Determinación de grasa trans en productos alimentarios en España por aplicación de la espectrofotometría infrarroja por transformadas de Fourier y reflexión total atenuada de segunda derivada (ART-FTIR (-2D))

Universidad de Sevilla FACULTAD DE FARMACIA Programa de Doctorado en Farmacia DETERMINACIÓN DE GRASA TRANS EN PRODUCTOS ALIMENTARIOS EN ESPAÑA POR APLICACIÓN DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA INFRARROJA POR TRANSFORMADAS DE FOURIER Y REFLEXIÓN TOTAL ATENUADA DE SEGUNDA DERIVADA (ATR-FTIR (-2D)) Tesis Doctoral Doctoranda: Sara Galvin Leyton Directores: Profa. Dra. María Violante de Paz Báñez Prof. Dr. Matías Guzmán Chozas Sevilla, 2024 AGRADECIMIENTOS Desde el inicio de la tesis doctoral son muchas las personas a las que quiero mostrar mi agradecimiento. En primer lugar, a mis directores. Al Prof. Dr. Matías Guzmán Chozas por confiar en mí desde que llegué a la Facultad. Por todo su tiempo, cercanía, preocupación, implicación y paciencia. Por guiarme y acompañarme en este camino. Por todas las oportunidades y sueños que me ha brindado y, sobre todo, por la enseñanza a nivel personal y profesional que ha dejado en mí. A la Profa. Dra. María Violante de Paz Báñez, por su ayuda en todo momento. Jamás podré agradecer todo el tiempo que ha invertido en este estudio, por su dedicación y por contagiarme de esas buenas sensaciones. Gracias por ayudarme en las circunstancias adversas y a tener paciencia. Agradezco a la Profa. Dra. Remedios Guillén Sans por su apoyo, sugerencias, aportaciones, pero, sobre todo, por el tiempo compartido, que han permitido enriquecerme y disfrutar de este proceso. Agradecemos la provisión de muestras de margarinas al proveedor comercial D.Antonio Moreno Maqueda. Y la disponibilidad de instrumentación en los ensayos de los aceites vegetales comestibles al Prof. Dr. Manuel Galán Vioque. También quiero dar las gracias al Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica por el apoyo y por darme la oportunidad de integrarme en el equipo de trabajo. Por otro lado, debo nombrar a todas aquellas personas que han estado a mi lado durante toda la investigación. A mis padres, habéis sido mi pilar fundamental, las personas que más habéis estado día tras día dándome ánimos. Gracias por la paciencia que habéis tenido conmigo, por enseñarme a luchar y por vuestro apoyo incondicional. Gracias también a mis “hermanos pequeños” por vuestro apoyo, consejos y compresión y cariño en los momentos díficiles. A mi sobrino, aquel que entraba a mi habitación con esa sonrisa y me contagiaba de alegría. Ahora es el momento de dedicarte todo mi tiempo. Eres mi luz. A mis compañeras de vida, las que han estado día tras día dándome fuerza, no dejándome caer, ofreciéndome todo su cariño y energía, por entender mi situación y estar al otro lado esperándome. No tengo palabras para expresar todo lo que me habéis apoyado y la confianza depositada en mí, solo puedo daros las gracias por estar a mi lado y vivir esta experiencia juntas. Y, por último, la más especial y a la que va dedicada mi Tesis Doctoral, a mi hermana, por ser un ejemplo que seguir. Me has enseñado durante todos estos años que, frente a una adversidad, debes de poner toda tu fuerza, ganas, energía, una gran sonrisa y luchar por aquello que quieres conseguir. Gracias por estar siempre a mi lado. ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................... 1 ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................. 3 ABREVIATURAS .......................................................................................................... 5 RESUMEN ...................................................................................................................... 9 ABSTRACT .................................................................................................................. 11 Capítulo 1. Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblacionales, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios ................ 15 1.1 Hidrogenación parcial de los aceites insaturados ............................................ 18 1.2 Trans-isomerización inducida por radicales libres .......................................... 20 1.3 Uso y ventajas tecnológicas de los aceites parcialmente hidrogenados ......... 20 1.4 Ácidos grasos trans procedentes de rumiantes (R-TFA) ................................. 21 1.5 Ácidos linoleicos conjugados (CLAs) ................................................................ 24 1.6 Ingestas de grasa trans ....................................................................................... 25 1.6.1 El Estudio TRANSFAIR ................................................................................. 31 1.7 Ácidos grasos trans y perfil lipídico .................................................................. 35 1.8 Efectos de la grasa trans sobre la salud ............................................................ 36 1.8.1. Cardiovascular ............................................................................................. 38 1.8.2 Tipo de fuente ................................................................................................ 38 1.8.3 Diabetes tipo-2 .............................................................................................. 40 1.8.4. Grasa trans, maternidad y lactancia ............................................................ 40 1.8.5 Deterioro cognitivo y Alzheimer ................................................................... 41 1.8.6 Obesidad ........................................................................................................ 42 1.8.7 Capacidad Reproductora .............................................................................. 42 1.9 Alternativas a los aceites hidrogenados. Reformulaciones ............................. 43 1.9.1 Interesterificación química ............................................................................ 45 1.9.2 Interesterificación enzimática ....................................................................... 45 1.9.3. Fraccionamiento ........................................................................................... 46 1.9.4 Organogeles .................................................................................................. 47 1.9.5 Aplicación de la ingeniería genética ............................................................. 47 1.10 Análisis de la grasa trans .................................................................................. 48 1.10.1 Cromatografía de gases .............................................................................. 48 1.10.2 Espectroscopía infrarroja ........................................................................... 49 1.10.3 Aplicación de la espectrofotometría infrarroja a la determinación de grasa trans por transformada de Fourier y reflexión total atenuada (ATR-FTIR) .......... 51 1.10.4 Método de espectroscopía infrarroja ATR-FTIR de segunda derivada ...... 54 Capítulo 2: Legislación y Recomendaciones .............................................................. 57 2.1 Dinamarca ........................................................................................................... 59 2.2. Canadá ................................................................................................................ 61 2.3 Estados Unidos .................................................................................................... 62 2.3.1 Nueva York y otras localidades de Estados Unidos ...................................... 64 2.4 Unión Europea .................................................................................................... 65 2.5 Europa ................................................................................................................. 67 2.6 España ................................................................................................................. 68 2.7 Sudamérica .......................................................................................................... 69 2.8 Asia ....................................................................................................................... 71 2.9 África ................................................................................................................... 72 2.10 India y Pakistán ................................................................................................ 73 2.11 Australia y Nueva Zelanda .............................................................................. 74 2.12 Organización Mundial de la Salud (OMS) ..................................................... 75 Capítulo 3: Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATRFTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada .................................. 81 3.1. Introducción ....................................................................................................... 81 3.2. Material y Métodos ............................................................................................ 85 3.2.1 Reactivos ........................................................................................................ 85 3.2.2 Aparatos ........................................................................................................ 86 3.2.3 Muestras ........................................................................................................ 86 3.2.4 Procedimientos .............................................................................................. 87 3.2.5 Análisis estadístico ........................................................................................ 89 3.3 Resultados ........................................................................................................... 90 3.4 Discusión .............................................................................................................. 93 3.4.1 Límites de grasa trans ................................................................................... 93 3.4.2 Niveles de grasa trans en margarinas ........................................................... 94 3.4.3 Evaluación de la grasa trans en las margarinas españolas .......................... 99 3.4.4. Ingestas de grasa trans por consumo de margarinas ................................ 100 3.4.5 Alternativas tecnológicas al uso de aceites parcialmente hidrogenados en la fabricación de margarinas ................................................................................... 101 3.5 Conclusiones ...................................................................................................... 103 Capítulo 4.1: Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos ...................................................................................................................................... 109 4.1.1 Introducción ................................................................................................... 109 4.1.2. Material y Métodos ....................................................................................... 111 4.1.2.1 Reactivos y Aparatos ................................................................................ 111 4.1.2.2 Muestras ................................................................................................... 112 4.1.2.3 Calibración del método ............................................................................ 112 4.1.2.4 Tratamiento de las muestras .................................................................... 114 4.1.2.5 Procedimiento espectrofotométrico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada (AOCS, 2009) ........................................................................................ 115 4.1.3 Resultados ...................................................................................................... 116 4.1.4 Discusión ......................................................................................................... 117 4.1.5 Conclusiones ................................................................................................... 128 Capítulo 4.2: Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz ......................................... 133 4.2.1 Introducción ................................................................................................... 133 4.2.2 Material y Métodos .................................................................................... 135 4.2.2.1 Reactivos y Aparatos ................................................................................ 135 4.2.2.1.1 Reactivos ................................................................................................ 135 4.2.2.1.2 Aparatos ................................................................................................ 136 4.2.2.2 Muestras ................................................................................................... 136 4.2.2.3 Procedimientos ......................................................................................... 138 4.2.3 Resultados ...................................................................................................... 140 4.2.4 Discusión ......................................................................................................... 147 Capítulo 5: Incidencia de cáncer de mama asociado a las ingestas de grasa trans: meta-análisis de estudios caso-control ...................................................................... 161 5.1 Introducción ...................................................................................................... 161 5.2 Metodología ....................................................................................................... 162 5.2.1 Elegibilidad. Extracción de datos ............................................................... 162 5.2.2 Criterios de exclusión .................................................................................. 163 5.2.3 Riesgo de sesgo (calidad del estudio) ......................................................... 163 5.2.4 Heterogeneidad ........................................................................................... 165 5.2.5 Síntesis de resultados. Modelos de efectos fijos y efectos aleatorios .......... 166 5.2.6 Análisis adicionales ..................................................................................... 167 5.2.7 Estadística ................................................................................................... 168 5.3 Resultados y Discusión ..................................................................................... 169 5.3.1 Selección de los estudios ............................................................................. 169 5.3.2 Características de los estudios .................................................................... 170 5.3.3 Riesgo de sesgo ............................................................................................ 176 5.3.4 Magnitud del efecto: síntesis cuantitativa ................................................... 180 5.3.5 Análisis de sensibilidad ............................................................................... 185 5.3.6 Fortalezas, limitaciones y conclusiones ...................................................... 187 5.4 Conclusiones ...................................................................................................... 189 CONCLUSIONES FINALES ................................................................................... 191 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 197 1 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Contenidos estacionales de TFAs en mantequillas francesas (Morin, 2005). . 23 Tabla 2. Porcentajes de TFA, sobre grasa total, en tejido adiposo en las poblaciones de distintos países (Combe et al., 1998) .............................................................................. 26 Tabla 3. Evaluación de las ingestas de grasa trans en distintos países. ......................... 27 Tabla 4. Límites máximos recomendados de ingesta de grasa trans ............................. 32 Tabla 5. Comparación entre las interesterificaciones química y enzimática (List, 2004) ........................................................................................................................................ 46 Tabla 6. Características espectrales de los posibles estándares cero-trans .................... 85 Tabla 7. Contenido de grasas trans de las margarinas ensayadas (Galvin et al., 2016) 92 Tabla 8. Contenido de grasa trans (porcentaje sobre grasa total) en margarinas de varios países .............................................................................................................................. 96 Tabla 9. Contenido de grasa trans en margarinas en España ....................................... 100 Tabla 10. Calibración del método aplicado ................................................................. 113 Tabla 11. Contenido de grasa trans de los productos alimentarios ensayados ............ 118 Tabla 12. Índices de aterogenicidad (IA)a ................................................................... 119 Tabla 13. Evolución del contenido de grasa trans en las galletas ................................ 121 Tabla 14. Evaluación de los niveles de grasa trans en patatas fritas de establecimientos de comida rápida ........................................................................................................... 127 Tabla 15. Datos para construir la línea del tiempo para patatas fritas de comida rápida en España ........................................................................................................................... 128 Tabla 16. Muestras de aceites vegetales comestibles estudiadas ................................ 137 8 9 RESUMEN Los ácidos grasos trans son más perjudiciales desde el punto de vista nutricional que los ácidos grasos saturados. Una ingesta excesiva de grasa trans afecta principalmente al sistema cardiovascular, aumentando la incidencia de cáncer y otras patologías. En 2004, Dinamarca y Canadá lideraron la limitación de su contenido en alimentos al 2% sobre grasa total. Otra medida adoptada fue la obligatoriedad de incluir información sobre grasa trans en el etiquetado, propuesta por la Food and Drug Administration (FDA) de EE. UU. a partir de 2006. En 2015, La FDA prohibió uso de aceites parcialmente hidrogenados, principal fuente de los ácidos grasos trans de origen industrial. En 2019, la Comisión Europea finalmente restringió el contenido de grasa trans de origen industrial en alimentos del 2%, sobre grasa total. Aún existen regiones en países del Este Europeo, antiguas repúblicas soviéticas, zonas asiáticas (India y Pakistán) y gran parte de África donde se detectan cifras muy altas y preocupantes de grasa trans en alimentos procesados, debido a la falta de regulaciones efectivas. La Organización Mundial de la Salud (OMS) está implementando el programa REPLACE para eliminar el uso de la grasa trans a nivel mundial. En este trabajo se analizaron margarinas españolas reformuladas (“cero trans”) que presentaban niveles de grasa trans inferiores al 0,5%, sobre grasa total. Se empleó el método de análisis de infrarrojos ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada, el cual se demostró ser más rápido, eficaz y sencillo que el método de cromatografía de gases. Antes de las reformulaciones, la carga de grasa trans en margarinas era muy alta en países como Canadá, Estados Unidos o Países Bajos. Se evaluaron también varios productos tradicionalmente ricos en grasa trans (dónuts, galletas, snacks, palomitas de maíz, sopas deshidratadas y alimentos de comida rápida), encontrando que los niveles de grasa trans eran inferiores al 1% sobre la grasa total, excepto en los casos de las palomitas de maíz y las patatas fritas de McDonald's, que oscilaron entre el 1,1% y el 2%. En ningún caso se superó el límite legal del 2%. De las 23 muestras de aceites vegetales comestibles analizadas (oliva, girasol, maíz), sólo 7 proporcionaban información sobre los índices de calidad y autenticidad (índices de acidez, peróxidos, refracción, extinciones específicas en el UV), sin hacer mención específica a los ácidos grasos trans. Algunas muestras mostraban índices de estar 10 oxidados. En los aceites refinados, los niveles de grasa trans oscilaban entre el 1% y del 2%. Mantener estos niveles por debajo del 1% resulta difícil y poco realista, especialmente en el caso de la refinación física, si la temperatura supera los 240ᵒC. El meta-análisis de los estudios caso-control de los últimos años sobre la asociación entre el consumo excesivo de grasa trans y el riesgo de incidencia de cáncer de mama indicó un incremento del riesgo de hasta un 41% (“odds ratio”=1,41). Se han analizado las fortalezas, limitaciones y conclusiones acerca de estos estudios caso-control. 