Uso de cannabinoides para el tratamiento de hemopatías malignas

Uso de cannabinoides para el tratamiento de hemopatías malignas Mayte Medrano Domínguez Tesis Doctoral 2023 Uso de cannabinoides para el tratamiento de hemopatías malignas Esta tesis doctoral ha sido realizada por Mayte Medrano Domínguez en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) para optar al grado de Doctora, dentro del programa oficial de doctorado Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica de la Universidad de Sevilla. El trabajo recogido en esta memoria ha sido codirigido por el Prof. José Antonio Pérez Simón y el Dr. Iván Valle Rosado, y financiado con la beca predoctoral PFIS del Instituto de Salud Carlos III (FI16/00412) y FEHH-Janssen 2020 de la Sociedad Española de Hematología y Hemoterapia (SEHH), con cargo al proyecto FIS PI14/02074 y PI17/02177 dirigido por el Prof. José Antonio Pérez Simón. Sevilla, a 24 de abril de 2023 El tutor y director de la tesis, El co-director de la tesis, José Antonio Pérez Simón Iván Valle Rosado La doctoranda, Mayte Medrano Domínguez “Estoy entre aquellos que piensan que la ciencia tiene una gran belleza. Un científico en su laboratorio no es sólo un técnico: es un niño colocado ante fenómenos naturales que lo impresionan como un cuento de hadas.” Marie Curie ÍNDICE Índice 1. ABREVIATURAS………………………………………………………………………………………………………………1 2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………..11 2.1. Hematopoyesis y Hemopatías malignas…………………………………….……………………….13 2.1.1. Hematopoyesis………………………………………………………………………………………….….13 2.1.2. Identificación de progenitores hematopoyéticos………………………………………..14 2.1.3. Hemopatías malignas……………………………………………………………………………………17 2.1.3.1. Mieloma Múltiple (MM)………………………………………………………………………..18 2.1.3.2. Leucemia mieloide aguda (LMA)…………………………………………………………19 2.2. El Sistema endocannabinoide……………………………………………………………………………..24 2.2.1. Receptores cannabinoides…………………………………………………………………………...25 2.2.2.Agonistas cannabinoides……………………………………………………………………………..28 2.2.2.1. Fitocannabinoides…………………………………………………………………………28 2.2.2.2. Endocannabinoides (eCB)……………………………………………...……………..29 2.2.2.3. Cannabinoides sintéticos………………………………………………………………30 2.2.3. Antagonistas ……………………………………………………………………………………………..30 2.2.4. Mecanismos de acción del receptor CB2 ………………………………………………..31 2.3. Uso clínico de los cannabinoides………………………………………………………………………….32 2.4. Metabolismo en hemopatías malignas………………………………………………………………...34 2.4.1.Ceramidas y esfingolípidos……………………………………..……………………………………34 2.4.1.1. Síntesis de ceramidas…………………………………………………………………….37 2.4.1.2. Efecto de los cannabinoides en el metabolismo de ceramidas…..38 2.4.2. Metabolismo en LMA………………………………………………………………………………….39 2.4.2.1 Glucólisis………………………………………………………………………………………..40 2.4.2.1.1. Glucólisis en LMA……………………………………………………………42 2.4.2.2. Vía de las pentosas fosfatos…………………………………………………………43 2.4.2.3. Metabolismo mitocondrial en LMA……………………………………………..44 2.4.2.4. Ciclo de Krebs……………………………………………………………………………….46 2 Abreviaturas 3 1. Abreviaturas 2-AG 2-DG 2-HG 6AN 7-AAD α-KG ΔΨm 2-araquidonilglicerol 2-deoxyglucosa 2-Hidroxiglutarato 6-aminonicotinamida 7-aminoactinomicina D α-ketoglutarato Potencial de membrana mitocondrial A AA ADN ADNmt ADP ARN ARNt AEA AIF Antimicina A Ácido desoxiribonucléico Ácido desoxiribonucléico mitocondrial Adenosín difosfato Ácido ribonucleico Ácido ribonucleico de transferencia Anandamida Factor de inducción de apoptosis (Apoptosis Inducing Factor) AMPc AMPK AraC ATCC ATP Adenosín monofosfato cíclico Proteína quinasa activada por AMP (Activated protein kinase) Citarabina American Type Culture Collection Adenosín trifosfato B Bcl-2 Bcl-XL BER BSA B-cell lymphoma 2 B cell lymphoma extra large Reparación por escisión de bases (Base excision repair) Albúmina de suero bovino (Bovine serum albumin) C C1P C1PP CB1 CB2 Ceramida-1-Fosfato Ceramida-1-Fosfato fosfatasa Receptor cannabinoide tipo 1 Receptor cannabinoide tipo 2 Abreviaturas 4 CBD CCCP Cdc CEEA CEIC CerS CI CK CLP CMH CMP CPM CR Cannabidiol Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone Célula dendrítica convencional Comité Ético de Experimentación Animal Comité Ético de Investigación Clínica Ceramida sintasa Combination index Ceramida kinasa Progenitor común linfoide (Common lymphoid progenitor) Célula madre hematopoyética Progenitor común mieloide (Common myeloid progenitor) Célula plasmática mielomatosa Complete remission o remisión completa D DAPI DDR DES DH-CerS dhSph DMEN DMS DMSO DSB DSMZ 4 ',6-diamidino-2-fenilindol Respuesta al daño del ADN (DNA damage response) Dihidroceramida desaturasa Dihidroceramida sintasa Dihidroesfingosina Dulbecco's Modified Eagle Medium Dimetil succinato Dimetilsulfóxido Rotura de doble cadena del ADN (Double strand DNA breaks) Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (Del alemán, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) E ECAR Tasa de acidificación extracelular (Extracellular acidification rate) eCB Endocannabinoide eCS Sistema endocannabinoide EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EM Esclerósis múltiple Abreviaturas 5 F FAAH FACS FB1 FBS FDA FLT-3 FITC FS FCCP Amida hidrolasa de ácido graso Fluorescence-activated cell sorter Fumonisina B1 Suero bovino fetal (Fetal bovine serum) Administración de Medicamentos y Alimentos Receptor de la tirosina kinasa tipo III (Fms related tyrosine kinase 3) Fluoresceína isotiocianato Forward scatter Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone G G6PDH GAPHD GCS G-CSF GFP GLUT1 GlyR GMP GPCR GvHD Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa Glucosilceramida sintasa Factor estimulante de colonias de granulocitos Proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein) Transportador de glucosa 1 (glucose transporter 1) Receptor de glicina Progenitor granulo-monocítico (Granulocyte-monocyte progenitor) Receptor acoplado a proteínas G Enfermedad injerto frente a huésped (Graft versus host disease) H H202 HPC HK HSC HR Peróxido de Hidrógeno Célula progenitora hematopoiética (Hematopoietic progenitor cell) Hexokinasa Célula madre hematopoyética (Hematopoietic stem cell) Recombinación homóloga (Homologous recombination) I IDH IMDM IMiD Isocitrato dehydrogenasa Medio de cultivo Dulbecco modificado de Iscove Inmunomodulador Abreviaturas 6 L LC-MS-MS LD50 Lin LK LKS LMA LSC LT-HSC Cromatografía líquida con espectrometría de masas Dosis letal media Marcadores de linaje Lin-/c-Kit+/Sca-1- cells Lin-/c-Kit+/Sca-1+ cells Leucemia mieloblástica aguda Célula madre leucémica (Leukemic stem cell) Célula madre hematopoyética con capacidad de reconstititución a largo plazo M MAGL MAPK MEP MM MO MOMP MP MPP MS Myr Monoacilglicerol lipasa Proteína cinasas activadas por mitógenos Megakaryocyte-erythroid progenitor Mieloma Múltiple (Multiple Myeloma) Médula ósea Mitochondrial outer membrane permeabilization Metil Piruvato Célula progenitora multipotente (Multipotent progenitor cells) Espectrometría de masas (Mass spectrometry) Miriocina N NAD+ NADH NADP+ NADPH NAM NAMPT NF-KB NHEJ NMN NSG Nicotinamida adenina dinucleótido Nicotinamida adenina dinucleótido reducido Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido Nicotinamida Nicotinamida Fosforibosiltransferasa Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas Unión de extremos no homólogos, (Non-homologous DNA end joining) Nicotinamida mononucleótido NOD scid gamma mouse Abreviaturas 7 O OAA OCR OXPHOS Ácido oxalacético (Oxalacetic acid) Tasa de consumo de oxígeno (Oxygen consumption rate) Fosforilación oxidativa (Oxidative phosphorylation) P PAR PARP PBS PCNA PCR pDC PE PE-Cy7 PFK PGI PGM PI3K PK PPAR PPP PKA Poli ADP-ribosa Poli ADP-ribosa polimerasa Solución salina tamponada con fosfato Antígeno nuclear de células en proliferación Reacción en cadena de la polimerasa Célula dendrítica plasmacitoide Ficoeritrina Ficoeritrina-cianina 7 Fosfofructoquinasa Glucosa-6-fosfato isomerasa Fosfoglucomutasa Fosfatidilinositol 3-kinasa Piruvato kinasa Receptor activado por proliferadores peroxisomales (Peroxisome proliferator activated receptors) Vía de las pentosas fosfato (Pentose phosphate pathway) Proteína quinasa A R R5P RC RE ROS Rot RPMI Ribulose 5-phosphate Remisión completa Retículo endoplásmico Especies reactivas de oxígeno (Reactive oxygen species) Rotenona Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute Abreviaturas 8 S S1P S1PP SK SMasa SMS SNC SP Sph SphK SPL SPF SPT SS SSB ST-HSC Esfingosina-1-fosfato Esfingosina 1-fosfato fosfatasa Esfingosina kinasa Esfingomielinasa Esfingomielina sintasa Sistema nervioso central Sangre periférica Esfingomielina Esfingomielina quinasa Esfingosina-1-fosfato liasa Zona libre de patógenos específicos Serina C-palmitoiltransferasa Side scatter Single-Stranded DNA Binding Protein Célula madre hematopoyética con capacidad de reconstitución a corto plazo T TBS TCA THC TMRE TPI TRPV1 TTBS Tris buffer salino Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Tricarboxylic acid cycle) Δ9-tetrahydrocannabinol Tetrametilrodamina Triosa fosfato isomerasa Receptor vaniloide tipo I Tris buffer salino-Tween U UA UPN UPR URF Unidades arbitrarias Unique patient number Unfolded protein response Unidades relativas de fluorescencia Abreviaturas 9 W WB WBC WIN-55 WT Western blot White blood cell WIN-55 212-2 mesylate Wild type Nota: en la mayoría de abreviaturas se ha mantenido la nomenclatura en inglés por ser la de uso habitual 10 11 INTRODUCCIÓN Introducción 18 como a avanzar en las aplicaciones clínicas de trasplantes, terapia génica, expansión de células madre y eliminación de células tumorales(Bonnet, 2002). El análisis genómico ha influido en el diagnóstico y el tratamiento de las neoplasias hematológicas.(Taylor et al., 2017) En el trabajo de la presente tesis doctoral, nos centramos en el mieloma múltiple, cuyo evento clonal afecta a la estirpe linfoide en su último estadío de diferenciación, y en la leucemia aguda mieloblástica, que afecta a las células más inmaduras de estirpe mieloide. Estas patologías, a pesar de afectar a células en extremos opuestos del proceso de diferenciación, comparten una característica común como mostraremos a continuación: su sensibilidad al efecto pro-apoptótico de los derivados cannabinoides. 2.1.3.1. Mieloma Múltiple El mieloma múltiple (MM) es una hemopatía maligna que se define por la presencia de células plasmáticas monoclonales que producen una paraproteína monoclonal, dando lugar a algunas manifestaciones clínicas características como anemia, insuficiencia renal, hipercalcemia o lesiones óseas (síntomas conocidos como “CRAB”)(García-sanz et al., 2007; Rajkumar et al., 2014) . En el momento del diagnóstico, el síntoma clínico prevalente es anemia normocrómica-normocítica, presente en ~75% de los pacientes, mientras que la leucopenia y la trombocitopenia se encuentran con menos frecuencia(Bruns et al., 2012; Kyle et al., 2003). En cuanto a su incidencia, es la segunda neoplasia maligna hematológica más frecuente (aproximadamente el 10%), y representa el 1% de todos los cánceres, causando el 2% de las muertes por cáncer(Laubach et al., 2010; Rajkumar et al., 2014). La edad media de los pacientes en el momento del diagnóstico es de unos 65 años.(Rajkumar, 2018) Los pacientes con MM presentan una reducción significativa de células progenitoras en la MO, en particular de MEP, los cuáles presentan alteraciones funcionales con respecto a su capacidad clonogénica y de autorrenovación a largo plazo, así como su actividad proliferativa. Por lo tanto, el agotamiento de las HSC en la MO de pacientes con MM no solo se debe a un desplazamiento poblacional, sino que también resulta de un deterioro funcional(Bruns et al., 2012). Introducción 19 La célula plasmática maligna surge de una célula B madura que ha pasado por el centro germinal del folículo linfoide y ha sufrido el proceso de hipermutación somática, (Tripodo et al., 2011). Respecto a la expresión de antígenos celulares estudiados mediante citometría de flujo, a diferencia de la célula plasmática normal (CD38+ high, CD19+ y CD56-), el fenotipo de la célula plasmática mielomatosa es IgS-, IgC+, CD38+ low, CD138+ (Syndecan-1), CD19-, CD56+ (San Miguel et al., 1995) Durante muchos años, el melfalán y la prednisona han representado el estándar en la terapia del MM, seguidos de trasplante de células madre hematopoyéticas (Laubach et al., 2010). En los últimos años, las mejoras terapéuticas aportadas por fármacos inmunomoduladores (IMiDs del inglés “ Immunomodulatory Drugs ”, como la talidomida, lenalidomida y pomalidomida), inhibidores del proteasoma (como bortezomib, carfilzomib e ixazomib), y el avance de la inmunoterapia con la generación de nuevos anticuerpos monoclonales dirigidos (como elotuzumab y daratumumab), han permitido un progreso notable en el control de esta enfermedad, aumentándose el tiempo medio de supervivencia de 3 a 9 años. Sin embargo, todavía se considera incurable(K. C. Anderson & Carrasco, 2011; Shah et al., 2020). Por lo tanto, se están dedicando grandes esfuerzos a descubrir nuevos fármacos con el fin de mejorar el arsenal terapéutico actualmente disponible. 2.1.3.2. Leucemia mieloide aguda La leucemia mieloide aguda (LMA) es causada por un trastorno clonal en las células madre hematopoyéticas del linaje mieloide. (Büchner et al., 2009; Estey et al., 2006). La LMA se caracteriza por la aparición de aberraciones cromosómicas recurrentes y mutaciones, que se pueden agrupan en 8 grandes grupos de acuerdo a la clasificación propuesta por Döhner et al, 2015 (Figura 3): - Mutaciones en genes de señalización, como el gen del receptor de la tirosina quinasa de clase III (FLT-3), que confieren una ventaja proliferativa a través de la vía de señalización RAS-RAF, JAK–STAT y PI3K –AKT. - Mutaciones en factores de transcripción mieloides como RUNX1 y fusiones de factores de transcripción por reordenamientos cromosómicos, como la Introducción 20 traslocación t(8; 21) (q22; q22); RUNX1-RUNX1T1, que conducen a la desregulación transcripcional y diferenciación hematopoyética alterada. - Mutaciones en el gen de la nucleofosmina (NPM1), que codifica una proteína de transporte nucleocitoplasmático multifuncional, que dan como resultado la localización citoplasmática aberrante de NPM1 y de las proteínas que interactúan con NPM1. - Mutaciones en genes del complejo del espliceosoma como SRSF2, SF3B1, U2AF1 y ZRSR2, que están involucradas en el procesamiento desregulado de ARN. - Mutaciones en genes del complejo de cohesina, como STAG2 y RAD21, que pueden afectar a la segregación cromosómica precisa y a la regulación transcripcional. - Mutaciones en genes implicados en la homeostasis epigenética de las células, como las descritas en ASXL1 o en EZH2, que conducen a la desregulación de la modificación de la cromatina (p. Ej., Metilación de las histonas H3 y H2A en los residuos de lisina K79, K27, y K119, respectivamente), así como la fusión del gen KMT2A-MLLT3, que puede dañar otras transferasas de grupos metilo como DOT1L (DOT1-like histona H3K79 metiltransferasa). - Mutaciones en DNMT3A y TET2, así como mutaciones en IDH1 e IDH2, actuando a través de la producción del oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2-HG), que puede conducir a la desregulación de la metilación de las regiones del ADN que contienen 5-metilcitosina (5mdC) y su producto de desmetilación 5-hidroximetil citosina (5hmdC). - Mutaciones en genes supresores de tumores como TP53, las cuales pueden conducir a la desregulación y posterior degradación a través de MDM2 y PTEN. Esta heterogeneidad de las LMA plantea un gran desafío terapéutico(J. Chen et al., 2010) Para el diagnóstico de la LMA se emplean diferentes técnicas, como el estudio morfológico, el inmunofenotipado, y los estudios genéticos y moleculares(Döhner et al., 2010; Löwenberg et al., 2003). Introducción 21 Figura 3. Clasificación de los distintos grupos de LMA según las aberraciones cromosómicas recurrentes y mutaciones propuesta por Döhner (NEJM 2015). La identificación de la LMA por citometría de flujo es compleja debido a la heterogeneidad de pacientes y subtipos de la enfermedad. Los marcadores aceptados para la identificación de cada subtipo, junto con otros criterios de diagnóstico que han sido aceptados recientemente aparecen en la Tabla 1.