Factores que influyen sobre la producción de hidroxitirosol durante la fermentación alcohólica

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA, TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA PRODUCCIÓN DE HIDROXITIROSOL DURANTE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA Memoria presentada por la graduada INMACULADA REBOLLO ROMERO para optar al grado de doctora por la Universidad de Sevilla Sevilla, junio de 2022 UNIVERSIDAD DE SEVILLA AREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA C/ Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954556761 Fax: 954233765 Dña. SILVIA PICHARDO SÁNCHEZ, Catedrática de Universidad y Directora del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, INFORMA: Que la Tesis Doctoral titulada “FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA PRODUCCIÓN DE HIDROXITIROSOL DURANTE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA”, presentada por la Gda. Dña. INMACULADA REBOLLO ROMERO para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el Área de Nutrición y Bromatología de este Departamento bajo la dirección de la Dra. Ana Belén Cerezo López y la Dra. Mª Carmen García Parrilla, cumpliendo los requisitos exigidos. Y para que así conste, firmo el presente certificado en Sevilla, a 17 de junio de 2022. Fdo. Silvia Pichardo Sánchez Código Seguro De Verificación bY0nLrYWhpCLsb88AwZh5A== Fecha 17/06/2022 Firmado Por SILVIA PICHARDO SANCHEZ Url De Verificación https://pfirma.us.es/verifirma/code/bY0nLrYWhpCLsb88AwZh5A== Página 1/1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL FACULTAD DE FARMACIA C/ Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954556761 Fax: 954233765 Mª CARMEN GARCÍA PARRILLA, Catedrática de Universidad del Área de Nutrición y Bromatología de la Universidad de Sevilla, y ANA BELÉN CEREZO LÓPEZ, Profesora Titular del Área de Nutrición y Bromatología de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: Que la Tesis Doctoral titulada “FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA PRODUCCIÓN DE HIDROXITIROSOL DURANTE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA”, ha sido realizada por la Gda. Dña. INMACULADA REBOLLO ROMERO en el Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal de la Universidad de Sevilla, bajo su dirección y que reúne, a su juicio, las condiciones requeridas para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Y para que conste, firmamos en Sevilla, Junio de 2022 Fdo. Mª Carmen García Parrilla Fdo. Ana Belén Cerezo López Código Seguro De Verificación R6gMh7il52b8ie6Kl0d41Q== Fecha 17/06/2022 Firmado Por ANA BELEN CEREZO LOPEZ MARIA DEL CARMEN GARCIA PARRILLA Url De Verificación https://pfirma.us.es/verifirma/code/R6gMh7il52b8ie6Kl0d41Q== Página 1/1 A mi abuelo Vicente “La audacia de saber sin límite. Es uno de los caracteres más apasionantes de la investigación científica.” Jean-Pierre Changeux AGRADECIMIENTOS Esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo con la financiación de los siguientes proyectos:  Proyecto I+D+i FEDER Andalucía 2014-2020 “Estrategias para incrementar la producción de Hidroxitirosol por levaduras y su potencial aplicación en bebidas fermentadas” otorgado por la Junta de Andalucía (Consejería de Economía y Conocimiento) y la Universidad de Sevilla (Referencia: US-1263469) (Investigadoras principales: María del Carmen García Parrilla y Ana María Troncoso González)  Proyecto PAIDI I+D+i “Empleo de levaduras productoras de hidroxitirosol y derivados como estrategia para la elaboración de vinos con valor añadido” otorgado por la Junta de Andalucía (Consejería de Economía y Conocimiento) (Referencia: P18-RT-3098) (Investigadoras principales: María del Carmen García Parrilla y Ana María Troncoso González)  Proyecto del Plan Estatal 2017-2020 Retos - Proyectos I+D+i “Potencial Bioactivo de Metabolitos Sintetizados por Microorganismos Seleccionados y su Impacto en la Calidad y Seguridad de Bebidas Fermentadas” otorgado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Referencia: PID2019- 108722RB-C32) (Investigadoras principales: María del Carmen García Parrilla y Ana María Troncoso González) Además, esta Tesis ha podido realizarse gracias a las instalaciones del Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD) y de la Universidad Pablo de Olavide, de los Servicios Generales de la Universidad de Sevilla (CITIUS) y del Centro Rancho de la Merced (IFAPA). AGRADECIMIENTOS PERSONALES Primero de todo me gustaría expresar mis agradecimientos a mis directoras de tesis Mª Carmen y Ana Belén. Gracias no solo por vuestra profesionalidad y vuestros consejos sino por haberme acogido desde el primer momento como una más del grupo, mostrándome vuestro cariño, apoyo y paciencia a lo largo de todos estos años. Gracias también a Ana Troncoso por mostrarme su apoyo y estar siempre pendiente de mis avances en las investigaciones aportando su opinión y experiencia. A Edu, tú fuiste mi guía cuando entré en el grupo de investigación. Gran parte de lo que he aprendido en estos años ha sido gracias a ti. Gracias por tu paciencia teniendo que supervisar a una persona, el tiempo vale oro y tú me has regalado mucho. Nunca olvidaré esos días en el laboratorio donde todo era más divertido por tenerte cerca, irradiando esa luz que desprendes y ese buen humor que te caracteriza. También me gustaría mostrar mi agradecimiento a mis compañeros de laboratorio. A Marta, por empezar juntas esta etapa, estar siempre dispuesta a echarme una mano y recibirme siempre que coincidíamos en el laboratorio con esa sonrisa que tanto te representa. A Fernando y a Elena por haberme ayudado en varios momentos de la realización de esta tesis, especialmente en las fermentaciones y a Marina por tu ayuda y compañía en la UPO y en el CITIUS, siempre atenta a prestarme cualquier ayuda. A Rocío, Pilar, Ruth, Cristina, Lourdes y Raquel por aportar un muy buen ambiente de trabajo en el laboratorio y preocuparse siempre por cómo me iba con la realización de la tesis. A Félix, por estar siempre ahí para solucionar mis dudas y echarme una mano. A la Dra. Emma Cantos Villar por su aportación de los diferentes vinos usados en los experimentos, al Dr. Fernando Govantes por permitirme el uso de sus equipos e instalaciones, al Dr. Modesto y a la Dra. Laura Navarro por facilitarme el uso de sus equipos e instalaciones, así como por su asesoramiento en cuanto al uso de diferentes equipos y a las Dras. Rocío Valderrama y Mª Eugenia Soria por enseñarme acerca del análisis de muestras y la espectrometría de masas. A la Dr. Josefa Álvarez por solventar mis dudas con gran profesionalidad y cercanía. A mis amigos Blanca, Felipe, Javi Pérez, Alberto, Javi, Marina, Pilar, Inés y Laura por sus ánimos constantes y su positividad. A mis primos Clara, Elo, Juan y Ángeles, mis tíos y mis suegros por interesarse por mis avances en la realización de la tesis y motivarme. A Fernando, por aparecer en el momento oportuno. Por hacer que la vida sea más bonita. Por respetar mi tiempo disponible para estar juntos. Por aguantar mis malos momentos y sacarme siempre una sonrisa. Por ser mi lugar favorito en el mundo. A mis hermanos Inés y Fernando, por haber soportado estos 5 años de doctorado, no solo los buenos momentos sino aquellos en los que he estado más susceptible. Gracias por vuestra paciencia y vuestro cariño diario. A mis padres, por vuestro apoyo incondicional. Gracias por haber hecho de mí una persona constante, trabajadora y luchadora, que, al caerse varias veces, se levanta y sigue para delante. Como siempre dice mi madre: “lo importante es la constancia”. Gracias por vuestro amor infinito. A mis abuelos, por ser mis ejemplos de vida. A mi abuelo Fernando, por cuidarme desde arriba y a mi abuelo Vicente, por sus incansables ánimos por tener a otro doctor en la familia y por creer en mí más incluso que yo misma. Todos habéis contribuido, en mayor o menor medida, al desarrollo de esta tesis, gracias de corazón. ÍNDICE Resumen ............................................................................................................ 1 Abreviaturas ....................................................................................................... 4 Índice de figuras ................................................................................................. 5 Índice de tablas .................................................................................................. 8 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 10 1.1. Aminoácidos precursores de compuestos bioactivos producidos por microorganismos ........................................................................................... 10 1.2. Compuestos bioactivos derivados de aminoácidos ............................. 12 1.2.1. Triptofol ......................................................................................... 14 1.2.2. Ácido 3-indolacético ...................................................................... 23 1.2.3. Melatonina .................................................................................... 30 1.2.4. Serotonina .................................................................................... 43 1.2.5. Glutatión ....................................................................................... 46 1.2.6. GABA ............................................................................................ 50 1.2.7. Tirosol ........................................................................................... 56 1.2.8. Hidroxitirosol ................................................................................. 66 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS .................................................................. 74 2.1. Justificación ......................................................................................... 74 2.2. Objetivos ............................................................................................. 74 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 76 3.1. Materiales ............................................................................................ 76 3.1.1. Patrones analíticos ....................................................................... 76 3.1.2. Cepas de levaduras ...................................................................... 76 3.1.3. Muestras ....................................................................................... 77 3.1.3.1. Mosto sintético .............................................................................. 77 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Ruta de Ehrlich de los aminoácidos aromáticos ........................................... 13 Figura 2. Estructura química del triptofol ..................................................................... 14 Figura 3. Estructura química del ácido 3-indolacético ................................................. 24 Figura 4. Metabolismo de compuestos indólicos derivados del L-Triptófano ............... 25 Figura 5. Estructura química de la melatonina ............................................................ 30 Figura 6. Rutas de síntesis de la melatonina en animales, plantas, levaduras y la ruta alternativa de síntesis ................................................................................................. 33 Figura 7. Estructura química de la serotonina ............................................................. 44 Figura 8. Estructura química del glutatión ................................................................... 47 Figura 9. Ruta de síntesis del glutatión y sus funciones fisiológicas generales en microorganismos ........................................................................................................ 48 Figura 10. Estructura química del GABA..................................................................... 50 Figura 11. Reacción de formación del GABA ............................................................. 51 Figura 12. Captación y catabolismo de GABA en función del metabolismo del carbono central de la levadura.................................................................................................. 52 Figura 13. Estructura química del tirosol ..................................................................... 56 Figura 14. Ruta de síntesis del tirosol en vinos por el metabolismo de la levadura ..... 59 Figura 15. Estructura química del hidroxitirosol ........................................................... 66 Figura 16. Ruta de síntesis del hidroxitirosol en vinos por el metabolismo de la levadura ...................................................................................................................... 68 Figura 17. Mostos naturales Palomino Fino y Chardonnay durante la fermentación alcohólica .................................................................................................................... 79 Figura 18. Mostos naturales Pedro Ximénez y Tempranillo durante la fermentación alcohólica ................................................................................................................... 79 Figura 19. Elaboración del mosto sintético .................................................................. 84 Figura 20. Fermentación alcohólica de los mostos ..................................................... 87 Figura 21. Esquema del tratamiento de muestras ....................................................... 92 Figura 22. Muestras sometidas al proceso de extracción en fase sólida ..................... 94 5 Figura 23. Evolución de la liberación de CO2 (g/L) durante la fermentación alcohólica. ................................................................................................................. 100 Figura 24. Producción de hidroxitirosol (ng/mL) en mosto sintético ........................... 101 Figura 25. Evolución de la absorbancia durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina .......................................................... 106 Figura 26. Evolución de la concentración de azúcares residuales (g/L) durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina ... 106 Figura 27. Evolución de la concentración de etanol (g/L) durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina .......................... 107 Figura 28. Evolución de la concentración de nitrógeno primario (g/L) durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina .... 108 Figura 29. Evolución de la concentración de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina ............................................................................................... 109 Figura 30. Evolución de la concentración de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio intracelular, durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina .............................................................................................. 110 Figura 31. Evolución de la concentración de tirosina (ng/mL), en el medio extracelular, durante la fermentación alcohólica en mostos sintético con diferentes contenidos de tirosina ..................................................................................................................... 112 Figura 32. Evolución de la concentración de tirosina (ng/mL), en el medio intracelular, durante la fermentación alcohólica en mostos sintético con diferentes contenidos de tirosina ..................................................................................................................... 112 Figura 33. Evolución de la absorbancia durante la fermentación alcohólica en los mostos de uva natural Palomino Fino y Chardonnay ................................................ 114 Figura 34. Evolución de la concentración de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, durante la fermentación alcohólica en los mostos de uva natural Palomino Fino y Chardonnay ................................................................................................... 115 Figura 35. Evolución de la concentración de tirosina (ng/mL), en el medio extracelular, durante la fermentación alcohólica en los mostos de uva natural Palomino Fino y Chardonnay .............................................................................................................. 118 Figura 36. Evolución de la liberación de CO2 (g/L) durante la fermentación alcohólica en el mosto de uva natural Pedro Ximénez.................................................................... 120 6 Figura 37. Evolución de la liberación de CO2 (g/L) durante la fermentación alcohólica en el mosto de uva natural Tempranillo ......................................................................... 121 Figura 38. Evolución de la liberación de CO2 (g/L) durante la fermentación alcohólica en el mosto de uva natural Palomino Fino. .................................................................... 121 Figura 39. Producción de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Tempranillo durante la fermentación alcohólica ...................................... 122 Figura 40. Producción de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Palomino Fino durante la fermentación alcohólica ................................. 123 Figura 41. Producción de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Pedro Ximénez durante la fermentación alcohólica ............................... 124 Figura 42. Producción de tirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Tempranillo durante la fermentación alcohólica ........................................... 125 Figura 43. Producción de tirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Palomino Fino durante la fermentación alcohólica ........................................ 126 Figura 44. Producción de tirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Pedro Ximénez durante la fermentación alcohólica ...................................... 126 7 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Aminoácidos precursores y sus compuestos bioactivos derivados ................ 11 Tabla 2. Concentraciones de los aminoácidos precursores (tirosina, triptófano, glutamato, cisteína y glicina) de compuestos bioactivos en mostos de uva y cerveza… ................................................................................................................... 11 Tabla 3. Condiciones fermentativas para la producción de triptofol............................. 16 Tabla 4. Condiciones fermentativas para la producción de ácido 3-indolacético ......... 26 Tabla 5. Condiciones fermentativas para la producción de melatonina ....................... 35 Tabla 6. Condiciones fermentativas para la producción de serotonina ........................ 44 Tabla 7. Condiciones fermentativas para la producción de glutatión ........................... 48 Tabla 8. Condiciones fermentativas para la producción de GABA .............................. 53 Tabla 9. Concentraciones de tirosol en vinos tintos y blancos .................................... 57 Tabla 10. Condiciones fermentativas para la producción de tirosol ............................. 60 Tabla 11. Concentraciones de hidroxitirosol en vinos tintos y blancos ........................ 67 Tabla 12. Condiciones fermentativas para la producción de hidroxitirosol .................. 69 Tabla 13. Cepas de levaduras empleadas en el Capítulo 1 ........................................ 76 Tabla 14. Reactivos empleados en la elaboración del mosto sintético (MS300) ......... 77 Tabla 15. Modificaciones en el contenido de sulfato de amonio y tirosina del mosto sintético (MS300) utilizado en el Capítulo 2 ................................................................ 78 Tabla 16. Composición del medio de crecimiento para las levaduras ......................... 80 Tabla 17. Medición de CO2 de los mostos de las diferentes experiencias ................... 