Estudio acelerado de estabilidad a ph controlado de un colirio solución

ESTUDIO ACELERADO DE ESTABILIDAD A pH CONTROLADO DE UN COLIRIO SOLUCIÓN 2019 ARACELI FUERTES CRIADO UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA TRABAJO FIN DE GRADO DEL DOBLE GRADO EN FARMACIA, ÓPTICA Y OPTOMETRÍA TÍTULO: ESTUDIO ACELERADO DE ESTABILIDAD A pH CONTROLADO DE UN COLIRIO SOLUCIÓN TRABAJO DE CARÁCTER EXPERIMENTAL ARACELI FUERTES CRIADO TUTELADO POR EL DOCTOR: JOSÉ IGNACIO PÉREZ MARTÍNEZ Lugar: Facultad de Farmacia Fecha de presentación: febrero de 2019 1 RESUMEN: El alto impacto que posee el glaucoma actualmente la sitúa como una de las patologías oculares con mayor incidencia a nivel global. El efecto sinérgico de dos fármacos sobre la presión intraocular es la vía de elección en el mayor número de casos para el tratamiento de dicha enfermedad. La combinación de un β-bloqueante (timolol) y un inhibidor de la anhidrasa carbónica (acetazolamida) en una formulación oftálmica ha sido desarrollada por el grupo de investigación: Investigación y Desarrollo Farmacotécnico de Medicamentos (CTS612), en un proyecto de Tesis Doctoral iniciado en 2014, con el fin de aportar una opción diferente a lo ya existente en el mercado. Debido a los problemas de solubilidad y estabilidad presentados por la acetazolamida, se modificó la formula inicial elaborada a pH de 7,2 y se diseñó un estudio de estabilidad acelerado para dicha formulación a pH de 5,3. El presente trabajo se fija como objetivo evaluar la influencia de una disminución en el pH tanto en el equilibrio de complejación acetazolamida:hidroxipropil-β-ciclodextrina, como en los parámetros de degradación de acetazolamida, así como confirmar la viabilidad de la formulación diseñada. Los resultados pudieron confirmar una mejora en los parámetros de degradación de la acetazolamida, siendo esta mejora insuficiente. Palabras clave: acetazolamida, hidroxipropil--ciclodextrina, glaucoma, estudio de estabilidad acelerado, colirios. 2 ABSTRACT: The high impact of glaucoma currently places it as one of the ocular pathologies with the highest global incidence. The synergistic effect of two drugs on intraocular pression is the route of choice in most of the cases for the treatment of this disease. The combination of a β-blocker (timolol) and a carbonic anhydrase inhibitor (acetazolamide) in an ophthalmic formulation has been developed by the research group Pharmaceutical Research and Development of Medicines (CTS612), in a Doctoral Thesis project initiated in 2014, to provide a different option from those already existing in the market. Due to the solubility and stability problems presented by acetazolamide, the initial elaborated formulation at pH of 7,2 was modified and an accelerated stability study was designed for the same formulation at pH of 5,3. The objective of this work is to evaluate the influence of a decrease in pH on both the acetazolamide complexation equilibrium: hydroxypropyl-β-cyclodextrin, and on the acetazolamide degradation parameters, as well as to confirm the viability of the designed formulation. The results confirmed an improvement in the acetazolamide degradation parameters, being this improvement insufficient. Keywords: acetazolamide, hydroxypropyl--cyclodextrin, glaucoma, accelerated stability study, eye drops. 3 ÍNDICE 1 INTRODUCCIÓN: .............................................................................................................. 7 1.1 GLAUCOMA ............................................................................................................ 7 1.1.1 Concepto: ........................................................................................................... 7 1.1.2 Factores de riesgo: .............................................................................................. 8 1.1.3 Tratamiento: ....................................................................................................... 