Implicaciones del endosimbionte Wolbachia SP. en la patología y el tratamiento de la filariasis

IMPLICACIONES DEL ENDOSIMBIONTE WOLBACHIA SP. EN LA PATOLOGÍA Y TRATAMIENTO DE LA FILARISIS MARGARITA JUNQUERO CASTRO Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla ‘’IMPLICACIONES DEL ENDOSIMBIONTE WOLBACHIA SP. EN LA PATOLOGÍA Y TRATAMIENTO DE LA FILARIASIS’’ TRABAJO FIN DE GRADO Revisión bibliográfica GRADO EN FARMACIA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA TUTOR: ANTONIO ZURITA CARRASCO MARGARITA JUNQUERO CASTRO Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Sevilla, noviembre 2022 RESUMEN La filariasis constituye un conjunto de enfermedades como la filariasis linfática, causada por los nematodos Wuchereria bancrofti y Brugia malayi, y por otro lado, la oncocercosis y la loasis, producidas por los nematodos Onchocerca volvulus y Loa loa respectivamente. Estas filariasis son transmitidas por unos vectores específicos, los cuales difieren según la especie de filaria. En las microfilarias (forma pre-larvaria) recae la importancia taxonómica y diagnóstica de estos nematodos. Por otro lado, la alfa-proteobacteria endosimbionte del género Wolbachia mantiene una relación mutualista con los nematodos filariales, mientras que con los artrópodos se produce un parasitismo reproductivo. A través del proyecto llevado a cabo por la OMS basado en la administración masiva de medicamentos antiparasitarios, se ha conseguido grandes avances en la eliminación de la filariasis en el mundo. Sin embargo, en la actualidad las filariasis siguen afectando a numerosas personas en el planeta En esta revisión bibliográfica se ha consultado distintas bases de datos, realizando búsquedas con una serie de palabras clave y seleccionando los artículos según su interés. Diversos estudios han revelado la importancia del endosimbionte Wolbachia sp. en la patogénesis de la filariasis, de modo que se está estudiando el empleo de diferentes antibióticos como la doxiciclina, la cual ha demostrado ser eficaz disminuyendo los síntomas asociados a la filariasis. De los cuatro nematodos objeto de esta revisión, L. loa es el único que no ha demostrado conexión con Wolbachia sp. Además, el empleo de técnicas basadas en la alteración reproductiva que provoca Wolbachia sp. en los vectores de enfermedades, están proporcionado resultados prometedores para el control de enfermedades como el Dengue. Pero aún queda un largo camino para introducir estos conocimientos en la práctica habitual y erradicar la filariasis en el mundo. PALABRAS CLAVE: filariasis, Wolbachia, tratamiento, control de vectores, alteración reproductiva. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………… 1.1. FILARIASIS LINFÁTICA…………………………………………………………………………………… 1.1.1. DISTRIBUCIÓN Y VECTOR…………………………………………………………………. 1.1.1.1. WUCHERERIA BANCROFTI…………………………………………………………. 1.1.1.2. BRUGIA MALAYI…………………………………………………………………………. 1.1.2. MORFOLOGÍA…………………………………………………………………………………… 1.1.3. CICLO BIOLÓGICO GENERAL…………………………………………………………….. 1.1.4. SÍNTOMAS……………………………………………………………………………………….. 1.2. FILARIASIS DE LOS TEJIDOS SUBCUTÁNEOS…………………………………………………… 1.2.1. LOA LOA…………………………………………………………………………………………… 1.2.2. ONCHOCERCA VOLVULUS………………………………………………………………… 1.2.2.1. DISTRIBUCIÓN Y VECTOR…………………………………………………………… 1.2.2.2. MORFOLOGÍA……………………………………………………………………………. 1.2.2.3. CICLO BIOLÓGICO……………………………………………………………………… 1.2.2.4. SÍNTOMAS…………………………………………………………………………………. 1.3. WOLBACHIA SP…………………………………………………………………………………………….. 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………… 3. METODOLOGÍA……………………………………………………………………………………………………. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………………………………….. 4.1. IMPLICACIONES DE WOLBACHIA SP. EN LA PATOLOGÍA DE LA FILARIASIS…….. 4.2. WOLBACHIA SP. Y EL PARASITISMO REPRODUCTIVO EN ARTRÓPODOS………… 4.3. IMPLICACIONES DE WOLBACHIA SP. EN EL TRATAMIENTO DE LA FILARIASIS… 4.3.1. TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO……………………………………………………. 4.3.2. CONTROL DE LOS VECTORES MEDIANTE LA MODIFICACIÓN REPRODUCTIVA QUE INDUCE WOLBACHIA SP………………………………….. 4.3.2.1. TÉCNICA DEL INSECTO INCOMPATIBLE………………………………………. 4.3.2.2. TÉCNICA DEL REEMPLAZO POBLACIONAL…………………………………… 5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………… 6. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………………… 5 5 5 5 6 6 7 9 10 10 11 11 11 12 12 13 15 16 17 17 20 21 21 26 27 28 30 31 5 1. INTRODUCCIÓN Según la OMS en 2009, se calcula que existen alrededor de unos 120 millones de personas infectadas por filarias en todo el mundo, de las cuales 40 millones presentan síntomas clínicos (McNulty et al., 2013). Es por ello que la filariasis es una enfermedad que requiere apoyo e investigación debido a la estigmatización social que producen sus síntomas, desencadenando problemas de salud mental para el paciente no menos importantes. Además, debido al aislamiento social e incapacitación física está asociado a una mayor pobreza económica. 