88 Tabla 18. Medida de etanol......................................................................................... 89 Tabla 19. Medida de los azúcares residuales ............................................................. 90 Tabla 20. Medida del nitrógeno primario ..................................................................... 91 Tabla 21. Toma de muestras de las diferentes experiencias ....................................... 91 Tabla 22. Ion protonado, energía de colisión y tiempo de retención de los compuestos estudiados. ................................................................................................................. 96 Tabla 23. Gradiente de elución I ................................................................................. 96 8 Tabla 24. Gradiente de elución II ................................................................................ 96 Tabla 25. Gradiente de elución III ............................................................................... 97 Tabla 26. Concentraciones de hidroxitirosol en mostos naturales Chardonnay y Palomino Fino ........................................................................................................... 116 Tabla 27. Producción de hidroxitirosol y tirosol durante la fermentación alcohólica del mosto Tempranillo ................................................................................................... 122 Tabla 28. Producción de hidroxitirosol y tirosol durante la fermentación alcohólica del mosto Palomino Fino ................................................................................................ 123 Tabla 29. Producción de hidroxitirosol y tirosol durante la fermentación alcohólica del mosto Pedro Ximénez ............................................................................................... 124 9 1. INTRODUCCIÓN Los compuestos bioactivos se definen como aquellos compuestos fitoquímicos presentes en los alimentos, que son capaces de regular las funciones metabólicas provocando un efecto beneficioso para el organismo humano (Galanakis, 2017). Muchos de ellos son metabolitos secundarios de las plantas, como los compuestos fenólicos (taninos, estilbenos, flavonoides, ácidos fenólicos, etc.), los alcaloides, los carotenoides, los terpenos, etc. (Giardi et al., 2010); (Jamwal et al., 2018); (Isah, 2019). Sin embargo, otros bioactivos son producidos por microorganismos como las levaduras, bacterias y hongos durante procesos como la fermentación. Entre estos compuestos destacan la melatonina, serotonina, ácido 3-indolacético, triptofol, GABA, glutatión, tirosol e hidroxitirosol (HT) (Hornedo-Ortega et al., 2016); (Fernández-Cruz et al., 2016); (Fernández-Cruz et al., 2020); (Guerrini et al., 2018); (Gori et al., 2011); (Tufariello et al., 2019); (Santos-Espinosa et al., 2020). 1.1 AMINOÁCIDOS PRECURSORES DE COMPUESTOS BIOACTIVOS PRODUCIDOS POR MICROORGANISMOS Estos compuestos bioactivos son producidos por microorganismos durante la fermentación a partir de diferentes aminoácidos a través de la ruta de Ehrlich. El L- triptófano es el precursor de la melatonina y de la serotonina (Fernández-Cruz et al., 2017) así como de sus principales metabolitos: el triptofol, el alcohol superior más sintetizado (Kradolfer et al., 1982) y el ácido 3-indolacético, como el ácido superior más presente (Mas et al., 2014). El L-glutamato, la L-cisteína y la glicina (Li et al., 2004) son los precursores del glutatión y el L-glutamato del GABA (Bown & Shelp, 1997). La tirosina es el aminoácido del que derivan el tirosol e HT (Bordiga et al., 2016) (Tabla 1). 10 Tabla 1. Aminoácidos precursores y sus compuestos bioactivos derivados Aminoácido precursor Compuesto bioactivo Nombre sistemático Triptófano Melatonina N-acetil-5-metoxitriptamina Serotonina N-acetil-5-hidroxitriptamina Ácido 3-indolacético ácido indol-3-acético Triptofol indol 3-etanol Tirosina Tirosol 4-(2-hidroxietil)fenol HT 3,4-dihidroxifeniletanol Glutamato GABA ácido 4-aminobutanoico Cisteína Glutatión Ácido (2S)-2-amino-4-{[(1R)-1- [(carboximetil)carbamoil]-2- sulfaniletil]carbamoil}butanoico Glicina Las concentraciones de los aminoácidos precursores (tirosina, triptófano, glutamato, cisteína y glicina) varían dependiendo del tipo de mosto (Tabla 2). En la Tabla 2 se muestra que las concentraciones más elevadas, de todos los aminoácidos, se encuentran en el mosto de cerveza, seguidas de los mostos de vino blanco y por último los mostos tintos, con excepción del aminoácido glicina cuya concentración en los mostos tintos es superior a la de los blancos. Tabla 2. Concentraciones de los aminoácidos precursores (tirosina, triptófano, glutamato, cisteína y glicina) de compuestos bioactivos en mostos de uva y cerveza Variedad Tirosina (mg/L) Triptófano (mg/L) Glutamato (mg/L) Cisteína (mg/L) Glicina (mg/L) Tipo de Uva Referencia Mosto de cerveza 161.95 ± 2.69 96.99 ± 2.85 152.68 ± 3.62 - - - Lei et al., 2013 - 10658 - - - Fernández- Cruz et al., 2020 Cabernet Sauvignon 10.47 ± 0.38 7.26 ± 0.13 43.00 ± 0.18 1.51 ± 0.10 173.75 ± 3.82 Tinta Wang et al., 2014 10.21 ± 0.28 5.99 ± 0.15 38.91 ± 0.85 2.05 ± 0.03 143.83 ± 2.40 Syrah 0.62 ± 0.03 - - - - Tinta Rodríguez- Naranjo et al., 2013 Merlot n.d. - - - - Tempranillo 0.46 ± 0.02 - - - - Tintilla de Rota 0.34 ± 0.05 - - - - Palomino Fino n.d. - - - - Blanca Tempranillo - ≈ 3.5 - - - Tinta Fernández- Cruz et al., 2018 Corredera - ≈ 0.4 - - - Blanca Sauvignon Blanc - ≈ 1 - - - Vijiriega - ≈ 0.8 - - - Sauvignon Blanc 6.0 50.1 79.1 7.6 4.5 Blanca Burin et al., 2015 Vermentino 5.6 32.0 118.1 2.9 5.9 Viogner 11.2 78.2 88.4 8.5 7.2 11 Estos aminoácidos precursores disminuyen durante la FA (Crepin et al., 2012); (Mas et al., 2014b); (Wang et al., 2014); (Hernández-Orte, et al., 2002) para la formación de sus compuestos bioactivos correspondientes (Mas et al., 2014b), llegando incluso a consumirse al final de la fermentación (Lei et al., 2013). Concretamente, Hernández- Orte et al., (2002) observaron que, en vinos blancos de la variedad Airen, el nivel de aminoácidos disminuyó durante la fermentación alrededor de un 60%, con excepción de la tirosina que disminuyó aproximadamente un 80%, la cisteína que fue totalmente consumida y la glicina que aumentó al ser excretada por las levaduras al final de la FA. Por otro lado, en el estudio de Lei et al., (2013), al final de la FA de cerveza, la levadura consumió un 79% de glutamato, un 30% de tirosina y un 31% de triptófano. 1.2 COMPUESTOS BIOACTIVOS DERIVADOS DE AMINOÁCIDOS Las levaduras llevan a cabo la FA obteniéndose bebidas fermentadas como el vino y la cerveza, así como otros productos como el pan (Maicas, 2020). Para que las levaduras puedan realizar la FA, necesitan nitrógeno asimilable (YAN) (Jiranek et al., 1995), siendo las dos principales fuentes de YAN el amonio y los aminoácidos (Beltran et al., 2004). El YAN está compuesto de nitrógeno procedente del amonio y principalmente de los alfa-aminoácidos (aminoácidos libres excepto la prolina). Las levaduras del vino son capaces de metabolizar más de 20 sustancias como fuentes únicas de nitrógeno para su crecimiento. No obstante, las levaduras prefieren algunas fuentes de nitrógeno sobre otras bajo condiciones de FA (Tesnière et al., 2015). El amonio es la fuente preferida de las levaduras frente a los aminoácidos y entre los aminoácidos, el glutamato y la asparragina se consideran fuentes de nitrógeno buenas o preferidas (Tesnière et al., 2015). Sin embargo, los aminoácidos arómaticos como el triptófano y la tirosina resultan de gran importancia debido a que, a partir de ellos se generan ciertos compuestos bioactivos. Estos compuestos con propiedades bioactivas (triptofol, ácido 3-indolacético, melatonina, serotonina, GABA, glutatión, tirosol e HT) son sintetizados por las levaduras, durante la FA, a través de varias rutas. Los alcoholes superiores son formados durante la fermentación, a partir de los ceto ácidos. Estos ceto ácidos son producidos a través de una de las dos rutas siguientes:  La ruta catabólica, que implica la degradación de los amino ácidos presentes en la fermentación a través de la ruta de Ehrlich (Hazelwood et al., 2008). 12  La ruta anabólica de biosíntesis de los aminoácidos a partir de la fuente de carbono (azúcares) (Hammond, 1993). En levaduras S. cerevisiae, la principal ruta es la de Erhlich de los aminoácidos aromáticos (Hazelwood et al., 2008) (Figura 1). Figura 1. Ruta de Ehrlich de los aminoácidos aromáticos (Mas et al., 2014) Estos compuestos bioactivos, derivados de aminoácidos, son de especial interés ya que poseen propiedades beneficiosas para la salud como actividad antioxidante (Kim et al., 2017); (Bonnefont-Rousselot & Collin, 2010); (Mercolini et al., 2012); (Pastore et al., 2003); (Fernández-Mar et al., 2012); (Fki, et al., 2005), antimicrobiana (Gañan et al., 2009), (Cueva et al., 2012); (Bisignano et al., 2010), neuroprotectora (St-Laurent- Thibault et al., 2011) y cardioprotectora (Samson Mathews et al., 2008), entre otras. Es por ello, que resulta de gran utilidad la investigación de estrategias que permitan incrementar la síntesis de estos compuestos en bebidas fermentadas como el vino. En la bibliografía no se recogen estudios que se hayan centrado en la modulación de los parámetros de fermentación que conducen a una mayor síntesis de estos compuestos bioactivos. Sin embargo, algunos ensayos indican las condiciones de 13 fermentación y la consecuente concentración de estos compuestos en el producto final (Guerrini et al., 2018); (Romboli et al., 2015); (Wang et al., 2014); (Fernández-Cruz et al., 2016). A continuación, se detallan las condiciones fermentativas para la síntesis de estos compuestos bioactivos descritas en la bibliografía. 1.2.1. TRIPTOFOL El triptofol es un alcohol superior (Mas et al., 2014a) que regula la morfogénesis durante la falta de nitrógeno y actúa como molécula Quorum-Sensing (QS) (Avbelj et al., 2016); (Wuster & Babu, 2009) que estimula el crecimiento pseudohifal en S. cerevisiae (Chen & Fink, 2006). Concretamente, al ser una molécula QS bajo condiciones bajas de nitrógeno (Hazelwood et al., 2008); (Wuster & Babu, 2009) promueve el cambio de las células a la fase estacionaria y regula la inducción de la formación de pseudohifas y el crecimiento invasivo, según la densidad celular local (Wuster & Babu, 2009); (Sprague & Winans, 2006); (Chen & Fink, 2006); (Hogan, 2006); (Leeder et al., 2011). Figura 2. Estructura química del triptofol Asimismo, este compuesto podría influir en las propiedades de la sensación en boca de las bebidas fermentadas ya que ha sido asociado con el sabor amargo en vino y cerveza (Gawel et al., 2018); (Szlavko et al., 1973). Igualmente, se ha demostrado que el triptofol induce sueño en ratones (Cornford et al., 1981), aunque esta acción podría ser debido al análogo funcional o precursor de la serotonina o de la melatonina (Mas et al., 2014). El triptofol es el principal alcohol superior a partir del triptófano y sus concentraciones elevadas en vino son bastante conocidas, las cuales se encuentran aproximadamente 14 S. cerevisiae QA23, la inoculación secuencial con T. delbrueckii y QA23 y la inoculación secuencial con T. delbrueckii y RF. Por otro lado, la concentración más baja de este compuesto con la cepa S.cerevisiae Aroma White apareció en el mosto de uva Vijiriega (Fernández-Cruz et al., 2018). Sin embargo, la concentración inicial de triptofol en este mosto de Tempranillo fue baja (4.9 ng/mL), comparado con el nivel (123 ng/mL) determinado para el mosto de uva Monastrell (Bordiga et al., 2016). Otros factores que han demostrado influir en la producción de triptofol son el pH (Ghosh et al., 2008); (Gori et al., 2011), la agitación (Zupán et al., 2013), la densidad celular de los cultivos (Gori et al., 2011); (González et al., 2018), la temperatura de fermentación (Bordiga et al., 2016); (Simat et al., 2004), la concentración de glucosa de los mostos (González et al., 2018), si la cosecha es temprana o tardía (Simat et al., 2004) , si son zumos o purés elaborados a partir de las uvas (Simat et al., 2004) y la suplementación con nutrientes (Simat et al., 2004). Gori et al., (2011) manifiestan que la producción de triptofol (161.2-322.4 ng/mL) fue ante todo determinada desde el final de la fase exponencial indicando una conexión con la densidad celular. Además, declaran que cultivos con una alta densidad celular parecieron producir unas concentraciones superiores de alcoholes moléculas QS en comparación con cultivos con una baja densidad celular. Opinan que eso sugiere que el alcohol aromático, triptofol, es una potencial molécula QS en la levadura Debaryomyces hansenii como se encontró previamente para S. cerevisiae (Chen & Fink, 2006). Bordiga et al., (2016) mantienen que el factor temperatura afectó a todos los pasos del muestreo de manera significativa. Específicamente, el mosto que resultó en la mayor (≈ 12500 ng/mL) concentración de triptofol fue fermentado a 22ºC en comparación con la temperatura de fermentación de 16ºC (≈ 8000 ng/mL). Por otro lado, Simat et al., (2004) mostraron que las mayores concentraciones de triptofol (≈ 3000 ng/mL) tuvieron lugar en la mayoría de las fermentaciones de uvas Muller Thurgau, cosechadas tardíamente, a las temperaturas más elevadas (22-24ºC) en comparación con las temperaturas de 12-14ºC (≈ 1000 ng/mL). El grado de alcohol no pareció influir en la producción de triptofol ya que, tanto el vino que dio lugar a la mayor concentración de triptofol como el que dio lugar a la menor concentración poseían 15º de alcohol en comparación con la graduación alcohólica de 12º (Bordiga et al., 2016). De acorde con González et al., (2018) la limitación en glucosa generalmente inhibe la producción de alcoholes aromáticos por lo que elaboraron un mosto sintético bajo en 21 glucosa para evaluar el efecto en la producción de triptofol. Específicamente, después de 5 días de fermentación, las concentraciones de triptofol fueron desde cercana a 0 ng/mL en el mosto bajo en glucosa (20 g/L de glucosa y 0 g/L de fructosa) a aproximadamente 35464 ng/mL con la levadura M. pulcherrima Mpp en el mosto bajo en glucosa suplementado 5 veces en aminoácidos aromáticos (50 µg/mL de tirosina, triptófano y fenilalanina) (González, et al., 2018). Estos autores justifican esta baja producción de triptofol en el mosto bajo en glucosa con varias explicaciones: 1. La primera es que esta baja producción puede estar relacionada con la baja densidad celular (el valor de DO 600nm en el mosto bajo en glucosa fue de 4.80 ± 0.37 vs. 11.47 ± 1.32 en el mosto estándar). Además, mantienen que las células a una baja densidad requieren de menor síntesis de proteínas, lo cual puede explicar porque las células consumen menos aminoácidos aromáticos. Estudios recientes han reforzado esta teoría ya que han asociado la producción de estos alcoholes (feniletanol, triptofol y tirosol) con la densidad celular, sugiriendo que una alta densidad poblacional estimula la síntesis de alcoholes aromáticos (Avbelj et al., 2015); (Chen & Fink, 2006); (Sprague & Winans, 2006); (Wuster & Babu, 2009). 2. La segunda explicación a la baja producción de triptofol en el mosto bajo en glucosa es que el rápido agotamiento de la glucosa en el mosto bajo en glucosa puede ser también responsable de las bajas cantidades de alcoholes aromáticos producidos (Espinosa Vidal et al., 2015). 3. La tercera explicación es que las diferencias en el metabolismo respirofermentativo puede ser, en parte, responsable de esta baja acumulación (González et al., 2018). En consecuencia, el periodo de maduración de la uva también parece influir en la concentración de triptofol en el producto fermentado. En concreto, la fermentación de uvas Muller Thurgau cosechadas tardíamente (4/10/2000) obtuvo mayor concentración de este compuesto (≈ 3000 ng/mL) comparado con la que tuvo lugar en la cosecha temprana (≈ 1000 ng/mL) (12/09/2000) (Simat et al., 2004). 1.2.1.3. Propiedades bioactivas del triptofol Los alcoholes aromáticos como el triptofol pueden actuar como antioxidantes y antimicrobianos (Gañan et al., 2009); (Cueva et al., 2012). En concreto, el triptofol muestra propiedades antimicrobianas contra bacterias patógenas como Moraxella 22 catarrhalis y Pseudomonas Aeruginosa PAO1. Las concentraciones a las que se desmostró su efecto bioactivo fueron de 137 μg/mL en el caso de la primera bacteria patógena y de 639 μg/mL en el caso de la segunda (Cueva et al., 2012). También el triptofol mostró propiedades antimicrobianas contra Campylobacter jejuni, el patógeno bacteriano más común en todo el mundo transmitido por los alimentos. Concretamente, este efecto bioactivo se observó con concentraciones superiores a los 100 mg/L (Gañan et al., 2009). Además, este compuesto posee un efecto inhibitorio sobre la formación de fibras amiloides, la cual está asociada con una serie de patologías neuronales conocidas como trastornos amiloides (Morshedi et al., 2007). Los depósitos amiloides se encuentran asociados con patologías crónicas neuronales y sistémicas, incluyendo el Alzheimer el Parkinson y la enfermedad de Huntington, la encefalopatía espongiforme transmisible y la diabetes tipo II (Bajic & Spremo‐Potparevic, 2011); (Pepys et al., 2001); (Chiti & Dobson, 2006). 1.2.2. ÁCIDO 3-INDOLACÉTICO El ácido 3-indolacético es una de las fitohormonas de la familia de las auxinas más estudiadas (Mas et al., 2014ª); (Simon & Petrášek, 2011) que, en plantas, regula varios procesos de desarrollo y fisiológicos (Teale et al., 2006) así como incrementa la protección de las mismas al estrés externo (Bianco & Defez, 2009). Igualmente, el ácido 3-indolacético actua como agente regulador de la diferenciación celular microbiana (Rao et al., 2010). A su vez, este compuesto es sintetizado por levaduras a partir de su aminoácido aromático precursor el triptófano durante la fermentación alcohólica de bebidas fermentadas (Žulj et al., 2016); (Fernández-Cruz et al., 2020). Además, es considerado como precursor de 2-aminoacetofenona, un off-flavor que en concentraciones elevadas está relacionada con la percepción organoléptica del defecto comúnmente conocido envejecimiento atípico en vinos (Nardin et al., 2022). Este compuesto es conocido por tener actividad bioactiva, concretamente se han comprobado sus efectos antioxidantes (Kim et al., 2017), anti-angiogénicos (Cerezo et al., 2017), antiproliferativos (Sze et al., 1993) y pro-apoptóticos (Dalmazzo et al., 2011). 23 Figura 3. Estructura química del ácido 3-indolacético Igualmente, el ácido 3-indolacético actua como agente regulador de la diferenciación celular microbiana (Rao et al., 2010). El ácido 3-indolacético está presente en bebidas fermentadas como el vino cuyo rango de concentraciones se sitúa entre 13.08 ng/mL y 35.83 ng/mL, de acuerdo con Žulj et al., (2016). 1.2.2.1. Ruta de síntesis En levaduras el ácido 3-indolacético sigue la misma ruta de síntesis que el triptofol. Se obtiene a partir del aminoácido triptófano y después de las siguientes reacciones: transaminación del triptófano, descarboxilación del indol-3-piruvato y reducción del acetaldehido-3-indol (Hazelwood et al., 2008); (Satoh et al., 2012); (Mas et al., 2014) (Figura 4). 