Glicodendrones como plataformas multivalentes para la transferencia selectiva de moléculas de interés biológico

GLICODENDRONES COMO PLATAFORMAS MULTIVALENTES PARA LA TRANSFERENCIA SELECTIVA DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO Mª Olivia Sánchez Maldonado Sevilla , 2010 CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS ISLA DE LA CARTUJA GLICODENDRONES COMO PLATAFORMAS MULTIVALENTES PARA LA TRANSFERENCIA SELECTIVA DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO Memoria presentada por la Licenciada Mª Olivia Sánchez Maldonado para optar al grado de Doctor en Química Sevilla, 2010 INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA Dr. Francisco Javier Rojo Marcos, Científico Titular del C.S.I.C. CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado: “Glicodendrones como plataformas multivalentes para la transferencia selectiva de moléculas de interés biológico” ha sido realizado bajo mi dirección y asesoramiento en los laboratorios del Instituto de Investigaciones Químicas del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja (Sevilla) constituyendo la Memoria que presenta la Lcda. Mª Olivia Sánchez Maldonado para aspirar al grado de Doctor en Química. Sevilla, Septiembre de 2010 Fdo.: Francisco Javier Rojo Marcos ÍNDICE 1. Introducción . 3 1.1. Los carbohidratos en la naturaleza . 3 1.2. Modelos artificiales de sistemas multivalentes de carbohidratos . 6 1.3. Dendrímeros . 8 1.3.1. Características generales de los dendrímeros . 8 1.3.2. Estrategias sintéticas para la preparación de dendrímeros . 10 1.4. Glicodendrímeros . 14 1.5. Respuesta inmune y células dendríticas . 25 1.5.1. DC - SIGN, receptor de estructuras oligosacarídicas . 29 1.5.2. Activa ción de la respuesta inmune por interacción con el receptor DC-SIGN. 34 2. Antecedentes y objetivos . 47 2.1. Antecedentes del Grupo de Investigación . 47 2.2. Objetivos . 53 3. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido bis - MPA . 57 3.1. Síntesis divergente de dendrones basados en el ácido 2,2 - bis - (hidroximetil)propiónico empleando como núcleo TRIS. 63 3.1.1. Síntesis del soporte dendrítico . 63 3.1.2. Síntesis del glicodendrón 3GTBoc(SucMan) 24 y del correspondiente control 3GTBoc(SucC) 24 . 67 3.1.3. Análisis de la interación usando biosenso res . 73 3.1.3.1. Biosensor con detección SPR . 74 3.1.3.2. Evaluación de la inhibición de la interacción gp120/DC - SIGN usando el glicodendrón 3GTBoc(SucMan) 24 . 77 3.1.4. Modificación de la posición focal de dendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico empleando como núcleo TRIS. 79 3.2. Dendrones basados en el ácido 2,2 - bis - (hidroximetil)propiónico con espaciador. 83 3.2.1. Síntesis del soporte dendrítico . 83 3.2.2. Síntesis de los glicodendrones de primera y segunda generación . 89 3.2.3. Análisis de la actividad de 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 usando biosensores. 101 4. Marcaje fluorescente e internalización . 107 4.1. Marcaje fluorescente del glicodendrón 2GLL(SucMan) 12 . 107 4.2. Síntesis y marcaje fluorescente de dendrones control . 113 4.3. Estudios de interna lización de los glicoconjugados 2GLLBodipy(SucMan) 12 y 2GLLBodipy(SucGal) 12 . 124 5. Conjugación de biomoléculas . 133 5.1. Adición quimioselectiva . 135 5.2. Síntesis de glicoconjugados a través de derivados de maleimida . 142 5.2.1. Acoplamiento del glicodendrón 54 a un péptido modelo . 146 5.2.2. Acoplamiento de glicodendrón 54 a un oligonucleótido modelo . 152 6. Conclusiones . 163 7. Parte experimental . 169 7.1. Disolventes y reactivos . 169 7.2. Técnicas y aparatos . 170 7.3. Caracterización . 172 7.3.1. Síntesis divergente de dendrones basados en el ácido 2,2 - bis(hidroximetil)propiónico empleando como núcleo TRIS. 172 7.3.2. Dendrones basados en el ácido 2,2 - bis - (hidroximetil)propiónico con espaciador. 192 7.3.3. Marcaje fluorescente de dendrones . 210 7.3.4. Conjugación de biomoléculas . 223 Anexo 1. Estructuras y abreviaturas de aminoácidos . 231 Anexo 2. Estructuras y abreviaturas de nucleótidos . 237 Anexo 3. Espectros . 241 Capítulo 1 Introducción Introducción 3 1. Introducción. 1.1. Los carbohidratos en la naturaleza. La superficie de la mayoría de las células de mamíferos se encuentra cubierta por una densa capa de carbohidratos denominada glicocálix. Estos carbohidratos aparecen fundamentalmente conjugados a otras biomoléculas (proteínas y lípidos), dando lugar a las denominadas glicoproteínas y los glicolípidos, respectivamente. 1 Los glicolípidos y glicoproteínas están involucrados en numerosos procesos biológicos de adhesión y reconocimiento célula-célula y célula-matriz extracelular a través de la interacción con sus correspondientes receptores (fundamentalmente interacción proteína-carbohidrato) (Figura 1). 2 Entre estos procesos biológicos naturales o patológicos cabe destacar la embriogénesis, 3 la diferenciación celular, 4 el proceso inflamatorio, 5 la metástasis, 6 etc. 1 Dwek, R.A. Chem. Rev. 1996, 96, 683-720. 2 Feizi, T. Curr. Opin. Struct. Biol. 1993, 3, 701-710. 3 Muramatsu, T. J. Cell. Biochem. 1988, 36, 1-14. 4 Hakomori, S. Ann. Rev. Biochem. 1981, 50, 733-740. 5 Lasky, L.A. Ann. Rev. Biochem. 1995, 64, 113-139. 6 Muramatsu, T. Glycobiology 1993, 3, 291-296. Capítulo 1 4 Figura 1. Representación de alguno de los diferentes procesos naturales e infecciosos de reconocimiento en los que están implicados los glicoconjugados de la superficie celular. Las interacciones de los carbohidratos con sus receptores son altamente selectivas y, en la mayoría de los casos, dependientes de cationes divalentes (fundamentalmente calcio); sin embargo, estas interacciones presentan una baja afinidad, solventada en la naturaleza por una presentación multivalente de los carbohidratos y del receptor. 7 La combinación de múltiples interacciones entre dos o más unidades de carbohidrato y su correspondiente receptor multimérico, da lugar a las llamadas interacciones multivalentes, también conocido como efecto cluster (Figura 2). 8 Estas interacciones multivalentes presentan ventajas funcionales sobre las interacciones monovalentes; no solo aumentan la afinidad de forma significativa, sino que también aumentan la especificidad de la interacción y por lo tanto, del proceso de reconocimiento molecular. 7 Lundquist, J.J.; Toone, E.J. Chem. Rev. 2002, 102, 555-578. 8 (a) Lee, Y.C.; Lee, R.T. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 321-327. (b) Mammen, M.; Choi, S.K.; Whitesides, G.M. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2754-2794. Introducción 5 Receptor monovalente Ligando monovalente Interacción monovalente Receptor multivalente Ligando multivalente Interacción Multivalente A B Figura 2. Representación general de una interacción ligando-receptor monovalente (A) y una interacción ligando-receptor multivalente (B). Para entender correctamente el “efecto cluster” es necesario establecer las diferencias entre cooperatividad y multivalencia. 9 La cooperatividad describe la influencia que puede tener sobre futuras uniones la unión de un ligando monovalente sobre su receptor si éste posee varios sitios activos. La cooperatividad puede ser positiva o sinérgica cuando la afinidad por la segunda unión es mayor que por la primera; negativa o interferente, cuando dicha afinidad es menor; o no cooperativa o aditiva cuando la magnitud de las uniones es la misma. Los ligandos que se unen sobre los distintos sitios activos no tienen por qué ser los mismos. El ejemplo más claro de cooperatividad descrito en la naturaleza es la oxigenación alostérica de la hemoglobina, donde esta proteína tetramérica se une a cuatro moléculas de oxígeno con afinidad creciente hasta que los cuatro sitios activos presentes están ocupados. 10 Por otro lado, la multivalencia implica la unión simultánea de dos o más ligandos idénticos, que descansan sobre un mismo soporte, y un receptor múltiple que a 9 Badjic, J.D.; Nelson, A.; Cantrill, S.J.; Turnbull,W.C.; Stoddart, J.F. Acc. Chem. Res. 2005, 38, 723-732. 10 Eaton, W.A.; Henry, E.R.; Hofrichter, J.; Mozzarelli, A. Nat. Struct. Biol. 1999, 6, 351-358. Capítulo 1 6 su vez se encuentra sobre una misma entidad, siendo la intensidad de la interacción varios órdenes de magnitud mayor que la correspondiente a la interacción monovalente. Los sistemas multivalentes de carbohidratos de origen natural son difíciles de obtener de sus fuentes naturales, dada su escasez, así como la dificultad de aislarlos puros. En la mayoría de los casos, estos sistemas naturales se encuentran como mezclas de compuestos (glicoformas), sistemas muy parecidos en los que varían en mayor o menor medida el tipo de carbohidrato o la posición que ocupan estos carbohidratos en el glicoconjugado, siendo muy complicada su separación. 1.2. Modelos artificiales de sistemas multivalentes de carbohidratos. El estudio de los procesos moleculares (biológicos) en los que participan de forma activa los carbohidratos requiere el desarrollo de herramientas que permitan una presentación multivalente de dichos carbohidratos. En la bibliografía se encuentran descritos numerosos modelos de sistemas multivalentes de carbohidratos para el estudio de estos procesos biológicos. 11 El diseño de estos sistemas está basado en imitar a los glicoconjugados naturales que están involucrados en dichos procesos biológicos. Estos sistemas artificiales consisten fundamentalmente en soportes de muy diversa naturaleza sobre los que se unen varias copias del carbohidrato, originando una presentación multivalente del mismo. 12 La unión del carbohidrato al soporte se establece normalmente a través de un espaciador, que proporciona el medio de anclaje, así como una separación suficiente entre el soporte y el ligando para que el primero no interfiera en la interacción. Entre los sistemas multivalentes más usados cabe destacar los péptidos y proteínas, 13 los 11 Houseman, T.B.; Mrksich, M. Top. Curr. Chem. 2002, 218, 1-44. 12 Martos, V.; Castreño, P.; Valero, J.; de Mendoza, J. Curr. Opin. Chem. Biol. 2008, 12, 698-706. 13 Davis, B.G. Science 2004, 303, 480-482. Introducción 7 liposomas, 14 los dendrímeros, 15 los calixarenos, 16 las ciclodextrinas, 17 oligómeros y polímeros, 18 y las nanopartículas 19 (Figura 3). Figura 3. Representación de diferentes sistemas modelo multivalentes de carbohidratos. El diseño y preparación de sistemas multivalentes sintéticos de carbohidrato permite un acceso a una cantidad mayor de compuesto y a un mayor control sobre la estructura, la pureza, la naturaleza del soporte, la multivalencia (número de copias de carbohidratos presentes), etc. Entre todos estos sistemas multivalentes, los dendrímeros constituyen unos sistemas muy interesantes. Dado que el trabajo que se describe en esta memoria se centra en el uso de estos sistemas como soporte multivalente, en el siguiente apartado describiremos las características más interesantes de los mismos. 14 (a) Brewer, G.J.; Matinyan, N. Biochemistry 1992, 31, 1816-1820. (b) Stewart, R.J.; Boggs, J.M. Biochemistry 1993, 32, 10666-10674. 15 Röckendorf, N.; Lindhorst, T.H. Top. Curr. Chem. 2001, 217, 201-238. 16 Dondoni, A.; Marra, A.; Scherrmann, M.C.; Casnati, A.; Sansone, F.; Ungaro, R. Chem. Eur. J. 1997, 3, 1774-1782. 17 Roy, R.; Hernández-Mateo, F.; Santoyo-González, F. J. Org. Chem. 2000, 65, 8743-8746. 18 Roy, R. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996, 6, 692-702. 19 de la Fuente, J.M.; Barrientos, A.G.; Rojas, T.C.; Rojo, J.; Cañada, F.J.; Fernández, A.; Penadés, S. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2258-2261. Capítulo 1 14 N NH N NH N HN O O NH H2N O HN NH2 O NH H2N O HN H2N O O N O N H N N HN N H N O O H N H2NO HN H2NO HN H2N O N H H2N O N HN N N H N H N O O N HNH2 O NH NH2 O N H NH2 O H N NH2 O O N ONN H N NH N N H O O NH NH2 O H NNH2 O NH H2N OHN NH2 O N N N H2NH2N H2N H2N N N N H2N H2N H2N H2N N N N NH2 NH2 NH2 NH2 NN NNH2 NH2 NH2 NH2 NN AB PAMAM G2 PPI G3 O O O OO OOH OH OH OH O O O O O OH OH OH OH O O O OO HO HO HO HO O O O O O O HO HO HO HO O O HO O O HO HO O OH OH O OOH OH O O O O O O HO OH OH HO O HO HO O OOH O OH OH O OH O HO HO O OH O HO O HO OH CD Poliglicerol Boltorn BH20 Figura 10. Estructuras de algunos soportes dendriméricos disponibles comercialmente. Como hemos comentado anteriormente, los dendrímeros poseen múltiples funcionalidades en su periferia, lo que permite introducir múltiples ligandos en su superficie. En otras palabras, son plataformas ideales para la presentación multivalente de ligandos. Dependiendo de la estructura y generación del dendrímero se puede modular la multivalencia así como la presentación de estos ligandos en la superficie del dendrímero. La utilización de carbohidratos como ligandos permite disponer de una presentación multivalente de éstos, aspecto fundamental para poder entender y participar en los procesos biológicos en los que están implicados dichos carbohidratos. 1.4. Glicodendrímeros. Los glicodendrímeros son un tipo de dendrímeros que incorporan carbohidratos en su estructura. Este tipo de compuestos pueden ser clasificados en tres grupos diferentes: los que contienen carbohidratos en la superficie (Figura 11A), los que Introducción 15 su núcleo es un carbohidrato (Figura 11B) y aquellos cuya estructura esta basada en carbohidratos (Figura 11C). En nuestro caso, y dado el objetivo de la presente memoria nos vamos a centrar en aquellos en los que los carbohidratos se encuentran en la superficie de los dendrímeros. Figura 11. Tipos de glicodendrímeros. Como hemos comentado anteriormente, los dendrímeros se caracterizan por su alta ramificación alrededor de un núcleo polifuncional, posibilitando la alta funcionalización de la superficie. Cuando estos grupos periféricos están constituidos por carbohidratos se obtienen lo que se denomina glicodendrímeros. Debido al gran número de posibilidades existentes, los glicodendrímeros pueden ser de muy diversa naturaleza dependiendo de la estructura dendrítica, así como de los carbohidratos existentes en su superficie. El número de ejemplos que se describen en la bibliografía es muy amplio por lo que se ha decidido seleccionar algunos ejemplos a modo ilustrativo de la diversidad de estructuras y métodos de preparar estos compuestos. 24,7 Centrándonos en los glicodendrímeros con ligandos carbohidrato en su superficie (Figura 11A), la funcionalización de dendrímeros comerciales ha sido un método muy útil para la obtención de glicoconjugados polivalentes en un número reducido de etapas. Es por tanto lógico que se haya explotado extensamente esta metodología, sobre todo empleando dos tipos de dendrímeros comerciales, PAMAM y 24 (a) Okada, M. Prog. Polym. Sci. 2001, 26, 67-104. (b) Turnbull, W.B.; Stoddart, J.F. Rev. Mol. Biotechol. 2002, 90, 231-255. (c) Bezouska, K. Rev. Mol. Biotech. 2002, 90, 269-290. (d) Lindhorst, T.K. Top. Curr. Chem. 2002, 218, 201-235. 