1.1. FILARIASIS LINFÁTICA La filariasis linfática es una enfermedad tropical infecciosa causada por nematodos de la superfamilia Filaroidea. A esta patología se le conoce, comúnmente como elefantiasis debido a los síntomas característicos de esta enfermedad. Hay tres especies de nematodos responsables de la filariasis linfática: Wuchereria bancrofti, Brugia malayi y Brugia timori. (OMS, 2021). Éstos nematodos son transmitidos al humano a través de las hembras de ciertos géneros de mosquitos, las cuales actuarían como vectores. Dependiendo de la zona y la especie parasita la transmisión se dará por una especie u otra de mosquito. El caso de W. bancrofti las especies transmisoras son hembras del género Culex (dado en las zonas urbanas y semiurbanas principalmente), Anopheles (más frecuente de las zonas rurales) y Aedes (que predomina en las islas endémicas del Pacífico). Por otro lado, B. malayi es transmitida por los géneros Mansonia, Anopheles y Aedes (Goel y Goel,2016; OMS, 2021). En cuanto a B. timori, no desarrollaremos en profundidad esta especie en este trabajo, puesto que a día de hoy el número de casos que provoca en humanos es bastante residual en comparación con las otras especies arriba mencionadas (Goel y Goel, 2016). 1.1.1. DISTRIBUCIÓN Y VECTOR 1.1.1.1. WUCHERERIA BANCROFTI W. bancrofti es la especie de filaria más ampliamente distribuida en el mundo y como consecuencia es la causante del 90% de las filariasis linfáticas registradas en el planeta. Las regiones de África Subsahariana, Sur y Suroeste de Asia están consideradas regiones endémicas para esta especie, aunque también podemos encontrar casos en los países del Caribe y de América latina. También era frecuente la presencia de ésta especie de filaria en Japón, China, República de Korea, Turquía, Egipto y Oceanía pero desde que se establecieron programas de eliminación para ésta enfermedad, está disminuyendo o incluso desapareciendo de éstas áreas (McNulty et al., 2013; Small et al., 2019). 6 1.1.1.2. BRUGIA MALAYI B. malayi representa el 9% restante de los casos de filariasis linfática en el mundo. B. malayi se distribuye por territorios tropicales del Sur y Sureste de Asia dándose en muchos casos la infección simultánea con W. bancrofti (McNulty et al., 2013). El mosquito que actúa como vector en la transmisión de la cepa antropofílica de B. malayi pertenece al género Anopheles, que conlleva una periodicidad nocturna de estas cepas de filarias. Como ya hemos mencionado Anopheles sp. se encuentra en las áreas rurales ya que se reproducen en espacios abiertos, pantanosos y en arrozales (Pichon y Treuil, 2004; McNulty et al., 2013). 1.1.2. MORFOLOGÍA A continuación, vamos a conocer las características morfológicas representativas de cada una de las especies de filarias descritas anteriormente. Para ello nos centraremos en el estudio de las dos formas que presentan importancia taxonómica y diagnóstica dentro de las filarias: la forma adulta y la microfilaria (fase prelarvaria). Los helmintos adultos son filiformes con ambos extremos ahusados, es decir, alargados, elipsoides y con las extremidades más estrechas que el centro y son de color blanco cremoso translúcido. Todas las formas adultas poseen esófago filariforme típico del Orden Spirurida. (Goel y Goel, 2016). El tamaño varía entre especies: para W. bancrofti las filarias adultas miden aproximadamente unos 2,5-4 cm por 0,1 mm de grosor en el caso de los machos, mientras que la hembra posee un tamaño entre 8-10 cm por 0,2-0,3 mm de grosor. B. malayi por su parte es más pequeña, siendo el gusano macho de unos 13-23 mm por 70-80 µm y la hembra sobre 43-55 mm por 130- 170 µm (Goel y Goel, 2016). En cuanto al gusano macho, en ambas especies, éste muestra un extremo posterior curvado ventralmente, mientras que el extremo de la hembra es recto. Además, el gusano macho presenta dos espículas copulatrices de distintas longitudes. Otra particularidad de las filarias consiste en que el macho y la hembra en su estadio adulto permanecen enrolladas juntos siendo difícil de separar (Goel y Goel, 2016). Ahora bien, la filariasis linfática se diagnostica principalmente mediante la identificación de las microfilarias en las muestras de sangre (McNulty et al., 2013). Por ello es importante saber los rasgos morfológicos que diferencian unas especies de microfilarias y otras. 7 Las microfilarias causantes de las filariasis de tipo linfáticas son transparentes e incoloras con la cabeza roma y la cola puntiaguda y están cubiertas por una vaina hialina más larga que la microfilaria (McNulty et al., 2013). Para diferenciar las microfilarias de una especie y otra debemos fijarnos fundamentalmente en el número y posición de los núcleos caudales, el espacio cefálico y en la presencia de vaina. Así pues W. bancrofti contiene núcleos por todo el eje central pero en el extremo posterior no presenta núcleos (Fig. 1 y 3) mientras que los núcleos de B. malayi están densamente empaquetados y se caracteriza por la presencia de dos núcleos aislados en el extremo posterior y la ausencia de núcleos en el espacio cefálico (Fig. 2 y 4) (Goel, 2016; Paily et al., 2009). 