24 Figura 4. Metabolismo de compuestos indólicos derivados del L-Triptófano (Fernández-Cruz et al., 2017) 25 1.2.2.2. Condiciones fermentativas para la producción de ácido 3-indolacético Tabla 4. Condiciones fermentativas para la producción de ácido 3-indolacético Muestra Microorganismo Tª (ºC) Azúcares Tiempo Concentración de ácido 3- indolacético Referencia Fructosa Glucosa Mostos sintéticos fermentados T. delbrueckii TD291 28 100 g/L 100 g/L 1 de 7 días ≈ 500 ng/mL Fernández- Cruz et al., 2017 S. cerevisiae QA23 ≈ 75 ng/mL S. cerevisiae y Aroma White 28 100 g/L 100 g/L 1 de 7 días 83.81 ± 1.86 ng/mL Fernández- Cruz et al., 2016 0 de 7 días 0.75 ± 0.04 ng/mL Mosto de cerveza fermentado S. cerevisiae Diamond 16 - 3 de 7 días ≈ 35 ng/mL Fernández- Cruz et al., 2020 S. cerevisiae Abbaye 22 2 de 7 días ≈ 23 ng/mL Vino Tempranillo S. cerevisiae RF 16- 18 - 2 de 14 días > 30 ng/mL Fernández- Cruz et al., 2018 Vino Chardonnay S. cerevisiae Aroma White 18 - 1.5 de 14 días ≈ 8 ng/mL Zumo de uva de Muller Thurgau fermentado (cosecha temprana) K. apiculata 24 170 g/L Mitad-final de la FA ≈ 170 ng/mL Simat et al., 2004 Zumo de uva de Muller Thurgau fermentado (cosecha temprana) S. cerevisiae Uvaferm CM 14 166 g/L Inicio-mitad de la FA ≈ 60 ng/mL Mosto sintético fermentado T. delbrueckkii Tdp 28 100 g/L 100 g/L Fermentación finalizada 22.63 ± 5.44 ng/108 células (intracelular) Fernández- Cruz et al., 2019 S. cerevisiae QA23 3.31 ± 0.27 ng/108 células (intracelular) Fernández-Cruz et al., (2017) manifiestan que el ácido 3-indolacético fue uno de los metabolitos más sintetizados. Las levaduras analizadas en diferentes estudios fueron: T. delbrueckii TD291 (≈ 500 ng/mL), S. cerevisiae ES488 (≈ 400 ng/mL), S. cerevisiae ICV GRE (≈ 300 ng/mL), S. cerevisiae Uvaferm BC (≈ 280 ng/mL), S. cerevisiae Red Fuit (≈ 220 ng/mL), M. pulcherrima Flavia MP346 (≈ 120 ng/mL) y S. cerevisiae QA23 (≈ 75 ng/mL) (Fernández-Cruz et al., 2017); S. cerevisiae Diamond (≈ 35 ng/mL) y S. cerevisiae SafLager (≈ 30 ng/mL) (temperatura de fermentación de 16ºC), S. cerevisiae 26 SafAle (≈ 30 ng/mL) y S. cerevisiae Abbaye (23 ng/mL) (temperatura de fermentación de 22ºC) (Fernández-Cruz et al., 2020). Las máximas concentraciones de este compuesto (≈ 500 ng/mL y 83.81 ± 1.86 ng/mL), en mosto sintético, se observaron al inicio de la FA (día 1 de 7 días) (Fernández-Cruz et al., 2017); (Fernández-Cruz et al., 2016) (Tabla 4). Fernández-Cruz et al., (2017) declaran que la aparición de la maxíma concentración de ácido 3-indolacético al inicio de la fermentación está relacionado con la disminución del L-Triptófano en el medio ya que el ácido 3-indolacético deriva del L-Triptófano. En el estudio de Fernández-Cruz et al., (2017) a partir de este pico máximo, la concentración disminuyó progresivamente hasta el final de la FA. De manera similar, Fernández-Cruz et al., (2016) observaron un aumentó significativo en el día 1 y a partir de ahí disminuyó hasta el día 6, no siendo detectado en el día 7. Ese aumento significativo en el día 1 demuestra que las levaduras sintetizaron el ácido 3-indolacético durante la fermentación. De hecho, el ácido 3- indolacético se ha identificado en el medio intracelular en mosto sintético fermentados con la levadura T. delbrueckii Tdp (22.63 ± 5.44 ng/108 células), S. cerevisiae P24 (6.98 ± 0.88 ng/108 células), H. uvarum Hu4 (4.34 ± 2.73 ng/108 células) y S. cerevisiae QA23 (3.31 ± 0.27 ng/108 células). La concentración de este compuesto disminuyó ligeramente del inicio de la fase exponencial a la mitad de la misma y luego aumentó hasta alcanzar la máxima concentración ya finalizada la fermentación (22.63 ± 5.44 ng/108 células). La concentración intracelular más baja también apareció ya finalizada la fermentación (3.31 ± 0.27 ng/108 células) (Fernandez-Cruz et al., 2019). Fernández-Cruz et al., (2017) hipotetizan que su disminución en el mosto durante la fermentación puede estar causada por la conjugación del ácido 3-indolacético con otras estructuras como aminoácidos y restos de azúcares (Hoenicke et al., 2001), ésteres y amidas (Sitbon et al., 1993), así como con el fallo de las levaduras para usar el L- Triptófano en las últimas etapas de la fermentación (Fernández-Cruz et al., 2017). Sitbon et al., (1993) y Hoenicke et al., (2001) resaltaron que el ácido 3-indolacético puede estar conjugado con otros compuestos para proteger la molécula de la oxidación, mostrando una disminución del compuesto libre en los siguientes días (Sitbon et al., 1993); (Hoenicke et al., 2001), lo cual es apoyado por los datos del estudio de Fernández-Cruz et al., (2016) y Fernández-Cruz et al., (2017). En el mosto de uva natural tuvieron lugar tendencias similares ya que también se encontró la máxima concentración al inicio de la fermentación. Específicamente, en el día 1 la concentración de ácido 3-indolacético fue muy baja, en el mosto de uva Tempranillo, con la levadura RF, alcanzando en el día posterior (día 2 de 14 días) la 27 máxima concentración (> 30 ng/mL) y bajando posteriormente hasta el final de la fermentación Fernández-Cruz et al., (2018) sostienen que el notable incremento de ácido 3-indolacético durante las primeras etapas de la fermentación en los mostos de uva blancos indica que la producción es debida al metabolismo de la levadura. Varios autores coinciden en que la aparición de este compuesto es dependiente del L- Triptófano (Contreras et al., 2015) (Nutaratat et al., 2016). Sin embargo, Fernández-Cruz et al. (2018) no se ha encontrado esta relación en su estudio. Simat et al., (2004) examinaron que la concentración máxima de ácido 3-indolacético (≈ 170 ng/mL), en zumos de uvas, apareció tras el inicio de la fermentación. Esta máxima concentración fue superior a las observadas en las etapas de inicio de la fermentación, mitad, final de la fermentación y después de la adición de sulfuroso. Por otro lado, la concentración más baja (≈ 60 ng/mL) apareció tras el inicio de la fermentación (Simat et al., 2004). La variedad de uva es un factor que influyó en la producción de ácido 3- indolacético ya que, con la cepa de levadura S. cerevisiae Aroma White, se obtuvieron diferentes concentraciones en diferentes vinos: Vijiriega (> 20 ng/mL), Moscatel (> 20 ng/mL), Corredera (≈ 17 ng/mL), Palomino Fino (≈ 15 ng/mL), Sauvignon Blanc (≈ 10 ng/mL) y Chardonnay (≈ 8 ng/mL) (Fernández-Cruz et al., 2018). La combinación de cepa de levadura y variedad de uva puede ser relevanteen la síntesis del ácido 3- indolacético (Fernández-Cruz et al., 2018). Fernández-Cruz et al., (2018) declaran que en el mosto sintético fermentado por la levadura S. cerevisiae Aroma White se observó un aumento inicial del compuesto y luego una disminución de la concentración, desde 83.8 ng/mL en el día 1 a < 0.9 ng/mL al final de la FA (Fernández-Cruz et al., 2016). En contraste, estos autores sostienen que Corredera y Palomino Fino presentaron una concentración de 3-indolacético de 16.5 y 14.8 ng/mL, respectivamente, al final de la FA la cual fue significativamente superior a aquella previa a la fermentación (Fernández- Cruz et al., 2018). Igualmente, en un estudio sobre la fermentación de mosto de uva Riesling con cuatro levaduras comerciales (Uvaferm CEG, Lalvin Cross, Anchor VIN y Anchor Exotics SPH), Žulj et al., (2016) observaron un aumento del ácido 3-indolacético durante la FA de 10–35 ng/mL, pero la concentración no disminuyó al final de la fermentación (Žulj et al., 2016). Otro de los factores que influye sobre la producción del ácido 3-indolacético es la temperatura de fermentación. Simat et al., (2004) mostraron que en uvas cosechadas tempranamente (12/09/2000) la mayor concentración de ácido 3-indolacético tuvo lugar cuando la temperatura de fermentación fue de 24ºC comparada con la fermentación a 14ºC, mostrando que la temperatura influye sobre la producción de ácido 3-indolacético. 28 Por otro lado, la concentración de ácido 3-indolacético, en el mosto de cerveza, sigue una tendencia similar a la fermentación del mósto de uva. En el estudio de Fernández- Cruz et al. (2020) el ácido 3-indolacético alcanzó su máxima concentración a mitad de la fermentación (día 3 de 7 días). Esta concentración más elevada fue aproximadamente de 35 ng/mL. Posteriormente, disminuyó progresivamente hasta el final de la fermentación. Según Fernández-Cruz et al., (2020) la disminución del ácido 3- indolacético durante la FA puede estar causada por su unión a aminoácidos o péptidos que las levaduras usan para su metabolismo después de la conveniente hidrólisis intracelular (Simat et al., 2004). 1.2.2.3. Propiedades bioactivas del ácido 3-indolacético El ácido 3-indolacético es conocido por mejorar la proliferación celular así como por poseer propiedades antioxidantes (Kim et al., 2017). Concretamente, en el estudio de Kim et al., (2017) se verificó que la citotoxicidad inducida por H2O2 en las células madre de la pulpa dental en humanos fue atenuada después del tratamiento con ácido 3- indolacético. Este efecto bioactivo se comprobó con una concentración de alrededor de 150 μM (Kim et al., 2017). También, este compuesto posee efecto anti-angiogénico ya que inhibe la activación del receptor 2 de VEGF (VEGFR-2), inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular, y la posterior angiogénesis. Esto se comprobó en células endoteliales de cordón umbilical humano con un IC50 de 0.9704 mM y un 54% de inhibición a 1 mM (Cerezo et al., 2017). Además, posee efectos antiproliferativos y pro-apoptóticos en las células endoteliales y tumorales (Sze et al., 1993); (Dalmazzo et al., 2011). Específicamente, este compuesto ha sido propuesto como una terapia anticáncer ya que induce apoptosis en las siguientes condiciones: i), en co-tratamiento con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante, en dos líneas de tumores hematológicos y en células de pacientes con leucemia mieloide aguda y pacientes con leucemia linfocítica crónica (Dalmazzo et al., 2011); ii) en co-tratamiento con peroxidasa de rábano picante en células de carcinoma de vejiga (Greco et al., 2002); iii) irradiado con ultravioleta B en células de cáncer de próstata (Kim et al., 2010); iv) en co-tratamiento con peroxidasa de rábano picante en células de melanoma humano (Kim et al., 2004); y v) en cotratamiento con la citoquina orto-metoxitopolina-ribósido en células Hela (Zhao et al., 2015). Las concentraciones a las cuales se observaron estos efectos fueron las siguientes: 10 mM (Dalmazzo et al., 2011), 3 mM (Greco et al., 2002), 500 μM (Kim et al., 2010); (Kim et al., 2004) y 1 mM (Zhao et al., 2015). 29 1.2.3. MELATONINA La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) es una indolamina que está formada por un anillo indólico y cuyos grupos funcionales principales son: un grupo acetil-amida en posición 2 y un grupo metoxi en posición 5 (Sánchez-Hidalgo et al., 2012). Originalmente, se consideró un producto exclusivo de la glándula pineal de los vertebrados, de hecho, se considera una neurohormona (Mas et al., 2014b); (Tan et al., 2012). Sin embargo, en las ultimas dos décadas la melatonina se ha identificado en un amplio rango de invertebrados, plantas, cerveza, vino, etc. (Dubbels et al., 1995); (Maldonado et al., 2009); (Rodríguez-Naranjo et al., 2011); (Vigentini et al., 2015); (Hornedo-Ortega et al., 2016). Por tanto, hoy día es considerada una molecula ubiqua presente en la mayoría de los organismos vivos (Mas et al., 2014b). Su principal función en humanos es es la de regular los ritmos circadianos y estacionales (Stege et al., 2010); (Morera & Abreu, 2006); (Reiter, 1993); (Reiter et al., 2014) como el ciclo de vigilia/sueño (Iriti & Varoni, 2015) por lo que también se utiliza como complemento alimenticio o incluso como medicamento (a dosis superiores a 2 mg) para mitigar los desórdenes del sueño (Reiter, 1993). Figura 5. Estructura química de la melatonina La Comisión Europea ha autorizado dos declaraciones de propiedades saludables para la melatonina basadas en las opiniones científicas de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) en relación con su contribución al alivio de sensaciones subjetivas de la descompensación horaria (jet lag) (dosis diaria mínima de 0.5 mg) y la reducción de la latencia de inicio del sueño (dosis diaria de 1 mg) (EFSA, 2010); (EFSA, 2011). La síntesis de melatonina por levaduras ha sido demostrada en varios estudios identificándose en el compartimento intracelular de varias levaduras: S. cerevisiae QA23 30 la primera parte de la fase de crecimiento (0-4 h) puede ser de alguna manera crucial para la levadura ya que solo las moléculas esenciales fueron formadas mientras que la levadura se estaba adaptando a las condiciones en el nuevo medio. En esta fase temprana, la melatonina no fue sintetizada. Después de 8 h, la melatonina ya no aumentó. Posteriormente, cuando la maquinaria metabólica estaba trabajando para soportar el crecimiento exponencial de la levadura, la acumulación de la melatonina fue bastante constante. Luego, en la fase estacionaria, la síntesis de melatonina por las células fue mayor y su concentración alcanzó un pico a las 26 h. Finalmente, en la fase de declive los niveles de melatonina disminuyeron (Rodríguez-Naranjo et al., 2012). En el medio intracelular la melatonina también siguió una tendencia en zig-zag. Las mayores concentraciones (1.38 ng/mL y 0.93 ± 1.11 ng/108 células), en el mosto sintético, también tuvieron lugar al inicio de la FA (Morcillo-Parra et al., 2019) y al inicio de la fase exponencial (Fernández et al., 2019). Por otro lado, las menores concentraciones (≈ 0.2 ng/mL y 0.66 ± 0.43 ng/108 células) se encontraron al inicio de la FA (Morcillo-Parra et al., 2019) y a mitad de la fase exponencial (Fernández-Cruz et al., 2019). Fernández-Cruz et al., (2019) sugieren que las diferencias observadas en la síntesis intracelular de melatonina pueden ser determinadas por la conocida capacidad diferencial en la absorción de carbono y fuentes de nitrógeno de los mostos de uva entre Saccharomyces y no-Saccharomyces (Curiel et al., 2017). Mantienen que recientemente, González et al., (2018) han informado de que la ruta de Ehrlich es igualmente activa en las levaduras no-Saccharomyces que producen alcoholes aromáticos durante la FA, aunque su regulación parece ser algo diferente de las S. cerevisiae (González et al., 2018). Al igual que en el mosto sintético, en el mosto de uva natural la melatonina también tuvo una tendencia en zig-zag y tuvo lugar la mayor concentración (≈ 0.8 ng/mL) al inicio de la FA (Fernández-Cruz et al., 2018), en Vino Moscatel. Por otro lado, la mínima concentración (≈ 0.15 ng/mL) fue también al inicio de la fermentación, en el vino Sauvignon Blanc (Fernández-Cruz et al., 2018). En los estudios de Rodríguez-Naranjo et al., (2011) y Rodríguez-Naranjo et al., (2013) las mayores concentraciones (423.0 ± 1.60 ng/mL y 18 ng/mL) tuvieron lugar en la etapa de trasvasado del vino en comparación con el mosto inicial, la etapa de prensado y la etapa de dejuice en los vinos blancos (Rodríguez-Naranjo et al., 2011) y en comparación con la etapa 1 de cosecha, la etapa 2 de densidad de 1020 g/L (FA), la etapa 3 de 37 prensado y la etapa 5 de estabilización (almacenamiento) (Rodríguez-Naranjo et al., 2013). Por otro lado, las menores concentraciones (74.13 ± 2.65 ng/mL y ≈ 0.2 ng/mL) tuvieron lugar en la etapa de prensado del vino (Rodríguez-Naranjo et al., 2011) y en la etapa de estabilización (Rodríguez-Naranjo et al., 2013). En este caso, la concentración aumentó hasta alcanzar su máximo en la etapa 4 y a partir de ahí disminuyó hasta la etapa 5 (Rodríguez-Naranjo et al., 2013). En el mosto de cerveza fermentado, la melatonina solo apareció, en el medio extracelular, al inicio de la FA, cuya concentración fue de 0.22 ng/mL (Fernández-Cruz et al., 2020). Por otro lado, en el medio intracelular, la melatonina siguió un patrón en zig-zag y tanto la máxima (≈ 0.08 ng/109 células) como la mínima concentración (≈ 0.02 ng/109 células) aparecieron a mitad de la fermentación con las levaduras S. cerevisiae Saflager y S. cerevisiae SafAle, respectivamente (Fernández-Cruz et al., 2020). Según Morcillo-Parra et al., (2019) la melatonina fue producida intracelularmente en la fase de latencia del crecimiento de la levadura y fue exportada al medio extracelular durante la fase estacionaria. Declaran que, dada la diferencia entre la producción intracelular y la detección extracelular de la melatonina, una posible interacción con algunas moléculas dentro de la célula, como proteínas, podría ser responsable de esta diferencia en la secreción de melatonina. Manifiestan que esta interacción podría ser parte de su transporte al medio extracelular o estar relacionada con una posible función señalizadora de esta molécula durante el crecimiento de la levadura (Morcillo-Parra et al., 2019). Rodríguez-Naranjo et al., (2011) observaron que, entre vinos comerciales de diferentes variedades, hubo diferencias significativas en la concentración de melatonina, incluso cuando la levadura y las condiciones fueron idénticas. Concretamente, estos autores encontraron la mayor concentración (423.0 ± 1.60 ng/mL) en el vino tinto Syrah en comparación con los vinos tintos Merlot, Tempranillo y Tintilla de Rota, Palomino Fino y Cabernet Sauvignon. Por otro lado, la menor concentración (74.13 ± 2.65 ng/mL) tuvo lugar en el vino Cabernet Sauvignon. Sin embargo, en el estudio de Rodríguez-Naranjo et al., (2013), en el cual se fermentaron los mismos mostos de uva, la mayor concentración de melatonina (18 ng/mL) se observó en el vino tinto Tintilla de Rota en comparación con los vinos tintos Merlot, Syrah y Tempranillo y con el vino blanco Palomino Fino. Por otro lado, la menor concentración de este compuesto se observó en el vino Syrah (≈ 0.2 ng/mL). Otros factores que influyen en la producción de melatonina son las temperaturas de fermentación (Morcillo-Parra et al., 2020); (Torija et al., 2003), la cantidad de células 38 inoculadas (Morcillo-Parra et al., 2020), la composición del mosto (Rodríguez-Naranjo et al., 2012), la limitación en glucosa (Morcillo-Parra et al., 2020), el grado de alcohol del vino (Rodríguez-Naramjo et al., 2013); (Tan et al., 2012) y las condiciones climatológicas (Rodríguez-Naranjo et al., 2013). De acuerdo con Morcillo-Parra et al., (2020) la temperatura es un factor importante durante la fermentación el cual afecta a su desarrollo, así como al crecimiento de la levadura, siendo la FA más lenta a temperaturas más bajas (13ºC y 25ºC); (Torija et al., 2003). El mosto sintético fermentado a una temperatura de 12ºC resultó en una mayor concentración intracelular de melatonina (≈ 1400 ng/mL) cuando se comparó con un mosto fermentado a 4ºC (Morcillo-Parra et al., 2020). Respecto a la cantidad de células inoculadas, de acuerdo con Morcillo-Parra et al., (2020), un alto tamaño del inóculo genera un menor crecimiento de las células (Carrau et al., 2010). Este retraso en la síntesis de melatonina podría añadir más evidencias para señalar que la melatonina es una molécula señal para el crecimiento de la levadura (Morcillo-Parra et al., 2020). En concreto, Morcillo-Parra et al., (2020) observaron una mayor concentración de melatonina en el mosto inoculado con 107 células que en el inoculado con 108 células (≈ 0 ng/mL). En el estudio de Rodríguez-Naranjo et al., (2012) el medio de crecimiento limitó la producción de melatonina. Concretamente, según estos autores la levadura S. cerevisiae QA23 fue la mayor productora de melatonina en condiciones de crecimiento cuando el medio inicial tuvo una concentración baja de azúcares residuales (20 g/L), sin embargo, no fue capaz de sintetizar melatonina durante la FA (200 g/L azúcares residuales). Además, observaron que las levaduras S. uvarum S6u y S. cerevisiae Uvaferm BC sí formaron melatonina en el mosto sintético bajo condiciones de fermentación. Por lo tanto, mantienen que tanto la composición del mosto como la cepa de levadura determinaron igualmente la concentración de melatonina en vinos (Rodríguez-Naranjo et al., 2012). Morcillo-Parra et al., (2020) mantienen que la limitación de glucosa también afecta al perfil de la síntesis de melatonina durante la FA. Proponen el estrés osmótico como responsable de la síntesis de melatonina intracelular, pero también un cambio en el metabolismo del carbono de la levadura debido a la concentración baja en azúcar. De hecho, resultados recientes de este grupo han mostrado que la melatonina interacciona con algunas proteínas glicolíticas (enolasa, fructosa bifosfato aldolasa, gliceraldehído- 3-fosfato deshidrogenasa, piruvato descarboxilasa, etc.) en la levadura con una alta 39 capacidad fermentativa, señalando que su posible papel como molécula señal probablemente está relacionado con el metabolismo fermentativo (Morcillo-Parra et al., 2019); (Morcillo-Parra et al., 2020). Por lo tanto, la cantidad de azúcar presente en el medio, el cual puede determinar el metabolismo de los azúcares en la levadura, podría ser la responsable de la presencia de melatonina en el producto final (Morcillo-Parra et al., 2020). Estos resultados están en consonancia con los obtenidos por Rodríguez-Naranjo et al., (2013) que determinaron la mayor concentración de melatonina (18 ng/mL), con respecto a vinificaciones con otras variedades (Merlot, Syrah, Tempranillo y Palomino Fino), siendo la principal característica de los vinos de la variedad Tintilla de Rota, un grado alcoholico mayor (16.02 %vol.) (Rodríguez-Naranjo et al., 2013). Tan et al., (2012) discutieron que el etanol formado durante la FA sería un factor estresante para Saccharomyces para sintetizar melatonina. Los resultados del estudio de Rodríguez-Naranjo et al., (2013) soportan que las condiciones climatológicas influyen sobre el contenido final de melatonina en vinos, probablemente porque diferentes condiciones cambian la concentración de azúcar de los mostos. Específicamente, Rodríguez-Naranjo et al., (2013) realizaron fermentaciones con las mismas variedades, crecidas en el mismo viñedo y con un proceso de elaboración del vino idéntico en 2008 y en 2010. Las concentraciones de melatonina en 2008 son también muy similares para todas las variedades involucradas, pero fueron 50 veces superiores a los encontrados en el estudio de 2010 (307 ng/mL en 2008 y 5.5 ng/mL en 2010 para la variedad Tempranillo) (Rodríguez-Naranjo et al., 2011). 