Análisis metabolómico y evaluación de la bioactividad de compuestos producidos por levaduras presentes en alimentos

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA, TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL Análisis metabolómico y evaluación de la bioactividad de compuestos producidos por levaduras presentes en alimentos Memoria presentada para optar al Título de Doctor por la Universidad de Sevilla con la mención de “Doctor Internacional” por la graduada, Marta Gallardo Fernández DIRECTORES Mª Carmen García Parrilla Ana Mª Troncoso González Sevilla, 2022 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Área de Nutrición y Bromatología Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de Farmacia. C/Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 12 45 Fax: 954 55 61 10 Dña. SILVIA PICHARDO SÁNCHEZ, Catedrática de Universidad y Directora del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, INFORMA: Que la Tesis Doctoral titulada: “Análisis metabolómico y evaluación de la bioactividad de compuestos producidos por levaduras presentes en alimentos” presentada por la Gda. MARTA GALLARDO FERNÁNDEZ para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el Área de Nutrición y Bromatología de este Departamento bajo la dirección de las Dir.as, Mª CARMEN GARCÍA PARRILLA y ANA Mª TRONCOSO GONZÁLEZ, durante el tiempo requerido y cumpliendo los requisitos exigidos en este tipo de trabajo. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo en Sevilla, a 17 de octubre de 2022. Fdo. Silvia Pichardo Sánchez PICHARDO SANCHEZ SILVIA - Firmado digitalmente por PICHARDO SANCHEZ SILVIA - UNIVERSIDAD DE SEVILLA Área de Nutrición y Bromatología Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de Farmacia. C/Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 12 45 Fax: 954 55 61 10 Dña. Mª CARMEN GARCÍA PARRILLA Y ANA Mª TRONCOSO GONZÁLEZ, Catedráticas de Universidad del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: Que la Tesis Doctoral titulada: “Análisis metabolómico y evaluación de la bioactividad de compuestos producidos por levaduras presentes en alimentos” ha sido realizada por la Gda. MARTA GALLARDO FERNÁNDEZ en el Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla bajo su dirección y que reúne, a su juicio, las condiciones requeridas para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla con la mención de “Doctor Internacional”. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos en Sevilla, a 12 de octubre de 2022. Fdo. Mª Carmen García Parrilla Fdo. Ana Mª Troncoso González GARCIA PARRILLA MARIA DEL CARMEN - TRONCOSO GONZALEZ ANA MARIA MARGARITA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Área de Nutrición y Bromatología Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de Farmacia. C/Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 12 45 Fax: 954 55 61 10 Dña. Mª CARMEN GARCÍA PARRILLA Y ANA Mª TRONCOSO GONZÁLEZ, Catedráticas de Universidad del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: Que siendo directoras de la Tesis Doctoral de la Gda. MARTA GALLARDO FERNÁNDEZ, con título “Análisis metabolómico y evaluación de la bioactividad de compuestos producidos por levaduras presentes en alimentos” avalan la idoneidad de la presentación de la misma en la modalidad de compendio por publicaciones, e indican que las aportaciones publicadas cumplen los requisitos de la Normativa reguladora de Estudios de doctorado. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos en Sevilla, a 12 de octubre de 2022. Fdo. Mª Carmen García Parrilla Fdo. Ana Mª Troncoso González A mis Padres, A mi Hermano Ana Belén, mi pepito grillo jaja. Creo que, si tuviera que describirte con una palabra, sería bondad. Gracias por recordarme siempre que lo he necesitado que es posible comerse la ballena a tapitas. Por transmitirme esa gran paciencia que tanta falta me hace, por tu cariño, por siempre estar dispuesta a echarme una mano incondicionalmente. Por compartir conmigo tantas anécdotas de Lucia y Martita. Me has hecho el camino más llano y siempre te estaré agradecida. Pilar, quiero agradecerle a la vida por haberte puesto en mi camino. Eres hogar, eres apoyo. “Ya está”, “ahí va...”, “Moreover”, mi compañera de risas, de comer mesas jaja, y de lágrimas. Aún recuerdo cada consejo que me has dado, cada anécdota vivida, cada mirada cómplice jaja. Estoy tan orgullosa de ti Dra. Segura... Mi elfa favorita, Marina. Llegaste para inundarlo todo de luz, alegría y positivismo. Es inevitable no sonreír al acordarme de tantas anécdotas que hemos vivido. Gracias por creer en mí siempre, por hacerme ver la luz al final del túnel, ser mi confidente en todo lo profesional y personal y enseñarme a vivir ligero. Confío ciegamente en ti y eso es algo complicado hoy en día. La palabra amistad se queda corta contigo, mi futura doctora, mi amiga, mi confidente, no dejes que nadie te apague jamás. Rocío, mi “compañera de colegio público” jaja, gracias por acompañarme en esta etapa, ayudarme, motivarme y enseñarme a quitarle hierro a las situaciones más complicadas. Gracias a Raquel y a Lourdes por su cercanía y ayuda cuando lo he necesitado. Eva, una parte importante de esta etapa. Gracias por abrirme las puertas de tu laboratorio y estar siempre dispuesta a ayudarme. Por las eternas risas delante del equipo y con Olaf siempre presente. La chilena del grupo, Cristina. Gracias por aportarme serenidad y calma cuando más lo he necesitado. Por sacarle el punto gracioso a todo, por motivarme e inspirarme a crecer y hacerme el día a día más cómodo. Fernando nuestro princeso, gracias por haberme regalado tantos momentos de diversión que hacían el día a día más llevadero, te echamos de menos. A Dani, por estar cuando lo he necesitado y hacerme vivir momentos que siempre recordaré. Edu gracias por todo tu apoyo, por ayudarme siempre y tener los mejores consejos para mí. A Pili por enseñarme tanto de la vida. Mar, gracias por estar dispuesta siempre a sacarme una sonrisa. Pedro, qué alegría que llegaras, no dejes nunca de hacer reír. Gracias Inma porque empezamos esta etapa juntas y siempre has hecho que crea en mí. Elena, has formado parte de esta Tesis y siempre voy a estarte agradecida por toda tu ayuda, apoyo, comprensión y risas. José Luis, por ofrecerte siempre a echarme una mano y ser compañero de cenas de gala jaja. A Eme y Conchi por las risas compartidas y las palabras de apoyo que siempre habéis tenido para mí. Por supuesto, a Félix. Eres una de las personas más resolutivas que conozco. Gracias de corazón por toda tu ayuda. Por sacarme siempre sonrisas, por tu amabilidad y por tus anécdotas que me hacían desconectar entre tanto trabajo. Quiero agradecer al Dr. Tristán por admitirme en su grupo de investigación para realizar mi estancia en Burdeos y hacerme sentir una más. A Josep por haber confiado siempre en mí y haberme apoyado siempre. Agradecerle también a la Dra. Maria Alexandra por haberme enseñado tanto durante mi estancia en Lisboa y recibirme con tanto cariño desde el primer día. A Rita por trabajar codo con codo cada día, por las risas entre placa y placa y estar siempre. A Joana por su apoyo y comprensión. A Rafa y Sara por ser mi familia portuguesa, por los largos paseos con Pixie, por apoyarme, escucharme y hacer de mi estancia una experiencia que jamás olvidaré. A las señoras de la cafetería por sus “Bom dia” y sonrisas cada mañana Al Dr. José Manuel Guillamón, la Dra. Mª Jesús Torija y a todo su Grupo de Investigación, excelentes profesionales y personas. A Ana y Rocío de bioquímica por confiar en mi y haberme enseñado tanto. A Josefa por haber estado siempre dispuesta a resolver todas mis dudas y transmitirme calma. Al Dr. Modesto Carballo, a Cristina y a Laura por ayudarme y animarme siempre que lo he necesitado. A Mónica, por hacerme más amenas las largas horas de laboratorio. Me has aportado alegría e interminables carcajadas cuando más lo he necesitado. Gracias por creer en mí y levantarme cada día. Eres una gran persona. A Eva y a Mercedes por ayudarme a empezar mis mañanas con una gran sonrisa y darme los consejos que siempre he necesitado, formáis parte de este trabajo. A mis amigas Laura, Margarita, Irene, Carmen, Irene B. y Leticia. Irene, gracias por cada mensaje, gracias por demostrarme que la distancia importa poco cuando alguien importa mucho y estar siempre que te he necesitado. Mi SH, gracias por ser hermana, por quererme tanto y tan bien, por cuidarme, por las risas, los abrazos, los momentos. Leticia, lo mejor que me dio la química. Por ser tan fundamental en mi vida, por sacarme a bailar, y regalarme momentos únicos. Gracias a cada una de vosotras por rescatarme tras mis largas horas de trabajo. Alex, mi compañero de la carrera. Mi dibujante personal, aún conservo tus dibujos. Cuántas risas hemos compartido en nuestro verano de prácticas jaja. Te aprecio tanto, gracias por estar siempre y gracias por hacerme la portada de Tesis más bonitas del universo. A mis abuelos. Salud y Rafael, sé que allá donde estéis estaréis muy orgullosos de mí. Abuelita Salud, tu secretaría te dedica esta Tesis. A mi abuelo Cristóbal por haberme regalado entrañables momentos, siempre te recordaré en el campo dónde fuiste tan feliz. Mercedes, mi súper abuela. Eres una todoterreno. Por estar siempre tan orgullosa de mí, y hacérselo saber al pueblo entero siempre tan entusiasmada. A mi “tita” Mari, gracias por aconsejarme siempre, por nuestras largas charlas y por impulsarme siempre a seguir. A mis primos Jimena y Enrique, siempre me habéis sacado una sonrisa y ayudado a desconectar. Al resto de mis tíos por cuidarme tanto y tan bien. Mili y J. Carlos, gracias por arroparme siempre y quererme tanto. A Adrián, Daniela y Hugo por vuestra inocencia y diversión que me hacían desconectar. A mi cuñada Carmen por transmitirme esa alegría que tanto te caracteriza, gracias. Enma y Máximo, os debo largas horas de paseo. Gracias por vuestro amor incondicional, por recibirme cada día con tanto entusiasmo el cual me da tanta alegría y estar, literalmente, siempre cerca de mí en mis largas horas frente al ordenador. A ti, mi compañero de vida por haber aguantado mis largas ausencias, por estar cada día y cada minuto animándome, apoyándome para conseguir mis metas y teniendo una paciencia infinita en mis peores momentos de estrés…, por rescatarme de mis largas horas trabajando y hacer que me despeje, pero sobre todo por demostrarme cada día lo mucho que me quieres. Hermano, un gracias se queda corto para expresarte mi mas profundo agradecimiento. Me has cuidado tanto, me he sentido tan protegida por ti. Eres un pilar fundamental en mi vida, siempre has estado para resolver cualquier situación, doy fe de que nadie sabe más que tú sobre todo y sigo pensando que tienes contactos en la nasa que te informan de todo jaja. Mis padres, lo más importante de mi vida. Hubiera sido totalmente imposible haber llegado hasta aquí sin vosotros. Este trabajo es fruto de todos y cada uno de los sacrificios que habéis hecho por mí. Papá, gracias por tu interés diario en saber si había inventado algo nuevo, no existe persona en el universo con tanta sabiduría como tú. Que grandes consejos me has dado, y que grandes lecciones. Me has sacado carcajadas cuando por dentro estaba rota. Me has acompañado, guiado y escuchado siempre sin juzgarme. Que sepas que siempre vas a ser el portero de mi cole. Eternamente tu divina pastora. Mamá, mi mami. Jamás seré capaz de poder mostrarte tanto que agradecerte. No te ha faltado jamás una muestra de cariño, un abrazo, palabras de ánimo. Me has enseñado a preocuparme de las cosas cuando lleguen y no antes, que sabias palabras. Por cada comidita acompañada de sorpresas. Has vivido por y para mi en cuerpo y alma desde que nací. Por tu arte para hacer reír, por estar cada mañana en la terraza para despedirte de mí. Ojalá poder llegar a ser como tú algún día. Eternamente, tu “chiqui”. Sois mi hogar, sois mi refugio. Nunca viviré los suficientes años para poder agradeceros tanta ayuda, paciencia, comprensión y cariño sin los cuáles, probablemente, nunca hubiese terminado mi doctorado. Mil gracias. Índice Resumen …………………………………………………………………………………………………………………. 27 Summary …………………………………………………………………………………………………………………. 29 Abreviaturas ……………………………………………………………………………………………………………. 31 Índice de Figuras ……………………………………………………………………………………………………… 35 Índice de Tablas ………………………………………………………………………………………………………. 37 Introducción ………………………………………………………………………………………....................... 39 1. DIETA MEDITERRÁNEA, BEBIDAS FERMENTADAS Y COMPUESTOS BIOACTIVOS ……………………………………………………………………………………………………………………… 41 2. HIDROXITIROSOL EN LA DIETA ……………………………………………………………………… 46 2.1 Aceituna de mesa …………………………………………………………………………………… 47 2.2 Aceite de oliva virgen …………………………………………………………………………….. 50 2.3 Vino ……………………………………………………………………………………………………….. 51 3. BIODISPONIBILIDAD DE HIDROXITIROSOL EN FLUIDOS BIOLÓGICOS…………….. 52 3.1 Absorción ……………………………………………………………………………………………….. 52 3.2 Distribución ……………………………………………………………………………………………. 53 3.3 Metabolización ………………………………………………………………………………………. 54 3.4 Excrección ………………………………………………………………………………………………. 56 3.5 Fuentes endógenas de hidroxitirosol y tirosol ………………………………………... 56 3.5.1 Formación endógena de hidroxitirosol a partir de dopamina y tirosol ……………………………………………………………………………………………………. 56 3.5.2 Formación endógena de tirosol a partir de tiramina …………………… 58 3.5.3 Interacción del etanol en la formación endógena de hidroxitirosol y tirosol …………………………………………………………………………………………. 59 4. PROPIEDADES BIOACTIVAS DEL HIDROXITIROSOL ………………………………………… 60 Justificación, hipótesis y objetivos …………………………………………………………………………… 63 Materiales y métodos ……………………………………………………………………………………………... 69 1. Materiales ……………………………………………………………………………………………………. 71 1.1 Reactivos ……………………………………………………………………………………………….. 71 1.1.1 Elaboración del mosto ………………………………………………………………… 71 1.1.2 Fermentaciones ………………………………………………………………………….. 74 1.1.2.1 Levaduras vínicas comerciales ………………………………………………. 74 1.1.3 Determinaciones cromatográficas ………………………………………………. 74 1.1.3.1 Patrones analíticos ………………………………………………………………… 74 1.1.3.2 Disolventes ………………………….………………………………………………… 75 1.1.4 Ensayos de actividad biológica ……………………….…………………………... 75 1.1.4.1 Compuestos seleccionados para el estudio de bioactividad …………………………….………………………….…………………………………….. 82 1.1.4.2 Líneas celulares ……………………….………………………….………………… 82 1.2 Instrumentación ……………………….………………………………………………….………… 83 1.3 Material fungible ……………………….………………………………………………….……….. 85 1.4 Software informático ……………………….………………………………………………….…. 85 2. Métodos ………………….…………………………………………………………….…………………….. 86 2.1 Preparación del mosto sintético ……..………………….………………………………….. 86 2.1.1 Rehidratación de las levaduras ………………….………………………………… 86 2.1.2 Preinóculo para el mosto sintético ………………….………………………….. 87 2.1.3 Inoculación en el mosto sintético ………………….……………………………. 87 2.2 Tratamiento de muestras ……………….…………………………………….………………… 88 2.3 Estudio de la ruta de síntesis de melatonina e hidroxitirosol mediante cromatografía líquida de ultra alta eficacia acoplado a espectrometría de masas (UHPLC/HRMS) ………..….………………….………………….……………………….. 89 2.4 Estimación de la ingesta dietética de HT en la población adulta de la Unión Europea ….……………….……………….……………….……………….……………….…………. 90 2.5 Ensayos in vitro para el estudio de la integridad de la barrera hematoencefálica .……………….……………….……………….………………………………..92 2.5.1 Cultivo de células ………………………………………………………………………… 92 2.5.2 Evaluación de la citotoxicidad (MTT) …………………………………………… 93 2.5.3 Resistencia eléctrica transendotelial (TEER) ………………………………… 94 2.5.4 Permeabilidad celular …………………………………………………………………. 95 2.5.5 Inmunocitoquímica …………………………………………………………………….. 96 2.6 Estudio del transporte a través de la barrera hematoencefálica …………….. 97 2.7 Ensayos para la evaluación del efecto neuroprotector …………………………… 98 2.7.1 Cultivo de células …………………………………………………………………………… 98 2.7.2 Toxicidad de los bioactivos en células neuronales (MTT)………………… 99 2.7.3 Estudio del nivel de agregación de α-sin en presencia de los bioactivos …………………………………………………………………………………………………................ 99 2.7.3.1 Ensayo ThT ……………………………………………………………………………. 99 2.7.3.2 Electroforesis ………………………………………………………………………. 100 2.7.3.3 Imágenes al microscopio electrónico de transmisión ………….. 100 2.7.4. RT-PCR ………………………………………………………………………………………… 101 2.8 Ensayos para el análisis del efecto neuroantiinflamatorio del hidroxitirosol ..……………………………………………………………………………………………………………. 102 2.8.1 Cultivo de células …………………………………………………………………………. 102 2.8.2 Ensayo de citotoxicidad (Rojo neutro) …………………………………………. 102 2.8.3 RT-PCR …………………………………………………………………………………………. 102 2.8.4 Análisis de p38, JNK, IL-1β y Akt mediante el ensayo de western blot ……………………………………………………………………………………………………………… 103 2.8.5 Determinación de especies reactivas de oxígeno ………………………… 104 2.8.6 Detección inmunohistoquímica de translocación al núcleo NFκB p65 ……………………………………………………………………………………………………………… 105 2.9 Ensayos para la determinación de la actividad anti-angiogénica ..……………………………………………………………………………………………………………. 106 2.9.1 Cultivo de células ………………………………………………………………………... 106 2.9.2 Determinación del potencial anti-VEGF de por el método ELISA: Estimación del IC50 .…………………………………………………………………………..... 107 2.9.3 Análisis de PLCγ1, Akt e eNOS mediante el ensayo de western blot ……………………………………………………………………………………………………………... 107 Resultados …………………………………………………………………………………………………………......109 Capítulo 1 ….……………………………………………………………………………………………….. 111 Capítulo 2 ….……………………………………………………………………………………………….. 123 Capítulo 3 ….……………………………………………………………………………………………….. 151 Capítulo 4 ….……………………………………………………………………………………………….. 185 Capítulo 5 ….……………………………………………………………………………………………….. 199 Capítulo 6 ….……………………………………………………………………………………………….. 219 Capítulo 7 ….…………………………………………………………………………………………....... 257 Discusión general …………………………………………………………………………………………………… 271 Conclusiones ……………………………………………………………………………………………………....... 297 Conclusions ……………………………………………………………………………………………………......... 299 Bibliografía …………………………………………………………………………………………………….......... 301 RESUMEN SUMMARY ABREVIATURAS 32 DMSO: Dimetilsulfóxido DOC: Desoxicolato de sodio DOPAC: 3,4-dihidroxifenilacético DOPAL: 3,4-dihidroxifenilacetaldehído DOPET: 3,4-dihidroxifeniletanol EBM-2: Medio de cultivo basal endotelial EDTA: Ácido etilendiaminotetracético EGCG: epigalocatequina-3-galato EGM-2: Medio de cultivo de crecimiento de células endoteliales ELISA: Ensayo de inmunoabsorción enzimática FBS: Suero fetal bovino HBMEC: células endoteliales microvasculares del cerebro humano HO-1: hemo oxigenada-1 HT: hidroxitirosol HUVEC: células endoteliales de vena de cordón umbilical humano HVA: Ácido homovalínico IBA: ácido indol butírico IL-1β: interleukina 1-beta ILA: ácido indolláctico IPA: ácido indolpropiónico IPy: ácido indolpirúvico LDL: lipoproteínas de baja densidad LDL: lipoproteínas de baja densidad ABREVIATURAS 33 LPS: lipopolisacáridos L-TRP: triptófano MAO: Monoamina oxidasa MAO-B: monoaminooxidasa B MAPKs: proteínas kinasas MEL: melatonina MOPAL: 4-hidroxifenilacetaldehído MOPET: alcohol homovalínico MTT: Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo NaF: fluoresceína de sodio NAS: N-acetil serotonina NEAA: Aminoácidos no esenciales NTS: Disolución neutralizadora de tripsina PBS: Buffer fosfato salino PCA: ácido protocatéquico PET: tomografía de transmisión de positrones proteínas de choque térmico: Hsp RN: rojo neutro ROS: especies reactivas de oxígeno RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa SDS: Disolución de dodecil sulfato de sodio SER:serotonina SULT: sulfotransferasas ABREVIATURAS 34 TEER: resistencia eléctrica transendotelial TEM: microscopio electrónico de transmisión ThT: Tioflavina T TLR4: receptores tipo Toll 4 TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa TOL: triptofol TPH: Triptófano hidroxilasa TRYPT: triptamina TYR: tirosina TYRS: tirosol UE: Unión Europea UGT: 5'-difosfoglucuronosil transferasas UHPLC/HRMS: cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas de alta resolución VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular VEGFR-2: receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular α-sin: α-sinucleína 35 Índice de Figuras Figura 1. Dieta mediterránea y enfermedades no transmisibles .................................. 41 Figura 2. Bioactivos presentes en el vino ...................................................................... 42 Figura 3. Ruta de Ehrlich para el triptófano ………………………………………………………........ 43 Figura 4. Ruta de Ehrlich para la tirosina ………………………………………………………….......... 44 Figura 5. Vía de síntesis de la melatonina en la levadura durante la fermentación alcohólica .……………………………………………………………………………………………………………….. 45 Figura 6. Vía de síntesis de hidroxitirosol en la levadura durante la fermentación alcohólica .……………………………………………………………………………...................................... 46 Figura 7. Estructuras de los principales compuestos relacionados con el hidroxitirosol descritos en aceitunas y aceite de oliva .………………………………………………………………..... 47 Figura 8. Ruta de síntesis de hidroxitirosol a partir de oleuropeína ............................. 49 Figura 9. Metabolismo del hidroxitirosol ………………………………………………………............ 55 Figura 10. Metabolismo oxidativo de la dopamina …………………………………………………… 57 Figura 11. Metabolismo oxidativo de la tiramina ………………………………………………........ 58 Figura 12. Preparación del mosto sintético ……………………………………………………………... 86 Figura 13. Tratamiento de muestras extracelulares .…………………………………………........ 88 Figura 14. Cultivo celular HBMEC ………………………………………………................................ 93 Figura 15. Ensayo de MTT ………………………………………………………………………………………… 94 Figura 16. Ensayo de media de TEER ………………………………………………........................... 95 Figura 17. Ensayo de permeabilidad celular …………………………………………………………….. 96 Figura 18. Cultivo celular PC12 …………………………………………………................................. 99 Figura 19. Ensayo ThT ……………………………………………………………………………………………. 100 Figura 20. Análisis por RT-PCR …………………………………………………………………................ 101 Figura 21. Cultivo celular Bv2 de microglía …………………………………………………………..... 102 Figura 22. Ensayo de western blot …………………………………………………………………………. 104 Figura 23. Ensayo de ROS ……………………………………………………………………….................. 105 Figura 24. Ensayo de inmunohistoquímica …………………………………………………………….. 106 Figura 25. Cultivo celular HUVEC ……………………………………………………………………......... 107 37 Índice de Tablas Table 1. Composición del mosto sintético (Compuestos primarios) ............................ 71 Table 2. Disolución de aminoácidos ………………………………………………............................ 72 Table 3. Disolución de vitaminas ………………………………………………………………….............. 73 Table 4. Disolución de oligoelementos ………………………………………................................ 73 Table 5. Compuestos marcados isotópicamente …………………………………………………...... 74 Table 6. Cepas de levaduras comerciales utilizadas en las fermentaciones ................. 74 Table 7. Patrones utilizados para los análisis cromatográficos ……………………………….... 75 Table 8. Reactivos de biología molecular .………………………………………………................... 75 Table 9. Compuestos empleados en biología molecular …………………………………………… 82 Table 10. Encuestas dietéticas para la población adulta de los países europeos utilizados en este estudio (EFSA, base de datos europea de consumo de alimentos) ................... 91 Table 11. Condiciones cromatográficas ........................................................................ 