Inhibición de la vía de señalización Hedgehog con glasdegib en pacientes con enfermedad injerto contra receptor crónica esclerodermiforme: resultados de un ensayo piloto de fase I/II

TESIS DOCTORAL Inhibición de la vía de señalización Hedgehog con glasdegib en pacientes con enfermedad injerto contra receptor crónica esclerodermiforme: resultados de un ensayo piloto de fase I/II REALIZADA POR: Eduardo Rodríguez Arbolí DIRIGIDA POR: José Antonio Pérez Simón D. José Antonio Pérez Simón Doctor en Medicina y Cirugía CERTIFICA: Que la memoria elaborada bajo el título “INHIBICIÓN DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN HEDGEHOG CON GLASDEGIB EN PACIENTES CON ENFERMEDAD INJERTO CONTRA RECEPTOR CRÓNICA ESCLERODERMIFORME: RESULTADOS DE UN ENSAYO PILOTO DE FASE I/II”, presentada por el licenciado en Medicina y Cirugía Eduardo Rodríguez Arbolí ha sido realizada bajo su dirección y reúne a su juicio las condiciones y méritos suficientes para ser leída y defendida como Tesis para optar al grado de Doctor. Y para que así conste, expide la presente certificación: Fdo. José Antonio Pérez Simón Director y tutor de tesis Sevilla, 25 de enero de 2023 A Blanca A mis padres Agradecimientos Al Prof. José Antonio Pérez Simón, por brindarme la oportunidad de involucrarme en este proyecto de forma temprana durante mi etapa de residencia, por su apoyo a mis inquietudes investigadoras, por su incansable entusiasmo por promover la ciencia para el beneficio de nuestros pacientes. A Teresa Caballero y Clara García, por su encomiable trabajo en los estudios biológicos asociados al ensayo clínico, por su disponibilidad, ayuda y paciencia con un lego en el mundo de la citometría de flujo. A Estefanía Menéndez, Reyes Fresneda y Clara Rosso, por su inestimable labor en las tareas de gestión y coordinación del estudio. A Stephanie J. Lee y Catherine J. Lee, por las estimulantes discusiones que han contribuido a enriquecer la presente tesis. A los investigadores y equipos clínicos de los centros participantes del Grupo Español de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, por su valiosa implicación, compromiso y esfuerzo, fundamentales para el desarrollo exitoso de este estudio. A los compañeros de la UGC de Hematología y Hemoterapia del Hospital Universitario Virgen del Rocío, por su excelente labor clínica al servicio de nuestros pacientes, piedra angular de nuestro día a día. A los pacientes y sus familiares, origen y fin de nuestra labor investigadora, por su generosidad y lecciones de vida. Truth is a shining goddess, always veiled, always distant, never wholly approachable, but worthy of all the devotion of which the human spirit is capable (From “University Education”, Fact and Fiction [1961]) Bertrand Russell 1 1 INTRODUCCIÓN 2 3 1.1 Enfermedad injerto contra receptor. Concepto y tipos La enfermedad injerto contra receptor (EICR) constituye una de las principales causas de morbilidad y mortalidad relacionadas con el trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (alo-TPH)(1–4). La eficacia singular del alo-TPH como estrategia potencialmente curativa de diversas neoplasias hematológicas reside en la capacidad de reconocimiento y eliminación de las células cancerosas por los linfocitos alorreactivos del donante(5–7). No obstante, como contrapartida de este efecto injerto contra leucemia, la alorreactividad puede conducir también al reconocimiento y daño inmunomediado de los tejidos sanos del receptor, resultando en el espectro de condiciones clínicas que conocemos como EICR(8,9). Clásicamente, dos variantes de la EICR han sido definidas en base a su cronología, presentación clínica y mecanismos fisiopatológicos. Por un lado, la EICR aguda (EICRa) suele acontecer en la fase precoz post-trasplante (primeros 100 días), afecta de forma generalmente selectiva a los epitelios cutáneos, gastrointestinal y hepático, y resulta en un curso clínico rápidamente progresivo y letal en ausencia de tratamiento(9–11). Por el contrario, la EICR crónica (EICRc) suele debutar de forma más tardía (tras el día +100) con un cuadro clínico pleomórfico y habitualmente multiorgánico de curso más insidioso(12–15). En la actualidad, la identificación de las formas aguda y crónica de la EICR viene determinada por las manifestaciones clínicas y no estrictamente por su desarrollo temporal. Aunque minoritarias, también existen presentaciones clínicas atípicas que escapan de esta dicotomía, como serían los casos de la EICRa persistente o del síndrome de solapamiento(10,16). Esta heterogeneidad clínica refleja en último término diferencias en los sustratos fisiopatológicos de la EICRa y la EICRc, con implicaciones directas sobre el abordaje clínico y terapéutico de los pacientes. 4 1.2 Fisiopatología de la EICRc Conceptualmente, la fisiopatología de la EICRc puede ser dividida en 3 fases: a) fase de daño tisular e inflamación; b) fase de inflamación crónica y desregulación de la inmunidad adaptativa; y c) fase de alteración en los mecanismos de reparación tisular e instauración de la fibrosis(17–19). En las fases tempranas del periodo post-trasplante, el daño tisular secundario a los esquemas de acondicionamiento del alo-TPH, la EICRa y las infecciones inducen la liberación de mediadores inflamatorios como los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) o los patrones moleculares asociados a daño (DAMPs) que ponen en marcha una cascada inflamatoria que estimula la actividad de las células presentadoras de antígenos, así como la diferenciación de los linfocitos T alorreactivos hacia fenotipos Th1/Tc1 y Th17/Tc17 efectores que migran a los tejidos y perpetúan el daño tisular y la inflamación(20–26). La segunda fase en el desarrollo de la EICRc está caracterizada por la desregulación de los mecanismos de tolerancia inmune y de la respuesta adaptativa en un contexto de inflamación crónica. El daño en el epitelio tímico infligido por el acondicionamiento del trasplante y por la citotoxicidad mediada por los linfocitos T alorreactivos presentes en el producto de infusión puede conducir a la pérdida de los mecanismos de tolerancia inmune central(27,28). En concreto, la disfunción de las células epiteliales medulares y dendríticas tímicas resulta en una selección negativa deficiente que permite la salida a los tejidos periféricos de linfocitos T auto/alorreactivos(29). Aunque clásicamente se había implicado a los linfocitos con diferenciación Th2/Tc2 en la fisiopatología de la EICRc, investigaciones más recientes han puesto de manifiesto el papel relevante que desempeñarían otros subtipos de células T, como los Th1/Tc1 y Th17/Tc17(30–32). La tolerancia inmune central deficitaria se acompaña de la alteración en los procesos de 5 tolerancia periférica, siendo un rasgo distintivo de la EICRc el déficit cuantitativo y/o funcional de poblaciones celulares reguladoras que incluyen los linfocitos T reguladores (Treg), las células B reguladoras (Breg) las células NK reguladoras (NKreg), las células NKT invariantes (iNKT), las células T reguladoras de tipo I (Tr1), o las células Tfr(33– 39). Los mecanismos de tolerancia y homeostasis de las células B también aparecen alterados en la EICRc. Varios estudios han reportado la asociación entre la EICRc y la sobreexpresión del factor activador de células B (BAFF)(40,41). En presencia de niveles suficientemente elevados de esta citoquina, crítica en la maduración linfocitaria, las células B reactivas frente a auto/aloantígenos logran evadir la selección negativa que se produciría en condiciones normales en la médula ósea(42,43). Estos linfocitos B reactivos interaccionan en los centros germinales con linfocitos activados Th2 y Th17 (productores de IL-21 e IL-17) que estimulan su maduración y la secreción de auto/aloanticuerpos cuyo depósito periférico contribuirá al daño tisular y a la activación aberrante del sistema monocito-macrófago con un fenotipo pro-fibrótico(28,44). En condiciones fisiológicas, los mecanismos de reparación tisular contribuyen a limitar la respuesta inflamatoria y a restaurar la arquitectura y homeostasis de los tejidos expuestos a un daño. Sin embargo, en el contexto de la EICRc, la desregulación persistente de la respuesta inmune interfiere en los circuitos de autorregulación de la reparación, resultando en la instauración de la fibrosis y la subsiguiente pérdida de la funcionalidad de los tejidos y órganos afectados. Independientemente del estímulo inicial, la cascada de la fibrosis culmina en la activación aberrante de fibroblastos que se diferencian a miofibroblastos productores de matriz extracelular (principalmente colágeno y biglicano)(45,46). En el caso de la EICRc, diferentes poblaciones celulares del sistema inmune innato y adaptativo están involucradas en este proceso. Así, la 6 activación macrofágica desempeña un papel clave en la fibrosis a través de la secreción de TGFβ y PDGFα, potentes inductores de la activación de los fibroblastos. Además de estos mediadores, los macrófagos clásicos (M1) secretan citoquinas pro-inflamatorias como TNFα e IL-1β que inducen la generación de matriz extracelular. La presencia de IL-17 y CSF-1 en los tejidos en los que se va a producir la cascada fibrótica facilitaría la quimiotaxis y el posterior secuestro macrofágico(47). La desregulación de la inmunidad adaptativa también promueve la fibrosis a través de varios mecanismos. Por un lado, la interacción de los auto/aloanticuerpos producidos por poblaciones linfocitarias B aberrantes con los receptores Fcγ expresados por los macrófagos tisulares estimula su activación y la secreción de TGFβ y otros mediadores pro-fibróticos(48). El depósito de estos anticuerpos puede resultar además en un daño directo endotelial y epitelial. Por otro lado, el reclutamiento de linfocitos T CD4+ Th2 y Th17 estimula la fibrosis principalmente a través de la secreción de IL-17 e IL-13, contribuyendo así a la perpetuación del estado inflamatorio crónico que retroalimenta el sistema(49). Figura 1.1. Esquema general de los mediadores moleculares y celulares implicados en la fisiopatología de la EICR. 7 1.3 Epidemiología y presentación clínica de la EICRc 1.3.1 Epidemiología y factores de riesgo de la EICRc La incidencia de EICRc oscila entre el 10% y el 70% en función de la plataforma específica de trasplante empleada, y particularmente, de la estrategia de profilaxis de la EICR, de la fuente de progenitores hematopoyéticos y del tipo de donante seleccionados. Globalmente, entre el 30% y el 50% de los pacientes receptores de un alo-TPH desarrollarán EICRc en los dos primeros años post-trasplante(50,51). Entre los principales factores de riesgo de desarrollo de la EICRc cabe destacar la historia previa de EICRa, el trasplante de donante mujer a receptor varón, la disparidad HLA entre donante y receptor, o el uso de sangre periférica como fuente de progenitores hematopoyéticos(52–55). En las últimas dos décadas, la incidencia de la EICRc y su gravedad han experimentado un aumento significativo atribuible a la expansión del trasplante a poblaciones de pacientes de mayor edad, al uso extendido de los trasplantes de sangre periférica y de los donantes alternativos, y al incremento de la supervivencia (50). Actualmente, la EICRc constituye la principal causa de mortalidad tardía relacionada con el trasplante, presentando también un impacto negativo sobre la morbilidad y la calidad de vida de los pacientes(2,51,56). A este respecto, la persistencia de la EICRc tras tratamiento de primera línea aumenta el riesgo de mortalidad relacionada con el trasplante en 2,5 veces(57). A pesar de que la aparición de EICRc ha sido vinculada en múltiples estudios a un menor riesgo de recaída de la enfermedad hematológica subyacente, el impacto negativo de las formas graves de EICRc sobre la supervivencia contrarrestaría el potencial efecto beneficioso del efecto injerto contra leucemia asociado. Por el contrario, las formas leves de EICRc podrían asociarse a un beneficio neto en términos de supervivencia global(58–60). 