1.2.3.3. Propiedades bioactivas de la melatonina Este compuesto es de especial relevancia por su bioactividad en organismos superiores, incluidos los humanos (González et al., 2018). En concreto, posee propiedades antioxidantes (Bonnefont-Rousselot & Collin, 2010); (Tan et al., 2010); (Tan et al., 2005); (Iriti & Varoni, 2015) que incluyen acciones directas de captación de radicales libres (Reiter et al., 2007) y acciones estimulantes indirectas sobre una variedad de enzimas antioxidantes (Reiter et al., 2009); (Reiter et al., 2005); (Hardeland & Pandi-Perumal et al., 2005) que promueven más su capacidad para reducir la toxicidad de los radicales y sus reactivos asociados (Reiter et al., 2005). Además de interactuar de manera eficiente con varias especies de oxígeno reactivo y nitrógeno reactivo y aumentar la actividad de las enzimas antioxidantes, también reduce la actividad de las enzimas prooxidantes (Reiter et al., 2007). 40 Como antioxidante, se ha descubierto que la melatonina es particularmente eficaz para reducir el daño al ADN causado por los radicales libres (Fernández-Mar et al., 2012). Además, podría tener un efecto sinérgico con otros antioxidantes como el resveratrol (Kwon et al., 2011). De hecho, ambos compuestos han demostrado un fuerte efecto protectivo contra el daño al ADN causado por carcinógenos como el Cr(III) (Burkhardt et al., 2001) y el KBrO3 (Cadenas & Barja, 1999). La melatonina inhibió la formación de 8-OH-dG inducida por el Cr(III)- de forma dependiente de la dosis. Las concentraciones efectivas de melatonina oscilaron entre 0.01 y 10 μM (Burkhardt et al., 2001). Por otro lado, después de consumir una dosis de 300 mg de melatonina, los linfocitos en muestras de sangre humana mostraron un descenso sifnificativo en la incidencia de las anomalías cromosómicas y de los micronúcleos (Vijayalaxmi et al., 1996). Los efectos antioxidantes de la melatonina no están asociados con un ciclo redox típico sino con una cascada de metabolitos que contribuye a las actividades antioxidantes (Tan et al., 2000); (Tan et al., 2007). Estos efectos antioxidantes también se han correlacionado con una mayor longevidad en ratas (Oaknin-Bendahan et al., 1995) y ratones (Nogués et al., 2006) y el desarrollo de mecanismos protectores contra mutaciones en hamsters (Karbownik et al., 2001). Asimismo, la melatonina posee antividad anticancerígena (Maestroni et al., 1994); (Sainz et al., 2003). Concentraciones entre 10 nM y 1 μM de melatonina fueron capaces de prevenir la apoptosis en células de la médula ósea incubadas con etopósido (fármaco citostático) en ratones (Maestroni et a., 1994). Regula la expresión génica de varias citoquinas inmunomoduladoras, incluido el factor de necrosis tumoral-α (TNF α), el factor de crecimiento transformante beta (TGFb) y el factor de células madre (SCF) por los macrófagos peritoneales, así como los niveles de interleucina-1beta (IL-1b) y el interferón gamma (INFg), entre otros (Liu et al., 2001). Si de hecho los niveles fisiológicos de melatonina normalmente restringen el crecimiento tumoral, la reducción en la producción de melatonina asociada con la edad puede contribuir a la mayor frecuencia de cáncer en la población mayor (Fernández-Mar et al., 2012). Asimismo, la melatonina también influye en el sistema inmune (Haldar et al.,1992). Tiene como función la mejora inmunológica (Tan et al., 2010) y también es beneficiosa para el sistema inmunológico, mejorando la resistencia a la infección y a enfermedades, presentando actividad inhibitoria en algunos cánceres e induciendo efectos beneficiosos en trastornos neuronales (Posmyk & Janas, 2009). La mayoría de los efectos de la melatonina sugieren una clara actividad neurohormonal, lo que ha permitido relacionar su presencia con procesos de aprendizaje y de memoria 41 (Larson et al., 2006), envejecimiento y tratamiento de la enfermedad del Alzheimer (Pappolla et al., 1997); (Pohanka, 2011), esclerosis lateral amiotrófica (Jacob et al., 2002) o migraña (Dodick & Capobianco, 2001). Además tiene efecto protector putativo contra enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el Parkinson (Hornedo- Ortega et al., 2016). Concretamente, la administración de 10 mg/kg de melatonina, en ratones, fue adecuada para la supresión de algunos procesos perjudiciales en el sistema nervioso. También desencadenó la regulación al alza del nivel ROR α1 (Caballero et al., 2008). La administración crónica de melatonina (10 mg/kg) también tuvo otro efecto significativo en ratones SAMP8: reducción de la pérdida de células y daño oxidativo de macromoléculas (Gutierrez-Cuesta et al., 2007). La melatonina también ha demostrado ser una molécula cardioprotectora y anticancerígena por su efecto antiangiogénico (Alvarez-García et al., 2013a). Por un lado, inhibe la angiogénesis (síntesis de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes) indirectamente mediante la disminución de la expresión y la secreción del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) en las células tumorales (Cui et al., 2012); (Alvarez-García et al., 2013b). Específicamente, 1 mM de melatonina añadida a los cultivos disminuyó el crecimiento de HUVEC y sólo esta concentración tuvo un inhibidor efecto sobre la proliferación celular (Cui et al., 2012). Por otro lado, se ha propuesto que inhibe directamente la angiogénesis al inhibir la proliferación de las células endoteliales (Cui et al., 2008); (Cui et al., 2006). En el estudio de Cerezo et al., (2017) muestra el potencial de la melatonina para inhibir la activación del VEGFR-2, que es el principal mediador de la proliferación, migración, supervivencia y permeabilidad en las células endoteliales (Holmes et al., 2007). En concreto, la melatonina mostró un 30% de inhibición a 1 mM (Cerezo et al., 2017). Igualmente, Álvarez-García et al., (2013) demostraron que la melatonina reducía la proliferación, la invasión, la migración y la formación de tubos de las células endoteliales de la vena umbilical humana. El tratamiento con melatonina previno parcialmente del aumento del tejido adiposo, del peso, de la insulinemia, de la glucemia y del colesterol, y redujo la ingesta de comida (Prunet-Marcassus et al., 2003); (Sanchez-Mateos et al., 2007); (López-Olmeda et al., 2006); (Pinillos et al., 2001). Respecto a la reducción en la ingesta de comidas, la ingesta de alimentos acumulada a las 8 h después de la inyección de melatonina indica que la melatonina intraperitoneal administrada (20 y 200 µg /g peso seco) a medianoche redujo significativamente la alimentación en peces de colores (Pinillos et al., 2001). Por otro lado, López-Olmeda et al., (2006) observaron que dosis de melatonina de 3 y 30 mg/kg inhibieron la ingesta de alimentos en un grado similar (16% y 14% de inhibición, 42 respectivamente), lo que indicó que el efecto de la melatonina no era dependiente de la dosis dentro de este rango. Aparte de todo lo mencionado, esta molécula tiene otras funciones como la señalización fotoperiódica y la regulación reproductiva (Tan et al., 2010) y tiene potencial para prevenir y tratar enfermedades cardiovasculares (Girotti et al., 2003); (Dominguez- Rodriguez et al., 2010). En concreto, se ha demostrado que la melatonina suprime la formación de colesterol en un 38% y reduce la acumulación de las LDL en un 42% en leucocitos mononucleares recién aislados en humanos (Müller et al., 1994). Además, se la ha relacionado funcionalmente con la fisiología de la retina ya que preserva las funciones visuales (Siu et al., 2006) y podría tener un papel como factor de crecimiento (Posmyk & Janas, 2009). En un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo se observó que la melatonina podría reducir la presión arterial en hombres con hipertensión crónica (Scheer et al., 2004). También se ha evaluado su efecto en el tratamiento con quimioterapias estándar. Específicamente, la administración de melatonina, cuando se combina con quimioterapias estándar, a menudo mejora la calidad de vida. Esto probablemente esté relacionado con la capacidad de la melatonina para reducir la toxicidad de los agentes quimioterapéuticos (Fernández-Mar et al., 2012). Además, los pacientes que reciben melatonina logran y mantienen un mejor estado funcional y también tienen menos ansiedad que aquellos tratados sin melatonina (Fernández-Mar et al., 2012). 1.2.4. SEROTONINA La serotonina, 5-hidroxitriptamina, es un neurotransmisor y un precursor de la síntesis de melatonina (Vilela, 2019); (Hornedo-Ortega et al., 2016). La serotonina es un neurotransmisor involucrado en la regulación de la ingesta de alimentos y el gasto de energía, que está presente en neuronas propiomelanocortina arqueadas seleccionadas (Nonogaki et al., 1998); (Xu et al., 2008). También juega un importante papel modulador en el comportamiento sexual (Uphouse & Guptarak, 2010); (Olivier et al., 2019) y controla la temperatura corporal causando, en el artículo de Bligh (1979), un aumento en la producción de calor y/o una disminución en la pérdida de calor y, por lo tanto, un aumento en la temperatura central en gatos (Bligh, 1979) así como controla los ritmos circcadianos ya que el agotamiento agudo de serotonina en el cerebro conduce a una interrupción de los ciclos diurnos de sueño-vigilia y la actividad locomotora en ratas (Nakamaru-Ogiso et al., 2012). Igualmente, los receptores de serotonina se encuentran en las regiones del cerebro involucradas en el aprendizaje y la memoria 43 (Meneses,1999). Además, una síntesis baja de serotonina está asociada con un humor depresivo (Young & Leyton, 2002); (Toker et al., 2010) . Figura 7. Estructura química de la serotonina La serotonina se encuentra en vinos a niveles que van desde los 2000 ng/mL a los 23000 ng/mL (Mas et al., 2014a). Además, también está presente en otras bebidas fermentadas como la cerveza en concentraciones cd entre 3500 y 24200 ng/mL (Kirschbaum et al., 1999). También se ha detectado su presencia, a niveles bajos, en quesos a una concentración inferior a 4.10 mg/100 g (Vale & Glória, 1998). La serotonina sigue la misma ruta metabólica que la melatonina. Este compuesto bioactivo es sintetizado a partir de su aminoácido precursor, el triptófano, en animales, plantas y levaduras (Figura 6). 1.2.4.2. Condiciones fermentativas para la producción de serotonina Tabla 6. Condiciones fermentativas para la producción de serotonina Muestra Microorganismo Tª (ºC) Azúcares Tiempo Concentración de serotonina Referencia Fructosa Glucosa Mosto sintético fermentado S. cerevisiae Aroma White - 100 g/L 100 g/L 7 de 7 días 4.70 ± 0.63 ng/mL Fernández- Cruz et al., 2016 1 de 7 días 0.67 ± 0.31 ng/mL Vino Cabenet Sauvignon - - 220 g/L Final maloláctica 3270 ± 280 ng/mL Wang et al., 2014 2940 ± 30 ng/mL Mosto sintético fermentado S. cerevisiae P24 28 100 g/L 100 g/L Inicio fase exponencial 7.03 ± 1.49 ng/108 células (intracelular) Fernández- Cruz et al., 2019 S. cerevisiae QA23 1.50 ± 0.81 ng/108 células (intracelular) 44 Fernández-Cruz et al., (2016) observaron, que en el mosto sintético con la levadura S. cerevisiae Aroma White, las concentraciones de serotonina aumentaron progresivamente desde el primer día de fermentación hasta el último (día 7 de 7 días) que fue en el que se observó la mayor concentración (4.70 ± 0.63 ng/mL), no siendo cuantificada en el día 0. Por otro lado, la concentración menor (0.67 ± 0.31 ng/mL) con esta cepa de levadura apareció al inicio de la fermentación (día 1 de 7 días) (Fernández- Cruz et al., 2016) (Tabla 6). A diferencia del mosto sintético, en el mosto de uva Cabernet Sauvignon, la concentración máxima (3.27 ± 0.28 mg/L) y mínima (2.94 ± 0.03 mg/L) de serotonina tuvieron lugar al final de la fermentación maloláctica, no siendo detectada en los diferentes estadíos de la FA (días 0, 2, 3 y 7) (Wang et al., 2014). Estas concentraciones fueron 1000 veces superiores a las detectadas en el mosto sintético del estudio de Fernández-cruz et al., (2016). La concentración más elevada de serotonina, en el medio intracelular en mosto sintético, tuvo lugar con la levadura S. cerevisiae P24 (7.03 ± 1.49 ng/108 células) en comparación con la levadura S. cerevisiae QA23 (1.50 ± 0.81 ng/108 células), demostrando que la serotonina también es un producto de la fermentación alcohólica, sintetizado por las levaduras. Además, no fue detectada con las levaduras H. uvarum Hu4 (CECT 13130) y T. delbrueckii Tdp (CECT 13135) (Fernández-Cruz et al., 2019). La máxima concentración (7.03 ± 1.49 ng/108 células) apareció al inicio de la fase exponencial, luego disminuyó a mitad de la fase exponencial, para volver a aumentar al final de esta fase y finalmente disminuyó finalizada la fermentación. La concentración más baja apareció también al inicio de la fase exponencial (1.50 ± 0.81 ng/108 células) (Fernandez-Cruz et al., 2019). 1.2.4.3. Propiedades bioactivas de la serotonina La serotonina es de especial relevancia por su bioactividad en organismos superiores, incluidos los humanos (González et al., 2018). Concretamente, este compuesto posee notables propiedades antioxidantes. Se ha encontrado que produce puntuaciones altas en el ensayo de reducción de iones cúpricos (Cu2+) (Gülçin, 2008) y en el test de capacidad antioxidante equivalente al trolox (TEAC), así como inhibiendo la peroxidación de lípidos en mitocondrias de hígado de rata (Sergeev et al., 1976). Este efecto bioactivo se observó en una concentración de 3.1-15 ng/mL (Mercolini et al., 2012). Existen datos que apoyan el papel estimulador de la serotonina en la proliferación de células tumorales in vitro (Dizeyi et al., 2004); (Siddiqui et al., 2006); (Cattaneo et al., 45 1995); (Oufkir, et al., 2010); (Sonier et al., 2006); (Sol et al., 2010). Sin embargo, otros estudios confirman el papel inhibidor (Sze et al., 1993); (Vicaut et al., 2000) de este compuesto en la proliferación de células tumorales destacando sus efectos antiangiogénicos y antiproliferativos en las células endoteliales y tumorales (Pakala et al., 1994); (Sze et al., 1993). Específicamente, la serotonina inhibe de manera significativa la activación del receptor VEGFR-2 inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular, en células endoteliales de la vena umbilical humana, y la posterior angiogenesis. Concretamente, la serotonina mostró un 24% de inhibición a 1 mM (Cerezo et al., 2017). Asimismo, posee un efecto protector contra enfermedades neurodegenerativas y degenerativas como el Alzheimer y el Parkinson (Hornedo-Ortega et al., 2016). Específicamente, los niveles de melatonina y su precursor serotonina están significativamente disminuidos en personas mayores con Alzheimer y se asocian con la aparición del Alzheimer (Hornedo-Ortega et al., 2016); (Zhou et al., 2003). También dos estudios cuantitativos de casos de inicio muy temprano de Alzheimer mostraron niveles prácticamente indetectables de serotonina en múltiples ensayos de tejido cortical, límbico y subcortical (Ebinger et al., 1987). Respecto al Parkinson, Pasquini et al., (2018) muestran que el temblor en reposo (y por implicación el temblor 're-emergente') está más probablemnte relacionado con la serotonina que con la deficiencia en dopamina (Pasquini et al., 2018). Este compuesto también parece ejercer actividad antifúngica contra Candida y Aspergillus spp. in vitro. Concretamente, el rango de MIC (mínima concentración inhibitoria) contra la bacteria Candida fue 0.91–7.34 mM y el MFC (mínima concentración fungicida) fue de 1.83–14.68 mM, respectivamente (Lass-Flörl et al., 2003). En el caso del Aspergillus spp, las concentraciones mínimas fungicidas fueron de 14.68 a 117.5 mM y de 29.37 a 235 mM durante 24 y 48 h de incubación (Lass-Flörl et al., 2002). 1.2.5. GLUTATIÓN El glutatión (GSH) es un tiol no proteico (Noctor et al., 2011), presente en varias formas en células, tejidos y plasmas aunque más del 90% del glutatión se encuentra en su forma reducida (Li et al., 2004). El glutatión puede ser usado en aditivos de comida y en las industrias cosméticas (Li et al., 2004). 