1.1.3. CICLO BIOLÓGICO GENERAL En este apartado vamos a describir de forma general las distintas fases por las que transcurre las filarias en su ciclo de vida. Conocer el ciclo biológico de la filaria es esencial para poder eliminar eficazmente la enfermedad. El ciclo biológico de las filarias se completa mediante dos hospedadores distintos: el hombre que es el hospedador definitivo y el vector que actúa como hospedador intermediario (Fig. 5). Figura. 2 Extremo anterior y posterior de la microfilaria de B. malayi (Goel y Goel, 2016). Figura 1: Microfilaria de W. bancrofti (Goel y Goel, 2016). Figura. 3: Microfilaria de W. bancrofti recogida de una muestra de sangre y teñida con Giemsa (CDC, 2019). Figura. 4: Parte posterior de la microfilaria de B. malayi (CDC, 2017). 8 El ciclo biológico comienza cuando el vector infectado deposita las larvas de estadio tres (L3), en la piel del hospedador definitivo. Luego pasan a través de la punción o atraviesan la piel directamente pasando por los tejidos del hospedador definitivo (Back et al., 2010). Una vez en el hospedador definitivo, las larvas L3 mudan para dar lugar a las larvas de estadio 4 (CDC, 2004; Goel y Goel, 2016). A continuación, maduran a la forma adulta en unos 5 a 18 meses y se produce la cópula entre el gusano macho y la hembra (Goel y Goel, 2016). La filaria hembra es vivípara, de modo que dan a luz directamente a las larvas, las cuales pasan a la sangre del huésped posteriormente. A estas larvas se les conoce como microfilarias (Paily et al., 2009; Goel y Goel, 2016). Posteriormente el vector adquiere las microfilarias a través de la toma de sangre de una persona infectada. Éstas microfilarias pasan al estómago del vector dónde atraviesan la pared intestinal hasta llegar a los músculos torácicos en unas 4 a 17 horas. Una vez aquí, las microfilarias van a desarrollar tres estadios larvarios (Goel y Goel., 2016; CDC, 2004).Un primer estadio larvario donde las microfilarias pasan de tener una forma fina y alargada a ser gruesa y corta, con una pequeña cola puntiaguda en solo dos días. Esta larva crece rápidamente y muda la cutícula una o dos veces donde, la parte caudal se atrofia a forma de muñón y todos los órganos se desarrollan completamente teniendo lugar el tercer estadio larvario (L3) (Goel y Goel, 2016). Este tercer estadio larvario va a ser la forma infectante para el hombre, estando listas para infectar a otro hospedador durante la toma de sangre permitiendo así continuar su ciclo biológico (CDC, 2004; Paily et al., 2009). Figura 5: Ciclo biológico general de las filarias. Los recuadros de color verde representan el transcurso del ciclo biológico de la filaria en el ser humano (hospedador definitivo) mientras que los recuadros naranjas corresponden a su paso por el vector (hospedador intermediario). 9 Centrándonos en el ciclo biológico de la filariasis linfática, el vector corresponde con la hembra de mosquito, cuyo género y especie transmisora varía según la localización y la filaria infectante como hemos visto anteriormente. Las microfilarias de W. bancrofti y B. malayi residen en los ganglios linfáticos, sobre todo en los ganglios ilio-inguinales debido a que la zona más común de picadura del mosquito vector es en las extremidades inferiores y pasan a sangre durante la noche, mostrando una periodicidad nocturna (Pichon y Treuil, 2004). Así pues la forma adulta se instalan de forma permanente en los vasos linfáticos aferentes de los ganglios linfáticos, dando lugar la hembra a unas 50.000 microfilarias por día (Goel y Goel, 2016). 1.1.4. SINTOMATOLOGÍA En cuanto a las manifestaciones sintomáticas de la enfermedad, pueden aparecer síntomas agudos, crónicos o incluso puede que la persona afectada sea asintomática, aunque siempre se produce algún tipo de daño, como por ejemplo, daño en el sistema linfático, en el sistema inmunitario y en los riñones, los cuales no son apreciables a simple vista. Estas alteraciones también se producen en las personas que sufren la forma crónica de la enfermedad, pero además tiene lugar otros signos externos como linfedema, elefantiasis de los miembros (Fig. 6 y 7) e hidrocele, así como alteración de las mamas y de los órganos genitales. Otros síntomas son las inflamaciones de los ganglios y de los vasos linfáticos que se deben a la propia respuesta inmunitaria del organismo o a infecciones bacterianas cutáneas secundarias principalmente, los cuales se dan de forma aguda (OMS, 2021). Figura. 6: Elefantiasis en la extremidad inferior producida por el bloqueo de los vasos linfáticos causado por los nematodos adultos (Mendoza et al., 2009). Figura. 7: Elefantiasis en pie (Mendoza et al., 2009). 