Glicosistemas con aplicaciones antivirales, antitumorales y en inmunoterapia a través de la interacción con lectinas

GLICOSISTEMAS CON APLICACIONES ANTIVIRALES, ANTITUMORALES Y EN INMUNOTERAPIA A TRAVÉS DE LA INTERACCIÓN CON LECTINAS Noelia de la Cruz Ruiz Sevilla, 2020 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Instituto de Investigaciones Químicas Departamento de Química Orgánica Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja GLICOSISTEMAS CON APLICACIONES ANTIVIRALES, ANTITUMORALES Y EN INMUNOTERAPIA A TRAVÉS DE LA INTERACCIÓN CON LECTINAS Memoria presentada por la Graduada Noelia de la Cruz Ruiz para optar al grado de Doctora en Química Sevilla, 2020 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Dr. Francisco Javier Rojo Marcos, Investigador Científico (CSIC), y Dra. Ana Sousa Hervés, Investigadora Postdoctoral CERTIFICAN: Que el presente trabajo titulado “Glicosistemas con aplicaciones antivirales, antitumorales y en inmunoterapia a través de la interacción con lectinas” ha sido realizado bajo nuestra dirección y asesoramiento en los laboratorios del Instituto de Investigaciones Químicas (CSIC-Universidad de Sevilla) del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja Sevilla constituyendo la Memoria que presenta la Graduada Noelia de la Cruz para optar al grado de Doctora en Química. Fdo.: Francisco Javier Rojo Marcos Fdo.: Ana Sousa Hervés Director del trabajo Directora del trabajo Sevilla, 2020 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc El presente trabajo ha sido realizado por Noelia de la Cruz Ruiz con una beca FPI asociada al proyecto CTQ2014-52328-P del MINECO, en el Laboratorio de Glicosistemas del Instituto de Investigaciones Químicas (CSIC-Universidad de Sevilla) bajo la dirección de los Drs. Francisco Javier Rojo Marcos y Ana Sousa Hervés. El trabajo ha sido tutelado por la Profesora Inmaculada Robina Ramírez en el marco del Programa de Doctorado en Química de la Universidad de Sevilla. Fdo. Noelia de la Cruz Ruiz Fdo.: Francisco Javier Rojo Marcos Fdo.: Ana Sousa Hervés Director del trabajo Directora del trabajo Fdo.: Inmaculada Robina Ramírez Tutora del trabajo Sevilla, 2020 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc AGRADECIMIENTOS Plasmar en un papel todo lo que estos cuatro años han representado para mí es una tarea difícil o más bien, imposible. Pero considero que es importante agradecer a todas las personas que han puesto su pequeñito granito de arena para que alcance mi título de doctora. Personas que de una u otra manera me han ayudado y me han animado. En mi cabeza, se agolpan millones de recuerdos de estos cuatro maravillosos años con personas increíbles. En primer lugar, me gustaría agradecer a mis directores de tesis. Al doctor Javier Rojo por darme la oportunidad de formar parte de su grupo de investigación y depositar toda su confianza en mí. Has permitido que me desarrolle no sólo profesionalmente si no como persona. Gracias por tus consejos y todos los momentos compartidos. A la doctora Ana Sousa por abrirme las puertas de un mundo totalmente desconocido para mí, los nanogeles y su colaboración en este trabajo. A la profesora Inmaculada Robina por aceptar ser tutora de esta tesis doctoral. A las doctoras María Jesús Vicent, Ana Armiñan y su excepcional grupo de investigación por ayudarme durante mi estancia en su laboratorio y descubrirme el mundo de la biología. A la doctora Salomé Pinho por dejarme hacer una estancia en su grupo de investigación. En especial a Inês, por su esfuerzo y abrirme las puertas de su casa. Muito obrigada. Al profesor Franck Fieschi por facilitarme la proteína DC-SIGN para llevar a cabo los estudios de polarización de fluorescencia. A los doctores José Juan Reina, José Luis de Paz y Pedro Ramírez por su ayuda prestrada. Gracias por enseñarme que para ser un buen profesional no sólo es necesario tener muchos conocimientos, sino querer compartirlos y transmitirlos. En especial, me gustaría agradecer al doctor Javier Ramos por su contribución a nivel científico a esta tesis doctoral, enseñarme, aconsejarme y ayudarme durante toda esta etapa cuando más lo necesitaba. A mi grupo de investigación con el que he compartido muchas horas de laboratorio. A Pedro Domínguez, un compañero y un amigo único, gracias por preocuparte por mí y hacer el día más ameno. A Jorge, por ayudarme a ver el lado positivo de las cosas y tu apoyo. A Leonardo, por compartir muchas risas y buenos momentos. A Carmen, por tu enorme corazón. A Myriam, por tus mil y una historias. A Antonio, por los últimos momentos compartidos. A Adrián le deseo mucha suerte en esta nueva etapa que comienza. Al doctor Pedro Nieto, Noel, Ainhoa, Ruiyi, Teresa, Rute, Susana, Rossana, Alice, Sergi, Jon… Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc ABREVIATURAS µg Microgramo µL Microlitro µM Micromolar ABC Complejo de avidina/biotina (del inglés avidin/biotin complex) Ac Acetilo ADN Ácido desoxirribonucleico All Alilo (del inglés allyl) AmCyan Anemonia Majano Cyan Anh. Anhidro APC Célula presentadora de antígeno (del inglés antigen presenting cell) APC Aloficocianina (del inglés allophycocyaninin) APS Persulfato de amonio (del inglés ammonium persulfate) ARN Ácido ribonucleico ASGP-R Receptor de asialoglicoproteínas (del inglés asialoglycoprotein receptor) Asn Asparagina Células B Células B específicas derivadas de la médula ósea (del inglés bone-marrow derived lymphocytes) BCR Receptores de células B (del inglés B-cell receptors) Bn Bencilo bNAbs Anticuerpos ampliamente neutralizantes (del inglés broadly neutralizing antibodies) Boc tert-Butiloxicarbonilo BODIPY Boro-dipirrometeno (del inglés boron-dipyrromethene) BSA Albúmina del suero bovino (del inglés bovine serum albumin) BSP 1-Bencenosulfinil piperidina Bu Butilo Bz Benzoílo C 60 Fullereno de 60 átomos de carbono c.c.f Cromatografía en capa fina Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc CD Clúster de diferenciación (del inglés cluster of differentiation) CDA Ciclohexano-1,2-diacetal CHCA Ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (del inglés α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) CLR Lectina tipo C (del inglés C-type lectin receptor) col. Colaboradores ConA Concanavalina A COSY Espectroscopía de correlación (del inglés correlation spectroscopy) CRD Dominio de reconocimiento de carbohidratos (del inglés carbohydrate recognition domain) CSA Ácido (10)-( R )-alcanforsulfónico (del inglés 10-( R )-camphorsulfonic acid) CSF Factor estimulador de colonias (del inglés colony-stimulating factor) CTLD Dominio de lectina de tipo C (del inglés C-type lectin–like domain) CuAAC Cicloadición 1,3-dipolar entre alquinos y azidas catalizada por cobre I (del inglés Cu(I)-catalyzed alkyne azide cycloaddition) cuant. cuantitativo Cy Cianina (del inglés cyanine) Cy8 Ciclooctino (del inglés Cyclooctine) Cys Cisteína (del inglés cysteine) DBU 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DC Célula dendrítica (del inglés dendritic cell) DCC Diciclohexil carbodiimida DCM Diclorometano DC-SIGN Lectina no integrina presente en células dendríticas que reconoce ICAM-3 selectivamente (del inglés dendritic cell-cpecific ICAM-3 grabbing nonintegrin) DCTB 2-[(2E)-3-(4-tert-butilfenil)-2-metilprop-2-enilideno]malononitrilo DDQ 2,3-Dicloro-5,6-dicianobenzoquinona DENV Virus del Dengue (del inglés Dengue virus) DIPEA N, N’-Diisopropiletilamina DLS Dispersión dinámica de la luz (del inglés dynamic light scattering) DMAP 4-Dimetilaminopiridina Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc DEMEM Dubelcco’s modified eagle medium DMF N,N’-Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DOX Doxorrubicina EBOV Virus del Ébola (del inglés Ebola virus) ECD Dominio extracelular (del inglés extracellular domain) ECL Quimioluminiscencia electrogenerada (del inglés electrogenerated chemiluminescence) ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (del inglés enzyme-linked immuno sorbent assay) EPR Aumento de permeabilidad y retención (del inglés enhanced permeability and retention) eq Equivalente ESI-MS Espectrometría de masas con ionización por electrospray (del inglés electrospray ionization-mass spectrometry) Et Etilo F ab Región de unión del anticuerpo (del inglés fragment antigen-binding) FACS Citometría de flujo (del inglés fluorescence-activated cell sorting) FBS Suero bovino fetal (del inglés fetal bovine serum) F c Región cristalizable del anticuerpo FDA Administración de alimentos y medicamentos (del inglés food and drug Administration) FITC Fluoresceína isotiocianato. FSC Dispersión frontal (del inglés forward scatter) FVD Marcador de viabilidad flexible (del inglés fixable viability dye) GDP Glicodendropéptido GlcNAc N-acetil- D -glucosamina GM Macrófago de granulocitos (del inglés granulocyte macrophage) G n Generación n GNP Gliconanopartícula gp Glicoproteína h hora Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc HABA Ácido 2-(4-hidroxifenilazo)benzoico (del inglés 2-(4- hydroxyphenylazo)benzoic acid) HATU Hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (del inglés hexafluorophosphate azabenzotriazole tetramethyl uronium) HCV Virus de la Hepatitis C (del inglés Hepatitis C virus) HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento (del inglés high performance liquid chromatography) HRMS Espectrometría de masas de alta resolución (del inglés high resolution mass spectrometry) HRP Peroxidasa de rábano (del inglés horseradish peroxidase) HSQC Correlación heteronuclear de nivel cuántico individual (del inglés heteronuclear single quantum coherence) IC 50 Concentración para una inhibición del 50% ICAM-3 Molécula de adhesión intercelular-3 (del inglés intercellular adhesion molecule 3) IFN Interferón Ig Inmunoglobulina IL Interleucina i Pr iso-propilo K D Constante de disociación KLH Hemocianina de lapa de ojo de cerradura (del inglés keyhole limpet hemocyan) J Constante de acoplamiento LCST Valor bajo crítico de la temperatura de disolución (del inglés low critical solution temperature) Le Lewis Lev Levulino LPS Lipopolisacárido Lys Lisina (del inglés lysine) m/z Relación masa/carga mAb Anticuerpo monoclonal (del inglés monoclonal antibody) MALDI-TOF Espectrometría de masas por ionización mediante desorción por láser asistida Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc por una matriz con detección por tiempo de vuelo (del inglés matrix assisted laser desorption ionization-time of flight). Man D -Manosa Me Metilo MFI Intensidad de fluorescencia media (del inglés mean fluorescence intensity) MHC Complejo mayor de histocompatibilidad (del inglés major histocompatibility complex) min minuto mM Milimolar MO Microondas MR Receptor de manosa (del inglés mannose receptor) MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazolio (del inglés 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium MWCO Límite de peso molecular (del inglés molecular weight cut-off) NaAsc Ascorbato sódico nab Nanopartícula de albumina conjugada NADPH Fosfato del dinucleótido de nicotinamida-adenina (del inglés nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) NBS N-bromosuccinimida NG Nanogel NHS N-hidroxisuccinimida NIS N-iodosuccinimida NIPAM N-isopropilacrilamida Células NK Células naturales asesinas (del inglés natural killer) NLR Receptores de tipo NOD (del inglés NOD-like receptors) nM Nanomolar NMNO N-óxido de la N-metilmorfolina (del inglés N-methylmorpholine N-oxide) NOD Dominios de oligomerización de unión a nucleótidos (del inglés nucleotidebinding oligomerization domains) NPhth N-ftalimido (del inglés N-phthalimide) OG Oregon-Green Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc on overnight OT Línea celular transgénica con TCR específicos de OVA (del inglés ovalbumin-specific TCR transgenic cell line) OVA Ovoalbúmina P Polarización PAMAM Poli(amidoamina) PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos (del inglés pathogen-associated molecular patterns) PBS Tampón fosfato salino (del inglés phospate buffer saline) PBMC Célula mononuclear de sangre periférica (del inglés peripherial blood mononuclear cells) PDI Índice de polidispersión (del inglés polidispersity index) PE Ficoeritrina (del inglés phycoerythrin) PEG Polietilenglicol PerCP Complejo proteico de peridinina-clorofila (del inglés peridinin-chlorophyll- protein-complex) Ph Fenilo (del inglés phenyl) PI Yoduro de propidio (del inglés propidium iodade) PLA 2 R Receptor de la fosfolipasa A 2 (del inglés phospholipase A 2 receptor) PLL Polilisinas PMB p-metoxibencilo PMS Metosulfato de fenazina (del inglés phenazine methosulfate) PPI Poli(propilenimina) ppm Partes por millón PRRs Receptores de reconocimiento de patrones (del inglés pattern recognition receptors) ρ-TsOH Ácido ρ-toluensulfónico PTX Paclitaxel PVDF Difluoruro de polivinilideno (del inglés polyvinylidenedifluoride) RAFT Polimerización por adición, fragmentación de cadena y transferencia reversible (del inglés reversible addition-fragmentation chain-transfer polymerization) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc RE Retículo endoplasmático Rf Factor de retención (del inglés retention factor) RIG-1 Gen inducible por ácido retinoico I (del inglés retionic acid-inducible gene-I) RLR Receptores de tipo RIG-1 (del inglés RIG-1-like-receptors) rt room temperature RMN Resonancia magnética nuclear RPMI Roswell Park Memorial Institute SDS Dodecilsulfato sódico (del inglés sodium dodecyl sulfate) SEM Microscopia electrónica de barrido (del inglés scanning electron microscopy) SPAAC Cicloadición 1,3-dipolar entre ciclooctinos y azidas (del inglés strainpromoted alkyne-azide cycloaddition) SPR Resonancia del plasmón de superficie (del inglés surface plasmon resonance) SSC Dispersión lateral (del inglés side scatter) STD-NMR Diferencia de la transferencia de saturación-resonancia magnética nuclear (del inglés saturation transfer difference-Nuclear Magnetic Resonance) Células T Células T derivadas del timo (del inglés thymus-derived lymphocytes) t.a. Temperatura ambiente TBAI Ioduro de tetrabutilamonio (del inglés tetrabutylammonium iodide) TBDMS tert-butildimetilsililo (del inglés tert-butyldimethylsilyl) TBDPS tert-butildifenilsililo (del inglés tert-butyldiphenylsilyl) TBTA Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina t Bu tert-butilo TCA Tricloroacetimidato T C Linfocitos T citotóxicos TCR Receptores de células T (del inglés T-cell receptors) TEM Microscopia electrónica de transmisión (del inglés transmission electron microscopy) TEMED N,N,N’,N’-Tetrametiletilendiamina TFA Ácido trifluoroacético (del inglés trifluoroacetic acid) Tf 2 O Anhídrido tríflico TfOH Ácido tríflico TGF Factor de crecimiento transformador (del inglés transforming growth factor) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc T H Linfocitos T colaboradores (del inglés T helper cell) THF Tetrahidrofurano TIPS Triisopropopilsililo TLR Receptor de tipo Toll (del inglés Toll-like receptor) TMSOTf Triflato de trimetilsililo TNF Factor de necrosis tumoral (del inglés tumor necrosis factor) Tol Tolilo (4-metilfenilo) T reg Linfocito T regulador TT Toxoide del Tétanos (del inglés Tetanus Toxoid) TTBP 2,4,6-Tri-tert-butilpirimidina UV Ultravioleta VIH-1 Virus de inmunodeficiencia humana-1 WGA Aglutinina del germen del trigo (del inglés wheat germen agglutinin) ZIKV Virus del Zika (del inglés Zika virus) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc ÍNDICE 1. Introducción 1 1.1 Carbohidratos 1 1.2 Multivalencia 5 1.2.1 Dendrímeros 14 1.2.2 Química click 19 2. Antecedentes y objetivos 25 2.1 Antecedentes 25 2.2 Objetivos 36 3. Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 39 3.1 Introducción 39 3.1.1 Glicoproteínas virales 39 3.1.1.1 Man 9 GlcNAc 2 45 3.1.1.2 Sistemas multivalentes del epítopo Man 9 57 3.2 Objetivos 60 3.3 Exposición y discusión de los resultados 61 3.3.1 Preparación del epítopo Man 9 funcionalizado en el extremo reductor con un espaciador de mayor longitud con configuración β 61 3.3.2 Preparación del epítopo Man 9 funcionalizado en su extremo reductor con espaciadores de diferente longitud con configuración α 72 3.3.3 Presentación multivalente de los epítopos de Man 9 83 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 2 Figura 1.1 Representación de la membrana plasmática. La complejidad estructural de los carbohidratos en la naturaleza, su heterogeneidad, y la dificultad sintética para poder obtenerlos en grandes cantidades, son algunos de los obstáculos que impiden conocer la relación entre su estructura y su actividad. 5 La consecuencia directa de este hecho es que las terapias basadas en carbohidratos no se han desarrollado lo suficiente. Desde la década de los años 70, se han producido numerosos avances tanto en técnicas analíticas como en métodos sintéticos (en disolución, enzimáticos o en fase sólida, manual o automática) que han permitido acceder a carbohidratos complejos puros, lo que facilita su estudio para poder entender su función y su actividad en la naturaleza. Este desarrollo ha abierto nuevas puertas en química biológica y química médica, sobre todo en el desarrollo de terapias y métodos de diagnóstico basados en carbohidratos. De hecho, existen algunos ejemplos importantes de compuestos comercializados que demuestran que este tipo de moléculas pueden 5 a) Bertozzi, C. R.; Kiessling, L. L. Science 2001, 291, 2357. b) Kamerling, J. P. Comprehensive Glycoscience: From Chemistry to Systems Biology. Elsevier Sci. Technol. U.K., 2007. c) Fraser-Reid, B. O.; Tatsuta, K.; Thiem, J. Glycoscience Chemistry and Chemical Biology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, 2008. Glicocálix Membrana plasmática Glicoproteínas Glicolípidos Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Introducción 3 funcionar de manera efectiva. Más de 130 fármacos basados en carbohidratos naturales han sido desarrollados como fármacos o excipientes. 6 Entre estos fármacos se incluyen compuestos naturales, desde monosacáridos simples como la glucosa hasta polisacáridos complejos como la heparina. En algunos casos, la diana biológica no se ha identificado, aunque el fármaco sea activo contra una enfermedad en particular. Se sabe que los carbohidratos están involucrados en numerosos procesos biológicos, tales como el desarrollo embrionario, la interacción huésped-patógeno durante la infección, procesos de señalización, diferenciación y reconocimiento celular, procesos de inflamación, el desarrollo de la respuesta inmune, el desarrollo de enfermedades o la progresión tumoral o la metástasis, entre otros. 2, 7 Sin duda, los carbohidratos juegan un papel fundamental en el proceso de infección por patógenos y en la modulación de la respuesta inmune. El primer paso en el proceso de infección consiste en el reconocimiento de las unidades sacarídicas, presentes en la superficie de los patógenos invasores, por parte de una gran variedad de receptores expresados en la membrana de las células dendríticas (DCs, del inglés Dendritic Cells). 8 En concreto, las DCs constituyen uno de los principales componentes del sistema inmune innato, capaz de detectar y prevenir la entrada de agentes exógenos en el organismo. 9 Este tipo de células presentan una serie de receptores en su superficie, conocidos como receptores de reconocimiento de patrones (PRRs, del inglés Pattern Recognition Receptors). Los PRRs se clasifican en cuatro familias: lectinas de 6 a) Wong, C.-H. Carbohydrate-Based Drug Discovery. Wiley-VCH. Weinheim, Germany, 2003. b) Osborn, H. M.I; Evans, P. G.; Gemmell, N.; Osborne, S. D. J. Pharm. Pharmacol. 2004, 56, 691. c) Ernst, B.; Magnani, J. L. Nat. Rev. Drug Discov. 2009, 8, 661. d) Klysov, A. A. Glycobiology and Drug Design. ACS. Washington DC. 2012. e) Fernández-Tejada, A.; Cañada, F. J.; Jiménez-Barbero, J. Chem. Eur. J. 2015, 21, 10616. f) Zhang, Y.; Wang, F. Drug Discov. Ther. 2015, 9, 79. g) Jimenez-Barbero, J.; Cañada, F. J.; Martin-Santamaria, S. Carbohydrates in Drug Design and Discovery. RSC. London, UK. 2015. h) Chackalamannil, S.; Rotella, D.; Ward, S. E. Comprehensive Medicinal Chemistry III. Elseiver Ltd. New York, USA. 2017. 7 a) Mody, R.; Joshi, S.; Chaney, W. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 1995, 33, 1. b) Haltiwanger, R. S.; Lowe, J. B. Ann. Rev. Biochem. 2004, 73, 491. c) Zachara, N. E.; Hart, G. W. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1761, 599. d) Seeberger, P. H.; Werz, D. B. Nature 2007, 446, 1046. e) Zhao, Y. Y.; Takahashi, M.; Gu, J. G.; Miyoshi, E.; Matsumoto, A.; Kitazume, S.; Taniguchi, N. Cancer Sci. 2008, 99, 1304. f) Slipo, A.; Erbs, G.; Shinya, T.; Dow, J. M.; Parrilli, M.; Lanzetta, R.; Shibuya, N.; Newman, M. A.; Molinaro, A. Glycobiology 2010, 20, 406. g) Pinho, S. S.; Reis, C. A. Nat. Rev. Cancer 2015, 15, 540. h) Sun, L.; Middleton, D. R.; Wantuch, P. L.; Ozdilek, A.; Avci, F. Y. Glycobiology. 2016, 26, 1029. i) Raman, R.; Tharakaraman, K.; Sasisekharan, V.; Sasisekharan, R. Curr. Opin. Struct. Biol. 2016, 40, 153. j) Pereira, M. S.; Alves, I.; Vicente, M.; Campar, A.; Silva, M. C.; Padrão, N. A.; Pinto, V.; Fernandes, Â; Dias, A. M.; Pinho, S. S. Front. Immunol. 2018, 9, 2754. 8 van Kooyk, Y.; Rabinovich, G. A. Nat. Immunol. 2008, 9, 593. 9 a) Osada, T.; Clay, T. M.; Woo, C. Y.; Morse, M. A.; Lyerly H. K. Int. Rev. Immunol. 2006, 25, 377. b) Patente, T. A.; Pinho, M. P.; Oliveira, A. A.; Evangelista, G. C. M.; Bergami-Santos, P. C.; Barbuto, J. A. M. Front. Immunol. 2019, 9, 3176. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 4 tipo C (CLR, del inglés C-type lectin receptors), receptores de tipo Toll (TLR, del inglés Tolllike receptors), receptores de tipo NOD (NLR, del inglés nucleotide-binding oligomerization domains-like-receptors), y receptores de tipo RIG-1 (RLR, del inglés retinoic acid-inducible gene-1-like receptors). 10 Estos receptores se localizan de forma estratégica por toda la célula: en las membranas celulares, donde median el reconocimiento de patógenos extracelulares (bacterias u hongos), en los endosomas, donde detectan invasores intracelulares como virus, y en el citoplasma. (Figura 1.2) Todos ellos, son capaces de reconocer estructuras moleculares conservadas y distinguir entre los diferentes tipos de patógenos o los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs, del inglés pathogen-associated molecular patterns). 11 Dentro de los PAMPs, se incluyen carbohidratos bacterianos, como los lipopolisacáridos; ácidos nucleicos, como ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) bacteriano o viral; peptidoglicanos o ácido lipoteicoico que proceden de bacterias Gram-positivas; formilmetionina y lipoproteínas presentes en la superficie de bacterias Gram-negativas. Además, las DCs son consideradas como las células inmunes de conexión entre el sistema inmune innato y el sistema inmune adquirido, modulando la respuesta inmune. 12 Las DCs, también conocidas como células presentadoras de antígenos, (APC, del inglés antigenpresenting cells), se ocupan de detectar patógenos, capturar, procesar y presentar antígenos en forma de complejos MHC (del inglés Major Histocompatibility Complex) a las células T. De esta manera, provocan la activación y la diferenciación de las células T y la liberación de citocinas y quimiocinas. 13 10 a) Medzhitov, R.; Janeway, C. Jr. New Engl. J. Med. 2000, 343, 338. b) Medzhitov, R.; Janeway, C. Jr. Immunol Rev. 2000, 173, 89. c) Akira, S.; Uematsu, S.; Takeuchi, O. Cell 2006, 124, 783. d) Takeuchi, O.; Akira, S. Cell 2010, 140, 805. 11 a) Janeway, C. A. Jr.; Medzhitov R. Annu. Rev. Immunol. 2002, 20, 197. b) Iwasaki, A.; Medzhitov, R. Science 2010, 327, 291. 12 van Vliet, S.J.; Garcia-Vallejo, J.J.; van Kooyk, Y. Immunol. Cell Biol. 2008, 86, 580. 13 Banchereau, J.; Steinman, R. M. Nature 1998, 392, 245. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Introducción 5 Figura 1.2 Reconocimiento de los patógenos por parte de los receptores de las DCs. 1.2 Multivalencia Los procesos infecciosos causados por bacterias, virus y parásitos involucran, en los primeros estadios del proceso, el reconocimiento de los carbohidratos presentes en la superficie del patógeno. 14 La habilidad de controlar estos eventos con pequeños carbohidratos sería muy deseable; sin embargo, una única unidad de ligando sacarídico interacciona de manera selectiva pero débil con los receptores, mostrando una constante de asociación del orden de 10 3 M -1 . Para lograr un control efectivo de las interacciones se requiere una afinidad significativamente mayor. En la naturaleza, la baja afinidad en las interacciones carbohidrato-proteína se compensa mediante la multivalencia. En este sentido, múltiples copias de carbohidratos en una superficie, es decir, sistemas o plataformas multivalentes, interaccionan fuertemente con los receptores celulares, también multivalentes. Este fenómeno fue denominado como cluster glycoside effect en 1995 por Lee y col. e implica la unión simultánea de dos o más ligandos idénticos que descansan sobre un mismo soporte a un receptor múltiple, que a su vez se encuentra sobre una 14 Sharon, N.; Ofek, I. Glycoconjugate J. 2000, 17, 659. Citocinas Quimiocinas Núcleo Citoplasma CD80/CD86 MHC I-II CLR TLR Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 6 misma entidad. 15 De esta manera, se consigue que la interacción sea varios órdenes de magnitud mayor que la correspondiente a la interacción monovalente. Los sistemas multivalentes son capaces de interaccionar con más de un sitio de reconocimiento de una entidad biológica simultáneamente y actuar así como potentes inhibidores de la interacción. 16 Es de destacar que no sólo se aumenta de manera significativa la afinidad, sino que aumenta también la especificidad de la interacción y, por lo tanto, del proceso de reconocimiento molecular. Los ligandos monovalentes presentan un número limitado de mecanismos de interacción. Sin embargo, existen varias estrategias que permiten potenciar las interacciones multivalentes. El aumento de afinidad en procesos multivalentes, en comparación con los monovalentes, depende de un gran número de factores entre los que cabe destacar: la afinidad del ligando monomérico por el receptor, el número y la correcta disposición espacial de los ligandos y la flexibilidad de la estructura. Además, dicho incremento en la afinidad se puede atribuir a una acción cooperativa, que resulta en un mayor efecto respecto al que correspondería si se atendiese únicamente a la valencia del sistema (efecto aditivo). 17 A su vez, la efectividad puede depender de la capacidad que posee el sistema multivalente para ocupar múltiples sitios de reconocimiento de forma simultánea. Los mecanismos de interacción de un sistema multivalente guardan relación con su arquitectura debido a que su complejidad estructural es elevada. 18 Por ello, si se altera alguna característica sencilla del sistema multivalente, se puede modificar la preferencia por un determinado mecanismo de interacción y, por tanto, se puede ver afectada su actividad. Principalmente, los mecanismos de interacción de un sistema multivalente son el efecto quelato, las interacciones de tipo secundario, la re-asociación estadística, la agregación y la estabilización estérica. 19 (Figura 1.3) 15 a) Lee, Y. C.; Lee, R. T. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 321. b) Mammen, M.; Choi, S. K.; Whitesides, G. M. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2755. c) Dimick, S. M.; Powell, S. C.; McMahon, S. A.; Moothoo, D. N.; Naismith, J. H.; Toone, E. J. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 10286. d) Lundquist, J. J.; Toone, E. J. Chem. Rev. 2002, 102, 555. e) Pieters, R. J. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 2013. f) Jayaraman, N. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 3463. 16 a) Kiessling, L. L.; Gestwicki, J. E.; Strong, L. E. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 696. b) Bhatia, S.; Cuellar Camacho, L.; Haag, R. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 8654. 17 Badjic, J. D.; Nelson, A.; Cantrill, S. J.; Turnbull, W. C.; Stoddart, J. F. Acc. Chem. Res. 2005, 38, 723. 18 a) Kiessling, L. L.; Strong, L. E; Gestwicki, J. E. Annu. Rep. Med. Chem. 2000, 35, 321. b) Tjandra, K. C.; Thordarson, P. Bioconjugate Chem. 2019, 30, 503. 19 a) Gestwicki, J. E.; Cairo, C. W.; Strong, L. E., Oetjen, K. A.; Kiessling, L. L. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14922. b) Kiessling, L. L.; Gestwicki, J. E.; Strong, L. E. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2348. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Introducción 7 Una disminución en las barreras entrópicas favorece la interacción entre los ligandos y el receptor, lo que provoca una mayor afinidad y un aumento de su potencia inhibitoria. 20 Cuando un ligando de un sistema multivalente se une a un centro activo del receptor, la unión de un segundo ligando al mismo receptor se ve favorecida. El reconocimiento del primer ligando supone el mayor coste energético; sin embargo, el resto de los ligandos se unen con bajos costes entrópicos al receptor, siendo el coste total entrópico bajo, lo que hace que la interacción esté favorecida. El mecanismo que provoca que dos o más ligandos de un sistema multivalente interaccionen con varios sitios activos del receptor se conoce como efecto quelato. 21 (Figura 1.3a) También se pueden producir interacciones de tipo secundario con otro sitio de unión, diferente al sitio primario de la interacción. Con este evento de interacción adicional, los sistemas multivalentes pueden llegar a ser más efectivos. 22 (Figura 1.3b) Así mismo, la velocidad de disociación de un ligando presente en una estructura multivalente es mucho menor que la de un ligando monovalente libre. Este hecho se debe a la proximidad entre los ligandos en el sistema multivalente, que permite que uno de los ligandos ocupe un lugar de unión inmediatamente después de que otro lo abandone, lo que se traduce en un incremento neto en la afinidad. Este mecanismo se denomina re-asociación estadística (del inglés statistical rebinding). 15e (Figura 1.3c) En lugar de la asociación intramolecular, algunas veces se produce la interacción intermolecular o agregación. 23 (Figura 1.3d) Este efecto depende de factores como la concentración, la valencia, la afinidad, los diferentes tipos de interacción, etc. Por otro lado, el tamaño del sistema multivalente puede impedir estéricamente las interacciones del receptor con otros sistemas, dando lugar a una estabilización estérica. 24 (Figura 1.3e) Sin duda, estos modos de interacción dan una información única sobre la interacción entre los carbohidratos y sus receptores. 20 Jencks, W. P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78, 4046. 21 Pieters, R. J. Drug Discov. Today Technol. 2009, 6, e27. 22 a) Howorka, S.; Nam, J.; Bayley, H.; Kahne, D. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 842. b) Banerjee, A. L.; Eiler, D.; Roy, B. C.; Jia, X.; Haldar, M. K.; Mallik, S.; Srivastava, D. K. Biochemistry 2005, 44, 3211. 23 Brewer, C. F.; Miceli, M. C.; Baum, L. G. Curr. Opin. Struct. Biol. 2002, 12, 616. 24 Mammen, M.; Dahmann, G.; Whitesides, G. M. J. Med. Chem. 1995, 38, 4179. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 8 Figura 1.3 Mecanismos de interacción multivalente: a) efecto quelato, b) unión secundaria, c) re-asociación estadística, d) agregación (entrecruzamiento) y e) efecto estérico. Entender las interacciones multivalentes es un aspecto crítico a la hora de modular muchos procesos biológicos. La complejidad estructural de los carbohidratos presentes en la superficie celular les permite almacenar una gran cantidad de información molecular. Dicha información es procesada a través del reconocimiento molecular con CLRs, fundamentalmente. 25 Este tipo 25 a) Sharon, N.; Lis, H. Sci. Am. 1993, 268, 82. b) Ofek, I.; Hasty, D. L.; Doyle, R. J. Bacterial Adhesion to Animal Cells and Tissues. ASM Press, Washington, 2003. c) Sharon, N.; Lis, H. Glicobiology 2004, 14, 53. d) Zelensky, A. N.; Gready, J. E. FEBS J. 2005, 272, 6179. e) Dam, T. K.; Fred Brewer, C. Glicobiology 2009, 20, 270. f) Dambuza, I.M.; Brown, G.D. Curr. Opin. Immunol. 2015, 32, 21. g) Roy, R.; Murphy, P. V.; Gabius, H.-J. Molecules 2016, 21, 629. h) Monteiro, J. T.; Lepenies, B. Viruses 2017, 9, 59. i) Bermejo-Jambrina, M.; Eder, J.; Helgers, L. C.; Hertoghs, N.; Nijmeijer, B. M.; Stunnenberg, M.; Geijtenbeek, T. B. H. Front. Immunol. 2018, 9, 590. a) b) c) d) e) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Introducción 9 de receptores son capaces de reconocer carbohidratos de manera dependiente de Ca 2+ . Estudios estructurales han demostrado que únicamente una pequeña proporción de los aminoácidos de las lectinas están implicados en el reconocimiento de los carbohidratos, en concreto aquellos que se encuentran dentro de lo que se denomina dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD, del inglés Carbohydrate Recognition Domain). 26 Los CRDs presentan dos bucles estabilizados por dos enlaces disulfuro altamente conservados y hasta 4 sitios activos, dependiendo de la lectina. 25d Los residuos de aminoácidos del CRD que presentan en sus cadenas laterales grupos carboxilo terminales se coordinan habitualmente con iones Ca 2+ . Los CRDs reconocen los grupos hidroxilo de los carbohidratos con una determinada configuración, por lo que pequeñas variaciones en los aminoácidos dentro de los CRDs pueden alterar la especificidad por los carbohidratos. El CRD reconoce fundamentalmente los residuos terminales de los oligosacáridos presentes en las glicoproteínas de los patógenos. Los CRDs presentan diferente afinidad para cada uno de los isómeros anoméricos. Además, la pérdida de Ca 2+ puede provocar la desestabilización de los bucles y la pérdida de la afinidad por los ligandos, incluso cuando los iones Ca 2+ no están implicados directamente en la complejación de los carbohidratos. Esta desestabilización puede tener lugar también cuando se producen cambios en el pH. 27 A parte de las propiedades del medio donde tiene lugar la interacción entre el receptor y el carbohidrato; el grado de oligomerización del receptor puede ser un factor determinante en la velocidad de interacción, la afinidad y la preferencia de la lectina por un tipo de ligando específico. Las propiedades de solvatación de los CRDs, la reorganización o el desplazamiento de la esfera de solvatación y la aparición de interacciones entre el ligando o la proteína con el agua, pueden afectar a aspectos termodinámicos del reconocimiento y a la estabilidad de las interacciones carbohidrato-proteína. 28 Cuando la concentración de lectina es alta, la agregación es mayor. Además, la densidad de ligando en la superficie celular puede provocar la oligomerización de las subunidades de las lectinas. 29 26 Weis, W. I.; Kahn, R.; Fourme, R.; Drickamer, K.; Hendrickson, W. A. Science 1991, 254, 1608. 27 a) Loeb, J. A.; Drickamer, K. J. Biol. Chem. 1988, 263, 9752. b) Wragg, S.; Drickamer, K. J. Biol. Chem. 1999, 274, 35400. 28 Gauto, D. F.; Petruk, A. A.; Modenutti, C. P.; Blanco, J. I.; Di Lella, S.; Martí, M. A. Glycobiology 2013, 23, 241. 29 Dam, T. K.; Gerken, T. A.; Brewer, C. F. Biochemistry 2009, 48, 3822. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 10 Los CLRs están agrupados dentro de una superfamilia dividida en 17 grupos (I-XVII) en función de su filogenia, estructura y propiedades funcionales. 30 El receptor de manosa (MR, del inglés mannose receptor) o el receptor Endo180 (CD280) pertenecen al grupo VI de CLRs, son receptores transmembrana de tipo I que poseen entre 8 y 10 dominios lectina de tipo C (CTLDs, del inglés C-type Lectin Domains) capaces de reconocer manosas. 31 (Figura 1.4) Dentro del grupo II se encuentran los receptores transmembrana de tipo II, tales como DC-SIGN (del inglés dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin). 32 Este receptor presenta una pequeña región citoplasmática, un segmento transmembrana y un dominio extracelular (ECD, del inglés extracellular domain) constituido por dos regiones diferentes desde el punto de vista estructural y funcional. Por un lado, un cuello flexible que facilita la oligomerización del receptor y un CRD dependiente de Ca 2+ encargado de los procesos de reconocimiento de carbohidratos. Figura 1.4 Estructura de los receptores MR, Endo180 y DC-SIGN, de izquierda a derecha. 30 a) Sancho, D.; Reis e Sousa, C. Annu. Rev. Immunol. 2012, 30, 491. b) Mayer, S.; Raulf, M.-K.; Lepenies, B. Histochem. Cell Biol. 2017, 147, 223. 31 Boskovic, J.; Arnold, J. N.; Stilion, R.; Gordon, S.; Sim, R. B.; Rivera-Calzada, A.; Wienke, D.; Isacke, C. M.; Martínez-Pomares, L.; Llorca, O. J. Biol. Chem. 2006, 281, 8780. 32 a) van Kooyk, Y.; Geijtenbeek, T. B. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 697. b) Den Dunnen, J.; Gringhuis, S. I.; Geijtenbeek, T. B. Cancer Immunol. Immunother. 2009, 58, 1149. c) da Silva, R. C.; Segat, L.; Crovella, S. Hum. Immunol. 2011, 72, 305. Dominio transmembrana Dominio citoplasmático Dominio extracelular CRDs Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Introducción 11 DC-SIGN se encuentra altamente expresada en DCs inmaduras y juega un papel relevante en la interacción con patógenos y en su internalización. Esta lectina contribuye a la maduración de las DCs y su posterior migración a los órganos linfoides donde tiene lugar la presentación de los antígenos a las células T. 33 Este receptor reconoce virus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), 34 del Ébola (EBOV), 35 del Dengue (DENV, del inglés Dengue Virus), 36 de la Hepatitis C (HCV), 37 etc. El nivel de expresión de DC-SIGN determina la captura del virus. Así, cuando DC-SIGN está sobreexpresada en las células provoca una mayor interacción con el VIH-1 que cuando la expresión de esta proteína es menor. 38 DC-SIGN es capaz de reconocer estructuras oligosacarídicas que contienen fucosa o manosa. En concreto, DC-SIGN reconoce oligosacáridos de tipo high-mannose unidos a asparagina (Asn), presentes en la glicoproteína gp120 de la superficie del VIH-1. Esta proteína es una de las más glicosidadas ya que en su estructura existen más de 20 N-glicanos. 39 High mannose es un undecasacárido ramificado, Man 9 GlcNAc 2 , considerado como uno de los ligandos que interacciona de forma más fuerte con esta lectina. (Figura 1.5) 33 a) Geijtenbeek, T. B.; Torensma, R.; van Vliet, S. J.; van Duijnhoven, G. C. F.; Adema, G. J.; van Kooyk, Y.; Figdor, C. G. Cell 2000, 100, 575. b) Mitchell, D. A.; Fadden, A. J.; Drickamer, K. A. J. Biol. Chem. 2001, 276, 28939. 34 Geijtenbeek, T. B.; Kwon, D. S.; Torensma, R.; van Vliet, S. J.; van Duijin-hoven, G. C.; Middel, J.; Cornelissen, I. L.; Nottet, H. S.; KewalRamani, V. N.; Littman, D. R.; Figdor, C. G.; van Kooyk, Y. Cell 2000, 100, 587. 35 Alvarez, C. P.; Lasala, F.; Carrillo, J.; Muñiz, O.; Corbí, A. L.; Delgado, R. J. Virol. 2002, 76, 6841. 36 Navarro-Sanchez, E.; Altmeyer, R.; Amara, A.; Schwartz, O.; Fieschi, F.; Virelizier, J. L.; Arenzana-Seisdedos, F.; Desprès, P. EMBO Rep. 2003, 4, 723. 37 a) Lozach, P. Y.; Lortat-Jacob, H.; de Lacroix de Lavalette, A.; Staropoli, I.; Foung, S.; Amara, A.; Houles, C.; Fieschi, F.; Schwartz, O.; Virelizier, J. L.; Arenzana-Seisdedos, F.; Altmeyer, R. J. Biol. Chem. 2003, 278, 20358. b) Pöhlmann, S.; Zhang, J.; Baribaud, F.; Chen, Z.; Leslie, G. J.; Lin, G.; Granelli-Piperno, A.; Doms, R. W.; Rice, C. M.; McKeating, J. A. J. Virol. 2003, 77, 4070. 38 Baribaud, F.; Pöhlmann, S.; Leslie, G.; Mortari, F.; Doms, R.W. J. Virol. 2002, 76, 9135. 39 Geyer, H.;Holschbach, C.; Hunsmann, G.; Schneider, J. J. Biol. Chem. 1988, 263, 11760. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 18 divergente. 57 Por el contrario, en la aproximación convergente, los grupos o moléculas seleccionados se acoplan en el extremo del monómero inicial antes del crecimiento del dendrón. El número de enlaces covalentes involucrados son pocos, lo que conduce a una fácil y completa funcionalización de la molécula. Sin embargo, los grupos de interés unidos al dendrón deben presentar una estabilidad y solubilidad adecuada, que permitan el crecimiento de la estructura a través de los pasos repetitivos de activación y acoplamiento sin sufrir degradación o reacciones secundarias. Si no fueran inertes en las condiciones de reacción de dichas etapas de crecimiento, sería necesaria su protección lo que conllevaría una etapa adicional de desprotección al final de la síntesis del dendrímero. 58 Los dendrones y los dendrímeros son excelentes soportes para la presentación multivalente de moléculas de interés. En el caso de los dendrones, al presentar grupos reactivos en la posición focal, pueden ser conjugados a diferentes moléculas o soportes. Este hecho les confiere un carácter bifuncional interesante desde el punto de vista del diseño y desarrollo de nuevos sistemas multivalentes. Los dendrímeros gracias a su estructura bien definida, a sus grupos fácilmente modificables en la superficie y a las cavidades que presentan en su interior, son idóneos para ser utilizados no sólo en el campo de la química sino también en campos como la biología, la medicina y la ciencia de los materiales, entre otros. 59 Desde el punto de vista biomédico, estas arquitecturas moleculares pueden diseñarse de tal modo que presenten una baja toxicidad y una baja respuesta inmunogénica, propiedades interesantes para su aplicación en este campo. 60 Teniendo en cuenta el gran número de cavidades internas que presentan los dendrímeros, éstos pueden ser unos buenos candidatos para el transporte de fármacos u otras moléculas de interés, así como soportes para la síntesis de nanopartículas metálicas, etc. 61 57 Leon, J. W.; Kawa, M.; Fréchet, J. M. J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8847. 58 a) Hawker, C. J.; Fréchet, J. M. J. Macromolecules 1990, 23, 4726. b) Piotti, M. E.; Rivera, F.; Bond, R.; Hawker, C. J.; Fréchet, J. M. J. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 9471. 59 a) Fréchet, J. M. Science 1994, 263, 1710. b) Bossman, A. W.; Janssen, H. M.; Meijer, E. W. Chem. Rev. 1999, 99, 1665. c) Inoue, K. Prog. Polym. Sci. 2000, 25, 453. d) Vögtle, F.; Gestermann, S.; Hesse, R.; Schwierz, H.; Windisch, B. Prog. Polym. Sci. 2000, 25, 987. e) Esfand, R.; Tomalia, D. A. Drug Discov. Today, 2001, 8, 427. f) Cloninger, M. J. Curr. Opin. Chem. Biol. 2002, 6, 742. g) Lee, C. C.; MacKay, J. A.; Fréchet, J. M. Nat. Biotechnol. 2005, 23, 1517. h) Astruc, D.; Boisselier, E.; Ornelas, C. Chem. Rev. 2010, 110, 1857. i) Rauter, A.P.; Lindhorst, T.K.; Albertina, C.; Queneau,Y. Carbohydrate chemistry, Chemical and Biological Approaches. The Royal Society of Chemistry, 2015. j) Müller, C.; Despras, G.; Lindhorst, T.K. Chem. Soc. Rev. 2016, 45, 3275. 60 Boas, U.; Heegaard, P. M. H. Chem. Soc. Rev. 2004, 33, 43. 61 a) Majoros, I. J.; Thomas, T. P.; Mehta, C. B.; Baker, J. R. J. Med. Chem. 2005, 48, 5892. b) Nanjwade, B. K.; Bechra, H. M.; Derkar, G. K.; Manvi, F. V.; Nanjwade, V. K. Eur. J. Pharm. Sci. 2009, 38, 185. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Introducción 19 Siguiendo tanto aproximaciones sintéticas divergentes como convergentes se han conjugado a este tipo de estructuras una gran variedad de biomoléculas, como por ejemplo carbohidratos, dando lugar a los denominados glicodendrímeros. Los glicodendrímeros han resultado ser excelentes herramientas para intervenir en aquellos procesos biológicos que implican el reconocimiento de los carbohidratos por las lectinas. 62 La primera síntesis de un glicodendrón fue descrita por Roy y col. en 1993, siguiendo una estrategia divergente en fase sólida. La estructura del primer glicodendrón estaba basada en un esqueleto de polilisinas (PLL) y funcionalizado con varias copias de ácido siálico. Este glicodendrón era capaz de inhibir la hemoaglutinación promovida por el virus de la gripe. 63 Para conjugar los carbohidratos a este tipo de estructuras, se han empleado una gran variedad de estrategias sintéticas que se basan, por ejemplo, en la formación de tioureas, 64 tioéteres, carbamatos, 65 en el empleo de la aminación reductora, 66 en la apertura de anillos de lactonas, 67 en cicloadiciones 1,3-dipolares, 68 etc. Sin embargo, muchas de estas estrategias impiden la funcionalización completa, o no se disponen de procedimientos de purificación que permitan obtener las estructuras finales de forma pura y monodispersa. En este sentido, las reacciones de química click han permitido superar algunos de estos impedimentos, facilitando sustancialmente el modo de preparación de estas estructuras. 1.2.2 Química click La química click abarca un conjunto de reacciones caracterizadas por unas condiciones de reacción sencillas (idealmente debe ser un proceso insensible al oxígeno molecular, al agua y a variaciones en el pH o la temperatura), y compatibles con una amplia variedad de grupos funcionales. Habitualmente este tipo de reacciones tienen lugar en agua. Además, deben ser 62 Cecioni, S.; Imberty, A.; Vidal, S. Chem. Rev. 2015, 115, 525. 63 Roy, R.; Zanini, D.; Meunier, S. J.; Romanowska, A. Chem. Commun. 1993, 1869. 64 Pagé, D.; Roy, R. Bioconjugate Chem. 1997, 8, 714. b) Zanini, D.; Roy, R. J. Org. Chem. 1998, 63, 3486. 65 a) Kitov, P. I.; Sadowska, J. M.; Mulvey, G.; Armstrong, G. D.; Ling, H.; Pannu, N. S.; Read, R. J.; Bundle, D. R. Nature 2000, 403, 669. b) Wittmann, V.; Seeberger, S. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 4348. 66 Kalovidouris, S. A.; Turnbull, W. B.; Stoddart, J. F. Can. J. Chem. 2002, 80, 983. 67 Aoi, K.; Itoh, K.; Okada, M. Macromolecules 1995, 28, 5391. 68 Pérez-Balderas, F.; Ortega-Muñoz, M.; Morales-Sanfrutos, J.; Hernández-Mateo, F.; Calvo-Flores, F. G.; Calvo- Asín, J. A.; Isac-García, J.; Santoyo-González, F. Org. Lett. 2003, 5, 1951. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 20 estereoespecíficas y poseer una elevada economía atómica que permita obtener rendimientos elevados. Los productos de partida deben ser accesibles, y se deben generar sólo subproductos inofensivos que puedan ser eliminados por métodos no cromatográficos. 