11 ABSTRACT From a nutritional point of view, trans-fatty acids are even more harmful than saturated fatty acids. Excessive intake of trans fat primarily affects the cardiovascular system, increasing the incidence of cancer and other pathologies. In 2004, Denmark and Canada led the way in limiting trans-fat content in food to 2% of total fat. Another measure implemented was the mandatory inclusion of trans fat information on labeling, proposed by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) starting in 2006. In 2015, the FDA banned the use of partially hydrogenated oils, the main source of industrially produced trans fatty acids. In 2019, the European Commission finally restricted industrial trans-fat content in food to 2% of total fat. There are still regions in Eastern European countries, former Soviet republics, Asian areas (India and Pakistan), and much of Africa where very high and concerning levels of trans fat in processed foods are reported due to ineffective regulations. The World Health Organization (WHO) is implementing the REPLACE program to eliminate trans fat use globally. In this study, reformulated Spanish margarines ("zero trans") were analyzed, showing trans-fat levels below 0.5% of total fat. The second derivative ATR-FTIR (-2D) infrared analysis method was used, proving to be faster, more effective, and simpler than gas chromatography. Prior to the reformulations, the trans-fat content in margarines was very high in countries like Canada, the United States, or the Netherlands. Various products traditionally high in trans-fat (doughnuts, biscuits, snacks, popcorn, dried soups, and fast food) were also evaluated, revealing that trans-fat levels were below 1% of total fat, except for cases like McDonald's popcorn and French fries, which ranged from 1.1% to 2%. In no instance did they exceed the legal limit of 2%. Out of the 23 samples of edible vegetable oils analyzed (olive, sunflower, corn), only 7 provided information on quality and authenticity indices (acidity, peroxides, refraction, specific UV extinctions), without specific mention of trans fatty acids. Some samples showed signs of being oxidized. In refined oils, trans fat levels ranged between 1% and 2%. Keeping these levels below 1% is challenging and unrealistic, especially in the case of physical refining, if the temperature exceeds 240°C. 12 The meta-analysis of case-control studies in recent years on the association between excessive trans-fat consumption and the risk of breast cancer indicated an increased risk of up to 41% (odds ratio = 1.41). The strengths, limitations, and conclusions of these casecontrol studies have been analyzed. 13 CAPÍTULO 1: Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblacionales, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 14 Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 15 Capítulo 1. Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblacionales, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios Los ácidos grasos trans (TFA) son definidos por la “Food & Drug Administration” (FDA) americana como “los ácidos grasos insaturados que contienen uno o más dobles enlaces aislados (no conjugados) en configuración trans” (FDA, 2003). Dinamarca y Canadá se acogen a la misma definición. El “Codex Alimentarius Mundi” propone una definición similar. Los define como “todos los isómeros geométricos de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y poliinsaturados (PUFA) que presentan dobles enlaces no-conjugados; interrumpidos por, al menos, un grupo metileno, que se forman durante la hidrogenación de aceites y grasas en presencia de catalizadores químicos” (Codex Alimentarius, 2006). Para la “European Food Safety Authority (EFSA)” un ácido graso trans “es un ácido graso insaturado que presenta, al menos, un doble enlace en configuración trans. Algunos presentan una estructura conjugada (por ejemplo: ácidos linoleicos conjugados (CLAs) en grasa láctea), pero la mayoría presentan dobles enlaces aislados” (EFSA, 2004). En la misma línea, la “Agencia de Seguridad Alimentaria de Francia (AFSSA)” definió a los ácidos grasos trans como “cualquier ácido graso insaturado que presenta uno o más dobles enlaces en configuración trans”. La Agencia francesa (AFSSA) se decantó por esta definición, argumentando que los CLAs se metabolizaban siguiendo las mismas rutas metabólicas que los enlaces trans aislados y que al menos, se sabía que el isómero trans-10, cis-12 CLA presentaba efectos adversos (esteatosis hepática). Sin embargo, predomina la definición que no incluye a los CLAs (FDA, Codex, Dinamarca…), basándose en que los CLAs podrían ser beneficiosos para la salud, por ejemplo, como anti-aterogénicos y anti-cancerígenos, aunque aún sea un tema a debate, que exige mayor investigación (Ledoux et al., 2007; Wahle et al., 2004). Etimológicamente cis- (latín) significa “sobre este lado”, mientras que trans (latín) significa “atravesado”. La disposición en zig-zag de los -CH- del doble enlace trans endurecen la cadena hidrocarbonada en comparación con el enlace cissiendo característica la vibración de flexión fuera del plano con torsión. Los ácidos grasos con enlace cis- (predominan en la naturaleza, salvo muy raras excepciones, como en algunos Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 16 marsupiales o en membranas cloroplásticas de algas) son líquidos a temperatura ambiente (ácido oleico, punto de fusión 14 ᵒC), mientras que las formas trans, que se asemejan a la estructura lineal de los ácidos grasos saturados, son sólidas (ácido elaídico, punto de fusión 45 ᵒC) (Figura 1). Fig. 1. Estructuras comparadas de los ácidos grasos cis y trans. Para que tenga lugar la isomerización geométrica debe superarse una energía de activación de 65 kcal/mol, pasando la configuración cis a la configuración trans, que es termodinámicamente más estable, aumentando el punto de fusión y cambiando la polaridad del ácido graso. Las fuentes, o el origen, de la grasa trans (TFAs), se pueden encontrar o bien en el procesamiento de los alimentos, y se les conoce como los producidos industrialmente (IP-TFA), a través de: - Hidrogenación parcial catalítica de aceites vegetales o de aceites de pescado insaturados. - Frituras con aceites vegetales. - Blanqueamiento/desodorización, etapas en la refinación de aceites vegetales. - Irradiación de alimentos. Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 17 O bien, pueden ser de origen natural, producidas en la biohidrogenación bacteriana de los ácidos linoleico y α-linolénico en el rumen de los animales rumiantes, y que se encontrarían en la leche (lácteos) y carne de rumiantes. La absorción intestinal y digestión de los TFAs es prácticamente la misma que la forma cis, pudiéndose así incorporar posteriormente, en distinta extensión, en tejidos y órganos. Así, después de absorbidos, se incorporan de forma usual al tejido adiposo, glándulas mamarias, y los fosfolípidos de membrana de eritrocitos. La inclusión es menos aparente en corazón y cerebro y un poco mayor en hígado (Valenzuela & Morgado, 1999). Por consiguiente, las concentraciones de TFAs en sangre y tejidos biológicos humanos reflejan sus ingestas en nuestra dieta. El tejido adiposo, con un recambio lento (vida media: 1-2 años) puede considerarse la mejor opción para evaluar la ingesta de grasa trans a largo plazo. Los glóbulos rojos, con un recambio moderado (vida media: 1-4 meses) sirven para evaluar las ingestas a medio plazo. El plasma y el suero sanguíneo, con un recambio rápido (vida media: 5-10 días) son útiles para ingestas a corto plazo y la adquisición de sus muestras es más accesibles. La concentración en leche materna refleja la ingesta del día anterior (Arab, 2003). La isomería geométrica se intuyó en 1819, fecha en la que Poutet, un farmacéutico de Marsella, consiguió transformar trioleína en trielaídina empleando una mezcla de mercurio y de “ácido azótico” (ácido nítrico) (Jart, 1961). Este tipo de isomerización del ácido oleico en presencia de óxidos de nitrógeno (NO, NO2) se conoció más tarde como la “reacción de la elaídina”, en el equilibro ácido oleico-ácido elaídico se forma el isómero trans en un 66% (Griffiths & Hilditch, 1932). Moore, en 1919, encontró que el componente predominante del ácido iso-oleico, obtenido por hidrogenación del oleato de etilo, era el ácido elaídico. Pero la caracterización espectral en el infrarrojo del doble enlace trans fue presentida por (Rasmussen et al., 1947) trabajando con octenos en una refinería de petróleo en California. Por la misma época, se detectó la banda trans a 10,36 µm (968 cm-1) en el aceite de linaza hidrogenado. Dicha banda también aparecía en el espectro de infrarrojos de otros aceites parcialmente hidrogenados y en aceites vegetales tratados con Selenio a 220 ᵒC . Por medidas del índice de iodo se pudo confirmar que la intensidad de absorción a 968 cm-1 era proporcional a la extensión con que se producía la isomería cis o trans (Lemon & Cross, 1949). Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 24 1.5 Ácidos linoleicos conjugados (CLAs) Los ácidos linoleicos conjugados (CLAs) tienen su origen en la bio-hidrogenación y pueden sintetizarse en nuestro organismo por síntesis endógena, a partir de ácido vacénico. Asimismo, existe la posibilidad de que se formen en pequeña extensión al inicio del proceso de hidrogenación de aceites insaturados o durante una etapa de desodorización de aceites, especialmente cuando la temperatura supera los 250 ᵒC, o incluso a temperaturas menores en el caso de aceites-PUFA (maíz, soja) (Destaillats & Angers, 2005). Prácticamente todos los CLAs presentan el doble enlace conjugado trans (los cis son minoritarios). La banda de absorción-infrarroja a 984 cm-1 (10,2 µm) se observa (con una extinción específica inferior a la de los IP-TFA) debido a la vibración de deformación fuera del plano de los -CH- trans. Los CLAs se encuentran predominantemente en un 70% en la leche y en un 25% en la carne, siendo el ácido ruménico (cis 9, trans-1 18:2) el 75-90% de los CLAs totales (Parodi, 2003). El ácido ruménico parece manifestar cierta actividad biológica positiva; por otro lado, el isómero trans-10, cis-12 18:2 es bastante nocivo, aunque, afortunadamente, sólo aparece en porcentajes inferiores al 1% sobre la grasa total de los alimentos (Park, 2009). Con una dieta mixta para el ganado, la presencia de CLA en leche se sitúa en un rango del 0,3-0,6%. Sin embargo, si la dieta se basa en pastizales, puede llegar al 1,1%, e incluso llegar al 5,17% si en la dieta del animal se incorpora aceite de girasol (Bauman & Lock, 2006). Los CLAs tienen el potencial de ejercer efectos beneficiosos para la salud (Gómez Cortés et al., 2018), pero no son todos los CLAs. Mientras que el isómero trans-10, cis- 12 18:2 está asociado a procesos catabólicos, el ácido ruménico y su precursor, el ácido vacénico, pueden actuar como ligandos de los receptores activados por proliferadores peroxisómicos (receptores activados por proliferadores peroxisomales, PPAR), y presentar actividad anti-arterioesclerótica y anti-carcinogénica (Gómez Cortes et al., 2018; Shokryzadan et al., 2017). La mezcla equilibrada de ácido ruménico con el isómero trans-10, cis-12 18:2 se mostró útil frente a la adiposidad abdominal, sin mostrarse anomalía hepática, dado los bajos niveles de concentración de los isómeros mezclados (Whigham et al., 2007). Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 25 1.6 Ingestas de grasa trans Las ingestas poblacionales dependen de los hábitos de consumo, frecuencia de consumo y estratos de la población considerada. Se confeccionan a partir de datos representativos de los consumos promedio poblacionales en cada país, obtenidos a través de encuestas de consumo alimentario o de entrevistas. Es una tarea cara, laboriosa y limitada. Se consiguen datos primarios de los consumidores por medio de metodologías tales como: - Recuerdo de 24 horas; - Registros de 7 días; - Cuestionarios de frecuencia (FFQ); - Empleos de Tablas de Composición de Alimentos. Estas tablas deberían ser preferentemente locales o nacionales. En España disponemos de las elaboradas por la Base de Datos Española de Composición de Alimentos (BEDCA) o las que editaba la profesora Moreiras y su grupo, del Departamento de Nutrición de la Universidad Complutense. Si se carece de dichas tablas o se dispone de tablas incompletas, se podría acudir a tablas generalistas, que se van renovando periódicamente. Las más recomendadas son las británicas de Widdenson & McCance (“The Composition of Foods”), o las de la USDA (Departamento de Agricultura de Estados Unidos). Lo ideal sería poder disponer de fuentes directas concretas, a través de un trabajo de investigación reciente, ya que dentro de cada grupo de alimentos puede existir una amplia variabilidad. Asimismo, se podrían emplear ecuaciones empíricas que establezcan relaciones entre las concentraciones biológicas de los TFAs y las ingestas de grasa trans mediante bio-marcadores (tejido adiposo, plasma, membranas de eritrocitos, leche materna). Aunque esta metodología sería más representativa, su implementación resulta más costosa y compleja. Es innegable que evaluar las consecuencias clínicas a largo plazo de un consumo habitual de grasa trans, bajo condiciones dietéticas totalmente controladas, no ha sido factible debido a las limitaciones éticas que esto conlleva. Globalmente, con el transcurso de los años (sobre todo a partir del año 2000) se han ido reduciendo las ingestas de grasa trans, al menos en los países más desarrollados y con legislaciones más contundentes (Micha et al., 2014). Aun así, habría que emprender Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 26 políticas para tratar de reducir las ingestas de grasa trans en las franjas poblacionales más desfavorecidas, también en los países más desarrollados (Allen et al., 2015). Como el 75-80% del TFA ingerido pasa a tejido adiposo humano, dicho tejido es un bio-marcador bastante representativo de las ingestas de grasa trans. Se puede calcular mediante la Ecuación de Enig (Ecuación 1) (Enig et al., 1990), y=0,97 + 0,44x Ecuación 1 Donde: x = porcentaje (%) de TFA en tejido adiposo; y = porcentaje (%) de TFA en la dieta. Se puede conocer las ingestas de TFA conociendo el %TFA, sobre grasa total, en el tejido adiposo, aplicando la técnica analítica (cromatografía de gases, espectroscopía infrarroja), después de conseguir la muestra de la persona mediante una biopsia abdominal (Boué et al., 2000). De los datos de la Tabla 2 se desprende la brecha existente entre las poblaciones de los países anglosajones, con mayor ingesta de grasa trans, y los países mediterráneos. España presenta el valor más bajo de la Tabla. Tabla 2. Porcentajes de TFA, sobre grasa total, en tejido adiposo en las poblaciones de distintos países (Combe et al., 1998). País % TFA en tejido adiposo Canadá 4,8 EEUU 3,2 Reino Unido 3,0 Francia 1,8 Grecia 1,2 España 0,6 Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 27 En las madres lactantes el contenido de grasa trans en la leche materna refleja fehacientemente la ingesta del día anterior al de la medida (Boatella et al., 1993). Se sabe que a través de la leche en la lactancia se trasladan al bebé grasa trans lo que puede perjudicar su desarrollo y el del sistema nervioso central. En la Unión Europea sólo están regulados los preparados para lactantes y de continuación mediante una Directiva en la que se establece que “el contenido de ácidos grasos trans no será superior al 3%, sobre el total de materia grasa del producto” (CEE, 2006). En la Tabla 3 se recoge la evolución con los años del consumo de grasa trans de algunos países representativos. Tabla 3. Evaluación de las ingestas de grasa trans en distintos países. País Año Ingesta de TFA (g/p/d) Referencia EEUU 1980s 7-12,8 Hunter & Applewhite, 1991 1990s 5,3 Borra et al., 2007 2003 4,0-6,4 Hunter, 2006 2010 1,3 Doell et al., 2012 Canadá 1980s 8-12 Aro et al., 1995 1990s 8,4 Ratnayake et al., 2009 2006 2,2-3,4 Ratnayake et al., 2009 Dinamarca 1980s 6-17 Aro et al., 1995 1991 5,0 Stender & Dyerberg, 2004 1997 2,7 Stender & Dyerberg, 2004 Reino Unido 1980s 7 Sanders, 1988 1990s 2,8 Hulshof et al., 1999 2003 3,0 (H)* 2,1 (M)* Laloux et al., 2007 Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 28 País Año Ingesta de TFA (g/p/d) Referencia Alemania 1980s 5-6,5 Aro et al., 1995 1990s 3,7 Steinhart & Pfalzgraf, 1995/1996 Países Bajos 1980s 10 Spaaij & Pijls, 2004 1990s 4,3 Health Council of the Netherlands, 2006 Noruega 1980s 7,1 Aro et al., 1995 1990s 4,0 van Poppel et al., 1998 2010 2-4 Wanders et al., 2017 Suecia 2010 0,7 Wanders et al., 2017 Islandia 1990s 5,4 Hulshof et al., 1999 2010 2,4 Wanders et al., 2017 Francia 1980s 5-6,5 Aro et al., 1995 1990s 2,3 Hulshof et al., 1999 2003 2,7-3,3 Léger et al., 2007 Italia 1980s 2-3,5 Boatella et al., 1993 1997 1,6 Pizzoferrato et al., 1999 Grecia 1990s 1,4 van Poppel et al., 1998 Portugal 1990s 1,6 van Poppel et al., 1998 España 1980s 2-3 Boatella et al., 1993 1990s 2,4 Parcerisa et al., 1999 2001 2,05 Capita & Alonso-Calleja, 2003 2010 0,78 Papantoniou et al., 2010 Polonia 1990s 3,3-6,9 Zbikowska, 2010 Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 29 País Año Ingesta de TFA (g/p/d) Referencia Japón 1990s 1,56 Okamoto et al., 1999 Zhou et al., 2003 2007 1,8 Yamada et al., 2010 China 1990s 0,4 Zhou et al., 2003 Corea del Sur 1990s 0,6 Craig-Schmidt, 2006 Irán 2010 9,3 Wanders et al., 2017 Brasil 2008 2,4 Wanders et al., 2017 Costa Rica 2006 2,9 Wanders et al., 2017 Sudáfrica 1990s 1,5 MacIntyre et al., 2002 Oriente Medio 2010 5,3 Wilczek et al., 2017 *H=Hombres; M=Mujeres. En líneas generales, las ingestas descendieron conforme se introducían las reformulaciones en dichos países a partir de los años noventa. El descenso ha sido significativo en Norteamérica y Centroeuropa. En los países mediterráneos se mantuvieron siempre ingestas menores. Es de destacar las muy bajas ingestas en países asiáticos orientales, como Japón, Corea del Sur y China. En América Latina también se ha trabajado para rebajar las ingestas de grasa trans. En cambio, en Europa del Este (Polonia), Irán y Oriente Medio las ingestas eran más altas. En España, las ingestas de grasa trans siempre han sido bajas. En los Estados Unidos, del 2003 al 2010 se produjo un descenso notable de la ingesta de grasa trans, que alcanzó el 72%. En este país, en 2004, todavía eran sustanciales las ingestas debido al consumo de margarinas duras, dónuts, bollería, precongelados y palomitas de maíz. Canadá figuraba en las décadas de 1980s y 1990s a la cabeza de las ingestas en grasas trans: más de un 10% se ingerían con las margarinas no reformuladas, contando también el consumo de bollería y pastelería industrial y productos y snacks de comida rápida. La grasa trans que se ingería en este país suponía hasta el 10% Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 30 de la grasa total ingerida, alcanzándose cifras impensables, de hasta 38 g/p/d. Como el 90% de la grasa trans se presenta como “grasa invisible”, se dieron casos de un consumo indebido en embarazadas canadienses, lo que repercutió negativamente en el normal desarrollo del feto (Elias & Innis, 2002). Dinamarca presentó un descenso sostenible de grasa trans entre 1991 y 1996, lo que se apreció en la salud cardiovascular de la población (Leth et al., 2006). En algunos países como en Alemania, Francia y España, la ingesta de grasas trans era mayor en hombres que en mujeres mientras que en otros, como Japón, las mayores ingestas se producían en mujeres de mediana edad. En los Países Bajos, el 25% de la ingesta de TFA provenía del consumo de galletas, bollería y repostería, y un 9% de fritos y snacks. En Suecia, en cambio, el nivel de ingestas era sólo del 0,3 E% y la bollería, pastelería y helados sólo contribuían a la ingesta de grasa trans en un 7%. En Francia, donde la Agencia de Seguridad Alimentaria (AFSSA) acoge también dentro del concepto de ácidos grasos trans a los que provienen de leche (lácteos) y carne de rumiantes, casi el 50% procedía de la mantequilla y los quesos (Laloux et al., 2007). En 2001, alrededor del 97% de la población española se situaba dentro de los niveles de ingesta considerados aceptables (menos de 2 E%, o sea, menos de 4,2 g/p/d) (Capita & Alonso-Calleja, 2003). Pero si tenemos en cuenta el estudio de la población del Noreste mediterráneo, se hallaron ingestas por debajo del 1 E%, establecido por la OMS, y significativamente diferentes (p<0,01) entre hombres (0,78 E%) y mujeres (0,47 E%) (Papantoniou et al., 2010). Por su parte, en las mujeres japonesas urbanas de mediana edad (frente al grupo equivalente rural) las ingestas de grasa trans podían superar el 1 E%; casi el 40 % de estas ingestas procedían del consumo excesivo de productos de panadería, bollería, y confitería (Yamada et al., 2010). Por el contrario, en el caso de Brasil, las ingestas eran más altas en los adolescentes, sobre todo en los varones (Remig et al., 2010). Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 31 1.6.1 El Estudio TRANSFAIR En 1995, la Comisión Europea financió el proyecto “TRANFAIR Study: Intake of fatty acids in Western Europe with emphasis on trans fatty acids”. TRANSFAIR es un acrónimo formado a partir de “trans fatty acid intake acid risk” (Ingestas de TFAs y factores de riesgo para la enfermedad cardiovascular en Europa). Participaron 14 países de Europa Occidental, entre ellos, España. Se confeccionó una dieta tipo para cada país, se hizo una combinación de los componentes, y se centralizaron todos los análisis en un mismo laboratorio (Países Bajos). Luego se determinaron las ingestas medias en cada país participante expresando los resultados en gramos de TFA por persona y día (g/p/d). España y los países mediterráneos (que suelen cocinar con aceite de oliva) presentaron ingestas por debajo del 1 E% (OMS). Alemania, Reino Unido y Dinamarca estaban en el límite, y Francia lo sobrepasaba un poco. Los países escandinavos y los Países Bajos presentaban las mayores ingestas. Esto se debía a que en los países del Centro y del Norte de Europa solían utilizar en cocina, mantequilla y margarina (Hulshof et al., 1999, van Poppel et al., 1998). Como se observa en la Tabla 4, la FAO/WHO y la Asociación Americana del Corazón (AHA) recomiendan no sobrepasar las ingestas de grasa trans del 1 E%. El mismo criterio siguieron Alemania, Austria, Países Bajos, y Suiza. En cambio, otros países fueron más permisivos y las limitaron al 2 E% (Canadá, Reino Unido y Francia). En España se adoptó una posición ecléctica, la misma que adoptó en principio la Comunidad Europea, recomendando unas ingestas tan bajas como fueron posible, manteniendo el valor nutricional adecuado de la dieta. Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 32 Tabla 4. Límites máximos recomendados de ingesta de grasa trans. País/Organización Límite de ingesta de TFA recomendado Referencia Canadá 2 E% EFSA, 2010 Alemania, Austria 1 E% EFSA, 2010 Países Bajos 1 E% Spaaij & Pijls, 2004 Reino Unido 2 E% EFSA, 2010 Suiza 1 E% EFSA, 2010 Francia 2 E% EFSA, 2010 Reino Unido, países escandinavos 10 E% (suma SFA+TFA) EFSA, 2010 AESAN a tan bajo como sea posible AESAN, 2010 AHAb, ADAc 1 E% Kris-Etherton & Innis, 2007 FAO/WHO 1 E% FAO/WHO, 2010 a AESAN: Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición; b AHA: American Heart Association; cADA: American Dietetic Association. La casuística en India y Pakistán preocupa mucho y afecta a la consecución de los objetivos de la OMS a corto plazo. En estos países y en algunos otros de la zona, es frecuente cocinar con aceites hidrogenados tanto en restaurantes como a nivel doméstico. Se tratan del “ghee” y el “vanaspati”. El “ghee” es una grasa de mantequilla obtenida mediante calentamiento, y separación de la fase acuosa. Se confecciona a partir de la leche de vaca, búfala, cabra u oveja. Es más resistente al enranciamiento que la mantequilla normal. Por su parte, el vanaspati es un aceite vegetal hidrogenado, purificado, y fortificado con vitaminas A y D; es el sucedáneo vegetal del “ghee”. El vanaspati se confecciona a partir de aceites tropicales (de palma, palmiste, y coco) importados, que se hidrogenan parcialmente. Presenta un contenido de grasa trans muy variable (0,6-30 %TFA), pero sólo el 7 % ofrece valores inferiores al 2 %TFA. Además, presenta un alto índice Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 33 aterogénico, pues la suma de ácidos grasos saturados más ácidos grasos trans es superior al 60 % (se recomienda que no sobrepase el 40 %) (Nigam, 2000). La tolerancia gubernamental y la ignorancia ciudadana inciden en un elevado consumo de vanaspati y aceites hidrogenados, tanto procedentes de frituras de abuso, como de la venta callejera de productos populares en dichos países como las “samosa” o los “paratha” y esto ha contribuido a la propagación de enfermedades cardiovasculares, incluso de diabetes (Butt & Sultan, 2009). Las autoridades gubernamentales, a través de una ley de seguridad alimentaria, establecieron una limitación del 10 %TFA para los vanaspati y otros aceites hidrogenados (FSSAI, 2010). Pero la realidad era que en algunas muestras de vanaspati analizadas se superaba de 1,3 a 2,5 veces lo legislado y se encontraron en algunos casos valores muy altos, de hasta el 30 %TFA. El consumo medio de estos aceites vegetales hidrogenados por la población india es de 1,60 g/p/d, lo que sumaba a los 0,60 g/p/d de TFA procedente del vanaspati, existiendo regiones al norte del país, como la del Punjab, con consumos extremos descontrolados de 15 g/p/d, y una mayor tasa de mortalidad de origen cardiovascular (Dixit & Das, 2012). Pakistán, al igual que la India, presenta ingestas excesivas de grasa trans. De acuerdo con el desafío de la OMS para 2023, se realizaron esfuerzos para eliminar los ácidos grasos trans de origen industrial (IP-TFA). Junto al vanaspati, las mayores fuentes de grasas hidrogenadas (PHVOs) han sido las grasas anhidras y concretas (“shortenings”) para uso en bollería, pastelería, margarinas duras, y otras grasas untables. Se constata que todavía la legislación en este país resulta insuficiente y se recomendó reemplazar el vanaspati con alternativas más sanas, implementar mayores prácticas reguladoras, y enmendar las leyes del etiquetado (Tarar et al., 2020). Los países del Este de Europa hace largo tiempo que presentan altos contenidos de grasa trans en sus suministros de alimentos. De un estudio comparativo europeo basado en la “cesta de la compra” se desprendía, por ejemplo, que una misma comida formal constituida por patatas fritas, galletas y palomitas de maíz aportaba menos de 2 gramos de TFA en Francia, Alemania y Reino Unido, mientras que, por el contrario, aportaba 10- 20 g de TFA en Polonia, Hungría o Rumanía (Stender et al., 2012). En Repúblicas ex–soviéticas (Georgia, Kazakhstan, Armenia) o ex–yugoslavas (Serbia, Croacia) se han encontrado recientemente en supermercados entre 50 y 100 productos alimentarios con más de 2 %TFA (sobre grasa total) dándose el caso en algunos Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 40 población de pacientes con cardiopatías diversas se determinaron los TFAs en plasma y en eritrocitos, y luego se representaron frente a la conocida como puntuación Gensini, que mide la severidad de la enfermedad arterial coronaria en función del estrechamiento del lumen de la arteria. Se observó cómo al aumentar los niveles de ácidos grasos trans en sangre aumentaba significativamente (p < 0,001) la puntuación Gensini, es decir, las lesiones ateroscleróticas (Hadj Ahmed et al., 2018). 1.8.3 Diabetes tipo-2 Muchos de los estudios emprendidos fueron de corta duración (apenas de 1 mes) y otros tantos resultados fueron contradictorios (Aronis et al., 2012). Una ingesta excesiva de grasa trans influía en el nivel de resistencia insulínica, por afectación de los receptores insulínicos de las membranas (Hu et al., 2001). Un incremento de 2 E% de TFA en mujeres de mediana edad se asociaba con una incidencia 1,39 veces mayor de diabetes (Salmerón et al., 2001). Se han observado efectos nocivos sobre la insulinemia post-pandrial en el caso de diabéticos obesos con ingestas frecuentes de grasa trans (Risérus, 2008). La grasa trans puede influir sobre la transcripción genética modulando receptores nucleares (PPAR) y el receptor X hepático, que desempeñan papeles clave en el metabolismo de la glucosa (Saravanan et al., 2005). Estudios más recientes han encontrado asociación directa significativa entre la concentración plasmática de ácido elaídico y la incidencia de diabetes tipo-2 en cohortes japonesas y norteamericanas (Itcho et al., 2017). 1.8.4. Grasa trans, maternidad y lactancia La grasa trans ingerida con la dieta en la madre gestante atraviesa la barrera placentaria y se instala en los fosfolípidos sanguíneos y tejidos fetales (Larqué et al., 2001). Esto puede afectar tanto a la duración de la gestación como al peso del bebé al nacer (Koletzko & Müller, 1990). Se encontró una correlación inversa entre los contenidos en sangre de TFAs y PUFAs de prematuras y tejido fetal. Ante esta situación se planteó, si fuera conveniente fortalecer con ácido linoleico la dieta de la madre gestante, pues la grasa trans inhibe la conversión de los ácidos grasos esenciales (EFAs), que son vitales en las primeras etapas de la vida (von Houwelingen & Hornstra, 1994). Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 41 En definitiva, niveles crecientes de ácido grasos trans en plasma materno resultan adversos para: - Crecimiento fetal, pues los ácidos grasos esenciales (EFAs) no pasan a PUFAs de cadena larga, como el ácido docosahexanoico (DHA), ni a prostaglandinas beneficiosas en los tejidos fetales (Dutta-Roy, 2000); - Desarrollo neural y visual; - Desarrollo post-natal (Innis, 2007). La cantidad de TFA detectado en los fosfolípidos fetales se correlacionaban con los encontrados en los fosfolípidos maternos, que eran una huella de la ingesta de grasa trans de la madre (Craig-Schmidt, 2001). Las ingestas de grasa trans de la madre afectan no sólo la calidad, sino también la cantidad de leche materna (Anderson et al., 2005). El contenido de grasa trans en leche materna es fiel reflejo de la dieta más próxima ingerida por la madre. En España, el contenido promedio de TFA en leche materna es 0,98%, sobre grasa total (Boatella et al., 1993), mucho menor que el de las madres norteamericanas (Chen et al., 1995). Así, en Canadá, el contenido promedio de TFA en leche materna era del 1,9% sobre grasa total, y aún más elevado, del 6-7% en los Estados Unidos. Las madres canadienses, durante la lactancia, consumieron un 50% del total de ácidos grasos trans, procedentes de bollería/confitería y snacks, un 11% procedía de “comida rápida” (Innis & King, 1999). 1.8.5 Deterioro cognitivo y Alzheimer Ya se ha visto cómo la grasa trans aumenta los niveles de colesterol plasmático. La distribución intracelular del colesterol, asimismo, modula la presencia del péptido betaamiloide, que se conecta con la demencia (Barnard et al., 2014). En el “Proyecto Envejecimiento y Salud de Chicago”, con más de 800 participantes y 4 años de seguimiento, utilizando un cuestionario de frecuencia (FFQ), se asoció el declive cognitivo y la incidencia de la enfermedad de Alzheimer al consumo continuado de ácidos grasos saturados (SFA) y grasa trans (TFA), mientras que ejercían un efecto de riesgo decreciente el consumo de grasa monoinsaturada (MUFA) y poliinsaturada (PUFA) (Morris & Tangney, 2014). Anteriormente, Morris et al., (2004) habían realizado un seguimiento de 6 años en ancianos y encontraron una clara correlación directa entre ingestas elevadas de grasa trans y una mayor velocidad del deterioro cognitivo. La Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 42 presencia de grasa trans aumentaba los niveles de APP (“Amyloid Precursor Protein”) no amiloidogénica, cuando se comparaba con el comportamiento de los cis-MUFA y cis-PUFA (Grimm et al., 2012). Las moléculas de ácidos grasos trans se incorporan a las membranas de las células cerebrales, alterando la capacidad de las neuronas para comunicarse, y afectando decisivamente el rendimiento mental con la edad (Ginter & Simko, 2016). 1.8.6 Obesidad En Estados Unidos, en una cohorte de más de 16.000 hombres, un elevado consumo de grasa trans se asoció con un aumento moderado de la circunferencia de la cintura, después de ajustar para todos los factores involucrados en la evaluación del índice de masa corporal (Koh-Banerjee et al., 2003). En la India y Pakistán, dónde existía un consumo desmesurado de vanaspati y aceites de cocina con grasa parcialmente hidrogenada, también aumentó la medida (cm) de la circunferencia de la cintura y el índice de masa corporal entre la población (Ghosh, 2007). En una cohorte del prolongado “Nurses´ Health Study” (NHS) (20 años de seguimiento) se observó un aumento del peso corporal entre las mujeres con mayor consumo de grasa trans (Field et al., 2007). Sin embargo, la mezcla en proporción adecuada de los isómeros ácido ruménico y trans-10, cis-12 CLA se mostró útil frente a la adiposidad abdominal (Whigham et al., 2007). 1.8.7 Capacidad Reproductora Se ha detectado asociación entre las ingestas de grasa trans en jóvenes y los parámetros de calidad del semen (Chavarro et al., 2014). También se ha percibido un descenso de testosterona sérica, junto a una morfología anormal de los espermatozoides. Incluso ingestas de 1 E%, si son continuadas, podrían afectar a las hormonas de la reproducción en jóvenes (Mínguez-Alarcón et al., 2017). Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 43 1.9 Alternativas a los aceites hidrogenados. Reformulaciones Los aceites parcialmente hidrogenados han sido, mayoritariamente, la principal fuente industrial de grasa trans. Ya mucho antes de que la FDA no siguiera considerándolos como sustancias GRAS (“generally recognized as safe”), en 2015, de forma progresiva, a partir de 1990 las grandes compañías comenzaron las reformulaciones para evitar la grasa trans en los alimentos procesados. Se avanzó especialmente en la década 2000-2010 cuando el sector industrial implementó muchas iniciativas para reformular margarinas y “shortenings” (grasas anhidras y concretas). En esto tuvo mucho que ver la presión gubernamental sobre la industria alimentaria, y la presión sobre las franquicias de “comida rápida” (“fast-food”), simbolizadas en las decisiones legislativas que implementó Dinamarca, por ejemplo, para tomar ventaja en esta porfía. En otros países, como los Países Bajos, se implementó el conocido como “modelo Polder”, grupo de trabajo colaborativo entre los distintos sectores implicados (gobierno, industria, autoridades sanitarias, y unión de consumidores), que funcionó eficazmente (Katan, 2006). Se contaba con grandes suministros de aceites vegetales comestibles, a nivel mundial, fundamentalmente aceites de palma y de soja, seguidos por el aceite de canola (que era una patente canadiense: aceite de colza rebajado de ácido erúcico) ¿Cuánto de esta producción global se convertía en aceites parcialmente hidrogenados? Al parecer, en 2007, casi un tercio de la producción, fundamentalmente de aceite de soja, en los Estados Unidos (Eckel et al., 2007). La tarea de eliminar estos aceites hidrogenados de los suministros alimentarios exigía reemplazarlos por ciertos aceites/grasas con propiedades físicas, reológicas y sensoriales semejantes. Había que tener en cuenta consideraciones sobre: - Disponibilidad; - Logística de las cadenas de suministro; - Aceptación del consumidor; - Costes (Borra et al., 2007). El empleo de aceites tropicales (aceites de palma, palmiste y coco) fue la decisión a tomar más fácil e inmediata, a la vez que económica, sobre todo en lo que se refiere al aceite de palma. Se trata de un aceite semi-sólido, a temperatura ambiente, de buena Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 44 conservación y palatabilidad, pero que contiene un 50 % de grasa saturada (44% de ácido palmítico). Mientras aumenta significativamente los niveles de HDL-C respecto al aceite parcialmente hidrogenado, también incrementa las lipoproteínas LDL-C con respecto a los aceites vegetales bajos en grasas saturadas; además, si desplazaba a MUFAs y PUFAs aumentaban significativamente las LDL-C (Hayes & Poncznk, 2010). A pesar de todo esto, se han utilizado bastante como alternativa a los PHVOs el aceite de palma, pero es una fuente de grasa saturada en muchas economías emergentes (Idris & Dian, 2005), es preferible usar aceites vegetales MUFA y PUFA y estearina de palma (Tarrago-Trani et al., 2006). Se implementaron estrategias para inducir a la industria alimentaria al empleo de grasas insaturadas como sustitutos de los PHVOs, en concreto, aceites alto-oleico o medio-oleico, para poder desterrar el uso generalizado de aceites tropicales. Otras estrategias fueron actuar sobre los factores que rigen el proceso de hidrogenación para conseguir bajos contenido de triglicéridos saturados y de ácidos grasos trans. Para ello se combinaron condiciones de baja temperatura (100 ᵒC) con una presión de hidrógeno muy alta (1,0 MPa) y catalizadores de platino sobre soportes de zeolitas, o un catalizador nanoestructurado con paladio inmovilizado (Skeaff, 2009; Philippaerst et al., 2013). Igualmente, la hidrogenación electroquímica significó un sustancial avance para reducir la formación de ácidos grasos trans en los aceites vegetales. Como alternativa para la sustitución de las grasas hidrogenadas surgieron dos nuevas tecnologías: - Interesterificación; - Fraccionamiento. La interesterificación supone una redistribución de los ácidos grasos en el esqueleto del triacilglicerol. La posición del ácido graso en la molécula es crítica para consolidar una grasa con las propiedades (físicas, reológicas, sensoriales) que no contiene grasa trans. No cambia el perfil de ácidos grasos de partida, lo que cambia es la morfología cristalina para conseguir el contenido de grasa sólida deseada. Esta nueva redistribución provoca cambios en las propiedades funcionales de las grasas, mejorando la consistencia. Se consiguen así grasas “cero-trans” con rangos de puntos de fusión aptos para emplearlos en el procesado de alimentos. Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 45 1.9.1 Interesterificación química Se lleva a cabo en un reactor discontinuo, a 110-160 ᵒC, donde el aceite se deseca a vacío, para separar las trazas de agua y de ácidos grasos libres que desactivarían el catalizador. Luego, se añade metóxido o etóxido sódico o potásico 0,1-0,3 % y se deja reaccionar un tiempo. Se retira el catalizador mediante lavado del aceite con agua, o acidificación. Se filtra, para retirar las trazas de jabón, y el producto final se calienta a vacío, para eliminar los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs). La reacción es rápida (tarda unos minutos). Se produce un intercambio aleatorizado inter- e intra-molecular, obteniéndose glicéridos mixtos, mezclas semi-sólidas y plásticas, exentas de grasa trans (Hunter, 2006; van Duijn, 2005). 1.9.2 Interesterificación enzimática Esta interacción puede tener lugar entre aceites vegetales insaturados con glicéridos saturados C12-C16, catalizada por lipasas estereoespecíficas sn-1,3 inmovilizadas. Es una reacción más suave y lenta (puede tardar varias horas) que la tecnología química (Zhang et al., 2004). Tiene la ventaja de que puede detenerse a voluntad, a un tiempo fijado, lo que permite una programación para obtener un producto con la composición, textura y reología deseada, pudiéndose seguir los cambios cristalinos microscópicamente (Mozaffarian et al., 2010). Se consiguen productos “cero-trans” de buen sabor, elaboración con un menor contacto con las sustancias químicas y de un coste razonable (Kadhum & Shamma, 2017). En la Tabla 5 se ofrece una comparación entre las dos tecnologías de interesterificación. Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 46 Tabla 5. Comparación entre las interesterificaciones química y enzimática (List, 2004). Química Enzimática Proceso discontinuo Proceso continuo Reacción no específica. Los triglicéridos se forman en distribución aleatoria Reacción específica para sn-1,3 Las curvas de grasa sólida son relativamente planas Las curvas de grasa sólida tienen más pendiente, mejor funcionalidad El catalizador es sensible a la humedad Uso de catalizadores enzimáticos (lipasas), más caros Formación de productos colaterales (jabones, FAMEs, mono- y diglicéridos) No se forman productos colaterales Requiere post-procesado (eliminar catalizador, retirar jabones, blanqueamiento) No necesita post-procesado En las interesterificaciones se suelen combinar, generalmente, un aceite totalmente hidrogenado (bloque sólido) con un aceite vegetal insaturado (PUFA). Se obtiene así una grasa con buenas propiedades de fusión, textura, adecuada morfología cristalina, estabilidad oxidativa y mejoradas propiedades funcionales (Korver & Katan, 2006). 1.9.3. Fraccionamiento En esta alternativa tecnológica se hace pasar el aceite de forma continua por la unidad de enfriamiento, hasta llegar a la sobresaturación y la formación de núcleos cristalinos. Se forman la fase sólida (estearinas) y la fase líquida (oleínas), que se pueden separar por filtración a vacío, o por centrifugación. Para evitar que el aceite líquido penetre en los cristales, se pueden utilizar disolventes (acetona, hexano), para una separación más pura. O bien, el empleo de materiales, como los fosfolípidos, o Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 47 emulsificantes (mono- y diglicéridos). Puede haber un doble fraccionamiento (Smith, 2005). Se suele trabajar con aceites de palma y girasol modificado. Son posibles dos clases de estearinas. La referida como “estearina blanda”, que se usa en bollería y pastelería. La “estearina dura” podría sustituir a la manteca de cacao en los productos de chocolatería (Herrera et al., 2015). Los cristales de morfología α (inestable) al principio pasan en el producto final a la morfología β (triclínica) la más estable. Se consiguen propiedades óptimas, de acuerdo con el destino del producto en el procesamiento de alimentos, y presenta como ventaja que, al tratarse de un procedimiento puramente físico, es una técnica limpia, de buen impacto medioambiental (Yilmaz & Agagündüz, 2022). 