16 3. METODOLOGÍA Este trabajo de fin de grado consiste en una revisión bibliográfica, por tanto, su elaboración se ha llevado a cabo mediante la búsqueda y consulta de artículos publicados en diferentes bases de datos. Las bases de datos empleadas han sido: - PubMed https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/advanced/ - Google académico https://scholar.google.es/ - Biblioteca virtual de la Universidad de Sevilla, Catálogo Fama+ https://bib.us.es - Organización Mundial de la Salud: OMS https://www.who.int/es - Centro de Control y Prevención de Enfermedades: CDC https://www.cdc.gov Las palabras clave utilizadas para la búsqueda de estos artículos son las siguientes: - Human filariasis - Lymphatic filariasis - Lymphatic filariasis symptom - Lymphatic filariasis epidemiology - Wuchereria bancrofti - Brugia malayi - Loa loa - Onchocerca volvulus - Wolbachia sp. - Wolbachia sp. filarial nematodes - Wolbachia sp. endosymbionts Los criterios de selección o filtros empleados fueron: texto completo gratuito, artículos científicos y de revisión, lengua hispana o inglesa. Los artículos recopilados se han clasificado según contenido y fecha de publicación para posteriormente obtener la información necesaria para la elaboración del trabajo. 17 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. IMPLICACIONES DE WOLBACHIA SP. EN LA PATOLOGÍA DE LA FILARIASIS Wolbachia sp. presenta un papel significativo en la inmunología y patología de la filariasis. Así pues, si se reduce la densidad de Wolbachia sp. en los nematodos de este grupo a través de tratamientos dirigidos a su eliminación, podría disminuirse los síntomas asociados a la enfermedad. Además, disminuiría la cantidad de tratamiento antiparasitario actualmente empleado, reduciéndose los efectos adversos que estos producen. Hay una serie de moléculas asociadas a Wolbachia sp. las cuales son reconocidas por el sistema inmune del hospedador e inducen la respuesta de anticuerpos específicos. Un ejemplo de ello es la presencia de anticuerpos IgG contra la proteína de superficie de Wolbachia (WSP) en sueros de humanos infectados con O. volvulus, lo cual indica la exposición a las moléculas de la bacteria (Bandi et al., 2001). Asimismo, en el artículo publicado por Pathak et al. (2014) se demuestra por primera vez, a través de un estudio experimental, la implicación de Wolbachia sp. y más concretamente de la proteína de superficie (WSP) de Wolbachia sp. en la respuesta inflamatoria durante la infección con filariasis linfática producida por B. malayi en este caso. En este estudio se monitorizó la respuesta inflamatoria del sistema inmune de ratones los cuales fueron divididos en tres grupos: a un grupo se le administró la proteína de superficie purificada de Wolbachia sp. (r-wsp), a otro grupo se le administró directamente las larvas L3 de B. malayi y al último grupo se le introdujo la r-wsp y posteriormente las larvas L3. La respuesta obtenida en los tres grupos fue la misma, niveles elevados de linfocitos T cooperadores, Th 17 y citoquinas Th1 implicados en la respuesta pro-inflamatoria. Así como el descenso de linfocitos T reguladores que dan lugar a citoquinas Th2, esto procede a una menor tolerancia inmunológica por parte del hospedador para eliminar la infección. Sin embargo, la respuesta del tercer grupo era incluso mucho mayor que en los otros dos grupos, esto quiere decir que la r-wsp y las larvas de B. malayi actúan sinergéticamente en la respuesta proinflamatoria de la patología (Pathak et al. 2014). Igualmente se comprobó, en sueros de pacientes infectados de oncocercosis, que se producía la respuesta del sistema inmune frente a la proteína de choque térmico 60 (HSP60) de Wolbachia sp. Esta respuesta del sistema inmune consiste también en la producción de anticuerpos IgG. E incluso tiene lugar reacciones cruzadas entre la HSP60 de Wolbachia sp. y la HSP60 humana, desencadenando una respuesta autoinmune por parte de los hospedadores afectados de oncocercosis (Bandi et al., 2001). 18 Adicionalmente existen otras moléculas asociadas a Wolbachia sp. que interaccionan con el sistema inmune innato del hospedador como los lipopolisacáridos (LPS) de la membrana externa de Wolbachia sp. Esta interacción causa reacciones inflamatorias donde están implicados neutrófilos, macrófagos y linfocitos T (Bandi et al., 2001). De este modo la primera respuesta del sistema inmune innato consiste en la producción de macrófagos a través de la activación de los receptores transmembrana Toll-like produciendo la consiguiente inflamación de la zona donde se hospeda la filaria. Algunas de las citoquinas producidas por los macrófagos son: el Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucinas (IL-1β) y óxido nítrico (Bandi et al., 2001). Esta respuesta inflamatoria ha sido contrastada en muestras de extractos de humanos infectados por adultos y microfilarias de B. malayi y O. volvulus (Hise et al., 2004; Tamarozzi et al., 2014). En la respuesta del organismo humano ante la infección por filariasis se incluye también una de las primeras células inmunitarias que participan en la defensa frente a la infecciones, los neutrófilos. En el estudio realizado por Tamarozzi et al. (2014) se establece una relación directa entre los lipopéptidos diacilados de la membrana del endosimbionte con la activación de los neutrófilos en muestras de sangre infectadas por O. volvulus. Estos lipopéptidos diacilados son los principales ligandos de los receptores Toll-like proinflamatorios y como consecuencia inducen neutrófilos