7 Lundquist, J.J.; Toone, E.J. Chem. Rev. 2002, 102, 555-578. Capítulo 1 16 PPI. Ambos dendrímeros tienen un esqueleto basado en aminas terciarias y disponen de aminas primarias en su superficie que pueden reaccionar con otras moléculas o grupos funcionales formando enlaces amida, urea o tiourea. Así, Stoddart y colaboradores 25 prepararon glicodendrímeros de hasta quinta generación, basados en el dendrímero PPI, que contenían 64 unidades de galactosa o lactosa en la superficie. Para ello, hicieron reaccionar un equivalente del correspondiente glicosil NHS-éster (N- hidroxisucinimida) con los grupos amino del dendrímero (Figura 12). Figura 12. Síntesis de glicodendrímeros PPI de lactosa. Aunque esta estrategia parece limitada por la escasa variedad de dendrímeros comerciales, ha sido posible obtener diferentes glicodendrímeros modificando, por ejemplo, los espaciadores que unen el esqueleto dendrítico con los azúcares. Este mismo grupo de investigación 26 modificó la longitud de estos espaciadores hasta en 10 unidades de metileno variando la densidad superficial de los carbohidratos. Este aspecto es interesante debido a que Roy y colaboradores 27 observaron que las afinidades 25 Ashton, P.R.; Boyd, S.E.; Brown, C.L.; Nepogodiev, S.A.; Meijer, E.W.; Peerlings, H.W.I.; Stoddart, J.F. Chem. Eur. J. 1997, 3, 974-983. 26 Peerlings, H.W.I.; Nepogodiev, S.A.; Stoddart, J.F.; Meijer, E.W. Eur. J. Org. Chem. 1998, 9, 1879-1886. 27 Pagé, D.; Roy, R. Bioconjugate Chem. 1997, 8, 714-723. Introducción 17 de estos dendrímeros podrían disminuir a partir de cierta valencia, debido a impedimentos estéricos. Otra forma de introducir diversidad en este tipo de glicodendrímeros es la unión de glicodendrones, previamente preparados, a dendrímeros comerciales usando éstos como núcleos. Esta metodología fue empleada por Stoddart y colaboradores 25 usando triadas dendriméricas de galactosa que se unieron al dendrímero comercial PPI de baja generación (Figura 13). Figura 13. Glicodendrímero de primera generación de galactosa empleando como núcleo PPI. En la síntesis de glicodendrímeros también se han empleado dendrímeros no comerciales. Así Roy y colaboradores 28 sintetizaron dendrones basados en la N,N-bis(3- aminopropil)glicina (Figura 14) y también basados en el ácido N,N-bis(3- aminopropil)succinámico mediante una estrategia en fase sólida. 29 En ambos casos se completaba la síntesis en una etapa divergente final funcionalizando los grupos periféricos con ácidos siálicos mediante la formación de tioésteres y amidas respectivamente. 28 Zanini D.; Roy, R. J. Org. Chem. 1996, 61, 7348-7354. 29 Llinares, M.; Roy, R. Chem. Commun. 1997, 2119-2120. Capítulo 1 18 N HN HN O O N H N HN O O N HN N H O O S O COOH HO HO HO OH AcHN S O COOH HO HO HO OH AcHN S O HOOC HO OH HO OH AcHN S O HOOC HO HO HO OH AcHN OH O Figura 14. Glicodendrímero basado en la N,N-bis (3-aminopropil)glicina. Otra alternativa para llevar a cabo la síntesis de glicodendrímeros es mediante el uso de una estrategia convergente, en la que se parte de azúcares simples o pequeños glicoclusters que se unen a unidades ramificadas aumentando su tamaño para finalmente conjugarse a un núcleo. La preparación de estos dendrímeros se puede llevar a cabo utilizando unidades de repetición ramificadas previamente sintetizadas de modo que permiten una construcción más rápida de grandes estructuras. Así, el dendrón de tris(hidroximetilamino)metano funcionalizado con diferentes monosacáridos peracetilados se ha unido a diferentes unidades de repetición bi o tridentadas así como a diferentes núcleos multidentados, para la síntesis de dendrímeros que presentan 9, 18 y 36 unidades de monosacárido en su periferia. La primera aproximación se realizó usando β-D-glucopiranosa 30 como carbohidrato y más tarde se extendió a la síntesis de derivados de α-D-manopiranosa (Figura 15). 31 30 (a) Ashton, P.R.; Boyd, S.E.; Brown, C.L.; Jayaraman, N.; Nepogodiev, S.A.; Stoddart, J.F. Chem. Eur. J. 1996, 2, 1115-1128. (b) Ashton, P.R.; Boyd, S.E.; Brown, C.L.; Jayaraman, N.; Stoddart, J.F. Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36, 732-735. 31 Ashton, P.R.; Hounsell, E.F.; Jayaraman, N.; Nielsen, T.M.; Spencer, N.; Stoddart, J.F.; Young, M. J. Org. Chem. 1998, 63, 3429-3437. Introducción 19 Figura 15. Síntesis convergente de glicodendrímeros de manosa. La mayoría de las síntesis de dendrímeros mencionadas hasta el momento implican la utilización de carbohidratos protegidos. Esto se debe a que los grupos hidroxilo libres pueden interferir en las reacciones de acoplamiento utilizadas en la síntesis de glicodendrímeros. Además, la naturaleza altamente polar de los azúcares los Capítulo 1 20 hacen inadecuados para la purificación mediante cromatografía en gel de sílice. Sin embargo, los grupos protectores traen asociado un aumento en el impedimento estérico que puede ser importante en sistemas de elevada generación con un gran número de carbohidratos. Para solventar este problema, Stoddart y colaboradores 32 describieron la síntesis de glicodendrímeros usando carbohidratos totalmente desprotegidos, por formación de enlaces amida entre un glicocluster desprotegido conteniendo un grupo amino y un núcleo con ésteres activados con N-hidroxisuccinimida (Figura 16). Figura 16. Síntesis de glicodendrímeros a partir de azúcares desprotegidos. Otros métodos para la derivatizacion de dendrímeros con grupos amino terminales se llevaron a cabo mediante la apertura de anillos de aldolactonas, 33 o formación de tioureas con isotiocianatos (Figura 17). 34 32 Jayaraman N.; Stoddart, J.F. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 6767-6770. 33 Aoi, K.; Itoh, K.; Okada, M. Macromolecules 1995, 28, 5391-5393. 34 Kieburg, C.; Dubber, M.; Lindhorst, T.K. Synlett 1997, 1447-1449. Introducción 21 Figura 17. Acoplamiento directo de azúcares activados como isotiocianatos (a) y glicolactonas (b) a dendrímeros que contienen grupos amino primarios en su superficie. La importancia de los glicodendrímeros se pone de manifiesto debido al gran número de aplicaciones biomédicas que se han descrito para este tipo de compuestos. Entre estas aplicaciones podemos destacar estudios de inhibición de infecciones víricas y bacterianas, erradicación de tumores por estimulación de la respuesta inmune, etc. A continuación describiremos algunos ejemplos representativos de glicodendrímeros con aplicaciones biológicas. El primer ejemplo de glicodendrímero que encontramos en la bibliografía fue publicado en 1993 por Roy y colaboradores. 35 Éste consistía en una oligolisina hiperramificada que presentaba 16 moléculas de ácido siálico. Este compuesto demostró ser un potente inhibidor de la hemoaglutinación causada por el virus de la gripe. En la Figura 18 se muestra la estructura del glicodendrón que contiene 8 moléculas de ácido siálico en su superficie. 35 Roy, R.; Zanini, D.; Meunier, S.J.; Romanowska, A.J. Chem. Commun. 1993, 1869-1872. Capítulo 1 22 S H NN H H NN H H NH NN HOH O O O O O O OO NH NH HN NH S O O O O N H H N N H S O O O O COOH HO HO HO OH AcHN O COOH HO HO HO OH AcHN O COOH HO HO HO OH AcHN HN NH S O O O O HOOC HO OH HO HO AcHN NH S HN NH HN NH HN HN O O O O O O H N H N N H H N S O O O O NH HN NH S O O O O HOOC HO OH HO HO NHAc O HOOC HO OH HO HO NHAc O HOOC HO OH HO HO NHAc HN NH S O O O O HOOC HO OH OH HO NHAc NH Figura 18. Glicodendrón que contiene 8 unidades de ácido siálico basado en una oligolisina ramificada. Este primer trabajo dio lugar a la aparición de numerosos estudios en este campo, demostrándose que los glicodendrímeros eran unas herramientas muy útiles para obtener información detallada de la interacción carbohidrato-proteína a nivel molecular. Posteriormente, Roy, Tomalia y Baker 36 prepararon un glicodendrímero empleando la cuarta generación del dendrímero comercial PAMAM derivatizado también con ácidos siálicos (Figura 19). Los estudios experimentales realizados in vivo con ratones demostraron la protección frente al virus de la gripe. En este caso, el glicodendrímero no solo mostró un incremento en la afinidad debido a la multivalencia, 36 Reuter, J.D.; Myc, A.; Hayes, M.M.; Gan, Z.; Roy, R.; Qin, D.; Yin, R.; Piehler, L.T.; Esfand, R.; Tomalia, D.A.; Baker, J.R. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 271-278. Introducción 23 sino que también facilitó la liberación de ácido siálico previniendo el proceso enzimático in vivo y disminuyendo la citotoxicidad. 37 Figura 19. 4ª generación del dendrímero PAMAM conjugado con ácido siálico. Otro ejemplo interesante lo constituyen los glicodendrímeros que presentan miméticos de GM1. La parte oligosacarídica del gangliósido GM1 (βGal1-3βGalNAc1- 4[αSia2-3]-βGal1-4Glc) (Figura 20) es responsable de la adhesión de la toxina del cólera a la superficie de las células del intestino, siendo esta interacción crucial para que se desarrolle la enfermedad. Dendrímeros basados en PPI y PAMAM han sido funcionalizados con el oligosacárido GM1 mostrando propiedades de inhibición 1000 veces superior a la del oligosacárido monovalente. 38 Además, este oligosacárido se ha unido a otro tipo de estructura dendrimérica más asequible como el ácido 3,5-bis-(2- aminoetoxi)benzoico. La afinidad mostrada por este tetrámero con respecto al monómero libre también supone una mejora muy significativa de la actividad. 39 Figura 20. Estructura oligosacarídica del gangliósido GM1 . 37 Landers, J.J.; Cao, Z.; Lee, I.; Piehler, L.T.; Myc, P.P.; Myc, A.; Hamouda, T.; Galecki, A.T.; Baker, J.R. J. Infect. Dis. 2002, 186, 1222-1230. 38 Thompson, J.P.; Schengrund, C.L. Glycoconjugate J. 1997, 14, 837-845. 39 Arosio, D.; Vrasidas, I.; Valentini, P.; Liskamp, R.M.; Pieters, R.J.; Bernardi, A. Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2113–2124. Capítulo 1 30 proteína está presente fundamentalmente en la superficie de las células dendríticas inmaduras. DC-SIGN, es una proteína transmembrana de tipo II que pertenece a la familia de las lectinas de tipo C (reconocen carbohidratos de forma Ca 2+ dependiente). Esta lectina presenta varios dominios bien diferenciados: un pequeño dominio intracelular en el extremo N-terminal, que está implicado en procesos de internalización y de señalización intracelular; un dominio transmembrana hidrofóbico; y un dominio extracelular (Figura 24). En el dominio extracelular se distinguen dos zonas bien diferenciadas, una zona denominada cuello constituido por un fragmento peptídico de 23 aminoácidos que se repite 7 veces de forma completa y otra vez más de forma incompleta, el cual es responsable de la oligomerización de la proteína (DC-SIGN es un homotetrámero). 52 En el extremo C-terminal se encuentra el dominio de lectina de tipo C, o dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) (Figura 24). El CRD es el responsable de la interacción con carbohidratos presentes en glicoproteínas de ligandos naturales como ICAM-3, ICAM-2 o glicoproteínas de patógenos como gp120 (VIH), GP1 (Ébola), etc. DC-SIGN fue descubierta y clonada por primera vez por científicos de la compañía farmacéutica Bristol Myers Squibb en 1992. 53 Pero no fue hasta el año 2000, cuando el grupo de van Kooyk redescubrió esta proteína y puso de manifiesto el papel que podría jugar en el proceso de infección del VIH. 54 aa 1-40 , N-terminal aa 41-61 Transmembrana aa 253-404 Dominio lectina tipo C aa 77-252 7.5 x (23 aa) Oligomerización Internalización Reconocimiento de carbohidratos aa 1-40 , N-terminal aa 41-61 Transmembrana aa 253-404 Dominio lectina tipo C aa 77-252 7.5 x (23 aa) Oligomerización Internalización Reconocimiento de carbohidratos Figura 24. Dominios del receptor DC-SIGN. 52 Feinberg, H.; Guo, Y, Mitchel, D.A.; Drickamer, K.; Weis, W.I. J. Biol. Chem. 2005, 280, 1327- 1335. 53 Curtis, B.M.; Scharnowski, S.; Watson, A.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 8356-8360. 54 (a) Geijtenbeek, T.B.H.; Torensma, R.; van Vliet, S.J.; van Duijnhoven, G.C.F.; Adema, G.J.; van Kooyk, Y.; Figdor, C.G. Cell 2000, 100, 575-585. (b) Geijtenbeek, T.B.H.; Kwon, D.S.; Torensma, R.; van Vliet, S.J.; van Duijnhoven, G.C.F.; Middel, J.; Cornelissen, I.L.M.H.A.; Nottet, H.S.L.M.; KewalRamani, V.N.; Littman, D.R.; Figdor, C.G.; van Kooyk, Y. Cell 2000, 100, 587-597. Introducción 31 Van Kooyk y col. demostraron que el VIH podía usar, a través de la interacción de la glicoproteína gp120 de la superficie viral con el receptor DC-SIGN, el mecanismo de defensa descrito anteriormente, como ruta para poder infectar las células T del sistema inmunitario. Sorprendentemente (no hay una explicación clara a este hecho), tras la interacción con el receptor en las DCs, el virus no es degradado sino que en una forma perfectamente infectiva viaja junto con las DCs hasta alcanzar los nódulos linfáticos donde entra en contacto con las células T. En otras palabras, el virus del SIDA es capaz de “secuestrar” este mecanismo de defensa del organismo para su propio beneficio y poder alcanzar así sus células diana (células T) del sistema inmune. A partir de este descubrimiento, numerosos grupos de investigación han demostrado que el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) de DC-SIGN interacciona con multitud de proteínas altamente glicosiladas como las presentes en la superficie de muchos patógenos además del VIH. DC-SIGN interacciona con glicoproteínas de virus (VIH-1 54 y VIH-2, 55 SIV-1, 56 Ébola, 57 Hepatitis C, 58 SARS, 59 Citomegalovirus 60 o Dengue 61 ), bacterias (Helicobacter pylori, 62 Mycobacterium tuberculosis 63 ), 55 Pöhlmann, S.; Soilleux, E.J.; Baribaud, F.; Leslie, G.J.; Morris, L.S.; Trowsdale, J.; Lee, B., Coleman, N.; Doms, R.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 2670-2675. 56 Lee, B.; Leslie, G.; Soilleux, E.; O'Doherty, U.; Baik, S.; Levroney, E.; Flummerfelt, K.; Swiggard, W.; Coleman, N.; Malim, M.; Doms, R.W. J. Virol. 2001, 75, 12028-12038. 57 Álvarez, C.P.; Lasala, F.; Carrillo, J.; Muñiz, O.; Corbí, A.L.; Delgado, R. J. Virol. 2002, 76, 6841-6844. 58 Pöhlmann, S.; Zhang, J.; Baribaud, F.; Chen, Z.; Leslie, G.J.; Lin, G.; Granelli-Piperno, A.; Doms, R. W.; Rice, C.M.; McKeating, J.A. J. Virol. 2003, 77, 4070-4080. 59 Marzi, A.; Gramberg , T.; Simmons, G.; Möller, P.; Rennekamp, A.J.; Krumbiegel, M.; Geier, M.; Eisemann, J.; Turza, N.; Saunier, B.; Steinkasserer, A.; Becker, S.; Bates, P.; Hofmann, H.; Pöhlmann, S. J. Virol. 2004, 78, 12090-12095. 60 Halary, F.; Amara, A.; Lortat-Jacob, H.; Messerle, M.; Delaunay, T.; Houlès, C.; Fieschi, F.; Arenzana-Seisdedos, F.; Moreau, J. F.; Déchanet-Merville, M.J. Immunity 2002, 17, 653-664. 61 Navarro-Sanchez, E.; Altmeyer, R.; Amara, A.; Schwartz, O.; Fieschi, F.; Virelizier, J.L.; Arenzana-Seisdedos, F.; Desprès, P. EMBO rep. 2003, 4, 723–728. 62 Bergman, M.P.; Engering, A.; Smits, H.H.; van Vliet, S.J.; van Bodegraven, A.A.; Wirth, H.P.; Kapsenberg, M.L.; Vandenbroucke-Grauls, C.M.; van Kooyk, Y.; Appelmelk, B.J. J. Exp. Med. 2004, 200, 979-990. 63 Tailleux, L.; Schwartz, O.; Herrmann, J.L.; Pivert, E.; Jackson, M.; Amara, A.; Legres, L.; Dreher, D.; Nicod, L.P.; Gluckman, J.C.; Lagrange, P.H.; Gicquel, B.; Neyrolles, O. J. Exp. Med. 2003, 197, 121-127. Capítulo 1 32 hongos (Candida albicans 64 ), y parásitos (Schistosoma mansoni, 65 Leishmania pifanoi 66 ) entre otros. Este amplio espectro de patógenos que son reconocidos por DC-SIGN ha contribuido a que se considere a esta lectina como un receptor universal de patógenos. 