98 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 41 Introducción 1. DIETA MEDITERRÁNEA, BEBIDAS FERMENTADAS Y COMPUESTOS BIOACTIVOS La Organización Mundial de la Salud (2003) reconoce que una dieta saludable ayuda a protegernos de la malnutrición en todas sus formas, así como de las enfermedades crónicas no transmisibles, entre ellas la diabetes, las cardiopatías, los accidentes cerebrovasculares y el cáncer. La dieta mediterránea (DM) es la que cuenta con mayor peso de evidencia científica, a tenor del número de metaanálisis, acerca de su efecto beneficioso en las citadas patologías. De hecho, la bibliografía ofrece un buen número de estudios que aportan datos acerca de la adherencia a la DM y la prevención de cáncer, especialmente el cáncer de colon (Schwingshack et al., 2017). Además, Rosato et al. (2019) realizaron una revisión en la que señalaron una disminución de la incidencia de enfermedades cardiovasculares en un 25% para sujetos que consumían alimentos propios de la dieta mediterránea. Asimismo, en un metaanálisis realizado por Zeraattalab‑Motlagh et al. (2022) se sugiere que una mayor adherencia a la DM está inversamente relacionada con el riesgo de sufrir diabetes mellitus. De la misma forma, la DM tuvo un impacto significativo sobre la memoria y la función ejecutiva reduciendo el riesgo de padecer enfermedades neurodegenerativas (McBean et al., 2022). De hecho, los datos epidemiológicos asocian el consumo de determinados alimentos como aceite de oliva virgen (AOV), nueces, frutas y verduras con una menor incidencia de dichas enfermedades (Lichtenstein et al., 2006; WHO, 2003; Sofi et al., 2013) (Figura 1). Figura 1. Dieta mediterránea y enfermedades no transmisibles INTRODUCCIÓN 48 Figura 7. Estructuras de los principales compuestos relacionados con el hidroxitirosol descritos en aceitunas y aceite de oliva. En igual forma, se ha detectado hidroxitirosol 4-β-D-glucósido en la pulpa de aceituna de las variedades de Manzanilla y Picual por lo que el HT procede también de la hidrólisis de aquel compuesto (Romero et al., 2002). El método de procesado de las aceitunas resulta ser el factor más determinante en el contenido de HT comparado con la variedad o el origen geográfico. Tres de los métodos más utilizados para procesar las aceitunas son el estilo español (aceitunas verdes), el estilo californiano (aceitunas negras por oxidación) y el estilo griego (aceitunas negras naturales). Las aceitunas al estilo español incluyen un tratamiento que causa la hidrólisis de oleuropeína produciendo HT y glucósido de ácido elenólico (Brenes et al., 1995). Además, las levaduras y bacterias lácticas, presentes en la aceituna y la salmuera, pueden metabolizar a la oleuropeína en un proceso de dos pasos. El primer paso consiste en la hidrólisis del enlace glucosídico de la oleuropeína por la β-glucosidasa para formar oleuropeína aglicona. Posteriormente, esta aglicona se hidroliza a ácido elenólico y HT, probablemente por una esterasa en un segundo paso (Figura 8). El procesamiento de las aceitunas negras al estilo californiano consiste en dos pasos. En un primer paso se produce la difusión de los polifenoles, principalmente la oleuropeína desde la pulpa de la aceituna a la solución y se produce la hidrólisis ácida mencionada anteriormente. Posteriormente, el segundo paso consiste en el oscurecimiento que provoca que los ortodifenoles se oxiden y polimericen, dando lugar a una disminución del HT. INTRODUCCIÓN 49 Figura 8. Ruta de síntesis de hidroxitirosol a partir de oleuropeína La concentración de HT en las aceitunas varía en un intervalo entre 14,49 y 3750 mg/kg en el caso de las aceitunas de estilo español y desde 134,33 a 1393,30 mg/kg en el caso de aceitunas de estilo griego (Johnson et al., 2018). En el caso de las aceitunas de estilo californiano la concentración de HT es menor variando entre 19,98 y 672,4 mg/kg (Melliou et al., 2015; Moreno-González et al., 2020). En conclusión, el HT es el compuesto fenólico mayoritario en aceitunas seguido de la oleuropeína y el TYRS. INTRODUCCIÓN 50 Para finalizar, sería interesante seleccionar las técnicas de producción de aceitunas que preservaran la concentración de HT en el producto final, evitando sus pérdidas en las aguas residuales. Del mismo modo, deberían realizarse estudios adicionales para escoger las variedades de aceitunas y técnicas de producción de AOV que conduzcan a una mayor concentración de HT y de sus precursores como el TYRS. 2.1 Aceite de oliva virgen El contenido de HT en el AOV evoluciona durante el almacenamiento. De hecho, conforme el tiempo de almacenamiento aumenta, la concentración de oleuropeína disminuye y la de HT aumenta (Brenes et al., 2001). Los compuestos secoiridoides presentes en el aceite virgen recién obtenido (oleuropeína, oleocantal) se hidrolizan durante el almacenamiento dando lugar a los compuestos fenólicos HT y TYRS (Brenes et al., 2001). Se ha observado que, tras un año de almacenamiento, la concentración de HT y TYRS aumenta en tres variedades de AOV siguiendo el siguiente orden de mayor a menor concentración: Picual > Hojiblanca > Arbequina (Brenes, et al., 2001). Salsano et al., (2022) confirmaron estos hallazgos, observando concentraciones muy bajas de HT (4,72 µg/g de aceite de oliva virgen extra (AOVE)) y TYRS (5,47 g/g AOVE) en aceites frescos y concentraciones más altas en los AOVE tras un año de almacenamiento (20,18 g de HT/g de AOVE y 54,51 g de TYRS/g de AOVE). Además del tiempo de almacenamiento, las altas temperaturas que alcanza el AOV tras freír, hervir u hornear tienen un gran impacto en la concentración de compuestos fenólicos. El HT es el primero que se pierde durante la oxidación térmica (hasta un valor de peróxido de 20-30 mEq/kg), por el contrario, el TYRS parece ser uno de los compuestos más estables (Nissiotis & Tasioula-Margari, 2002). Las concentraciones máxima y mínima de HT detectadas en AOV están entre 41,3 mg/kg y 0,09 mg/kg respectivamente (Cioffi et al., 2010; Dağdelen et al., 2013) con diferencias significativas según el origen. De acuerdo con los estudios hasta ahora publicados, la mayor concentración media de HT está descrita en los AOV de España (50-200 mg/kg) (Romero y Brenes et al., 2012), seguida de Grecia (4,1-20,2 mg/kg) (Kaliora et al., 2013) e Italia (0,6-11,4 mg/kg) (Trombetta et al., 2017). Las muestras de INTRODUCCIÓN 51 otros orígenes, como Túnez (3,8-7,2 mg/kg) (Ouni et al., 2011), Argelia (1,1-4,8 mg/kg) (Douzane et al., 2013), Marruecos (0,5-4,1 mg/kg) (Bajoub et al., 2017) y Turquía (0,1- 0,2 mg/kg) (Dağdelen et al., 2013; Kesen et al., 2013), presentan concentraciones más bajas. Como cabe esperar, no se han encontrado diferencias significativas en la concentración de HT entre las variedades o entre el AOV y el AOVE (Romero & Brenes, 2012; Trombetta et al., 2017; Leporini et al., 2018). Además, el HT obtenido a partir de residuos y subproductos de la industria oleícola puede considerarse una valiosa fuente de HT para ser utilizado como ingrediente alimentario que se añade a otros alimentos, nutracéuticos y complementos alimenticios, aumentando así el potencial bioactivo y su ingesta dietética. Por lo tanto, los futuros estudios deberían incluir la selección de técnicas de extracción y purificación de HT eficientes y respetuosas con el medio ambiente. 2.2 Vino El contenido en polifenoles de los vinos está influenciado por el tipo de uva utilizada, las prácticas enológicas (Garrido et al., 2013), el tipo de levadura utilizada en la fermentación alcohólica y el tipo de maduración (Baiano et al., 2014). Durante la elaboración del vino, los vinos tintos están expuestos a todas las partes de la uva, por ello, la concentración polifenólica de los vinos tintos es más alta (1-5 g/L) que en vinos blancos (0,2-0,5 g/L) (Visioli et al., 2020). Los vinos rosados presentan un contenido polifenólico intermedio entre los tintos y los blancos (Paixao et al., 2007; Baiano et al., 2014). Además, los polifenoles en el vino son determinantes de muchas de las propiedades sensoriales como la apariencia, el color, la astringencia, el amargor, y el sabor (Landete et al., 2011; Alcalde-Eon et al., 2014; Avizcuri et al., 2016). Si bien el contenido de HT en vinos ha sido escasamente estudiado, en particular si lo comparamos con otros alimentos como la aceituna de mesa o el aceite de oliva, su concentración en vinos es muy variable oscilando entre 0,000071 y 4,37 mg/L (Di Tommaso et al. 1998; Wang et al. 2020). Así, alrededor del 83% de referencias bibliográficas indican una concentración de HT entre 1 y 4 mg/L, independientemente del tipo de vino, origen o variedad. INTRODUCCIÓN 52 Al ser la oleuropeína propia de la aceituna y no estar presente ni en las uvas ni los vinos se deduce que debe existir otro mecanismo que explique la presencia de HT en vinos. Así la presencia de HT en el vino está relacionada con el metabolismo de la levadura. De hecho, durante la fermentación alcohólica las levaduras metabolizan a los aminoácidos aromáticos dando lugar a compuestos como el TYRS y el HT mediante la ruta de Ehrlich descrita en el apartado 1 (Figura 6). Asimismo, a diferencia de la composición de las aceitunas, a menudo, el TYRS está presente en los vinos en concentraciones más altas que el HT (Piñeiro et al., 2011; Álvarez-Fernández et al. 2018). 3. BIODISPONIBILIDAD DE HIDROXITIROSOL EN FLUIDOS BIOLÓGICOS Para poder evaluar el potencial bioactivo de HT y TYRS, es fundamental conocer la ingesta dietética, la biodisponibilidad y la actividad de ambos y sus metabolitos. 3.1 Absorción A continuación, se aportan 8 estudios acerca de la absorción del HT. Uno de ellos in vitro y seis in vivo. Uno en ratas y 6 en humanos. Manna et al., (2000) estudiaron por primera vez los mecanismos de absorción de HT mediante el uso de HT marcado con 14C y monocapas de células Caco-2 diferenciadas como modelo del epitelo intestinal humano. Así, concluyeron que el transporte de HT ocurre a través de un mecanismo de difusión pasiva bidireccional y que se absorbe a nivel intestinal. Los estudios en modelos de ratas proporcionaron información sobre la absorción de HT y TYRS. En el estudio realizado por Tuck et al. (2001) con ratas, administraron los compuestos en disoluciones de aceite y agua vía oral. La aplicación de HT y TYRS en la disolución de aceite dio lugar a una eliminación significativamente mayor en orina tras 24h de los compuestos fenólicos (94% y 75% respectivamente) que tras la administración de ambos compuestos en una disolución de agua (71% y 53% respectivamente). INTRODUCCIÓN 53 Asimismo, González-Santiago et al., (2010) administraron a 10 sujetos 2,5 mg de HT/ kg de peso en una disolución acuosa. Tras la administración, las concentraciones plasmáticas de HT aumentaron en todos los sujetos. Los datos cinéticos calculados a partir de las curvas de absorción mostraron que la concentración máxima en plasma de HT se alcanzó a los 13 min tras su administración. Sin embargo, se alcanzaron valores indetectables 1 h después de la administración. La vida media estimada fue de aproximadamente 8 min. Estudios en humanos confirmaron que, tras la administración de aceite de oliva, la absorción de HT y TYRS era dosis dependiente (Caruso et al., 2001; Miró-Casas et al., 2001, 2003a, b; Weinbrenner et al., 2004). La excrección de HT en humanos es mayor en el caso de su administración como componente natural del aceite de oliva virgen (44,2% de HT administrado) que tras su adición al aceite de oliva refinado (23% de la HT administrada (Visioli et al., 2003). Tales observaciones llevan a la conclusión de que la absorción de HT y TYRS depende de la matriz. 3.2 Distribución La absorción de HT tiene lugar en el intestino delgado (Vissers et al., 2002) y alcanza la concentración máxima en plasma 5-10 min después de su ingesta (Miro-Casas et al., 2003a). Una vez absorbido, HT se distribuye ampliamente por todo el organismo. En el análisis farmacocinético realizado por D´Angelo et al. (2001) administraron una dosis intravenosa de 1,5 mg/kg de HT marcado con 14C a ratas. Los resultados obtenidos mostraron una distribución amplia y rápida por diferentes órganos incluidos el músculo esquelético, los riñones, el hígado, los pulmones, el corazón y el cerebro. Además, en otro estudio en ratas la administración oral en dosis creciente de HT (1, 10 y 100 mg/kg) en una matriz de aceite de oliva refinado, se demostró que el HT se acumulaba de forma dosis-dependiente no sólo en orina y plasma, sino también en hígado, riñón y cerebro (de las Hazas et al., 2016). INTRODUCCIÓN 54 Considerando la biodisponibilidad de HT (40-95%) (Visioli et al., 2001; Tuck, 2002; Vissers et al., 2002) y el volumen plasmático (5L), la concentración circulante de HT en humanos podría estar entre 0,15 y 37 µM (Hornedo-Ortega et al., 2018a). 3.3 Metabolización Hasta el momento, se han descrito en bibliografía más de 10 metabolitos del HT. Estos incluyen formas O-metiladas (Caruso et al., 2001), aldehídos y ácidos formados a través de la oxidación del HT (D'Angelo et al., 2001), sulfatos (Tuck et al., 2002), glucurónidos (Khymenets et al., 2011), y derivados acetilados y sulfatados (Rubió et al., 2012), así como un derivado de N-acetilcisteína (Kotronoulas et al., 2013). Este último, se identificó en orina de ratas en el que se investigó que la metabolización del HT era dependiente de la dosis a las tres dosis estudiadas (1, 10 y 100 mg/kg). A su vez, se evaluó en orina la presencia de mercapturatos del HT (N-acetil-5-S-cisteinil-HT) resultantes de la oxidación del HT y la formación de aductos con glutatión. A la dosis más baja de HT (1 mg/kg), la vía de glucuronidación fue la más relevante (25-30 %), con menores recuperaciones para la sulfatación (14 %), mientras que a la dosis más alta de HT (100 mg/kg), la sulfatación fue la más prevalente (75%). En general, estos resultados indican que tras la administración de HT, la recuperación de todos los metabolitos evaluados dependía de la dosis de HT administrada (Kotronoulas et al., 2013). En cuanto a las enzimas implicadas en el metabolismo de HT, podemos diferenciar dos grandes familias. Las implicadas en el metabolismo de la fase I de HT son las alcohol y aldehído deshidrogenasas no microsomales (ADH y ALDH respectivamente), ambas localizadas en el citosol. Los metabolitos correspondientes son DOPAL, ácido 3,4- dihidroxifenilacético (DOPAC) y ácido homovanílico (HVA), que son inespecíficos ya que no solo son metabolitos provenientes de la ingesta dietética de HT, sino también de la dopamina. Por otro lado, las enzimas involucradas en las reacciones de fase II de HT son las sulfotransferasas (SULT), las uridinas 5'-difosfoglucuronosil transferasas (UGT), las catecol-O-metiltransferasas (COMT) y las O-acetiltransferasas (ACT). Los metabolitos INTRODUCCIÓN 55 corresponden con las formas glucuronidadas y sulfatadas de HT y con el metabolito metilado de HT, MOPET. También se ha identificado un metabolito resultante de la metilación y la glucuronidación, aunque representa una vía metabólica menor (Khymenets et al., 2011; Miró-Casas et al., 2003a). En la Figura 9 se muestra una representación general de los metabolitos de HT. Concluyendo este apartado, a la hora de evaluar la actividad biológica ha de tenerse en cuenta el amplio espectro de metabolitos que se forman a partir de HT de la dieta. Figura 9. Metabolismo del hidroxitirosol. DOPAL: 3,4- dihidroxifenilacetaldehído; DOPAC: 3,4-dihidroxifenilacético; HVA: Ácido INTRODUCCIÓN 56 homovanílico; MOPET: Alcohol homovalínico; ALDH: Aldehído deshidrogenasa; ADH: Alcohol deshidrogenasa; COMT: Catecol-O-metil transferasa; UGT: Glucuronosil transferasa; SULT: Sulfotransferasa; ACT: O-acetil transferasa. 3.4 Excreción Uno de los primeros estudios in vivo en ratas acerca de la excreción del HT, observó que el HT se excretaba de forma dosis-dependiente en la orina de 24 h principalmente en forma glucuronidada (Visioli et al., 2001). A partir de dosis moderadas de aceite de oliva (25 ml/día), que son inferiores a la ingesta dietética diaria tradicional en los países mediterráneos (Weinbrenner et al., 2004; Marrugat et al., 2004), alrededor del 98 % de los metabolitos de HT están presentes en orina en formas conjugadas, principalmente glucurónidos y sulfatos conjugados (Visioli et al., 2000; Caruso et al., 2001; Vissers et al., 2002; Miró-Casas et al., 2003a). Sólo el 5-10% de HT y TYRS se recuperaba en su forma libre en la orina debido a su extenso metabolismo en el intestino y el hígado (Caruso et al., 2001). A su vez, García-Villalba et al., (2010) realizaron los análisis de las muestras de orina de diez voluntarios sanos mediante LCESI-TOF-MS tras una ingesta elevada de aceite de oliva virgen extra. En este estudio, se identificaron más de 50 metabolitos, la mayoría de ellos formas glucuronidadas y metiladas. Además, los estudios cinéticos realizados señalaron que la concentración más alta de cada uno de los compuestos analizados se detectó 2 h después de la administración de aceite de oliva virgen (García-Villalba et al., 2010). 3.5 Fuentes endógenas de HT y TYRS 3.5.1 Formación endógena de HT a partir de dopamina y TYRS La dopamina es un neurotransmisor que, además de estar presente en el cerebro, se produce en cantidades apreciables en el tracto gastrointestinal (Eisenhofer et al., 1997). A su vez el HT puede formarse de manera endógena en el organismo humano a través del metabolismo oxidativo de la dopamina. Se metaboliza inicialmente a DOPAL mediante la enzima monoaminooxidasa B (MAO-B). A continuación, DOPAL sigue dos rutas metabólicas. Por un lado, se oxida mediante la enzima ALDH a DOPAC, el cual es el metabolito mayoritario de la dopamina. Por otro lado, DOPAL se reduce mediante la enzima aldehído reductasa (ALR) para dar lugar a 3,4-dihidroxifeniletanol (DOPET) o INTRODUCCIÓN 57 más ampliamente conocido como HT (Hashimoto et al., 2004) (Figura 10). Por consiguiente, podemos afirmar que el HT proviene simultáneamente de la dieta y del metabolismo de la dopamina. Figura 10. Metabolismo oxidativo de la dopamina. DOPAL: 3,4- dihidroxifenilacetaldehído; DOPAC: 3,4-dihidroxifenilacético; HVA: Ácido homovalínico; MAO: Monoamina oxidasa; ALR: Aldehído reductasa; ALDH: Aldehído deshidrogenasa; ADH: Alcohol deshidrogenasa; COMT: Catecol-O-metil transferasa A su vez, Pérez-Mañá et al., (2015a) realizaron una investigación en la que administraron por vía intraperitoneal a 96 ratas dos dosis diferentes de TYRS (10 y 20 mg/kg). Tras la administración, se recogió la orina durante 4 h. Los resultados mostraron que el TYRS aumentó la excreción urinaria de HT de manera dosisdependiente (48,4 y 105 nmol de HT, respectivamente). De esta forma, se identificó al TYRS como precursor del HT. Además, estudios recientes en humanos han demostrado que el HT se forma a partir del TYRS mediante la participación del citocromo P450 (CYP) (Rodríguez-Morató et al., 2017; Boronat et al., 2019). Los experimentos realizados con hígados humanos genotipados mostraron que la variabilidad interindividual en la formación de HT estaba relacionada con las isoenzimas CYP2A6 y CYP2D6 que catalizan la hidroxilación del TYRS para producir HT. La cantidad de HT JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 65 Justificación, hipótesis y objetivos El desarrollo de técnicas analíticas cada vez más sensibles, como la cromatografía líquida de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas, está permitiendo conocer compuestos minoritarios que forman parte de los alimentos y que resultan muy interesantes por presentar bioactividad (Stürtz et al., 2011; Álvarez-Fernández et al., 2016; Fideler et al., 2019). En las bebidas fermentadas se han descrito principalmente compuestos de tipo polifenólico (Álvarez-Fernández et al., 2014, 2015; Rios-Corripio et al., 2019; Kelanne et al., 2020). Además, existen otras familias de compuestos bioactivos presentes en bebidas fermentadas como los compuestos indólicos (Manfroi et al., 2009; Fernández-Cruz et al., 2020). Por otro lado, Di Tommaso et al., (1998) referenciaron por primera vez la presencia en vinos tintos y blancos en concentraciones medias de 4,0 y 1,9 mg/L, respectivamente. Además, estudios posteriores identificaron HT en el compartimento intracelular de las levaduras (Álvarez-Fernández et al., 2018). Así mismo, Rodriguez-Naranjo et al., (2011a, b) describieron por primera vez la MEL, durante el proceso de fermentación alcohólica a concentraciones que oscilan entre 245-423 ng/mL. Estas moléculas parecen provenir mayoritariamente del metabolismo de aminoácidos aromáticos de las levaduras que participan en la fermentación alcohólica (Muñiz-Calvo et al., 2019, 2020). Sin embargo, el conocimiento de las rutas que intervienen en la síntesis de estas moléculas bioactivas por parte de las levaduras es muy limitado. La dieta aporta un elevado número de compuestos bioactivos cuyo potencial está relacionado con la ingesta. Por ello, es importante realizar un estudio del nivel de ingesta dietética de cada uno de los bioactivos para dilucidar si realmente se puede llegar a alcanzar una concentración circulante efectiva. Asimismo, es necesario contemplar si estos compuestos y/o sus metabolitos alcanzan los órganos diana. Recientemente, diversos estudios han señalado cómo HT, MEL y otros compuestos indólicos como la serotonina inhiben y desestabilizan fibras del péptido β-amiloide y de la proteína α-sin ejerciendo un papel neuroprotector en enfermedades de JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 66 Alzheimer y Parkinson (St-Laurent-Thibault et al., 2011; Hornedo-Ortega et al., 2018a, 2018b). A su vez, presentan propiedades antiangiogénicas mediante la inhibición del VEGFR2 (Cerezo et al., 2019). No obstante, no se conoce si son capaces de llegar al lugar de acción y el mecanismo implicado. La hipótesis de la presente Tesis Doctoral supone que, mejorar el conocimiento del metabolismo de aminoácidos aromáticos (triptófano y tirosina) por parte de las levaduras puede proporcionar información relevante para incrementar el contenido de compuestos bioactivos en bebidas fermentadas. A su vez, el estudio de los mecanismos de acción por los cuales estos compuestos bioactivos ejercen su efecto neuroprotector y cardiovascular permitirá profundizar en el conocimiento de sus propiedades saludables. Dado los antecedentes descritos, se plantean las siguientes cuestiones que dan lugar a los objetivos específicos de la presente Tesis Doctoral. 1. ¿Cómo sintetiza la levadura compuestos bioactivos a partir de aminoácidos aromáticos? Esta cuestión se aborda en el primer objetivo planteado que consiste en: • Elucidar las rutas metabólicas relacionadas con la síntesis de compuestos bioactivos en la levadura mediante el uso de sus precursores aminoácidos marcados isotópicamente (Capítulo 1). 2. ¿Cuál es el aporte dietético del hidroxitirosol en la población europea y cuál es la contribución de las bebidas fermentadas al mismo? El HT es un potente bioactivo, muy relacionado con la dieta mediterránea y que posee un papel importante en la protección de enfermades no transmisibles más prevalentes, que también están relacionadas con la dieta. No obstante, en la actualidad sigue siendo difícil establecer la ingesta dietética del HT. Por ello, el segundo objetivo que planteamos fue: • Conocer la ingesta dietética actual del HT de la población adulta en la UE y la contribución de las bebidas fermentadas a su ingesta (Capítulo 2). JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 67 3. Con vistas a evaluar el potencial efecto protector frente a la neurodegeneración y la neuroinflamación de los bioactivos derivados del triptófano y la tirosina, ¿tienen sus metabolitos la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica para llegar a su lugar de acción? Por consiguiente, los objetivos se centran en: • Simular in vitro la barrera hematoencefálica con el fin de conocer la mayor o menor capacidad que poseen los metabolitos de atravesarla (Capítulo 3). • Estudiar la integridad de la barrera hematoencefálica en presencia de los compuestos objeto de estudio (Capítulo 3). 4. ¿El efecto neuroprotector que posee el HT frente a la agregación de α-sinucleína se potencia en presencia de otros compuestos descritos en bebidas fermentadas, y que atraviesan la barrera hematoencefálica? La dieta que consumimos está formada por una gran variedad de alimentos que son fuente de un número considerable de bioactivos, por lo que parece adecuado considerar el efecto de varios de estos compuestos de forma simultánea. En consecuencia, nos propusimos: • Determinar el efecto que poseen HT, MEL y PCA frente a la agregación de αsinucleína cuando están presentes de manera simultánea (Capítulo 4). • Evaluar si la expresión de los vitagenes está implicada en el mecanismo de acción (Capítulo 4). 5. Considerando las propiedades neuroprotectoras que posee el HT, ¿Podría el HT poseer efectos neuroantiinflamatorios? Las células de microglía son las principales responsables que impulsan la respuesta inmunitaria del cerebro en condiciones de enfermedad. Por tanto, nos formulamos los siguientes objetivos: • Examinar la capacidad del HT de reducir la inflamación inducida por LPS y αsinucleína en células de microglía (Capítulo 5). JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 68 • Estudiar los posibles mecanismos de acción involucrados en los efectos neuroantiinflamatorios del HT (Capítulo 5). 6. Teniendo en cuenta que el HT se metaboliza rápidamente, ¿presentan los metabolitos DOPAL, MOPAL y MOPET actividad frente a la agregación de αsinucleína? El efecto biológico del HT depende en gran medida de su biodisponibilidad y metabolización, ya que para muchos polifenoles los metabolitos formados presentan actividad diferente a la de los compuestos originales. La baja biodisponibilidad del HT observada en varios estudios, relacionada con las bajas concentraciones de HT circulante, se debe al metabolismo de fase I y II en el intestino y el hígado. DOPAL, MOPET y MOPAL son algunos de los metabolitos del HT, por tanto, deberían ser considerados. De modo que, conocer los efectos de los metabolitos podría contribuir a comprender mejor la bioactividad del HT. Esta cuestión está recogida en los siguientes objetivos: • Determinar el efecto neuroprotector de DOPAL, MOPET y MOPAL (Capítulo 6). • Estudiar el potencial de los metabolitos en la expresión de los vitagenes como posible mecanismo de acción (Capítulo 6). 7. En cuanto a los efectos antiangiogénicos, no hay estudios sobre la actividad de los principales metabolitos humanos de HT (DOPAL, MOPET y MOPAL) y de los metabolitos del triptófano (IPy, IPA, IBA y, ILA) En consecuencia, se contemplan los siguientes objetivos: • Evaluar el potencial anti-VEGF de los tres metabolitos derivados del HT y de los cuatro metabolitos del triptófano las HUVEC. (Capítulo 7). • Estudiar el efecto de los metabolitos sobre la modulación de la cascada de señalización intracelular mediada por VEGF (PLCγ-1, AKT, eNOS) (Capítulo 7). MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 71 Materiales y métodos. Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, se han empleado los siguientes materiales y métodos: 1. Materiales 1.1. Reactivos 1.1.1. Elaboración del mosto La composición del mosto se basó en Riou et al. (1997). Se requieren: A: Compuestos primarios (Tabla 1). B: Disolución de aminoácidos (Tabla 2) C: Disolución de vitaminas (Tabla 3) D: Disolución de oligoelementos (Tabla 4). Los compuestos primarios y las disoluciones se disuelven en agua Milli-Q®. A: Tabla 1. Composición del mosto sintético (Compuestos primarios) Compuesto Concentración (g/L mosto) Proveedor Referencia Compuestos primarios Fuentes de carbono Glucosa 100 Sigma- Aldrich G5767 Fructosa 100 VWR 24282.368 Ácido cítrico 0,3 Merck 137002 Ácido tartárico 3 VWR 20718.290 Ácido málico 5 VWR 20365.290 Sales minerales Fosfato monopotásico (KH2PO4) 0,75 Merck 104873 Bisulfato potásico (KH2SO4) 0,5 VWR 26936.293 Sulfato de magnesio heptahidratado 0,25 Merck 105886 MATERIALES Y MÉTODOS 72 (MgSO4·7H2O) Cloruro cálcico dihidratado (CaCl2·2H2O) 0,155 Merck 102382 Cloruro sódico (NaCl) 0,2 VWR 27810.295 Fuente de nitrógeno asimilable Sulfato de amonio (NH4)2SO4 0,567 Sigma- Aldrich 254134 B: La disolución de aminoácidos se prepara en una disolución de bicarbonato de sodio (Panreac, Ref: SX0320) a una concentración final de 20 g/L para favorecer la disolución de los aminoácidos. La tabla 2 recopila la concentración de cada uno de los aminoácidos en la disolución. Tabla 2. Disolución de aminoácidos Compuesto Concentración (g/L) Proveedor Referencia Disolución de aminoácidos Tirosina 1,5 Sigma-Aldrich 93829 Triptófano 13,4 Sigma-Aldrich 93659 Isoleucina 2,5 Sigma-Aldrich 58879 Ácido aspártico 3,4 Sigma-Aldrich 11189 Ácido glutámico 9,2 Sigma-Aldrich 49449 Arginina 28,3 Sigma-Aldrich A5006 Leucina 3,7 Sigma-Aldrich 61.819 Treonina 5,8 Sigma-Aldrich 89.179 Glicina 1,4 Sigma-Aldrich 50046 Glutamina 38,4 Sigma-Aldrich G3126 Alanina 11,2 Sigma-Aldrich 5130 Valina 3,4 Sigma-Aldrich 94619 Metionina 2,4 Sigma-Aldrich 64319 Fenilalanina 2,9 Sigma-Aldrich 78019 Serina 6,0 Sigma-Aldrich 84959 Histidina 2,6 Sigma-Aldrich 53319 Lisina 1,3 Sigma-Aldrich 62840 Cisteína 1,6 Sigma-Aldrich 30089 Prolina 46,1 Sigma-Aldrich P0380 C: La concentración de las vitaminas en la disolución se detalla en la tabla 3. MATERIALES Y MÉTODOS 73 Tabla 3. Disolución de vitaminas Compuesto Concentración (g/L) Proveedor Referencia Disolución de vitaminas Mio-inositol 20 Alfa aesar A13586 Ácido nicotínico 0,2 Alfa aesar A12683 Pantotenato cálcico 1,5 Avantor 1443-03 Clorhidrato de tiamina 0,025 Merck 1.08181.0025 Clorhidrato de piridoxina 0,025 Applichem A0957 Biotina 0,003 Applichem A0969 D: La tabla 4 recoge la concentración de cada oligoelemento en la disolución. Tabla 4. Disolución de oligoelementos Compuesto Concentración (g/L) Proveedor Referencia Disolución de oligoelementos Sulfato de manganeso hidratado (ZnSO4·H2O) 4 Prolabo 25303.233 Sulfato de zinc hidratado (ZnSO4·H2O) 4 Panreac 141787 Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4·5H2O) 1 Prolabo 23174.233 Yoduro de potasio (KI) 1 Sigma-Aldrich 207969 Cloruro de cobalto hexahidratado (CoCl2·6H2O) 0,4 Alfa aesar B22031 Ácido bórico (H3BO3) 1 Panreac 131015 Molibdato de amonio (NH4)6Mo7O24 1 Sigma-Aldrich 09878 MATERIALES Y MÉTODOS 80 Kit de Sandwich ELISA PathScan® Phospho- VEGFR-2 (Tyr1175) Ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) Cell Signalling 7335C Metanol (grado HPLC) Western-blot Merck I525-0940 Buffer de transferencia (20x) Western-blot NuPAGE NP0006-1 Buffer de electroforesis Western-blot NuPAGE NP0001 Agente reductor para las muestras (ditiotreitol) (10x) Western-blot NuPAGE NP0009 Antioxidante Western-blot NuPAGE NP0005 Buffer de la muestra (dodecilsulfato de litio) (4x) Western-blot NuPAGE NP0007 Marcador de proteínas para electroforesis Western-blot NuPAGE LC5602 Buffer de separación (Stripping buffer) Western-blot NuPAGE 21059 Disolución de Ponceau S Western-blot Sigma-Aldrich P3504 Sustrato para Quimioluminiscencia (Signal West Pico PLUS) Western-blot Pierce 34580 Anticuerpo PLCγ1 (D9H10, XPxp® Rabbit mAb) Western-blot Cell signalling 5690S Anticuerpo fosforilado de PLCγ1 (Tyr783) Western-blot Cell signalling 2821S Anticuerpo fosforilado de Akt (Ser473) (D9E, XP® Western-blot Cell signalling 4060S MATERIALES Y MÉTODOS 81 Rabbit mAb) Anticuerpo Akt Western-blot Cell signalling 9272S Anticuerpo fosforilado de eNOS (Ser1177) (C9C3, Rabbit mAb) Western-blot Cell signalling 9570S Anticuerpo eNOS Western-blot Cell signalling 9572S Anticuerpo fosforilado p- 38 Western-blot Santa Cruz Biotechnology sc-166182 Anticuerpo p-38 Western-blot Santa Cruz Biotechnology sc-81621 Anticuerpo fosforilado c- Jun N-terminal kinasa (JNK) Western-blot Santa Cruz Biotechnology sc-6254 Anticuerpo c-Jun N- terminal kinasa (JNK) Western-blot Santa Cruz Biotechnology sc-7345 Anticuerpo IL-1β Western-blot R&D Systems AF-401-SP Anticuerpo gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenada (GADPH) Western-blot Santa Cruz Biotechnology sc-47724 Anticuerpo secundario (Rabbit IgG, HRP-Linked) Western-blot Cell signalling 7074S Reactivo CellROX™ Producción de especies de oxígeno reactivas Thermo Fisher Scientific C10422 Paraformaldehído Fijación de células Sigma-Aldrich 47608 Anticuerpo policlonal de conejo NF-kB p65 Inmunohistoquímica Cell signalling 8242T Anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 conjugado anti-IgG Inmunohistoquímica Molecular probesTM A31620 Anticuerpo β-catenin Inmunohistoquímica Thermo Fisher 71-2700 MATERIALES Y MÉTODOS 82 Scientific Medio de montaje de fluorescencia Inmunohistoquímica Dako S1964 Anticuerpo primario antiβ-catenina Inmunohistoquímica Thermo Fisher Scientific 71-2700 Anticuerpo secundario Alexa Fluor® 555 Inmunohistoquímica Thermo Fisher Scientific A21428 Colorante Hoechst Inmunohistoquímica Thermo Fisher Scientific 33342 Medio de montaje para microscopía DPX Inmunohistoquímica Merck 100579 1.1.4.1. Compuestos seleccionados para el estudio de bioactividad. Se emplearon un total de 13 compuestos. Entre ellos, 7 compuestos polifenólicos y 6 compuestos indólicos (Tabla 9). Tabla 9. Compuestos empleados en biología molecular Compuesto Pureza (%) Proveedor Referencia Tirosina ≥99 Sigma-Aldrich 93829 Tirosol 98 Sigma-Aldrich 188255 Hidroxitirosol ≥98 Extrasynthese 4999S 3,4-dihidroxifenilacetaldehído ≥98 Cayman Chemical 70604 Alcohol homovanílico 99 Sigma-Aldrich 148830 3-metoxi-4-hidroxifenilacetaldehído 99 Sigma-Aldrich 5703-24-2 Ácido protocatéquico ≥97 Sigma-Aldrich 03930590 Melatonina ≥98 Sigma-Aldrich M5250 Serotonina ≥98 Sigma-Aldrich 14927 Ácido indol-3-pirúvico ≥97 Sigma-Aldrich I7017 Ácido indol-3-propiónico ≥99 Sigma-Aldrich 57400 Ácido indol-3-butírico ≥99 Sigma-Aldrich 57310 Ácido indol-3-láctico 99 Sigma-Aldrich I5508 1.1.4.2. Líneas celulares MATERIALES Y MÉTODOS 83 Se han empleado 4 líneas celulares en el desarrollo de los experimentos de biología molecular. En primer lugar, la evaluación de la posible actividad neuroprotectora se realizó empleando una línea celular derivada de una feocromocitoma de la médula suprarrenal de las ratas llamadas PC12 obtenidas por American Type Culture Collection (ATCC). Por otro lado, las células de microglía Bv2 (regalo del profesor B. Joseph (Instituto Karolinska, Suecia)) nos permitieron evaluar el efecto antiinflamatorio. Además, en el estudio de la integridad de la barrera hematoencefálica se hizo uso de las células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) (proporcionado por el Prof. Kwang S. Kim, División de Enfermedades Infecciosas, Baltimore). Por último, en la determinación de la actividad antiangiogénica se emplearon las HUVEC suministradas por Lonza (Slough, Reino Unido). 1.2. Instrumentación • Agitador magnético con calefacción, placa de aluminio (VWR, Radnor, Pensilvania, EE. UU). • Agitador orbital MaxQ 4000 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). • Agitador vórtex VV3 (VWR, Radnor, Pensilvania, EE. UU). • Autoclave modelo AES 75L (Raypa, Barcelona, España). • Baño de ultrasonidos J.P. Selecta UB-1538 (Abrera, Barcelona, España). • Baño termostatizado BAE-2 (Raypa, Barcelona, España). • Bomba de vacío MZ2CNT (Vacuubrand, Wetheim, Alemania). • Cabina de seguridad biológica modelo Advantage (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). • Cabina de seguridad biológica modelo BIO II A Mini (Telstar). • Centrífuga Allegra X-22R (Beckman Coulter, Pasadena, California, EE. UU). • Centrífuga diferencial con rotor para tubos falcon de 15 ml modelo 3D-30 (Sigma-Aldrich, Barcelona, España). • Centrífuga Heraeus Megafuge 16R (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). • Centrífuga de vacío Hypervac-lite (Gyozen, Corea). MATERIALES Y MÉTODOS 84 • Contador automático de células Countess®C10227 (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU). • Cámara de Neubauer improved (Marienfeld, Alemania). • Equipo de Agua Milli-Q® modelo Nanopure Diamond (Barnstead, Alemania). • Equipo de espectrometría de alta resolución (HRMS) consistente en un híbrido de cuadrupolo/Orbitrap® Qexactive Plus (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) con fuentes de ionización ESI, APCI y nanoESI acoplado a un cromatógrafo líquido de ultra-alta eficacia (UHPLC) (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany). • Equipo de quimioluminiscencia Amershan Imager 600 (GE Healthcare Life • Sciences, Marlborough, MA, USA). • Incubador de CO2 modelo NU-4750E AutoFlowTM (Nuaire, Plymouth, UK). • Incubadora de CO2 para levaduras (INCO, Barcelona, España). • Lector de placas multimodal para medidas de fluorescencia, luminiscencia y absorbancia modelo Synergy HT (BioTek ®, Izasa Scientific, Barcelona, España). • Medidor de pH Basic 20 (Crison, L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona, España). • Micropipetas de 10, 100 y 1000 μL Eppendorf Research plus (Hamburgo, Alemania). • Micropipeta multicanal de 200 μL Eppendorf Research plus (Hamburgo, Alemania). • Pipeta automatica FastPette™ V2 (Labnet International, Edison, NJ, EE. UU). • Sistema de extracción en fase sólida al vacío (Supelco-Visiprep, Sigma- Aldrich, Barcelona, Spain). • Equipo de PCR Lightcycler® 480 Instrument II (Roche, Rotkreuz, Switzerland). • Microscopio electrónico de transmisión Zeiss Libra 120, 80 kV (Carl Zeiss MicroImaging Gmbh, Munich, Germany). • Microscopio confocal láser de barrido Zeiss LSM 7 DUO (Carl Zeiss MicroImaging Gmbh, Munich, Germany). MATERIALES Y MÉTODOS 85 • Cámara acoplada a un medidor de resistencia EVOMX. End OhmTM (World Precision Instruments, Inc., USA). • Microscopio Olympus BX60 equipado con lámpara de mercurio Olympus U-RFL- T y cámara CCD monocromática refrigerada Hamamatsu Orca R2, con objetivos de aceite de 40x. 1.3. Material fungible • Filtros para botellas de 0.2 μM de NalgeneTM (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). • Cartuchos desechables de SPE Mega BE-C18, 1 g, 6 mL (VARIAN, Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU). • Columnas de UHPLC SB-C18 (2,1x5 mm, 1,8 μM) (Agilent, Technologies, Santa Clara, California, EE. UU). • Precolumnas para columna de UHPLC ZORBAX SB-C18 (2.1x5 mm, 1,8 μM) (Agilent, Technologies, Santa Clara, California, EE. UU). 1.4. Software informático • Thermo Fisher Scientific (2013) XcaliburTM Software version 3.0.63. Sistema de interpretación de resultados tras análisis pro HRMS. • GraphPad Prism® (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) versión 8. Sistema de estadística y representación de datos. • StatSoft, Inc. (2004). Statistica Software version 7. Sistema software de análisis de datos. • National Institute of Health (2016) ImageJ Software versión 1.51. Sistema de interpretación de bandas obtenidas por Western-Blot. • Microsoft Corporation 365 Paquete Office Excel® versión 365. Sistema de representación y organización de datos. • CambridgeSoft Limited (2011) ChemDraw Software versión 12. Sistema de representación de estructuras químicas. MATERIALES Y MÉTODOS 86 2. MÉTODOS 2.1. Preparación del mosto sintético (Capítulo 1). Se toma 1L de mosto primario (Tabla 1) y se adiciona: 13 mL de la disolución de aminoácidos (Tabla 2); 10 mL de la disolución de vitaminas (Tabla 3) y, 1 mL de la disolución de oligoelementos (Tabla 4). Seguidamente se ajusta el pH a 3,3 con NaOH, se filtra con filtros de 0,2 µM y se almacena a 4oC hasta su uso (Figura 12). Figura 12. Preparación del mosto sintético 2.1.1 Rehidratación de las levaduras Las fermentaciones alcohólicas se llevaron a cabo empleando dos levaduras, S. cerevisiae Lalvin YSEO QA23 y S. cerevisiae Red Fruit. Cada una de las levaduras liofilizadas se rehidrataron durante 30 min a 37oC y, a continuación, se sembraron en placas de Petri con medio sólido compuesto por (2% peptona, 2% glucosa, 1% extracto de levadura y 2% agar) (apartado 1.1.2). El período de incubación fue de 48 h a 28oC y, posteriormente, se almacenaron a 4oC hasta su uso. MATERIALES Y MÉTODOS 87 2.1.2. Preinóculo para el mosto sintético Las colonias de levaduras dispuestas en las placas de Petri con medio sólido se introdujeron en un matraz Erlenmeyer que contiene 150 mL de medio líquido (2% peptona, 2% glucosa, 1% extracto de levadura), esta operación se realizó por duplicado. El período de incubación fue de 24 h en un agitador orbital a 28oC y 150 rpm. 2.1.3. Inoculación en el mosto sintético Se utilizaron 6 matraces Erlenmeyer de 1L de capacidad con 750 mL de mosto sintético para cada una de las fermentaciones a fin de obtener un sextuplicado biológico. Los matraces se sellaron utilizando tapones de goma con dos salidas para asegurar las condiciones de esterilidad del mosto sintético, (Imagen 1). Todo el material se esterilizó previamente en autoclave. Se toma un volumen para 1·106 células/mL en la inoculación del mosto sintético. El recuento de células se realizó, por duplicado con una cámara de Neubauer. Tras la inoculación, los matraces se incubaron en un agitador orbital a 28oC con una agitación continua de 150 rpm durante 10 días en el caso de la inoculación con la cepa S. cerevisiae Red Fruit y 7 días en el caso de la inoculación con la cepa S. cerevisiae Lalvin QA23. El seguimiento se realizó mediante la pesada diaria de cada uno de los matraces para calcular la pérdida de dióxido de carbono hasta su estabilización. Imagen 1. Disposición de matraces Erlenmeyer durante la fermentación alcohólica MATERIALES Y MÉTODOS 88 Por otro lado, la evolución del crecimiento celular se llevó a cabo mediante la medida de densidad óptica a 600 nm. 2.2. Tratamiento de muestras (Capítulo 1). Se realizó un muestreo diario tomando de cada Erlenmeyer un volumen correspondiente a 1·109 células/mL. A continuación, se centrifugaron a 4500 rpm durante 3 min y a 4oC para separar las células del contenido extracelular. Posteriormente, las muestras extracelulares se almacenaron a -80oC hasta su análisis. Con el objetivo de limpiar la muestra de posibles impurezas que dificulten el análisis cromatográfico y concentrar los analitos de interés se realizó una extracción en fase sólida de las muestras extracelulares. Se emplearon cartuchos de tipo C18 (VARIAN, Agilent Technologies). Para comenzar, se llevó a cabo el acondicionamiento del cartucho en el cual se añadieron 2 mL de metanol y posteriormente 2 mL de aga Milli Q®. Seguidamente, se introducen 2 mL de muestra y 2 mL de una disolución de metanol/agua al 10% (v/v). Para terminar, se coloca el eppendorf y se eluye la muestra con 1 mL de metanol. A continuación, las muestras se introducen en un desecador a vacío para el eliminar el solvente. En último lugar, se resuspenden en 100 µL de una disolución metanol/ácido fórmico 0,1% (v/v) e inmediatamente se analizan por espectrometría de masas (Figura 13). Figura 13. Tratamiento de muestras extracelulares. MATERIALES Y MÉTODOS 89 2.3. Estudio de la ruta de síntesis de melatonina e hidroxitirosol mediante cromatografía líquida de ultra alta eficacia acoplado a espectrometría de masas (UHPLC/HRMS) (Capítulo 1). El instrumento de análisis consistió en un UHPLC Vanquish acoplado a un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus equipado con una sonda de ionización por electropulverización calentada (HESI-II) (Thermo Fisher Scientific, San José, CA). El espectrómetro de masas se calibró con las disoluciones de calibración de iones positivos y negativos Pierce® ESI (Thermo Fisher Scientific). La separación cromatográfica se realizó en una columna Agilent Zorbax SB-C18 (100 mm × 2,1 mm × 1,8 μm) a 40oC con un sistema solvente binario compuesto por agua Milli-Q® acidificada (0,1% ácido fórmico, solvente A) y acetonitrilo acidificado (0,1% ácido fórmico, solvente B). Se programó una elución en gradiente de la siguiente manera: • 0-5 min: 99% A - 1% B • 5–10 min: 60% A - 40 % B • 11–13 min: 5% A - 95% B • 14–16 min: 99% A - 1% B La curva de calibración se preparó con diez disoluciones que contienen los 14 analitos (15N2 L-TRP, L-TRP, 5-OH-TRP, SER, NAS, MEL, TRYPT, TOL, 13C TYR, TYR, 4-HPAA, TYRS y HT) a partir de un stock. El intervalo de concentración empleado fue de 0,0003–50 mg/L. El volumen de inyección fue de 1 μL y el flujo se fijó en 0,4 mL/min. La temperatura de la columna se mantuvo a 40oC. Los principales parámetros de la fuente HRMS fueron: • Voltaje de pulverización: 4000 V • Flujo de gas de envoltura (sheath gas): 53 unid. arbitrarias • Flujo de gas auxiliar (auxiliary gas): 14 unid. arbitrarias • Flujo de gas de barrido: 3 unidades arbitrarias • Energía de colisión normalizada (NCE): 20 • Gas envolvente: (60 a. u.) • Gas auxiliar: (20 a. u.) MATERIALES Y MÉTODOS 96 Figura 17. Ensayo de permeabilidad celular 2.5.5. Inmunocitoquímica La evaluación de la expresión de la proteína β-catenina se llevó a cabo tras el periodo de incubación. En primer lugar, las células se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% (p/v) durante 20 min a temperatura ambiente seguido de una disolución de Triton X-100 0,3% (v/v) durante 5 min y un bloqueo con BSA al 3% (v/v) en PBS durante 60 min a temperatura ambiente. Tras el bloqueo, se añade el anticuerpo primario de conejo β-catenina (1:100) durante la noche a 4oC. A continuación, las células se incubaron con el anticuerpo secundario Alexa Fluor® 555 (1:500) durante 60 min a temperatura ambiente. Tanto el anticuerpo primario como el secundario se diluyeron en una solución de bloqueo. Seguidamente, los núcleos celulares se tiñeron con el colorante Hoechst 33342 durante 10 min a temperatura ambiente. La muerte celular se determinó mediante el estudio de la morfología de los núcleos y el número de células presentes. Finalmente, las células deshidratadas con metanol se montaron en el portaobjetos de microscopía con DPX, se secaron y se almacenaron a 4oC hasta la toma de imágenes. MATERIALES Y MÉTODOS 97 Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio Olympus BX60 equipado con lámpara de mercurio Olympus U-RFL-T y cámara CCD monocromática refrigerada Hamamatsu Orca R2, con objetivos de aceite de 40x. En todos los ensayos, se controló la integridad de la monocapa mediante TEER, permeabilidad celular con fluoresceína de sodio y ensayo inmunocitoquímico de la proteína β-catenina, para estudiar que el paso de metabolitos a través de la BBB no se debió a una alteración de las propiedades de barrera. 2.6. Estudio del transporte a través de la barrera hematoencefálica Con el objetivo de evaluar la capacidad de cada uno de los bioactivos de atravesar la barrera hematoencefálica se recolectó el medio de las zonas apicales y basales en distintos tubos tal y como se refleja en la Figura 17 (1). A continuación, se realizó el análisis de los metabolitos sometidos a transporte transendotelial por UHPLC/HRMS tras las desproteinización de las muestras. Las desproteinización se efectuó mediante la precipitación de las proteínas empleando 2,5 mL de ACN/mL de muestra y centrifugando a 3200 g durante 15 min. A continuación, se recolectó el sobrenadante y se secó en un concentrador de vacío a 30oC y 2000 rpm. Por último, las muestras se disolvieron en ACN/H2O 10% (v/v) y se analizaron por UHPLC/HRMS. La separación cromatográfica se realizó en una columna Agilent Zorbax SB-C18 (100 mm × 2,1 mm × 1,8 μm) a 40oC. El método empleado para el análisis cromatográfico de los metabolitos se encuentra descrito en la tabla 11. MATERIALES Y MÉTODOS 98 Tabla 11. Condiciones cromatográficas 2.7. Ensayos para la evaluación del efecto neuroprotector (Capítulos 4 6). 2.7.1. Cultivo de células La evaluación del efecto neuroprotector se llevó a cabo empleando las células PC12 en medio de cultivo DMEM completo (3% FBS, 18% suero de caballo y 1,2% de antibiótico). Tras descongelarlas, se siembran en un frasco a 37°C y con 5% de CO2. Al cabo de una semana, conseguimos una confluencia adecuada para poder realizar nuestros experimentos (Figura 18). Compuesto Condiciones cromatográficas TYRS and HT • Fases móviles: (A) solución acuosa de ácido fórmico al 0,1% y (B)solución al 0,1% de ácido fórmico en metanol. • Gradiente: 0–1 min (5% B); 1–7 min (100% B); 7–8.5 min (100% B); 8.6– 10 min (5% B). • Monitorización de reacciones paralelas (PRM): 153.05572 m/z • Energía de colisión normalizada (NCE): 25 eV TYR and SER • Fases móviles: (A) solución acuosa de ácido fórmico al 0,1% y (B)solución al 0,1% de ácido fórmico en metanol. • Gradiente: 0–1 min (5% B); 1–7 min (100% B); 7–8.5 min (100% B); 8.6– 10 min (5% B). • PRM: 182.08117 y 177.10224 m/z • NCE: 40 eV PCA • Fases móviles: (A) solución acuosa de ácido fórmico al 0,1% y (B)solución al 0,1% de ácido fórmico en metanol. • Gradiente: 0–1 min (5% B); 1–7 min (100% B); 7–8.5 min (100% B); 8.6– 10 min (5% B). • PRM: 153.01933 m/z • NCE: 40 eV MATERIALES Y MÉTODOS 99 Figura 18. Cultivo celular PC12 2.7.2. Toxicidad de los bioactivos en células neuronales (MTT) En primer lugar, se realizó un estudio de toxicidad de los compuestos objeto de estudio: MEL, PCA, HT, DOPAL, MOPAL y MOPET. Además, en la evaluación del efecto neuroprotector se incubaron en presencia de fibras de α-sin. La metodología seguida se esquematiza en la Figura 15 (apartado 2.5.2.). En este caso, se sembraron en placas de 96 pocillos 25000 células PC12 por pocillo. 2.7.3. Estudio del nivel de agregación de α-sin en presencia de los bioactivos 2.7.3.1. Ensayo ThT Con el objetivo de estudiar la capacidad de los compuestos de inhibir la formación de fibras de α-sin o desestabilizar las fibras ya formadas se empleó la molécula fluorescente ThT debido a su capacidad de unirse a las fibras de α-sin y emitir fluorescencia. El ensayo se realizó de acuerdo con el método descrito por Ono et al. (2004) con algunas modificaciones. En el ensayo de inhibición se preparó un stock de α-sin 140 µM disuelto en tampón fosfato y, posteriormente, se diluyó hasta alcanzar una concentración final de 70 µM. Por otro lado, para el ensayo de desestabilización la disolución de α-sin se incubó durante seis días a 37oC y agitación continua (1000 rpm) para poder formas las fibras. A continuación, los monómeros de fibras (en el caso del ensayo de inhibición) y las fibras de α-sin (en el caso del ensayo de desestabilización) se colocaron en contacto con las disoluciones de los compuestos, en las condiciones MATERIALES Y MÉTODOS 100 correspondientes de cada ensayo, en una placa de 96 pocillos negra. Se empleó como control una disolución de α-sin 70 µM. Los datos de fluorescencia fueron monitorizados durante seis días (con agitación continua en el caso del ensayo de inhibición) con un espectrofotómetro de fluorescencia (Synergy HT, Biotek) a una longitud de onda de excitación de 450 nm y de emisión de 485 nm (Figura 19). Figura 19. Ensayo ThT 2.7.3.2. Electroforesis El ensayo de electroforesis se llevó a cabo para confirmar los resultados obtenidos en el ensayo Tht. Las muestras resultantes del ensayo Tht se diluyeron con 5 µL del tampón de carga y se calentaron a 50oC, 3 min. Seguidamente, las muestras se colocaron en el gel dentro de la cubeta durante 1h a 100V (Imagen 2). Por último, el gel se tiñó con Coomassie Blue y a continuación se destiñó para visualizar las bandas. 2.7.3.3. Imágenes al microscopio electrónico de transmisión Imagen 2. Gel de electroforesis en el interior de la cubeta MATERIALES Y MÉTODOS 101 Las imágenes de las fibras de α-sin se tomaron usando el microscopio electrónico de transmisión (Zeiss Libra 120). Para ello, las muestras resultantes del ensayo Tht se colocaron en las rejillas recubiertas de carbono y se incubaron durante 20 min. A continuación, se retiró el exceso de muestra, se añadieron 5µL de glutaraldehído y se incubó durante 5 min. Para concluir, la muestra se tiñó durante 1 min con 5 µL de uranilo y se dejó secar durante 24 h hasta su visualización. 2.7.4. RT-PCR Para comenzar, se sembraron las células neuronales en placas de 24 pocillos durante 24 h (1). En segundo lugar, se incubaron los compuestos en presencia y en ausencia αsinucleína en sus respectivas condiciones de ensayo (2) y tras 24 h se realizó la extracción de ARN con Trisure. Seguidamente, se transformó el ARN en ADN complementario (ADNc) mediante el uso del kit RevertAid First Strand cDNA (4). Finalmente, se añadieron el ADNc resultante, junto con cada uno de los primers (SIRT- 1, SIRT-2, Hsp70, HO-1 y β-actina) y el kit SensiFASTTM SYBR NO-ROX KIT en una placa de 384 pocillos y se introdujo en el equipo Lightcycler® 480 Instrument II donde se desarrolló la RT-PCR (5) (Figura 20). Figura 20. Análisis por RT-PCR MATERIALES Y MÉTODOS 102 2.8. Ensayos para el análisis del efecto neuroantiinflamatorio del hidroxitirosol (Capítulo 5). 