Sird, una proteina con dominio uspa y sustrato de sicipk6, regula la respuesta inmune en solanáceas

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! SlRD,&una&proteína&con&dominio&UspA&y& sustrato&de&SlCIPK6,®ula&la&respuesta& inmune&en&Solanáceas& Instituto!de!Bioquímica!Vegetal!y!Fotosíntesis! Departamento!de!Bioquímica!Vegetal!y!Biología! Molecular! Universidad!de!Sevilla=CSIC! Trabajo!realizado!para!optar!al!grado!de! Doctor!por!la!Universidad!de!Sevilla!por!el! Licenciado! ! Emilio&Gutiérrez&Beltrán& ! ! ! Directora!de!Tesis! ! Dra.!Olga!del!Pozo!Cañas! Científico!titular! ! Tutor! !! Dr.!José!María!Romero!Rodríguez! Profesor!titular!de!la!US! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 1! Índice'general' Introducción··································································································7' I.!1. Sistema!de!defensa!vegetal············································································9! I.!1.1. Defensa!basal!o!PTI············································································10! I.!1.2. Respuesta!específica!de!la!planta!o!ETI················································11! I.!1.3. Defensa!sistémica···············································································15! I.!1.4. Proteínas!relacionadas!con!la!patogénesis···········································16! I.!2. Papel!de!las!hormonas!en!la!respuesta!inmune!de!la!planta························16! I.!2.1. Ácido!salicílico,!ácido!jasmónico!y!etileno·········································17! I.!2.2. Auxinas···························································································18! I.!2.3. Ácidos!abscísico···············································································19! I.!3. Respuestas!defensivas·················································································20! I.!3.1. Producción!de!especies!reactivas!de!oxígeno!(ROS)·····························20! I.!3.2. Óxido!nítrico······················································································21! I.!3.3. MAPKKKs··························································································21! I.!3.4. El!Ca2+!como!segundo!mensajero························································22! I.!4. Proteínas!sensoras!de!Ca2+···········································································23! I.!4.1. Función!de!los!complejos!CBL/CIPK····················································26! I.!4.2. Mecanismos!de!especificidad!en!la!respuesta!CBL/CIPK······················26! I.!5. Universal*stress*protein!(Usp)·······································································29! Bibliografía····································································································35! Objetivos·······································································································47' Capítulo'1:!Caracterización!molecular!de!!SlCIPK6!y!SlCBL10·························51! Resultados·····································································································53! 1.1. Análisis!de!la!expresión!génica!de!SlCBL10!y!SlCIPK6!!en!tomate!············53! 1.1.1. Acumulación!de!transcrito!en!diferentes!tejidos····························53! 1.1.2. Acumulación!de!transcrito!en!respuesta!a*Pst*DC3000···················54! 1.1.3. Acumulación!de!transcrito!en!respuesta!a!diferentes!hormonas·····56! ! 2! 1.1.4. Acumulación!de!transcrito!en!respuesta!a!estrés!abiótico··············58! 1.2. Localización!subcelular!de!SlCBL10!y!SlCIPK6!en!N.*benthamiana···········59! 1.3. Caracterización!de!la!interacción!SlCBL10/SlCIPK6!mediante!doble···········.!!!!!! híbrido!en!levaduras············································································63! 1.4. Generación!de!plantas!transgénicas!!que!sobreexpresan!SlCBL10!en!..............!!!!!!!!!!!!!!! N.*benthamiana····················································································65! 1.4.1. Sensibilidad!a!sal!de!las!plantas!transgénicas!SlCBL10!en.........................!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! N.*benthamiana············································································67! Discusión·······································································································72! Bibliografía····································································································81! Capítulo'2:!Identificación!de!proteínas!que!interaccionan!con!SlCIPK6!mediante.! doble!híbrido!en!levaduras·················································································85! Resultados·····································································································87! 2.1. Antecedentes·······················································································87! 2.2. Caracterización!bioquímica!de!SlCIPK6·················································88! 2.3. Escrutinio!genético!de!doble!híbrido!en!levaduras································91! 2.4. Selección!de!candidatos·······································································96! 2.4.1. Participación!en!la!respuesta!inmune!en!tomate····························96! 2.4.2. Identidad!de!los!clones·································································98! 2.4.3. Estudio!de!interacción!in*vivo!con!SlCIPK6··································102! Discusión·····································································································104! Bibliografía··································································································108! Capítulo'3!Caracterización!de!SlRD······························································113! Resultados···································································································115! 3.1. Análisis!bioinformático!de!SlRD···························································115! 3.2. Estudio!de!la!interacción!entre!SlRD!y!SlCIPK6·····································117! ! 3! 3.3. Análisis!de!la!expresión!génica!de!SlRD!en!tomate································123! 3.3.1. Acumulación!de!transcrito!en!diferentes!tejidos!y!en!respuesta!a!.......!!!!!!! Pst!DC3000················································································124! 3.3.2. Acumulación!de!transcrito!respuesta!a!estrés!abiótico················126! 3.4. Estudio!de!la!fosforilación!de!SlRD!por!SlCIPK6····································128! 3.5. Estudio!de!la!implicación!de!SlRD!en!la!respuesta!inmune!en..............................! Solanáceas·························································································129! 3.5.1. Implicación!en!el!desarrollo!de!los!síntomas!de!enfermedad!en.............!!!!!!!!!! N.*benthamiana··········································································132! 3.5.2. Papel!en!la!respuesta!ETI!mediada!por!Pto/AvrPto·····················133! 3.5.3. Papel!en!la!respuesta!ETI!mediada!por!múltiples!elicitores··········135! 3.5.4. Implicación!en!la!PCD!tras!la!infección!con!Pst*tabaci!(AvrPto)····137! 3.6. Estudio!de!la!homodimerización!de!SlRD·············································138! 3.6.1. Localización!del!dímero!SlRDcSlRD!mediante!BiFC······················140! 3.6.2. Implicación!de!la!dimerización!en!la!unión!a!SlCIPK6··················142! 3.7. Estudio!de!la!unión!de!ATP!a!SlRD·······················································147! 3.8. Estudio!de!la!complementación!de!SlRD!en!el!mutante!ΔuspA*de!E.*coli·150! 3.9. Estudio!de!la!generación!de!especies!reactivas!de!oxígeno!(ROS)!en................!!!!!!!!!!!!!!!!!! N.*benthamiana··················································································152* 3.9.1. Implicación!de!la!perdida!de!función!de!SlRD!en!la!generación!de.........! ROS!··························································································154* 3.9.2. Estudio!de!la!generación!de!ROS!en!la!respuesta!PTI!y!ETI!en!plantas! sobrecexpresoras!de!SlRD···························································155* 3.10. Efecto!de!la!sobreexpresión!de!SlRD!en!levaduras······························156! Discusión······································································································160! Bibliografía··································································································173! Conclusiones·····························································································181' Materiales'y'métodos·············································································185! M.1. Material!biológico·····················································································187! M.1.1 Estirpes!bacterianas·········································································187! ! 4! M.1.2 Estirpes!de!levaduras·······································································187! M.1.3 Plantas····························································································188! M.2. Cultivo!y!manipulación!del!material!vegetal··············································188! M.2.1 Esterilización!de!semillas·································································188! M.2.2 Germinación!y!condiciones!de!cultivo···············································188! M.2.3 Transformación!estable!de!N.!benthamiana!vía!Agrobacterium··········189! M.2.4 Selección!de!líneas!trangénicas!de!N.*benthamiana····························190! M.2.5 Silenciamiento!génico!inducido!por!virus!(VIGS)·······························190! M.2.6 Agrocexpresión!en!!hojas!de!N.*benthamiana·····································191! M.2.7 Medida!de!la!muerte!celular!mediante!conductividad!iónica··············191! M.3. Cultivo!y!manipulación!de!microorganismos·············································192! M.3.1 Medio!de!cultivo!líquido!y!sólido·······················································192! M.3.2 Obtención!de!células!competentes····················································193! M.3.3 Transformación!bacteriana······························································193! M.3.4 Ensayo!de!complementación!del!mutante!ΔuspA!de!E.*coli·················194! M.3.5 Ensayo!crossGlinking!en!E.*coli···························································194! M.3.6 Transformación!de!levaduras···························································195! M.3.7 Ensayo!de!resistencia!en!levaduras···················································195! M.4. Sistema!LexA!de!doble!híbrido··································································195! M.4.1 Fundamentos!del!sistema!de!doble!híbrido·······································195! M.4.2 Transformación!de!la!genotéca!de!tomate!en!la!cepa!EGY48··············197! M.4.3 Escrutinio!genético··········································································197! M.4.4 Selección!y!aislamiento!de!colonias!positivas····································198! M.4.5 Ensayo!βcgalactosidasa····································································198! M.5. Aislamiento!y!manipulación!de!ácidos!nucleicos········································199! M.5.1 Purificación!y!manipulación!de!ADN·················································199! M.5.1.1 Aislamiento!de!plásmidos!de!E.*coli··········································199! M.5.1.2 Aislamiento!de!plásmido!de!levadura·······································199! M.5.1.3 Digestión,!purificación!y!ligación!de!fragmentos!de!DNA···········200! M.5.1.4 Mutagénesis!dirigida·······························································201! M.5.1.5 Purificación!de!DNA!de!plantas················································201! M.5.1.6 Electroforesis!de!DNA!en!geles!de!agarosa.·······························201! M.5.1.7 Reacción!en!cadena!de!la!polimerasa!(PCR)······························202! ! 5! M.5.1.8 Secuenciación!automática!de!DNA···········································202! M.5.2 Purificación!y!manipulación!de!RNA·················································202! M.5.2.1 Tratamiento!del!material·························································202! M.5.2.2 Aislamiento!de!RNA!!de!planta·················································203! M.5.2.3 Transcripción!reversa·····························································203! M.5.2.4 PCR!semicuantitativa.······························································203! M.5.2.5 PCR!a!tiempo!real.···································································204! M.6. Purificación!y!manipulación!de!proteínas··················································206! M.6.1 Extracción!de!proteínas!de!plantas.···················································206! M.6.2 Electroforesis!en!geles!de!poliacrilamida!(PAGE)·······························206! M.6.3 Transferencia!de!proteína!a!membrana!(westernGblot).······················207! M.6.4 Ensayo!de!cocinmunoprecipitación!in*vivo·········································207! M.6.5 Expresión!y!purificación!de!proteínas!recombinantes························208! M.6.5.1 Purificación!desde!E.*coli·························································208! M.6.5.2 Purificación!desde!hojas!de!N.*benthamiana·····························209! M.6.6 Ensayo!de!fosforilación!con!γcATP.····················································209! M.6.7 Ensayo!de!unión!a!αcATP··································································209! M.7. Tratamientos!de!plantas···········································································209! M.7.1 Inoculación!con!bacteria!patógenas··················································209! M.7.1.1 Inoculación!por!inmersión·······················································209! M.7.1.2 Inoculación!por!infiltración·····················································210! M.7.2 Tratamientos!en!tomate···································································210! M.7.3 Ensayo!de!la!generación!de!ROS!en!N.*benthamiana···························211! M.8. Microscopía·····························································································211! M.8.1 Adquisición!de!imágenes!por!microscopía!confocal···························211! M.9. Herramientas!bioinformáticas··································································211! Bibliografía··································································································213! ! ! ! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 12! es!capaz!de!desarrollar!una!infección!satisfactoria.!En!la!interacción!incompatible! la!cepa!del!patógeno!es!avirulenta!y!en!el!caso!de!la!interacción!compatible!la! cepa!es!virulenta.! + + + + + + + + + + + Sin!embargo!y!tras!el!avance!del!conocimiento!del!tema!Van!der!Biezen!y!Jones! en!1998!postularon!una!adaptación!algo!más!sofisticada!del!modelo!gen!a!gen,! enunciado!con!el!nombre!de!hipótesis+guardia.!En!ella!se!postula!que!no!tiene! lugar!una!interacción!física!entre!la!proteína!!Avr!y!R!sino!que!éstas!son!capaces! de!reconocer!a!determinados!efectores!sin!una!unión!directa.!Muchas!proteínas! R! se! encargarían!de! monitorizar! el! estado! de! varios! componentes! defensivos! vegetales!siendo!capaces!de!detectar!el!cambio!generado!por!los!efectores!(Van! der!Biezen!and!Jones!1998).!De!esta!forma!se!explicaría!que!las!células!vegetales! sean!capaces!de!responder!a!una!gran!variedad!de!efectores!patogénicos!con!tan! solo!unas!pocas!proteínas!de!resistencia.!Así!por!ejemplo!se!ha!descrito!que!las! proteínas! R! de! membrana! RPM1! y! RPS2! son! capaces! de! monitorizar! las! modificaciones!de!RIM4!que!tienen!lugar!como!resultado!de!la!actividad!de!los! Figura+ I.1:!Esquema+ del!modelo+ gen+ a+ gen.! Esta! teoría! postula! que! cuando! tiene! lugar! una! interacción!entre!una!proteína!de!Avirulencia!(Avr)!secretada!por!el!patógeno!y!una!proteína!de! Resistencia! (R)! proporcionada! por! la! planta! se! produce! un! reconocimiento! incompatible,! imposibilitando!la!infección!por!parte!del!invasor.!Sin!embargo,!si!falla!alguno!de!los!elementos! anteriores!no!se!genera!tal!reconociemento!dando!lugar!a!una!infección.! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 13! efectores! AvrRpt2,! AvrRpm1! y! AvrB! (Axtell,! Chisholm! et! al.! 2003)!y! (Mackey,! Belkhadir!et!al.!2003).! Recientemente! se! ha! establecido! el! modelo+ zigEzag!como! resumen! de! la! respuesta!inmune!de!la!planta!(Jones!and!Dangl!2006).!Éste!se!divide!en!cuatro! fases! diferentes! y! se! muestra! en! la! figura! I.2.! En! la! fase! I! tiene! lugar! el! reconocimiento!de!los!PAMPs!por!parte!de!los!receptores!PRRs!y!se!dispara!la! respuesta! PTI,! la! cual! podría! parar! la! infección.! En! la! fase! 2! los! agentes! patogénicos! envían! efectores! que! interfieren! con! la! PTI! derivando! en! la! susceptibilidad! mediada! por! efectores! (ETS).! En! la! fase! 3,! un! efector! es! reconocido!por!una!proteína!R!lo!cual!activa!la!inmunidad!mediada!por!efectores! (ETI).!En!la!fase!4,!la!selección!natural!hace!que!los!agentes!patogénicos!eliminen! la! respuesta! ETI,! bien! por! la! pérdida! de! efectores! reconocidos! o! bien! por! la! ganancia!de!nuevos,!y!den!lugar!a!infección.!De!la!misma!manera,!la!selección! natural!dirigirá!a!las!plantas!a!reconocer!nuevos!efectores!en!su!carrera!armada! hacia!la!perpetuación!en!el!tiempo.!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !"#$%&'()(*)$+)(*,*-.+) !"#$% &$'$% ()*% +),% +)*% +),% +)*% /,*0&12*.) #+&134-%01.) 5!65.) !7289) /,*0&12*.) #+&134-%01.) !7289) :";2+$)#+2+)$+)<9) :";2+$)#+2+)$+) 2*.%.&*-0%+)*,*0=7+) Figura+I.2:!Esquema+que+representa+el+modelo+zigEzag,+que+explica+el+sistema+inmune+de+ plantas.+Leyenda:!PAMPs:!Patrones!moleculares!asociados!a!patógenos;!PTI:!Inmunidad!inducida! por! los! PAMPs;! ETS:! Susceptibilidad! inducidad! por! efectores;! ETI:! Inmunidad! activada! por! efectores;! HR:! Respuesta! Hipersensible;! Avr:! Proteíanas! de! Avirulencia;! R:! Proteínas! de! Resistencia.! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 14! La!ETI!culmina!con!la!resistencia!de!la!planta!y!normalmente!con!una!respuesta! hipersensible! (HR)! que! implica! muerte! celular! programada! en! el! sitio! de! la! infección.! La! HR,! que! es! controlada! genéticamente! por! la!planta,! puede! tener! lugar!2! o! 3! horas! después!del! contacto! de! una! simple! bacteria! con! la! célula! vegetal.! Sin! embargo,! en! la! práctica,! se! define! como! una! muerte! celular! macroscópica!que!ocurre!cuando!un!mínimo!del!25%!de!las!células!en!contacto! con! el! patógeno! mueren,!desarrollando!una! muerte! celular! confluente.! La! HR! podría! inhibir! o! retrasar! la! propagación! del! patógeno,! pero! su! significado! biológico!es!difícil!de!determinar!debido!a!la!falta!de!plantas!mutantes!afectadas! en!la!muerte!celular!(Mur,!Kenton!et!al.!2008).!En!algunas!interacciones!plantaS patógeno!la!activación!de!la!HR!es!suficiente!para!la!contención!de!la!infección,! mientras!que!en!otros!casos!no!es!suficiente!para!la!resistencia!a!la!enfermedad.! Se!ha!propuesto!que!la!muerte!celular!tendría!lugar!si!se!supera!un!cierto!umbral! de!estrés.! El!modelo!de!interacción!plantaSpatógeno!mejor!caracterizado!en!Solanáceas!es! el! formado! por! la! planta! de! tomate,! Solanum1 lycopersicum,! y! Pseudomonas1 syringae!pv! tomato! (Pst),! causante! de! la! enfermedad! denominada! mancha! bacteriana.!En!las!plantas!susceptibles,!el!patógeno!se!multiplica!en!el!espacio! apoplástico,!formando!a!los!pocos!días!pequeñas!lesiones!necróticas!rodeadas!de! un!halo!clorótico.!En!casos!de!infecciones!severas!se!puede!llegar!a!la!defoliación! de!la!planta.!La!resistencia!a!esta!bacteria!está!mediada!por!la!quinasa!Pto!que! reconoce!el!efector!AvrPto!iniciando!una!cascada!de!señalización!que!culmina!en! la!inmunidad!frente!al!patógeno!(Jeong,!Dijk!et!al.!2009).! Pto!es!una!serina/treonina!quinasa!que!carece!de!la!región!rica!en!repeticiones! de! leucina! presente! en! otros! genes! R.! La! proteína! AvrPto! es! una! pequeña! proteína!hidrofílica!cuya!expresión!es!regulada!por!una!caja!hrp!(hypersensitive. response1and1pathogenicity)!en!su!promotor,!inducida!en!condiciones!en!las!que! el!crecimiento!bacteriano!está!favorecido.!Pto!también!reconoce!a!otra!proteína! de!Pst!DC3000!denominada!AvrPtoB!!que!no!presenta!homología!con!AvrPto!y! que! también! inicia! la! respuesta! de! resistencia! en! tomate! (Pedley! and! Martin! 2003).! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 15! Prf! es! una! proteína! con! dominios! ricos! en! leucina! necesaria! para! el! funcionamiento!de!la!resistencia!mediada!por!Pto!y!estudios!recientes!sugieren! que!funciona!formando!un!complejo!con!Pto!y!AvrPto.!En!el!modelo!de!trabajo! aceptado!actualmente,!Pto!forma!un!complejo!inestable!con!Prf!en!la!membrana! en! ausencia! de! patógeno.! ! En! este! complejo! también! podrían! estar! presentes! proteínas!implicadas!en!la!defensa!basal!de!la!planta.!Una!vez!que!Pst!DC3000!se! encuentra!en!el!espacio!apoplástico!y!secreta!los!efectores!dentro!de!la!célula! vegetal,! Pto! detecta! la! presencia! de! AvrPto! estimulándose! así! su! actividad! quinasa,!y!estableciendo!el!complejo! PtoSPrf.!Dicho! complejo!activo!inicia!una! cascada!que!induce!la!resistencia!específica!de!Pst1DC3000.!Al!tratarse!Pto!de!una! quinasa,!posiblemente!inicie!cascadas!de!fosforilación.!Se!han!identificado!varios! sustratos! de! Pto! mediante! ensayos! de! doble! híbrido! en! levaduras,! como! la! quinasa! Pti1! (Pto1interacting1 protein)! y! los! factores! de! transcripción! Pti4/5/6! pertenecientes!a!la!familia!ERF!