9 1.2 ACETAZOLAMIDA (ACZ) .........................................................................................10 1.2.1 Antecedentes .....................................................................................................10 1.2.2 Mecanismo de acción:........................................................................................10 1.2.3 Estructura química, características fisicoquímicas y farmacocinéticas .................11 1.3 TIMOLOL MALEATO (TIM) .....................................................................................11 1.3.1 Antecedentes .....................................................................................................12 1.3.2 Mecanismo de acción.........................................................................................12 1.3.3 Estructura química, características fisicoquímicas y farmacocinéticas .................12 1.4 CICLODEXTRINAS (CD) ...........................................................................................12 1.4.1 Antecedentes .....................................................................................................13 1.4.2 Solubilización mediante complejación con CD ....................................................13 1.4.3 Derivados de las ciclodextrinas ...........................................................................14 1.5 COLIRIOS................................................................................................................14 1.5.1 Definición...........................................................................................................14 1.5.2 Componentes de los colirios...............................................................................14 1.6 ESTUDIO DE ESTABILIDAD......................................................................................15 1.6.1 Concepto ...........................................................................................................15 1.6.2 Propósitos ..........................................................................................................15 1.6.3 Estudio de estabilidad acelerado ........................................................................15 2 OBJETIVOS: ....................................................................................................................17 3 METODOLOGÍA: .............................................................................................................19 3.1 MATERIALES: .........................................................................................................19 3.2 MÉTODOS: .............................................................................................................19 3.2.1 Valoración de ACZ y TIM mediante HPLC: ...........................................................19 3.2.2 Estudio de solubilidad ACZ HP-β-CD a pH 5,3. .....................................................20 3.2.3 Elaboración de las formulaciones de referencia. .................................................21 3.2.4 Elaboracin de la formulacin oftlmica. ............................................................21 3.2.5 Diseño del estudio de estabilidad. ......................................................................23 4 3.2.6 Cálculo de los parámetros de degradación. ........................................................23 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................25 4.1 ESTUDIO DE SOLUBILIDAD ACZ:HP-β-CD A pH 5,3. ................................................25 4.2 INFLUENCIA DEL pH SOBRE EL PROCESO DE DEGRADACIÓN DE ACZ. ....................26 4.3 INFLUENCIA DE LA HP-β-CD SOBRE EL PROCESO DE DEGRADACIÓN DE ACZ A pH 5,3………………………………………………………………………………………………………………………………….27 4.4 INFLUENCIA DE TIM SOBRE LA DEGRADACIÓN DE ACZ EN LA FORMULACIÓN FINAL A pH 5,3..............................................................................................................................29 4.5 PARÁMETROS DE DEGRADACIÓN. .........................................................................30 5 CONCLUSIONES ..............................................................................................................33 6 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................35 5 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ACZ: acetazolamida. CA: anhidrasa carbónica. CAI: inhibidor de la anhidrasa carbónica. CD: ciclodextrina. HA: humor acuoso. HP--CD: hidroxipropil--ciclodextrina. PIO: presión intraocular. TIM: timolol maleato. ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Grupos farmacológicos más importantes en el tratamiento del glaucoma. ...... 9 Tabla 2. Características fisicoquímicas y farmacológicas de ACZ. ................................. 11 Tabla 3. Caracterísitcas fisicoquímucas y farmacocinéticas de TIM. ............................ 