1.9.4 Organogeles En los últimos años se han estudiado e introducido nuevos métodos de modificación de los lípidos para conseguir nuevos productos para uso en procesamientos (horneados, confitería y otros procesados) libre de grasa trans, con bajos contenidos de grasa saturada y buenas proporciones de PUFAs (Patel et al., 2020). Se han conseguido sistemas estructurados con niveles reducidos de grasa saturada, pero sin modificaciones estructurales o químicas de las moléculas de triglicéridos; se trata de ofrecer consistencia, eliminar los ácidos grasos trans y conseguir un perfil lipídico saludable. Los organogeles son sistemas con una fase orgánica líquida no-polar y agentes estructurales que promueven la formación de una red cristalina tri-dimensional, que atrapa dentro de sí el aceite líquido. Se emplean agentes estructurantes (fitoesteroles, lecitinas, orizanoles, ceras, ceramidas, monoglicéridos), que deben ser sustancias GRAS, de grado alimentario, y poder usarse a bajas concentraciones (Park & Maleky, 2020). Recientemente, se han obtenido bigeles a partir de oleogeles de cera de abeja, aceite de canola y alginato sódico, e hidrogeles de carboximetilcelulosa. La dureza de las “cookies” en que se emplearon era similar a la obtenida con una grasa anhidra (Quilaqueo et al., 2022). 1.9.5 Aplicación de la ingeniería genética Cuando se deciden las alternativas al empleo de los aceites parcialmente hidrogenados es necesario que con la modificación tecnológica no se provoque un Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 48 ascenso de la grasa saturada, ni grandes cantidades de PUFAs, que alteren la estabilidad oxidativa. Ambos casos se pueden lograr aplicando la ingeniería genética. Actuando sobre la expresión transgénica proporcionan el medio de rebajar la carga de ácidos grasos saturados del aceite. Al mismo tiempo, los avances en genética molecular y bioquímica de la síntesis de aceites vegetales en las plantas oleaginosas proporcionan las herramientas para rebajar la carga de PUFAs, bloqueando su síntesis durante el desarrollo de la semilla, consiguiendo variedades alto-oleico, bajo-PUFA, en los cultivos de soja, colza, y otras plantas oleaginosas (Wallis et al., 2022). 1.10 Análisis de la grasa trans Hay dos metodologías que han predominado: la cromatografía de gases y la espectrofotometría infrarroja. En la actualidad, ha descendido el uso de la cromatografía de gases (que puede conservar un papel en la investigación de base), en favor de un empleo más generalizado de la espectrofotometría infrarroja, por razones que más abajo esgrimiremos, particularmente cuando sólo se requiere el conocimiento de los ácidos grasos trans totales, para controlar sus niveles en productos alimentarios, y comprobar si se cumple la legislación alimentaria, o si se declaran falsos negativos (por ejemplo, declarar en la etiqueta “libre de grasa trans”, cuando entre los ingredientes del producto aparecen aceites hidrogenados). Más concretamente, se aplica la espectroscopía infrarroja de transformadas de Fourier con reflexión total atenuada (ATR-FTIR). Incidentalmente, se ha aplicado la resonancia magnética nuclear de carbono-13 (13C-NMR) para determinar el número absoluto de carbonos-trans alílicos (Miyake et al., 1998). 1.10.1 Cromatografía de gases Al principio, en las décadas de los años 1970s y 1980s, se usaron columnas capilares de polietilenglicol (OV-275, Silar, CP-Sil 88) cortas (40-50 m) y 0,32 mm de diámetro interno, pero existían co-elución de las formas cis y trans y solapamiento con los PUFAs de cadena larga (Ulberth & Henninger, 1992). Para evitar estos problemas técnicos, se introdujeron en los 1990s las columnas capilares largas, altamente polares (100 m x 0,25 mm de diámetro interno x 0,20 µm de espesor de la fase estacionaria) SP-2340, de policianopropilsiloxano, térmicamente estables. Además, se añadió una etapa de Capítulo 1 Introducción: Definiciones y conceptos, ingestas poblaciones, efectos sobre la salud, determinación de grasa trans en productos alimentarios 49 pre-separación por cromatografía de capa fina (AgNO3-TLC), o bien, por cromatografía líquida de alta resolución (AgNO3- HPLC). Esta fue la base del método oficial AOCS 1 h-0,5, con columnas SP-2560, y derivatización de los ácidos grasos a ésteres metílicos (FAMEs), pudiéndose emplear las alternativas del detector de ionización de llama (GCFID) o de espectrometría de masas (GC-MS) (Albuquerque et al., 2018). El isómero cispresenta una afinidad más fuerte por el ciano-dipolo, queda retenido en la columna, y el isómero trans se eluye antes que el cis. Aunque la cromatografía proporciona información sobre el perfil lipídico de la mezcla de isómeros, y desde el punto de vista cualitativo puede presentar utilidad, tiene varios inconvenientes, como son: - Las columnas capilares son de vida corta; - La técnica consume tiempo, es laboriosa, y cara; - Requiere derivatización (FAMEs), debido a la polaridad de los ácidos grasos; - Depende de la disponibilidad de estándares cromatográficos adecuados. En definitiva, la técnica cromatográfica no resulta tan adecuada cuando se trata de análisis de control rutinarios y rápidos, donde interesa la cuantificación global de todos los enlaces trans aislados, ya procedan de un ácido monoenoico, o de un ácido polienoico. Para esto, la técnica de infrarrojo ATR-FTIR ofrece indudables ventajas. 1.10.2 Espectroscopía infrarroja Antes de la introducción de los métodos instrumentales existían dos métodos generalizados para la determinación de los ácidos grasos trans. El primero de ellos era un método gravimétrico que se basaba en la insolubilidad en disolventes orgánicos específicos de las sales de plomo del ácido elaídico (95% de rendimiento). El otro método se fundamentaba en la diferencia entre las constantes de equilibrio de las reacciones de los isómeros cis y transcon iodo en CCl4. Ambos métodos eran lentos y laboriosos, de dudosa confiabilidad, requerían un gran tamaño de muestra y se trabajaba en un entorno tóxico (Swern et al., 1950). Estos métodos fueron sustituidos por los métodos espectroscópicos. El espectro infrarrojo se puede dividir en tres partes: 56 Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 57 Capítulo 2: Legislación y Recomendaciones No se conoce ningún efecto beneficioso atribuible a los ácidos grasos trans de origen industrial (IP-TFA), mientras que en el caso de los ácidos grasos procedentes de rumiantes (R-TFA) está todavía a debate su posible nocividad o beneficio. En cualquier caso, estudios bien diseñados parecen coincidir en que los R-TFA no parecen mostrar nocividad, siempre que no se sobrepase un determinado nivel de ingesta. Por lo tanto, las legislaciones de los distintos países se han centrado en los IP-TFA, lo que, por otra parte, está de acuerdo con la propia definición del término “ácido graso trans” o “grasa trans” que ofrece la “Food & Drug Administration” (FDA), el “Codex Alimentarius”, y otros organismos, como la Organización Mundial de la Salud. El propósito común de las distintas legislaciones es limitar el contenido de grasa trans en los productos alimentarios y reducir su ingesta, sobre todo en las poblaciones más expuestas como niños, adolescentes, y personas menos favorecidas. Las medidas legislativas se han centrado, principalmente en: - Etiquetado, voluntario u obligatorio, del contenido de grasa trans del producto; - Reformulaciones en el procesado de alimentos; - Prohibiciones a nivel local, regional o nacional, del uso o venta de productos procesados que contengan grasa trans. Para comprender mejor la evolución de las medidas legislativas tomadas en torno a la grasa trans, se expone en la Figura 5 una “línea del tiempo”, donde se especifica, en orden cronológico, las legislaciones más determinantes promulgadas en estos últimos años. Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 58 Fig. 5. Línea del tiempo de las principales medidas legislativas sobre la grasa trans. Para la reducción del contenido de grasa trans en los productos alimentarios se han aplicado políticas diversas, que incluyen: - Auto-regulación voluntaria; - Declaración obligatoria en el etiquetado; - Declaración obligatoria y límites voluntarios; - Prohibiciones a nivel local; - Prohibiciones a nivel nacional; lo que ha conseguido un descenso apreciable del contenido de ácidos grasos trans (TFAs) en alimentos procesados, y de sus ingestas poblacionales a nivel mundial, con algunas excepciones. Del tratamiento de 26 estudios seleccionados entre los años 2005 y 2012 se dedujo que, en general, a lo largo de estos años habían descendido los contenidos de grasa trans y de la suma ácidos grasos saturados más ácidos grasos trans, no había aumentado la grasa saturada, y se percibía un aumento de la grasa insaturada (MUFA + PUFA), en los productos alimentarios implicados. Por lo que se refería a los productos “libres de grasa trans”, la incidencia era muy alta (92-100%) cuando se habían adoptado prohibiciones, tanto a nivel local como nacional, salvo en los casos de los establecimientos de “comida rápida” (59% de incidencia). En los casos de etiquetado obligatorio, la incidencia fue buena en restaurantes (80%), y mejor en supermercados (95%); en productos de horneado/bollería/pastelería, la incidencia fue variable Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 59 y no tan satisfactoria (42-77%); y los peores resultados (45% de la incidencia) se obtuvieron en las situaciones de autorregulación voluntaria por parte de la industria (Downs et al., 2013). Ha sido importante la concienciación de los consumidores y sus asociaciones sobre el tema de las grasas trans. En este sentido países como Francia, Alemania y Reino Unido han desarrollado campañas informativas y educacionales para que los propios consumidores ejerzan presión sobre la industria (Coombes, 2011). En algunas franquicias de establecimientos de comida rápida aparece en su página WEB información sobre ingredientes y comidas, con información sobre ácidos grasos saturados y trans. Dietistas americanos han estudiado el comportamiento de los ciudadanos en sus compras de alimentos y desarrollado campañas de formación para el conocimiento de las grasas trans y saturadas (Eckel et al., 2009). Dado el creciente interés de la población por la conexión dieta-salud, son importantes los incentivos y la labor de los medios de comunicación (prensa, radio, TV) y su influencia en la toma de decisiones de los consumidores (Unnevehr & Jagmanaite, 2008). En este sentido se ha llegado a proponer que los datos sobre el contenido de TFAs aparezcan en la etiqueta del producto como incrementos sucesivos de 0,1 g partiendo de 0 gramos (Brandt, 2011). 2.1 Dinamarca Dinamarca fue, con Canadá, uno de los primeros países que legislaron sobre las grasas trans, en 2003 (Stender & Dyerberg, 2004). En dicho año limitó el contenido de grasa trans de los productos alimentarios vendidos en el país, incluidos los productos de importación y las comidas en lugares de restauración, al 2% sobre la grasa total. Por aquel entonces la población ingería como promedio 30 g de TFA/p/d de grasa trans producida industrialmente (IP-TFA), pero la preocupación se había extendido antes, después de la aparición del artículo de Willett (1993) sobre la aparente relación directa entre las ingestas de grasa trans y las enfermedades cardiovasculares, impresiones que corroboró el Consejo de Nutrición de Dinamarca (Stender & Dyerberg, 2004). Como hubo ciertas discrepancias (algunos países europeos manifestaron que la normativa danesa iba en contra del espíritu del libre comercio) y puntos de vista contradictorios en la Comisión Europea, la Comisión demandó un pronunciamiento de la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). El grupo de expertos europeos emitió un informe (EFSA, 2004) Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 60 por el que concluía que la medida restrictiva danesa se consideraba innecesaria por el momento, y que la información en el etiquetado nutricional sería suficiente para proteger a los consumidores. Se plantearon entonces diversos pleitos. Sin embargo, en marzo del 2007, la Comisión Europea decidió retomar el caso y, a la vista de nuevas evidencias científicas autorizadas y sus argumentos, decidió admitir con pleno derecho la legislación danesa, y las demandas judiciales se reiteraron (Astrup, 2006; EFSA, 2010). La normativa danesa había entrado en vigor en enero del 2004, después de un período de transición de 6 meses. Estas medidas legislativas recibieron el apoyo del gobierno y de la comunidad, la colaboración voluntaria de la industria, y la fuerza motora del Consejo Nacional de Nutrición (Leth et al., 2006). Después de la entrada en vigor, las tasas de fallecimiento por causa cardiovascular descendieron un 3,2%, comparado con países del entorno donde no se implementaron restricciones (Restrepo & Rieger, 2016). Se pueden ejemplificar la forma de proceder y la rigurosidad aplicada. En 2004, después de controlar, para ver si cumplían la reciente legislación en Dinamarca, 10 categorías de alimentos de los que se presuponía mayores contenidos de grasa trans, nueve de ellas cumplían con la legislación (menos de 2% de grasa trans, sobre grasa total), pero un producto contenía 6%. Se trataba de dónuts de una determinada franquicia procedente de Bélgica (este país no tenía entonces legislación referente a la grasa trans) que los habían utilizado en el procesado aceite parcialmente hidrogenado, PHVO. En cuestión de horas toda esta partida fue retirada de las estanterías. En 2006, en un restaurante de Ikea en Copenhagen se encontraron patatas fritas con 10% de grasa trans, sobre grasa total; el producto fue retirado en cuestión de horas, después de que la noticia fuese publicitada por la televisión pública en hora punta (L´Abbé et al., 2009). Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 61 2.2. Canadá Desde el 2002 se venía elaborando la normativa de Canadá, que aparece en enero de 2003, y entra en vigor en diciembre de 2005. Para confeccionar la legislación y monitorizar el cumplimiento de esta, “Health Canada” creó un grupo de trabajo. Se limitaba el contenido de grasa trans en aceites vegetales y margarinas blandas al 2%, sobre grasa total, y en el caso de los demás alimentos, incluidos los servidos en restaurantes, la venta al por menor, y servicios de alimentos (“catering”), al 5%, sobre grasa total. Si en 2003 la etiquetación era voluntaria, en 2005 los “Food and Drug Regulations (FDR)” exigían la declaración obligatoria en el etiquetado nutricional de la cantidad de ácidos grasos trans (TFAs) en gramos por ración del producto alimentario. Una declaración “cero-trans” o “libre de trans” podía hacerse si eran menos de 0,2 g por ración, y contenía menos de 0,2 g de grasa saturada (bajo en ácidos grasos saturados) (Ratnayake et al., 2007), condiciones más exigentes que las que propuso la legislación estadounidense (FDA, 2003). El gobierno canadiense exhortó a la industria alimentaria para que se alcanzaran estos límites en el plazo de dos años (2005-2007), y siguió de cerca sus acciones y las ingestas poblacionales. La declaración de TFA aparecía en la etiqueta, en una línea separada, debajo de la declaración de grasa saturada (Kris-Etherton & Innis, 2007). Se incentivó a los fabricantes para que en las reformulaciones emplearan MUFAs o PUFAs, evitando en lo posible el uso de aceites tropicales, que aumentarían los niveles de grasas saturadas (Health Canada, 2006). La normativa establecida, combinada con las limitaciones voluntarias, logró que se produjera un 30% de reducción de ingesta de grasa trans en la población canadiense, que estaba a la cabeza de las ingestas en el mundo occidental (Ratnayake et al., 2009 a). En 2009, el 80% de los productos alimentarios cumplían los límites legales, un buen avance si se comparaba con el año 2005, donde sólo el 50% de los productos cumplían estos límites (Ratnayake, 2009 b). Finalmente, ante el gran número de evidencias contrastadas en la literatura científica, y siguiendo los pasos de la “Food and Drug Administration”, se declaró ilegal para los productores usar grasas conteniendo ácidos grasos parcialmente hidrogenados (PHVOs) en el procesado de alimentos, incluyendo los importados y los menús en restauración. Estas grasas hidrogenadas fueron calificadas por “Health Canada” (2017) dentro del grupo de “contaminantes y otras sustancias adulterantes de los alimentos”. Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 62 2.3 Estados Unidos La normativa promulgada por la “Food and Drug Administration” en 2003 (FDA, 2003), establecía la obligatoriedad de declarar en el etiquetado nutricional el contenido de grasa trans de origen industrial, justo debajo de la información sobre el contenido de grasa saturada por ración del producto alimentario. Se podía declarar un producto “cero-trans” si su contenido estaba por debajo de 0,5 g de TFA de origen industrial por ración. Esta ley FDA-2003, que entró en vigor en enero de 2006, fue la culminación de un proceso de varios años. En 1990 el Congreso Norteamericano aprobó la Ley de Etiquetado Nutricional (NELA). Pocos años más tarde, el “Centro para Uso de la Ciencia en el Interés Público”, presionaba a la FDA para que se informara en las etiquetas de los contenidos de grasa saturada y de grasa trans, como ya lo hacía el “Palm Oil Institute” de Malasia. En 1994 se registró una petición ciudadana de salud referente a la grasa trans. En 1999 la Agencia publicó propuestas y abrió un debate público, acompañando indicaciones acerca de procurar un mínimo de ingesta de TFA, y ya se presentían cambios legislativos más eficaces (Wilkening, 2001). Finalmente, el 11 de julio del 2003 apareció la normativa publicada (FDA, 2003) en la revista oficial de la agencia gubernamental (List, 2004). La FDA se había mantenido inmersa en la problemática de las grasas trans todos estos años a través de varias actuaciones, como: - Revisión de comentarios de expertos; - Llevando a cabo estudios que implicaban a los consumidores; - Revisando críticamente la producción científica. para intentar asistir a los consumidores (Moss, 2006). La declaración obligatoria del contenido de grasa trans también ha influido en la confección de los menús escolares. Instituciones sanitarias y hospitales consideraron la prohibición de productos que declaran TFAs en sus cocinas y apareció una “ley de cuidados razonables” que obligaba, a requerimiento del paciente o del cliente, a ofrecer información sobre los contenidos de grasa total, grasa saturada y trans de los menús o comidas (Aase, 2009). Desde la entrada en vigor de la normativa FDA, en 2006, el contenido de grasa trans en la dieta típica americana descendió desde 4,6 g/p/d hasta 1 g/p/d (Doell et al., 2012). El gobierno federal estadounidense realiza controles periódicos para comprobar si se cumple la normativa. Según la “Federal Food, Drug and Cosmetic Act” un producto alimentario Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 63 estaría erróneamente marcado en la etiqueta si la cantidad de grasa trans que se encontrara en el control superara en un 20% la cantidad declarada por el fabricante (Mossoba et al., 2009a). Indudablemente, si no se declara contenido de grasa trans, pero en la lista de ingredientes aparecen las leyendas “aceite parcialmente hidrogenado”, “aceites o grasas vegetales hidrogenadas” hay que sospechar de la existencia de ácidos grasos trans. También puede ocurrir que, por otra parte, atendiendo el consumidor a la posible presencia de grasa trans, no se fije en el contenido de grasa saturada; esto lo evita, por ejemplo, con medidas como las recogidas en la legislación canadiense que obliga a declarar en la etiqueta la suma conjunta de ambos contenidos, que no debería superar el 40%, sobre el contenido de grasa total del producto (Skeaff, 2009). Tal y como fue legislada, la normativa FDA 2003 puede confundir a muchos consumidores y dejaba un resquicio a la industria alimentaria para manufacturar productos alimentarios con cantidades cuantificables de grasa trans, declarándoles “legalmente” como “cero-trans”. Así, por ejemplo, si se consumieran 5 raciones de un producto declarado “cerotrans”, que contuviera 0,4 g de TFA por ración (estaría dentro del marco de la ley FDA 2003), se superaría la ingesta de 1 E% de grasa trans recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Hosmer, 2006). Por ello, se ha de ser más realistas y concretos y eliminar el concepto “cero-trans”, tal como lo aplica la FDA 2003, para una mayor protección de los consumidores (Brandt, 2011; Erickson, 2006; Moss, 2006). El 7 de noviembre de 2013, la FDA determinó que los aceites parcialmente hidrogenados ya no se podrían considerar como sustancias GRAS (“generally recognized as safe”); si se aceptaran como aditivos alimentarios, pasada la criba de la solicitud y la memoria aportada por el fabricante a la FDA, tendrían que indicarse dentro de los ingredientes (FDA, 2013). Los Centros para Control y Prevención de la Enfermedad de Estados Unidos lo consideraron como un triunfo de la sanidad pública y estimaron que con esta medida se podían prevenir hasta 20.000 casos de accidentes coronarios por año. Se puede decir que la prohibición de los aceites parcialmente hidrogenados sentó un precedente para que otros constituyentes de los alimentos, como la sal, los azúcares añadidos, las grasas saturadas, y la cafeína estuvieran bajo la lupa gubernamental de la FDA (McCarthy, 2013; Brownell & Pomeranz, 2014). Después de esta determinación tentativa del 2013, la decisión final de la FDA vio la luz en 2015. Hubo una moratoria de 3 años (período de condescendencia), y a partir de junio del 2018 la industria alimentaria estadounidense tuvo que eliminar el uso de los aceites Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 64 parcialmente hidrogenados, principales exponentes de los ácidos grasos trans de origen industrial (IP-TFA) y sustituirlos por aceites/grasas más sanas (FDA, 2015). Los fabricantes tuvieron, pues, que prescindir por ley de los aceites hidrogenados parcialmente y reformular sus productos, mediante tecnologías tales como el fraccionamiento o la interesterificación. Se les conminó a que, a ser posible, no usaran aceites tropicales, que cargaban de grasa saturada al producto reformulado, y se emplearan como alternativa o bien aceites-MUFA (alto-oleico), o se optaran por las oleogeles, más recientemente. Grandes cadenas de restaurantes y fabricantes de alimentos han reconocido que son capaces de prescindir de los aceites hidrogenados, sin perjudicar el sabor y la calidad gastronómica de los platos, que se sirven, y sin que supongan mucho peso económico. 