(Arber et al., 2022; Khoury et al., 2022) Introducción 22 TIPOS CRITERIO DE DIAGNÓSTICO LMA con diferenciación mínima • Los blastos son negativos (<3%) para MPO y SBB por citoquímica • Expresión de 2 o más antígenos asociados a mieloides, como CD13, CD33 y CD117 LMA sin maduración • ≥3% de blastos positivos para MPO (por inmunofenotipado o citoquímica) o SBB y negativos para NSE porcitoquímica • Las células en maduración del linaje granulocítico constituyen <10% de las células nucleadas de la MO • Expresión de dos o más antígenos asociados a mieloides, como MPO, CD13, CD33 y CD117 LMA con maduración • ≥3% de blastos positivos para MPO (por inmunofenotipificación o citoquímica) o SBB por citoquímica • Las células en maduración del linaje granulocítico constituyen ≥10 % de las células nucleadas de la MO • Las células de linaje de monocitos constituyen <20 % de las células de la médula ósea • Expresión de dos o más antígenos asociados a mieloides, como MPO, CD13, CD33 y CD117 Leucemia basófila aguda • Blastos y basófilos inmaduros/maduros con metacromasia en la tinción con azul de toluidina • Los blastos son negativos para MPO, SBB y NSE citoquímicos • Sin expresión del equivalente fuerte de CD117 (para excluir la leucemia de mastocitos) Leucemia mielomonocítica aguda • ≥20 % de monocitos y sus precursores • ≥20 % de células granulocíticas en maduración • ≥3 % de blastos positivos para MPO (mediante inmunofenotipificación o citoquímica) Leucemia monocítica aguda • ≥80 % de monocitos y/o sus precursores (monoblastos y/o promonocitos) • <20 % de células granulocíticas en maduración • Blastos y promonocitos que expresan al menos dos marcadores monocíticos, incluidos CD11c, CD14, CD36 y CD64, o positividad de NSE en citoquímica Leucemia eritroide aguda • ≥30 % de células eritroides inmaduras (proeritroblastos) • Médula ósea con predominio eritroide, por lo general ≥80% de la celularidad Leucemia megacarioblástica aguda • Los blastos expresan al menos una o más de las glicoproteínas plaquetarias: CD41 (glucoproteína llb), CD61 (glucoproteína IIIa), o CD42b (glucoproteína lb)b Tabla 1. Expresión de marcadores citoplasmáticos y de superficie celular para el diagnóstico de LMA. *Los criterios de diagnóstico compartidos incluyen: - ≥20% de blastos en médula ósea y/o sangre (excepto leucemia eritroide aguda). - No se cumplen criterios para tipos de LMA con alteraciones genéticas definidas. Introducción 23 - No se cumplen los criterios para la leucemia aguda de fenotipo mixto (relevante para la LMA con diferenciación mínima). - No cumplir con los criterios de diagnóstico de neoplasia mieloide post terapia citotóxica. - Sin antecedentes de neoplasia mieloproliferativa. MO (médula ósea), MPO (mieloperoxidasa), NSE (esterasa no específica), SBB (Sudan Black B). (Adaptado de Khoury et al, 2022). En cuanto al pronóstico, solo el 40-55% de los adultos mayores de 60 años logran una remisión completa (RC), con pésimas tasas de supervivencia a largo plazo(Shipley & Butera, 2009). Entre los pacientes más jóvenes, el 60-80% logra la RC con la terapia estándar(Löwenberg et al., 2003). Sin embargo, solo el 20-30% tiene una supervivencia libre de enfermedad a largo plazo(Tallman et al., 2005). En la última década, las opciones de tratamiento para la LMA se han expandido como resultado del descubrimiento de nuevas dianas moleculares, pero la mayoría de ellos se encuentran aún en fase de ensayo clínico(DiNardo & Wei, 2020; Kayser & Levis, 2018). Introducción 24 Figura 4. Resumen de los nuevos fármacos usados en la práctica clínica de la LMA. Para los pacientes sin comorbilidades en ausencia de una diana terapéutica, CPX-351 puede ser la opción preferida para la terapia en pacientes con LMA con displasia y gemtuzumab ozogomicina (GO) podrían añadirse a la terapia convencional, especialmente para pacientes con LMA con factor de unión al núcleo (CBF). Para los pacientes que no son aptos para la quimioterapia intensiva, es probable que las opciones de tratamiento dirigido y no dirigido se utilicen más ampliamente en el futuro en combinación con Ara-C en dosis bajas (LDAC) o agentes hipometilantes (HMA). (Adaptado de Di Nardo & Wei, Blood 2020) La identificación de dianas terapéuticas es una tarea de rutina tanto en el momento del diagnóstico como durante la progresión de la enfermedad. Como se describe en la figura 4, se debe considerar a los pacientes por su idoneidad para la terapia intensiva frente a la no intensiva. (DiNardo & Wei, 2020). A pesar de estos avances, para la gran mayoría de pacientes, el régimen de inducción estándar se basa en la combinación de un agente específico del ciclo celular, como es la citarabina 100 mg / m2 en infusión continua durante 7 días y una antraciclina, como la daunorrubicina a concentraciones que van desde 45 a 60 mg/m2/d por vía intravenosa durante 3 días, régimen que se lleva usando desde hace más de 40 años(Crowther et al., 1970; Dillman et al., 1991; Tallman et al., 2005; Yates et al., 1982). Por tanto, la identificación de nuevos compuestos activos en el tratamiento de esta enfermedad es, al igual que en el mieloma múltiple, una necesidad médica insatisfecha. 2.2. El Sistema endocannabinoide Los cannabinoides son componentes activos de la planta Cannabis sativa (marihuana) y sus derivados. El interés terapéutico sobre los cannabinoides surgió después del descubrimiento de un complejo sistema endocannabinoide (eCS) en humanos(Mackie, 2008; Onaivi, 2008), el cual está constituido por ligandos endógenos (endocannabinoides), junto con sus receptores y las proteínas responsables de su síntesis, transporte y degradación(Mackie, 2008; Malfitano et al., 2014; Velasco et al., 2012) Introducción 25 2.2.1. Receptores cannabinoides Hasta la fecha, se han identificado dos tipos de receptores cannabinoides específicos, el receptor CB1, clonado a partir de muestra de cerebro de rata en 1990(Matsuda et al., 1990), y el receptor CB2, obtenido a partir de la línea celular de leucemia promielocítica humana HL60, en 1993(Munro et al., 1993a). Ambos pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (Howlett, 2002)(Howlett, 2002; Pertwee et al., 2010). Los receptores CB1 se encuentran mayoritariamente en el cerebro y el sistema nervioso central, y en menor abundancia en sistema nervioso periférico y órganos(Mackie, 2008). Está implicado en la capacidad de reconocimiento y memoria, además del control de la función motora. Estos receptores también median muchos de los efectos psicoactivos de los cannabinoides(Mackie, 2008). Por otro lado, los receptores CB2 se encuentran principalmente en órganos periféricos, especialmente en células del sistema inmune y hematopoyético (Galiegue et al., 1995), que también expresan CB1 aunque en mucha menor medida(Howlett, 2002). Estudios de expresión génica del gen Cnr2 (gen que codifica para el receptor CB2) han revelado que se expresa en todas las células hematopoyéticas, pero sus niveles de expresión varían entre las poblaciones de células inmunes, al igual que en sus estados de activación o reposo. En los seres humanos, los niveles de expresión de Cnr2 entre las poblaciones de células inmunitarias es el siguiente: células B> células NK> macrófagos> células polimorfonucleares> células T CD8> células T CD4(Galiegue et al., 1995). Las funciones de los receptores cannabinoides incluyen la modulación de la liberación de citocinas, la migración de células inmunes y la estimulación del crecimiento en la mayoría de los linajes hematopoyéticos(Derocq et al., 2000; P. Valk et al., 1997). Se ha descrito que los receptores CB2 desempeñan diferentes funciones en el sistema immune y la respuesta inflamatoria. En macrófagos, la estimulación de CB2 suprime la proliferación y la liberación de citocinas IL-2, IL-12 y TNF-α, a la vez que induce la migración de células NK y suprime la migración y diferenciación de neutrófilos. Modelos murinos deficientes en CB2 muestran que la hematopoyesis en ratones CB2-/- parece ser completamente normal, a excepción de una linfocitosis leve y niveles ligeramente elevados de células progenitoras circulantes. Además, la movilización en Introducción 26 respuesta a estímulos farmacológicos (como Plerixafor o G-CSF), es indistinguible entre ratones silvestres y Cnr2 -/- y, en experimentos de trasplante en animales receptores irradiados las células de MO de animales Cnr2 -/- reconstituyen la hematopoyesis con una cinética similar a las células silvestres (Danner et al., 2019). Estructuralmente, el receptor CB2 está compuesto por una cadena polipeptídica, que contiene siete hélices-α transmembrana, con un extremo amino-terminal (NH2) extracelular y glicosilado, y un extremo carboxi-terminal (COOH) intracelular(Malfitano et al., 2014). El estado de fosforilación de CB2 se puede determinar mediante el uso de un anticuerpo policlonal específico que reconoce el COOH-terminal y que puede discriminar entre las isoformas de CB2 fosforiladas activas (fosforiladas en la serina 352) e inactivas (no fosforiladas en este residuo) (BOUABOULA et al., 1993; Galiegue et al., 1995; Malfitano et al., 2014). Además de activar los receptores CB1 y CB2, los cannabinoides también interactúan con otros receptores GPCR y canales iónicos. Algunos de ellos son: - Receptor vanilloide tipo 1 o TRPV1: Son canales catiónicos no selectivos que conducen el calcio y el sodio a una amplia variedad de tipos celulares en los mamíferos(Starkus et al., 2019). Están presentes en sangre, MO, lengua, riñones, hígado, estómago, vías respiratorias y neuronas, donde desempeñan un papel en la nocicepción debido a su capacidad de respuesta a nivel molecular a los metabolitos secundarios de las plantas que son nocimiméticos (p. Ej., Capsaicina) y a compuestos que son picantes e imitan sensaciones de ardor o enfriamiento (p. Ej., alicina, cinamaldehído, mentol). Algunos cannabinoides, incluidos la anandamida (AEA), Δ9-tetrahidrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD), cannabinol (CBN) y algunos compuestos minoritarios del Cannabis se unen a este receptor(Pertwee et al., 2010; Starkus et al., 2019). La activación cannabinoide de TRPV1 muestra una dependencia significativa de niveles externos de calcio. Otros canales de esta familia, como el TRPV2, TRPM8 y TRPA1 también muestran una activación diferencial con la exposición a cannabinoides.(Starkus et al., 2019) - GPR18: Es un receptor acoplado a proteína G (GPCR) que comparte una homología de secuencia baja con los receptores cannabinoides CB1 y CB2 (~13% Introducción 27 y 8% respectivamente). No obstante, se ha relacionado con el sistema endocannabinoide, ya que se ha demostrado que una variedad de cannabinoides endógenos, fitogénicos y sintéticos modulan este receptor. Se puede encontrar principalmente en la MO, el bazo y los ganglios linfáticos y, en menor medida, los testículos(Console-Bram et al., 2014; Morales et al., 2020; Pertwee et al., 2010). En los últimos años se ha demostrado el potencial terapéutico de GPR18, ya que la modulación de este receptor se ha asociado con procesos fisiopatológicos que incluyen dolor, fisiología del esperma, inmunomodulación, presión intraocular, metabolismo o cáncer(Morales et al., 2020) - GPR55: Otro receptor GPCR con capacidad de interactuar y ser modulado por ligandos cannabinoides, y que está altamente expresado en huesos, el yeyuno e íleon y el cerebro, en particular el cerebelo. En neuronas puede activarse por varios cannabinoides (THC, metanandamida, JWH-015, CP55940, AEA y 2-araquidonilglicerol (2-AG))(Mackie, 2008), aumentando el calcio intracelular e iniciando vías de señalización distintas a las que se activan por los receptores CB1 y CB2(Lauckner et al., 2008; Pertwee et al., 2010; Ryberg et al., 2007). - Receptores PPAR: Algunos cannabinoides activan las diferentes isoformas de los receptores PPAR (α, β y γ). La superfamilia PPAR participa en el metabolismo de los lípidos intracelulares mediante la regulación transcripcional de genes implicados en la captación, transporte y almacenamiento de lípidos en adipocitos, monocitos y macrófagos(Luo et al., 2020). La activación de todas las isoformas, pero principalmente PPARα y γ, media algunos (pero no todos) de los efectos analgésicos, neuroprotectores, de modulación de la función neuronal, antiinflamatorios, metabólicos, antitumorales, gastrointestinales y cardiovasculares de algunos cannabinoides, a menudo junto con activación de los sitios de acción diana más tradicionales, como los receptores cannabinoides CB1 y CB2 y el canal iónico TRPV1. Los PPAR también median algunos de los efectos de los inhibidores de la degradación o el transporte de endocannabinoides(O’Sullivan, 2016). Algunos endocannabinoides como la AEA Introducción 34 asociados con esclerósis múltiple. Sin embargo, Sativex está aprobado para su uso en Canadá y muchos países europeos. - Además, hay al menos cinco fármacos adicionales a base de cannabis que han finalizado o están en fase de ensayos clínicos en varios países.(Malfitano et al., 2014). 