67 Las glicoproteínas de estos patógenos que son reconocidas por DC-SIGN contienen, fundamentalmente, estructuras oligosacarídicas que presentan manosas y fucosas como parte de los N-glicanos unidos al aminoácido Asn presente en diferentes posiciones de estás glicoproteínas. La estructura de high mannose (Figura 25), constituida por Man 9 GlcNAc 2 como epítopo principal, se considera como uno de los ligandos que interaccionan de forma más fuerte con esta lectina. DC-SIGN reconoce tanto estructuras ramificadas con un mínimo de tres unidades de manosa (trisacáridos del tipo Manα1-3[Manα1-6]Man indicado en color azul en la Figura 25) como estructuras con dos unidades de manosa terminales (disacáridos Manα1-2Man indicado en color rojo en la Figura 25). Además, el reconocimiento específico de diferentes estructuras oligosacarídicas por DC-SIGN parece que depende del lugar que ocupe el carbohidrato en la glicoproteína. 68 Parece evidente que la disposición espacial de este “cluster” de manosas ramificadas presentes en distintos enclaves de la proteína viral es crítico en la interacción selectiva multivalente con DC-SIGN. 64 Cambi, A.; Gijzen, K.; de Vries, J.M.; Torensma, R.; Joosten, B.; Adema, G.J.; Netea, M.G.; Kullberg, B.J.; Romani, L.; Figdor, C.G. Eur. J. Immunol. 2003, 33, 532-538. 65 van Die, I.; van Vliet, S.J.; Nyame, A.K., Cummings, R.D.; Bank, C.M.; Appelmelk, B.; Geijtenbeek, T.B.; van Kooyk, Y. Glycobiology 2003, 13, 471-478. 66 Colmenares, M.; Puig-Kröger, A.; Pello, O.M.; Corbí, A.L.; Rivas, L. J. Biol. Chem. 2002, 277, 36766-36769. 67 (a) van Kooyk, Y.; Geijtenbeek, T.B. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 697-709. (b) Pöhlmann, S.; Baribaud, F.; Doms, R.W. Trends Immunol. 2001, 22, 643-646. 68 Mitchell, D. A.; Fadden, A. J.; Drickamer, K. J. Biol. Chem. 2001, 276, 28939-28945. Introducción 33 O O OO O O O O OOO O O OOO O O O O O OH O HO HO HO HO NHAc NHAc HO HO HO HO HO HO HO HO HO HO OH HO HO HO OH HO HO HO HO HO HO HO OH HO OH HO HO Asn Figura 25. Estructura del oligosacárido high mannose. La lectina DC-SIGN tiene un dominio intracelular que está implicado en el proceso de internalización de dicha proteína. Cuando dicho receptor interacciona con un ligando específico, se produce un proceso de internalización que introduce el virus (patógeno) dentro de la célula dendrítica. Posteriormente, estas células migran hacia los nódulos linfáticos al mismo tiempo que se van produciendo una serie de procesos morfológicos, estructurales y bioquímicos que van a permitir desencadenar una respuesta inmune frente a dicho patógeno o antígeno. El descubrimiento de esta nueva lectina implicada en procesos de inmunoregulación fue un hecho destacado que tiene un gran interés debido a la potencial aplicación de esta lectina como diana para el desarrollo de agentes terapéuticos. 69 A continuación se comentaran algunos de los sistemas multivalentes de carbohidratos que han sido desarrollados para inducir una respuesta inmune mediante la interacción con el receptor DC-SIGN. 69 (a) Zhou, T.; Chen, Y.; Hao, L.; Zhang, Y. Cell. Mol. Immunol. 2006, 3, 279-283. (b) van Kooyk, Y. Biochem. Soc. Trans. 2008, 36, 1478-1481. (c) den Dunnen, J.; Gringhuis, S.I.; Geijtenbeek, T.B.H. Cancer Immunol. Immunother. 2009, 58, 1149-1157. (d) Geijtenbeek, T.B.H.; den Dunnen, J.; Gringhuis, S.I. Future Microbiol. 2009, 4, 879-890. (e) Gringhuis, S.I.; Dunnen, J.; Litjens, M.; Vlist, M.; Geijtenbeek, T.B.H. Nat. Immunol. 2010, 10, 1081-1089. (f) Dunnen, J.; Gringhuis, S.I.; Geijtenbeek, T.B.H. Immunol. Lett. 2010, 128, 12-16. Capítulo 1 34 1.5.2. Activación de la respuesta inmune por interacción con el receptor DCSIGN. A finales de los años 90 se publicaron las primeras evidencias de que epítopos (o péptidos inmunogénicos) manosilados estimulaban la correspondiente respuesta inmune por la interacción con Receptores de Manosa (MR) de células dendríticas. De manera simultánea, Pieters 70 y Koning 71 demostraron que proteínas o péptidos inmunogénicos manosilados inducían una fuerte estimulación de células T. Pieters y colaboradores pusieron de manifiesto que la proteína BSA (albumina de suero bovino) manosilada (BSA-man) es reconocida por receptores de manosa, internalizándose y localizándose en compartimentos intracelulares para ser degradada y presentada en forma de complejos MHC de clase II. El reconocimiento de BSA-man a través de receptores de manosa se incrementó 100 veces con respecto a la BSA no manosilada. Koning y colaboradores realizaron un estudio complementario empleando diferentes péptidos antigénicos manosilados y BSA, concluyendo que la manosilacion podía provocar una mejora de 200-10.000 veces en la actividad por estimulación de células T. Estos resultados mostraron por primera vez la potencial aplicación de antígenos manosilados usando células dendríticas como vehículos para su presentación. Hay algunos ejemplos interesantes previos al descubrimiento de DC-SIGN como el descrito por Grandjean y colaboradores 72 en los que un receptor de manosa se consideraba como vía de entrada al interior celular. Estos autores emplearon una estrategia modular para la unión de manosas y un péptido a una plataforma peptídica basada en lisinas (Figura 26). Este fue el primer ejemplo que combinaba una presentación multivalente de manosas y un péptido antigénico, el cual podría ser usado para inducir una respuesta inmune mediada por células dendríticas. Estudios de internalización en modelos celulares que presentaban receptores de manosa, de estos cluster (basados en lisina funcionalizados con manosa, quinina o ácido siquímico 70 Engering, A.J.; Cella, M.; Fluitsma, D.; Brockhaus, M.; Hoefsmit, E.C.M.; Lanzavecchia, A.; Pieters, J. Eur. J. Immunol. 1997, 27, 2417-2425. 71 Tan, M.C.A.A.; Mommaas, A.M.; Drijfhout, J.W. y col. Eur. J. Immunol. 1997, 27, 2426-2435. 72 Grandjean, C.; Rommens, C.; Gras-Masse, H.; Melnyk, O. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 1068-1072. Introducción 35 marcados fluorescentemente) mostraron la co-localización de los compuestos dendríticos y de los receptores de manosa, así como el proceso de internalización. 73 SN H H NN H H NN HN HN H X OOO NH O NH O NH O O NH NH O NH S S O O O S O H NN H S HN S NH HN SHN S O O O O O O O HO HO HO O HO O HO HO HO O HO O HO HO OH O OH O HO HO OH O OH O HO HO OH O OH OOH OH OH OH OOOH OH OH OH O OOH OH OH OH O H NN H PKYVKQNTLKLAT-NH2 O X = [(ClCH2C=O)-Lys(ClCH2C=O)]4-Lys2-Lys-Lys- Ala-HN-(CH2)3-HN H O O SH O HO HO OH O OH H2NN H PKYVKQNTLKLAT-NH2 O 1) 2) DMF/citrato-Tampon fosfato pH 5.2 K2CO3, pH 8-8.5, t.a. Figura 26. Síntesis de una estructura dendrítica manosilada basada en una plataforma peptídica de lisinas conjugada con un péptido inmunogénico. Sin embargo, la mayoría de los trabajos descritos están basados en la glicosilación de proteínas antigénicas para ser capturadas por APCs. En todos estos ejemplos hay una ausencia completa del control sobre el nivel de manosilación. Uno de los primeros ejemplos fue descrito por Roche y colaboradores. 74 Estos autores usaron BSA conjugada con varias copias (25 unidades) de manosa, fucosa o lactosa (como control negativo) demostrando la internalización y el tráfico de estos glicoconjugados 73 Grandjean, C.; Angyalosi, G.; Loing, E.; Adriaenssens, E.: Melnyk, O.; Pancré, V.; Auriault, C.; Gras-Masse, H. ChemBioChem 2001, 2, 747-757. 74 Frison, N.; Taylor, M.E.; Soilleux, E.; Bousser, M.T.; Mayer, R.; Monsigny, M.; Drickamer, K; Roche, A.C. J. Biol. Chem. 2003, 278, 23922-23929. Capítulo 1 36 tras la interacción mediada por lectinas tipo C (fundamentalmente receptores de manosa y DC-SIGN). Por otra parte, estos autores usaron también pequeños péptidos basados en lisina para conjugar entre 2 y 6 copias de diferentes azúcares incluyendo dimanósidos lineales, Lewis a, Lewis b o lewis x (Figura 27). Los experimentos in vitro demostraron una endocitosis, dependiente del receptor, de los glicoconjugados manosilados y fucosilados. Los carbohidratos presentes en estos glicoclusters modulaban la selectividad de la lectina tipo C. Así, los glicoconjugados que presentaban unidades de tipo Manα1,6Man interaccionaban fundamentalmente con receptores de manosa, mientras que los glicoconjugados de Lewis lo hacían más selectivamente con el receptor DC-SIGN. Figura 27. Glicodendrón basado en oligolisinas de Manα1,6Man. Estos estudios fueron completados posteriormente usando un péptido consistente en 25 aminoácidos del antígeno de un melanoma elongado en su extremo N-terminal con cuatro lisinas y glicosilado con cuatro copias de Manα1,6Man o una mezcla de Lewis a y Lewis x o bien lactosa como control negativo (Figura 28). 75 Las células dendríticas indujeron una eficiente internalización de estos conjugados (con 75 Srinivas, O.; Larrieu, P.; Duvenger, E. ; Boccaccio, C.; Bousser, M.T.; Monsigny, M.; Fonteneau, J.F.; Jotereau, F.; Roche, A.C. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 1547-1554. Introducción 37 excepción de los lactosil derivados). Mediante el uso de biosensores con detección por Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) se demostró la selectividad del receptor DC-SIGN por los glicoconjugados del derivado de dimanosa y Lewis x mientras los receptores de manosa reconocieron fundamentalmente derivados de manosa. Los glicoconjugados de manosa o de Lewis indujeron una clara activación de linfocitos citotóxicos dependiente del complejo MHC clase I. Figura 28. A) Oligosacáridos usados para preparar los glicosintones. B) Aproximación sintética en la preparación de glicosintones. C) Síntesis de glicopéptidos antigénicos. Capítulo 1 38 Chang y colaboradores 76 han descrito un método directo basado en la síntesis en fase sólida para preparar dendrones de polilisina manosilados. La 4ª generación, que presentaba 16 copias de manosa en su superficie, fue marcado fluorescentemente (Figura 29) y se evaluó el proceso de internalización vía endocitosis. Mediante microscopía confocal pudo observarse que el glicodendrímero se acumuló dentro de vesículas en las células dendríticas. La internalización a través de receptores de manosa fue demostrada mediante el empleo de controles negativos. Figura 29. Dendrón monodisperso de 4ª generación basado en polilisina con 16 manosas. Frisch y colaboradores 77 realizaron una aproximación multivalente que implicaba la utilización de mono, di, y tetramanosil derivados de moléculas anfifílicas que contenía una cola lipofílica (Figura 30). Éstos fueron anclados dentro de liposomas preparados mediante una combinación de fosfolípidos y colesterol. La internalización en células dendríticas fue evaluada usando liposomas fluorescentes. El contenido de manosa de estos liposomas resultó jugar un papel muy 76 Kantchev, E.A.B.; Chang, C.C.; Cheng, S.F.; Roche, A.C.; Chang, D.K. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 1377-1385. 77 Espuelas, S.; Thumann, C.; Heurtault, B.; Schuber, F.; Frisch, B. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2385-2393. Introducción 39 importante en el proceso de internalización. Este hecho confirmó la necesidad de una presentación multivalente de manosas para el diseño de sistemas que utilizan como diana las células dendríticas. El reconocimiento de liposomas manosilados fue inhibido por manano, demostrando una endocitosis vía receptores específicos de manosa. Por tanto, estos liposomas manosilados podrían ser considerados como unos vehículos apropiados para la presentación y liberación de fármacos o antígenos en células dendríticas. Esta estrategia podría ser aprovechada una respuesta inmune que podría emplearse para el desarrollo de vacunas. Figura 30. Mono, di y tetramanosilderivados usados para preparar liposomas. Hacohen y colaboradores 78 han modificado ovalbumina (OVA) con una selección de oligosacáridos dirigidos a la diana DC-SIGN en DCs para la presentación de antígenos y con la posibilidad de modular la señalización de células dendríticas. OVA fue funcionalizado con un grupo maleimida posteriormente acoplado a una batería de oligosacáridos (Figura 31) que presentaban un espaciador en la posición anomérica con un grupo tiol. 78 Adams, E.W.; Ratner, D.M.; Seeberger, P.H.; Hacohen, N. ChemBioChem 2008, 9, 294-303. Antecedentes y objetivos 47 2. Antecedentes y objetivos. 2.1. Antecedentes del Grupo de Investigación. Anteriormente al trabajo desarrollado en la presente memoria, en nuestro grupo de investigación se habían preparado polímeros glicodendríticos de manosa uniendo unidades de este carbohidrato a una estructura polimérica comercial altamente ramificada a través de un espaciador. Estos polímeros denominados Boltorn están basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico como unidad de crecimiento y en el 2,2-bis(hidroximetil)-1,3-propanodiol o pentaeritritol como núcleo central de crecimiento. Existen diferentes generaciones de este polímero dendrítico que se encuentran disponibles comercialmente, lo que ha permitido acceder a diversos polímeros con un número diferente de grupos hidroxilo en la superficie para ser funcionalizados: segunda generación (2G), Boltorn H20 (16 OH); tercera generación (3G), Boltorn H30 (32 OH); y cuarta generación (4 G), Boltorn H40 (64 OH) (Figura 34). Capítulo 2 48 Figura 34. Polímeros dendríticos Boltorn de segunda (BH20) y tercera (BH30) generación. Estos polímeros comerciales se han utilizado fundamentalmente en la industria como aditivos en pinturas y como superficies protectoras para plásticos. Sólo se había descrito una excepción a estas aplicaciones, su uso como soporte sólido para la síntesis de oligosacáridos en disolución. 83 Dichos sistemas nunca habían sido considerados como soporte para una presentación multivalente de ligandos con importancia biológica. En nuestro grupo de investigación se ha trabajado fundamentalmente con los polímeros de segunda (BH20) y tercera (BH30) generación. Para la preparación de los sistemas multivalente basados en los polímeros Boltorn se activó, en primer lugar, la superficie de dichos polímeros mediante la introducción de grupos carboxílo. Este paso proporcionó un soporte dendrítico funcionalizado con ácidos carboxílico terminales que permitió, en una segunda etapa, la introducción de glicoconjugados a través de la formación de un enlace amida, como se indica en el Esquema 1. 83 Kantchev, A.S.; Parquette, J. R.; Tetrahedron Lett. 1999, 40, 8049-8053. Antecedentes y objetivos 49 O O O OH OH O O O H NOR R= Man, n=16 n=32 R= H n=16 n=32 nn BH20sucMan BH30sucMan BH20sucL BH30sucL anhídrido succínico, DMAP, Piridina, 50 ºC, 15 h, cuant. HOBt, DIC 17 ó HOCH2CH2NH2 (1.2 eq. por OH) 24 h, 60-88% O OH HO HO OH ONH2 17 n Esquema 1. Preparación de los sistemas dendríticos BH20sucL, BH20sucMan, BH30sucL y BH30sucMan. Como primera aproximación se había utilizado como azúcar un monosacárido, la α-D-manopiranosa. Para poder unir el azúcar al soporte multivalente fue necesario funcionalizar dicha manosa en la posición anomérica con un espaciador que presentara un grupo amino terminal (compuesto 17) como se representa en el Esquema 1. Una vez preparados estos compuestos, se evaluó su solubilidad en medios fisiológicos y su toxicidad frente a diferentes líneas celulares demostrándose su viabilidad para aplicaciones biológicas. 