2.3.1 Nueva York y otras localidades de Estados Unidos En el 2005 el alcalde de Nueva York, Michael Bloomberg, llevó a cabo una campaña para aprobar una enmienda que permitiera retirar la grasa trans de origen industrial (IP-TFA) en todos los locales de restauración de la ciudad. En diciembre de 2006, el Departamento de Salud e Higiene Mental del municipio se sirvió de la aprobación de dicha enmienda para prohibir el contenido a 0,5 g de TFA por ración, en sus restaurantes y servicios de restauración, además de en hospitales, clínicas, centros de días, y otras jurisdicciones locales. Al mismo tiempo, se desarrollaron campañas de educación e información a los consumidores sobre la vigilancia con las grasas trans (Aase, 2009; Okie, 2007; Eckel et al., 2009). El bando de prohibición se programó en dos etapas. En la primera etapa, cuyo plazo expiró en julio de 2007, se garantizó menos de 0,5 g de TFA por ración en aceites, “shortenings” (grasas concretas) y margarinas. En octubre de 2007 se comprobó que el 96% de los restaurantes de la ciudad cumplían con el bando municipal. En la segunda etapa, se exigió a los fabricantes la reformulación en todos los alimentos, para que no se superara la cantidad de 0,5 g TFA por ración. En noviembre de 2008, fecha de entrada en vigor del bando municipal, solo el 1,6-1,9% de los restaurantes neoyorquinos usaban aceites hidrogenados (PHVOs) frente a un 50% de restaurantes que los usaban en 2005 (Mello, 2009). En un principio, la alcaldía de Nueva York contactó con los responsables de restauración en la ciudad, para que redujeran de forma voluntaria los niveles de grasa trans, pero ante la heterogeneidad de comportamientos (muchos restaurantes continuaron usando aceites de cocina Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 65 y de fritura con grasa parcialmente hidrogenada) la municipalidad se vio en la necesidad de pasar a la obligatoriedad (Tan, 2009). Se estimó una reducción concurrente del 4,5% de la mortalidad de origen cardiovascular en los años que siguieron a la proclamación de la prohibición municipal (Restrepo & Rieger, 2016). Las reformulaciones no supusieron un encarecimiento de los productos ni merma de su calidad, debido a que los procesos tecnológicos alternativos (fraccionamiento, interesterificación) tenían un coste comparable al de los procesos tradicionales de hidrogenación (List, 2004). Además, se consumió de forma más saludable: el contenido medio de grasa trans en los restaurantes de Nueva York descendió desde aproximadamente 3 g por comida, a menos de 0,5 g por comida (Assaf, 2014). Las consecuencias inmediatas del “efecto Nueva York” se dejaron sentir en los proveedores de comida (“caterings”), tiendas de comestibles y grandes compañías, entre ellas “Kraft Foods”, que asimilaron la inmediatez de las sustituciones en la grasa trans (Angell et al., 2009). Filadelfia y Washington, en 2007, San Francisco en 2008, también emitieron bandos municipales de prohibición de la grasa trans; y el mismo camino emprendieron Baltimore, Nueva Jersey y Boston, Montgomery, Albany, Seatle y los Estados de Colorado, California y Puerto Rico. Por ejemplo, en Carolina del Norte y California se requirió por ley utilizar aceites de cocina libres de grasas trans en los menús escolares. Sin embargo, existieron algunas resistencias, como es el caso paradigmático de Cleveland. Sus prohibiciones sobre las grasas trans fueron bloqueadas por el gobierno de su propio Estado (Ohio); se pleiteó, y el municipio de Cleveland ganó el pleito, y ratificó su bando de prohibición (Assaf, 2014; Coombes 2011; Mozaffarian & Willet, 2007; Angell et al., 2009; Downs et al., 2013). 2.4 Unión Europea En 2004 la Unión Europea (UE) legisló que si un producto alimentario contuviese aceite parcialmente hidrogenado (PHVO) debe consignarse en la lista de ingredientes de la etiqueta, pero no había que indicar la cantidad de grasa trans. Si se declaraba “libre de grasa trans” sería obligatorio consignar en la etiqueta las cantidades de grasa saturada, y de grasa mono- y poli-insaturada (Stender & Dyerberg, 2004). En la UE sólo estaba regulada la grasa trans en preparados para lactantes, donde su contenido no debía sobrepasar el 3%, sobre grasa total (Directiva 141/2006/CE). En 2010 la Comisión Europea solicitó al Parlamento la propuesta de Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 72 muy bajas (8,6% para saturadas, y 4,7% para trans). Después de examinar 97 de las marcas más populares en el mercado chino, se encontraron niveles por encima del 0,5% de grasa trans, sobre grasa total, en el 80% de los productos estilo-occidental, y 33% de productos estilo-chino. Sin embargo, en ninguno de estos productos aparecía en la etiqueta que contuviera grasa trans. Con esto se demostraba la necesidad de vigencia de una adecuada legislación sobre declaración obligatoria en el etiquetado (Tao et al., 2011). China prepara un plan de acción que expresa un compromiso con la reducción o la eliminación de la grasa trans en sus alimentos (OMS, 2019). En 2009 la Organización Mundial de la Salud (OMS) organizó un encuentro con países de Oriente Medio y del Maghreb para desarrollar un taller cuyo objetivo era que estos países conocieran mejor las estrategias para la eliminación de la grasa trans y sustentaran legislaciones al respecto. Uno de los desafíos que se encontró fue el déficit de laboratorios de control y seguimiento para supervisar el adecuado cumplimiento de las normativas. Ante esta iniciativa de la OMS, varios países del Golfo Pérsico (Arabia Saudí, Bahrein, Kuwait) implementaron regulaciones entre 2016 y 2017. Estos Países colaboraron con las empresas alimentarias para que, de forma voluntaria, eliminaran el uso de aceites parcialmente hidrogenados (PHVOs) en el procesado y manufacturación de alimentos (Li et al., 2019; Wang et al., 2016). 2.9 África Aunque se está empezando a tomar medidas en algunos países del continente africano, todavía queda mucho por avanzar. La eliminación de grasa trans de los alimentos no es una prioridad política para sus gobiernos, lo que supone una seria limitación. En Sudáfrica el contenido de grasa trans no puede exceder del 2% sobre grasa total, en los productos con mayores niveles de grasa trans, tanto en los alimentos nacionales como en los importados. Para que un producto se declare “libre de grasa trans” debe contener menos de 1 gramo de TFA por 100 g del producto. Es posible que, desde su iniciativa en 2011, haya habido inconvenientes para implementar la normativa; pero, actualmente, Sudáfrica se encuentra entre los países con las mejores prácticas de políticas encaminadas a desterrar la grasa trans, al mismo nivel que Dinamarca, Canadá, Estados Unidos y los países escandinavos (OMS, 2019; Rashid et al., 2020). En Nigeria se creó en 2018 el proyecto NAFDAC para limitar el contenido de grasa trans en sus alimentos, y bajo este proyecto limitó estos contenidos a un 2%, sobre grasa total. Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 73 Mientras, en Uganda se han realizado controles del etiquetado nutricional para evaluar los niveles de grasa trans en los alimentos más populares del país (OMS, 2019). 2.10 India y Pakistán Como se mencionó con anterioridad, el vanaspati es un aceite fabricado a partir de mezclas de aceites vegetales y aceites parcialmente hidrogenados (PHVOs), que sustituyó en países como India y Pakistán al “ghee” (especie de grasa de mantequilla deshidratada) tanto en el consumo a nivel de cocinado y de frituras, como en el espacio doméstico, comercial, de restauración y de venta callejera. Las autoridades sanitarias de estos países se sintieron alarmadas, cuando conocieron la nocividad de la grasa trans de origen industrial (IP-TFA), y los preocupantes datos epidemiológicos de aumento de la enfermedad y mortalidad por accidentes cardiovasculares y diabetes. Como una primera medida de intervención de choque, la agencia gubernamental “Food Safety and Standards Authority of India (FSSAI)” a través de la “Ley de Prevención y Adulteración de Alimentos” reguló por debajo del 10% TFA el contenido máximo permisible de grasa trans. En 2008, se estableció un plazo de 3 años para que vanaspati y los aceites vegetales parcialmente hidrogenados (PHVOs) pasará a contener 5% TFA sobre grasa total (FSSAI, 2010). La citada ley, por otra parte, llegó a proponer, incluso, la presencia de menos de 0,2 g de TFA por ración. La agencia gubernamental sugirió que en cocinado y fritura se sustituyera el vanaspati por aceites con altos niveles de MUFAs (aceites alto-oleico), en lugar de utilizar para ello aceites tropicales de palma y coco (abundantes y baratos), para así evitar un aumento de la grasa saturada (SFA) en el producto final bajo-trans (Kala, 2012; Dows et al., 2013b). En cualquier caso, existen dificultades de tipo técnico y tecnológico, y gran parte de las industrias que fabrican el vanaspati se muestran poco dispuestas a modificar el proceso de hidrogenación, y los hábitos sociales desarrollado durante años (Downs et al., 2013a). No obstante, las agencias gubernamentales han limitado recientemente el contenido máximo de grasa trans al 2%, sobre grasa total, en aceites vegetales, vanaspati y grasas concretas (“shortenings”) como parte de su objetivo de liberar sus alimentos de grasa trans (Rashid et al., 2020). En Pakistán la situación es similar a la de la India, con el consumo de vanaspati y otros aceites de cocina parcialmente hidrogenados y, por consiguiente, con un aumento de Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 74 cardiopatías en la población. Aunque el gobierno ha introducido ciertas normativas, éstas varían según las jurisdicciones. Además, existe cierta ausencia de credibilidad sobre sanciones efectivas para los que violan las normativas y cierta falta de interés por parte del consumidor. Por todo esto, recientemente Rashid et al. (2020), han recomendado que se lleven a cabo: - Esfuerzos multilaterales entre legisladores, productores y científicos, que conduzcan a una necesaria armonización; - La sustitución del vanaspati tradicional; - Esfuerzos de comunicación para cambios de comportamiento, promoción de alternativas al vanaspati y empleo de grasas más sanas, así como un reforzamiento de las capacidades de control por parte de los legisladores. 2.11 Australia y Nueva Zelanda En los seguimientos anuales desarrollados entre 2005 y 2013 en Australia no se demostró un descenso apreciable de grasa trans en los alimentos seleccionados como potenciales fuentes principales de estos isómeros. Se superaba el límite del 2% sobre grasa total, en muchos de ellos, y los niveles eran particularmente más altos en algunos, como horneados, palomitas de maíz y productos de confitería. Pero esta situación cambió en la última encuesta dietética, representativa de la población australiana y neozelandesa, pues sólo el 10 % de la población excedía la ingesta recomendada por la OMS (1 E% de TFA); además, estas ingestas anormales se daban en las capas socioeconómicamente menos favorecidas (OMS, 2019). Normalmente, el etiquetado del contenido de grasa trans en estos países ha sido voluntario, pero con cierto control por parte del consumidor: si se diera alguna reclamación en este sentido, que afectara o incluyera al perfil lipídico o al colesterol, la declaración pasaría a ser obligatoria. En estos países, las cadenas de “comida rápida”, como McDonald’s o Burger King, pueden etiquetar sus alimentos con un logo (señal con un corazón) si cumple rigurosos criterios sobre contenido de calorías, sodio, grasa saturada, o grasa trans (Skeaff, 2009). Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 75 2.12 Organización Mundial de la Salud (OMS) En 2004 la Organización Mundial de la Salud, dentro de su estrategia global sobre dieta, educación física y salud, recomendó una ingesta de grasa trans que no subiera del 1 E%, lo que, sobre una dieta estándar de 2.000 kcal supondría 2,2 g/p/d (OMS, 2004). En 2006 los cardiólogos, a través de la “Asociación Americana del Corazón” recomendaron la misma ingesta límite del 1 E% de grasa trans (Eckel et al., 2007). Consideraban que incluso bajos niveles de consumo pueden ser nocivos. Así, se demostró que una ingesta de 5 g/p/d (aproximadamente, 2 E% diario) se asociaba con un aumento del 23% de la enfermedad cardíaca isquémica (Mozaffarian et al., 2006). Como parte de la implantación de la estrategia global sobre dieta, actividad física y salud, la OMS estimuló un diálogo con las principales compañías en el campo de la alimentación y la nutrición para inducirles a que practicaran reformulaciones y alternativas a la grasa trans (OMS, 2003). En 2019 existían límites obligatorios legislados para la grasa trans en 28 países, el 31% de la población mundial ese año. De estos 28, 12 países (Estados Unidos, Canadá, Dinamarca, Noruega, Islandia, Austria, Hungría, Letonia, Eslovenia, Chile, Tailandia y Sudáfrica) presentaron las mejores estrategias legislativas (Li et al., 2019; OMS, 2019). En la Unión Europea, donde se incluye España, la reglamentación de 2019 limita la grasa trans al 2% sobre grasa total en todos los productos alimentarios. Pero quedan aún países que no disponen de una legislación adecuada sobre este tema. Entre ellos, muchos países de Europa del Este y de las antiguas repúblicas soviéticas, varios países asiáticos y muchos del continente africano, a excepción de Sudáfrica. El 14 de mayo de 2018 la OMS y la Organización “Resolve to Safe Lives”, de forma conjunta, anunciaron la iniciativa REPLACE, que se puso como objetivo liberar al mundo de la grasa trans en 2023. REPLACE provee a los países de herramientas para que puedan llevar a efecto la eliminación de los ácidos grasos trans de origen industrial (IP-TFA) en sus suministros alimentarios. Se considera la primera iniciativa global para deshacerse de un importante factor de riesgo de las enfermedades cardiovasculares. El mapa de ruta de REPLACE se diversifica en seis campos de acción (Ghebreyesus & Frieden, 2018): - REview: revisar las fuentes dietéticas de la grasa trans de origen industrial (IP-TFA); Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 76 - Promote: Promover la sustitución de aceites parcialmente hidrogenados (PHVOs) por grasas y aceites más saludables; - Legislate: Legislar iniciativas de regulación; - Assess: Controlar y monitorizar el contenido de grasa trans en los suministros alimentarios y los cambios en las ingestas poblacionales; - Create: Crear una concienciación sobre el impacto negativo para la salud de la grasa trans entre las políticas, productores, distribuidores, y público en general; - Enforce: Imponer el cumplimiento de las medidas legislativas. En abril de 2019 el Dr. Ghebreyesus, director general de la OMS, y científico en el campo de las grasas trans en su país, solicitó a las industrias alimentarias la reformulación universal de sus alimentos para desterrar definitivamente el uso de aceites vegetales (o de pescado) parcialmente hidrogenados (OMS, 2019). Ese mismo año el grupo de empresas pertenecientes a la “International Food and Beverage Alliance (IFBA)” se comprometió a que aceites y grasas producidos industrialmente no deberían superar los 2 g de grasa trans por cada 100 g del producto en 2023. Para tratar de alcanzar este objetivo la red de empresas “Scaling Up Nutrition (SUN) Business Network” se comprometió a aportar fondos y brindar soporte técnico a pequeñas y medianas empresas para la reformulación adecuada de los productos implicados (IFBA, 2019). ¿Cuáles son los desafíos e inconvenientes que planteó la OMS para eliminar universalmente la grasa trans, fijándose en el año 2023 como objetivo? ¿Qué recomendaba para tratar de superar estas limitaciones? La OMS se fijó en tres situaciones de déficits: - Déficit de capacidad reguladora: Como las políticas a emprender para eliminar eficazmente la grasa trans de los suministros alimentarios debieran ser aplicables y sostenibles en países con limitaciones de recursos humanos y financieros, esto podría constituir un problema. Muchos países tienen aún importantes sectores alimentarios que no están regulados. La OMS ha elaborado un plan de acción de capacitación para el desarrollo de las medidas políticas necesarias. Capítulo 2 Legislación y Recomendaciones 77 - Déficit de laboratorios y equipos de control: En 2019 la OMS publicó una serie de protocolos para que sirvieran de ayuda a los laboratorios de control de las grasas trans. Los laboratorios requieren a menudo apoyo financiero y técnico adicional. - Déficit de datos precisos y fiables: Muchos países no poseen datos sobre los niveles de ácidos grasos trans (TFAs) en sus alimentos, o datos sobre sus ingestas poblacionales. Sin datos, la eliminación de TFAs, a menudo, no se considera un tema prioritario para invertir tiempo y recursos. La OMS apoyaría el diseño y la realización de estudios, con la intención de crear bancos de datos sobre el contenido de grasa trans en los alimentos nacionales, como acción prioritaria para promover dietas más saludables (OMS, 2019). En 2018, 45 países, la mayoría países desarrollados, habían tomado decisiones efectivas para reducir la grasa trans de origen industrial (IP-TFA), incluyendo: - Etiquetado voluntario u obligatorio; - Auto-regulación en los productores; - Directrices para fabricantes y consumidores; - Restricciones legislativas o prohibiciones. Sin embargo, gran parte de la población mundial estaba desprotegida ante la presencia de la grasa trans, y la mayor mortalidad se asociaba a países pobres, o en vías de desarrollo (Ghebreyesus & Frieden, 2018). La mayoría de estos países tienen que implementar decisiones políticas nacionales. Como alternativas a los aceites parcialmente hidrogenados se han investigado y usado aceites alto-oleico y grasas técnicas (ceras, oleogeles). La condición esencial es que no se produzca un aumento sustancial en el contenido de grasa saturada, y no se deben alterar las propiedades funcionales, reológicas y sensoriales, ni producirse un descenso de la disponibilidad o un incremento significativo de los costes: solo el corazón notaría la diferencia. 78 79 CAPÍTULO 3: Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 80 Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 81 Capítulo 3: Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 3.1. Introducción La margarina es un producto alimentario que consiste en una emulsión del tipo agua/aceite, de cristales de grasa sólida en una fase acuosa de gotitas minúsculas, grasas vegetales, que puede contener leche en una cantidad no superior al 3,3%, sobre el contenido de grasa total. Los cristales de grasa sólida, que suministran dureza y textura, se disponen bajo las formas polimórficas α, β´, β, en orden de estabilidad, pero se prefiere la forma β´ porque no comunica granulosidad a la margarina (European Council, 1999). En el Código Alimentario Español (CAE) se autorizaba en la fabricación el empleo de grasas hidrogenadas alimentarias, obtenidas por un proceso de hidrogenación catalítica de grasas naturales refinadas comestibles (CAE, 1997). La margarina podía contener como ingredientes adicionales: - Emulsificadores, como lecitina (E-322) y mono- y diglicéridos; - Reguladores del pH, como los ácidos cítricos (E-330) y láctico (E-270), o sus sales, que evitan sabores ácidos o amargos; - Ácido sórbico (E-200) o sorbato potásico (E-202), como antimicrobianos o antifúngicos; - β-caroteno, retinol, clorofilas, que adecúan el color amarillento, y son pro-vitamina A; - Suero lácteo, en el rango 0 - 2,5%; - Sal común, rango 1 – 3,2% si es salada (0 – 1%, no se considera salada). En la Figura 6 aparece un esquema del proceso de fabricación de la margarina. Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 88 c) Procedimiento espectrofotométrico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada 1 – 10 µL de la mezcla de calibrado, o de la fase oleosa de margarina, se depositan y se extienden sobre el cristal ATR (diamante/ZnSe) cubriendo totalmente su superficie. La temperatura no debe estar fuera del rango 20 – 40 °C, ya que el cristal ATR es muy sensible térmicamente, y podría explotar (Mossoba et al., 2009 b). Si ha solidificado parcialmente la muestra a medir se pulveriza y homogeniza en mortero de ágata y luego se esparce uniformemente sobre la superficie del cristal ATR. No es imprescindible que la muestra esté fundida. Cuando se pasa del estado líquido al estado sólido, sucede: - Pequeño aumento de absorbancia; - Estrechamiento del ancho de banda espectral; - Desplazamiento espectral hipsocrómico desde 966 cm-1 hasta 963/961 cm-1. Pero la exactitud de la medida no se afecta, puesto que el pequeño aumento de absorbancia se compensa con la disminución del ancho de banda. Antes de la medición se co-adicionan 64 bandas, para mejorar la ratio señal-ruido (SNR), y poder detectar niveles de grasas trans inferiores a 1-2 %, sobre la grasa total. Entre medidas consecutivas es importante la limpieza del cristal ATR, para evitar el conocido “efecto de memoria”. Para ello se debe proceder de la siguiente forma: - Retirar suavemente de la superficie del cristal ATR la muestra que se ha medido utilizando papel tisú absorbente libre de hebras. - Colocar unas gotas de n-hexano sobre la superficie del cristal ATR, uniformemente, y retirar presionando suavemente con papel tisú. - Disponer 1 – 2 µL de la nueva muestra, y proceder a la medida. Desde la fuente, la luz IR penetra unos pocos micrómetros en el interior de la fase oleosa, después de atravesar el cristal ATR (Figura 7). Al pasar desde un medio con alto índice de refracción (cristal ATR) a otro de menor índice de refracción (fase oleosa), en vez de transmitirse experimenta una reflexión interna, con un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico. La intensidad de absorción de la onda de radiación IR decae con el paso de luz (fijo) y debido al porcentaje de radiación que absorbe la grasa. Se produce un interferograma que posteriormente, por transformada de Fourier, pasa a espectro de rayo único. Se define el espectro de absorción IR frente al aire como fondo espectral de referencia. Como el tamaño del paso de luz efectivo es muy pequeño, se pueden ensayar tamaños de muestra muy pequeños Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 89 (1 – 10 µL), sin necesidad de utilizar ningún disolvente volátil y tóxico y en unos 5 – 7 minutos (Mirabella, 1992; Mossoba et al., 2007; Mossoba et al., 2009 a). Fig. 7. Penetración por cristal ATR: reflexión total atenuada. Los espectros ATR-FTIR se acumularon en el rango de número de onda 4.000 – 600 cm-1, con una resolución espectral de 4 cm-1. Para el procedimiento de segunda derivada ATR-FTIR (-2D) se empleó una extensión espectral con un rango 1.070 – 830 cm-1. Se multiplica por (-1) de forma convencional, con el propósito de que las bandas de absorción se dirijan hacia arriba en los espectros. Las condiciones experimentales empleadas son las mismas cuando se procede a la calibración del método que cuando se miden las muestras de margarinas. 3.2.5 Análisis estadístico Los resultados se expresaron al 0,01% más cercano. Se ofrece la media y la desviación estándar (SD), sobre 6 replicados de cada tipo de margarina. Se llevan a cabo la prueba t-Student, para n1=n2 y σ12=σ22 (n= número de replicados; σ2=varianza), y la prueba F de Fischer para el cociente de varianzas, considerando significativo para p ≤ 0,05. Se hizo uso del software SPSS Statistics v.20 (SPSS Inc., Chicago). Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 90 3.3 Resultados En la Figura 8, con fines ilustrativos, se muestra el espectro ATR-FTIR de segunda derivada para una mezcla trielaidina-tripalmitina, con un nivel trans de 40,15% como porcentaje de grasa total. Se distingue netamente la banda trans sobre las demás bandas en el espectro (banda 8). Conforme desciende el porcentaje de TE en la mezcla se observa un desplazamiento espectral hipsocrómico e hipocrómico, que desplaza el máximo de absorción desde 966 cm-1 hasta 963/961 cm-1. Este hecho, que fue confirmado por Mossoba et al., (2007), ya fue descrito por varios autores (Jart, 1960; Hatt & Lamberton, 1955; Franko et al., 1994; Mitcham et al., 1973; Yu et al., 2008). Fig. 8. Región del espectro que exhibe la banda de deformación del doble enlace trans, en escala expandida para el espectro de segunda derivada negativa, para una mezcla trielaidinatripalmitina, con un nivel trans de 40,15% (pico 8), como porcentaje sobre grasa total. La altura de la banda de la segunda derivada negativa puede medirse exactamente, para cualquier muestra que se ensaye, a partir de la misma línea-base horizontal (Y=cero). Se observa cómo no hay solapamiento de la banda trans con las bandas colindantes. Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 91 A partir de la representación de altura de banda (mAU/cm-2) vs porcentaje de TE en la mezcla TE-TP, que representa %TFA, sobre grasa total, se obtiene una función de calibración lineal (y = 0,1479x + 0,1635; Figura 9). Fig. 9. Recta de calibrado construida a partir de las mezclas estándares tripalmitinatrielaidina mediante el método ATR-FTIR de la segunda derivada. El porcentaje (%) de trielaidina en la mezcla binaria marca el nivel (%) de ácidos grasos trans (TFA), sobre grasa total. Se obtiene un coeficiente de correlación lineal muy próximo a 1 (R2 = 0,9967), lo que confirma una sólida concordancia entre los valores de ordenadas y abscisas. El nivel de ruido observado para la línea-base en los espectros de calibración fue 0,01 mAU/cm-2. Como la ordenada correspondiente al nivel (%) de TE más bajo (0,22%) en la mezcla de calibración TETP fue 0,19 mAU/cm-2, la ratio señal-ruido (SNR) era de 19:1 (0,19/0,01), mayor de 10:1, luego satisfactoria para el uso del detector DTGS (Mossoba et al., 2011). En los espectros ATR-FTIR (-2D) de las margarinas se aprecia claramente la banda característica de los TFA (966 – 961 cm-1). Esta banda no se observa ni en los ácidos grasos saturados, ni en los cis-insaturados. Aparecen bandas próximas asignables a los ácidos linoleicos conjugados (CLAs) (985 cm-1 y 945 cm-1, para cis, trans- y trans, cis-CLA; 990 cm- 1 para trans, trans-CLA), que no interfieren salvo que su nivel fuera superior al 1%, caso que aquí no se da [los CLAs son característicos de los TFAs procedentes de leche (lácteos) y carne de animales rumiantes]. En el mundo vegetal, únicamente el aceite de ricino, debido a la presencia de grupos -OH, podría modificar la intensidad de vibración de deformación fuera del plano del enlace C-H trans (Jart, 1960). Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 92 Sustituyendo en la ecuación de regresión y = 0,1479x + 0,1635 el valor de la ordenada por la altura de banda (mAU/cm-2) obtenida en la medición espectrofotométrica al número de onda de máxima absorción trans de ambos tipos de margarina (A y B), y despejando “x”, se consigue saber el porcentaje (%) de TFA (grasa trans), sobre el contenido de grasa total (Tabla 7). En la misma Tabla aparecen las cantidades en gramos de grasa trans por 100 g del producto y por ración del producto. Aunque en el envase se considera 10 g el tamaño de ración, se ha optado por 15 g, que se acerca más al promedio de las margarinas, y a la porción de cafetería (Requejo & Ortega, 2009). Tabla 7. Contenido de grasas trans de las margarinas ensayadas (Galvin et al., 2016). Descripción (número de replicaciones) Total grasa (g/100 g margarina)a Grasa trans (g/100 g grasa total)b Grasa trans (g/100 g margarina) Grasa trans (g por ración)c Margarina blanda (n=6) 60 0,21 ± 0,22 0,126 0,019 Margarina dura (n=6) 79 0,33 ± 0,20 0,261 0,039 a Declaración etiqueta; b Media ± SD; c 15 g de margarina. La precisión establecida para este método oficial ATR-FTIR (-2D) fue de 0,5% TFA, sobre la grasa total (Mossoba et al., 2011). Los niveles de TFA (%) encontrados para estas margarinas “cero-trans” están por debajo de este límite, con lo que la desviación estándar es alta; pero podemos considerar, o establecer, un rango confiable. Así, en cuanto a su contenido de TFA, el rango para la margarina A sería de aproximadamente de 0 – 0,4 % TFA mientras que para la margarina B sería de 0,1-0,5% TFA sobre grasa total. Por las características presentadas, se podría considerar a la margarina A como margarina blanda, y a la margarina B como semiblanda (20 – 40% de ácido linoleico) (Larqué et al., 2003). Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 93 3.4 Discusión Las margarinas ensayadas son “cero-trans”. La margarina blanda no hace mención alguna en el etiquetado a contenido alguno de grasa trans. La margarina semiblanda declara en el etiquetado un contenido de grasa trans inferior al 0,5%, sobre la grasa total, y como declara 79% de grasa, esto supondría menos de 0,63 g de grasa trans por 100 g de margarina. En el ensayo realizado se determinó un contenido de aproximadamente 0,27 g de TFA por 100 g del producto (Tabla 7). De aquí se deduce que es correcta la declaración comercial. Habría que considerar si los equivalentes de retinol añadidos para el enriquecimiento legal de las margarinas pueden interferir en la determinación de los TFAs, debido a las bandas trans características a 964 cm-1 y 966 cm-1 de beta-caroteno y retinol. El contenido de equivalentes de retinol de las margarinas es, como promedio, de 900 µg por 100 g del producto, o sea, aproximadamente, 0,001% sobre la grasa total (Moreiras et al., 2011). Por lo tanto, el contenido de equivalentes de retinol es de 210 a 330 veces inferior al contenido de TFA calculado, y no causa interferencias. Cuando se aplicaron las pruebas estadísticas (t-Student, F-Fischer) no se dedujo diferencias estadísticamente significativas entre los niveles promedio de %TFA de las dos margarinas (p>0,05), ambos con niveles inferiores al 0,5% de TFA, sobre grasa total. El índice aterogénico (AI= (SFA + TFA) / (MUFA + PUFA)) adquiere valores menores de la unidad en ambas margarinas (0,43, para la blanda; 0,84 para la semiblanda) favorable para el sistema cardiovascular (los ácidos grasos láurico y mirístico, y la grasa trans son aterogénicas, mientras que los ácidos grasos insaturados, MUFA y PUFA, son antiaterogénicos). Esto está de acuerdo con los datos de Burdaspal et al., (2010), que ofrecía valores para este índice de 0,3-0,6, en margarinas españolas, y contrasta grandemente con los valores por encima de la unidad (aterogénicos) en margarinas de países del Este Europeo (Vučić et al., 2015). 3.4.1 Límites de grasa trans ¿Cuáles serían los límites permisibles de grasa trans para considerar “cero-trans” una margarina? Esto dependerá de la legislación al respecto del país considerado. Si tenemos en Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 94 cuenta las legislaciones en este sentido de EE. UU., Canadá y Dinamarca, y considerando las raciones de 15 g, tendríamos: - En EE. UU.: (0,5/15) · 100 = 3,3% de TFA, sobre el peso neto; - En Canadá: (0,2/15) · 100 = 1,3 % de TFA sobre el peso neto; - En Dinamarca: 1% TFA, sobre la grasa total, y considerando 80% de grasa, 1,25% de TFA sobre peso neto. Como se puede comprobar (Tabla 7), las margarinas ensayadas cumplen con esta condición, para las tres legislaciones. Si la ingesta energética diaria procedente del consumo de grasa trans aumenta del 0,9 E% al 2,1 E%, el riesgo de enfermedad cardiovascular se incrementará en un 30% (Mozaffarian et al., 2006). Dinamarca experimentó una disminución sustancial de un 60% en la incidencia de sucesos cardiovasculares y cerebrovasculares, debido en parte a una ingesta progresivamente menor de grasa trans procedente de margarinas (Stender & Dyerberg, 2004). La “Asociación Internacional de Margarinas de los Países Europeos” se propuso como objetivo, hace unos 20 años, considerar un máximo permisible de 1,25 %TFA en la fase grasa de una margarina tradicional, y no superar 5 %TFA, sobre grasa total, en margarinas industriales. Las grandes corporaciones de la industria alimentaria (Unilever, Kraft-Foods, Nestlé) adoptaron medidas innovadoras para reducir la grasa trans, en sus productos y Unilever decidió eliminar prácticamente los ácidos grasos trans en las margarinas europeas (Korver & Katan, 2006; Eckel et al., 2007). 3.4.2 Niveles de grasa trans en margarinas En la Tabla 8 se ofrecen los contenidos de grasa trans en las margarinas de algunos países representativos. Desde 1965 las margarinas de Canadá presentaban niveles promedios (20-25 %TFA, sobre grasa total), con rangos preocupantes de 12 – 65 %TFA. Si consumían margarinas duras (algunas con menos del 5% de ácido linoleico) fabricadas a partir de aceites vegetales parcialmente hidrogenados (PHVO) se exponían a ingerir hasta 1,5 % de trans-18:1 (ácido elaídico, principalmente) (Ratnayake et al., 2007). Con las primeras reformulaciones de margarinas en Canadá (entre 2005 y 2007) se reformuló el 72% de las margarinas reduciendo los contenidos estimados de 26 ± 13 %TFA, sobre grasa total, a niveles de 2-4 %TFA y, en algunas blandas, al 0,8 %TFA sobre grasa total (Ratnayake et al., 2009). En EE. UU., al igual Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 95 que en Canadá, los contenidos de grasa trans en margarinas han sido muy elevados (generalmente dentro del rango 14,9 – 27,7% pero con algunos valores extremos de 40 – 50 %TFA), lo cual no era de extrañar, teniendo en cuenta el uso casi masivo de aceite de soja parcialmente hidrogenado en su fabricación. Aún en 2012, el valor promedio en margarinas era del 11,59 %TFA. Las más sanas [sin uso PHVO, ácidos grasos saturados menores al 20% y ácido linoleico (PUFAs) mayor del 40%] solían ser más caras, y no estaban ampliamente difundidas. En Canadá y EE. UU. se llegaron a encontrar niveles preocupantes de 2,1 – 4,0 %TFA en la leche de madres lactantes (Chen et al., 1995; Doell et al., 2012; Remig et al., 2010). Si se comparan los contenidos de grasa trans en las margarinas de Japón, los datos también eran altos. En el periodo comprendido entre 1995 y 2003 se pasó de aproximadamente un 24 %TFA promedio a un 11 – 12% promedio, casi a la mitad. En Italia, con niveles de grasa trans en margarinas similares a los de España en los ochenta (1980s), se pasó a partir de 2004, a una situación con alternativas: aquellas fabricadas con aceites hidrogenados presentaban un promedio muy variable (7,2 ± 8,3 %TFA), mientras que las variedades blandas y reformuladas podrían considerarse “cero-trans” (0,47 ± 0,33 %TFA). Como se observa, al igual que sucede con las margarinas ensayadas (Tabla 7) la desviación estándar era alta, y la suma (trans-18:2 + trans-18:3) duplicaba la de trans-18:1. En realidad, estos valores por debajo del 0,5 %TFA se corresponden con los niveles de TFA encontrados en los aceites vegetales refinados, y son consecuencia de las etapas de blanqueamiento y, sobre todo, de desodorización (Caponio & Gomes, 2004; Yamada et al., 2010). Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 96 Tabla 8. Contenido de grasa trans (porcentaje sobre grasa total) en margarinas de varios países. % TFA País Año Blanda Dura En conjunto Referencia Canadá 1977 12,0-64,8 Ratnayake et al., 2007 1990s 2,2 (sin PHVO) 20-40 (con PHVO) 1999 1,1- 44,4 39,8 2007 0,8 EE. UU. 1990s 14,2 24,8 Garsetti et al., 2016 2003 17 2013 0,1-21,7 Dinamarca 1990 2,9 6,2 Stender&Dyerberg, 2004 1996 0 -1,9 Francia 1996 0,2-0,6 L´Abbé et al.,2009 2003 1,0 0,9 Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 97 % TFA País Año Blanda Dura En conjunto Referencia Italia 1970s 7-35 Caponio & Gomes, 2004 1990 6,48 ± 9,75 2000- 2010 7,26 ± 8,35 (con PHVO) 0,47 ± 0,33 (reformulados) Finlandia 2012 0-1,10 Helldan et al., 2013 Serbia 2015 0,17- 6,89 16,30- 28,84 Vučić et al., 2015 Eslovenia 2018 0,11-6,37 Abramovič et al., 2018 Pakistán 2002 22,0-34,8 Bhanger & Anwar, 2004 2004 Menos de 4,1 1,6-23,1 Los daneses han sido tradicionalmente grandes consumidores de margarina, de ahí sus preocupaciones legislativas pioneras en torno a las grasas trans. En 1996 ya consiguieron, en las margarinas blandas [ácido linoleico superior al 40%, según la clasificación de (Ovesen et al., 1998)] niveles en el tramo 0-1,9 %TFA, sobre grasa total y, en general, el porcentaje de grasa trans era inversamente proporcional al contenido de ácido linoleico de la margarina en cuestión: - Si linoleico era menor de 20% (duras): 0-14,2 %TFA; - Si linoleico era 20 – 40% (semiblandas): 0 – 5,8 %TFA (Ovesen et al., 1998). Dinamarca experimentó una reducción significativa del 60% en la incidencia de enfermedades cardiovasculares debido en gran parte a un menor contenido de grasa trans de sus margarinas. Con su legislación restrictiva y el apoyo de la industria alimentaria introduciendo sustituyentes de los aceites hidrogenados han posibilitado en la actualidad disponer usualmente de margarina cero-trans (Pande & Akoh, 2014; Leth et al., 2006). Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 104 - Aumentase la profundidad de penetración de la radiación IR, que se refiere al campo eléctrico componente de la radiación IR, penetrando una distancia micrométrica (menos de 5 µm) en la fase oleosa ensayada; - Al ser pequeña la capacidad del cristal ATR, es posible realizar la medida para tamaños de muestra muy pequeños (1-10 µL). Esta circunstancia resulta muy ventajosa si se compara con el tiempo que se consumía en la preparación de disoluciones de muestras (normalmente, al 10%) en disolventes que, además, eran volátiles y tóxicos (CCl4, CS2) (Chalmers & Griffiths, 2001). En el 2000 se validaron los métodos oficiales ATR-FTIR para la determinación de las grasas trans, tanto por la AOCS como por la AOAC (Adam et al., 2000; Mossoba et al., 2001). Finalmente, en 2011 se validó el método de la segunda derivada, ATR-FTIR (-2D) (Mossoba et al., 2011), que presenta indudables ventajas, como son: - No hay inclinación de la línea-base correspondiente a la banda trans a 966 cm-1, la línea base es totalmente horizontal; esto ya se daba en los métodos oficiales del 2000 (Mossoba et al., 2007); - Se reduce el nivel de ruido espectral; - Al estrecharse el ancho de la banda, se aumentan la exactitud y la selectividad, sobre todo para estos niveles de TFA inferiores al 1 %TFA, sobre grasa total; las bandas vecinas asignables a la grasa saturada y a los ácidos linoleicos conjugados, que eran poco visibles en el método anterior (AOAC, 2000.10), ya se pueden distinguir perfectamente y resolver en el método actual de la segunda derivada; - No se necesita obtener previamente los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs), más laborioso, como sí se recomendaba, para niveles inferiores a 15 %TFA, en el método ATR-FTIR AOAC 2000.10, para evitar la banda interferente a 935 cm-1, atribuible a la vibración de deformación fuera del plano del -OH del grupo funcional - COOH (Mossoba et al., 1998); - El fondo de referencia espectral es aire, no se necesita ningún aceite estándar nativo cero-trans, de composición lo más próxima posible a la muestra que se me mide; - Se tarda muy poco tiempo, apenas unos 5 minutos; Capítulo 3 Determinación de grasa trans por el método espectroscópico ATR-FTIR (-2D) de segunda derivada en margarina reformulada 105 En la actualidad, cuando tecnológicamente se puede prescindir del uso de aceites parcialmente hidrogenados para su fabricación, según lo establecido por la “Food & Drug Administration” (FDA, 2013), la margarina, que ha mejorado y equilibrado su composición grasa, vuelve a relanzarse como una alternativa no colesterolémica a la mantequilla. Además, amplía sus aplicaciones en repostería y pastelería (Albers et al., 2008; Silva et al., 2021). 106 107 CAPÍTULO 4.1: Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 108 Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 109 Capítulo 4.1: Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 4.1.1 Introducción El conocimiento de la grasa trans se nutre de los datos que se consigan experimentalmente sobre su contenido en los productos alimentarios que consumimos en nuestra dieta diaria y las ingestas poblacionales en distintas edades, distintos países y distintas franjas sociales. La determinación de los contenidos de grasa trans en distintos tipos de alimentos ayuda a ampliar las bases de datos, y actualizar las Tablas de Composición de Alimentos que, por otro lado, están en la base del cálculo de las ingestas poblacionales de grasa trans. Además, se suministra información de primera mano a las agencias alimentarias oficiales (FDA, EFSA, AECOSAN, y otras). Las iniciativas gubernamentales que tenían como foco a la industria alimentaria para que usaran como alternativa a los aceites parcialmente hidrogenados (PHVOs), grasas cis-insaturadas, no pasaban del nivel de las recomendaciones. La elección de los sustitutos de los PHVOs se dejó entonces a lo que manifestaban las fuerzas del mercado. Y la decisión, en su momento, fue emplear como reemplazantes los aceites tropicales (de palma, palmiste y coco), sobre todo, el uso del aceite de palma o sus derivados, como la estearina de palma. Este producto presentaba fácil abastecimiento, precios bajos, cierta estabilidad y características físicas y sensoriales favorables. Además, es semisólido a temperatura ambiente pero presenta una carga de 44% de ácido palmítico, ácido saturado, lo que constituía un inconveniente (Skeaff, 2009). Se creó entonces una polémica, en torno al uso del ácido palmítico. De hecho, hace pocos años (Marangoni et al., 2017) un grupo de expertos reunidos en un Simposio sobre este tema organizado, por la Fundación de Nutrición de Italia, concluían que no parecían existir evidencias de los efectos sobre la salud pública del aceite de palma, en comparación con otras grasas ricas en ácidos grasos saturados. Más allá de la polémica, en los últimos años se ha mejorado los productos procesados rebajando los componentes lipídicos (ácidos grasos trans y saturados) mediante el empleo de organogeles, hidrogeles monoglicerídicos o mediante el empleo de grasas interesterificadas (Chaves et al., 2018). Cuando se pretenden emplear nuevas alternativas al uso de los aceites hidrogenados habría que tener en cuenta: Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 110 - Disponibilidad; - Logística de las cadenas de suministro; - Costes; - Aceptación del consumidor (Borra et al., 2007). La espectrofotometría de infrarrojo de segunda derivada, la técnica ATR-FTIR (-2D), que se emplea en esta Tesis presenta indudables ventajas y mejoras respecto a las técnicas infrarrojas anteriormente propuestas. Así: – Presenta una alta tasa de operaciones de medida, siendo ideal para análisis rutinario; - Debido a una mayor estrechez de la banda de 963-966 cm-1, el método gana en selectividad y resuelve las posibles interferencias de ácidos grasos saturados (SFA) y ácidos linoleicos conjugados (CLA); - Se evidencia una fuerte mejora de los componentes de baja frecuencia (bajo número de onda) en la descomposición de Fourier del espectro de absorción FTIR; - Buena resolución: la banda de la grasa trans a 966 cm-1 es puntiaguda y simétrica, mientras que la banda de la grasa saturada (SFA), alrededor de 960 cm-1, es más plana y asimétrica; - No se requiere la derivatización de los ácidos grasos hasta sus ésteres metílicos (FAMEs) y la referencia espectral es el aire. Por lo tanto, no hay que utilizar una grasa estándar especialmente refinada exenta de grasa trans (Mossoba et al., 2007, 2011). En la primera parte de este Capítulo 4 se plantean como objetivos: - Determinar los niveles de grasas trans en productos alimentarios procesados que no lo declaran en el etiquetado nutricional; - Determinar de forma concreta los niveles de grasa trans en productos etiquetados como “cero-trans”; - Determinar la posible presencia de grasa trans en productos procesados sospechosos de contenerla; - Determinar posibles contenidos de grasa trans en productos alimentarios sin etiquetado nutricional, o productos de establecimientos de “comida-rápida” (“fast-foods”). Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 111 Para ello se ha realizado una pequeña, pero representativa, selección de productos alimentarios entre los que más pueden predominar los ácidos grasos trans (TFAs), de acuerdo con experiencias previas en España y en países de nuestro entorno. 4.1.2. Material y Métodos 4.1.2.1 Reactivos y Aparatos 4.1.2.1.1 Reactivos - Trielaidina (TE) [1,2,3-tris(trans-9-octadecenoato) de glicerilo]. Se conserva en congelador (-20 ᵒC) hasta el momento de su uso. Cuando se vaya a usar hay que descongelar la muestra durante una noche. Banda de absorción destacada a 966 cm-1 en el espectro ATR-FTIR (-2D) del producto (pureza > 99%, Sigma-Aldrich). - Tripalmitina (TP) [1,2,3–tris(hexanodecanoato) de glicerilo]. Se conserva en congelador (-20 ᵒC) hasta el momento de su uso. Cuando se vaya a usar hay que descongelar la muestra durante una noche. Banda de absorción destacada a 956 cm-1 en el espectro ATRFTIR (-2D) del producto (pureza > 99%, Sigma-Aldrich). - Etanol absoluto, ácido clorhídrico concentrado (12 M), pirogalol, éter etílico, éter de petróleo, sulfato sódico anhidro, n-hexano. Todos estos reactivos eran de calidad analítica (R.A), y 99.9% de pureza, de Merck, o marcas comerciales similares. 4.1.2.1.2 Aparatos - Espectrofotómetro de infrarrojo Jasco FTIR-4200 A, con software QAU-400 Quantitative Analysis Program (Jasco Analytica, Japón). - Balanza analítica Mettler AE 100. - Triturador-homogeneizador Waring-Blendor, con cuchillas de acero inoxidable. - Rotavapor R-300 Buchi. - Agitador Vortex Ika. Genius 3, mod. VG3 - Baño de agua termostatizado Selecta, con agitador intermitente. - Embudo Büchner para filtración, acoplado a bomba de vacío. - Embudo de decantación para extracción, de 250 mL. - Viales de vidrio Pyrex de 10 mL y 20 mL, con tapones de rosca. - Micropipeta de 1-10 µL. Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 112 4.1.2.2 Muestras Basándose en los principales ingredientes y características de los artículos alimentarios, así como en la distribución empleada en otros estudios similares recientes (Albuquerque et al., 2018), se optó por el agrupamiento propuesto por la FAO para los productos alimentarios que se eligieron (en función de la posible preponderancia de grasa trans) que se expone a continuación (FAO / INFOODS, 2012). Categoría de alimento Producto seleccionado Horneado/bollería Donete, dónuts Galletas, bizcochos, obleas Galleta “cookie” Snacks Gusanitos, palomitas Comidas listas para consumir Sopa deshidratada “Comida rápida” Patatas fritas, hamburguesas Los productos alimentarios se adquirieron en supermercados, hipermercados o establecimientos locales y se analizaron lo más pronto posible, antes de su fecha de caducidad. Se ha omitido ensayar bollería convencional (cruasán, suizos, palmeras,…) porque en anteriores estudios en nuestro país no se demostró contenidos de grasa trans (Ansorena et al., 2013; Pérez-Farinós et al., 2015). 4.1.2.3 Calibración del método Se prepararon mezclas estándares de trielaidina (TE) y tripalmitina (TP) pesando hasta la cuarta cifra decimal, con balanza de precisión, en viales de vidrio Pyrex de 10 mL. Los viales, después de homogenizar y tapados, se llevaron a un baño de agua termostatizado a 70 ᵒC, con agitación intermitente, hasta fusión de los reactivos mezclados. Se retiran los viales del baño, y se agita con Vortex para homogenizar, antes de la medida en el espectrofotómetro infrarrojo. Se obtuvieron los siguientes valores (Tabla 10). Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 113 Tabla 10. Calibración del método aplicado. Punto % TEa AU/cm-2·103 1 0,13 0,11 2 15,02 0,30 3 20,18 0,38 4 40,61 0,74 5 100 2,14 a Porcentaje de TE en la mezcla TE-TP, representa el % TFA, sobre grasa total. Representando dichos puntos se obtiene la recta de calibrado. La ecuación de regresión es: y=2·10-5x + 2·10-6, Ecuación 4 Donde: x= % TFA; y= mAU/cm-2; R2= 0,9900, muy elevado, lo que confirma la existencia de una alta dependencia lineal entre los valores de mAU/cm-2 y el % TFA. A partir de la ecuación de regresión se puede obtener el porcentaje de TFA (% sobre grasa total) de cualquier grasa que se ensaya, despejando x=(y-2·10-6) / 2·10-5. Se calculó la ratio señal-ruido (SNR): SNR= 𝐵𝐵 𝐴𝐴 Donde: B=altura de banda (mAU/cm-2) que corresponde al valor más bajo de TE en la mezcla de estándares TE-TP de la recta de calibrado; A=nivel de ruido pico a pico, suministrado en los espectros IR de las mezclas de estándares TE+TP de la recta de calibrado. Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 120 - Dónuts Se han ensayado donetes (declara en la etiqueta aceite de palmiste totalmente hidrogenado, grasa de palma y aceite de girasol) y dónuts comerciales (declara en la etiqueta aceite de palmiste totalmente hidrogenado, grasa de palma y cubrimiento de cacao). Parece ser que se ha usado como alternativa una interesterificación entre un aceite totalmente hidrogenado y un aceite vegetal. Los valores obtenidos (Tabla 11) son inferiores al 1 %TFA, sobre grasa total. Parcerisa et al. (1999) encontraron valores en el rango 0.6-11.89 %TFA, sobre grasa total en dónuts. Ya en el presente siglo se informó de contenidos en el rango 0.15-5.94 %TFA (Vicario et al., 2003) en bollería española, y descendieron a menos del 2 %TFA en 2015 (Pérez-Farinós et al., 2016). Este descenso se mantiene por los resultados hallados en nuestras muestras (Tabla 11) y satisface las exigencias legislativas comunitarias actuales. Estos resultados contrastan con lo observado en los dónuts “Berliner” (22-27 %TFA, sobre grasa total), que alcanzaron los valores más altos de grasa trans entre los productos de bollería alemanas (Fritsche et al., 2010), o los contenidos de 10-20 %TFA en los dónuts australianos (McCarthy et al., 2008). Los valores hallados en los dónuts argentinos fueron variables (0.9-5.6 %TFA) (Kakisu et al., 2018). - Galleta Se ensaya una galleta con gotas de chocolate (“cookie”), que declara grasa de palma y manteca de cacao. El valor obtenido ha sido 0,51 %TFA, sobre grasa total, inferior al 1%. En galletas españolas han descendido los contenidos de grasa trans notablemente, desde los valores de 0,15-5,94 %TFA de principios de este siglo (Vicario et al., 2003), hasta 0,54 -1,0 %TFA (Ansorena et al., 2013), o el más reciente de 0,62-0,83 %TFA en galletas industriales (Gutiérrez-Luna et al., 2019). Nuestros resultados corroboran esta tendencia (Tabla 13). En el estudio de Gutiérrez-Luna et al., (2019) se ensayaron también galletas artesanales, y el resultado (0,99-3,50 %TFA) no fue el mismo. Los autores aducían falta de estandarización en las fórmulas de elaboración de las galletas, mala práctica de fabricación, o empleo de aceites tropicales. Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 121 Tabla 13. Evolución del contenido de grasa trans en las galletas. País %TFAa Referencia España 5,20-9,30% Vicario et al., 2003 Portugal < 1% Costa et al., 2016 España 0,5-1,02% Ansorena et al., 2013 Brasil 1,2% Aued-Pimentel & Kus-Yamashita, 2021 España 0,62-0,83% Gutiérrez-Luna et al., 2019 España 0,51% Resultado presente Tesis a Sobre grasa total En Portugal han conseguido rebajar la cifra a 0,20 %TFA, sobre grasa total, para el grupo de galletas, bizcochos y obleas (Alburquerque et al., 2018). En Suecia el porcentaje de TFA en galletas era inferior al 1 % y las ingestas de grasa trans en la población son de las más bajas, 0,3 E %TFA, sobre base energética (Trattner et al., 2015). Lógicamente, al utilizar como alternativa al aceite parcialmente hidrogenado grasas de palma, subía el porcentaje relativo de grasa saturada, y, como en nuestro caso (Tabla 12), el producto era ligeramente aterogénico (índice aterogénico un poco superior a la unidad). El descenso por debajo del 1 %TFA está confirmado en Portugal y España (Pérez-Farinós et al., 2016). Lo mismo ha ocurrido en Brasil entre 2003 y 2018, llegándose a niveles de 1,2 %TFA en galletas y bizcochos, aunque con contenidos de grasa saturada muy altos (más del 40%), consecuencia directa del uso de aceites de palma; últimamente se están empleando como alternativa grasas interesterificadas en las galletas (Aued-Pimentel & Kus-Yamashita, 2021). En Europa y Norteamérica los niveles de TFA en galletas eran variables, aunque superaban en muchos casos el 2-3 %TFA. Así, tenemos los datos de: - Alemania: 0-3,8 %TFA (Kuhnt et al., 2011); - Suiza: 0,64-12,26 %TFA (Richter et al., 2009); - Estados Unido: 8,4 %TFA (Albers et al., 2008), con alrededor de 40% de grasa saturada. Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 122 Estos valores están muy alejados de los que se dan en Pakistán (9,3-34,9 %TFA) y en India (hasta 30-40 %TFA). La Agencia de Seguridad Alimentaria y Estándares de la India recomendó la elaboración de galletas y panecillos, de amplio consumo en estos países, descartando el empleo de vanaspati y sugiriendo el empleo de aceites de soja y de lino que, además de no introducir grasa trans, aportaban omega-3 y ácido α-linolénico. La situación era tal en la India que la Agencia permitió temporalmente el uso de vanaspati conteniendo hasta un 10 %TFA. La OMS certificó que los fallecimientos en la India por causas cardiovasculares se duplicaron en el período 1985-2015 (Ghafoorunissa, 2008; Tarar et al., 2020). A partir de 2013 se observa un descenso significativo del contenido de grasa trans en galletas de España, Portugal y Brasil (Tabla 13). De tal forma que el contenido en galletas españolas estuvo por debajo del 1 %TFA, sobre grasa total, ya en 2015, con respecto a 2010 (Robledo de Dios et al., 2015) y se ha estabilizado, como demuestran los resultados (Tabla 13). En Portugal el descenso en contenido de trans de las galletas fue de un 80 %, y se llegaron a conseguir buenas reformulaciones para evitar, conjuntamente, los contenidos de ácidos grasos trans y saturados, aunque esto repercutió en el precio de venta (Santos et al., 2015). - Gusanitos (snacks) Los gusanitos se declaran como sémola de maíz horneado con aceites de maíz o de girasol. Constituyen un producto-aperitivo y presentan un consumo usual entre la población infantil. En el estudio TRANSFAIR se ofrecían contenidos medios de 0,82 %TFA entre los aperitivos salados (Aro et al., 1998). El contenido en snacks americanos era de 1,5 %TFA, sobre grasa total (Albers et al., 2008). Los aperitivos salados en España presentaban un contenido medio de 0,23 %TFA (Robledo de Dios et al., 2015) que aún descendió más entre 2010 y 2015 (Pérez-Farinós et al., 2016) y que se acerca al valor obtenido, 0,28 %TFA, sobre grasa total, en nuestro ensayo de gusanitos. En Portugal se dieron cifras similares para snacks, 0,40 %TFA, sobre grasa total (Albuquerque et al., 2018). Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 123 - Palomitas de maíz Se declaran un producto de aperitivo de maíz horneado (sémola de maíz, aceite de girasol). Habría que distinguir entre las palomitas de microondas y las palomitas confeccionadas a partir de la fritura del grano de maíz con aceite de girasol, u otro aceite vegetal refinado. Las primeras, debido a la probable presencia de aceite parcialmente hidrogenado contenían habitualmente elevados niveles de grasa trans. Así, McCarthy et al. (2008) encontraron niveles que se aproximaban al 30 %TFA, sobre grasa total en palomitas de microondas australianas, mientras que en las ya confeccionadas en bolsas los niveles eran 0,8-1,4 %TFA. En Norteamérica, Albers et al., (2008) encontraron niveles superiores al 30 %TFA, con 37% de grasa saturada. En España se reportaron cifras de 36 %TFA, y de 1-2 %TFA en las ya confeccionadas en bolsas para comercializarlas (Fernández San Juan, 2000). La situación no era diferente en Dinamarca y otros países europeos donde expertos ya advertían que una ración (bolsa) de 30 gramos podría contener hasta 12 gramos de grasa trans (Stender et al., 2012). Nuestros resultados en las palomitas de maíz son de 1,44 %TFA, sobre grasa total (palomitas sin envasar, ambigú de cine) y de 1,11 %TFA, bolsa comercializada de hipermercado. Están, pues, en el intervalo 1-2 %TFA, no superan el límite legislativo comunitario del 2 %TFA, y son valores en consonancia con los obtenidos en otros estudios españoles (Pérez-Farinós et al., 2016). Prácticamente, se corresponde con el valor que alcanza el aceite vegetal empleado en la fritura del maíz. - Sopa deshidratada En el estudio TRANSFAIR se obtuvieron cifras muy elevadas de grasa trans en sopas deshidratadas (7,61-19,13 %TFA) donde, en su fabricación, se solía usar grasa vegetal y grasa animal parcialmente hidrogenada (Aro et al., 1998). Por ese tiempo, se detectaron en cubitos de caldo italianos, fabricados con grasas animales, grasas vegetales de palma y aceite parcialmente hidrogenado, niveles de 10-23 %TFA, sobre grasa total (Strocchi & Marascio, 1992). En España, sucedía lo mismo, alcanzándose cifras variables, pero altas, con un promedio de 15,4 ± 9,4 %TFA en sopas de sobre (Fernández San Juan, 2000). Ya en el presente siglo, los niveles se redujeron. En Alemania, fueron más bajos, aunque variables: 2,02 ± 5,91 %TFA (Kuhnt et al., 2011). En la muestra de sopa de sobre Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 124 deshidratada que se ensayó se obtuvo un valor de 0,28 %TFA, sobre grasa total, muy bajo, que se sitúa dentro del intervalo 0-1 %TFA que se ha obtenido en sopas deshidratadas españolas más recientemente (Pérez-Farinós et al., 2016). Esto demuestra que han cambiado la fórmula e ingredientes de elaboración de este producto. De hecho, la muestra ensayada declara aceite de oliva como el componente graso empleado en su elaboración. Coincide, asimismo, con el rango 0,3-0,5 %TFA encontrado en sopas deshidratadas argentinas (Kakisu et al., 2018). - Comida rápida Se han ensayado muestras de patatas fritas y de hamburguesas de establecimientos de comida rápida (“fast-foods”) de locales distintos. Sólo en un establecimiento (Burger King), y para las hamburguesas, ofrecía la franquicia en su página WEB el contenido de grasa trans (0,1 %TFA), cifra que fue inferior a lo que obtuvimos en el procedimiento experimental aplicado. Las cadenas de comida rápida (McDonald´s, Burger King…) en los 1990s empleaban en Norteamérica y Sudamérica aceites de fritura con alrededor de 23 %TFA, y en países europeos con 10 %TFA (es decir, contenían aceites parcialmente hidrogenados), mientras que en las franquicias de España los niveles eran del 5 %TFA, y en Dinamarca, tan sólo del 1 %TFA (sin duda, obligadas a las exigencias legislativas danesas) (Stender et al., 2006) al inicio del presente siglo (2000-2005). A la entrada en vigor, en 2006, de la regulación legislativa de la FDA 2003 sobre declaración en las etiquetas, se redujo ostensiblemente el contenido de grasa trans (patatas fritas, 2,76 %TFA; hamburguesas, 0,86 %TFA) en las franquicias estadounidenses de comida rápida (Kohn & Mitchell, 2006), con respecto al panorama que se solía encontrar antes del emprendimiento legislativo citado (Satchithanandam et al., 2004). En China, en los considerados “alimentos occidentalizados” (establecimientos de comida rápida) se daban niveles de grasa trans dentro del rango 0,66-4,46 %TFA, sobre grasa total (Fu et al., 2010). Y en Japón, en muchos establecimientos de comida rápida se superaba fácilmente el 2 %TFA, sobre grasa total, y se comparaban con los alimentos tradicionales de la cultura japonesa, que contenían menos de 1 %TFA (Yamada et al., 2010). Es muy interesante considerar la evolución en los Estados Unidos, país, si se piensa, inductor de la comida rápida (“fast-food”). Antes de las medidas legislativas operativas Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 125 en este país y programadas por la Agencia “Federal Food & Drug Administration” (FDA), la situación era bastante caótica, pudiéndose alcanzar en patatas fritas de franquicias niveles de hasta 24,7-38,2 %TFA, sobre grasa total (Stender et al., 2006) y llegándose a 24 gramos de grasa trans por ración (Mozaffarian et al., 2010). Después de la entrada en vigor en 2006, de la ley reguladora FDA 2003, coincidiendo con concienciación de la sociedad sobre el peligro de la grasa trans y la reformulación llevada a cabo por las industrias alimentarias, los niveles descendieron ostensiblemente. Sobre la misma época (2012) se realizaron estudios que incluían indagaciones hasta en más de treinta establecimientos de comida rápida. Los trabajos de Tyburczy et al., (2012) (patatas fritas: 0,51-12,51 %TFA; hamburguesas: 2,79-5,70 %TFA) y de Mossoba et al., (2014) (patatas fritas: 0,65-10,62 %TFA; hamburguesas: 3,39-5,69 %TFA) demuestran que todas las hamburguesas analizadas, y una parte sustancial de las patatas fritas analizadas excedían el límite preceptivo del 2 %TFA, sobre grasa total. Los datos más recientes, aplicando el procedimiento ATR-FTIR (-2D), que es el empleado en la presente Tesis, volvían a ofrecer datos globales de productos de comida rápida (0,47-11,40 %TFA) que estaban un poco por debajo de los anteriores, pero donde seguían apareciendo muestras que superaban el 2 %TFA, sobre grasa total (Karunathilaka et al., 2018). Las muestras analizadas en esta Tesis, de tres establecimientos de comida rápida, ofrecen valores bajos, inferiores al 1 %TFA, sobre grasa total, excepto en el caso de las patatas fritas de McDonald´s que se sitúan en el intervalo 1-2 %TFA (Tabla 11); en cualquier caso, están por debajo del 2 %TFA, y contrastan grandemente, y positivamente, con la situación de estas mismas franquicias en Estados Unidos. Los valores obtenidos están de acuerdo con el promedio de 1,96 % resultante en alimentos españoles (Robledo de Dios et al., 2015), o con los más recientes de Astiasarán et al., (2017), en el tramo 0,49-0,89 %TFA, sobre grasa total (Tabla 14). Destaca el valor obtenido en hamburguesas, inferior a los valores 2,3-3,3 %TFA, que suministran para este producto en España Burdaspal et al., (2010). Igualmente, se ha confirmado el bajo valor (0,1-0,3) del índice aterogénico en patatas fritas (Tabla 12). También es asumible (alrededor de 0,7) este índice en hamburguesas (Tabla 12). En la Tabla 14 se puede observar un apreciado descenso a partir de 2008 del contenido de grasa trans en patatas fritas de restaurantes de comida rápida, descenso bien patente en España y Portugal. Hay excepciones, como en el caso de Polonia, donde es usual la tendencia a valores muy altos de grasa trans, comportamiento bastante común en Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 126 los países del Este Europeo. En la Figura 10 se traza la línea del tiempo en España para las patatas fritas de comida rápida. Se contempla un descenso parabólico acusado desde la situación en el estudio TRANSFAIR, a finales de los años noventa (Aro et al., 1998). Se ha demostrado la importancia de consumir en lugares de restauración de franquicia controlada. Por ejemplo, en Alemania los niveles medio de contenido de grasa trans en patatas fritas, hamburguesas, y otros productos de comida rápida (“nuggets” de pollo, pastel de manzana, etc.) fueron de 0,22 %TFA, en franquicias controladas; sin embargo, en establecimientos sin autocontrol, los niveles subieron hasta el 15 %TFA (Kuhnt et al., 2011). Asimismo, en India se produjo una reducción importante para dicho país, alcanzándose niveles de 1,57-3,83 %TFA, sobre grasa total, si el establecimiento de comida rápida empleaba buenas prácticas y evitaba el uso del vanaspati como aceite de cocinar (Khan et al., 2017). En Pakistán se rebajó hasta contenidos de 2,32-6,10 %TFA, en establecimientos con autocontrol, frente a niveles del 15-24 %TFA, que aparecían en establecimientos de comida rápida no franquiciadas e incontroladas (Bhanger & Anwar, 2004). Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 127 Tabla 14. Evaluación de los niveles de grasa trans en patatas fritas de establecimientos de comida rápida. Añoa País %TFAb Referencia 1997 Europa 12-35 % Aro et al., 1998 1997 España 33,57% Aro et al., 1998 2000 Austria 1,9-18% Wagner et al., 2000 2000 España 20,9 ± 12,9% Fernández San Juan, 2000 2003/2006 España 4-13% Stender et al., 2006 2003/2006 Polonia 42% Zbikowska, 2010 2006 EEUU 2,76% Kohn & Mitchell, 2006 2008 España 2,50% Barrado et al., 2008 2008 Austria 1,72 ± 3,04% Wagner et al., 2008 2008 Australia 1,4-3,4% McCarthy et al., 2008 2010 Alemania 0,09-0,3% Fritsche et al., 2010 2010 España 0,6 -1% Burdaspal et al., 2010 2012 EEUU 0,5-12,5% Tyburczy et al., 2012 2013 Reino Unido 0,11% Roe et al., 2013 2014 Pakistán 0,11-2,4% Karim et al., 2014 2014 EEUU 0,65-10,62% Mossoba et al., 2014 2015 España 1,96% Robledo de Dios et al., 2015 2017 España 0,49-0,89% Astiasarán et al., 2017 2017 India 1,57-3,83% Khan et al., 2017 2018 EEUU 0,47-11,40% Karunathilaka et al., 2018 2018 Portugal 1,63% Alburquerque et al., 2018 2021 España 1,36% (McDonald´s) Resultado presente Tesis 2021 España 0,42% (KFC)c Resultado presente Tesis a El año hace referencia a la publicación del artículo; b Sobre grasa total; c KFC: Kentucky Fried Chicken. Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 128 Tabla 15. Datos para construir la línea del tiempo para patatas fritas de comida rápida en España. Añoa %TFAb Referencia 1997 33,57% Aro et al., 1998 2003/2006 4-13% Stender et al., 2006 2008 2,5% Barrado et al., 2008 2010 1,61% Burdaspal et al., 2010 2017 0,49-0,89% Astiasarán et al., 2017 2021 0,42-1,36% Resultado presente Tesis a El año hace referencia a la publicación del artículo; bSobre grasa total. Fig. 10. Línea del tiempo para patatas fritas de comida rápida en España. 4.1.5 Conclusiones Los resultados obtenidos parecen confirmar la tendencia en los últimos años en España, y en algunos países europeos, como Portugal y Reino Unido, de una reducción de los contenidos de grasa trans en alimentos procesados. Reflejan cantidades inferiores al 2 %TFA, sobre grasa total, tal y como estableció de forma pionera Dinamarca y que luego han acogido asociaciones e instituciones internacionales, encabezadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS), la FDA y, más recientemente (desde 2021) la Comisión Europea. Tanto la declaración obligatoria, limitaciones o prohibiciones, la Capítulo 4.1 Determinación de grasa trans en productos alimentarios escogidos 129 adopción de buenas prácticas de fabricación y autocontrol, como las reformulaciones para sustituir a los aceites parcialmente hidrogenados, ya periclitados, permitieron el empleo de grasas saludables, interesterificadas o hidrogeles (grasas con bajo nivel de grasa trans, grasa saturada, y cantidades adecuadas de ácido linoleico, que contrarrestan a los ácidos grasos trans), que resultan eficaces para que se consigan ya, o en un futuro próximo, los objetivos planteados (la OMS se fijó como plazo el año 2023). No hay que olvidar, en esta batalla contra la grasa trans, la presión de los consumidores, a título individual, o a través de sus asociaciones. También, la labor fundamental de los Grupos de Trabajo, creados al efecto para tratar la dimensión del problema, y la predisposición voluntaria de la industria alimentaria, cuando la hubo (por ejemplo, en los Países Bajos y en el Reino Unido ha existido una colaboración a imitar entre la industria y distintos estamentos, que resultó muy positiva). Han colaborado a los logros conseguidos las buenas prácticas y el autocontrol en la industria, el empleo eficaz de alternativas saludables (fraccionamiento, interesterificación, empleo de hidrogeles y oleogeles), junto a la labor legislativa y de asesoramiento de organismos internacionales y agencias de salud, como FDA, OMS, EFSA y las asociaciones del corazón, en diversos países, como la “American Heart Association”. Muchas de las reformulaciones acometidas por la industria alimentaria se han introducido bajo patente, y se han ido extendiendo paulatinamente desde el 2003 y, sobre todo, después del golpe de gracia de la FDA a las grasas parcialmente hidrogenadas (foco principal de los ácidos grasos trans de origen industrial) en 2013, al no considerarlos ya como sustancias GRAS. Con la introducción de las nuevas alternativas (entre las que se incluyen ceras, hidrogeles y oleogeles) se pretende, en lo posible, descartar el uso como alternativas de los aceites tropicales (de palma, palmiste, y coco), que presentan el inconveniente de la introducción de grasa saturada. Actuando de esta forma se pretende conseguir alimentos procesados de adecuadas propiedades reológicas y organolépticas, estables, de costes reducidos, que no contengan grasa trans (o con menos de 1-2 %TFA, sobre grasa total) y con bajo porcentaje de grasa saturada. La eliminación de la grasa trans en los surtidos de alimentos [y aquí nos estamos refiriendo a la de origen industrial, pues la de la leche (lácteos) y carne de rumiantes, en las cantidades que normalmente se consumen en la dieta no parecen ser nocivas] ayudará a reducir, sobre todo en determinados países, la mortalidad y morbilidad por causas Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 136 4.2.2.1.2 Aparatos - Espectrofotómetro de infrarrojos Jasco-FTIR 4200 A, con software QAU-400 Quantitative Analysis Program (Jasco Analytica, Japón). - Espectrofotómetro UV-visible Shimadzu (Japón), con cubetas de cuarzo de 1,0 cm de paso de luz. - Refractómetro de Abbe UNICAM WYA-15, termostatizado a 25 ᵒC. - Balanza analítica Mettler AE100. - Bureta y material de vidrio para volumetría. - Viales de vidrio de 10 mL y 20 mL, provistos de tapón de rosca. - Micropipeta de 1-10 µL. 4.2.2.2 Muestras Se estudian 23 tipos de muestras de aceites vegetales comestibles de oliva, girasol, y maíz, y de cada muestra-tipo de aceite se escogen tres categorías (premium, estándar, marca blanca) (excepto para el aceite de maíz). Las muestras, codificadas desde la A hasta la W, alfabéticamente, aparecen descritas en la Tabla 16. Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 137 Tabla 16. Muestras de aceites vegetales comestibles estudiadas. Muestra codificadaa Tipo de muestra Categoría A Aceite de oliva virgen extra (prensado en frío) Premium B Aceite de oliva virgen extra Premium C Aceite de oliva virgen extra Estándar D Aceite de oliva virgen extra Marca blanca E Aceite de oliva virgen Premium F Aceite de oliva virgen Estándar G Aceite de oliva virgen Marca blanca H Aceite de oliva 1ᵒ Premium I Aceite de oliva 1ᵒ Estándar J Aceite de oliva 1ᵒ Marca blanca K Aceite de oliva 0,4ᵒ Premium L Aceite de oliva 0,4ᵒ Estándar M Aceite de oliva 0,4ᵒ Marca blanca N Aceite de orujo de oliva Premium O Aceite de orujo de oliva Estándar P Aceite de orujo de oliva Marca blanca Q Aceite de girasol Premium R Aceite de girasol Estándar S Aceite de girasol Marca blanca T Aceite de girasol 80% oleico Premium U Aceite de girasol 65% oleico Estándar V Aceite de girasol 26% oleico Marca blanca W Aceite de maíz Premium a Las muestras de aceites de orujo de oliva, aceites de girasol y aceite de maíz son aceites refinados. Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 138 Las muestras de aceite se mantuvieron hasta su ensayo en sus envases, a temperatura adecuada, y protegidas de la luz. Las muestras se adquirieron en supermercados o hipermercados o en tiendas reconocidas. Las tres categorías establecidas se fundamentaron, básicamente, en su precio de venta al consumidor. Todos los ensayos se realizaron, después de adquirirlas, lo más pronto posible, se hicieron replicados y, en todos los casos se analizaron antes de su fecha de caducidad. 4.2.2.3 Procedimientos Índice de acidez Se disuelven 10 ± 0,2 g, exactamente pesados, del aceite en 50 mL de una mezcla éter dietílico-etanol 96 % 1:1 v/v, en matraz Erlenmeyer de 250 mL. Se adicionan 0,15 mL de una disolución de fenolftaleína. Se valora desde la bureta con disolución etanólica de KOH 0,1M (previamente estandarizada con el patrón ftalato ácido de potasio) hasta viraje al rosa del indicador. Se realiza la lectura del valorante gastado hasta la neutralización. Se calcula el índice de acidez, expresado en porcentaje (%) de ácido oleico. Se realiza el ensayo por triplicado. Índice de peróxidos En matraz Erlenmeyer de 250 mL, con boca y tapón esmerilado, se pesan, exactamente 2 g de la muestra de aceite. Se añaden 10 mL de cloroformo, y se agita hasta que se disuelva el aceite. Luego, se añaden 15 mL de ácido acético glacial, y 1 mL de disolución acuosa saturada de ioduro potásico. Se tapa el matraz y se agita vigorosamente durante 1 minuto, manteniéndolo 5 minutos en la oscuridad a 15-25 ᵒC. Se añaden 75 mL de agua destilada. Se destapa el matraz, y se valora lo más rápidamente posible, manteniéndolo en agitación, con una disolución, previamente estandarizada, de tiosulfato sódico 0,01 N. Cuando resta poco para llegar al punto final, se añade engrudo de almidón como indicador. Se continúa la valoración hasta decoloración del color azul del aducto iodo-almidón. El resultado se expresa en mEq de oxígeno por kg. Se realizan duplicados. Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 139 Índice de refracción Se utiliza el refractómetro de Abbe. Se filtra previamente la muestra de aceite sobre papel de filtro, que tiene una capa de sulfato sódico anhidro, para eliminar la posible humedad. Las lecturas en el refractómetro se toman con 4 cifras decimales. Hay una temperatura de lectura (t´) y una temperatura de referencia (t). La temperatura de referencia es 25 ᵒC: Se corrige el índice de refracción por la diferencia de temperaturas. Sucede: a) Si t´>t, n25= nt´ + F (t´- 25) b) Si t´<t, n25= nt´ + F (25 - t´) donde F=factor de conversión de temperatura = 0,00035 En los aceites vegetales comestibles puros el intervalo de nt es 1,4400 – 1,4700. A 25 ᵒC los rangos de índice de refracción para los aceites ensayados son: • Aceite de oliva: 1,4665 – 1,4683; • Aceite de girasol: 1,4706 – 1,4740; • Aceite de girasol medio oleico: 1,4684 – 1,4705; • Aceite de girasol alto oleico: 1,4683; • Aceite de maíz: 1,4710 – 1,4725. Se realizan duplicados. Extinciones específicas en el ultravioleta Antes de realizar las medidas en el espectrofotómetro UV-visible, provisto de cubetas de cuarzo de 1,0 cm de paso de luz, se comprueba la exactitud y precisión del aparato utilizando una disolución patrón de dicromato potásico al 0,2 %, disuelto en disolución de KOH 0,05 N. Su absorbancia a 275 nm, frente a la potasa como blanco de referencia, deberá encontrarse en el intervalo 0,200 ± 0,005. Se pesan, en vaso de precipitado de 50 ó 100 mL, 90 mg de aceites de oliva vírgenes, 60 mg de aceites de oliva refinados, ó 40 mg de aceites de semillas. El aceite debe de estar completamente nítido y transparente; en caso contrario, se requiere una adecuada filtración. Se disuelve el aceite en ciclohexano, se trasvasa a matraz aforado de 10 mL y se diluye y enrasa con ciclohexano. Se mide en el espectrofotómetro UV-visible, en cubetas de cuarzo de 1,0 cm de paso de luz, a 232 nm, 266 nm, 270 nm y 274 nm, utilizando ciclohexano puro como blanco de referencia. La lectura de la absorbancia debe Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 140 situarse dentro del intervalo 0,200-0,800. De no ser así, habría que repetir la medida, bien diluyendo convenientemente con ciclohexano puro o bien procediendo a una nueva pesada del aceite y preparación. La extinción específica (𝐾𝐾1cm 1% ) se calcula a través de la expresión: 𝐾𝐾1𝑝𝑝𝑚𝑚 1% =𝑇𝑇𝜆𝜆 𝑐𝑐 𝑥𝑥 𝑒𝑒 Donde: Aλ= Absorbancia a la longitud de onda λ; c= concentración de la muestra de aceite disuelta en ciclohexano, expresado en gramos por 100 mL de disolución; e= espesor de la cubeta de cuarzo (1,0 cm). Determinación de grasa trans Se utiliza el procedimiento basado en la espectroscopía de infrarrojos de segunda derivada AOCS “Official Method” Cd 14e-09 (AOCS, 2009) que se detalla en el Apartado 4.1.2.5 anterior. Las muestras de aceite se extienden directamente y expanden sobre el cristal ATR, y se lleva a cabo la medida. Se aplica la misma recta de calibrado que se explica en el Apartado “4.1.2.3. Calibración del método”. Análisis estadístico: Se ofrece la media y la desviación estándar de los resultados. Se calcula el coeficiente de correlación de Pearson. Se utiliza el paquete estadístico SPSS Statistics V. 20 (SPSC Inc., Chicago). 4.2.3 Resultados Los procedimientos utilizados son los oficializados por la Comisión Europea (CEE, 1991, 1992, 2003) para aceites vegetales comestibles. En los Anexos II y IX del Reglamento CEE No. 2568/91 aparecen los valores normativos para los parámetros y medidas realizadas en las muestras de aceites vegetales comestibles (Tabla 17). Los resultados obtenidos para los distintos parámetros de calidad y autenticidad se recogen en las Tablas 18, 19, 20, 21 y 22. Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 141 Tabla 17. Valores normativos de la CEE para los parámetros de autenticidad y calidad de los aceites vegetales comestibles ensayados. Aceite de oliva virgen extra Aceite de oliva virgen Aceite de oliva Aceite de orujo de oliva Aceite de girasol Acidez (%) ≤ 0,8 ≤ 2,0 ≤ 1,0 ≤ 0,3 ≤ 2,0 Índice de peróxidos ≤ 20 ≤ 20 ≤ 15 ≤ 5 ≤ 10 K232 ≤ 2,50 ≤ 2,60 ≤ 5,50 K270 ≤ 0,20 ≤ 0,25 ≤ 0,90 ≤ 1,10 ΔK ≤ 0,01 ≤ 0,01 ≤ 0,15 ≤ 0,25 ≤ 0,16 n25 1,4665-1,4683 1,4700-1,4740 Aceite de girasol 26% oleico Aceite de girasol 65% oleico Aceite de girasol 80% oleico Aceite de maíz Acidez (%) ≤ 2,0 ≤ 2,0 ≤ 2,0 ≤ 2,0 Índice de peróxidos ≤ 10 ≤ 10 ≤ 10 ≤ 10 n25 1,4706-1,4740 1,4684-1,4705 1,4683 1,4710-1,4725 Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 142 Tabla 18. Índice de acidez (% oleico) de los aceites vegetales comestibles ensayados. Muestra (Código) Tipo de muestra Categoría Índice de acidez (% oleico) (media ± desviación estándar) A Aceite de oliva virgen extra (prensado en frío) Premium 0,164 ± 0,016 B Aceite de oliva virgen extra Premium 0,170 ± 0,009 C Aceite de oliva virgen extra Estándar 0,210 ± 0,009 D Aceite de oliva virgen extra Marca blanca 0,229 ± 0,009 E Aceite de oliva virgen Premium 0,205 ± 0,007 F Aceite de oliva virgen Estándar 0,263 ± 0,013 G Aceite de oliva virgen Marca blanca 0,258 ± 0,009 H Aceite de oliva 1ᵒ Premium 0,136 ± 0,024 I Aceite de oliva 1ᵒ Estándar 0,186 ± 0,000 J Aceite de oliva 1ᵒ Marca blanca 0,318 ± 0,006 K Aceite de oliva 0,4ᵒ Premium 0,147 ± 0,006 L Aceite de oliva 0,4ᵒ Estándar 0,105 ± 0,020 M Aceite de oliva 0,4ᵒ Marca blanca 0,171 ± 0,013 N Aceite de orujo de oliva Premium 0,178 ± 0,007 O Aceite de orujo de oliva Estándar 0,159 ± 0,007 P Aceite de orujo de oliva Marca blanca 0,147 ± 0,007 Q Aceite de girasol Premium 0,043 ± 0,007 R Aceite de girasol Estándar 0,074 ± 0,006 S Aceite de girasol Marca blanca 0,066 ± 0,007 T Aceite de girasol 80% oleico Premium 0,062 ± 0,007 U Aceite de girasol 65% oleico Estándar 0,097 ± 0,007 V Aceite de girasol 26% oleico Marca blanca 0,097 ± 0,007 W Aceite de maíz Premium 0,097 ± 0,006 Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 143 Tabla 19. Índice de peróxidos de los aceites vegetales comestibles ensayados. Muestras (Código) Tipo de muestra Categoría Índice de peróxidos (mEq O activo/kg) (media ± desviación estándar) A Aceite de oliva virgen extra (prensado en frío) Premium 15,2 ± 3,6 B Aceite de oliva virgen extra Premium 21,7 ± 0,6 C Aceite de oliva virgen extra Estándar 22,1 ± 1,1 D Aceite de oliva virgen extra Marca blanca 17,0 ± 2,4 E Aceite de oliva virgen Premium 24,2 ± 3,0 F Aceite de oliva virgen Estándar 19,1 ± 0,6 G Aceite de oliva virgen Marca blanca 17,8 ± 1,2 H Aceite de oliva 1ᵒ Premium 15,7 ± 0,6 I Aceite de oliva 1ᵒ Estándar 12,3 ± 0,6 J Aceite de oliva 1ᵒ Marca blanca 8,6 ± 0,1 K Aceite de oliva 0,4ᵒ Premium 14,9 ± 1,8 L Aceite de oliva 0,4ᵒ Estándar 6,8 ± 1,2 M Aceite de oliva 0,4ᵒ Marca blanca 6,8 ± 1,2 N Aceite de orujo de oliva Premium 3,8 ± 0,6 O Aceite de orujo de oliva Estándar 4,2 ± 1,2 P Aceite de orujo de oliva Marca blanca 3,4 ± 1,2 Q Aceite de girasol Premium 7,2 ± 0,6 R Aceite de girasol Estándar 8,9 ± 0,6 S Aceite de girasol Marca blanca 37,8 ± 0,6 T Aceite de girasol 80% oleico Premium 5,1 ± 1,2 U Aceite de girasol 65% oleico Estándar 11,0 ± 0,0 V Aceite de girasol 26% oleico Marca blanca 23,8 ± 1,2 W Aceite de maíz Premium 6,4 ± 0,6 Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 144 Tabla 20. Índice de refracción a 25 ° C de los aceites vegetales comestibles ensayados. Muestras (Código) Tipo de muestra Categoría Índice de refracción a 25 ° C (media ± desviación estándar) A Aceite de oliva virgen extra (prensado en frío) Premium 1,4666 ± 7,0 · 10-5 B Aceite de oliva virgen extra Premium 1,4669 ± 2,8 · 10-4 C Aceite de oliva virgen extra Estándar 1,4670 ± 2,1 · 10-4 D Aceite de oliva virgen extra Marca blanca 1,4665 ± 4,9 · 10-4 E Aceite de oliva virgen Premium 1,4663 ± 3,5 · 10-4 F Aceite de oliva virgen Estándar 1,4673 ± 2,1 · 10-4 G Aceite de oliva virgen Marca blanca 1,4668 ± 9,9 · 10-4 H Aceite de oliva 1ᵒ Premium 1,4669 ± 0,0000 I Aceite de oliva 1ᵒ Estándar 1,4670 ± 8,5 · 10-4 J Aceite de oliva 1ᵒ Marca blanca 1,4668 ± 6,4 · 10-4 K Aceite de oliva 0,4ᵒ Premium 1,4660 ± 7,1 · 10-5 L Aceite de oliva 0,4ᵒ Estándar 1,4667 ± 9,2 · 10-4 M Aceite de oliva 0,4ᵒ Marca blanca 1,4663 ± 7,1 · 10-5 N Aceite de orujo de oliva Premium 1,4671 ± 7,1 · 10-5 O Aceite de orujo de oliva Estándar 1,4676 ± 7,1 · 10-5 P Aceite de orujo de oliva Marca blanca 1,4675 ± 1,4 · 10-4 Q Aceite de girasol Premium 1,4720 ± 1,3 · 10-4 R Aceite de girasol Estándar 1,4719 ± 1,4 · 10-4 S Aceite de girasol Marca blanca 1,4718 ± 0,0000 T Aceite de girasol 80% oleico Premium 1,4673 ± 7,1 · 10-5 U Aceite de girasol 65% oleico Estándar 1,4680 ± 0,0000 V Aceite de girasol 26% oleico Marca blanca 1,4699 ± 1,4 · 10-4 W Aceite de maíz Premium 1,4712 ± 4,2 · 10-4 Capítulo 4.2 Determinación de grasa trans y parámetros de calidad y autenticidad en aceites vegetales comestibles de oliva, girasol y maíz 145 Tabla 21. Extinciones específicas en el UV de los aceites vegetales comestibles ensayados. Muestra (Código) Tipo de muestra Categoría K232 K270 ΔKa A Aceite de oliva virgen extra (prensado en frío) Premium 1,616 0,170 0,00 B Aceite de oliva virgen extra Premium 1,940 0,354 0,00 C Aceite de oliva virgen extra Estándar 1,824 0,225 0,00 D Aceite de oliva virgen extra Marca blanca 2,121 0,272 0,00 E Aceite de oliva virgen Premium 1,889 0,272 0,00 F Aceite de oliva virgen Estándar 1,998 0,244 0,01 G Aceite de oliva virgen Marca blanca 1,683 0,140 0,00 H Aceite de oliva 1ᵒ Premium 1,956 0,581 0,00 I Aceite de oliva 1ᵒ Estándar 2,096 0,472 0,04 J Aceite de oliva 1ᵒ Marca blanca 1,926 0,305 0,04 K Aceite de oliva 0,4ᵒ Premium 2,185 0,672 0,07 L Aceite de oliva 0,4ᵒ Estándar 2,007 0,572 0,05 M Aceite de oliva 0,4ᵒ Marca blanca 1,925 0,395 0,02 N Aceite de orujo de oliva Premium 3,626 1,576 0,14 O Aceite de orujo de oliva Estándar 3,336 1,252 0,11 P Aceite de orujo de oliva Marca blanca 3,363 1,205 0,10 Q Aceite de girasol Premium 3,275 2,020 0,21 R Aceite de girasol Estándar 3,539 3,479 0,28 S Aceite de girasol Marca blanca 3,437 1,481 0,13 T Aceite de girasol 80% oleico Premium 1,938 0,936 0,13 U Aceite de girasol 65% oleico Estándar 2,669 0,699 0,07 V Aceite de girasol 26% oleico Marca blanca 3,409 1,593 0,14 W Aceite de maíz Premium 2,633 2,672 0,29 a ΔK= K270 – (K266 + K274) / 2.