2.4. Metabolismo en hemopatías malignas 2.4.1. Ceramidas y esfingolípidos Los esfingolípidos son un tipo de lípidos bioactivos que se encuentran en las membranas celulares y desempeñan un papel fundamental en la transducción de señales para controlar funciones como el ciclo celular, senescencia, apoptosis, migración celular e inflamación. La esfingosina (2-amino-4-octadeceno-1,3-diol o Sph) y dihidroesfingosina (2- aminooctadecano-1,3-diol o dhSph), también conocida como esfinganina, son los bloques de construcción básicos de todos los esfingolípidos en mamíferos. Además, existen diferentes variantes de ceramidas dependiendo de la longitud de su cadena de ácidos grasos y la isoforma enzimática que la sintetiza. Por otro lado, algunas de las enzimas involucradas en la síntesis de ceramidas tienen actividad inversa y el metabolismo forma una "telaraña" donde diferentes rutas pueden converger y divergir en un mismo punto (Figura 6).(Espaillat et al., 2015) Enzimas tales como la ceramidasa, esfingomielinasa, fosfatasa C1P, fosfatasa S1p, ceramida o esfingosina quinasas o SphK1 tendrían una expresión / actividad anormal en células leucémicas promoviendo así un desequilibrio entre lípidos anti y proapoptóticos. Dentro de las células, la esfingosina-1-fosfato (S1P), la ceramida-1-fosfato (C1P) o la glucosilceramida podrían tener un efecto antiapoptótico, promoviendo la inflamación, la supervivencia celular, la angiogénesis e invasión celular; mientras que la ceramida y la esfingosina tienen el efecto opuesto, modulando la apoptosis, detención del ciclo celular y senescencia (Figura 7). (Hernández-Corbacho et al., 2017). Introducción 35 Figura 6. Esquema de las vías metabólicas de los esfingolípidos y su compartimentación subcelular. La síntesis de novo de esfingolípidos se origina en el retículo endoplásmico (RE), donde a través de una serie de reacciones de condensación y reducción se produce ceramida (Cer). La Cer también puede formarse en las membranas asociadas a las mitocondrias. La Cer generada de novo no se transporta por vesículas, sino por la proteína de transferencia de ceramida (CERT) y luego a través del transporte vesicular por la proteína adaptadora de cuatro fosfatos 2 (FAPP2) al Golgi. En el Golgi, Cer se modifica para formar esfingomielina (SM), ceramida-1-fosfato (C1P) y glucosilceramida (GluCer), esta última actúa como precursora de glucoesfingolípidos complejos (GSL). Después de la síntesis en el aparato de Golgi, la SM y el complejo GSL se envían a la membrana plasmática por transporte vesicular. Hay varias enzimas metabólicas de esfingolípidos presentes en la membrana plasmática para regular los niveles de SM, Cer, esfingosina (Sph) y esfingosina-1-fosfato (S1P). La S1P es producida por las isoenzimas 1 y 2 de la esfingosina quinasa (SK) y puede transportarse a través de la bicapa para señalizar a través del receptor S1P (no mostrado). Durante la endocitosis, los esfingolípidos de membrana se internalizan y transportan al lisosoma a través de vesículas endocíticas, donde la hidrólisis es catalizada por la esfingomielinasa ácida (aSMasa), ceramidasa ácida (aCDasa) y glicosidasa. La Sph puede ser fosforilada por SK para formar S1P y seguir el eje metabólico de la producción de Introducción 36 glicerolípidos regulada por la liasa S1P. Alternativamente, S1P puede pasar por la vía de rescate para la generación de Cer. Espaillat et al., 2015 Figura 7. Equilibrio entre ceramida-S1P en cáncer y terapia. Existe un equilibrio o reóstato entre la ceramida y la señalización de S1P en el cáncer. Un cambio hacia la acumulación de ceramidas conduce a efectos proapoptóticos, autofágicos, respuesta al estrés del RE y la no supervivencia, mientras que un cambio dinámico hacia la acumulación de S1P conduce a la supervivencia, tiene un efecto anti-apoptótico, metastásico y produce resistencia a los medicamentos (Adaptado de Selvam SP y Ogretmen B, 2013). La composición de esfingolípidos es variable a lo largo de la diferenciación hematopoyética en humanos, y variaciones en la homeostasis de esfingolípidos sirven para regular el destino de las HSC. La delta 4-desaturasa, esfingolípido 1 (DEGS1), por ejemplo, es una enzima esfingolípida necesaria para la función hematopoyética de las células madres y actúa activando la autofagia y la respuesta de proteína malplegadas (UPR, del inglés Unfolded Protein Response ).(Xie et al., 2019) En cuanto al papel de los esfingolípidos en neoplasias hematológicas, se ha descrito que la S1P puede actuar activando el factor de transcripción NF-κB en la línea celular de LMA U937(Shatrov et al, 1997)(Wallington-Beddoe et al., 2013), y se ha demostrado que los factores que promueven la proliferación en neoplasias hematológicas activan además a la esfingosina quinasa 1 (SPHK1), la cual se encuentra afectada en células de mieloma múltiple (Li et al, 2007a). Estos datos sugieren que tanto la S1P como la SPHK1 pueden ser dianas intracelulares interesantes para el desarrollo de medicamentos contra la leucemia(Vorbach et al., Introducción 37 2020). Por otro lado, se ha descrito que la sobreexpresión del receptor de la esfingosina-1-fosfato tipo 3 (S1P3) en células madre hematopoyéticas es suficiente para inducir leucemia mieloide trasplantable. Por el contrario, la sobreexpresión de S1P3 en las poblaciones más maduras no provocaron una transformación maligna. (Vorbach et al., 2020). 2.4.1.1. Síntesis de ceramidas La producción de esfingolípidos bioactivos está regulada en una red interconectada de reacciones en las que la producción de ceramidas se considera el eje central. Como podemos observar en la figura 8, la síntesis de novo de esfingolípidos bioactivos comienza con la condensación de serina y palmitoil CoA catalizada por la serina palmitoil transferasa (SPT) en la membrana del RE. Este paso inicial genera 3- cetosfinganina, que se reduce posteriormente a dihidroesfingosina. A continuación, la dihidroceramida sintasa (DH-CerS) genera dihidroceramida mediante la adición de un grupo acil CoA. Posteriormente, la dihidroceramida desaturasa (DES) produce ceramida a través de una reacción de desaturación. La ceramida se puede convertir en: esfingomielina, mediante la esfingomielina sintasa (SMS); glucosilceramida por la glucosilceramida sintasa (GCS) (y glucoesfingolípidos complejos) y fosforilada por la ceramida quinasa (CK) para formar ceramida-1-fosfato. La ceramida también se puede generar de forma recíproca mediante las actividades enzimáticas de la esfingomielinasa (SMasa), la glucocilceramidasa (GCasa) y la ceramida-1-fosfato fosfatasa (C1PP). Además, la ceramida puede desacetilarse mediante ceramidasas (CDasa) para formar esfingosina, la cual puede ser fosforilada por la esfingosina quinasa (SK) para formar esfingosina-1-fosfato (S1P) o acetilada por la ceramida sintasa (CerS) en la ruta de rescate para regenerar ceramida. Finalmente, la S1P se puede desfosforilar por la S1P-fosfatasa (S1PP) para generar esfingosina, o ser degradada de forma irreversible por la S1P liasa (SPL), generando glicerolípidos a través de la producción de etanolamina fosfato y hexadecenal(Espaillat et al., 2015). Introducción 38 Figura 8. Representación esquemática de la vía metabólica de los esfingolípidos. (Espaillat et al., 2015) 2.4.1.2. Efecto de los cannabinoides en el metabolismo de las ceramidas Estudios previos han sugerido que los cannabinoides pueden desempeñar su función a través de las ceramidas, promoviendo la síntesis de novo de las mismas y aumentado los niveles intracelulares de éstas. (Herrera et al., 2005; Sánchez et al., 2001)(Galve-Roperh et al., 2000; Gómez del Pulgar et al., 2002; M. Guzmán et al., 2001). La acumulación de ceramidas inducida por cannabinoides ha sido descrita en tumores del sistema nervioso central, específicamente en gliomas(Galve-Roperh et al., 2000; Velasco et al., 2012), así como en otros tumores sólidos tras el tratamiento con diferentes agentes quimioterápicos, como etopósido, estaurosporina, daunorrubicina o dexametasona(Grullich et al., 2000; Siskind, 2005). Sin embargo, aunque los mecanismos implicados en estos procesos aun se desconocen, se ha descrito que los esfingolípidos juegan un papel clave en la funcionalidad celular actuando como moléculas bioactivas que regulan la proliferación, diferenciación, supervivencia y apoptosis celular. Debido a que la ceramida es el bloque fundamental para la síntesis de los esfingolípidos, ha sido definida como la "coordinadora" de las respuestas, ejerciendo Introducción 39 como "directora" de orquesta en los procesos apoptóticos(Morad & Cabot, 2013). De hecho, la alteración del metabolismo de los esfingolípidos es un elemento clave en el desarrollo del cáncer, por lo que actualmente se considera un "sello de identidad" de las células tumorales, que logran evadir los mecanismos apoptóticos evitando la acumulación de ceramidas.(Zhou & Blom, 2015) . A pesar de la evidencia que apunta a la ceramida como coordinadora de la respuesta apoptótica a los cannabinoides (y otros agentes quimioterapéuticos), actualmente se desconocen los mecanismos que median la acumulación de ceramidas y los procesos que controlan la regulación del perfil y patrón de esfingolípidos. Esto se debe principalmente a que el estudio de los lípidos, conocido como lipidómica, se encuentra en sus etapas iniciales, a diferencia de otras disciplinas "ómicas", como la genómica y la proteómica. Lamentablemente, la naturaleza química de los lípidos ha sido un obstáculo inherente al estudio y caracterización funcional de los lípidos, que ha quedado relegada a un segundo plano en el campo de la oncología(Schmelzer et al., 2007). De hecho, el desarrollo de la lipidómica está ligado al desarrollo tecnológico, que solo en los últimos años ha permitido destacar la importancia de los lípidos en la biología de la célula. A la dificultad y poca accesibilidad para el estudio de los lípidos, se suma la alta complejidad del metabolismo de los esfingolípidos(Yusuf A. Hannun & Obeid, 2011). 2.4.2. Metabolismo en LMA Las HSC normales, las LSC y los blastos de LMA tienen perfiles metabólicos distintos y únicos. En comparación con la baja demanda de energía de las HSC normales, los blastos leucémicos requieren una mayor producción de adenosín trifosfato (ATP) para promover su mayor división celular y son más dependientes de vías metabólicas como la glucólisis y la vía de las pentosas fosfato (PPP) necesarias para producir los componentes básicos de las macromoléculas. Por el contrario, las LSC dependen más del metabolismo mitocondrial para mantener su viabilidad y autorrenovación(Mesbahi et al., 2022). Las vías metabólicas reprogramadas en LMA incluyen la glucólisis, la fosforilación oxidativa (OXPHOS), la síntesis de aminoácidos y la síntesis de lípidos (Figura 9). Introducción 40 Figura 9. Esquema simplificado de las vías del metabolismo celular importantes para la fisiopatología de la LMA. Los nombres en los recuadros marrones indican las principales vías metabólicas. GLUT, transportador de glucosa; G6P, glucosa-6-fosfato; R5P, ribosa-5-fosfato; F1P, fructosa-1- fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato; G3P, glicerol-3-fosfato; OAA, oxalacetato; a-KG, a-cetoglutarato; PPP, ruta de las pentosas fosfato; ALAT, alanina transferasa; GSH, glutatión; GSR, glutatióndisulfuro reductasa; GPX1, glutatión peroxidasa 1; FA, ácido graso; GLS, glutaminólisis; OXPHOS, fosforilación oxidativa. (Mesbahi et al., 2022) 2.4.2.1. Glucólisis La glucólisis es una vía de 10 pasos que convierte una molécula de glucosa en 2 de piruvato, con una producción neta de 2 moléculas de ATP, y en paralelo proporciona intermediarios para vías anabólicas. Cada paso de la reacción glucolítica es catalizado por una enzima o complejo enzimático específico. Algunas de estas enzimas Introducción 41 comprenden diferentes isoformas, que se expresan de una manera diferente dependiendo del contexto y del tejido, estando desreguladas en las células cancerígenas para contribuir a la glucólisis aeróbica. De estas enzimas, hay tres enzimas limitantes de la velocidad que se sabe que controlan el flujo glucolítico según las condiciones: hexoquinasa (HK), fosfofructoquinasa (PFK) y piruvato quinasa (PK)(Kreitz et al., 2019). Figura 10. Esquema de la glucólisis GLUT1, transportador de glucosa tipo 1; HK, hexokinasa; G6P, glucosa-6-fosfato; PGI, glucosa 6- fosfato isomerasa; F6P, fructosa-6-fosfato; PFK, fosfofructoquinasa; F1,6BP, fructosa-1,6-bifosfato; DHAP, fosfato de dihidroxiacetona; TPI, triosafosfato isomerasa; GAP, gliceraldehído-3-fosfato; GAPDH, gliceraldehído fosfato deshidrogenasa; G13BP, 1,3-bisfosfoglicerato; PGK, fosfoglicerato quinasa; 3PGA, 3-fosfoglicerato; PGM, fosfoglicerato mutasa; 2PGA, 2-fosfoglicerato; PEP, fosfoenolpiruvato; PK,piruvato quinasa; LDH, lactato deshidrogenasa. Introducción 42 La entrada de glucosa en las células se lleva a cabo mediante difusión facilitada a través de la familia de los transportadores de glucosa (GLUT). Una vez en la célula, la glucosa es fosforilada a glucosa-6-fosfato (G6P) por la enzima hexokinasa (HK) con el consumo de una molécula de ATP. La siguiente enzima glucolítica de la vía es la glucosa 6-fosfato isomerasa (PGI), que cataliza la reacción reversible de glucosa-6-fosfato a fructosa-6-fosfato (F6P), la cuál es convertida hasta fructosa-1,6-bifosfato (F1,6BP) por la fosfofructoquinasa (PFK). El fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) y el 3-fosfato de gliceraldehído (GAP) se crean a partir de la F1,6BP mediante la aldolasa. El DHAP se convertirá en GAP por la triosafosfato isomerasa (TPI), donde ahora las dos moléculas de GAP continuarán por el mismo camino. El gliceraldehído-3-fosfato se oxidará en una reacción exergónica a 1,3-bisfosfoglicerato (G13BP), reduciendo una molécula de NAD+ a NADH y H+. El G13BP se convertirá luego en 3-fosfoglicerato (3PGA) con la ayuda de la fosfoglicerato quinasa (PGK), junto con la producción de la primera molécula de ATP a partir de la glucólisis. Posteriormente el 3PGA se convertirá, con la ayuda de la fosfoglicerato mutasa (PGM), en 2-fosfoglicerato (2PGA). Con la liberación de una molécula de H2O, la enolasa producirá fosfoenolpiruvato (PEP) a partir de 2-PGA. Debido al estado inestable de la PEP, la piruvato quinasa (PK) facilitará la pérdida de un grupo fosfato para crear el segundo ATP en la glucólisis. Por lo tanto, PEP luego se convertirá en piruvato (Figura 10)(Lenzen, 2014). 