46 1.2.6.2. Condiciones fermentativas para la producción de GABA Tabla 8. Condiciones fermentativas para la producción de GABA Muestra Microorganismo Tª (ºC) Azúcares Tiempo Concentración de GABA Referencia Kimchi L. sakei - - 35 de 120 días 1856.16 ng/mL Jeong et al., 2013 0-5 de 120 días ≈ 0 ng/mL Lactobacillus buchneri 30 - 3 días 61650000 ng/100 g Cho et al., 2011 Mosto de uva Cabernet Sauvignon fermentado - - 220 g/L 0 de 7 días 96230 ± 5330 ng/mL Wang et al., 2014 89620 ± 3380 ng/mL Vino - 28-30 - 5 días 710240 ng/mL Song et al., 2021 Tempeh Rhizopus microsporus var. Oligosporus IFO 32002 - - - 1740000000 ng/100 g base seca Aoki et al., 2003 Rhizopus oryzae IFO 5780 420000000 ng/100 g base seca Leche fermentada Streptococcus thermophiles y Lactobacillus rhamnosus - - 48 h 8300000 ± 600000 ng/mL Han et al., 2020 S. thermophilus - 2300000 ± 200000 ng/mL Leche de soja negra Lactobacillus brevis FPA 3709 37 - 2450000 ± 30000 ng/mL Ko et al., 2013 Lactobacillus Brevis FPS 2520 ≈ 900000 ng/mL Yogur Streptococcus thermophilus 42 4.8–5.8% 2000000 ng/mL Linares et al., 2016 Pan de masa madre Lactobacillus plantarum C48 - - - 504000000 ng/kg Coda et al., 2010 Cerveza de mora L. plantarum BC114 y S. cerevisiae SC125 30 - 72 h de 72 h 2420000 ng/mL Zhang et al., 2020 36 h de 72 h 450000 ng/mL Lactobacillus sakei fue la única bacteria ácido láctica productora de GABA en el kimchi en comparación con las bacterias ácido lácticas Leuconostoc gasicomitatum, Weissella koreensis, y Leuconostoc gelidum (Jeong et al., 2013). El kimchi es un alimento vegetal fermentado tradicional de Corea, que tiene como ingrediente principal la col asiática (Brassica pekinensis) (Cheigh HS & Park KY, 1994). La máxima producción de GABA fue de 1856.16 ng/mL (Jeong et al., 2013) (Tabla 8). En el tempeh, el hongo Rhizopus microsporus var. oligosporus IFO 32002 fue el mayor productor en comparación con los hongos Rhizopus microsporus var. oligosporus IFO 32003 (1500000000 ng/100 g base seca), Rhizopus microsporus var. oligosporus IFO 53 31987 (810000000 ng/100 g base seca), Rhizopus oryzae IFO 4705 (770000000 ng/100 g base seca), Rhizopus oryzae IFO 5438 (770000000 ng/100 g base seca), Rhizopus microsporus var. oligosporus IFO 8631 (720000000 ng/100 g base seca), Rhizopus oryzae IFO 9364 (629000000 ng/100 g base seca), Rhizopus oryzae IFO 4770 (510000000 ng/100 g base seca) y Rhizopus oryzae IFO 5780 (420000000 ng/100 g base seca) (Aoki et al., 2003). En la leche de soja negra, la bacteria Lactobacillus brevis FPA 3709 produjo la mayor concentración de GABA (2450000 ± 30000 ng/mL) en comparación con las bacterias Lactobacillus Brevis FKR 3739 (≈ 2150000 ng/mL), FPP 3713 (≈ 1800000 ng/mL), FKR 3741 (≈ 1700000 ng/mL), FKR 3737 (≈ 1350000 ng/mL), FPA 3708 (≈ 1250000 ng/mL), FPAW 3778 (≈ 1250000 ng/mL), FKR 2526 (≈ 1200000 ng/mL), FPM 3702 (≈ 950000 ng/mL) y FPS 2520 (≈ 900000 ng/mL) (Ko et al., 2013). En la cerveza de mora, un cocultivo de L. plantarum BC114 y S. cerevisiae SC125 dio lugar a la mayor concentración de GABA (2420000 ng/mL) en comparación con solo L. plantarum BC114 (1450000 ng/mL) y con solo la cepa de levadura S. cerevisiae SC125 (1030000 ng/mL) (Zhang et al., 2020). En la leche fermentada, un cocultivo de S. thermophilus y Lactobacillus rhamnosus produjo la mayor concentración de GABA (8300000 ± 600000 ng/mL) en comparación con un cocultivo de S. thermophilus y Lactobacillus paracasei (6200000 ± 400000 ng/mL), un cocultivo de S. thermophilus y Lactobacillus helveticus (5200000 ± 400000 ng/mL), un cocultivo de S. thermophilus y Lactobacillus delbrueckii (2500000 ± 200000 ng/mL) y S. thermophilus (2300000 ± 200000 ng/mL) (Han et al., 2020). En el estudio de Zhang et al., (2020) las concentraciones de GABA, en la cerveza de mora, aumentarion progresivamente hasta alcanzar la máxima concentración (2420000 ng/mL) al final de la fermentación (72 horas de 72 horas). Por otro lado, la menor concentración (450000 ng/mL) apareció a mitad de la fermentación (36 h de 72 h). En el estudio de Jeong et al., (2013) la concentración de GABA, en el kimchi, aumentó de forma continua, hasta alcanzar su máxima concentración (1856.16 ng/mL) al inicio de la fermentación (aproximadamente día 35 de una fermentación de 120 días) y a partir de este punto disminuyó levemente hasta mantenerse casi constante hasta el final de la fermentación. En los mostos de uva Cabernet Sauvignon la concentracioón máxima (96230 ± 5330 ng/mL) apareció también al inicio de la fermentación (día 0 de 7 días). A partir de esa 54 máxima concentración (96230 ± 5330 ng/mL) el GABA no fue detectado en las etapas siguientes de la FA (días 2, 4 y 7) (Wang et al., 2014). Según Han et al., (2020), la temperatura afectó a la producción de GABA siendo mayor a 42ºC (1300000 ± 100000 ng/mL) que a 37ºC (1100000 ± 100000 ng/mL) durante una fermentación de 24 horas debido a la rápida tasa de crecimiento a una temperatura alta, pero disminuyó durante períodos más largos (48 o 72 horas) debido a la muerte bacteriana más rápida a la mayor temperatura. 1.2.6.3. Propiedades bioactivas del GABA El GABA posee actividades ansiolíticas, antidepresivas y antihipertensivas, regula la secreción hormonal (Ogunleye et al., 2015); (Yoshimura et al., 2010); (Inoue et al., 2003); (Tsai et al., 2006); (Lee & Paik, 2017) ya que, por ejemplo, inhibe la secreción de prolactina en la pituitaria anterior en ratas (Racagni et al., 1979). También reduce la presión sanguínea en animales experimentales así como en humanos (Inoue et al., 2003); (Kimura et al., 2002). El consumo diario de 10 mL de leche fermentada con contenido en GABA durante 12 semanas es suficiente para mostrar efectos en personas con hipertensión leve (Inoue et al., 2003). En el estudio de Kimura et al., (2002), se produjeron disminuciones de la presión arterial relacionadas con la dosis entre 0.3 y 300 mg/kg de GABA intraduodenal. En el suero de leche en polvo de una leche de soja fermentada, con un 0.36 % de GABA, se inhibió la enzima convertidora de angiotensina I in vitro (Tsai et al., 2006). Este compuesto puede estar involucrado en la respuesta al estrés, por ejemplo, hipoxia, estrés mecánico, choque por frío, choque por calor y estrés hídrico (Wallace et al., 1984); (Mayer et al., 1990); (Rhodes et al., 1986) así como en el desarrollo y diferenciación de las células (Behar et al., 1996); (Barbin et al., 1993); (LoTurco et al., 1995); (Liu et al., 1997). GABA produjo efectos dependientes de la concentración y saturables en la entrada de Cl- en células del tronco encefálico (cultivos de células disociadas primarias) en el día 3 in vitro, con una mejora máxima a 10 mM GABA a 13.6 nmol/mg de proteína (Liu et al., 1997). Además, extractos de arroz integral con niveles mejorados de GABA tuvieron acciones inhibitorias en la proliferación de células en la leucemia y efectos estimulantes sobre la apoptosis de células cancerosas. Concetramente, el extracto de arroz integral con GABA (820 nmol/mL) retrasó significativamente las tasas de proliferación de células 55 L1210 y Molt4 y mejoró significativamente la apoptosis de los cultivos de células L1210 (Oh & Oh, 2004). 1.2.7. TIROSOL El tirosol, 2-(4-hidroxifenil)etanol, es también un alcohol superior producido por el catabolismo de la tirosina durante la fermentación alcohólica por las levaduras a través de la via de Ehrlich (Mas et al., 2014). Regula la morfogénesis durante la falta de nitrógeno y actúa como molécula QS en las levaduras S. cerevisiae (Avbelj et al., 2016); (Wuster & Babu, 2009). Figura 13. Estructura química del tirosol Las bebidas fermentadas como el vino y la cerveza contienen tirosol. Los vinos tintos presentan concentraciones superiores que los blancos. Concretamente, en los primeros se encuentran entre 3610 ng/mL y 73100 ng/mL mientras que en los segundos rondan entre los 1100 ng/mL y los 45000 ng/mL (Tabla 9). Por otro lado, las concentraciones presentes en la cerveza se encuentran entre los 9700 ng/mL y los 11450 ng/mL (Soldevila-Domenech et al., 2019); (Boronat et al., 2020). 56 Tabla 9. Concentraciones de tirosol en vinos tintos y blancos Tipo de vino Variedad Concentración de tirosol (ng/mL) Referencia Tintos Montepulciano 5900 Minussi et al., 2003 Barbera 5900 Blended 6000 Nero d'Avola 30000 De la Torre et al., 2006 Merlot 33000 Cabernet, Syrah, Petit-Verdot 44700 Blend - Ragusa et al., 2017 Negroamaro - Primitivo - Susumaniello - Tempranillo 24980 Piñeiro et al., 2011 Petit Verdot 39540 Syrah 37540 Blasco 27380 Cabernet Sauvignon 32260 Merlot 44460 Tintilla de Rota 29940 Melonera 36090 Vitis silvestris 29100 Palomino negro 29570 Rome 35490 Garnacha 28440 Lemberger 39700 Pour Nikfardjam & Pickering, 2008 Kadarka 50400 Baco Noir 73100 Maréchal Foch 63900 Villa Adami 4690 Di Tommaso et al., 1998 Chianti Classico 3610 Collesecco Rubino 3680 Barbera del Monferrato 4470 Piave Merlot 4800 Blancos Trebbiano d’Abruzzo 2340 Galestro Ruffino 1710 Bolla Soaveb 1690 Grigio Di Ca’Vit 1570 Corvo 1420 Bianco d’Alessano - Ragusa et al., 2017 Blend - Chardonnay - Falanghina - Fiano - Malvasia - Moscato - Negroamaro - Verdecca - Greco di Tufo 1100 Minussi et al., 2003 Pinot Grigio 1700 Verdicchio 2400 57 1.2.7.1. Ruta de síntesis Los alcoholes superiores son formados durante la fermentación a partir de los ceto ácidos. Estos ceto ácidos son producidos a través de la ruta catabólica (Hazelwood et al., 2008) o de la ruta anabólica (Hammond 1993). La primera implica la degradación de los amino ácidos presentes en la fermentación a través de la ruta de Ehrlich (Hazelwood et al., 2008) mientras que la segunda es la ruta de biosíntesis de los aminoácidos a partir de la fuente de carbono (Hammond 1993). Las levaduras siguen la ruta de Ehrlich cuando usan otras fuentes como los aminoácidos, en el caso de que su fuente de nitrógeno preferida, el amonio esté restringida (Mas et al., 2014). El tirosol y el HT podrían ser considerados como metabolitos secundarios formados por las levaduras durante la FA a partir del aminoácido tirosina (Dickinson et al., 2003). En este caso la ruta de Ehrlich a partir de la tirosina consiste en las siguientes reacciones (Figura 14): 1. Transaminación de la tirosina: transaminación del grupo amino y la formación, a partir de la tirosina, del α-ceto ácido correspondiente, el 4-hidroxifenil piruvato (Hazelwood et al., 2008); (Satoh et al., 2012); (Mas et al., 2014b). Esta reacción es catalizada por la aminotransferasa aromática I la cual es codificada por el gen ARO8 (Chrzanowski, 2020). 2. Descarboxilación del 4-hidroxifenilpiruvato: este ceto ácido es descarbolixado, por la piruvato descarboxilasa, a su correspondiente aldehído, el 4- hidroxifenilacetaldehído (Hazelwood et al., 2008); (Satoh et al., 2012); (Mas et al., 2014b). Esta reacción es catalizada por la descarboxilasa aromática codificada por el gen ARO10 y por la piruvato descarboxilasa (Avbelj et al., 2015). 3. Reducción del 4-hidroxifenilacetaldehído: dependiendo del estado de oxidaciónreducción de la célula, este aldehído puede ser metabolizado, por la alcohol deshidrogenasa, al alcohol aromático correspondiente, el tirosol, o ser oxidado a su correspondientes ácido, el ácido 4-hidroxifenilacético (Hazelwood et al., 2008); (Satoh et al., 2012); (Mas et al., 2014b). 58 Figura 14. Ruta de síntesis del tirosol en vinos por el metabolismo de la levadura (Piñeiro et al., 2011) 59 1.2.7.2. Condiciones fermentativas para la producción de tirosol Tabla 10. Condiciones fermentativas para la producción de tirosol Muestra Microorganismo Tª (ºC) Azúcares Tiempo Concentración de tirosol Referencia Fructosa Glucosa Mosto sintético fermentado x5 aminoácidos aromáticos H. uvarum Hu4 y S. cerevisiae QA23 28 100 g/L 100 g/L 48 h de 2 días ≈ 13816.4 ng/mL González et al., 2018 S. bacillaris Cz4 ≈ 2763.28 ng/mL Mosto sintético fermentado S. cerevisiae EC1118 22 100 g/L 100 g/L 29 h de 29 h ≈ 6908.02 ng/mL Zupan et al., 2013 T. pretoriensis 28 h de 28 h ≈ 967.148 ng/mL S. cerevisiae BM45 28 200 g/L Final 7100 ± 110 ng/mL Guerrini et al., 2018 S.cerevisiae Premium Zinfandel 4060 ± 150 ng/mL Vino Tannat S.cerevisiae Natuferm 804 23- 26 240 g/L Maceración fría prefermentativa 37850 ± 5020 ng/mL Favre et al., 2014 Maceración tradicional 26320 ± 3880 ng/mL Vino Monastrell suplementad o en Hys S. cerevisiae U.C.L.M. S325 22 - Final (30 días) ≈ 60000 ng/mL Bordiga et al., 2016 16 ≈ 20000 ng/mL Vino Piave Merlot - - - - 4800 ± 310 ng/mL Di Tommaso et al., 1998 Vino Corvo 1420 ± 30 ng/mL Vino Merlot - - - - 44460 ± 2130 ng/mL Piñeiro et al., 2011 Vitis silvestris D 20380 ± 1910 ng/mL Mosto sintético fernentado x5 aminoácidos aromáticos H. uvarum Hu4 y S. cerevisiae QA23 28 100 g/L 100 g/L 48 h de 2 días ≈ 34541 ng/mL (intracelular) González et al., 2018 S. bacillaris Cz4 ≈ 6908.2 ng/mL (intracelular) El mosto sintético estándar suplementado 5 veces en aminoácidos aromáticos (50 mg/L de tirosina, triptófano y fenilalanina) dio lugar a una mayor concentración de tirosol cuando se comparó con un mosto estándar, un mosto limitado en nitrógeno (300 mg/L) y un mosto bajo en glucosa (20 g/L de glucosa y 0 g/L de fructosa) (González et al., 2018). Los resultados de González et al., (2018) demuestran que un aumento de tirosina (7-98 mg/L) conduce a una mayor producción de su alcohol resultante, el tirosol (0-34541 ng/mL aprox). Otros estudios también observaron que el incremento de tirosina (50 mg/L) produjo un aumento general en la producción de tirosol (≈ 14000 μg/g peso seco) (Ghosh et al., 2008); (Gori et al., 2011). Sin embargo, estos autores observaron que estos incrementos en los alcoholes no eran 60 proporcionales a los aumentos en los precursores. Concretamente Gori et al., (2011) mostraron que, aunque la suplementación de tirosina fue de 50 μg /mL (junto con la fenilalanina y el triptófano), la producción de tirosol aumentó entre 16 y 79 veces. El tirosol fue sintetizado por la mayoría de las cepas de levaduras analizadas en diversos estudios: H. uvarum Hu4 (≈ 13816.4 ng/mL), S. cerevisiae QA23 (≈ 13816.4 ng/mL), T. delbrueckii Tdp (≈ 11053.12 ng/mL), M. pulcherrima Mpp (≈ 5526.56 ng/mL) y S. bacillaris Cz4 (≈ 2763.28 ng/mL) (González et al., 2018); S. cerevisiae BM45 (7100 ± 110 ng/mL), S. cerevisiae R6 (6170 ± 180 ng/mL), S. cerevisiae P8 (4970 ± 250 ng/mL), S. cerevisiae Zymaflore VL1 (4630 ± 0.00 ng/mL), S. cerevisiae EC1118 (4110 ± 70 ng/mL) y S. cerevisiae Premium Zinfandel (4060 ± 150 ng/mL) (Guerrini et al., 2018) y S. cerevisiae EC1118 (≈ 6908.02 ng/mL), ZIM 850 Z. baili (≈ 2763.28 ng/mL), ZIM 670 H. uvarum (≈ 1943.3 ng/mL) y ZIM 734 T. pretoriensis (≈ 967.148 ng/mL) (Zupan et al., 2013) (Tabla 10). Por el contrario, Zupan et al., (2013) encontraron que las levaduras ZIM 842 C. zemplinina y ZIM 701 D. bruxellensis no sintetizaron tirosol. Gerrini et al., (2018) observaron que la cantidad final de tirosol encontrada en los vinos mostraron una correlación positiva con el tipo de levadura (R2 = 0.97, p < 0.05), indicando un comportamiento cepa-dependiente en la producción de este alcohol superior. Concretamente, las levaduras no- Saccharomyces con frecuencia forman bajos niveles de alcoholes superiores en comparación con las S. cerevisiae (González et al., 2018). Sin embargo, hay una gran variabilidad entre las cepas (Romano et al., 1992); (Zironi et al., 1993). González et al., (2018) sostienen que la mayor síntesis de estos alcoholes en S.cerevisiae puede ocurrir porque las especies no S. cerevisiae (C. stellata, C. zemplinina y S. bombicola) difieren de las S. cerevisiae en la distribución del flujo metabólico durante la fermentación y, por lo tanto, en la producción de etanol, en la síntesis de biomasa y en la formación de subproductos (Ciani et al., 2000); (Magyar & Tóth, 2011); (Milanovic et al., 2012); (Tofalo et al., 2012). En los estudios de González et al., (2018) y Zupan et al., (2013) las concentraciones de este compuesto, en mosto sintético, aumentaron a medida que fue avanzando la fermentación hasta alcanzar sus máximas concentraciones (≈ 13816.4 ng/mL y ≈ 6908.02 ng/mL) al final (48 horas de 2 días y 29 h de 29 h). 61 Al igual que en el mosto sintético, en el mosto de uva Monastrell fermentado con S. cerevisiae U.C.L.M. S325 a 22ºC y suplementado con histidina (50 mg/L) las concentraciones máximas (≈ 60000 ng/mL) se obtuvieron también al final de la FA (Bordiga et al., 2016). Sin embardo, cuando se fermentó el mismo mosto suplementado con histidina, tirosina y triptófano (50, 25 y 10 mg/L, respectivamente) a 16ºC la mayor concentración se obtuvo a mitad de la fermentación (≈ 38000 ng/mL), disminuyendo posteriormente (≈29000 ng/mL) (Bordiga et al., 2016). Cuando se comparó la maceración fría prefermentativa (antes de la FA) con la maceración tradicional (simultánea a la FA), Favre et al., (2014) demostraron que la actividad de las cepas de levaduras nativas en la fase prefermentativa fue posiblemente la responsable de que las concentraciones obtenidas de tirosol fueran significativamente superiores (37850 ± 5020 ng/mL) en la primera con respecto a la segunda. En vinos tintos Tanat, la mayor concentración (37850 ± 5020 ng/mL) apareció antes de la FA, en una maceración fría prefermentativa (antes de la maceración tradicional) en comparación con la maceración tradicional (simultánea a la FA), la vinificación con adición de enzimas pectolíticas en el “barreling” y la adición de taninos de las semillas de las uvas en el “barreling”. Por otro lado, la menor concentración de este compuesto (26320 ± 3880 ng/mL) apareció en la maceración tradicional (Favre et al., 2014). Feuillat (1997) demostró un aumento en la diversidad de levaduras en los primeros pasos de la maceración fría prefermentativa. Favre et al., (2014) justifican que este aumento en la diversidad de levaduras en los primeros pasos de la maceración fría prefermentativa (Feuillat, 1997), podría explicar la aparición de la concentración más elevada de tirosol. En el estudio de González et al., (2018) la concentración de este compuesto, en el medio intracelular, en mosto sintético, aumentó a medida que fue avanzando la fermentación hasta alcanzar su máxima concentración (≈ 34541 ng/mL) al final de la fermentación (48 h de 2 días) (González et al., 2018). La producción de tirosol depende de la variedad de vino estudiada. En concreto, en el vino tinto Piave Merlot, fue en el que presentó la mayor concentración (4800 ± 310 ng/mL) en comparación con los vinos tintos Villa Adami (4690 ± 250 ng/mL), Chianti Classico (3610 ± 130 ng/mL), Collesecco Rubino (3680 ± 260 ng/mL), Barbera Del Monferrato (4470 ± 90 ng/mL) y los vinos blancos Trebbiano d’Abruzzo (2340 ± 340 ng/mL), Galestro Ruffino (1710 ± 110 ng/mL), Bolla Soave (1690 ± 50 ng/mL), Grigio Di Ca’Vit (1570 ± 80 ng/mL). Por otro lado, el vino en el que apareció la menor concentración (1420 ± 30 ng/mL) fue el Corvo (Di Tommaso et al., 1998). 62 1.2.8.2. Condiciones fermentativas para la producción de hidroxitirosol A diferencia de lo expuesto en los compuestos bioactivos anteriores, existen escasos estudios sobre las condiciones fermentativas que influyen en la producción del HT (Tabla 12). Tabla 12. Condiciones fermentativas para la producción de hidroxitirosol Muestra Microorganismo Tª (ºC) Azúcares Tiempo Concentración de hidroxitirosol Referencia Fructosa Glucosa Vinos Sangiovese S. cerevisiae Sc1 28 128.4 ± 1.7 g/L 121.4 ± 1.4 g/L 14 días 66500 ng/mL (HT+tirosol) Romboli et al., 2015 C.zemplinina y S. cerevisiae Sc1 3000 ± 100 ng/mL (HT+tirosol) Vino Monastrell suplementado en Hys, Tyr y Trp S. cerevisiae U.C.L.M. S325 22 - Final (30 días) ≈ 1500 ng/mL Bordiga et al., 2016 16 ≈ 800 ng/mL Vino Collesecco Rubino - - - - 4200 ± 160 ng/mL Di Tommaso et al., 1998 Vino Corvo 1720 ± 20 ng/mL Vino Cabernet Sauvignon B - - - - 5020 ± 1280 ng/mL Piñeiro et al., 2011 Vino Vitis silvestris 280 ± 490 ng/mL En el estudio de Romboli et al., (2015) la mayor concentración de HT + tirosol (66500 ng/mL), en uvas fermentadas de la variedad Sangiovese, se obtuvo cuando únicamente se utilizó S. cerevisiae Sc1, mientras que la más baja tuvo lugar con una inoculación secuencial con C. zemplinina seguida después de 5 días con S. cerevisiae Sc1 (3000 ± 100 ng/mL) (Tabla 12). El mosto de uva Monastrell suplementado con histidina, tirosina y triptófano (50 mg/L, 25 mg/L y 10 mg/L) y fermentado a 22ºC se observó la mayor concentración de HT (1500 ng/mL) en comparación con el mosto no suplementado y con el mosto solo suplementado con histidina (50 mg/L) (1000 y 1100 ng/mL de hidroxitirosol, respectivamente) (Bordiga et al., 2016). En estos ensayos se osbservaron que en todos los casos la concentraciónde hidroxitirosol fue máxima al final de la fermentación. En el mosto de uvas Monastrell, las concentraciones máxima (≈ 1500 ng/mL) y mínima (≈ 800 ng/mL) de HT se obtuvieron al final de la FA, a 22ºC y 16ºC de temperaturas de fermentación, respectivamente (Bordiga et al., 2016). 