2.8.1. Cultivo de células Las células que se han utilizado para la evaluación del efecto neuroantiinflamatorio del HT fueron las Bv2 de microglía. En primer lugar, se cultivaron durante una semana en medio DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de la disolución de estreptomicina/penicilina (tabla 8). Al cabo de una semana a 37°C y con 5% de CO2 se alcanzó la confluencia idónea para realizar los ensayos (Figura 21). Figura 21. Cultivo celular Bv2 de microglía 2.8.2. Ensayo de citotoxicidad (Rojo neutro) Se sembraron 12·103 células por pocillo en una placa de 96 pocillos durante 24h a 37oC. Para comenzar, el bioactivo se incubó durante 6 h con las células de Bv2 y, a continuación, se retiró el medio y se añadió una disolución de RN (10 mg/mL). La disolución se mantuvo en contacto con las células durante 3h a fin de que los lisosomas de las células viables captasen el RN. Seguidamente, se retiró la disolución de RN y se fijaron las células con formaldehído durante 2 min. Para terminar, se añadió una disolución de ácido acético para extraer y solubilizar el RN absorbido por las células. La cuantificación se realizó a una longitud de onda de 540 nm. 2.8.3. RT-PCR MATERIALES Y MÉTODOS 103 La metodología empleada se detalló en el apartado 2.7.4. con algunas modificaciones. En este caso, el tratamiento consistió en añadir HT (50 µM) a las células Bv2 en presencia y ausencia de LPS o α-sinucleína durante 6 h. Se añadió LPS o α-sinucleína con y sin HT durante 3 h y, finalmente, ATP durante 1 h a fin de activar el inflamosoma. Los primers empleados fueron: TNF-α, iNOS, IL-1β, IL-6, arginase, CXCL10, las subunidades de NAPDH (p22phox, p47phox, and gp91phox), NPLR3 y β-actina. 2.8.4. Análisis de p38, JNK, IL-1β y Akt mediante el ensayo de western blot Las proteínas empleadas se obtuvieron siguiendo el método descrito en la Figura 22. En primer lugar, se sembraron 15·103 células por pocillo durante 24 h con el objetivo de alcanzar la confluencia. Después, se sometieron al tratamiento descrito en el apartado 2.8.3. Tras el tratamiento, se procedió a la lisis celular añadiendo 50 µL por pocillo de buffer RIPA y con ayuda de un scrapper y (1). A continuación, se realizó un recuento de proteínas mediante el ensayo con BCA a fin de tener la misma cantidad de proteínas en cada una de las condiciones y, por último, se añadió SDS y DOC a la cantidad calculada. La desnaturalización de las proteínas se llevó a cabo a 70oC durante 10 min y, posteriormente, se dispusieron en los pocillos del gel de electroforesis (2). La electroforesis tuvo lugar durante 1 h (3) y, después, se transfirió a una membrana de de nitrocelulosa 0,2 µM (3). Posteriormente, la membrana se incubó con el anticuerpo correspondiente (p38, JNK, IL-1β y Akt) disuelto en BSA durante la noche a 4oC (4). Para terminar, se adicionó el anticuerpo secundario durante 1h a temperatura ambiente y las bandas se detectaron usando una disolución quimioluminiscente. Las imágenes de las bandas se visualizaron en el equipo Amersham Imager 600 station (5) y se cuantificaron con el software ImageJ. MATERIALES Y MÉTODOS 104 Figura 22. Ensayo de western blot 2.8.5. Determinación de especies reactivas de oxígeno. Para evaluar el estrés oxidativo producido en las células de Bv2, se sembraron 35·103 células por pocillo en placas de Ibidi durante 24 h a 37oC. A continuación, las células se trataron con LPS o α-sin en presencia y en ausencia de HT durante 6 h y, después, se añadió el reactivo CellROX® a cada pocillo. Este reactivo es una sonda fluorogénica que exhibe fluorescencia en presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el citoplasma celular. La concentración final de CellROX® fue de 5mM en cada pocillo. Tras 30 min de incubación a 37oC, se retiró el medio y las células se lavaron con PBS tres veces. Por último, se tomaron las imágenes empleando el microscopio confocal láser de barrido Zeiss LSM 7 DUO (Figura 23) y se analizaron con el software ImageJ. En cada imagen, se calculó el número total de células y se midió la intensidad de área para células fluorescentes y no fluorescentes. Luego, se utilizó la siguiente fórmula para calcular la fluorescencia celular total corregida (CTCF): CTCF= Densidad de área – (Área celular · Fluorescencia media) MATERIALES Y MÉTODOS 105 Figura 23. Ensayo de ROS 2.8.6. Detección inmunohistoquímica de translocación al núcleo NFκB p65 Con el objetivo de estudiar el nivel de translocación al núcleo de NFκB p65, 40·103 células por pocillo se sembraron en placas de 24 pocillos durante 24 h (1). A continuación, las células fueron tratadas con LPS o α-sinucleína en presencia y ausencia de HT durante 6 h (2). Seguidamente, se empleó paraformaldehído para fijar las células (3) y se incubaron con la disolución de bloqueo (5% PBS, 1% BSA, 0,1% Triton X-100, anticuerpo de conejo policlonal NFκB p65) durante una noche a 4oC (4). Al día siguiente, se incubaron con el anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 conjugada anti-IgG) durante 1 h a temperatura ambiente (4). Para terminar, el núcleo se tiñó con una disolución de Hoechst 33342 (1 µg/mL) y se preparó empleando un medio fluorescente (4). Las imágenes se tomaron con un microscopio confocal de barrido láser (5) y se cuantificaron con el software ImageJ (Figura 24). Food Chemistry 374 (2022) 131742 Available online 2 December 2021 0308-8146/© 2021 The Author(s). Published by Elsevier Ltd. This is an open access article under the CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Isotopic labelling-based analysis elucidates biosynthesis pathways in Saccharomyces cerevisiae for Melatonin, Serotonin and Hydroxytyrosol formation M. Gallardo-Fern´ andez a , J. Valls-Fonayet b , E. Valero c , R. Hornedo-Ortega a , T. Richard b , A. M. Troncoso a , M.C. Garcia-Parrilla a , * a ´ Area de Nutrici´ on y Bromatología, Departamento de Nutrici´ on y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, C/Profesor Garcia Gonzalez, 2, 41012 Sevilla, Spain b MIB, Unit´ e de Recherche Œnologie, Universit´ e de Bordeaux, EA 4577, USC 1366 INRA, ISVV, Bordeaux, France c Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Universidad Pablo de Olavide, Ctra. Utrera, Km 1, 41013 Sevilla, Spain ARTICLE INFO Keywords: Yeast Nitrogen Indolic compounds Polyphenol Alcoholic fermentation HRMS ABSTRACT Yeasts can synthetise bioactive compounds such as Melatonin (MEL), Serotonin (SER) and Hydroxytyrosol (HT). Deciphering the mechanisms involved in their formation can lead to exploit this fact to increase the bioactive potential of fermented beverages. Quantitative analysis using labelled compounds, 15-N2 L-tryptophan and 13-C tyrosine, allowed tracking the formation of the above-mentioned bioactive compounds during the alcoholic fermentation of synthetic must by two different Saccharomyces cerevisiae strains. Labelled and unlabelled MEL, SER and HT were undoubtedly identified and quantified by High Resolution Mass Spectrometry (HRMS). Our results prove that there are at least two pathways involved in MEL biosynthesis by yeast. One starts with tryptophan as precursor being known for the vertebrates’ pathway. Additionally, MEL is produced from SER which in turn is consistent with the plants’ biosynthesis pathway. Concerning HT, it can be formed both from labelled tyrosine and from intermediates of the Erlich pathway. 1. Introduction Melatonin (MEL), N-acetyl-5-methoxytryptamine, is a neurohormone involved in the regulation of circadian rhythms in humans. It is widespread present in different kingdoms such as fungi, plants, and vertebrates (Szafra´ nska & Posmyk, 2017). Its presence in foods has attracted much interest for its recognized bioactive properties (antioxidant, neuroprotective, antinflammatory and cardiovascular properties) (R. J. Reiter et al., 2000;Russel J. Reiter et al., 2010; , Sanchez-Barcelo et al., 2012) and has been analysed in different foods and beverages. Indeed, it has been detected in several foodstuffs including, among others, tomatoes, strawberries (Stürtz et al., 2011), cherry (Zhao et al., 2013), apple (Lei et al., 2013), walnuts (Russel Reiter et al., 2005) and pistachios (Oladi et al., 2014) as well as fermented foods such as wine (Rodriguez-Naranjo et al., 2011), fermented orange beverages (Fern´ andez-Pach˜ on et al., 2014) and beer (Edwin Fern´ andez-Cruz et al., 2020). The role of yeast to explain the presence of MEL in fermented products was initially highlighted when this bioactive compound was detected in a fermented grape must in which MEL was initially absent (M. Isabel Rodriguez-Naranjo et al., 2011). These findings could be confirmed when MEL was determined after the alcoholic fermentation of a synthetic must, pinpointing the synthesis of MEL by Saccharomyces (María Isabel Rodriguez-Naranjo et al., 2012). Yeasts are well known for transforming nitrogen sources into metabolites that have an impact in sensorial properties of wines (Mas et al., 2014; Bell & Henschke, 2005). In addition, these studies show that yeasts are at the same time capable of synthesising bioactive compounds, opening new possibilities of research. Consequently, the interest of unravelling the biosynthetic pathway involved in MEL synthesis has increased not only to favour the concentration of bioactives in foods but also to understand the significance of MEL for yeast and its biological role. Recently, Morcillo-Parra and their co-workers, (Morcillo-Parra et al., 2019) proved that MEL bounds to glycolitic enzymes reinforcing the possible role of MEL as a signal molecule, likely related to fermentation metabolism. This signalling role may explain the fact that MEL appears and disappears during the * Corresponding author. E-mail address: [email protected] (M.C. Garcia-Parrilla). Contents lists available at ScienceDirect Food Chemistry journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.131742 Received 17 September 2021; Received in revised form 24 November 2021; Accepted 28 November 2021 Food Chemistry 374 (2022) 131742 2 fermentation process (Fernandez-Cruz et al., 2019) following a zig zag pattern likely associated to the binding to different proteins (Morcillo- Parra et al., 2019). So far, the biosynthetic pathway described in mammals (Ruddick et al., 2006). involves four steps reactions considering the amino acid L-tryptophan (L-TRP) as the initial precursor, which is subsequently transformed into 5-hydroxytryptophan (5-OH-TRP), SER, N-acetylserotonin (NAS) and 5-methoxytryptamine (5-MT-TRYPT) as displayed in Fig. 1A. These metabolites were determined in the intracellular compartment of Saccharomyces and non-Saccharomyces wine yeasts during alcoholic fermentation of synthetic musts (´ Alvarez- Fern´ andez et al., 2019). On the other hand, Mu˜ niz Calvo and their colleagues performed experiments adding intermediates (L-Trp, 5-OH-TRP, SER, NAS, tryptamine (TRYPT), and 5-MT) in S. cerevisiae cells in different grown stages as pulses to assess the bioconversion into new indolic compounds (Mu˜ niz-Calvo et al., 2019). Their results showed that the decarboxilation of L-TRP forming TRYPT could be an initial step. Secondly, a hydroxylation of TRYPT could form SER. This alternative route in yeasts is different from those described in vertebrates in which 5-OH- TRP is the first step (Hardeland et al., 1993). Fig. 1A represents the proposed pathway. This research was carried out with several pulses with the intermediates of the pathway (L-TRP, 5-OH-TRP, SER, NAS, TRYPT, and 5-MT- TRYPT) applied to cells in different growth stages and conditions, thus it might differ from a natural fermentation media in which these intermediates are present at the concentrations that yeasts synthetise them (Hardeland et al., 1993). In addition to MEL, another relevant bioactive, hydroxytyrosol (HT), has been very recently detected in the intracellular compartment of yeast (´ Alvarez-Fern´ andez et al., 2018a). In fact, HT is present in wine (Di Tommaso et al., 1998) but at lower concentrations than in extra virgin olive oil, (Mateos et al., 2001) the major dietetic source. HT is indeed a polyphenol typically found in olives, and also present in olive mill Fig. 1. Illustration of the biosynthetic pathway of A. melatonin from tryptophan and B. hydroxytyrosol from tyrosine. MEL: melatonin, L-TRP: tryptophan, 5-OH- TRP: 5-hydroxytryptophan, SER: serotonin, NAS: N- acetylserotonin which are the predominant intermediates in mammalian model whereas additional or alternative steps including TRYPT: tryptamine and 5-MT-TRYPT: 5- methoxytryptamine are reported for yeast and plant models. HT: hydroxytyrosol, TYR: tyrosine, 4- HPP: 4-hydroxyphenylpyruvate, 4-HPAA: 4- hydroxyphenylacetic acid, TYRS: Tyrosol. M. Gallardo-Fern´ andez et al. Food Chemistry 374 (2022) 131742 3 wastewater. In nature, HT in olives is found in the form of its elenolic acid ester, oleuropein (Vissers et al., 2002). Conversely, HT in wines may derive, partly at least, from the hydroxylation of tyrosol (TYRS) which in turn is formed by the Ehrlich pathway as shown in Fig. 1B. All these findings proved that yeasts, in particular Saccharomyces but also certain non-Saccharomyces, do synthetize bioactive compounds with impact in human health. To exploit this data and improve the bioactive composition of fermented products, it is necessary to gain knowledge about the pathways and steps leading to their formation and accumulation. A classical experimental design to unravel biosynthetic pathways is the use of labelled compounds that permit more easily to follow the newformed molecules. This approach has been successfully applied to monitor the formation of aromatic compounds and a better understanding of amino acid metabolism in yeasts (Rollero et al., 2017). Therefore, the aim of this paper is to decipher the metabolic pathways related to the synthesis of bioactive compounds in yeast, namely MEL, HT and SER. For this purpose, we performed alcoholic fermentation experiments with synthetic must that includes labelled L-TRP or TYR as potential precursors of MEL and HT respectively. This strategy allows to follow the bioactive compounds during different days of the fermentation process. 2. Material and methods 2.1. Reagents and materials All standards used in this study (L-Tryptophan- 15 N 2 ( 15 N 2 L-TRP) (Fig. 2A), L-TRP, 5-OH-TRP, SER, NAS, MEL, TRYPT, Tryptophol (TOL), L-Tyrosine-(phenyl-4- 13 C) ( 13 -C TYR) (Fig. 2B), Tyrosine (TYR), 4- hydroxyphenylacetic acid (4-HPAA), TYRS and HT) were purchased from Sigma Aldrich (St.Louis, MO, USA). HPLC grade methanol was supplied from Merck (Darmstadt, Germany) and formic acid was provided by Prolabo® (Obregon, Mexico). 2.2. Yeast strains The experiments on alcoholic fermentation of synthetic musts were performed with two different commercial wine yeast strains: S. cerevisiae Lalvin YSEO QA23 (Lallemand; QA) and S. cerevisiae Red Fruit (Enartis; RF). They were selected based on our previous experience in which QA23 proved to synthesize MEL and other indole compounds (Fern´ andez-Cruz et al., 2017) while Red Fruit produces HT (´ Alvarez-Fern´ andez et al., 2018b). All the strains were provided as active dried yeast and were rehydrated for 30 min at 37 ◦C and plated on yeast extract peptone dextrose (YPD) agar (2% peptone, 2% glucose, 1% yeast extract and 2% agar). Then, they were incubated at 28 ◦C in an oven for 2 days. Afterwards, the pre-culture was prepared in 150 mL of YPD broth (2% peptone, 2% glucose and 1% yeast extract) and shaken at 150 rpm, 28 ◦C, overnight, before inoculation. 2.3. Alcoholic fermentation The experiments of alcoholic fermentations were carried out using a synthetic must (SM) at pH 3.5., prepared based on literature (Riou et al., 1997) with some modifications. The must containing isotopically labelled TYR was prepared at a concentration of 10 mg/L of labelled TYR and 260 mg/L of (NH 4 ) 2 SO 4 . In the case of the must that contains labelled L-TRP, its concentration was 13.4 mg/L and 260 mg/L of (NH 4 ) 2 SO 4 . The concentration of glucose and fructose as a carbon source is 100 g/L each and the amounts of malic and citric acid were 5 and 0.5 g/L, respectively. The concentration for the remaining compounds was maintained unaltered (Riou et al., 1997). Mineral salts, sugars and organic acids were the first to be added. Subsequently, the solution was shaken, and the pH of the medium was adjusted to 3.5, with NaOH. Ref Fruit was inoculated in the labelled TYR medium, while QA23 was inoculated in the labelled L-TRP medium. Each Erlenmeyer flask with 750 mL of SM was inoculated with 10 6 cell/mL and capped with taps equipped with a capillary to release carbon dioxide. During fermentations, all the flasks were stored in an orbital incubator at 28 ◦C. The flasks were weighed daily before and after sampling. Cell growth and evolution were assessed by measuring the optical density (DO) at 600 nm every sampling day (Fig. 3 3.1–3.6). To obtain the most reliable results and capture the random biological variation, six biological replicates of each fermentation were considered. 2.4. Extracellular metabolites extraction. A sample volume corresponding to 10 9 cells of each Erlenmeyer flask was taken for ten days in the case of fermentation with Red Fruit yeast and for seven days in the case of fermentations with QA23 yeast. The number of cells was counted taking 1 mL of each Erlenmeyer and using the Neubauer chamber and the DO value. Immediately, the samples were centrifuged, at 4500 rpm for 3 min at 4 ◦C, in order to separate the cells from extracellular contents. The extracellular samples were collected and stored at −80 ◦C until the analysis. All extracellular extracts were cleaned up as reported by Fern´ andez- Cruz (E. Fern´ andez-Cruz et al., 2017) with some modifications. C18 SPE cartridges (1 g, Variant, Agilent) were conditioned with 2 mL of methanol and 2 mL of milli Q water. For cleaning extracellular samples an aliquot of 2 mL of extracellular sample was loaded, followed by a washing step with 2 mL of a 10% v/v methanol/water solution. The analytes were eluted with 1 mL of methanol. Methanol was then evaporated until dryness by using a vacuum concentrator (HyperVAC-LITE, GYOZEN, Korea) at 30 ◦C and 2000 rpm for 8 h. Each sample was reconstituted with 100 μ L of methanol/0.1% formic acid and immediately analysed. 2.5. UHPLC-HRMS instrumental analysis The instrument of analysis consisted of a UHPLC Vanquish coupled to a Q-Exactive Plus mass spectrometer equipped with a heated electrospray ionization (HESI-II) probe (all from Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). The mass analyser was calibrated before analysis using Pierce® ESI Negative and Positive Ion Calibration Solutions (Thermo Fisher Scientific). Chromatographic separation was carried out on an Agilent Zorbax SB-C18 column (100 mm ×2.1 mm ×1.8 µm) at 40 ◦C Fig. 2. Structure of A: L-Tryptophan- 15 N2 and B: L-Tyrosine-(phenyl-4- 13 C). M. Gallardo-Fern´ andez et al. Food Chemistry 374 (2022) 131742 4 with a binary solvent system composed by acidified milliQ water (0.1% formic acid, solvent A) and acidified LC-MS acetonitrile (0.1% formic acid, solvent B). A gradient elution was programmed as follows: 0–5 min: 1% B; 5–10 min: 1% −40% B; 11–13 min: 95% B; 14–16 min; 1% B. For the calibration curve, ten solutions containing the 14 analytes ( 15 -N 2 L-TRP, L-TRP, 5-OH-TRP, SER, NAS, MEL, TRP, TOL, 13 -C TYR, TYR, 4-HPAA, TYR and HT) were prepared in a range of 0.0003–50 mg/ L. Injection volume was 1 µL and the flow was set at 0.4 mL/min. The temperature of the column was maintained at 40 ◦C. The main parameters of the HRMS source were: Spray voltage (4000 V), Sheath gas (60 a.u); Auxiliary Gas (20 a.u.), Capillary temperature and probe heater temperature (200 ◦C), S-lens RF level (50). A FullScan mode in the range m/z 100–400 was selected for the acquisition at a resolution of 70,000 (FWHM). The automatic gain control target was set at 3.10 6 ions and the maximum injection time was set at 200 ms. Subsequent data analysis was performed by Xcalibur Software Fig. 3. Monitoring of the evolution of both fermentations: 3.1, 3.2, 3.3 → 13-C TYR as precursor of HT during the ten days of alcoholic fermentation by the yeast S. cerevisiae Red Fruit; 3.4, 3.5, 3.6 → 15-N2 L-TRP as precursor of MEL during the seven days of alcoholic fermentation by the yeast S. cerevisiae Lalvin YSEO QA23. by weight, OD and cell growth. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.) M. Gallardo-Fern´ andez et al. Food Chemistry 374 (2022) 131742 5 (version 3.0.63), to confirm compound identification and quantify the different analytes, using the molecular formula and exact mass of the indole compounds, both of which are available in public databases, such as PubChem and ChemSpider. For quantification, extracted ion chromatograms for each labelled and unlabelled metabolite were obtained at a scan with of 0.01 uma around the exact mass of the compound. 3. Results In order to monitor the evolution of the fermentations, some parameters were recorded. Before and after sampling, the flasks were weighed daily as displayed in Figs. 3.1 and 3.4 showing a decrease during fermentation as expected. Optical density (OD) measured at 600 nm (Figs. 3.2 and 3.5) and Cell growth (Figs. 3.2 and 3.6) determined thanks to a Neubauer’s chamber increase at day 1 and keep constant till the end of the fermentation. Four compounds deriving from L-TRP (5-OH-TRP, Ser, NAS, and MEL) were followed during the seven days of alcoholic fermentation and unequivocally identified through their retention time, exact mass and matching their mass spectra with that of the commercial standard. Accurate mass determination allowed us to unequivocally distinguish labelled and unlabelled compounds standard (Table 1A). Quantitation was performed using external calibration curves with 10 points, which were freshly prepared at every analytical session. Tables 2A and 2B and Fig. 4A and 4B display the concentration of the compounds derived from each aromatic amino acid (L-TRP and TYR respectively) determined at each day during the fermentation experiment. Results are the average of the six biological replicates analysed in duplicate. As expected, labelled compounds deriving from 15 -N 2 L-TRP included in the must (Table 2A) were detected in the samples taken during fermentation. Indeed, compounds believed to be intermediates in the synthesis of melatonin are detected following a time sequences as follows; day 0 15 N 2 L-TRP, day 1, labelled 5-OH-TRP, day 2, labelled SER and labelled NAS and finally at day 3, labelled MEL. This timeline fits perfectly with the pathway described for the synthesis of melatonin in mammals.(Ruddick et al., 2006; Reiter, 1991) At the initial point (day 0), just 15 -N 2 L-TRP is present, and it was consumed promptly. Consequently, its concentration sharply decreases during the first three days of fermentation in line with other works described in the literature (E. Fern´ andez-Cruz et al., 2017). Indeed, 15 -N 2 L-TRP has a maximum concentration at day 0 (9 mg/L); at day 1 its concentration is 0.3 mg/L, at day 2 of fermentation there is only left, 0.005 mg/L and at day 3 all the 15 -N 2 L-TRP has been consumed. However, the graph shows that unlabelled L-TRP (not present at day 0) appears on Day 1 and day 2 at a concentration of 0.01 and 0.002 mg/ L, respectively. This L-TRP which has not been added to the fermentation medium, agrees with the fact that yeast is involved in a novo tryptophan formation which can be used to synthetise MEL thereafter. The order of appearance of non-labelled compounds is as follows: nonlabelled L-TRP, non-labelled 5-OH-Trp, non-labelled SER (day 1); non-labelled NAS (day 2), non-labelled MEL (day 4). These results evidenced that an important percentage of the intracellular tryptophan is synthesised from the shikimate pathway, using chorismate as carbon skeleton and ammonium (or other amino acid) as provider of nitrogen, by transaminase reactions. Therefore, the formation of MEL, does not depend entirely on the original L-TRP content of the must. Consequently, results prove that there exists at least another alternative pathway for the formation of MEL, which does not depend on the original L-TRP content of the must. Consequently, the results from our experimental design clearly show that L-TRP in must is a precursor for the synthesis of MEL and SER in yeasts but it is not the only one. It is worth to mention that unlabelled compounds L-TRP, 5-OH-TRP and SER are all determined at day 1. Interestingly, it takes longer time for labelled metabolites to be produced. For instance, it takes 48 h for labelled SER to be formed (it is measured at day 2). Considering that the not labelled L-TRP appears at day 1 it seems likely that another pathway for SER synthesis might exist. In the case of 5-OH-TRP, it is present in the medium from day one to day five at concentrations ranging between 0.005 and 0.009 mg/L. SER is already present on day 1 and is consumed on day 6. Moreover, the concentrations are higher than that of the labelled SER ranging from 0.013 mg/L on day 1 to 0.0005 mg/L on day 6. Similarly, to 15 -N 2 NAS, unlabelled NAS appears on day 2 and is consumed on day 7. Finally, MEL is detected on day 4 reaching a maximum concentration on day 5 of 0.002 mg/L. Unlabelled TRYP could not be detected on days 2–5, TOL it is maintained on days 1–5 at a concentration ranging from 0.6 to 0.8 mg/L and decreases from day 6 reaching a concentration of 0.03 mg/L on day 7. Regarding experiments conducted with 13 C TYR, three compounds derived from TYR (4-HPAA, TYRS and HT) were assessed during the nine days of alcoholic fermentation and unequivocally identified with commercial pure standards (Table 1B). In Table 2B the concentrations of the different labelled and unlabelled compounds are displayed. 13 -C TYR is present on day zero (9 mg/L) and is completely consumed since it is not detected neither on day one nor in any of the following days. However, unlabelled TYR is not detected in any of the 10 days of fermentation. Fig. 4B shows the concentrations of the labelled and unlabelled 4- HPAA, TYRS and HT throughout the 9 days of fermentation and values are consistent with the route previously described in the literature.