que se dirigen a los tejidos infectados por el nematodo, como por ejemplo la córnea, causando la queratitis típica de oncocercosis (Tamarozzi et al., 2014; Sulaiman et al., 2019). Además, se halla una evidencia fundamental de la inducción de moléculas proinflamatorias por el sistema inmune en respuesta a Wolbachia sp., la cual consiste en la acumulación de estos neutrófilos alrededor de O. volvulus que contienen Wolbachia sp. pero no alrededor de O. volvulus que no contienen la bacteria de forma natural (Tamarozzi et al. 2014; Tamarozzi et al., 2016) o bien en la reducción de estos neutrófilos en pacientes tratados con doxiciclina, la cual produce la depleción de Wolbachia sp. en el tejido afectado (Tamarozzi et al., 2016). Por otro lado, fue descrito por Francis et al. (1985) un fenómeno denominado Reacción de Mazzotti, que se fundamenta en la brusca aparición de efectos adversos, como fiebre, dolor corporal generalizado, prurito, edema, linfoadenopatías e inflamación ocular, después de la administración de dietilcarbamazina (DEC) e IVM debido a la liberación violenta de las moléculas que contiene las filarias (Bandi et al., 2001; Tamarozzi et al., 2011). Esta liberación de moléculas induce la activación de mecanismos inmunitarios del hospedador como los citados anteriormente tales como la producción de citoquinas pro-inflamatorias, TNF-α, IL-6 y IL-8 liderada por los macrófagos y neutrófilos. (Hise et al., 2004; Tamarozzi et al., 2014). Así pues, teniendo en cuenta estas observaciones existe una relación con respecto a Wolbachia sp. puesto 19 que en la liberación del contenido de las filarias durante el tratamiento con DEC también se escapan estas bacterias. Y además según el estudio realizado por Haarbrink et al. (2000), el organismo produce las mismas moléculas, como son la IL-6 y el TFN-α, tras la administración de LPS experimental. Por lo tanto, esta respuesta del sistema inmune puede ser característica de bacterias intracelulares como Wolbachia sp. una vez destruida la filaria y entrar en contacto directo con el hospedador humano (Haarbrink et al., 2000). Continuando con la respuesta que media Wolbachia sp. en el organismo, Tamarozzi et al. (2011) elaboraron un estudio experimental con ratones a los cuales a través de la exposición con O. volvulus que contenían Wolbachia sp desarrollaban queratitis corneal, y analizando a su vez las moléculas producidas por el sistema inmune de los ratones, este experimento mostró que la presencia del endosimbionte era indispensable para la respuesta inflamatoria mediada por neutrófilos. Es decir, Wolbachia sp. es un componente esencial para la producción de opacidad corneal característica de la enfermedad. De este modo se genera una secuencia de eventos (Fig. 14): en primer lugar, una vez el endosimbionte es liberado de las filarias secreta contenido al exterior del estroma corneal, el cual va a activar las células de alrededor como los fibroblastos, células dendríticas y macrófagos. Estas células a su vez van a producir la activación de quimiocinas como la MIP-2 y sobre todo de queratinocitos. Luego estos queratinocitos inducen la migración de neutrófilos a la córnea, los cuales son activados posteriormente por Wolbachia sp. a través de los receptores Toll-like. Además la activación de estos neutrófilos van a producir más MIP-2, induciendo mayor cantidad de neutrófilos en la zona afectada. Finalmente, la desgranulación de los neutrófilos producen la opacidad del estroma corneal, y como consecuencia los síntomas visuales de la oncocercosis (Tamarozzi et al., 2011). Figura 14: Proceso de inducción de la queratitis por O. volvulus y el endosimbionte Wolbachia sp. (Tamarozzi et al., 2011).. TLR: receptores Toll-like. KC: queratinocitos. MIP: proteína inflamatoria de macrófagos. 20 Por lo tanto, es evidente la correlación entre las manifestaciones clínicas de la filariasis, como por ejemplo la fibrosis en la Oncocercosis o las disfunciones linfáticas que tienen lugar en las filariasis linfáticas, y los diferentes antígenos de Wolbachia sp. a los que se expone la persona infectada. Finalmente, cabe señalar que hasta la fecha no se han encontrado evidencias de que L. loa presente ningún tipo de relación simbionte con Wolbachia sp., puesto que no se ha encontrado la presencia de esta bacteria en los nematodos adultos, ni tampoco en las microfilarias de L. loa (Bandi et al., 2001; Rao et al., 2005; Walker et al., 2015). 