69 La variedad de uva es un factor que influye en la síntesis de HT. En concreto, el vino tinto Collesecco Rubino fue el que obtuvo la mayor concentración (4200 ± 160 ng/mL) en comparación con los vinos tintos Chianti Classico, Collesecco Rubino, Barbera Del Monferrato y Piave Merlot y los vinos blancos Trebbiano d’Abruzzo, Galestro Ruffino, Bolla Soave, Grigio Di Ca’Vit y Corvo (1720 ± 20 ng/mL) (Di Tommaso et al., 1998). Por otra parte, en el estudio de Piñeiro et al., (2011), el vino que presentó la concentración más elevada de HT fue el vino de la variedad Cavernet Sauvignon (5020 ± 1280 ng/mL) en comparación con los vinos Tempranillo, Blasco, Petit Verdot, Syrah, Merlot, Tintilla de Rota, Melonera, Tempranillo, Palomino Negro, Rome, Garnacha y Vitis silvestris (280 ± 490 ng/mL) (Piñeiro et al., 2011a). Otros factores que han demostrado influir en la síntesis de HT son la aireación en los mostos (Romboli et al., 2015), las cepas involucradas en la fermentación (Romboli et al., 2015), la composición de los mostos (Romboli et al., 2015), la cinética de la fermentación (Romboli et al., 2015), el grado de alcohol de los vinos (Bordiga et al., 2016) y la temperatura de la fermentación (Bordiga et al., 2016). Romboli et al., (2015) manifiestan que la aireación en los mostos durante la FA hizo que la levadura S. cerevisiae Sc1 aumentara significativamente su tasa máxima específica de producción de CO2 y el vigor de la fermentación, dando lugar a menores niveles de HT + tirosol. Esto destaca el papel clave de la cinética de la fermentación en la acumulación de HT + tirosol en el vino. Concretamente, la mayor concentración de HT + tirosol en uvas Sangiovese se obtuvo bajo condiciones de no aireación (mezcla diaria con los matraces cerrados) y la concentración más baja de HT + tirosol bajo condiciones de aireación (mezcla diaria con los matraces abiertos) (Romboli et al., 2015). Bordiga et al., (2016) manifiestan que el grado alcoholico afectó de manera significativa a todos los pasos del muestreo. En concreto, el vino que dio lugar a una mayor concentración de HT tenía un grado de alcohol de 15 mientras que el que dio a la menor concentración poseía un grado de alcohol normal (12ºC) (Bordiga et al., 2016). Estos autores también mantienen que el factor temperatura afectó a todos los pasos del muestreo de manera significativa, con excepción del HT a mitad de la fermentación. Concretamente, el mosto que resultó en una mayor concentración de HT fue fermentado a 22ºC (1500 ng/mL) mientras que el que dio lugar a una menor concentración a 16ºC (800 ng/mL) (Tabla 12) (Bordiga et al., 2016). 70 1.2.8.3. Propiedades bioactivas del hidroxitirosol El HT posee actividad antioxidante, neutralizando radicales como peroxil, hidroxil y otros radicales libres, especies reactivas de nitrógeno y aniones superóxido, rompiendo las reacciones en cadena peroxidativas y previniendo la producción catalizada por iones metálicos de especies de oxígeno reactivas (ROS) (Cornwell & Ma, 2008); (Tripoli et al., 2005). Para mostar su actividad antioxidante, Papadopoulas et al., (1991) observaron que el HT tenía un factor de protección de 15.2 a las 264 horas y de 9.5 a las 456 horas. Por otro lado, las alteraciones inducidas por H2O2 fueron prevenidas completamente al preincubar las células Caco-2 con HT (250 mmol/L). Cuando el estrés oxidativo fue inducido por la xantina oxidasa, se obtuvo una protección completa a una concentración tan pequeña como 100 mmol/L (Manna et al., 1997). Se ha comprobado que es un neutralizador de inhibidores de radicales derivados del ácido hipocloroso (Visioli et al., 1998). Específicamente, el HT exhibió una fuerte actividad de eliminación de radicales libres, con un EC50 de 2.6 x 10-7 M en células (Visioli et al., 1998). El HT es incluso un antioxidante más activo que el tirosol (Fernández-Mar et al., 2012) y también posee mayor poder antioxidante que antioxidantes como el ácido ascórbico (Torres de Pinedo et al., 2007). El HT mostró una capacidad de inhibición de los radicales libres de aproximadamente el 80 % de en comparación con el aproximadamente 45 % del ácido ascórbico y el casi 60% del el α-tocoferol (Torres de Pinedo et al., 2007). En el artículo de Oliveras-López et al., (2008), después de 4 días con una suplementación con 50 μl al día de aceite, la concentración plasmática de HT en ratones que siguieron una dieta con aceite de oliva virgen extra fue 10 veces mayor que la del grupo control y 0.9 veces mayor que en el grupo de ratones que siguieron una dieta con aceite de girasol. Con relación a la prevención del cáncer, en estudios in vitro, la presencia de HT reduce los efectos bioquímicos de peroxinitritos, como la desaminación de adenina y guanina en algunas líneas celulares (Deiana et al., 1999). Concretamente, una concentración de 100 mM de HT supuso más del 50% de inhibición de la nitración de tirosina en una línea celular de hibridoma neuronal N-18-RE-105 (Deiana et al., 1999). Concentraciones de 50 a 100 mM de HT provocaron una completa detención de la proliferación de células de leucemia mieloide humana HL60 y la inducción de la apoptosis (Ragione et al., 2000). Por otro lado, las concentraciones de HT que inhibieron el 50% de la proliferación celular fueron de aproximadamente 50 y 750 μmol/l para las células HL60 y células de adenocarcinoma de colon humano HT29, respectivamente. A concentraciones entre 50 71 y 100 μmol/l, el hidroxitirosol indujo una apoptosis considerable en células HL60 después de 24 h de incubación (Fabiani et al., 2002). Asimismo, el HT mejora el perfil lípidico después de su consumo continuo. La mayoría de los ensayos se han realizado con el HT presente en el aceite de oliva. En el estudio de Carluccio et al., (2003) se mostró que los compuestos fenólicos de una preparación comercial de aceitunas y aguas residuales de la almazara, administrada a varios voluntarios sanos, aumentaron los niveles totales de glutatión en el plasma. De entre los compuestos fenólicos presentes, el HT fue el compuesto bioactivo más abundante (Carluccio et al., 2003). Además, La EFSA ha declarado que el consumo de HT (y sus derivados) del aceite de oliva virgen extra contribuye a la protección del LDL del daño oxidativo Por ello, considera el consumo de 5 mg al día de HT y sus derivados en el aceite de oliva (Panel & Nda, 2011). Igualmente, el grado de hinchazón del grupo al que se le administraron 500 mg/kg de HT fue de un 45.14 ± 5.99 % después de 270 minutos de la administración en comparación con el grado de hinchazón de un 53.32 ± 6.97 % del grupo al que se le administraron carragenianos (compuesto presente en las algas rojas) (Gong et al., 2009). Además, el HT aumenta la biogénesis mitrocondrial en las células epiteliales pigmentarias de la retina contribuyendo a la salud ocular mediante la prevención de la degeneración de estas células inducida por el estrés oxidativo. El pretratamiento con 100 μmol/L durante 48 h de HT suprimió el efecto de la acroleína y mejoró los niveles de proteína nuclear Nrf2 (Zhu et al., 2010). El HT ha demostrado tener efecto antiangiogénico, crucial para la prevención de las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. Cerezo & Hornedo-Ortega (2019) sugieren por primera vez que el HT interactúa con los componentes de la superficie de la membrana de la célula endotelial, evitando que el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) active su receptor, inhibiendo así la angiogénesis. Concretamente, en células endoteliales de la vena umbilical humana, 50 μM de HT inhibió significativamente la fosforilación del receptor-2 de VEGF en un 37 % en comparación con el control con VEGF. Según estos autores esto apoya la idea de que el HT podría unirse al VEGFR-2 o a cualquiera de sus co-receptores, inhibiendo la activación del mismo. El HT también inhibió la fosforilación de PLγ1 en un 41% y activó significativamente la fosforilación de eNOS y Akt, lo que demuestra que inhibe la proliferación de las células endoteliales, mientras que de manera paralela activa la producción de óxido nítrico (Cerezo & 72 Hornedo-Ortega, 2019). Este hecho supone una ventaja de este bioactivo frente a los actuales fármacos anti-VEGF, ya que evitaría los problemas de hipertensión asociados al uso de estos fármacos a largo plazo. Los resultados de Hornedo et al., (2018) hacen del HT un potente candidato neuroprotector. El HT, en células PC12, es un potente inhibidor de la agregación de αsinucleína y un desestabilizador de fibrillas de α-sinucleína. De hecho, a altas concentraciones (100 μM), ejerce un importante efecto inhibidor y desestabilizador (alrededor del 85% y 65%, respectivamente). Además, porcentajes de inhibición muy similares (81%) se obtienen con 50 µM de HT (Hornedo-Ortega et al., 2018). Por otro lado, los resultados de Hornedo et al., (2018) demuestran que 25 μM de HT, son capaces de contrarrestar totalmente la toxicidad de α-sinucleína mientras que también proporcionan alrededor de un 70% de inhibición de la formación de fibrillas de αsyn. Se observó un aumento significativo en la viabilidad celular para HT a partir de 10 µM, revirtiendo totalmente el efecto tóxico de α-sinucleína y alcanzando la viabilidad del control (100%) a 25 µM (Hornedo-Ortega et al., 2018). El HT tiene actividad antimicrobiana frente a varias cepas de bacterias que son agentes ocasionales de infecciones del tracto intestinal o respiratorio en humanos (Bisignano et al., 2010). Concretamente, las concentraciones inhibitorias mínimas del HT contra las bacterias Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Salmonella typhi, Vibrio parahaemolyticus y Staphylococcus aureus fueron de 0.24 y 7.85 μg/mL de HT y frente a las bacterias Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Salmonella species, Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, etc. fueron de 0.97 y 31.25 μg/mL (Bisignano et al., 2010). También este compuesto es altamente tóxico para fitopatógenos como Pseudomonas syringae pv savastanoi y Corynebacterium michiganense (Capasso et al., 1995). Esta tesis está centrada en el HT, concretamente, en las estrategias (cepas de levaduras involucradas en la fermentación, concentración inicial de tirosina del mosto, composición del mosto, variedad de uva, temperatura de fermentación y esterilización del mosto) para aumentar la producción de este compuesto bioactivo en vinos. 73 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 2.1 JUSTIFICACIÓN El HT es un compuesto que presenta propiedades bioactivas siendo conocido por su potente efecto antioxidante (Tripoli et al., 2005); (Cornwell & Ma, 2008). También posee otras propiedades beneficiosas para la salud al ser un compuesto anti-inflamatorio (Gong et al., 2009), cardioprotector (Panel & Nda, 2011), antimicrobiano (Bisignano et al., 2010), anticancerígeno (Cornwell & Ma, 2008); (Roleira et al., 2015), etc. Se encuentra presente en bebidas fermentadas como el vino, tanto en blancos como en tintos (Romboli et al., 2015). El HT es producido por las levaduras durante la FA (Álvarez-Fernández et al., 2018); (Hazelwood et al., 2008). La fuente preferida de nitrógeno para las levaduras S. cerevisiae es el amonio. Sin embargo, en condiciones en las que este compuesto está restringido, las levaduras pueden usar otras fuentes de nitrógeno como los aminoácidos. Cuando esto ocurre, las levaduras siguen la ruta de Ehrlich (Mas et al., 2014). En el caso del HT, es producido a partir del aminoácido aromático tirosina (Álvarez-Fernández et al., 2018); (Hazelwood et al., 2008). Existen escasos estudios que hayan evaluado el efecto de las diferentes condiciones de fermentación (sustrato de partida, variedad de uva, aireación, grado alcohólico y temperatura de fermentación) sobre la concentración final de HT en bebidas fermentadas (Romboli et al., 2015); (Bordiga et al., 2016); (Di Tommaso et al., 1998); (Piñeiro et al., 2011). Por tanto, la hipótesis de esta Tesis Doctoral está fundamentada en que la presencia de HT en productos fermentados como el vino se debe en parte al metabolismo de las levaduras y que un mayor conocimiento de las condiciones de fermentación puede conducir a incrementar la producción de HT con el fin de obtener vinos más ricos en este compuesto bioactivo. 2.2 OBJETIVOS La Tesis Doctoral tiene como objetivo general evaluar el efecto de la cepa de levadura, la concentración inicial de tirosina en el mosto, el tipo de mosto, la variedad de uva, la temperatura de fermentación y la esterilización del mosto en el aumento de la producción de HT en vinos. 74 Los objetivos específicos, son los siguientes: 1. Evaluación de la producción de HT, en mosto sintético, por diferentes cepas de levaduras (S. cerevisiae Aroma White, S. cerevisiae ES 488, S. cerevisiae ICV GRE, S. cerevisiae QA23, S. cerevisiae RF, S. cerevisiae Uvaferm, T. delbrueckii Biodiva TD291, M. pulcherrima Flavia MP346, S. cerevisiae Yero 2.23 y S. cerevisiae Yero 2.24) para seleccionar aquella que de lugar a una mayor producción de este compuesto y determinar si la cepa de levadura es un factor que influye en la producción de HT (Capítulo 1). 2. Estudio de la producción de HT, en mosto sintético, por la cepa seleccionada (S. cerevisiae RF) a partir de diferentes concentraciones iniciales de tirosina (10 mg/L y 60 mg/L) para determinar, si a mayor contenido de tirosina en el mosto, mayor producción de HT, es decir, si diferentes concentraciones de tirosina en el mosto inicial influyen en la producción final de HT (Capítulo 2). 3. Determinación de la producción de HT, por la cepa RF, en mostos de uva natural (Chardonnay y Palomino Fino) para verificar si el tipo de mosto es un factor que influye en la producción de este compuesto bioactivo (Capítulo 3). 4. Análisis de la producción de HT y tirosol, por la cepa RF, en mostos de uva natural (Pedro Ximénez, Tempranillo y Palomino Fino) para evaluar si la esterilización del mosto y la temperatura de fermentación son dos factores que influyen en la producción de HT (Capítulo 4) 75 3. MATERIALES Y MÉTODOS A continuación, se describen los materiales utilizados para la realización de la presente Tesis Doctoral: 3.1. MATERIALES 3.1.1. PATRONES ANALÍTICOS Se prepararon disoluciones de patrones de los siguientes compuestos para la cuantificación de las muestras en el UHPLC/HRMS:  HT (Oshia Biotecnologia, 4999 S) (1.56-200 ng/mL)  Tirosina (TYR) (Sigma-Aldrich, 93829) (1-500 ng/mL)  Tirosol (TYL) (Sigma-Aldrich, 188255) (39.06-5000 ng/mL) 3.1.2. CEPAS DE LEVADURAS Para el desarrollo del Capítulo 1 de la presente Tesis Doctoral se utilizaron 10 cepas de levaduras: 8 S. cerevisiae (6 comerciales y 2 autóctonas) y 2 de los géneros T. delbrueckii y M. pulcherrima (Tabla 13). Tabla 13. Cepas de levaduras empleadas en el Capítulo 1. Cepa de levadura Comercial Autóctona S. cerevisiae Enartis Ferm Aroma White (Enartis) S. cerevisiae Yero 2.23 (Rancho de la Merched, IFAPA, Jerez de la Frontera) S. cerevisiae Enartis Ferm ES488 (Enartis) S. cerevisiae Yero 2.24 (Rancho de la Merched, IFAPA, Jerez de la Frontera) S. cerevisiae Lalvin ICV GRE (Lallemand) S. cerevisiae Lalvin YSEO QA23 (Lallemand) S. cerevisiae Enartis Ferm RF (Enartis) S. cerevisiae Uvaferm (Lallemand) T. delbrueckii Biodiva TD291 (Lallemand) M. pulcherrima Flavia MP346 (Lallemand) En el caso de los Capítulos 2-4 solo se utilizó, para el desarrollo de las fermentaciones, la cepa de levadura S. cerevisiae RF. 76 3.1.3. MUESTRAS 3.1.3.1. Mosto sintético Para la elaboración del mosto sintético se emplearon los reactivos que aparecen en la Tabla 14. La composición del mosto sintético se basó en Riou et al. (1997) con algunas modificaciones. Este mosto sintético se ha empleado en el Capítulo 1 para evaluar la producción de hidroxitirosol a partir de diferentes cepas de levaduras. Tabla 14. Reactivos empleados en la elaboración del mosto sintético (MS300) Elemento principal Compuesto Concentración (g/L) Proveedor Azúcares Fructosa 100 Sigma-Aldrich Glucosa 100 Sigma-Aldrich Ácidos Ácido málico 5 VWR Ácido cítrico 0.5 Panreac Acido tartárico 3 VWR Minerales Fosfato monopotásico (KH2PO4) 0.75 Merck Bisulfato potásico (KH2SO4) 0.5 VWR Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4·7H2O) 0.25 Merck Cloruro sódico (NaCl) 0.2 VWR Cloruro cálcico dihidratado (CaCl2·2H2O) 0.155 Merck Cloruro de amonio (NH4Cl) 0.46 Sigma-Aldrich Solución de aminoácidos Tirosina 1.5 Sigma-Aldrich Triptófano 13.4 Isoleucina 2.5 Ácido aspártico 3.4 Ácido glutámico 9.2 Arginina 28.3 Leucina 3.7 Treonina 5.8 Glicina 1.4 Glutamina 38.4 Alanina 11.2 Valina 3.4 Metionina 2.4 Fenilalanina 2.9 Serina 6 Histidina 2.6 Lisina 1.3 Cisteína 1.6 Prolina 46.1 Bicarbonato sódico 20 77 Solución de vitaminas Mioinositol 2 Sigma-Aldrich Pantotenato de calcio 0.15 Sigma-Aldrich Clorhidrato de tiamina 0.025 Merck Ácido nicotínico 0.2 Sigma-Aldrich Piridoxina 0.025 Sigma-Aldrich Biotina 0.003 Sigma-Aldrich Solución de oligoelementos Sulfato de manganeso hidratado (MnSO4·H2O) 4 Sigma-Aldrich Sulfato de zinc hidratado (ZnSO4·H2O) 4 Panreac Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4·5H2O) 1 Sigma-Aldrich Yoduro de potasio (KI) 1 Sigma-Aldrich Cloruro de cobalto hexahidratado (CoCl2·6H2O) 0.4 Sigma-Aldrich Ácido bórico (H3BO3) 1 Panreac Molibdato de amonio (NH4)6Mo7O24 1 Sigma-Aldrich Para la elaboración del mosto sintético utilizado en el Capítulo 2 para evaluar la producción de hidroxitirosol a partir de diferentes concentraciones de tirosina, se emplearon los mismos reactivos (Tabla 14), con las modificaciones expuestas en la Tabla 15. Tabla 15. Modificaciones en el contenido de sulfato de amonio y tirosina del mosto sintético (MS300) utilizado en el Capítulo 2 Compuesto Concentración Baja concentración de tirosina Alta concentración de tirosina Sulfato de amonio 3.28 g/L 3.19 g/L Tirosina 10 mg/L 60 mg/L 3.1.3.2. Mosto natural Para la evaluación de la producción de HT y tirosina en mostos de uva natural con la cepa de levadura seleccionada (Capítulo 3), se utilizaron los mostos de uva Chardonnay y Palomino Fino (variedades de uva blanca) tal como se muestra en la Figura 17. 78 Se añaden los diferentes compuestos y soluciones:  Azúcares  Ácidos  Minerales  Sulfato de amonio  Tirosina  Solución de vitaminas  Solución de oligolementos Para la determinación de las cantidades de sulfato de amonio y tirosina a añadir a los mostos sintéticos, se partió de una concentración de nitrógeno asimilable para las levaduras (YAN) de 140 mg/L que es la concentración minima de nitrógeno disponible para las levaduras necesaria para la fermentación. Por otro lado, las concentraciones iniciales de tirosina de los mostos sintéticos fueron de 10 mg/L, para el ensayo de baja concentración de tirosina, y de 60 mg/L, para el ensayo de alta concentración. 3.2.2 ELABORACIÓN DEL MOSTO NATURAL: Capítulos 3 y 4 La elaboración del mosto natural se llevó a cabo en el centro IFAPA el Rancho de la Merched (Jeréz de la Frontera, Cádiz). Las uvas fueron cosechadas, desgranadas, machacadas y prensadas. A continuación, se les añadieron a los mostos 2.5 mL/hL de enzimas pectolíticas y 40 mg/L de SO2 durante 24 horas a 4ºC. Después de esto, los mostos exprimidos se almacenaron en un recipiente de acero de 100 L. 3.2.3. PREINOCULACIÓN: Capítulos 1-4 Antes de inocular el mosto, cada cepa de levadura liofilizada se rehidrató en un baño a 37 ºC durante 30 minutos. Posteriormente, las levaduras se sembraron en placas de medio sólido de YPD. Las cepas se sembraron por duplicado. A continuación, se incubaron en la estufa a 28ºC durante 48-72 horas. Tras observar crecimiento en las placas, las levaduras se almacenaron a 4ºC hasta su uso. Posteriormente, los preinóculos, se prepararon en medio YPD líquido esterilizado. Se cogieron las colonias de las placas de YPD sólido, con un asa de siembra, y se introdujeron en un matraz de YPD. Seguidamente, el preinóculo se incubó en un agitador orbital a 25ºC y 150 rpm durante 12-24 h, hasta la inoculación. 85 3.2.4. INOCULACIÓN: Capítulos 1-4 Para la inoculación, se contó el número de células del preinóculo, por duplicado, en la cámara de Neubaber. Antes de la inoculación, se realizó un lavado con agua destilada. Para ello, las muestras se centrifugaron a 3500-5000 rpm durante 3-5 minutos. Seguidamente, los sobrenadantes se desecharon y los pellets se lavaron con agua destilada y se volvieron a centrifugar. El proceso de lavado y centrifugación se repetió dos veces. Los móstos tanto sintéticos como naturales se inocularon con una concentración de 106 células/mL. 3.2.5. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA: Capítulos 1-4 En las fermentaciones alcohólicas del Capítulo 1 (evaluación de la producción de HT por diferentes cepas de levaduras) el mosto sintético fue inoculado con 106 células/mL. Estos matraces se taparon con tapones de goma los cuales tenúan una abertura que contenía una jeringa para liberar el CO2 producido durante la fermentación. Después de la inoculación, los matraces se incubaron a 25ºC con una agitación de 150 rpm para empezar con la fermentación alcohólica. En las fermentaciones alcohólicas del Capítulo 2 (evaluación de la producción de HT a partir de diferentes concentraciones de tirosina) el mosto sintético fue inoculado con 106 células/mL. Los matraces se taparon con tapones de goma y se incubaron a 25ºC con una agitación de 150 rpm para empezar con la fermentación alcohólica. En las fermentaciones alcohólicas con el objetivo de evaluar la producción de HT en mostos naturales, matraces con 750 mL de mostos de uva natural (Chardonnay y Palomino Fino) fueron inoculados con 106 células/mL. Previamente los mostos fueron esterilizados a 100 ºC durante 10 minutos. Los matraces se taparon con tapones de goma y se incubaron a 25ºC con una agitación de 150 rpm para empezar con la fermentación alcohólica. En las fermentaciones alcohólicas con el objetivo de evaluar la producción de HT y tirosol para analizar el efecto de la temperatura de fermentación y de la esterilización o no del mosto, matraces con 80 mL de mostos de uva natural (Pedro Ximénez, Tempranillo y Palomino Fino) fueron inoculados con 106 células/mL. Previamente algunos mostos fueron esterilizados a 100 ºC durante 10 minutos. Los matraces se taparon con tapones de goma y se incubaron a 25ºC y a 18ºC con una agitación de 150 rpm para empezar con la fermentación alcohólica. 86 Las fermentaciones alcohólicas se llevaron a cabo en el laboratorio de la Universidad Pablo de Olavide (Figura 20). Figura 20. Fermentación alcohólica de los mostos Paras realizar las fermentaciones alcohólicas con el objetivo de seleccionar la cepa mayor productora de HT (Capítulo 1) se utilizaron diez cepas de levaduras: S. cerevisiae Aroma White, S. cerevisiae ES488, S. cerevisiae ICV GRE, S. cerevisiae QA23, S. cerevisiae RF, S. cerevisiae Uvaferm, T. delbrueckii Biodiva TD291, M. pulcherrima Flavia MP346, S. cerevisiae autóctona Yero 2.23 y S. cerevisiae autóctona Yero 2.24. Para las fermentaciones restantes, con los objetivos de evaluar la producción de HT, a partir de diferentes concentraciones de tirosina en mostos sintéticos (Capítulo 2) y en mostos naturales (Capítulo 3) y evaluar la producción de HT y tirosol en mostos naturales (Capítulo 4) se utilizó la cepa S. cerevisiae RF. Las fermentaciones alcohólicas se llevaron a cabo a una temperatura de 25 ºC, a excepción de las fermentaciones realizadas en el Capítulo 4 que tuvieron lugar a 25 ºC y a 18 ºC para evaluar el efecto de la temperatura en la producción de HT y tirosol. Todas las fermentaciones alcohólicas se realizaron por triplicado. Las fermentaciones se monitorizaron a través de la medición de CO2, de la medición de la densidad óptica (DO) y de las mediciones de los contenidos de etanol, azúcares residuales y nitrógeno con kits enzimáticos (3.1.6.1.). 3.2.5.1. Medición de CO2 desprendido La monitorización de las fermentaciones tuvo lugar pesando los matraces para cuantificar el desprendimiento de CO2 hasta la estabilización del peso. Los días en los que se pesaron los mostos fueron diferentes (Tabla 17). 87 Tabla 17. Medición de CO2 de los mostos de las diferentes experiencias Capítulo Tipo de mosto Pesada (días) 1 Sintético 0-7 2 Sintético 0-6, 8 y 10 3 Natural 0-7 4 Natural 0-9 3.2.5.2. Medición de la densidad óptica Las fermentaciones también se monitorizaron a través de la medición de la DO. Para ello, se pone el espectofotómetro a 600 nm. Antes de medir la absorbancia de las muestras, se mide de una muestra de agua destilada que hace de blanco. Después, se miden las absorbancias de las diferentes muestras. El resultado debe salir entre 0.02 y 0.8. Para que salga dentro de ese rango se miden las muestras originales y diferentes diluciones de las muestras (1:10 y 1:100). 3.2.5.3. Mediciones de etanol, azúcares residuales y nitrógeno En las fermentaciones alcohólicas con el objetivo de evaluar la producción de HT a partir de diferentes concentraciones iniciales de tirosina, se midieron los contenidos de etanol, azúcares residuales y nitrógeno siguiendo las especificaciones del kit, como se explica a continuación: Medición de etanol (K-ETOH) Para medir la producción de etanol se uilizaron las siguientes soluciones y se llevó a cabo el siguiente procedimiento:  Preparativos: -Solución buffer -Solución NAD+: disolver en 12.4 mL de agua destilada -Solución aldehído deshidrogenasa -Solución alcohol deshidrogenasa -Solución patrón etanol: diluir 0.5 mL en 50 mL de agua destilada (5 mg/mL)  Procedimiento: 1. Se rellenan los pocillos de las placas con las cantidades reflejadas en la Tabla 18, a excepción de los 2 μL de la solución de alcohol deshidrogenasa. 88 Tabla 18. Medida de etanol Blanco (μL) Muestra (μL) Patrón (μL) Agua destilada 210 200 200 Muestra - 10 - Patrón - - 10 Solución buffer 20 20 20 Solución NAD+ 20 20 20 Solución aldehído deshidrogenasa 5 5 5 Solución alcohol deshidrogenasa 2 2 2 2. Se agitan las placas. 3. Se hace una lectura para leer la absorbancia a los 2 minutos. Para esa lectura se le pone al lector de placas una longitud de onda de 340 nm y una temperatura de 25ºC. El rango linear es de 0.1-1.2 µg de etanol por pocillo de la placa. 4. Se continúa añadiendo 2 μL de la solución de alcohol deshidrogenasa. 5. Se agitan las placas. Se hace una lectura para leer la absorbancia a los 5 minutos (si la reacción no ha finalizado, se mide cada 1 minuto hasta que la lectura de la absorbancia sea estable). Medición de azucares residuales: glucosa y fructosa (K-FRUGL) Para medir el consumo de azúcares residuales se usaron las siguientes soluciones y se se siguió el proceso siguiente:  Preparativos: -Solución buffer -Solución NASP+, ATP, PVP: disolver en 12 mL de agua -Solución hexoquinasa + glucosa 6 fosfato deshidrogenasa -Solución fosfoglucosa isomerasa -Solución patrón D-glucosa+fructosa: diluir en agua destilada (0.2 mg/L)  Procedimiento: 1. Se rellenan los pocillos de las placas con las cantidades de la Tabla 19, a excepción de los 4 μL de la solución de hexoquinasa+glucosa 6 fosfato deshidrogenasa+solución fosfoglucosa isomerasa 89 Tabla 19. Medida de los azúcares residuales Blanco (μL) Muestra (μL) Patrón (μL) Agua milliQ 210 200 200 Muestra - 10 - Patrón - - 10 Solución buffer 10 10 10 Solución NADP+, ATP, PVP 10 10 10 Solución hexoquinasa+glucosa 6 fosfato deshidrogenasa+solución fosfoglucosa isomerasa 4 4 4 2. Se agitan las placas. 3. Se hace una lectura para leer la absorbancia a los 3 minutos. Para esa lectura se le pone al lector de placas una longitud de onda de 340 nm y una temperatura de 25ºC. El rango linear es de 0.1-8 µg de D/glucosa y D/fructosa por pocillo de la placa. 4. Se prosigue añadiendo los 4 μL de la solución de hexoquinasa+glucosa 6 fosfato deshidrogenasa+solución fosfoglucosa isomerasa 5. Se agitan las placas 6. Se hace una lectura para medir la absorbancia a los 10 minutos (si la reacción no se ha terminado, se mide cada 2 minutos hasta que la lectura de la absorbancia sea constante). Medición de nitrógeno primario (K-PANOPA) Para la medición del consumo de nitrógeno primario se emplearon las siguientes soluciones y se realizó el procedimiento que se detalla a continuación:  Preparativos: -Solución N-acetil-L-cisteína (NAC): disolver la pastilla en 3 ml de agua milliQ durante 2-3 minutos. -Solución orto-ftalaldehído (OPA). Almacenamiento en oscuridad a 4ºC -Solución patrón isoleucina: 140 mg N2/L. Almacenamiento a 4ºC  Procedimiento: 1. Se rellenan los pocillos de las placas con las cantidades de la Tabla 20, a excepción de los 10 μL de la solución de orto-ftalaldehído. 90 Tabla 20. Medida del nitrógeno primario Blanco (μL) Muestra (μL) Patrón (μL) Solución N-acetil-L- cisteína 300 300 300 Agua destilada 5 - - Muestra - 5 - Solución patrón isoleucina - - 5 Solución ortoftalaldehído 10 10 10 2. Se agitan las placas. 3. Se hace una lectura para medir la absorbancia a los 2 minutos. Para esa lectura se le pone al lector de placas una longitud de onda de 340 nm y una temperatura de 25ºC. El rango linear es de 0.2-1 µg de nitrógeno por pocillo de la placa. 4. Se continúa rellenando las placas con los 10 μL de la solución de ortoftalaldehído. 5. Se agitan las placas. 6. Se hace una lectura de la absorbancia a los 15 minutos. 3.2.6. TOMA DE MUESTRAS: Capítulos 1-4 Las muestras se tomaron todos los días de fermentación expecto en el Capítulo 1 que sólo se tomaron al final (día 7), en el Capítulo 2 que se tomaron la mayoría de los días y en el Capítulo 3 que se tomaron solo al inicio, mitad y final (Tabla 21). Agunas fermentaciones duraron más dependiendo de la composición del mosto (Capítulo 2) y de la temperatura de fermentación (Capítulo 4). Concretamente, las muestras fermentadas a 18 ºC fueron recolectadas un día más tarde (días 6 y 9) que las fermentadas a 25 ºC (días 5 y 8). Tabla 21. Toma de muestras de las diferentes experiencias Capítulo Tipo de mosto Toma de muestra (día) 1 Sintético 7 2 Sintético 0-6, 8 y 10 3 Natural 0-7 4 Natural 0, 5-6 y 8-9 91 Las muestras se recogieron en función del volumen correspondiente a 109 células/mL, previamente contadas en una cámara de Neubaber. A continuación, las muestras se centrifugaron, a 4500-5000 rpm durante 3 minutos, para separar los pellets (parte intracelular) del contenido extracelular. Seguidamente, los sobrenadantes se recogieron para ser posteriormente filtrados y guardados a -80ºC hasta su análisis. Por otro lado, los pellets se lavaron con agua destilada y se volvieron a centrifugar. El proceso de lavado y centrifugación se volvió a repetir. De esta manera, se eliminó la presencia de analitos del compartimento extracelular. Posteriormente las muestras se guardaron a - 80ºC hasta el procedimiento de inactivación celular (quenching). En el caso de los Capítulos 3-4, con mostos naturales, sólo se analizaron las muestras extracelulares. 3.2.7. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS: Capítulos 1-4 La Figura 21 muestra un esquema del tratamiento de las muestras hasta su análisis por espectrometría de masas. Figura 21. Esquema del tratamiento de muestras 3.2.7.1. Inactivación celular (quenching) Las muestras intareclulares se sometieron a un procedimiento de inactivación enzimática, el cual fue publicado por Villas-Bôas & Bruheim, (2007) y consiste en detener el metabolismo de las células. Este procedimiento tuvo lugar en el laboratorio de la Universidad Pablo de Olavide y en el Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD).  Preparativos: -La centrífuga se deja, en modo HOLD, a -20ºC y a 5000 rpm ya que tarda en coger temperatura. -Se ponen en hielo los adaptadores para la ultracentrífuga y la solución de quenching de glicerol en frío. 92  Procedimiento: 1. Se resuspenden los pellets de las levaduras con 1 mL de agua milliQ. 2. Se trasladan las levaduras a un tubo de policarbonato apto para ultracentrífugas. 3. Se añaden 4 mL de la solución de glicerol en frío a cada tubo. 4. Se vortexean las muestras. 5. Se dejan en hielo al menos 5 minutos. 6. Se centrifugan las muestras a 36.086 g durante 20 minutos a -20ºC. 7. Se deja la centrífuga, en modo HOLD, a -20ºC y a 5000 rpm para que vaya alcanzando esa temperatura mientras que se hacen los pasos siguientes hasta que se vuelvan a centrifugar otra vez las muestras (paso 11). 8. Se descartan los sobrenadantes. 9. Se añaden 2 mL de la solución de lavado a cada tubo. 10. Se vortexean hasta resuspender los pellets. 11. Se centrifugan las muestras a 36.086 g durante 20 minutos a -20ºC. 12. Se descartan los sobrenadantes. 13. Se guardan las muestras a -80ºC hasta el momento de la extracción de los metabolitos intracelulares. 3.2.7.2. Extracción de metabolitos intracelulares Los metabolitos intracelulares se extrayeron siguiendo procedimiento descrito por Álvarez-Fernández (Álvarez-Fernández et al., 2019), con algunas mínimas modificaciones. La extracción de metabolitos intracelulares se realizó en el laboratorio de la Universidad Pablo de Olavide y en el CABD.  Procedimiento: 1. Se añaden 2.5 mL de la solución de extracción a los pellets. 2. Se vortexean hasta resuspender levaduras. 3. Se llevan las muestras a un congelador de -80ºC durante 30 minutos. 4. Se descongelan las muestras poniéndolas en hielo durante 5 minutos. 5. Se llevan a un congelador de -80ºC durante 30 minutos. 6. Se pone la centrífuga, en modo HOLD, a -20ºC y a 5000 rpm para que vaya alcanzando esa temperatura mientras que se hacen los pasos siguientes hasta que se vuelvan a centrifugar otra vez las muestras (paso 9). 7. Se descongelan las muestras poniéndolas en hielo durante 5 minutos. 93 8. Se aplica ultrasonido a las muetras en hielo durante 1 minuto a máxima potencia (90 Hz). 9. Se centrifugan las muestras a 36.086 g durante 20 minutos a -20ºC. 10. Se recolectan los sobrenadantes en viales de vidrio. 11. Se añaden 2,5 mL de la solución de extracción a los pellets. 12. Se vortexean las muestras hasta resuspender levaduras. 13. Se repiten los pasos 9 y 10 y se conservan los sobrenadantes a -80ºC. 3.2.7.3. Extracción en fase sólida Las muestras extra e intracelulares se sometieron a un procedimiento de extracción en fase sólida (SPE), tal como se muestra en la Figura 22, para eliminar aquellos compuestos que pudieran interferir en el análisis de la muestra, como son fosfolípidos y proteínas en el caso de las muestras intracelulares, además de para concentrar los compuestos de interés. Para ello se utilizan cartuchos desechables de SPE (3.1.6.1.). Figura 22. Muestras sometidas al proceso de extracción en fase sólida Este procedimiento tuvo lugar en el laboratorio de la Facultad de Farmacia (Universidad de Sevilla) y en el laboratorio del CITIUS (Universidad de Sevilla).  Procedimiento de las muestras extracelulares: 1. Se acondicionan los cartuchos con 2 mL de metanol. 2. Posteriormente se añade 2 mL de agua milliQ. 3. Se cargan 500 µl de las muestras de mostos sintéticos y mostos de uva Palomino Fino y Chardonnay y 2 mL de las muestras de Pedro Ximénez, Tempranillo y Palomino Fino. 4. Se lavan las muestras con 2 mL de una solución metanol/agua al 10% (v/v). 5. Se eluyen las muestras con 1 ml de metanol puro. 94 0.01 ng/mL), M. pulcherrima (0.55 ± 0.03 ng/mL), Yero 2.24 (0.64 ± 0.06 ng/mL), QA23 (1.19 ± 0.04 ng/mL), Aroma White (1.31 ± 0.02 ng/mL), Uvaferm (1.36 ± 0.06 ng/mL), ICV GRE (1.44 ± 0.03 ng/mL), ES 488 (2.97 ± 0.14 ng/mL) y RF (6.12 ± 0.11 ng/mL) en el medio extracelular. Las levaduras S. cerevisiae comerciales analizadas (Aroma White, Uvaferm, ICV GRE, QA23, RF y ES 488) produjeron más HT (1.19-6.12 ng/mL en el medio extracelular y 0.04-0.11 ng/mL en el medio intracelular) que las levaduras S. cerevisiae autóctonas analizadas (Yero 2.23 y Yero 2.24) (0.32-0.64 ng/mL en el medio extracelular y 0.10- 0.14 ng/mL en el medio intracelular) y que las no S. cerevisiae analizadas (T. delbrueckii y M.pulcherrima) (0.25-0.55 ng/mL en el medio extracelular y 0.09 ng/mL en el medio intracelular) (Figura 24). Concretamente, la levadura que produjo mayor concentración de HT fue S. cerevisiae comercial RF (6.12 ng/ mL) (Figura 24). Por tanto, la cepa RF fue la seleccionada para los futuros experimentos. Estos datos muestran que las diferentes cepas presentan diferentes capacidades para la síntesis de HT y su selección podría tener un impacto en la concentración final de este compuesto bioactivo. Fernández-Cruz et al., (2017) observaron también que varias cepas de levaduras (RF, QA23, ES 488, ICE GRE, Uvaferm, T. delbrueckii y M. pulcherrima) demostraron 0 1 2 3 4 5 6 7 CONCENTRACIÓN (ng/mL) Extracelular Intracelular Figura 24. Producción de hidroxitirosol (ng/mL) en mosto sintético 101 diferentes capacidades para la formación de compuestos bioactivos, en ese caso de melatonina. Específicamente, la cepa RF fue la que menos melatonina sintetizó (≈ 0.75 ng/mL), en mosto sintético, en el último día de fermentación (día 7). Respecto al resto de levaduras, ICV GRE y Uvaferm no produjeron melatonina y las restantes sintetizaron este compuesto en el siguiente orden: ES 488 (≈ 0.8 ng/mL), M. pulcherrima (≈ 0.9 ng/mL) y QA23 y T. delbrucuekii (≈ 1 ng/mL). Las concentraciones de glucosa y fructosa del mosto sintético del estudio de Fernández-Cruz et al., (2017) fueron las mismas que las de esta Tesis (100 g/L de cada azúcar). Sin embargo, ambos estudios se diferencian en que las muestras de Fernández-Cruz et al., (2017) fueron fermentadas a una temperatura ligeramente superior, 28ºC en lugar de 25ºC, que los mostos sintéticos fueron autoclavados a 121ºC durante 21 minutos en vez de esterilizados por filtrado y que los mostos fueron inoculados con 105 células/mL en lugar de con 106 células/mL. En el estudio de Álvarez-Fernández et al., (2018) las diferentes cepas de levaduras involucradas en la FA también mostraron diferentes capacidades para la producción de HT. La levadura T. delbrueckii fue la mayor productora de HT (16.1 ± 2.3 ng/mL) en muestras intracelulares de mosto sintético. Otras levaduras analizadas como QA23 y RF produjeron 6 ± 2.7 ng/mL y 106.2 ± 35.1 ng/mL de HT, respectivamente (Álvarez- Fernández et al., 2018). Estas concentraciones de HT en el medio intracelular fueron superiores a las obtenidas en esta Tesis, tanto a las extracelulares como a las intracelulares. En el estudio de Álvarez-Fernández et al., (2018) el mosto sintético tenía una concentración de glucosa y fructosa iguales que las del mosto sintético elaborado en esta Tesis (100 g/L de cada azúcar), también fue esterilizado por filtrado e inoculado con 106 células/mL. Sin embargo, en el estudio de Álvarez-Fernández et al., (2018) las muestras intracelulares fueron recolectadas en el día 2 de una fermentación de 14-15 días mientras que en esta Tesis en el día 7 y la temperatura de fermentación fue de 28ºC. Por otro lado, en vinos blancos, con la levadura Aroma White, las concentraciones fueron bastante superiores a las obtenidas en esta Tesis. Específicamente, en el día 7 fueron: Corredera (≈ 150 ng/mL), en una fermentación de 11 día; Moscatel (≈ 5 ng/mL), en una fermentación de 11 dias; Chardonnay (≈ 150 ng/mL), en una fermentación de 15 días; Sauvignon blanc (≈ 240 ng/mL), en una fermentación de 13 días; Palomino Fino Tradicional (≈ 70 ng/mL) en una fermentación de 7 días y Vijiriega (≈ 140 ng/mL), en una fermentación de 10 días. Una razón de que estas concentraciones sean superiores a las nuestras puede ser por el hecho de que son en mostos naturales y no en mosto sintético como en esta Tesis, así como que la temperatura de fermentación fue de 28ºC. Nuestros resultados coinciden con los de Romboli et al., (2015) que mostraron que la producción de HT + tirosol está influenciada por las cepas de levaduras involucradas en 102 la FA. Concretamente, vieron que en las fermentaciones con únicamente una cepa de levadura S. cerevisiae se encontró una gran variabilidad de HT + tirosol (Romboli et al., 2015). La concentración de HT + tirosol en el vino Sangiovese fue de 18400 ± 3300 ng/mL, con la levadura S. cerevisiae Sc1, la cual fue superior a las observadas en esta Tesis Doctoral. Este hecho puede deberse a que las fermentaciones fueron en mostos naturales y no en sintéticos. Además, en el estudio de Romboli et al., (2015) la fermentación duró 14 días y la temperatura de fermentación fue de 28ºC. Por otro lado, la levadura C. zemplinina en una inoculación secuencial influyó negativamente en la acumulación de estos alcoholes superiores. De acuerdo con González et al., (2018) en general, las levaduras no Saccharomyces sintetizan menores cantidades de alcoholes aromáticos en comparación con las levaduras S. cerevisiae, existiendo una gran variabilidad entre las cepas (Romano et al., 1992); (Zironi et al., 1993). Concretamente, en el estudio de González et al, (2018) en el mosto sintético con una concentración de glucosa y de fructosa de 100 g/L de cada azúcar, las concentraciones de tirosol fueron superiores a las obtenidas en esta Tesis. Concretamente fueron las siguientes: ≈ 5526.56-6908.2 ng/mL (QA23), ≈ 1381.64- 2072.46 ng/mL (H. uvarum Hu4), ≈ 552.656 ng/mL (S. bacillaris Cz4), ≈ 690.82-1381.64 ng/mL (M. pulcherrima) y ≈ 1381.64-1657.968 ng/mL (T. delbrueckii). Algunas diferencias de ambos estudios son que, en el estudio de González et al., (2018) la temperatura de fermentación fue de 28ºC, la fermentación duró solo 2 días y la inoculación fue de 2 x 106 células/mL. Por otro lado, al igual que en nuestros resultados, la levadura S. cerevisiae (QA23) produjo más tirosol que las no S. cerevisiae (H. uvarum, S. bacillaris, M. pulcherrima y T. delbrueckii) (González et al., 2018). 