(Pedley!and!Martin!2003).! I.+1.3. Defensa+sistémica+ La! resistencia! sistémica! adquirida! (SAR,! systemic1 acquired1 resistance)! es! una! respuesta!de!defensa!activa,!sistémica,!de!amplio!espectro!que!se!asocia!a!una! alta!expresión!de!genes!PR! (pathogenesis1related).!En! la! mayoría! de! los! casos,! SAR! es! igualmente! efectiva! contra! hongos,! bacterias,! virus! o! nematodos,! independientemente! del! organismo! inductor! (Ryals,! Neuenschwander! et! al.! 1996).! La! manifestación! de! SAR! de! manera! sistémica! en! la! planta! implica! la! existencia!de!algún!sistema!de!señales!capaces!de!transmitirse!a!través!de!los! tejidos.!Las!investigaciones!realizadas!indican!que!el!ácido!salicílico!(SA)!es! la! molécula!que!ha!mostrado!mayores!evidencias!de!estar!involucrada!en!las!vías! de!SAR.! De! esta! forma,! la! inducción!de!SAR! generalmente! se! correlaciona! con! incrementos! en! la! acumulación! de! SA! tanto! localmente! como! sistémicamente! (Lawton,!Weymann!et!al.!1995).! Otro! tipo! de! resistencia! sistémica! inducida!se! desarrolla! a! partir! de! la! colonización! de! las! raíces! de! la! planta! por! microorganismos! de! la! rizosfera,! particularmente! rizobacterias.! Este! tipo! de! resistencia! es! conocida!como! resistencia!sistémica!inducida!(ISR,!induced!systemic!resistance)!y!se!caracteriza! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 16! por!estar!mediada!por!vías!metabólicas!sensibles!al!ácido!jasmónico!y!al!etileno!y! ser!independiente!de!la!expresión!de!los!genes!PR!y!del!ácido!salicílico!(Pieterse! and!van!Loon!1999).! I.+1.4. Proteínas+relacionadas+con+la+patogénesis+ Las!proteínas!relacionadas! con! la! patogénesis! (proteínas! PR)!son! un! grupo! variable! que! se! acumulan! en! las! plantas! después! y! durante! la! infección! con! patógenos.! La! inducción! de! los! genes! PR! ocurre! no! solo! por! la! infección! con! varios! tipos! de! patógenos,! sino!también! en! respuesta! al! tratamiento! con! elicitores,! reguladores! del! crecimiento! de! las! plantas,! por! la! acción! de! compuestos!metabólicos!y!diversos!agentes!químicos!(van!Loon,!Rep!et!al.!2006).! Las!proteínas!PR!se!caracterizan!por!su!bajo!peso!molecular,!por!la!resistencia!a! las! proteasas,! por! su! localización! extracelular! y! sus!valores! de! pH! extremos! (Stintzi,!Heitz!et!al.!1993).! Entre!las!proteínas!PR!mas!estudiadas!se!encuentran!las!quitinasas!y!glucanasas! que!participan!en!la!respuestas!de!defensa!activa!de!la!plantas!contra!patógenos! fúngicos!(van!Loon,!Rep!et!al.!2006).! I.+2.Papel+de+las+hormonas+en+la+respuesta+inmune+de+la+planta+ Las! plantas! producen! una!gran!variedad! de! hormonas! vegetales! incluyendo! auxinas,!giberelinas!(GA),!etileno!(ET),!ácido!abscísico!(ABA),!citoquininas!(CK),! brasinosteroides!(BR)!y!hormonas!peptídicas.!Recientemente!se!han!descrito!las! estrigolactonas!como!una!nueva!clase!de!hormonas!vegetales!(Umehara,!Hanada! et!al.!2008).!Las!fitohormonas!juegan!un!importante!papel!en!diversos!procesos! relacionados! con! el! crecimiento! y! desarrollo,! así! como! en! varias! respuestas! a! estreses! bióticos! o! abióticos.! La! identificación! y! caracterización! de! varios! mutantes!afectados!en!la!biosíntesis,!percepción!y!transducción!de!señales!de!las! fitohormonas!han!sido!indispensables!para!determinar!su!papel!en!la!respuesta! de!defensa.!Sin! embargo,!los! mecanismos!moleculares!mediante!los! cuales! las! plantas!integran!los!cambios!en!los!niveles!hormonales!inducidos!por!el!estrés!e! inician!respuestas!adaptativas!son!todavía!poco!conocidos!(Bari!and!Jones!2009).! ! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 17! I.+2.1. Ácido+salicílico,+ácido+jasmónico+y+etileno.+ Se!encuentra!bien!caracterizada!el!papel!de!las!tres!fitohormonas!(SA,!JA!y!ET)!en! la!regulación!de!la!defensa!de!la!planta!a!varios!tipos!de!patógenos!y!estreses! abióticos,! así!como! herida! y! exposición! a! ozono! (Balbi! and! Devoto! 2008)! y! (Loake!and!Grant!2007).! El! SA! tiene! un! papel! importante! en! la! defensa! vegetal,! participando! principalmente!en! la! activación! de! la! defensa! en! respuesta! a! patógenos! biotróficos!y!hemiSbiotróficos!y!en!la!resistencia!sistémica!adquirida!(Grant!and! Lamb!2006).!Sin!embargo,!las!hormonas!JA!y!ET!están!asociadas!generalmente! con!la!defensa!a!patógenos!necrotróficos!e!insectos!herbívoros.!Aunque!las!vías! de! señalización! de! SA! y! JA/ET! son!antagonistas,! existen! evidencias! de! interacciones!sinérgicas!entre!ellas!(Mur,!Kenton!et!al.!2006).! Uno!de!los!componentes!reguladores!más!importante!en!la!señalización!por!SA! es!la!proteína!NPR1!(non.expressor1of1PR1genes11)!la!cual!interactúa!con!el!factor! de! transcripción! TGA,! involucrado! en! la! activación! de! un! grupo!de! genes! relacionados!con!la!patogénesis!(PR)!(Dong!2004).!La!proteína!NPR1!supone!un! punto! clave! en! la!señalización! por! SA! y! en! la! inhibición! de! la! respuesta! a!JA! (Spoel,!Koornneef!et!al.!2003).!Recientemente!se!ha!descrito!que!los!cambios!en! el! estado! rédox! de! la! célula! juegan! un! importante! papel! en! la! traducción! de! señales!de!SA!(Mou,!Fan!et!al.!2003).!De!esta!forma!se!ha!relacionado!el!aumento! de! los! niveles! de! glutatión,! uno! de! los! componentes! responsable! de! la! homeostasis!celular,!con!la!capacidad!de!SA!de!suprimir!la!expresión!de!genes!de! respuesta!a!JA!(Koornneef,!LeonSReyes!et!al.!2008).!! Aunque!el!ácido!jasmónico!se!encuentra!involucrado!en!procesos!tales!como!la! germinación,!el!crecimiento!de!la!raíz,!la!formación!del!tubérculo,!la!senescencia! foliar! y! la! apertura! estomática,! también! juega! un! papel! importante! en! la! respuesta!de!defensa!a!insectos!y!patógenos!microbianos.!Varios!estudios!han! demostrado!que!la!concentración!local!de!JA!aumenta!en!respuesta!a!la!infección! por! patógenos! o! daños! en! el! tejido.! De! la! misma! forma! se! ha! descrito! que! la! aplicación!exógena!de!la!hormona!induce!la!expresión!de!genes!relacionados!con! la!defensa!(Wasternack!2007).!Los!principales!componentes!en!la!señalización! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 18! por! JA! descritos! hasta! el! momento! están! formados! por! las! proteínas!COI! (coratine! insensitive! 1),! JAR1! (jasmonate1 resistant1 1)! y! JIN1/MYC2! (Jasmonate1 insensitive11/MYC2).!Recientemente!se!identificaron!las!proteínas!JAZ!(jasmonato1 ZIM.domain)! como! represoras! de! la! señalización! por! JA.! Así! por! ejemplo! la! degradación!de!las!proteínas!JAZ!permite!la!activación!de!genes!de!respuesta!a!JA! por!el!factor!de!transcripción!MYC2!(Thines,!Katsir!et!al.!2007).! Numerosos! estudios! indican! que! la! señalización! de! JA! y! ET! operan! sinérgicamente!en!la!activación!de!la!expresión!de!diversos!genes!de!defensa!tras! la!inoculación!del!patógeno!(Penninckx,!Thomma!et!al.!1998).!Así!por!ejemplo!el! factor!de!transcripción!ERF1!(ethylene1response1factor)!es!un!regulador!positivo! de!la!señalización!por!JA!y!ET!en!Arabidopsis!(Lorenzo,!Piqueras!et!al.!2003).!De! igual! forma! el! gen! PDF1.2! (plant1defensin1 gene)! de! A.1 brassicicola!es! inhibido! tanto!en!el!mutante!insensible!a!jasmonato!coi1!como!en!el!mutante!insensible!a! etileno!ein2!(Thomma,!Penninckx!et!al.!2001).! Por! lo! tanto!las! plantas,! con! el! objetivo! de! activar! una! respuesta! defensiva! efectiva!frente!a!diversos!patógenos,!modulan!la!abundancia!de!las!hormonas!SA,! ET!y!JA,!modifican!la!expresión!de!genes!relacionados!con!la!defensa!y!coordinan! los!complejos!de!interacción!entre!las!diferentes!vías!de!defensa.!Sin!embargo!los! mecanismos!por!los!cuales!las!plantas!llevan!a!cabo!éstas!acciones!se!desconocen.! I.+2.2. Auxinas+ Aunque! las! auxinas! son! consideradas! hormonas! reguladoras! del! crecimiento! vegetal!recientemente!se!las! ha!implicado! en! la! defensa!de!la!planta! (Yamada! 1993).!Debido!a!que!muchos!microorganismos!fitopatógenos!producen!auxinas! (ácido!indo!lacético,!IAA)!durante!sus!interacciones!con!las!plantas,!se!propuso!la! participación! de! esta! hormona! en! el! desarrollo! de! la! enfermedad! (Spaepen,! Vanderleyden!et!al.!2007).!Posteriormente!se!demostró!que!las!auxinas!reprimen! la!expresión!de!los!genes!PR,!lo!que!indicó!que!podrían!modular!la!respuesta!de! defensa!de!la!planta!(Jouanneau,!Lapous!et!al.!1991).!En!varios!estudios!se!ha! descrito!la!actuación!antagónica!de!la!señalización!por!auxinas!con!respecto!a!la! señalización! por! SA!(Bari! and! Jones! 2009).! Esta! actuación!antagónica!podría! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 19! deberse!a!que!la!planta!desvía!los!recursos!dedicados!al!crecimiento!vegetal!a! procesos!relacionados!con!la!defensa!cuando!ocurre!un!ataque!por!patógenos.! Las! auxinas! promueven! la! degradación! de! una! familia! de! represores! transcripcionales! llamados! Aux/IAA!(Auxin/IndoleS3Sacetic!acid),!los!cuales!se! encuentran!unidos!en!condiciones!de!no!inducción!a!los!factores!de!respuestas!a! auxina!ARFs!(auxin1response1factors)!e!impiden!la!transcripción!de!determinados! grupos!de!genes!(Leyser!2006).!Cuando!la!proteína!TIR1!forma!un!complejo!con! Aux/IAA!se! produce! la! degradación! de! éste! vía! ubiquitinación.!Las! auxinas! regulan!el!crecimiento!vegetal!mediante!la!expresión!de!varios!grupos!de!genes,! entre!los!que!se!encuentra!la!familia!génica!GH3!(Woodward!and!Bartel!2005).! Los! genes! GH3!codifican! a! sintetasas! encargadas! de! la! regulación! de! la! homeostasis!de!las!auxinas!y!recientemente!se!las!ha!implicado!en!la!respuesta! de!defensa!en!Arabidopsis!y!arroz!(Zhang,!Li!et!al.!2007).! I.+2.3. Ácido+abscísico+(ABA)+ El!ABA!está!implicada!en!la!regulación!de!numerosos!aspectos!del!crecimiento!y! desarrollo! vegetal!como! la! germinación,! la! maduración! del! embrión,! la! senescencia!foliar,!la!apertura!estomática,!así!como!también!en!la!adaptación!a! estreses! ambientales! (Wasilewska,! Vlad! et! al.! 2008).! Varios! estudios! han! demostrado!que!el!ABA!participa!en!la!respuesta!de!la!planta!frente!al!ataque! patogénico!y!cuya!función!va!a!depender!del!tipo!de!interacción!planta!patógeno! que! se! establezca.! En! la! mayoría! de! los! casos! la! hormona!actúa! como!un! regulador! negativo! de! la! respuesta! de! la! planta! a! la! infección! por! varios! patógenos! biotróficos! y! necrotróficos! (Bari! and! Jones! 2009).! Sin! embargo! también! se! ha! visto!que! en! algunos! casos! puede! actuar! como! un! regulador! positivo! de! la! respuesta! de! la! planta!a! la! infección!(MauchSMani! and! Mauch! 2005).! Se!ha! descrito!que! el!ABA! podría!mediar!la! respuesta!a! la!interacción!plantaS patógeno! mediante! la! regulación! del! metabolismo! de!la!síntesis! de! la! pared! celular!(Flors,!Ton!et!al.!2008),!la!generación!de!especies!reactivas!de!oxígeno!y! la!expresión!de!genes!de!defensa!(Xing,!Jia!et!al.!2008).!! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 20! I.+3.Respuestas+defensivas+ La!detección!del!patógeno!por!parte!de!la!planta,!ya!sea!en!la!PTI!o!bien!en!la!ETI,! desencadena! una! gran! cantidad! de! cambios! en! el! interior! de! las! células! del! hospedador.! La! velocidad,! intensidad! o! magnitud! con! la! que! se! desarrollan! dichos!cambios!son!cruciales!para!determinar!la!eficiencia!de!la!respuesta.!Entre! los! eventos! comunes! que! se! producen! en!las! respuestas! PTI! y! la! ETI! encontramos:! cambios! en! el! flujo! de! iones,! síntesis! de! especies! reactivas! de! oxígeno! y! nitrógeno,!activación! de! vías! de! señalización,! alteración! de! los! patrones!transcripcionales!y!la!alcalinización!del!espacio!extracelular.!! I.+3.1. Producción+de+especies+reactivas+de+oxígeno+(ROS)+ La! generación! de!especies! reactivas! de! oxígeno,! conocida! como! “explosión! oxidativa”,! es! uno! de! los! primeros! eventos! que! ocurre! tras! la! percepción! del! patógeno!(Torres,!Jones!et!al.!2006).!Las!ROS!incluyen!el!radical!superóxido!(O2S),! el!peróxido!de!hidrógeno!(H2O2)!y!el!radical!hidroxilo!(OHS).!En!condiciones!de! no!infección!las!ROS!se!producen!a!bajas!concentraciones!en!toda!la!planta!como! subproductos!de!diversas!vías!metabólicas.!Sin!embargo!a!los!dos!o!tres!minutos! de!la!infección!por!patógenos!la!producción!de!ROS!aumenta!considerablemente! en!la!célula!y!!tiene!lugar!lo!que!se!ha!llamado!“explosión!oxidativa”.!La!principal! enzima!responsable!de!la!producción!de!ROS!en!la!célula!tras!la!percepción!del! patógeno!es!la!NADPH!oxidasa!de!membrana!RbohD!(Zhang,!Shao!et!al.!2007).! Las! proteínas! NADPH! oxidasas! de! plantas! están! formadas! por! 6! dominios! transmembrana!y!un!dominio!NSterminal!que!posee!dos!manos!EF,!sugiriendo! una!regulación!por!Ca2+.!! La!generación!de!especies!reactivas!de!oxígeno!en!la!célula!vegetal!en!respuesta! a!la!infección!por!patógenos!es!bifásica!y!ambas!fases!son!dependientes!de!la! enzima!RbohD.!En!la!primera!fase!la!acumulación!de!ROS!viene!dada!por!un!pico! con!baja!amplitud!y!de!poca!duración,!y!en!la!segunda!fase!el!pico!posee!una! mayor! magnitud!y!duración.! Probablemente! el! primer! pico! sea! debido! a! la! respuesta! PTI! y! el! segundo! al! reconocimiento! específico!de! los! efectores! patogénicos!(Torres,!Jones!et!al.!2006).!! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 21! I.+3.2. Óxido+nítrico+(NO)+ El!óxido!nítrico!está!involucrado!en!numerosos!procesos!durante!el!ciclo!vital!de! las! plantas.! Interviene! en! el! crecimiento! y! la! diferenciación! celular,! en! la! estimulación!de!la!germinación!de!las!semillas,!en!el!crecimiento!de!la!raíz,!en!la! maduración! del! fruto,! en! el! cierre!estomático! y! la! senescencia! (Wendehenne,! Durner!et!al.!2004).!Además!existen!numerosas!evidencias!que!indican!que!el!NO! u!otros!metabolitos!relacionados!con!el!NO,!tales!como!los!SSnitrosotioles,!juegan! un!importante!papel!en!las!vías!de!señalización!iniciadas!tras!la!percepción!del! patógeno!(Hong,!Yun!et!al.!2008).!Así!por!ejemplo!se!ha!descrito!que!el!NO!es! esencial!para!que!se!produzca!la!HR!inducida!por!patógenos!(Yoshioka,!Asai!et!al.! 2009).! Además,! muchos! genes! de! defensa! tales! como! el! que! codifica! para! la! fenilalanina! amino! liasa! (PAL),! glutatión! SStransferasa! (GST)!y! proteínas! relacionadas! con! la! patogénesis! (PR)! son! inducidos! por! la! administración! de! donadores!de!NO!(Durner,!Wendehenne!et!al.!1998).! I.+3.3. MAPKKKs+ Las!cascadas!de!activación!por!MAPKs!son!muy!comunes!en!eucariotas!y!tienen! una! gran! importancia! en! la!percepción,! procesamiento,! traducción! y! amplificación! de! señales! intra! y! extracelulares.! Como! esquema! general,! la! cascada!MAPK!comienza!con!la!fosforilación!y!activación!de!la!proteína!MAPKKK! que!posteriormente!fosforila!y!activa!a!una!MAPKK,!la!cual!hace!lo!mismo!con! una! MAPK.! Por! último! ésta!MAPK! fosforila!y! activa!a! otras! proteínas!de! la! señalización!transmitiendo!la!señal!agua!abajo.!Se!ha!descrito!que!las!proteínas! de!Arabidopsis!AtMAPK6,!3!y!4!se!activan!en!respuesta!a!una!gran!variedad!de! estímulos!diferentes.!Por!lo!tanto!se!postuló!que!la!cascada!MAPK!aparece!como! un! punto! de! convergencia! en! la! señalización! a! diferentes! tipos! de! estreses! (Pedley!and!Martin!2005).! En! la! interacción! plantaSpatógeno! se! han! descrito! multitud! de! evidencias! que! apuntalan!la!importancia!de!las!cascadas!MAPK!en!las!respuestas!defensivas.!Así! por!ejemplo!la!percepción!de!flg22!da!lugar!a!la!activación!de!la!cascada!MAPK! en!la!que!participan!MEKK1!(MAPKKK),!MAPKK4/5!y!MAPK3/4!(Asai,!Tena!et!al.! 2002).! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 28! S Diferencias!en!la!interacción!y!activación!de!los!complejos! Otro! aspecto! que! permite! aumentar! la! especificidad! de! la! respuesta! es! la! diferente! interacción! entre! miembros! de! la! familia! de! las! proteínas! CBLs! con! CIPKs.!Mediante!análisis!de!doble!híbrido!se!ha!comprobado!que,!al!menos!en! levaduras,!las!CBLs!no!interaccionan!con!todas!las!CIPKs!y!viceversa!(Albrecht,! Ritz! et! al.! 2001).! Estas! mismas! observaciones! se! han! confirmado! en! experimentos!in1vivo.!Estos!resultados!sugieren!que!uno!de!los!mecanismos!que! genera!especificidad!espacial!y!temporal!en!la!señalización!a!Ca2+!es!la!diferente! afinidad! de! interacción! que! presentan! entre! sí! las! CBLs! y! las! CIPKs.! Estas! diferencias!darán!lugar!a!la!formación!de!diferentes!complejos!en!la!planta.! También!se!ha!podido!comprobar!que!el!dominio!quinasa!parece!tener!un!papel! importante! en! la! estabilización! y! en! la! especificidad! de! la! interacción.! Así,! mediante!análisis!de!doble!híbrido!se!vio!que!AtCBL3!puede!interaccionar!con!el! dominio!regulador!de!AtCIPK6!y!AtCIPK5!(Kim,!Cheong!et!al.!2000).!Sin!embargo,! cuando! se! emplearon! las! proteínas! integras,! sólo! AtCIPK6! interaccionaba! con! AtCBL3!en!levaduras.!También!se!observó!que!la!proteína!quimérica!AtCIPK5/6! (dominio!quinasa/dominio!regulador)!no!era!capaz!de!interaccionar!con!AtCBL3,! indicando! una! influencia! negativa! del! dominio! quinasa! de! AtCIPK5! en! la! interacción!(Kim,!Cheong!et!al.!2000).! S Diferencias!en!la!activación!de!proteínas!dianas! La! formación! concreta!de! determinados! complejos! CBL/CIPKs! da! lugar! a! la! interacción! específica! con!proteínas! dianas! y! constituye! el! último! aspecto! que! ayudaría!a!generar!especificidad!en!la!respuesta!de!la!señalización!a!Ca2+.!Así!por! ejemplo!AtCIPK1!es!regulada!de!diferente!manera!por!dos!AtCBLs.!Mientras!que! la!interacción!de!AtCBL1!con!AtCIPK1!es!importante!en!la!regulación!de!procesos! aguaSabajo!durante!la!señalización!a!estrés!salino,!el!complejo!AtCBL9/AtCIPK1! media!la!respuesta!a!ABA!(Cheong,!Pandey!et!al.!2007)!y!(Pandey,!Cheong!et!al.! 2004).!De!igual!forma!se!ha!visto!que!AtCBL1!y!AtCBL9!activan!a!AtCIPK23!con!la! consecuente!fosforilación!de!AKT1,!mientras!que!AtCBL5!y!AtCBL8,!que!también! forman!complejo!con!AtCIPK23,!no!son!capaces!de!activar!a!AKT1!(Xu,!Li!et!al.! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 29! 2006).! Esto! implica! que! la! interacción! de! las! CIPKs! con! las! CBLs! modula! la! especificidad!de!unión!a!las!dianas!de!CIPKs.! I.+5.Universal*stress*protein+(Usp)+ En!un!estudio!reciente!realizado!en!nuestro!laboratorio!se!identificó!la!proteína! SlRD!como!diana!de!fosforilación!de!la!quinasa!SlCIPK6.!La!comparación!de!la! secuencia! de! aminoácidos!de! este! clon!con! las! secuencias! depositadas! en! las! bases!de!datos!revelaron!que!SlRD! tiene!una! alta!homología!con!la!familia!de! proteínas!UspA!(Universal1stress1protein1A).! Universal1 stress1 proteína1A1 (UspA)! fue! el! nombre! que! se! le! dio! a! la! proteína! inicialmente! conocida! como! C13.5,! ya! que! se! su! expresión! era! fuertemente! inducida!por!una!gran!variedad!de!estímulos!(VanBogelen,!Hutton!et!al.!1990).! En!1992!se!clonó!el!gen!y!posteriormente!fue!registrado!como!dominio!(Pfam! número!de!acceso!PF0582).!Hasta!el!momento!se!han!identificado!más!de!2000! proteínas!que!contienen!el!dominio!Usp!y!que!forman!parte!del!genoma!de!una! gran!variedad!de!organismos!tales!como!bacterias,!arqueas,!hongos,!protozoos!y! plantas!(Aravind,!Anantharaman!et!al.!2002).! Los! genes! usp1 pueden! codificar! a! proteínas! con! diferente! tamaño! y! diferente! carga!de!dominios!Usp.!Pueden!dar!lugar!a!pequeñas!proteínas!con!tan!solo!un! dominio,!a!proteínas!de!mayor!tamaño!y!con!dos!dominios!dispuestos!en!tanden! o!por!último!codificar!a!proteínas!de!mayor!complejidad!y!con!varios!dominios! funcionales! siendo! uno! de! ellos! el! Usp.! El! genoma! de! E.1 coli!codifica! a! seis! proteínas!Usps!diferentes!denominadas!UspA,!UspC,!UspD,!UspE,!UspF!y!UspG!y! divididas!en!cuatro!clases!en!base!a!la!similitud!del!dominio!Usp.!!UspA,!UspC!y! UspD!!pertenecen!a!la!clase!I!mientras!que!UspF!y!UspG!pertenecen!a!la!clase!II! (Figura!I.6).!La!UspE!es!una!proteína!con!dos!dominios!Usp!repetidos!en!tanden! que!parece!ser!el!resultado!de!una!duplicación!génica.!Por!una!parte!el!dominio!2! de! la! UspE! se! encuentra! filogenéticamente! mas! relacionado! con! la! subfamilia! UspFG!y!pertenece!a!la!clase!IV!mientras!que!el!dominio!1!está!mas!relacionado! con!la!subfamilia!UspA!y!forma!parte!de!la!clase!III.! ! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 30! ! ! ! ! ! ! ! ! El!gen!UspA!es!el!mejor!caracterizado!de!la!familia!Usp!de!E.1coli.!La!proteína!se! sintetiza!durante!la!fase!estacionaria!y!en!respuesta!a!numerosos!agentes!que! causan! inhibición! del! crecimiento! (Nystrom! and! Neidhardt! 1992).! El! mutante! uspA!detiene!su!crecimiento!cuando!se!expone!a!diversos!!agentes!de!estrés!y!en! condiciones!prolongadas!de!ausencia!de!fuente!de!carbono.!Además!se!observó! que!en!el!mutante!el!tiempo!de!expresión!de!los!genes!de!respuesta!a!hambre!es! diferente!que!el!mostrado!en!el!silvestre,!dando!lugar!a!un!diferente!patrón!en!la! síntesis! de! proteínas! (Nystrom! and! Neidhardt! 