84 También se confirmó que las unidades de manosa presentes en la superficie del polímero dendrítico Boltorn eran reconocidas por una lectina modelo (Lens Culinaris), que reconoce manosa y además, este proceso de reconocimiento transcurría de forma multivalente, formándose agregados que precipitaban en el medio de reacción. 84 Los primeros estudios biológicos que se realizaron con estos sistemas multivalentes fueron los experimentos de inhibición de la interacción del receptor DCSIGN con la glicoproteína GP1 del virus del Ébola. 85 Estos experimentos se realizaron en el Hospital 12 de Octubre de Madrid en colaboración con el doctor Rafael Delgado. En estos experimentos se utilizaron células Jurkat capaces de expresar DC-SIGN de forma estable y se determinó la cantidad de proteína GP1 unida al receptor en presencia y en ausencia de los inhibidores glicodendríticos, mediante la utilización de anticuerpos 84 Arce, E.; Nieto, P.M.; Díaz, V.; García-Castro, R.; Bernad, A.; Rojo, J. Bioconjugate Chem., 2003, 14, 817-823. 85 (a) Lasala, F.; Arce, E.; Otero, J.R.; Rojo, J.; Delgado, R. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 3970-3972. (b) Rojo, J.; Delgado, R. J. Antimicrob. Chemother. 2004, 54, 579-581. Capítulo 2 50 marcados fluorescentemente. En este experimento se demostró que al menos la 3ª generación con 32 manosas en la superficie (BH30sucMan) inhibía la interacción entre DC-SIGN y GP1. Posteriormente, se realizaron experimentos de inhibición de la infección en cis (directa) y en trans (a través de un intermedio) con un modelo artificial del virus del Ébola. Los resultados obtenidos indicaban que los controles BH20sucL, BH30sucL producían una pequeña disminución de la infección atribuida a interacciones no selectivas de estos compuestos con la superficie celular. En el caso de BH20sucMan también se observó una pequeña disminución de la infección. Por el contrario, cuando se usó BH30sucMan como inhibidor se observó una disminución de la infección muy significativa, calculándose un IC 50 de 0.3 µM (Figura 35). También se llevaron a cabo experimentos con el sistema monovalente O-metil-α-D-manopiranosido (ManOMe) observándose un IC 50 del orden 1 mM. Estos resultados indicaban que pasar de un sistema monovalente (ManOMe), al sistema multivalente con 32 manosas (BH30sucMan) suponía un incremento de la actividad de 3000 veces, lo que puso de relieve un claro efecto multivalente. 0 0 20 40 60 80 100 BH30sucMan BH20sucMan BH30sucL BH20sucL 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 Inhibidor [M] % infección Inhibidor 0 0 20 40 60 80 100 BH30sucMan BH20sucMan BH30sucL BH20sucL 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 Inhibidor [M] % infección Inhibidor 0 0 20 40 60 80 100 BH30sucManBH30sucMan BH20sucManBH20sucMan BH30sucLBH30sucL BH20sucLBH20sucL 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 Inhibidor [M] % infección Inhibidor Figura 35. Resultados de inhibición de la infección en cis. Posteriormente, se realizaron los experimentos de infección en trans. Este es un experimento más complicado donde una de las líneas celulares (K562 que expresa DCSIGN) actúa como transportadora del patógeno a una segunda línea celular (HeLa) Antecedentes y objetivos 51 donde se produce la infección. En ausencia de inhibidor se observó una infección en las células HeLa correspondiente al 100%. El mismo valor se obtuvo con el dendrímero control BH30sucL. Sin embargo, el compuesto BH30sucMan dio lugar de nuevo a una clara inhibición en el proceso de infección en trans de forma similar a como lo hizo en cis. Además de estos estudios, también se llevaron a cabo estudios de interacción de sistemas glicodendríticos con DC-SIGN utilizando biosensores con detección por Resonancia del Plasmón de Superficie (SPR). Para llevar a cabo estos experimentos se utilizaron dos modelos diferentes de la lectina DC-SIGN: el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CDR) monomérico y el dominio extracelular (ECD) soluble tetramérico. Estos dos modelos permitieron estudiar el papel de la multivalencia desde el punto de vista del receptor, debido a que el CRD posee únicamente un centro de reconocimiento de carbohidratos mientras que el ECD posee cuatro centros de reconocimiento, pudiendo dar lugar a interacciones multivalentes. Las proteínas (CRD y ECD de DC-SIGN) utilizadas en estos estudios se obtuvieron por sobreexpresión de los correspondientes plásmidos en E. coli en el laboratorio del Prof. Franck Fieschi. 60 En los experimentos se SPR se utilizaron tres tipos diferentes de superficies con las dos proteínas (Figura 36). Así, en este estudio se pudo observar que las estructuras dendríticas control (BH20sucL y BH30sucL) no presentaban una interacción apreciable con ninguna de las tres superficies, esto mismo fue observado con el polímero dendrítico de segunda generación con 16 manosas (BH20sucMan). Sin embargo, el compuesto dendrítico con 32 manosas (BH30sucMan) interaccionó de forma clara con la superficie ECD de alta densidad. 86 Este dato demostró que la alta densidad y la proximidad entre dominios de CRD eran esenciales para que tuviera lugar una interacción multivalente. 60 Halary, F.; Amara, A.; Lortat-Jacob, H.; Messerle, M.; Delaunay, T.; Houlès, C.; Fieschi, F.; Arenzana-Seisdedos, F.; Moreau, J. F.; Déchanet-Merville, M.J. Immunity 2002, 17, 653-664. 86 Tabarini, G.; Reina, J. J.; Ebel, C.; Vivés, C.; Lortar-Jacob, H.; Rojo, J.; Fieschi, F. FEBS Lett. 2006, 580, 2402-2408. Capítulo 2 52 Analito: BH30sucMan Ligangos Respuesta (RU) Tiempo (s) Analito: BH30sucMan Ligangos Analito: BH30sucMan Ligangos Respuesta (RU) Tiempo (s) Figura 36. A) Representación esquemática de las tres superficies funcionalizadas interaccionando con BH30sucMan; B) Sensograma del proceso de interacción de BH30sucMan con las tres superficies . Posteriormente, se empleó la superficie de alta densidad ECD-HD y diferentes concentraciones de BH30sucMan para la obtención de los sensogramas (Figura 37) a partir de los cuales se pudo deducir que dicha interacción era estable y además se obtuvo una constante de afinidad aparente del orden submicromolar. Respuesta (RU) Tiempo (s) Respuesta (RU) Tiempo (s) Figura 37. Sensogramas de la interacción DC-SIGN con BH30sucMan a diferentes concentraciones. El posterior estudio de la interacción de DC-SIGN con la glicoproteína viral gp120 del VIH en competición con los compuestos glicodendríticos preparados puso en evidencia que los compuestos dendríticos BH30sucL, BH20sucL y BH20sucMan no eran capaces de inhibir la asociación entre el receptor DC-SIGN y gp120 (Figura 38B) mientras que el compuesto BH30sucMan (Figura 38A) era capaz de inhibir dicha interacción con una IC 50 de 50 µM. Antecedentes y objetivos 53 Respuesta (RU) Tiempo (s) Respuesta (RU) Tiempo (s) Respuesta (RU) Tiempo (s) Respuesta (RU) Tiempo (s) Figura 38. Inhibición de la interacción DC-SIGN/gp120 usando una superficie de ECD de alta densidad. A) BH30sucMan; B) BH30sucL a las siguientes concentraciones 0, 7.5, 14, 28, 57, 85, 128 µM. Estos experimentos permitieron estudiar en detalle la interacción de las estructuras glicodendríticas con una superficie funcionalizada con DC-SIGN demostrándose que para observar una fuerte interacción se requería al menos 32 manosas y una superficie con una alta densidad de DC-SIGN. También se confirmó que la interacción era calcio y carbohidrato dependiente. A la vista de los resultados obtenidos en nuestro grupo de investigación se deduce que, la tercera generación del polímero dendrítico Boltorn presenta una estructura y tamaño adecuado para interaccionar con el receptor DC-SIGN y es una buena plataforma para el diseño de sistemas multivalentes de carbohidratos. 2.2. Objetivos. El objetivo fundamental del trabajo que se presenta es la preparación de sistemas glicodendríticos como vehículos para internalizar de forma selectiva moléculas de interés biológico en dianas celulares. Para ello utilizaremos la capacidad del receptor DC-SIGN para internalizar compuestos en las células dendríticas mediante el reconocimiento de carbohidratos, fundamentalmente manosas. Para alcanzar este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos especificos como parte del trabajo de la presente Memoria: Capítulo 2 54 1. Preparación de sistemas multivalentes que presenten carbohidratos y una posición funcionalizada de forma diferente que nos permita la posterior conjugación de moléculas de interés biológico. 2. Análisis de la interacción con el receptor DC-SIGN utilizando biosensores con detección de Resonancia del Plasmón de Superficie de los sistemas glicodendríticos preparados. 3. Estudios de internalización de los sistemas glicodendríticos preparados. 4. Estudios de conjugación con biomoléculas. Capítulo 3 Síntesis de glicodendrones basados en el ácido bis- MPA Capítulo 3 62 Posteriormente Malkoch y colaboradores, 91 emplearon como agente acilante el anhídrido del ácido isopropiliden-2,2-bis-(hidroximetil)propiónico para realizar la síntesis divergente de dendrones cuyo punto focal presentaba distintos grupos funcionales los cuales eran sensibles a la hidrogenolisis. Estos autores, utilizan la misma estrategia de crecimiento que la empleada en el caso del anhídrido del ácido benciliden- 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico y la posterior desprotección de los grupos isopropilidenacetal es llevada a cabo mediante el empleo de una resina ácida. Más adelante, en 2005, Sharpless y colaboradores 92 describieron la primera síntesis de glicodendrones a partir de este tipo de estructuras. Para ello, sintetizaron dendrones de 1ª a 4ª generación y funcionalizaron los grupos hidroxilo de su superficie con el anhídrido del ácido 4-pentinóico. De este modo, mediante el uso de una reacción de cicloadición 1,3 dipolar se introducía en la superficie de los distintos dendrones el monosacárido 2-azidoetil-α-D-manopiranósido. En este ejemplo particular, la posición focal del dendrón se funcionalizó con diferentes cumarinas lo que condujo a “compuestos duales” que combinaban reconocimiento con detección, es decir, en una misma molécula, contaban con un grupo que facilitaba su detección, un fluoróforo en este caso, y grupos que eran específicos para un receptor, en este caso los carbohidratos. Estas propiedades hacían de estos sistemas modelos muy interesantes para la identificación de diferentes procesos que transcurrían vía interacción multivalente. En la siguiente figura se recoge la estructura de uno de los glicodendrones preparados. 91 Malkoch, M.; Malmström, E.; Hult, A. Macromolecules 2002, 35, 8307-8314. 92 Malkoch, M. ; Hunt, J.N.; Vestberg, R. ; Katgrad, E.; Finn, M.G.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Hawker, C.J. Chem. Commun. 2005, 43, 5775. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 63 Figura 39. Estructura del primer glicodendrón descrito basado en el ácido bis-MPA. 3.1. Síntesis divergente de dendrones basados en el ácido 2,2-bis- (hidroximetil)propiónico empleando como núcleo TRIS. 3.1.1. Síntesis del soporte dendrítico. Como primera aproximación, para realizar la síntesis de los dendrones utilizando una metodología divergente se empleó como núcleo de crecimiento el trishidroximetilaminometano o TRIS (1) (Esquema 5). Este núcleo presenta una posición diferenciada, el grupo amino, que será protegido durante la síntesis y posteriormente será utilizado para introducir diferentes moléculas de interés biológico. Para la preparación de las diferentes generaciones del dendrón se ha utilizado como unidad de crecimiento el anhídrido del ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico (5). En el Esquema 5 se muestra el esquema retrosintético de la síntesis de un dendrón de tercera generación basado en el núcleo TRIS. Capítulo 3 64 Esquema 5. Esquema retrosintético de la preparación de un dendrón de tercera generación. La síntesis del anhídrido 5 se ha llevado a cabo según el procedimiento descrito en la bibliografía. 89 Así, en primer lugar se realizó la protección del diol del ácido 2,2- bis(hidroximetil)propiónico (3) con benzaldehído dimetilacetal en presencia de una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico (p-TsOH), en acetona anhidra. Posteriormente, se realizó la autocondesación del ácido benciliden-2,2-bis(hidroximetil) propiónico (4) usando DCC como activador del ácido carboxílico (Esquema 6). La formación del anhídrido 5 se confirmó por el análisis de su espectro de 13 C-RMN donde se observó la variación del desplazamiento químico del carbono carbonílico, pasando de 178.7 ppm en el compuesto 4 a 169.2 ppm en el anhídrido 5, ya que el resto de señales en los espectros de 1 H-RMN y 13 C-RMN aparecen a desplazamientos químicos muy parecidos debido a la similitud de las moléculas. O O O Ph O O O Ph O O O O PhHO OH OH O HO 345 DCC, DMAP Ph OMe OMe p-TsOH Acetona 64% CH2Cl2 89% Esquema 6. Síntesis del anhídrido 5. Una vez preparado el anhídrido 5 que se va a utilizar como unidad de crecimiento, fue necesario proteger el grupo amino presente en el núcleo de crecimiento 1. Esta protección se llevo a cabo empleando Boc 2 O en presencia de Et 3 N, dando lugar al intermedio 2 (Esquema 7). La protección del grupo amino se confirmó en el espectro de 1 H-RMN por la señal característica del metilo del grupo Boc a 1.26 89 Ihre, H.; Padilla, O.L.; Fréchet, J.M.J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5908-5917. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 65 ppm. Hemos de destacar que las condiciones empleadas en esta reacción mejoran sensiblemente las condiciones descritas hasta ahora en la bibliografía. 93, 94 O O O BocHN OO O O O O P h Ph O OO Ph OH BocHN HO OH OH H 2 N OH OH OH OH O BocHN OO O OH OH O HO HO O O O O BocHN OO OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O Ph Ph Ph Ph Ph Ph O O O BocHN OO OO O O O O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O Ph O O Ph O O Ph O O O Ph O O OO Ph O O O Ph O O O Ph O O O Ph O OO Ph O O O Ph O O O Ph O O OPh O 1 6 27 8 O O O BocHN OO OO O OH OH O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O HO HO OH OH O OH OH O OH OHO OH OH O OH OH O HO HO O HO HO O O HO HO O OH OH O OH OH O O O O BocHN OO OOH OH OH OH O O O O O OH OH OH OH O O O OO HO HO HO HO O O 10 11 H 2 /Pd (C) CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) 99% Boc 2 O, Et 3 N DMF, 84% 5, DMAP Piridina/CH 2 Cl 2 92% H 2 /Pd (C) CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) 99% 5, DMAP Piridina/CH 2 Cl 2 90% H 2 /Pd (C) CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) 99% 5, DMAP Piridina/CH 2 Cl 2 85% 9 Esquema 7. Síntesis divergente de los dendrones de 1ª (7), 2ª (9) y 3ª (11) generación basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico. 93 Seto, C.T.; Mathias, J.P.; Whitesides, G.M. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 1321-1329. 94 Kang, J.H.; Chung, H.E.; Kim, S.Y.; Kim, Y.; Lee, J.; Lewin, N.E.; Pearce, L.V.; Blumberg, P.M.; Marquez, V.E. Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 2529-2539. Capítulo 3 66 Una vez protegido el grupo amino del núcleo de crecimiento 1, los dendrones se construyeron paso a paso mediante la repetición de la secuencia de reacciones que se comenta a continuación (acoplamiento y desprotección), empleando las condiciones de reacción descritas en la bibliografía para obtener las diferentes generaciones de dendrones (Esquema 7). 