103 CAPÍTULO 2 104 Una vez seleccionada la cepa de levadura más productora de HT, la RF, se analizó la producción de este compuesto en dos mostos sintéticos con diferentes concentraciones iniciales de tirosina (10 y 60 mg/L) con el objetivo de evaluar si a mayor concentración de tirosina la levadura es capaz de sintetizar más HT. También se realizó un seguimiento del consumo de tirosina. 4.3 MONITORIZACIÓN DE LAS FERMENTACIONES ALCOHÓLICAS 4.3.1. DENSIDAD ÓPTICA El mosto sintético se elaboró con los mismos reactivos que el mosto sintético del Capítulo 1 (basado en Riou et al., (1997) con algunas modificaciones), con las siguientes modificaciones: el único aminoácido fue la tirosina (10 mg/L y 60 mg/L), la concentración de YAN fue de 140 mg/L y el resto del YAN lo aportó el sulfato de amonio (3.28 g/L en el mosto sintético bajo en tirosina y 3.19 g/L en el mosto sintético alto en tirosina). Los valores de tirosina seleccionados para las fermentaciones en mosto sintético son similares a aquellos descritos en la bibliografía para mostos naturales de diferentes variedades de uva. El seguimiento de las fermentaciones se llevó a cabo a través de la medición de la DO para determinar la velocidad de crecimiento de la cepa, en este caso, la RF (Figura 25). También se realizó mediante el desprendimiento de CO2 (Anexo, Figura 45). La absorbancia aumentó desde el inicio de la fermentación (día 1), luego se mantuvo más o menos constante a mitad (días 4-6) y finalmente disminuyó al final de la fermentación (días 8-10) (Figura 25). 105 Figura 25. Evolución de la absorbancia durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina 4.3.2. AZÚCARES RESIDUALES, ETANOL Y NITRÓGENO PRIMARIO Las fermentaciones fueron también monitorizadas a través del consumo de azúcares residuales (glucosa y fructosa) (Figura 26), la producción de etanol (Figura 27) y el consumo de nitrógeno (Figura 28), por la levadura RF. La concentración de azúcares residuales (glucosa y fructosa) fue disminuyendo progresivamente a lo largo de la fermentación, siendo totalmente consumidos al final (día 10) (Figura 26). Figura 26. Evolución de la concentración de azúcares residuales (g/L) durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 123456810 ABSORBANCIA TIEMPO (Días) Concentración (10 mg/L) Concentración (60 mg/L) 0 50 100 150 200 250 0 1 2 3 4 5 6 8 10 CONCENTRACIÓN (g/L) TIEMPO (Días) Concentración (10 mg/L) Concentración (60 mg/L) 106 La producción de etanol aumentó hasta mitad de fermentación (días 3-4) y a partir de ese momento tuvo lugar una disminucón notable hasta el día siguiente (días 4-5). Finalmente, a partir de estos días, en el caso del mosto sintético con una concentración inicial de 10 mg/L, aumentó ligeramente y en el caso del mosto sintético con una concentración inicial de 60 mg/L se mantuvo constante hasta el final de la fermentación (día 10) (Figura 27). Figura 27. Evolución de la concentración de etanol (g/L) durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina El nitrógeno fue prácticamente consumido en el día 0 de fermentación debido a una disminución brusca en su concentración, luego se mantuvo prácticamente constante hasta el final de la fermentación (día 8) aumentando ligeramente en el último día (día 10) (Figura 28). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 1 2 3 4 5 6 8 10 CONCENTRACIÓN (g/L) TIEMPO (Días) Concentración (10 mg/L) Concentración (60 mg/L) 107 Figura 28. Evolución de la concentración de nitrógeno primario (g/L) durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina Es importante que las levaduras tengan nitrógeno disponible para llevar a cabo la fermentación (Crepin et al., 2012). Concretamente, 140 mg/L es la concentración minima de nitrógeno disponible para las levaduras necesaria para la fermentación (Vendramini et al., 2017). Si el nitrógeno disponible es insuficiente, la fermentación se vuelve más lenta y hay un alto riesgo de que se pare (Bell & Henschke, 2005). Por lo tanto, 140 mg/L fue la concentración de nitrógeno disponible para las levaduras en el mosto sintético con el fin de forzar a la levadura a usar la tirosina, una fuente no preferida. 4.4 INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE TIROSINA EN EL MOSTO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE HIDROXITIROSOL En el día 0 de la FA el HT está ausente tal como se esperaba y fue detectado desde el primer día de la FA en cada muestra (Figura 29). En el mosto sintético con una concentración inicial de tirosina de 10 mg/L, el HT estuvo presente desde el primer día y no existen diferencias significativas desde el día 2 y los días posteriores (Figura 29). Sin embargo, en el mosto sintétio con una concentración inicial de tirosina de 60 mg/L la mayor concentración de HT apareció en el día 3, disminuyendo levemente en los días posteriores (Figura 29). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0 1 2 3 4 5 6 8 10 CONCENTRACIÓN (g/L) TIEMPO (Días) Concentración (10 mg/L) Concentración (60 mg/L) 108 El tirosol se forma a partir de la tirosina por la ruta de Ehrlich (Mas et al., 2014). Una hidroxilación posterior del tirosol da lugar a la síntesis de HT (Muñiz-Calvo et al., 2020). Por lo tanto, la hipótesis fue que, a mayor concentración de tirosina en el medio, mayor contenido de HT producido. Sin embargo, a pesar de que la concentración de tirosina fue seis veces superior, el HT no fue producido en esa proporción. Por ejemplo, en el día 3 de fermentación, la concentración de HT del mosto con una concentración inicial de 10 mg/L de tirosina fue de 5.48 ng/mL. En el mosto con una concentración inicial de tirosina de 60 mg/L la concentración de HT debería haber sido 6 veces superior, es decir, 32.88 ng/mL, no obstante, esta fue de 8.09 ng/mL (1.48 veces más concentrado). La concentración de tirosina inicial no parece tener un papel decisivo en la producción de HT. Por lo tanto, podría haber otros factores o rutas metabólicas involucradas en la producción de HT. Lo mismo ocurrió en otros estudios donde el aumento en el aminoácido precursor (fenilalanina, triptófano y tirosina) aumentó la producción de sus alcoholes resultantes (feniltanol, triptofol y tirosol), sin embargo, estos incrementos no fueron proporcionales a los aumentos en los precursores (González et al., 2018); (Ghosh et al., 2008) (Gori et al., 2011). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 8 10 CONCENTRACIÓN (ng/mL) TIEMPO (Días) Concentración (10 mg/L) Concentración (60 mg/L) *** *** *** *** *** ** ** Figura 29. Evolución de la concentración de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina. Diferencias significativas entre las dos concentraciones de tirosina, con p < 0.05 son mostradas con *, p < 0.01 con ** y p < 0.001 con *** 109 Para confirmar que la levadura sintetiza HT, fue analizado en el medio intracelular. Las concentraciones fueron inferiores en el medio intracelular que en el compartimento extracelular. Las mayores concentraciones detectadas en el medio intracelular fueron en los días 6 (2.74 ng/mL) y 5 (0.65 ng/mL) cuando el mosto tuvo 10 mg/L y 60 mg/ de concentración de tirosina, respecitvamente (Figura 30). Álvarez-Fernández et al., (2018) demostraron que la levadura (S. cerevisiae QA23 y RF y T. delbruecki Biodiva) puede sintetizar HT ya que fue detectado en el medio intracelular. Las levaduras S. cerevisiae usan NH4 como fuente de nitrógeno preferida. Sin embargo, en condiciones en las que este compuesto está restringido, las levaduras pueden usar otras fuentes como los aminoácidos (Mas et al., 2014b). La naturaleza y composición del medio (mosto de uva sintético, mosto de uva natural, mosto de cerveza, etc.) es un factor que puede afectar a la producción de metabolitos que promueven la salud humana (Vilela, 2019). Concretamente, es conocido que la producción de alcoholes superiores por levaduras puede estar influenciada por la composición del mosto de uva (parámetros fisicoquímicos) (Romboli et al., 2015). 0 1 2 3 1 2 3 4 5 6 8 10 CONCENTRACIÓN (ng/mL) TIEMPO (Días) Concentración (10 mg/L) Concentración (60 mg/L) Figura 30. Evolución de la concentración de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio intracelular, durante la fermentación alcohólica en mosto sintético con diferentes contenidos de tirosina 110 Fino, en el día 5 de fermentación en una fermentación de 15 dias en el caso del Chardonnay y de 7 días en el palomino Fino (Álvarez-Fernández et al., 2018). Álvarez- Fernández et al., (2018) usaron la cepa de levadura Aroma White y la temperatura de fermentación fue de 28ºC. La microflora de la uva podría ser la responsable de la diferencia entre los valores registrados y aquellos obtenidos al esterilizar los mostos de uva. De hecho, la concentración de tirosina no parece ser un factor relevante, mostrando ser producida a una tasa constante. Aparentemente, la presencia de diferentes cepas podría ser más importante para lograr unas mayores cantidades. Estudios previos indican que los valores obtenidos en mostos blancos fermentados (21.78 ng/mL como máximo) son notablemente inferiores que los determinados para los tintos, concretamente con el Tempranillo con la mayor concentración de HT en el día 2 (235 ng/mL) (Álvarez-Fernández et al., 2018). Piñeiro et al., (2011) determinaron valores de entre 280 ng/mL y 5020 ng/mL de HT en 15 variedades de vino tinto. Este hecho lleva a pensar en otras vías alternativas que implican polifenoles ya que los vinos tintos son más ricos en HT que los rosados (1.1 ± 0.4 mg/kg2 y 1.2 ± 0.8 mg/kg2) y los blancos (Ragusa et al., 2017). 4.8 INFLUENCIA DEL TIPO DE MOSTO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE TIROSINA Con respecto a la presencia de tirosina en el medio extracelular, las concentraciones en el mosto Palomino Fino oscilaron entre 4.31 ng/mL (día 4) y 12.20 mg/L (día 2), mientras que las concentraciones en el mosto Chardonnay oscilaron entre 3.83 ng/mL (día 1) y 21.79 ng/mL (día 2). Las concentraciones de tirosina disminuyeron brucamente del día 0 al día 1 y a lo largo de toda la fermentación fueron aumentando y disminuyendo hasta ser al final de la fermentación (día 7) similares a las del día 1 (Figura 35). 117 Estos valores son similares a los obtenidos en el mosto sintético con una concentración inicial de tirosina de 10 mg/L. No hay diferencias significativas entre los mostos y tampoco entre los días, a excepción de los días 0 (Palomino Fino 117 ng/mL y Chardonnay 109 ng/mL) y 1 en ambos mostos. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 1 2 3 4 5 6 7 CONCENTRACIÓN (ng/mL) TIEMPO (Días) Palomino Fino Chardonnay Figura 35. Evolución de la concentración de tirosina (ng/mL), en el medio extracelular, durante la fermentación alcohólica en los mostos de uva natural Palomino Fino y Chardonnay 118 CAPÍTULO 4 119 El Capítulo 4 se centra en analizar la producción de HT y tirosol en mostos de uva tinta y blanca (Tempranillo, Pedro Ximénez y Palomino Fino) a dos temperaturas diferentes de fermentación (18 y 25ºC) y sometidos a esterilización y sin esterilizar para evaluar un posible efecto de consorcios de diferentes levaduras. 4.9 MONITORIZACIÓN DE LAS FERMENTACIONES ALCOHÓLICAS 4.9.1 DESPRENDIMIENTO DE CO2 Igualmente, el progreso de las fermentaciones fue seguido por las determinaciones de las pérdidas de pesos debido a la liberación de CO2 hasta que los pesos se mantuvieron constantes (Figuras 36, 37 y 38) y mediante la medición de la densidad óptica (Anexo, Figuras 47, 48 y 49). El desprendimiento de CO2 en Pedro Ximénez, Tempranillo y Palomino Fino aumentó progresivamente desde el inicio de la fermentación (día 0) hasta mitad de fermentación (día 4 en los fermentados a 25ºC y día 5 en los fermentados a 18ºC), luego experimentó un notable aumento hasta dos días más tarde (días 6 y 7, respectivamente) momento a partir del cual las concentraciones se mantuvieron prácticamente estables hasta el final de la fermentación (días 8 y 9) (Figuras 36, 37 y 38). Figura 36. Evolución de la liberación de CO2 (g/L) durante la fermentación alcohólica en el mosto de uva natural Pedro Ximénez. Pedro X: Pedro Ximénez; E: esterilizado; NE: no esterilizado; 25: temperatura de 25ºC; 18: temperatura de 18ºC 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0123456789 CONCENTRACIÓN (g/L) TIEMPO (Días) Pedro X E 25 Pedro X NE 25 Pedro X E 18 Pedro X NE 18 120 Figura 37. Evolución de la liberación de CO2 (g/L) durante la fermentación alcohólica en el mosto de uva natural Tempranillo. E: esterilizado; NE: no esterilizado; 25: temperatura de 25ºC; 18: temperatura de 18ºC Figura 38. Evolución de la liberación de CO2 (g/L) durante la fermentación alcohólica en el mosto de uva natural Palomino Fino. PF: Palomino Fino; E: esterilizado; NE: no esterilizado; 25: temperatura de 25ºC; 18: temperatura de 18ºC 0 50 100 150 200 250 0123456789 CONCENTRACIÓN (g/L) TIEMPO (Días) Tempranillo E 25 Tempranillo NE 25 Tempranillo E 18 Tempranillo NE 18 0 50 100 150 200 250 0123456789 CONCENTRACIÓN (g/L) TIEMPO (Días) PF E 25 PF NE 25 PF E 18 PF NE 18 121 4.10 INFLUENCIA DE LA ESTERILIZACIÓN DEL MOSTO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE HIDROXITIROSOL Y TIROSOL En el caso del mosto natural Tempranillo, las concentraciones de HT sólo presentaron diferencias significativas en las muestras de final de fermentación a 25ºC, siendo mayores en las muestras no esterilizadas (Tabla 27; Figura 39). Tabla 27. Producción de hidroxitirosol y tirosol durante la fermentación alcohólica del mosto Tempranillo Temperatura 18ºC Temperatura 25ºC Hidroxitirosol Tirosol Hidroxitirosol Tirosol Inicio 2,57 ± 0,08 0 2,57 ± 0,08 0 Mitad E 0,86 ± 0,07 74,91 ± 3,32 0,87 ± 0,17 155,89 ± 33,77b Mitad NE 0,96 ± 0,17 n.d. 1,07 ± 0,04 70,48 ± 19,68b Final E 1,93 ± 0,56 179,01 ± 47,96c 1,54 ± 0,74a 314,75 ± 174,07d Final NE 1,83 ± 1,01e 79,57 ± 25,94c,f 19,87 ± 3,48a,e 7852,90 ± 789,25d,f Los valores principales y las desviaciones estándard están expresados en ng/mL. E: esterilizado; NE: no esterilizado; Los mismos superíndices indican diferencias significativas p<0.05 Figura 39. Producción de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Tempranillo durante la fermentación alcohólica. Diferencias significativas son mostradas con p < 0.05 0 5 10 15 20 25 ENE CONCENTRACIÓN (ng/mL) Inicio Mitad 18 Mitad 25 Final 18 Final 25 e a 122 En relación con la fermentación realizada con mosto de uva Palomino Fino, al igual que en el Tempranillo, todas las muestras no esterilizadas presentaron concentraciones significativamente mayores de HT en comparación con las esterilizadas. Concretamente, los valores mayores se alcanzaron al final de la fermentación (día 9) en las muestras fermentadas a 25ºC (25.75 ± 2.18 ng/mL) (Tabla 28; Figura 40). Tabla 28. Producción de hidroxitirosol y tirosol durante la fermentación alcohólica del mosto Palomino Fino Temperatura 18ºC Temperatura 25ºC Hidroxitirosol Tirosol Hidroxitirosol Tirosol Inicio 0 0 0 0 Mitad E 0,92 ± 0,04a 4102,74 ± 458,32e 1,56 ± 0,51b 5172,29 ± 784,33 Mitad NE 20,78 ± 5,22a 4700,70 ± 342,96e 11,64 ± 2,20b 6514,71 ± 1283,99 Final E 0,75 ± 0,30c 5847,96 ± 1052,46f 1,17 ± 0,33d 5375,87 ± 675,10g Final NE 15,10 ± 0,67c,h 8120,49 ± 1480,75f 25,75 ± 2,18d,h 7218,97 ± 715,02g Los valores principales y las desviaciones estándard están expresados en ng/mL. E: esterilizado; NE: no esterilizado; Los mismos superíndices indican diferencias significativas p<0.05 Figura 40. Producción de hidroxitiroso (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Palomino Fino durante la fermentación alcohólica. Diferencias significativas son mostradas con p < 0.05 0 5 10 15 20 25 30 ENE CONCENTRACIÓN (ng/mL) Inicio Mitad 18 Mitad 25 Final 18 Final 25 c a d h b 123 En el mosto natural Pedro Ximénez, las muestras presentaron diferencias significativas sólo al final de la fermentación a la temperatura de 18ºC y a la mitad de fermentación cuando se fermentó a 25ªC, siendo en todos los casos la concentración de HT mayor en las muestras no esterilizadas (Tabla 29; Figura 41). Tabla 29. Producción de hidroxitirosol y tirosol durante la fermentación alcohólica del mosto Pedro Ximénez. Los valores principales y las desviaciones estándard están expresados en ng/mL. E: esterilizado; NE: no esterilizado; Los mismos superíndices indican diferencias significativas p<0.05 Figura 41. Producción de hidroxitirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Pedro Ximénez durante la fermentación alcohólica. Diferencias significativas son mostradas con p < 0.05 Con relación al Tempranillo, las concentraciones de tirosol fueron significativamente mayores en la muestra final no esterilizada a 25ºC y en la muestra de mitad de 0 5 10 15 20 25 30 ENE CONCENTRACIÓN (ng/mL) Inicio Mitad 18 Mitad 25 Final 18 Final 25 a d Temperatura 18ºC Temperatura 25ºC Hidroxitirosol Tirosol Hidroxitirosol Tirosol Inicio 3,48 ± 0,17 0 3,48 ± 0,17 0 Mitad E 0,65 ± 0,26 n.d. 0,59 ± 0,09a 131,37 ± 38,70 Mitad NE 0,77 ± 0,32 79,79 ± 2,29 2,84 ± 0,31a 84,56 ± 25,37 Final E 19,35 ± 0,18b,d 5270,35 ± 2338,46f 1,06 ± 0,12d 305,72 ± 20,12c,f Final NE 27,28 ± 0,45b,e 2805,21 ± 477,40g 2,38 ± 1,06e 107,31 ± 0,40c,g b e 124 fermentación esterilizada a 25ºC, mientras que a 18ºC las mayores concentraciones de tirosol se presentaron en las muestras finales esterilizadas (Tabla 29; Figura 42). Figura 42. Producción de tirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Tempranillo durante la fermentación alcohólica. Diferencias significativas son mostradas con p < 0.05 En el caso de Palomino Fino, la concentración de tirosol también presentó diferencias significativas entre las muestras no esterilizadas y esterilizadas, excepto a mitad de fermentación a 25ºC, dando lugar a mayores concentraciones en las no esterilizadas en todas las muestras (Tabla 28; Figura 43). 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 ENE CONCENTRATCIÓN (ng/mL) Inicio Mitad 18 Mitad 25 Final 18 Final 25 b c f d 125 Figura 43. Producción de tirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Palomino Fino durante la fermentación alcohólica. Diferencias significativas son mostradas con p < 0.05 En el caso del tirosol en Pedro Ximénez, sólo presentaron diferencias significativas en las muestras de final de fermentación a 25ºC, siendo mayores en las muestras esterilizadas (Tabla 29; Figura 44). Figura 44. Producción de tirosol (ng/mL), en el medio extracelular, en el mosto de uva natural Pedro Ximénez durante la fermentación alcohólica. Diferencias significativas con p < 0.05 son mostradas con *, p < 0.01 con ** y p < 0.001 con *** 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 ENE CONCENTRACIÓN (ng/mL) Inicio Mitad 18 Mitad 25 Final 18 Final 25 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 ENE CONCENTRACIÓN (ng/mL) Inicio Mitad 18 Mitad 25 Final 18 Final 25 c g e f g f 126 potential applications in human disease and aging. Toxicology, 278(1), 55–67. https://doi.org/10.1016/j.tox.2010.04.008 Bordiga, M., Lorenzo, C., Pardo, F., Salinas, M. R., Travaglia, F., Arlorio, M., … Garde- Cerdán, T. (2016). 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