen los problemas que se ocasionan con la SPME, se calculan constantes de reparto con regresiones lineales simples, se puede medir el aumento de la capacidad (AC) para cuantificar la capacidad de CAPÍTULO I: Introducción - 80 - azúcares, polisacáridos, aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas, taninos, alcaloides, esteroles, enzimas, factores de crecimiento, tensioactivos, flavonones, nucleótidos, etc. Todos ellos proporcionan una fuente rica de de nutrientes para las poblaciones microbianas en al rizosfera (Pinton y col. , 2007). De hecho, los compuestos derivados de la rizodeposición (liberación de compuestos orgánicos desde la raíz al suelo) tales como exudados, mucílagos y restos de raíz por desprendimiento de tejidos y células muertas, representan entre el 8 y el 86% del carbono neto anual fijado por fotosíntesis (Meng y Zhu, 2011). De estos compuestos se estima que los exudados constituyen entre el 40 y 90% (Lynch y Whipps, 1990; Pinton y col. , 2007), los cuales pueden proporcionar carbono y energía suficientes para mantener un gran número de microorganismos, alrededor de 10 8 -10 9 microorganismos asociados a la rizosfera por gramo de suelo (Erickson y col., 1995). Debido a la presencia de estos exudados, las poblaciones y actividades microbianas son del orden de 5 a 100 veces mayor en la rizosfera que en la mayor parte del suelo. (Anderson y col., 1993; Gunther y col., 1996). Estos consorcios microbianos, a su vez pueden ofrecer a las plantas diversos beneficios como la secreción de quelantes para aumentar la disponibilidad de minerales y su mejor absorción por la raíz, protección contra patógenos para la planta y degradación de los contaminantes antes de que puedan influir negativamente en el vegetal. El éxito de la rizorremediación depende en gran medida de la capacidad de los microorganismos degradadores de los contaminantes presentes en el suelo para descontaminar, así como del crecimiento de las plantas que impulsan a los microorganismos a colonizar eficientemente las raíces. La quimiotaxis hacia compuestos específicos de los exudados de raíz puede ser la clave para la colonización eficiente de las raíces aunque la respuesta quimiotáctica puede ser provocada por diferentes compuestos en función de la especie colonizadora (de Weert y col., 2002; Kuiper y col., 2002). Ortega-Calvo y col., (2003) demostraron que se producía CAPÍTULO I: Introducción - 81 - quimiotaxis hacia naftaleno, fenantreno y exudados de raíz en bacterias de la rizosfera degradadoras de HAPs. Cabe destacar que algunas especies de plantas pueden aumentar el número de degradadores en un gran volumen de suelo que se extiende más allá de la rizosfera (Siciliano y col., 2003; Leigh y col., 2006). Aunque la rizorremediación ocurre de forma natural, también se puede optimizar, mediante la manipulación deliberada de la rizosfera. Esto se puede lograr mediante el uso adecuado del par planta-microorganismo. Estas combinaciones pueden ser plantas y rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR) o plantas y microorganismos degradadores de contaminantes. Por ejemplo, una especie de césped combinada con un microorganismo degradador de naftaleno que protege la semilla del césped de los efectos tóxicos del naftaleno, el crecimiento de las raíces impulsa a las bacterias degradadoras de naftaleno en el suelo, el cual podría haber estado profundamente distribuido en el suelo como para poderlo degradar en ausencia de raíces (Kuiper y col., 2004). Asimismo, las plantas provocan la movilización de los HAPs en el suelo, dando lugar a su acumulación, en una forma más biodisponible, en zonas próximas a las raíces, posiblemente mediante el efecto combinado del flujo de agua a través de las raíces y la pseudosolubilización de los HAPs por compuestos orgánicos derivados de la planta (Liste y Alexander, 2000a; Liste y Alexander, 2000b). Se conoce muy poco sobre la idoneidad de la especie de planta a utilizar en un proceso de fitorremediación de HAPs. Si bien la mayor parte de los estudios se han realizado con especies herbáceas (Aprill y Sims, 1990; Binet y col. , 2000; Miya y Firestone, 2000), posiblemente por su fácil manejo en el laboratorio, especies del género Pinus (P. banksiana, P. resinosa, P. strobus y P. sylvestris) son también capaces de estimular la biodegradación de HAPs en el suelo (Heinonsalo y col. , 2000; Liste y Alexander, 2000b). Claramente, la planta a utilizar debe ser capaz de crecer en presencia de los CAPÍTULO I: Introducción - 82 - contaminantes, y deben tolerar condiciones locales, tales como drenaje limitado o concentraciones altas de sal. Otras propiedades deseables incluyen crecimiento rápido, que sea perenne, y que posea un sistema radicular profundo y denso (Alexander, 1999). Esta última propiedad es relevante en el caso de contaminantes situados a cierta profundidad en el suelo, y añade interés al estudio de especies forestales, donde existe una información muy escasa. Entre las especies estudiadas en la fitorremediación de HAPs, resulta de especial interés, de cara a esta Tesis Doctoral las que, aparte de tener las características anteriores, cumplan los dos criterios siguientes: a) una buena adaptación a las zonas mediterráneas con una contrastada utilidad en fitorremediación de suelos contaminados por HAPs y b) existencia de protocolos de propagación, tanto sexuales como agámicos, eficaces para su germinación y desarrollo en suelos contaminados por HAPs, así como para la propagación clonal posterior. Estas dos condiciones las cumplen, entre otras, Festuca arundinácea Schreb; Lolium perenne, L. y el girasol Helianthus annuus, L. Festuca arundinacea. Schreb. Pertenece a la familia de las Poaceas y se conoce vulgarmente como festuca alta, vive en juncales, riberas de ríos, lagos, arroyos y pastos. Esta planta perenne se ha usado ampliamente en la fitorremediación de HAPs y se ha constatado su éxito en la supresión de varios de estos compuestos (Shann y Boyle, 1994; Cunningham y col., 1996; Banks y col., 1999; Cheema y col., 2009). Parrish y col., (2004) encontraron que entre varias especies fue esta planta la que desarrolló una mayor biomasa tanto en raíces como en parte aérea y la que eliminó un porcentaje mayor de contaminante. Epuri y Sorensen (1997) indicaron el claro efecto de esta especie en la mineralización y extractabilidad de benzo(a)pireno en un suelo contaminado con este HAP. Parrish y col., (2005) cultivaron Festuca arundinacea durante 12 meses en invernadero, en macetas con suelo que contuvieron 15 tipos de HAPs y observaron que las poblaciones microbianas degradoras de CAPÍTULO I: Introducción - 83 - estos compuestos fueron 100 veces mayores en las macetas con estas plantas que en el control (sin planta). Huang y col., (2004) destacaron su capacidad de mantener o, incluso incrementar, el contenido de agua en los tejidos fotosintéticos y aumentaron el desarrollo de las raíces facilitando el transporte de fotoasimilados en condiciones de alto estrés provocado por creosota. Aparte de la conocida capacidad de germinación de las semillas de esta especie, que la hacen muy adecuada para su uso inicial en suelos contaminados, existen protocolos eficaces para su micropropagación. Seko y Nishimura (1996) estudiaron el efecto del CO 2 sobre la supervivencia de regenerantes in vitro en medio de cultivo sin azúcar. Gyulai y col., (1995) incluyeron esta especie en un amplio estudio sobre desarrollo in vitro de Monocotiledóneas de cara a su interacción con microorganismos. Cao y col., (2006) optimizaron las técnicas de cultivo in vitro para regenerar plantas de Festuca arundiacea y Lolium perenne transformadas con Agrobacterium. Lolium perenne, L. conocida vulgarmente como vallico, pertenece también a las Poaceas, es perenne y muy común en praderas y céspedes formando parte importante de los pastos, por lo que es alimento diario del ganado. Johnson y col., (2004) demostraron que un suelo plantado con Lolium perenne y Trifolium repens junto a un inóculo de la bacteria Rhizobium leguminosarum trifolii presentó una concentración menor de HAPs extraíbles que el suelo sin plantar, tras 180 días de experimentación y aumentando (tras este período) la biomasa microbiana en los suelos tratados. Olson y col., (2007) estudiaron la capacidad de uso en fitorremediación de 18 especies, tanto Monocotiledóneas como Dicotiledóneas, y destacaron, entre las primeras, a Lolium perenne y Andropogon gerardii, como las más efectivas y, en ambos casos multiplicaron por dos el descenso de los HAPs testados a los 220 días de experimentación. L. perenne cuenta con sistemas de propagación tanto convencionales por semillas como mediante micropropagación (Creemersmolenaar y col. , 1992), incluso se han obtenido plantas de Lolium perenne mas tolerantes a suelos salinos mediante transgenización con CAPÍTULO I: Introducción - 84 - Agrobacterium tumefaciens (Wu y col. , 2005), al que hay que unir el trabajo ya citado para Festuca de Cao y col., (2006). Helianthus annuus, L. El girasol, perteneciente a la familia Asteracea es ampliamente conocido por la producción de aceite de sus semillas. Es una planta anual, que puede alcanzar los dos metros de altura. Esta especie se ha usado como piloto en experiencias de fitorremedianción de HAPs, y presenta cierta sensibilidad al fluoranteno, en comparación con otras especies como Faba vulgaris (Kummerova y col. , 2001). En experimentos con fluoreno, antraceno, pireno y criseno, el girasol comparado con otras especies, elimina en mayor medida que el resto, los HAPs citados del suelo, sobre todo al final del experimento (Maliszewska-Kordybach y Smreczak, 2000). Estos autores indicaron que entre un grupo de especies ensayadas, el girasol fue el que presentaba mejor respuesta a la germinación de semillas y elongación radical en suelos con los HAPs antes citados. Olson y col., (2007) encontraron que dentro de las