1994).! Por! otro! lado! la! sobreexpresión! del! gen! UspA!genera! cambios! en! el! punto! isoeléctrico! (pI)! de! determinadas!proteínas!por!lo!que!se!ha!postulado!que!podría!estar!involucrada! en!las!modificaciones!postraduccionales!de!éstas!(Nystrom!and!Neidhardt!1996).!! Hasta! el! momento! se! han! identificado! una! serie! de! factores! que! controlan! la! expresión!de!UspA!y!entre!las!que!se!encuentra!la!proteína!FadR,!la!cual!reprime! su!expresión!(Kvint,!Hosbond!et!al.!2000).!FadR!tiene!una!acción!dual,!por!una! parte!actúa!como!un!represor!de!genes!involucrados!en!la!degradación!de!ácidos! grasos! (genes! fad)! y! por! otra! parte! actúa! como! un! activador! de! los! genes! involucrados!en! su!biosíntesis!(genes!fab).!Al!igual! que!UspA,!los!genes!fad!se! inducen!durante!la!fase!estacionaria!de!E.1coli,!lo!que!condujo!a!la!hipótesis!de! que! el! aumento! de! la! expresión! de! UspA! en! las! condiciones! de! ! crecimiento! detenido!era!debido!a!la!inactivación!como!represor!de!FadR.!Sin!embargo!esta! !"#$ !"#$%&'& !"#$%&''& !"#$%&'''& !"#$%&'(& Figura+I.5:!Clasificación+de+las+Usps+de+bacterias+en+4+Clases.!Análisis!filogenético!de!las!seis! proteínas!Usps!presentes!en!E.1coli.!Las!proteínas!UspA,!UspD!y!UspC!pertenecen!a!la!clase!I,!UspF! y! UspG! forman! la! clase! II,! el! primer! dominio! Usp! de! UspE! forma! la! clase! III! y! por! último,! el! segundo!dominio!Usp!de!UspE!forma!la!clese!IV.!+ Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 31! dependencia!solo!tiene!lugar!parcialmente.!El!papel!de!UspA!en!la!biosíntesis!de! ácidos!grasos!aún!no!está!claro!(Farewell,!Diez!et!al.!1996).!! Además!uspA!también!parece!ser!que!es!regulada!por!la!proteínas!FtsK!y!RecA.! La! proteína! FtsK! se! encarga! de! coordinar! la! separación! de! los! cromosomas! durante!la!división!celular!y!en!donde!la!parte!citoplasmática!CSterminal!de!la! proteína!juega!un!importante!papel.!(Aussel,!Barre!et!al.!2002).!Las!cepas!de!E.1 coli!que!carecen!de!este!extremo!dan!lugar!a!una!superinducción!del!gen!uspA!y! de!los!genes!implicados!en!la!respuesta!SOS.!La!respuesta!SOS!es!un!sistema!que! contiene!la!bacteria!para!protegerla!de!agentes!que!causan!daños!en!el!DNA!y!en! la!que!participan!las!proteínas!RecA!y!LexA.!La!inducción!de!uspA!en!el!mutante! ftsK!es!dependiente!únicamente!de!RecA!y!no!de!LexA.!Tanto!el!mutante!ftsK!con! el!uspA!muestran!una!fuerte!inhinibición!del!crecimiento!en!contacto!con!luz!U.V! y!mitomicina!C,!dos!agentes!que!dan!lugar!a!daños!en!el!DNA.!Por!este!motivo!se! postuló! que! el! gen!UspA1 era! requerido! para! la! resistencia! al! daño! del! DNA! y! regulada!por!una!vía!dependiente!de!las!proteínas!RecA!y!FtsK!(Diez,!Gustavsson! et!al.!2000).!! En!un!estudio!reciente!se!ha!demostrado!que!la!estabilidad!del!mRNA!de!uspA! disminuye!drásticamente!en!el!mutante!ΔcspC!ΔcspE!y!aumenta!en!la!cepa!que! sobreSexpresa!CspC.!Las!proteínas!CspC!y!CspE!son!homólogas!a!la!proteína!CspA! (cold.shock1protein)!que!se!expresan!de!forma!constitutiva!a!37ºC!(Phadtare!and! Inouye! 2001).! Tanto! CspC! como! CspE! ! facilitan! un! entorno! idóneo! para! la! expresión!de!uspA,!pero!no!están!implicados!en!su!inducción.! Se! ha! descrito! que! UspA! es! fosforilada! en! residuos! de! serina! o! treonina! en! respuesta!a!agentes!que!causan!inhibición!del!crecimiento!(Freestone,!Nystrom! et! al.! 1997).! Inicialmente! se! identificó! como! una! proteína! con! capacidad! de! autofosforilación,!sin!embargo!posteriormente!se!describió!que!la!fosforilación! es! dependiente! de! la! fosfoproteína! ribosomal! TypA! (Freestone,! Trinei! et! al.! 1998).! Se! ha! postulado! que! esta! modificación! postraduccional! actúa! como! un! interruptor!lo!cual!activa!a!UspA!para!llevar!a!cabo!su!función!biológica.! En! 1998! se!obtuvo! el! cristal! de! la!proteína! con! dominio! UspA! MJ0577! de! la! bacteria! Methanococcus1 jannaschii!(Zarembinski,! Hung! et! al.! 1998).! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 32! Sorprendentemente!la!proteína!cristalizó!en!forma!de!homodímeros!y!con!una! molécula! de! ATP! unido! a! cada! monómero.! Mediante! análisis! bioquímicos! posteriores!se!observó!que!aunque!MJ0577!se!purificaba!con!ATP!unido,!ésta!era! incapaz!de!hidrolizarla.!El!procesamiento!del!ATP!solo!tenía!lugar!en!presencia! de! una! proteína! desconocida! presente! en! el! extracto! crudo! celular! de! M.1 jannaschii,! por! lo! que! se! sugirió! que! la! función! biológica! de! MJ0577! era! dependiente!de!su!capacidad!de!unión!a!ATP!(Zarembinski,!Hung!et!al.!1998).! Posteriormente!se!cristalizó!la!UspA!de!Haemophilus1influenzae,!la!cual!comparte! un!68%!de!similitud!con!la!UspA!de!E.1coli!(Sousa!and!McKay!2001).!A!diferencia! de!MJ0577!esta!vez!la!proteína!no!se!purificó!con!ATP!unido.!Estos!resultados! dieron!pie!a!sugerir!la!existencia!de!dos!clases!diferentes!dentro!de!la!familia!de! proteínas!con!dominio!Usp:!aquellas!que!unen!ATP!y!se!asemejan!a!MJ0577!y!las! que!no!lo!unen!y!estructuralmente!se!asimilan!a!HiUspA.!! Aunque! existe! una! cierta! conservación! en! los! aminoácidos! presentes! en! los! motivos!de!unión!a!ATP!entre!EcUspA!y!MJ0577!se!observó!que!ha!tenido!lugar! la! sustitución! de! residuos! de! glicina! por! glutamina! y! metionina! en! el! lazo! de! unión!al! trifosfato.!Mediante!alineamientos!múltiples!con!otros! organismos!se! llegó! a! la! conclusión! que! el! motivo! cuya! secuencia! corresponde! a! GS2XSGS9X! (S/T)!es!un!elemento!esencial!para!la!unión!a!ATP!y!en!el!que!las!glicinas!127!y! 141!de!MJ0577!son!sustituidas!por!glutamina!y!metionina!en!la!UspA!de!E.1coli! (Sousa!and!McKay!2001)En!función!a!estos!datos!se!!concluyó!que!la!presencia! de! residuos! voluminosos! en! los! motivos! de! unión! a! ATP! impiden! la! unión! al! nucleótido.! Otros! residuos! conservados! y! que! interactúan! con! la! molécula! de! ATP! en! la! proteína! MJ0577! es! el! aspartato! en! la! posición! 13! y! la! valina! 41! (Zarembinski,!Hung!et!al.!1998).!! En!plantas!se!han!descrito!numerosas!proteínas!con!dominio!Usp!que!responden! a!una!gran!variedad!de!estímulos!diferentes.!Sin!embargo!hasta!el!momento!no! se!ha!descrito!el!modo!exacto!de!actuación!de!ninguna!de!ellas.!Así!por!ejemplo! Kerk!y!colaboradores!en!el!año!2003!identificaron!44!proteínas!en!Arabidopsis! con! similitud! al! dominio! UspA! de! bacterias.! El! alineamiento! múltiple! de! las! secuencias!identificadas!mostró!que!todas!derivan!de!la!proteína!MJ5077!de!M.1 jannaschii!(Kerk,!Bulgrien!et!al.!2003).!Algunas!de!ellas!han!sido!estudiadas!con! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 33! mayor! profundidad.! Así! por! ejemplo! las! proteínas! At5g54430! (AtPHOS32)! y! At4g27320!(AtPHOS34)!son!fosforiladas!en!respuesta!a!elicitores!microbianos!en! células! de! Arabidopsis!y! además! AtPHOS23! es! capaz! de! interaccionar! con! AtMPK3! y! AtMPK6! (Merkouropoulos,! Andreasson! et! al.! 2008).! En! un! estudio! posterior! se! vio! que! At2g03720! estaba! involucrada! en! la! morfogénesis! de! las! raíces! aéreas! (Jones,! Raymond! et! al.! 2006)!y! que! el! gen! AtRD2! se! inducía! fuertemente! en! respuesta! al! tratamiento! de! deshidratación! (YamaguchiS Shinozaki,!Koizumi!et!al.!1992).! No!solo!en!Arabidopsis!se!han!identificado!proteínas!con!dominio!Usp.!En!el!año! 2000!Hohnjec!y!colaboradores!demostraron!que!la!proteína!VfENOD18!de!Vicia1 faba!estaba!implicada!en!la!formación!de!nódulos!en!la!raíz!y!que!además!era! capaz! de! unir! ATP,! primera! evidencia! de! la! unión! al! nucleótido! en! plantas! (Becker,!Moreira!et!al.!2001).!Al!mismo!tiempo!se!identificaron!los!genes!ER6!de! tomate!y!OsUSP1!de!arroz!en!respuesta!a!la!fitohormona!etileno!(Zegzouti,!Jones! et!al.!1999)!y!(Sauter,!Rzewuski!et!al.!2002).!Además!de!AtRD2!en!Arabidopsis!se! identificaron!varios!genes!que!responden!a!desecación,!como!por!ejemplo!GUSP1! y!GUSP2!de!Gossypium1arboreum!(Zahur,!Maqbool!et!al.!2009).!En!el!mismo!año! se!realizó!un!análisis!funcional!del!promotor!de!GUSP!de!algodón!y!se!comprobó! que!este!respondía!a!sequía,!ABA,!sal,!metales!pesados,!giberelina!y!oscuridad! (Zahur,!Maqbool!et!al.!2009).! La!superfamilia!UspA!se!encuentra!extensamente!representada,!sin!embargo!su! función!biológica!exacta!se!desconoce.!Se!ha!postulado!que!tanto!la!unión!a!ATP! como!su!fosforilación!son!importantes!para!su!función!(Freestone,!Nystrom!et!al.! 1997)!y! (Zarembinski,! Hung! et! al.! 1998).! Al! no! poseer! actividad! enzimática! intrínseca!se!ha!sugerido!que!su!papel!biológico!depende!de!la!interacción!con! una!segunda!proteína,!entre!las!que!podría!estar!una!ATPasa!(Zarembinski,!Hung! et!al.!1998).!Por!ello!no!es!de!extrañar!que!también!el!dominio!Usp!se!encuentre! formando!parte!de!proteínas!de!mayor!complejidad!que!posean!otros!dominios! funcionales.!Así!por!ejemplo!en!Arabidopsis!existen!22!proteínas!quinasas!que! contienen! además! un! dominio! UspA! en! su! secuencia.! El! sistema! mejor! caracterizado!es!el!de!la!proteína!quinasa!KdpD!de!E.1coli,!en!el!que!la!unión!del! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 34! ligando!a!través!de!su!dominio!UspA!da!lugar!a!un!cambio!conformacional!que! afecta!a!la!actividad!quinasa!(Heermann,!Weber!et!al.!2009).! ! + + Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 35! Bibliografía+ Albrecht,!V.,!O.!Ritz,!et!al.!(2001).!"The!NAF!domain!defines!a!novel!proteinS protein!interaction!module!conserved!in!Ca2+Sregulated!kinases."!EMBO! J!20(5):!1051S1063.! Aravind,!L.,!V.!Anantharaman,!et!al.!(2002).!"Monophyly!of!class!I!aminoacyl! tRNA!synthetase,!USPA,!ETFP,!photolyase,!and!PPSATPase!nucleotideS binding!domains:!implications!for!protein!evolution!in!the!RNA."! Proteins!48(1):!1S14.! Asai,!T.,!G.!Tena,!et!al.!(2002).!"MAP!kinase!signalling!cascade!in!Arabidopsis! innate!immunity."!Nature!415(6875):!977S983.! Aussel,!L.,!F.!X.!Barre,!et!al.!(2002).!"FtsK!Is!a!DNA!motor!protein!that!activates! chromosome!dimer!resolution!by!switching!the!catalytic!state!of!the! XerC!and!XerD!recombinases."!Cell!108(2):!195S205.! Axtell,!M.!J.,!S.!T.!Chisholm,!et!al.!(2003).!"Genetic!and!molecular!evidence!that!the! Pseudomonas!syringae!type!III!effector!protein!AvrRpt2!is!a!cysteine! protease."!Mol!Microbiol!49(6):!1537S1546.! Balbi,!V.!and!A.!Devoto!(2008).!"Jasmonate!signalling!network!in!Arabidopsis! thaliana:!crucial!regulatory!nodes!and!new!physiological!scenarios."! New!Phytol!177(2):!301S318.! Bari,!R.!and!J.!D.!Jones!(2009).!"Role!of!plant!hormones!in!plant!defence! responses."!Plant!Mol!Biol!69(4):!473S488.! Batelli,!G.,!P.!E.!Verslues,!et!al.!(2007).!"SOS2!promotes!salt!tolerance!in!part!by! interacting!with!the!vacuolar!H+SATPase!and!upregulating!its!transport! activity."!Mol!Cell!Biol!27(22):!7781S7790.! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 36! Batistic,!O.!and!J.!Kudla!(2004).!"Integration!and!channeling!of!calcium!signaling! through!the!CBL!calcium!sensor/CIPK!protein!kinase!network."!Planta! 219(6):!915S924.! Batistic,!O.,!R.!Waadt,!et!al.!(2010).!"CBLSmediated!targeting!of!CIPKs!facilitates! the!decoding!of!calcium!signals!emanating!from!distinct!cellular!stores."! Plant!J!61(2):!211S222.! Becker,!J.!D.,!L.!M.!Moreira,!et!al.!(2001).!"The!nodulin!vfENOD18!is!an!ATPS binding!protein!in!infected!cells!of!Vicia!faba!L.!nodules."!Plant!Mol!Biol! 47(6):!749S759.! Broadley,!M.!R.,!H.!C.!Bowen,!et!al.!(2003).!"Variation!in!the!shoot!calcium!content! of!angiosperms."!J!Exp!Bot!54(386):!1431S1446.! Cheng,!N.!H.,!J.!K.!Pittman,!et!al.!(2004).!"The!protein!kinase!SOS2!activates!the! Arabidopsis!H(+)/Ca(2+)!antiporter!CAX1!to!integrate!calcium!transport! and!salt!tolerance."!J!Biol!Chem!279(4):!2922S2926.! Cheong,!Y.!H.,!G.!K.!Pandey,!et!al.!(2007).!"Two!calcineurin!BSlike!calcium!sensors,! interacting!with!protein!kinase!CIPK23,!regulate!leaf!transpiration!and! root!potassium!uptake!in!Arabidopsis."!Plant!J!52(2):!223S239.! Chinchilla,!D.,!Z.!Bauer,!et!al.!(2006).!"The!Arabidopsis!receptor!kinase!FLS2! binds!flg22!and!determines!the!specificity!of!flagellin!perception."!Plant! Cell!18(2):!465S476.! Cunnac,!S.,!M.!Lindeberg,!et!al.!(2009).!"Pseudomonas!syringae!type!III!secretion! system!effectors:!repertoires!in!search!of!functions."!Curr!Opin! Microbiol!12(1):!53S60.! Diez,!A.,!N.!Gustavsson,!et!al.!(2000).!"The!universal!stress!protein!A!of! Escherichia!coli!is!required!for!resistance!to!DNA!damaging!agents!and! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 37! is!regulated!by!a!RecA/FtsKSdependent!regulatory!pathway."!Mol! Microbiol!36(6):!1494S1503.! Dolmetsch,!R.!E.,!K.!Xu,!et!al.!(1998).!"Calcium!oscillations!increase!the!efficiency! and!specificity!of!gene!expression."!Nature!392(6679):!933S936.! Dong,!X.!(2004).!"NPR1,!all!things!considered."!Curr!Opin!Plant!Biol!7:!547S552.! Durner,!J.,!D.!Wendehenne,!et!al.!(1998).!"Defense!gene!induction!in!tobacco!by! nitric!oxide,!cyclic!GMP,!and!cyclic!ADPSribose."!Proc!Natl!Acad!Sci!U!S!A! 95(17):!10328S10333.! Farewell,!A.,!A.!A.!Diez,!et!al.!(1996).!"Role!of!the!Escherichia!coli!FadR!regulator! in!stasis!survival!and!growth!phaseSdependent!expression!of!the!uspA,! fad,!and!fab!genes."!J!Bacteriol!178(22):!6443S6450.! Felix,!G.,!J.!D.!Duran,!et!al.!(1999).!"Plants!have!a!sensitive!perception!system!for! the!most!conserved!domain!of!bacterial!flagellin."!Plant!J!18(3):!265S276.! Flors,!V.,!J.!Ton,!et!al.!(2008).!"Interplay!between!JA,!SA!and!ABA!signalling!during! basal!and!induced!resistance!against!Pseudomonas!syringae!and! Alternaria!brassicicola."!Plant!J!54(1):!81S92.! Freestone,!P.,!T.!Nystrom,!et!al.!(1997).!"The!universal!stress!protein,!UspA,!of! Escherichia!coli!is!phosphorylated!in!response!to!stasis."!J!Mol!Biol! 274(3):!318S324.! Freestone,!P.,!M.!Trinei,!et!al.!(1998).!"Tyrosine!phosphorylation!in!Escherichia! coli."!J!Mol!Biol!279(5):!1045S1051.! Gong,!D.,!Y.!Guo,!et!al.!(2004).!"The!SOS3!family!of!calcium!sensors!and!SOS2! family!of!protein!kinases!in!Arabidopsis."!Plant!Physiol!134(3):!919S926.! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 44! Wasilewska,!A.,!F.!Vlad,!et!al.!(2008).!"An!update!on!abscisic!acid!signaling!in! plants!and!more."!Mol!Plant!1(2):!198S217.! Wasternack,!C.!(2007).!"Jasmonates:!an!update!on!biosynthesis,!signal! transduction!and!action!in!plant!stress!response,!growth!and! development."!Ann!Bot!100(4):!681S697.! Wendehenne,!D.,!J.!Durner,!et!al.!(2004).!"Nitric!oxide:!a!new!player!in!plant! signalling!and!defence!responses."!Curr!Opin!Plant!Biol!7(4):!449S455.! White,!P.!J.!and!M.!R.!Broadley!(2003).!"Calcium!in!plants."!Ann!Bot!92(4):!487S 511.! Woodward,!A.!W.!and!B.!Bartel!(2005).!"Auxin:!regulation,!action,!and! interaction."!Ann!Bot!95(5):!707S735.! Xing,!Y.,!W.!Jia,!et!al.!(2008).!"AtMKK1!mediates!ABASinduced!CAT1!expression! and!H2O2!production!via!AtMPK6Scoupled!signaling!in!Arabidopsis."! Plant!J!54(3):!440S451.! Xu,!J.,!H.!D.!Li,!et!al.!(2006).!"A!protein!kinase,!interacting!with!two!calcineurin!BS like!proteins,!regulates!K+!transporter!AKT1!in!Arabidopsis."!Cell! 125(7):!1347S1360.! Yamada,!T.!(1993).!"The!role!of!auxin!in!plantSdisease!development."!Annu!Rev! Phytopathol!31:!253S273.! YamaguchiSShinozaki,!K.,!M.!Koizumi,!et!al.!(1992).!"Molecular!cloning!and! characterization!of!9!cDNAs!for!genes!that!are!responsive!to!desiccation! in!Arabidopsis1thaliana:!sequence!analysis!of!one!cDNA!clone!that! encode!a!putative!transmembrane!channel!protein."!Plant!Cell!Physiol! 33(3):!217S224.! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 45! Yoshioka,!H.,!S.!Asai,!et!al.!(2009).!"Molecular!mechanisms!of!generation!for!nitric! oxide!and!reactive!oxygen!species,!and!role!of!the!radical!burst!in!plant! immunity."!Mol!Cells!28(4):!321S329.! Zahur,!M.,!A.!Maqbool,!et!al.!(2009).!"[Isolation!and!functional!analysis!of!cotton! universal!stress!protein!promoter!in!response!to!phytohormones!and! abiotic!stresses]."!Mol!Biol!(Mosk)!43(4):!628S635.! Zarembinski,!T.!I.,!L.!W.!Hung,!et!al.!(1998).!"StructureSbased!assignment!of!the! biochemical!function!of!a!hypothetical!protein:!a!test!case!of!structural! genomics."!Proc!Natl!Acad!Sci!U!S!A!95(26):!15189S15193.! Zegzouti,!H.,!B.!Jones,!et!al.!(1999).!"EthyleneSregulated!gene!expression!in! tomato!fruit:!characterization!of!novel!ethyleneSresponsive!and! ripeningSrelated!genes!isolated!by!differential!display."!Plant!J!18(6):! 589S600.! Zhang,!J.,!F.!Shao,!et!al.!(2007).!"A!Pseudomonas!syringae!effector!inactivates! MAPKs!to!suppress!PAMPSinduced!immunity!in!plants."!Cell!Host! Microbe!1(3):!175S185.! Zhang,!Z.,!Q.!Li,!et!al.!(2007).!"Dual!regulation!role!of!GH3.5!in!salicylic!acid!and! auxin!signaling!during!ArabidopsisSPseudomonas!syringae!interaction."! Plant!Physiol!145(2):!450S464.! Zipfel,!C.,!G.!Kunze,!et!al.!(2006).!"Perception!of!the!bacterial!PAMP!EFSTu!by!the! receptor!EFR!restricts!AgrobacteriumSmediated!transformation."!Cell! 125(4):!749S760.! Zipfel,!C.,!S.!Robatzek,!et!al.!(2004).!"Bacterial!disease!resistance!in!Arabidopsis! through!flagellin!perception."!Nature!428(6984):!764S767.! ! ! Introducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 46! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Objetivos!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 47! Objetivos* * Objetivos!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 48! * * Objetivos!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 49! Objetivos*! En! nuestro! laboratorio! se! ha! descrito! que! la! pérdida! de! función!de! SlCBL10!y! SlCIPK6!inhibe!eventos!de!PCD!asociados!a!la!respuesta!ETI!y!de!susceptibilidad! causadas!por!la!bacteria!patógena!Pst5DC3000!en!N.5benthamiana!y!tomate.!Sin! embargo! las! dianas! a! las! que! se! une! SlCIPK6! para! mediar! la! respuesta! a! la! infección! por! patógenos! se! desconocen.! Por! ello! en! nuestro! laboratorio! se! realizaron! dos!escrutinios! de! doble! híbrido! con! el! fin! de!identificar! posibles! proteínas!reguladoras!de!la!actividad!y/o!dianas!de!fosforilación!de!SlCIPK6.!De! los! 50! interactores! inicialmente! identificados! en! el! doble!híbrido!se! realizó!un! segundo! escrutinio! mediante! tecnología! VIGS! en! plantas! de! tomate! con! el! objetivo!de!seleccionar!aquellos!que!estuvieran!implicados,!al!igual!que!SlCIPK6,! en!susceptibilidad.!Finalmente!de!los!20!clones!que!se!encontraban!involucrados! en!la!respuesta!susceptible!se!seleccionó!CIP29!para!su!posterior!caracterización! en!detalle.!CIP29!presentó!una!alta!homología!a!la!proteína!AtRD2!de!Arabidopsis! por!lo!que!se!le!renombró!como!SlRD.! A!continuación!se!detallan!los!objetivos!generales!de!cada!uno!de!los!capítulos!en! los!que!se!encuentra!dividido!el!presente!trabajo!de!tesis:! 1. El! capítulo! 1! se! centró! en! la! caracterización! inicial! de! SlCBL10! y! SlCIPK6! Solanáceas.! ! 2. En! el! capítulo! 2! el! objetivo! principal! fue! la! identificación! de! proteínas! interactoras!de!SlCIPK6!implicadas,!al!igual!que!la!quinasa,!en!inmunidad.! ! 3. El!capítulo!3!se!dedicó!a!la!caracterización!en!detalle!de!SlRD,!la! diana! de! SlCIPK6!seleccionada!previamente.! ! ! ! ! Objetivos!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! 50! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 51! Capítulo)1:)) Caracterización)molecular)de) SlCBL10)y)SlCIPK6) ) Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 52! ) ) Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 53! Resultados) ) 1.1. Análisis)de)la)expresión)génica)de)SlCIPK6)y)SlCBL10)en)tomate) Como!primera!aproximación!a!la!caracterización!molecular!de!SlCIPK6!y!SlCBL10! se!analizó!la!acumulación!transcripcional!mediante!PCR!a!tiempo!real,!utilizando! para!ello!oligonucleótidos!específicos!para!cada!uno!de!los!genes,!así!como!para! el!gen!de!la!actina!(utilizado!como!control!endógeno!de!la!expresión).! Se! ha! caracterizado! el! patrón! en! la! acumulación! de! transcrito! de! SlCIPK6!y! SlCBL10!en!tomate! durante! la! respuesta! ETI!y! susceptible!desencadenada! por!! Pst!DC3000,!en!los!distintos!estadios!de!desarrollo,!en!respuesta!al!tratamiento! con! cloruro! sódico! y! con! manitol! (choque!osmótico)! y! al! tratamiento! con! distintas!hormonas!vegetales!mediadoras!de!la!respuesta!de!defensa!de!la!planta.!! 1.1.1. Acumulación!de!transcrito!en!diferentes!tejidos! Tanto!NbCIPK6!como!NbCBL10!se!identificaron!en!un!escrutinio!mediante!VIGS! (Virus?Induced?Gene?Silencing)!realizado!en!hojas!de!N.+benthamiana,!por!lo!tanto! era!importante!verificar!su!expresión!en!hojas!y,!por!extensión,!!en!otros!tejidos! de!tomate.!! En!la!figura!1.1!se!aprecia!como!el!transcrito!de!SlCIPK6!y!SlCBL10!se!acumula!en! todos!los!tejidos!analizados.!Los!niveles!de!mensajero!en!la!raíz!y!en!el!tallo!de! SlCIPK6!y!SlCBL10!contrasta!con!la!leve!acumulación!de!transcrito!en!la!raíz!y!su! elevada! expresión! en! el! tallo! detectadas! en! sus! ortólogos! AtCBL10!y! AtCIPK6+ (Quan,!Lin!et!al.!2007)!y!(Tripathi,!Parasuraman!et!al.!2009).)Las!diferencias!en!el! patrón! de! acumulación! de! transcrito!de! SlCBL10!y! SlCIPK6!en! los! tejidos! analizados!podrían!explicarse!por!una!divergencia!funcional!adquirida!durante! la!evolución.! ! ! ! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 60! mediante!microscopía!confocal.!La!proteína!de!fusión! SlCBL10[GFP!se!localiza! principalmente!en!la!periferia!celular!como!se!puede!observar!en!la!figura!1.6.! Esta!localización!podría!ser!citoplasmática!o!tonoplastídica!ya!que!se!descartó!la! localización! en! la! membrana! plasmática! al! no! colocalizar! con! el! marcador! de! membrana! FM4[64!(figura! 1.6.C).! A! diferencia! de! la! localización! vista!para! su! ortólogo! en! Arabidopsis!por! Quan! y! colaboradores,! que! describieron!que! AtCBL10!interaccionan!con!AtCIPK24!(SOS2)!en!la!membrana!plasmática!(Quan,! Lin!et!al.!2007).!Se!podría!considerar!que!SlCBL10!se!localiza!principalmente!en! el! tonoplasto!en! las! condiciones! ensayadas! ya! que! tanto! las!invaginaciones! intracelulares! como! el! bolsillo! nuclear! observado! en! la!figura!1.6.A!son! característicos! de! una! localización!en! la! membrana! tonoplastídica.! Esta! localización! observada! para! SlCBL10[GFP! es! similar! a! la! descrita! para! su! ortólogo!en!Arabidopsis!por!Kim!y!colaboradores!(Kim,!Waadt!et!al.!2007).! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura) 1.6:!Localización) intracelular) de) SlCBL10XGFP) en) células) epidérmicas) de) N.. benthamiana.)A))Localización!subcelular!de!SlCBL10[GFP!(verde).)B))Fluorescencia!derivada!del! marcador!de!membrana!FM4[64!(rojo).)C))Colocalización!de!A!y!B.)!La!construcción!SlCBL10[GFP! en! el! vector! pBIBA7! se! expresó! de! forma! transitoria! en! hojas! de! N.+ benthamiana!vía! Agrobacterium.!Pasados!dos!días!se!visualizó!la!expresión!en!un!microscopio!confocal.!Las!flechas! muestran!la!localización!observada!para!SlCBL10[GFP.!) !" #" !"#$!! !"#$!! $" Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 61! Posteriormente,! para! confirmar! los! resultados! observados! en! hojas! de! N.+ benthamiana,!se!realizó!un!ensayo!de!localización!celular!en!células!de!epitelio! de!cebolla!mediante! bombardeo!de! partículas!de! oro.!Para!ello!se! clonó!en! el! vector! pGEM[T! el! fragmento!comprendido! desde! el! promotor! 35S! hasta! el! terminador!OCS!de!la!construcción!SlCBL10[GFP!en!pBIBA7.!! Como!muestra!la!figura!1.7,!SlCBL10!se!localiza!principalmente!en!la!membrana! vacuolar.!La!localización!tonoplastídica!es!caracterizada!por!un!ensanchamiento! de!la!membrana!plasmática!y!de!la!vacuola!en!aquel!lugar!donde!se!localiza!el! núcleo! y! que! es! observado! de! nuevo! en! este! ensayo! (flecha!figura! 1.7.B).! Los! resultados! obtenidos! se! asemejan!al! visto! para! su! ortólogo! por! Kim! y! colaboradores,! en! el! que! AtCBL10! presenta! también! una! localización! tonoplastídica!(Kim,!Waadt!et!al.!2007).!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura)1.7:!Expresión)transitoria)de)SlCBL10)en)células)epiteliales)de)cebolla,)visualizada) mediante)microscopía)de)fluorescencia.)!A)!Localización!de!SlCB10[GFP!en!la!células!epitelial! de! cebolla.! B)!Aumento! de! la! zona! de! interés! de! A.! C)!Imagen! de! campo! claro! de! B.! La! construcción! SlCBL10[GFP! en! el! vector! pGEM[T! se! expresó! de! forma! transitoria! en! células! de! epitelio!de!cebolla!mediante!bombardeo!con!partículas!de!oro.!Pasadas!48!horas!se!visualizó!la! expresión! en! un! microscopio! de! fluorescencia.! ! La! fluorescencia! de! GFP! se! concentró! en! la! membrana!vacuolar,!que!sigue!al!contorno!celular!excepto!en!aquel!lugar!en!el!que!se!encuentra! el!núcleo,!donde!se!ensancha!(mostrado!con!una!flecha).! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 62! Para!determinar! la! localización! subcelular! de! SlCIPK6! en! hojas! de! N.+ benthamiana!se!siguieron!las!mismas!pautas!que!en!el!caso!de!SlCBL10[GFP!y!los! resultados!obtenidos!se!pueden!observar!en!la!figura!1.8.! La!proteína!SlCIPK6[GFP!se!localiza!predominantemente!en!la!periferia!celular! (figura!1.8.A).!Podemos!descartar!la!localización!en!la!membrana!plasmática,!ya! que! no! se! aprecia! un! solapamiento! con! el! marcador! de! membrana! FM4[64.! Además,! la! distribución! de! la! proteína! de! fusión! SlCIPK6[GFP! (figura!1.8.A,! flechas! blancas)! no! muestra! un! grosor! homogéneo!como! ocurre! con! SlCBL10[ GFP,!por!lo!que!se!podría!asumir!que!no!presenta!una!localización!tonoplastídica.! Tras! descartar! la! membrana! plasmática! y! el! tonoplasto! y! observar! que! la! fluorescencia! ocurre! entre! estas! dos! estructuras! se! puede! afirmar! que! la! distribución!de!la!proteína!de!fusión!se!localiza!en!el!citoplasma.!Así!mismo!en!la! figura!1.8.A!se!observa!que!SlCIPK6!se!encuentra!en!el!núcleo.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura) 1.8:!Localización) intracelular) de) SlCIPK6XGFP) en) células) epidérmicas) de) N.. benthamiana.)A))Localización!subcelular!de!SlCBL10[GFP!(verde).)B))Fluorescencia!derivada!del! marcador!de!membrana!FM4[64!(rojo).)C)) Colocalización!de!A!y!B!La!construcción!SlCIPK6[GFP! en! el! vector! pBIBA7! se! expresó! de! forma! transitoria! en! hojas! de! N.+ benthamiana!vía! Agrobacterium.!Pasados!dos!días!se!visualizó!la!expresión!en!un!microscopio!confocal.!Las!flechas! muestran!la!localización!observada!para!SlCIPK6[GFP) !"#$%% !" #" !&#$%% $" Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 63! A! continuación! se! llevó! a! cabo! el! estudio! de! la! localización! celular! !de!!!!!!!! SlCIPK6[GFP!en!células!de!epitelio!de!cebolla.!La!proteína!de!fusión!SlCIPK6[GFP! presenta! una! localización! nuclear! (1.9.B)! y! citoplasmática! (1.9.C),! similar! a! la! observada!en!N.+benthamiana.!La!gran!vacuola!de!las!células!de!cebolla!deja!un! pequeño!hueco!en!el!polo!celular!donde!se!encuentra!el!citoplasma!y!se!puede! apreciar!y!diferenciar!la!localización!de!proteínas!citoplasmáticas!mediante!GFP.! La!localización!en!el!citoplasmas!y!núcleo!es!semejante!a!la!observada!con!otro! miembro!de!la!familia!de!las!CIPKs!en!Arabidopsis!(Cheong,!Pandey!et!al.!2007).! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 1.3. Caracterización) de) la) interacción) SlCBL10/SlCIPK6) ) mediante) doble)híbrido)en)levaduras) SlCBL10! y! SlCIPK6! se! identificaron! en! un! escrutinio! genético! mediante! silenciamiento!génico!inducido!por!virus,!en!el!que!las!plantas!silenciadas!para! cada! uno! de! los! genes!mostraban! una! inhibición! de!la!PCD! asociada! a! la! ETI! Figura)1.9:!Expresión)transitoria)de)SlCIPK6)en)células)epidérmicas)de)cebolla,)visualizada) mediante)microscopía)de)fluorescencia.)A))Localización!de!SlCIPK6[GFP!en!la!célula!epitelial! de!cebolla.!B!y!C)!Aumento!de!las!zonas!de!interés!de!A.!D!y!E)!Imagen!en!campo!claro!de!B!y!C! respectivamente.! La! construcción! SlCIPK6[GFP! en! el! vector! pGEM[T! se! expresó! de! forma! transitoria!en!células!de!epitelio!de!cebolla!mediante!bombardeo!con!partículas!de!oro.!Pasadas! 48!horas!se!visualizó!la!expresión!en!un!microscopio!de!fluorescencia.!!La!fluorescencia!de!GFP!se! concentró!en!el!núcleo!(B,!flecha!blanca)!y!el!citoplasma!(C,!flecha!blanca).!) Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 64! desencadenada! por!Pto/AvrPto.! Ambas!proteínas! podrían!actuar!en! el! mismo! módulo!de!señalización!mediante!su!interacción.!Para!demostrar!esto!se!llevó!a! cabo!un!ensayo!de!interacción!mediante!doble!híbrido!en!levaduras!basado!en!el! sistema! LexA! (Gyuris,! Golemis! et! al.! 1993).! Para! ello! se! clonaron! en! el! vector! pEG202! la!versión! silvestre!de! SlCIPK6! y! una! versión! mutante! carente! del! dominio!NAF,!responsable!de!la!unión!a!las!CBLs!(SlCIPK6ΔNAF).!Por!otro!lado,! en!el!vector!pJG4[5!se!clonó!el!cDNA!correspondiente!a!SlCBL10.!Los!ensayos!de! interacción! se! realizaron! en! la! cepa! de! S.+ cerevisiae!EGY48! y! los! resultados! obtenidos!se!muestran!en!la!figura!1.10.! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! Según! estos! resultados! SlCBL10! interacciona! mediante! doble! híbrido! con! la! forma!silvestre!de!SlCIPK6,!mientras!que!no!lo!hace!con!la!forma!que!carece!del! dominio! NAF! (necesario! para!su! interacción! con! la! CBL).! Análisis!previos! Figura)1.10:!Ensayo)de)doble)híbrido)entre!SlCIPK6)y)SlCBL10)en)levaduras.)A)!Ensayos!de! doble! híbrido! realizados! con! SlCIPK6! y! SlCIPK6ΔNAF! como! cebos! y! SlCBL10! como! presa.)B)! Western?blot!que! confirma! la! expresión! en! levaduras! de! SlCIPK6! y! SlCBL10,! usando! como! anticuerpos! anti[LexA! y! anti[HA! respectivamente.! La! cepa! de! levaduras! EGY48! se! usó! ! para! comprobar!la!interacción!entre!SlCIPK6!(clonada!en!el!vector!pEG202)!y!SlCBL10!(clonada!en!el! vector!pJG4[5).!Los!ensayos!se!realizaron!sobre!placas!que!fuerzan!la!interacción!(sin!LEU).!Los! cultivos!se!hicieron!crecer!durante!toda!la!noche!en!medio!mínimo!SD!(SD!Glu!–URA,![HIS!y!– TRP),!se!diluyeron!en!agua!estéril!y!se!sembraron!sobre!el!medio!correspondiente!a!una!DO600=! 0.1!y!0.01.!! ! !" #$%&'()" #$%&'()*+!," #$%-./0" #$%-./0" #$%&'()" #$%&'()*+!," 123404" 153678" 135678" #$%-./0" 9%:;<="9'>:?@=" 0A/" 0A0/" !"#$%&'()*+,-./*0 1200 3200 4400 !"#$%&',-./*0 !"#5-67,8*0 !,8*0 !,-./*0 9:0 50 Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 65! mediante!doble!híbrido!demostraron!que!cada!CBL!une!un!determinado!número! de!CIPKs! con! diferente!afinidad!(Das! y!Pandey! 2010).! Para! comprobar! que! la! interacción!SlCBL10/SlCIPK6!es!específica!se!realizó!un!ensayo!de!doble!híbrido! entre!SlCBL10!y!dos!miembros!cercanos!de!la!familia!de!las!CIPKs,!SlCIPK11!y! SlCIPK14.! Como! se! muestra! en! la!figura!1.11,! no! se! observa! crecimiento! en! ninguno!de!las!dos!casos,!por!lo!tanto!no!interaccionan!y!asumimos!que!!SlCBL10! y!SlCIPK6!se!unen!de!forma!específica.! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 1.4. Generación) de) plantas) transgénicas) ) que) sobreexpresan) SlCBL10) en)N..benthamiana) Con! el! objetivo! de! investigar! la! función! específica! de! SlCIPK6! y! SlCBl10! en! Solanaceas,! se! generaron! plantas! transgénicas! para! ambos! genes! en! N.+ Figura) 1.11:!Ensayo) de) doble) híbrido) entre!SlCPK11) y) SlCIPK14) y) SlCBL10) en) levaduras.))))) A)!Ensayos!de!doble!híbrido!realizados!con!SlCIPK11!y!SlCIPK14!como!cebos!y!SlCBL10!como! presa.)B)!Western?blot!que!confirma!la!expresión!en!levaduras!de!SlCIPK11!y!SlCIPK14!y!SlCBL10,! usando!como!anticuerpos!anti[LexA!y!anti[HA!respectivamente.!La!cepa!de!levaduras!EGY48!se! usó!!para!comprobar!la!interacción!entre!SlCIPK11!y!SlCIPK14!(clonadas!en!el!vector!pEG202)!y! SlCBL10! (clonada! en! el! vector! pJG4[5).! Los! ensayos! se! realizaron! sobre! placas! que! fuerzan! la! interacción!(sin!LEU).!Los!cultivos!se!hicieron!crecer!durante!toda!la!noche!en!medio!mínimo!SD! (SD! Glu! –URA,! [HIS! y! –TRP),! se! diluyeron! en! agua! estéril! y! se! sembraron! sobre! el! medio! correspondiente!a!una!DO600=!0.1!y!0.01.!! ) !" #$%&'())" #$%&'()*"#$%+,)-" #$%+,)-" .%/012".'3/452" -6)" -6-)" #$%&'()*"789*:;" #$%&'()*"789*:;" !!" #$%&'())*+,-." #$%/+)0*1." #$%&'()2*+,-." !*1." !*+,-." 34" 56" 76"" /" Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 66! benthamiana.!Para!ello!se!emplearon!las!construcciones!realizadas!en!el!vector! pBIBA7!(figura!1.5)!que!están!fusionadas!a!GFP!y!bajo!el!promotor!CaMV!35S.! Como! control! experimental! se! transformó! el! vector! vacío! pBIBA7.! La! transformación! en! planta! se! realizó! mediante! discos! de! N.+ benthamiana!vía! Agrobacterium!(apartado! 2.3! de! materiales! y! métodos).! Inicialmente! se! obtuvieron! 25! transformantes! para! SlCLB10,! 53! para! SlCBPK6! y! 15!para! GFP! (F0).! Se! nombró! como! F0!a! la! generación! obtenida! directamente! del! callo.! A! continuación,!para!confirmar!la!expresión!del!transgén,!se!analizó!la!F1!mediante! microscopía!confocal.!Tras!el!análisis!por!microscopía!se!confirmó!que!un!total! de! 7! plantas! sobre[expresaban! SlCBL10,! 5!plantas! sobre[expresaban! GFP! y! ninguna!lo!hacía!para!SlCIPK6.!Ni!en!esta!primera!transformación!ni!en!los!tres! intentos!posteriores!se!consiguió!obtener!plantas!que!sobre[expresaran!SlCIPK6[ GFP!de!forma!estable.!Debido!a!este!resultado,!el!estudio!de!la!sobre[expresión! en!plantas!de!N.+benthamiana!se!continuó!exclusivamente!con!SlCBL10.! De! las! 7! plantas! que! inicialmente! sobre[expresaban! SlCLB10[GFP! se! seleccionaron!cuatro!líneas!independientes!que!presentaban!una!sola!inserción! del!transgén! en!su! genoma.! Posteriormente! se!obtuvieron! homocigotas!de! las! líneas!1.1!y!6.5!de!SlCBL10[GFP.!Por!otro!lado!se!eligió!la!línea!homocigota!2.4!de! GFP!como!control!para!posteriores!experimentos.!A!continuación!se!comprobró! los! niveles! de! proteínas! para! cada! una! de! las! líneas! seleccionadas! mediante! western?blot.!!Para!ello!se!cargaron!30!μg!del!extracto!crudo!de!cada!una!de!las! líneas!analizadas.!Los!resultados!obtenidos!se!muestra!en!la!figura!1.12.! ! ! ! ! ! ! ! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 67! ! ! ! ! ! Como!muestra!la!figura!1.12!los!niveles!de!las!proteínas!sobre[expresada!!de!la! línea! SlCBL10[GFP!6.5! son! levemente! superiores! a! los! mostrados! en! la! línea! SlCBL10[GFP!1.1.!La! cantidad! de! proteína! transferida! a! la! membrana! se! cuantificó!mediante!tinción!con!rojo!de!Ponceau!(paneles!inferiores!figura!1.12).! 1.4.1. Sensibilidad! a! sal! de! las! plantas! transgénicas! SlCBL10! en! N.+ benthamiana! En!Arabidopsis,!la!participación!de!AtCBL10!en!estrés!salino!se!encuentra!bien! establecida.!El!mutante!Atcbl10!muestra!una!fuerte!inhibición!en!el!desarrollo! foliar!cuando!el!medio!es!suplementado!con!100!mM!de!NaCl!(Quan,!Lin!et!al.! 2007).! Por! este! motivo,! la! primera! aproximación! que! se! realizó! fue! probar! la! resistencia!a!sal!de!las!líneas!sobre[expresoras.!!! Inicialmente! se! observó! que,! en! condiciones! de! crecimiento! de! día! largo,!no! existían!diferencias!de!crecimiento!entre!la!línea!GFP2.4!y!las!sobre[expresoras! de!SlCBL10[GFP.!A!continuación!se!realizaron!ensayos!de!germinación!bajo!dos! concentraciones!diferentes!de!NaCl,!50!y!100!mM.!Los!resultados!obtenidos!se! muestran!en!la!figura!1.13.!! ! Figura)1.12:)Western:blot)de)las)líneas)sobreXexpresoras)SlCBL10XGFP)1.1,)SlCBL10XGFP)6.5) y)GFP)2.4.)Se)!Los!niveles!de!las!proteínas!sobre[expresadas!se!cuantificaron!mediante!western? blot,!usando!para!ello!el!anticuerpo!anti[GFP.!Se!cargaron!tres!réplicas!experimentales!idénticas.! La!tinción!con!rojo!Ponceau!(imágenes!inferiores)!muestran!la!cantidad!de!proteína!transferida! en!cada!ensayo.!) !"#$%&'()*+,-* !"#$%&'()*.,.* /0* 12* '()*3,4* 54* 3+** /0* 6&'()* 6&'()* Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 68! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! En!general!la!velocidad!de!germinación!en!los!medios!suplementados!con!NaCl! de!las!plantas!sobre[expresoras!SlCBL10[GFP!fue!mayor!que!la!observada!para! las! plantas!controles!(GFP!2.4).! En! condiciones! de! no! estrés! la!velocidad! de! germinación!de! las! tres! líneas! transgénicas! no! mostró! ninguna! diferencia! considerable!(figura!1.13.C,!O!mM).!! Como!se!observa!en!la!figura!1.13.A,!en!el!medio!suplementado!con!50!mM!de! NaCl,! la! velocidad! de! germinación! de! SlCBL[GFP! 6.6! y! 1.1! fue!mayor! que! la! mostrada! por! las! plantas!GFP! 2.4.! Al! cuarto! día!de! la! exposición! al! estrés!se! produjo!la!germinación!del!100%!de!las!semillas!de!todas!las!líneas!empleadas! en!el!experimento.!En! el!ensayo!realizado!en! el!medio! suplementado!con!100! mM!de!NaCl!la! diferencia! en! la! germinación! entre! las! líneas! sobre[expresoras! para!SlCBL10[GFP!y!GFP!fue!mayor!(figura!1.13.B).!Además!al!cuarto!día!de!la! exposición!del!estrés!solo!se!produjo!la!germinación!del!20%!de!las!semillas!de! Figura)1.13:!Velocidad)de)germinación)de)las)líneas)transgénicas)SlCBL10XGFP1.1)y)6.5)y) GFP) 2.4.) !A)!Ensayo!de!germinación!en!presencia!de!50!mM!de!NaCl!de!las!líneas!transgénicas! SlCBL10!1.1,!SlCBL10!6.5!y!GFP!2.4.!B)!Ensayo!de!germinación!en!100!mM!de!NaCl!de!las!líneas! transgénicas!SlCBL10!1.1,!SlCBL10!6.5!y!GFP!2.4.!C)!Fotografía!del!ensayo!control!(0!mM!NaCl).!El! experimento!se!repitió!un!mínimo!de!tres!veces.) !" #!" $!" %!" &!" '!!" '#!" !" '" #" (" $" )" *"+,-./012/30" 4/,.56"7891:;" ")!.<"=1>?" #@$" '@'" %@)" A !" #!" $!" %!" &!" '!!" !" '" #" (" $" )" *"+,-./012/30" 4/,.56"7891:;" '!!.<"=1>?" #@$" '@'" %@)" A Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 69! la!planta!control!GFP!2.4,!a!diferencia!de!los!resultados!obtenidos!en!el!ensayo! realizado!con!50!mM!de!NaCl.! Para!determinar!si!el!aumento!de!la!expresión!de!SlCBL10!afecta!al!desarrollo!de! la!raíz!en!condiciones!de!estrés!salino,!se!realizó!un!ensayo!de!transferencia!a! medios! suplementados! con! diferentes! concentraciones! de! NaCl.! Para! ello,! las! plántulas!germinadas!en!MS!con!cuatro!días!de!edad!se!transfirieron!a!medios! suplementado! con! 0,! 50,! 100! y! 150! mM! de! NaCl.! Los! resultados! obtenidos! se! pueden!observar!en!la!figura)1.14.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Las! plantas! SlCBL10[GFP! 1.1! y! 6.5!en! N.+ benthamiana!mostraron! diferencia! significativas!en!la!longitud!de!las!raíces!en!el!medio!suplementado!con!100!mM! de! NaCl! con! respecto! a! la! planta! control! (figura! 1.14).! Sin! embargo! a! concentraciones!menores!o!mayores!a!100!mM!no!se!obtuvo!ninguna!diferencia! considerable!en!la!longitud!de!las!raíces..!! Figura)1.14:!Respuesta)a)NaCl)de)las)plantas)transgénicas)para)SlCBL10.)A)!Longitud!de!las! raíces!de!las!líneas!SlCBL10[GFP!1.1!y!6.5!y!GFP!2.4!en!respuesta!a!0,!50,!100!y!150!mM!de!NaCl.! B)!Fotografía!realizada!a!los!nueve!días!de!la!transferencia.!Cuatro!días!después!de!la!germinación! en!medio!MS!sólido,!las!plántulas!de!SlCBL[GFP!6.5,!1.1!y!GFP!2.4!se!transfirieron!a!un!medio! suplementado!con!0,!50,!100!y!150!mM!de!NaCl.!La!longitud!de!la!raíz!se!midió!pasados!nueve! días!de!la!transferencia.!Al!experimento!se!repitió!un!mínimo!de!4!veces.) !" #" $!" $#" %!" %#" &!" '()"%*+" ,-.$!"$*$" ,-.$!"/*#" .0123456"7839:;"<==>" .?1:8;" !=@"A8,B" #!=A"A8,B" $!!=@"A8,B" $#!=@"A8,B" C Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 76! estrés,!iniciando!una!cascada!de!fosforilación!tras!la!unión!a!alguna!SlCBL!u!otro! sustrato.!Por!otra!parte,!el!papel!de!AtCBL10!en!la!respuesta!a!NaCl!en!raíz!está! muy!estudiado.!Tras!la!percepción!del!estímulo!se!produce!un! aumento! en! la! concentración!de!calcio!citosólico!que!activa!a!AtCBL10!y!forma,!posteriormente,! un!complejo!con!AtCIPK24!en!el!tonoplasto,!donde!transporta!sodio!al!interior! de!la!vacuola.!De!igual!forma!SlCBL10!podría!actuar!en!la!planta!de!tomate!(Kim,! Waadt!et!al.!2007).! En!conclusión,!los!resultados!obtenidos!muestran!que!SlCIPK6!y!SlCBL10!inducen! su! expresión! en! respuesta! a! patógenos,! hormonas! y! estreses! abióticos.! En! algunos! de! los! tratamientos! analizados! el! patrón! de! expresión! obtenido! para! ambos! genes! no! es! el!mismo,! indicándonos! un!! tiempo! de!actuación!desigual.! Estos! resultados! se! podrían! explicar! por! la! posible! formación! de! diferentes! complejos!SCBL10/SlCIPK!o!SlCBL/SlCIPK6!en!respuesta!a!los!distintos!estreses! u!órganos!vegetales.! Localización)subcelular)en)N..benthamiana) Una!vez!establecido!el!patrón!de!expresión!de!SlCIPK6!y!SlCBL10!en!tomate!se! procedió! a! estudiar! la! localización! subcelular! de! ambas! proteínas,! hecho! importante!para!limitar!las!posibles!funciones!en!la!célula.!! El!análisis!de!la!expresión!transitoria!de!la!fusión!SlCBL10[GFP!tanto!en!células! epidérmicas! de! N.+benthamiana!como! en! células! epiteliales! de! cebolla! revelan! una! localización! tonoplastídica,! que! es! similar! a! la! mostrada! para! su! ortólogo+ AtCBL10!por!Kim!y!colaboradores!(Kim,!Waadt!et!al.!2007).!En!Arabidopsis,!la! distribución! celular! de! las! CBLs! se! encuentra! relacionada! con! su! separación! filogenética!en!2!grupos!diferentes.!Mientras!que!AtCBL2!y!AtCBL10!(grupo!2)!se! encuentran! localizadas!en! la! membrana! vacuolar,! AtCBL1! y!AtCBL9! (grupo! 1)! están! localizadas! en! la! membrana! plasmática.! En! este! último! caso! las! modificaciones!lipídicas!son!importantes!para!su!localización!(Batistic,!Waadt!et! al.! 2010).! Se! ha! comprobado! ! que! AtCBL1,! AtCBL4,! AtCBL5! y! AtCBL9! se! meristoilan!en!su!extremo!N[terminal,!mientras!que!AtCBL1!se!S[acetila.!Por!otro! lado! AtCBL10! es! la! única! que! alberga! un! dominio! transmembrana! en! su! N[ terminal! y! que! también! se! encuentra! presente! en! SlCBL10.! Esta! singularidad! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 77! parece! ser! determinante! para! su! localización! en! la! membrana! del! tonoplasto! (Batistic,! Waadt! et!al.! 2010).!Además! se! ha! demostrado! que! el! extremo! N[ terminal!de!las!CBLs!es!importante!y!determina!su!distribución!espacial.! Por! otro! lado! la! fusión! CIPK6[GFP! tanto! en! células! epidérmicas! de! N.+ benthamiana+como!en!células!epiteliales!de!cebolla!mostró!una!localización!en!el! núcleo!y!el!citoplasma,!similar!a!la!observada!para!AtCIPK1,!AtCIPK24!y!AtCIPK8! (Kim,!Waadt!et!al.!2007)!y!(Batistic,!Sorek!et!al.!2008).!A!diferencia!de!las!CBLs,! las!!CIPKs!no!poseen!una!señal!de!localización!reconocible.!Estudios!previos!!de! fusiones!a!GFP!con!diferentes!CIPKs!de!Arabidopsis!mostraron!una!localización! en!el!citoplasma!y/o!el!núcleo.!Sin!embargo,!mediante!estudios!de!localización!de! los!complejos!CBL/CIPKs!!en!la!célula!mediante!BIFC!