12 Tabla 4. Ejemplos de colirios comercializados en España a pH ácido. .......................... 22 Tabla 5. Valores de la constante de complejación (k1:1) y eficacias solubilizantes (Es) asumiendo complejo 1:1 a diferentes pH. ................................................................... 26 Tabla 6. Parámetros de degradación. .......................................................................... 30 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura química de las CD naturales. ....................................................................13 Figura 2. Esquema de la formulación de un complejo de inclusión. .........................................14 Figura 3. Diagrama de solubilidad de ACZ en presencia de HP--CD a diferentes pH................25 Figura 4. Ecuación de Henderson-Hasselbalch para un ácido débil. .........................................26 Figura 5. Cinética de degradación de ACZ a pH 5,3 ( ) y a pH 7,2 ( ). .......................................27 Figura 6. Reacción de hidrólisis de ACZ....................................................................................27 Figura 7. Cinética de degradación de ACZ en presencia de HP--CD a pH 5,3 ( ) y a pH 7,2 ( ).28 Figura 8. Hidrólisis de ACZ y estructura del complejo ACZ:HP--CD. ........................................28 Figura 9. Cinética de degradación de TIM en la formulación final a pH 5,3 ( ) y a pH 7,2 ( ). ...29 Figura 10. Cinética de degradación de ACZ en la formulación final a pH 5,3 ( ) y a pH 7,2 ( ). .29 12 1.3.1 Antecedentes En 1967 se realizó un estudio con el objetivo de determinar el efecto específico de los - bloqueantes adrenérgicos sobre la PIO (Phillips et al., 1967). Posteriormente, en 1979 el TIM se incluyó en el tratamiento del glaucoma al demostrarse que la PIO volvía a valores normales entre 1-3 días tras su administración (Lavik et al., 2011; Wilson et al., 1979). 1.3.2 Mecanismo de acción El TIM bloque tanto a los receptores 1 como 2, no es electivo, pero no se sabe con exactitud el mecanismo que sigue para reducir la PIO. Aparentemente, inhibe la producción de HA al bloquear los receptores  que modulan una vía de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) proteinquinasa A. El bloqueo de estos receptores disminuye la actividad simpaticomimética de esta vía, evitando la estimulación de los receptores  por catecolaminas, reduciendo el AMPc intracelular. Otra teoría dice que los antagonistas -adrenérgicos, al disminuir el flujo sanguíneo en el ojo reducen la ultrafiltración necesaria para producir HA (Goodman & Gilman, 2007). 1.3.3 Estructura química, características fisicoquímicas y farmacocinéticas En la siguiente tabla se presentan algunas las características fisicoquímicas y farmacocinéticas de TIM. Tabla 3. Caracterísitcas fisicoquímucas y farmacocinéticas de TIM. (Drugbank Database; Mohamed et al., 2014). 1.4 CICLODEXTRINAS (CD) Las ciclodextrinas (CD) son oligosacáridos cíclicos. Se obtienen a partir del almidón debido a la transglicosilación intramolecular que cataliza la ciclodextrina glucosiltransferasa. Están TIMOLOL MALEATO Fórmula molecular C17H28N4O7S Peso molecular 432,49 g/mol Nombre químico (Monomaleato de (S) -3- [3- (terc-butilamino) - 2-hidroxipropoxi] -4-morfolino-1,2,5-tiadiazol Estructura Absorción AV máxima 294 nm Solubilidad (25°C) Muy soluble en agua 13 formados por 6 (-CD), 7 (-CD) u 8 (-CD) unidades de glucosa unidas por enlaces -(1-4) glicosídicos. La característica más importante de estos oligosacáridos macrocíclicos es su disposición espacial. Tienen una estructura molecular cilíndrica hueca, presentando una superficie exterior polar y una cavidad apolar (Loh et al., 2016; Mora et al., 2015; Schöffer et al. 2017). Figura 1. Estructura química de las CD naturales. (Liu et al., 2017). 1.4.1 Antecedentes Los primeros datos publicados sobre las CD constan de 1891, recogidos por A. Villiers, quien aisló 3 gramos de sustancia cristalina desde 1000 g de almidón, tras la digestión bacteriana. Detectó tanto la -CD como la -CD. Posteriormente, en 1935, Freudenberg and Jacob descubrieron la -CD (Loftsson y Dûchene, 2007). 