Dicotiledóneas, Helianthus annuus es la que mejor responde en presencia un suelo muy contaminado con HAPs frente a otras 11 especies de Dicotiledóneas ensayadas. Respecto a su propagación, por ser una especie ampliamente cultivada, las semillas disponibles en el mercado presentan una máxima capacidad de germinación. Así mismo, la metodología de propagación in vitro está ampliamente desarrollada desde hace años (Trifi y col., 1981; Cavallini y Lupi, 1987; Imhoff y col., 1996). Existen otros trabajos que inciden en el cultivo de protoplastos de esta especie (Wingender y col. , 1996), en el control genético de plantas obtenidas por organogénesis in vitro (Berrios y col. , 1999), en el uso del saco embrionario como material de partida (Popielarska y Przywara, 2003) y en el cultivo de embriones cigóticos (Sujatha y Prabakaran, 2001) o somáticos (Petitprez y col. , 2005). Por otro lado, los biocombustibles se consideran como una de las alternativas ecológicas al petróleo, a fin de reducir, a corto plazo, las emisiones de CO 2 en la atmósfera, contribuyendo así a reducir el efecto invernadero. Entre los biocombustibles, el biodiesel es una fuente de energía renovable, biodegradable y no tóxico. CAPÍTULO I: Introducción - 85 - En Brasil, uno de los países más desarrollados en lo referente a biodiesel, basa la producción de este biocombustible en la utilización del girasol (Tavares y col. , 2011). Por lo que cabría la posibilidad de combinar la capacidad de esta planta para recuperar suelos contaminados con HAPs, y su uso potencial para la obtención de biodiesel, de manera alternativa e independiente de la aplicación habitual en alimentación. Una vez seleccionada la planta más adecuada, según los supuestos anteriores, lo más interesante del estudio por su complejidad, es ver los principales procesos involucrados en rizodegradación de HAPs, los cuales se resumen en la Figura I.11. Figura I. 11.- Rizorremediación de HAP. A) Biodisponibilidad del HAP en NAPL: el contaminante orgánico se encuentra unido a las partículas de suelo o físicamente atrapado en microporos donde no son fácilmente biodisponibles. B) Procesos generales que afectan a la rizorremediación: las raíces de las plantas sustentan el crecimiento microbiano en la superficie de la raíz y en la rizosfera. Las raíces crean canales en el suelo que permiten el movimiento de O 2 y H 2 O, que son lo suficientemente anchos para que los contaminantes tengan una mayor accesibilidad microbiana. C) Degradación aeróbica de HAPs: en la interfase agua/NAPL los microorganismos utilizan métodos de adhesión o surfactantes mejorando la accesibilidad y por tanto aumentando la descontaminación del suelo (Gerhardt y col. , 2009). CAPÍTULO I: Introducción - 86 - Además del aumento de la actividad y de las poblaciones microbianas, se debe tener en cuenta que las raíces adquieren agua del suelo fomentando la translocación de los contaminantes disueltos en la rizosfera (Ferro y col., 1994), que los tensioactivos procedentes de exudados de raíz pueden aumentar la solubilidad de los hidrocarburos aromáticos policíclicos y mejorar así su biodisponibilidad (Song y col., 2004) y que las raíces pueden mejorar la difusión de oxígeno, proporcionando canales de flujo de aire (Child y col., 2007). La disponibilidad de oxígeno es importante, debido a la degradación de los HAPs por ciertas bacterias del suelo, incluyendo a las micobacterias, que realizan las transformaciones a través de dioxigenasas. I.7.3. Materia orgánica disuelta: Ácidos húmicos En el medio acuático, aproximadamente entre un 75 y 99% del carbono orgánico está en forma de partículas o como materia inerte disuelta (el resto está presente en los organismos vivos). Las concentraciones de materia orgánica disuelta (MOD) en aguas naturales se encuentran dentro del rango de 0.5 a 50 mg/L. La MOD está predominantemente compuesta por sustancias húmicas (SH) que constituyen entre el 40-80% del total de MOD (Steinberg y col., 2006). En sedimentos, el carbono orgánico formado por SH puede representar hasta un 20% del total de su peso seco (Akkanen y col., 2005). Las SH son productos naturales formados por diagénesis de la descomposición de la materia orgánica, que incluye degradación y procesos de condensación. Generalmente, las SH se pueden dividir en ácidos húmicos (AH), ácidos fúlvicos (AF) y huminas coloidales o insolubles, que difieren tanto en sus propiedades físico-químicas como biológicas. Debido a la amplia gama de tamaño molecular nominal y grupos funcionales, estos compuestos son generalmente definidos por su solubilidad en soluciones alcalinas o por sus características espectrales. CAPÍTULO I: Introducción - 87 - Pan y col., (2007) encontraron que las afinidades de adsorción de los HAPs variaron entre AH, AF y las fracciones de huminas debido a las diferencias entre ellas, citadas anteriormente. También se demostró que el pireno en el HA fue más disponible que en humina durante la biodegradación (Tang y col., 2008). La distribución de HAPs en diferentes fracciones húmicas podría dar una idea del mecanismo que rige la biodisponibilidad de los HAPs en suelos. Engebretson y Vonwandruszka (1994) describieron la forma que podían tener los ácidos húmicos, que poseían una especie de microestructura micelar similar a la de los tensioactivos (Figura I.12). Figura I. 12.- Estructura de los ácidos húmicos mostrando la contribución de Mg 2+ en la formación de un microambiente hidrofóbico intramolecular. R, es la continuación de unidades estructurales similares. (Esquema modificado de Engebretson y Vonwandruszka, 1994). Esta microestructura acelera la degradación de HAPs mediante el aumento de la solubilidad de estos contaminantes, promoviendo su biodisponibilidad para los microorganismos. A pesar del gran número de artículos que CAPÍTULO I: Introducción - 88 - hablan de la importancia de los AH en la biorremediación de diferentes contaminantes antropogénicos (Haluska y col., 1995; Fu y col., 1999), su papel en la detoxificación de los HAPs por los microorganismos se mantiene incierto. Existen estudios de los efectos de los AH sobre la biodegradación de los HAPs en ambientes geológicos saturados de agua y en medios acuosos que presentan aumento de la degradación (Ortega-Calvo y Saiz-Jimenez, 1998; Haftka y col., 2008; Smith y col., 2009), otros que muestran inhibición y otros que muestran ningún efecto (Laor y col., 1999). Se sabe que la biodegradación de los HAPs depende del flujo de masa total hacia las células degradadoras. Las bacterias degradadoras suelen tomar los HAPs disueltos por difusión desde los alrededores de la fase acuosa hacia las células. Aquí, las concentraciones disueltas determinan la biodisponibilidad, y bajas concentraciones libres disueltas pueden producir una biodegradación lenta. Debido a la baja solubilidad de los HAPs y a su alta hidrofobicidad, estos compuestos son adsorbidos de tal forma que las concentraciones libres disueltas son bajas. Además, si el depósito de concentraciones libres disueltas se agota por biodegradación, por una cinética de desorción limitada, como por ejemplo en microporos de la materia sólida, la reposición es limitante. Algunos de estos HAPs permanecerán inaccesibles y persistentes durante mucho tiempo. Existe un amplio número de artículos que indican que hay otras vías de transporte que puedan proporcionar HAPs adicionales para las células degradadoras. La mayoría de las evidencias provienen de la cinética de degradación en presencia de surfactantes artificiales y naturales. Dependiendo del tipo de tensioactivo y de bacteria, la fracción de HAP en forma de micela puede estar directamente biodisponible para las células bacterianas sin necesidad de ser desorbida pasando a ser una concentración libre disuelta. Esto se ha atribuido a la interacción de la micela del tensioactivo con la superficie de la célula, seguida por la liberación directa de HAP intercalado. Mientras que los AH pueden disminuir la biodegradación, reduciendo la concentración de HAPs libres disueltos por CAPÍTULO I: Introducción - 89 - sorción, los AH además pueden actuar como transportadores de HAPs (Totsche y col., 1997; Haftka y col., 2008). Normalmente la adsorción de COH a la materia orgánica disuelta (MOD) se expresa como un coeficiente de reparto (K OC ) del compuesto químico entre la MOD y las fases acuosas libres. La determinación del K OC requiere de medidas o cálculos de la cantidad de compuesto químico sorbido al carbono orgánico disuelto (COD) y la concentración del compuesto químico libre disuelto en la fase acuosa. Para determinar la concentración libre disuelta del contaminante en disoluciones que contienen COD se necesita una técnica que pueda medir directamente esta concentración sin tener necesidad de hacer una separación de fases, de forma que se pueda conocer la concentración libre disuelta y la concentración del contaminante unida a la MOD. Gauthier y col., (1986) fueron los primeros en introducir el uso del quenching de fluorescencia como un método no destructivo para determinar constantes en equilibrio de interacciones entre materiales húmicos disueltos y HAPs sintéticos. Otros investigadores han empleado técnicas similares para determinar constantes de unión con naftaleno (Traina y col., 1989) y fenantreno (Magee y col., 1991) en presencia de carbono orgánico disuelto en agua para saber qué es lo que ocurre entre naftaleno o 1naftol y ácidos húmicos (Morra y col., 1990). Cualquier proceso en el que disminuya la fluorescencia de un compuesto es conocido como quenching de fluorescencia, este fenómeno se utilizó para desarrollar una nueva técnica conocida como Espectrofotometría de fluorescencia sincrónica. Las técnicas más comunes para la determinación de HAPs son los métodos cromatográficos, especialmente la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con fase reversa (con columna C18 para resolver problemas de coelución con HAPs isoméricos) con detección fluorimétrica. Esta técnica logra la separación de los 16 HAPs de la EPA. No obstante los métodos cromatográficos son caros, consumen mucho tiempo y requieren grandes cantidades de disolventes. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 96 - CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 97 - III.1. REACTIVOS Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs). Se utilizaron fenantreno (98%) y pireno (98%), ambos distribuidos por la casa comercial Sigma Chemical Co. Los compuestos radioquímicos fueron suministrados por Sigma Chemical Co (St Louis, MO): fenantreno-914 C [actividad específica, 13,1 mCi/mmol; pureza radioquímica, >98%], fluoranteno-314 C [actividad específica, 45 mCi/mmol; pureza radioquímica, >98%] y pireno-4,5,9,1014 C [actividad específica, 55 mCi/mmol; pureza radioquímica, >98%]. Tensioactivo. El tensioactivo empleado fue Brij 35 (C 12 E 10 ) tratándose de un tensioactivo no-iónico (Poerschmann y col. ) y suministrado por Sigma -Aldrich. Bioestimulantes. El fertilizante oleofílico usado como bioestimulante fue S-200, fabricado y suministrado por IEP Europe (Madrid). Contiene urea (fuente de N) y ésteres fosfóricos (fuentes de P), en una mezcla de ácidos grasos saturados e insaturados en la que predomina el ácido oleico como producto oleofílico. Contiene como disolventes 2-butoxietanol y glicol-éter, además de llevar como base agua. Los ácidos húmicos empleados fueron ácidos húmicos suministrados por Aldrich y ácidos húmicos extraídos de un suelo localizado en el Parque Nacional de Doñana, cerca del lago de Santa Olalla (Huelva) (Lahlou y col., 2000). Ácido oleico (90%) fue suministrado por Aldrich y urea por la casa Fluka. Disolventes. Todos los disolventes utilizados (acetona, diclorometano, metanol y acetonitrilo) fueron de calidad HPLC y fueron suministrados por Merck. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 98 - III.2. LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs) En este trabajo se emplearon 4 líquidos en fase no acuosa: • 2,2,4,4,6,8,8heptametilnonano (HMN), n-hexadecano (HD) y di-2-etilhexil-ftalato (DEHP) se obtuvieron de Sigma Chemical Co, todos ellos con una pureza igual o superior a 98%. • Fuel pesado, RMG 35 (ISO 8217), obtenido de la Oficina Técnica de Vertidos Marinos Accidentales (OTVM), Universidad de Vigo. Las constantes físico-químicas de cada NAPL utilizado, relevante para este estudio y disponible en la literatura (Carroquino y Alexander, 1998) o proporcionada por OTVM, son la solubilidad en agua, S w (mg/L); partición octanol-agua, log k ow , densidad, D (g/L), y la viscosidad, V (centistokes, cSt). Los valores de estas constantes físico-químicas correspondientes a cada NAPL los podemos ver en la Tabla III. 1. Tabla III. 1.- Propiedades físico-químicas de los NAPLs. NAPLs S w (mg/L) Log k ow D (g/mL) V (cSt) DEHP 2.2·10 -5 7.45 0.981 81.4 (20ºC) HD 0.283·10 -3 9.16 0.773 3.03 (25ºC) HMN 0.278·10 -3 8.25 0.793 3.18 (25ºC) FUEL PESADO - - 0.981 380 (50ºC) Con el fin de reducir la viscosidad y permitir que los resultados fueran reproducibles en los experimentos de biodegradación y de reparto, las muestras de fuel pesado se mezclaron en la proporción siguiente: 1 g de fuel con 1 mL de HMN o DEHP. El resultado de estas muestras de NAPL más fluidas, a las que se refiere como fuel/HMN y fuel/DEHP, CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 99 - tenían viscosidades a 25ºC de 13.99 ± 0.28 y 31.16 ± 0.14 cSt, respectivamente. Estos valores de viscosidad se determinaron mediante el tiempo que transcurre cuando pasa el fluido a través de una pipeta de 10 mL comparándolo con HMN (Birman y Alexander, 1996). III.3. SUELOS Se utilizaron dos tipos de suelo en este trabajo: A) Suelo contaminado por creosota. Este suelo fue facilitado por EMGRISA (Empresa de Gestión de Residuos Industriales, Sociedad Estatal, Madrid, España) responsable de la gestión ambiental del emplazamiento. Las muestras procedían de una antigua planta de tratamiento de maderas situada en Andalucía con un alto contenido en HAPs (NiquiArroyo y col., 2006). Se utilizó una pala excavadora para recoger las muestras del horizonte superficial del suelo hasta un metro de profundidad que es hasta donde penetró la creosota (Figura III.1). Una vez cogidas las muestras de suelo se guardaron en contenedores especiales para este tipo de muestras y se mantuvieron a 4ºC hasta su posterior utilización. B) Suelo no contaminado. Se trata de un suelo franco arenoso con el 67% de arena lavada (Aquarama) y 33% de suelo de Vega procedente de la finca experimental “Las Hampas” del IRNAS-CSIC en Coria del Río (Sevilla). La mezcla de ambos suelos contenía un pH de 8.73, 27.5% de CaCO 3 , 1.75% de materia orgánica, 0.096% de nitrógeno orgánico (Kjeldahl), 13.8 mg·kg -1 de fósforo disponible y 428 mg·kg -1 de potasio. La distribución de tamaño de partículas fue: 19.5% de arena de grano grueso, 39.9% de arena de grano fino, 15.9% de limo y 24.6% de arcilla. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 100 - Figura III. 1.- Emplazamiento contaminado con creosota. Fotos de la zona y del muestreo de suelo. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 101 - III.4. BACTERIAS, MEDIOS, CONDICIONES DE CULTIVO Y PREPARACIÓN DE INÓCULOS La estirpe utilizada en esta Tesis Doctoral fue Mycobacterium gilvum VM552. Esta estirpe procede de un suelo contaminado con HAPs y es capaz de crecer con fenantreno, fluoranteno y pireno como única fuente de carbono y de energía (Wick y col., 2002; van Herwijnen, 2003). También se han observado resultados de degradación, mediante procesos cometabólicos, de antraceno y benzo(a)pireno (Bueno-Montes y col., 2011). El medio líquido utilizado para cultivar la estirpe se denomina Medio Suiza (SW), (pH=7, Tabla III. 2). El cultivo se realizó en agitador orbital a 30ºC, 150 revoluciones por minuto (rpm) y con 0.2 % (p/v) de fenantreno como fuente de carbono. Los cristales de fenantreno fueron previamente esterilizados mediante disolución en diclorometano y posterior recristalización. Esta estirpe forma en medio sólido de agar soja triptona suplementado (TSA, Cultimed, Panreac Química, S. A.) colonias redondas de color amarillo-anaranjado y de aspecto mucoso y brillante. Este medio rico (Tabla III. 2) se preparó añadiendo a un medio denominado MSB (minimal salts medium), el peso adecuado de agar soja triptona (42 g/L). En los ensayos de biodegradación, se empleó el medio de mineralización (MM, Tabla III. 2) cuyo pH fue igual a 5.7, siendo suficientemente ácido como para permitir la liberación del 14 CO 2 generado durante el proceso de biodegradación del sustrato marcado, y su captura en la trampa alcalina. Para la preparación de los inóculos, se siguió el siguiente procedimiento: 1º) Se filtró a través de una placa porosa nº2 (40 µm de tamaño de poro) 1000 mL de cultivo para los experimentos de interfase constante y 100 mL de cultivo para los experimentos CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 102 - de mineralización con exudados y ácidos húmicos, cada uno incubado con fenantreno como fuente de carbono adecuada. 2º) Se mantuvo el cultivo bacteriano filtrado, durante 24 h, en agitación a 30ºC y 150 rpm, para eliminar los posibles cristales residuales de fenantreno en solución. 3º) Después de la incubación del cultivo filtrado, éste se sometió a varios ciclos de lavado para liberar el pellet bacteriano de restos de metabolitos. Este lavado consistió en varias centrifugaciones con medio de mineralización durante 10 minutos a 8000 rpm (para los experimentos de interfase constante) y 5 minutos a 10000 rpm (para los experimentos de mineralización en presencia de exudados y ácidos húmicos). 4º) Tras el lavado, el pellet se resuspendió en un volumen conocido de medio de mineralización estéril. Las células viables se determinaron en cada experimento como unidades formadoras de colonias (CFU) después de sucesivas diluciones del pellet con medio de cultivo y siembra en placas de TSA (Triptone Soy Agar). También se midió la densidad óptica del inoculo a 600 nm en un espectrofotómetro UVvisible (Genesys 10vis, Spectronic Unicam). CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 103 - Tabla III. 2.- Composición por litro de los distintos medios utilizados en esta tesis. Los reactivos marcados con * se autoclavaron por separado de los marcados con ** y se mezclaron una vez enfriados. Los marcados con *** se añadieron por filtración a través de millipore de poro 0.2 µm. Compuesto Medio Suiza (SW) Medio Mineralización (MM) MM con N ajustado (MMNA) Medio MSB Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 3.52g ** 670 mg KH 2 PO 4 0.2g ** 900 mg** 900mg ** 340 mg K 2 HPO 4 100 mg** 100 mg ** MgCl 2 ·6H 2 O 0.1 g* (NH 4 ) 2 SO 4 0.5 g* Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O 0.05 g* CaCl 2 80 mg* 80 mg* 14 mg NH 4 Cl 500 mg NH 4 NO 3 100 mg* 876 mg* MgSO 4 ·7H 2 O 100 mg* 100 mg* 112 mg ZnSO 4 ·7H 2 O 2.5 µg*** 5 mg ZnCl 2 5 µg*** MnCl 2 ·4H 2 O 30 µg*** H 3 BO 3 5.5 µg*** CoCl 2 ·6H 2 O 19.5 µg*** CuCl 2 ·2H 2 O 1.7 µg*** NiCl 2 ·6H 2 O 2.3 µg*** Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O 2 µg*** 2 µg*** MnSO 4 ·H2O 2 µg*** 2 µg*** CuSO 4 ·5 H 2 O 2 µg*** 2 µg*** Na 2 MoO 4 ·2 H 2 O 10 µg*** 1.4 µg*** 1.4 µg*** 2.5 mg ZnSO 4 ·H 2 O 2 µg*** 2 µg*** CuSO 4 2.5 µg*** Na 2 EDTA 2 mg*** FeCl 2 0.75 mg*** LiCl 1.25 µg*** SnCl 2 1.25 µg*** KBr 5 µg*** KI 5 µg*** BaCl 2 1.25 µg*** FeCl 3 ·6H 2 O 10 mg*** 10 mg*** 0.22 mg TSA 40 g pH 7.0 5.7 5.7 7.0 CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 104 - III.5. ANÁLISIS DE HAPs POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) La instrumentación utilizada fue un cromatógrafo líquido de alta resolución (Waters 996 Separation Module) de fase reversa equipado con un detector de UV-VIS (Waters 996 Photodiode Array Detector) y otro detector de fluorescencia (Waters 474 Scanning Fluorescence Detector). La columna empleada está especialmente indicada para la determinación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (Waters PAH column, C 18 , 5 µm de tamaño, 4.6 x 250 mm). Los componentes de la fase móvil, acetonitrilo de calidad HPLC (Merckx y col. ) y agua Milli-Q, fueron filtrados previamente a su uso para aumentar la vida útil de la columna, utilizando para ello un filtro de membrana de nylon de 0.45 µm de poro y 47 mm de diámetro (Teknokroma, Barcelona, España). Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: • Flujo fase móvil: 1 mL/min. • Temperatura de la columna: 30ºC. • Volumen de inyección 80 µL. • Tiempo de análisis 50 min. El gradiente empleado para la fase móvil lo podemos ver en la Tabla III. 3 (Garagorri y col. , 1999), así como la programación del detector de fluorescencia en la Tabla III. 4. Tabla III. 3.- Gradiente empleado como fase móvil en el análisis de muestras de reparto. Tiempo (min) Acetonitrilo (%) Agua Milli-Q (%) 0 45 55 5 45 55 25 95 5 31 100 0 38 100 0 43 45 55 CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 105 - Tabla III. 4.- Programación del detector de fluorescencia. Estas condiciones analíticas se utilizaron en los análisis de los experimentos de reparto de los HAPs desde los NAPLs a la fase acuosa, en el ensayo del invernadero a tiempo inical, intermedio (45 días) y final (90 días), así como, en los ensayos de mineralización con suspensiones de suelo contaminado con creosota mediante poblaciones autóctonas en presencia y ausencia de exudados de girasol a tiempo inicial y final. Se realizó una recta de calibrado para el análisis de las muestras de cinco puntos, cubriendo el intervalo de concentraciones de las muestras a determinar. Los límites de detección y cuantificación de los componentes analizados se calcularon como tres veces y diez veces la desviación estándar relativa de la ordenada en el origen de la recta de calibrado. La curva de calibrado para el experimento de reparto de fenantreno fue del orden de ng·mL -1 , siendo el límite de detección igual a 0.2 ng·mL -1 y el límite de cuantificación igual a 0.7 ng·mL -1 , obtenidos con el detector de fluorescencia. La curva de calibrado para los HAPs de las muestras de suelo fue del orden de µg·mL -1 , los límites de detección y de cuantificación calculados aparecen en la Tabla III. 5. Tiempo (min) λ Excitación (nm) λ Emisión (nm) 0.0 270 323 14.5 248 374 21.0 270 400 32.5 305 430 38.0 270 323 CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 112 - las primeras germinaciones de semillas, por lo que se retiró el papel de aluminio, quedándose a una intensidad lumínica de 2.75 µEm -2 s -1 y 18 horas de fotoperíodo. Transcurridos 45 días se vio un desarrollo adecuado de la zona radicular de las plantas de ambas especies. En consecuencia, se retiraron las plantas y se congeló el medio a -20ºC para su posterior análisis tanto del carbono orgánico como del carbono orgánico total mediante el Servicio de Análisis del IRNAS. Ante los resultados alentadores conseguidos en el primer ensayo, se realizó una producción de exudados a mayor escala. Para ello, se prepararon frascos de 1000 mL de capacidad a lo que se les instaló en su interior un soporte a modo de cesta de tela metálica de acero inoxidable (0.98 mm de luz y 0.40 mm de diámetro) sostenida por hilos metálicos que se sujetaron en la boca del frasco que se cerró herméticamente. La longitud de estos hilos metálicos se calculó para que las semillas posicionadas en la cestilla estuvieran en contacto con el medio de cultivo (500 mL de MM), pero sin hundirse en él, lo que produciría efectos de anoxia y, en consecuencia, la germinación resultaría seriamente afectada. Gracias a este sistema (Figura III.3), las raíces que se van desarrollando se internan en el medio líquido donde vierten los exudados objeto de extracción, sin tener ningún tipo de participación la parte aérea. Posteriormente, en el interior de la cabina de flujo laminar, se esterilizaron por separado dos grupos de 50 semillas de girasol mediante inmersión en etanol 96º durante 90 seg. Seguidamente ambos grupos se sometieron a una nueva inmersión en hipoclorito sódico (NaClO) (3.5% de cloro activo) durante 30 minutos y para eliminar los restos de hipoclorito se realizaron tres lavados de cinco minutos cada uno en agua destilada estéril. De igual modo 200 semillas de Lolium perenne y 200 de Festuca arundinacea se esterilizaron por separado mediante inmersión en etanol 96º durante 90 segundos y posteriormente en NaClO (3.5% de cloro activo) CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 113 - durante 20 minutos finalizando con los tres lavados con agua estéril de cinco minutos cada uno. Figura III. 3.- Sistema utilizado para la obtención de exudados de girasol in vitro. Una vez esterilizadas las semillas se colocaron los 2 grupos de 50 semillas en el caso del girasol, y 2 grupos de 100 para el caso de las dos gramíneas en cada uno de los 6 frascos con los soportes descritos anteriormente, previamente esterilizados en autoclave. A cada uno de los frascos se les añadió en cámara de flujo laminar, 500 mL de MM (pH=5.7) estéril sin reguladores de crecimiento y sin fuente de carbono, a fin de no interferir con los exudados de raíz y que fueran éstos los únicos compuestos hidrocarbonados disponibles para los microorganismos. Una vez sembradas las semillas y cerrados los frascos con parafilm, el conjunto se depositó en una cámara de cultivo a 25±1ºC, 65.24 µEm -2 s -1 , para CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 114 - potenciar la fotosíntesis dado que el medio de cultivo carece de fuente de carbono, y 18 horas de fotoperíodo. Transcurrido un mes de incubación en estas condiciones, se observó una germinación adecuada de las semillas con una proliferación del sistema radicular bastante aceptable, por lo que se separaron las plantas de los medios de cultivo con los exudados excretados en condiciones estériles. Los medios recogidos se centrifugaron durante 3 horas a 31000 g para obtener una solución nítida que incluye la materia orgánica disuelta potencialmente presente en el agua intersticial de los sedimentos (Haftka y col., 2008) y se almacena a -20ºC hasta su uso en los experimentos de mineralización. Se analizó el carbono orgánico total (COT) a los medios centrifugados, también mediante el Servicio de Análisis del IRNAS, Sevilla. Dada la mayor concentración de exudados producidos por Helianthus annuus, estimada mediante la concentración de carbono orgánico total (COT) y su mejor crecimiento in vitro, se utilizaron preferentemente los exudados de esta planta en los posteriores ensayos de mineralización y eliminación de de HAP en invernadero. Para llevar a cabo esta producción regular de exudados de raíces de girasol, se realizaron siete cultivos, usando siempre 50 semillas completas y esterilizadas en cabina de flujo laminar sumergiéndolas en etanol absoluto durante 3 minutos, inmediatamente después de la eliminación del etanol se introdujeron en una solución de hipoclorito sódico al 57% (14% de cloro activo) durante 25 minutos y posterior lavado de 5 minutos cada uno con agua esterilizada. Transcurridos 30 días, se cuantificó el número de plantas para calcular el porcentaje de germinación, el peso freso y seco y la tasa de crecimiento relativo (relative growth rate, RGR) de la planta completa de acuerdo con la ecuación: 1 )ln(ln − ⋅−= DpipfRGR (Merckx y col., 1987) donde pf es el peso seco de la planta completa al final del experimento; pi es el peso seco al inicio del experimento (media de 5 plántulas CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 115 - secadas 3 días después de la germinación de la semilla) y D es la duración del experimento en días. El secado de las plantas se efectuó manteniendo el material vegetal en estufa a 70ºC durante 72 horas. III.7.2. Mineralización de pireno en cultivos líquidos en presencia y ausencia de exudados de raíces de girasol Para ver el efecto de los exudados de raíces de girasol en la biodegradación de HAPs puros, llevamos a cabo dos tipos de estudios de mineralización de pireno en presencia o ausencia de estos exudados: Por debajo de la solubilidad del pireno (S=0.135 µg·mL -1 a 25ºC) a 6·10 -4 µg·mL -1 y por encima de la solubilidad del pireno a 27.2 µg·mL -1 . A) Para medir la mineralización del hidrocarburo por debajo de su solubilidad, se preparó una disolución de MM de 40 mL con 4296 dmp·mL -1 . Conociendo el valor de dmp·mL - 1 de esta disolución y la actividad específica podemos conocer la concentración del este hidrocarburo en la disolución. De esta manera, la disolución de pireno en MM era de 7.21·10 -3 µg·mL -1 . Una vez preparadas las disoluciones, éstas se añadieron por duplicado en tubos de pirex 18 x 100 cm hasta alcanzar una concentración de HAP marcado de 6·10 -4 µg·mL -1 en 5 mL de volumen total donde 0.5 mL eran de inóculo bacteriano (densidad óptica a 600 nm igual a 0.19 en los 5 mL totales, 2.3·10 8 células/mL) en ausencia o presencia de 50 µg·mL -1 de carbono orgánico procedente de los exudados de raíz de girasol. En el interior del tubo de ensayo se colocó una varilla de vidrio de 5 cm para homogenizar la disolución en su interior durante la agitación a 80 rpm y 25ºC. Los tubos de ensayo se cerraron con tapones envueltos en Teflón, de los cuales suspendían unos viales de 1 mL donde se colocaron las trampas de NaOH (1 mL a 0.5 M). CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 116 - Se tomó diariamente 1 mL de la trampa de sosa para medir la producción de 14 CO 2 como se ha descrito anteriormente. B) Los experimentos de mineralización por encima de la solubilidad del pireno, se realizaron en los mismos tubos de ensayo y en las mismas condiciones de temperatura y agitación. Se preparó una disolución de pireno en acetona (136 µg·mL -1 ) de la cual se depositó 100 µL en el fondo de