2.4.2.1.1. Glucólisis en LMA Se ha descrito que la glucólisis aumenta en las células leucémicas. Curiosamente, las células que inician la leucemia dependen de un alto flujo glucolítico mediado por la activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), y la deleción de AMPK inhibe la proliferación de las células leucémicas al comprometer el flujo de glucosa a través de una menor expresión de GLUT1 y al aumentar el estrés oxidativo y el daño del ADN. El alto flujo de glucólisis también se correlaciona con un nivel disminuido de autofagia y la resistencia a fármacos, por lo que las terapias dirigidas frente a la glucólisis pueden ser, por tanto, una estrategia viable para el tratamiento de la LMA. Introducción 43 También hay que destacar la capacidad de las células de LMA para adaptar su metabolismo al microambiente que se genera en la MO, y es que, debido a su alto índice de consumo de glucosa, las células aumentan la expresión del transportador GLUT5 para contrarrestar su déficit en el medio, lo que les permite utilizar fructosa como sustrato alternativo para la glucólisis. Además, se ha descrito que un bloqueo de la absorción de fructosa reduce la leucemogénesis y potencia la citotoxicidad de la citarabina. Finalmente, las células leucémicas también controlan su mayor necesidad de glucosa independientemente de los mecanismos intrínsecos. La inducción de un "estado diabético" en el huésped, a través de la regulación de diferentes mecanismos que conllevan la supresión de la secreción de insulina, permite una mayor disponibilidad de glucosa para impulsar su propio crecimiento. Por tanto, la adicción de las células de LMA a la glucólisis, vía metabólica frecuentemente regulada al alza para acelerar su capacidad proliferativa, crea por tanto una vulnerabilidad metabólica que puede aprovecharse terapéuticamente.(Chapuis et al., 2019) 2.4.2.2. Vía de las pentosas fosfatos La vía de las pentosas fosfato es una vía metabólica que genera NADPH y pentosa. Los genes implicados en la PPP están también sobreexpresados en muchos tumores. En LMA, Chen et al. han estudiado las posibles alteraciones genéticas de los genes implicados en esta vía y comprobaron que estaban regulados positivamente en el 61% de los pacientes con LMA, estando sobreexpresados genes como G6PD, PFKL, PFKP y PGLS en todos los casos (Y. Chen et al., 2016). Por otro lado, la supervivencia de las células de LMA depende en gran medida de la glucólisis, que permite mantener un alto flujo de glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato, lo que convierte a la enzima que se encarga de este paso, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), en una posible diana terapéutica. De hecho, se ha visto que la sobreexpresión de G6PDH se correlaciona con un pronóstico adverso en la LMA, y se ha observado una actividad antileucémica de 6-AN, un inhibidor de la G6PDH(Y. Chen et al., 2016). Introducción 50 2.5.1.2. Regulador mitocondrial La hiperactivación exacerbada de PARP1 se caracteriza por un consumo excesivo de NAD+ nuclear acompañado de su agotamiento a nivel citosólico. Esta depleción de NAD+ compromete las funciones de las vías metabólicas dependientes de NAD+, como la glucólisis y el ciclo de Krebs (TCA), pudiendo culminar en un mal funcionamiento de la cadena respiratoria de electrones y la consecuente acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Figura 13). También se ha documentado que la permeabilidad mitocondrial inducida por ROS puede conducir a una pérdida de NAD+ intramitocondrial. Por tanto, la hiperactivación de PARP1 podría iniciar eventos que no solo agravan el daño de las mitocondrias, sino que también contribuyen a la generación de roturas adicionales de ADN monocatenario mediadas por ROS. Estos hallazgos inspiraron la idea de que los inhibidores de PARP podrían ejercer un efecto citoprotector limitando el agotamiento de NAD+ celular inducido por PARP1 y, en consecuencia, preservando la bioenergética mitocondrial. Figura 13. Efecto de la activación de PARP1 en la supervivencia celular. La actividad de PARP1 dependiente del daño en el ADN provoca la PARilación de proteínas dianas y la disminución de NAD+ y ATP. La PARilación en los sitios de daño del ADN promueve el reclutamiento de modificadores de cromatina y facilita la reparación del ADN. Mientras que la PARilación también suprime la glucólisis a través de la inhibición de HK, el consumo de NAD+ debido a la PARilación también inhibe la glucólisis. Como resultado, el Introducción 51 consumo de NAD+ por PARP1 desencadena un cambio general de dependencia metabólica a OXPHOS, lo que contribuye a la disminución de NADH. En respuesta al daño al ADN y a la activación de PARP1, la vía OXPHOS se convierte en fundamental para la reposición de ATP. (Adaptado de Murata et al, 2019). Otros estudios han planteado la posibilidad de que el efecto protector de la inhibición de PARP1 están mediados por la vía AKT/PKB. Aunque la relación entre el metabolismo y la vía AKT / PKB se ha conocido durante décadas, la implicación de esta vía en la mitocondria se describió por primera vez en 2003. (Cseh et al., 2017) 2.5.1.3. Actividad enzimática de PARP1 La poli(ADP-ribosil)ación (ó PARilación) es una modificación postraduccional de proteínas mediante la adición de cadenas lineales o ramificadas de unidades del monómero ADP-ribosa. Usando NAD+ como donador de ADP-ribosa, las proteínas PARPs transfieren estos residuos a las cadenas laterales de los residuos de arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, lisina, serina y tirosina de las proteínas diana(Gibson & Kraus, 2012). La enzima central para la producción de polímeros de poli (ADP-ribosa) (PAR) en células y la principal diana de la poli (ADP-ribosil)ación durante el daño del ADN es PARP1. (Alemasova & Lavrik, 2019) Se ha visto que la síntesis de PAR mediada por PARP1, pero no el agotamiento directo de NAD+, bloquea la glucólisis y conduce a la pérdida de ATP. Estos hallazgos apoyan un modelo en el que la hiperactivación de PARP1 conduce a la inhibición y deslocalización de la hexoquinasa-1, causando una reducción de la glucólisis y el agotamiento del ATP celular.(Fouquerel, Goellner, Yu, Gagné, Moura, et al., 2014). 2.5.1.4 Parthanatos: Muerte mediada por AIF La muerte celular mediada por PARP se denomina parthanatos, en referencia al polímero de poli (ADP-ribosa) (PAR), que es el producto de la activación de PARP1 y “ thanatos ”, que es la personificación griega de la muerte y la mortalidad. (Harraz, et al., 2008). Parthanatos es un proceso que depende de la actividad de PARP y no requiere la mediación de las caspasas para su ejecución, pero es claramente dependiente de la translocación nuclear del factor inductor de apoptosis asociado a mitocondrias (AIF). Introducción 52 AIF es una flavoproteína NADH oxidasa normalmente anclada a la membrana mitocondrial interna, contribuyendo al mantenimiento del complejo I. La sobreactivación de PARP provoca la poli (ADP-ribosa)ribosilación excesiva y conlleva la translocación nuclear de la proteína AIF mitocondrial, que causa una fragmentación del ADN a gran escala (50 kb) y la condensación de la cromatina, y conduce a la muerte celular(Fatokun et al., 2014)(Heeres & Hergenrother, 2007) (Figura 14). El polímero PAR generado tras la sobreactivación de PARP1 está considerado como la molécula clave en la cascada de señalización de parthanatos(Andrabi et al., 2006). Figura 14. Esquema de los efectos producidos tras la muerte celular dependiente de la sobreactivación de PARP1 o parthanatos. 2.5.2. Inhibidores de PARP: Olaparib En base a su papel central en la maquinaria de reparación nuclear, PARP1 se considera una diana potencial para el tratamiento del cáncer, cuyas células presentan una maquinaria de reparación de corte de doble cadena defectuosa. De acuerdo con Introducción 53 este concepto, cánceres BRCA1/2 negativos son adictos a la función de PARP, cuya inhibición actuaría como un "segundo golpe” en el mal funcionamiento de la maquinaria de reparación celular, que daría lugar a inestabilidad cromosómica exacerbada que provocaría la detención del ciclo celular y la apoptosis. Esto llevó al desarrollo terapéutico de inhibidores de PARP y su aplicación para potenciar los agentes alquilantes antineoplásicos(Cseh et al., 2017). Olaparib (AZD-2281, Ku-0059436) es un inhibidor de PARP actualmente en investigación en pacientes con tumores sólidos. Está diseñado para actuar como un inhibidor competitivo de NAD+ en el sitio catalítico de PARP1 y PARP2, ambos miembros de la familia de enzimas PARP, que son fundamentales para la reparación de roturas de cadena sencilla del ADN (SSB) mediadas a través de la vía de reparación por escisión de bases (BER). La inhibición de la vía BER por Olaparib conduce a la acumulación de SSB no reparados, que tras la replicacion del ADN conduce a la formación de roturas de doble hebra (DSB) deletéreas, en ausencia de un mecanismo de recombinación homóloga (HR) funcional. En células con una vía de HR funcional, estos DSB se pueden reparar de forma eficaz. Sin embargo, en tumores con deficiencias de reparación de HR, Olaparib causa letalidad sintética a través de la combinación de dos eventos moleculares que de otra manera no son letales cuando se producen de forma aislada. Olaparib ya está aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer de ovario recidivante con mutación en BRCA, y se ha demostrado que proporciona beneficios clínicamente significativos entre estos pacientes. Olaparib también ha mostrado una actividad prometedora en pacientes con cáncer de mama o de próstata metastásico con mutaciones en BRCA en la línea germinal. Además de su uso como agente único, Olaparib también puede actuar como quimio y/o radiosensibilizador, debido a su capacidad para potenciar los efectos citotóxicos de estos agentes terapéuticos. Sin embargo, todavía no se ha demostrado un beneficio claro para el paciente con esta última aplicación.(Bochum et al., 2018). 54 55 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 56 Hipótesis y Objetivos 57 4. Hipótesis y Objetivos 4.1 Hipótesis Algunos estudios sugieren que los cannabinoides ejercen un efecto proapoptótico en distintos tumores, como el glioma. Si los receptores CB2 se expresan principalmente en células hematopoyéticas, y de forma más elevada en células tumorales que en sanas, el uso de derivados cannabinoides podría ser un tratamiento dirigido en hemopatías malignas. 4.2 Objetivos El objetivo principal de esta tesis es evaluar la utilidad potencial de los cannabinoides en el tratamiento de las hemopatías malignas, específicamente el mieloma múltiple (MM) y la leucemia mieloblástica aguda (LMA). Como objetivos secundarios: a) Evaluaremos el mecanismo de acción, y el perfil de toxicidad del derivado cannabinoide WIN-55 212,2. También se evaluará la expresión de receptores cannabinoides en las distintas estirpes celulares y se comprobará si esta expresión está relacionada con los efectos de los cannabinoides. b) Se determinarán las vías de señalización celular implicadas en el efecto de los cannabinoides. Particularmente evaluaremos su efecto sobre el metabolismo celular. c) Analizaremos el efecto de los cannabinoides sobre organelas específicas, concretamente mitocondria y retículo endoplásmico, evaluando el daño mitocondrial o estrés del retículo endoplasmático según proceda. Hipótesis y Objetivos 58 d) Por último, se evaluará el efecto de este fármaco en modelos murinos de mieloma múltiple y leucemia mieloide aguda, así como el posible efecto sinérgico con otros fármacos ya usados actualmente en clínica. 59 MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 66 Reactivos Western blot  Laemmli buffer (10x) - 30,3 gr Trizma (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) - 144 gr de Glicina (Bio-Rad) - 10 gr SDS (PanReac AppliChem, ITW Reagents)  Loading Sample Buffer (4x) - 4,4 ml de Tris (0,5 M, pH 6,8) - 4,4 ml de Glicerol (PanReac AppliChem, ITW Reagents) - 2,2 ml de SDS (20%) - 0,5 ml de Blue Bromoph (1%) - 0,48 ml de DTT (1 M)  TTBS - 1 L de TBS (1x) - 1 ml Tween® 20 (Sigma-Aldrich)  TBS (10x) - 24 g Tris Base (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) - 88 g NaCl - pH 7,6  RIPA Buffer - 3 ml de cloruro de sodio (5 M) - ml de Tris-HCl (1 M, pH 8.0) - 1 ml de Nonidet P-40 - ml de desoxicolato de sodio (10 %) - 1 ml de SDS (10 %) - Volumen restante hasta 100 ml de ddH2O 4.2.3. Anticuerpos Anticuerpos para Western Blot Marca Caspasa-2 Caspasa-8 Caspasa-9 Caspasa-3 activa p-Akt Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Materiales y Métodos 67 p-Erk p-p38MAPK p-JNK SPT CB1 CB2 Mcl-1 Bcl-xL PARP1 Bax Bak AIF beta-actina beta-tubulina Anticuerpos secundarios conjugados con HRP mouse Anticuerpos secundarios conjugados con HRP rabbit Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Cell Signaling Technology BD Biosciences BD Biosciences Cell Signalling Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Jackson ImmunoResearch Jackson ImmunoResearch Anticuerpos monoclonales de FACS Fluorocromo Marca Para ratón B220 FITC Immunostep B220 PE BD Pharmingen CD11b FITC Immunostep CD11b PE Immunostep CD11c FITC Immunostep CD127 BV510 BD Biosciences CD16/32 V450 BD Biosciences CD3 FITC eBioscience CD3 PerCP Cy5 BD Pharmingen CD34 APC eBioscience CD4 FITC Immunostep CD4 APC BD Biosciences CD45 APC BD Biosciences CD8 FITC BD Biosciences CD8 PE Immunostep C-Kit PerCP Cy5 BioLegend FLT3 PE Immunostep GR1 FITC Immunostep IgM APC BD Biosciences ScaI PE Cy7 BD Biosciences Ter119 FITC Immunostep Materiales y Métodos 68 Anticuerpos monoclonales de FACS Fluorocromo Marca Para humano 7-aminoactinomicina D (7-AAD) PerCP Cy5 BD Biosciences Annexin V PE BD Pharmingen CD45 CF-Blue Immunostep CD117 PE-Cy7 BD Pharmingen CD19 APC-Cy7 BD Pharmingen CD3 FITC BD Pharmingen CD33 APC BD Pharmingen CD34 FITC BD Biosciences HLA-DR V450 BD Biosciences CD138 FITC BD Pharmingen CD64 PerCP Cy5 BD Pharmingen CD34 APC BD Pharmingen CD56 PE Immunostep CD38 FITC BD Biosciences 4.2.4. Kits actividad enzimática Kit actividad enzimática Marca Hexokinase Colorimetric Assay kit (K789-100) Biovision Phosphoglucose Isomerase Activity Colorimetric Assay Kit( K775-100) Biovision Phosphofructokinase (PFK) Activity Colorimetric Assay Kit (K775-100) Biovision Aldolase Activity Colorimetric Assay Kit (K665-100) Biovision Enolase Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit Kit (K691-100) Biovision GAPDH Activity Assay Kit (K680-100) Biovision Phosphofructokinase (PFK) Activity Colorimetric Assay Kit (K776-100) Biovision Phosphoglucose Isomerase Activity Colorimetric Assay Kit (K775-100) Biovision Pyruvate Kinase Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit (K709-100) Biovision Triose Phosphate Isomerase (TPI) Activity Colorimetric Assay Kit (K670-100) Biovision Phosphoglycerate Kinase Activity Assay Kit (Colorimetric) (K194-100) Biovision 4.2.5. Programas informáticos Software Marca Infinicyt 2.0 Cytognos FLowJo v10 BD Biosciences Prism 7 GraphPad Materiales y Métodos 69 BioRender BioRender Transcriptome Analysis Console (TAC) Thermo Fisher Seahorse Wave Desktop Software Agilent SDS v2.4 Thermo Fisher ImageLab Bio-rad Adobe Photoshop Adobe Adobe Illustrator Adobe Image J National Institute of Mental Health CalcuSyn Biosoft 4.3. Métodos 4.3.1. Estudios de viabilidad celular y apoptosis in vitro. 