89 El compuesto 2 se hizo reaccionar con el anhídrido 5 (1.35 equivalentes por enlace formado) en una mezcla diclorometano/piridina en presencia de una cantidad catalítica de dimetilaminopiridina (DMAP) dando lugar al dendrón de primera generación protegido 6 con un rendimiento excelente. La esterificación de los tres grupos hidróxilo se confirmó por 1 H-RMN donde aparecen nuevas señales, características del monómero 4, (7.28-7.46, 5.45, 4.62, 3.63 y 0.96 ppm) cuya integración concuerda exactamente con la entrada de tres unidades de dicho monómero. Adicionalmente, en el espectro de masas se observó exclusivamente la señal correspondiente al ión molecular, m/z = 856.3 [M+ Na] + , lo que confirma la entrada de tres unidades de monómero 4. Estos análisis demuestran la monodispersidad de los compuestos sintetizados. En una segunda etapa, se llevó a cabo la desprotección de los grupos hidroxilo mediante una hidrogenación con paladio sobre carbono como catalizador, en una mezcla diclorometano/metanol a temperatura ambiente. De este modo, se obtuvo la primera generación de nuestro sistema multivalente 7 con buenos rendimientos. La eliminación del grupo protector se confirmó por la desaparición en el espectro de 1 H- RMN de todas las señales aromáticas correspondientes a los fenilos del benciliden acetal. Siguiendo la misma secuencia sintética (acoplamiento con el anhídrido 5 e hidrogenación) se preparó la segunda generación del dendrón correspondiente, compuesto 9, que presenta 12 grupos hidroxilo en la superficie, y el producto de tercera generación 11 conteniendo 24 hidroxilos en su superficie. Mediante el análisis de los 89 Ihre, H.; Padilla, O. L.; Fréchet, J.M.J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5908-5917. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 67 espectros de 1 H-RMN y 13 C-RMN se pudieron corroborar las estructuras de los compuestos obtenidos, observandose a campo bajo, primero la aparición y después la pérdida de las señales correspondientes a los grupos fenilo. La monodispersidad de estos compuestos se confirmó nuevamente mediante espectrometría de masas. En la Figura 40 se muestran los espectros de masas de los compuestos desprotegidos de segunda y tercera generación 9 y 11 respectivamente. 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 [M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+ Na ] + Compuesto 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3[M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+Na] + 1288.5 [M+Na] + +MS, 0.2-0.5min #(6-15) 0.0 0.5 1.0 1.5 6 x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z 1304.5 [M+K] + 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 [M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+ Na ] + Compuesto 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3[M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+Na] + 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 [M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+ Na ] + Compuesto 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z Compuesto 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 Intens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3[M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+Na] + 1288.5 [M+Na] + +MS, 0.2-0.5min #(6-15) 0.0 0.5 1.0 1.5 6 x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z 1288.5 [M+Na] + +MS, 0.2-0.5min #(6-15) 0.0 0.5 1.0 1.5 6 x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z 1304.5 [M+K] + Compuesto 9 1265.6 m/z Figura 40. Espectros de masas (ESI) de los dendrones desprotegidos 9 y 11. De esta forma, mediante una síntesis divergente se han podido preparar los dendrones de primera, segunda y tercera generación en escala multigramo, de una forma sencilla, barata y monodispersa. Además, cabe destacar que la purificación de todos estos dendrones se realizó por recristalización lo que facilitó enormemente la purificación de dichos compuestos, obteniéndose en todos los casos productos de elevada pureza. 3.1.2. Síntesis del glicodendrón 3GTBoc(SucMan) 24 y del correspondiente control 3GTBoc(SucC) 24 . La preparación de los sistemas multivalentes glicodendríticos requiere, en primer lugar, la activación del dendrón de tercera generación 11, mediante la Capítulo 3 68 introducción de ácidos carboxílicos en la superficie siguiendo la metodología que había sido puesta a punto en nuestro grupo de investigación previamente. 83 Estos grupos carboxílico terminales permitirán posteriormente el anclaje de los glicoconjugados y los correspondientes controles al soporte multivalente a través de la formación de un enlace amida. La funcionalización del dendrón de tercera generación con ácidos carboxílicos se realizó en una etapa mediante la apertura de anhídrido succínico (en gran exceso), en piridina empleando DMAP como catalizador. De esta forma, se obtuvo con buen rendimiento el compuesto 12 (Esquema 8). Esquema 8. Preparación del dendrón 12. La formación de este producto se confirmó mediante el análisis de su espectro 1 H-RMN en el que se pudo observar la aparición de un multiplete a 2.55-2.72 ppm, correspondiente a los protones de los metilenos del ácido succínico. El análisis por espectrometría de masas de este compuesto presentaba una distribución gaussiana de picos en torno al peso molecular esperado (5058.5), lo que indicaba la polidispersidad del compuesto (Figura 41). 83 Arce, E.; Nieto, P.M.; Díaz, V.; García-Castro, R.; Bernad, A.; Rojo, J. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 817-823. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 69 Figura 41. Espectro de masas MALDI-ToF del dendrón 12. La siguiente etapa en la preparación del glicodendrón fue la introducción de las unidades de carbohidrato, en este caso manosa, en la superficie del dendrón. Para ello fue necesario funcionalizar adecuadamente dicho monosacárido en su posición anomérica con un espaciador que presentara un grupo amino terminal. Así, el derivado de manosa 17 se preparó en cuatro etapas a partir de la correspondiente manosa peracetilada comercial 13 siguiendo la metodología desarrollada en nuestro grupo de investigación, según se muestra en el Esquema 9. 83 Esquema 9. Síntesis del derivado de manosa 17. 83 Arce, E.; Nieto, P.M.; Díaz, V.; García-Castro, R.; Bernad, A.; Rojo, J. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 817-823. Capítulo 3 70 La primera etapa consistió en la glicosilación del derivado peracetilado 13 usando como aceptor de glicosilo el 2-bromoetanol y como promotor BF 3. Et 2 O, obteniéndose el derivado glicosilado 14 con un rendimiento del 73%. El análisis del espectro de 1 H-RMN nos muestra la aparición de un doblete a 4.87 ppm correspondiente al protón anomérico cuya constante de acoplamiento es 1.5 Hz, lo que indica la formación exclusiva del anómero α. El siguiente paso consistió en la sustitución nucleófila del grupo Br del extremo terminal del espaciador del derivado de manosa 14 por un grupo azida. Esta etapa se realizó utilizando un gran exceso de NaN 3 en DMF anhidra, obteniéndose el derivado 15 de forma cuantitativa. La sustitución fue confirmada por el análisis del espectro de 13 C-RMN del producto 15 en que se pudo observar la desaparición de la señal del carbono unido al bromo (30.1 ppm) y la aparición de una nueva señal a 50.7 ppm correspondiente al desplazamiento de un carbono unido a un grupo azida. La desacetilación del compuesto 15 utilizando NaOMe 1M en MeOH condujo al producto 16 con excelentes rendimientos. Mediante el análisis del espectro de 1 H- RMN se pudo observar la desaparición de las señales correspondientes a los metilos de los grupos acetato. Por último, la hidrogenación del grupo azida utilizando como catalizador paladio sobre carbono a presión y temperatura ambiente, condujo al derivado de manosa 17 cuya formación fue corroborada mediante el análisis del espectro de 13 C-RMN. La desaparición de la señal a 51.7 ppm (CH 2 -N 3 ) y la aparición de una nueva señal a 41.8 ppm característica de un carbono metilénico unido a un grupo amino confirmó la formación del producto 17. Una vez obtenido el dendrón 12 y el derivado de manosa 17 convenientemente funcionalizados, se llevo a cabo la conjugación entre ambos utilizando las condiciones clásicas de formación de enlaces peptídicos (Esquema 10). Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 71 O O O BocHN OO O O O OO OOO O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O HO O OOH O O OH OO OH O O OH O O OH O O OH O O OH O O OH O O OH O O HO O O HO O O OH O O HO O O HO O O HO O O OH O O HO O O OH OO OH O O OH O O OH O O OH OO HO O O O O O BocHN OO O O O OO O OO O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O HN O OHN O O HN OO H N O O NH O O H N O O NH O O NH O O NH O O NH O O NH O O NH O O N H O O H N O O H N O O HN O O NH O O HN O O NH OO NH O O NH O O N H O O N H OO HN O O O O O O O O O O OO OO O O O O O O O O O OO O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O HO HO OH O OH NH2 O O NH2 O O O BocHN OO O O O OO OOO O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O HN O OHN O O HN OO HN O O HN O O H N O O H N O O NH O O NH O O NH O O NH O O N H O O N H O O N H O O H N O O HN O O NH O O HN O O NH OO N H O O NH O O N H O O HN OO HN O O OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH HO OH OH HO HO OH HO HO HO HO 17 12 3GTBoc(SucC)24 3GTBoc(SucMan)24 17, DIC, HOBt DMF, 24h, t.a. 86% H2NOH DIC, HOBt DMF, 24h, t.a. 50% Esquema 10. Preparación del glicodendrón 3GTBoc(SucMan) 24 y del dendrón control 3GTBoc(SucC) 24 . Así, los ácidos carboxílicos del dendrón 12 se activaron utilizando diisopropilcarbodiimida (DIC) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) en DMF, y a continuación se hicieron reaccionar con el derivado de manosa 17 (1.2 eq. por grupo carboxílico del dendrón) a temperatura ambiente. De esta forma se obtuvo el glicodendrón de tercera generación que hemos denominado 3GTBoc(SucMan) 24 . El producto se purificó por ultrafiltración, utilizando filtros de exclusión por tamaño centriplus YM-3000, con tamaño de poro de 3000 daltons. En el espectro de 1 H-RMN se pudo observar la aparición de la señal correspondiente al protón anomérico de la Capítulo 3 78 Tiempo (s) R e s p u e s t a ( R U ) Tiempo (s) R e s p u e s t a ( R U ) [3GTBoc(SucMan) 24 ][3GTBoc(SucC) 24 ] -- + + Figura 46. Inhibición de la interacción DC-SIGN/gp120 usando una superficie de gp120 y como inhibidores: a) 3GTBoc(SucC) 24 a concentraciones (0, 7.5, 14, 28, 57, 85 y 128 µM); b) 3GTBoc(SucC) 24 a concentraciones (0, 7.5, 14, 28, 57, 85 y 128 µM). Como se ha comentado anteriormente en los antecedentes, se había demostrado usando biosensores que el polímero dendrítico Boltorn de tercera generación funcionalizado con 32 manosas (BH30SucMan) era capaz de inhibir la interacción DC-SIGN/gp120 con un IC 50 de 50 µM. La inhibición de la interacción entre DC-SIGN/gp120 que se obtiene usando el glicodendrón 3GTBoc(SucMan) 24 es del mismo orden (≈ 50 µM) que la obtenida usando el glicodendrímero homólogo de tercera generación con 32 manosas. A la vista de estos resultados, se pudo concluir que la ausencia de un brazo en estos sistemas dendríticos, que implicaría un menor número de manosas en la superficie, no tiene un efecto significativo en la capacidad de inhibición de la interacción de DC-SIGN/gp120. En otras palabras, el nuevo dendrón preparado, con una media de 20 manosas es capaz de interaccionar con el receptor DCSIGN con una afinidad similar a como lo hacía el dendrímero correspondiente BH30SucMan con 32 manosas. Esto parece indicar, que en este proceso de interacción, es más importante una adecuada presentación de los ligandos que posibilite la interacción de forma multivalente con el receptor, que el número total de ligandos (manosas en este caso). Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 79 Una vez sintetizado el glicodendrón y comprobada su capacidad de interacción con el receptor DC-SIGN, el siguiente paso sería la funcionalización de la posición focal diferenciada del dendrón para introducir moléculas de interés biologico. 3.1.4. Modificación de la posición focal de dendrones basados en el ácido 2,2- bis-(hidroximetil)propiónico empleando como núcleo TRIS. Dados los problemas de caracterización y con el fin de reducir al máximo la polidispersidad en el dendrón activado con ácidos carboxílicos, se planteó una estrategia sintética diferente que consistió en introducir el ácido succínico protegido como monobenciléster, de forma que se facilitara la síntesis y purificación del compuesto final. Para llevar a cabo esta funcionalización fue necesario, en primer lugar, preparar el monobenciléster del ácido succínico, utilizando la metodología descrita en la bibliografía. 98 La apertura del anillo de anhídrido succínico se realizó por ataque nucleófilo del alcohol bencílico en CH 2 Cl 2 catalizado por DMAP, dando lugar al monosuccinato de bencilo 18 (Esquema 11). La formación del producto pudo confirmarse claramente mediante la aparición de las señales características del grupo bencilo a 7.38 y 5.18 ppm en el espectro 1 H-RMN. Esquema 11. Síntesis del monobenciléster del ácido succínico 18. Una vez sintetizado el monobenciléster derivado 18, la siguiente etapa fue la funcionalización de la superficie del dendrón 11 con 24 unidades del compuesto 18, mediante la formación de enlaces éster. Aunque el número de enlaces que se tienen que formar en una única etapa sintética sobre la superficie del dendrón 11 es muy elevado, 98 Isomura, I.; Wirsching, P.; Janda, K. D. J. Org. Chem. 2001, 66, 4115-4121. Capítulo 3 80 se consiguieron funcionalizar todas las posiciones del dendrón con un buen rendimiento. Para ello, se utilizaron las condiciones desarrolladas por Ihre y col. 88 El dendrón 11, el monobenciléster del anhídrido succínico 18 y p-toluensulfonato de dimetilaminopiridina (DPTS) 99 se disolvieron en CH 2 Cl 2 en atmosfera inerte y posteriormente se añadió DCC a la mezcla de reacción. Tras 24 horas a temperatura ambiente se obtuvo el compuesto 19 con un excelente rendimiento(Esquema 12), que fue purificado mediante cromatografía de exclusión por tamaños (Sephadex LH-20). Esquema 12. Síntesis del dendrón 20. 88 Ihre, H.; Hult, A.; Fréchet, J.M.J.; Gitsov, I. Macromolecules 1998, 31, 4061-4068. 99 Moore, J. S.; Stupp, S. I. Macromolecules 1990, 23, 65-70. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 81 El compuesto 19 se caracterizó mediante experimentos de RMN y espectrometría de masas. En el espectro de 1 H-RMN se pudo observar la aparición de nuevas señales a 7.26 ppm correspondientes a los protones aromáticos, un singlete a 5.03 ppm correspondiente al metileno del grupo bencilo y la señal correspondiente a los metilenos del succínico a 2.57 ppm. La integración de estas señales puso de manifiesto el acoplamiento de 24 unidades de monosuccinato de bencilo. Adicionalmente, por espectrometría de masas usando ionización electrospray (ESI) se pudo observar las señales correspondientes al compuesto con dos y tres cargas cuya masa coincide con el producto completamente funcionalizado, lo que indicaba claramente que este producto era monodisperso (Figura 47). Figura 47. Espectro de masas ESI del dendrón 19. Antes de introducir los azucares sobre el dendrón 19 y dado el coste sintético que suponía preparar dicho glicodendrón de manosa, se decidió realizar las pruebas de desprotección del grupo amino sobre el dendrón 19 y su posterior funcionalización para demostrar la viabilidad de la estrategia sintética. La desprotección del grupo carbamato se llevó a cabo empleando condiciones clásicas (CH 2 Cl 2 /ácido trifluoracetico (TFA)(1:1) a temperatura ambiente) obteniéndose el compuesto 20 de forma cuantitativa (Esquema 12). La eliminación del grupo protector Boc se confirmó mediante el análisis del espectro de 1 H-RMN de este compuesto, en el que se pudo observar la desaparición de la señal a 1.33 ppm característica del grupo tert-butilo del Boc. Capítulo 3 82 Una vez sintetizado el compuesto 20 nuestro objetivo era introducir en la posición amino libre diferentes moléculas de interés biológico. Para ello, era necesario añadir un espaciador adecuadamente funcionalizado y suficientemente largo para permitir, en etapas posteriores, la conjugación de moléculas biológicas de interés. En este sentido, se intentó la apertura del anhídrido succínico con objeto de introducir posteriormente un espaciador que permitiera dicha conjugación. Sin embargo, los distintos ensayos de apertura empleando cantidades crecientes de anhídrido succínico (1.5, 2.5 y 5 eq), así como el aumento de la temperatura (t.a., 40 ºC y 60 ºC) no condujo, en ningún caso, al producto deseado. Mediante cromatografía en capa fina no se observó la aparición de un nuevo producto, confirmándose a través del espectro de 1 H- RMN la recuperación del producto de partida en todos los casos. También, se intentó la funcionalización del producto 20 con fluoresceína, utilizando el isotiocianato de fluoresceína (FITC) y trietilamina en DMF. La reacción de una amina con un isocianato es una reacción muy eficaz, limpia y rápida que se usa de forma general para introducir fluoresceína en moléculas complejas como proteínas. Sin embargo, en todas las condiciones que se ensayarón, donde se varió tanto el número de equivalentes de FITC, la temperatura y los tiempos de reacción, se recuperó, al igual que en el caso comentado anteriormente, el producto de partida inalterado. A pesar de que en la bibliografía 100,101 existen descritos ejemplos en que una amina unida a un carbono tetrasustituido y con un impedimento estérico semejante se funcionaliza, en nuestro caso todos los intentos para funcionalizar el compuesto 20 resultaron infructuosos. A la vista de estos resultados, se decidió cambiar la estrategia sintética y realizar una síntesis divergente en la que la posición diferenciada del núcleo de crecimiento estuviera funcionalizada con un espaciador largo desde el inicio de la secuencia sintética. 100 Kleinert, M.; Röckerdorf, N.; Lindhorst, T. K. Eur. J. Org. Chem. 2004, 3931-3940. 101 Huang, K.; Voss, B.; Kumar, D.; Hamm, H. E.; Harth, E. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 403- 409. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 83 3.2. Dendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico con espaciador. Dadas las dificultades encontradas a la hora de intentar la funcionalización del dendrón 20, nos planteamos la síntesis de dendrones a partir de un núcleo de crecimiento que llevara desde el inicio un espaciador convenientemente protegido y con la flexibilidad suficiente para que nos permitiera la introducción de cualquier molécula de interés en etapas posteriores. Además, como ya se ha comentado anteriormente, el dendrón de tercera generación 3GTBoc(SucMan) 24 no presentaba una pérdida significativa de actividad en la inhibición de la interacción DC-SIGN/gp120 con respecto al dendrímero BH30sucMan, por ello nos planteamos la síntesis de dendrones de generaciones inferiores (2ª generación en lugar de tercera), lo que implica un menor número de unidades de carbohidrato en su superficie. La síntesis de generaciones inferiores, conllevaría por consiguiente un ahorro sintético que puede ser importante a la hora de su posible uso en aplicaciones biomédicas aunque ello supusiera una disminución en la afinidad por el receptor. En el Esquema 13 se muestra el análisis retrosintético para la preparación de un dendrón de segunda generación que contiene en su estructura un espaciador. Esquema 13. Esquema retrosintético de la preparación de un dendrón de segunda generación con un espaciador. 3.2.1. Síntesis del soporte dendrítico. La primera cuestión a abordar para preparar el núcleo de crecimiento era la elección de un espaciador adecuado. Se optó por la diamina comercial 1,13-diamino- Capítulo 3 84 4,7,10-trioxatridecano (21). Esta diamina es un derivado de tetraetilenglicol que a priori debe aportarnos una gran flexibilidad y una alta solubilidad en disolventes polares. Dado que el derivado 21 es una diamina, el primer paso fue la protección de una de las aminas. Para ello se seleccionó un grupo protector que fuera compatible con cada una de las etapas de crecimiento posterior del dendrón. De todas las opciones posibles elegimos como más adecuado para nuestros objetivos el grupo protector Boc. De esta forma la diamina 21 se monoprotegió utilizando Boc 2 O y dioxano como disolvente, en las condiciones descritas en la bibliografía 102 (Esquema 14), obteniéndose el compuesto 22 con un excelente rendimiento. El espectro de 1 H-RMN del producto 22 confirmó la incorporación del carbamato al presentar la señal característica del grupo tert-butilo a 1.43 ppm. La integración de esta señal en dicho espectro nos indicaba claramente que se había producido la monoproteccion de la diamina. En el espectro de masas, se observó un único pico, correspondiente al ión molecular del producto monoprotegido (m/z 343.3 [M+ Na] + ). Esquema 14. Síntesis de la diamina monoprotegida 22. Una vez sintetizado el espaciador convenientemente protegido realizamos la síntesis de un nuevo núcleo al que poder anclarlo. Para ello se llevó a cabo la protección selectiva de tres de los cuatro grupos hidroxilo presentes en el pentaeritritol (23), dejando una posición libre para la posterior unión del espaciador. Para esta reacción se utilizaron tres equivalentes de cloruro de bencilo en presencia de hidruro sódico. El análisis del espectro de 1 H-RMN y del espectro de masas del crudo de reacción indicó la existencia de tres productos que correspondían a las especies di-, tri- y tetrabenciladas. La posterior purificación mediante el empleo de cromatografía en columna condujo fácilmente al compuesto tribencilado 24 con un rendimiento del 51% (Esquema 15). La protección de los tres hidroxilos se confirmó en el espectro de 1 H- 102 Braun, M.; Hartnagel, U.; Ravanelli, E.; Schade, B.; Böttcher, C.; Vostrowsky, O.; Hirsch, A. Eur. J. Org. Chem. 2004, 1983-2001. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 85 RMN por la aparición de las señales características del grupo bencilo (4.56 y 7.31-7.43 ppm) del producto 24. Por otra parte, se observó también las señales correspondientes a los metilenos unidos a los grupos hidroxilo protegidos, ya que en este compuesto aparecían a mayor campo, permaneciendo la señal geminal de los metilos inalterada. La integración de las señales confirmó la protección de 3 de las posiciones hidroxilo, hecho que fue ratificado por espectrometría de masas donde se observó una única señal correspondiente al ión molecular (429.3 [M +Na] + ). La siguiente etapa sintética era la apertura del anhídrido succínico en presencia de DMAP y piridina por el grupo hidroxilo libre presente en el compuesto 24. Esta reacción condujo, con un excelente rendimiento al producto 25 el cual fue purificado empleando cromatografía en columna de gel de sílice. La incorporación del ácido succínico en la estructura fue confirmada en el espectro de 1 H-RMN del producto 25 por la aparición de un multiplete a 2.50-2.57 ppm correspondiente a los grupos metileno del resto succínico introducido en la molécula. Esquema 15. Síntesis del núcleo de crecimiento 27. Capítulo 3 86 Posteriormente, el ácido carboxílico se acopló con el espaciador 22 mediante la formación de un enlace amida, empleando como reactivos DIC y HOBt en DMF anhidra, obteniéndose el compuesto 26 con buen rendimiento. En el espectro de 13 C- RMN del producto 26 se confirmó la formación del enlace amida por la desaparición de la señal a 178.1 ppm correspondiente al ácido carboxílico libre y la aparición de una nueva señal a 171.3 ppm. Una vez ensamblados el espaciador y el núcleo, el siguiente paso de la síntesis era el crecimiento del núcleo para preparar las distintas generaciones del dendrón. Para ello, procedimos a la desprotección de los grupos hidroxilo por hidrogenación del producto 26, empleando como catalizador paladio sobre carbono. Esta reacción dio lugar a la liberación de los grupos hidroxilo obteniéndose el compuesto 27 de forma cuantitativa (Esquema 15). En el espectro de 1 H-RMN del compuesto 27 se observó la desaparición del multiplete a 7.23-7.33 ppm, correspondiente a los protones aromáticos, y de la señal a 4.49 ppm, de los metilenos del grupo bencilo. Una vez sintetizado el núcleo de crecimiento 27 adecuadamente funcionalizado, se siguió la misma metodología que en el caso de los dendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico sin espaciador, para la síntesis de los dendrones de primera y segunda generación 29 y 31 (Esquema 16). Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 87 O O O NHO 3 BocHN OO O O O O O O O Ph Ph O O O Ph OH OH O O O O OH OH O HO HO O O O O NHO 3 BocHN OO O O O O O O O O O O O O O Ph O O O Ph O O OPh O O O Ph O O O Ph O O O P h O O O NHO 3 BocHN OO O O O O O O O O O O OH OH O OH OH O OH OH O OH OH O OH OH O HO HO O O O O NHO 3 BocHN 27 5, DMAP Piridina/CH2Cl2, 40ºC 87% 5, DMAP Piridina/CH2Cl2, 40ºC 85% H2/Pd (C) CH2Cl2/MeOH (1:1) 99% H2/Pd (C) CH2Cl2/MeOH (1:1) 99% 28 29 30 31 Esquema 16. Síntesis de los dendrones 29 y 31. El compuesto 27 se hizo reaccionar con el anhídrido 5 en una mezcla diclorometano/piridina empleando DMAP como catalizador a 40 ºC durante 24 h, dando lugar al compuesto 28 el cual fue purificado empleando cromatografía por columna. La esterificación de todos los grupos hidroxilo se confirmó mediante la integración de las señales características de la unidad de crecimiento en el espectro de 1 H-RMN. Adicionalmente, la monodispersidad del compuesto se puso de manifiesto por la observación de una única señal correspondiente al ión molecular en el espectro de masas del compuesto 28, m/z 1173.5 [M+Na] + . La hidrogenación de este compuesto, empleando paladio sobre carbono como catalizador, condujo al dendrón de primera generación desprotegido 29. La desprotección se confirmó mediante el análisis del espectro de 1 H-RMN, en el cual se observó la desaparición de las señales correspondientes a los grupos fenilo. Realizando la misma secuencia de reacciones, acoplamiento con el anhídrido 5 e hidrogenación, se obtuvo el dendrón de segunda generación 31 con buenos rendimientos. La monodispersidad de los productos 29 y 31 Capítulo 3 94 ppm ( f 1 ) 1 . 0 2 . 0 3 . 0 4 . 0 5 . 0 CH3Boc CH3b´ CH3c´ H1 NH CH2 b CH2 a NH H8 H2-H7+ CH2OCH2 suc NH CH3b´ CH3Boc CH2 suc NH H1 CH2 b H2-H7+ CH2O ppm ( f 1 ) 1 .02.03. 0 4 .05.0 H8 CH2 a+c O O O NHO O OBocHN O O O O O O O O O O OO O O O O O O a b c b´ c´ 37 O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O O NH O O O BocHN O O O O O O O O a b b´ 36 O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH PPM 2.92 2.88 2.84 2.80 2.76 2.72 2.68 2.64 2.60 2.56 2.52 2.48 2.44 2.40 2.36 2.32 2.28 2.24 2.20 2.16 2.12 2.08 2.04 2.00 1H-RMN del compuesto 35 PPM 2.88 2.84 2.80 2.76 2.72 2.68 2.64 2.60 2.56 2.52 2.48 2.44 2.40 2.36 2.32 2.28 2.24 2.20 2.16 2.12 2.08 2.04 2.00 1H-RMN del compuesto 34 Figura 50. Espectros de 1 H-RMN de los glicodendrones 36 y 37 en D 2 O. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 95 El análisis por espectrometría de masas de los glicodendrones 36 y 37 se llevó a cabo mediante la técnica MALDI-ToF. En el caso del glicodendrón de primera generación 36, las mejores condiciones para registrar este espectro fueron las siguientes: el producto se disolvió en H 2 O y se uso el ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB) como matriz. Así, como puede observarse en la Figura 51, el espectro muestra un pico a m/z 2739.6 muy mayoritario, el cual corresponde a la entrada de 6 unidades del derivado de manosa 17. Figura 51. Espectro de masas MALDI-ToF del glicodendrón de primera generación 36. En el espectro también se observaba un pico a m/z 2432.9, que no se corresponde con el pico esperado si el compuesto presentara una unidad menos de manosa. Un análisis más exhaustivo de dicho pico revela que este podía deberse a una fragmentación del compuesto 36. La fragmentación observada correspondería a la ruptura del enlace éster más externo de la molécula como se indica en la Figura 51. Capítulo 3 96 Para el análisis por espectrometría de masas MALDI-ToF del glicodendrón de segunda generación 37, las mejores condiciones para la obtención del espectro se consiguieron disolviendo el compuesto en H 2 O y usando ácido α-ciano-4- hidroxicinámico (HCCA) como matriz. El espectro de masas muestra un grupo de señales, entre las que se puede observar el pico m/z 5267.3 que corresponde a la entrada de 12 unidades del derivado de manosa 17 (Figura 52). En el espectro también aparecen otras señales a m/z inferiores que, al igual que se observó en el caso del glicodendrón de primera generación, no corresponden a la entrada de un menor número de unidades de manosa sino a la fragmentación de los enlaces ésteres más externos de la molécula. Figura 52. Espectro de masas MALDI-ToF del glicodendrón de segunda generación 37. Una vez obtenidos los glicodendrones de primera y segunda generación (36 y 37), se procedió a la desprotección del grupo amino. Para ello los compuestos protegidos se trataron con una mezcla H 2 O/TFA (1:2) durante 16 horas a temperatura ambiente. En estas condiciones se obtuvieron los glicodendrones de primera y segunda generación que hemos denominado 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 , Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 97 respectivamente (Esquema 19). La desprotección del grupo amino se confirmó en el espectro de 1 H-RMN por la desaparición de la señal característica del grupo tert-butilo (1.36 ppm), así como la desaparición de la señal correspondiente en el espectro de 13 C- RMN a 27.8 ppm tanto para el compuesto 36 como para el compuesto 37. Esquema 19. Síntesis de los glicodendrones 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 . Además de la desaparición de las señal correspondientes al grupo tert-butilo, en los espectros de 1 H-RMN y 13 C-RMN de los productos 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 , se pudieron observar notables cambios en dichos espectros que fueron realizados en las mismas condiciones y disolvente que los espectros de los correspondientes productos de partida protegidos. A continuación se comentarán los cambios detectados en el espectro de 1 H-RMN del glicodendrón de 2GLL(SucMan) 12 (Figura 53), los cuales son extensibles al glicodendrón de primera generación 1GLL(SucMan) 6 . Capítulo 3 98 2GLL(SucMan)12 O O O NH O O O H2N O O O O O O O O O O OO O O O O O O a b c b´ c´ O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH ppm ( f 1 ) 1 . 