8 1.3.2 Presentación clínica de la EICRc Desde un punto de vista clínico, la EICRc constituye un síndrome de características pleomórficas que puede asemejarse a condiciones autoinmunes como la esclerosis sistémica, el síndrome de Sjögren, la bronquiolitis obliterante o la cirrosis biliar primaria. Las manifestaciones clínicas de la EICRc aparecen típicamente durante el primer año post-trasplante, generalmente a partir del día +100, y más infrecuentemente de forma más tardía (<10% de los casos). Además de la afectación de los tejidos epiteliales que son clásicamente diana de la EICRa (piel, hígado y tracto gastrointestinal), la EICRc involucra a un espectro muy amplio de tejidos que puede incluir los ojos, la mucosa oral, los pulmones, las articulaciones y fascias, o los genitales. Aunque ocasionalmente las manifestaciones de la EICRc pueden quedar restringidas a un único órgano, la afectación es con mayor frecuencia multiorgánica(15,61–64). En algunos pacientes, la EICRc se acompaña de otras manifestaciones típicas de la EICRa conformando el llamado síndrome de “overlap”, asociado en algunos estudios a un peor pronóstico(65–67). 1.3.3 La EICRc esclerodermiforme como fenotipo clínico distintivo de la EICRc La EICRc esclerodermiforme (EICRcs) constituye una variante fenotípica de la EICRc caracterizada por la progresiva inflamación y fibrosis de la dermis y de los tejidos subcutáneos(68–70). Habitualmente, la afectación esclerodermiforme se inicia en las capas más superficiales de la piel y posteriormente se extiende en profundidad, aunque también existen formas con afectación profunda exclusiva, en ausencia de alteraciones visibles en la superficie cutánea. En fases avanzadas, la EICRcs resulta en la aparición de contracturas articulares que limitan o impiden la movilidad, la ulceración de la piel y la restricción pulmonar, causando una gran morbilidad a los pacientes afectos. Con frecuencia, la EICRcs es refractaria a las terapias estándar, condicionando el uso prolongado de tratamiento inmunosupresor y un riesgo elevado de complicaciones 9 asociadas al mismo. La EICRcs es una complicación de instauración tardía, con una mediana de tiempo hasta su aparición que supera el año post-trasplante. La prevalencia reportada es variable en diferentes estudios, pero se aproximaría al 20% a los 3 años(68,70). En el análisis publicado por el grupo de Seattle, un 13% de los pacientes con EICRcs presentaron afectación esclerodermiforme en piel, un 33% contracturas articulares o fascitis, y el 53% restante ambas manifestaciones(70). Aunque los factores de riesgo de desarrollo de la EICRcs no están bien definidos, algunos datos sugieren que el empleo de acondicionamientos con irradiación corporal total (ICT) >450 cGy, el trasplante de sangre periférica, la selección de donantes HLA-compatibles y la incompatibilidad ABO podrían asociarse a un mayor riesgo(69,70). La EICRcs no se ha establecido de forma concluyente como factor de riesgo independiente de mortalidad relacionada con el trasplante en pacientes con EICRc, aunque aquellos pacientes con afectación cutánea más extensa podrían presentar una supervivencia disminuida(68,69). Figura 1.2. Espectro de manifestaciones cutáneas de la EICRcs. A-B) Placas de esclerosis localizada tipo morfea. C) Extensa placa esclerótica en torso. D) Fibrosis subcutánea y en fascias asociada a la apariencia ondulada de la piel, con semejanzas a las manifestaciones de la fascitis eosinofílica. E) Signo del monje por contracturas articulares. F) Ulceración cutánea en EICRcs avanzada. Adaptado de Martires K.J. et al. 10 1.4 Abordaje diagnóstico y evaluación de respuestas en EICRc 1.4.1 Introducción La falta de marcadores diagnósticos validados, la dificultad para obtener una confirmación histopatológica sin recurrir a procedimientos invasivos y la presentación clínica con manifestaciones frecuentemente distintivas han contribuido a que históricamente la aproximación diagnóstica y el seguimiento de la EICRc hayan estado basados en la exploración física y en la entrevista no estructurada. Más recientemente, esfuerzos cooperativos liderados por los National Institutes of Health (NIH) han promovido la estandarización de la evaluación diagnóstica y de las respuestas al tratamiento en el paciente con EICRc, resultando en las recomendaciones de consenso de 2005 y 2014(14,15,71–73). Estos criterios de consenso fueron concebidos con el fin de asegurar la inclusión inequívoca de pacientes con EICRc en los estudios clínicos, por lo que algunos pacientes con manifestaciones secundarias a la alorreactividad podrían quedar fuera de la definición de los NIH. A pesar de esta limitación, los criterios de consenso de 2014 han sido ampliamente adoptados en el ámbito académico, la industria farmacéutica y las agencias regulatorias, mientras que su empleo sistemático en la práctica clínica habitual está aún menos extendido(74). 1.4.2 Criterios diagnósticos de la EICRc De acuerdo a los criterios NIH de 2014, el diagnóstico de EICRc exige a) al menos una manifestación diagnóstica o b) 1 manifestación distintiva confirmada por biopsia o por una prueba diagnóstica en el mismo u en otros órganos afectos. Las manifestaciones diagnósticas, suficientes para declarar el diagnóstico de EICRc, quedan restringidas a la piel (constando entre ellas la esclerosis), la boca, el tracto digestivo, el pulmón, las fascias y los genitales. En el caso de que el pulmón sea el único órgano diana de la EICRc, se exige para la inclusión en estudios clínicos la confirmación por biopsia de bronquiolitis. 17 1.5 Estrategias terapéuticas en la EICRc 1.5.1 Tratamiento estándar de la EICRc A pesar de los avances en nuestro conocimiento sobre las bases fisiopatológicas de la EICRc, los esteroides aún se mantienen como la opción terapéutica de primera elección en los pacientes con EICRc moderada o grave que requieran de inicio de tratamiento sistémico. En pacientes respondedores, el tratamiento con esteroides a altas dosis es seguido de una lenta fase de retirada con objeto de evitar el rebrote de la enfermedad, y que puede prolongarse durante muchos meses(79,80). Con frecuencia, los esteroides son combinados con un inhibidor de calcineurina o sirolimus. A este respecto, el estudio randomizado BMT CTN 0801 evaluó el tratamiento con prednisona/sirolimus con o sin un inhibidor de calcineurina asociado, no demostrándose un beneficio con la triple combinación(81). De forma similar, múltiples estudios han testado sin éxito la incorporación al tratamiento de primera línea de fármacos adicionales (azatioprina, talidomida, micofenolato mofetil, hidroxicloroquina) que pudiesen potenciar la actividad de los esteroides y minimizar las toxicidades relacionadas con el uso prolongado de los mismos(82–85). Más de la mitad de los pacientes con EICRc precisarán de tratamiento de segunda línea en los dos primeros años tras el inicio del tratamiento con esteroides, ya sea por refractariedad, progresión o dependencia esteroidea de la enfermedad. Con anterioridad a la incorporación de los nuevos fármacos (detallados en la siguiente sección), no existía un consenso establecido sobre el abordaje farmacológico óptimo de la EICRc tras el fracaso del tratamiento esteroideo, aunque múltiples estudios han reportado tasas de respuesta que oscilan entre el 20% y el 70% con diferentes aproximaciones(86). La mayor parte de estos estudios han consistido en pequeños ensayos no controlados en los que el análisis de las respuestas no fue estandarizado, dificultando las comparaciones del perfil 18 de eficacia y tolerabilidad de diferentes fármacos. No obstante, los resultados de eficacia del brazo control del ensayo REACH3 sugieren que las tasas de respuesta de los fármacos y estrategias terapéuticas más frecuentemente empleados en segunda línea no superarían el 30% una vez son aplicados los criterios de respuesta de los NIH de 2014, siendo parciales la gran mayoría de respuestas (Tabla 1.4)(87). Tabla 1.4. Tasas de respuesta de la EICRc en el brazo control del ensayo REACH3. RP, respuesta parcial; RC, respuesta completa; RG, respuesta global. Tipo de respuesta, n (%) Terapia RP RC RG Fotoféresis extracorpórea 15/55 (27) 1/55 (2) 16/55 (29) Imatinib 2/8 (25) 0 2/8 (25) Rituximab 1/6 (17) 0 1/6 (17) Ibrutinib 2/27 (7%) 4/27 (15) 6/27 (22) Infliximab 1 (20) 0 1/5 (20) Sirolimus 2/7 (29) 0 2/7 (29) Everolimus 1/5 (20) 0 1/5 (20) Micofenolato mofetil 9/35 (26) 1/35 (3) 10/35 (29) Metotrexato a dosis bajas 3/10 (30) 0 3/10 (30) 1.5.2 Terapias dirigidas emergentes en la EICRc En los últimos años, 3 terapias dirigidas han ampliado nuestro armamentario para el tratamiento de los pacientes con EICRc corticorrefractaria (CTR) o corticodependiente (CTD). A diferencia de los estudios reportados con anterioridad, los ensayos que han conducido a la aprobación de estos fármacos han adoptado las recomendaciones estandarizadas de evaluación de respuesta de los NIH, permitiendo un análisis más homogéneo de los datos reportados. El primero de estos nuevos fármacos en recibir la aprobación por la FDA en 2017 fue ibrutinib, un inhibidor oral de la tirosina quinasa de Bruton (BTK), en base a los resultados del estudio PYC-1129 (NCT02195869)(88). PYC-1129 fue un ensayo fase II no controlado que evaluó el uso de ibrutinib en 42 pacientes con EICRc CTR o