1.4.2 Solubilización mediante complejación con CD Las CD, gracias a su estructura, pueden formar complejos de inclusión, por interacción molecular débil. Estos complejos son dinámicos, puesto que la molécula huésped está continuamente en asociación y disociación con la CD. De forma que m moléculas de sustrato (S) se unen a n moléculas de ligando (L), dando lugar al complejo (SmLn) que resulta ser más soluble (Kurkov y Loftsson, 2013). Siendo la constante de estabilidad del complejo formado (K): En la siguiente imagen (Figura 2) se muestra el esquema de formación de un complejo de inclusión fármaco-ligando, quedando el ligando o fármaco en la cavidad apolar de la CD. m n m n S L S L   [ ] [ ] mn mn SL KSL  14 Figura 2. Esquema de la formulación de un complejo de inclusión. (Abou-Okeil et al., 2018). La capacidad de formar complejos, actuando como un contenedor molecular, tiene diferentes aplicaciones en la industria farmacéutica. Por ejemplo, las CD mejoran la solubilidad de aquellas moléculas poco solubles (Jambhekar y Breen, 2016). 1.4.3 Derivados de las ciclodextrinas Las CD naturales presentan una solubilidad limitada, sobre todo la -ciclodextrina. La baja solubilidad de la CD naturales se atribuye a la presencia de hidrógenos intermoleculares relativamente fuertes en el estado cristalino. La sustitución de uno de los enlaces hidroxilos que forman los enlaces de hidrogeno provoca una mejora dramática de su solubilidad. Dentro de estos derivados se incluyen los -hidroxipropílicos y -ciclodextrinas, las -ciclodextrinas metiladas, los sulfobutiléter -ciclodextrina y las ciclodextrinas ramificadas (Jambhekar y Breen, 2016). 1.5 COLIRIOS 1.5.1 Definición Los colirios son preparados oftálmicos. La Real Farmacopea Española define a los preparados oftálmicos como formulaciones estériles líquidas, semisólidas o sólidas, destinados a ser administrados en el globo ocular o en la conjuntiva, o bien a ser introducidos en el saco conjuntival. En concreto los colirios son disoluciones (acuosas u oleosas) o suspensiones estériles que pueden portar uno o más principios activos, para su administración en el ojo, debiendo cumplir los ensayos de esterilidad y tamaño de partícula (Real Farmacopea Española, 5a Ed., 2015). 1.5.2 Componentes de los colirios Los colirios poseen 3 componentes: principio o principios activos, vehículo y excipientes. Los excipientes van a permitir determinar diferentes características de los colirios: 15 Ajuste de la tonicidad: son usados cloruro sódico (NaCl), manitol o sorbitol. Se considera un colirio isotónico en el intervalo de 0,7-2% p/v de NaCl. Ajuste de la viscosidad: se usan sustancias mucoadhesivas como Hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), metilcelulosa (MC), alcohol polivinílico, dextranos, Carbopol®. Estabilización del pH: hay diferencia entre baja escala o gran escala. Se emplean disoluciones muy diluidas de hidróxido sódico (NaOH) o ácido clorhídrico (HCl) para el ajuste de pH a baja escala, así como tampones si es a gran escala. Incremento de la solubilidad del principio activo o estabilizar la preparación: para lograrlo se usan tensioactivos a baja concentración, que pueden ser no inicos o catinicos. Esterilidad: Los conservantes más usados en los colirios son: cloruro de benzalconio, nitrato de fenilmercurio, acetato de fenilmercurio, clorambutol y acetato de clorhexidina. Los colirios en forma de disolución son límpidos y están prácticamente exentos de partículas cuando se examinan con una luz adecuada. Los colirios en suspensión pueden presentar un sedimento que se redispersa fácilmente por agitación, proporcionando una suspensión lo suficientemente estable para permitir administrar la dosis correcta (González y Esteban, 2011; Real Farmacopea Espaola, 5a Ed., 2015). 1.6 ESTUDIO DE ESTABILIDAD 1.6.1 Concepto Los estudios de estabilidad son aquellos estudios o serie de ensayos, que proporcionan los resultados necesarios para establecer el periodo de validez de un medicamento en su envase original y en las condiciones de almacenamiento indicadas en él. Se entiende estabilidad como la capacidad que posee un producto o un principio activo de mantener, por un tiempo determinado, sus propiedades originales (fsicas, qumicas, biolgicas y microbiolgicas) dentro de las especificaciones de calidad establecidas (Real Farmacopea Espaola, 5a Ed., 2015). 1.6.2 Propósitos El propósito de las pruebas de estabilidad es proporcionar evidencia sobre cómo la calidad de una sustancia farmacéutica o producto farmacéutico varía con el tiempo bajo la influencia de una variedad de factores ambientales como la temperatura, la humedad y la luz, y establecer un período de reexamen para la sustancia del fármaco o la vida útil del medicamento y las condiciones de almacenamiento recomendadas (ICH, 2018). 