(Bimolecular+fluorescence+ complementation),! se! observó! que! las! CIPKs! son! dirigidas! a! diferentes! compartimentos! membranosos! cuando! unen! CBL.! Además,! dependiendo! del! complejo!que!se!forme!la!localización!variará.!Así!aunque!AtCIPK24!se!encuentra! normalmente! en! el! núcleo! y! el! citoplasma,! cuando! forma! el! complejo! con! AtCBL10!se!visualiza!en!el!tonoplasto,!!pero!si!el!complejo!se!forma!con!AtCBL4! su!localización!se!produce!en!la!membrana!plasmática!(Kim,!Waadt!et!al.!2007).! Por!otra!parte,!en!nuestro!laboratorio!se!ha! descrito!la! implicación!directa!de! SlCBL10! y! SlCIPK6! en! la! inmunidad! innata! en! Solanáceas.! Además! se! ha! comprobado,!mediante!BiFC,!que!la!interacción!entre!SlCBL10!y!SlCIPK6!tiene! lugar!en!el!tonoplasto!en!las!condiciones!ensayadas.!Aunque!hasta!el!momento! no! hay! mucho! discutido! sobre! la! implicación! de! proteínas! localizadas! en! el! tonoplasto! en! la! defensa! vegetal,! recientemente! se! ha! comprobado! que! el! contenido! de! la! vacuola! es! liberado! y! acumulado! en! el! espacio! extracelular! inducido! por! HR! (Zhou,! Cheung! et! al.! 2010).! Sin! embargo! se! desconoce! la! implicación!biológica!de!las!proteínas!localizadas!en!la!membrana!vacuolar!en! este!proceso.!Otra!posibilidad!es!que!el!complejo!SlCBL10/SlCIPK6!se!localice!en! otro!compartimento!tras!la!percepción!del!patógeno.! ! ! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 78! Caracterización)de)la)interacción)SlCIPK6/SlCBL10)mediante)doble)híbrido) en)levaduras) Los!resultados!obtenidos!en!el!doble!híbrido!muestran!que!SlCBL10!interacciona! con!la!forma!silvestre!de!SlCIPK6,!mientras!que!no!lo!hace!con!la!forma!!que!tiene! eliminado!el!dominio!NAF,!necesario!para!su!unión!con!las!CBLs!(Albrecht,!Ritz! et! al.! 2001).! Además,! se! ha! verificado! que! esta! unión! es! específica,! ya! que! SlCBL10! no! interacciona! ni! con! SlCIPK11! ni! con! SlCIPK14,! dos! miembros! cercanos! a! SlCIPK6.! Sin! embargo! no! se! puede! descartar! la! unión! de! ambos! a! otros!miembros!de!la!familia.!Así!por!ejemplo,!AtCIPK6!interacciona!con!AtCBL3! y! AtCBL4! (Kolukisaoglu,! Weinl! et! al.! 2004)!mientras! que! AtCBL10! se! une! a! AtCIPK24,!como!ya!se!ha!mencionado!en!numerosas!ocasiones.!Seguramente!la! especificidad! a! la! hora! de! formar! complejos! SlCIPK6/SlCBL! o! SlCIPK/SlCBL10! vendrá!determinada!por!el!estímulo!percibido.!Como!ya!se!ha!mostrado!en!este! trabajo,! ambos! genes! son! inducidos! en! respuesta! a! numerosos! tratamientos! y! además!el!patrón!de!expresión!observado!es!diferente!en!algunos!de!los!casos,! sugiriendo!el!diferente!punto!de!actuación!para!SlCIPK6!y!SlCBL10.!Además,!la! formación!de!diferentes!complejos!CIPK/CBL!conllevaría!la!interacción!de!cada! uno! de! ellos! con! numerosas! proteínas! controlando! de! esta! forma! un! gran! abanico!de!rutas!metabólicas.! Generación) de) plantas) transgénicas) que) sobreexpresan) SlCBL10) en) N.. benthamiana) Con! el!objetivo! de! investigar! la! función! específica! de! SlCIPK6! y! SlCBL10! en! Solanáceas,! se! generaron! plantas! que! sobre[expresen! de! forma! estable! ambos! genes.!Desafortunadamente!solo!se!consiguió!obtener!plantas!transgénicas!de!N.+ benthamiana!para!SlCBL10[GFP.!Al!ser!SlCIPK6!una!quinasa,!posiblemente!active! numerosas! rutas! de! fosforilación! que! hagan! que! sea! inviable! su! continua! actuación.!! Cuando!la!planta!se!encuentra!expuesta!a!altas!concentraciones!de!sal!se!produce! un! aumento! en! la! concentración! de! Ca2+!citosólico,! iniciándose! entonces! los! mecanismos!requeridos!para!la!detoxificación!dependientes!de!Ca2+!(Luan,!Kudla! et! al.! 2002).! En! la! célula! vegetal! la! detoxificación! tiene! lugar! por! dos! vías! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 79! diferentes.!En!una!de!ellas!ocurre!la!exportación!de!los!iones!tóxicos!al!exterior! de!la!célula!mediante!transportadores!específicos!localizados!en! la!membrana! plasmática.! El! otro! mecanismo! consiste! en! el! almacenamiento! de! los! iones! en! orgánulos! específicos! (Hasegawa,! Bressan! et! al.! 2000).! En! Arabidopsis,! el! complejo! AtCBL10/AtCIPK24! se! identificó! como! un! componente! en! la! señalización!por!Ca2+!que!regula!la!detoxificación!a!sal!mediante!la!acumulación! de! iones! en! el! interior! de! la! vacuola.! ! Por! ello,! la! primera! aproximación! para! establecer! la! función! específica! de! SlCBL10! en! Solanaceas! fue! probar! la! sensibilidad!a!sal!de!las!líneas!sobreexpresoras.! Como! primer! ensayo! se! realizó! un! test! de! germinación! en! medio! con! altas! concentraciones!de!NaCl.!El!resultado!obtenido!muestra!una!mayor!resistencia! de!las!líneas!sobreexpresoras!SlCBL10[GFP!1.1!y!6.5!con!respecto!al!control!(GFP! 2.4).! La! germinación! en! Arabidopsis!se! encuentra! controlada! por! diferentes! fitohormonas!como!ABA!y!giberelinas!(GA).!En!la!semilla!el!ABA!previene!de!la! perdida!de!la!pared!celular!y!como!consecuencia!evita!la!captura!de!agua!y,!de! esta!forma,!aumenta!la!durmancia!de!la!semilla.!La!germinación!se!produce!si!la! semilla! es! capaz! de! reducir! los! niveles! de! ABA.! Como! ya! se! ha! visto! anteriormente,! SlCBL10,! es! altamente! inducida! por! ABA,! pudiendo! estar! involucrada!en!procesos!de!germinación!dependientes!de!esta!hormona.! Por!otro!lado,!también!se!ha!visto!que!las!plantas!de!N.+benthamiana!SlCBL10[ GFP!1.1!y!6.5!muestran!una!mayor!resistencia!a!altas!concentraciones!de!NaCl.!A! concentraciones!de!100!mM!de!NaCl!las!plantas!!transgénicas!para!SlCBL10[GFP! mostraron!una!mayor!longitud!de!las!raíces.!En!Arabidopsis!el!mutante!atcbl10+ muestra!una!importante!inhibición!del!crecimiento!del!tejido!aéreo!y!no!en!la! raíz,!cuando!el!medio!es!suplementado!con!alta!concentración!de!NaCl!(Quan,!Lin! et! al.! 2007).! Esto! es! debido! a! que! la! actuación! de! AtCBL10! en! la! planta! es! exclusiva! de! la! parte! aérea.! Se! ha! descrito! que! la! CBL! responsable! de! la! detoxificación!en!la!raíz!es!AtCBL4.!Además,!la!expresión!de!AtCBL10!en!la!raíz! es!indetectable,!a! diferencia!de! lo!que! ocurre!en! tomate.!Esta! diferencia!en! la! acumulación! de! transcrito! podría! indicar! una! divergencia! funcional! en! ambos! genes.! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 80! Estos! resultados! muestran! la! implicación! directa! de! SlCBL10! en! la! ruta! de! señalización!iniciada!en!respuesta!a!altas!concentraciones!de!sal!en!Solanáceas.!A! diferencia! de! Arabidopsis,!SlCBL10! se! expresa! en! la! raíz! y! posiblemente! sea! responsable!del!fenotipo!de!resistencia!a!sal!obtenido.!Como!ya!se!ha!nombrado! anteriormente,!los!complejos!AtCIPK23/AtCBL4!en!la!raíz!y!AtCIPK23/AtCBL10! en!la!hoja!son!los!responsables!de!la!detoxificación!a!NaCl!en!Arabidopsis.!Sin! embargo,!en!tomate!se!desconoce!la!SlCIPK!que!formaría!complejo!con!SlCBL10! bajo!estas!condiciones.!Por!otro!lado,!tanto!la!mayor!acumulación!de!transcrito! en! respuesta! a! ABA! como! la! mayor! velocidad! de! germinación! de! las! plantas! transgénicas!en!respuesta!a!NaCl!podría!indicar!la!implicación!de!SlCBL10!en!la! ruta! de! señalización! mediada! por! ABA.! En! Arabidopsis!se! ha! descrito! la! participación!de!varias!CIPKs!y!CBLs!en!la!señalización!por!ABA.!Por!ejemplo,!el! mutante!Atcipk3!y+Atcipk14!presentaban!una!mayor!inhibición!en!la!germinación! en! respuesta! a! ABA!y! NaCl! en! comparación! al! silvestre! (Pandey,! Grant! et! al.! 2008).! Además,! AtCIPK14! mostró! una! fuerte! inducción! en! respuesta! a! tratamientos!con!NaCl!y!ABA!(Qin,!X!et!al.!2008).! La! futura! identificación! de! las! CIPKs! que! forman! complejos! con! SlCBL10! en! tomate,! así! como! la! identificación! de! dianas! de! fosforilación! de! SlCIPK6,! ayudarían! a! profundizar! en! el! entendimiento! de! la! función! que! ambos! genes! realizan!en!Solanáceas.! ! ! ! ! ! ) ) Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 81! Bibliografía) Albrecht,! V.,! O.! Ritz,! et! al.! (2001).! "The! NAF! domain! defines! a! novel! protein[ protein!interaction!module!conserved!in!Ca2+[regulated!kinases."!EMBO! J!20(5):!1051[1063.! Bari,! R.! and! J.! D.! Jones! (2009).! "Role! of! plant! hormones! in! plant! defence! responses."!Plant!Mol!Biol!69(4):!473[488.! Batistic,!O.,!N.!Sorek,!et!al.!(2008).!"Dual!fatty!acyl!modification!determines!the! localization! and! plasma! membrane! targeting! of! CBL/CIPK! Ca2+! signaling!complexes!in!Arabidopsis."!Plant!Cell!20(5):!1346[1362.! Batistic,!O.,!R.!Waadt,!et!al.!(2010).!"CBL[mediated!targeting!of!CIPKs!facilitates! the!decoding!of!calcium!signals!emanating!from!distinct!cellular!stores."! Plant!J!61(2):!211[222.! Becker,!D.!(1990).!"Binary!vectors!which!allow!the!exchange!of!plant!selectable! markers!and!reporter!genes."!Nucleic!Acids!Res!18(1):!203.! Cheong,!Y.!H.,!G.!K.!Pandey,!et!al.!(2007).!"Two!calcineurin!B[like!calcium!sensors,! interacting!with!protein!kinase!CIPK23,!regulate!leaf!transpiration!and! root!potassium!uptake!in!Arabidopsis."!Plant!J!52(2):!223[239.! Das,! R.! and! G.! K.!Pandey! (2010).! "Expressional! analysis! and! role! of! calcium! regulated!kinases!in!abiotic!stress!signaling."!Curr!Genomics!11(1):!2[13.! Evans,!N.!H.,!M.!R.!McAinsh,!et!al.!(2001).!"Calcium!oscillations!in!higher!plants."! Curr!Opin!Plant!Biol!4(5):!415[420.! Gyuris,! J.,! E.! Golemis,! et! al.! (1993).! "Cdi1,! a! human! G1! and! S! phase! protein! phosphatase!that!associates!with!Cdk2."!Cell!75(4):!791[803.! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 82! Hasegawa,! P.! M.,! R.! A.! Bressan,! et! al.! (2000).! "Plant! Cellular! and! Molecular! Responses!to!High!Salinity."!Annu!Rev!Plant!Physiol!Plant!Mol!Biol!51:! 463[499.! Hofius,! D.,! D.! I.! Tsitsigiannis,! et! al.! (2007).! "Inducible! cell! death! in! plant! immunity."!Semin!Cancer!Biol!17(2):!166[187.! Kim,! B.! G.,! R.! Waadt,! et! al.! (2007).! "The! calcium! sensor! CBL10! mediates! salt! tolerance!by!regulating!ion!homeostasis!in!Arabidopsis."!Plant!J!52(3):! 473[484.! Kolukisaoglu,!U.,!S.!Weinl,!et!al.!(2004).!"Calcium!sensors!and!their!interacting! protein! kinases:! genomics! of! the! Arabidopsis! and! rice! CBL[CIPK! signaling!networks."!Plant!Physiol!134(1):!43[58.! Kwak,!J.!M.,!I.!C.!Mori,!et!al.!(2003).!"NADPH!oxidase!AtrbohD!and!AtrbohF!genes! function! in! ROS[dependent! ABA! signaling! in! Arabidopsis."! EMBO! J! 22(11):!2623[2633.! Luan,! S.,! J.! Kudla,! et! al.! (2002).! "Calmodulins! and! calcineurin! B[like! proteins:! calcium! sensors! for! specific! signal! response! coupling! in! plants."! Plant! Cell!14)Suppl:!S389[400.! Overmyer,!K.,!M.!Brosche,!et!al.!(2003).!"Reactive!oxygen!species!and!hormonal! control!of!cell!death."!Trends!Plant!Sci!8(7):!335[342.! Pandey,!G.!K.,!J.!J.!Grant,!et!al.!(2008).!"Calcineurin[B[like!protein!CBL9!interacts! with! target! kinase! CIPK3! in! the! regulation! of! ABA! response! in! seed! germination."!Mol!Plant!1(2):!238[248.! Pedley,!K.!F.!and!G.!B.!Martin!(2003).!"Molecular!basis!of!Pto[mediated!resistance! to!bacterial!speck!disease!in!tomato."!Annu!Rev!Phytopathol!41:!215[ 243.! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! 83! Qin,!Y.,!L.!i.!X,!et!al.!(2008).!"Regulation!of!salt!and!ABA!responses!by!CIPK14,!a! calcium! sensor! interacting! protein! kinase! in! Arabidopsis."! Sci!China! C! Life!Sci!51(5):!391[401.! Qiu,!Q.!S.,!Y.!Guo,!et!al.!(2002).!"Regulation!of!SOS1,!a!plasma!membrane!Na+/H+! exchanger!in!Arabidopsis!thaliana,!by!SOS2!and!SOS3."!Proc!Natl!Acad! Sci!U!S!A!99(12):!8436[8441.! Quan,! R.,! H.! Lin,! et! al.! (2007).! "SCABP8/CBL10,! a! putative! calcium! sensor,! interacts! with! the! protein! kinase! SOS2! to! protect! Arabidopsis! shoots! from!salt!stress."!Plant!Cell!19(4):!1415[1431.! Torres,! M.! A.,! J.! L.! Dangl,! et! al.! (2002).! "Arabidopsis! gp91phox! homologues! AtrbohD!and!AtrbohF!are!required!for!accumulation!of!reactive!oxygen! intermediates!in!the!plant!defense!response."!Proc!Natl!Acad!Sci!U!S!A! 99(1):!517[522.! Tripathi,! V.,! B.! Parasuraman,! et! al.! (2009).! "CIPK6,! a! CBL[interacting! protein! kinase!is!required!for!development!and!salt!tolerance!in!plants."!Plant!J! 58(5):!778[790.! Wasilewska,!A.,!F.!Vlad,!et!al.!(2008).!"An!update!on!abscisic!acid!signaling!in! plants!and!more."!Mol!Plant!1(2):!198[217.! Yokoi,! S.,! F.! J.! Quintero,! et! al.! (2002).! "Differential! expression! and! function! of! Arabidopsis! thaliana! NHX! Na+/H+! antiporters! in! the! salt! stress! response."!Plant!J!30(5):!529[539.! Zhou,! L.,! M.! Y.! Cheung,! et! al.! (2010).! "Rice! hypersensitive! induced! reaction! protein! 1! (OsHIR1)! associates! with! plasma! membrane! and! triggers! hypersensitive!cell!death."!BMC!Plant!Biol!10:!290.! ! ! Caracterización+molecular+de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!1! ! ! 84! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 85! Capítulo)2:)) Identificación)de)proteínas)que) interaccionan)con)SlCIPK6) mediante)doble)híbrido) ) Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 92! La! cepa! EGY48! de! S.+ cerevisae!que!portaba!el! plásmido! pSH18B34! (con!el! gen! reportero!LacZ)!y!la!construcción!pEG202BSlCIPK6/SlCIPK6T172D!se!transformó! con!la!genoteca!de!tomate.!Posteriormente!un!total!de!4,5!·!103!transformantes! para! SlCIPK6T172D!y! 1,1! ·! 103!transformantes! para! SlCIPK6! se! sometieron! a! condiciones! selectivas!que! forzaban!la! interacción![SD! 2%! (p/v)! Galactosa/Rafinosa!sin!Ura,!Trp,!His!ni!Leu]!durante!3B4!días!a!30ºC.!Las!colonias! crecidas!se!sometieron!a!un!segundo!test!de!selección!y!se!eligieron!aquellas!que! crecieron!en!un!medio!sin!Leu!y!presentaban!una!coloración!azul!en!presencia!de! XBGal!(ver!apartado!4!de!materiales!y!métodos).!! Las! colonias! responsables! de! crecer! en! los! dos! tratamientos! selectivos! se! les! extrajo! el! DNA! y!se! mandaron! a! secuenciar!los! plásmidos.! Estos! plásmidos! contenían!los!fragmentos!de!cDNA!correspondientes!a!las!proteínas!capaces!de! interaccionar! con! SlCIPK6.! La! identificación! de! las! secuencias! se! realizó! por! comparación! con! las!secuencias! depositadas! en! las!bases! de! datos! del! NCBI! utilizando!la!aplicación!informática!BLAST.!! En!la!tabla!2.1!se!muestra!la!identidad!de!los!clones!identificados!en!el!escrutinio! de!doble!híbrido!con!la!forma!constitutivo!activa!de!SlCIPK6.!Se!identificaron!un! total! de! 34!clones! diferentes! que! interaccionan! con! SlCIPK6.! Los! posibles! interactores!fueron!nombradas!como!CIPK+Interacting+Protein!(CIP)!seguidas!de! un!número,!que!corresponde!al!número!de!clon!secuenciado.!! ! ! ! ! ! ! ! ! Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 93! Doble!híbrido!con!SlCIPK6T172D! CIP! Identidad!del!clon! Homología! Nº!acceso! 1! Subunidad!beta!3!del!proteosoma! N.+tabacum+ AJ291739! 4! Proteína!con!dominio!tudor! P.+sativum+ AB078603! 6! Executer! R.+communis+ XP_002511410! 7! Proteína!14B3B3!(tft!10)! S.+lycopersicum+ X98866! 8! Proteína!desconocida!1! + ! 12! Triosa!fosfato!isomerasa! A.+thaliana+ AY087893.1! 13! NAD(P)H!quinona!oxidoreductasa! S.+tuberosum+ AB061251! 14! CDC48!1! N.+glutinosa+ GQ131539! 16! 4BCumaratoBCoA!ligasa! P.+trichocarpa+ XP_002318707! 25! Proteína!ISPH! S.+lycopersicum+ ACY27516! 30! Treonina!deaminasa! S.+lycopersicum+ M61914! 31! Deoxiuridina!trifosfatasa! S.+lycopersicum+ S40549! 32! Proteina!desconocida!2! + ! 34! Triosa!fosfato!isomerasa! S.+tunerosum+ DQ222496.1! 46! Proteína!desconocida!3! + ! 48! Proteasa!FtsH! S.+lycopersicum+ AY334306! 53! Pirofosfatasa!inorgánica! A.+thaliana+ AY079355! 55! CDC48!2! N.+tabacum+ DQ515925! 64! Proteína!desconocida!4! + ! 67! Proteína!desconocida!5! + ! 70! Proteína!LRRBRLK! A.+thaliana+ FJ708817! 90! Anexina!p35! S.+lycopersicum+ AF079231! 100! Proteína!ribosomal!rpS1! S.+oleracea+ M82923! 102! Adenilato!quinasa! A.+thaliana+ AK227882! 103! Proteína!de!unión!a!calmodulina! R.+communis+ XM_002524860! 106! DnaJ! S.+tuberosum+ DQ228340! 112! SBAdenosilBL_metionina!sintasa! S.+lycopersicum+ Z24741! 115! Proteína!14B3B3!(tft7)! S.+lycopersicum+ X95905! 118! Proteína!SHEPHERD! A.+thaliana+ AB064528! 123! Proteína!desconocida!6! + ! 139! Cisteina!sintasa!citosólica! S.+tuberosum+ AB029511! 140! Proteína!fosfatsa!2C! N.+tabacum+ AJ309007! 141! Proteína!desconocida!6! + ! 143! DDB1(UV+damaged+DNA+binding+protein+1)! S.+lycopersicum+ AY452480! ! ! ! Posteriormente!en!el!doble!híbrido!realizado!con!la!forma!silvestre!de!SlCIPK6!se! obtuvo!un!número!menor!de!clones.!Recientemente!se!ha!descrito!que!versiones! constitutiva! activas! de! quinasas!mejora! la! interacción! proteínaBproteína! con! Tabla)2.1:!Clones)identificados)en)el)doble)híbrido)empleando))SlCIPK6T172D)como)cebo.! La!identidad!de!los!clones!se!obtuvo!por!comparación!con!las!secuencias!depositadas!en!la!base! de! datos! del! NCBI! (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)! utilizando! la! aplicación! informática! BLAST.!!! Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 94! respecto!a!la!versión!silvestre!(Uno,!Rodriguez!Milla!et!al.!2009).!Posiblemente! por!este!motivo!se!hayan!obtenido!un!número!inferior!de!clones!en!el!escrutinio! realizado!con!la!forma!silvestre.!Además!muchos!de!ellos!se!identificaron!en!los! dos! escrutinios! como! por! ejemplo!los! clones! CIP48,! CIP55,! CIP90,! CIP100! y! CIP112.!La!tabla!2.2!muestra!los!CIPs,!diferentes!al!primer!escrutinio,!obtenidos! en!el!segundo!ensayo.! Doble!híbrido!con!SlCIPK6! CIP! Identidad!del!clon! Homología! Nº!acceso! 22! Transportador!ABC! R.!communis! XM_002523649! 23! UBQ!(Ubiquitin!like!protein)! A.!thaliana! AF370527! 24! Proteina!LEA! S.!lycopersicum! Z46654! 29! RD2! A.!thaliana! AB039925! 32! Pep3/Vps18/orange!family!protein! A.!thaliana! NM_101119! 61! CDM1(cell+death?associated+protein)! N.!glutaminosa! AF208022! ! ! ! En! resumen,! se! identificaron!un! total! de! 40! clones! diferentes! en! los! dos! escrutinios!realizados,! de! los! cuales! 34! se! obtuvieron! en! el! ensayo! de! doble! híbrido! con! la! forma! constitutiva! activa! y! tan! solo! 6! con! la! forma! silvestre.! Algunos! de! los! interactores! como! por! ejemplo! CIP90! y! CIP25! se! identificaron! varias! veces! y! de! forma! independiente.! Se! decidió! no! analizar! mas! colonias! cuando!se!consiguió!un!número!elevado!de!interactores,!por!lo!que!los!ensayos! no! llegaron! a! ser! saturantes.!La! tabla! 2.3! muestra! de! forma! esquemática! !los! resultados!obtenidos.!! ! ! ! ! Tabla)2.2:!Clones)diferentes)identificados)en)el)doble)híbrido)utilizando)la)forma)SlCIPK6) como)cebo.!!La!identidad!de!los!clones!se!obtuvo!por!comparación!con!las!secuencias!depositadas! en! la! base! de! datos! del! NCBI! (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)! utilizando! la! aplicación! informática!BLAST.!!! !!! Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 95! ! ! ! ! ! Con!el!objetivo!de!eliminar!falsos!positivos!se!realizó!un!segundo!control!en!la! especificidad!de!la!interacción.!Para!ello!se!retransformó!cada!uno!de!los!clones! en!la!cepa!de!levaduras!que!contenía!el!cebo!correspondiente.!!De!esta!forma! podríamos!descartar!aquellos!clones!que!no!crecieran!en!ausencia!de!Leu!o!no!se! colorearon!de!azul!en!presencia!de!XBGal!(figura!2.4).!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! SlCIPK6T172D! SlCIPK6! Transformantes!iniciales!(UFC)! 1.3!·!105! 2.1!·!105! Clones!analizados!(UFC)! 4.5!·!103! 1.1!·!103! CIPs!obtenidos! 34! 11! CIPs!diferentes! 34) 6) Figura) 2.4:!Retransformación) de) los!clones) identificados) en) el) doble) híbrido.!!Los! clones! identificados!en!el!doble!híbrido!se!retransformaron!en!la!cepa!EGY48!con!los!vectores!pEG202B SlCIPK6T172D/SlCIPK6!y! pSH18B34.! A! continuación,! cada! uno! de! los! cultivos! crecidos!toda! la! noche!en!medio!SD!se!diluyeron!en!agua!estéril!y!se!plaquearon!a!una!DO600!de!0,1.!!La!coloración! azul!en!presencia!de!XBGal!(1)!y!el!crecimiento!en!un!medio!carente!de!Leu!(2)!indican!interacción! entra!ambas!proteínas.!!! Tabla) 2.3:!Resumen) de) los) resultados) obtenidos) en) los) escrutinios) de) doble) híbrido)en)levaduras.! !!! Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 96! En!la!retransformación!a!excepción!de!los!clones!CIP122!y!CIP32!todos!los!CIPs! analizados!dieron!lugar!a!un!fenotipo!de!interacción!con!SlCIPK6!(figura!2.4).!! Cabe!destacar!que!en!los!escrutinios!de!doble!híbrido!realizados!no!se!obtuvo! ningún! clon! perteneciente! a! la! familia! génica! de! las! CBLs,! indicando! que! los! ensayos! no! llegaron! a! la! saturación.! Sin! embargo! si! se! identificaron!otras! proteínas!cuya!interacción!ha!sido!descrita!con!algún!miembro!de!la!familia!de! las!CIPKs!y!entre!las!que!se!encuentran!una!fosfatasa!(CIP140)!(Ohta,!Guo!et!al.! 2003)!y!una!chaperona!DnaJ!(CIP106)!(Yang,!Qin!et!al.!2010).!La!diversidad!de! clones! identificados! pone! de! manifiesto! las!diversas! funciones! celulares!que! SlCIPK6!podría!regular.! 2.4. Selección)de)candidatos) Una!vez!realizados!los!ensayos!de!doble!híbrido!el!siguiente!paso!se!centró!en!la! selección!de!candidatos!para!su!posterior!caracterización!en!detalle.!Para!ello!se! emplearon! principalmente! tres! criterios:! (1))participación!en!la! respuesta! inmune,!!(2)!identidad!conocida!del!gen!y!