69 Se trata de reacciones totalmente biocompatibles, rápidas y altamente específicas. Se pueden enumerar varios tipos de reacciones que cumplen estos criterios, tales como reacciones de apertura de anillo nucleofílico de epóxidos y aziridinas, reacciones con carbonilos de tipo no aldólico, tales como reacciones de formación de hidrazonas y heterociclos, adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono, tales como formación oxidativa de epóxidos y adiciones de Michael, y reacciones de cicloadición. Pero sin duda, una de las reacciones click que han cobrado mayor relevancia en los últimos años es la reacción de cicloadición 1, 3-dipolar de tipo [3+2] entre azidas y alquinos catalizada por cobre (I) (CuAAC, del inglés copper (I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition). Esta reacción, descrita por primera vez por Sharpless en 2002, 70 consiste en una versión mejorada de la reacción de cicloadición de Huisgen [3+2] descrita en 1968. 71 La reacción de Huisgen suponía el empleo de altas temperaturas, conllevaba bajos rendimientos de reacción y la obtención de una mezcla prácticamente equimolar de los dos posibles triazoles regioisoméricos, 1,4 y 1,5-disustituidos. (Esquema 1.2) Esquema 1.2 Reacción de Huisgen: cicloadición 1,3-dipolar de azidas y alquinos bajo condiciones térmicas. Entre las mejoras que supuso el uso de cobre como catalizador de la reacción, cabe mencionar el incremento drástico en la velocidad de reacción de cicloadición, el transcurso de la reacción a temperatura ambiente y la completa regioselectividad. El proceso catalizado por cobre da lugar a la formación exclusiva del regioisómero 1,4. Para ello, el cobre debe de estar como Cu(I) en el medio de reacción. Si se emplea como fuente de cobre Cu (II), es necesario añadir ascorbato de sodio para reducir el estado de oxidación del metal. A veces, es preciso 69 Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless. K. B. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004. 70 Demko, Z. P.; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2113. 71 Huisgen, R. Angew. Chem. Int. Ed. 1968, 7, 321. 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Cálculos teóricos indican que la coordinación del cobre disminuye el pK a del enlace C-H del alquino, por lo que es posible la desprotonación en sistemas acuosos incluso sin adición de base (el complejo Cu-acetileno ha sido encontrado en solución acuosa incluso a pH ácido). La complejación alquino-π es endotérmica, pero la formación de las especies [B] y [B’] es exotérmica (11.7 kcal/mol), lo cual apoya que este tipo de reacciones aumenten su velocidad en presencia del metal. 72 Chan, T. R.; Hilgraf, R.; Sharpless, K. B.; Fokin, V. V. Org. Lett. 2004, 6, 2853. 73 Himo, F.; Lovell, T.; Hilgraf, R.; Rostovtsev, V. V.; Noodleman, L.; Sharpless, K. B.; Fokin, V. V. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 210. 74 Bock, V. D.; Hiemstra, H.; van Maarseveen, J. H. Eur. J. Org. Chem. 2006, 51. 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Por otra parte, es una reacción bioortogonal, ya que tanto las azidas como los alquinos son prácticamente inertes en condiciones biológicas, donde existen multitud de moléculas con un alto grado de funcionalización. Este hecho, junto con la facilidad con la que los grupos alquino y azida pueden ser introducidos en una molécula, y su estabilidad relativa bajo una amplia variedad de condiciones hacen que esta reacción sea una excelente alternativa en procesos de bioconjugación. Sin embargo, la desventaja fundamental que presenta la reacción CuAAC es el uso de cobre como catalizador, el cual puede tener efectos tóxicos si no se elimina de forma apropiada. 75 75 Gaetke, L. M.; Chow, C. K. Toxicology 2003, 189, 147. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Introducción 23 Además, si la estructura del compuesto final contiene grupos funcionales capaces de quelatar iones cobre, la eliminación completa del metal puede ser complicada, limitando así el uso terapéutico de los compuestos obtenidos mediante esta estrategia sintética. Por este motivo, Bertozzi y col. desarrollaron como alternativa la cicloadición [3+2] de azidas y ciclooctinos promovida por la tensión del anillo, también conocida como reacción SPAAC (del inglés Strainpromoted alkyne-azide cycloaddition), que no necesita el uso de ningún catalizador. 76 Una de las principales ventajas de la SPAAC frente a la CuAAC es que la SPAAC se puede emplear directamente en organismos vivos para unir diferentes tipos de biomoléculas, entre ellas carbohidratos. 77 Además, la reacción SPAAC no genera productos colaterales ni es necesaria la presencia de aditivos como el ascorbato sódico o el TBTA, que dificultan la purificación del producto final. Otra ventaja de la reacción SPAAC es que no requiere una optimización extensiva de las condiciones de reacción. Se trata de una reacción experimentalmente sencilla, siendo determinante únicamente la elección del disolvente donde tanto el ciclooctino como el azido derivado deben ser solubles. 78 A pesar de ser una versión mejorada de la reacción CuAAC, la reacción SPAAC presenta varias desventajas frente a la primera, entre las que cabe destacar la falta de regioselectividad y la necesidad de funcionalización del anillo de ciclooctino para su conjugación con otras moléculas o plataformas. La reacción CuAAC es regioespecífica, genera un único producto 1,4- disustituido mientras que la reacción SPAAC da lugar a los dos posibles regioisómeros. La reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre ciclooctinos y azidas ha sido ampliamente utilizada desde su desarrollo en diferentes áreas de la química, y ha resultado ser una herramienta de gran utilidad en química biológica o en el diseño de nuevos materiales. Por este motivo, la reacción SPAAC ha adquirido un enorme interés en la comunidad científica gracias a su gran versatilidad, pudiéndose utilizar tanto en procesos de imagen in vivo como en la obtención de nuevos fármacos o materiales con aplicaciones prometedoras. 79 Dentro del área de la glicobiología, las reacciones de química click han sido ampliamente utilizadas en ingeniería metabólica de glicanos, que incluye la imagen de ligandos carbohidrato 76 Agard, N. J.; Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046. 77 Chang, P. V.; Prescher, J. A.; Sletten, E. M.; Baskin, J. M.; Miller, I. A.; Agard, N. J.; Lo, A.; Bertozzi, C. R. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2010, 107, 1821. 78 Debets, M. F.; van Berkel, S. S.; Dommerholt, J.; Dirks, A. T.; Rutjes, F. P.; van Delft, F. L. Acc. Chem. Res. 2011, 44, 805. 79 Laughlin, S. T.; Baskin, J. M.; Amacher, S. L.; Bertozzi, C. R. Science 2008, 320, 664. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 1 24 no invasiva, estudios de glicómica y manipulación de la superficie de virus para el descubrimiento de fármacos, y en otras aplicaciones como en el estudio del perfil de proteínas basado en la actividad y en los microarrays con carbohidratos. 80 80 Zhang, X.; Zhang, Y. Molecules 2013, 18, 7145. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc CAPÍTULO 2 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Antecedentes y objetivos 25 2.1 Antecedentes Desde sus inicios, el grupo de investigación en el que se ha desarrollado esta tesis doctoral se ha centrado en la búsqueda de herramientas basadas en carbohidratos que permitan esclarecer el papel de éstos en procesos infecciosos o procesos moduladores de la respuesta inmune. Para ello, empleando una variedad de plataformas multivalentes, se ha logrado preparar diferentes miméticos de conjugados de carbohidratos capaces de interaccionar y bloquear el receptor DCSIGN, involucrado en numerosos procesos biológicos. 81 En nuestro grupo de investigación, los dendrímeros han suscitado un gran interés por las innumerables propiedades que presentan, y que han sido descritas en la introducción. Estos sistemas han sido convenientemente funcionalizados en su periferia con múltiples copias de los carbohidratos seleccionados. Inicialmente y como prueba de concepto se llevó a cabo la funcionalización con manosas de polímeros hiperramificados Boltorn I, compuestos comerciales basados en 2,2’-bis-hidroximetil propiónico, empleando una estrategia divergente. 82 (Figura 2.1) Mediante ensayos de precipitación cuantitativa, se comprobó que estos glicodendrímeros eran capaces de interaccionar con la lectina Lens Culinaris (LCA). Sin embargo, no se observó una mayor afinidad al aumentar la valencia de los sistemas, pasando de 16 a 32 unidades de manosa. 81 a) J. J. Reina Martín, Diseño y síntesis de ligandos basados en carbohidratos y estudio de la interacción con la lectina DC-SIGN. Tesis doctoral, Universidad de Sevilla, Sevilla, 2008. b) M. Sánchez-Navarro, Síntesis de sistemas multivalentes de carbohidratos basados en glicodendrones, Tesis doctoral, Universidad de Sevilla, Sevilla, 2009. c) R. Ribeiro-Viana, Síntesis y evaluación biológica de sistemas glicodendríticos basados en la reacción de cicloadición 1,3-dipolar catalizada por Cu (I), Tesis doctoral, Universidad de Sevilla, Sevilla, 2012. d) J. Ramos- Soriano, Sistemas Glicodendríticos como Herramientas en Biomedicina. Tesis doctoral, Universidad de Sevilla, Sevilla, 2017. e) di Maio, A. Carbohydrate Multivalent Systems to functionalize proteins and surfaces for lectin interaction studies. Tesis doctoral, Universidad de Sevilla, Sevilla, 2019. 82 Arce, E.; Nieto, P. M.; Díaz, V.; Castro, R. G.; Bernad, A.; Rojo, J. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 817. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 2 32 180 grupos alquino en su superficie. Estos grupos se funcionalizaron posteriormente con los glicodendrones anteriomente mencionados, vía reacción de CuAAC, obteniéndose los sistemas VIIIa con 540 (a partir del dendrón trivalente VII) y VIIIb con 1620 (a partir del dendrón nonavalente II) copias de manosa en su superficie. 86 (Figura 2.6) Figura 2.6. Estructura de las glicodendriproteínas VIIIa-b de Qβ y manosas. Ambas estructuras, que mimetizan a los patógenos tanto en tamaño como en su superficie altamente glicosidada, presentaron una elevada capacidad para bloquear la infección de células dendríticas mediada por el receptor DC-SIGN causada por un modelo pseudotipado del virus del Ébola. En concreto, la glicodendriproteína con 1620 copias de manosa en su superficie presentó un IC 50 en el rango bajo nanomolar. Nuestro grupo de investigación en colaboración con el grupo del Prof. Nazario Martín de la Universidad Complutense de Madrid, ha desarrollado nuevos sistemas nanométricos basados en fullerenos decorados con manosa, desde 12 hasta 120 unidades (Figura 2.7), mostrando excelentes resultados de actividad inhibitoria frente a virus como el Ébola. 43 86 Ribeiro-Viana, R.; Sánchez-Navarro, M.; Luczkowiak, J.; Koeppe, J. R.; Delgado, R.; Rojo, J.; Davis, B. G. Nat. Commun. 2012, 3, 1303. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Antecedentes y objetivos 33 Figura 2.7 Estructura general de tridecafullerenos IXa-b. Especial interés han suscitado los tridecafullerenos por su estructura globular, su tamaño y el número de carbohidratos. Estas superestructuras IX están constituidas por un núcleo C 60 unido covalentemente a 12 hexaductos C 60 funcionalizdos con 10 unidades de manosa cada uno, resultando en un total de 120 unidades de carbohidrato. Estos sistemas fueron capaces de bloquear la infección en un modelo pseudotipado del virus del Ébola, con un IC 50 en el rango bajo nM, empleándose como control negativo la estructura equivalente decorada con galactosas. Sin duda, con todas estas plataformas se ha demostrado que el uso de estructuras multivalentes genera innumerables ventajas y permite bloquear los receptores celulares e intervenir en numerosos procesos biológicos. Además, muestran la versatilidad química que ofrecen los glicodendrones como bloques de construcción para la obtención de sistemas multivalentes complejos totalmente monodispersos. A la vista de estos precedentes, parece necesario explorar nuevas plataformas sencillas y accesibles que aporten propiedades beneficiosas que guarden relación, no sólo con el proceso de interacción, sino que también mejoren la circulación y la acumulación de estos sistemas en el organismo para que lleguen a los puntos de acción. En este sentido, es importante controlar Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 2 34 aspectos como la biocompatibilidad y el tamaño. Además, las estrategias de síntesis deben permitir la conjugación de unidades sacarídicas más grandes para que se asemejen más a los fragmentos oligosacarídicos que existen en la superficie de los patógenos. Otro aspecto en el que nuestro grupo de investigación ha centrado su atención ha sido en el desarrollo de nuevas estrategias sintéticas que permitan la construcción de oligosacáridos naturales como el epítopo Man 9 presente en la superficie de muchos virus. Teniendo en cuenta que DC-SIGN presenta una gran afinidad por este ligando, para poder bloquear este receptor es preciso disponer de rutas sintéticas que permitan obtenerlo en grandes cantidades y de manera sencilla, minimizando el número de etapas sintéticas. En este sentido, el grupo de investigación abordó una estrategia convergente para la obtención del oligosacárido Man 9 , 87 reduciendo notablemente el número de etapas de purificación, el tiempo y aumentando el rendimiento global en comparación con el resto de las estrategias existentes hasta el momento. 88, 89 La síntesis del nonasacárido X (epítopo fundamental de la estructura high-mannose) se llevó a cabo siguiendo una estrategia convergente a partir de tres intermedios: un monosacárido aceptor XVII, un pentasacárido XI y un trisacárido XIV. (Esquema 2.2) El mayor reto sintético de la síntesis de este epítopo natural era la obtención del derivado β-manósido XVII ya que la configuración anomérica mayoritaria de la manosa es α. En la bibliografía, existen pocos ejemplos en los que se recoja la síntesis de este epítopo con configuración β en su extremo reductor. De forma resumida, nuestro grupo de investigación preparó el monosacárido aceptor XVII con configuración β siguiendo las condiciones descritas por Crich y col. que facilita la preparación de β-manósidos a partir de derivados en los que el hidroxilo en posición 2 está protegido en forma de propargilo. 90 Para construir el pentasacárido XI, fue necesario emplear como dador de glicosilo un disacárido XIII y como aceptor de glicosilo, el monosacárido XII. Tanto este disacárido XIII como el trisacárido XIV, se obtuvieron mediante dos estrategias diferentes. Por un lado, una de las estrategias consistía en la acetólisis de la levadura del pan, a través de la cual se lograron obtener ambos bloques de construcción en tan sólo 10 h y en una escala de gramos. Por otro lado, siguiendo una ruta consecutiva se llevaron a cabo las 87 Ramos-Soriano, J.; de la Fuente, M. C.; de la Cruz, N.; Figueiredo, R. C.; Rojo, J.; Reina, J. J. Org. Biomol. Chem. 2017, 15, 8877. 88 Grice, P.; Ley, S. V.; Pietruszka, J.; Osborn, H. M. I.; Priepke, H. W. M.; Warriner, S. L. Chem. Eur. J. 1997, 3, 431. 89 Ratner, D. M.; Plante, O. J.; Seeberger, P. H. Eur. J. Org. Chem. 2002, 826. 90 Crich, D.; Jayalath, P. Org. Lett. 2005, 7, 2277. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Antecedentes y objetivos 35 funcionalizaciones pertinentes del monosacárido aceptor XV. A continuación, la autoglicosidación de este monosacárido XV condujo a la formación de los bloques disacáridico XIII y trisacarídico XIV, necesarios para preparar el pentasacárido XI y el nonasacárido X, respectivamente. Esquema 2.2 Análisis retrosintético de la preparación del nonasacárido X. Los bloques de construcción fueron funcionalizados en la posición anomérica del extremo reductor con el grupo S-tolilo. No es muy frecuente el uso de tioglicosidos como donadores de glicosilo en síntesis de oligosacáridos, pero se demostró que esta estrategia era totalmente viable, al igual que los donadores funcionalizados con tricloroacetimidato o con flúor, frecuentemente utilizados para este tipo de reacciones de glicosilación. Como grupos protectores se seleccionaron grupos benzoilo o grupos acetilo para que fuera viable la síntesis de Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 2 36 los correspondientes derivados con grupos azido, así como grupos alquino, alqueno o aldehído. Además, se evita la pérdida sustancial de rendimiento tras el último paso de desprotección de los grupos hidroxilo. El nonasacárido fue funcionalizado en la posición anomérica del extremo reductor con un grupo azido que permite la conjugación posterior con otras moléculas, mediante química click o enlaces amidas, previa reducción del grupo azido a amino. De acuerdo con estos resultados, cabe pensar que esta estrategia sintética convergente podría permitir acceder a otras muchas oligomanosas intermedias lineales o ramificadas con gran interés biológico. Si estas moléculas se funcionalizan convenientemente, se podrían conjugar a estructuras multivalentes, empleándose la estrategia comentada con anterioridad desarrollada en nuestro grupo de investigación. Estos sistemas multivalentes podrían ser utilizados en aplicaciones biológicas para el estudio de la interacción con lectinas o como vehículos en el transporte selectivo de moléculas de interés biológico hacia dianas celulares. A la vista de estos antecedentes del grupo de investigación, se han propuesto los siguientes objetivos que constituyen la base de esta tesis doctoral. 2.2 Objetivos El objetivo fundamental del trabajo que se presenta en esta Memoria es la construcción de nuevas plataformas para la presentación multivalente de carbohidratos (monosacáridos, oligosacáridos y sistemas glicodendríticos) orientados a diferentes aplicaciones terapéuticas. Como ya se ha mencionado anteriormente, es fundamental disponer de estrategias sintéticas que permitan obtener glicoconjugados capaces de interaccionar con los receptores presentes en la superficie celular para comprender el papel fundamental que los carbohidratos juegan en numerosos procesos biológicos. Esta tesis doctoral se ha centrado principalmente en el estudio de la actividad que muestran los glicoconjugados preparados en procesos de infección viral, en procesos moduladores de la respuesta inmune o en cáncer. Para ello, se ha intentado aumentar la afinidad de los diferentes sistemas multivalentes sintetizados por las correspondientes lectinas. Para obtener una primera aproximación de cómo podría ser la efectividad de estos sistemas en la inhibición de procesos de infección, se han llevado a cabo estudios de interacción con otras lectinas. Para alcanzar este objetivo general, se proponen los siguientes objetivos específicos: Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Antecedentes y objetivos 37 • Síntesis de oligosacáridos de manosa complejos convenientemente funcionalizados para que puedan ser conjugados a diversas plataformas multivalentes y determinación de su afinidad por lectinas específicas. • Construcción de neoglicoproteínas a partir de glicodendrones y evaluación de la respuesta inmune que desencadenan en células dendríticas o similares. • Preparación de plataformas multivalentes biocompatibles de carbohidratos basadas en nanogeles (gliconanogeles), cuya morfología y tamaño mimetizan a los virus. Determinación de la capacidad que poseen estos sistemas para interaccionar con lectinas. • Empleo de los gliconanogeles multivalentes como transportadores direccionales de fármacos antitumorales. Evaluación de la capacidad de estos sistemas para ser internalizados en células tumorales específicas. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 2 38 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc CAPÍTULO 3 SÍNTESIS Y PRESENTACIÓN MULTIVALENTE DE OLIGOMANOSAS. ESTUDIOS DE AFINIDAD CON LECTINAS Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 39 3.1 INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 3.1.1 Glicoproteínas virales La glicosilación de las proteínas presentes en la superficie de los virus ocurre durante la replicación dentro de las células huéspedes. (Figura 3.1) Las unidades de glicanos en las glicoproteínas virales son responsables de las interacciones con lectinas u otros receptores presentes en la superficie de las células, constituyendo el primer paso en el proceso de infección tras el cual se produce la internalización de los virus dentro de las células diana. 91 Figura 3.1 Pasos más relevantes en la patogénesis vírica. De manera general, la N-glicosilación de las proteínas ocurre cuando éstas alcanzan el RE de las células eucariotas. Una vez dentro, sufren la primera modificación, que consiste en la trasferencia de un oligosacárido precursor en el extremo amino terminal de un residuo de Asparagina (Asn) de la proteína. Este precursor está constituido por tres glucosas, nueve manosas y dos N-acetilglucosaminas (Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 ). 92 91 Watanabe, Y.; Bowden, T. A.; Wilson, I. A.; Crispin, M. Biochim. Biophys. Acta, Gen. Subj. 2019, 1863, 1480. 92 Aebi, M. Biochim. Biophys. Acta 2013, 1883, 2430. Célula huésped infectada GP Viral Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 46 Esquema 3.1 Análisis retrosintético de la preparación del undecasacarido Man 9 GlcNAc 2 NH 2 (I). (NPhth: grupo N- ftalimido) El mayor reto sintético que supone la preparación de este ligando es la obtención del derivado β-manósido, ya que los derivados de manosa, tras la reacción de glicosidación, proporcionan exclusivamente el derivado α-manosa, favorecido por el efecto anomérico. La síntesis del trisacárido aceptor III se llevó a cabo a partir de dos monosacáridos diferentes V y VII. Esta síntesis implica un gran número de etapas de enorme dificultad, tanto de reacciones de glicosidación, de desprotección como reacciones de inversión de la configuración del C-2 de la glucosa que dan como resultado el derivado de manosa con configuración β con bajo rendimiento. (Esquema 3.2). Fueron necesarias un total de 11 etapas sintéticas para obtener este compuesto con un rendimiento global del 5%. Esto pone de manifiesto, no sólo la enorme complejidad de la síntesis, sino que además se hace necesaria una nueva estrategia más simple que aumente considerablemente el rendimiento global del trisacárido III. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 47 Esquema 3.2 Síntesis del trisacárido III aceptor. Por otro lado, el trisacárido lineal II funcionalizado con un átomo de flúor en la posición anomérica del extremo reductor y del pentasacárido IV funcionalizado con un grupo S-tolilo en el extremo reductor fueron preparados mediante una síntesis lineal. Emplearon los monosacáridos XI y XII para obtener el trisacárido II y los monosacáridos XI y XIV para sintetizar el pentasacárido IV con rendimientos del 44% (4 etapas de síntesis) y 42% (3 etapas de síntesis), respectivamente. (Esquema 3.3) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 48 Esquema 3.3 Etapas sintéticas para la preparación del trisacárido lineal II y del pentasacárido IV. Una vez obtenidos los tres bloques de construcción II, III y IV, se unieron mediante dos reacciones de glicosidación con una etapa intermedia de desprotección, para obtener el correspondiente oligosacárido protegido I. (Esquema 3.4). Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 49 Esquema 3.4 Preparación del oligosacárido Man 9 GlcNAc 2 NH 2 ( I). Por último, se llevó a cabo la desprotección de los grupos amino que posteriormente fueron protegidos mediante N-acetilación. A continuación, se desprotegieron los grupos hidroxilo protegidos como acetatos, se eliminaron los grupos bencilo mediante hidrogenación y finalmente se redujo el grupo azido presente en el extremo reductor. En esta síntesis, la hidrogenación requería presiones altas para que la conversión fuera completa, esto daba lugar a la obtención de subproductos procedentes de la reducción de los anillos aromáticos. El rendimiento global de las etapas de desprotección del compuesto XVII fue del 26%. Como ya se ha mencionado anteriormente, mediante estudios de cristalización se demostró que la parte manosilada del oligosacárido Man 9 GlcNAc 2 es la parte fundamental en la interacción. La función del disacárido de GlcNAc es meramente estructural, es la parte más Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 50 próxima al residuo de Asn de la proteína del patógeno. Por esta razón, en numerosas ocasiones se ha planteado únicamente la preparación del epítopo Man 9 para reducir la complejidad de la síntesis de este oligosacárido, esperando que el nivel de reconocimiento no se vea afectado. En este caso, la configuración del extremo reductor podría ser α o β. En la bibliografía existen varias aproximaciones para la preparación de este nonasacárido de manosas de manera regio- y estereoselectiva, funcionalizado en su extremo reductor con diferentes sustituyentes y con configuración α. 100, 111 Sin embargo, para preparar el derivado con configuración β, existen menos estrategias descritas ya que supone una mayor dificultad. Por un lado, Grice y col. 88 siguieron una aproximación convergente mientras que Ratner y col. 89 usaron una estrategia lineal. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha descrito una estrategia sintética convergente para la obtención de este epítopo. 87 En la estrategia descrita por Grice, 88 se optó por seleno- y tioglicósidos como donadores de glicosilo, siendo mucho más reactivo el primer grupo. Esta diferencia de reactividad permitió llevar a cabo la síntesis de bloques de construcción XXIV y XXVIII para la obtención del Man 9 funcionalizado con el grupo 8-(metoxicarbonil)octilo en una única etapa. (Esquema 3.5) Como grupo protector, se utilizó el ciclohexano-1,2-diacetal (CDA) que permite la protección de hidroxilos vecinos, en concreto, los grupos hidroxilo 3 y 4. 111 a) Merritt, J. R.; Naisang, E.; Fraser-Reid, B. J. Org. Chem. 1994, 59, 4443. b) Grice, P.; Ley, S. V.; Pietruszka, J.; Priepke, H. W. M. Angew. Chem. Int. Ed. 1996, 35, 197. c) Zhu, Y.; Kong, F. Synlett 2001, 8, 1217. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 51 Esquema 3.5 Síntesis de los bloques de construcción XXIV y XXVIII. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 52 Previamente, fue necesaria la síntesis de los precursores, XVIII, XIX, XXV, XXI y XXVII, a partir de los monosacáridos XXIX y XXXI. (Esquema 3.6) Esquema 3.6 Síntesis de los precursores XVIII, XIX, XXV, XXI y XXVII. La síntesis del monosacárido aceptor o núcleo con configuración β XXIII se llevó a cabo a partir del derivado metil-α- D -manopiranósido XXXIII. Este monosacárido fue protegido regioselectivamente para obtener el derivado XXXIV, de acuerdo con el procedimiento descrito en la literatura. 112 A continuación, mediante β-glicosidación con 8-(metoxicarbonil)oct-1-ol, siguiendo el método descrito por Paulsen, 113 obtuvieron mayoritariamente el derivado βmanósido (β:α>13:1). (Esquema 3.7) Posteriormente, los grupos alilo fueron eliminados y la posición 6 fue protegida selectivamente con cloruro de tert-butildifenilsililo para obtener el aceptor de glicosilo XXIII y así, poder construir el correspondiente tetrasacárido XXIV. 112 a) Ogawa, T.; Katano, K.; Sasajima, K.; Matsui, M. Tetrahedron 1981, 37, 2779. b) Ogawa, T.; Nakahayashi, S.; Kitajima, T. Carbohydr. Res. 1983,114, 225. 113 a) Paulsen, H.; Lockhoff, O. Chem. Ber. 1981, 114, 3102. b) Paulsen; H. Angew. Chem. Int. Ed. 1982, 21, 155. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 53 Esquema 3.7 Síntesis del β-manósido XXIII. Tras una etapa de glicosidación de los bloques XXIV y XXVIII se obtuvo el correspondiente nonasacárido protegido XXXV con un rendimiento del 89% (Esquema 3.8). Tras realizar las pertinentes reacciones de desprotección se obtuvo el producto final Man 9 CO 2 Me (XXXVI) con un rendimiento global bajo, del 14%. Esquema 3.8 Síntesis y etapas de desprotección necesarias para obtener el nonasacárido Man 9 CO 2 Me (XXXVI). Por otro lado, Ratner y col. 89 emplearon una estrategia lineal para obtener el nonasacárido funcionalizado en la posición anomérica del extremo reductor con el grupo pentenilo. Este derivado se asemeja al que se podría obtener tras el desanclaje del correspondiente oligosacárido de la resina Merrifield que se emplea en la síntesis de los carbohidratos en fase sólida. Al igual que en el resto de estrategias, el mayor reto lo constituía la síntesis del residuo Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 54 β-manósido XLI. La ruta sintética para preparar este residuo comenzaba con la protección selectiva del hidroxilo en la posición 3 del derivado XXXVII y la reacción de bencilación del hidroxilo en la posición 4, generándose el glucal XXXVIII. (Esquema 3.9) Tras la epoxidación del doble enlace, se llevó a cabo la apertura de este epóxido en trans con 4-penten-1-ol, dando lugar de manera exclusiva al derivado β-glucósido XXXIX. En este punto, la inversión de la configuración de la posición 2 se realizó mediante un proceso de oxidación-reducción, seguida de una reacción de bencilación del hidroxilo en posición 2, formándose el derivado XL. Por último, se llevó a cabo la desprotección selectiva de la posición 3, obteniéndose el aceptor glicosidico XLI. El rendimiento global fue del 43% en ocho etapas de síntesis. Esquema 3.9 Ruta sintética para obtener el monosacárido XLI aceptor de glicosilo. El resto de bloques de construcción se obtuvieron usando los monosacáridos XLIII y XLV, preparados a partir de los compuestos comerciales XLII y XLIV, respectivamente. Para ello, se siguieron los métodos descritos en la bibliografía. 114, 115 (Esquema 3.10) 114 Mayer, T. G.; Kratzer, B.; Schmidt, R. R. Angew. Chem. Int. Ed. 1994, 33, 2177. 115 Rademan, J.; Geyer, A.; Schmidt, R. R. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 1241. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 55 Esquema 3.10 Preparación de los monosacáridos XLIII y XLV. A continuación, se llevaron a cabo una serie de reacciones de glicosidación y desprotección para obtener el nonasacárido Man 9 Pent (L), tal y como se detalla en el esquema 3.11. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 62 manósidos vía la formación de un intermedio triflato en su posición anomérica. En esta estrategia, emplearon como promotor el anhídrido tríflico (Tf 2 O) en presencia de 1- bencenosulfinil piperidina (BSP) y 2,4,6-tri-tert-butilpirimidina (TTBP) como agentes activantes. (Esquema 3.12) Esquema 3.12 Ejemplo representativo de la reacción de β-glicosidación de manosas de Crich. Los grupos protectores de las posiciones 2 y 3 deben ser grupos activantes y no orientadores, como éteres. Para aumentar la estereoselectividad de la reacción de glicosidación y evitar que se desestabilice la conformación que permite el ataque por la cara β (Figura 3.8), es necesario que al menos uno de los sustituyentes de las posiciones 2 y 3 del dador de glicosilo no sea voluminoso. En concreto, si el hidroxilo en la posición 2 del tiomanósido está protegido en forma de éter propargílico, se favorece el ataque por la cara β, mientras que la posición 3 debe funcionalizarse con un grupo voluminoso, como por ejemplo el PMB para asegurar la estereoselectividad deseada. La presencia de un grupo voluminoso en la posición 2, como un grupo bencilo, dificulta el ataque por la cara β ya que impide su giro y conduce a mezclas de anómeros α/β. Adicionalmente, la presencia del bencilidenacetal en las posiciones 4 y 6 genera una distorsión conformacional del anillo de piranosa adoptando una disposición espacial que favorece el ataque por la cara β. El grupo voluminoso de la posición 3 provoca que la orientación del bencilidenacetal sea hacia la cara α, por lo que impide el ataque por esta cara. Figura 3.8 Conformación del intermedio de la reacción de β-glicosidación. Por otro lado, la protección ortogonal de la posición 3 con PMB empleada en la aproximación de Crich permite la desprotección selectiva de esta posición. Posteriormente, esta O PMBO O OO Ph OTf O O O OTf O Ataque β Ataque α O MeO Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 63 posición se glicosidará con un trisacárido de manosa para obtener el correspondiente tetrasacárido. Teniendo en cuenta todo esto, la síntesis del derivado β-manósido aceptor 6 se planteó a partir del p-tolil-1-tio-α- D -manopiranósido (2) según se describe en el Esquema 3.13. Esquema 3.13 Síntesis del derivado β-manósido aceptor 6. Entre corchetes y de color gris se indican los intermedios que se generan en cada reacción. De acuerdo con la estrategia sintética descrita en la referencia 87, antes de llevar a cabo la reacción de glicosidación es preciso proteger ortogonalmente todos los grupos hidroxilo del derivado tiomanósido 2. De manera consecutiva, sin precisar etapas intermedias de purificación, se preparó el derivado tiomanósido 3 o dador de la reacción de glicosidación. , 29 , 39 BSP, TTBP, Tf 2 O, DCM Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 64 En primer lugar, se preparó el derivado tiomanósido 2 siguiendo el procedimiento descrito en la literatura. 125 Brevemente, este procedimiento consiste en la glicosidación de la manosa peracetilada con el 4-metilbencenotiol en presencia de BF 3 OEt 2 . Una vez desprotegido siguiendo las condiciones de Zemplen, se realizó la protección simultánea y regioselectiva de las posiciones 4 y 6, en forma de bencilidenacetal. Normalmente, para la protección de dioles en carbohidratos se suelen utilizar grupos acetales 126 que son muy accesibles y dan lugar a buenos rendimientos. La regioselectividad de esta reacción se debe a la mayor reactividad del alcohol primario en posición 6 con respecto al resto de grupos hidroxilo. Además, la formación de un acetal cíclico de seis átomos está más favorecida termodinámicamente que el correspondiente acetal de cinco átomos generado por los dioles vecinales 2-3 o 3-4. 127 La reacción entre el tiomanósido 2 y el benzaldehído dimetilacetal está catalizada por el ácido (10)-(R)- alcanforsulfónico (CSA, del inglés 10-(R)-CamphorSulfonicAcid). 128 Tras la elaboración de la reacción y la eliminación del disolvente, se llevó a cabo la protección regioselectiva del grupo hidroxilo de la posición 3. Como los grupos hidroxilo secundarios de las posiciones 2 y 3 presentan una reactividad parecida es necesaria una estrategia que evite la obtención de una mezcla de productos procedentes de la monoprotección en 2 o 3 y la diprotección del derivado tiomanósido. Para diferenciar entre estos dos grupos hidroxilo, se formó un acetal de estaño. 129 Este tipo de acetales derivados de alcoholes de la misma naturaleza que presentan orientaciones diferentes (axial y ecuatorial), son alquilados selectivamente en la posición ecuatorial. En este caso, el grupo hidroxilo de la posición 2 se encuentra en disposición axial, mientras que el correspondiente a la posición 3 posee una disposición ecuatorial, lo que implica que se va a producir su protección de manera regioselectiva. Para llevar a cabo la formación del acetal de estaño se empleó Bu 2 SnO en tolueno a reflujo. Los acetales de estaño son muy inestables, se hidrolizan con facilidad y no se puede seguir su formación por cromatografía en capa fina (c.c.f.). La reacción se dio por 125 a) Franzyk, H.; Meldal, M.; Paulsen, H.; Bock, K. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1995, 2883. b) Tai, C.-A.; Kulkarni, S. S.; Hung, S.-C. J. Org. Chem. 2003, 68, 8719. c) Watt, J. A.; Williams, S. J. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 1982. d) Blatter, R; Furneaux, R. H.; Ludewing, M. Carbohydr. Res. 2006, 341, 299. e) Patil, P. S.; Lee, C.-C.; Huang, Y.-W.; Zulueta, M. M. L.; Hung, S.-C. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 2605. 126 Calinaud, P.; Gelas, J. Preparative Carbohydrate Chemistry; Hannesian, S., Ed.; Marcel: New York, 1997. 127 Pétursson, S. J. Chem. Edu. 1997, 74, 1297. 128 Sanapala, S. R.; Kulkarni, S. S. Chem. Eur. J. 2014, 20, 3578. 129 a) Hanessian, S. Preparative Carbohydrate Chemistry, Taylor and Francis CRC Press, New York, 1997. b) Grindley, T. B. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1998, 53, 17. c) Cherif, S.; Clavel, J.-M.; Monneret, C. J. Carbohydr. Chem. 1998, 17, 1203. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 65 finalizada cuando se observó la desaparición de un precipitado blanco generado al añadir el Bu 2 SnO en la disolución que contenía el carbohidrato. A continuación, se añadió el cloruro de p-metoxibencilo (PMB-Cl) y Bu 4 NI, obteniendo exclusivamente el derivado protegido en la posición 3. 130 El último paso de esta síntesis consecutiva para obtener el intermedio de manosa 3 ortogonalmente protegido, conlleva la protección del grupo axial de la posición 2. Como se ha mencionado anteriormente, la elección del grupo protector de esta posición es crucial para obtener el anómero β de forma exclusiva. La propargilación del hidroxilo de la posición 2, se realizó por tratamiento con bromuro de propargilo y NaH en DMF. Tras purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice, se obtuvo el derivado 3 ortogonalmente protegido con un rendimiento del 75%. En el espectro de 1 H-RMN del derivado 3 aparece la señal característica del protón del metino del acetal como singlete a 5.64 ppm y las señales características del grupo propargilo a 4.42 y 2.46 ppm correspondientes a los protones del grupo metilénico próximos al alquino y al protón del metino del alquino, respectivamente. Además, a 3.82 ppm se aprecia un singlete que corresponde a los protones del grupo metilo del grupo protector PMB. Posteriormente, se llevó a cabo la reacción de glicosidación entre el derivado tiomanósido 3 totalmente protegido y el 2-[2-(2-cloroetoxi)etoxi]etanol, que actúa como aceptor de glicosilo, siguiendo las condiciones de reacción empleadas por Crich y col. 94 Para ello, se empleó una mezcla de BSP/Tf 2 O/TTBP. Mediante c.c.f. del crudo de esta reacción, se observó la aparición de varios productos. Uno de ellos aparece en la línea base de la c.c.f, por otro lado, tras cromatografía en columna de gel de sílice se aisló el compuesto 4 con un rendimiento bajo, en torno al 29% y otro producto que se encontraba a mayor Rf respecto al derivado β, que correspondía con el derivado α, tal y como se observó mediante análisis por 1 H-RMN. Con la ayuda del experimento bidimensional de correlación 1 H- 13 C (HSQC), se pudo asignar la señal correspondiente al protón β-anomérico a un desplazamiento químico de 4.57 ppm, (Figura 3.9) en concordancia con lo descrito en la bibliografía para β-manósidos. Por el contrario, los valores para los protones anoméricos con configuración α generalmente se ubican en torno a 5 ppm. 90, 130 Sun, B.; Srinivasan, B.; Huang, X. Chem. Eur. J. 2008, 14, 7072. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 66 131 Mediante experimentos HSQC se pudo confirmar la configuración del centro anomérico a través del análisis de los valores de J C,H . Generalmente, para los anómeros α se encuentran valores de J C,H en el rango de 170-175 Hz, mientras que para los β los valores oscilan entre 150 y 156 Hz. 132 En la figura 3.9, se muestra el espectro bidimensional HSQC para el compuesto 4, donde se observa la señal de cruce entre el protón-carbono anomérico del extremo reductor con configuración β con una J C,H = 157.3 Hz. Figura 3.9 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 , 298 K) del β-manósido 4. Ampliación del experimento HSQCRMN (400 MHz, CDCl 3 , 298 K). 131 a) Doores, K. J.; Davis, B. G. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 2692. b) Ardá, A.; Venturi, C.; Nativi, C.; Francesconi, O.; Cañada, F. J.; Jiménez-Barbero, J.; Roelens, S. Eur. J. Org. Chem. 2010, 64. c) Mukjerjee, C.; Mäkinen, K.; Savolainen, J.; Leino, R. Chem. Eur. J. 2013, 19, 7961. 132 Bock, K.; Pedersen,C. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 1974, 293. J C,H = 157.3 αβ Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 67 A continuación, se llevó a cabo la sustitución del átomo de cloro del extremo terminal del espaciador del derivado de β-manosa por un grupo azido, usando NaN 3 y DMF como disolvente. El rendimiento de esta reacción fue más bajo de lo esperado (39%), observándose la aparición de subproductos que quedan retenidos en la línea base por c.c.f. Teniendo en cuenta que la temperatura de la reacción es elevada, se pueden producir reacciones de química click vía térmica inter- o intramoleculares entre el grupo azido del espaciador en la posición anomérica y el grupo alquino en la posición 2 de la manosa. Para evitar la formación de estos subproductos, se decidió cambiar el espaciador empleado en la reacción de glicosidación y se utilizó como dador de glicosilo el 2-[2-(2- azidoetoxi)etoxi]etanol. Para ello, se llevó a cabo la reacción de sustitución del átomo de cloro de este espaciador por el grupo azido en la etapa previa a la reacción de glicosidación. 133 Las condiciones en las que se llevó a cabo la reacción de glicosidación son idénticas a las condiciones empleadas previamente. (Esquema 3.14) Esquema 3.14 Reacción de β-glicosidación para obtener el derivado 5 en un solo paso. Al igual que en la reacción de glicosidación previamente mencionada, se observó la aparición de varios compuestos por c.c.f., lo que provocó que el rendimiento fuese bajo en torno al 36% en los dos ensayos realizados. Una vez obtenido el derivado β-manósido 5, es preciso eliminar el grupo protector presente en la posición 2. Para llevar a cabo la formación del tetrasacárido precursor del nonasacárido no sería necesaria la desprotección selectiva de esta posición. El hidroxilo en posición 2 se podría mantener protegido con el grupo propargil éter incluso hasta el final de la síntesis del nonasacárido. Sin embargo, se comprobó que era inviable la eliminación de este grupo una vez formado el nonasacárido final. Por ello, tal y como se describe en la bibliografía, en primer lugar, se llevó a cabo la desprotección del grupo alquino. Esta desprotección conlleva en primer lugar la isomerización 133 Li, J.; Zacharek, S.; Chen, X.; Wang, J.; Zhang, W.; Janczuk, A.; Wang, P. G. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1549. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 68 al correspondiente aleno en presencia de un ligero exceso de KO t Bu en THF y su rotura en presencia de OsO 4 y N-óxido de la N-metilmorfolina (NMNO, del inglés N-methylmorpholine N-oxide). Tras el tratamiento con KO t Bu, en las mismas condiciones de reacción que las descritas previamente en nuestro grupo de investigación no se observaron cambios en el Rf por c.c.f., pero se decidió continuar y se realizó la adicción de OsO 4 en cantidad catalítica y un exceso de NMNO en una mezcla de acetona/H 2 O (4:1) durante 1 h. A continuación, se llevó a cabo la benzoilación de la posición 2 sin apreciar cambios por c.c.f. Únicamente se observó algún cambio de Rf al añadir 2,3-dicloro-5,6-dicianobenzoquinona (DDQ), indicativo de que se había producido la desprotección de la posición 3. (Esquema 3.15) El espectro de 1 H-RMN del producto de reacción coincidía con el derivado β-manósido 7, protegido en la posición 2 y desprotegido en la posición 3. En este espectro, no se observó la señal singlete de los protones del metileno unido al bencilo del grupo protector PMB (4.73 ppm) pero se seguía viendo la señal del metino del alquino (2.47 ppm) y la señal de los protones del metileno unido al alquino (4.63 ppm). Estos resultados indicaban claramente que no se había producido la eliminación del éter propargílico. Esquema 3.15 Últimas etapas de la síntesis del aceptor β-manósido 7. Se llegó a la conclusión de que la etapa que no había tenido lugar era la formación del aleno 8. Por ello, se decidió repetir de nuevo el proceso de isomerización del grupo alquino del derivado 5 aumentando el número de equivalentes de KO t Bu hasta 3 equivalentes y la dilución de la reacción, para poder disolver el sólido blanco que aparecía en el fondo del matraz de reacción tras añadir el exceso de KO t Bu. Una vez transcurridas 2 h tras la adición de la primera porción de KO t Bu, se decidió añadir otros 3 equivalentes más para ver si la reacción evolucionaba. Sin embargo, el sólido blanco no desapareció tras la adición de esta cantidad. Puede ocurrir que se produzca la precipitación del anión intermedio y que éste no se pueda protonar ni evolucionar al aleno 8. (Esquema 3.16) DDQ DCM/H2O, t.a. purificación KOtBu THF, t.a. work-up OsO4, NMNO acetona/H2O, t.a. Bz2O, Et3N DMAP, DCM, t.a. work-up 67 O HO O O OO Ph N3 3 O PMBO O OBz OO Ph N3 3 x work-up O O Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 69 Esquema 3.16 Formación del aleno 8 a partir del alquino 5. Para que no se formasen precipitados, se aumentó únicamente el volumen de THF anhidro añadido, sin modificar el número de equivalentes. Sin embargo, la reacción no evolucionó hacia la formación del correspondiente aleno 8. Por ello, se decidió forzar las condiciones de reacción, aumentando la temperatura y utilizando un disolvente polar aprótico como la DMF que permitiese disolver el intermedio aniónico formado. 134 (Esquema 3.17) De esta manera, se logró la formación parcial del aleno 8. Sin embargo, tras el tratamiento con agua y extracción con éter dietílico, se observó la aparición de un sólido blanquecino insoluble en DCM. En este caso, el sólido no podía corresponder con la precipitación del anión intermedio ya que éste se disolvería en presencia de agua. Se pensó entonces que este sólido podría provenir de alguna reacción que se produjera por vía térmica. En el espectro de 1 H-RMN del crudo de reacción, se observó que la integral de algunas señales del monosacárido era superior respecto a las integrales de las señales del alquino (triplete a 2.47 ppm) y el aleno (triplete a 6.94 ppm), indicativo de la presencia de algún subproducto. Esquema 3.17 Isomerización en DMF y a 65ºC del grupo propargilo en posición 2 del derivado β-manósido 5 para dar lugar al aleno 8. 134 Attolino, E.; Rising, T. W. D. F.; Heideckeand, C. D.; Fairbanks, A. J. Tetrahedron Asymm. 2007, 18, 1721. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 70 Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió llevar a cabo la eliminación del grupo propargilo utilizando otras alternativas. Una de las opciones empleadas más frecuentemente se basa en la desprotección reductora en un único paso de síntesis. Para ello, se empleó SmI 2 en presencia de una amina y agua, tal y como se describe en la bibliografía. 