1.6.3 Estudio de estabilidad acelerado Un estudio de estabilidad acelerado es aquel estudio de estabilidad diseñado con el fin de aumentar la velocidad de degradación química o los cambios físicos de un principio activo o producto farmacéutico. Para ello se establecen condiciones de almacenamiento extremas de 16 temperatura y humedad (condiciones de estrés), como parte de un programa de almacenamiento formal o definitivo (Real Farmacopea Espaola, 5ª Ed., 2015). A la hora de comercializar una formulación oftálmica, se permite determinar el periodo de validez a través de un ensayo acelerado, con solo 6 meses de duración (ICH, 2018). Obteniendo así un periodo de validez provisional. El poder predictivo de los datos obtenidos en este estudio acelerado se basa en la ecuación de Arrhenius. Esto no quita, que haya que llevar a cabo un ensayo a largo plazo para determinar el periodo de validez definitivo. 17 2 OBJETIVOS: En este apartado es necesario aclarar que los resultados obtenidos en este estudio son una continuación de un proyecto iniciado por este mismo grupo el cual culminará con la publicación de la tesis doctoral de D. Cesáreo José Jiménez de los Santos este mismo año. Por lo tanto dichos resultados serán comparados con valores registrados en trabajos anteriores tales como el “Estudio de degradacin de timolol maleato, acetazolamida e hidroxipropil-β-ciclodextrina: aplicacin para la formulacin de un colirio disolucin”, [TFG defendido por Alba Daz Ros en Julio de 2016], donde se estableció la cinética de degradación por hidrólisis de ACZ, así como su constante de degradación y periodo de validez para una fórmula definitiva ajustada a un pH de 7,2. Con el fin de mejorar los resultados obtenidos en este estudio previo, se ha rediseñado la fórmula inicial ajustando a un pH de 5,3. Con ello se pretende mejorar la estabilidad de ACZ frente a la hidrólisis permaneciendo dentro de los límites de tolerancia del ojo humano. Para ello, este grupo se marca los siguientes objetivos: 1- Establecer la influencia que una disminución de pH del entorno ejerce sobre la constante de complejación de este fármaco con la ciclodextrina. 2- Valorar el nuevo periodo de validez en las condiciones ensayadas, con el fin de establecer una formulación definitiva. 18 19 3 METODOLOGÍA: 3.1 MATERIALES: En la realización de este trabajo han sido utilizados los siguientes productos: ✓ Acetazolamida (ACZ): se presenta como un polvo blanco cristalino e inodoro (Acofarma, Barcelona). ✓ Timolol maleato (TIM): se encuentra como un polvo blanco cristalino, muy soluble en agua y en etanol al 96%. (Acofarma, Barcelona). ✓ Hidroxipropil--ciclodextrina (HP--CD): se trata de un polvo blanco cristalino, que posee un grado de sustitución de 0,6 y un peso molecular es de 1380 g/mol (Fluka, Japón). ✓ Cloruro de benzalconio: se presenta como un líquido incoloro o amarillento ligeramente viscoso, su peso molecular es de 370 g/mol y con una riqueza del 50% (Acofarma, Barcelona). ✓ Cloruro sódico (NaCl): se trata de un sólido blanco cristalino con un peso molecular de 58,44 g/mol (Panreac, Barcelona). ✓ Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA): se encuentra como un polvo blanco cristalino. Su peso molecular es de 372,24 g/mol y posee una riqueza del 99,2% (Fagron, Barcelona). ✓ Tampón Cítrico/Fosfato (pH= 5,3): ácido cítrico 1-hidrato y Di-Sodio Hidrógeno Fosfato 2-Hidratado. • Ácido cítrico 1- Hidrato: se trata de un polvo blanco cristalino y con un peso molecular de 210,14 g/mol (Panreac, Barcelona). • Di-Sodio Hidrógeno Fosfato 2-Hidratado: se encuentra en forma de polvo blanco cristalino y con un peso molecular de 177,99 g/mol (Panreac, Barcelona). ✓ Agua Milli-Q: agua destilada ultra depurada que se obtiene a través de un sistema Milli- Q. 3.2 MÉTODOS: 3.2.1 Valoración de ACZ y TIM mediante HPLC: El método analítico empleado ha sido la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), el cual había sido puesto a punto por el grupo de investigación CTS-240 (Cabanzo, 2013; Abad, 2012). La determinación, se llevó a cabo por HPLC de fase reversa mediante un cromatógrafo (Hitachi HPLC Elite Lachrom) compuesto de: ✓ Bomba isocrática L-2130. ✓ Inyector automático de muestras L-2200. 