4.2. WOLBACHIA SP. Y EL PARASITISMO REPRODUCTIVO EN ARTRÓPODOS Tal como hemos comentado anteriormente, Wolbachia sp. presenta la capacidad de alterar la reproducción de los artrópodos, los cuales muchos de estos artrópodos actúan como vectores de enfermedades infecciosas como es el caso de la filariasis. A continuación, vamos a detallar los mecanismos que emplea esta bacteria para modificar la reproducción, con el objetivo de comprender sus posibles aplicaciones en el control de la filariasis. Feminización La feminización es el mecanismo en el que un macho genético se convierte en una hembra funcional, es decir, un embrión macho que está programado genéticamente para desarrollar los órganos masculinos, desarrollaría en su lugar los órganos femeninos permitiéndoles una mayor descendencia y transmisión de Wolbachia sp. Se ha determinado que este fenómeno ocurre debido a que Wolbachia sp. controla la diferenciación y el desarrollo de la glándula androgénica mediante la inhibición de los genes que determinan la masculinidad. Este fenómeno permite que hasta el 90% de la descendencia de una hembra infectada sean individuos del sexo femenino (Rodriguero, 2013). Androcinio Esta alteración reproductiva consiste en la muerte de los embriones machos durante una etapa temprana de su desarrollo. Además de suponer un bien para la transmisión de Wolbachia sp. a través de la línea germinal femenina, las hembras aprovechan para alimentarse de los restos de los embriones macho. Así las hembras mejoran su crecimiento e incrementan sus posibilidades de supervivencia. El mecanismo por el cual Wolbachia sp. reconoce el sexo de los embriones para la muerte selectiva de los embriones machos se desconoce (Rodriguero, 2013). 21 Partenogénesis telitóquica En realidad, la partenogénesis telitóquica se trata de un tipo de reproducción, donde el huevo no fecundado termina desarrollándose y además únicamente da lugar a hembras. Este mecanismo de reproducción supone una ventaja para los hospedadores infectados, pues aumentan el número de descendencia frente al de los hospedadores no infectados con Wolbachia sp. (Rodriguero, 2013). Incompatibilidad citoplasmática La incompatibilidad citoplasmática es un proceso de alteración en la reproducción muy frecuente que consiste en la muerte de los embriones en desarrollo tras el cruzamiento entre un macho infectado con Wolbachia sp. con una hembra no infectada. Mientras que si se da cruzamientos compatibles entre un macho y una hembra infectados con la misma cepa o entre un macho no infectado y una hembra infectada. Por lo tanto, Wolbachia sp. impide que nazcan individuos no infectados. A éste fenómeno se le conoce como incompatibilidad unidireccional (ICU) ya que los cruzamientos incompatibles ocurren sólo cuando el macho está infectado, siendo el único causante de la incompatibilidad: hembra sana y macho infectado (LePage et al., 2017; Xiao et al., 2021). El otro tipo de incompatibilidad se conoce como incompatibilidad citoplasmática bidireccional (ICB), que se da cuando el cruzamiento ocurre entre un macho y una hembra infectados con distintas cepas de Wolbachia sp., es decir, ambos son responsables de la esterilidad (Xiao et al., 2021). Efecto popcorn El efecto popcorn consiste en la degeneración masiva y repentina de las células del tejido somático debido a la multiplicación de la bacteria Wolbachia sp. en el interior de las células nerviosas y musculares de su hospedador. Este efecto se ha detectado únicamente en la mosca Drosophila melanogaster. Una vez las moscas son adultas comienza la reproducción violenta de la bacteria, con la consiguiente muerte de forma abrupta hacia la mitad de la adultez de la mosca (Kusmintarsih, 2008). El efecto popcorn podría emplearse para el control de los vectores de la filarias aunque no se trate de una alteración reproductiva como tal. 4.3. IMPLICACIONES DE WOLBACHIA SP. EN EL TRATAMIENTO DE LA FILARIASIS 4.3.1. TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO Ante la falta de control de la filariasis en las zonas endémicas y debido a la gran extensión de las mismas, la Organización Mundial de la Salud fundó en el año 2000 el Programa Mundial para Eliminar la Filariasis Linfática Y Oncocercosis con el fin de erradicar la transmisión de la enfermedad para el año 2020. Para conseguirlo se estableció un protocolo que consistió en la 22 administración masiva de medicamento, conocido por sus siglas en inglés como MDA (Mass Drug Administration). A pesar de no llegar al objetivo propuesto se ha conseguido reducir la transmisión de la enfermedad de forma considerable, tanto es así que se ha reducido en un 74% su transmisión. Sin embargo, sigue siendo una enfermedad que afecta a millones de personas en el mundo, pues en el año 2019 el número de infectados fue de 51,4 millones de personas (OMS, 2020). Al crearse los programas de control de la filariasis por parte de la OMS, este se centró fundamentalmente en el control de los vectores, sin embargo éste propósito fue desplazado por la administración masiva de tratamiento antifilárico a personas infectadas o en riesgo de estarlo. Este cambio de estrategia se debía al coste económico y los problemas de eficacia con los que se toparon para el control de los vectores (Hise et al., 2004). Es por ello que a lo largo de los años posteriores, una de las principales medidas de control empleada para la eliminación de la filariasis ha consistido en el empleo de tratamientos farmacológicos cuya diana terapéutica ha sido la eliminación de las microfilarias (Aljayyoussi et al., 2017). En la tabla 1 se exponen los antiparasitarios más utilizados en clínica para tratar a los pacientes infectados por distintas filariasis que resultan de