(Hazelwood et al., 2008) Labelled 4-HPAA appears the first day at a concentration of 0.5 mg/L and is consumed on the eighth day reaching a maximum concentration on day 3 of 7.8 mg/L. In agreement with the maximum concentration of 4-HPAA on the third day, the maximum TYRS concentration is found on day five at 3.5 mg/L. Finally, HT concentrations throughout the 9 days of fermentation remain practically constant, its concentration being around 0.018 mg/L. We must highlight the presence of unlabelled compounds derived from TYR. Since the only source of TYR in the medium is the labelled one, these unlabelled compounds should then come from another alternative pathway. Noteworthy, the unlabelled HT concentrations are Table 1 Parameters of labelled and unlabelled compounds. Ionization mode (+/−), exact mass (g/mol) and retention times (min). A: Compounds deriving from L- Trp. B: Compounds deriving from TYR. A. Compound Ionizationmode Exact mass(g/ mol) Retention time (min) L-TRP +205.23261 7.53 5-OH-TRP +221.23524 2.43 SER +177.22476 2.01 NAS +219.25634 8.89 MEL +233.28446 10.55 TRP +161.22213 7.75 TOL +162.20291 10.54 15 N2 L-TRP +207.23252 7.65 15 N2 5-OH- TRP +223.23474 2.52 15 N2 SER +179.22557 2.03 15 N2 NAS +221.25476 8.90 15 N2 MEL +235.28693 10.57 15 N2 TRP +163.22334 7.80 15 N2 TOL +164.20877 10.57 B. Compound Ionizationmode Exact mass(g/mol) Retention time(min) TYR – 180.19214 1.34 4-HPAA – 151.15576 8.65 TYRS – 137.16631 3.37 HT – 153.16144 6.24 13 C TYR – 181.19472 1.37 13 C 4-HPAA – 152.15693 8.68 13 C TYRS – 138.16146 3.39 13 C HT – 154.16239 6.26 M. Gallardo-Fern´ andez et al. Food Chemistry 374 (2022) 131742 6 Table 2 Concentrations (mg/L) ±SD of the A: L-Trp derived metabolytes (labeled (L) and not isotopically labeled (NL) during the seven days of alcoholic fermentation by the yeast S. cerevisiae Lalvin YSEO QA23. B: TYR derived metabolytes (L and NL) during the ten days of alcoholic fermentation by the yeast S. cerevisiae Red Fruit. ND: Not detected. A. Concentration ± SD (mg/L) Days offermentation L-TRP 5-OH-TRP SER NASS MEL TRYPT TOL L NL L NL L NL L NL L NL NL NL 0 9.35±0.9 ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.0053± 0.0008 0.31± 0.005 1 0.14±0.02 0.011± 0.002 0.007± 0.001 0.009± 0.002 ND 0.013± 0.0001 ND ND ND ND 0.0045± 0.0004 0.63±0.02 2 0.015±0.001 0.0022± 0.0001 ND 0.0028± 0.0001 0.0025± 0.0001 0.016± 0.0006 0.00053±0.00005 0.00078± 0.0001 ND ND ND 0.70±0.08 3 0.0005±0.0001 ND 0.0035± 0.002 0.0033± 0.001 0.003± 0.0002 0.014± 0.0005 0.00064±0.0001 0.0012± 0.0002 0.00022± 0.00002 ND ND 0.68± 0.00002 4 ND ND 0.0037± 0.001 0.0055± 0.0005 0.005± 0.0004 0.012± 0.0005 0.00034± 0.00008 0.0017± 0.0005 0.00023± 0.00005 0.0014±0.0001 ND 0.77±0.05 5 ND ND ND 0.0059± 0.0007 0.0053± 0.0008 0.036±0.002 0.0040±0.0006 0.0019± 0.0006 ND 0.0023±0.0008 ND 0.84±0.04 6 ND ND ND ND ND 0.00019± 0.0008 9.27E -5 ±0.00001 0.00053± 0.0001 0.00046± 0.00008 0.0011±0.0007 0.007± 0.0004 0.13± 0.008 7 ND ND ND ND ND ND 3.59E -5 ±0.00005 0.00012± 0.00008 0.00082± 0.00005 0.00083±0.0001 0.005± 0.0007 0.032± 0.006 B. Concentration ±SD (mg/L) Days offermentation TYR 4-HPAA TYRS HT L L NL L NL L NL 0 9.28 ±1.2 ND ND ND ND ND ND 1 ND 0.48 ±0.005 0.38 ±0.02 0.24 ±0.05 0.81 ±0.04 0.0003 ±0.0001 0.0122 ±0.005 2 ND 2.84 ±1.0 1.70 ±0.03 1.023 ±0.6 1.45 ±0.5 0.0019 ±0.0008 0.0103 ±0.006 3 ND 7.82 ±2.5 0.24 ±0.01 0.86 ±0.3 0.73 ±0.06 0.0019 ±0.0006 0.0132 ±0.007 4 ND 4.44 ±1.2 4.65 ±1.8 2.60 ±0.1 1.10 ±0.4 0.00185 ±0.0004 0.0133 ±0.002 5 ND 3.04 ±1.5 3.23 ±1 3.50 ±1.6 0.90 ±0.1 0.00183 ±0.0005 0.0136 ±0.008 6 ND 1.79 ±0.001 1.23 ±0.02 2.56 ±0.2 0.93 ±0.08 0.00156 ±0.002 0.0114 ±0.002 7 ND 1.52 ±0.2 0.98 ±0.07 2.92 ±1.4 0.90 ±0.06 0.001848 ±0.001 0.0128 ±0.004 8 ND 1.93 ±0.3 1.49 ±0.2 3.11 ±1 0.94 ±0.04 0.00178 ±0.004 0.0131 ±0.008 10 ND ND ND 1.92 ±0.5 0.64 ±0.03 0.00135 ±0.0006 0.00103 ±0.0006 M. Gallardo-Fern´ andez et al. Food Chemistry 374 (2022) 131742 7 Fig. 4. Concentrations of the: A. L-Trp derived metabolytes (labelled and not isotopically labelled) during the seven days of alcoholic fermentation by the yeast S. cerevisiae Lalvin YSEO QA23; B. TYR derived metabolytes (labeled and not isotopically labeled) during the ten days of alcoholic fermentation by the yeast S. cerevisiae Red Fruit. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.) M. Gallardo-Fern´ andez et al. Food Chemistry 374 (2022) 131742 8 around ten times higher than those of labelled HT (Table 2). These results evidence that the shikimate pathway is more important in the formation of tyrosol than the Ehrlich pathway. That is, sugar metabolism is the main precursor of the aromatic higher alcohol synthesis instead of amino acid catabolism. 4. Discussion Sprenger and co-workers (Sprenger et al., 1999) reported for the first time that MEL was present in S. cerevisiae. Having a circadian rhythm regulator role in vertebrates, the question was to understand its function in yeast, but their data did not support the hypothesis of a regulatory function. Indeed, the role of MEL in yeast and other microorganisms seems far from being understood. Although the presence of circadian rhythms in yeast has been reported (Eelderink-Chen et al., 2010). Furthermore, the response in yeast seems to be induced by temperature changes only after several generations, apparently related to the primary nitrogen metabolism, particularly, to the expression of transporter genes of some nitrogen compounds (MEP2, transporter on ammonium and GAP1, general amino acid transporter) (Eelderink-Chen et al., 2010). To better understand these functions, it is essential to unravel the possible synthetic pathways for this compound. Sprenger et al 31 showed that when starving yeast cells were exposed to the precursor L-TRP (1 mM), MEL did increase (25.3 ng/mg protein). Furthermore, the supplementation with either SER (1 mM), NAS (1 mM) or 5-methoxy- tryptamine (0.05–0.1 mM) resulted in an increase of MEL (18.0, 43.1 and 90–300 ng/mg protein, respectively). Therefore, they showed that the precursors of the normal biosynthetic pathway described for vertebrates from L-TRP and subsequent formation of 5-OH-TRP, SER and NAS also led to the formation of MEL. In our experimental design, just the addition of labelled L-TRP is considered without the addition of any other precursor. In turn, we can track labelled compounds to verify the proposed pathway during alcoholic fermentation of a synthetic must (Sprenger et al., 1999) , (María Isabel Rodriguez-Naranjo et al., 2012). Moreover, the compounds already described in the vertebrate’s pathway are in turn detected in our experiment following a consistent sequence. In plants, the biosynthetic pathway of MEL begins with L-TRP bioconversion to TRYPT by the enzyme L-TRP decarboxylase (Tan & Reiter, 2020). Then, the subsequent hydroxylation reaction is catalysed by tryptamine-hydroxylase to 5-hydroxytryptamine (Fig. 1A). Our results, however, cannot support this pathway in yeast as the TRYPT is present exclusively in the non labelled form thus not originated from the initial L-TRP. If non labelled MEL is thereafter formed from this non labelled TRYPT remains to be confirmed. According to our results, the only TRYPT detected was unlabelled thus involving another different pathway than that one starting with the original L-TRP present in must. In previous works, feeding yeast with a high amount of TRYPT resulted in SER synthesis (Mu˜ niz-Calvo et al., 2019). Consequently, it is possible that this unlabelled TRYPT is involved in the formation of unlabelled derivatives detected as SER. In fact, the concentration of unlabelled SER fits well with the sum of the concentrations of its two unlabelled precursors 5-OH-Trp and TRYPT. In summary, it is clear that L-TRP is a precursor of MEL and the rest of derivatives above described. However, from our results it can be deduced that the initial L-TRP in the must is not the solely precursor of MEL for S. cerevisiae, thus implying that they may use more than one Fig. 4. (continued). M. Gallardo-Fern´ andez et al. Food Chemistry 374 (2022) 131742 9 pathway for MEL biosynthesis (Dei Cas et al., 2021) and that they are working simultaneously during alcoholic fermentation. The results obtained in the fermentation carried out with 13 -C TYR and the S. cerevisiae Red Fruit yeast verify that HT is formed from TYR by the Ehrlich pathway (Hazelwood et al., 2008) (Fig. 4B). TYR turns into 4-hydroxyphenylpyruvate (4-HPP) through the first transamination-step of the catabolic degradation cascade known as the Ehrlich pathway. After the decarboxylation of 4-HPP in 4-hydroxyphenylacetic acid (4- HPAA), the reduction of 4-HPA results in the higher alcohol TYRS through the last step of the Ehrlich pathway. Finally, TYRS is converted into HT. Fig. 4B displays the compounds present in the HT synthesis pathway appearing throughout the nine days of fermentation following a logical order. Many of the fusel alcohols are thought to be formed during alcoholic fermentation by one of two pathways related to amino acid metabolism: (a) catabolism of grape amino acids, characterized by deamination of amino acids to α -keto acids followed by decarboxylation to an aldehyde and, finally, reduction to a fusel alcohol (the Ehrlich pathway) (Hazelwood et al., 2008) or (b) production of α -keto acids during amino acid biosynthesis from sugars, which may then be degraded to fusel alcohols. (Ugliano et al., 2009) Consistently, our results show that both pathways lead to the formation of HT (Fig. 4B). The first one includes labelled compounds from TYRS. The second, the synthesis from α -keto acids. Indeed, non labelled TYR is being detected. Strains capacity of overproducing higher alcohols directly from glucose has already been reported (Cordente et al., 2018). In addition, in previous works we have used different concentrations of TYR (10 and 60 mg/L) in the fermentation medium without obtaining notable differences in the amount of HT (Rebollo-Romero et al., 2020), which confirms that most of the HT that is formed does not come from the initial TYR must content. Declaration of Competing Interest The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper. Acknowledgements The authors are very grateful to the Spanish Government for its financial assistance (Plan Estatal 2013-2016, Ministerio de Economía y Competitividad Project AGL2016-77505-C3-2-R and M.G.F predoctoral contract; Plan Estatal 2017-2020, Ministerio de Ciencia, Innovaci´ on y Universidades, Project PID2019-108722RB-C32,) and Junta de Andalucía, Consejería de Economía y Conocimiento Project P18-RT-3098. We acknowledge the services of Science Institute of Vine and Wine (Bordeaux) and Pablo de Olavide University, and the Bordeaux Metabolome Facility and MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) project. References ´ Alvarez-Fern´ andez, M. A., Fern´ andez-Cruz, E., Cantos-Villar, E., Troncoso, A. M., & García-Parrilla, M. C. (2018a). Determination of hydroxytyrosol produced by winemaking yeasts during alcoholic fermentation using a validated UHPLC–HRMS method. Food Chemistry, 242(May 2017), 345–351. 10.1016/j. foodchem.2017.09.072. ´ Alvarez-Fern´ andez, M. A., Fern´ andez-Cruz, E., Cantos-Villar, E., Troncoso, A. M., & García-Parrilla, M. C. (2018b). Determination of hydroxytyrosol produced by winemaking yeasts during alcoholic fermentation using a validated UHPLC–HRMS method. Food Chemistry, 242(May 2017), 345–351. 10.1016/j. foodchem.2017.09.072. ´ Alvarez-Fern´ andez, M. A., Fern´ andez-Cruz, E., Garcia-Parrilla, M. C., Troncoso, A. M., Mattivi, F., Vrhovsek, U., & Arapitsas, P. (2019). Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii Intra- and Extra-Cellular Aromatic Amino Acids Metabolism. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 67(28), 7942–7953. https:// doi.org/10.1021/acs.jafc.9b01844 Bell, S. J., & Henschke, P. A. (2005). Implications of nitrogen nutrition for grapes, fermentation and wine. Australian Journal of Grape and Wine Research, 11(3), 242–295. https://doi.org/10.1111/j.1755-0238.2005.tb00028.x Cordente, A. G., Solomon, M., Schulkin, A., Leigh Francis, I., Barker, A., Borneman, A. R., & Curtin, C. D. (2018). 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Spanish-style 3.205 0.859 133.685 n.dr. Manzanilla California-style 36.7 ±3.1 n.dr. 210.0 ±18.8 n.dr. UHPLC-QqQ MS/MS dMRM [28] Mission Dry-salted black olives 516.2 ±44.3 n.dr. 633.8 ±55.1 n.dr. Greece Throuba Thassos Dry-salted black olives 1459.5 ±100.1 n.dr. 195.1 ±7.8 n.dr. Algeria Azz Sed Spanish-style n.dc. 37.27 ±0.73 105.97 ±12.2 n.dr. RP-HPLC-DAD [29] Gordal Spanish-style n.dc 43.65 ±1.09 45.68 ±1.49 n.dr. Sevilla Spanish-style n.dc 106.49 ±0.26 545.42 ±13.24 n.dr. Sigoise Spanish-style 1840.29 ± 49.27 35.84 ±8.76 98.80 ±19.8 n.dr. Teffahi Spanish-style n.dc 24.38 ±0.00 14.49 ±1.49 n.dr. Bouchouk Spanish-style n.dc 27.60 ±4.23 100.60 ±1.65 n.dr. Azz Taz Spanish-style n.dc 24.35 ±0.00 38.22 ±0.00 n.dr. Tunisia Chétoui Spanish-style 307 ±1.2 49 ±0.2 3750 ±8.3 n.dr. HPLC-DAD [30] 480 ±2 42 ±0.02 2300 ±9.3 n.dr. Turkey Gemlik Dry-salted black olives 231 ±1 78 ±0 221 ±1 64 ±0LC-DAD-ESI- MS/MS [31] Non-determined (n.dr.), non-detected (n.dc.). Foods 2022,11, 2355 5 of 25 Table 2. Hydroxytyrosol (HT), tyrosol (TYR), hydroxytyrosol acetate (HT-AC), oleuropein-aglycone di-aldehyde (3,4-DHPEA-EDA), oleuropein-aglycone monoaldehyde (3,4-DHPEA-EA), ligstroside-aglycone di-aldehyde (p-DHPEA-EDA), oleuropein (OLE) and secoiridoids derivative (S-DER) concentration in olive oil samples according to origin, variety, category, processing and analytical method. Origin Variety Category Concentration (mg/kg) Method References HT TYR HT-AC 3,4-DHPEA- EDA 3,4-DHPEA- EA p-HPEA- EDA p-HPEA-EA OLE S-DER Calabria Italy Frantoio EVOO 5.3 ±0.9 5.4 ±0.7 n.dr. 98.4 ±3.5 27.5 ±1.6 52.9 ±1.7 4.4 ±0.9 n.dr. n.dr. HPLC -DAD [32] Calabria Italy 4.6 ±0.7 2.5 ±0.3 1.9 ±0.3 50.3 ±2.8 22.5 ±2.2 34.9 ±1.7 3.0 ±0.9 n.dr. n.dr. Calabria Italy 1.2 ±0.4 1.1 ±0.2 n.d. 89.4 ±2.9 19.0 ±1.7 37.9 ±1.6 n.d. n.dr. n.dr. Praia a mare, Calabria Italy 1.7 ±0.1 1.7 ±0.5 0.7 ±0.1 56.0 ±3.1 18.9 ±1.9 34.6 ±2.7 1.7 ±0.9 n.dr. n.dr. Italy Coratina VOO 1.97–7.1 5.7–16.4 n.dr. 65.1–147.7 94.6–268.9 89.4–153.7 25.4–120.8 n.dr. n.dr. IOC Extraction RP-HPLC- DAD [33] Bosana 1.9–3.0 3.7–5.7 n.dr. 71.8–237.2 53.4–118.7 70.8–155.6 16.1–34.7 n.dr. n.dr. Semidana 1.3–4.8 2.7–9.2 n.dr. 4.5–90.8 11.6–66.2 17.0–57.5 5.5–17.2 n.dr. n.dr. Tonda di Cagliari 0.9–5.3 2.2–10.4 n.dr. 13.5–138.8 13.7–59.9 23.2–108.0 8.4–26.3 n.dr. n.dr. Tuscany Italy Multivarietal EVOO 161.5 ±4.5 122.5 ±3.5 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Acid hydrolysis HPLC-DAD [34] Northern Italy Frantoio EVOO 0.9 ±0.0 4.2 ±0.6 1.3 ±0.2 76.7 ±55 7.9 ±0.4 6.7 ±0.9 n.dr. 18.5 ±1.6 n.dr. LLE HPLC-DAD- MS [35] 3.0 ±0.2 4.3 ±0.3 1.9 ±0.2 62.2 ±4.9 2.6 ±0.3 2.2 ±0.1 n.dr. 5.3 ±0.3 n.dr. Casaliva 0.7 ±0.7 3.1 ±0.4 1.8 ±0.2 56.6 ±4.7 3.2 ±0.1 7.4 ±0.4 n.dr. 6.6 ±0.7 n.dr. 1.9 ±0.3 4.6 ±0.4 1.5 ±0.2 55.0 ±0.8 1.4 ±0.0 2.7 ±0.2 n.dr. 1.8 ±0.1 n.dr. Organic Casaliva 2.3 ±0.1 1.7 ±0.1 1.8 ±0.3 108.2 ±9.6 9.2 ±0.9 12.3 ±1.2 n.dr. 12.8 ±1.9 n.dr. 4.3 ±0.3 4.9 ±0.8 3. ±0.23 98.9 ±13.3 3.5 ±0.1 7.3 ±0.1 n.dr. 2.7 ±0.2 n.dr. Multi-varietal 6.4 ±0.2 2.5 ±0.4 3.4 ±0.2 102.4 ±4.6 5.5 ±0.1 10.9 ±1.0 n.dr. 10.0 ±1.1 n.dr. 0.3 ±0.0 1.1 ±0.1 2.9 ±0.2 54.6 ±3.0 6.4 ±0.6 0.9 ±0.0 n.dr. 1.5 ±0.1 n.dr. Organic multi-varietal 11.4 ±0.6 5.6 ±0.6 1.7 ±0.1 106.9 ±12.6 8.8 ±2.9 12.5 ±0.6 n.dr. 15.4 ±1.5 n.dr. 0.6 ±0.0 2.8 ±0.4 1.9 ±0.3 89.4 ±1.3 2.2 ±0.1 14.4 ±1.3 n.dr. 9.5 ±0.7 n.dr. Salerno Italy N/D (Cilento PDO) VOO 37–41.3 23.8–34.6 n.dr. n.dr. 19.9–24.9 n.dr. 23.8–35 120.4–140 n.dr. RP-HPLC- DAD [36] Abruzzo Italy Gentile VOO 1.6–3.7 3.9–5.8 n.dr. n.dr. 20.8–22.0 n.dr. n.dr. n.dr. 232.8–359.9 HPLCDAD HPLCMS [37] 0.8 ±0.1 4.1 ±0.2 n.dr. n.dr. 15.2 ±0.3 n.dr. n.dr. n.dr. 173.8 ±3.0 Leccino 2.3 ±0.1 6.1 ±0.2 n.dr. n.dr. 5.9 ±0.1 n.dr. n.dr. n.dr. 91.0 ±1.6 n.d. 4.0 ±0.2 n.dr. n.dr. 5.4 ±0.2 n.dr. n.dr. n.dr. 120.1 ±1.4 Dritta 2.0–2.8 7.4–7.9 n.dr. n.dr. 14.9–30.9 n.dr. n.dr. n.dr. 189.9–299.1 3.5 ±0.1 8.8 ±0.24 n.dr. n.dr. 11.3 ±0.2 n.dr. n.dr. n.dr. 310.3 ±5.3 Foods 2022,11, 2355 6 of 25 Table 2. Cont. Origin Variety Category Concentration (mg/kg) Method References HT TYR HT-AC 3,4-DHPEA- EDA 3,4-DHPEA- EA p-HPEA- EDA p-HPEA-EA OLE S-DER Southwest Spain Arbequina VOO 1.3 ±0.4 1.9 ±0.3 42.3 ±3.6 75.5 ±23.9 33.7 ±1.9 59.9 ±6.9 16.5 ±0.9 n.dr. n.dr. SPE RP-HPLC-DAD [38] 0.4 ±0.0 0.6 ±0.0 36.8 ±1.5 44.7 ±1.1 104.4 ±1.2 36.8 ±0.2 9.7 ±1.8 n.dr. n.dr. Carrasqueña 2.8 ±0.8 3.5 ±0.9 7.3 ±0.3 141.1 ±1.1 68.4 ±14.9 73.5 ±18.9 82.9 ±6.9 n.dr. n.dr. 0.6 ±0.0 3.4 ±0.0 6.9 ±1.4 88.7 ±10.5 95.2 ±33.4 36.1 ±3.1 14.3 ±1.7 n.dr. n.dr. Corniche 2.0 ±0.8 3.1 ±1.9 n.d. 69.0 ±14.7 61.2 ±16.5 101.7 ±21.5 12.4 ±2.3 n.dr. n.dr. 0.9 ±0.3 2.1 ±1.0 20.9 ±2.5 150.5 ±12.6 37.0 ±9.3 116.9 ±32.4 10.5 ±3.4 n.dr. n.dr. Manzanilla Cacereña 1.5 ±0.6 5.9 ±1.4 n.dc. 56.0 ±9.6 32.8 ±9.8 58.2 ±7.3 73.4 ±0.9 n.dr. n.dr. 0.7 ±0.3 7.8 ±1.5 n.dr. 40.6 ±4.5 48.3 ±5.9 59.4 ±8.1 10.9 ±3.1 n.dr. n.dr. Morisca 1.3 ±0.3 3.0 ±0.9 6.2 ±10.0 70.6 ±7.2 30.4 ±4.1 41.4 ±31.6 51.0 ±1.2 n.dr. n.dr. 1.4 ±0.7 3.2 ±1.4 43.3 ±8.3 42.5 ±5.3 18.9 ±0.8 40.3 ±3.6 23.9 ±5.0 n.dr. n.dr. Picual 3.3 ±1.2 5.7 ±1.3 n.dc. 89.3 ±15.6 73.3 ±16.9 44.2 ±3.5 39.8 ±7.4 n.dr. n.dr. 1.6 ±0.8 3.5 ±2.7 n.dc. 71.7 ±3.9 46.9 ±0.8 39.7 ±7.5 68.8 ±9.6 n.dr. n.dr. Verdial de Badajoz 1.4 ±0.2 6.3 ±0.6 n.dr. 143.8 ±34.2 33.7 ±5.7 166.4 ±15.0 41.6 ±11.8 n.dr. n.dr. 0.8 ±0.4 4.2 ±1.1 n.dr. 71.6 ±18.8 16.5 ±1.7 123.5 ±19.1 6.5 ±0.5 n.dr. n.dr. Jaén, Spain Picual VOO 2.8–7.8 4.9–9.9 n.dr. 221.4–849.7 29.5–929.2 19.5–248.9 24.4–344.2 n.dr. n.dr. LLE HPLCDAD [39] 2.8–6.2 0.9–7.8 n.dr. 231.5–788.0 26.2–790.7 13.5–262.2 22.0–269.5 n.dr. n.dr. Seville, Spain Arbequina Hojiblanca Manzanilla Picual N/A EVOO 50–200 40–180 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Acid hydrolysis HPLCUV-FL [40] N/D OO 5-20 5–30 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Spain Picual-Arbequina blend VOO 15.7 ±0.9 9.1 ±0.5 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 38.5 ±3.8 n.dr. n.dr. SPE HPLC-ESI-TOF/MS [41] 14.3 ±0.2 8.9 ±0.3 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 44.8 ±0.9 n.dr. n.dr. SPE HPLC-UV Catalonia Spain Arbequina VOO 2.5 3.0 1.6 152 68 20 42 n.dr. 26.4 LLE UPLC-MS/MS [42] Spain Cornicabra EVOO 0.9–2.8 1.0–2.3 n.dr. 396–770 136–301 228–498 39–138 n.dr. n.dr. SPE HPLC-DAD [43] Messenia, Greece Koroneiki EVOO 4.1 ±0.1 0.4 ±0.0 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Selective ion monitoring GC/MS [44] 9.3 ±0.1 0.4 ±0.0 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 20.2 ±1.0 0.4 ±0.1 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Foods 2022,11, 2355 7 of 25 Table 2. Cont. Origin Variety Category Concentration (mg/kg) Method References HT TYR HT-AC 3,4-DHPEA- EDA 3,4-DHPEA- EA p-HPEA- EDA p-HPEA-EA OLE S-DER Morocco Arbequina VOO 6.4 ±2.7 11.6 ±3.3 26.6 ±32.7 n.dr. 55.4 ±6.4 n.dr. 53.9 ±4.4 n.dr. n.dr. LLE LC-ESI- IT-MS [45] Arbosana 1.3 ±1.9 3.3 ±4.0 1.5 ±1.3 n.dr. 21.0 ±8.4 n.dr. 18.9 ±2.2 n.dr. n.dr. Cornicabra 4.3 ±0.4 6.6 ±0.4 1.4 ±0.1 n.dr. 96.9 ±14.5 n.dr. 93.9 ±6.4 n.dr. n.dr. Frantoio 0.8 ±0.4 4.1 ±0.6 0.3 ±0.2 n.dr. 24.5 ±14.6 n.dr. 34.8 ±8.7 n.dr. n.dr. Hojiblanca 0.5 ±0.3 5.4 ±2.1 1.1 ±0.8 n.dr. 35.8 ±17.1 n.dr. 41.1 ±18.1 n.dr. n.dr. Koroneiki 8.3 ±2.6 7.5 ±2.4 2.2 ±0.3 n.dr. 93.6 ±9.0 n.dr. 66.1 ±15.8 n.dr. n.dr. Manzanilla 3.8 ±3.3 10.8 ±5.6 1.8 ±1.5 n.dr. 54.0 ±33.2 n.dr. 65.6 ±37.1 n.dr. n.dr. P-Languedoc 2.2 ±0.8 9.5 ±1.2 0.8 ±0.2 n.dr. 46.6 ±10.9 n.dr. 46.3 ±14.4 n.dr. n.dr. P-Marocaine 2.2 ±1.7 8.5 ±1.6 0.9 ±0.3 n.dr. 35.2 ±7.6 n.dr. 35.9 ±3.7 n.dr. n.dr. Picual 4.8 ±2.7 9.2 ±2.0 2.2 ±1.9 n.dr. 51.96 ±26.81 n.dr. 47.4 ±6.1 n.dr. n.dr. Dahbia 0.2 ±0.0 1.7 ±0.2 0.2 ±0.0 n.dr. 26.1 ±0.4 n.dr. 33.1 ±0.9 n.dr. n.dr. Haouzia 3.7 ±1.4 7.6 ±2.0 0.5 ±0.3 n.dr. 63.5 ±12.7 n.dr. 51.1 ±22.8 n.dr. n.dr. Menara 4.1 ±2.7 11.4 ±2.6 0.4 ±0.2 n.dr. 41.6 ±10.5 n.dr. 43.8 ±5.3 n.dr. n.dr. Algeria Azeradj EVOO 2.8–3.0 13.3–26.4 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 1.2–2.1 n.dr. SPE HPLCUV-vis [46] Mekki 1.1–1.4 9.0–11.2 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dc. n.dr. Neb djemel 4.4–7.3 15.1–17.2 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dc. n.dr. Chemlal 3.3–4.2 13.6–19.2 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 0.0–4.4 n.dr. Hamra 1.1–4.1 9.9–20.7 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 8.3–13.1 n.dr. Blanquette de Guelma 4.8–8.9 19.5–21.6 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 1.3–2.2 n.dr. Limli 2.9–3.2 13.1–18.2 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Aberkane1 1.1–1.2 16.7–18.5 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Aimell 2.2–6.3 18.0–18.3 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Rougette de la mitidja 4.1–4.6 14.6–19.6 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 1.2–1.5 n.dr. Aghenaou 1.7–2.4 14.0–18.1 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dc. n.dr. Boughenfas 2.6–2.8 16.6–26.4 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 1.6–2.5 n.dr. Bouichret 3.1–4.2 13.5–14.6 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dc. n.dr. Aghenfas 3.2–3.9 18.4–25.1 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 0.8–5.2 n.dr. Bouchouk de Guergour 3.8–4.2 14.5–20.2 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 0.3–0.5 n.dr. X-Aghenfas 3.5–8.7 13.9–36.3 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dc. n.dr. Bounguergueb 1.8–3.5 13.9–14.0 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dc. n.dr. Ronde de miliana 0.0–1.5 16.6–20.2 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 1.0–1.5 n.dr. Sigoise 1.4–2.6 22.4–27.9 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 0.2–0.4 n.dr. Grosse du Hamma 9.67-14.93 28.1–32.9 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 0.4–0.9 n.dr. Rougette de Guelma 3.3–3.7 14.0–18.5 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. 0.7–1.4 n.dr. Tunisia Oueslati EVOO 3.8–7.2 1.9–3.1 0.3–1.3 n.dr. 222.6–537.8 n.dr. 2.9–19.4 n.dr. n.dr. RRLCESI- TOF-MS [47] Hatay Turkey Halhali VOO 5.5 ±0.0 10.3 ±0.2 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. LLE HPLCDAD [48] EVOO 5.2 ±0.9 14.8 ±0.4 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Balikesir Turkey Ayvalik VOO 0.1–0.8 0.7–1.1 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. HPLCDAD [49] Domat 0.0–1.2 0.2–0.9 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Gemlik 0.2–0.4 0.5–1.6 n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. n.dr. Non-determined (n.dr.), non-detected (n.dc.), non-declared (N/D). Foods 2022,11, 2355 8 of 25 Table 3. Tyrosol (TYR) and hydroxytyrosol (HT) content in wine according to origin, variety, and method of analysis. Origin Variety Year Concentration (mg/L) Method References TYR HT France Not specified n.dr. 0.0092 LC-MS/MS [50] Australia - 0.0054 China 0.0056 China 0.000071 Salento, Italy Negroamaro (Red wine) - n.dr. 2.3 ±0.8 mg/kg HPLC [51] Primitivo (Red wine) - 2.7 ±0.7 mg/kg Croatia Cabernet Sauvignon (Red wine) 2013 44.5 2.3 UV/VIS-HPLC [52] 2014 29.8 2.1 2015 46.4 1.746 Merlot (Red wine) 2013 40.7 2.7 2014 41.5 3.2 2015 36.9 2.6 Plavac mali (Red wine) 2013 41.3 2.9 2014 31.1 2.4 2015 48.3 2.6 Teran (Red wines) 2013 40.6 3.7 2014 21.6 4.0 2015 36.5 3.4 Jerez de la Frontera, Spain Corredera (White wine) -n.dr. 0.173 HPLC [53] Moscatel (White wine) 0.159 Chardonnay (White wine) 0.167 Sauvignon Blanc (White wine) 0.288 Palomino Fino (White wine) 0.089 Vijiriega (White wine) 0.238 Spain Bach Viña Extrísimo (White wine) 2016 10.4 1.3 LC/MS-MS [54] Girona, Spain Jardins Negre (Red wine) 2017 25.30 1.80 LC/MS-MS [55] Foods 2022,11, 2355 9 of 25 Table 3. Cont. Origin Variety Year Concentration (mg/L) Method References TYR HT Italy Greco di Tufo (White wine) 1998 1.1 2.7 HPLC [56] Verdicchio (White wine) 1998 3.0 1.6 Pinot Grigio (White wine) 1997 2.3 1.9 Blended 1998 5 6.1 1996 6 5.9 Barbera (Red wine) - 5.9 9.6 Montepulciano (Red wine) 1998 5.9 0.5 Italy White wine 1.42–2.34 1.79–2.00 GC-MS [57] Red wine 3.61–4.80 3.81–4.37 Jerez de la Frontera, Spain Tempranillo (Red wine) 2009 20.51–22.76 0.82–1.84 HPLC-FD [58] Blasco (Red wine) 27.38 1.55 Cabernet Sauvignon (Red wine) 31.95–32.57 5.02–3.63 Petit Verdot (Red wine) 40.59–38.50 4.12–2.33 Syrah (Red Wine) 2010 40.98–34.11 1.11–0.82 Merlot (Red Wine) 44.46 1.77 Tintilla de Rota (Red Wine) 28.91–30.97 2.66–1.65 Melonera (Red Wine) 35.31–36.86 0.53–0.45 Tempranillo (Red Wine) 25.03–44.26 1.78 Vitis silvestris (Red Wine) 20.38–40.20 0.28–3.09 Palomino negro (Red Wine) 29.57 1.10 Rome (Red Wine) 35.41–35.57 1.67–1.86 Garnacha (Red Wine) 26.73–30.15 1.02–1.28 Non-determined (n.dr.). Foods 2022,11, 2355 10 of 25 2.2. Estimation of Hydroxytyrosol Dietary Intake in Europe The 2011 EFSA survey, namely the Comprehensive European Food Consumption Database was used [ 59 ] to estimate the mean consumption of olive oil, table olives and wine per person in the different European countries, following the previously reported methodology for the intake estimation of other polyphenolic compounds [ 60 ]. The food consumption of twenty-two different countries was considered (Austria, Belgium, Croatia, Czech Republic, Cyprus, Denmark, Estonia, Finland, France, Germany, Greece, Hungary, Ireland, Italy, Latvia, Netherlands, Portugal, Romania, Slovenia, Spain, Sweden and the United Kingdom) since the other countries either did not present data or presented data that did not refer to the adult population. Data regarding the most recent surveys were considered (Table 4). For each food items, the mean consumption data in g/day per person was used, taking into account that all subjects in the surveys were included, not only those consuming the foods under study. Table 4. Dietary surveys for the adult population in the European countries used in this study (EFSA Comprehensive European Food Consumption Database). Country Name of the Dietary Survey Period of Survey Nº of Subjects Austria Austrian Study on Nutritional Status 2010–2012—Adults (ASNS–Adults) 2010–2012 615 Belgium Belgian National Food consumption survey (NATIONAL-FCS-2014) 2014–2015 2278 Croatia Croatian food consumption survey on adults (NIPNOP-HAH-2011-2012) 2011–2012 2000 Czech Republic Czech National Food Consumption Survey (SISP04) 2003–2004 1666 Cyprus National dietary survey of the adult population of Cyprus (CY 2014-2017-LOT2) 2014–2017 812 Denmark The Danish National Dietary survey 2005–2008 (DANSDA 2005-08) 2005–2008 1739 Estonia National Dietary Survey among 11–74 years old individuals in Estonia (DIET-2014-EST-A) 2013–2015 2124 Finland National FINDIET 2012 Survey (FINDIET2012) 2012 1295 France The French national dietary survey (INCA3) 2014–2015 1773 Germany National Nutrition Survey II 2007 10,419 Greece The EFSA-funded collection of dietary or related data in the general population aged 10–74 years in Greece (GR-EFSA-LOT2 2014-2015) 2014–2016 791 Hungary National Repr Surv (NATIONAL REPR SURV) 2003 1074 Ireland National Adult Nutrition Survey (NANS 2012) 2008–2010 1274 Italy Italian National Food Consumption Survey (INRAN SCAI 2005-06) 2005–2006 2313 Latvia Latvian National Dietary survey (LATVIA_2014) 2012–2015 1080 Netherlands Dutch National food consumption survey 2012–2016 (FCS2016_CORE) 2012–2017 4313 Portugal National Food, Nutrition and Physical Activity Survey of the Portuguese general population (IAN.AF 2015-2016) 2015–2016 3102 Romania Dietary Pilot Adults 2012 1254 Slovenia Slovenian national food consumption survey (SI. MENU-2018) 2017–2018 2119 Spain Spanish National dietary survey in adults, elderly, and pregnant woman (ENALIA2) 2013–2015 669 Sweden Swedish National Dietary Survey—Riksmaten adults 2010–11 (RIKSMATEN 2010) 2010–2011 1430 United Kingdom National Diet and Nutrition Survey (NDNS) 2000–2001 1724 Foods 2022,11, 2355 11 of 25 Concerning food composition, concentration in each food was expressed in ng/g. In the case of wine, the corresponding density was used to convert the intake to ng/g. Finally, HT dietary intake in each country was expressed as the sum of the contribution of all the foods under study in mg/day/person. Statistical analyses were performed using STATISTICA 7®(Palo Alto, CA, USA). 