4.3.1.1. Obtención y cultivo de células primarias de pacientes y donantes sanos Las médulas óseas de los pacientes con MM y LMA se diluyeron en suero fisiológico a una proporción 1:4 y se separó la fracción mononucleada mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll (1600 rpm durante 25 minutos). Tras la centrifugación, se recogió la interfase que contiene las células mononucleadas con pipetas Pasteur estériles tal como se muestra en la figura 15. Figura 15. Esquema de las distintas fases obtenidas tras centrifugación por gradiente con Ficoll. Materiales y Métodos 70 Posteriormente, se lavaron 2 veces con medio RPMI suplementado con 1% de antibiótico a 1200 rpm durante 10 minutos. Tras el segundo lavado, retiramos el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio RPMI. Luego, se procedió al recuento celular mediante cámara de Neubauer o contador celular Mythic 18 Vet (Orphée, Geneva, Plan-lesOuates, Switzerland). Para los concentrados leucoplaquetarios o buffy coat se siguió el mismo protocolo, aunque la proporción de dilución con suero fisiológico fue de 1:8. En el caso de las leucoaféresis, se realizaron 2 lavados con medio RPMI suplementado con 1% de antibiótico antes del uso de las células totales de la muestra. Hay que destacar que para los estudios con cannabinoides se usaron medios de cultivos sin SBF, ya que hay evidencias de que este puede interactuar con estos compuestos bloqueando en parte su acción.(Jacobsson et al., 2000) Como medida especial, durante la pandemia por Covid-19 se exigió que las células primarias usadas fueran de pacientes con una PCR negativa previa a su extracción o en caso de no tenerla, se le realizó a la muestra una PCR en el Servicio de Genómica del Instituto de Biomedicina de Sevilla antes del uso de las mismas. 4.3.1.2. Ensayo de proliferación “Cell Counting Kit-8 (CCK-8)” 4.3.1.2.1. Líneas celulares Las líneas celulares estudiadas se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano (50.000 células/pocillo) en un volumen final de 100 µL de medio, ya sea IMDM o RPMI según la línea celular, evitando usar los pocillos de los bordes de la placa cuya deshidratación puede influenciar los resultados. Las dosis usadas y tiempo de incubación con los fármacos se detallan en cada experimento. En los experimentos de tratamientos de cannabinoides combinados con Materiales y Métodos 71 inhibidores o antagonistas, estos últimos se administraron 1 hora antes a menos que se detalle lo contrario. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo colorimétrico usando el reactivo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) según las instrucciones del fabricante para la determinación de la viabilidad celular en ensayos de proliferación celular y citotoxicidad. Este kit se basa en la reducción de la sal de tetrazolio WST-8 mediante las actividades deshidrogenasas de las células, para formar el colorante formazán de color amarillo. La cantidad de colorante formazán, es directamente proporcional al número de células vivas. Elegimos este kit ya que la sensibilidad de detección de CCK-8 es más alta que las otras sales de tetrazolio como MTT, XTT, MTS o WST-1. Las densidades ópticas se midieron a 450 nm usando un lector de placas MultiskanTM Go Microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Cada condición se sembró por triplicado en la placa de 96 pocillos y se realizaron al menos 3 experimentos independientes en cada caso. 4.3.1.2.2. Células sanas Para los estudios de viabilidad en células sanas, se aisló cada población de interés antes de sembrarla. Para ello, las células HSC (CD34+) provenientes de la leucoaféresis se aislaron usando el kit de aislamiento celular de Myltenyi basado en bolas magnéticas conjugadas con anti-CD34. El mismo proceso se llevó a cabo con las células mononucleadas provenientes del buffy coat para aislar los linfocitos T (CD3+) y linfocitos B (CD19+) usando los kits con bolas magnéticas conjugadas con anti-CD3 y anti-CD19 respectivamente. Materiales y Métodos 72 Se realizó el protocolo recomendado por el fabricante para cada uno de los kits y, una vez obtenidos las poblaciones celulares puras se procedió a sembrarlas en las mismas condiciones que las líneas celulares. En el caso de las células primarias tanto sanas como patológicas, el tiempo máximo de incubación con el fármaco fue de 18 horas, ya que fue el tiempo máximo al que no observamos muerte celular en las condiciones controles al usar un medio sin suplemento de suero o citoquinas adicionales. 4.3.1.3. Estudios de sinergismo La evaluación del sinergismo entre el cannabinoide WIN-55 y otros fármacos utilizados en el mieloma múltiple o en la LMA, como dexametasona, melfalán o citarabina, se realizó evaluando la viabilidad celular mediante ensayos con Cell Counting Kit-8. La eficacia de la combinación se cuantificó con el Software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO), que se basa en el método de Chou Talalay y calcula un índice de combinación (CI), donde los valores de CI entre 0 y 0,9 se asocian a sinergismo, los valores entre 0,9 y 1,1 a aditividad y los mayores a 1,1 a antagonismo(Chou, 2010). 4.3.1.3. Estudios de viabilidad por FACS 4.3.1.3.1. Líneas celulares Los estudios de viabilidad por citometría de flujo se realizaron usando el kit de Anexina V / 7AAD, según las instrucciones del fabricante (BD Biosciences). Este kit se basa en la deteccion del fosfolípido fosfatidilserina, que se transloca desde el interior al exterior de la membrana plasmática en células apoptóticas, exponiéndose así al entorno celular externo, a la vez que se forman poros en la misma. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos que tiene una alta afinidad por la Materiales y Métodos 73 fosfatidilserina y se une a las células con esta expuesta, mientras que la 7AAD es un compuesto químico fluorescente con una fuerte afinidad por el ADN, que se une a este cuando la membrana plasmática está dañada. De esta forma, las células viables serían Anexina V-/7AAD-, las que entran en apoptosis temprana serían Anexina V+/7AAD- y las células muertas Anexina V+/7AAD+. Tras la tinción con estos compuestos se analizó las muestras en un citómetro de flujo FACS Canto II (BD Biosciences) y se analizó con el software FlowJo. Para este estudio se sembraron 100.000 células por condición en un volumen final de 200 µL de medio en placas de 96 pocillos con fondo curvo, que fueron usadas directamente para realizar el marcaje con la 7AAD y la Anexina V y se usó como soporte para la adquisición de células en el citómetro usando el adaptador para placa. 4.3.1.3.2. Células primarias En el caso de células primarias, ya sean normales, de MM o LMA, se sembraron las células mononucleares o de leucoaféresis totales sin seleccionar previamente. En este caso, se sembraron 1x106 células por condición siempre que la cantidad de muestra lo permitió (en el caso que la cantidad no fuese suficiente se adaptó el número de células a las condiciones propuestas para el estudio). Para analizar la viabilidad celular de la población de interés, el marcaje específico para cada una de ellas se incluyó junto al marcaje con 7AAD y Anexina V. Las células plasmáticas mielomatosas se identificaron usando una combinación de anticuerpos (CD138, CD64, CD34, CD56, CD38, y CD45) como muestra la estrategia de análisis resumida en la Figura 16. Materiales y Métodos 74 Muestra con vehículo Muestra con 50 µM de WIN-55 Figura 16. Identificación de células plasmáticas mielomatosas en muestras de MO de pacientes con MM. Los blastos provenientes de la MO de pacientes con LMA se identificaron con la combinación de anticuerpos monoclonales contra los antígenos asociados a estas células en el momento del diagnóstico (CD33, CD34, CD117, HLA-DR y CD45) como se muestra en la Figura 17. Materiales y Métodos 75 Figura 17. Identificación de blastos prodecentes de MO de pacientes con LMA En el caso de las células provenientes del buffy coat, la viabilidad celular de los linfocitos T y B se estudió usando una combinación de anticuerpos contra CD45, CD3 y CD19 como se muestra en las gráficas de la Figura 18. Figura 18. Identificación de linfocitos T (CD3+) y linfocitos B (CD19+) por FACS procedentes de buffy coats de donantes sanos en condiciones control. Por último, para la identificación de las HSC se realizó un marcaje contra CD45 y CD34 (Figura 19). Materiales y Métodos 82 4.3.2.3.3. Estudio de progresión de la enfermedad. Para el estudio del efecto del fármaco en los primeros estadíos de la enfermedad en este modelo (5 días) se inyectó células HL60-Luciferesa a un grupo de ratones (n=7 por cada condición), y cuando se confirmó la infiltración de las células por bioluminiscencia se trataron con vehículo y 5mg/kg/día de WIN-55 durante 5 días. Transcurrido este tiempo, los ratones se sacrificaron y se analizó el tamaño del bazo y la infiltración de células CD45+ humanas en sangre periférica (SP), bazo y médula ósea (MO) después de esos 5 días de tratamiento. 4.3.3. Extracción de ARN y PCR Cuantitativa El ARN total se aisló utilizando el kit de QIAamp RNA Blood Mini (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se generó a partir de 2 mg de ARN total usando SuperSript IV VILO System (Invitrogen). Se utilizó una solución de ADNc (diluida 1:10; 2 ml) como plantilla para la PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR). Los productos génicos se cuantificaron mediante qPCR con el sistema de PCR en tiempo real 7500 FAST de Applied Biosystems. Los valores se normalizaron a la expresión del gen ABL humano. Cada experimento se realizó por triplicado. La secuencia de oligonucleótidos de ABL y sondas Taqman utilizadas se tomaron de la literatura (Gabert et al., 2003) y se enumeran a continuación: Fw ABL (ENF1003): 5´TGG AGA TAA CAC TCT AAG CAT AAC TAA AGG T 3´ RV ABL (ENR1063): 5´GAT GTA GTT GCT TGG GAC CCA 3´ ABL sonda (ENP541): 5´CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A 3´ Las sondas TaqMan CNR2 Hs00275635_m1 y CNR1 Hs00275634_m1 (TermoFisher Scientific) se utilizaron para la expresión de los genes CB2 y CB1, respectivamente. Materiales y Métodos 83 4.3.4. Microarrays Para estudiar la diferencia de expresión de genes, 1x106 células HL60 se trataron con WIN-55 (50 µM) o con su respectivo vehículo durante 6 horas. Posteriormente, las células se lavaron 2 veces con PBS frío, para descartar restos del tratamiento y el ARN se extrajo usando el kit de extracción de ARN de Qiagen siguiendo las indicaciones del proveedor. Una vez extraído, el ARN fue cedido al Servicio de Genómica del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), donde se amplificó y se marcó utilizando el kit de reactivos GeneChip® WT PLUS (Thermo Fisher Scientific, Inc.) La amplificación se realizó con 100 ng de ARN total siguiendo los procedimientos descritos en el manual del usuario del kit. El ADNc amplificado se cuantificó, fragmentó y marcó para realizar la posterior hibridación con GeneChip® Clariom S Human Array (Thermo Fisher Scientific, Inc.) utilizando 5,5 μg de producto de ADNc monocatenario y siguiendo los protocolos descritos en el manual del usuario. El lavado, la tinción (GeneChip® Fluidics Station 450, Thermo Fisher Scientific, Inc.) y el escaneo (GeneChip® Scanner 3000, Thermo Fisher Scientific, Inc.) se realizaron siguiendo los protocolos descritos en el manual del usuario para matrices de cartuchos. 4.3.5. Estudios de expresión de proteínas 4.3.5.1. Western blot Para el estudio de expresión de proteínas de interés mediante WB, la línea celular HL60 se incubó con una concentración de 50 µM de WIN-55 o su correspondiente vehículo a diferentes tiempos de incubación (0, 2, 6, 18 y 24 h de tratamiento). Las células se lisaron de acuerdo con Gilbert et al.(Gilbert et al., 2002), usando un buffer de lisis compuesto por 20 mM de tampón Tris-HCl (pH 7.3), conteniendo además DTT (2 mM), ASB (1%), NP-40 (1%), NaCl (150 mM), Na3VO4 (1 Materiales y Métodos 84 mM), NaF (10 mM) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) y 10% de cocktail inhibidor de proteasas (Roche, Mannheim, Germany) en los casos en los que se estudió proteínas de membranas, o se lisaron con RIPA suplementado con inhibidores de proteasas y nucleasas en el resto de casos. Las muestras se incubaron 30 minutos en hielo y posteriormente se centrifugaron a 13000 r.p.m. durante 15 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y la concentración de proteínas se cuantificó utilizando el Kit BCA (Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rocford, IL, USA). Los extractos de proteínas (15-30 μg) se separaron mediante electroforesis SDS/PAGE en geles prefabricados AnykD Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Polyacrylamide Gels SDS (Bio Rad, Hercules, CA) usando un amperaje constante de 20 Amperios/ gel y se transfirieron a membranas de PVDF utilizando el sistema Trans-BlotVR TurboTM (Bio-Rad). Posteriormente, las membranas fueron bloqueadas con solución de bloqueo (2% de BSA, Tween-20 al 0.1% en TBS ó TTBS) seguido de una incubación durante toda la noche a 4ºC con los anticuerpos primarios de interés. Al día siguiente, se retiró los anticuerpos primarios y tras varios lavados con TTBS se procedió a incubar 1-2 horas con el anticuerpo secundario adecuado. Luego se realizaron varios lavados con TTBS para eliminar los restos de anticuerpo secundario y un último lavado con TBS antes de proceder a la detección de las proteínas por quimioluminiscencia. La detección de los anticuerpos se realizó por quimioluminiscencia con las soluciones del Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology) en ChemiDocTM Touch Imaging System (Bio-Rad) y el análisis de las imágenes y la cuantificación/normalización de la proteína con en el software Image Lab (Bio-Rad). Materiales y Métodos 85 Para el estudio de la expresión de AIF en diferentes localizaciones celulares, realizamos además un subfraccionamiento celular previo al Western blot para evaluar la expresión de dicha proteína en el citoplasma, mitocondria y núcleo celular. Tras realizar un pretratamiento con Olaparib, y posteriormente un tratamiento de 6 o 18 horas con WIN-55 a una dosis de 50 µM, se recogieron las células y lavaron en 10 mL de PBS frío centrifugando a 1200 r.p.m durante 10 minutos. Para la purificación de mitocondrias se usó el kit de aislamiento de mitocondrias Thermo Scientific para células cultivadas, mientras que para el citoplasma y núcleo se usó el kit de fraccionamiento subcelular de proteínas para células cultivadas de Thermo Scientific siguiendo las indicaciones del fabricante en ambos casos. 4.3.5.2. Inmunofluorescencia Las células tratadas con WIN-55 durante 2 y 6 horas se recogieron y se colocaron en portaobjetos. En el caso de las ceramidas, la tinción por inmunofluorescencia se realizó como describieron previamente Vielhaber et al.