CTD tras 19 ≤3 líneas de tratamiento. Como singularidad relevante en el diseño de este estudio, es de destacar la inclusión restringida a pacientes que al menos presentasen una afectación cutánea con rash eritematoso >25% de la superficie corporal, o bien una puntuación en mucosa oral según criterios NIH >4. Ambas manifestaciones fueron seleccionadas por ser susceptibles de responder rápidamente al tratamiento. Ibrutinib resultó en una tasa global de respuesta (TGR) del 67% (RC en 21%), con tasas de respuesta muy elevadas en piel (88%) y mucosa oral (99%). Esto contrasta, sin embargo, con la TGR de tan sólo el 22% observada con ibrutinib en el brazo control del ensayo REACH3 (n=27 pacientes), y pone de manifiesto la limitada reproducibilidad de los estudios en EICRc incluso cuando se emplean criterios estandarizados de respuesta(87). El tratamiento se asoció a una mejoría ≥7 puntos en la Lee Symptoms Scale (LSS) en un 24% de los pacientes. La mayoría (79%) de respuestas fueron alcanzadas en la primera evaluación, y un 71% de los pacientes respondedores mantuvieron la respuesta ≥20 semanas. La mayor parte de eventos adversos fueron de G1-2, siendo los más frecuentes la astenia (57%), la diarrea (37%) y los espasmos musculares (28%). Un tercio de los pacientes discontinuó el tratamiento a causa de los mismos, siendo esta una proporción superior a la reportada con el uso de ibrutinib en neoplasias hematológicas de células B(89). En estudios correlativos, los análisis de biomarcadores revelaron una reducción significativa en plasma de factores relacionados con la inflamación y la activación linfocitaria (incluyendo TNF-α y CD25 soluble), así como de factores relacionados con la fibrosis (EGF y GM-CSF). Más recientemente, belumosudil, un inhibidor oral de ROCK2, obtuvo también la aprobación en pacientes con EICRc activa tras al menos dos líneas previas de tratamiento. Belumosudil fue evaluado inicialmente en un estudio de fase IIa de búsqueda de dosis (KDO25-208) que arrojó una TGR del 65%(90). Posteriormente, estos resultados fueron confirmados en el estudio ROCKstar, un ensayo de fase II que randomizó 132 pacientes 20 con EICRc activa tras 2-5 líneas de tratamiento a dos esquemas de belumosudil (QD o BID)(91). La TGR fue similar en ambas ramas de tratamiento (74% y 77%; RC en 5%). Las respuestas fueron alcanzadas precozmente, con una mediana de tiempo hasta respuesta de tan solo 5 semanas. La mediana de duración de respuestas fue de 54 semanas, permaneciendo un 44% de los pacientes en tratamiento al año. Los eventos adversos más frecuentes fueron la astenia (38%), la diarrea (33%) y las náuseas (31%), motivando la discontinuación del tratamiento en un 12% de los pacientes. Los análisis farmacodinámicos exploratorios que fueron reportados en el estudio de fase IIa sugieren que el tratamiento con belumosudil podría asociarse a un incremento en la población circulante de linfocitos Treg, así como a un descenso paralelo en la subpoblación linfocitaria Th17. Por último, ruxolitinib, un inhibidor oral de JAK1-JAK2, ha demostrado su superioridad frente al tratamiento estándar de segunda línea en el ensayo de fase III REACH3(87). Este estudio incluyó 329 pacientes con EICRc CTR o CTD activa tras tratamiento con esteroides (con o sin inhibidor de calcineurina asociado). Los pacientes fueron randomizados al tratamiento con ruxolitinib o a una de entre diez opciones de tratamiento de uso estándar, a elección de los investigadores. La TGR en la semana 24, variable primaria del estudio, fue significativamente superior en el brazo de ruxolitinib (50% vs. 26%, p<0.001). La tasa de mejor respuesta durante el seguimiento también favoreció al brazo de ruxolitinib (76% vs. 60%, p=0,001), así como la tasa de respuesta en la LSS modificada (24% vs. 11%, p<0.001). De forma similar a lo observado en los estudios REACH1 y REACH2 en EICRa, la anemia (29%), trombocitopenia (21%) y la neutropenia (11%) fueron los principales eventos adversos reportados(92,93). 21 1.5.3 Resultados clínicos en EICRcs Los datos clínicos de eficacia disponibles en EICRcs en la era previa a la llegada de los nuevos fármacos son muy limitados. Cabe destacar los resultados discordantes reportados con el uso de imatinib en diferentes estudios, con tasas de respuesta que oscilan entre el 17% y el 79%(94–96). De forma similar, las tasas de respuesta reportadas con el uso de rituximab han sido muy variables (13-100%)(96–99). Diferencias en los criterios de respuesta empleados podrían explicar parcialmente esta heterogeneidad, siendo aquellos estudios con criterios más estandarizados los que con mayor frecuencia reportaron tasas de respuesta más bajas. Dado que la vía de ROCK2 ha sido implicada en la instauración de la fibrosis, podría ser esperable que el tratamiento con belumosudil demostrase eficacia en la EICRcs(100,101). Entre los 41 pacientes que alcanzaron respuestas cutáneas en el ensayo ROCKstar, 24 presentaron mejoría en las manifestaciones escleróticas. En este sentido, la elevada tasa de respuestas en articulaciones/fascia (71%) también sugiere que el tratamiento con belumosudil es activo en la EICRcs(91). En el caso de los ensayos PYC-1129 y REACH3, no disponemos de datos de respuesta específicos en la EICRcs. Aunque el tratamiento con ibrutinib se asoció a una tasa de respuesta en piel del 88%, el estudio no reportó la prevalencia de la afectación esclerodermiforme, y la inclusión preferente de pacientes con rash cutáneo sugiere que la afectación cutánea liquenoide podría estar más representada que la esclerodermiforme(88). En el ensayo REACH3, las tasas de respuesta en piel y articulaciones/fascia en el brazo de ruxolitinib fueron del 41% y 38%, respectivamente, en contraste con tasas de apenas el 16% en el brazo control(87). Más recientemente, un estudio de fase II (NCT05095649) liderado por nuestro grupo ha evaluado la combinación de ruxolitinib y linfocitos T reguladores, reportando una tasa de respuesta de la EICRcs cutánea del 56% (datos no publicados). 22 En lo que se refiere a las intervenciones no farmacológicas, el uso de la fotoféresis extracorpórea se ha asociado históricamente a elevadas tasas de respuesta en EICRc cutánea, también en pacientes con afectación esclerodermiforme. En un estudio retrospectivo que incluyó 71 pacientes con EICRc grave, la tasa de respuesta cutánea tras fotoféresis extracorpórea fue del 59%, siendo reportadas un 42% de las respuestas en pacientes con EICRcs(102). Sin embargo, un ensayo randomizado posterior que implementó una evaluación ciega y estandarizada de la EICRc cutánea no detectó diferencias significativas entre la fotoféresis extracorpórea y el tratamiento estándar (mediana de mejoría de la puntuación cutánea del 15% vs. 9%, respectivamente). Por el contrario, la evaluación no ciega resultó en una tasa de respuesta cutánea del 40% en el brazo experimental frente al 10% en el brazo control(103). 1.6 La vía de señalización Hedgehog y sus implicaciones en la EICRcs La vía de señalización Hedgehog constituye uno de los circuitos regulatorios fundamentales en la biología del desarrollo, desempeñando un papel esencial en el desarrollo embrionario(104–106). Inicialmente descrita en estudios genéticos en Drosophila melanogaster, la vía recibe su nombre por el fenotipo observado en los embriones con alelos nulos hh, caracterizados por la aparición de dentículos en el dorso que recordarían a las púas de un erizo. En mamíferos, 3 proteínas diferentes y evolutivamente conservadas (sonic hedgehog [SHH], indian hedgehog [IHH] y desert hedgehog [DHH]) han sido identificadas como ligandos activadores de la vía. Estos ligandos actúan en condiciones fisiológicas como morfógenos que regulan la organogénesis a través de la inducción de respuestas diferenciales en las células diana de acuerdo a un gradiente de concentración. Dadas sus funciones críticas en la regulación de la diferenciación y proliferación tisular, la vía de señalización Hedgehog está estrechamente regulada, y generalmente silenciada, en los tejidos adultos, conservando 23 funciones muy restringidas en el mantenimiento de la homeostasis y reparación celular. A este respecto, un número creciente de estudios han puesto de manifiesto el papel de la desregulación de esta vía en la oncogénesis de diversos tipos de tumores, impulsando el desarrollo de estrategias farmacológicas dirigidas a modular su actividad(106,107). 1.6.1 Vía canónica de señalización Hedgehog La cascada canónica de señalización de la vía de Hedgehog se inicia mediante la interacción entre los ligandos hedgehog y el receptor transmembrana PTCH1(104,106). La unión entre los ligandos hedgehog y PTCH1 es a su vez modulada por la expresión de los correceptores Cdo, Boc y Gas1, que promueven una unión de alta afinidad entre ambas proteínas(108,109). En condiciones basales, PTCH1 reprime la activación de la vía a través de su efecto inhibitorio sobre SMO, una proteína efectora que desempeña un papel central en la vía. La unión de los ligandos hedgehog a PTCH1 permite que SMO acceda al cilio primario, donde mediará la activación de la familia de factores de transcripción GLI1-3 (oncogenes relacionados con el glioma)(110,111). Las proteínas GLI2 y GLI3 presentan una actividad bifuncional y pueden ejercer como activadores o represores transcripcionales. La señalización a través de la vía de hedgehog altera el balance entre las formas activadoras y represoras de estas proteínas mediante la regulación de su procesamiento proteolítico post-transduccional. En ausencia de activación de la vía, GLI2 y GLI3 sufren modificaciones por fosforilación y por escisión de sus dominios transactivadores mediadas en parte por la actividad de la proteína kinasa A (PKA)(112). Por el contrario, GLI1 carece de dominio represor de la transcripción y desempeñaría un papel menor en la amplificación de la respuesta transcripcional(113). GLI1 es también diana de la vía, por lo que sus niveles de expresión pueden ser útiles como medida del grado de activación de la misma. La regulación de las proteínas GLI también es producto de su secuestro en el citoplasma por un complejo multiproteico que contiene la proteína 24 supresora de homólogo fusionado (SUFU)(114). La activación de SMO promueve la acumulación de las formas activas de los factores GLI y la disociación del complejo GLISUFU, facilitando su migración al núcleo, donde en último término activan un programa transcripcional pleiotrópico que regula funciones relacionadas con el desarrollo de la embriogénesis, la regulación de la proliferación celular o el mantenimiento homeostático y la reparación de los tejidos adultos. Múltiples factores modulan