3. HT Health Benefits and Mechanisms of Action HT may act in vivo as a strong anti-inflammatory agent, inhibiting lipopolysaccharide (LPS)-mediated expression of inflammatory cytokines, i.e., TNF- α and IL-1 β [ 5 ]. Indeed, these effects are also related to a neuroprotective role. Microglial activation, expression of NADPH oxidase and MAPKs, production of ROS, and activation of the inflammasome induced by LPS were reduced or prevented by HT. HT was also able to decrease the activation of microglial cells after alpha-synuclein ( α -syn) treatment [ 6 ], thus demonstrating its capacity to reduce neuroinflammation. Furthermore, it is important to highlight its neuroprotective effect against Parkinson and Alzheimer’s diseases, being able to inhibit the formation of α-synuclein [7,8] and β-amyloid fibrils [9], respectively. Furthermore, HT exerts antiangiogenic effect by VEGF receptor-2 (VEGFR-2) inhibition [ 10 ]. Angiogenesis in adults is involved in the development of cancer and cardiovascular diseases, favoring both tumor development and the development and destabilization of the atheroma plaque [ 11 ]. Indeed, tumors express various pro-angiogenic factors, the main one being VEGF, which binds to VEGFR-2 [ 12 ]. In addition, HT decreases proliferation in MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) breast cancer cell model [ 13 ]. This effect may be linked to its pro-apoptotic activity [14]. In addition, several studies indicate that HT has an insulin-like effect on target cells including adipocytes, hepatocytes and muscle cells, exerting significant anti-diabetic effects in animals’ models of type 2 diabetes mellitus [61,62]. Certainly, its best-known biological effect is related to blood lipids’ protection from oxidative stress. [ 15 ]. In particular, the EU authorized health claim states that “Olive oil polyphenols contribute to the protection of blood lipids from oxidative stress”, based on the protection of LDL particles from oxidative damage. The health claim can be applied to olive oils containing at least 5 mg of HT and its derivatives (e.g., oleuropein complex and TYR) per 20 g of olive oil. Table 5summarizes the HT mechanisms of action. Table 5. Summary of the health benefits and mechanism of action of HT. Health Benefit Mechanism of Action References Anti-inflammatory Inhibition of LPS mediated expression of TNF-αand IL-1β ↓Expression of NADPH oxidase and MAPKs ↓Inflammasome [5,6] Neuroprotective Inhibition of the formation of α-synuclein and β-amyloid fibrils [7–9] Antiangiogenic Inhibition of VEGF receptor-2 activation [10] Pro-apoptotic ↓Proliferation of MCF-7 [13,14] Anti-diabetic Insulin-like effect on target cells [61,62] Antioxidant Blood lipids’ protection from oxidative stress [15] 4. Determination of HT in Foods In order to evaluate dietary intake, it is crucial to select reliable data on food composition that largely depends on the performance of the analytical determination. Therefore, it is useful to understand the advantages and drawbacks of the analytical methods used and the possible matrix effect and interferences. HT is present as a minor compound within a complex food matrix, and it is generally determined simultaneously with the Foods 2022,11, 2355 12 of 25 phenolic profile. In fact, regarding olive oil, the official method of the International Olive Council (IOC) [ 63 ] quantifies HT together with TYR, natural and oxidized oleuropein and ligstroside derivatives, lignans, flavonoids and phenolic acids in olive oil, overall expressed as biophenols. The first step and most critical point when analyzing HT in olive oil is its extraction from the lipidic food matrix. Solid phase extraction and liquid–liquid (methanol:water 80:20) extraction have been used [ 64 ] to extract the polar fraction that contains HT. This last method, which performs acidic hydrolysis before extraction, is expected to become an official method. Other food matrixes required different pre-treatments. Olive fruits are grinded, followed by extraction with methanol, ethanol or mixtures of both with water. Then, n-hexane is the solvent most frequently used to purify the extract. Optionally, freeze-drying can be performed [ 65 ]. In some cases, the extracts are loaded onto SPE cartridges with hexane followed by methanol to eluate HT. For the wine matrix analysis, direct injection of the sample was used with high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to fluorescence detectors [ 58 ]. Álvarez-Fernández et al. [ 53 ] proposed cleaning up the sample with C18 SPE cartridges followed by elution with methanol for subsequent determination by ultrahigh performance liquid chromatography couple to high-resolution mass spectrometry (UHPLC/HRMS). Additionally, the wine extract can be treated after purification with an Amberlite column and separated by high-speed counter current chromatography prior quantification by DAD or HRMS [66]. Liquid chromatography is the most widespread and reliable method for analyzing HT individually in the different foods as displayed in Tables 1–3. Reversed-phase, which is based on partition chromatography, is the preferred mode of separation for most polar compounds such as HT in terms of reproducibility of retention time and separation [ 66 ]. It separates individual components using a non-polar octade-cylsilane (C18) column as the bonded stationary phase, while the mobile phase is a polar solvent consisting of water acidified with orthophosphoric acid, formic acid, acetic acid, or trichloroacetic acid, and methanol or acetonitrile [ 27 , 33 , 53 ]. Different detection techniques include the use of a diode array (DAD) detector at 280 nm since phenols possess a strong chromophore system, providing considerable structural information that helps distinguish the type of phenol and the oxidation pattern [ 67 ]. Additionally, a fluorescence detector has also been used since HT shows a good response to fluorescence excitation ( λ ex = 279 nm and λ em = 631 nm) [ 68 ]. However, the most extended powerful analytical tool is the liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS) as a detection system, which provides unequivocal identification based on the molecular masses of the separated compounds obtained through prominent ions [ 69 ]. The limit of detection (LOD) and quantitation (LOQ) differ among the techniques being up to 0.09 mg/L and 0.3 mg/L for DAD, and 0.023 mg/L and 0.076 mg/L for fluorescence, [52,58] and 0.5 µg/L and 1 µg/L for LC-MS/MS, respectively [17]. 5. Dietary Sources Despite being a phenolic compound, HT is present in limited food sources. HT has been identified in foods characteristic of the Mediterranean diet such as table olives, olive oil and wine (Tables 1–3). HT and its derivates compounds (e.g., oleuro-pein complex and tyrosol, as defined by EFSA [ 15 ]) have been only reported in table olives and olive oil (Tables 1and 2). Additionally, HT is synthesized by yeast during the alcoholic fermentation and found consequently in wine (Table 3). Solely one study has reported HT in commercial beers at a concentration (ca. 0.03 mg/L) significantly lower than the abovementioned dietary sources [70]. 5.1. Olives Up to 36 phenolic compounds have been identified in olive fruits, with secoiridoids being the most abundant and widespread (Figure 1). Among them, oleuropein and ligstroside are the major main native compounds [ 71 ]. Their breakdown products include relevant Foods 2022,11, 2355 13 of 25 phenolic constituents of the olive fruit such as HT, oleocanthal, elenolic acid, oleuropein aglycone, and TYR [ 71 ]. During olive ripening, storage, and processing, hydrolysis of the secoiridoid compounds yields HT [ 72 ]. Generally, as oleuropein decreases, HT increases during maturation, making this substance the main compound in mature olives. Most table olives worldwide are processed using one of three methods: Spanish-style (green olives), Californian-style (olives darkened by oxidation), or Greek-style (natural darkened olives) processing. Spanish-style includes lye treatment, brining and fermentation. Lye treatment with a NaOH solution (1.5–4.5 w/v) causes the hydrolysis of oleuropein to yield HT and elenolic acid glucoside [ 73 ]. Furthermore, yeasts and lactic acid bacteria, naturally present in olives and brine, can metabolize oleuropein in a two-step process. The first step comprises the hydrolysis of the glycosidic linkage of oleuropein by β -glucosidase to form oleuropein-aglycone. Subsequently, this aglycone is hydrolyzed to elenolic acid and HT, probably by an esterase in a second step. Californian-style black olive processing consists of preserving the fruits in brine or an acidified solution followed by darkening with air under alkaline conditions. The first step causes the diffusion of polyphenols, mainly oleuropein, from the olive flesh into the solution and acid hydrolysis takes place as previously mentioned. Subsequently, the darkening step basically causes ortho-diphenols to be oxidized and polymerized resulting in a decrease in HT. After harvesting, the olives are placed in brine where they are fermented. Similar to the other described processes, the acid hydrolysis of oleuropein and HT glucoside occurs. Table 1summarizes data published in the literature on HT and derived compounds present in table olives. HT concentration reported by different authors using the abovementioned analytical methods does not reflect significant differences (p> 0.05) between Spanish and Greek table olives. Values range from 14.49 to 3750 mg/kg and from 134.33 to 1393.30 mg/kg for Spanish and Greek style, respectively. Values for Californian style olives are in general lower, ranging from 19.98 to 672.40 mg/kg. This observation is in agreement with the results reported by Johnson et al. [ 27 ], whose predominant phenolic compound was HT in all three styles of commercial olives with similar concentrations observed for Greek and Spanish olives (134.329 and 133.685 mg/kg, respectively) and significantly lower concentrations for Californian olives (19.981 mg/kg). Romero et al. [ 74 ] detected the presence of hydroxytyrosol 4- β -D-glucoside in the olive pulp of the Manzanilla and Picual varieties, pinpointing that not only the hydrolysis of oleuropein produces HT, but it can also come from hydroxytyrosol 4- β -D-glucoside hydrolysis. Indeed, Arroyo López et al. [ 75 ] found hydroxytyrosol 4-β-D-glucoside content was greater than that of oleuropein. As can be seen in Table 1, HT is the main phenolic compound in edible olives followed by oleuropein and TYR. In summary, the processing method is the most determinant factor compared to the variety or geographical origin. 5.2. Olive Oil Table 2summarizes the concentration of HT, TYR, hydroxytyrosol acetate (HT-AC), oleuropein-aglycone di-aldehyde (3,4-DHPEA-EDA), oleuropein-aglycone mono-aldehyde (3,4-DHPEA-EA), ligstroside-aglycone di-aldehyde (p-HPEA-EDA), oleuropein (OLE), and secoiridoid derivatives (S-DER) (Figure 1) reported in olive oils from different origins, varieties and categories. As can be seen, the maximum and minimum concentration of HT determined are between 41.3 mg/kg and 0.09 mg/kg, respectively, with noticeable differences according to origin. In particular, the highest mean HT concentration is found in olive oils from Spain (13.31 ± 39.45 mg/kg), followed by Greece (11.17 ± 8.22 mg/kg), and Italy (10.24 ± 29.09 mg/kg). Samples from other origins, such as Tunisia, Algeria, Morocco, and Turkey, present lower concentrations as follows: 5.51 ± 2.36 mg/kg, 3.86 ±2.73 mg/kg , 3.29 ±2.44 mg/kg, and 1.89 ±2.39 mg/kg, respectively. Some analytical procedures include an acid hydrolysis that allows the determination of not only free HT content in olive oil but also the resultant from oleuropein hydrolytic degradation [ 76 ] (Figure 2); these values reach 151.5 mg/kg for an oil of Italian origin and 200 mg/kg for an olive oil of Spanish origin. Hence, these values were not considered for Foods 2022,11, 2355 20 of 25 eluates with high amounts of HT. Similarly, a simple hydrolysis reaction allowed a relatively high amount of purified HT to be obtained from Olea europaea leaf extract (2.3g per 100g of fresh olive leaves) [ 112 ]. Herrero et al. [ 113 ] optimized pressurized liquid extraction, achieving up to 8.542 mg HT/g dried extract using water as an extracting agent, while oleuropein was present in ethanolic extracts (6.156–2.819 mg/g extract). Finally, HT and derivatives can also be obtained in substantial quantities (16.21 mg HT/L residue) from the wastewater generated from table olives production [114]. Summarizing, the current regulatory status for HT within the EU context as an authorized novel food ingredient that can be added to different foods as stated in the Commission Implementing Decision [ 92 ] opens possibilities of broadening its use in other foods in the future. Obtaining HT for further uses as a food ingredient from different wastes and byproducts represents a straightforward opportunity for the revalorization of olive oil cultivars, consequently, leading to a more sustainable production. 8. Conclusions This paper compiles scientific data on HT content in the main food sources. The average content range was as follows: olives > olive oil > wines. The dietary intake in the EU population was estimated based on dietary surveys and updated with current compositional data available in the scientific literature. Greece, Spain, Denmark, Cyprus, and Italy rank as having the largest intake in adult populations. Olives and wine are the main dietary contributors to HT intake in EU. Additionally, the contribution of olive oil to HT dietary intake is relevant in Mediterranean countries (Italy, Spain, Greece, and Cyprus). Considering HT is present only in food characteristic of the Mediterranean diet, further epidemiological research would be needed to bring to light the role of HT in chronic diseases, other than cardiovascular. Further research is also necessary to increase the HT concentration in natural sources such as wine, by means of selecting the highest producer microorganisms and fermentation conditions. Additionally, it would be interesting to select the olive production techniques that most preserve HT concentration in the final product, avoiding its losses on the wastewater. Similarly, additional studies should be conducted to select the olive varieties and olive oil production techniques that lead to a higher HT and its precursors’ concentration. Moreover, HT obtained from waste and by-products of the olive industry can be considered a valuable source for HT as a food ingredient to be added to other foods, nutraceuticals, and food supplements, thus increasing the bioactive potential and its dietary intake. Hence, further studies should comprise the selection of efficient and environment friendly HT extraction and purification techniques. Author Contributions: Conceptualization, A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Formal Analysis, M.G.-F., M.G.-R., A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Investigation, M.G.-F., M.G.-R., A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Data Curation, M.G.-F., M.G.-R., A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Writing—Original Draft Preparation, M.G.-F., M.G.-R., A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Writing—Review and Editing, A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Visualization, M.G.-F., M.G.-R., A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Supervision, A.B.C., A.M.T. and M.C.G.-P.; Project Administration, A.M.T. and M.C.G.-P.; Funding Acquisition, A.M.T. and M.C.G.-P. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: The authors are very grateful to the Spanish Government for its financial assistance (Project MICINN PID2019-108722RB-C32), the Junta de Andalucía (P18-RT-3098, US-1263469), and the financial support of the Ministry of Science, Innovation and Universities. (M.G.F.’s FPI contract). Institutional Review Board Statement: Not applicable. Informed Consent Statement: Not applicable. Data Availability Statement: Data will be available from the corresponding author on reasonable request. Conflicts of Interest: Authors declare no conflicts of interest. Foods 2022,11, 2355 21 of 25 References 1. Villaño, D.; Fernández-Pachón, M.S.; Troncoso, A.M.; García-Parrilla, M.C. Comparison of antioxidant activity of wine phenolic compounds and metabolites in vitro. Anal. Chim. Acta 2005,538, 391–398. [CrossRef] 2. Napolitano, A.; De Lucia, M.; Panzella, L.; d’Ischia, M. 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Carmen Garcia-Parrilla and M. Alexandra Brito En preparación para su publicación Food bioactives compounds through blood-brain barrier 1 2 Gallardo-Fernández, M.1, Garcia, A.R.2,3, Hornedo-Ortega, R.1, Troncoso, A.M.1, 3 Garcia-Parrilla, M.C.1, Brito, M. A2,3 4 5 1Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de 6 Farmacia. Universidad de Sevilla. C/ Profesor García González nº 2. Sevilla 41012, 7 [email protected] (M.G.-F.); [email protected] (R.H.-O.); [email protected] (A.M.T.); 8 [email protected] (M.C.G.P.). 9 2iMed—Research Institute for Medicines, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa, 10 Av. Prof. Gama Pinto,1649-003 Lisbon, Portugal 11 3Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa, Av. Prof. Gama Pinto, 1649-003 Lisbon, 12 Portugal. [email protected]l.pt (A.R.G.); [email protected] (MAB). 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 34 biological significance of simple phenols of dietary origin: Hydroxytyrosol and tyrosol. Drug Metab. Rev. 48, 218-236. https://doi.org/10.1080/03602532.2016.1179754. Scarmeas, N., Stern, Y., Mayeux, R., Manly, J.J., Schupf, N., Luchsinger, J.A. 2009. Mediterranean diet and mild cognitive impairment. Arch. Neurol. 66, 216-225. https://doi.org/10.1001/archneurol.2008.536 Singh, P., Hanson, P.S., Morris, C. M., 2017. SIRT1 ameliorates oxidative stress induced neural cell death and is down-regulated in Parkinson’s disease. BMC Neurosci. 18, 1-13. https://doi.org/10.1186/s12868-017-0364-1. Srivastava, S., C Haigis, M., 2011. Role of sirtuins and calorie restriction in neuroprotection: implications in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Curr. Pharm. Des. 17, 3418-3433. https://doi.org/10.2174/138161211798072526. Steiner, J.A., Angot, E., Brundin, P., 2011. A deadly spread: cellular mechanisms of α-synuclein transfer. Cell Death Dis. 18, 1425-1433. https://doi.org/10.1038/cdd.2011.53. 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CAPÍTULO 7 Anti-VEGF Effect of Bioactive Indolic Compounds and Hydroxytyrosol Metabolites Marta Gallardo-Fernández, Ana B. Cerezo, Ruth Hornedo-Ortega, Ana M. Troncoso and M. Carmen Garcia-Parrilla Foods, (2022) 11, 526   Citation: Gallardo-Fernández, M.; Cerezo, A.B.; Hornedo-Ortega, R.; Troncoso, A.M.; Garcia-Parrilla, M.C. Anti-VEGF Effect of Bioactive Indolic Compounds and Hydroxytyrosol Metabolites. Foods 2022,11, 526. https://doi.org/10.3390/ foods11040526 Academic Editor: Barry J. Parsons Received: 22 December 2021 Accepted: 9 February 2022 Published: 11 February 2022 Publisher’s Note: MDPI stays neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations. Copyright: © 2022 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/). foods Article Anti-VEGF Effect of Bioactive Indolic Compounds and Hydroxytyrosol Metabolites Marta Gallardo-Fernández , Ana B. Cerezo * , Ruth Hornedo-Ortega , Ana M. Troncoso and M. Carmen Garcia-Parrilla Departamento de Nutrición, Bromatología, Toxicología y Medicina Legal, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, C/P. García González No. 2, 41012 Sevilla, Spain; [email protected] (M.G.-F.); [email protected] (R.H.-O.); [email protected] (A.M.T.); [email protected] (M.C.G.