20 ✓ Detector de diodo L-2455. ✓ Horno Elite LaChrom Hitachi L-2350. El sistema cromatográfico utilizado para la técnica analítica a desarrollar se encuentra constituido por: - Columna Merck, RP-18 LichroCART ® de 125x4 mm. - Longitud de onda: 265 nm para la cuantificación de ACZ y 295 nm para la cuantificación de TIM. - Fase móvil: solución de acetato sódico 0,05 M ajustado a pH de 4,02 y acetonitrilo en una proporción 90/10 v/v respectivamente. - Velocidad de flujo: 1,5 mL/min. - Volumen de inyección: 10 µL. - Temperatura del horno de 45 ± 1 °C. Los tiempos de retención de los fármacos analizados fueron de 1,7 minutos para ACZ y de 4,1 minutos para TIM. Con estas condiciones se asegura una adecuada separación entre los picos de las moléculas activas y el resto de los componentes de las muestras. Para determinar la linealidad del método se realizó una recta de calibrado, de la que se integran las áreas registradas en el espectro para cuantificar la cantidad de fármaco presente en la muestra. 3.2.2 Estudio de solubilidad ACZ HP-CD a pH 5,3. Los estudios de solubilidad se llevaron a cabo de acuerdo con el método propuesto por Higuchi y Connors (1965). Para ello se emplearon concentraciones variables de HP-β-CD (0 - 0,1 M), y un exceso de 30 mg de ACZ por mL de solución tampón cítrico/fosfato de pH 5,3 empleado. Un total de tres lotes de muestras fueron mantenidos en agitación (agitador ACS 360 TS-K 412) a 25°C durante una semana. Este tiempo es considerado como suficiente para alcanzar el equilibrio de la reacción en base a un estudio preliminar. Por último, las muestras fueron filtradas a través de un filtro Millipore® de 0,22 µm y diluidas aplicando un factor de dilución de 10. Todas las muestras fueron analizadas por duplicado mediante HPLC obteniendo seis mediciones de cada muestra. A partir del diagrama de solubilidad se puede calcular la eficacia solubilizante (ES) de la CD, que se define como el aumento de solubilidad relativa del fármaco observado a una determinada concentración de CD, a partir de la siguiente ecuación: donde SCD representa la solubilidad del fármaco a dicha concentración de CD y S0 representa la solubilidad del fármaco en ausencia de CD. Este parámetro da idea del número de veces que se 0 S S ECD S 21 incrementa la solubilidad de un fármaco en presencia de CD. Del mismo modo a partir de la ecuación de la regresión lineal se puede calcular la constante de complejación asumiendo un complejo de estequiometría 1:1. Una expresión simplificada para el caso específico en el que se forme un complejo 1:1 para la constante de estabilidad vendrá dada por la ecuación (Higuchi y Connors, 1965): 3.2.3 Elaboración de las formulaciones de referencia. Con el fin de determinar las posibles variables con influencia en el estudio de estabilidad han sido elaboradas dos formulaciones de referencia de 50 ml por lote: 1. Solución de ACZ: con el fin de determinar la influencia de la temperatura en el proceso de degradación se elaboró una solución de ACZ, de manera que 25 mg de ACZ fueron añadidos a un vaso de precipitados para disolverlo en el vehículo preparado con el tampón cítrico fosfato y el resto de los excipientes. Para conseguir la isotonicidad del preparado fueron añadidos 460 mg de NaCl. 2. Solución de ACZ + HP-β-CD: con el fin de determinar la influencia que la CD ejerce en el proceso de degradación al pH estudiado de 5,3; 250 mg de ACZ fueron añadidos a un vaso de precipitado con el vehículo preparado con el tampón cítrico fosfato y el resto de los excipientes y una cantidad ya pesada de 6,9 g de HP-β-CD para la formación del complejo. La cantidad pesada de NaCl para garantizar la isotonicidad del preparado fue de 110 mg. 3. Solución de TIM: para comprobar que TIM no se degrada al pH estudiado de 5,3; 340 mg de TIM fueron añadidos a un vaso de precipitado con el vehículo preparado con el tampón cítrico fosfato y el resto de los excipientes y una cantidad ya pesada de 6,9 g de HP-β-CD con el fin de simular las condiciones de la solución de referencia 2. La cantidad pesada de NaCl para garantizar la isotonicidad del preparado fue de 460 mg. 3.2.4 Elaboracin de la formulacin oftlmica. Cabe destacar que todo el proceso de elaboración de la formulación diseñada es realizado en una campana de flujo laminar. Como se indicó anteriormente, el tampón est compuesto por dos tipos de reactivos, ambos disueltos en un vehículo acuoso, en este caso se empleó agua Milli-Q®. Para