la respuesta celular a la activación de la vía de hedgehog, entre los cuales figuran la concentración de los ligandos, la duración de la señal, o la competencia espacial y temporal de la célula receptora (mediada a su vez por los patrones de co-expresión de factores adicionales, que pueden promover o inhibir la activación de la vía)(105). Figura 1.3. Vía canónica de señalización Hedgehog. Adaptado de Crompton T. et al. 1.6.2 Vías no canónicas de señalización Hedgehog Los ligandos hedgehog también pueden inducir respuestas celulares que no están mediadas por la actividad transcripcional de los factores GLI. Se han definido al menos 25 dos tipos de señalización no canónica: tipo I, mediada por funciones de PTCH1 no relacionadas con su actividad inhibitoria sobre SMO; y tipo II, mediada por funciones de SMO que no son dependientes de la activación transcripcional de los factores GLI(115– 118). Entre las funciones tipo I de PTCH1 cabría destacar su implicación en la regulación de la apoptosis, actuando en determinadas circunstancias como un gen supresor tumoral, y en la regulación del ciclo celular a través de la inhibición de la actividad de la ciclina B1. En cuanto a las funciones tipo II, se ha descrito el papel de SMO en la activación de pequeñas GTPasas Rho que regularían la migración de los fibroblastos o la producción de fibras de estrés en las células endoteliales. Si bien muchas de estas funciones están aún por caracterizar, los datos disponibles sugieren que el abanico de respuestas celulares desencadenado por los ligandos hedgehog sería mecanísticamente más diverso de lo previamente estimado. 1.6.3 Papel de la vía de señalización Hedgehog en la regulación inmune Más allá de sus funciones establecidas en el desarrollo embrionario o en la homeostasis de las células progenitoras en tejidos adultos, datos recientes sugieren que la vía de hedgehog también estaría implicada en la regulación de la inmunidad adaptativa a diferentes niveles(119,120). En particular, la secreción de SHH por el epitelio tímico controlaría aspectos relativos a la producción y selección de células T maduras en el timo. Así, los ligandos SHH serían necesarios para la proliferación y supervivencia de los linfocitos T dobles negativos (DN), y para la correcta diferenciación de los linfocitos T DN1 (CD44+CD25−) a DN2 (CD44+CD25+)(121–123). La señalización mediada por SHH también estaría implicada en la selección del repertorio TCR. La sobreactivación de la vía en los timocitos reduciría la intensidad de la señal TCR, interfiriendo así con la selección positiva mediada por el TCR, alterando la ratio CD4:CD8 y permitiendo el 26 escape de células autorreactivas de los procesos de deleción clonal(124). A este respecto, se ha postulado que alteraciones genéticas o adquiridas que afecten a la vía de hedgehog podrían tener un impacto sobre la susceptibilidad a determinadas enfermedades autoinmunes(125,126). En contraste con su papel en el timo, las funciones y relevancia de la vía de hedgehog en la activación de las células T son más controvertidas. No obstante, también hay datos que apuntan a su implicación directa. Por ejemplo, la señalización autocrina por IHH en linfocitos T CD8 maduros estaría involucrada en la formación de la sinapsis inmune a través de la remodelación de actina necesaria para la polarización del centrosoma y la liberación de los gránulos citotóxicos(127). En los linfocitos T periféricos CD4, SHH modularía la activación linfocitaria y la producción de citoquinas(128). Por último, es concebible que la expresión conocida de ligandos hedgehog en la piel, el tubo digestivo o los pulmones durante los procesos de remodelado tras infecciones u otros contextos de daño tisular pudiese tener un impacto sobre procesos dependientes de la señalización por el TCR, como la diferenciación de los linfocitos Th1/2 1, o la inducción de la anergia linfocitaria(119). 1.6.4 Implicación de la vía de señalización Hedgehog en la EICRcs Las manifestaciones clínicas de la EICRcs, aunque singulares en el contexto del alo-TPH, remedan el fenotipo clínico de otras condiciones de naturaleza autoinmune como la esclerosis sistémica, caracterizadas también por la fibrosis tisular. La esclerosis sistémica constituye una rara entidad reumatológica en la que la producción excesiva y consiguiente acumulación de colágeno resulta en la fibrosis de la piel y de órganos viscerales como los pulmones, el tracto digestivo o el corazón. Aunque la fisiopatología de la esclerosis sistémica está aún lejos de haber sido dilucidada, Horn et al. identificaron en un estudio seminal en 2012 el papel central que desempeñaría la activación de la vía de señalización 33 Otro estudio de fase I posterior en 47 pacientes con neoplasias mieloides en situación de recaída o refractariedad tras tratamiento estándar (NCT00953758) arrojó resultados similares(141). En este estudio, la DMT quedó establecida en 400 mg diarios tras la discontinuación del reclutamiento en la cohorte de tratamiento a 600 mg por prolongación G3 del intervalo QTc en 4 de 5 pacientes evaluables para TLD. De nuevo, la disgeusia (28%), la alopecia (15%), la diarrea (13%) y los calambres musculares (9%) fueron algunos de los eventos adversos relacionados con el tratamiento más frecuentemente reportados. Más recientemente, glasdegib obtuvo la aprobación regulatoria para su uso en combinación con citarabina a bajas dosis en pacientes con leucemia mieloblástica aguda de nuevo diagnóstico no candidatos a quimioterapia intensiva en base a los resultados del ensayo randomizado fase II BRIGHT AML 1003 (NCT01546038)(142). En este estudio, la dosis seleccionada de glasdegib fue de 100 mg QD (n = 84 pacientes). A este nivel de dosis, la inhibición en la expresión de GLI1 superaría el 90%, lo que permitiría alcanzar una actividad biológica óptima con un mejor perfil de tolerabilidad. La concentración estacionaria plasmática fue alcanzada a los 8 días de tratamiento, y la t1/2 media fue de 17,4 horas. En este estudio, la incidencia de calambres musculares en el brazo de tratamiento de glasdegib fue del 23% (vs. 5% en el brazo control) y la de disgeusia del 25% (vs. 2% en el brazo control). La incidencia de diarrea fue similar en ambos brazos (27% vs. 22%). La incidencia de prolongaciones del intervalo QTc fue superior en el brazo experimental para eventos de cualquier grado (8% vs. 2%) o ≥G3 (4% vs. 2%). En su conjunto, estos resultados apoyan el empleo de glasdegib para la evaluación del impacto de la inhibición de la vía de Hedgehog en pacientes con EICRcs. 34 35 2 HIPÓTESIS 36 37 La activación aberrante de la vía de señalización Hedgehog en los fibroblastos ha sido implicada en la instauración y mantenimiento de las manifestaciones fibróticas características de la EICRcs. Asimismo, la inhibición farmacológica de la vía se ha asociado a la regresión de la esclerodermia en modelos preclínicos. Con estos antecedentes, planteamos el uso de glasdegib, un inhibidor selectivo de SMO, como una nueva estrategia terapéutica potencialmente segura y eficaz en pacientes con EICRcs sin respuesta al tratamiento estándar. Esta hipótesis es evaluada en la presente tesis doctoral en el escenario de un ensayo clínico académico de fase Ib/IIa promovido por el Grupo Español de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular (GETH). Aunque la inhibición de la vía de Hedgehog parece tener un impacto directo sobre la esclerodermia mediado por la reducción en la producción de colágeno por los miofibroblastos, estudios recientes han puesto de manifiesto la implicación de esta vía de señalización en diversos procesos de regulación inmune relevantes en la fisiopatología de la EICRcs. En este contexto, nuestro estudio también evalúa la hipótesis de que la actividad clínica de glasdegib en la EICRcs podría estar parcialmente mediada por mecanismos inmunes indirectos que impliquen la modulación de la alorreactividad. 38 39 3 OBJETIVOS 40 41 1. Identificar la dosis óptima de tratamiento con glasdegib en pacientes con EICRcs activa tras tratamiento estándar. a. Identificar la dosis máxima tolerada. 2. Evaluar el perfil de seguridad y tolerabilidad de glasdegib en pacientes con EICRcs activa tras tratamiento estándar. a. Identificar las toxicidades limitantes de dosis. b. Analizar el perfil de eventos adversos asociados a glasdegib y su impacto sobre la tolerabilidad, la adherencia al tratamiento y la calidad de vida de los pacientes. 3. Evaluar la eficacia clínica de glasdegib en pacientes con EICRcs activa tras tratamiento estándar. a. Evaluar las tasas de respuesta global y por órganos. b. Evaluar la tasa de respuesta modificada de la EICRcs cutánea y/o articular. c. Evaluar la duración de las respuestas clínicas. d. Evaluar la posibilidad de reducción de dosis y/o retirada del tratamiento inmunosupresor concomitante. 4. Evaluar el impacto de glasdegib sobre la distribución y funcionalidad de las principales subpoblaciones inmunes implicadas en la fisiopatología de la EICRcs. 42 49 - Mielosupresión que se prolongue más de 42 días desde su inicio, definida como recuento de neutrófilos <500 µL o recuento de plaquetas <10 x 109/L con una médula ósea normal. - Imposibilidad para administrar al menos el 80% de la dosis prevista de glasdegib debido a toxicidades no hematológicas. - Retraso >28 días en el inicio de un ciclo de tratamiento debido a la persistencia de toxicidades no hematológicas. Dosis máxima tolerada (DMT) Teóricamente, la DMT de glasdegib debería quedar asociada a una incidencia de TLD en <33% de los pacientes. En la práctica, la DMT estimada sería el nivel de dosis en el cual 0/6 o 1/6 pacientes evaluables experimentasen una TLD (durante el periodo de observación), teniendo el siguiente nivel de dosis al menos 2/3 o 2/6 pacientes que hubiesen experimentado una TLD. Si no se alcanzase la DMT en la fase de escalada preestablecida, la dosis máxima testada quedaría definida como la dosis máxima administrada (DMA). 4.1.4 Periodo de reducción de dosis Tal y como se ha mencionado previamente, aquellos pacientes que obtuviesen un beneficio clínico objetivo bajo tratamiento con glasdegib (definido como al menos una respuesta parcial en uno o más órganos diana) podrían optar a una fase de retirada lenta del tratamiento durante un periodo adicional de 6 meses después del fin del ciclo 24. El esquema de retirada de dosis fue el siguiente: - Ciclo 25: Glasdegib 50 mg QD x 5 días/semana y 25 mg QD x 2 días/semana. - Ciclo 26: Glasdegib 50 mg QD x 3 días/semana y 25 mg QD x 4 días/semana. - Ciclo 27: Glasdegib 50 mg QD x 1 día/semana y 25 mg QD x 6 días/semana. 