(3)!verificación!de!la!interacción!in+ vivo!con!SlCIPK6.!! Teniendo! en! cuenta! el! gran! número!de! clones! identificados!se! hizo! necesario! diseñar! un!segundo! escrutinio!genético.! Para! ello! se! diseñó! una! estrategia! experimental!basada!en!el!silenciamiento!génico!inducido!por!virus!(VIGS)!con!el! objetivo!de!seleccionar!clones!implicados!en!la!respuesta!inmune!en!tomate!y!el! cual!se!explica!a!continuación.! 2.4.1. Participación!en!la!respuesta!inmune!en!tomate!(1)! Previamente!en!nuestro!laboratorio!se!demostró!la!participación!de!SlCIPK6!en! la! respuesta! ETI! y! susceptible!en! tomate!causadas! por! la! bacteria! patógena!!!!!!!!!! Pst!DC3000.!!Se!buscaban!clones!que!estuvieran!implicados!en!la!misma!ruta!de! señalización!que!SlCIPK6.!Se!optó!por!seleccionar!aquellos!clones!implicados!en! la! respuesta! susceptible! en! tomate! ya! que! los! ensayos! resultaron! ser! más! repetitivos!y!claros.!En!las!plantas!susceptibles!el!patógeno!entra!en!el!espacio! apoplástico! donde! se! multiplica,! dando! lugar! a! los! pocos! días,! a! pequeñas! Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 97! lesiones!necróticas!rodeadas!de!un!halo!clorótico,!conocidas!con!el!nombre!de! pecas!a!manchas!bacterianas.!! Para!el!escrutinio!se!llevó!a!cabo!el!silenciamiento!de!plantas!de!tomate!RGBPtoS! (carentes! del! gen! Pto),!(Salmeron,!Oldroyd! et! al.!1996)!mediante!vectores!del! silenciamiento!con!cada!uno!de!los!clones!identificados!en!el!doble!híbrido!(Liu,! Schiff!et!al.!2002).!Una!vez!silenciadas,!las!plantas!con!seis!semanas!de!edad,!se! infectaron!con! Pst!DC3000! y! cuatro! días! después!se! analizó!el! crecimiento! bacteriano!mediante! conteo! bacteriano!como! marcador! de! la! incidencia! de! la! enfermedad.!Como!control!se!emplearon!plantas!silenciadas!con!el!vector!vacío! (TRVBC)!que!se!llevaron!en!paralelo.!Debido!al!gran!número!de!clones!a!analizar,! el!escrutinio!se!distribuyó!en!tres!tandas!diferentes.!Cada!experimento!se!repitió! al!menos!cuatro!veces!por!tanda.!La!figura!2.5!muestra!los!resultados!obtenidos! en!uno!de!los!experimentos!realizados!y!que!sigue!la!misma!tendencia!que!los! otros.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !" #" $" %" &" '" (" )" *" !" +,-./0/-123"45.2-,/513"6738"9:;+<07=>" +?@A" B ""CDEF+"""""""("""""""""")""""""""""*""""""""""#&""""""""#("""""""""$'""""""""%$""""""""%&""""""""&(""""""""&*"""""""""''"""""""")!" !"#$%$ !"#$&$ !" #" $" %" &" '" (" )" *" !" +,-./0/-123"45.2-,/513"6738"9:;+<07=>" +?@A" B """""CDEF+""""""#$""""""""%!""""""""%#""""""""'%"""""""G!""""""#!$"""""#!%""""""#!("""""##$""""""##'"""""##*"""""#$%" !"#$%$ !"#$&$ Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 98! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! En! la! tanda! 1! los! clones! CIP34,! CIP25,! CIP70,! CIP48!y! CIP6!mostraron!un! crecimiento! bacteriano! con! un! orden! de! magnitud! inferior!en! la! escala! logarítmica!que!al!observado!en!la!planta!TRVBC.!El!mismo!comportamiento!se! observó!en!los!clones!CIP30,!CIP31,!CIP53,!CIP90,!CIP103,!CIP24,!CIP90,!CIP61!y! CIP29,+siendo!este!último!el!de!mayor!diferencia!con!respecto!al!control.!Tras!el! análisis!de!los!datos!obtenidos!en!el!escrutinio!realizado!en!plantas!de!tomate! RGBPtoS,! se! pudo!llegar! a! la! conclusión! de! que! numerosas! de! las! dianas! identificadas! en! el! ensayo! de! doble! híbrido! se! encontraban! implicadas! en! la! respuesta!susceptible!en!tomate.!A!pesar!de!haber!descartado!clones!como!CIP7,! CIP8,!CIP102,!CIP123,!CIP64!y!CIP141!la!lista!de!posibles!dianas!a!caracterizar! aún!era!grande.! 2.4.2. Identidad!de!los!clones!(2)! Posteriormente! se! realizó! un! estudio! bibliográfico!de! los! candidatos!que! mostraron!un!crecimiento!bacteriano!más!reducido!y!que!correspondieron!con! los! clones:!CIP6,+ CIP22,+ CIP24,+ CIP25,+CIP29,+CIP31,+ CIP32,+ CIP34,+ CIP53,+ CIP61,+ Figura)2.5:!Crecimiento)bacteriano)en)plantas)de)tomate)RGTPtoS.!A,!B!y!C!corresponden!con! los!datos!obtenidos!tras!el!silenciamiento!de!la!tanda!1,!2!y!3!respectivamente.!Crecimiento!de!la! bacteria! patógena! Pst!DC3000! en! plantas! de! tomates! silenciadas! con! clones! procedentes! del! escrutinio!de!doble!híbrido.!Como!control!de!la!infección!se!emplearon!plantas!silenciadas!con!el! vector!vacío!(TRVBC).! Se!representa!el!valor! medio!de!un!ensayo!con! cinco!réplicas!biológicas! independientes.!La!barra!de!error!corresponde!al!error!estándar!de!la!media.) !" #" $" %" &" '" (" )" *" +" !" ,-./010.234"56/3.-0624"7849":;<,=18>?" ,@AB" , CDEF",""""#%"""""""($""""""""(&"""""""()"""""#!!"""""#%+"""""#&!""""#&#"""""""$$"""""""$%"""""""$&"""""""$+"""""""%$""""""""(#" !"#$%$ !"#$&$ Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 99! CIP70,+ CIP90,+ CIP103,+ CIP106,+ CIP13,+ CIP140.! Se! buscaban! interactores! cuyos! homólogos!descritos!en! las!bases! de! datos! mostraran!una! función! establecida! que! pudiera! encajar! dentro! del! sistema! de! estudio.! De! entre! todos! los! clones! preseleccionados!finalmente!se!eligieron!los!interactores+CIP70,!CIP90!y!CIP29.! Como! se! observa! en! la! figura! 2.6! las! plantas! silenciada! para! estos! clones! mostraron!menos!síntomas!de!enfermedad!que!las!plantas!TRVBC.!Como!control! del! silenciamiento!se! realizaron! PCRs! semicuantitativas! con! oligonucleótidos! específicos!de!la!secuencia!codificante.!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! A! continuación! se! hace! un! breve! resumen! de! los! datos! más! relevantes! encontrados!en!la!bibliografía!de!cada!uno!de!los!interactores!preseleccionados.! El!clon!CIP70!pertenece!a!la!familia!de!las!RLKs!(receptor?like+ protein+ kinases)! que!son!proteínas!de!membrana!con!un!dominio!extracelular!rico!en!leucinas!y! otro!intracelular!con!actividad!quinasa.!Su!ortólogo!en!Arabidopsis!se!denomina! HSL2! y! se! ha! demostrado! su! implicación!directa!en! el! control! de! la! abscisión! floral! (Stenvik,! Butenko! et! al.! 2008).! En! plantas,! la! función! de! las! RLKs! está! Figura) 2.6:) Desarrollo) de) los) síntomas) de) enfermedad) en) plantas) de) tomate) RG) PtoS) silenciadas)con)los)clones)CIP70,)CIP90)y)CIP29.!A)!Las!plantas!de!tomates!RGBPtoS!fueron! silenciadas! para! los! clones! CIP70,! CIP90,! CIP29!y! como! control! TRV.! Posteriormente,! fueron! inoculados! con!P.+ syrinagea!DC3000! y! 4! días! después! las! hojas! fueron! desteñidas! y! fotografiadas.!B)!Acumulación!de!transcrito!de!cada!uno!de!los!clones!en!plantas!silenciadas! con!respecto!al!control!(TRVBC).!Como!control!interno!se!empleó!el!gen!de!la!actina.! !"#!$% !"#!"#$% &'()*+,% &'"#$-.% &'%&(%&)%'&%% &'%&(%&)%'&%% &'()*+,% &'"#$./% &'%&(%&)%'&%% &'%&(%&)%'&%% &'()*+,% &'"#$0/% &'%&(%&)%'&%% &'%&(%&)%'&%% *+*,-.% Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 100! relacionada! con! la! ! detección! y! transducción! de! determinadas! señales! intra! y! extracelulares.! Esta! familia! de! proteínas! está!implicada! en! la! respuesta! a! patógenos,!percepción!hormonal,!señalización!y!desarrollo.!Se!ha!propuesto!que! las! CIPKs! podrían! ser! fosforiladas! por! quinasas! situadas!aguaBarriba!en! la! cascada! de! señalización,! sin! embargo! hasta! el! momento! no! se! ha! identificado! ningún!candidato.!Las!RLKs!son!proteínas!de!membrana!que!inician!una!cascada! de!fosforilación!tras!la!percepción!del!estímulo!(Piroux,!Saunders!et!al.!2007).!De! alguna! forma! la! RLK! podría! influir! sobre! la! actividad! de! SlCIPK6! tras! la! percepción!del!estímulo.! CIP90!es!una!Anexina!que!fue!identificada!tanto!en!el!escrutinio!de!doble!híbrido! realizado!con!la!forma!silvestre!como!con!la!forma!constitutiva!activa!de!SlCIPK6.! Las!Anexinas!constituyen!una!familia!de!proteínas!que!se!encuentran!tanto!en! células! animales! como! en! células! vegetales! y! se! unen! a! fosfolípidos! de! membranas!de!una!forma!dependiente!de!Ca2+.!En!plantas,!el!Ca2+!es!un!segundo! mensajero! en! la! señalización! iniciada! en! respuesta! a! numerosos! estreses,! incluyendo!la!respuesta!a!patógenos.!Se!ha!demostrado!la!implicación!directa!de! determinadas!Anexinas!de!plantas!en!la!tolerancia!a!estrés,!tanto!abiótico!como! biótico!(Jami,!Clark!et!al.!2008).!En!tomate,!se!ha!descrito!que!la!actividad!de!la! anexina! p35! (CIP90)! se! inhibe! tras! unirse! a! fosfolípidos! de! membrana! (Lim,! Roberts!et!al.!1998).!Por!otra!parte!se!ha!comprobado!que!la!gran!mayoría!de!las! anexinas!tienen! actividad! peroxidasa! y! que! ésta! es! dependiente! de!una! regulación! postraduccional,! así! por! ejemplo! la! actividad! peroxidasa! de! la!!! anexina!1!de!Arabidopsis!disminuye!con!la!defosforilación!(Gorecka,!KonopkaB Postupolska! et! al.! 2005).! En! nuestro! laboratorio!se! ha! demostrado! la! participación!de!SlCIPK6!en!la!respuesta!PTI!y!ETI!así!como!en!la!formación!de! especies!reactivas!de!oxígeno,!por!lo!que!CIP90!podría!estar!involucrada!en!la! señalización!derivada!de!!ROS.! Por! último,! CIP29! es! una! pequeña! proteína! que! posee! un! dominio! UspA! (universal+ stress+ protein+ A)! que! ocupa! el! 90%! de! su! tamaño.! El! nombre! del! dominio!proviene!de!la!proteína!inicialmente!descrita!en!E.+coli!y!!denominada! UspA! (Nystrom! and! Neidhardt! 1992).! EcUspA! es! sintetizada! y! fosforilada! en! repuesta! a! numerosos! agentes! que! inhiben! el! crecimiento! bacteriano! como! Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 101! metales! pesados,! antibióticos,! pH! alto,! shock! osmótico! o! calor! (Yohannes,! Barnhart!et!al.!2004).!Además!EcUspA!es!necesaria!para!la!supervivencia!de!la! célula!en!condiciones!de!estrés!(Nystrom!and!Neidhardt!1992).!RD2!(responsive+ to+deseccation)!es!el!nombre!del!ortólogo!de!CIP29!en!Arabidopsis!cuyo!cDNA!se! aisló,!junto!con!otros!genes,!en!respuesta!a!desecación.!En!el!escrutinio!realizado! en! tomate! las! plantas! silenciadas! para! CIP29! mostraron!un! crecimiento! bacteriano!muy!reducido!por!lo!que!este!clon!podría!ser!un!buen!candidato!si! además!se!demuestra!que!interacciona!in+vivo!con!SlCIPK6!y!es!fosforilada!por! ésta.! El!clon!CIP29!se!identificó!únicamente!en!el!ensayo!de!doble!híbrido!realizado! con! la! forma! silvestre!mientras! que! CIP70! lo! hizo! con! la! versión! constitutivo! activa!y! CIP90!se! obtuvo! en! los! dos! escrutinios.! Para! determinar! si! CIP70! interacciona!con!la!forma!silvestre!y!si!CIP29!lo!hace!con!la!forma!constitutiva! activa! de! SlCIPK6!se! realizó! un! ensayo! de! doble! híbrido! con! las! formas! correspondientes!y!los!resultados!obtenidos!se!muestran!en!la!figura!2.7.! ! ! ! ! ! ! ! Como!se!puede!comprobar!en!la!figura!tanto!CIP70!como!CIP29!interaccionan! tanto!con!la!forma!silvestre!como!con!la!forma!constitutiva!activa!de!SlCIPK6.! Estos!resultados!vuelven!a!indicar!que!los!ensayos!de!doble!híbrido!no!fueron! saturantes.! ! Figura) 2.7:!Ensayo) de) doble) híbrido) con) CIP29) y) CIP70.! ! Los! clones! CIP70! y! CIP29! se! retransformaron!en!la!cepa!EGY48!que!expresaba!SlCIPK6!y!SlCIPK6T149D.!Los!cultivos!crecidos! toda!la!noche!a!30ºC!en!medio!SD!se!diluyeron!en!agua!estéril!y!se!plaquearon!a!una!DO600!de!0,1!y! 0,01.! La! coloración! en! medio! con! XBgal! (1)! y! el! crecimiento! en! un! medio! carente! de! Leu! (2)! indican!interacción!entre!las!proteínas!probadas.! Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 108! Bibliografía) Fuglsang,!A.!T.,!Y.!Guo,!et!al.!(2007).!"Arabidopsis!protein!kinase!PKS5!inhibits! the!plasma!membrane!H+!BATPase!by!preventing!interaction!with!14B3B 3!protein."!Plant!Cell!19(5):!1617B1634.! Gong,!D.,!Y.!Guo,!et!al.!(2002).!"Biochemical!characterization!of!the!Arabidopsis! protein! kinase! SOS2! that! functions! in! salt! tolerance."! Plant! Physiol! 130(1):!256B264.! Gorecka,! K.! M.,! D.! KonopkaBPostupolska,! et! al.! (2005).! "Peroxidase! activity! of! annexin! 1! from! Arabidopsis! thaliana."! Biochem! Biophys! Res! Commun! 336(3):!868B875.! Guo,! Y.,! U.! Halfter,! et! al.! (2001).! "Molecular! characterization! of! functional! domains! in! the! protein! kinase! SOS2! that! is! required! for! plant! salt! tolerance."!Plant!Cell!13(6):!1383B1400.! Guo,! Y.,! L.! Xiong,! et! al.! (2002).! "A! calcium! sensor! and! its! interacting! protein! kinase!are! global! regulators!of! abscisic!acid!signaling!in!Arabidopsis."! Dev!Cell!3(2):!233B244.! Gyuris,! J.,! E.! Golemis,! et! al.! (1993).! "Cdi1,! a! human! G1! and! S! phase! protein! phosphatase!that!associates!with!Cdk2."!Cell!75(4):!791B803.! Himmelbach,!A.,!T.!Hoffmann,!et!al.!(2002).!"Homeodomain!protein!ATHB6!is!a! target! of! the! protein! phosphatase! ABI1! and!regulates! hormone! responses!in!Arabidopsis."!EMBO!J!21(12):!3029B3038.! Hu,!X.,!H.!Zhang,!et!al.!(2009).!"Ectopic!expression!of!a!rice!protein!phosphatase! 2C!gene!OsBIPP2C2!in!tobacco!improves!disease!resistance."!Plant!Cell! Rep!28(6):!985B995.! Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 109! Jami,! S.! K.,! G.! B.! Clark,! et! al.! (2008).! "Ectopic! expression! of! an! annexin! from! Brassica!juncea!confers!tolerance!to!abiotic!and!biotic!stress!treatments! in!transgenic!tobacco."!Plant!Physiol!Biochem!46(12):!1019B1030.! Johnson,!C.,!S.!Crowther,!et!al.!(2010).!"Bioinformatic!and!experimental!survey!of! 14B3B3Bbinding!sites."!Biochem!J!427(1):!69B78.! KatiyarBAgarwal,! S.,! J.! Zhu,! et! al.! (2006).! "The! plasma! membrane! Na+/H+! antiporter!SOS1!interacts!with!RCD1!and! functions!in! oxidative!stress! tolerance! in! Arabidopsis."! Proc! Natl! Acad! Sci! U! S! A!103(49):! 18816B 18821.! Kolukisaoglu,!U.,!S.!Weinl,!et!al.!(2004).!"Calcium!sensors!and!their!interacting! protein! kinases:! genomics! of! the! Arabidopsis! and! rice! CBLBCIPK! signaling!networks."!Plant!Physiol!134(1):!43B58.! Kuhn,!J.!M.,!A.!BoissonBDernier,!et!al.!(2006).!"The!protein!phosphatase!AtPP2CA! negatively! regulates! abscisic! acid! signal! transduction! in! Arabidopsis,! and!effects!of!abh1!on!AtPP2CA!mRNA."!Plant!Physiol!140(1):!127B139.! Kurusu,!T.,!J.!Hamada,!et!al.!(2010).!"Regulation!of!microbeBassociated!molecular! patternBinduced!hypersensitive!cell!death,!phytoalexin!production,!and! defense! gene! expression! by! calcineurin! BBlike! proteinBinteracting! protein! kinases,! OsCIPK14/15,! in! rice! cultured! cells."! Plant! Physiol! 153(2):!678B692.! Lim,!E.!K.,!M.!R.!Roberts,!et!al.!(1998).!"Biochemical!characterization!of!tomato! annexin! p35.! Independence! of! calcium! binding! and! phosphatase! activities."!J!Biol!Chem!273(52):!34920B34925.! Liu,!Y.,!M.!Schiff,!et!al.!(2002).!"VirusBinduced!gene!silencing!in!tomato."!Plant!J! 31(6):!777B786.! Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 110! Madeo,! F.,! J.! Schlauer,! et! al.! (1998).! "Tyrosine! phosphorylation! regulates! cell! cycleBdependent!nuclear!localization!of!Cdc48p."!Mol!Biol!Cell!9(1):!131B 141.! Miao,!Y.,!D.!Lv,!et!al.!(2006).!"An!Arabidopsis!glutathione!peroxidase!functions!as! both!a!redox!transducer!and!a!scavenger!in!abscisic!acid!and!drought! stress!responses."!Plant!Cell!18(10):!2749B2766.! Nystrom,! T.! and! F.! C.! Neidhardt! (1992).! "Cloning,! mapping! and! nucleotide! sequencing!of!a!gene!encoding!a!universal!stress!protein!in!Escherichia! coli."!Mol!Microbiol!6(21):!3187B3198.! Ohta,! M.,! Y.! Guo,! et! al.! (2003).! "A! novel! domain! in! the! protein! kinase! SOS2! mediates!interaction!with!the!protein!phosphatase!2C!ABI2."!Proc!Natl! Acad!Sci!U!S!A!100(20):!11771B11776.! Park,! S.,! D.! M.! Rancour,! et! al.! (2008).! "In! planta! analysis! of! the! cell! cycleB dependent!localization!of!AtCDC48A!and!its!critical!roles!in!cell!division,! expansion,!and!differentiation."!Plant!Physiol!148(1):!246B258.! Piroux,! N.,! K.! Saunders,! et! al.! (2007).! "Geminivirus! pathogenicity! protein! C4! interacts! with! Arabidopsis! thaliana! shaggyBrelated! protein! kinase! AtSKeta,! a! component! of! the! brassinosteroid! signalling! pathway."! Virology!362(2):!428B440.! Quintero,!F.!J.,!M.!Ohta,!et!al.!(2002).!"Reconstitution!in!yeast!of!the!Arabidopsis! SOS!signaling!pathway!for!Na+!homeostasis."!Proc!Natl!Acad!Sci!U!S!A! 99(13):!9061B9066.! Rienties,!I.!M.,!J.!Vink,!et!al.!(2005).! "The! Arabidopsis! SERK1! protein! interacts! with!the!AAABATPase!AtCDC48,!the!14B3B3!protein!GF14lambda!and!the! PP2C!phosphatase!KAPP."!Planta!221(3):!394B405.! Identificación+de+proteínas+que+interaccionan+con+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 111! Rubio,! V.,! Y.! Shen,! et! al.! (2005).! "An! alternative! tandem! affinity! purification! strategy! applied! to! Arabidopsis! protein! complex! isolation."! Plant! J! 41(5):!767B778.! Salmeron,! J.! M.,! G.! E.! Oldroyd,! et! al.! (1996).! "Tomato! Prf! is! a! member! of! the! leucineBrich! repeat! class! of! plant! disease! resistance! genes! and! lies! embedded!within!the!Pto!kinase!gene!cluster."!Cell!86(1):!123B133.! SanchezBBarrena,!M.! J.,!H.! Fujii,!et!al.!(2007).!"The!structure!of!the! CBterminal! domain! of! the! protein! kinase! AtSOS2! bound! to! the! calcium! sensor! AtSOS3."!Mol!Cell!26(3):!427B435.! Schweighofer,! A.,! V.! Kazanaviciute,! et! al.! (2007).! "The! PP2CBtype! phosphatase! AP2C1,!which!negatively!regulates!MPK4!and!MPK6,!modulates!innate! immunity,!jasmonic!acid,!and!ethylene!levels!in!Arabidopsis."!Plant!Cell! 19(7):!2213B2224.! Stenvik,!G.!E.,!M.!A.!Butenko,!et!al.!(2008).!"Identification!of!a!putative!receptorB ligand! pair! controlling! cell! separation! in! plants."! Plant! Signal! Behav! 3(12):!1109B1110.! Tripathi,! V.,! B.! Parasuraman,! et! al.! (2009).! "CIPK6,! a! CBLBinteracting! protein! kinase!is!required!for!development!and!salt!tolerance!in!plants."!Plant!J! 58(5):!778B790.! Uno,! Y.,! M.! A.! Rodriguez! Milla,! et! al.! (2009).! "Identification! of! proteins! that! interact! with! catalytically! active! calciumBdependent! protein! kinases! from!Arabidopsis."!Mol!Genet!Genomics!281(4):!375B390.! Verslues,! P.! E.,! G.! Batelli,! et! al.! (2007).! "Interaction! of! SOS2! with! nucleoside! diphosphate! kinase! 2! and! catalases! reveals! a! point! of! connection! between! salt! stress! and! H2O2! signaling! in! Arabidopsis! thaliana."! Mol! Cell!Biol!27(22):!7771B7780.! Identificación+de+proteínas+interactoras+de+SlCIPK6+mediante+doble+híbrido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capítulo!2! ! ! 112! Vlad,!F.,!S.!Rubio,!et!al.!(2009).!"Protein!phosphatases!2C!regulate!the!activation! of!the!Snf1Brelated!kinase!OST1!by!abscisic!acid!in!Arabidopsis."!Plant! Cell!21(10):!3170B3184.! Wang,! L.,! K.! Tsuda,! et! al.! (2009).! "Arabidopsis! CaM! binding! protein! CBP60g! contributes! to! MAMPBinduced! SA! accumulation! and! is! involved! in! disease! resistance! against! Pseudomonas! syringae."! PLoS! Pathog!5(2):! e1000301.! Xu,!J.,!H.!D.!Li,!et!al.!(2006).!"A!protein!kinase,!interacting!with!two!calcineurin!BB like! proteins,! regulates! K+! transporter! AKT1! in! Arabidopsis."! Cell! 125(7):!1347B1360.! Yang,!Y.,!Y.!Qin,!et!al.!(2010).!"The!Arabidopsis!chaperone!J3!regulates!the!plasma! membrane!H+BATPase!through!interaction!with!the!PKS5!kinase."!Plant! Cell!22(4):!1313B1332.! Yohannes,! E.,! D.! M.! Barnhart,! et! al.! (2004).! "pHBdependent! catabolic! protein! expression!during!anaerobic!growth!of!Escherichia!coli!KB12."!J!Bacteriol! 186(1):!192B199.! Zhou,! J.,! Y.! T.! Loh,! et! al.! (1995).! "The! tomato! gene! Pti1! encodes! a! serine/threonine!kinase!that!is!phosphorylated!by!Pto!and!is!involved!in! the!hypersensitive!response."!Cell!83(6):!925B935.! ! ! ! ! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 113! Capítulo)3:)) Caracterización)de)SlRD) ) Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 114! ) ) Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 115! Resultados) ) 3.1. Análisis)bioinformático)de)SlRD! La!comparación!de!la!secuencia!de!nucleótidos!de!CIP29!con!las!depositadas!en! las!bases!de!datos!mostró!que!este!clon!presenta!una!homología!del!72%!con!el! gen!AtRD2!de!Arabidopsis,!por!lo!que!se!renombró!como!SlRD.!La!proteína!AtRD2! contiene!un!dominio!UspA!identificado!inicialmente!en!E.+coli.!En!función!de!su! estructura!las!proteínas!con!dominio!Usp!se!clasificaron!en!dos!grupos,!aquellas! que!unen!ATP!y!son!semejantes!a!la!proteína!MJ0577!(Zarembinski,!Hung!et!al.! 1998)!y!las!que!no!unen!ATP!y!se!asemejan!a!HiUspA!(Sousa!y!McKay!2001).!La! mayoría!de!los!aminoácidos!responsables!de!la!unión!a!ATP!se!comparten!entre! ambos! grupos.! Además! ambas! familias! poseen! un! motivo! de! dimerización! localizado!en!el!extremo!C[terminal.! Posteriormente! se! realizó! un! árbol! filogenético! con!las! secuencias! de! aminoácidos!de!CIP29,! su!ortólogo! AtRD2!de!Arabidopsis!y!NtRD!de!Nicotiana+ tabacum+(N.+tabacum),!la!UspAs! de!E.+coli!H.+influenzae!y!M.+jannaschii!y!otras! proteínas!de!plantas!con!dominio!UspA.!En!la!figura!3.1.A!se!puede!observar!que! CIP29! y! sus! ortólogos! AtRD2!y! NtRD!se! localizan! en! el! mismo! clúster.! El! alineamiento! múltiple! de! SlRD! con!distintas! proteínas! con! dominio! UspA! identificó!regiones! muy! conservadas! y! similares! a! la! proteína! MJ0577!que! corresponden!con!los!residuos!de!unión!a!ATP!y!de!dimerización!(figura!3.1.B).! El!análisis!bioinformático!de!la!secuencia!depositada!en!la!base!de!datos!del!gen! SlRD!(AK321106)!mostró!que!codifica!a!una!proteína!de!177!aminoácidos!con!un! peso!molecular!de!19.5!kD!y!un!punto!isoeléctrico!(PI)!de!5.98.! ! ! ! ! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 116! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura) 3.1:!Análisis) filogenético) y) alineamiento) múltiple) de) SlRD.! Comparación! de! las! secuencias! de! aminoácidos! de! proteínas! con! dominio! Usp! de! los! siguientes! organismos:! E.+ coli! (EcUspA,!NC_000913),!H.+Imfluenzae!(HiUspA,!CP002276.1),!M.+Jannaschii!(MJ0577,!NC_000909),!O.+ sativa!(OsUSP1,!AF491815.1),!S.+licopersicum!(LeER6,!AF096262.1!y!SlRD,!AK321100.1),!Vicia+faba! (VfENOD18,!AJ271815.1),!Arabidopsis!(AtRD2,!NC_003071)!y!N.+tabacum!(NtRD).!SlCBL10!(!se!usó! como! componente! alejado! filogenéticamente! de! la! familia! Usp! A)!Análisis! filogenético! de! las! secuencias! nombradas! anteriormente! realizado! con! el!programa! MEGA! 4! (mediante! CLUSTALW)! (Thompson,!Higgins!et!al.!1994).!B))Alineamiento!múltiple!de!la!secuencia!de!aminoácidos!de!SlRD,! OsUSP1,! LeER6,! VfENOD18,! MJ0577,! HiUspA! y! EcUspA.! El! fondo! negro! muestras! los! residuos! idénticos!en!ambas!secuencias,!en!gris!los!residuos!muy!conservados!y!en!blanco!los!residuos!no! conservados.!Lo!residuos!de!unión!a!ATP!se!muestras!en!la!figura!y!en!los!que!la!(A)!representa!el! lugar!de!unión!a!de!la!adenina,!la!(P)!al!fosfato!y!la!(R)!a!la!ribosa.!Los!residuos!implicados!en!la! dimerización!se!muestran!con!una!(D).! !" !" #$%" %" &" SlRD --------RGRDIVIAIDHGPNSKHAFDWAVTHLCRLADTLHLVHAVSSLKN-------- 44 OsUSP1 MAAAEGEQRKTVVVVGVDDSEHSNYALEWTMQHLASGMAGGGGAELVIVHAKPSPSSVVG 60 LeER6 MNALNWTLDNIKLKPHDPDSPESQGFIVILHVQSPPSIAAG-LNPGAIPFGGPSDVEVPA 59 VfEnod18 ------MVEDRKVGVGIDFSKNSKNALKWAIVNMADKGDTFYLIHINSNSSDESRSKLFA 54 MJ0577 -----MSVMYKKILYPTDFSETAEIALKHVKAFKTLKAEEVILLHVIDEREIKKRDIFSL 55 HiUspA --------MYKHILVAVDLSEESP-----ILLKKAVGIAKRHDAKLSIIHVDVNFSDLYT 47 EcUspA -------MAYKHILIAVDLSPESK-----VLVEKAVSMARPYNAKVSLIHVDVNYSDLYT 48 SlRD --------------EIVYEA---TQGLMEKLAVEAFSVAMV--KTVARIVEGDAGKVICK 85 OsUSP1 FGAGPGSGEVVRYVEADLRK--TAEDVVEKARRLCIANAMH--ALIEVIE-GEPRYVLCN 115 LeER6 FTAA---------IEAHQKR--ITQAILDHALGICAKKNAN--VKTQVVI-GDPKEKICD 105 VfEnod18 KTGSPLIPLELKEAGVMKQYGVQTDVEVIDLLEIAATQKEV--SVVAKLYWGDARQKLMD 112 MJ0577 LLGVAGLNKSVEEFENELKN-KLTEEAKNKMENIKKELEDVGFKVKDIIVVGIPHEEIVK 114 HiUspA GLIDVN-------MSSMQDR--ISTETQKALLDLAESVDYP--ISEKLSGSGDLGQVLSD 96 EcUspA GLIDVN-------LGDMQKR--ISEETHHALTELSTNAGYP--ITETLSGSGDLGQVLVD 97 SlRD EAERLKPSAVVMGTRGRGIIQSVLQGSVAEYCLHNCKIAPVIIVPGKEAGEVSVI- 140 OsUSP1 AVEKHSAGLLVVGSHGYGAIKRAFLGSVSDYCAHHAHCSVMIVKQPKAKRSRAETA 171 LeER6 AVEEMNADLLVMGSRAFGPIKRMFLGSVSNYCTNHAQCPVIIVKATP--------- 152 VfEnod18 SIEDLKLDALVLGSRGLSTIKRILLGSVSNFVMVHSPCPVTIVKDYSSSSSD---- 164 MJ0577 IAEDEGVDIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKKSNKPVLVVKRKNS-------- 162 HiUspA AIEQYDVDLLVTGHHQDFWSK---LMSSTRQVMNTIKIDMLVVPLRDE-------- 141 EcUspA AIKKYDMDLVVCGHHQDFWSK---LMSSARQLINTVHVDMLIVPLRDEEES----- 145 ! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 117! 3.2. Caracterización)de)la)interacción)entre)SlRD)y)SlCIPK6) Previamente!se!ha!visto!que!SlRD!interacciona!en!levaduras!tanto!con!la!forma! silvestre!como!con!la!forma!constitutiva!activa!de!SlCIPK6.!Para!caracterizar!la! interacción! entre! ambas!proteínas!se! llevó! a!cabo!un!ensayo!de!doble!híbrido! entre! SlRD! y! las! siguientes! versiones!de! SlCIPK6:! SlCIPK6! (silvestre),! SlCIPK6T172D!(forma! constitutiva! activa),! SlCIPK6ΔNAF!(forma! constitutiva! activa! tras! eliminar! el! dominio! de! unión! a! las! CBLs),! SlCIPK6K34M! (forma! quinasa!inactiva)! y! SlCIPKΔCterm!(forma! constitutiva! activa! resultante! tras! la! eliminación! del! dominio! regulador! C[terminal).!La! interacción! se! cuantificó! mediante!ensayo!β[galactosidasa!(ver!materiales!y!métodos!apartado!M.4.5).!En! el!doble!híbrido!se!emplearon!como!presa!el!cDNA!completo!de!SlRD!clonado!en! el!vector!pJG4[5!y!como!cebo!las!variantes!de!SlCIPK6!clonadas!en!el!plásmido! pEG202.!Se!empleó!el!ensayo!de!doble!híbrido!basado!en!el!sistema!LexA!(ver! apartado!M4!de!materiales!y!métodos).!! En!la!figura!3.2!se!puede!observar!que!SlRD!es!capaz!de!interaccionar!tanto!con! la! forma! silvestre! como! con!las! formas! constitutivas! activas! de! SlCIPK6.!Sin! embargo! la!interacción!con!la! forma! inactiva! de! la! quinasa! (SlCIPK6K34M)! es! muy!reducida!(figura!3.2.A).!Estos!resultados!se!cuantificaron!mediante!ensayo! β[galactosidasa! (figura! 3.2.C)! y! la! expresión! de!las! proteínas!se! confirmó! por! westernHblot!(figura!3.2.B).!Una!vez!analizados!los!resultados!se!puede!concluir! que:! (1)! SlRD! interacciona! de! forma! más! favorable! con! la! forma! silvestre! de! SlCIPK6,!(2)!la!actividad!quinasa!parece!ser!importante!para!la!interacción!y!(3)! el!dominio!quinasa!es!importante!para!la!unión!entre!SlCIPK6!y!SlRD!ya!que!la! forma!SlCIPK6ΔCterm!mantiene!la!interacción.! ! ! ! ! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 124! tiempo!real!utilizando!oligonucleótidos!específicos!para!SlRD!y!para!el!gen!de!la! actina,!empleado!como!control!endógeno!de!la!expresión.! 3.3.1. Acumulación!de!transcrito!en!diferentes!tejidos!y!en!respuestas!a! Pst!DC3000! En!el!capítulo!anterior!se!comprobó!la!participación!de!SlRD!en!el!desarrollo!de! los!síntomas!de!enfermedad!desencadenada!por!la!bacteria!patógena!Pst!DC3000! en!tomate.!La!hoja!es!el!punto!principal!de!entrada!en!la!planta!de!dicha!bacteria,! por! lo! que! era!importante! verificar! la!expresión! de! SlRD!en! este! tejido!y,! por! extensión,!en!otros!tejidos!de!tomate.!Para!ello!se!tomaron!muestras!de!cada!uno! de!los!órganos!y!se!analizó!la!acumulación!de!transcrito!mediante!PCR!a!tiempo! real!Los!resultados!obtenidos!se!pueden!observar!en!la!figura!3.6.!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Como!se!observa!en!la!figura!3.6!SlRD!se!expresa!en!todos!los!tejidos!analizados.! Cabe! destacar! que! la! acumulación! de! transcrito! observada!en! raíz! es! muy! elevada,! especialmente!si! comparamos! con! la! obtenida!en! hojas!(26! veces! !" #" $!" $#" %!" %#" &!" '()*" +,-.(/(" 0*//(" 1/(2" 3*45" 6.7,/,8"2,/*97(8":,"";36<" =2>*?(8" !" #" $!" '()*" +,-.(/(" 0*//(" 1/(2" 3*45" 6.7,/,8"2,/*97(8":,";36<" =2>*?(8" Figura)3.6:) Patrón) de) expresión) de) SlRD)en) diferentes) órganos) de) tomate.!Los!niveles!de! mensajero!de!SlRD!se!analizaron!mediante!PCR!a!tiempo!real!a!partir!de!40!ng!de!cDNA!obtenidos! tras!aislar!RNA!de!los!diferentes!órganos.!Los!niveles!de!expresión!se!encuentran!referidos!a!la! acumulación!de!transcrito! en! hojas.!Se!representa!el!valor!medio!de!tres!ensayos!con!réplicas! biológicas!independientes.!La!barra!de!error!corresponde!al!error!estándar!de!la!media.! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 125! superior).!Este!dato!sugiere!que!SlRD!podría!tener!una!función!importante!en! raíz!que!deberá!ser!estudiada!en!mayor!profundidad.!En!general,!la!acumulación! de! transcrito!observada,! en! condiciones! normales! de! crecimiento,!en! peciolo,! tallo,!flor!y!raíz!es!unas!3!veces!mayor!que!la!obtenida!en!hojas.!Fue!importante! confirmar!la!expresión!en!hojas!ya!que!se!ha!demostrado!que!SlRD!participa!en! la!resistencia!a!la!infección!por!Pst!DC3000!en!este!órgano.!Sin!embargo!no!se! puede!descartar!que!la!expresión!de!SlRD+se!induzca!en!respuesta!a!estrés.! Posteriormente!se! procedió! al! estudio! del! patrón! de! expresión! de! SlRD!en! la! respuesta!ETI!y!susceptible!en!tomate.!El!procedimiento!experimental!se!realizó! siguiendo!las!mismas!pautas!descritas!para!SlCIPK6!(apartado!2.2!del!capítulo!1).!! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Tanto!en!la!respuesta!susceptible!(figura!3.7.A)!como!en!la!respuesta!ETI!(figura! 3.7.B)!se! aprecia! una! elevada! acumulación! de! transcrito! de! SlRD.! Aunque! la! expresión!de!SlRD!en!hojas!en!condiciones!normales!de!crecimiento!no!es!muy! elevada! éste!se! induce!rápidamente! cuando! la! planta! es! infectada! por!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Pst!DC3000.!! Figura)3.7:)Patrón)de)la)acumulación)transcripcional)de)SlRD)en)plantas)de)tomate)(A))RGR PtoS)infectadas)con)Pst)DC3000)(104)UFC/ml))durante)la)respuesta)susceptible)y)(B))RGR PtoR)infectadas)con)Pst)DC3000)(107)UFC/ml))en)la)respuesta)ETI.!Los!niveles!de!mensajero! de!SlRD!se!analizaron!mediante!PCR!a!tiempo!real!a!partir!de!40!ng!de!cDNA!obtenidos!tras!aislar! RNA!de!hojas!de!tomate!durante!el!desarrollo!de!los!síntomas!de!enfermedad!o!durante!la!HR.!Los! niveles!de!expresión!se!encuentran!referidos!a!la!acumulación!de!transcrito!en!el!punto!cero.!Se! representa! el!valor!medio!de!tres!ensayos!con!réplicas!biológicas!independientes.! La!barra!de! error!corresponde!al!error!estándar!de!la!media! !" #" $" %" &" '!" !" '" #" (" $" )*+,-./01",-23453" 6/-7+8"9:;3.<" =>8?" @ !" #" $!" $#" %!" %#" &!" !" '" (" $)" *+,-./012"-.34564" 70.8,9":;9-4/<" =>9?" @ Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 126! En! el! caso! de! la! respuesta! susceptible! (figura!3.6.A)! la! acumulación! transcripcional!del!gen!es!menos!abundante!que!en!la!respuesta!ETI,!ocurre!a! tiempos!muy!tempranos!(día!1)!y!se!mantiene!a!lo!largo!del!tiempo.!La!elevada! acumulación!de!transcrito!obtenida!en!el!día!1!tras!la!infección!sugiere!que!SlRD! podría!participar!en!la!señalización!iniciada!antes!de!la!formación!de!las!lesiones,! observadas!en!el!día!tres.!Este!dato!apoya!los!resultados!previos!en!los!que!la! pérdida!de!función!de!SlRD!disminuye!los!síntomas!de!enfermedad!desarrollados! en!tomate.!! Por!otro!lado,! durante!la!respuesta!ETI!(figura!3.7.B),! el!transcrito!de!SlRD!se! acumula!a!niveles!muy!elevados!llegando!a!su!pico!máximo!a!las!ocho!horas!tras! la!infección!(25!veces!superior!al!punto!cero),!momento!en!el!que!se!observa!una! PCD! visible.! Posteriormente! tiene! lugar! un! disminución! drástica! que! podría! deberse! a! una! muerte! celular! masiva! en! la! zona! de! infiltración.! Aunque! los! niveles!de!transcrito!observados!para!SlRD!en!la!respuesta!ETI!son!mayores!que! los!observados!para!SlCIPK6,!el!patrón!de!la!acumulación!de!transcrito!es!similar.! Estos!datos!apoyan!una!posible!actuación!coordinada!de!ambas!proteínas!en!la! respuesta!ETI.! 3.3.2. Acumulación!de!transcrito!en!respuesta!a!estrés!abiótico.! En!el!capítulo!1!se!mostró!que!SlCIPK6!se!expresa!en!condiciones!de!estrés!salino! y! osmótico.!Además!se! ha! descrito! que! la! sobre[expresión! de! la! versión! constitutiva!activa!CaCIPK6!(CaCIPK6T172D)!en!N.+tabacum!presenta!una!mayor! tolerancia!a!estrés!salino!y!presión!osmótica!(PO)!(Tripathi,!Parasuraman!et!al.! 2009).! Por! estos! motivos! se! decidió!analizar! la! acumulación! de! transcrito! de! SlRD!en!respuesta! a!cloruro! sódico!(NaCl)!y!manitol.! El!estudio!del!patrón! de! expresión!se! realizó! siguiendo! las! mismas! pautas! descritas!para! SlCIPK6! (apartado!2.4!del!capítulo!1).! ! ! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 127! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! La!acumulación!de!los!mensajeros!de!SlRD!en!respuesta!a!los!tratamientos!con! NaCl!y!manitol!es!muy!abundante.!En!el!caso!de!la!adición!al!medio!de!NaCl!se! observa!que!la!acumulación!transcripcional!de!SlRD+ocurre!a!tiempos!cortos!(2! horas)! y! ésta! se! mantiene! hasta! las! 24! horas,! donde! decae! (figura! 3.8.A).! Sin! embargo!la!respuesta!mostrada!por!el!transcrito!de!SlRD!en!respuesta!al!medio! suplementado! con! manitol! es! bien! diferente.! La! mayor! abundancia! de! mensajeros!de!SlRD!tiene!lugar!a!un!tiempo!mas!tardío!(12!horas)!y!los!niveles! de!transcritos!obtenidos!son!superiores,!llegando!a!ser!40!veces!mayor!que!el! tiempo!cero!(figura!3.8.B).!! Estos! datos! son! similares! a! los! que! se! ha! observado!para!su! ortólogo! de! Arabidopsis!(AtRD2),!el!cual!muestra!una!acumulación!transcripcional!de!forma! tardía!en!respuesta!a!sequía!(Yamaguchi[Shinozaki,!Koizumi!et!al.!1992).!Un!dato! relevante! es! que! el! patrón! de!la! acumulación! transcripcional! observado! para! SlRD!es!similar!al!obtenido!para!SlCIPK6!en!respuesta!a!NaCl!y!PO.!Tanto!SlRD! como! SlCIPK6! muestran! una! acumulación! de! transcrito! en! respuesta! a! NaCl! a! tiempos! cortos! (1! hora),! mientras! que! para! el! tratamiento! con! manitol! la! acumulación!obtenida!es!tardía!(12!horas).! !" #" $" %" &" '!" '#" '$" '%" !" #" $" &" '#" #$" ()*+,-./0"+,12342" 5.,6*7"897+2-:" ;2<1" = !" #!" $!" %!" &!" '!" !" $" &" (" #$" $&" )*+,-./01",-23453" 6/-7+8"9:8,3.;" <=" > Figura)3.8:)Patrón)de)la)acumulación)de)transcrito)de)SlRD)en)tomate)respuesta)a)NaCl)(A))y) PO)(B).!Los!niveles!de!mensajero!de!SlRD!se!analizaron!mediante!PCR!a!tiempo!real!a!partir!de!40! ng!de!cDNA!obtenido!tras!aislar!RNA!de!hojas!de!tomate!tratadas!con!NaCl!(100!mM,!A)!o!manitol! (300! mM,! B)! a! los! tiempos! de! tratamiento! indicados.! Los! niveles! de! expresión! se! encuentran! referidos!a!la!acumulación!de!transcrito!en!el!punto!cero.!Se!representa!el!valor!medio!de!tres! ensayos!con!réplicas!biológicas!independientes.!La!barra!de!error!corresponde!al!error!estándar! de!la!media! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 128! Estos! son! los! primeros! resultados! que! indican! la! participación! dual!en! la! respuesta!a!estrés!abiótico!y!biótico!de!una!proteína!con!dominio!Usp!en!plantas.! 3.4. Estudio)de)la)fosforilación)de)SlRD)por)SlCIPK6) Dado! que!SlRD! es! capaz! de! interaccionar! con! SlCIPK6! y! esta! unión! es! dependiente!de!la!actividad!quinasa!(figura!3.2),!se!quiso!investigar!si!SlRD!era! un!!sustrato!de!fosforilación!de!SlCIPK6.!! Para!llevar!a!cabo!este!objetivo!la!proteína!SlRD!se!clonó!en!el!vector!pDEST17! (fusión!transcripcional!a!un!cola!de!6!histidinas),!se!expresó!en!la!cepa!de!E.+coli! BL21! y! se! purificó!mediante! columna! de! níquel.! Por! otra! parte! las! versiones! silvestre! y! constitutiva! activa! de! SlCIPK6! se! clonaron! en! el! vector! pC[TAPa! (fusión!transcripcional!a! una! cola! de! 6! histinas! y! al! epitopo! Myc),! se! agro[ expresaron!en!hojas!de!N.+benthamiana!y!se!purificaron!mediante!resina!con!IgG! unida!(apartado!M.6.4!de!materiales!y!métodos).!Para!la!reacción!de!fosforilación! se!empleó!la!misma!cantidad!de!ambas!proteínas!(aproximadamente!1!μg),!las! cuales!se!mantuvieron!a!30ºC!durante!50!minutos!en!presencia!de![γ[32P]!ATP! (apartado!M.6.6!de!materiales!y!métodos).!Tras!detener!la!reacción!las!muestras! se!analizaron!por!SDS[PAGE!y!se!auto[radiografíaron.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura)3.9:)Fosforilación)in#vitro)de)SlRD)por)SlCIPK6.)Para!el)ensayo!quinasa)se!empleó!2!μg! de!las!proteínas!de!fusión!HIS[SlRD,!Myc[SlCIPK6!y!SlCIPK6T172D!purificadas.!Las!muestras!se! analizaron!por!SDS[PAGE!y!se!auto[radiografiaron.!Como!control!de!carga,!la!misma!membrana!se! analizó!mediante!westernHblot,!utilizando!los!anticuerpos!descritos!a!la!derecha!de!la!figura.!! SlCIPK6-Myc ! SlCIPK6T172D-Myc! SlRD-HIS! ! - + - + - ! - - + - +! + + + - - ! α-Myc" α-HIS" 97 " 118 " 29 " γ-ATP" kD" Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 129! En!el!panel!superior!de!la!figura!3.9!se!observan!dos!bandas!correspondientes!a! los!carriles!donde!se!ha!llevado!a!cabo!la!reacción!de!fosforilación!con!SlCIPK6!y! SlRD.!Estos!resultados!indican!que!SlRD!es!fosforilada!tanto!por!SlCIPK6!como! por! SlCIPK6T172D.! No! se! observó!señal! en! ausencia! de! SlRD! o!SlCIPK6! o! SlCIPK6T172D.! Como! control! de! carga!se! realizaron! dos!westernHblots!de! la! misma! membrana!empleada! en! el! ensayo! quinasa,! utilizando! para! ello! los! anticuerpos!anti[HIS!y!anti[Myc!(panel!medio!e!inferior).! El!hecho!de!que!un!miembro!de!la!familia!de!las!CIPKs!fosforile!a!una!proteína! diferente!a!un!canal!resulta!por!sí!mismo!un!aporte!novedoso.!Los!sustratos!de! fosforilación! mejor! caracterizados!de! las! CIPKs! hasta! ahora! son! canales! de! membrana!que!median!la!resistencia!a!estrés!abióticos.!Así!por!ejemplo!se!ha! descrito!la!fosforilación,!por!miembros!de!la!familia!de!las!CIPKs,!de!las!proteínas! de!membrana!AKT1!(Xu,!Li!et!al.!2006)!y!AHA!(Fuglsang,!Guo!et!al.!2007).!Sin! embargo!también!se!ha!descrito!la!fosforilación!por!PKS5!de!la!proteína!que!no! canal!NPR1!(Xie,!Zhou!et!al.!2010).!Otro!dato!novedoso!es!el!hecho!de!que!un! miembro!de!la!familia!Usp!sea!fosforilado!por!una!CIPK.!Previamente!tan!solo!se! había!visto!la!fosforilación!de!la!Usp!de!Arabidopsis!AtPHOS32!por!las!proteínas! AtMAPK3!y!AtMAPK4!(Merkouropoulos,!Andreasson!et!al.!2008).!Por!lo!tanto!la! identificación!de!un!sustrato!nóvel!para!las!CIPKs!con!funciones!diferentes!a!las! de!canal!de!membrana!suponen!una!aportación!novedosa!y!amplia!el!abanico!de! funciones!potencialmente!reguladas!por!estas!quinasas.! 3.5. Estudio)de) la) implicación) de) SlRD)en) la) respuesta) inmune) en) Solanáceas) Previamente!hemos!descrito!la!participación!de!SlCIPK6!en!la!PCD!mediada!por! diferentes!proteínas!R/elicitores!en!N.+benthamiana.! Por!tanto!era! importante! determinar! si!SlRD! también! participa! en! las!mismas!vías!de! señalización.! Se! empleó! plantas!de!N.+benthamiana!en!vez!de! tomate! porque!el! silenciamiento! mediante!VIGS!es!más! eficiente.!Además!N.+benthamiana!permite!la!expresión! transitoria,!vía!Agrobacterium,!de!los!distintos!elicitores!de!la!PCD.!! Previamente!al!experimento,! se!compararon! las! secuencias! de! nucleótidos!del! cDNA! de!RD!de! tomate! y!de! tabaco! (único! del! género!cuya! secuencia! se! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 130! encuentra!depositada!en!la!bases!de!datos,!SGN[U430618)!para!garantizar!que!el! silenciamiento!génico!de!SlRD!se!puede!llevar!a!cabo!en!N.+benthamiana!(figura! 3.10).!! ! ! ! ! ! ! ! ! Para! que! tenga! lugar! el!silenciamiento!mediante! la! tecnología! VIGS,! el! gen! endógeno! y! el! cDNA! deben! compartir! como! mínimo! de! 21!a! 23! nucleótidos! idénticos!a!lo!largo!de!la!secuencia!de!nucleótidos!(Baulcombe!1999).!Como!se! muestra! en! la! figura!3.10!la! identidad! entre! ambos! genes! es! muy! elevada! y! existen! dos! regiones! con! mas! de! 21! nucleótidos! idénticos,! por! lo! que!el! silenciamiento!del! ortólogo+NbRD!en!N.+ benthamiana!sería! a! priori!eficiente! empleando!SlRD!para!ello.!Independientemente!se!realizó!una!PCR!a!tiempo!real! con!oligonucleótidos!específicos!de!RD!con!el!fin!de!confirmar!el!silenciamiento! génico!de!NbRD!en!plantas!de!N.+benthamiana.!! ! ! ! ! ! Figura) 3.10:) Alineamiento) de) la) secuencia) de) nucleótidos) de) NtRD) y) SlRD.!El!fondo!negro! muestra!los!residuos!idénticos!en!ambas!secuencias!y!en!blanco!los!!residuos!no!conservados.!El! alineamiento!se!realizó!mediante!ClustalW!utilizando!el!programa!bioEdit.! SlRD ATGGAAACGGTTATGGAAGACGAAAAGTACAATTGGAGCGAAGTGAAGCTTCATTCTCTCATACCCATAGTGCCGGAGCC 80 NtRD ATGGAAACACTAATGGAGGAAGAAGAGTACAACTGGAGAGAAGTGAAGCTTCCGTCGCTCATACCAGTGGTGCCGCCGCC 80 SlRD GGAGCTCGATAGGGAAACCGGCGAACGGCGTCGCGGCCGTGATATAGTGATCGCTATAGATCACGGTCCTAATAGCAAAC 160 NtRD TGAACTGGAGAGAGAAACAGGAGAAAGGCGCCGTGGGCGTGACATAGTCATCGCTATTGATCACGGTCCTAACAGCAAGC 160 SlRD ACGCTTTTGATTGGGCCGTTACTCACCTTTGCCGTCTCGCCGATACGCTTCATCTCGTTCACGCCGTCTCCAGTCTGAAA 240 NtRD ACGCTTTTGATTGGGCTGTTACTCATATTTGCCGTCTCGCTGATACCATTCATCTTGTCCACGCCGTCTCCAGTTTGAGA 240 SlRD AATGAGATAGTTTATGAGGCTACGCAAGGACTCATGGAGAAGCTTGCTGTTGAGGCTTTTTCGGTTGCTATGGTGAAGAC 320 NtRD AATGAGATTGTCTATGAAGCTACACAGGCGCTCATGGAGAAGCTTGCCATCGAGGCTTTTGAGGTTGCTATGGTGAAGAC 320 SlRD AGTGGCTAGGATTGTGGAAGGAGATGCTGGAAAGGTAATTTGCAAGGAAGCAGAAAGGTTGAAGCCTTCAGCTGTGGTTA 400 NtRD AGTGGCTAGGATTGTGGAAGGAGATGCTGGAAAGGTTATATGCAGGGAAGCAGAACGGTTGAAGCCTGCAGCCGTGGTTA 400 SlRD TGGGAACCAGGGGACGTGGCATAATTCAAAGTGTACTGCAAGGAAGTGTCGCTGAGTATTGCTTACACAACTGTAAGATA 480 NtRD TGGGAACCAGGGGACGTAGTTTAATCAAAAGTGTACTTCAAGGAAGTGTGGGTGAGCATTGCTTTCACCACTGTAAAACA 480 SlRD GCACCGGTCATCATAGTTCCTGGAAAAGAAGCTGGGGAAGTCTCTGTGATTTAA 534 NtRD GCCCCAATCATAATAGTTCCTGGAAAAGAAGCAGGGGAGGAATCTGTAATTTAA 534 Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 131! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! El! silenciamiento! de! RD! es! muy! eficiente,! con!una! reducción!del! 85%! en! la! expresión,!respecto!a!la!planta!control!TRV[C!(figura!3.11.A).!Tras!una!búsqueda! mediante! BLAST! en! la! base! de! datos! de! Solanáceas! y! de! ! Arabidopsis!no! se! identificó!! ningún! gen! que!compartiera!una!semejanza!importante!con!SlRD!o! AtRD2!respectivamente.!Sin!embargo!para!asegurar!que!en!la!planta!TRV[SlRD! no!tenía!lugar!el!co[silenciamiento!!de!otros!genes!de!la!familia!Usp,!se!realizó! una!PCR!a!tiempo!real!de!dos!de!los!miembros!más!cercanos!filogenéticamente!a! AtRD2.! Como! se! muestra! en! la! figura! 3.11.B! los! genes! SGNHU565777! (más! parecido!a! At3g53990)! y!SGNHU578954! (más!parecido!a!At3g17020)!no!se!co[ silencian!con!RD!en!!plantas!de!N.+benthamiana+TRV[SlRD.! ! Figura)3.11:)Silenciamiento)de)los)genes)SlRD,)SGNRU565777)(At3g53990))y)SGNRU578954) (At3g17020))en)plantas)TRVRSlRD)de)N.#benthamiana.)A)!Análisis!de!los!niveles!de!mensajero! de!SlRD!!en!plantas!TRV[RD!con!respecto!a!TRV[C!mediante!PCR!a!tiempo!real.!La!posición!de!los! olignucleótidos!empleados!en!la!reacción!de!PCR!se!muestran!con!una!flecha.!El!fragmento!de! cDNA!del!gen!SlRD!empleado!en!el!silenciamiento!se!nombra!como!TRV[SlRD.!B)!Análisis!de!los! niveles! de! mensajero! los! genes! SGN[U565777! y! SGN[U578954,! ortólogos! de! At3g53990! y! At3g17020!respectivamente,!en!plantas!TRV[RD!y!TRV!mediante!PCR!a!tiempo!real.!Se!representa! el! valor! medio! de! tres! ensayos! con! réplicas! biológicas! independientes.! La! barra! de! error! corresponde!al!error!estándar!de!la!media! ! ! !" #!" $!" %!" &!" '!!" '#!" '$!" '" #" (")*"+,-*./,01,*.23" !"