-P.) *Correspondence: acer[email protected]; Tel.: +34-954-556-760 Abstract: Angiogenesis is a key process involved in both cancer and cardiovascular diseases, the vascular endothelial growth factor (VEGF) and its VEGF receptor-2 (VEGFR-2) being the main triggers. The aim of this study was to determine the molecular mechanism underlying the potent inhibition of VEGF signaling by hydroxytyrosol (HT) metabolites and indolic compounds and establish a relation between their structure and bioactivity. Experiments involved the evaluation of their potential to inhibit VEGF on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by ELISA assay and their subsequent effect on the downstream signaling pathway (PLC γ 1, Akt, and endothelial nitric oxide synthetase (eNOS)) by Western blot. Respectively, 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde (DOPAL) (100 µ M) and indole pyruvic acid (IPy) (1 mM) were capable of inhibiting VEGFR-2 activation with an IC 50 value of 119 µ M and 1.037 mM. The anti-angiogenic effect of DOPAL and IPy is mediated via PLC γ 1. Additionally, DOPAL significantly increases eNOS phosphorylation, while IPy maintained it. These data provide for the first time evidence of the anti-angiogenic effect of DOPAL and IPy for future use as potential bioactive food ingredients. Keywords: hydroxytyrosol; VEGF; eNOS; metabolites; 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde; indole pyruvic acid; angiogenesis 1. Introduction Several studies have described the association between the growth of malignant tumors and the development and growth of new blood growth vessels [ 1 – 3 ]. Angiogenesis is the physiological process in which new blood vessels are formed from pre-existing ones. VEGF is the most important player that regulates vessel formation during embryonic development, wound healing, and the maintenance of vessel homeostasis in adult organisms [ 4 ]. Angiogenesis in adults is involved in the development of cancer and cardiovascular diseases, favouring both tumor development and the development and destabilization of the atheroma plaque [ 3 ]. Indeed, tumors express various pro-angiogenic factors among them, the main one being VEGF which binds to VEGFR-2 [ 5 ]. VEGF can promote angiogenesis [ 2 , 6 ] exerting its angiogenic effects by stimulating VEGFR-2, which is critical to promote endothelial cell proliferation and differentiation [ 4 , 5 ]. Therefore, inhibiting angiogenesis by inhibiting the binding of VEGF to its receptor-2 is the mechanism that certain drugs use for the treatment of cancer and several other disorders, which is also a promising strategy for prevention through diet. In addition, it is worth noticing that certain anti-VEGF drugs, such as bevacizumab, sorafenib and sunitinib, cause hypertension as a side effect [ 7 – 9 ]. This is related to a nitric oxide (NO) reduction. There is increasing interest in studying the anti-angiogenic properties of naturally occurring molecules in the diet. Additionally, in vitro studies have shown that compounds such as EGCG from green tea [ 10 ], procyanidin oligomers from apples [ 11 ] and resveratrol and quercetin found in grapes and red wine [ 12 ] possess anti-angiogenic effect. Foods 2022,11, 526. https://doi.org/10.3390/foods11040526 https://www.mdpi.com/journal/foods Foods 2022,11, 526 2 of 11 Furthermore, caffeic acid phenethyl ester derived from honeybee propolis [ 13 ], as well as urolithins [ 14 ] and ellagitannin [ 15 ] present in pomegranate and curcumin [ 16 ], have proven to exert anti-VEGF effect in vivo . More recently HT, which has been described both in fermented beverages and olive oil, as well as certain indolic compounds, such as 3-indolacetic acid (IAA) present in wine, have exhibited an IC 50 against VEGFR-2 inhibition of 72.40 µ M and 0.9704 mM, respectively [ 17 , 18 ]. Additionally, melatonin and serotonin simultaneously maintain eNOS phosphorylation, while EGCG, procyanidin tetramers and hydroxytyrosol increase it [ 10 , 17 ], which would avoid the adverse hypertensive effects associated with VEGF inhibitor drugs. This fact supports the advantage of these bioactive compounds over drugs. The biological effect of HT largely depends on its bioavailability and metabolization, since for many polyphenols the formed metabolites present activity different from that of their parent compounds. HT is one of the major phenolic compounds in olive oil and table olives (5 mg of HT/20 g of olive oil) [ 19 – 22 ]. Furthermore, HT is present in wine in a range from 1.50 to 25 mg/L [ 23 – 28 ]. HT absorption occurs in the small intestine and colon [ 29 ] and reaches a maximum plasma concentration 5–10 min after ingestion [ 30 ]. Considering the bioavailability of HT (40–95%) [ 21 , 29 , 31 ] and plasma volume (5 L), the circulating HT would be between 0.15 and 37 µ M [ 32 ]. Additionally, several studies have demonstrated that tyrosol is converted to HT in vivo [ 33 ]. Therefore, these findings imply that tyrosol intake also contributes to the circulating HT. The low bioavailability of HT observed in various studies, related to the low concentrations of circulating HT, is due to phase I and II metabolism in the gut and liver. Enzymes involved in HT phase I metabolism, mostly present in the intestinal wall, are nonmicrosomal alcohol and aldehyde dehydrogenases, both located in the cytosol, resulting in metabolites such as DOPAL (Figure 1). DOPAL is not a specific metabolite of dietary HT since it is also a dopamine metabolite by deamination [34]. Furthermore, 4-hydroxy-3-methoxyphenylethanol (MOPET) is a methylated metabolite of HT (identified also in olive oil) [ 34 ] and 3-methoxy-4-hydroxyphenylacetaldehyde (MOPAL), the methylated metabolite of DOPAL. Additionally, MOPAL is part of dopamine metabolism [ 35 , 36 ]. Therefore, although DOPAL, MOPET and MOPAL are dietary metabolites of HT, their plasmatic levels are not specific to HT, since they also come from dopamine metabolism. In any case, in order to evaluate the overall effects of HT, there is a need to take into consideration the potential activity of its metabolites. On the other hand, IAA is synthetized during alcoholic fermentation from tryptophan (L-TRP) amino acid by yeast [ 37 ]. Additionally, it was reported that about 3% of dietary L-TRP is converted to IAA in the gastrointestinal tract [ 38 , 39 ]. Some of the intermediaries of the IAA synthesis pathway with similar structure are IPy, indole propionic acid (IPA), indole butyric acid (IBA) and indole lactic acid (ILA) (Figure 1). These indolic compounds have been identified in fermented foods [ 40 , 41 ]. Additionally, IPy, IPA and ILA are human metabolites. IPy is synthesized endogenously in the intestinal microflora of mammals [ 42 ] and IPA and ILA have been described in plasma [43]. Concerning anti-angiogenic effects, nothing is known about the activity of the main human HT metabolites (DOPAL, MOPAL and MOPET) and of L-TRP metabolites (IPy, IPA, IBA and ILA). The original aim of the present study was to evaluate the anti-VEGF activity of HT metabolites and these four indolic compounds in order to establish a relation between structure and activity. Additionally, their intracellular mechanism of action was elucidated, showing their significant effect on eNOS activation and maintenance as a clear advantage over anti-VEGF drugs. Foods 2022,11, 526 3 of 11 Figure 1. Chemical structure of HT metabolites and indolic compounds under study. 2. Materials and Methods 2.1. Chemicals and Reagents DOPAL (Purity: ≥ 90%) was acquired from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). MOPAL (99%), MOPET (99%), IPy ( ≥ 97%), IPA ( ≥ 99.0%), ILA (99%), IBA ( ≥ 99.0%), dimethyl sulfoxide (DMSO), and bicinchoninic acid (BCA) were obtained from Sigma– Aldrich (St. Louis, MO, USA). HUVECs, endothelial cell growth medium-2 (EGM-2) and endothelial basal medium (EBM) were obtained from Lonza (Slough, UK). Recombinant human VEGFA 165 was bought from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). A PathScan ® Phospho-VEGFR-2 (Tyr1175) sandwich ELISA kit was purchased from Cell Signaling Technology (Hitchin, UK). NuPAGE lithium dodecyl sulfate (LDS) sample buffer and NuPAGE DTT and 4–12% Bis-Tris gels were obtained from Invitrogen (Loughborough, UK). Nitrocellulose 0.2 µ m membranes was acquired from Bio-Rad (Hercules, CA, USA); p-PLC γ 1, PLC γ 1, p-Akt, Akt, p-eNOS, eNOS from Cell Signaling Technology Foods 2022,11, 526 4 of 11 (Danvers, MA, USA) and SuperSignal West Pico chemiluminescent substrate from Thermo Scientific (Hitchin, UK). 2.2. Cell Culture HUVECs between passages 4 and 5 were grown in EGM-2. 2.3. Treatment of HUVECs The HUVECs were grown to confluence and afterwards exposed to EBM including the individual compounds under study at the following concentrations: DOPAL, MOPAL and MOPET at 100 and 50 µ M, and Ipy, IPA, ILA and IBA at 1 and 0.1 mM, agreeing with previous studies on molecules with similar chemical structure [ 17 , 18 ]. In all cases, the final concentration of DMSO was ≤ 0.1%. Furthermore, EBM (EGM-2, only including antibiotics, at ≤ 0.1% DMSO) was used for negative and positive vehicle controls (with and without 25 ng/mL of VEGF, respectively). The cells were incubated with the individual compounds for 4 h at 37 ◦ C. After that, HUVECs were stimulated with VEGF (25 ng/mL) for 5 min to determine VEGFR-2 phosphorylation, for 10 min to PLC γ 1 phosphorylation, and for 60 min to Akt and eNOS phosphorylation. Every sample procedure was performed in duplicate, and experiments were carried out three times. HUVECs were then lysed with radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer and subsequently centrifuged at 4 ◦C, 13,000 rpm for 10 min. The protein content of the lysates was determined by the BCA assay. Furthermore, the DOPAL and the 3-indolpiruvic acid IC 50 values were determined from five concentrations (180–50 µM and 0.7–2.0 mM, respectively). 2.4. Phosphorilated VEGFR-2 (ELISA Assay) To measure the phosphorylated VEGFR-2 levels in the lysates, the sandwich ELISA kit for phospho-VEGFR-2 (Tyr1175) was used following the manufacturer’s instruction. 2.5. Western Blot Analysis for PLCγ1, Akt and eNOS The protein lysates (26.8 µ g) were mixed with NuPAGE lithium dodecyl sulfate (LDS) sample buffer, NuPAGE DTT, before heating for 10 min at 70 ◦ C to denature proteins. Subsequently, electrophoresis was performed in NuPAGE 4–12% Bis-Tris gels before being transferred to 0.2 µ m nitrocellulose membranes. Tris buffered saline with Tween 20 (TBST) was mixed with bovine serum albumin (BSA) to a final concentration of 5% (w/v) for blotting of the membranes before incubation with primary antibodies (p-PLC γ 1, PLC γ 1, p-Akt, Akt, p-eNOS, eNOS) overnight at 4 ◦ C. Subsequently, secondary antibody (anti-rabbit IgG-HRP) in TBST + BSA (5%, w/v) was added to the membranes for 1 h at room temperature. The bands were visualized using a SuperSignal West Pico chemiluminescent substrate on an Amersham Imager 600 station (GE Healthcare live sciences, Marlborough, MA, USA). Samples were analysed in duplicate, and the assay was performed three times. 2.6. Statistical Analysis Statistical analyses were carried out using Graphpad Prism software 8.0.2 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA), using student’s ttest to analyze significant differences between samples. The degree of significance of the analysis was as follows: p< 0.05 (*), p< 0.01 (**). Data are displayed as mean ±standard deviation. 3. Results 3.1. Anti-Angiogenic Effect by Inhibition of VEGFR-2 Activation in the Presence of Hydroxytyrosol Metabolites and Indolic Compounds The first experimental design was carried out to evaluate the effect of the compounds under study against the activation of the VEGFR-2. Table 1shows that MOPAL and MOPET (HT metabolites) did not inhibit VEGFR-2 activation. However, DOPAL at 100 µ M was Foods 2022,11, 526 5 of 11 capable of inhibiting VEGFR-2 activation by 46%. Therefore, the IC 50 value was tested by ELISA between 180 and 50 µM, showing an IC50 value of 119 µM. Table 1. Inhibition of VEGF-induced VEGFR-2 phosphorylation and IC 50 values of HT metabolites and indolic compounds. Compounds Concentrations Inhibition (%) IC50 DOPAL 50 µM 5 ±7 119 µM 100 µM 46 ±8 (95.49–148.1) MOPAL 100 µM NI ND MOPET 100 µM NI ND IPy 0.1 mM 4 ±10 1.037 mM 1 mM 56 ±0.7 (0.9061–1.171) IPA 0.1 mM NI ND 1 mM NI ILA 0.1 mM NI ND 1 mM NI IBA 0.1 mM NI ND 1 mM NI Inhibition percentages of VEGF-induced VEGFR-2 activation are expressed as the mean ± SD (n= 3). The 95% confident intervals are shown in brackets. NI: non-inhibition. ND (not determined). DOPAL (3,4- dihydroxyphenylacetaldehyde); MOPAL (3-methoxy-4- hydroxyphenylacetaldehyde); MOPET (4-hydroxy-3- methoxyphenylethanol); IPy (indole pyruvic acid); IPA (indole propionic acid); indole lactic acid (ILA); IBA (indole butyric acid). Additionally, Table 1shows that IPy was the only indolic compound inhibiting VEGF induced VEGFR-2 activation by 4% and 56% at 0.1 and 1 mM, respectively. Secondly, the pre-incubation treatment with the IPy (0.7–2.0 mM) resulted in an IC 50 value of 1.037 mM. 3.2. Effects of DOPAL and 3-Indolpiruvic Acid on PLCγ1, Akt and eNOS Since DOPAL and IPy acid were shown to inhibit VEGF-induced VEGFR-2 phosphorylation, we evaluated whether they are able to regulate downstream signaling events of p-VEGFR-2. We assessed their effect in PLC γ 1, the main protein involved in the cell proliferation, as well as Akt and eNOS, proteins downstream activated in the VEGF signaling and involved in the vasodilation. Figures 2A and 3A showed that DOPAL and IPy caused a significant decrease in the pPLC γ 1/PLC γ 1 ratio in comparison with the positive control (VEGF only). These data demonstrate that these compounds are not only inhibiting VEGFR-2 activation, but they are also preventing downstream signaling through PLCγ1. Foods 2022,11, 526 6 of 11 Figure 2. Effects of DOPAL on PLC γ 1, Akt and eNOS. HUVEC cells were treated with DOPAL (120 µ M) for 4 h and then stimulated with VEGF (25 ng/mL) for 10 min ( A ) and 60 min ( B – D ). Westernblot membranes were incubated with anti PLC γ -1 and anti p-PLC γ -1 ( A ), anti Akt and anti p-Akt ( B ) and anti eNOS and anti p-eNOS ( C , D ) antibodies. Data representation of p-PLC γ -1/PLC γ -1, p-Akt/Akt and p-eNOS/eNOS ratio are displayed as mean ± SD (n= 5). * p< 0.05 against VEGF alone (A) and versus negative control (D). Figure 3. Indole pyruvic acid inhibits PLC γ 1 phosphorylation while activate Akt and eNOS. HUVEC cells were treated with IPy (1 mM) for 4 h and then stimulated with VEGF (25 ng/mL) for 10 min ( A ) and 60 min ( B – D ). Western-blot membranes were incubated with anti PLC γ -1 and anti p-PLC γ -1 ( A ), anti Akt and anti p-Akt ( B , C ) and anti eNOS and anti p-eNOS ( D ) antibodies. Data representation of phosphorylated antibody/total antibody ratio is indicated as mean ± SD (n= 5). * p< 0.05, ** p< 0.01 against VEGF alone (A) and versus negative control (B). Foods 2022,11, 526 7 of 11 Additionally, DOPAL maintained the activation of Akt both in the presence and absence of VEGF (Figure 2B). Subsequently, Figure 2C,D show that DOPAL significantly increases the p-eNOS/eNOS ratio in the presence and absence of VEGF stimulation. These results are reliable since they indicate that DOPAL is able to inhibit the angiogenesis activated by VEGF, while increasing the activation of eNOS, which is a potent vasodilator. IPy significantly increased Akt activation in the presence and absence of VEGF ( Figure 3B ). Figure 3D presents the western blot bands, in which the activation of AKT by IPy is observed in the presence and absence of VEGF. Consequently, the p-eNOS/eNOS ratio is also maintained by IPy in the presence and absence of VEGF, as shown in Figure 3C. 4. Discussion In order to understand how diet can prevent angiogenic related diseases, it is necessary to know the underlying molecular mechanism that explains the effect of the bioactive compounds naturally present in foods and beverages as well as their derived metabolites. In previous studies, the anti-angiogenic effect of compounds derived either from tyrosine, such as HT [ 17 ], or from L-TRP, such as IAA [ 18 ], has been highlighted. Now, we explore the bioactivity of HT endogenous metabolites such as DOPAL, MOPAL and MOPET and other L-TRP metabolites such as IPy, IPA, ILA and IBA. In the present study, we present for the first time evidence that DOPAL possesses anti-angiogenic activity (IC 50 : 119 µ M), while MOPAL and MOPET were inactive. DOPAL, MOPAL and MOPET have in common that they present a benzene ring (Figure 1). One of the differences between them is the type of substituents attached to this benzene ring. DOPAL possess a catechol group while MOPAL and MOPET present a substitution of one methoxy group instead of one of the hydroxyl groups. If the ring is attached to a group that donates electrons, such as the -OH group, the electron density of benzene will be higher, and its reactivity will increase. In fact, the catechol group was one of the chemical characteristics strongly related to a potent VEGF inhibition [ 11 ]. This might explain why DOPAL is the only compound of the three HT metabolites under study that has anti-VEGF activity (Figure 4), similarly to HT (IC 50 : 72 µ M) [ 17 ]. However, MOPAL and MOPET present a substitution of the hydroxyl group with a methoxy group, which results in a lower reactivity. These results agree with previous studies in which methylation of one of the hydroxyl groups of the catechol, on the B-ring, of quercetin to turn it into tamarixetin caused a loss in its activity against the inhibition of VEGFR-2 [ 11 ]. In addition, HT (IC 50 : 72 µ M) [ 17 ] has higher anti-angiogenic activity than DOPAL (IC 50 : 119 µ M). It seems that the functional group (alcohol or aldehyde) produces a shift in the activity of the molecule (Figure 4). Figure 4. Chemical characteristics of HT and its metabolites which seem to drive VEGF inhibition (green) and non-effect (red). Furthermore, if we compare these results with those previously reported for certain bio-actives such as the flavonoids, quercetin, quercetagetin, luteolin, and orobol, they DISCUSIÓN GENERAL 273 Discusión general La presente Tesis doctoral se centra en el estudio de bioactivos derivados de aminoácidos aromáticos presentes en bebidas fermentadas. El primer aspecto en el que nos hemos enfocado trata de dilucidar las rutas implicadas en el metabolismo de aminoácidos aromáticos por parte de la levadura durante la fermentación alcohólica (Capítulo 1). De igual forma, conocer la ingesta dietética de HT nos ha permitido poner de manifiesto el efecto biológico del HT en el contexto de la dieta (Capítulo 2). Además, se han llevado a cabo estudios de biodisponibilidad con los que hemos podido determinar la capacidad de los metabolitos para alcanzar el lugar de acción (Capítulo 3) y evaluar sus efectos neuroprotectores (Capítulo 4,5 y 6) y cardioprotectores (Capítulo 7). Con respecto al primer objetivo planteado, existen antecedentes en los que se demuestra que las levaduras Saccharomyces cerevisae son capaces de metabolizar el triptófano (L-TRP) para producir MEL. Este hallazgo fue descubierto por primera vez para la levadura cultivada en medio crecimiento (Sprenger et al., 1999). De hecho, Sprenger et al., (1999) demostraron que cuando las levaduras se exponían a L-TRP (1 mM), la concentración de MEL aumentaba (25,3 ng/mg de proteínas). En igual forma, la suplementación con serotonina (1 mM) y NAS (1 mM) provocó un aumento de la concentración de MEL (18,0 y 43,1 ng/mg de proteína respectivamente). Posteriormente, Rodríguez-Naranjo et al., (2011a) detectaron la presencia de MEL en el vino y que se producía durante la fermentación alcohólica (Rodríguez-Naranjo et al., (2011b) y, finalmente también determinaron la presencia de MEL en la cerveza (Maldonado et al., 2009; Fernández-Cruz et al., 2020). En los últimos años, se han descrito diferentes rutas metabólicas implicadas en la producción de MEL a partir de triptófano. Inicialmente, se propuso que la levadura seguía la misma ruta de síntesis de MEL que los vertebrados en la que el triptófano se convierte en 5-OH-TRP seguido de SER, NAS y por último MEL (Figura 5) (Ruddick et al., 2006). A su vez, Muñiz-Calvo et al. (2019) propusieron una ruta de síntesis adicional de MEL en levaduras del género Saccharomyces durante la fermentación alcohólica. Los DISCUSIÓN GENERAL 274 resultados de estos autores mostraron que se forma serotonina, en la levadura, a partir de la descarboxilación del triptófano, seguida de la hidroxilación de la TRYPT, al igual que sucede en las plantas (Muñiz-Calvo et al., 2019). En nuestro diseño experimental, sólo se adicionó como fuente de nitrógeno al mosto sintético L-TRP marcado isotópicamente (2N2 L-TRP) junto a sulfato de amonio y otros aminoácidos. En primer lugar, nuestros resultados confirman la ruta de síntesis de MEL de vertebrados a partir de L-TRP ya descrita (Ruddick et al., 2006). Se han detectado cada uno de los compuestos implicados en dicha ruta marcados isotópicamente (5-OH-TRP, SER, NAS y MEL) siguiendo una secuencia consistente. Además, nuestros resultados muestran que no es la única ruta implicada en la síntesis de MEL durante la fermentación alcohólica. En el día 1 y 2 de fermentación se ha detectado L-TRP sin marcar, por lo tanto, la levadura es capaz de producirlo. Asimismo, cada uno de los compuestos implicados en la ruta de vertebrados están presentes en forma no marcada. Además, detectamos TRYPT sin marcar isotópicamente. Muñiz-Calvo et al., (2019) propusieron que la adición de una elevada cantidad de TRYPT dio lugar a la síntesis de SER por parte de la levadura. Nuestros resultados concuerdan con lo anterior puesto que la concentración de SER sin marcar isotópicamente detectada en el día 2 de fermentación (0,015 mg/L) se ajusta bien a la suma de las concentraciones de sus dos precursores no marcados (5-OH-TRP (0,009 mg/L) y TRYPT (0,004 mg/L)) en el día 1 de fermentación. Podemos afirmar así que el L-TRP añadido al inicio en el mosto es un precursor de la MEL y del resto de intermediarios de la ruta descrita anteriormente (5-OH-TRP, SER y NAS). Ahora bien, el L-TRP inicial añadido en el mosto sintético no es el único precursor de la MEL para las levaduras S. cerevisiae, ya que a partir del L-TRP que la propia levadura sintetiza se produce también MEL. De hecho, Rodríguez-Naranjo et al (2011a) mostraron que aún aumentado 5 veces la concentración inicial de L-TRP no existían diferencias significativas entre las concentraciones de MEL detectadas al final de la fermentación. En resumen, las levaduras pueden utilizar más de una vía para la síntesis de MEL y ambas vías ocurren simultáneamente durante la fermentación alcohólica. La ruta más predominante es la que parte del L-TRP producido por la levadura ya que detectamos entre un 69-100% de MEL sin marcar frente a un 14-86% marcada isotópicamente a lo largo de los 7 días de fermentación (Capítulo 1). DISCUSIÓN GENERAL 275 En estudios previos, se ha demostrado que muchos de los alcoholes superiores se forman por una de las siguientes dos vías relacionadas con el metabolismo de los aminoácidos: (a) Mediante la vía de Ehrlich (Muniz-Calvo et al., 2020) o (b) Producción de de α-cetoácidos durante la síntesis de aminoácidos a partir de azúcares (Ugliano et al., 2009). En la fermentación alcohólica en mosto sintético realizada con TYR marcada isotópicamente (13C TYR) detectamos cada uno de los compuestos marcados (ácido 4- hidroxifenilacético, TYRS y HT) a lo largo de los 9 días de fermentación siguiendo un orden lógico, confirmando así la producción de HT a partir de TYR por parte de la levadura mediante la vía de Ehrlich (Figura 6) (Muniz-Calvo et al., 2020). De manera simultánea hemos encontrado los siguientes compuestos sin marcar: ácido 4- hidroxifenilacético, TYRS y HT. Nuestros resultados muestran que, durante la fermentación alcohólica, ambas vías conducen a la formación de HT en el mosto sintético por parte de la levadura. Destacando que entre el 98 y el 88% de HT presente en el mosto sintético no está marcado isotópicamente. Cordente et al., (2018) pusieron de manifiesto la capacidad de las levaduras de producir alcoholes superiores directamente a partir de la glucosa. Al igual que Rebollo-Romero et al., (2020) no obtuvieron diferencias en la concentración final de HT durante la fermentación alcohólica tras emplear dos concentraciones diferentes de TYR en el mosto sintético. En base a los estudios previos y a nuestros resultados, podemos confirmar que la mayor parte del HT que se forma durante la fermentación alcohólica no procede del contenido inicial de TYR en el mosto sintético. Los valores obtenidos para la concentración de HT al final de la fermentación con mosto sintético (0,014 mg/L) concuerdan con los obtenidos anteriormente por Álvarez-Fernández et al., (2018) y Rebollo-Romero et al., (2020) en mosto sintético (0,008 mg/L). Así, diversos autores (Di Tommaso et al., 1998; Wang et al., 2020) determinaron la concentración de HT en vino oscilando entre 0,00071 y 4,37 mg/L. En el estudio de la ingesta dietética del HT en la UE realizado por la EFSA, a raíz de la declaración de propiedades saludables (Turck et al., 2017) esta contribución de HT a partir de vinos no se consideró. La EFSA estimó la ingesta dietética de HT basándose únicamente en la contribución del aceite de oliva virgen y las aceitunas de mesa como DISCUSIÓN GENERAL 276 principales fuentes alimentarias (Turck et al., 2017). Así pues, se consideró adecuado incluir en el vino para así conocer el aporte dietético real de HT. Aunque el HT está presente en la cerveza, no se incluyó en el estudio debido a la limitada información disponible (Boronat et al., 2020). Con las aceitunas de mesa, el aceite de oliva virgen y el vino como principales fuentes dietéticas de HT, se estimó, en primer lugar, la ingesta diaria de HT a partir del consumo de los alimentos anteriormente mencionados basado en el contenido medio de HT en cada uno de ellos: aceite de oliva virgen (5,2 µg/g), aceituna de mesa (629,1 µg/g) y vino (2,1 µg/g) y en la ingesta estimada en la UE tal y como figura en la base de datos de consumo de alimentos de la EFSA (EFSA, 2011c). Grecia es el país con la mayor ingesta de HT (6,82 mg/día), seguido de España (5,79 mg/día). Por el contrario, Austria, Hungría y Croacia mostraron la ingesta más baja de HT (0,13; 0,13 y 0,14 mg/día respectivamente). La ingesta media de HT en los países de la UE es de 1,97 ± 1,82 mg/día. Sólo Grecia y España tienen lo valores de ingesta de HT suficientes (5 mg/día) para ejercer un efecto protector de las LDL frente al daño oxidativo (EFSA, 2011a). Con respecto a los alimentos, se observó que las aceitunas de mesa y el vino fueron los principales contribuyentes a la ingesta dietética de HT en los países de la UE. Específicamente, las aceitunas de mesa son la principal fuente de HT en la UE. Aunque la cantidad de aceitunas de mesa que se consume en la UE no es especialmente relevante, su contenido en HT es el más elevado entre los alimentos estudiados. Como consecuencia, se supone que los adultos de la UE que no consumen aceitunas de mesa o vino no tendrán un aporte significativo de HT a través de la dieta. Como era de esperar, el aceite de oliva virgen contribuye significativamente a la ingesta de HT sólo en algunos países de la cuenca de mediterránea (Italia (16%), España (3%), Chipre (0,7%), Grecia (0,6%) y Eslovenia (6%)) ya que, principalmente, es en estos países donde se consume aceite de oliva virgen. Hay que considerar que la estimación de la ingesta de HT se basó en el HT libre. Por el contrario, en el aceite de oliva virgen y en las aceitunas de mesa también están presentes la oleuropeína y la oleuropeína aglicona, los cuales pueden ser hidrolizados a hidroxitirosol contribuyendo así a la ingesta total de HT (de la Torre et al., 2008). Por lo DISCUSIÓN GENERAL 277 tanto, la ingesta dietética de HT podría ser mayor que la estimada basada exclusivamente en el HT libre presente en la dieta. Al mismo tiempo, la oxidación térmica del aceite de oliva virgen durante la fritura (180oC) durante 30-60 min provoca pérdidas de HT entre el 60 y el 90% (Attya et al., 2010), lo que a su vez sobrestimaría el aporte de HT del aceite de oliva virgen cuando se utiliza para freír. Asimismo, nuestros datos muestran por primera vez que el vino es uno de los principales contribuyentes, junto con las aceitunas a la ingesta dietética de HT en la población adulta de la UE. La ingesta total de polifenoles en la dieta de la población adulta en los países de la UE es de 1706 mg/día (Dinamarca) y 664 mg/día (Grecia) (Ziauddeen et al., 2019). Considerando la ingesta media de HT en estos países, la contribución relativa de HT