0 2 . 0 3 . 0 4 . 0 5 . 0 CH3Boc CH3b' CH3c' NH CH2 b CH2 a + c 37 ppm ( f 1 ) 1 . 0 2 . 0 3 . 0 4 . 0 5 . 0 NH CH3 b' + c' CH2 c O O O NHO O OBocHN O O O O O O O O O O OO O O O O O O a b c b´ c´ O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH CH2 a + b Figura 53. Espectros de 1 H-RMN de los glicodendrones 37 y 2GLL(SucMan) 12 en D 2 O. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 99 En primer lugar, se pudo observar cambios tanto en los desplazamientos químicos como en la multiplicidad de los metilenos correspondientes a la unidad de crecimiento (CH 2a , CH 2b , CH 2c ). En el caso del glicodendrón protegido 37 estas señales aparecían como un conjunto de singletes anchos en torno a 4.0-4.4 ppm, mientras que es el caso del glicodendrón desprotegido 2GLL(SucMan) 12 los metilos externos (CH 2c ) mantenían su desplazamiento químico aunque variando su multiplicidad, y los metilenos internos (CH 2a , CH 2b ) cambiaban sustancialmente su desplazamiento químico apareciendo en la zona de 3.5 a 3.9 ppm. También, se pudo observar que las señales de los metilos (CH 3b´ , CH 3c´ ) del glicodendrón protegido 37 que aparecían como singletes, cambiaron su aspecto en el caso del producto desprotegido. Otra variación observada fue el desdoblamiento de los protones beta al amino del espaciador. En el espectro de 1 H-RMN del glicodendrón protegido 37 estos aparecían como un único multiplete centrado a 1.70 ppm, por el contrario en el compuesto desprotegido 2GLL(SucMan) 12 la señal se desdoblaba en dos multipletes centrados a 1.70 y 1.88 ppm. Todas estos cambios en el desplazanmiento químico y multiplicidad de las señales fueron corroboradas mediante el análisis de los espectros bidimensonales de correlación protón-carbono HMQC, los cuales se muestran en la Figura 54. Estos cambios detectados en el espectro de 1 H-RMN del producto 2GLL(SucMan) 12 no tienen una explicación sencilla y seguramente se deban a la conformación diferente de esta molécula en disolución. Capítulo 3 100 Figura 54. Espectros HMQC de los compuestos 37 y 2GLL(SucMan) 12 . Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 101 3.2.3. Análisis de la actividad biológica de 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 usando biosensores. Para la evaluación de la actividad biológica de los sistemas preparados (1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 ) se eligió un experimento de competición. Para ello se funcionalizó un chip CM4 del biosensor (cubierto con una superficie de carboxidextrano que permite su funcionalización mediante la formación de enlaces amida), con la proteína α1-3,α1-6 Manotriosa BSA (BSA-Man) que contenía 15 residuos del trisacárido manotriosa por molécula de BSA. Se hizo fluir una cantidad fija del dominio extracelular soluble de la lectina (DC-SIGN-EDC) en presencia o ausencia de los glicodendrones de primera y segunda generación 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 preparados previamente. Se inyectaron conjuntamente cantidades crecientes del compuesto multivalente 1GLL(SucMan) 6 (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 µΜ) y una concentración fija del receptor DC-SIGN (800 µM). En la Figura 55 se representan los sensogramas obtenidos para el ensayo de inhibición de la interacción del receptor DC-SIGN con BSA-Man. En ausencia de inhibidores, se obtuvo una curva que correspondía al proceso de interacción de DC-SIGN con la superficie funcionalizada con la proteína BSA-Man. Sin embargo, cuando se inyectaron cantidades crecientes del glicodendrón 1GLL(SucMan) 6 se observó una disminución de la señal que era directamente proporcional a la concentración de glicodendrón, lo que indicaba una inhibición de dicha interacción. Desafortunadamente, el análisis de las curvas del sensograma mostró que el estado de disociación comenzaba antes de llegar al estado en el que la superficie se encuentra saturada (situación de equilibrio en el que la señal se estabiliza, probablemente sea debido a una interacción débil). Dado que los datos en dicha situación de equilibrio se utilizan para calcular el IC 50 no fue posible estimar el mismo para la inhibición de la interacción DC-SIGN/BSA-Man. Capítulo 3 102 -100 0 100 200 300 400 500 600 -50 0 50 100 150 200 250 300 Tiempo (s) Respuesta (RU) - + [1GLL(SucMan)6] -100 0 100 200 300 400 500 600 -50 0 50 100 150 200 250 300 Tiempo (s) Respuesta (RU) - + [1GLL(SucMan)6] Figura 55. Sensogramas del proceso de inhibición de la interacción DC-SIGN/BSA-Man usando como inhibidor el glicodendrón 1GLL(SucMan) 6 a distintas concentraciones. Del mismo modo, se realizó el estudio de inhibición de la interacción empleando el compuesto multivalente 2GLL(SucMan) 12 . Se inyectaron conjuntamente cantidades crecientes de dicho glicodendrón (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 µΜ) y una concentración fija del receptor DC-SIGN (800 µM). En la Figura 56 se representan los sensogramas obtenidos para el ensayo de inhibición de la interacción del receptor DC-SIGN con BSA-Man. Cuando se inyectaron cantidades crecientes del glicodendrón 2GLL(SucMan) 12 se observó una clara disminución de la señal directamente proporcional a la concentración de dicho glicodendrón (Figura 56). Esto indicaba que el compuesto 2GLL(SucMan) 12 competía de forma favorable con la proteína BSA-Man por la interacción con el receptor DC-SIGN, inhibiendo dicha interacción. En este caso, el análisis de las curvas obtenidas en el sensograma permitió estimar un IC 50 para el glicodendrón de segunda generación 2GLL(SucMan) 12 de 200 µM. Síntesis de glicodendrones basados en el ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico 103 - 100 0 100 200 300 400 500 600 - 50 0 50 100 150 200 250 300 Tiempo (s) Respuesta (RU) - + [2GLL( SucMan ) 12 ] Figura 56. Sensogramas del proceso de inhibición de la interacción DC-SIGN/BSA-Man usando como inhibidor el glicodendrón 2GLL(SucMan) 12 a distintas concentraciones. De este modo, y mediante el uso de biosensores hemos demostrado que el compuesto 2GLL(SucMan) 12 es capaz de inhibir la interacción del receptor DC-SIGN y la glicoproteína BSA-Man. En otras palabras, este compuesto tiene el tamaño y el número de azúcares necesario para poder interaccionar con el receptor DC-SIGN de manera significativa. Por lo tanto, es un buen candidato para ser conjugado con biomoléculas y estudiar el proceso de internalización dependiente de DC-SIGN. Capítulo 4 110 2GLL(SucMan)12 2GLLBodipy(SucMan)12 41 EDC, HOBt Et3N, DMF 93% O O O NHO H2N O 3 O O O O HN 12 OH OH OH OH O O O NH O O 3 O O O O HN 12 OH OH OH OH O O N NB FF H N Esquema 21. Síntesis del glicodendrón de manosa marcado fluorescentemente con bodipy, 2GLLBodipy(SucMan) 12 . En la Figura 58 se muestran los espectros de 1 H-RMN del derivado de bodipy 41 (Figura 58a), así como del glicodendrón de manosa de segunda generación marcado fluorescentemente 2GLLBodipy(SucMan) 12 (Figura 58b). El análisis del espectro de dicho compuesto marcado fluorescentemente nos indica la aparición de una serie de señales que están en concordancia con el anclaje del fluoróforo 41 al soporte glicodendrítico mediante un enlace tipo amida. Así, en el espectro que se muestra podemos observar la aparición de las señales A-G las cuales pertenecen al residuo de bodipy unido al glicodendrón. Marcaje fluorescente e internalización 111 ppm ( f 1 ) 1. 0 2. 0 3. 0 4.05.06.07.0 C B G E, F AD 41 C B A G E, F a b Figura 58. (a) Espectro de 1 H-RMN del fluoróforo 41 en CDCl 3 . (b) Espectro de 1 H-RMN del glicodendrón 2GLLBodipy(SucMan) 12 en MeOH-d 4 . Otra variación observada fue el desdoblamiento de los protones beta al amino del espaciador. En el espectro de 1 H-RMN del glicodendrón 2GLL(SucMan) 12 , éstos aparecían como dos multipletes centrados a 1.70 y 1.88 ppm mientras que en el nuevo compuesto esta señal aparece como un único multiplete centrado a 1.55 ppm (Figura 59). Capítulo 4 112 ppm (f1) 1.60 1.70 1.80 1.90 ppm (f1) 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 a b Figura 59. Ampliación de los espectros de 1 H-RMN del glicodendrón 2GLL(SucMan) 12 (a) y del 2GLLBodipy(SucMan) 12 (b). Adicionalmente, se realizó el estudio de las propiedades espectrocópicas del derivado de bodipy 41 en comparación con el glicodendrón marcado fluorescentemente 2GLLBodipy(SucMan) 12 . En un principio se realizaron estas medidas en agua y no se observó ninguna variación significativa en las medidas de máximos de absorción, emisión y rendimiento cuántico entre las dos moléculas fluorescentes. Además, en este mismo medio también se midió el tiempo de vida media de ambos compuestos observandose un incremento moderado de éste en el caso del glicodendrón. Dado el efecto que puede tener el medio (pH, fuerza iónica, etc.) en la fluorescencia de este tipo de fluoróforos, también se realizo el estudio de las propiedades fluorescentes del glicodendrón en un medio H 2 O-PBS para simular el pH y las condiciones fisiológicas en las que se harían los estudios biológicos de este tipo de compuestos. Así, al igual que en el caso de los estudios en agua no se observó ningún cambio significativo salvo en la mejora del tiempo de vida media, por lo que podemos decir que el glicodendrón 2GLLBodipy(SucMan) 12 posee unas buenas propiedades de fluorescencia a pH fisiológico (Figura 60). Marcaje fluorescente e internalización 113 0 0.02 0.04 0.06 0.08 300 350 400 450 500 550 600 650 700 UV Fluo 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 240 340 440 540 640 740 Fluo UV H 2 O Máximo de absorción: 522nm Máximo de emisión: 535nm Φ f = 0.2 (Rodamina B) τ= 5.66 ns χ 2 = 1.192 H 2 O - PBS Máximo de absorción: 524nm Máximo de emisión: 541nm Φ f = 0.1 (Rodamina B) τ= 7.06 ns χ 2 = 1.155 (H 2 O) τ = 6.87 ns χ 2 = 1.167 (PBS) a b Figura 60. Espectros de emisión y absorción de UV y fluorescencia. (a) Derivado de bodipy 41 en H 2 O; (b) Glicodendrón 2GLLBodipy(SucMan) 12 en H 2 O-PBS. 4.2. Síntesis y marcaje fluorescente de dendrones control. Adicionalmente, se planteó la síntesis del glicodendrón de galactosa marcado fluorescentemente que sería empleado posteriormente como control negativo para los estudios de internalización en células dendríticas. El receptor DC-SIGN reconoce derivados de manosa, fucosa e incluso glucosa pero no galactosa. Este glicodendrón nos permitiría confirmar que el proceso de internalización es dependiente del carbohidrato y por tanto del receptor DC-SIGN de forma selectiva. Para sintetizar el glicodendrón de galactosa fue necesaria la síntesis de un derivado de galactosa que contuviese en su estructura un grupo amino libre, que al igual que en el caso de la manosa 17, nos permitiese la unión al dendrón de segunda generación 35. Así, el derivado de galactosa 46 se preparó en cuatro etapas a partir de la correspondiente galactosa peracetilada comercial 42, utilizando la misma metodología empleada para la síntesis del derivado de manosa 17 (Esquema 22). Capítulo 4 114 Esquema 22. Síntesis del derivado de galactosa 46. La primera etapa consistió en la glicosidación del compuesto peracetilado 42 con 2-bromoetanol empleando las condiciones descritas previamente en la bibliografia, 111 obteniéndose el derivado glicosilado 43 con un rendimiento del 67%. El espectro de 1 H-RMN del producto 43 mostraba la aparición de un doblete a 4.52 ppm correspondiente al protón anomérico cuya constante de acoplamiento era 8 Hz, lo que indicaba la formación exclusiva del anómero β. Posteriormente, se realizó la sustitución nucleófila del grupo Br del extremo terminal del espaciador del producto 43 por un grupo azida. Esta etapa se realizó utilizando un gran exceso de NaN 3 en DMF anhidra, obteniéndose el derivado 44 de forma cuantitativa. La sustitución de bromo por azida fue confirmada por el análisis del espectro de 13 C-RMN del producto 44 en que se pudo observar la desaparición de la señal del carbono unido al bromo a 29.8 ppm y la aparición de una nueva señal a 50.6 ppm correspondiente al desplazamiento de un carbono unido a un grupo azida. La desacetilación del producto 44 utilizando NaOMe 1M en MeOH condujo al compuesto 45 con excelentes rendimientos. Mediante el análisis del espectro de 1 H- RMN se pudo observar la desaparición de las señales correspondientes a los metilos de los grupos acetato. Por último, la hidrogenación del grupo azida utilizando como catalizador paladio sobre carbono a presión y temperatura ambiente, condujo al 111 Davis, B.G.; Maughan, M.A.T.; Ullman, A.; Jones, J.B. Tetrahedron: Asymm. 2000, 11, 245–262. Marcaje fluorescente e internalización 115 derivado de galactosa 46. El análisis del espectro de 13 C-RMN del producto 46 mostró la desaparición de la señal a 52.0 ppm (CH 2 -N 3 ) y la aparición de una nueva señal a 42.3 ppm característica de un carbono unido a un grupo amino. Una vez sintetizado el derivado de galactosa 46 correctamente funcionalizado, se llevó a cabo el acoplamiento con el dendrón de segunda generación 35. Para ello, se emplearon las mismas condiciones anteriormente utilizadas para la síntesis del glicodendrón de manosa de segunda generación 37. Así, el dendrón de segunda generación 35 y el derivado de galactosa 46 (2 eq x COOH) se disolvieron en DMF anhidra. Posteriormente, se realizó la adición a temperatura ambiente de DIC y HOBt (3 eq x COOH) y se mantuvo la reacción a 40ºC durante 48 h. En estas condiciones se obtuvo el glicodendrón de segunda generación de galactosa 47 con buen rendimiento tras su purificación por cromatografía de exclusión por tamaño usando Sephadex LH20 (Esquema 23). Esquema 23. Síntesis del glicodendrón de galactosa 47 . Al igual que en el caso del glicodendrón de manosa de segunda generación 37, en el espectro de 1 H-RMN en D 2 O del glicodendrón 47 se observó un desdoblamiento de las señales correspondientes a los grupos metilénicos de los succínicos mientras que en el espectro del producto de partida aparecían como un único multiplete. Este resultado indicaba un claro cambio en el entorno químico de los mismos, poniendo de Capítulo 4 116 manifiesto la formación de los enlaces amida necesarios para la conjugación del carbohidrato. Además, en el espectro también se pudo apreciar la aparición de nuevas señales correspondientes a la unidad de galactosa, cuya integración con respecto a las señales propias de los dendrones pusieron de manifiesto la entrada de 12 unidades de galactosa (Figura 61). Figura 61. Espectro de 1 H-RMN de los glicodendrones 47 en D 2 O. Una vez obtenido el glicodendrón de galactosa 47, se realizó la desprotección del grupo amino. Para ello, dicho compuesto se trató con una mezcla H 2 O/TFA (1:2) durante 16 horas a temperatura ambiente, bajo estas condiciones se obtuvo el glicodendrón 2GLL(SucGal) 12 (Esquema 24). La desprotección del grupo amino se confirmó en el espectro de 1 H-RMN por la desaparición de la señal