#$%#&&'( !"#$)*'+'( 4 5678,( 567-./01( !" #!" $!" %!" &!" '!!" '#!" '" (")*"+,-*./,01,*.23" !"#$% !"#$!"#$% 4 5678!" 567#$%&'" Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 132! 3.5.1. Implicación! de! SlRD! en! el! desarrollo! de! los! síntomas! de! enfermedad!en!N.+benthamiana! En! el! capítulo! 2!se! describió!la! implicación!de! SlRD! en! el! desarrollo! de! los! síntomas!de!enfermedad!en!tomate.!Las!plantas!susceptibles!de!tomate!PtoS[RG! silenciadas! para!el! gen!SlRD!mostraron!un! menor! crecimiento! de! la! bacteria! patógena! Pst!DC3000!con! respecto! al! control! (TRV[C).!Para!comprobar! si! el! fenotipo!de! resistencia!observado!en! tomates! era! extensible! a! otras! interacciones! de! susceptibilidad,! se! infectaron!plantas!de! N.+benthamiana,!con! seis!semanas!de!edad,!con!la!bacteria!Pst!tabaci!a!una!concentración!de!5!·!105! UFC/ml.!Ésta!da!lugar!a!lesiones!derivadas!del!desarrollo!de!la!enfermedad!4[5! después!de!la!infección.!! Cuatro! días! después! de!la! infección! las! plantas! silenciadas! con! SlRD!no! mostraron!PCD!asociada!a!la!enfermedad!en!comparación!con!las!plantas!TRV[C,! donde!el!tejido!vegetal!estaba!completamente!colapsado!(figura!3.12.A).!Cuando! comenzó!a!verse!el!colapso!celular!un!70%!de!las!plantas!TRV[SlRD!mostraron! inhibida!la!PCD!deriva!del!progreso!de!la!enfermedad.!Sin!embargo!en!las!plantas! TRV[C! tan! solo!en! un! 10%! se! visualizó!la!inhibición! de!la! muerte! celular! resultante!de!la!infección!(figura!3.12.C).!Los!resultados!obtenidos!se!reforzaron! con!la!cuantificación!de!la!muerte!celular!por!mediada!de!la!conductividad!iónica! (figura!3.12.B).!! ! ! ! ! ! ! ! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 133! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 3.5.2. Papel!de!SlRD!en!la!respuesta!ETI!mediada!por!Pto/AvrPto+ En!estudios!previos!se!ha!descrito!la!participación!de!SlCIPK6!en!la!PCD!mediada! por!Pto/AvrPto,!por!lo!que!se!quiso!comprobar!si!SlRD!podría!estar!involucrada! en!esta!misma!ruta.!Con!el!fin!de!determinar!esta!posibilidad!se!agro[expresó!la! combinación!AvrPto/Pto!en!hojas!de!N.+benthamiana!silenciadas!para!SlRD.!La! ruta! de! resistencia! mediada! por! Pto!está! conservada! en! N.+ benthamiana:! Pto! forma!un!complejo!con!AvrPto!que!estabilizado!por!Prf!inicia!una!ETI!que!incluye! un!evento!de!PCD.!Como!control!de!muerte!celular!se!agro[expresó!el!gen!pro[ apoptótico!de!ratón!Bax+(Lacomme!y!Santa!Cruz!1999).!Los!resultados!obtenidos! tras!48!horas!de!la!infiltración!se!muestran!en!la!figura!3.13.! Figura)3.12:)El)silenciamiento)de)SlRD)en)plantas)de)N.#benthamiana)reduce)los)síntomas) de)enfermedad.)A)!Fotos!tomadas!cuatro!días!después!de!la!infiltración!con!la!cepa!Pst+tabaci!a! una!concentración!de!5!·!105!UFC/ml.!En!el!ensayo!se!emplearon!plantas!silenciadas!con!el!gen! SlRD!(TRV[SlRD)! y! el! vector! vacío! (TRV[C),! como! control.! B)!Medida! de! la! PCD! mediante! conductividad! iónica.! Se! representa! el! valor! medio! de! cuatro! ensayos! con! réplicas! biológicas! independientes.!La!barra!de!error!corresponde!al!error!estándar!de!la!media.)C)!El!porcentaje!de! muerte!celular!observado!en!A!se!categorizó!en!tres!clases:!completa!(>80%),!parcial!(20[80%)!y! no!PCD!(<20%).!! Los!experimentos!se!repitieron!un!mínimo!de!cuatro!veces.! ! !" #!" $!" %!" &!" '!!" ()*" ()*+,-)." /"01"23." 4&!/" #!+&!/" 5#!/" 3" !" #!!" $!!" %!!" &!!" '!!!" !"#$%&"'( ()*+,-./0+1+2345" 60789)"2:);145" !" $" <" 6=>?!" 6=>#$%&'" !"#$!" !"#$#$%&" %&'()*& +& Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 140! ! ! ! ! ! ! ! ! ! En!presencia!del!agente!crossHlinking!aparece!una!nueva!banda!en!el!westernHblot!! cuyo!tamaño!corresponde!al!doble!de!la!banda!obtenida!para!la!proteína!SlRD!en! el! ensayo! no! tratado! (figura! 3.16).! Por! lo! tanto!y! atendiendo! a! los! resultados! observados!se!puede!asegurar!que!SlRD!forma!un!homodímero!in+vivo.!! 3.6.1. Localización!del!dímero!SlRD[SlRD!mediante!BiFC! Una!vez!observado!que!SlRD!forma!homodímeros!en!levaduras!y!en!bacterias!se! quiso! corroborar! si! este! fenómeno! tenía! lugar! en! células! vegetales! y,! si! así! ocurría,!estudiar!la!distribución!en!éstas.!El!abordaje!de!este!objetivo!se!realizó! mediante!un!ensayo!de!BiFC,!al!igual!que!se!hizo!en!el!estudio!de!la!interacción! SlCIPK6/SlRD.!Para!ello!se!clonó!el!cDNA!completo!de!SlRD!en!los!vectores!del! BiFC!y! mediante! Agrobacterium!se! expresaron! las!cuatro! combinaciones! diferentes!en!hojas!de!N.+benthamiana.!Dos!días!después!el!resultado!se!visualizó! en!un!microscopio!confocal!(figura!3.18).! ! ! ! Figura)3.17:)SlRD))forma)un)homodímero)in#vivo.!!La!sobre[expresión!de!HIS[SlRD!en!E.+coli!se! indujo!por!la!adición!al!medio!de!cultivo!de!1!mM!de!IPTG.!Las!células!se!trataron!durante!30! minutos!con!el!agente!crosslinking!DSG!y!la!sobre[expresión!de!la!proteína!se!detectó!por!westernH blot,!empleando!el!anticuerpo!anti[HIS.!El!nivel!de!polimerización!se!calculó!en!función!al!peso! molecular!resultante,!!donde!1X!!corresponde!al!tamaño!del!monómero!y!2X!al!del!dímero.! !"""""""""!""""""""#" !"""""""""#""""""""#" $%&#&'()" !"#$%#&'()**+,-$.-$"& *+" ,-"" -*" ./" */" "0)" Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 141! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! La!combinación!que!mostró!unos!resultados!más!representativos!fue!aquella!en! la!que!el!trozo!de!la!proteína!YFPC!y!YFPN!se!encontró!fusionado!al!!N[terminal!de! SlRD.!Como!se!aprecia!en!la!figura!3.18!el!dímero!SlRD/SlRD!se!localiza,!en!las! condiciones!ensayadas,!en!el!citoplasma!(figura!3.18.A!y!B)!y!en!el!núcleo!(figura! 3.18.C).! Previamente! a! su! colocalización! con! el! marcador! de! citoplasma! AtFKBP12[CFP! (cian)!se! observó! que! SlRD/SlRD! no! se! colocaliza! con! FM4[64! (figura!3.18.B),!por!lo!que!se!descartó!su!localización!en!la!membrana!plasmática.! La!distribución!observada!para!el!dímero!de!SlRD/SlRD!es!similar!a!la!obtenida!a! por! la! fusión! GFP[SlRD,! vista! en! el! apartado! 2.2.!Estos! son! los! primeros! Figura) 3.18:)Localización) celular) del) homodímero) formado) por) SlRD) en) células) epidérmicas)de)N.#benthamiana.!A)y)C)!Colocalización!del!dímero!SlRD[SlRD!(amarillo)!con!el! marcador!de!membrana!FM4[64!(rojo).!B)!Colocalización!del!dímero!SlRD[SlRD!(amarillo)!con!la! proteína! citoplasmática! AtFKBP12[CFP! (cian).! Las! construcciones! SlRD[YFPC!y! SlRD[YFPN!se! expresaron!de!forma!transitoria!en!hojas!de!N.+benthamiana!vía!Agrobacterium.!Pasados!dos!días! se! visualizó! la! expresión! en! un! microscopio! confocal.! Las! flechas! remarcan! la! localización! observada!para!SlRD.! ! !" #" $" !%&%'(&)*(')+," -(.'(/%." 01234&56" !"#$%#& !"#$%#& '(!)*+,-& "789"" :;89"" "789"" Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 142! resultados!que!muestran!la!dimerización!y!localización!in+vivo!de!una!proteína! con!dominio!Usp!de!plantas.! 3.6.2. Implicación!de!la!dimerización!en!la!unión!a!SlCIPK6! Tras!comprobar!la!capacidad!de!SlRD!de!formar!dímeros!se!procedió!a!estudiar! la!implicación!que!la!dimerización!tenía!en!la!interacción!a!SlCIPK6.!Para!ello!se! construyó!un!mutante!de!SlRD!en!el!que!se!había!eliminado!los!aminoácidos!VIIV,! correspondientes,!a!priori,!a!los!residuos!responsables!de!la!dimerización!(figura! 3.1),!y!al!que!se!denominó!SlRDΔDIM.!Posteriormente!se!realizó!un!ensayo!de! doble!híbrido!donde!las!levaduras!expresaban!la!versión!SlRDΔDIM!en!el!vector! presa! y! cebo!simultáneamente! (pEG202! y! pJG4[5! respectivamente)! con! el! objetivo!de!verificar!que!el!dominio!eliminado!realmente!estaba!implicado!en!la! dimerización.!Como!control!positivo!se!emplearon!las!levaduras!transformadas! con!las!formas!silvestres!de!SlRD!(figura!3.16).! No!se!observó!interacción!en!las!levaduras!transformadas!con!las!construcciones! pEG202[SlRDΔDIM!y!pJG4[5[SlRDΔDIM!(figura!3.19.A).!Los!resultados!obtenidos! se! cuantificaron!por! ensayo! β[galactosidasa! (figura! 3.19.C).! Estos! datos! demuestran! que! la! región! eliminada! es! la! responsable! de! la! dimerización!en! levaduras,! ya! que! SlRDΔDIM! pierde! la! capacidad! de! formar! homodímeros.! La! expresión!de!las!proteínas!utilizadas!en!el!ensayo!de!doble!híbrido!se!verificó! mediante!westernHblot!(figura!3.19.B).! ! ! ! ! ! ! ! Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 143! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura) 3.19:)Ensayo) de) doble) híbrido) con) la) forma) mutante) SlRDΔDIM)en) levaduras.!A)! Ensayo!de!doble!híbrido!empleando!como!cebo!y!presa!a!la!proteína!SlRDDIM.) B)!WesternHblot! que!confirma!la!expresión!en!levaduras!de!la!forma!mutante!SlRDΔDIM.!C)!Medida!de!la!actividad! β[galactosidasa!expresada!en!unidades!de!Miller.!Se!representa!el!valor!medio!de!tres!ensayos! con! réplicas! biológicas! independientes.! La! barra! de! error! corresponde! al! error! estándar! de! la! media.!La!cepa!de!S.+cereviseae!EGY48!se!usó!para!probar!la!capacidad!de!dimerizar!de!la!forma! mutante!SlRDΔDIM!(clonada!en!los!vectores!pEG202!y!pJG4[5).!Los!ensayos!se!realizaron!sobre! placas!que!fuerzan!la!interacción,!(1)!SD!Gal!con!Xgal!y!(2)!SD!Gal!sin!LEU.!Los!cultivos!que!se! hicieron! crecer!durante! toda! la! noche! en! medio! mínimo! SD!(SD! Glu! –URA,! [HIS! y! –TRP)!se! diluyeron!en!agua!estéril!y!se!plaquearon!a!una!DO600!de!0.1!y!0.001..!! !" #!" $!" %&!" %'!" &!!" %" &" (" #" )*+,-,./",."0+11.2"3)4" 5 %6 7189:7189" &6 7189;9<0:7189;9<0" (6 =>?&!&:7189;9<0" #6 7189;9<0:=@?#AB" !!" !#$%" !#&'(%" !!" )*" +" ," -" Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 144! Paralelamente!se!llevaron!a!cabo!ensayos!de!BIFC!con!la!versión!SlRDΔDIM!con! el!objetivo!de!verificar!si!el!dominio!de!dimerización!eliminado!también!estaba! implicado!en!la!formación!de!los!dímeros!en!N.+benthamiana.!Previamente,!para! comprobar!la!estabilidad!de!la!proteína!SlRDΔDIM!en!la!planta,!se!agro[expresó! en!hojas!de!N.+benthamiana!la!proteína!de!fusión!GFP[SlRDΔDIM!y!se!visualizó!su! localización!mediante!microscopía!confocal.!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Como!se!puede!apreciar!en!la!figura!3.20!la!proteína!GFP[SlRDΔDIM!se!expresa! perfectamente!en!la!planta!y!su!localización!fue!similar!a!la!presentada!por!GFP[ SlRD!(figura!3.4),!encontrándose!en!el!núcleo!(flechas!blancas,!figura!3.21.A)!y!en! el!citoplasma!(flechas!blancas,!figura!3.21.B)!!De!estos!datos!se!puede!interpretar! que! el! transporte! de! SlRD! al! núcleo! es! independiente! del! estado! de! dímero! o! monómero.! A! continuación! se! clonó! la! forma! GFP[SlRDΔDIM!en! los! cuatros! vectores! del! BiFC! y! posteriormente! se! agro[expresaron! las! diferentes! combinaciones! en! hojas! de! N.+ benthamiana,!viéndose! los! resultados! dos! días! después!mediante!microscopía!confocal!(figura!3.21).! Figura) 3.20:)Localización) celular) del) mutante) SlRDΔDIM)en) células) epidérmicas) de) N.# benthamiana.!A) y) B)!Colocalización!de!GFP[SlRDΔDIM!(verde)!con!el!marcador!de!membrana! FM4[64!(rojo).!La!construcción!GFP[SlRDΔDIM!clonada!en!el!vector!pGWB5!se!expresó!de!forma! transitoria! en! hojas! de! N.+ benthamiana!vía! Agrobacterium.! Pasados! dos! días! se! visualizó! la! expresión!en!un!microscopio!confocal.!Las!flechas!remarcan!la!localización!observada!para!GFP[ SlRDΔDIM.! ! !" #" $%&'()*+,+-." "/01"" 2/01"" 34)456)786579:" .6;56<4;" !"#$%#& !"#$%#& Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 145! ! ! ! ! ! ! Al!igual!que!ocurre!en!el!ensayo!de!doble!híbrido,!en! planta!la!forma!mutada! SlRDΔDIM!también! ha! perdido! la! capacidad! de! dimerizar.! Como! se! puede! apreciar!en!la!figura!3.21!la!proteína!SlRDΔDIM!no!es!capaz!de!reconstituir!la! fluorescencia!derivada!de!la!YFP.! Tras! determinar! que! SlCIPK6! y! SlRD! interaccionan,!que!SlRD! forma! homodímeros! y! determinar! el! dominio! de! aminoácidos! necesarios! para! la! dimerización,! se! procedió! a! comprobar! si! la! interacción!SlCIPK6/SlRD! es! dependiente! de! la! capacidad! de! dimerizar! de! SlRD.! Para! ello! y! como! primera! aproximación!se!realizó!un!ensayo!de!doble!híbrido,!en!el!que!las!levaduras!se! transformaron! con! la! combinaciones! siguientes:! pEG202[SlCIPK6/pGJ4[5[ SlRDΔDIM,! pEG202[SlCIPK6T172D/pGJ4[5[! SlRDΔDIM! y! como! control! pEG202! (00)/pGJ4[5[!SlRDΔDIM.! ! ! ! ! ! ! ! Figura)3.21:)Ensayo)BIFC)realizado)con)la)forma)mutante)SlRDΔDIM)en)células)epidérmicas) de) N.# benthamiana.! Las! construcciones! se! expresaron! de! forma! transitoria! en! hojas! de! N.+ benthamiana!vía!Agrobacterium.!Pasados! dos! días! se! visualizó! la!expresión! en! un! microscopio! confocal.!! !"#$%$&'()*+,-. !"#$%$&'()*+/. )*+,(!"#$%$&'-. !"#$%$&'()*+/. !"#$%$&'()*+,-. )*+/(!"#$%$&'. )*+,(!"#$%$&'-. )*+/(!"#$%$&'. Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 146! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! En!el!ensayo!de!doble!híbrido!de!la!figura!3.22!se!puede!apreciar!que!las!formas! silvestre!y!constitutiva!activa!de!SlCIPK6!no!interaccionan!con!SlRDΔDIM,!ya!que! no! hay! ni! supervivencia! en! un! medio! sin! LEU! ni! actividad! β[galactosidasa! en! presencia!de!X[gal.!La!expresión!de!las!proteínas!utilizadas!en!el!doble!híbrido!se! confirmó!mediante!westernHblot!(figura!3.22B).!Por!último!y!para!confirmar!que! este!fenómeno!tampoco!tendría!lugar!en!células!vegetales,!se!realizó!un!ensayo! BiFC! entre!la! forma! mutante! SlRDΔDIM! y! SlCIPK6.! Las! condiciones! de! ensayo! fueron!las!mismas!que!en!el!caso!anterior.!! ! ! ! ! ! Figura)3.22:)Interacción)entre)la)forma)mutante)SlRDΔDIM))y)SlCIPK6)en)levaduras.!A)!Ensayo! de!doble!híbrido!realizado!con!las!combinaciones!pEG202[SlCIPK6/pGJ4[5[SlRDΔDIM,!pEG202[ SlCIPK6T172D/pGJ4[5[SlRDΔDIM! y! pEG202(00)/pGJ4[5[SlRDΔDIM.! B)!WesternHblot!que! confirma!la!expresión!en!levaduras!de!la!forma!mutante!SlCIPK6!(LexA)!y!SlRDΔDIM!(HA)!(1),!! SlCIPK6T172D!(LexA)!y!SlRDΔDIM!(HA)!(2)!y!el!vector!pGE202!vacío!y!SlRDΔDIM!(HA)!(3).!La! cepa!de!S.+cereviseae!EGY48!se!usó!para!probar!la!interacción!entre!la!forma!mutante!SlRDΔDIM! (clonada! en! el! vector! pJG4[5)! y! SlCIPK6! (clonada! en! el! plásmido! pEG202).! Los! ensayos! se! realizaron!sobre!placas!que!fuerzan!la!interacción,!(1)!SD!Gal!con!Xgal!y!(2)!SD!Gal!sin!LEU.!Los! cultivos!que!se!hicieron!crecer!durante!toda!la!noche!en!medio!mínimo!SD!(SD!Glu!–URA,![HIS,![ TRP)!se!diluyeron!en!agua!estéril!y!se!hicieron!diluciones!a!una!DO600!de!0.1!y!0.001.!! ! !"#$%$&'()*+ ,-++ ..++ /$+ 0++++++++++1+++++++++2++++++++ 3(456*+ 3()*+ 7 Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 147! ! ! ! ! ! ! Como!se!puede!apreciar!en!la!figura!3.23!tampoco!se!observó!interacción!in+vivo! mediante!ensayo! BiFC!entre! SlRDΔDIM!y! SlCIPK6,! ya! que! no! se! visualizó! fluorescencia!derivada!de!la!YFP.!Por!tanto!podemos!concluir!que!para!que!exista! interacción! entre! las! proteínas! SlCIPK6! y! SlRD! es! necesario! que! ésta! última! dimerice.!! 3.7. Estudio)de)la)unión)a)ATP)de)SlRD)) Como! se! ha! descrito! previamente!las! Usps! de! bacterias! se! clasifican! en! dos! grupos,!uno!formado!por!proteínas!que!unen!ATP!y!se!asemejan!a!la!proteína! MJ5077!y!el!otro!por!proteínas!que!no!lo!unen!y!se!asemejan!a!HiUspA.!Mediante! alineamiento! múltiple! de! las! secuencias! de! aminoácidos! de! varias! proteínas! pertenecientes!a!la!superfamilia!Usp!se!comprobó!que!SlRD!tiene!conservadas! las! regiones!de!unión! a!ATP! (figura! 3.1).! Recientemente,! mediante!un! análisis! filogenético!realizado! con!la! secuencia! de! aminoácidos! de!al! menos!100! proteínas!con!homología!a!las!Usps!de!plantas!y!microorganismos,!se!confirmó! que! las! Usps! de! plantas! se! encuentran! más! cercanas!filogenéticamente!a! la! subfamilia!MJ0577.!Para!verificar!que!SlRD!une!ATP!in+vivo!se!realizó!un!ensayo! de!unión!al!nucleótido!empleando!para!ello!ATP!marcado!radiactivamente!con! 32P!en!el!fosfato!α!(apartado!M.6.7!de!materiales!y!métodos).!Para!ello!2!μg!de!la! proteína!HIS[SlRD!clonada!en!el!vector!pDEST17!y!purificada!mediante!columna! de!!níquel!se!incubaron!durante!una!hora!!en!presencia!de!(α[32P)ATP.!Tras!la! reacción,!las!muestras!se!analizaron!por!SDS[PAGE!y!se!auto[radiografiaron.!! Figura) 3.23:)Ensayo) BIFC) realizado) con) la) forma) mutante) SlRDΔDIM)y) SlCIPK6) en) células) epidérmicas)de)N.#benthamiana.!Las!construcciones!se!expresaron!de!forma!transitoria!en!hojas! de! N.+ benthamiana!vía! Agrobacterium.! Pasados! dos! días! se! visualizó! la! expresión! en! un! microscopio!confocal.!! !"#$%$&'()*+,-. !"/&+01()*+/. )*+,(!"#$%$&'-. !"/&+01()*+/. !"#$%$&'()*+,-. )*+/(!"/&+01. )*+,(!"#$%$&'-. )*+/(!"/&+01. Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 148! En!la!figura!3.24!se!observa!como!SlRD!une!de!forma!específica!(α[32P)ATP!en!las! condiciones! ensayadas!(carrail! 1,! figura! 3.24)!a! diferencia!de! la! proteína! GFP! (carril!2,!figura!3.24),!empleada!como!control!negativo!del!ensayo.!Previamente! ya!se!había!demostrado!experimentalmente!que!la!Usp!de!planta!VfENOD18!une! ATP! in+ vitro!(Becker,! Moreira! et! al.! 2001).! Como! control! de! carga! proteica! se! realizó!un!westernHblot!de!la!misma!membrana!empleada!en!el!ensayo,!utilizando! para! ello! anticuerpos! anti[HIS!(panel! inferior,! figura! 3.24).! Por! lo! tanto! y! en! función!de!los!resultados!obtenidos!SlRD!puede!ser!clasificar!como!una!proteína! con!dominio!Usp!perteneciente!a!la!subfamilia!MJ0577.!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Una! vez! verificada! la! capacidad! de! SlRD! de!unir! ATP! se! quiso! explorar! la! relevancia!funcional! de!la!unión.! Para!ello!se! realizaron!mutaciones!puntuales! sobre! residuos! conservados! de! las! regiones!de! unión! a! ATP.! Previamente! se! había!descrito!que!la!sustitución!del!ácido!aspártico!15!por!ácido!glutámico!y!de! la!glicina!117!por!alanina!en!la!proteína!Rv2623!de!Mycobacterium+tuberculosis+ daba!lugar!a!una!disminución!de!la!unión!a!ATP+(Drumm,!Mi!et!al.!2009).!En!base! a!estos!datos!se!localizaron!los!mismo!residuos!conservados!en!la!proteína!SlRD! (correspondientes!a! D47! y! G135!den! SlRD,! figura!3.25)!y! se! construyeron! los! siguientes!versiones!mutantes!de! la! proteína:! SlRDD47E,! SlRDG135A! y! el! mutante!doble!SlRDdmut.! Figura) 3.24:)Unión) a) (α32P)RATP) de) SlRD#in# vitro.) El)ensayo!de! unión! a! ATP)se! realizó! incubando! 2! μg!de! HIS[SlRD! (línea! 1)! con! (α32P)[ATP!durante! una! hora! a! 30ºC.! Como! control! negativo!del!ensayo!se!utilizaron!3!μg!de!la!proteína!GFP!(línea!2).!Una!vez!parada!la!reacción!las! muestras!se!analizaron!por!SDS[PAGE!y!se!auto[radiografíaron.!Como!control!de!carga!se!realizó! un! westernHblot!a! la! misma! membrana! empleada! en! el! ensayo! de! unión! a! ATP,! utilizando! el! anticuerpo!anti[HIS.!! ! !"# !"## $%&'(# $%)*+# ,############!###### -.# Caracterización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capítulo!3! ! ! 149! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Posteriormente!las!tres!versiones!de!SlRD!se!clonaron!en!el!vector!pDEST17,!se! purificaron!mediante!columna!de!níquel!y! se!realizó!el!ensayo!de! unión!a!(α[ 32P)ATP!con!cada!una!de!ellas,!siguiendo!las!misma!pautas!descritas!que!para!el! ensayo!anterior.!Una!vez!parada!la!reacción,!las!muestras!se!analizaron!por!SDS[ PAGE!y!se!auto[radiografiaron.!! ! ! ! ! ! ! ! En! las!condiciones! de! ensayo! realizadas!todas! las! formas! mutantes! de! SlRD! presentaron!intacta!la!capacidad!de!unión!a!ATP!(panel!superior,!figura!3.26).! Como! control! de! carga! proteica! se! realizó! un! westernHblot!de! la! misma! !!!"!!!!!!!!!!#!!!!!!!!!!$!!!!!!!!!!%! #&!! #&! '()*+! '(,-.! /0! Figura)3.26:)Ensayo)de)unión)a)(α32P)RATP)de)los)mutantes)SlRDD47E)(2),)SLRDG135A)(3))y) SlRDdmut)(mutante)doble,)4)#in#vitro.)El)ensayo!de!unión!a!ATP)se!realizó!incubando!3!μg!de! cada!una!de!las!formas!con!(α32P)[ATP!durante!una!hora!a!30ºC.!Como!control!positivo!del!ensayo! se! utilizó! la! forma! silvestre! de! SlRD! (línea! 1).! Una! vez! parada! la! reacción,! las! muestras! se! analizaron!por!SDS[PAGE!y!se!auto[radiografiaron.!Como!control!de!carga!se!realizó!un!westernH blot!a!la!misma!membrana!empleada!en!el!ensayo!de!unión!a!ATP,!utilizando!el!anticuerpo!anti[ HIS.!! ! Figura)3.25:!Alineamiento)de) la)secuencia) de) aminoácidos)entre)SlRD) y) MJ0577.!El!fondo! negro!muestra!los!residuos!idénticos!en!ambas!secuencias,!en!gris!los!residuos!muy!conservados! y!en!blanco!los!!residuos!no!conservados.!Los!residuos!implicados!en!la!unión!a!ATP!y!mutados!se! indican!con!una!flecha!roja.!Los!residuos!de!unión!a!ATP!se!muestran!en!la!figura!y!en!los!que!la! (A)!representa!el!lugar!de!unión!a!la!adenina,!la!(P)!al!fosfato!y!la!(R)!a!la!ribosa.!El!alineamiento! se!realizó!utilizando!el!programa!bioEdit.! SlRD ---RGRDIVIAIDHGPNSKHAFDWAVTHLCRLADTLHLVHAVSS---------------- 41 MJ0577 MSVMYKKILYPTDFSETAEIALKHVKAFKTLKAEEVILLHVIDEREIKKRDIFSLLLGVA 60 SlRD --------LKNEIVYEATQGLMEKLA--VEAFSVAMVKTVARIVEGDAGKVICKEAERLK 91 MJ0577 GLNKSVEEFENELKNKLTEEAKNKMENIKKELEDVGFKVKDIIVVGIPHEEIVKIAEDEG 120 SlRD PSAVVMGTRGRGIIQSVLQGSVAEYCLHNCKIAPVIIVPGKEAGEVSVI 140 MJ0577 VDIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKKSNK-PVLVVKRKNS------ 162 !" !" #$%" %" !"#$ %&'($