ello, se disuelven 17,8 g de Di-Sodio Hidrógeno Fosfato 2-Hidrato en un matraz aforado de 500 mL. Seguidamente se disuelven 10,5 g de cido ctrico 1-hidrato en un matraz aforado de 500 mL. Cuando se tienen ambas disoluciones preparadas, se toman 270 mL de la 1:1 pendiente = Kordenada origen (1 - pendiente) 28 Figura 7. Cinética de degradación de ACZ en presencia de HP-  -CD a pH 5,3 ( ) y a pH 7,2 ( ). Como se ha comentado, la hidrólisis que sufre ACZ en el grupo acetamida es la causa de su degradación. El hecho de que la degradación de ACZ disminuya en presencia de HP-β-CD indica que el radical involucrado en la hidrolisis interviene en la formación del complejo ligandofármaco, quedando protegido por la CD (Msson et al., 1999). Para verificar este hecho se ha realizado un estudio de la complejación por resonancia magnética nuclear de protones (1H RMN), el cual manifestó que el grupo acetamida, que es el susceptible de ser hidrolizado, se incorpora a la cavidad apolar de la CD por su metilo al formarse el complejo de inclusión con estequiometria 1:1, impidiendo la hidrólisis del fármaco. Estos resultados han sido presentados en el XI Foro Internacional CISDEM en el pasado mes de octubre de 2018 en Pamplona (pendiente de publicación). y = 98,9216e-0,0186x R² = 0,9973 y = 96,028e-0,089x R² = 0,998 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 010 20 30 40 50 60 % ACZ TIEMPO (DÍAS) Figura 8. Hidrólisis de ACZ y estructura del complejo ACZ:HP-  -CD. 29 4.4 INFLUENCIA DE TIM SOBRE LA DEGRADACIÓN DE ACZ EN LA FORMULACIÓN FINAL A pH 5,3. Para comprobar la influencia que puede ejercer TIM sobre la degradación de ACZ en solución, hemos de comprobar primero la estabilidad de este segundo fármaco bajo las condiciones ensayadas en el estudio de estabilidad. En la figura 9 se muestran las modificaciones que sufre el TIM a lo largo del tiempo, a ambos pH estudiados. Figura 9. Cinética de degradación de TIM en la formulación final a pH 5,3 ( ) y a pH 7,2 ( ). Como puede observarse TIM no sufre grandes fluctuaciones a lo largo del período de tiempo ensayado lo que hace pensar que es bastante estable en solución a ambos pH (Kulkarni y Amin, 2000). En la figura 10 se observa la tendencia que sigue la degradación de ACZ en la formulación final. Figura 10. Cinética de degradación de ACZ en la formulación final a pH 5,3 ( ) y a pH 7,2 ( ). El proceso de degradación que sigue la ACZ en la formulación oftálmica final no presenta una diferencia notable con respecto a la solución con HP-β-CD (Figura 7), entendiéndose que el TIM no altera la formación del complejo de inclusión formado por la ACZ y HP--CD y no modifica 0 20 40 60 80 100 120 010 20 30 40 50 60 % TIM TIEMPO (DÍAS) y = 98,0474e-0,0202x R² = 0,9981 y = 93,278e-0,066x R² = 0,995 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 010 20 30 40 50 60 % ACZ TIEMPO (DÍAS) 30 por tanto la cinética de degradación de ACZ. La escasa influencia que TIM ejerce sobre el equilibrio de complejación ACZ: HP--CD, ha sido previamente estudiada por este mismo grupo de investigación en el trabajo de fin de grado denominado “Estudios de complejación con timolol y acetazolamida con hidroxipropil-beta-ciclodextrina: aplicacin al desarrollo de una formulacin oftlmica” desarrollado por Sergio Portillo Vzquez en junio de 2015. En dicho trabajo se evidenció que el TIM no alteraba de manera relevante la constante de complejación del complejo integrado por ACZ y HP-β-CD, lo que indica que no tiende a alojarse en el interior de la cavidad de la CD. Este hecho unido a la estabilidad que presenta TIM en solución (Lavik et al., 2011) y al efecto sinérgico que provoca junto a la ACZ (Berson y Epstein, 1981) lo hacen un candidato interesante para la formulación oftálmica final. 