interés en esta revisión. En 2019 la OMS recomendó el uso de una triple terapia la cual incluye, IVM, DEC y albendazol para algunas distritos endémicos (OMS, 2020). Especie / Fármaco Dosis adultos Dosis pediátrica Filariasis linfáticas (W. bancrofti, B. malayi ) y L. loa./ Dietilcarbamazina + Albendazol DEC: Día 1: 50 mg Día 2: 50 mg/8 h Día 3: 100 mg/8 h Días 4-14: 6 mg/kg/día, en 3 dosis ALB: Dosis única 400 mg Día 1: 1m/kg Día 2: 1mg/kg/8 h Día 3: 1-2 mg/kg/8 h Días 4-14: 6 mg/kg/día, en 3 dosis O. volvulus / Ivermectina + Albendazol 150 µg/kg, monodosis, repetir cada 6-12 meses hasta desaparición de los síntomas ALB: Dosis única 400 mg Igual que en adultos Tabla 1: Fármacos antiparasitarios y posologías empleadas en el tratamiento de la filariasis por W. bancrofti, B malayi, y O. volvulus (Aparicio et al., 2003; Chai et al., 2021). 23 Sin embargo, este plan estratégico basado en la MDA presenta inconvenientes debidos al largo ciclo de vida que presentan las filarias, por lo cual el tratamiento debe ser administrado durante muchos años a un gran número de población para conseguir la interrupción de la transmisión (Taylor et al., 2014; Aljayyoussi et al., 2017). En consecuencia, este programa actual no es suficiente para erradicar la filariasis linfática y la oncocercosis, y por ello se comenzó a usar al endosimbionte Wolbachia sp. como diana terapéutica. Debido a la relación simbiótica mutualista obligada entre Wolbachia sp. y los nematodos W. bancrofti, B. malayi y O.volvulus, la cual es necesaria para la supervivencia de ambos organismos tal como describimos en la introducción de esta revisión, se comenzó a investigar antibióticos contra Wolbachia sp. para eliminar la infección por estas especies de nematodos. En el 2007 se fundó el consorcio anti-wolbachia, conocido por el acrónimo de A-WOL, el cual está formado por un grupo de investigadores académicos de diversas áreas, como la farmacología, la parasitología o la medicina química, entre otras, siendo este proyecto financiado por la Fundación Bill & Melinda Gates. El objetivo de esta fundación consiste en obtener nuevos fármacos que incrementen el éxito del tratamiento frente a la oncocercosis y la filariasis linfática. Además, entre otros objetivos, se incluye reducir la duración del tratamiento farmacológico, asegurar un tratamiento seguro para todas las personas, conseguir un fármaco que produzca una esterilización permanente y evitar los efectos adversos derivados del tratamiento antiparasitario utilizado hasta el momento en la coinfección con L. loa (A-WOL., 2022). La nueva estrategia terapéutica se basaría en usar antibióticos con actividad frente a Wolbachia sp., de modo que la eliminación del endosimbionte diera lugar a la consecuente esterilización de las filarias, es decir, por bloqueo de la embriogénesis, de modo que poseen actividad macrofilaricida (frente a las formas adultas), retrasa el desarrollo y produce la muerte de los nematodos filariales adultos (Aljayyoussi et al., 2017; Sulaiman et al., 2019). Concretamente los antibióticos como las tetraciclinas, la rifampicina y el cloranfenicol, los cuales son activos frente a las bacterias de la familia Rickettsiaceae, han demostrado ser eficaces contra las transiciones larvarias de L3 a L4 y su desarrollo in vitro, mostrando cierta actividad microfilaricida (Rao et al., 2005). El primer medicamento anti-Wolbachia empleado en ensayo clínico fue la doxiciclina para tratar la oncocercosis donde la administración de una dosis de 100 mg al día durante seis semanas tuvo como resultado una reducción del 80% en la presencia de Wolbachia sp., afectando también a la embriogénesis y viabilidad de los nematodos adultos de O. volvulus (Hoerauf et al, 24 2000). Este fármaco también ha demostrado ser eficaz como tratamiento para las filariasis linfáticas, mejorando los síntomas clínicos como el linfedema en tan solo tres semanas de tratamiento. Como podemos apreciar la duración del tratamiento es inferior en el caso de la filariasis linfática con respecto a la oncocercosis, esto puede deberse a que el fármaco se distribuye más fácilmente por los vasos linfáticos que en los tejidos subcutáneos donde se aloja O. volvulus (Sulaiman et al., 2019). En estudios posteriores se determinó que el tratamiento de 4 o 6 semanas con 200 o 100 mg de doxiciclina respectivamente, era suficiente para alcanzar el 90% de eliminación de Wolbachia sp. de los nematodos: W. bancrofti, B .malayi y O. volvulus. Un punto importante a destacar es que este porcentaje de eficacia se obtiene tras 18 a 24 semanas posteriores al tratamiento (Walker et al., 2015; Aljayyoussi et al., 2017). Esto se debe al modo de actuación de la doxiciclina puesto que no produce la muerte directa de los nematodos adultos, sino que al darse la esterilización de las hembras, causada por la eliminación de Wolbachia sp. de la filaria, se va reduciendo de forma gradual el número de microfilarias y como consecuencia el agotamiento de la población (Walker et al., 2015). Sin embargo la doxiciclina presenta el inconveniente de que su uso está