los tubos de ensayo estériles añadiéndoles a cada tubo de ensayo el pireno marcado para conseguir una radiactividad de 40000 dpm por tubo y se dejó evaporar toda la acetona durante 24 horas, quedándose los cristales de HAP en el fondo del tubo. Una vez evaporado todo, se añadieron las disoluciones de MM, exudados de girasol a 50 µg·mL -1 y 0.5 mL de inóculo bacteriano (Densidad óptica a 600 nm de 0.19 ± 0.03, 2.3·10 8 células/mL para un volumen total de 5 mL). Como el volumen total para cada tratamiento fue de 5 mL, la concentración final de pireno que se obtuvo fue de 27.2 µg·L -1 . La mineralización se pudo medir, recogiendo las trampas de sosa (0.5 M) diariamente como hemos descrito en el caso anterior. III.7.3. Ensayo en invernadero El suelo utilizado en esta tarea fue una mezcla (1:1) de suelo contaminado con creosota y suelo no contaminado. La descripción de estos suelos aparece detallada en el apartado III.3. El suelo no contaminado utilizado se autoclavó previamente antes de mezclarse con el suelo contaminado para que sólo existieran los microorganismos autóctonos de este último. La mezcla se secó ligeramente en estufa a 30ºC CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 117 - durante 18 horas, posteriormente se molió y se realizó un cribado hasta obtener un tamaño de grano no superior a 2 mm. Una vez finalizados estos tratamientos, la mezcla (1:1) se homogeneizó en una hormigonera durante períodos diarios de 9 horas a lo largo de una semana, cambiando periódicamente el sentido de giro para conseguir una mezcla óptima. Las características finales de la mezcla (1:1) fueron: 2.2% de humedad sobre peso húmedo, pH de 8.09; 15.9% de CaCO 3, 0.69% de materia orgánica oxidable, 0.401% carbono orgánico oxidable, 0.055% de nitrógeno orgánico (Kjeldahl), 7.0 mg·kg -1 de fósforo Olsen, 0.9% carbono orgánico total. Distribución de tamaño de partícula: 46.6% de arena de grano grueso, 4.3% de arena de grano fino, 15.8% de limo, y el 33.2% de arcilla. La clase textural fue: francoarcillo-arenosa. Por último, se realizó una extracción de los HAPs presentes en la mezcla homogénea de suelo (ver apartado III.7.4) para su posterior análisis por HPLC (ver apartado III.5). La concentración inicial de HAPs en la mezcla (1:1) fue igual a 21.75 mg·kg -1 que corresponde al sumatorio de 6 PAHs (fluoreno, fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno y criseno). Se consideró que estos niveles de HAPs en el suelo fueron suficientes para permitir períodos de pruebas relativamente cortos y estimaciones precisas del proceso de biodegradación en nuestro sistema experimental. Además, las concentraciones resultantes pueden ser consideradas realistas por los suelos presentados en fuentes puntuales de contaminación debido a la eliminación de residuos industriales o derrames accidentales de hidrocarburos aromáticos policíclicos, que suelen contener concentraciones superiores a 1 mg / kg (Posada-Baquero y Ortega-Calvo, 2011). Después de conocer el contenido de HAPs en el suelo y comprobar la homogeneidad de la mezcla, comenzó el ensayo en invernadero según el diseño experimental de la Figura III.4. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 118 - Figura III. 4.- Diseño experimental del ensayo realizado en invernadero. Los círculos simbolizan las macetas utilizadas y los colores nos indican el tipo de suelo empleado. Se colocaron en el invernadero 20 macetas con 2 kg de suelo en cada maceta (10 kg de suelo no contaminado y 10 kg de mezcla (1:1). En las macetas con planta se plantaron 5 semillas de girasol por maceta (50 semillas en total). La duración de la prueba fue de 90 días. Las condiciones del invernadero fueron: temperatura 23±1ºC, régimen de luz natural y el sustrato se mantuvo a capacidad de campo mediante adición de 100 cc de agua de la red a cada maceta cuando fue necesario. Se tomaron muestras de suelo y planta a tiempo inicial (T 0 ), tras 45 (T 45 ) y 90 días (T 90 ) para comprobar la evolución de los HAPs en el suelo y su efecto sobre las plantas. Las muestras de suelo se extrajeron con un tubo de vidrio (20 g) y con cuidado para no dañar las plantas. Las muestras recogidas se congelaron (-20ºC) y se guardaron hasta su extracción (ver apartado III.7.4) y análisis por HPLC (ver apartado III.5). Además del análisis químico de los contaminantes así como de las propiedades del suelo a T 0 y T 90 , estas muestras fueron analizadas a nivel microbiológico gracias a la colaboración del Departamento de Microbiología de la Universidad de Barcelona liderado por la Doctora Magdalena Grifoll. También se guardaron muestras de la mezcla de suelo homogénea a T 0 a -20ºC y a 4ºC para los experimentos de mineralización en suspensiones (apartado III.7.5). CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 119 - El análisis microbiológico consistió en cuantificar las poblaciones microbianas (tanto heterótrofa como la degradadora de alto y bajo peso molecular de HAPs) mediante la técnica del número más probable (NMP) miniaturizado en placas de microtitulación, con 8 réplicas por dilución (Wrenn y Venosa, 1996). Y además se hizo un estudio de la composición de las comunidades microbianas mediante la técnica molecular de secuenciación directa de bandas de DGGE (gel de gradiente desnaturalizante químico) para el análisis de genes que codifican el 16S rRNA. Esta técnica permitió la separación de una mezcla heterogénea de genes amplificados por PCR en un gel de poliacrilamida con un gradiente químico de formamida y urea en concentraciones crecientes en el sentido de la migración electroforética de muestras de suelo con creosota (mezcla 1:1, invernadero) control y suelo con creosota (mezcla 1:1, invernadero) en presencia de Helianthus annuus después de los 90 días que duró el experimento en invernadero. La separación de las moléculas de DNA se consigue porque durante su migración por el gel de poliacrilamida, el DNA, se encuentra con concentraciones crecientes de los agentes desnaturalizantes formamida y urea, lo que genera diferentes horquillas de desnaturalización, según la secuencia de las moléculas de DNA, traduciéndose en una reducción de la velocidad de migración y una separación en diferentes bandas de migración electroforética. Una vez las moléculas quedan separadas en el gel, es posible recortarlas y estudiar su secuencia, con el fin de asociar cada banda a un determinado grupo filogenético. Al final del experimento se calcularon el porcentaje de germinación y el peso fresco y seco de tallos y raíces por separado. Para el peso seco se mantuvo el material vegetal durante 72 horas en estufa a 70ºC. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 120 - III.7.4. Extracción de los HAPs del suelo y purificación de la muestra La extracción de los HAPs presentes en la mezcla de suelo (1:1) utilizada en el invernadero, así como su extracción en las suspensiones para los experimentos de mineralización se realizaron como se explica a continuación (esquema detallado en la Figura III.5): 1º) Se realizó una extracción Soxhlet de 250 mL de capacidad. Se utilizó como fase orgánica extractora 100 mL de diclorometano. Se pesó 2.8 g de suelo para las muestras del invernadero y 1 g para las suspensiones de los experimentos de mineralización. Todas las muestras se sometieron a un proceso de secado en estufa a 40ºC durante 48 horas y posteriormente se eliminó la humedad restante mediante molienda de la muestra en un mortero de ágata junto a un peso equivalente a la muestra de sulfato sódico anhidro. Después estas muestras se introdujeron en unos cartuchos de celulosa (19 mm Ø interior x 90 mm, Filtros Anoia, S.A., Barcelona, España) y se sometieron a extracción durante un periodo de 8 horas (Jones y col., 1989). 2º) El extracto orgánico obtenido se llevó al rotavapor hasta casi su sequedad y se resuspendió en 5 mL de diclorometano. Para eliminar los compuestos más polares del extracto, se pasó por un cartucho de fluorisil (Sep-Pak cartridges, WATERS) que permitió el paso de los compuestos apolares como los HAPs y retuvo los polares. El cartucho se acondicionó previamente con 9.5 mL de diclorometano con ayuda de una jeringa Hamilton. Después de pasar el extracto por el cartucho, se limpió el cartucho con 2 mL de diclorometano para arrastrar las trazas de HAPs que se hubieran quedado retenidas (Garrigues y Bellocq, 1989; Aceves y Grimalt, 1993; Leal-Granadillo y col. , 2000). 3º) Una vez que el extracto quedó limpio, se llevó a sequedad mediante corriente de nitrógeno. Se resuspendió en CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 121 - un volumen conocido de acetonitrilo y se sonicó durante 15 minutos para alcanzar la completa disolución de los HAPs. 4º) Por último, la muestra en acetonitrilo se filtró mediante un filtro de Nylon (0.45 µm y 13 mm de diámetro) para eliminar las posibles impurezas existentes en la disolución y se traspasó a un vial para ser analizada mediante HPLC (apartado III.5). Figura III. 5.- Proceso de extracción y cuantificación de HAPs en suelos. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 128 - Los viales con PDMS en el fondo, se mantuvieron a 5ºC durante 72 h para reducir las burbujas de aire, luego se pusieron a temperatura ambiente durante 72 h y a 110ºC durante una noche para fijar bien la silicona. Una vez fijada la silicona, se prosiguió con su limpieza mediante 3 lavados de etanol (96%) con los viales totalmente cerrados y manteniendo un contacto total de 48 horas para eliminar impurezas y oligómeros. Después de este tiempo se hicieron 3 lavados con agua Milli-Q durante 24 horas para eliminar los restos de etanol. Por último, los viales con el polímero se secaron a 110ºC durante una hora y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta su uso en los ensayos de biodegradación o de disolución del pireno. Para la esterilización de estos viales, se realizaron 3 lavados con etanol absoluto durante 72 horas, luego 3 lavados con agua Milli-Q autoclavada y por último, se eliminó el agua para secarlos en estufa a 80ºC durante 24 horas. III.9.2. Estudio de la mineralización y disolución de pireno en presencia y ausencia de ácidos húmicos en viales con PDMS Para ver el efecto de los ácidos húmicos (10 µg·mL -1 ) sobre la biodegradación de pireno a 50 µg·mL -1 y su disolución en MM, se usaron los viales con PDMS fijada en su base para controlar la concentración de pireno libre disuelta. En estos viales con PDMS (Figura III.6) y en condiciones estériles, se fijó 100 µL de pireno en acetona (250 µg·mL -1 ) como en los apartados de mineralización (III.8.2) y de disolución (III.8.3) para tener una concentración de 50 µg·mL -1 en un volumen de 5 mL. Se añadió 15000 dpm de 14 C-pireno en acetona por vial. Se dejó evaporar la acetona durante 24 h y el pireno quedó retenido en la silicona debido a la alta hidrofobicidad de la silicona. A continuación, se añadieron las CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 129 - disoluciones de medio MM (control) y 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos de Santa Olalla en MM. Por último se colocó 0.5 mL de inóculo bacteriano (M. gilvum VM552, A 600nm = 0.16, 1.9·10 8 células/mL) en los experimentos de mineralización. Figura III. 6.- Viales de dopaje pasivo con PDMS fijados en su base para la mineralización de 50 µg·mL -1 de pireno por Mycobacterium gilvum VM552 en presencia de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos extraidos de Santa Olalla, Huelva. Los viales fueron sellados con tapones envueltos en teflón, de los cuales pendían las trampas de NaOH (1 mL, 0.5 M). En el interior de estos viales se colocaron unas barritas de vidrio de 5 cm de longitud para homogeneizar la mezcla durante su incubación en agitador orbital a 80 rpm y 25ºC. Las muestras de NaOH con 14 CO 2 producido de la mineralización del pireno, fueron recogidas a diario en viales de centelleo de 7 mL junto a 5 mL de líquido de centelleo (Ready safe, Beckman Instruments, Fullerton, California) y transcurridas 8 horas de oscuridad para disipar su quimioluminiscencia, fueron medidas por contador de centelleo (Beckman Instruments, Fulleron, California). Se realizaron triplicados por cada tratamiento (con o sin 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos de Santa Olalla). En el caso de los ensayos de disolución de pireno a 50 µg·mL -1 , se emplearon los mismos viales de la Figura III.6 con las mismas disoluciones que en los ensayos de mineralización CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 130 - y las mismas condiciones de incubación, pero sin añadir los microorganismos ni la trampa de sosa. Al igual que en el apartado III.8.3, se prepararon varias series de tratamientos en paralelo para evitar un cambio brusco de concentración al muestrear. Se recogieron 0.5 mL de muestra durante 8 horas y la última muestra 24 horas después. Estas muestras también fueron medidas por contador de centelleo (Beckman Instruments, Fulleron, California) para conocer la concentración total de pireno en todo el proceso ya que la concentración disuelta se controló con la presencia de la silicona. III.9.3. Estudio de la difusión de PAHs en presencia de los 3 bioestimulantes empleados en biodegradación Para estudiar la influencia de los bioestimulantes empleados en la biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos, se utilizaron unas siliconas de polidimetilsiloxano con forma de discos (SSP-M823), con un espesor de 600 ± 10 µm y 6 mm de diámetro, que fueron suministradas por Specialty Silicone Products, Inc. (Ballston Spa, NY). Sodeman Industrifjedre A/S (Viby, Dinamarca) suministraron arandelas de acero inoxidable de 100 µm (ID 4mm, OD 8 mm) que se utilizaron como separadores. Se seleccionaron de las arandelas suministradas aquellas que tuvieron un radio de 100 ± 5 µm. Los imanes utilizados fueron unos discos de neodimio-hierro-boro niquelados con 10 mm de diámetro y un espesor de 5 mm, fueron suministrados por Farnell (Herlev, Dinamarca). Los HAPs estudiados fueron; fenantreno (98%, Aldrich), fluoranteno (99%, Aldrich), pireno (99%, EGA), benzo(a)antraceno (Aldrich), criseno (95%, Aldrich), benzo(k)fluoranteno (98%, Aldrich) y benzo(a)pireno (98%, Aldrich). CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 131 - Más de 1000 discos de PDMS se limpiaron 3 veces con 200 mL de metanol durante 24 h. Estos discos se contaminaron con una mezcla metanol: agua (90:10, v/v) que contenían los HAPs a una concentración de 40-47 µg·mL -1 cada hidrocarburo. El contacto total entre los discos y la mezcla fue de 16 horas para que los HAPs quedaran retenidos en el PDMS. En el mismo día que se realizó el experimento de difusión, los discos contaminados se trasladaron a un vaso de precipitado con un volumen pequeño de agua (mL/disco) con el fin de eliminar el metanol. El experimento consistió en una serie de microcámaras (Figura III.7) para medir la transferencia de masa mediante reparto-difusión-reparto, poniendo 10 µL de las disoluciones en estudio con los bioestimulantes entre un disco contaminado con HAPs y un disco limpio. Los bioestimulantes empleados fueron: fertilizante oleofílico (100 µg·mL -1 ), exudados de girasol (71.7 µg·mL -1 ) y ácidos húmicos (100 µg·mL -1 ) extraídos de Santa Olalla en MM. Figura III. 7.- Sección transversal del diseño experimental de las microcámaras empleadas en el estudio del aumento de difusión en presencia de los diferentes bioestimulantes utilizados. (Modificación de Mayer, P., y col., 2005). Las diferentes matrices se colocaron en cada microcámara y quedaron fijadas en el medio por una arandela de acero inoxidable de 100 µm de espesor. Las diferentes disoluciones que componen las matrices en estudio son el factor variable de este diseño experimental y forman el modelo “Unstirred Boundary Layer” (UBL) citado en la introducción I.3. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 132 - Las microcámaras se colocaron sobre una placa de vidrio horizontal con soporte de acero y se mantenían unidas gracias al empuje de un imán. Todas las microcámaras se realizaron sobre un porta de cristal 40 x 60. De esta forma los HAPs pasaron por reparto del disco de PDMS a la matriz en estudio, mediante difusión a través de los 100 µm del modelo UBL y finalmente por reparto al disco de PDMS limpio. Se cogieron muestras por triplicado en períodos de tiempo de 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 min, 24 y 48 h. Las medidas se realizaron quitando el imán y trasfiriendo cada disco a 0.4 mL de metanol (para los discos limpios) y a 4 mL de metanol (para los discos contaminados con HAPs) para extraer los HAPs y medirlos por HPLC. El HPLC utilizado tenía detección por fluorescencia (Agilent 1100 system con G1321A FLD, ex. 260 nm; em 350, 420, 440 y 500 nm). La columna de separación “CP-Ecospher 4 PAH” fue obtenida por Varian Inc. (Palo Alto, CA) y operaba a 0.5 mL/min (28ºC, 30 µL de inyección). Metanol (grado HPLC suministrado por Merck) y agua Milli-Q eran la fase móvil: 50% metanol a t=0-2 min, gradiente linear desde 50 a 75% metanol a t=2-7 min, gradiente linear desde 75 a 100% a t=7-35 min y 100% metanol a t=33-55 min. La cuantificación de las concentraciones de HAPs en los extractos se realizó por una curva estándar externa de cinco puntos. El análisis de las muestras se llevó a cabo dentro de dos semanas después de la toma de muestras. La integración de la señal se realizó con HP Chemstation software (A.06.03, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) y se corrigió a mano cuando fue necesario. Generalmente, se recuperó entre un 90-100% de los HAPs iniciales en el extracto final de los discos contaminados y limpios respectivamente, indicando un completo balance de masas. CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 133 - Finalmente, el porcentaje que fue transferido al disco limpio fue ajustado para cada HAPs con la ecuación (1), con el fin de determinar la tasa de velocidad constante a, que luego se normalizó con la constante de velocidad determinada por el agua destilada (ecuación 2). Estas regresiones no lineales se realizaron mediante mínimos cuadrados con el programa GraphPad Prizm 5 (San Diego, CA). ( ) ( ) ( ) at dldl e C tC m tm 2 00 1%50 − −⋅== (1) Donde m dl es la masa de HAP en el disco limpio, m 0 es la masa de HAP inicial y a es la constante de velocidad (s -1 ). j i j i j i D D K a a⋅= (2) Donde K ij es el coeficiente de reparto entre el medio i y el medio j, D es el coeficiente de difusión para el medio i y para el medio j y a i /a j es la relación entre velocidades que describe una conductividad relativa para la transferencia de masa por difusión. Para mas detalle ver la introducción (apartado I.6). III.9.4. Ensayos de dopaje pasivo en el estudio de la capacidad extractora de HAPs por los bioestimulantes empleados en biodegradación Para conocer la capacidad de los bioestimulantes en captar los HAPs de un medio donde se encuentran contenidos (en este caso la silicona), se propuso el siguiente esquema experimental. Primero se usaron viales de vidrio de 10 mL de capacidad con silicona (PDMS) fijada en el fondo de su base (Ver apartado III.8.4.1). Estos viales fueron expuestos a una disolución saturada de PAHs al 10 % de su solubilidad en metanol. Los HAPs utilizados fueron: naftalerno (>99%, CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 134 - Aldrich), fenantreno (>98%, Merck), antraceno (>99%, Fluka), fluoranteno (>99%, Aldrich) y pireno (>99%, Sigma). Los cristales de los HAPs en metanol mantuvieron el nivel de saturación. La silicona de estos viales contiene los HAPs debido al reparto de estos hidrocarburos desde el metanol a la silicona a 22ºC durante un periodo mínimo de 72h. Después de que la silicona captara los HAPs, el metanol fue cuidadosamente retirado y se limpió la superficie con un tisú para eliminar