(Vielhaber et al., 2001) utilizando anti-ceramida como anticuerpo primario. El anticuerpo para la ceramida se obtuvo de Sigma-Aldrich. El anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 era de Abcam. Con respecto a la condición de control, las células se trataron con DMSO (<0,15%) en medio RPMI 1640 de Gibco (Gaithersburg, MD). Para la determinación de los niveles de ser139-H2AX o de poly(ADP)ribosilación, las células se centrifugan, se lavan con PBS, se fijan en una solución de PBS +formaldehido 4% y se permeabilizan en PBS+0.2% triton-X-100 durante 2 minutos. Las células se lavan con PBS, se bloquean en solución de bloqueo (PBS + 3% FBS) durante 30 min, y se incuban posteriormente con los anticuerpos primarios de interés (anti ser139-H2AX ó Materiales y Métodos 86 anti PAR) diluidos 1:1000 en solución de bloqueo durante 1 h. Tras la incubación, las células se lavan 3 veces con PBS + 0.25% Tween-20 durante 5 min cada una. Tras los lavados, las células se incuban con el anticuerpo secundario (1:5000 en solucion de bloqueo) durante 1,5 horas. Trascurrido el timepod e incubación, las células se lavan tres veces en PBS + 0.25% Tween-20 durante 5 min cada una. Finalmente, las células se montan en portaobjetos usando medio de montaje Prolong conteniendo DAPI. 4.3.6. Estudios de daño mitocondrial 4.3.6.1. Análisis del potencial de membrana mitocondrial La pérdida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se evaluó mediante marcaje con TMRE de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las líneas celulares U266, HL60 y U937 se expusieron a 50 µM de WIN-55 durante 15, 30, 45 y 60 min y luego se incubaron durante 20 min a 37ºC con TMRE, que se acumula en las mitocondrias activas. La tinción de TMRE se analizó a 549/575 nm (Ex/Em) mediante espectrofotometría de fluorescencia en microplacas. Se utilizó cianuro de carbonilo mclorofenilhidrazona (CCCP) como control para inducir la pérdida de ΔΨm. 4.3.6.2. Estudio de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) Las células tratadas con WIN-55 (50 µM) (106 células/ensayo) ó con el vehículo respectivo se incubaron durante 15 ó 30 minutos a 37ºC, y se tiñeron con la sonda MitoSOX [Molecular Probes (Invitrogen)] a una concentración de 5 µM para detectar el superóxido mitocondrial. La señal de MitoSOX se detectó mediante citometría de flujo según recomendaciones del fabricante. Materiales y Métodos 87 4.3.7. Estudios metabólicos 4.3.7.1. Cuantificación de ceramidas Las líneas celulares HL60, KG-1a y U937 (20x106 células/condición) se trataron con WIN-55 (50µM) y/o inhibidores de ceramidas durante diferentes períodos de tiempo y los lípidos se extrajeron con una solución 2:1 de cloroformo / metanol(Folch et al., 1987). En los extractos clorofórmicos de los lisados celulares se incluyeron patrones internos (20 µL) de C17:0 y se secaron bajo una corriente constante de nitrógeno a temperatura ambiente. Las muestras reconstituidas se analizaron utilizando un sistema de cromatografía líquida Agilent (Serie 1200) que consta de una bomba binaria (G1312A), conectada a un espectrómetro de masas API 2000 de triple cuadrupolo (Applied Biosystems) utilizando una interfaz de ionización por electropulverización en modo de ionización positiva (ESI +). Las distintas ceramidas se separaron en una columna Zorbax Eclipse XDB-C1 de Agilent. Los iones precursores y del producto se usaron con fines de cuantificación y confirmación, y las condiciones de funcionamiento se resumen en la Tabla 4. Ceramida Transición observada DP FP EP CE CXP 14:0 492.5  264.3 86 370 8 31 6 492.5  82.2 86 370 8 69 2 492.5  56.1 86 370 8 69 6 16:0 520.5  264.2 121 370 9 33 6 520.5  82.2 121 370 9 69 2 520.5  55.0 121 370 9 95 6 18:0 548.6  264.4 86 370 9 37 6 548.6  82.0 86 370 9 83 8 548.6  55.0 86 370 9 97 6 18:1 546.5  264.3 106 370 8.5 37 6 546.5  82.2 106 370 8.5 75 2 546.5  55.1 106 370 8.5 101 6 20:0 225.2  55.1 31 360 10 53 6 225.2  61.1 31 360 10 35 8 Materiales y Métodos 88 225.2  100.2 31 360 10 23 4 22:0 604.5  264.3 136 370 12 35 6 604.5  82.2 136 370 12 87 2 604.5  55.1 136 370 12 111 6 24:0 632.5  264.3 146 250 11 37 6 632.5  82.2 146 250 11 91 2 632.5  55.1 146 250 11 109 6 24:1 630.5  264.2 136 370 9.5 45 8 630.5  82.2 136 370 9.5 75 0 630.5  67.0 136 370 9.5 123 0 17:0 (IS) 534.4  264.3 101 370 10 37 6 534.4  82.2 101 370 10 77 2 534.4  55.1 101 370 10 103 6 Tabla 4. Optimización de las transiciones MRM para la detección de ceramidas. (DP: declustering potential; FP: focusing potential; EP: entrance potential; CE: collision energy; CXP: cell exit potential; IS: Internal Standard). 4.3.7.2. Tasa de consumo de oxígeno (OCR) y tasa de acidificación extracelular (ECAR) La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de las células U937, HL60 y CD34+ humanas se determinó utilizando un analizador Seahorse XFp (Agilent, Santa Clara, Estados Unidos). Los cartuchos del sensor XFp (Agilent, Santa Clara, Estados Unidos) se hidrataron durante la noche anterior con 200 µL de ddH2O a 37 °C en un incubador sin CO2. Dos horas antes de su uso, el ddH2O se retiró y se añadió 200 µL de la solución calibrante XF (Agilent, Santa Clara, Estados Unidos) y se incubó a 37 °C en un incubador sin CO2. Brevemente, las líneas celulares U937 y HL60 se trataron con: i) vehículo, ii) WIN-55 100 µM durante 30 min o iii) Olaparib 10 µM durante 1 h y WIN-55 100 µM durante 30 min. Las células humanas primarias CD34+ se trataron con WIN-55 (100 µM) y se sembraron 3x105, 4x105 y 3x105 células, respectivamente, en 180 µL de medio Eagle modificado de Dulbecco (XF DMEM) en cada pocillo de la placa de cultivo celular de Seahorse de 8 Materiales y Métodos 89 pocillos, y se dejaron en reposo durante 30 min antes del análisis. Las mediciones de oxígeno y protones se realizaron durante 110 min, siguiendo el protocolo programado. También se determinó la tasa de consumo de oxígeno basal y la tasa de acidificación extracelular basal. Además, las lecturas de OCR y ECAR se normalizaron por millón de células.  Prueba de Mitostress La función mitocondrial se analizó mediante inyecciones secuenciales de oligomicina (2,5 µM), para bloquear la respiración acoplada a ATP; Cianuro de carbonilo mclorofenilhidrazona (CCCP, 0,3 μM), para desacoplar la cadena respiratoria y asegurar una respiración máxima completa; y 0,5 μM de rotenona + antimicina A (Rot / AA), para bloquear la respiración mitocondrial. Para esta prueba, se utilizó XF DMEM suplementado con L-glucosa 10 mM y L- glutamina 2 mM para células U937 y CD34+ humanas, y con L-glucosa 21 mM y L- glutamina 2 mM para células HL60. Figura 24. Esquema resumen del funcionamiento del ensayo para medir la función mitocondrial usando el kit Mito Stress Test para el analizador Seahorse XF de Agilent (Imagen tomada de la web de Agilent Technologies, Inc.). Materiales y Métodos 90  Test de estrés glucolítico Para el test de estrés glucolítico, las células se trataron con inyecciones secuenciales de glucosa 5 mM (10 mM en total), para forzar el proceso glucolítico celular; y 2- desoxiglucosa (2-DG) 100 mM, para inhibir la glucólisis. Para esta prueba, se usó XF DMEM suplementado con L-glutamina 2 mM. Figura 25. Esquema resumen del funcionamiento del ensayo para medir la función glucolítica usando el kit Glycolysis stress test para el analizador Seahorse XF de Agilent. En nuestro abordaje se ha obviado el uso de Oligomicina porque solo queríamos estudiar la glucólisis y no la capacidad glucolítica. (Imagen tomada de la web de Agilent Technologies, Inc.).  Interpretación de los resultados Las mediciones del analizador de flujo se realizaron por duplicado para las células U937 y HL60, y por triplicado para las células CD34+ humanas, y se repitieron al menos tres veces (n=3). La respiración mitocondrial se calculó de la siguiente forma: 1) La respiración no mitocondrial es la tasa después de la inyección de Rot / AA. Materiales y Métodos 91 2) Respiración mitocondrial basal: es la resta de la respiración no mitocondrial (valor OCR tras la inyección de rotenona+antimicina A) menos el OCR basal. 3) Respiración mitocondrial máxima: es la resta de la respiración no mitocondrial a la tasa de OCR después de las inyecciones de CCCP. 4) La glucólisis se calculó restando el valor de ECAR basal al valor del ECAR después de la segunda inyección de glucosa 5mM (es decir, 10mM de glucosa). 4.3.7.3. Actividad enzimática Las células HL60 y U937 se incubaron en presencia de WIN-55 (50 µM ó 100 µM) durante 6 horas, Olaparib 10 µM (durante 7 horas) o ambos (una preincubación de 1 hora con Olaparib + 6 horas con WIN-55). Las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS. Una vez lavadas, se resuspendieron en el volumen de tampón de ensayo requerido en cada kit de ensayo enzimático y se mantuvieron en hielo durante 10-20 minutos, dependiendo del kit de ensayo enzimático en cuestion. Tras centrifugar a 4 °C y 12.000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante resultante se utilizó para realizar el ensayo enzimático. Todas las enzimas de glucólisis se analizaron mediante diferentes kits de actividad enzimática (Biovision) según las instrucciones del fabricante. Por último, los resultados fueron normalizados por número de células. 4.3.8. Análisis Estadísticos A menos que se indique lo contrario, los experimentos se realizaron al menos tres veces de forma independiente. Para los análisis estadísticos, se utilizó el software SPSS versión 15.0 (Statistical Package for the Social Sciences, SPSS, Chicago, IL, EE. UU) y el software GraphPad Prism 5, y la significación estadística se definió como p ≤ 0,05. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). 98 Figura 28. A) Gráfico de puntos representativo y diagramas de barras de las distintas poblaciones celulares de MO de pacientes de MM tras el tratamiento ex vivo con dosis crecientes de WIN-55. Las células plasmáticas se identifican como CD38+, los linfocitos como CD45+ y las células granulomonocíticas como CD64+ tras las dosis indicadas de WIN-55 durante 18 horas. Se representa la media de los resultados obtenidos tras el estudio de viabilidad por FACS de todos los pacientes con MM estudiados (n=6). Los datos corresponden al porcentaje de células 7- AAD+. B) Viabilidad de las poblaciones desglosadas de linfocitos T y B en las mismas condiciones que las representadas anteriormente. Los valores medios de proliferación de las muestras control no tratadas se tomaron como 100%. * indica diferencias significativas con un valor de p ≤0,05. Además, analizamos el efecto antiproliferativo de WIN-55 sobre las células madre hematopoyéticas (CD34+) normales residuales de pacientes con MM y, sorprendentemente, la viabilidad celular de las células madre hematopoyéticas no se vieron afectadas por el tratamiento con WIN-55 (Figura 29). Figura 29. Análisis de la viabilidad celular en células madre hematopoyéticas (CD34+) previamente separadas por AutoMacs usando MicroBeads anti-CD34 después del tratamiento con WIN-55, mediante ensayo con CCK-8. Los valores medios de las muestras de control no tratadas se tomaron como 100%. Estos resultados indican que los cannabinoides tienen un efecto antiproliferativo y pro-apoptótico muy selectivo sobre las células mielomatosas, mientras que la viabilidad de las células sanas, incluyendo las células precursoras hematopoyéticas no se afectan tras la exposición a WIN-55. 0 20 40 60 80 100 120 140 CNT 0,5 µM 1 µM 10 µM 20 µM 50 µM % Viabilidad celular Células CD34+ 99 5.1.2. El efecto de WIN-55 está mediado por mecanismos apoptóticos. Para evaluar si el efecto antiproliferativo de WIN-55 está mediado por mecanismos apoptóticos, se analizó la expresión de las proteínas PARP, caspasas y otras proteínas pro / anti-apoptóticas (de la familia Bcl-2) en la línea celular de MM U266. El tratamiento con WIN-55 indujo la escisión de la forma completa de PARP de manera dependiente del tiempo, con un aumento concomitante del fragmento proteolizado de 89 kDa, que se convirtió en ligeramente detectable tras sólo 2 horas de exposición. Además, se evaluó la activación de la caspasa-3 usando un anticuerpo que reconoce sus formas escindidas de 17 kDa y 12 kDa, respectivamente. La expresión de ambas formas escindidas aumentó con el tiempo, en paralelo a la fragmentación de PARP. Esto indica que el efecto anti-proliferativo de WIN-55 es consistente con una inducción de la activación de la cascada de caspasas (Figura 30A). Con el fin de identificar las principales vías de apoptosis a través de las cuales WIN-55 ejerce su efecto pro-apoptótico, ya sea la vía intrínseca, la extrínseca o la asociada a estrés de retículo endoplasmático, se evaluó la expresión de las principales caspasas iniciadoras, Casp-9, Casp-8 y Casp-2, respectivamente. Como se muestra en la figura 30B, la expresión de las tres pro-caspasas disminuyó después de 2 h de exposición a los cannabinoides, pero sólo en el caso de la Casp-2 se detectó un fuerte aumento en la expresión de todas las formas escindidas. Por lo tanto, el procesamiento y la activación de Casp-2 fue mucho más notable que la observada para Casp-8 y -9. Para llevar a cabo un análisis aún más detallado de los mecanismos implicados en la apoptosis inducida por WIN-55, se analizaron varias proteínas de la familia Bcl-2, como MCL-1, Bcl-XL, Bax y Bak involucradas en el proceso de apoptosis. 100 Figura 30. Análisis mediante Western blot de la expresión de proteínas implicadas en procesos apoptóticos en células U266 tratadas con WIN-55 (50 µM) durante 0, 2, 6, 18 y 24 horas. (A) Perfil de la evolución temporal de la expresión de la caspasa 3 y su sustrato, PARP. (B) Expresión de las caspasas iniciadoras principales Casp-9, Casp-2 y Casp-8. La expresión de β-tubulina se utilizó como control de carga. (PRO ó full: Proteínas en su totalidad; CL: formas escindidas). 101 El estudio de expresión por Western blot (Figura 31) mostró un aumento notable de los reguladores pro-apoptóticos Bak y Bax, mientras que el nivel de expresión de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-xL y MCL-1, disminuyó con el tiempo. Figura 31. Western blot de las proteínas de la familia Bcl-2 Bak, Bax, Bcl-xL y Mcl-1 de células U266 tras el tratamiento con WIN-55 (50 µM) durante el tiempo indicado. La expresión de βtubulina se utilizó como control de carga. Para determinar si el el efecto pro-apoptótico de WIN-55 está mediado por la activación de las caspasas descritas anteriormente, las células se preincubaron con o sin el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD con anterioridad al tratamiento con WIN-55. Como se muestra en la figura 32, Z-VAD inhibió la apoptosis inducida por cannabinoide en las líneas U266 y RPMI. A B C FIGURE 3 WIN-55 (50M): A B C FIGURE 3 WIN-55 (50M): 102 FIGURE 4 WIN-55 (50M): Figura 32. Viabilidad celular de las líneas celulares (A) U266 y (B) RPMI después de la incubación con un inhibidor de pan-caspasa (PC) y / o WIN-55 (W) a las dosis indicadas en cada caso durante 18 h mediante ensayos con CCK-8. Los valores medios de las muestras de control no tratadas se tomaron como 100%. * indica diferencias significativas con un valor de p ≤0,05. Todos estos resultados muestran que el efecto del cannabinoide WIN-55 en las células de MM está, al menos en parte, mediado por mecanismos apoptóticos, siendo posiblemente la vía de la Casp-2 la activada más fuertemente. 