a la ingesta total de polifenoles sería alrededor de 0,2-1%. Cabe destacar, que la ingesta media de HT (1,9 mg/día) está entro del orden de magnitud de algunos antocianos como la peonidina y la petunidina (1,6 mg/día y 1,13 mg/día, respectivamente) (Zamora-Ros et al., 2011), ciertos flavonoles, como la isorhamnetina (2 mg/día), la flavanona eriodictiol (1 mg/días) y la flavona luteolina (1 mg/día) (Vogiatzoglou et al., 2015) estimados para la población de la UE. Varios estudios espidemiológicos han demostrado que la adherencia a la DM se asocia con una reducción del deterioro cognitivo y un menor riesgo de demencia (Scarmeas et al., 2006, 2009; Di Giovanni, 2009; Alcalay et al., 2012; Gardener et al., 2012; Singh et al., 2014; Casamenti et al., 2015; Safouris et al., 2015; Anastasiou et al., 2017). El potencial neuroprotector asociado a la DM está relacionado con su contenido en bioactivos como el TYRS, el HT o el PCA. D´Angelo et al., (2001) señalaron en un estudio llevado a cabo con ratas que tras 5 min de la inyección intravenosa de 1,5 mg de HT/kg, el tejido cerebral contenía 0,31% de la dosis administrada. Además, Wu et al., (2009) determinaron en el cerebro de rata una Cmáx de 2,1 µg de HT/mL tras una dosis intravenosa de 100 mg de HT/kg. Asimismo, Bu et al. (2007) observaron en un estudio in vivo en ratas que el TYRS tenía la capacidad de atravesar la BBB. DISCUSIÓN GENERAL 278 A su vez, el PCA es uno de los ácidos fenólicos mayoritarios formados a partir de los antocianos (Vitaglione et al., 2007; Pimpo et al., 2014). El PCA está presente en las bayas (0,62-794,13 mg/100 g), vino tinto (0,21 mg/100 mL), frutas (0,28-18,73 mg/100 g), mermeladas y confituras de bayas (0,07-9,36 mg/100 g), zumos de frutas (1,14-6,70 mg/100 mL) y verduras (0,62-10,62 mg/100 g) (Neveu et al., 2010; Rothwell et al. 2012, 2013). Asimismo, Zhang et al., (2011) demostraron en un estudio in vivo en ratones que tras la administración de un extracto líquido de Dan shen, el PCA está presente en el cerebro. Sin embargo, no hay estudios acerca de cómo este tipo de metabolitos puede atravesar la BBB o cómo la estructura influye en la biodisponibilidad cerebral. Figueira et al., (2017a) demostraron que las diferencias en el transporte a través de la BBB de metabolitos derivados del ácido gálico y el ácido vanílico podrían estar relacionadas con el grado de modificación en su estructura química. En concreto, la metilación y la sulfatación mejoraban el transporte de los metabolitos. Además, los transportadores de membrana presentes en las HBMEC (proteínas de unión al trifosfato de adenosina (ATP) (ABC)) pueden limitar la biodisponibilidad de los metabolitos en el cerebro (Figueira et al., 2017b). En nuestros ensayos de transporte endotelial a través de la BBB, hemos observado que el TYRS y el HT parecen tener un comportamiento similar. En primer lugar, el TYRS y el HT no producen ninguna alteración en la BBB, como demuestran nuestros estudios de permeabilidad, en los que observamos que los valores de TEER y de permeabilidad celular no varían con respecto al control a ninguna de las concentraciones ensayadas. Además, las imágenes de inmunofluorescencia muestran que no hay cambios en la expresión de β-catenina en la membrana de las HBMEC con respecto al control (Capítulo 3). En segundo lugar, los tres compuestos pueden cruzar la barrera, lo que concuerda con estudios previos que indican la capacidad de TYRS y HT de atravesar la BBB in vivo (D'Angelo et al., 2001; Bu et al., 2007; Wu et al., 2009). Por tanto, el hecho de que TYR, TYRS y HT estén presentes en la zona basal podría estar relacionado con un transporte activo o pasivo a través de la BBB. DISCUSIÓN GENERAL 279 TYR (50%), TYRS (30%) y HT (70%) muestran el mismo porcentaje de transporte endotelial a través de la BBB en las dos concentraciones fisiológicas ensayadas para cada compuesto. Podemos plantear la hipótesis de que tienen el mismo porcentaje de transporte a diferentes concentraciones por una de las siguientes razones. Por un lado, podría ser que la TYR, el TYRS y el HT atraviesen la BBB mediante transporte pasivo. Por otro lado, si pasan la BBB por transporte activo, los transportadores podrían haberse saturado a las concentraciones ensayadas o incluso a concentraciones mucho más bajas de las estudiadas. Cabe destacar que, aunque el TYRS y el HT presentan una estructura química muy similar, es muy diferente su capacidad de atravesar la BBB (30 y 70% respectivamente). Sorprendentemente, el compuesto más polar (HT) es el que presenta un mayor porcentaje (70%). Este hecho podría estar relacionado con la sustitución ortodifenólica, más comúnmente llamada grupo catecol. Como afirmaron Rogaie et al., (2013), el grupo catecol está relacionado con una mayor actividad de la molécula. Por lo tanto, el HT podría tener una mayor capacidad para establecer conexiones con las proteínas de membrana y así aumentar el transporte activo. En muchos estudios, las moléculas donantes de hidrógeno más eficientes se caracterizan por la funcionalidad dihidroxi la cual le permite cruzar la BBB más libremente (Rogaie et al., 2013). De hecho, la capacidad química de algunos metabolitos para establecer enlaces de hidrógeno con otros grupos funcionales de las biomoléculas (por ejemplo, el grupo catecol) podría sugerir una tendencia a un mecanismo de transporte activo en la BBB (Figueira et al., 2019). Del mismo modo, los estudios de permeabilidad de la SER y el PCA muestran que no producen cambios en la integridad de la BBB. En cuanto al porcentaje de transporte transendotelial, la SER (20 y 200 µM) mostró porcentajes acorde a la concentración (4 y 30% respectivamente). Además, en el caso del PCA (1 y 100 µM) también se obtuvieron porcentajes diferentes para ambas concentraciones (0,1 y 9% respectivamente). Estas diferencias sugieren que el transporte a través de la BBB no podría justificarse simplemente por transporte pasivo, sino también por transporte activo. También es posible que ciertos compuestos sean menos estables en el medio celular y se degraden DISCUSIÓN GENERAL 280 antes de poder ser transportados. Esto podría explicar los bajos porcentajes de transporte a través de la BBB de la SER (20 µM) y PCA (1 µM) a las concentraciones más bajas ensayadas. La estabilidad de estos metabolitos podría examinarse en un futuro controlando la recuperación de los medios celulares y el transporte de los productos de degradación utilizando compuestos marcados isotópicamente. Además, algunos componentes (como los antocianos) pueden ser más sensibles a la degradación oxidativa. De hecho, Figueira et al., (2019) propusieron que la quercetina detectada en el cerebro (Bieger et al., 2008; Ishisaka et al., 2011) puede ser el resultado de la degradación de la quercetina a sus formas conjugadas, que se transportan a través de la BBB, y la quercetina sola puede no ser capaz de atravesar la BBB. Asimismo, Pogacnik et al., (2016) detectaron el transporte a través de la BBB de glucósidos de la quercetina, pero no de la quercetina libre. El estudio realizado por Faria et al., (2014) señala que sólo un 8% de la quercetina libre se transportaba través de la BBB tras 18 h de incubación en el modelo celular de BBB, hCMEC/D. Así, podría explicarse de forma análoga por un elevado metabolismo/degradación del PCA en la BBB el bajo porcentaje de transporte transendotelial obtenido (9%) para PCA. Podemos hipotetizar que dicho metabolismo puede ocurrir a nivel de la BBB, pero no podemos confirmarlo a partir de nuestros datos de UHPLC/HRMS ya que no se han analizado las formas conjugadas. Hay que tener en cuenta que la BBB es una interfaz compleja compuesta no sólo por células endoteliales, sino también por astrocitos y pericitos (Bernas et al., 2010; Cardoso et al., 2010), y estos tipos de células también pueden influir en el transporte de metabolitos a través de la BBB in vivo. Nuestro trabajo muestra que los bioactivos TYR, TYRS, HT, SER y PCA, a concentraciones fisiológicas, pueden atravesar la BBB. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para dilucidar los mecanismos mediante los cuales estos compuestos atraviesan la BBB. El análisis de la expresión de varios transportadores mediante qRT-PCR, la repetición de los ensayos de permeabilidad en presencia y ausencia de inhibidores específicos de transportadores de flujo y la determinación de la actividad de estos transportadores son buenas opciones para ampliar los conocimientos sobre el papel de estos compuestos a través de la BBB. DISCUSIÓN GENERAL 281 La dieta está formada por alimentos que son fuente de diversos compuestos bioactivos. Por lo tanto, atribuir los efectos biológicos a un solo compuesto podría conducirnos a una percepción parcial. Por esta razón, estudiar el efecto biológico simultáneo de las combinaciones de diferentes compuestos podría acercarnos a una situación más real en el contexto de la dieta. Entre los distintos bioactivos descritos en bebidas fermentadas hay evidencias que demuestran las propiedades neuroprotectoras que MEL, PCA y HT poseen frente a la agregación de la proteína α-sin (Ono et al., 2012; Hornedo-Ortega et al., 2016; 2018a) y además son capaces de atravesar la BBB. Se llevaron a cabo estudios de neuroprotección empleando una concentración más elevada de la dosis dietética en el ensayo con tioflavina T observando así el posible efecto frente a la toxicidad de las fibras de α-sin. En concreto, PCA (100 µM) y HT (100 µM) de manera independiente tienen el mayor potencial de inhibición y desestabilización de fibras de α-sin (80% y 60%, respectivamente para el PCA y 80% y 71%, respectivamente para el HT). Estos resultados son coherentes con los con los trabajos realizados anteriormente por el grupo (Hornedo-Ortega et al., 2016; 2018a) en los que detectaron un efecto similar para PCA y HT frente a la formación y desestabilización de fibras de α-sin. Otros compuestos polifenólicos como la oleuropeína aglicona (Palazzi et al., 2018), la curcumina (Ono & Yamada, 2006) o la epigalocatequina-3-galato (EGCG) (Bieschke et al., 2010), han sido estudiados en relación con sus propiedades neuroprotectoras, aunque no existe evidencia de que atraviesen la barrera hematoencefálica. A su vez, la presencia simultánea de PCA y HT fue la combinación más efectiva frente a la inhibición y a la desestabilización de fibras de α-sin (90 y 89% respectivamente) en comparación con las combinaciones de ambos compuestos con la MEL. En el caso de la desestabilización de fibras de α-sin, la combinación de PCA y HT resultó ser más efectiva que ambos compuestos de manera independiente (53 y 71%, respectivamente). Una vez comprobado el efecto antiagregante y desestabilizador de fibras de α-sin, es preciso comprobar el efecto sobre células neuronales. En este caso, las concentraciones de cada uno de los metabolitos se redujeron (MEL (25 μM), PCA (10 μM) y HT (10 μM) para acercarnos a las concentraciones fisiológicas. DISCUSIÓN GENERAL 288 Es interesante considerar si estos metabolitos pudieran ser tóxicos a las concentraciones fisiológicas determinadas en plasma y cerebro (0,1-10 µM) (Burke et al., 1999; Kristal et al., 2001; de las Hazas et al., 2016, 2018). Los resultados del estudio de viabilidad celular en células PC12 y en presencia de α-sin indican que DOPAL (2, 5, 10 y 15 µM) y MOPET (10 y 15 µM) previene la muerte de las células PC12 posiblemente por la capacidad que presentan estos metabolitos de inhibir la formación de fibras de α-sin. Una explicación tentativa para los resultados obtenidos en el caso de DOPAL podría ser la que Carmo- Gonçálvez et al., (2020) manifestaron en su estudio en el que, exponen que el aducto formado entre DOPAL y α-sin muestra una menor toxicidad comparada con el DOPAL por sí solo. Este hecho da lugar a plantearnos si la producción de dichos aductos son parte de la protección mediada por α-sin en las neuronas expuestas al DOPAL es un resultado colateral. Hornedo-Ortega et al., (2018a) mostraron que el HT a 10 µM revertía en un 15-20% los efectos tóxicos producido por las fibras de α-sin. Los resultados obtenidos en el presente estudios manifestaron resultados similares para el MOPET (10 µM). En cambio, el DOPAL (10 µM) posee más potencial que el MOPET y el HT incrementando la viabilidad en un 40%. De forma complementaria se llevó a cabo el estudio acerca de cómo los vitagenes (SIRT- 1, SIRT-2, HO-1 y Hsp70) estaban implicados en los efectos neuroprotectores de DOPAL y MOPET. Aunque el MOPAL no presentó efectos neuroprotectores, lo consideramos para este estudio a fin de conocer si modula la expresión de lo vitagenes bajo estudio en ausencia de fibras de α-sin. Tal y como hemos mencionado anteriormente, la disminución de los niveles de SIRT-1 están implicados en lesiones neuronales (Gao et al., 2012) y en una gran variedad de enfermedades neurodegenerativas (Srivastava & Haigis et al., 2011; Ng et al., 2015). Nuestros resultados más relevantes muestran que en ausencia de fibras de α-sin DOPAL (0,5, 5 y 15 µM) y MOPET (5, 10 y 15 µM) aumentan significativamente la expresión de SIRT-1. Cada uno de los metabolitos muestran un comportamiento frente a la expresión de SIRT-1 similar al HT. A su vez, DOPAL y MOPET producen una inhibición de la expresión del gen SIRT-2 la cual está relacionada con la protección celular frente a la toxicidad de la α-sin en la DISCUSIÓN GENERAL 289 enfermedad de Parkinson (Garske et al., 2007; Outerio et al., 2007). Como hemos observado en el estudio con el HT, aumenta la expresión de la SIRT-2 comportándose de manera diferente a sus metabolitos DOPAL, MOPET y MOPAL a la misma concentración (10 µM). La expresión de la HO-1 disminuyó en presencia de cada uno de los metabolitos bajo estudio y, por consiguiente, estos compuestos no son capaces de prevenir el estrés oxidativo relacionado con el aumento del HO-1 (Lin et al., 2007). Sin embargo, el HT (10 µM) si aumentó de manera significativa la expresión de la HO-1. Varios estudios han revelado que Hsp70 puede tener un papel tanto en el pliegue como en la degradación de agregados de α-sin proporcionando así protección contra la toxicidad de α-sin (Klucken et al., 2006; Ebrahimi-Fakhari et al., 2012). En nuestro ensayo hemos demostrado que DOPAL y MOPET en ausencia y presencia de fibras de α-sin aumentan significativamente la expresión del gen Hsp70. Este hecho podría estar relacionado con el efecto neuroprotector observado para ambos compuestos. Estos resultados muestran que los metabolitos del HT aumenta la expresión del gen Hsp70 5 veces más que el HT a la misma concentración (10 µM). En conjunto, estos estudios muestran que el DOPAL ejerce un efecto protector a través del sistema de vitagenes que no había sido explicado previamente. El siguiente aspecto trata de evaluar la posible actividad antiangiogénica de los metabolitos del HT bajo estudio (DOPAL, MOPET y MOPAL) en HUVEC. En el trabajo realizado por Cerezo et al., (2019) determinaron que HT posee efectos antiangiogénicos frente al receptor 2 de VEGF (VEGFR-2). En los análisis que hemos realizado, presentamos por primera vez la evidencia de que DOPAL posee actividad antiangiogénica (IC50: 119 µM) mientras que MOPET y MOPAL no presentaron actividad frente al VEGFR-2. Una de las diferencias entre ellos es el tipo de sustituyentes unidos al anillo de benceno. El DOPAL posee un grupo catecol mientras que el MOPET y MOPAL presentan una sustitución del grupo metoxi en lugar de uno de los grupos hidroxilo. Si el anillo está unido a un grupo que dona electrones, como el grupo -OH, la densidad electrónica del DISCUSIÓN GENERAL 290 benceno será mayor, y su reactividad aumentará. De hecho, el grupo catecol era de una de las características químicas relacionadas con un mayor efecto de inhibición frente al VEGF (Cerezo et al., 2015). Podría decirse que este hecho confirma porque DOPAL es el único compuesto de los tres metabolitos del HT bajo estudio que posee actividad anti- VEGF. De forma contrapuesta, MOPET y MOPAL presentan una sustitución del grupo hidroxilo por un grupo metoxi, lo que resulta en una menor actividad. Los resultados son consistentes con estudios anteriores en los que la metilación de uno de los grupos hidroxilo del grupo catecol, en el anillo B, de la quercetina para convertirla en tamarixetina provocó una pérdida de su actividad contra la inhibición del VEGFR-2 (Cerezo et al., 2015). Los resultados observados por Cerezo et al., (2019) indican que el HT (IC50: 72 µM) tiene mayor actividad antiangiogénica que el DOPAL (IC50: 119 µM). Esta diferencia podría indicar que el grupo funcional (alcohol o aldehído) en la cadena alifática unida al anillo de benceno produce un cambio en la actividad de la molécula. De manera similar, si comparamos nuestros resultados con el efecto antiangiogénico de otros bioactivos como los flavonoides: quercetina, quercetagetina, luteolina y orobol. Todos ellos presentan un efecto anti-VEGF significativamente más alto (IC50: 0,754, 0,096, 7,46, 3,311 µM, respectivamente) (Cerezo et al., 2015) que el DOPAL. Aun presentando todo ellos un grupo catecol, parece que otras características químicas como la estructura C6-C3-C6, el doble enlace C2=C3 en el anillo o incluso el tamaño molecular son esenciales para presentar un mayor potencial anti-VEGF. Burke et al., (1999) determinó que la concentración plasmática de DOPAL era de 9,75 pg/mL que es igual a 6,4·10-5 µM. Esta concentración está bastante lejos de su IC50 (119 µM). Tal y como se ha indicado anteriormente, si bien este estudio no es representativo, es el único encontrado en bilbliografía. Con el objetivo de comprobar si el DOPAL al inhibir el VEGFR-2 además inhiben la proliferación celular, que es una de las fases iniciales del proceso de angiogénesis, se evaluó el efecto del DOPAL sobre la inhibición de la principal proteína intracelular DISCUSIÓN GENERAL 291 implicada en la proliferación celular, como es el PLCγ1. Los resultados muestran que tras incubar las HUVEC con VEGF y, seguidamente, DOPAL se produce un descenso significativo comparado con el control en el que sólo se incubó VEGF con las HUVEC. La inhibición de la activación de PLCγ1 nos da información sobre el mecanismo de acción de compuestos que tienen efecto antiangiogénico. El mecanismo anti-VEGF del DOPAL podría estar mediado por la proteína PLCγ1. La capacidad de DOPAL de inhibir la fosforilación de PLCγ1 coincide con los resultados descritos en bibliografía, que confirmaron que el efecto antiangiogénico del HT también está mediado por la inhibición de PLCγ1 (Cerezo et al., 2019). Asimismo, la vasodilatación también se estimula mediante la activación del VEGFR-2 inducida por VEGF. Este activa eNOS, por medio de AKT, desencadenando la producción de óxido nítrico (NO) (Xiao‐Ping & Xi‐Gui, 2006). La hipertensión es un efecto secundario habitual de las terapias anti-VEGF, como sorafenib (Wu et al., 2008), sunitinib (Zhu et al., 2009), pazopanib (Qi et al., 2013a) y axitinib (Qi et al., 2013b). Sin embargo, nuestra investigación ha demostrado que el DOPAL puede aumentar notablemente la fosforilación de eNOS via AKT e inhibir simultáneamente la activación del VEGFR-2. Este hallazgo coincide con otro bioactivos como las procianidinas dp4, la EGCG y el HT los cuales activan eNOS via AKT (Moyle et al., 2015; Cerezo et al., 2017). Además de los compuestos polifenólicos, existen otras familias de compuestos como los compuestos indólicos (MEL, SER y el ácido-3-indolacético (IAA)) que poseen la capacidad de inhibir al VEGFR-2 (Cerezo et al., 2017, 2019). El IAA fue el compuesto que mostró el mayor efecto antiangiogénico de entre los tres anteriormente mencionados con un porcentaje de inhibición de la activación del VRGFR-2 del 54% a una concentración de 1 mM (IC50: 0,97 mM). Basándonos en estos datos, en nuestro estudio se ha evaluado la capacidad de inhibir al VEGFR-2 de compuestos con estructura similar al IAA (ácido indolpirúvico (IPy), ácido indolpropiónico (IPA), ácido indolbutírico (IBA) y ácido indolláctico (ILA)). Estos compuestos indólicos han sido identificados en alimentos fermentados (Álvarez-Fernández et al., 2019, 2020). Además, IPy, IPA y ILA son metabolitos humanos. El IPy se sintetiza de manera endógena en la flora intestinal de DISCUSIÓN GENERAL 292 mamíferos (Hubbard et al., 2015) y, IPA e ILA han sido descritos en plasma (Morita et al., 1992). El único compuesto indólico entre los estudiados que presenta actividad antiangiogénica fue el IPy con un IC50 de 1,037 mM, similar al descrito anteriormente para el IAA (IC50: 0,97 mM) (Cerezo et al., 2017). Una posible explicación para las diferencias encontradas entre los compuestos bajo estudio podría estar relacionada con sus estructuras químicas. Al comparar la estructura, todos los compuestos bajo estudio y el IAA tienen el anillo indólico en común. Por el contrario, la cadena alifática unida al anillo indólico difere entre ellos. Los resultados ponen de manifiesto que un incremento en la cadena, como en el caso del IPA o el IBA no produce actividad frente a la inhibición del VEGFR-2. Si la cadena se alarga y tiene un sustituyente hidroxilo tampoco da lugar a actividad anti-VEGF como ocurre con el ILA. Sin embargo, en el caso del IPy, en el que la cadena incrementa su tamaño y tiene un grupo carbonilo, si observamos actividad antiangiogénica. Este hecho podría explicarse por el movimiento de electrones ocasionado por el doble enlace C=O el cual aumenta la reactividad de la molécula y, en consecuencia, su actividad. Los datos obtenidos para el IPy muestran que posee un mayor efecto anti-VEGF (56% de inhibición) que la MEL > SER a la concentración de 1mM (32 y 30% de inhibición respectivamente) (Cerezo et al., 2017). En conjunto, estos estudios contribuyen a una primera aproximación de la funcionalidad de compuestos indólicos y fenólicos según su estructura química los cuales podrían ayudarnos a entender cómo estos metabolitos poseen propiedades bioactivas. Si bien, para establecer un modelo de relación cuantitativa estructuraactividad (QSAR) (Nongonierma et al., 2016), es necesario la evaluación de la actividad anti-VEGF de más compuestos indólicos y fenólicos con diferentes estructuras. De igual forma que anteriormente, nuestro estudió incluyó la investigación de la cascada de señalización del VEGFR-2. Al igual que ocurría con el DOPAL, IPy causó un descenso significativo de PLCγ1. Y a su vez, el IPy mantiene la fosforilación de eNOS evitando así la hipertensión asociada a numerosos compuestos anti-VEGF mencionados anteriormente. Estos resultados concuerdan con lo obtenidos para la MEL y la SER las DISCUSIÓN GENERAL 293 cuáles también mostraron la capacidad de evitar la inactivación de eNOS (Cerezo et al., 2019). Los futuros estudios deberían centrarse en la inhibición de la migración (ensayo de cicatrización de heridas in vitro) y la formación de nuevos vasos sanguíneos (modelos de anillos aórticos ex vivo). CONCLUSIONES CONCLUSIONS CONCLUSIONES 297 Conclusiones 1. Mediante el empleo de triptófano marcado se ha puesto de manifiesto que durante la fermentación alcohólica la levadura produce melatonina a través de dos vías metabólicas de manera simultánea. Emplea el triptófano presente en el medio y, el triptófano que ella misma sintetiza, siendo esta última al parecer la ruta predominante en la síntesis de melatonina. Respecto a la ruta de Ehrlich, no resulta ser la mayoritaria para la síntesis de hidroxitirosol por parte de la levadura, a partir de ensayos con tirosina marcada. 2. La aceituna de mesa y el vino son los alimentos que contribuyen en mayor medida a la ingesta de HT en la población europea adulta. Grecia, España, Dinamarca, Chipre e Italia son los países que presentan la mayor ingesta de HT en la población adulta de la UE. 3. Estudios in vitro de barrera hematoencefálica desarrollados, muestran que tirosina, tirosol, hidroxitirosol, serotonina y ácido protocatéquico son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. 4. Los valores de resistencia eléctrica transendotelial, permeabilidad transendotelial y expresión de β-catenina de la membrana de las células endoteliales cerebrales humanas permanecen inalterados tras la aplicación de tirosina, tirosol, hidroxitirosol, serotonina y ácido protocatéquico. Por lo tanto, ninguno de los compuestos estudiados altera la integridad de la BBB. 5. Respecto a los estudios de neuroprotección, la presencia simultánea de ácido protocatéquico e hidroxitirosol produce un mayor efecto frente a la inhibición (90%) y la desestabilización (89%) de formación de fibras de α-sinucleína en comparación con ambos compuestos de manera independiente. 6. Todas las combinaciones entre melatonina, ácido protocatéquico e hidroxitirosol manifestaron propiedades neuroprotectoras incrementando la viabilidad celular entre BIBLIOGRAFÍA 304 Torulaspora delbrueckii intra-and extra-cellular aromatic amino acids metabolism. Journal of agricultural and food chemistry, 67(28), 7942-7953. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b01844. Álvarez-Fernández, M. A., Carafa, I., Vrhovsek, U., & Arapitsas, P. (2020). Modulating wine aromatic amino acid catabolites by using Torulaspora delbrueckii in sequentially inoculated fermentations or Saccharomyces cerevisiae alone. Microorganisms, 8(9), 1349. https://doi.org/10.3390/microorganisms8091349. Anastasiou, C. A., Yannakoulia, M., Kosmidis, M. H., Dardiotis, E., Hadjigeorgiou, G. M., Sakka, P., Arampatzi, X., Bougea, A., Labropoulos, I., & Scarmeas, N. (2017). Mediterranean diet and cognitive health: Initial results from the Hellenic Longitudinal Investigation of Ageing and Diet. 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