cualquier solución adherida. Por último, se lavó la silicona 3 veces con agua Milli-Q para eliminar el posible metanol retenido y se secó con un tisú (Smith y col., 2010). Una vez preparados los viales con los HAPs retenidos en la silicona, se añadió 3 mL de agua Milli-Q en cada vial y equilibramos los viales a 20ºC y 1000 rpm durante 24. Todo el experimento se realizó en una habitación con temperatura controlada. Después de este tiempo, se tomó 0.75 mL de cada muestra y se mezclaron con 0.75 mL de metanol para medirlas por HPLC con detector de fluorescencia. De esta cuantificación se obtuvo una concentración de HAPs disuelta, C 1 . Se retiró el agua Milli-Q y se añadió 3 mL de los siguientes bioestimulantes en cada vial: ácidos húmicos de Santa Olalla (10 µg·mL -1 y 100 µg·mL -1 ), exudados de girasol (71.7 µg·mL -1 ), exudados de Lolium (10.1 µg·mL -1 ) y exudados de Festuca (17.8 µg·mL -1 ), además del control MM. Se alcanzó el equilibrio de estas disoluciones a las 24h de incubación, se cogieron muestras después de alcanzar el equilibrio (0.75 mL de muestra + 0.75 mL de metanol) y se midió la concentración mediante HPLC con detector de fluorescencia. De esta cuantificación se obtuvo una concentración total de HAPs, C t . Por último, se retiraron las disoluciones con los bioestimulantes y se añadió 3 mL de agua Milli-Q en cada vial, se equilibraron los viales con agua de igual modo que en los casos anteriores. Se tomaron las muestras y se realizó CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 135 - cuantificación de la misma manera. De esta medida se obtuvo una concentración en disolución de HAPs, C 2 . También se colocaron unos viales con agua Milli-Q en paralelo a 20ºC y 1000 rpm, para controlar que no existía una desviación en las medidas de C 1 y C 2 . De esta forma se puede saber que en el equilibrio existe una concentración de HAPs libre disuelta (C ld ) dada por la ecuación 1. 2 21 CC CC Aguald + == (1) Mientras que el aumento de la capacidad (AC) de captar los HAPs de las disoluciones con los bioestimulantes en estudio viene expresada por la siguiente ecuación (2). ld t C C AC = (2) CAPÍTULO III: Materiales y Metodologías - 136 - C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I IV V Resultados - “Cuando puedes medir aquello de lo que hablas, y expresarlo con números, sabes algo acerca de ello; pero cuando no lo puedes medir, cuando no lo puedes expresar con números, tu conocimiento es pobre e insatisfactorio: puede ser el principio del conocimiento, pero apenas has avanzado en tus pensamientos a la etapa de ciencia”. William Thomson Kelvin (1824-1907). CAPITULO IV: Resultados - 144 - Figura IV. 3.- Concentraciones de HAPs recuperadas del NAPL de los controles y matraces inoculados, tanto con o sin bioestimulante S-200. Sólo se muestran los HAPs con la degradación significativa (P<0.05). Las barras muestran la relación entre el área del pico y la del hopano para cada tipo de muestra. FL, fluoreno; FEN, fenantreno; ANT, antraceno; FLT, fluoranteno y PIR, pireno. El análisis por GC-MS de los extractos neutro y ácido de la fase acuosa con y sin bioestimulante presentó perfiles similares de acumulación de metabolitos. Sin embargo, la concentración en los matraces con bioestimulante fue alrededor de 10 veces mayor (los valores fueron de alrededor de una décima de varios microgramos por mililitro, es decir, 120 ng·mL -1 para 1-indanona, 140 ng·mL -1 para el ácido difénico, 690 ng·mL -1 para el ácido 2-carboxicinámico y 3.6 mg·mL -1 para el ácido 4-metilftálico, Figura IV.4). Los metabolitos neutros correspondieron a alquilos oxidados o naftalenos fenólicos, mientras que los compuestos ácidos fueron principalmente ácidos dicarboxílicos, generalmente acumulados durante la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos y sus derivados de metilo por cepas de Mycobacterium. En concreto, el ácido ftálico es un producto intermedio común en la degradación de naftaleno, fenantreno, CAPITULO IV: Resultados - 145 - fluoranteno y pireno, mientras que los ácidos carboxicinámico y difénico son metabolitos del naftaleno y fenantreno, respectivamente (Lopez y col., 2008). La presencia de metabolitos con los grupos metilo indica vías similares de biodegradación para los correspondientes HAPs alquilo (Vila y col., 2001; Lopez y col., 2008; Vila y Grifoll, 2009). Figura IV. 4.- Cromatogramas típicos con GC-MS del extracto neutro (arriba) y del ácido (abajo) de las fases acuosas de los cultivos con Mycobacterium gilvum VM552 en la presencia de bioestimulantes con los picos identificados (ver Tabla IV. 1). Los metabolitos ácidos fueron identificados como los correspondientes a ésteres metílicos. (•) Ácidos monoaromáticos; (*) lactonas del ácido hidroxi aromático; MN, metilnaftaleno; HMN, heptametilnonano; DMN, dimetilnaftaleno, TMN, trimetilnaftaleno; MFL, metilfluoreno. Para la identificación de los compuestos 118, ver tablas IV. 1 y 2. 19 21 23 25 27 29 14 16 18 20 22 24 O O H3C CH2OH CH3 OH H3C HO H OH H H3C OH H3C H3C H3C HO H OH H H3C H3C OH H3C H3C CH3 OH H3C COOCH 3 H3COOC COOCH3 COOCH3 H3C H3C O O H3C O O H3C COOCH3 COOCH3 H3C COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 H3C H3CCOOH COOCH3 2MN 2MN 1,7DMN TMN MFL ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ** * * COOCH3 COOCH3 H3C H3C 1 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 13 15 16 17 18 19 21 23 25 27 29 14 16 18 20 22 24 O O H3C CH2OH CH3 OH H3C HO H OH H H3C OH H3C H3C H3C HO H OH H H3C H3C OH H3C H3C CH3 OH H3C COOCH 3 H3COOC COOCH3 COOCH3 H3C H3C O O H3C O O H3C COOCH3 COOCH3 H3C COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 H3C H3CCOOH COOCH3 2MN 2MN 1,7DMN TMN MFL ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ** * * COOCH3 COOCH3 H3C H3C 1 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 13 15 16 17 18 CAPITULO IV: Resultados - 146 - Tabla IV. 1.- Tiempos de retención (Tr) y los iones fragmento del GC-MS para identificar los metabolitos detectados en los extractos neutros de los matraces con Mycobacterium gilvum VM552 con fuel, en presencia y ausencia de S-200. Nº Tr Ion Fragmento, m/z (%) Identificación 1 15.0 132 (M + ,100), 104 (M + -CO, 86.1), 89 (M + -CH 3 -CO,4.2), 78 (30.9), 51 (17.06) 1-Indanona 1 2 17.2 146 (M + , 94.42), 131 (M + -CH 3 , 4.51),117 (M + -CH 3 -CH 2 , 100),103 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 2 , 10.2),91 (22.09), 77 (9.11), 63 (8.86), 51 (8.18) Metil 1-ndanona 2 3 20.5 158 (M + , 56.17), 141 (M + -OH, 20.68), 129 (M + -CHO, 100), 115 (17.22), 102 (4.06), 98 (1.02) Naftaleno metanol 2 4 20.6 158 (M + ,100), 141 (M + -OH, 31.08), 129 (M + -CHO, 93.24), 115 (M + -CHO-CH 2 , 79.73), 105 (79.73), 91 (50), 77 (36.48) Metil naftol 2 20.9 158 (M + , 87.83), 141 (M + -OH, 28.37), 129 (M + -CHO, 100), 115 (M + -CHO-CH 2 , 55.41), 104 (18.92), 91 (22.98), 77 (21.62) 21.1 158 (M + ,100), 141 (M + -OH, 4.05), 129 (M + -CHO, 32.43), 115 (M + -CHO-CH 2 , 18.92), 102 (4.05), 89 (2.70) 5 22.2 190 (M + , 5.35), 172 (M + -H 2 O, 100), 157 (M + -H 2 O-CH 3 , 35.23), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 32.57), 129 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 , 39.24), 115 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 , 26.05), 104 (2.85) 1,2-dihidroxi 1,2dihidro dimetil naftaleno 3 22.3 190 (M + , 6.56), 172 (M + -H 2 O, 100), 157 (M + -H 2 O-CH 3 , 34.95), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 30.16), 129 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 , 41.4), 115 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 , 25.48), 104 (4.09) 22.3 190 (M + , 19.6), 172 (M + -H 2 O, 100), 157 (M + -H 2 O-CH 3 , 15.69), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 52.94), 129 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 , 26.47), 115 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 , 24.51), 105 (6.86), 91 (10.78), 77 (10.78) 6 22.8 172, (M + ,100 ), 157 (M + -CH 3 , 20.55), 143 (M + -CH 3 -CH 2 , 9.82), 128 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 , 26.84), 115 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 , 12.74), 102 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 -CH, 1.99), 86 (M + -CH 3 -CH 2 - CH 3 -CH 3 -CH-O, 4.46) Dimetil naftol 2 22.8 172 (M + , 100), 157 (M + -CH 3 ,39.1), 141 (M + -CH 3 -O, 12.57), 128 (M + -CH 3 -O-CH, 22.52), 115 (M + -CH 3 -O-CH-CH, 12.69), 103 (1.80), 91 (5.02) 23.0 172 (M + , 100), 157 (M + -CH 3 , 18.43), 143 (M + -CH 3 -CH 2 , 8.30), 128 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 , 25.37), 115 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 , 15.02), 102 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 -CH, 2.80), 86 (M + -CH 3 -CH 2 - CH 3 -CH 3 -CH-O, 4.69) 7 23.3 204 (M + , 7.30), 186 (M + -H2O, 51.13), 171 (M + -H 2 O-CH 3 , 100), 158 (M + -H 2 O-CH 3 -CH, 15.77), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH-CH 3 , 13.30), 128 (M + -H 2 O-CH 3 -CH-CH 3 , 23.87), 115 (17.09) 1,2-dihidroxi 1,2dihidro trimetil naftaleno 3 24.1 204 (M + , 4.85), 186 (M + -H 2 O, 100), 171 (M + -H 2 O-CH 3 57.28), 157 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 7.76), 141 (53.39), 128 (20.38), 115 (33.01) CAPITULO IV: Resultados - 147 - Tabla IV. 2.