5.1.3. Vías de señalización alteradas por la exposición de las células mielomatosas a WIN-55 Con el fin de explorar las vías de señalización implicadas en la inducción de la apoptosis por WIN-55, se evaluó el perfil de expresión y fosforilación de las quinasas p- JNK, p-Erk1/2, p-38, MAPK, p-Akt mediante western blot (Figura 33). El tratamiento de la línea celular U266 con el cannabinoide WIN-55 incrementó ligeramente la fosforilación de p-JNK y p-Erk1/2, mientras que la activación de la vía pp38-MAPK disminuyó moderadamente. Curiosamente, WIN-55 también indujo una regulación al alza de p-Akt en momentos tempranos, mientras que, en tiempos más tardíos, los niveles de expresión mostraron una fuerte caída. Figura 33. Análisis de la expresión mediante Western blot de las proteínas fosforiladas p- Akt, p-Erk1/2, p-JNK y p-p38 en extractos de células U266 incubadas con 50 µM de WIN-55 en los tiempos indicados. Se utilizó α-tubulina como control de carga. 103 De acuerdo con estos resultados, WIN-55 modula diferentes vías implicadas en el equilibrio de la supervivencia / muerte celular. Además, la vía de Akt está fuertemente modulada y muestra una respuesta bifásica, con una activación a corto plazo y una regulación a la baja a largo plazo. 5.1.4. La síntesis de novo de ceramidas está involucrada en la apoptosis inducida por WIN-55 Se ha descrito que la acumulación de ceramidas sintetizadas de novo está implicada en el efecto pro-apoptótico de los cannabinoides en células de glioma(Velasco et al., 2005, 2012). Por ello, se evaluó la expresión de ceramidas mediante inmunofluorescencia en células de MM tras la exposición a WIN-55 (Figura 34). Figura 34. Microfotografía de tinción de ceramidas en células U266 sin tratar (izquierda) y tratadas con 50 µM de WIN-55 (derecha) durante 6 horas. Los resultados de este experimento mostraron un aumento notable en la expresión de ceramida total mediante inmunocitoquímica en las células U266 tratadas con WIN-55 en comparación con las células no tratadas. A B C D PARP 116 kDa tubulin PARP 85 kDa CNT WIN WIN +FB1 FIGURE 5 WIN-55 (50M): 104 Además, el nivel de expresión de serina palmitoiltransferasa (SPT), la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de novo de la ceramida, se incrementó en células U266 después de la incubación con WIN-55 (Figura 35). Figura 35. Western blot en células U266 tratadas con 50 µM de WIN-55 durante los tiempos indicados para la detección de SPT. La expresión de α-tubulina se utilizó como control de carga. Se observó un aumento moderado de la SPT a las 2h después del tratamiento con WIN-55, que alcanzó el nivel máximo a las 18h, coincidiendo con el punto de la inhibición de p-Akt en el tiempo. Para confirmar la implicación de este fosfolípido en la apoptosis inducida por cannabinoides, las células de MM se preincubaron con un inhibidor de la síntesis de ceramida, la fumonisina B1. Como se muestra en la figura 36A, el bloqueo farmacológico de la síntesis de ceramidas mediado por fumonisina B1, inhibe la fragmentación de PARP inducida por WIN-55 en células U266. Además, la fumonisina B1 revertió el efecto antiproliferativo inducido por el cannabinoide en U266 y RPMI, tal como se constató mediante CCK-8 (Figura 36B). 105 Figura 36. A) Niveles de expresión de PARP evaluados por Western blot en células tratadas con vehículo, 50µM de WIN-55 ó 50 µM de Fumonisina B1 (FB1) junto con el cannabinoide. Se utilizó α-tubulina como control de carga. (B) Análisis de la viabilidad celular mediante el ensayo CCK-8 en células U266 (izquierda) y RPMI (derecha) tratadas con WIN-55, FB1 o la combinación de ambos durante 18 h a las dosis indicadas. * indica diferencias significativas con un valor de p ≤0,05. (CNT, control; FB1, fumonisina B1). Estos datos confirmaron que la ceramida juega un papel clave en la apoptosis inducida por el cannabinoide WIN-55 en células de MM. 5.1.5. Efecto de WIN-55 en el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias Por otro lado, las células mielomatosas tienen un RE muy hipertrofiado, y presentan una intensa respuesta frente al estrés del retículo que les permite mantener su viabilidad. Por ello, se evaluó el efecto de WIN-55 en el estrés del RE en las células 106 U226. Para esto, estudiamos la expresión de distintas proteínas implicadas en la respuesta al estrés del RE por Western blot en la línea U266 (Figura 37). Figura 37. Estudio de la expresión de las proteínas involucradas en la respuesta al estrés del RE, como CHOP, ATF-4, p-IRE1 y XBP-1 en sus formas XBP-1s (escindida) y XBP-1u (no escindida) después del tratamiento con 50 µM de WIN-55 a los tiempos de tratamiento especificados. Se utilizó β-tubulina como control de carga. Contrariamente a nuestras expectativas, encontramos una disminución leve pero sostenida de la expresión de proteínas de estrés del RE como CHOP, ATF-4, p-IRE1 y XBP-1 s, en comparación con las células control, y un ligero aumento del nivel de XBP- 1u, lo que podría sugerir que los cannabinoides disminuyen o evitan la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) en células de MM. Es importante destacar que la pérdida de potencial de membrana mitocondrial (Δψm) es un punto de no retorno durante el proceso de apoptosis. Por lo tanto, evaluamos los cambios del Δψm en células U266 tratadas con WIN-55 y se observó un notable descenso del Δψm en células U266 tras 30 minutos de incubación, que siguió decreciendo ligeramente con el tiempo (Figura 38). 107 Figura 38. Evaluación del potencial de membrana mitocondrial en células U266 después del tratamiento con 50 µM de WIN-55, en los momentos indicados o CCCP como control positivo de la técnica. Las células se marcaron con TMRE y la señal se analizó con un lector de fluorescencia en placa usando el filtro con Em/Exc=485/538 nm. * indica diferencias significativas con un valor de p ≤0,05. (URF: unidades relativas de fluorescencia). 5.1.6. El efecto de WIN-55 en las células de MM está mediado por el receptor CB2 Para saber si el efecto proapoptótico de WIN-55 depende de los niveles de los receptores cannabionoides presentes en la célula, se evaluó la expresión de los receptores cannabinoides CB1 y CB2 en líneas celulares de MM, así como en las células normales hematopoyéticas (Figura 39). FIGURE 7 CB1 CB2 A B 114 de las subpoblaciones de células normales de donantes sanos no se vio afectada incluso a las dosis más altas testadas. Las líneas celulares más sensibles bajo nuestras condiciones de estudio fueron HL60 y U937, que presentaron una LD50 de 6,99 y 6,35 µM respectivamente tras 18 horas de incubación. Además, analizamos el efecto de WIN-55 sobre estas dos líneas celulares a diferentes tiempos de incubación y dosis más bajas (Figura 44). Figura 44. Estudio de viabilidad celular de las líneas HL60 y U937 mediante Cell Counting Kit-8 a diferentes tiempos (18, 48 y 72 horas) de incubación a dosis de 0-10 µM de WIN-55. Estos experimentos nos permiten concluir que el efecto antiproliferativo de WIN- 55 es dependiente de concentración y de tiempo de exposición al fármaco. Para comprobar el tipo de muerte celular producida tras la exposición a WIN-55, se realizaron estudios de viabilidad mediante citometría de flujo usando un marcaje con Anexina V y 7AAD. La figura 45 muestra cómo la frecuencia de células Anexina V+/7AAD+ incrementa de manera dosis dependiente, al igual que se observó en células Anexina V+/7AAD- a dosis más bajas (datos no mostrados), lo que indica que la muerte celular se produce a través de apoptosis. 115 A B Figura 45. A) Los gráficos de citometría corresponden a un ejemplo representativo del análisis de viabilidad de la línea HL60 por citometría de flujo a las 18 horas. Las condiciones control, 10 µM y 50 µM de WIN-55 se muestran en esta figura. B) Análisis de las células vivas (7AAD-/Anexina V-) tras el tratamiento con diferentes dosis de WIN-55 en las líneas HL60 y U937 a 18 horas. En todos los casos, los valores medios de viabilidad de las muestras control se tomaron como 100%. Los resultados son representativos de cuatro experimentos. *** indica diferencias significativas con un valor de p ≤ 0,0005. Por otro lado, quisimos estudiar si el efecto citotóxico de WIN-55 se producía de manera aguda tras su administración en las células o si era consecuencia de un periodo de tiempo prolongado en el medio de cultivo. Para ello, incubamos las células HL60 con altas dosis de WIN-55 (50-200 µM) durante solo 15 minutos, seguido de un lavado de las células y posterior incubación de las mismas en medio completo sin fármaco. La viabilidad celular se analizó 18 horas después mediante tinción con Anexina V/7AAD mediante citometría de flujo (Figura 46), y observamos que la viabilidad celular 116 se vio significativamente afectada tras 15 minutos de incubación con WIN-55 a las dosis testadas. A B Figura 46. A) Los gráficos de citometría corresponden a un ejemplo representativo del análisis de viabilidad por citometría de flujo en la línea HL60 expuesta a distintas dosis de WIN-55 durante 15 minutos y analizada a las 18 horas. Las condiciones control, 50 µM y 200 µM de WIN-55 se muestran en esta figura. B) Análisis de las células vivas (7AAD-/Anexina V-) tras el tratamiento con diferentes dosis de WIN-55 en la línea celular HL60 durante 15 min y analizadas a las 18 horas. En todos los casos, los valores medios de viabilidad de las muestras control se tomaron como 100%. Los resultados son representativos de cuatro experimentos. ** indica diferencias significativas con un valor de p ≤ 0,005 y *** p ≤ 0,0005. 5.2.2. WIN-55 ejerce un efecto heterogéneo en las células leucémicas primarias de pacientes con LMA, mediado principalmente a través del receptor CB2. Para determinar si el efecto antiproliferativo de WIN-55 se producía también sobre células leucémicas de pacientes, el efecto de WIN-55 ex vivo se examinó 117 mediante citometría de flujo sobre blastos obtenidos de 40 pacientes con LMA en el momento del diagnóstico. Se obtuvieron las células mononucleares de muestras de MO después de centrifugación en gradiente con Ficoll y se incubaron con WIN-55 durante 18 horas. Después del tratamiento, las células de LMA se identificaron con una combinación de anticuerpos monoclonales contra los antígenos asociados a las células de LMA en el momento del diagnóstico previamente descrita (Ver sección Materiales y Métodos 5.3.1.3.2). El análisis de viabilidad celular mediante tinción con Anexina V / 7AAD mostró una disminución notable (> 50%) en el 77,5% de los pacientes a una dosis de 50 µM de WIN-55 (Figura 47). Figura 47. Efecto de WIN-55 ex vivo. Se incubaron células mononucleadas de 40 pacientes de LMA con 10 µM y 50 µM de WIN-55 y se analizó la viabilidad celular mediante marcaje con 7AAD / Anexina V por FACS a las 18 horas. Cada línea de la gráfica se corresponde con un paciente. Los resultados muestran un patrón muy heterogéneo de respuesta, por lo que dividimos a los pacientes en tres grupos según su sensibilidad al efecto antileucémico de WIN- 55. 118 5.2.3. Relación entre la sensibilidad a WIN-55 y la expresión de receptores cannabinoides. Ante estos resultados, quisimos comprobar si el efecto heterogéneo producido por los cannabinoides se correspondía con los niveles de receptores cannabinoides expresados por cada paciente, por lo que analizamos los niveles de trasncripción de los receptores CB1 y CB2 en muestras de los pacientes mediante PCR cuantitativa (Figura 48). Figura 48. Correlación entre el efecto antileucémico de WIN-55 dectectado por citometría de flujo tras el tratamiento durante 18 horas a una dosis de 50 µM y los niveles de expresión de CB1 (R=-0,3714 y P=0,13) y CB2 (R=-0.5079 y P=0,0134) determinados por PCR cuantitativa. Estos niveles se relativizaron a los niveles obtenidos para la expresión del gen ABL (usado como housekeeping). Solo se usó las muestras de los pacientes con una infiltración en MO> 75% de blastos. 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0 20 40 60 80 100 mRNA CB1 (Niveles relativos) % Viabilidad celular 0.0 0.5 1.0 1.5 0 20 40 60 80 100 mRNA CB2 (Niveles relativos) % Viabilidad celular 119 Observamos cómo existe una correlación inversa entre la expresión de ambos receptores y la viabilidad celular tras el tratamiento con WIN-55 durante 18 horas, de manera que los pacientes con mayores niveles de expresión de receptor presentan una mayor sensibilidad al fármaco y, por tanto, una menor viabilidad. Los datos estadísticos muestran que sólo en el caso del receptor CB2 se produce una relación inversa significativa (p=0,0134), aunque los datos de CB1 también presentan una tendencia. Esto se puede deber a un menor número de pacientes incluidos en el caso de CB1, ya que, aunque se ha estudiado en el mismo número de pacientes, el nivel de expresión de CB1 en células del sistema inmune es indetectable en muchos casos. A continuación, examinamos la citotoxicidad inducida por WIN-55 en líneas celulares de LMA en presencia de antagonistas selectivos de CB1 o de CB2. Con ese fin, las células de la línea HL60 se expusieron a 10 µM de WIN-55 en presencia o ausencia del antagonista CB1 (LY320135) y / o CB2 (SR144528), y se determinó la viabilidad celular 18 h después (Figura 49). 120 Figura 49. Estudio de la viabilidad celular por CCK-8 en la línea celular HL60 tras 18 horas de incubación con los antagonistas cannabinoides CB1 (LY320135) y / o CB2 (SR144528) solos o en combinación con WIN-55 (10 µM). Los resultados muestran que el tratamiento con el antagonista selectivo de CB2 SR144525, inhibe significativamente la muerte celular inducida por el cannabinoide WIN-55, mientras que LY320135, selectivo de CB1, no mostró datos estadísticamente significativos, aunque muestra una tendencia similar. Cuando se combinaron ambos antagonistas el resultado fue similar al obtenido por el antagonista selectivo de CB2 por si solo, por lo que no se observó ningún efecto sinérgico entre ambos antagonistas. 