50 - Ciclo 28: Glasdegib 25 mg QD x 6 días/semana. - Ciclo 29: Glasdegib 25 mg QD x 4 días/semana (lunes, miércoles, viernes y domingo). - Ciclo 30: Glasdegib 25 mg QD x 2 días/semana (martes y viernes). Aquellos pacientes que obtuviesen una respuesta clínica tras una reducción de la dosis de glasdegib a 25 mg diarios debido a eventos adversos iniciarían la fase de retirada de acuerdo a la siguiente pauta alternativa: - Ciclo 25: Glasdegib 25 mg QD x 6 días/semana. - Ciclo 26: Glasdegib 25 mg QD x 6 días/semana. - Ciclo 27: Glasdegib 25 mg QD x 4 días/semana (lunes, miércoles, viernes y domingo). - Ciclo 28: Glasdegib 25 mg QD x 4 días/semana (lunes, miércoles, viernes y domingo). - Ciclo 29: Glasdegib 25 mg QD x 2 días/semana (martes y viernes). - Ciclo 30: Glasdegib 25 mg QD x 2 días/semana (martes y viernes). 4.1.5 Reducción de dosis y/o retirada del tratamiento inmunosupresor concomitante En el supuesto de que la respuesta clínica al tratamiento con glasdegib se mantuviese tras el segundo ciclo de tratamiento, la reducción de dosis de esteroides y/o fármacos inmunosupresores concomitantes podría ser iniciada según la tolerabilidad individual de cada paciente, pudiendo resultar eventualmente en la retirada completa si la respuesta clínica fuese favorable. 4.1.6 Comité externo de monitorización de datos Un comité independiente de monitorización de datos compuesto por 3 hematólogos clínicos con extensa experiencia investigadora relevante para los objetivos del estudio fue establecido para evaluar los datos emergentes de seguridad antes de cada escalada de dosis. De esta forma, un informe detallado con los datos de seguridad fue proporcionado 51 al comité en cada ocasión que el criterio de escalada de dosis fue alcanzado. La aprobación unánime por parte de los miembros del comité fue requisito imprescindible antes de proceder al reclutamiento de cada nueva cohorte de pacientes. Miembros del comité de monitorización de datos: Dr. Enrich Carreras i Pons Servicio de Hematología. Hospital Clínic. Barcelona. Dra. Anna Sureda Balari Servicio de Hematología. Instituto Catalá d'Oncologia. Dra. Rocío Parody Porras Servicio de Hematología. Institut Català d'Oncologia. 4.1.7 Formulación y administración de glasdegib Glasdegib está formulado en comprimidos de 25 y 100 mg, siendo administrado una vez al día por vía oral con o sin comida, acompañado por abundante agua. No estuvo indicado el ajuste de dosis según peso. Los pacientes mantuvieron un diario en el que quedó recogida la toma (o pérdida) de cada dosis del fármaco. Glasdegib se administró en ciclos continuos de 28 días. Las dosis perdidas de glasdegib por toxicidades relacionadas con el tratamiento no fueron recuperadas (no se prolongaron los ciclos más allá del día 28). La dosis de glasdegib pudo ser reducida o suspendida en cualquier momento. A partir de C2D1, se permitió a discreción del investigador la evaluación de regímenes alternativos de dosificación (por ej. a semanas alternas) para la optimización de la tolerabilidad del tratamiento durante la fase de expansión de dosis. Los ciclos pudieron extenderse hasta un máximo de 56 días por toxicidades no hematológicas que no se fuesen atribuibles a glasdegib, o hasta 70 días por toxicidades 52 hematológicas. La interrupción del tratamiento >28 días por toxicidades no hematológicas relacionadas con glasdegib, o >42 días por toxicidad hematológica, resultarían en la discontinuación permanente del tratamiento (con la excepción de aquellos pacientes que estuviesen obteniendo un beneficio clínico a criterio del investigador). 4.1.8 Interacciones farmacológicas y restricciones en el tratamiento concomitante Inhibidores de CYP3A4/5 Considerando que la inhibición de las isoenzimas CYP3A4/5 podría resultar en un incremento en la exposición a glasdegib, y que la magnitud de esta interacción en humanos era desconocida, el uso de inhibidores moderados o fuertes de CYP3A4/5 no fue permitido en los estudios iniciales con glasdegib. Estudios posteriores en voluntarios sanos han determinado la magnitud de esta interacción empleando ketoconazol como inhibidor fuerte de CYP3A4/5 (comunicación personal de Pfizer, datos no publicados). En base a estos resultados y a los de otros análisis de modelaje in silico, el uso de inhibidores moderados o fuertes ha sido permitido en estudios posteriores con glasdegib, incluyendo el presente ensayo clínico(142). No obstante, cabe destacar que la combinación de claritromicina o eritromicina con azoles podría resultar en un aumento en la exposición a glasdegib mayor del deseable, por lo que el uso simultáneo de estos fármacos quedó desaconsejado. En la medida de lo posible, se recomendó seleccionar medicación concomitante sin o con mínimo potencial de inhibición de CYP3A4/5 durante el desarrollo del estudio. Inductores de CYP3A4/5 Los fármacos inductores de CYP3A4/5 pueden potenciar el metabolismo de glasdegib, resultando en concentraciones plasmáticas reducidas. El impacto de los inductores de CYP3A4/5 en la farmacocinética de glasdegib no ha sido evaluado en ensayos clínicos. 53 Por tanto, la coadministración de glasdegib en combinación con fármacos inductores moderados o fuertes de CYP3A4/5 no fue permitido desde la entrada del paciente en el estudio hasta la discontinuación del tratamiento del ensayo. Ciclosporina A, tacrolimus y corticoesteroides La ciclosporina A y el tacrolimus son inhibidores moderados de CYP3A4, por lo que podrían incrementar la exposición a glasdegib, aunque no al nivel de los azoles. El uso de estos fármacos fue por tanto permitido en el estudio. Por otro lado, los corticoesteroides (metilprednisolona, prednisona y dexametasona) son inductores débiles de CYP3A4, por lo que podrían reducir ligeramente la exposición a glasdegib. Su uso fue también permitido en el ensayo. Fármacos con riesgo conocido de torsade de pointes Glasdegib ha demostrado potencial de prolongación del intervalo QTc en estudios preclínicos. En el primer estudio clínico en humanos como agente único, se observaron prolongaciones de QTcF a las dosis más elevadas empleadas (400 mg y 600 mg). Aunque la dosis de glasdegib evaluada en este estudio es inferior, el uso concomitante de fármacos con riesgo conocido de torsade de pointes fue desaconsejado. En el supuesto de que el uso de estos fármacos no pudiese ser evitado, se recomendó la intensificación de la monitorización electrocardiográfica de los pacientes durante el transcurso del estudio. 4.2 Población de estudio y selección de pacientes Los siguientes criterios de inclusión y exclusión determinaron la elegibilidad de los pacientes para su entrada en el estudio. Los pacientes candidatos debieron cumplir todos los criterios de inclusión y ninguno de exclusión. 54 4.2.1 Criterios de inclusión a) Paciente adulto (≥18 años) receptor de un alo-TPH con EICRcs sin respuesta, en RP o en recaída tras al menos dos líneas de tratamiento previas que incluyesen corticoesteroides y una de las siguientes segundas líneas de tratamiento, de acuerdo a las recomendaciones de Dignan et. al(144): - Fotoféresis extracorpórea (opción preferente). - Un inhibidor de calcineurina. - Un inhibitor de mTOR - Pentostatina - Rituximab - Imatinib - Ruxolitinib b) Estado funcional según escala ECOG de 0 a 2. c) Función orgánica adecuada, definida como: - AST y ALT ≤ 3 x límite superior de la normalidad (LSN). - Bilurrubina sérica total ≤2 x LSN (excepto en pacientes con síndrome de Gilbert). - Creatinina sérica ≤1.5 x LSN o aclaramiento de creatinina estimado ≥60 mL/min (calculado con el método estándar de cada centro). d) Neoplasia hematólogica de base en situación de remisión completa. 55 e) Efectos adversos agudos relacionados con terapias previas resueltos hasta G ≤1 según CTCAE 4.0, excepto aquellos eventos que no constituyan un riesgo de seguridad a juicio del investigador responsable. f) Test de embarazo en suero u orina (en mujeres en edad fértil) negativo en el screening e inmediatamente antes del inicio del tratamiento (C1D1). Hombres y mujeres potencialmente fértiles deben estar de acuerdo en el uso de métodos contraceptivos durante el estudio y al menos 180 días desde la última dosis de tratamiento. g) Firma de consentimiento informado indicando que el paciente (o su representante legal) ha sido informado de todos los aspectos pertinentes relativos al estudio. 4.2.2 Criterios de exclusión a) Pacientes con cáncer activo, con las excepciones de carcinoma basocelular, cáncer de piel no-melanoma, o carcinoma cervical in situ. Otros tipos o antecedentes de cáncer serán considerados individualmente. b) Cualquiera de los siguientes, en el momento de inclusión en el estudio o en los 6 meses previos: infarto de miocardio, síndrome de QT largo congénito, torsade de pointes o arritmia ventricular clínicamente significativa. c) Intervalo QTc >470 milisegundos empleando la fórmula de Fridericia (QTcF). d) Pacientes con una infección activa sistémica, que implique un riesgo vital o que sea clínicamente significativa. e) Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o infección activa por virus de la hepatitis B o C. f) Síndrome de malabsorción u otra condición médica que pueda interferir con la absorción de la medicación del estudio. 56 g) Cirugía mayor o radioterapia en las 4 semanas previas al inicio de tratamiento. h) Tratamiento previo con: - Un inhibidor de la vía de señalización Hedgehog. - Un fármaco en investigación para el tratamiento de EICRc (será necesario un periodo de lavado de 3 meses). i) Tratamiento simultáneo con cualquier otro fármaco en investigación. j) Tratamiento simultáneo con productos de herboristería. k) Tratamiento en el momento de entrada en el estudio con fármacos que sean inductores potentes conocidos de CYP3A4/5. l) Mujeres embarazadas o lactantes. 4.3 Visitas y procedimientos reglados del estudio El seguimiento de los pacientes durante el ensayo clínico incluyó controles clínicos, analíticos y electrocardiográficos periódicos que fueron más frecuentes al inicio del estudio y que posteriormente fueron espaciándose. Las visitas y procedimientos programados durante el periodo de 12 meses reportado en el presente estudio quedan recogidos en la Tabla 4.2. 