contraindicado en niños menores de ocho años y en embarazadas, además de presentar un curso relativamente largo de tratamiento de entre 4 a 6 semanas. Por estos motivos el programa de administración masiva de fármacos (MDA) no reconoce a la doxiciclina como un buen sustituto a gran escala de los tratamientos convencionales (Aparicio et al. 2003; Taylor et al., 2014). Consecuentemente para solucionar este problema la A-WOL puso en marcha un plan de búsqueda de nuevos compuestos con actividad frente a Wolbachia sp. Para ello A-WOL realizó el cribado de una galería de compuestos de unas 10.000 moléculas (Clare et al., 2015; Johnston et al., 2017). En primer lugar, el consorcio A-WOL seleccionó de diferentes librerías de compuestos, principalmente de BioFocus y SoftFocus, un extenso grupo de moléculas estructuralmente diversas entre sí con el objetivo de hallar las estructuras químicas que poseen mayor actividad contra Wolbachia sp., es decir, los hits. Posteriormente para realizar el ensayo, se empleó líneas celulares del mosquito Aedes albopictus infectado con Wolbachia sp., a los cuales se les adiciona de forma individual los compuestos a ensayar, e incubándolos luego durante nueve días a 26º C. A continuación, mediante microscopía óptica y además por PCR se analizaron la reducción de copias de ARN ribosomal 16S de Wolbachia sp. obtenida en las distintas muestras. Así pues, se obtuvo como resultado 174 hits de los cuales fueron reconfirmados como hits 112 a través de otro cribado, y a su vez de estos 112, tan solo 50 fueron validados puesto que podían almacenarse en seco y cumplían una toxicidad mínima del 70% con 25 respecto a las muestras control. Finalmente, se clasificaron los 45 compuestos resultantes en 6 series de hits según la similitud de sus estructuras químicas básica (Johnston et al., 2017). Las estructuras químicas de estas seis series son Tienopirimidina (11 compuestos), Imidazo[4,5- c]piridina (5 compuestos), Oxazepinona (7 compuestos), Imidazo[1,2-a]piridina (6 compuestos), Pirrolopiridina (14 compuestos) y Oxazol imidazolidinona (2 compuestos). Así pues este estudio realizado por Johnston et al. (2017) resulta un buen comienzo para la búsqueda de nuevos compuestos activos frente a Wolbachia sp. Hasta la fecha se han estudiado diferentes antibióticos como posible tratamiento tras el éxito de los ensayos clínicos con la doxiciclina como potencial fármaco anti-Wolbachia. De los antibióticos estudiados la minociclina, un fármaco del grupo de las tetraciclinas al igual que la doxiciclina, es el compuesto antibiótico más potente en la eliminación de Wolbachia sp. y como microfilaricida obtenido hasta el momento. A través de una dosis de 25 mg/kg dos veces al día durante 28 días en un grupo de roedores infectados por filariasis linfática se obtuvo una reducción del 99,51% de Wolbachia sp. frente al 90,35% con el empleo de doxiciclina. Por otro lado, el inconveniente que presenta la minociclina es que resulta contraproducente su uso en niños y mujeres embarazas al igual que ocurre con la doxiciclina (Sulaiman et al., 2019; Turner et al., 2017). Por el contrario la rifampicina podría desempeñar un importante papel como tratamiento ya que su empleo combinado junto con albendazol durante siete días resultó en la eliminación por casi completo de la filariasis en un estudio preclínico en ratones infectados con B. malayi (Turner et al., 2017). Además de ser un tratamiento de menor duración, su uso es seguro en embarazadas y niños. En cambio su empleo puede verse afectado, dicho antibiótico supone el principal tratamiento frente a la tuberculosis, así pues se teme el posible riesgo de resistencia cruzada con Mycobacterium spp. Actualmente se están estudiando alternativas de posologías y duración del régimen de tratamiento para acelerar el efecto del mismo y no afectar su uso como antituberculoso (Aljayyoussi et al., 2017; Sulaiman et al., 2019). Otro potencial fármaco se trata de la Coralopironina A, la cual es una sustancia aislada de Corallococcus coralloides, una cepa de mixobacterias. Dicho compuesto con actividad inhibidora de la ARN polimerasa ha presentado en estudios preclínicos in vivo en ratones, mediante una dosis de 35 mg/kg al día, un gran potencial frente a Wolbachia sp. (más de un 99,9% de reducción en la carga) impidiendo el desarrollo de los nematodos filariales. Incluso presenta un buen perfil de seguridad, ya que no induce toxicidad en las células eucariotas. Si bien es cierto que se requieren de más estudios para poder ser empleado, podría ser una buena alternativa como antibiótico en el tratamiento de la filariasis puesto que en este caso no interviene en el desarrollo de resistencias en la tuberculosis (Schiefer et al., 2012; Schäberle et al., 2014). 32  Francis H., Awadzi K., Ottesen, E.A. The Mazzotti reaction following treatment of onchocerciasis with diethylcarbazine: clinical severity as a funtion of infection intensity. Am. J. Trop. Hyg. 1985; 34: 529-536.  Goel T.C., Goel A. Lymphatic Filariasis. 1ª ed. 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