5.2.4. Análisis genético de las mutaciones presentes en blastos de pacientes, y su relación con la sensibilidad a WIN-55 También quisimos estudiar la relación entre la respuesta al tratamiento con WIN- 55 en muestras primarias humanas con las mutaciones encontradas en los blastos de cada paciente. Para ello, los pacientes se categorizaron en tres grupos en relación a la función celular que desempeñan cada uno de los genes mutados (Figura 50): en verde, se muestran los pacientes que presentan mutaciones en los factores de transcripción (RUNX1 y CEPBα), en morado los genes implicados en proliferación y supervivencia (PTPN11, KIT, FLT3 Y KRAS), y en azul, los genes implicados en las modificaciones epigenéticas (NPM1, TET2, IDH1/2 y DNMT3α). La figura 50 representa la sensibilidad de los blastos de los distintos pacientes de LMA estudiados en relación a la función molecular que desempeñan los genes que se encuentran mutados en cada caso. 121 Figura 50. Representación de la correlación entre la sensibilidad de los blastos al tratamiento con WIN-55 tras incubar a una dosis de 50 µM durante 18 horas y las mutaciones que presentan dichos blastos de pacientes en el momento del diagnóstico. Cabe destacar que la mayoría de los pacientes presentan más de un gen mutado. (Los datos de cada paciente se encuentran detallados en la Tabla 3). Los resultados obtenidos en pacientes con LMA nuevamente muestran un patrón muy heterogéneo, donde no se observa una clara correlación entre la sensibilidad al fármaco WIN-55 y las mutaciones encontradas en cada paciente. Aunque en el caso de los pacientes con la mutación CEBPα se aprecia una mayor sensibilidad a WIN-55 y los pacientes con mutación en KRAS una mayor resistencia, sería pertinente aumentar el número de pacientes con dichas mutaciones en este estudio para corroborar dichos datos. 5.2.5. El cannabinoide WIN-55 tiene un potencial antileucémico potente y selectivo in vivo Para explorar el efecto de los cannabinoides sobre el crecimiento de células de LMA humanas in vivo , las células HL60 se inyectaron por vía intravenosa en ratones inmunodeprimidos NSG irradiados. Este experimento genera un modelo de leucemia aguda humana bastante agresivo (el tiempo máximo de supervivencia sin tratamiento 122 nunca superó los 20 días), que se caracteriza por una infiltración medular en las fases iniciales que se extiende posteriormente por el individuo completo. Fenotípicamente, estos ratones presentan esplenomegalia, pérdida de peso, piloerección, caquexia y parálisis de las patas traseras en la etapa final de la enfermedad. Para monitorizar la progresión de la enfermedad, una vez que se confirmó por citometría de flujo la infiltración de células humanas en MO, los ratones se asignaron a 4 grupos: ratones inyectados con células HL60 tratados con vehículo (HL60+vehículo), ratones con células HL60 tratados con 5 mg/kg/día de WIN-55 (HL60+WIN-55), ratones irradiados inyectados con medio RPMI y con el vehículo (Control+Vehículo), en lugar de células HL60, que no debían manifestar ningún síntoma excepto los provocados por el proceso de irradiación, y otro grupo control sin células tratado con WIN-55 (Control+WIN-55). Tras 5 días de tratamiento, los ratones se sacrificaron y el porcentaje de células humanas HL60 en MO, sangre periférica y bazo se cuantificó por citometría de flujo. Como podemos apreciar en la Figura 51, WIN-55 redujo el número de células HL60 humanas en SP, MO y bazo tras 5 días de tratamiento en comparación con el grupo de ratones tratados con vehículo. Figura 51. Estudio de la presencia de células CD45+ humanas en MO, SP y bazo de los ratones xenotrasplantados con células HL60 después de 5 días de tratamiento tras la confirmación de la enfermedad con vehículo o cannabinoide WIN-55 a una dosis de 5 mg/kg/día analizados por 123 citometría de flujo. Se usaron n=7 ratones en cada condición. * indica diferencias significativas con un valor de p ≤ 0,05 También se determinó el tamaño del bazo de los diferentes grupos de ratones después de 5 días de tratamiento para monitorizar la esplenomegalia típica de este modelo, que correlaciona directamente con la carga tumoral del ratón (Figura 52). Figura 52. A) Imagen representativa del tamaño medio de los bazos en cada grupo tras 5 días de tratamiento. B) Cuantificación media de las medidas tomadas a todos los ratones expresadas en cm. Se usaron n=7 ratones en cada condición. ** indica diferencias significativas con un valor de p ≤ 0,005 y *** p ≤ 0,0005 Observamos un aumento estadísticamente significativo del tamaño del bazo en ratones con el xenoinjerto de HL60 tratados con vehículo frente a ratones de los grupos controles sin enfermedad, mientras que los xenoinjertos de HL60 tratados con WIN-55 presentaron un tamaño del bazo similar a los del grupo control, lo que coincide con los datos que muestran una infiltración menor de células humanas en bazo tras el tratamiento con el cannabinoide. 130 Figura 59. Porcentaje de subpoblaciones de progenitores presentes en la fracción Linde la MO después del tratamiento con vehículo (CNT), 150 µg/kg/día de G-CSF más vehículo durante 3 días y sólo vehículo hasta llegar al día 7 (n=6), o G-CSF durante 3 días y luego 5 mg/kg/día de WIN-55 hasta el día 7 (n=8). Analizamos las subpoblaciones de células LKS presentes en la médula ósea (poblaciones de LKS de largo plazo (LT-HSC), de corto plazo (ST-HSC) y de progenitores multipotentes (MPP)), las subpoblaciones de LK (progenitor común mieloide (CMP), progenitores megacariocito/eritroides (MEP) y población de progenitores de granulocitos/ macrófagos (GMP)) y los progenitores comunes linfoides (CLP) mediante citometría de flujo. En todas las condiciones donde no se detalla la significancia estadística es porque los datos no fueron significativos. Los porcentajes hacen referencia a la fracción Linde la MO. 131 Sin embargo, en las poblaciones de HSC de la MO, que son poblaciones más dinámicas, sí se aprecia que el efecto de G-CSF sobre la proliferación de las células LTHSC y ST-HSC se suprime por la adición de WIN-55, bien porque WIN-55 esté actuando afectando la viabilidad de las células más proliferantes o que esté afectando al proceso de diferenciación celular de las HSC. 5.2.6. WIN-55 desregula procesos biológicos cruciales en las células de LMA. Para dilucidar las vías de señalización implicadas en el efecto antileucémico de WIN-55, realizamos un análisis de la expresión génica mediante microarrays en células HL60 tras el tratamiento con WIN-55 (la lista completa de genes afectados usando como criterio un Fold Change mayor a +/-2 se muestra en el Anexo I). Tabla 5. Vías celulares desreguladas en presencia de WIN-55 detectadas en base al sistema de clasificación de ontología genética (GO) y utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de los resultados obtenidos tras el estudio de microarrays de células HL60 tratadas durante 6 horas con 50 µM de WIN-55 frente a células control. (NES: Normalized enrichment score, FDR: False discovery rate) Tabla 5. Vías desreguladas afectadas tras el tratamiento de la línea HL60 con WIN-55 ID Descripción NES FDR Tamaño del conjunto Nº de genes Nº de genes de genes sobreexpre sados regulados a la baja GO:003 4976 Respuesta a estrés del RE 2,80682 166 9,92E -33 283 42 1 GO:000 8152 Procesos metabólicos - 1,32629 702 1,82E -26 10815 169 70 GO:000 6281 Respuesta celular a daño en el ADN - 1,62457 259 1,68E -07 525 4 5 GO:000 7005 Organización mitocondrial - 1,60948 036 3,77E -07 510 9 3 GO:000 8283 Proliferación celular - 1,29792 253 3,20E -06 1837 32 23 132 La agrupación de los genes expresados diferencialmente en procesos biológicos, basados en el sistema de clasificación de ontología genética (GO) y utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), reveló un enriquecimiento significativo de genes regulados hacia arriba o hacia abajo asociados con distintos procesos biológicos, como la respuesta a estrés del RE (regulación positiva), proceso metabólico (regulación negativa), reparación del ADN (regulación negativa), organización de la mitocondria (regulación negativa) o proliferación celular (regulación negativa) (Tabla 5 y Figura 60). Así, este análisis indica que WIN-55 desregula los procesos recién mencionados, razón por la cual podría producir el efecto antileucémico en las células de LMA y por ello procedimos a estudiar cada uno de estos procesos. 133 Figura 60. Resumen de las principales vías alteradas y los genes afectados en cada una de ellas tras realizar un estudio por microarrays de células HL60 tratadas durante 6 horas con 50 µM de WIN-55 frente a células control. 134 5.2.7. WIN-55 afecta a las principales vías de proliferación e induce apoptosis mediada por caspasas. La regulación de AKT, ERK1/2, JNK y p38 juegan un papel fundamental en la supervivencia celular o apoptosis(Gómez Del Pulgar et al., 2000; Herrera et al., 2005). Por lo tanto, examinamos si la exposición a WIN-55 alteraba los niveles de las formas fosforiladas de estas quinasas de señalización. Las células HL60 se expusieron a WIN-55 (50 µM, durante 2, 6, 18 y 24 h). Los ensayos de Western blot demostraron que el tratamiento con WIN-55 regulaba ligeramente al alza p-JNK y p-Erk1/2 al igual que ocurría en las células de MM, mientras que p-p38 y p-AKT se regulaban moderadamente a la baja a lo largo del tiempo (Figura 61). Figura 61. Estudio de la activación mediante fosforilación de diferentes proteínas implicadas en las vías de señalización MAPK y PI3K/Akt tras incubación con WIN-55 (50 µM) durante distintos periodos de incubación (0-24 horas) mediante Western blot. Se usó la expresión de β-tubulina como control de carga. La vía de PI3K/AKT se encarga de modular la proliferación celular mientras que las quinasas JNK (también conocidas como Stress-Activated Protein Kinase) actúan en respuesta a una señal de estrés, por lo que podríamos afirmar que WIN-55 suprime las vías de inducción de proliferación celular mientras que aumenta la expresión de proteínas de respuesta a estrés. 135 Por otro lado, estudiamos la activación de las caspasas implicadas en este proceso después del tratamiento con WIN-55. De acuerdo con los estudios del proceso de apoptosis mediante citometría de flujo, se determinó la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis celular en células HL60 expuestas a WIN-55 (50 µM o vehículo durante 2, 6, 18 y 24 h) mediante Western blot (Figura 62). Figura 62. Las células HL60 se incubaron con 50 µM de WIN-55 en el período de tiempo indicado y la expresión de las formas escindidas o truncadas de la caspasa 3 y la fragmentación de su sustrato PARP se analizaron mediante Western blot. La expresión de las caspasas iniciadoras principales, Casp-9, Casp-2 y Casp-8 también se estudiaron. Se usó la β-tubulina como control de carga. Los resultados obtenidos muestran que la exposición a WIN-55 provocó la activación de caspasas. Más específicamente, observamos la escisión de la caspasa-3 y su sustrato PARP y la acumulación de sus formas activas, a la vez que se observó una reducción de la procaspasa-2, -8 y -9, hecho que sucede cuando se activan. Esto indica que WIN-55 activa las vías apoptóticas tanto intrínsecas como extrínsecas. Para investigar más a fondo la importancia de las caspasas en el efecto citotóxico de los cannabinoides, se evaluó la capacidad del inhibidor pancaspasa Z-VAD(OMe)- 136 FMK para suprimir el proceso de muerte celular inducida por WIN-55. Las células se preincubaron durante 1 hora con Z-VAD(OMe)-FMK y posteriormente se añadió WIN- 55 o vehículo durante 18 h. Como se muestra en la figura 63, el efecto proapoptótico de los cannabinoides en las células de LMA disminuyó significativamente tras la coincubación con el inhibidor de pancaspasas. Figura 63. Se incubaron células HL60 con vehículo, 5 µM de WIN-55, 10 µM del inhibidor pancaspasa Z-VAD(OMe)-FMK o en presencia de ambos compuestos. Después de 18 h, se analizó la viabilidad celular mediante Cell Counting Kit-8. En resumen, nuestros resultados proporcionan evidencias de que el compuesto cannabinoide WIN-55 induce la muerte celular mediada por apoptosis mediante la activación de las vías intrínseca y extrínseca. 5.2.8. WIN-55 no provoca un daño directo en el ADN, pero PARP1 ejerce un papel importante en el efecto producido por las células de LMA. Para comprobar si WIN-55 actuaba produciendo daño en el ADN, estudiamos dos mecanismos implicados en este proceso, como es el aumento de la fosforilación de la proteína H2AX y la acumulación de poly-(ADP-ribosa) (o PAR), producto de la actividad de la enzima PARP1, mediante inmunofluorescencia. 137 En este caso, el aumento de la fosforilación de la serina 139 de H2AX y de la PARylación de proteínas nucleares, eventos clave en la señalización de la presencia de daño en el ADN aumentó (Figura 64 y 65), pero este efecto se atribuyó a un efecto indirecto sobre las células apoptóticas tras la incubación con altas dosis de WIN-55 más que a un efecto generalizable de daño en el ADN inducido por WIN-55. Figura 64. La expresión de H2AX y PAR se midió mediante análisis de inmunocitofluorescencia a las 6 horas después del tratamiento con WIN-55. Figura 65. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia observada en el análisis de inmunocitofluorescencia que se muestra en la Figura 64. 138 Finalmente, para descartar un efecto de WIN-55 como inductor de cortes de doble cadena en el ADN, daño que activa la fosforilación de la serina 139 en H2AX, analizamos la sinergia en la letalidad celular tras la preincubación con Olaparib, un inhibidor de PARP1. Si el incremento de señal en ser139-H2AX tras el tratamiento con WIN-55 se debe a una deficiencia intrínseca del proceso de recombinación homóloga en las células de LMA, y a la generación de cortes de cadena sencilla por la acción de WIN-55 y su posterior conversión a cortes de doble cadena tras la replicación, es esperable que WIN-55 sea sinérgico con el inhibidor de PARP Olaparib. Sorprendentemente obtuvimos el efecto contrario. Olaparib revirtió casi en su totalidad la muerte causada por WIN-55 (Figura 66), lo que sugiere que durante el tratamiento con WIN-55 PARP1 presenta una función importante durante el proceso apoptótico mas que durante el proceso de reparación del ADN. . Figura 66. La supervivencia celular de las células HL60 se determinó después de la incubación con WIN-55 10 µM, Olaparib 10 µM o ambos mediante ensayos de viabilidad con el Cell Counting Kit-8 tras 18 horas de incubación. Tras comprobar la importante implicación de PARP en el efecto antileucémico provocado por WIN-55, nos propusimos estudiar si existía una correlación entre la 139 sensibilidad al tratamiento y los niveles de expresión basal de ARNm de PARP1 en los pacientes de LMA estudiados (Figura 67). 0.000 0.005 0.010 0.015 0 50 100 150 Niveles de ARNm PARP1 % Viabilidad celular Figura 67. Correlación entre viabilidad celular tras tratamiento con WIN-55 (50 µM) y niveles de ARNm de PARP1 en muestras de pacientes con LMA estudiadas al diagnóstico con más de un 75% de blastos (Azul) o CD34+ de donantes sanos (Rojo). Estos resultados indican que no existe una clara correlación entre la expresión de PARP1 en pacientes de LMA y el grado de sensibilidad a WIN-55. 5.2.9. WIN-55 induce daño en organelas como el retículo endoplasmático y la mitocondria. Nuestro estudio transcriptómico muestra que la vía celular más afectada por el tratamiento con WIN-55 son las vías de estrés del RE y la de respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). Por tanto, para validar nuestros datos analizamos la activación de algunas de las proteínas principales de estas vías, como son las fosforilaciones de p- PERK, p-IRE1 o la acumulación de CHOP mediante Western blot (Figura 68).