135 (Esquema 3.18) De esta manera, tras la adición secuencial de estos reactivos, se observó por c.c.f. un único producto en la línea base. El espectro de 1 H-RMN reveló la presencia de una pequeña proporción de alquino; sin embargo, mediante espectometría de masas ESI no se observó señal correspondiente al producto de partida. El valor de m/z observado corresponde a la reducción del grupo azido a amina. De hecho, en presencia del derivado de Samario (II), las azidas pueden reducirse de manera efectiva a aminas. 136 Esquema 3.18 Tratamiento del derivado 5 con SmI 2 en presencia de N-isopropil amina. Para evitar que se produzca la reducción del grupo azido, se decidió llevar a cabo la reducción del correspondiente alquino a partir del derivado β-manósido 4 que presentaba un átomo de cloro en el extremo terminal del espaciador. (Esquema 3.19) Sin embargo, no se produjo la desprotección del grupo propargil éter en presencia de SmI 2 a temperatura ambiente y empleando las mismas condiciones utilizadas anteriormente. Esquema 3.19 Tratamiento del derivado 4 con SmI 2 en presencia de N-isopropil amina. 135 Manabe, S.; Ueki, A.; Ito, Y. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 5159. 136 Goulaouic-Dubois, C.; Hesse, M. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 7427. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 71 Por otro lado, se decidió forzar las condiciones de isomerización del alquino del derivado 4, empleando exceso de KO t Bu en THF, a reflujo. De esta manera, se logró la formación del correspondiente aleno; sin embargo, también se produjo la β-eliminación del átomo de cloro del extremo reductor, obteniendo el compuesto 11. (Esquema 3.20) En el espectro de 1 H-RMN del crudo de reacción, se observó la aparición de la señal triplete correspondiente al protón del metino del aleno a 6.93 ppm y de un nuevo doblete de dobletes a un desplazamiento de 6.48 ppm correspondiente al nuevo alqueno formado. Esquema 3.20 Isomerización del alquino del derivado 4 a reflujo. Teniendo en cuenta que la isomerización del grupo alquino en los derivados de β-manosa 4 y 5 conducen a subproductos no deseados cuando se fuerzan las condiciones de reacción, se decidió modificar el grupo propargil éter en el derivado tiomanosido 2 antes de llevar a cabo la reacción de β-glicosidación. (Esquema 3.21) Crich y col., 87 únicamente observaron una ligera pérdida de la selectividad hacia el derivado β-manosa cuando el hidroxilo en la posición 2 de la manosa se encontraba protegido con un grupo alilo; sin embargo, el éter del aleno sigue siendo un grupo no voluminoso, no orientador y activante. La isomerización del grupo propargil éter se llevó a cabo a partir del derivado 3 en presencia de un exceso de KO t Bu, en THF a reflujo, no observándose evolución de la reacción. Sin embargo, en DMF anhidra y en presencia de un exceso de KO t Bu a 90ºC, se logró obtener el correspondiente aleno en la posición 2, compuesto 12. (Esquema 3.21) Esquema 3.21 Formación de los derivados 8 y 10 a partir del derivado 3. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 78 cloruro de tert-butildimetilsililo (TBDMSCl), protegiéndose la posición 3 más reactiva y menos impedida estericamente. El intermedio 35 se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice, y tras dos etapas consecutivas se obtuvo el derivado deseado 28. En primer lugar, fue necesario benzoilar el resto de las posiciones libres del derivado 35 y, por último, en condiciones ácidas, se llevó a cabo la desprotección selectiva de las posiciones sililadas en una disolución del complejo HF/piridina y en presencia de AcOH. El rendimiento de estas reacciones consecutivas fue del 72%. Esquema 3.26 Síntesis de los aceptores de glicosilo 28 y 30. El otro bloque de construcción, el aceptor 30 se preparó en 4 etapas consecutivas de reacción, obviando la síntesis por etapas y empleando como producto de partida nuevamente el derivado 34. La estrategia se inició con la formación de un ortoéster entre los hidroxilos de las posiciones 2 y 3 del derivado 34, mediante reacción con el trimetil ortoacetato y CSA (como catalizador). El tratamiento del ortoéster con una disolución de HCl 1M dio lugar a la hidrólisis parcial, desprotegiéndose únicamente la posición 3. Tras benzoilar las posiciones 3 y 4 libres, con Bz 2 O, Et 3 N y DMAP, se desprotegíó la posición 6, en una disolución del complejo HF/piridina y en presencia de AcOH, manteniéndose inalteradas el resto de las posiciones. Tras Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 79 benzoilar la posición 6, se llevó a cabo la desprotección selectiva del grupo acetilo de la posición 2 usando una disolución de HCl al 7% en MeOH en 24h. El rendimiento global de todas las etapas consecutivas llevadas a cabo para obtener el derivado 30 fue del 55%. Por otro lado, se llevó a cabo la reacción de glicosidación entre el trisacárido 33 y cada uno los aceptores 24 o 25, empleando 1.5 eq de NIS y 0.2 eq de TfOH, a -20ºC. (Esquema 3.27) De esta manera, se obtuvieron los correspondientes tetrasacáridos 36 y 37 con buenos rendimientos del 88% y del 86%, respectivamente. Esquema 3.27 Síntesis de los tetrasacáridos 36 y 37. En el espectro de 1 H-RMN del tetrasacárido 36, las señales de los protones anoméricos del extremo reductor con configuración α aparecían a 5.57, 5.35, 5.05 y 4.91 ppm. (Figura 3.11) También se observa la señal característica del –CH– del grupo bencilidenacetal a 5.49 ppm como un singlete ancho. De forma análoga, se observaron estas mismas señales en el espectro de 1 H-RMN del tetrasacárido 37. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 80 Figura 3.11 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 , 298 K) del tetrasacárido 36. El último paso de la síntesis de los tetrasacáridos aceptores de glicosilo consistió en la desprotección del grupo bencilidenacetal de los compuestos 36 y 37, usando un exceso de ácido p-toluenosulfónico (TsOH) en CH 3 CN. (Esquema 3.27) Tras purificación por cromatografía en columna de gel de sílice se obtuvieron los correspondientes tetrasacáridos 38 y 39 convenientemente desprotegidos con rendimientos del 78% y del 67%, respectivamente. En los espectros de 1 H-RMN se pudo observar la desaparición de la señal del protón del metino del acetal y la reducción del número de protones aromáticos. Además, la estructura de estos compuestos se analizó por espectrometría de masas. En el espectro de masas ESI del tetrasacárido 39, se observó la señal correspondiente a los iones [M+Na] + : m/z 1991.2 y [M+2Na] 2+ : m/z 1006.5. (Figura 3.12) Así mismo, en el espectro de masas ESI del tetrasacárido 38 se observaron las señales correspondientes a los iones [M+Na] + : m/z 1903.2 y [M+2Na] 2+ : m/z 962.5. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 81 Figura 3.12 Espectro de masas ESI del tetrasacárido 39. La siguiente etapa de la ruta sintética consistió en la reacción de glicosidación entre los tetrasacáridos 38 y 39 como aceptores glicosídicos y el pentasacárido 29 como dador de glicosilo, para obtener los correspondientes nonasacáridos protegidos 40 y 41. (Esquema 3.28) Las condiciones de reacción empleadas fueron las mismas que se usaron para la obtención de los tetrasacáridos, NIS y TfOH. Tras purificación cromatográfica en columna de gel de sílice se obtuvo el producto 40 con un rendimiento del 73%, mientras que el producto 41 se obtuvo con un rendimiento del 79%. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 82 Esquema 3.28 Síntesis de los nonasacáridos 13 y 14. A pesar de que existen dos posiciones libres en el tetrasacárido, la reacción de glicosidación tiene lugar exclusivamente en la posición 6, ya que está posición es mucho más reactiva. Además, una vez funcionalizada esta posición, es muy complicado que se produzca una segunda reacción de glicosidación en la posición 4 debido al impedimento estérico. La estructura de estos compuestos fue confirmada por RMN y espectrometría de masas, observándose las señales correspondientes al ión [M+2Na] 2+ : m/z 2200.1 del compuesto 40 y a los iones [M+2Na] 2+ : m/z 2244.7 y [M+3Na] 3+ : m/z 1503.9 del compuesto 41. Por último, se llevó a cabo la desprotección de los grupos benzoilo del nonasacárido con una disolución de NaOH 2M, en MeOH y tolueno (4:1). (Esquema 3.28) De esta manera, se obtuvieron los oligosacáridos desprotegidos 13 y 14, con un rendimiento del 93% y del 83%, respectivamente. Mediante RMN se comprobó que se habían desprotegido todos los grupos hidroxilo, hecho que se confirmó mediante espectrometría de masas, observándose las señales Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 83 correspondientes a los iones [M+Na] + : m/z 1568.2 y [M+2Na] 2+ : m/z 795.5 del compuesto 13 y a los iones [M+Na] + : m/z 1656.2 y [M+2Na] 2+ : m/z 839.5 del compuesto 14 (Figura 3.13). Figura 3.13 Espectro de masas ESI del nonasacárido 14. Los oligosacáridos totalmente desprotegidos 13 y 14 funcionalizados con un grupo azido pueden ser acoplados mediante reacción CuAAC o SPAAC a otras biomoléculas o estructuras de interés. En la presente tesis doctoral, se han construido sistemas multivalentes con estas moléculas, que se describirán en detalle en las siguientes secciones. 3.3.3 Presentación multivalente de los epítopos de Man 9 La presentación multivalente de carbohidratos es una de las estrategias más importantes para conseguir mejorar sustancialmente la afinidad de estos ligandos por las lectinas. Por ello, se planteó la preparación de sistemas multivalentes con los oligosacáridos cuya síntesis se ha descrito previamente. Las estructuras dendríticas son una de las plataformas más adecuadas para este fin. En concreto, se ha llevado a cabo la síntesis de glicodendrones trivalentes con un grupo azido en el punto de ramificación y/o focal, empleando la estrategia convergente diseñada en nuestro grupo de investigación, basada en la química de acoplamiento CuAAC. De esta manera, existe la posibilidad de conjugar estas moléculas a otros sistemas, biomoléculas o marcadores fluorescentes que presenten un grupo alquino en su estructura. Brevemente, para la preparación del núcleo crecimiento 43 fue necesario la alquilación de tres de los cuatro grupos hidroxilo del pentaeritritol comercial, en condiciones de eterificación de Williamson, utilizando hidruro sódico en DMF y bromuro de propargilo como agente alquilante. 142 (Esquema 3.29) A continuación, se funcionalizó el grupo hidroxilo libre del núcleo 142 Mollard, A.; Zharov, I. Inorg. Chem. 2006, 45, 10172. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 84 42 con un espaciador que presentaba un haluro terminal que será más tarde sustituido por un grupo azido. En concreto, se utilizó un derivado de tetraetilenglicol diclorado, disponible comercialmente, usando condiciones de catálisis de transferencia de fase, en presencia de hidrógeno sulfato de tetrabutilamonio y una disolución acuosa de NaOH al 50% p/v. 143 Esquema 3.29 Síntesis del núcleo de crecimiento 43. Una vez preparado el esqueleto 43 se llevó a cabo la reacción CuAAC con los nonasacáridos 13 y 14 funcionalizados con un grupo azido en su extremo reductor, así como con el oligosacárido de configuración β en el extremo reductor, 44. (Esquema 3.30) De esta manera, se obtuvieron los compuestos multivalentes que permitirán estudiar la influencia de la configuración de la unidad sacarídica situada en el extremo reductor y de la longitud del espaciador unido al nonasacárido, en la afinidad por los receptores celulares o lectinas. En la reacción de acoplamiento, se añadió un ligero exceso de cada uno de los ligandos para favorecer la funcionalización de todos los grupos alquino presentes en el esqueleto. Se utilizó CuSO 4 5H 2 O como fuente de Cu (II), NaAsc como agente reductor in situ de Cu (II) a Cu (I) y TBTA como agente estabilizador de Cu (I). Esta reacción se llevó a cabo bajo irradiación de microondas (MO) a 60ºC durante 30 minutos, en una mezcla de DMSO/H 2 O (1:1). Transcurrido este período, fue necesario eliminar las sales de cobre ya que este metal podría causar problemas de citotoxicidad, añadiendo una pequeña proporción de resina QuadraSil ® MP. A continuación, se purificaron cada uno de los glicodendrones mediante cromatografía de exclusión de tamaño Sephadex G-50 en H 2 O/MeOH 9:1. 143 Ortega-Muñoz, M.; Lopez-Jaramillo, J.; Hernandez-Mateo, F.; Santoyo-Gonzalez, F. Adv. Synth. Catal. 2006, 348, 2410. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 85 Esquema 3.30 Síntesis de los dendrones trivalentes de Man 9 48, 49 y 50. En los espectros de 1 H-RMN de los compuestos 45, 46 (Figura 3.14) y 47, se observó la aparición de la señal del metino del nuevo triazol, a 8.04 ppm, así como una señal a 4.63 ppm correspondiente al metileno en posición α al triazol. La relación entre los protones anoméricos del Man 9 y la señal del triazol es 9:1, lo que demuestra la funcionalización completa. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 86 Figura 3.14 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, D 2 O, 298 K) del dendrón trivalente 46. Mediante espectrometría de masas, se confirmó la estructura de los compuestos deseados, así como la ausencia de los nonasacáridos de partida. A modo representativo, en el espectro de masas (ESI) del compuesto 46 (Figura 3.15), se observaron únicamente las señales correspondientes a los iones [M+2Na] 2+ : m/z 2692.8, [M+3Na] 3+ : m/z 1803.1 y [M+4Na] 4+ : m/z 1357.2. Figura 3.15 Espectro de masas ESI del dendrón trivalente 46. H-triazol 3 3 OCH 2 triazol CH 2 CH 2 N triazol Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 87 Por último, se procedió a la sustitución del átomo de cloro presente en la posición focal por un grupo azido. (Esquema 3.30) Para ello, la reacción se llevó a cabo con un exceso de azida sódica en DMF a 70ºC durante dos días. El crudo de reacción se purificó mediante cromatografía por exclusión por tamaños Sephadex G-50 en H 2 O/MeOH 9:1, obteniéndose los correspondientes glicodendrones 48, 49 y 50. La sustitución completa del átomo de cloro por azida se confirmó mediante espectrometría de masas ESI y RMN, observándose en el espectro de 13 C-RMN del glicodendrón 49 la desaparición de la señal a 43.2 ppm correspondiente al metileno en posición alfa respecto al átomo de cloro. (Figura 3.16) Además, en este espectro apareció una nueva señal a 50.1 ppm que corresponde con el átomo de carbono del metileno unido al grupo azido próxima a la señal de los carbonos en α unidos a los átomos de nitrógeno de los triazoles. Figura 3.16 Espectro de 13 C-RMN (100 MHz, D 2 O, 298 K) del dendrón trivalente 49. CH 2 N 3 CH 2 Cl Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 94 finales con varias cargas, lo que verifica que no quedaba ligando sin conjugar con fluoresceína, ni fluoresceína sin reaccionar. En el espectro de masas ESI del compuesto 51 en modo negativo (Figura 3.20), se observó únicamente la señal del ión [M+2H] 2- : m/z 977.8 y del compuesto 52, se observaron las señales de los iones [M+H] - : m/z 1957.0 y [M+2H] 2- : m/z 977.7. Figura 3.20 Espectro masas ESI del compuesto 51. A continuación, se realizaron los ensayos de unión directa, entre los compuestos 51 y 52 y DC-SIGN ECD. Las medidas de polarización de fluorescencia fueron llevadas a cabo en placas de microtitulación de 384 pocillos (poliestireno negro, no tratado, Corning), minimizando el volumen y, por tanto, la cantidad de muestra necesaria para el análisis. Las medidas de polarización se registraron utilizando un lector de multiplacas y empleando filtros de polarización con longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente. Pequeños volúmenes de disoluciones de cada uno de los ligandos fluorescentes de concentración 20 nM fueron añadidas sobre varias disoluciones de proteína de concentración comprendida entre 28 μM y 75 nM, siendo la concentración final de ligando fluorescente 10 nM. Las medidas a cada concentración de proteína se realizaron por triplicado y se utilizó como blanco una disolución de la proteína de concentración 14 μM en el mismo tampón. Además, se midió el valor de polarización del compuesto fluorescente en ausencia de proteína y su valor se restó de los valores de polarización de fluorescencia del resto de medidas en presencia de la proteína. Esa variación de polarización se representó frente a la concentración de proteína, obteniendo las correspondientes isotermas de Langmuir. (Figura 3.21) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 95 Figura 3.21 Isotermas de Langmuir de los compuestos fluorescentes: a) α-Man 9 (51) y b) β-Man 9 (52). Analizando cada una de las isotermas de Langmuir, se obtuvieron valores de K D similares para ambos compuestos: 5.2±1.2 μM (51) y 4.6±1.3 μM (52). A partir de estos resultados, se puede concluir que la configuración del extremo reductor no afecta a la interacción entre DCSIGN y el epítopo Man 9 . Por otro lado, con el objetivo de analizar el efecto multivalente de los dendrones de Man 9 sintetizados a partir de los nonasacáridos 13, 14 y 44, se sintetizaron los correspondientes dendrones marcados fluorescentemente 53, 54 y 55. Estos compuestos se obtuvieron empleando las mismas condiciones de reacción que en el marcaje de los correspondientes nonasacáridos. (Esquema 3.32) Con el dendrón 54, se pretende ver si influye la longitud del espaciador en la afinidad por el receptor. 