característica del grupo tert-butilo (1.36 ppm) del producto 47, así como la desaparición de la señal correspondiente en el espectro de 13 C-RMN a 27.8 ppm. Marcaje fluorescente e internalización 117 O O O NH O BocHN O 3 O O 47 HN 12 O O O O NHO H2N O 3 O O 2GLL(SucGal)12 HN 12 O O O N NB FF O O NH O H N 3 2GLLBodipy(SucGal)12 TFA/H2O (2:1) 16h, t.a. 97% 41 EDC, HOBt Et3N, DMF 90% O HO OH OH OH O HO OH OH OH OO O O HN 12 O O HO OH OH OH Esquema 24. Síntesis del glicodendrón 2GLL(SucGal) 12 y del glicodendrón marcado fluorescentemente 2GLLBodipy(SucGal) 12 . Posteriormente, se realizó el acoplamiento del glicodendrón de galactosa con el fluoróforo 41, obteniéndose de este modo el glicodendrón marcado 2GLLBodipy(SucGal) 12 (Esquema 24). El análisis del espectro 1 H-RMN del glicodendrón de galactosa marcado fluorescentemente presentaba al igual que en el caso del compuesto 2GLLBodipy(SucMan) 12 la aparición de las señales del fluoróforo 41 lo que determinó el anclaje de éste al soporte glicodendrítico mediante un enlace tipo amida. Capítulo 4 118 Otro control negativo para los estudios de internalización celular interesante sería el mismo dendrón pero sin azúcares. Este sistema nos permitiría demostrar que son los carbohidratos los que realmente inducen la internalización de forma selectiva dependiente del receptor. Podría ocurrir que en las células utilizadas hubiera algún receptor de galactosa y por tanto podría interferir en el estudio de la selectividad del proceso de internalización dependiente del receptor DC-SIGN. Por ello se planteó la síntesis del derivado 52 (Figura 62) que presenta grupos hidroxilo en su superficie. O O O NH O O O NH OO O O O OO O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O OO O O O O OO OO O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O OH OH OH OH OH OH OH OH O H OH OH OH O O NN B F F 52 Figura 62. Dendrón control 52 con grupos hidroxilo en su superficie marcado fluorescentente. El primer paso de esta ruta sintética implicaba el acoplamiento mediante un enlace éster del 2-benciloxietanol comercial al dendrón 35 (Esquema 25). Para ello se utilizaron las condiciones empleadas anteriormente para la obtención de los dendrones de primera y segunda generación 32 y 33 (DCC, DPTS y como disolvente diclorometano a 40ºC). Marcaje fluorescente e internalización 119 Esquema 25. Síntesis del dendrón 48 a partir del dendrón 35. Sin embargo, en estas condiciones se obtuvo una mezcla de productos consecuencia de una entrada incompleta del 2-benciloxietanol tal y como se muestra en la Figura 63. El aumento en el número de equivalentes de alcohol, DCC o HOBt no mostró una mejora significativa, obteniéndose espectros de masas muy similares. El cambio de disolvente por otros tales como THF o DMF no condujo en ningún caso al producto monodisperso deseado. Figura 63. Espectro de masas ESI del dendrón 48. Dado que hasta el momento, los acoplamientos tipo éster que se habían realizado mediante el empleo de DCC y DPTS habían dado excelentes resultados en la obtención de productos monodispersos, se planteó que el problema podía radicar en el acoplamiento sobre una superficie de poliácidos como es el producto 35. Así, se planteó una nueva síntesis del derivado 48 a partir del dendrón de segunda generación 31. Esta ruta implicaba la síntesis del producto 49 que tras el acoplamiento nos conduciría al dendrón deseado. El producto 49 se obtuvo mediante la apertura del anillo de anhídrido succínico por ataque nucleofilo del 2-benciloxietanol en piridina (Esquema 26). La formación del producto pudo confirmarse claramente mediante la Capítulo 4 126 -1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 0 20 40 60 80 [ glicodendrón] µl/ml 2GLLBodipy(SucGal)12 2GLLBodypy(SucMan)12 Figura 67. Ensayos de interacción/internalización de los glicodendrones 2GLLBodipy(SucMan) 12 y 2GLLBodipy(SucGal) 12 empleando citometría de flujo. Estos resultados demuestran que este tipo de glicodendrones son capaces de interaccionar con el receptor DC-SIGN e internalizarse al interior de las células dendríticas. Aunque el receptor DC-SIGN no es capaz de reconocer galactosas, el glicodendron que lleva como ligando este tipo de carbohidrato es internalizado en las células dendríticas, aunque en menor medida que el que presenta manosas. Una explicación para este hecho podría ser que las células dendríticas pueden expresar en su superficie otros receptores distintos de DC-SIGN capaces de interaccionar con galactosas lo que explicaría los resultados encontrados. Es claro que el glicodendrón de galactosas 2GLLBodipy(SucGal) 12 no es un control negativo adecuado para estos experimentos aunque la diferencia encontrada entre el compuesto de manosa y galactosa pone en evidencia la selectividad del proceso dependiente de un receptor. A la vista de estos resultados podemos concluir que los glicodendrones sintetizados que contienen 12 copias de manosas son capaces de ser internalizados en las células dendríticas vía DC-SIGN. Para confirmar el proceso de internalización al interior celular se están llevando a cabo estos estudios usando un microscopio confocal y marcadores específicos de determinados estructuras intracelulares para confirmar que el proceso de interacción del glicodendrón con el receptor conduce a un proceso de internalización mediado por dicho receptor. Marcaje fluorescente e internalización 127 Estos resultados muy prometedores abren las puertas para la potencial utilización de estos sistemas glicodendríticos como transportadores selectivos de moléculas (fármacos, péptidos, ácidos nucleicos) que puedan conjugarse a dichos sistemas con aplicaciones en diferentes campos de investigación como pueden ser la terapia génica no viral, el desarrollo de vacunas, y el transporte selectivo de fármacos aumentando su eficiencia y disminuyendo los potenciales efectos secundarios. La implicación de DC-SIGN en procesos de señalización hace de este receptor una diana muy interesante para poder modular, a través de la interacción de diferentes carbohidratos con dicho receptor, el proceso de señalización y por tanto una respuesta inmune específica. 69 Para evaluar si nuestros sistemas glicodendríticos, al interaccionar con el receptor DC-SIGN, dan lugar a algún tipo de señalización, se llevaron a cabo experimentos en los que se analizó la secreción de citoquinas mediante ELISA, usando de nuevo las DC inmaduras obtenidas a partir de células leucocitarias de dos donantes sanos. Estas células se incubaron en presencia o ausencia de ambos glicodendrones y en presencia o ausencia de lipopolisacáridos (LPS) durante 18 horas a 37º C. Los Lipopolisacáridos (LPS) son macromoléculas constituidas por un lípido y un polisacárido, que se encuentran en la membrana externa de bacterias Gramnegativas. Estos actúan como endotoxinas prototípo porque pueden ser reconocidas por TLRs desencadenado, entre otras respuestas, la secreción de la citoquina interleuquina 10 (IL-10). El reconocimiento de los epítopos de manosa por el receptor DC-SIGN puede hacer que éste actué como inmunomodulador, activando los TLRs y aumentando por tanto el reconocimiento de LPS, un efecto que tendría como consecuencia el aumento de la producción de IL-10. 69 (a) Zhou, T.; Chen, Y.; Hao, L.; Zhang, Y. Cell. Mol. Immunol. 2006, 3, 279-283. (b) van Kooyk, Y. Biochem. Soc. Trans. 2008, 36, 1478-1481. (c) den Dunnen, J.; Gringhuis, S.I.; Geijtenbeek, T.B.H. Cancer Immunol. Immunother. 2009, 58, 1149-1157. (d) Geijtenbeek, T.B.H.; den Dunnen, J.; Gringhuis, S.I. Future Microbiol. 2009, 4, 879-890. (e) Gringhuis, S.I.; Dunnen, J.; Litjens, M.; Vlist, M.; Geijtenbeek, T.B.H. Nat. Immunol. 2010, 10, 1081-1089. (f) Dunnen, J.; Gringhuis, S.I.; Geijtenbeek, T.B.H. Immunol. Lett. 2010, 128, 12-16. Capítulo 4 128 Mediante este experimento, se observó, como puede verse en la Figura 68, un cierto grado de sinergia en la elevación de la secreción de la citoquina, IL-10 en el caso del glicodendrón 2GLLBodipy(SucMan) 12 en presencia de LPS, y en menor medida con el glicodendrón 2GLLBodipy(SucGal) 12 . Estos resultados indican que estos glicodendrones pueden inducir una señalización determinada tras su interacción con el receptor DC-SIGN. Sin embargo, este efecto es dependiente del donante del que se obtengan las células dendríticas, como se ve en la Figura 68, el efecto es diferente en el caso del donante B, en el que dicho efecto no está tan claro ya que se aprecian menos diferencias en la producción de IL-10. 0.0 1000.0 2000.0 3000.0 4000.0 5000.0 6000.0 7000.0 8000.0 9000.0 10000.0 Control 2GLLBodipy(SucGal)12 2GLLBodipy(SucMan)12 IL-10 (ng/ml) No LPS LPS 0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 1200.0 1400.0 Control 2GLLBodipy(SucGal)12 2GLLBodipy(SucMan)12 IL-10 (ng/ml) No LPS LPS Donante A Donante B Figura 68. Experimentos de secreción de citoquinas IL-10 10 por los glicodendrones de manosa y galactosa en presencia de LPS. En resumen podemos decir que se han preparado glicodendrones que presentan 12 unidades de manosa o de galactosa marcados fluorescentemente Marcaje fluorescente e internalización 129 (2GLLBodipy(SucMan) 12 y 2GLLBodipy(SucGal) 12 respectivamente) los cuales se han empleado para realizar estudios de interacción/internalización que han sido evaluados mediante citometría de flujo, así como experimentos de secreción de citoquinas IL-10 evaluados mediante el empleo de ELISA en células dendríticas. Estos experimentos han puesto de relieve que el proceso de internalización es dependiente del carbohidrato y por tanto del receptor DC-SIGN de forma selectiva. Capítulo 5 Conjugación de biomoléculas Conjugación de biomoléculas 133 5. Conjugación de biomoléculas. Como comentamos en el capítulo 3 de la presente memoria el glicodendrón 2GLL(SucMan) 12 tiene la capacidad de bloquear la interacción entre el receptor DCSIGN y la glicoproteína BSA-Man. Aprovechando el mecanismo de internalización del receptor DC-SIGN y la interacción entre DC-SIGN y el glicodendrón de manosa de segunda generación 2GLL(SucMan) 12 nos planteamos la preparación de sistemas multivalentes mixtos que presenten carbohidratos y otras moléculas de interés biológico. De esta forma, estos glicodendrones mixtos interaccionarían de forma selectiva con el receptor DC-SIGN a través de los carbohidratos y se internalizarían introduciendo de forma selectiva las moléculas de interés biológico que llevan ancladas. Como moléculas de interés biológico por la potencial aplicación que pueden tener en el futuro, vamos a emplear péptidos y oligonucleótidos. Los carbohidratos son moléculas poco inmunogénicas y no van a dar lugar a anticuerpos específicos frente a los mismos; sin embargo, los péptidos en general si lo son. Seleccionando adecuadamente estos péptidos se podría internalizar en las células dendríticas estos sistemas desencadenando una respuesta inmune específica frente a Capítulo 5 134 dichos péptidos que se podría utilizar en el desarrollo de vacunas frente a un determinado tipo de enfermedad. 112 Además de la generación de vacunas, los sistemas multivalentes mixtos también podrían emplearse en transferencia de plásmidos en lo que se denomina terapia génica. Desde el descubrimiento del origen genético (gen defectuoso, inactivo, etc.) de muchas enfermedades frente a las cuales no hay por el momento ningún tipo de terapia, la esperanza para curar este tipo de enfermedades reside en lo que se denomina la terapia génica. Esta terapia génica consiste en la sustitución del gen defectuoso por otro funcional utilizando un vector de transferencia adecuado. 113 Inicialmente se han utilizado vectores de transfección basados en sistemas virales, pero estos sistemas están dando muchos problemas desde el punto de vista experimental, ético y de seguridad. Por esta razón, el uso de vectores no virales ha recibido una gran atención en los últimos años. Aunque se han desarrollado un gran número de estos vectores, todos ellos adolecen de una falta parcial o total de selectividad a la hora de transferir el plásmido a una determinada célula diana. 114 En este sentido, se pretende utilizar los glicodendrones para conseguir plásmidos de forma que, a través de los carbohidratos del sistema multivalente, se dote al sistema una especificidad adecuada en función del carbohidrato elegido para cada tipo de receptor celular. De esta forma, se podrá hacer una transferencia selectiva del plásmido a un determinado tipo de célula diana. En este capítulo se ha estudiado la funcionalización del sistema multivalente de carbohidratos 2GLL(SucMan) 12 para generar sistemas mixtos con un péptido o un oligonucleótido modelo. A continuación se hara un breve repaso sobre los distintos tipos de adición quimioselectiva que han sido empleados mayoritariamente en los procesos de conjugación de biomoléculas. 112 Rojo, J. Anti-Infective Agents Med. Chem. 2009, 23, 50-72. 113 Stephanopoulos, N. Harvard Sci. Rev. 2001, 14, 43-46. 114 Ferber, D. Science 2001, 294, 1638-1642. Conjugación de biomoléculas 135 5.1. Adición quimioselectiva. La adición de biomoléculas quimioselectiva es el acoplamiento covalente de dos o más sustancias desprotegidas en medio acuoso en el cual dichas moléculas están altamente funcionalizadas y contienen únicamente un grupo reactivo funcional. El concepto subyacente que caracteriza la adición de biomoléculas quimioselectiva es el término “bioortogonalidad”. En otras palabras, el par de grupos funcionales que dan lugar a la unión deben ser los únicos que se vean alterados. En resumen podemos decir que la mejor conjugación de moléculas de forma quimioselectiva debe ser: rápida, de elevado rendimiento, no debe requerir un gran exceso de reactivos (y si lo emplea que sean fácilmente reutilizables), deben llevarse a cabo en medios acuosos sin requerir el uso de co-disolventes y han de ser irreversibles en condiciones fisiológicas. Una de las reacciones que ha sido empleada en este tipo de uniones quimioselectivas han sido las reacciones de cicloadición (Figura 69), entre ellas podemos destacar la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen entre azidas y alquinos (Figura 69B). La utilidad de este tipo de reacciones radica en la facilidad para introducir las funciones alquino o azida en moléculas orgánicas, y en el hecho de que estas funciones son estables bajo una gran variedad de condiciones. Además, son fundamentalmente inertes tanto en disolventes orgánicos como en condiciones fisiológicas donde existen moléculas con alta funcionalización, inertes en presencia de oxígeno molecular y/o agua, y bajo la mayoría de las condiciones comunes en síntesis orgánica. Anexo 3 Espectros Espectros 241 1 H-RMN 400 MHz CD 3 OD Anexo 3 242 PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 1 H-RMN 300 MHz CDCl 3 Espectros 243 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD Anexo 3 244 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD Espectros 245 PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 S p i n W o r k s 3 : P r o t o n 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD Anexo 3 246 PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 S p i n W o r k s 3 : P r o t o n 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD