Modelos avanzados para el estudio de la toxicidad in vitro y su aplicación a cianotoxinas

Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia MODELOS AVANZADOS PARA EL ESTUDIO DE LA TOXICIDAD IN VITRO Y SU APLICACIÓN A CIANOTOXINAS. María de las Mercedes Recio Remón Grado en Farmacia Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Trabajo Fin de Grado Grado en Farmacia MODELOS AVANZADOS PARA EL ESTUDIO DE LA TOXICIDAD IN VITRO Y SU APLICACIÓN A CIANOTOXINAS. María de las Mercedes Recio Remón. Aula 0.2. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. 4 de Julio 2022. Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal Área de Toxicología Tutoras: Dra. Ana María Cameán Fernández Dra. Leticia Diez-Quijada Jiménez Trabajo de Revisión Bibliográfica RESUMEN Las cianotoxinas son toxinas producidas por diferentes especies de cianobacterias, cuya proliferación está aumentando en los últimos años como consecuencia del cambio climático, y diferentes factores ambientales y humanos. Por ello, el estudio de las mismas ha adquirido un mayor peso en la última década como consecuencia de los efectos perjudiciales que tienen tanto en el hombre como en el medioambiente. La necesidad de nuevas investigaciones que permitan dilucidar los rangos de toxicidad, los efectos y sus consecuencias hacen que el desarrollo y empleo de nuevos modelos in vitro sea cada vez necesario. Dichos modelos, nos permiten obtener resultados semejantes a lo que sucedería en el organismo humano, teniendo dichos estudios cada vez más peso, y por lo tanto siendo cada vez más utilizados. Por lo cual, en los últimos años se ha potenciado el uso de estos nuevos modelos para el estudio de la toxicidad in vitro, con el objetivo de obtener el máximo rendimiento y donde los esferoides y organoides se abren paso entre los modelos bidimensionales (2D). En consecuencia, la presente revisión tiene por objetivo recoger la información existente en la literatura científica acerca de los nuevos modelos tridimensionales (3D), en referencia a sus ventajas e inconvenientes, así como sus formas de obtención, con especial atención en los esferoides y organoides. Del mismo modo, se pretende recopilar y revisar la información disponible sobre los estudios realizados con cianotoxinas, y en concreto Microcistinas (MCs) y Cilindrospermopsina (CYN) mediante el empleo de modelos 3D. Los resultados obtenidos tras la realización de esta revisión, han mostrado que los modelos 3D ofrecen resultados más fiables y más precisos y cercanos a la realidad de lo que lo hacen los modelos 2D, siendo necesario el desarrollo de nuevos modelos, cada vez más optimizados y completos. Palabras clave: Cianotoxinas, modelos celulares 3D, esferoides, organoides, Toxicología ABSTRACT Cyanotoxins are toxins produced by different species of cyanobacteria, whose proliferation is increasing in recent years as a result of climate change, and different environmental and human factors. For this reason, the study of them has acquired more importance in the last decade as a consequence of the detrimental effects they have both on man and on the environment. The need of new research that allows elucidating the ranges of toxicity, the effects and their consequences makes the development and use of new in vitro models increasingly necessary. These models allow us to obtain similar results to what would happen in the human body, these studies having more and more importance, and therefore being used more and more. Therefore, in recent years the use of these new models for the study of in vitro toxicity has been promoted, with the aim of obtaining maximum performance and where spheroids and organoids make their way between two-dimensional (2D) models. Consequently, this review aims to collect the existing information in the scientific literature about the new three-dimensional (3D) models, in reference to their advantages and disadvantages, as well as their methods of obtaining, with special attention to spheroids and organoids. In the same way, it is intended to collect and review the information available on the studies carried out with cyanotoxins, and specifically Microcystins (MCs) and Cylindrospermopsin (CYN) through the use of 3D models. The results obtained after carrying out this review have shown that 3D models offer more reliable and more precise results that are closer to reality than 2D models, making it necessary to develop new models that are increasingly optimized and complete. Keywords: Cyanotoxins, 3D cell model, spheroids, organoids, Toxicology. ÍNDICE 1. Índice de Figuras y Tablas……………………………………………………….1 2. Índice de abreviaturas……………………………………………………………2 3. Introducción……………………………………………………………………...4 3.1. Cultivos 3D………………………………………………………………….5 3.2. Esferoides…………………………………………………………………...8 3.3. Organoides…………………………………………………………………10 3.4. Cianotoxinas……………………………………………………………….12 4. Objetivos de la revisión………………………………………………………...16 5. Metodología…………………………………………………………………….16 6. Resultados y discusión………………………………………………………….17 7. Conclusiones……………………………………………………………………29 8. Bibliografía……………………………………………………………………..30 1 1. ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Organoides tisulares…………………………………………………………..10 Figura 2. Organoides de células madre………………………………………….………11 Figura 3. Estructura general de las MCs………………………………………………..13 Figura 4. Estructura general de la CYN…………………………………………………16 Figura 5. Histograma de frecuencias de los artículos encontrados clasificados por años……………………………………………………………………………………..17 Tabla 1. Resumen de los estudios realizados sobre la toxicidad de las MCs y CYN mediante el empleo de modelos in vitro………………………………………………..18 Tabla 2. Resumen de los estudios realizados sobre la toxicidad de Noc A y PAB mediante el empleo de modelos in vitro…………………………………………………………...26 2 2. ÍNDICE DE ABREVIATURAS AB: Azul alamar. BCL: Linfoma de células B. BMAA: β-metilamino-L-alanina. CFDA-AM: Éster acetoximetílico de diacetato de 5-carboxifluoresceína. CYN: Cilindrospermopsina. CYP450: Citocromo P-450. DMSO: Dimetilsulfóxido. DSB´s: Rotura de la doble cadena. ECM: Célula-matriz extracelular. ELISA: Enzimoinmunoanálisis de adsorción. EMC: Esferoides multicelulares. FDA: Food and Drugs Administration. HCC: Carcinoma hepatocelular. HCT: Carcinoma de colon humano. HDP: Placas colgantes. HepG2: Células de carcinoma hepatocelular humano. HIF: Factor inducible por hipoxia. HL1-1: Células madre de hígado humano adulto. hTERT: Telomerasa transcriptasa inversa humana. ICC: Inmunocitoquímica. LSC: Célula madre hepática. LSD: Células madre hepáticas adultas humanas. MAPK: Proteína Quinasa activada por mitógenos. MCF: Carcinoma de mama humano. MCs: Microcistinas. MC-LR: Microcistina-LR. MC-RR: Microcistina-RR. MDR: Proteínas resistentes a múltiples fármacos. MEC: Matriz extracelular. MTS: Sal de Tetrazolio. MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol. NocA: Nocuolina A. 3 NR: Rojo neutro. Nrf2: Factor 2 relacionado con el factor nuclear eritroide 2. OATP: Sistema de transportadores de aniones orgánicos. OATP1B1: Sistema de transportadores de aniones orgánicos tipo 1B1. OATP1B3: Sistema de transportadores de aniones orgánicos tipo 1B3. OMS: Organización Mundial de la Salud. PAB: Portoamidas A y B. PP: Proteínas serina/treonina. ROS: Especies reactivas de oxígeno. RC: Respiración celular. TRME: Éster etílico de tetrametil-rodamina. WB: Transferencia Western. 2D: Dos dimensiones/bidimensional. 3D: Tres dimensiones/tridimensional. 4 3. INTRODUCCIÓN Los modelos animales, en particular los roedores, han sido utilizados a lo largo de la historia con fines científicos en investigación clásica al tener estructuras fisiológicas similares a las del hombre, lo cual permitía conocer el funcionamiento de los sistemas orgánicos, por las similitudes entre los sistemas fisiológicos del diferentes especies animales y el ser humano (Rodríguez, 2007). Sin embargo, recientemente la consideración de los aspectos éticos de la investigación, su limitación en cuanto viabilidad y su elevado coste han delimitado su uso (Saglam-Metiner et al., 2019; Weinhart et al., 2019). Existen otros motivos que limitan su uso ya que, a pesar de la eficacia y seguridad de los estudios preclínicos, se han demostrado algunos de sus inconvenientes (Weinhart et al., 2019). Entre las posibles razones podríamos destacar la caracterización de los modelos relevantes, es decir, las diferencias interespecies relacionadas con los humanos tales como la anatomía, pato(fisiología) e inmunología (Weinhart et al., 2019). Como consecuencia de la falta de concordancia y los problemas de reproducibilidad, el papel del uso de modelos animales preclínicos ha sido cuestionado (Weinhart et al., 2019). Con el objetivo de solventar estos problemas éticos, las técnicas convencionales de cultivo celular in vitro en dos dimensiones (2D) se han convertido en importantes herramientas para el estudio de fármacos y enfermedades de acuerdo con el principio de las 3Rs (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) descrito por Russell y Burch en 1959 (Saglam-Metiner et al.,2019). Actualmente, se puede comprobar que existe todavía un gran camino por recorrer, ya que aún no se han dejado de utilizar los animales en experimentación, al ser necesarios para la evaluación de diferentes sustancias siguiendo protocolos internaciones de experimentación, como los existentes en la Organización para la Cooperación y Desarrollo Económicos (OECD) (https://www.oecd.org/). No obstante, los sistemas de cultivo 2D formados en placas de cultivo tisular se emplean en numerosas ocasiones para el estudio de fármacos in vitro, así como sus aplicaciones, al tener bajo coste y ser fácilmente controlables (Saglam-Metiner et al., 2019). Por el contrario, los sistemas 2D no tienen las características de los sistemas tridimensionales (3D) que hace que sea más difícil hacer aproximaciones a la realidad. Por tanto, el mayor problema presentado por los cultivos convencionales en 2D es la ausencia de matriz extracelular (MEC), la cual es la encargada de la comunicación entre las células formadoras de la matriz que participa directamente en las propiedades 11 Por otro lado, encontramos los organoides de células madre, los cuales crecen a partir de células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas o células madre adultas restringidas a los órganos que queremos sintetizar (Saglam-Metiner et al., 2019). Figura 2: Organoides de células madre. Imagen tomada de Saglam-Metiner et al., (2019). Por añadidura de que pueden ser producidos a partir de múltiples materias primas, el fenotipo y cariotipo de los organoides se mantienen estables. Es por lo que esta estructura ha pasado a ser un modelo valioso para el estudio de la biología de células madre, la organogénesis, la patología humana, etc. Además, la especificidad genética del órgano de la persona, la capacidad de asemejar a la complejidad y estructura in vivo, así como la posibilidad de realización de pruebas a largo plazo son las ventajas que los hacen tan importantes (Saglam-Metiner et al., 2019). En contraposición, encontramos ciertas desventajas como son: problemas éticos (principalmente asociados al empleo de células madre embrionarias), el factor económico y el factor tiempo (debidos a la lentitud en el desarrollo); la limitación de vida media; la dificultad para alcanzar la madurez in vivo, así como las dificultades en las técnicas disponibles para resolverlos, jugando todo ello en su contra (Saglam-Metiner et al., 2019). Así como los esferoides tienen una vida relativamente larga, en el caso de los organoides no fue hasta el 2006 cuando se creó el primer organoide. Se trataba de un organoide hepático creado a base del reclutamiento de hepatocitos en estructuras vasculares endoteliales cultivado en un Matrigel (Van Berlo et al., 2021). Este modelo tuvo una gran ventaja frente a los “gold standard” (que hasta la fecha habían sido los esferoides) para el estudio de investigaciones in vitro del hígado, los hepatocitos primarios cultivados, y es que estos organoides ofrecían la posibilidad de ser cultivados durante más de dos meses con actividad citocromo-P-450 (CYP450) (Lou & Leung, 2018). 12 3.4.CIANOTOXINAS Las cianobacterias son un grupo de antiguos microorganismos fotosintéticos que están presentes en todas partes y que se caracterizan por la producción de metabolitos secundarios que tienen aplicaciones generalizadas (Sousa et al., 2020). Las cianotoxinas, son los metabolitos secundarios tóxicos producidos por las cianobacterias, y abarcan una amplia gama de compuestos, que incluye péptidos cíclicos y alcaloides, que pueden ser hepatotóxicos, citotóxicos, genotóxicos o neurotóxicos (Kaloudis et al., 2022). Son microorganismos muy versátiles, ya que se han desarrollado pudiendo adaptarse a las diferentes condiciones de los entornos que habitan (Sousa et al., 2019). Se clasifican de modo general según su mecanismo de acción y su estructura química. En función de su objetivo toxicológico, es decir, según el órgano o sistema en el cual ejercen su toxicidad, se pueden clasificar en 4 grupos (Sanseverino et al., 2017.) : • Hepatotoxinas: Microcistinas y Nodularina. • Citotoxinas: Cilindrospermopsina. • Neurotoxinas: Anatoxinas, Saxitoxinas, β-metilamino-L-alanina (BMAA). • Dermatotoxinas: Lipopolisacárido, Lingbiatoxinas, Aplisiatoxina. En función de su estructura química, se clasifican en tres grupos (Sanseverino et al., 2017): - Péptidos cíclicos: Microcistinas y Nodularina. - Compuestos heterocíclicos (alcaloides): Cilindrospermopsina, Anatoxina, Saxitoxina, Lingbiatoxinas, Aplisiatoxina. - Compuestos lipídicos: Lipopolisacáridos. Su capacidad para para producir metabolitos secundarios ha hecho que se le reconozcan interesantes aplicaciones a nivel biotecnológico como los bioplásticos, productos farmacéuticos, anticancerígenos, antibióticos o antiprotozoarios, entre otras (Sousa et al., 2019). Sin embargo, las cianotoxinas pueden causar efectos tóxicos tanto en el hombre como en el medio ambiente (Díez-Quijada et al., 2019a). Entre las cianotoxinas descritas hasta la fecha, vamos a centrarnos en las Microcistinas (MCs) y la Cilindrospermopsina (CYN). Las MCs son el grupo mejor descrito y diverso de cianotoxinas, representando uno de los grupos más peligrosos de hepatotoxinas a nivel medioambiental (Raska et al., 2018; Diez-Quijada et al., 2019b). Las MCs pueden ser producidas por diferentes géneros 13 de cianobacterias como Microcystis, Planktothrix y Dolichospermum, entre otras (Catherine et al., 2017). En su mayoría son intracelulares, pero es posible que estén presentes extracelularmente como consecuencia de la lisis de las floraciones de cianobacterias (Díez-Quijada et al., 2019a). El número de variantes de MCs ha aumentado en los últimos años, aunque se ha demostrado que algunas de estas variantes minoritarias tienen actividades diferentes, no obstante, la información que se tiene de ellas aún es escasa (Raška et al., 2019). Dentro de las MCs, MC-LR y MC-RR son de los congéneres más investigadas, siendo MC-LR la variante más frecuentemente reportada, altamente peligrosa y ampliamente estudiada en el ámbito toxicológico principalmente (Raska et al., 2018). En relación con su estructura, las MCs son heptapéptidos cíclicos con la siguiente estructura: D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda-Arg5-D-Glu6-Mdha7, donde X y Z son los aminoácidos variables, D-MeAsp es el ácido D-eritro-β-metilaspártico, Adda es el ácido (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-metoxi-2-6-8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico y Mdha es N- metildehidroalanina. Cabe destacar que el ciclo Adda es único para cianobacterias (Díez- Quijada, 2019b). Los residuos de L-amino ácidos en las posiciones 2 (X) y 4 (Z) son los que permiten la aparición de las diferentes variantes de MCs (Díez-Quijada et al., 2019b). En el caso de MC-LR, tiene un residuo de Leucina (L) y Arginina (R) en las posiciones 2 y 4, respectivamente, siendo el congénere más estudiado, debido a su toxicidad, ubicuidad y prevalencia (Díez-Quijada et al., 2019b). Sin embargo, en función de los aminoácidos presentes en las posiciones 2 y 4, la toxicidad de las MCs puede diferir, tal y como es el caso de otros congéneres minoritarios de MCs que han mostrado tener un perfil toxicocinético y toxicodinámico diferente (Díez-Quijada et al., 2019b). Figura 3: Estructura general de MCs. Tomada de Díez-Quijada et al., (2019a). 14 La toxicidad de las MCs se produce por su captación por un sistema de polipéptidos transportadores de aniones orgánicos multiespecíficos (OATPs), este sistema de transporte se expresa en diferentes tejidos, lo cual hace que se haya observado toxicidad por estas cianotoxinas en diferentes órganos y no solo a nivel hepático (Raska et al., 2018). En relación a su mecanismo de acción, se sabe que las MCs inhiben a las fosfatasas de proteínas serina/treonina (PP), y especialmente PP1 y PP2A mediante enlace covalente (Díez-Quijada et al., 2019b). La alta proliferación de MCs tanto en agua dulce como en agua salada se ven aumentadas y favorecidas con el cambio climático y a las actividades antropogénicas. Como consecuencia de ello, se detectan comúnmente en ecosistemas acuáticos, contaminando aguas recreativas, aguas potables para consumo doméstico y por extensión puede derivar en la contaminación de alimentos irrigados o regados con estas aguas (Raska et al., 2018). La intoxicación por altas dosis de MCs se manifiesta en el hígado principalmente, a través de hemorragias hepáticas, shock hemorrágico, pudiendo desembocar en la muerte, mientras que, las exposiciones crónicas derivan en tumores. Esto ha hecho que las MCs formen parte de un grupo de hepatotoxinas ambientales altamente relevantes, que, por su peligrosidad, han sido altamente estudiadas (Raska et al., 2018). Por ello, la Organización Mundial de la Salud (OMS), ha establecido el valor guía en su última revisión para agua de consumo humano en 1,0 µg/L para MC-LR (OMS 2020), sin embargo, no se han definido valores de orientación específicos para otros congéneres. El valor de referencia es provisional, ya que se refiere únicamente a la MCLR, la base de datos es limitada, y se están generando datos nuevos sobre la toxicidad de las cianotoxinas (OMS 2020). En el caso de CYN, se trata de una cianotoxina que como consecuencia del cambio climático y al enriquecimiento de nutrientes en el agua, está en aumento dado que puede ser producida por diferentes especies de cianobacterias como Anabaena sp., Aphanizomenon sp., Chrisosporum ovalisporum, Rhaphisiopsis raciborskii, Lyngbya wollei etc.(Hercog et al., 2020). A pesar de que sus productores son especialmente nativos de zonas subtropicales, es cierto que se han desplazado a zonas más templadas detectándose en regiones de América del Norte y Europa, en aguas interiores y embalses para el suministro de agua lo que implica que se han desplazado a aguas más templadas y puede suponer un riesgo para la salud humana (Hercog et al., 2020). 15 Los seres humanos pueden exponerse a las CYN por exposición cutánea y por inhalación principalmente, aunque es la vía oral la que destaca por excelencia, ya sea por deglución accidental o por la ingestión de agua potable contaminada, pudiendo ocurrir, al igual que en el caso de las MCs, con el empleo de estas aguas para uso profesional, recreativo o doméstico (Hercog et al., 2020). La CYN es un alcaloide tricíclico que está formada por una guanidina tricíclica unida a un grupo hidroximetiluracilo (Pichardo et al., 2017). La presencia del grupo hidroxiuracilo unido a su esqueleto carbonado tricíclico, llevó a los investigadores a sugerir una posible interacción con los ácidos nucleicos (Raška et al., 2019; Hercog et al., 2020). Aunque los órganos diana de la toxicidad por MCs y por CYN son el hígado y el riñón, en el caso de CYN, muchos otros pueden verse afectados, de ahí su clasificación como citotoxina. Entre los mecanismos de acción tóxica de CYN se encuentran la inhibición de la síntesis de proteínas y glutatión, así como la inducción de estrés oxidativo y capacidad genotóxica (Hercog et al., 2020). La inhibición en la síntesis de glutatión produce la aparición de especies reactivas de oxígeno (ROS) y a la peroxidación lipídica (Hercog et al., 2020). En cuanto a su capacidad genotóxica, se ha mostrado que causa efectos genotóxicos en sistemas metabólicamente activos lo que significa que se requiere activación metabólica al ser progenotóxico, por acción del CYP450, para que se produzcan los efectos genotóxicos y citotóxicos, aunque dicha vía metabólica sigue sin estar clara. Esta actividad genotóxica, termina produciendo roturas del ADN y daño cromosómico (Hercog et al., 2020). Las enzimas del CYP450 son hemoproteínas encargadas de procesos de desintoxicación de xenobióticos, participan en el metabolismo celular y homeostasis. Por ello la inducción o inhibición de las enzimas del CYP450 es fundamental para el metabolismo de compuestos químicos externos (fármacos, toxinas…) o sustratos endógenos. Estas enzimas pueden ser activadas transcripcionalmente través de mecanismos mediados por receptores y dando como resultado la biotransformación de determinados compuestos que puede resultar en la bioactivación de compuestos químicos ambientales en productos potencialmente cancerígenos (Hercog et al., 2020). Sin embargo, ni la OMS ni el Codex Alimentarius hacen mención sobre las CYN y sus valores admisibles en agua. 16 Figura 4: Estructura general de la CYN. Tomada de Nyoni et al., (2017). 4. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo ha sido llevar a cabo una revisión bibliográfica en la que se recopile y revise la información disponible en la literatura científica sobre los modelos in vitro desarrollados hasta la fecha para la evaluación de la toxicidad de diferentes sustancias, y en concreto la aplicación específica de dichos modelos al estudio de la toxicidad de las cianotoxinas, al ser la información disponible sobre su toxicidad es escasa. Es por ello que los objetivos perseguidos en la presente revisión se centran en: • Estudio de los modelos avanzados para la evaluación de la toxicidad in vitro. Aplicación de los modelos avanzados al estudio de la toxicidad in vitro de las cianotoxinas. 5. METODOLOGÍA Se han empleado diferentes bases de datos científicas como fuentes de información para la redacción de la presente revisión bibliográfica, entre las cuales encontramos Science Direct, PubMed y Google Académico. Las palabras claves utilizadas para la búsqueda de información bibliográfica fueron: “3D cell model”, “spheroids”, “stem cells”, “organoids”, “toxicology”, “cyanotoxins”, “cylindrospermopsin”, “microcystins”. La búsqueda bibliográfica se ha limitado a una ventana de años que abarca desde 2017 al 2022, ya que así se asegura la novedad de la información aquí recopilada, así como su actualidad en el ámbito de la detección de la toxicidad de determinadas 17 sustancias in vitro. La referencia más antigua es Chuah & Zink, (2017) y la más actual Kaloudis et al., (2022). Figura 5: Histograma de frecuencias de los artículos encontrados clasificados por años. Por otro lado, ha sido fundamental el empleo de páginas web de referencia, como lo son OMS y FDA, las cuales han sido consultadas con objeto de determinar valores estipulados como límites permitidos en diferentes medios. Estas son referenciadas a lo largo de la revisión y recogidas en la bibliografía. Así mismo la traducción de los artículos empleados y citados ha sido hecha basándome en mis propios conocimientos del idioma, no obstante, se ha empleado el diccionario WordReference como apoyo. Además de lo ya mencionado, los tutores han sido pieza clave para la consulta de dudas, así como para la interpretación de los artículos empleados para elaborar la presente revisión acerca del estudio de los nuevos modelos para estudios in vitro. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. A continuación, nos vamos a centrar en el análisis y discusión de los estudios realizados para la determinación y descripción de la toxicidad in vitro de MCs y CYN, así como los modelos empleados para dicho fin. 2017 2018 2019 2020 2021 2022 Num 5 5 10 613 3 0 2 4 6 8 10 12 14 Numero de artículos publicados Año de publicación 18 Tabla 1: Tabla resumen de los estudios realizados sobre la toxicidad de MCs y CYN in vitro. Toxina Modelo experimental Ensayos realizados Rango de concentraciones y condiciones de exposición Principales resultados Referencia Estándar puro CYN y MC-LR. Modelo de esferoides 3D de la línea celular HL1- hT1, obtenida por inmortalización con hTERT de HL1-1 Ensayos en monocapa, esferoides pequeños (250 células/ esferoide) y grandes (4000 células/ esferoide) de viabilidad y crecimiento celular por medición en tiempo real de la impedancia celular. Además, se ensayó la viabilidad también por combinación de ensayos metabólicos tradicionales que evalúan la RC y actividad deshidrogenasa, esterasa e integridad de la membrana. Se ensayaron concentraciones de exposición por debajo de 10 µmol/L, para CYN y MC-LR. En monocapa se hicieron mediciones a las 96, 168, 336h. Los pequeños esferoides iniciales, se estudiaron a las 24, 96, 168, 264 y 336h (14 días) de exposición. Los esferoides más grandes, se estudiaron a las 96 y 168h de exposición. En monocapa, MC-LR no indujo citotoxicidad (EC50>10 µM), CYN inhibió el crecimiento celular y la viabilidad (48-96h; EC50 5,5 µM). En esferoides pequeños se inhibió crecimiento y viabilidad por ambas cianotoxinas (≥0,1µmol/L), con alteraciones a nivel superficial. En esferoides grandes, se redujo la viabilidad por ambas cianotoxinas a las 96h (EC50: 0,04µM-MCs y EC50: 0,1µM-CYN) (Basu et al., 2018) Estándar puro MCLR Línea celular de tallo hepático humano HL1-1 inmortalizadas con hTERF, dando HL1-hT1. Ensayos de viabilidad celular con tres indicadores: AB, CFDA-AM y NR, Captación de MC-LR y actividad MAPK mediante WB. Formación de ROS por ensayo CellROX. Evaluación del daño en el ADN por DSB´s mediante ICC. Se partió de una solución madre 500 μM de MC-LR en H2O estéril y se almacenó a −20 °C. Las concentraciones finales empleadas para las pruebas fueron 0,01-10µM durante 48h. No se afectó el crecimiento ni viabilidad de los cultivos tras 48h a la concentración máxima probada (10 μM). Las condiciones de exposición que mostraron bandas en WB no alteraron la expresión ni la actividad de las quinasas. No indujo aparición ni mantenimiento de ROS. (Raska et al., 2018) 19 No se alteró la expresión del gen inducible por estrés ATF3 en células tratadas con MC-LR. La acumulación de MCs se produjo probablemente por mecanismos independientes de OATP y MDR generando variaciones cuali y cuantitativas. Estándar puro CYN Cultivo en monocapa de la línea celular HL1- hT1 en material plástico de cultivo de tejidos. Análisis de citotoxicidad mediante medición de la impedancia celular. Análisis de estrés oxidativo mediante CellRox y medición de ROS. Análisis de genotoxicidad mediante ICC. Análisis de activación de MAPK. Se partió de una solución madre 500μM de MC-LR en H2O estéril y se almacenó a −20 °C. Para las sucesivas pruebas se emplearon concentraciones en el rango 0,1-5 µM durante 48-120h. CYN generó toxicidad y aumentó la muerte celular a las 24-48h de exposición a concentraciones mayores de 1µM, a concentraciones inferiores detuvo el crecimiento, pero no se observó muerte celular. El daño citotóxico se generó por la estimulación de vías de señalización y transcripcionales criticas para la regulación y no por estrés oxidativo inducido por CYN. (Raška et al., 2019) Estándar puro de CYN. Modelo avanzado 3D esferoides formados por flotación forzada Ensayos de crecimiento y viabilidad celular por MTS. Influencia sobre proliferación celular, alteración del ciclo celular y DSB´s mediante citometría de flujo. Estudio de los Se preparó una solución madre de CYN de 0,5 mg/ml en metanol al 50% y se almacenó a -20 °C. Posteriormente se emplearon las siguientes concentraciones 0,125- Se observó una reducción del tamaño de los esferoides la cual fue dosis dependientes. CYN afecto al ciclo celular en fase G1. (Hercog et al., 2020) 20 de células HCC, línea HepG2. genes implicados en metabolismo de xenobióticos, respuesta al daño de ADN, apoptosis y estrés oxidativo. 0,25-0,5 µg/mL con exposición de un tiempo máximo de 72h. No se determinó inducción de DSB´s en comparación con el control. Desregulación de los genes implicados en la codificación de enzimas de la fase I, genes implicados en proliferación celular y apoptosis. Abreviaturas: AB: azul alamar. CFDA-AM: éster acetoximetílico de diacetato de 5-carboxifluoresceína. CYN: cilindrospermopsina. DSB´s: rotura de la doble cadena. HepG2: células de carcinoma hepatocelular humano. HL1-1: células madre de hígado humano adulto. HCC: carcinoma hepatocelular. hTERT: telomerasa transcriptasa inversa humana. ICC: análisis inmunocitoquímico. MAPK: proteínas quinasas activadas por mitógenos.MCs: microcistinas. MC-LR: microcistina LR. MDR: proteínas resistentes a múltiples fármacos. MTS: Sal de Tetrazolio. NR: rojo neutro. OATP: transportadores de aniones orgánicos. RC: respiración celular. ROS: especies reactivas de oxígeno. WB: transferencia Western. 27 género Phormidium sp. (3D), células no cancerígenas y larvas de pez cebra. disueltos en DMSO y en esferoides con MTT, azul tripan y fosfatasa ácida. Ensayo de permeabilización. Tinción con TMRE para el ensayo de variación de la polaridad de la membrana mitocondrial. Ensayo con ToxGlo de la integridad de la membrana y de los niveles de ATP. Prueba de estrés mitocondrial. Ensayo toxicológico de larvas de pez cebra.WB. Análisis de apoptosis con ELISA. para el ensayo de viabilidad celular en monocapa. Exposición hasta 10 µM durante 1h, y, durante 6h a concentraciones de 5-10 µM para la medición de la polaridad de la membrana mitocondrial. Concentraciones de 10-5- 2,5-1,25-0,625-0,3125- 0,156 µM para TexGlo. embargo, penetró mejor en los esferoides multicelulares, dando un IC50 cuatro veces mayor que en monocapa. Además, se probó una absorción independiente de la energía puesto que no hubo toxicidad a 4º y 37ºC. PAB disminuyó la producción de ATP, la reparación mitocondrial y la hiperpolarización de la membrana mitocondrial. Abreviaturas: BCL: Linfoma de células B. EMC: esferoides multicelulares. DMSO: dimetilsulfóxido. ELISA: enzimoinmunoanálisis de adsorción. HCT: de carcinoma de colon humano. HIF: factor inducible por hipoxia. MCF: carcinoma de mama humano. MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol. NocA: Nocuolina A. Nrf2: factor 2 relacionado con el factor nuclear eritroide 2. PAB: Portoamidas A y B. TRME: Éster etílico de tetrametil-rodamina. WB: transferencia Western. 28 Como hasta ahora hemos comentado, los productos naturales pueden ser fuentes útiles en el descubrimiento y desarrollo de medicamentos. Aunque los estudios se han centrado principalmente en las aplicaciones de MCs y CYN, hemos incluido en esta revisión otros productos, destacando la Oxadiacina Nocuolina A (Noc A) y las Portoamidas A y B (PAB). La tabla 2 recoge a modo resumen un análisis de los estudios realizados acerca de las PAB y de la Oxadiazina Noc A. Para el estudio de los oxadiazoles y oxadiazinas que han atraído la atención recientemente gracias a sus posibles aplicaciones anticancerígenas la oxadiazina Noc A se aisló previamente de la cepa cianobacteriana Nodularia sp. LEGE 06071. Se han examinado sus efectos citotóxicos contra diferentes cepas de la línea celular de cáncer de colon HCT116 a la línea celular inmortalizada hTERT RPE-1 (Sousa et al., 2019) . Para ello, se utilizó el modelo esferoide tumoral multicelular (EMC), cuya complejidad está a caballo entre los tumores in vivo y los cultivos celulares monocapa, los cuales permitieron exponer que la oxadiazina Noc A muestra actividad antiproliferativa en las células del cáncer de colon cultivadas (Sousa et al., 2019). La respuesta de HCT116 a concentraciones variables de Noc A mostró que a concentraciones superiores a 5 µM se generó un aumento de los esferoides (Sousa et al., 2019). Además, la pérdida de fluorescencia en los estudios realizados indicó una viabilidad reducida sobre la capa de esferoides. Es decir, Noc A afectó a la viabilidad e indicó la apoptosis de las células HCT116 cultivadas como EMC (Sousa et al., 2019). Los ensayos de apoptosis realizados concluyeron que a concentraciones de Noc A cercanas a la IC50 se conseguía el mecanismo que daba los efectos antiproliferativos (Sousa et al., 2019). No obstante, a pesar de la común asociación de medicamentos antiproliferativos con la inducción de una respuesta de estrés oxidativo se examinó la respuesta a Noc A de la línea celular HTC116 dejando ver que tras 48h de exposición, la actividad antiproliferativa no estaba asociada al estrés oxidativo (Sousa et al., 2019). Por otro lado, los estudios de autofagia realizados pusieron de manifiesto que está se daba a concentraciones de Noc A entre 1,25-2,5 µM a las 18h de exposición. Por tanto, el estudio concluía que existían efectos antiproliferativos de Noc A asociados a la fosforilación oxidativa (Sousa et al., 2019). Otros compuestos cianobacterianos que también tienen peso y son, por tanto, dignos de mención, son las PAB. Para su estudio se centraron en la función mitocondrial por manipulación del potencial de membrana mitocondrial (Sousa et al., 2020). 29 Las PAB son péptidos cíclicos aislados de la cepa Phormidium sp. Sousa et al., (2020) evaluaron su actividad antiproliferativa en células HTC116 mediante el estudio de viabilidad. Las PAB redujeron la viabilidad de células de cáncer de colon HTC116 cultivadas en monocapa y EMC. No obstante, PAB penetró en el EMC en mayor medida, lo cual generó una IC50 cuatro veces mayor que en cultivos monocapa. Sin embargo, la toxicidad fue similar en el rango de temperatura de 4ºC a 37ºC, sugiriendo que la absorción es independiente de la energía de exposición, aunque su exposición sí que disminuyó la producción de energía en forma de ATP, las tasas de respiración mitocondrial, así como la hiperpolarización de la membrana mitocondrial (Sousa et al., 2020). Es importante destacar que el estudio ha permitido reflejar que las PAB actúan como toxinas mitocondriales sobre células cancerígenas y no cancerígenas y que además ejercieron toxicidad sistémica sobre las larvas de pez cebra (Sousa et al., 2020). Por lo tanto, su posible aplicación en un futuro dependerá de que estudios posteriores arrojen luz sobre la posibilidad de dirigir dicha toxicidad demostrada sobre células cancerosas sin afectar a las no cancerosas para así poder evadir los efectos secundarios que se generarían (Sousa et al., 2020). 7. CONCLUSIONES Las cianotoxinas representan a día de hoy un foco de peligrosidad, dada su creciente distribución por nuevas zonas produciendo toxicidad que afecta no solo a los seres humanos. Los estudios que se han realizado en cultivos 3D han demostrado tener una mayor cercanía a las funciones celulares in vivo que los cultivos celulares 2D pareciéndose más a la organización de tejidos y órganos del cuerpo humano. Sin embargo, en la revisión realizada podemos ver como aún no es el modelo experimental empleado por excelencia a pesar de que establece mejores interacciones célula-célula y ECM. Los modelos celulares 3D han demostrado que su uso facilita la evaluación toxicológica in vitro de diferentes compuestos químicos, obteniendo resultados más fiables y cercanos a los modelos in vivo. Siendo de utilidad en la evaluación toxicológica de las cianotoxinas. Del mismo modo, sería conveniente el uso de los modelos tridimensionales con el propósito de completar el perfil toxicológico de diferentes sustancias, entre las que se encuentran las cianotoxinas como MC-RR, Noc A y PAB, y así poder obtener una mejor comprensión de su toxicidad, y por lo tanto implicaciones en la salud del hombre. 30 Además, desde un punto de vista global, se puede observar la carencia de estudios de todas las cianotoxinas en modelos celulares tridimensionales, así como, la ausencia de estudios sobre mezclas de cianotoxinas que se centrasen en la actividad sinérgica que pueden abrir futuras líneas de investigación. Por tanto, los ensayos de toxicidad in vitro siguen siendo una herramienta de peso para el estudio de los perfiles toxicológicos de las cianotoxinas. 8. BIBLIOGRAFÍA Basu A, Dydowiczová A, Čtveráčková L, Jaša L, Trosko JE, Bláha L, et al. Assessment of Hepatotoxic Potential of Cyanobacterial Toxins Using 3D in Vitro Model of Adult Human Liver Stem Cells. 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