57 Tabla 4.2. Visitas y procedimientos reglados programados durante el estudio. Screening Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Actividad en protocolo En los 28 días previos a C1D1 Día 1 Día 2 Día 3 Día 10 Día 21 (±2 días) Día 1 (±2 días) Día 8 (±2 días) Día 15 (±2 días) Día 22 (±2 días) Día 1 (±2 días) Día 8 (±2 días) Día 15 (±2 días) Día 22 (±2 días) Documentación basal Consentimiento informado X Historia clínica X ECOG X X X X Evaluaciones/Análisis Signos vitales X X X X X X X X X X X X Examen físico X X X X X X X X X X X X Hemograma X X X X X X X X Perfil bioquímico X X X X X X X X Análisis de orina X X X X Estudio de coagulación X X X X Test de embarazo X X X X ECG 12 derivaciones ECG Pre-dosis X X X X X ECG 1 hora post-dosis X X X X X X X X ECG 2 horas post-dosis X Otras evaluaciones clínicas Evaluación de eventos adversos X X X X X X X X X X X X X Tratamiento concomitante X X X X X X X X X X X X X X Transfusiones X X X X X X X X X X X X X X Adherencia al tratamiento X X X X X X X X X X X X X Evaluación EICRc NIH X X X Tratamiento de estudio Glasdegib Día 1-28 Día 1-28 Día 1-28 57 58 Tabla 4.2. Visitas y procedimientos reglados programados durante el estudio (continuación). Ciclo 4 Ciclos 5 y 6 Ciclo 7 Ciclos 8 and 9 Ciclo 10 Ciclos 11 y 12 Actividad en protocolo Día 1 (±2 días) Día 15 (±2 días) Día 1 (±2 dias) Día 15 (±2 días) Día 1 (±2 días) Día 15 (±2 días) Día 1 (±2 días) Día 15 (±2 días) Día 1 (±2 día) Día 15 (±2 día) Día 1 (±2 días) Día 15 (±2 días) Documentación basal Consentimiento informado Historia clínica ECOG X X X X X X Evaluaciones/Análisis Signos vitales X X X X X X X X X X X X Examen físico X X X X X X X X X X X X Hemograma X X X X X X X X X X X X Perfil bioquímico X X X X X X X X X X X X Análisis de orina X X X X X X Estudio de coagulación X X X X X X Test de embarazo X X X X X X ECG (1 hora post-dosis) X X X X X X Otras evaluaciones clínicas Evaluación de eventos adversos X X X X X X X X X X X X Tratamiento concomitante X X X X X X X X X X X X Transfusiones X X X X X X X X X X X X Adherencia al tratamiento X X X X X X X X X X X X Evaluación EICRc NIH X X X Tratamiento de estudio Glasdegib Days 1-28 Days 1-28 Days 1-28 Days 1-28 Days 1-28 Days 1-28 58 65 Tabla 4.4. Listado de anticuerpos monoclonales empleados en el análisis de la diversidad del repertorio TCR. Los 24 anticuerpos quedan agrupados en 8 tubos diferentes (A-H). * Nomenclatura según Wei et al(146). (#) Nomenclatura IMGT(147). Tubo Vβ* (#) Fluorocromo Clon A Vb 5.3 (TRBV5-5) Vb 7.1 (TRBV4-1, TRBV4-2, TRBV4-3) Vb 3 (TRBV28) PE PE+FITC FITC 3D11 ZOE CH92 B Vb 9 (TRBV3-1) Vb 17 (TRBV19) Vb 16 (TRBV14) PE PE+FITC FITC FIN9 E17.5F3 TAMAYA1.2 C Vb 18 (TRBV18) Vb 5.1 (TRBV5-1) Vb 20 (TRBV30) IgG (mouse) PE PE+FITC FITC BA62.6 IMMU157 ELL1.4 D Vb 13.1 (TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV6-9) Vb 13.6 (TRBV6-6) Vb 8 (TRBV12-3, TRBV12-4) PE PE+FITC FITC IMMU222 JU74.3 56C5.2 E Vb 5.2 (TRBV5-6) Vb 2 (TRBV20-1) Vb 12 (TRBV10-3) PE PE+FITC FITC 36213 MPB2D5 VER2.32 F Vb 23 (TRBV13) Vb 1 (TRBV9) Vb 21.3 (TRBV11-2) PE PE+FITC FITC AF23 BL37.2 IG125 G Vb 11 (TRBV25-1) Vb 22 (TRBV2) Vb 14 (TRBV27) PE PE+FITC FITC C21 IMMU546 CAS1.1.3 H Vb 13.2 (TRBV6-2) Vb 4 (TRBV29-1) Vb 7.2 (TRBV4-3) PE PE+FITC FITC H132 WJF24 ZIZOU4 A cada uno de los 8 tubos pre-cargados con las combinaciones de anticuerpos (20 µL de la mezcla de anticuerpos frente al TCR Vβ + 10 µL del anti-CD3-APC-H7) se añadió un volumen de 100 µL de sangre. Posteriormente, se procedió a incubar los tubos a temperatura ambiente (18-25 ºC) durante 20 minutos en la oscuridad. A continuación, se completó la lisis eritrocitaria con solución FACS Lysis (BD) según las instrucciones del proveedor. El pellet celular resultante se resuspendió en 1 mL de PBS con formaldehído 66 0.5% y se mantuvo en la oscuridad a –4 ºC hasta el momento de la adquisición en el citómetro de flujo. El porcentaje de uso de cada especificidad Vβ en la población total CD3+ fue calculado y reportado en un clonograma. Con objeto de obtener una medida cuantitativa global de la diversidad del repertorio que facilitase las comparaciones intra e inter-pacientes, empleamos una estrategia análoga a la del cálculo del coeficiente de Gini, índice de uso extendido en el ámbito de las ciencias económicas para la cuantificación de la desigualdad en los ingresos de un país(148). Este índice (Gini-TCR) fue estimado a partir de la construcción de curvas de Lorenz en las que se representaron las proporciones cumulativas de las 24 especificidades TCR-Vβ analizadas (normalizadas a un total del 100%) en el eje X, y las proporciones cumulativas de linfocitos CD3+ que quedaron cubiertas por estas especificidades en el eje Y. Para el cálculo del índice, el área delimitada por la línea de equidistribución (línea equivalente a una distribución equitativa perfecta) y la curva de Lorenz fue dividida entre el área total bajo la línea de equidistribución. La construcción de las curvas de Lorenz y el cálculo del índice Gini-TCR se realizaron con el software estadístico Stata 14 (StataCorp). 4.5.4 Análisis de moléculas co-estimuladoras o co-inhibitorias de células T La expresión de moléculas co-estimuladoras o co-inhibitorias de células T fue evaluada mediante citometría de flujo en condiciones de reposo y tras la activación linfocitaria con PMA e ionomicina. Los ensayos de activación se llevaron a cabo en 500 µL de sangre periférica estimulada o no con PMA (20 µg/mL) e ionomicina (0,91 µg/mL). En ambos casos se añadió también brefeldina A (10 µg/mL) a las muestras. Tras 4 horas, las células fueron marcadas con anticuerpos frente a las proteínas de superficie 4-1BB (CD137), PD-1 (CD279), TNFRSF18 (CD357), OX40 (CD134) y CTLA-4 (CD152). Los anticuerpos monoclonales empleados en estos ensayos quedan recogidos en la Tabla 4.5. 67 Tabla 4.5. Listado de anticuerpos monoclonales empleados en los ensayos de activación y expresión de moléculas co-estimuladoras o co-inhibitorias de células T. Anticuerpo monoclonal Laboratorio Referencia CD137-FITC Invitrogen 11-1379-42 CD279-PE BD 557946 CD357-PerCP-Cy5.5 Biolegend 371218 CD134-PE-Cy7 BD 563663 CD152-APC BD 555855 CD3-APC-H7 BD 641415 4.5.5 Análisis de fosfoproteínas implicadas en la activación de células T Para el análisis de la activación de fosfoproteínas implicadas en la activación de células T empleamos una estrategia de marcaje combinado con anticuerpos frente a marcadores de superficie (CD3, CD4 y CD8) y frente a proteínas fosforiladas intracelulares (pERK, p38, pSTAT3 y pSTAT5) (Tabla 4.6). Las muestras de sangre periférica (150 µL) se incubaron inicialmente con anticuerpos monoclonales frente a marcadores de superficie durante 30 minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente. Posteriormente, las muestras fueron lavadas con solución buffer y activadas (o no) con PMA 40 nM (para el análisis de pERK y p38), IL-2 50 ng/mL (para el análisis de pSTAT5) e IL-6 20 ng/mL (para el análisis de pSTAT3) durante 15 minutos a 37 ºC en la oscuridad. Tras este tratamiento inicial, las células nucleadas fueron fijadas con 4 mL de solución de lisis/fijación (dilución 1:5, 10 minutos a 37 ºC en la oscuridad), y lavadas dos veces con solución buffer de lavado. Para permeabilizar los linfocitos, se añadió 1 mL de Phosphoflow Buffer III (BD). Las muestras se agitaron posteriormente con un mezclador tipo vórtex, y fueron incubadas a 4 ºC durante 30 minutos. Después de dos pasos adicionales de lavado, las muestras fueron finalmente incubadas con los anticuerpos frente a las fosfoproteínas intracelulares durante 1 hora antes de la adquisición en el citómetro. 68 Tabla 4.6. Listado de anticuerpos monoclonales empleados en los análisis de fosfoproteínas implicadas en la activación de células T. Anticuerpo monoclonal Laboratorio Referencia p38 MAPK (pT180/y182) AF-647 BD 560750 ERK (pT202/204) AF-647 BD 560750 STAT3 (pY705) AF-647 BD 560750 STAT5 (pY694) AF647 BD 560750 CD3-PerCP BD 560750 CD4-FITC BD 560750 CD8-PE BD 560750 4.6 Análisis estadístico Los datos de seguridad y tolerabilidad fueron reportados empleando estadísticos descriptivos. Las tasas de respuesta de la EICRc y la EICRcs fueron estimadas con intervalos de confianza binomiales exactos del 80% usando el método de Clopper- Pearson. En los estudios inmunológicos se empleó el test de Friedman para evaluar diferencias entre determinaciones seriadas en el tiempo, y el test de Wilcoxon para las comparaciones post-hoc. El umbral de significación fue ajustado según la corrección de Bonferroni. Los análisis estadísticos fueron llevados a cabo en R 4.2.2 (http://www.r-project.org) y Stata 14 (StataCorp). 69 70 5 RESULTADOS 71 72 5.1 Características demográficas y clínicas de los pacientes Veinte pacientes fueron incluidos en el análisis del estudio. Un paciente adicional no evaluable para TLD fue reemplazado tempranamente tras su inclusión en la cohorte 1, de acuerdo a las indicaciones del protocolo, tras presentar un accidente isquémico cerebrovascular G3 que fue considerado como un evento no relacionado con el fármaco del estudio. La mediana de edad en el momento de la inclusión fue de 47 años (rango 27- 73), y la mayoría de los pacientes (70%) tenían una puntuación basal Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0-1. La mediana de tiempo desde el diagnóstico de la EICRc y de la EICRcs hasta el inicio del tratamiento con glasdegib fue de 30 (rango 6-105) y 11 (rango 1-86) meses, respectivamente. La mediana de la puntuación basal NIH de gravedad global de la EICRc fue de 8 puntos (rango 5-9) en una escala semicuantitativa de 0-10, y un 80% de los pacientes presentaban afectación por EICRc en ≥4 órganos diana. La mediana de líneas previas de tratamiento para la EICRc fue de 4 (rango 2-10). En este aspecto, es destacable que un 70% de los pacientes habían recibido tratamiento previo con fotoféresis extracorpórea, y un 50% habían estado expuestos a tratamiento con ruxolitinib. Las características de los pacientes quedan recogidas en la Tabla 5.1. 