- Continuación de la tabla IV. 1. Nº Tr Ion Fragmento, m/z (%) Identificación 8 23.7 186 (M + , 100), 168 (M + -H 2 O, 66.72), 157 (70.20), 143 (55.50), 128 (50.75), 115 (54.33) Trimetilnaftol 3 24.2 186 (M + , 46.31), 171 (M + -CH 3 , 100), 153 (M + -CH 3 -H2O, 3.06), 141 (8.66), 128 (M + 12.77), 115 (9.66), 102 (1.83) 9 24.7 196 (M + ,47.97), 181(M + -CH 3 , 100), 165 (M + -CH 3 -O, 31.37), 152 (M + -CH 3 -O-CH, 25.91) Metil fluorenol 3 10 19.1 162 (M + , 100), 147 (M + -CH 3 , 3.9), 134 (M + -CO, 57.7), 119 (31.6), 105 (12.6), 91 (62.9) 2H-1-Benzopira-2ona,3,4-dihidro-6metil 2 11 19.5 160 (M + , 100), 132 (M + -CO, 69.4), 131 (M + -CO-H, 71.0), 104 (21.3), 77 (18.0) 2H-1-Benzopira-2ona,6-metil 2 12 20.2 208 (M + , 13.7), 177 (M + -CH 3 , 100), 149 (M + -COOCH 3 , 5.7), 118 (2.8), 91 (11.5) DME ácido 4-metil-ftálico 1 13 20.9 194 (M + , 31.1), 162 (M + -OCH 3 -H, 100), 134 (M + -OCH 3 - HCO, 77.7), 105 (12.6), 91 (60.2) ME metal ftálico 3 14 21.7 222 (M + , 13.5), 191 (M + -OCH 3 , 100), 163 (M + -COOCH 3 , 4.9), 148 (1.5), 132 (1.9), 120 (1.2), 105 (5.8), 91 (2.7), 77 (4.9) DME ácido 4,5dimetil ftálico 2 15 23.1 220 (M + , 3.6), 189 (M + -O CH 3 , 10.6), 173 (14.5), 161 (M + -COOCH 3 , 100), 145 (7.6), 130 (6.7), 118 (11.0), 115 (6.17), 102 (7.8), 91 (5.7) DME ácido 2carboxicinámico 1 16 23.4 234 (M + , 6.8), 220 (M + - CH 3 , 4.9), 203 (M + -OCH 3 , 3.9), 189 (M + -CH 3 -OCH 3 , 10.7), 175 (M + -COOCH 3 , 100), 161 (M + -CH 2 -COOCH 3 , 32.0), 145 (30.6), 131 (14.6), 118 (8.7), 115 (16.5), 105 (6.8), 91 (16.5) DME ácido metil carboxicinámico 3 17 25.6 270 (M + , 2.7), 239 (M + -O CH 3 , 3.8), 211 (M + -COOCH 3 , 100), 196 (M + -COO CH 3 -CH 3 , 13.4), 180 (M + -COOCHOCH 3 , 13.3), 168 (6.5), 152 (12.4), 139 (10.1) DME ácido difénico 1 18 26.1 248 (M + , 7.7), 234 (M + -CH 3 , 10.2), 217 (M + -OCH 3 , 20.7), 189 (M + -COOCH 3 , 100), 174 (M + -CH 2 -COOCH 3 , 26.0), 161 (M +- CH-COOCH 3 , 7.0), 145 (26.6), 131 (13.1), 115 (42.5), 105 (9.4), 91 (22.5) DME ácido dimetil carboxicinámico 3 La identificación se basó en análisis de estándares auténticos 1 , en el uso de patrones de fragmentación con parecidos superiores al 90% con la librería NIST 2 , o se dedujo de acuerdo al patrón de fragmentación y mediante datos de la literatura 3 . a ME es metil éster, y DME es dimetil éster. CAPITULO IV: Resultados - 148 - IV.1.3. Estudio del reparto del fenantreno desde los NAPLs La transferencia de masa del fenantreno, tomado como HAP modelo, desde el NAPL a la fase acuosa se midió para determinar si el aumento de mineralización causado por el bioestimulante podría explicarse por un aumento del reparto entre ambas fases. Sin embargo, el reparto de fenantreno, elegido como representante de los HAPs del fuel en el NAPL, no se modificó sustancialmente en presencia del bioestimulante (Figura IV.5). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 10 20 30 40 50 60 Horas C (ng/mL) Figura IV. 5.- Reparto de fenantreno desde el fuel/HMN en presencia y ausencia del bioestimulante oleofílico S-200. Los símbolos representan las concentraciones de fenantreno en la fase acuosa sin bioestimulante (●) y con bioestimulante (□). Las líneas continua y discontinua representan, respectivamente, al ajuste experimental de la ecuación 3 (III.6.2) sin y con bioestimulante. Las barras de error indican una desviación estándar de los duplicados. Las tasas de reparto y las concentraciones en el equilibrio en fase acuosa se muestran en la Tabla IV. 3. Las tasas para los procesos abióticos se compararon con las tasas CAPITULO IV: Resultados - 149 - máximas de mineralización. En ausencia de bioestimulante, la tasa de mineralización del fenantreno inicialmente presente en el fuel/HMN no fue significativamente diferente de la que se midió para la tasa de reparto. Esto confirma la consistencia entre las mediciones por HPLC y 14 C en el sistema experimental utilizado. Sin embargo, cuando el bioestimulante estaba presente, la tasa de mineralización máxima fue superior a la tasa de reparto obtenida. Tabla IV. 3.- Efecto del bioestimulante oleofílico S-200 sobre el reparto y mineralización de fenantreno inicialmente presente en NAPL con fuel. Reparto Mineralización NAPL S-200 C eq (ng·mL -1 ) Tasa ( ng·mL -1 ·h -1 ) Tasa ( ng·mL -1 ·h -1 ) Final (%) Días b Fuel/HMN - 1.62 ± 0.006a 0.18 ± 0.002Aa 0.11 ± 0.012Aa 12.64 ± 0.16a 58 + 1.86 ± 0.047a 0.13 ± 0.007Aa 1.13 ± 0.07Bb 42.5 ± 1.96b 58 - c 26.60 ± 9.41 d a 0.70 ± 0.18Aa e 0.14 ± 0.001Ba 8.12 ± 0.54a 35 + c 33.83 ± 1.69 d a 0.77 ± 0.31Aa e 1.67 ± 0.091Bb 32.57 ± 0.94b 35 Fuel/DEHP - 2.30 ± 0.34a 0.30 ± 0.12Aa 0.07 ± 0.002Ba 2.96 ± 1.02a 35 + 3.82 ± 0.38 d a 0.17 ± 0.04Aa e 0.29 ± 0.18Ba 5.54 ± 2.89a 35 a Los valores mostrados son la media ± una desviación estándar. Los valores en una línea seguidos con la misma letra mayúscula no son significativamente diferentes (P = 0.05). Para cada NAPL, los valores en una columna seguidos por la misma letra minúscula no son significativamente diferentes (P = 0.05). Los análisis estadísticos de los datos de reparto se realizaron separadamente mediante tratamientos con y sin Brij 35. b Período de tiempo empleado para las medidas de los experimentos de mineralización. c Tratamientos con Brij 35. d Último valor experimental porque no se alcanzó el equilibrio durante el experimento. e Valores calculados mediante regresión lineal con los 10 primeros puntos (las primeras 24 h). CAPITULO IV: Resultados - 150 - Horas 0 10 20 30 40 0 200 400 600 800 1000 % 14 C Mineralizado Una situación similar se observó cuando añadimos el tensioactivo Brij 35 para aumentar el reparto de fenantreno desde el NAPL (fuel/HMN) hacia la fase acuosa (Tabla IV. 3). En estas condiciones, el bioestimulante oleofílico no tuvo, de nuevo, efecto significativo sobre las tasas de reparto, pero la mineralización de fenantreno se mejoró en su presencia, siguiendo una gráfica en forma de “S” (Figura IV.6) y produciéndose tasas máximas de mineralización superiores a las previstas por reparto abiótico. En ausencia de bioestimulante, la mineralización también fue lineal, pero obteniendo significativamente tasas menores que las tasas de reparto (Tabla IV. 3), lo que sugiere que el reparto excedió el potencial catabólico de los microorganismos. Figura IV. 6.- Efecto del bioestimulante oleofílico (S-200) sobre la mineralización del fenantreno presente en el NAPL (fuel/HMN) por Mycobacterium gilvum VM552 en presencia del tensioactivo Brij 35. Los símbolos representan el % de 14 Cfenantreno mineralizado sin bioestimulante (○) y con bioestimulante (■). Las barras de error representan una desviación estándar de los duplicados. El efecto estimulador del S-200 sobre la mineralización de fenantreno se observó también cuando el HMN fue sustituido por DEHP como medio para fluidizar el NAPL (Tabla IV. 3). La tasa de mineralización fue, en presencia del CAPITULO IV: Resultados - 151 - bioestimulante, inferior a la observada con la mezcla de HMN, pero aún fue el doble de las predicciones de la tasa de reparto. También se realizaron experimentos de mineralización y de reparto con fenantreno disuelto en NAPLs puros (constituidos por un solo componente), con el fin de discriminar los posibles efectos causados por la biodegradabilidad de los NAPLs. Por lo tanto, se determinó la mineralización del fenantreno inicialmente disuelto en un NAPL que podría ser utilizado como fuente de carbono y energía (hexadecano o HD) y dos NAPLs que no fueron degradados por la cepa bacteriana utilizada (HMN y dietilhexilftalato, DEHP). En estas condiciones, las tasas de reparto y las concentraciones en equilibrio medidas en ausencia de bacterias aumentó en el ensayo con HMN y con DEHP, pero no con HD (Tabla IV. 4). La razón exacta de estas diferencias es desconocida, pero puede estar relacionada con el alto valor del log K ow del HD en comparación con los valores de log K ow del HMN y DEHP. No obstante, con independencia del NAPL usado, las curvas de mineralización del fenantreno tuvieron forma de “S” (Figura IV.7). En el inicio de la mineralización del fenantreno presente en HD, se observaron dos fases diferentes. El aumento por el bioestimulante oleofílico fue evidente sólo en la fase inicial de mineralización (hasta 234 h) (Figura IV.7.A), alcanzando la mineralización su valor máximo. La tasa siguiente (hasta 404 h) no fue estadísticamente diferente con y sin la presencia del bioestimulante. En esta gráfica se presentó un período de latencia de 150 horas y un tiempo de duplicación de 71.7 h (µ max = 0.009 h -1 ) en experimentos de crecimiento por separado con HD, posiblemente debido a que la proliferación en HD ocurrió durante la fase de mineralización máxima de fenantreno. CAPITULO IV: Resultados - 152 - Figura IV. 7.- Efecto del bioestimulante oleofílico (S-200) sobre la mineralización de fenantreno presente en hexadecano (A), heptametilnonano (B) y en ftalato de di-2etilhexil (C) por Mycobacterium gilvum VM552. Los símbolos representan % 14 C mineralizados sin bioestimulante (○) y con bioestimulante (■). Las barras de error representan una desviación estándar de los duplicados. 0 10 20 30 0 200 400 600 0 10 20 30 40 50 0 100 200 300 0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 Horas Horas Horas % 14 C Mineralizado % 14 C Mineralizado % 14 C Mineralizado A) B) C) CAPITULO IV: Resultados - 153 - Cuando el fenantreno se suministró en forma de cristales y en las mismas condiciones de crecimiento, M. gilvum no mostró fase de latencia y el tiempo de duplicación fue de 22.7 h (µ max = 0.03 h -1 ). El crecimiento exponencial observado en estos experimentos de crecimiento excluye cualquier limitación nutricional en las condiciones experimentales utilizadas. La mineralización se mejoró también en presencia del bioestimulante oleofílico en los ensayos con fenantreno en HMN y DEHP, pero las diferencias en las tasas se mantuvieron durante toda la fase de mineralización máxima (Tabla IV. 4). En todos los casos, las tasas de mineralización fueron superiores a las tasas de reparto. Todos estos resultados de reparto concordaron con los resultados obtenidos mediante ensayos con polidimetilsiloxano para profundizar en el comportamiento físico-químico del fenantreno en presencia y ausencia del bioestimulante oleofílico. Mediante estos ensayos se obtuvieron resultados de difusión donde omedioacuos medioconS a a 200− no fue superior a 1, indicando ningún efecto de transferencia de masa por difusión del fenantreno en presencia del fertilizante oleofílico, S-200 y su concordancia con los datos obtenidos de la ausencia de un efecto sobre el reparto.