4.5 PARÁMETROS DE DEGRADACIÓN. En la tabla 6 se recoge un resumen de los parámetros de degradación calculados a partir de las curvas de degradación de ACZ, el complejo formado con HP-β-CD y la formulación final a pH 5,3 comparados con los obtenidos previamente a pH 7,2. Tabla 6. Parámetros de degradación. FORMULACIÓN pH K40 (d-1) K25 (d-1) T90 (días) t50 (días) Solución ACZ 7,2 0,162 0,017 6 41 Solución ACZ 5,3 0,037 0,004 24 161 Solución ACZ + HP-β-CD 7,2 0,089 0,007 14 95 Solución ACZ + HP-β-CD 5,3 0,019 0,002 53 347 Formulación final 7,2 0,066 0,005 21 141 Formulación final 5,3 0,020 0,002 53 347 Como se puede observar en la tabla 6, el pH influye notablemente sobre los diferentes parámetros de degradación. De esta manera tanto las constantes de degradación a 40°C como a 25°C disminuyen a pH 5,3 mientras que el T90 y t50 aumentan, en todas las soluciones estudiadas. Esto indica que a pH 5,3 nuestro fármaco es más estable, puesto que es menos susceptible de ser hidrolizado al no estar ionizado (Parasrampuria y Gupta, 1989). Además, al evaluar la influencia de la CD (comparando las soluciones ACZ con ACZ + HP-β-CD a ambos pH) las constantes de degradación a 25°C disminuyen (de 0,017 a 0,007 días-1 a pH 7,2 y de 0,004 a 0,002 días-1a pH 5,3) puesto que la presencia del agente complejante aumenta la estabilidad de ACZ al proteger la zona de la molécula que se hidroliza, como se ha comentado anteriormente (Msson et al., 1999). Como consecuencia, los valores del periodo de validez y la semivida de degradación obtenidos aumentan (de 6 a 14 días a pH 7,2 y de 24 a 53 días a pH 5,3 31 para el parámetro T90; y de 41 a 95 días a pH 7,2 y de 161 a 347 días a pH 5,3 para el parámetro t50). Al examinar los datos obtenidos para la formulación final con respecto a la solución de ACZ + HP-β-CD se observan variaciones significativas en los valores de la constante de degradación a 25°C únicamente a pH 7,2 (de 0,007 varía a 0,005 dias-1), por lo tanto, solo serán relevantes a altas velocidades de degradación, siendo prácticamente inapreciables a bajas velocidades de degradación (pH 5,3). De igual manera ocurre con el periodo de validez y semivida de degradación de la fórmula final, aumentando a pH 7,2 de 14 a 21 días y de 95 a 141 días respectivamente. Para comparar el efecto que ejerce el pH respecto al que ejerce la CD en la degradación de ACZ utilizaremos el período de validez (T90) como parámetro más representativo. Se observa que el T90 aumenta de 6 a 24 días en la solución de ACZ por el efecto del pH, de 6 a 14 días por el efecto de la CD a pH 7,2 y de 24 a 53 días por el efecto de la CD a pH 5,3; o expresado en porcentaje, aumenta un 300 % al disminuir el pH mientras que se incrementa en un 133 % a pH 7,2 y 121 % a pH 5,3, debido a la presencia de CD. Por lo tanto, el efecto que ejerce el pH en el proceso de hidrólisis de ACZ es más significativo que el que ejerce la CD, en las condiciones ensayadas. 32 33 5 CONCLUSIONES 1. Se ha comprobado que la presencia de HP-β-CD en la formulación provoca la disminución de la constante de degradación de ACZ a todos los pH ensayados. Por lo tanto, HP-β-CD es un agente complejante que protege a la ACZ de ser hidrolizada al formar un complejo fármaco-ligando con estequiometría 1:1. 2. La velocidad de degradación de ACZ a pH 5,3 ha disminuido con respecto a pH 7,2 en todos los casos estudiados, por lo que se puede concluir que la ACZ se degrada a menor velocidad cuando menor es el pH. 3. Entre la solución de ACZ + HP-β-CD y la formulación final se observan variaciones significativas en los parámetros de degradación a altas velocidades de degradación (pH 7,2) siendo prácticamente inapreciables a bajas velocidades de degradación (pH 5,3). 4. El efecto que ejerce el pH en el proceso de hidrólisis de ACZ es más significativo que el que ejerce la ciclodextrina. 5. A pesar de haberse incrementado el periodo de validez en la formulación oftálmica ensaya, este es insuficiente para comercializarlo en solución. Para solucionar este problema cabe pensar en una alternativa como una preparación extemporánea ya que los valores de T90 a pH 5,3 si permiten la utilización del colirio reconstruido durante al menos un mes permaneciendo dentro de los límites legales exigidos por la administración. 34 35 6 BIBLIOGRAFÍA Abad N. Liposomas ultradeformables de acetazolamida para su administracin oftlmica: Diseo y estudios de caracterización. Trabajo fin de máster, CITURME. Sevilla: Universidad de Sevilla; 2012. Abou-Okeil A, Rehan M, El-Sawy SM, El-bisi MK, Ahmed-Farid OA, Abdel-Mohdy FA. Lidocaine/βcyclodextrin inclusion complex as drug delivery system. Eur Polym J. 2018; 108: 304-310. Agencia Espaola de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS). Real Farmacopea Espaola. 5ª ed. Madrid: Ministerio de Sanidad y Consumo; 2015. Becker B. Decrease in intraocular pressure in man by a carbonic anhydrase inhibitor, Diamox: A Preliminary Report. Am J Ophthalmol. 1954; 37 (1): 13-15. Berson FG, Epstein DL. 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