73 Tabla 5.1. Características demográficas y clínicas. Variable Todos (n=20) Cohorte 1 (50 mg) (n=3) Cohorte 2 (100 mg) (n=3) Cohorte de expansión (50 mg) (n=14) Edad, mediana (rango), años 47 (27-73) 50 (42-53) 39 (33-60) 47 (27-73) Sexo femenino, n (%) 5 (25) 1 (33) 1 (33) 3 (21) Trasplante mieloablativo, n (%) 12 (60) 2 (67) 2 (67) 8 (57) Tipo de donante, n (%) Hermano HLA-idéntico 8 (40) 2 (67) - 6 (43) DNE compatible 8 (40) 1 (33) 3 (100) 4 (29) DNE con incompatibilidad 1 (5) - - 1 (7) Haploidéntico 3 (15) - - 3 (21) Indicación de trasplante (%) LMA 8 (40) 2 (67) - 6 (43) LLA 4 (20) - 2 (67) 2 (14) Linfoma 3 (15) 1 (33) - 2 (14) SMPC 2 (10) - 1 (33) 1 (7) Otros 3 (15) - - 3 (21) Puntuación ECOG basal, n (%) 0-1 15 (75) 2 (67) 2 (67) 11 (79) 2 5 (25) 1 (33) 1 (33) 3 (21) Tiempo desde el trasplante hasta la EICRc, mediana (rango), meses 9 (3-59) 6 (3-19) 5 (4-11) 10 (4-59) Tiempo desde la EICRc hasta la inclusión, mediana (rango), meses 31 (7-106) 71 (63-78) 52 (12-106) 28 (7-65) Tiempo desde la EICRcs hasta la inclusión, mediana (rango), meses 12 (2-87) 61 (59-67) 9 (5-87) 9 (2-55) Puntuación de gravedad global de la EICRc, mediana (rango) 8 (5-9) 8 (8-9) 8 (5-9) 7 (6-9) Puntuación de rigidez articular, mediana (rango) 8 (6-9) 8 (7-9) 8 (6-9) 8 (6-9) 73 74 Puntuación de gravedad global reportada por el paciente, mediana (rango) 8 (4-10) 8 (7-9) 8 (4-9) 8 (5-10) Órganos afectados, n (%) Boca Tracto digestivo Ojos Pulmones Hígado Piel Articulaciones/fascia 16 (80) 6 (30) 16 (80) 8 (40) 3 (15) 20 (100) 20 (100) 2 (67) 1 (33) 3 (100) 1 (33) 1 (33) 3 (100) 3 (100) 3 (100) 1 (33) 3 (100) 1 (33) - 3 (100) 3 (100) 11 (79) 4 (29) 10 (71) 6 (43) 2 (14) 14 (100) 14 (100) Órganos afectados, mediana (rango) 5 (3-6) 5 (3-6) 5 (4-5) 5 (3-6) ≥4 órganos afectados, n (%) 16 (80) 2 (67) 3 (100) 11 (79) Líneas previas de tratamiento, mediana (rango) 4 (2-10) 6 (5-10) 5 (3-10) 3 (2-6) Líneas previas de tratamiento, n (%) Ruxolitinib 10 (50) 3 (100) 2 (67) 5 (36) Ibrutinib 1 (5) - - 1 (7) Fotoféresis extracorpórea 14 (70) 3 (100) 2 (67) 9 (64) Rituximab 6 (30) 2 (67) 1 (33) 3 (21) Imatinib 6 (30) 3 (100) 1 (33) 2 (14) Inhibidor de mTOR 8 (40) 1 (33) 1 (33) 6 (43) Inhibidor de calcineurina 7 (35) 1 (33) 3 (100) 3 (21) Abreviaturas: DNE, donante no emparentado; EICRc, enfermedad injerto contra receptor crónica; EICRcs, enfermedad injerto contra receptor crónica esclerodermiforme; LLA, leucemia linfoblástica aguda; LMA, leucemia mieloblástica aguda; SPMC, síndrome mieloproliferativo crónico. 74 74 81 de entrada en el estudio a 0,11 mg/kg/día (0,01-0,39; mediana de reducción de dosis del 52%). 5.3.4 Evaluación de resultados por parte del paciente La evaluación de respuestas por parte del paciente estuvo disponible en ≥75% de las visitas programadas en 13 pacientes, 8 de los cuales fueron respondedores de acuerdo a la evaluación clínica según criterios NIH. Siete pacientes (54%; 6 respondedores) y 5 pacientes (38%; 4 respondedores) reportaron una mejoría ≥2 puntos que persistió en ≥2 visitas consecutivas en la puntuación de gravedad global de la EICRc y en la puntuación de rigidez cutánea, respectivamente. 5.4 Estudios biológicos 5.4.1 Análisis de subpoblaciones de células T En el análisis por citometría de flujo multiparamétrica de las subpoblaciones de células T no se observaron cambios en la prevalencia de linfocitos T-reguladores totales, linfocitos T-reguladores naive, linfocitos T gamma-delta totales o linfocitos T gamma-delta naive en sangre periférica. La distribución de estas poblaciones fue similar tanto en los pacientes que obtuvieron una respuesta clínica de la EICRcs como en los no respondedores (Figura 5.3). Del mismo modo, también fue similar la distribución de subpoblaciones de células T CD4+ o CD8+ circulantes a lo largo del tratamiento (Figura 5.4). 82 Figura 5.3- Análisis por citometría de flujo multiparamétrica de la prevalencia y evolución bajo el tratamiento con glasdegib de subpoblaciones seleccionadas de células T. A) Células T gamma-delta; B) células T gamma-delta naive; C) células T-reguladoras; D) células T- reguladoras naive. n.s., no estadísticamente significativo. C2D1: ciclo 2 día 1; C4D1: ciclo 4, día 1. * Diferencia en la prueba ómnibus de Friedman en la serie global. En los tests post-hoc únicamente se detectó una diferencia significativa entre las visitas C2D1 y C4D1 en los pacientes respondedores (p=0,007), pero no respecto a la determinación basal previa al inicio de tratamiento. 83 Figura 5.4. Análisis por citometría de flujo multiparamétrica de la distribución de las subpoblaciones de células T CD4+ (panel izquierdo) o CD8+ (panel derecho) y de su evolución bajo tratamiento con glasdegib. C1D1: ciclo 1, día 1; C2D1: ciclo 2, día 1; C4D1: ciclo 4, día 1. 5.4.2 Análisis del repertorio TCR Vβ El repertorio TCR Vβ en los pacientes con EICRcs incluidos en el estudio se caracterizó por una diversidad en general reducida como consecuencia de la presencia de dominancia mono- u oligoclonotípica (Figura 5.5). La mediana del índice de diversidad TCR-Gini fue de 0,48 (rango 0,32-0,71), donde un valor de 0 representaría una distribución perfectamente equitativa y un valor de 1 la ausencia completa de diversidad. El tratamiento con glasdegib no se asoció a cambios en la diversidad del repertorio (Figura 5.6). 84 Figura 5.5. Análisis del repertorio TCR Vβ. A) Clonograma de un paciente con EICRcs con una amplia distribución clonotípica. B-D) Clonogramas representativos de pacientes con EICRcs en los que se evidencia dominancia clonotípica y una reducida diversidad resultante del repertorio TCR Vβ. Figura 5.6. Cuantificación por citometría de flujo de la diversidad del repertorio TCR Vβ mediante un índice Gini-like. Un valor de 0 indica una distribución perfectamente equitativa, mientras que un valor de 1 indica una completa ausencia de diversidad. n.s., no estadísticamente significativo. 85 5.4.3 Análisis por fosfo-citometría de flujo de las vías de activación de células T En condiciones basales previas al inicio del tratamiento con glasdegib, la mediana de valores de MFI fue similar para p-p38 (CD4+: 69,9, rango 32,8-138,8; CD8+: 67,7, 34,5-123,1), pERK (CD4+: 83,7, 41,5-153,1; CD8+: 72,8, 46,5-131,4) y STAT3 (57,9, 33,8-121,0), siendo superior en el caso de pSTAT5 en ambas subpoblaciones T (CD4+: 272,8, 78,5-2911,1; CD8+: 149,6, 80,3-1695,0). Tras la incubación con PMA (pERK y p-p38), IL-2 (pSTAT5) o IL-6 (pSTAT3), se objetivó una notable activación en el compartimento CD4+ de la fosforilación de pERK, pSTAT3 y pSTAT5, pero no de p-p38, reflejada en las ratios de MFI post-activación/basal (pERK: 3,0, rango 1,0-10,2; pSTAT3: 3,6, 1,0-10,6; pSTAT5: 4,1, 1,2-12,3; p-p38: 1,2, 1,0-1,6). En el compartimento CD8+, el incremento de la fosforilación post-activación fue menor, particularmente en el caso de p38 y STAT3 (pERK: 1,8, 0,3-5,9; pSTAT3: 1,1, 0,8-4,4; pSTAT5: 2,4, 1,0-23,0; p-p38: 1,2, 1,0-2,0) (Figura 5.7). No se detectaron diferencias en los patrones de fosforilación en sucesivas determinaciones bajo tratamiento con glasdegib en el análisis de la serie completa ni en el subanálisis de pacientes con o sin respuesta de la EICRcs. Cabe mencionar que a pesar de que en el análisis de STAT3 en células CD8+ se obtuvo una diferencia significativa en el test ómnibus que comparaba las ratios de MFI en la serie global (p=0,047), no hubo diferencias significativas en ninguno de los test corregidos post-hoc. Por otro lado, la limitada evidencia de activación de la fosforilación de STAT3 en la subpoblación CD8+ y la posible influencia de algunos valores extremos sobre el análisis ponen en cuestión la relevancia de este hallazgo (Figura 5.7). 86 Figura 5.7. Análisis por fosfo-citometría de flujo de las vías de activación de células T. La determinación por citometría de flujo de los niveles de fosforilación de A) p38 (pT180/y182), B) ERK (pT202/204), C) STAT3 (pY705), y D) STAT5 (pY694) fue realizada en condiciones basales y tras activación con PMA 40 nM (pERK y p38), IL-2 50 ng/mL (pSTAT5) o IL-6 20 ng/mL (pSTAT3) en las subpoblaciones CD4+ y CD8+. Las diferencias entre determinaciones seriadas en el día 1 de los ciclos 1, 2 y 4 fueron examinadas en la serie global y en los pacientes que alcanzaron o no respuestas clínicas en la EICRcs. Se muestran las ratios de MFI post-activación/basal. MFI, intensidad de fluorescencia media; n.s.,no estadísticamente significativo. * Diferencia en el test ómnibus de Friedman en la serie global. No hubo diferencias significativas en los tests post-hoc, ni en el análisis de pacientes respondedores y no respondendores. 5.4.4 Análisis de la expresión de moléculas co-inhibitorias y co-estimuladoras de células T La expresión de moléculas co-inhibitorias y co-activadoras de células T fue minoritaria, aunque variable, en condiciones basales previas al tratamiento con glasdegib. Así, la mediana de la proporción de linfocitos T CD4+ positivos para la expresión de estos marcadores fue del 0.32% (rango 0-4,9%) para CTLA-4, del 5,1% (0,1-25,2%) para TNFRSF18, del 1,3 (0,01-11,8%) para PD-1, del 7% (0,44-26,7%) para OX40, y del 0,02% (0-0,21%) para 4-1BB. Los valores correspondientes en el compartimento CD8+ fueron 3,2% (0-19,6%) para CTLA-4, 1,3% (0-12,1%) para TNFRSF18, 0,4% (0-20,2%) para PD-1, 0,5% (0-3,8%) para OX40, y 0% (0-0,12%) para 4-1BB (Figura 5.8). 87 Tras la activación con ionomicina y PMA, la expresión en linfocitos CD4+ de CTLA-4 (mediana de cambio absoluto 18,7%, rango 1,1-48,7% y OX40 (27,5%, 9,7-56,4%) aumentó de forma notable. Por el contrario, los cambios en la expresión de TNFRSF18 (3,8%, 0,01-11,1% PD-1 (0,8%, -1,5-15,1%), y 4-1BB (0,2%, -0,1-1,1%) fueron poco apreciables. En la población CD8+ únicamente fue destacable el aumento en la población positiva para CTLA-4 (9,6%, 0-24,7%) (Figura 5.8). No de detectaron cambios en la expresión de estos marcadores bajo tratamiento con glasdegib, ni se objetivó un patrón diferencial en pacientes respondedores vs. no respondedores (Figura 5.8). 88 Figura 5.8. Expresión de moléculas co-estimuladoras y co-inhibitorias de células T en sangre periférica. La expresión de A) CTLA-4, B) TNFRSF18, C) PD-1, D) OX40, y E) 4-IBB fue medida mediante citometría de flujo en los compartimentos CD4+ y CD8+ en condiciones de reposo y tras una incubación durante 4 horas con ionomicina (0.91 µg/mL) y PMA (20 µg/mL). n.s., no estadísticamente significativo. * Diferencia en el test ómnibus de Friedman en la serie global. En los test post-hoc únicamente se detectó una diferencia significativa entre las visitas C2D1 y C4D1 (p=0.011), pero no respecto a la determinación basal. 89 5.4.5 Análisis de subpoblaciones monocíticas y dendríticas En el análisis por citometría de flujo multiparamétrica de las subpoblaciones monocíticas y dendríticas no se detectaron diferencias de interés en la evolución bajo tratamiento de los monocitos clásicos, monocitos intermedios, monocitos no clásicos, células dendríticas plasmacitoides, células mieloides dendríticas BDCA-1+, y células mieloides dendríticas BDCA-3+. La prevalencia de estas poblaciones fue similar tanto en los pacientes que obtuvieron una respuesta clínica de la EICRcs como en los no respondedores (Figura 5.9). Figura 5.9. Análisis por citometría de flujo multiparamétrica de la prevalencia y evolución bajo el tratamiento con glasdegib de subpoblaciones celulares monocíticas y dendríticas en sangre periférica. A) Monocitos clásicos; B) monocitos intermedios; C) monocitos no clásicos; D) células dendríticas plasmacitoides; E) células mieloides dendríticas BDCA-1+; F) células mieloides dendríticas BDCA-3+. n.s., no estadísticamente significativa. * Diferencia en el test ómnibus de Friedman en la serie global. En los test post-hoc únicamente se detectó una diferencia significativa entre las visitas C2D1 y C4D1 (p=0.007), pero no respecto a la determinación basal. No hubo diferencias en el análisis de pacientes respondedores y no respondendores. 90 6 DISCUSIÓN 97 con cambios en la puntuación global P-ROM de hasta 8 puntos, y de hasta 6 puntos en la puntuación de rigidez cutánea y/o articular. Las respuestas fueron alcanzadas precozmente en la mayoría de los pacientes (mediana de 2,1 meses hasta respuesta). No obstante, es destacable que la mediana de tiempo hasta mejor respuesta se alejase hasta los 8,4 meses, poniendo de relieve la posibilidad de profundización de respuestas con el tratamiento más prolongado. Como cabría esperar en esta población de pacientes, todas las respuestas globales fueron parciales, aunque sí fueron alcanzadas algunas RC en determinados ítems como la evaluación de articulaciones/fascia. Además de la obtención de respuestas en las manifestaciones de la EICRcs, sería por otro lado destacable la reducción significativa en la dosis concomitante de tratamiento corticoesteroideo como marcador indirecto de eficacia clínicamente relevante en una población de pacientes particularmente susceptible a las complicaciones derivadas del uso prolongado de estos fármacos. Nuestros resultados también concuerdan con los reportados en los ensayos previamente mencionados con sonidegib y vismodegib(138,139). En el estudio con sonidegib, la tasa global de RP en piel o afectación esclerodermiforme fue del 47%, si bien cabe destacar que las respuestas no fueron evaluadas de acuerdo a criterios estandarizados. También fue alcanzada una RP en 5 de los 6 pacientes incluidos en el estudio con vismodegib, según criterios de respuesta NIH de 2014. De forma similar a las observaciones en relación al perfil de seguridad, nuestros hallazgos han sido confirmados en el estudio estadounidense con glasdegib. En este ensayo, el tratamiento con glasdegib resultó en una tasa global de respuesta modificada de la EICRcs en piel y/o articulaciones del 47%. Desglosados los ítems de evaluación, el 33% de los pacientes alcanzaron una respuesta en superficie corporal o manifestaciones escleróticas, el 20% una respuesta en articulaciones/fascia (incluyendo una RC), el 31% una mejoría 98 ≥2 puntos en la puntuación global P-ROM, y el 31% una mejoría ≥2 puntos en la puntuación de rigidez cutánea y/o articular. Estos son resultados son, por tanto, algo inferiores a los reportados en nuestro estudio, si bien no es posible inferir de forma definitiva diferencias por el limitado tamaño muestral de los dos ensayos. No obstante, es posible que el mayor tiempo en tratamiento pudiese haber contribuido a la mayor tasa de respuestas en nuestro estudio. Estos resultados de eficacia preliminar pueden interpretarse de forma favorable, especialmente a la luz del elevado número de líneas previas de tratamiento recibidas por los pacientes incluidos en el ensayo, así como el muy prolongado periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la cascada fibrótica hasta la introducción de glasdegib. En este aspecto, cabría pensar que la afectación clínica derivada de la esclerosis fuera ya irreversible en algunos casos, ofreciendo una barrera significativa a la detección de señales de actividad clínica. Quizás sea esperable que el inicio del tratamiento con inhibidores de SMO en una fase más precoz de la esclerodermia se asocie a una mayor eficacia, e incluso a un perfil más favorable de tolerabilidad. Esta hipótesis tendría un soporte empírico en la obtención de unos mejores resultados con el tratamiento profiláctico en modelos preclínicos de EICRcs(137). En los últimos años, las aprobaciones de ruxolitinib, ibrutinib y belumosudil por las agencias regulatorias han expandido las opciones de tratamiento para los pacientes con EICRc. Sin embargo, y a pesar de que estos nuevos fármacos han demostrado actividad clínica en la EICRc cutánea, las tasas de respuesta en la EICRcs no han sido reportadas de manera explícita(87,88,91). De forma notable, algunos pacientes expuestos previamente a ruxolitinib o ibrutinib obtuvieron beneficio clínico en nuestro estudio. Es por tanto concebible que el tratamiento con glasdegib u otros inhibidores de SMO pudiese ocupar un nicho terapéutico en pacientes seleccionados que no respondiesen a estos 99 nuevos agentes, especialmente si se llegasen a identificar regímenes de dosificación mejor tolerados. 6.3 Evidencia del papel inmunomodulador de glasdegib en la EICRcs Más allá de su influencia directa en la actividad de los miofibroblastos, la vía de señalización Hedgehog ha sido involucrada en una variedad de procesos inmunológicos clave cuya desregulación podría contribuir a la patogénesis de la EICRc. Estos procesos incluirían, entre otros, la selección y eliminación de células autorreactivas en el timo, la homeostasis de células B y la polarización macrofágica M2(119,160,161). El hallazgo en nuestro estudio de respuestas clínicas en órganos diana de la EICRc cuya afectación no estaría mediada a priori por la fibrosis también podría apuntar en la dirección de esta hipótesis. Nuestros extensos análisis por citometría de flujo no lograron, sin embargo, demostrar un impacto inmunomodulador ni identificar marcadores inmunológicos de respuesta al inhibir la señalización de la vía con glasdegib. En este sentido, en el estudio piloto con vismodegib no se observaron cambios en la producción de citoquinas derivadas de células T, en la prevalencia de células T reguladoras, o en los niveles de factores de transcripción esenciales para la polarización Th1 y Th17 (TBX21 y RORC, respectivamente). Del mismo modo, concordando con nuestros resultados, no se detectaron cambios en la expresión de moléculas co-inhibitorias de células T (PD-1, OX40 y CTLA-4). Por último, el tratamiento con vismodegib tampoco se asoció a cambios en los niveles de biomarcadores circulantes de la EICRc como BAFF, osteopontina, TGFβ, CXCL9, MMP3, o ST2. Por el contrario, sí se constató una disminución de la infiltración cutánea por macrófagos M2 y de los niveles de células B pre-centrogerminales (CD20+CD27+IgD+CD38Hi) y plasmablasto-like (CD20+CD27+IgDloCD38Hi) en sangre periférica. Este hallazgo se acompañó además de una disminución en la expresión por 100 células T CD4+ del factor de transcripción GATA3, esencial para el desarrollo de las respuestas Th2 y humoral(139). Globalmente, estas observaciones podrían sugerir un papel cooperador de la inmunopatología de células B en la instauración o mantenimiento de la esclerodermia. Desafortunadamente, nuestros estudios no permiten arrojar luz sobre esta posibilidad, quedando por tanto por esclarecer de forma concluyente si mecanismos inmunes independientes de los fibroblastos explican en cierta medida la actividad clínica de glasdegib en la EICRcs. 6.4 Limitaciones de nuestro estudio Este estudio presenta varias limitaciones. En primer lugar, no fueron realizados análisis de modelaje farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD). Por tanto, no fue posible realizar inferencias sobre el impacto del uso de glasdegib a la dosis de 50 mg diarios sobre la modulación de la vía de Hedgehog. Sin embargo, cabe destacar que en los ensayos de fase 1 el tratamiento con glasdegib a dosis ≥50 mg resultó en una marcada (>80%) disminución en la expresión en piel de GLI1(140,141,162). Junto con los resultados de seguridad y eficacia aquí reportados, estos datos indicarían que la obtención de un efecto biológico relevante es factible a las dosis reducidas empleadas en nuestro ensayo. En segundo lugar, nuestros resultados deben interpretarse con cautela considerando el diseño no controlado del estudio y la superposición parcial entre las toxicidades asociadas a los inhibidores de SMO y las manifestaciones de la EICRc. Las dificultades inherentes a la evaluación precisa de las respuestas clínicas en EICRcs suponen también un importante obstáculo, aún no resuelto incluso tras la aplicación estandarizada de los criterios NIH de 2014, para el desarrollo clínico de nuevos fármacos en esta población de pacientes. A pesar de estas limitaciones, la consistencia de los resultados reportados en ambos estudios académicos independientes con glasdegib apoya la validez de nuestros hallazgos. 101 102 7 CONCLUSIONES 103 104 1. La dosis de glasdegib a 100 mg diarios superó la dosis máxima tolerada por la aparición de calambres musculares relacionados con el tratamiento que cumplieron criterios de toxicidad limitante de dosis. 2. La dosis de glasdegib a 50 mg diarios quedó establecida como la dosis máxima tolerada. No obstante, fue frecuente la necesidad de ajustes sucesivos de dosis en relación a toxicidades sobre diana (calambres musculares, alopecia y disgeusia, principalmente). 3. El tratamiento con glasdegib se asoció a respuestas clínicamente significativas y sostenidas en el tiempo, definidas por criterios estandarizados, en múltiples manifestaciones de la EICRcs. La tasa global de respuestas de la EICRcs cutánea o articular fue del 65%. También se objetivaron respuestas en otros órganos diana de la EICRc a priori no necesariamente afectados por la fibrosis. 4. La instauración de respuestas fue precoz tras el inicio del tratamiento, con una mediana de tiempo hasta primera respuesta de apenas 2,1 meses. El tratamiento prolongado se asoció a la obtención de respuestas más tardías y a su profundización. Así, la mediana de tiempo hasta mejor respuesta fue de 8,4 meses. 5. A pesar de las limitaciones en cuanto a la tolerabilidad, la mitad de los pacientes optaron por continuar el tratamiento con glasdegib más allá de los 12 meses, quedando de manifiesto la posibilidad de tratamiento prolongado en pacientes seleccionados. 6. El tratamiento con glasdegib no se asoció a un impacto significativo sobre la diversidad del repertorio TCR Vβ, la expresión de moléculas co-inhibitorias o co-estimuladoras, los patrones de activación o la distribución de las subpoblaciones de células T. Nuestros estudios no arrojan por tanto evidencia de la existencia de mecanismos inmunomoduladores independientes de los fibroblastos que contribuyan a la actividad clínica de glasdegib en la EICRcs. 105 106 8 REFERENCIAS 113 38. De Masson A, Bouaziz JD, Le Buanec H, Robin M, O’Meara A, Parquet N, et al. CD24hiCD27+ and plasmablast-like regulatory B cells in human chronic graftversus-host disease. Blood. 2015;125(11):1830–9. 39. Kariminia A, Holtan SG, Ivison S, Rozmus J, Hebert MJ, Martin PJ, et al. Heterogeneity of chronic graft-versus-host disease biomarkers: Association with CXCL10 and CXCR3+ NK cells. Blood. 2016;127(24):3082–91. 40. Sarantopoulos S, Stevenson KE, Kim HT, Bhuiya NS, Cutler CS, Soiffer RJ, et al. 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