0 7 14 0 100 200 300 ∆P(mP) Concentración DC-SIGN ECD(µM) KD = 5,2±1,2 µM r2 = 0,98 a) 0 7 14 0 100 200 ∆P(mP) Concentración DC-SIGN ECD(µM) KD = 4,6±1,3 µM r2 = 0,97 b) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 96 Esquema 3.32 Reacción de acoplamiento CuAAC para sintetizar los dendrones trivalentes marcados fluorescentemente 53, 54 y 55 de los nonasacáridos 13, 14 y 44, respectivamente. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 97 Los compuestos 53, 54 y 55 fueron caracterizados por RMN y espectrometría de masas ESI. A modo de ejemplo, en la Figura 3.22 se muestra el espectro de masas del compuesto fluorescente 54 en modo negativo donde se observa únicamente las señales correspondientes a los iones [M-2H] 2- : m/z 2880.2, [M-3H] 3- : m/z 1918.7 y [M-4H] 4- : m/z 1438.3. Figura 3.22 Espectro de masas ESI del dendrón trivalente del epítopo Man 9 marcado fluorescentemente 54. De nuevo, se estudió mediante polarización de fluorescencia la interacción entre los compuestos fluorescentes 53, 55 y DC-SIGN ECD. Las constantes de disociación obtenidas para los compuestos fluorescentes trivalentes 53 (K D = 0.53±0.09 μM), 54 (K D = 0.24±0.11μM) y 55 (K D = 0.37±0.04 μM) (Figura 3.23) son un orden de magnitud mayor que la de los compuestos 51 y 52, lo que indica un claro efecto multivalente. Además, los resultados obtenidos para todos estos glicodendrones fluorescentes 53, 54 y 55 corroboraron que la configuración del extremo reductor no afecta en la interacción con DC-SIGN. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 98 Figura 3.23 Isotermas de Langmuir de los compuestos fluorescentes: a) 53, b) 54 y c) 55. Por otro lado, se decidió evaluar también la afinidad por la lectina Concanavalina A (ConA) que presentan los dendrones funcionalizados con carbohidratos más sencillos, y que son utilizados comúnmente en nuestro grupo de investigación como sistemas multivalentes. Estos sistemas son más fácilmente sintetizables si se compara con el epítopo Man 9 . En concreto, se decidió preparar el dendrón de 9 unidades de manosa marcado fluorescentemente 57, ya que contiene el mismo número de unidades de manosa que el epítopo Man 9 pero presenta una distribución espacial diferente. Por otro lado, también se prepararon el dendrón de tres unidades del disacárido Manα1,2Manα marcado fluorescentemente 56, que mimetiza la estructura de los tres brazos terminales D1-D3 del nonasacárido, así como el dendrón de 9 unidades del disacárido Manα1,2Manα marcado fluorescentemente 58, comparable con el dendrón trivalente del epítopo Man 9 , 55. (Figura 3.24) 0,0 0,5 1,0 1,5 0 50 100 150 ∆P(mP) Concentración DC-SIGN ECD(µM) KD = 0,53±0,09 µM r 2 = 0,99 a) 0,0 0,5 1,0 1,5 0 50 100 ∆P(mP) Concentración de DC-SIGN ECD(µM) b) K D = 0,24±0,11 µM r 2 = 0,95 0,0 0,5 1,0 1,5 0 50 100 150 ∆P(mP) Concentración de DC-SIGN ECD(µM) c) K D = 0,37±0,04 µM r 2 = 0,99 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 99 Figura 3.24 Estructuras de los ligandos 56, 57 y 58 marcados fluorescentemente. ConA es una lectina que se extrae de la planta Canavalia ensiformis y presenta una alta especificidad por conjugados que poseen unidades de α-manosa y α-glucosa en su estructura. Esta proteína es un homotetrámero donde cada una de las subunidades está unida a iones Mg 2+ y O O O O HO HO OH HO HO HO HO 58 O O O O O N N N NNN NN N O O O O O O O O O O O O O OO NN N N N N N N N N N N N N N N NN N N N N NNNN N O O O O O O O O O O O O O O O O O O OO O OO OH O HO HO HO 57 O O O O O N N N NNN NN N O O O OO 56 O O O HO HO HO HO HO HO HO O OO HO OH OH OH HO HO HO O O O OH OH HO OH OH OH OH N N N O HO O COOH HN O N N N O HO O COOH HN O Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 100 Ca 2+ . Cada subunidad constituye un sitio activo, por lo que posee 4 centros de reconocimiento. El pH es un factor clave para el proceso de oligomerización de esta proteína. Se sabe que a pH=7.2, la proteína se encuentra en su forma tetramérica, mientras que a valores de pH inferiores aparece fundamentalmente como un dímero. 146 La ConA es ampliamente utilizada en bioquímica para caracterizar y purificar glicoproteínas y otras glicomoléculas. Además, se emplea en estudios inmunológicos y de afinidad. De manera resumida, el dendrón 61 de primera generación del disacárido de manosa se sintetizó a partir del núcleo de crecimiento 43 y el disacárido 59 funcionalizado en el extremo no reductor con el espaciador 2-azido etanol, siguiendo un procedimiento similar al descrito para la obtención de dendrones trivalentes de los epítopos de Man 9 45-47. (Esquema 3.33) La reacción se llevó a cabo en MO a 60ºC, en presencia de CuSO 4 5H 2 O, TBTA y NaAsc. Tras eliminar los restos de cobre y purificar por Sephadex LH20 MeOH, se obtuvo el producto 60, que se hizo reaccionar con azida sódica a 70ºC con el objetivo de sustituir el átomo de cloro por azida. Esquema 3.33 Síntesis del dendrón trivalente 61 de Manα1,2Manα. El disacárido 59 se obtuvo a partir de la reacción de glicosidación entre el 2-bromoetanol 16 y el derivado tiomanósido 26, en presencia de NIS y TfOH a -20ºC. (Esquema 3.34) 146 Reeke, G. N. Jr.; Becker, J. W.; Cunningham, B. A.; Wang, J. L.; Yahara, I.; Edelman, G. M. Adv. Exp. Med. Biol. 1975, 55, 13. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 101 Esquema 3.34 Síntesis del disacárido 59. Tras la purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice, se aisló el compuesto 62 con un 82% de rendimiento. Este compuesto se analizó por espectrometría de masas. La distribución isotópica del pico era fundamental para corroborar la obtención del producto 62 debido a que su masa molecular coincide con la masa del producto de partida 26. En la figura 3.25 se muestra el espectro de masas ESI del producto 62 aislado, en la ampliación del pico [M+Na] + se observa una distribución isotópica que coincide con la presencia Br (isótopos 79 y 81 al 50%). Figura 3.25 Espectro de masas ESI del producto 62, ampliación de la distribución isotópica del pico [M+Na] + . Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 102 A continuación, se llevó a cabo la sustitución del átomo de bromo para obtener el derivado 62, usando azida sódica en DMF a 50ºC. La completa transformación se confirmó con el desplazamiento de la señal de 35 ppm a 50 ppm en el espectro de 13 C-RMN. Por último, el disacárido 63 se desprotegió completamente usando las condiciones de Zemplen con metóxido sódico en metanol, obteniéndose el derivado 59 deseado con un 90 % de rendimiento. Por otro lado, el dendrón de segunda generación de manosa 22 y el del disacárido 59 se prepararon siguiendo el procedimiento descrito en nuestro grupo de investigación, 83 modificado posteriormente en el grupo 81d . De forma resumida, en primer lugar, es necesario preparar el dendrón de 3 unidades de carbohidrato que se acoplará al núcleo de crecimiento 43 mediante reacción de CuAAC. (Esquema 3.35) Para ello, se preparó el núcleo de crecimiento 64 a partir del derivado 42 y el 2-cloroetil éter comercial, empleando las condiciones descritas en la bibliografía. El núcleo de crecimiento 64 se funcionalizó mediante reacción de acoplamiento CuAAC con los correspondientes carbohidratos modificados con un grupo azido (22 o 59). En este caso, la reacción de acoplamiento se llevó a cabo en presencia de CuSO 4 ⋅5H 2 O, ascorbato sódico y TBTA en una mezcla de DMSO/H 2 O (1:1) y bajo irradiación de microondas a 60ºC. Tras purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaños Sephadex LH20 en MeOH, se realizó la sustitución del cloruro por azida de los glicodendrones 65 y 66, usando azida sódica en DMF a 70ºC. De esta manera, tras purificación por cromatografía de exclusión por tamaños Sephadex LH20 en MeOH, se obtuvieron los glicodendrones trivalentes 67 y 68 listos para ser conjugados al núcleo de crecimiento 43, con un espaciador más largo en la posición focal que permite aumentar la separación entre los ligandos unidos al dendrón y el centro de conjugación en la posición focal. Se siguió la misma estrategia de acoplamiento CuAAC y condiciones de purificación para obtener los glicodendrones de nueve unidades 69 y 70. Finalmente, se sustituyó el átomo de cloro por un grupo azido, dando lugar a los glicodendrones 71 y 72. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 103 Esquema 3.35 Síntesis de los glicodendrones de segunda generación 71 y 72. Una vez obtenidos los glicodendrones de 3 unidades de disacárido 61, de 9 unidades de manosa 71 y de 9 unidades de disacárido 72, éstos se conjugaron con la fluoresceína-alquino comercial. Las condiciones de la reacción de acoplamiento CuAAC fueron exactamente las mismas que las utilizadas en la preparación del resto de compuestos fluorescentes, es decir, empleando CuBr (I) y TBTA. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 110 desprotegida, mientras que el resto de protones correspondientes a las posiciones protegidas aparecen a campo más bajo. (Figura 3.30) Figura 3.30 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 , 298 K) del monosacárido aceptor 80. Estos aceptores de glicosilo 79 y 80 fueron sometidos a reacciones de glicosidación, siguiendo el método de tioglicosidos y tricloroacetimidatos. Se utilizaron como donadores de glicosilo, la manosa perbenzoilada funcionalizada con un grupo triclorocetimidato en la posición anomérica, 83, el tiodisacárido 26, protegido con grupos benzoilo y el disacárido 27, funcionalizado con un grupo tricloroacetimidato en el extremo reductor. El donador de glicosilo 83 fue obtenido siguiendo la estrategia descrita en la bibliografía. 151 A partir de la manosa perbenzoilada 81, se desprotegió selectivamente la posición anomérica del monosacárido en presencia de acetato de hidracina en DMF a 60ºC. (Esquema 3.37) Tras purificar este intermedio 82 por cromatografía en columna de gel de sílice, se llevó a cabo la protección de su posición anomérica con tricloroacetonitrilo y DBU en diclorometano seco, obteniéndose el donador de glicosilo 83 en dos etapas de síntesis con un rendimiento global del 69%. 151 Lee, D. J.; Kowalczyk, R.; Muir, V. J.; Rendle, P. M.; Brimble, M. A. Carbohydr. Res. 2007, 342, 2628. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 111 Esquema 3.37 Síntesis del donador de glicosilo 83. A continuación, se llevó a cabo la reacción de glicosidación entre el aceptor de glicosilo 80 y el donador de glicosilo 83, en presencia de TMSOTf a 0ºC, (Esquema 3.38) obteniéndose el disacárido 84 con un rendimiento del 80% tras purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice. Esquema 3.38 Síntesis del disacárido 73. La desprotección de todos los grupos hidroxilo de este disacárido se llevó a cabo empleando las condiciones de Zemplen, dando lugar al producto 73 con un rendimiento del 94%. En el espectro de 1 H-RMN de 73 se observó únicamente dos señales de protones anoméricos, confirmando la formación del disacárido deseado. El compuesto también fue caracterizado mediante espectrometría de masas ESI. Posteriormente, se preparó el glicodendrón trivalente 86 del disacárido 73. Se utilizó como núcleo de crecimiento el compuesto 43 y las mismas condiciones de reacción empleadas para la formación de otros glicodendrones. (Esquema 3.39) De esta manera, se obtuvo el glicodendrón trivalente de disacáridos 85 con un rendimiento del 98%. Su estructura fue analizada por 1 H- RMN, observándose la aparición del protón del metino del triazol a 7.99 ppm. (Figura 3.31) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 112 Esquema 3.39 Síntesis del glicodendrón 86. Posteriormente, el átomo de cloro presente en la posición focal fue sustituido por un grupo azido, en presencia de azida sódica a 70ºC, obteniéndose el glicodendrón 86 de forma cuantitativa. Mediante 13 C-RMN, se observó la desaparición de la señal del metileno unido al átomo de cloro a 44.0 ppm y la aparición de una nueva señal a 51.6 ppm, que se corresponde con el metileno unido al grupo azido, confirmándose así la completa sustitución. En el grupo del profesor Nazario Martín, 147 llevaron a cabo la conjugación de los compuestos 73 y 86 sobre derivados de fullereno para la obtención de glicofullerenos con 12 y 36 unidades del disacárido Manα1,2Manα y tridecafullerenos con 120 y 360 unidades del mismo. (Figura 3.31) La capacidad que poseen estos sistemas para bloquear la entrada celular de los virus Zika (ZIKV) y Dengue (DENV) se evaluó en el grupo del doctor Rafael Delgado, del Hospital Universitario 12 de Octubre de Madrid. Para ello, utilizaron un modelo de células Jurkat que expresan el receptor DC-SIGN en su superficie y que fueron infectadas con los virus ZIKV y DENV. Todos los compuestos presentaron excelentes valores de inhibición, con valores de IC 50 en el rango nano- y picomolar. En concreto, el tridecafullereno con 360 unidades del disacárido presentaba un mayor poder inhibitorio para ambos virus, ZIKV (IC 50 = 67 pM, 95% CI= 39 pM-116 pM) y DENV (IC 50 = 35 pM, 95% CI= 18 pM-68 pM). Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 113 Figura 3.31 Estructura del tridecafullereno 87 decorado con 360 unidades del disacárido 73. A partir de estos resultados tan prometedores, se está evaluando la posibilidad de funcionalizar estos sistemas con oligosacáridos más complejos que puedan bloquear la entrada Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 114 de virus de una manera más efectiva. Se sabe que el brazo D1 del epítopo Man 9 (Manα1,2Manα1,2Manα) presenta una afinidad muy parecida a Man 9 por los receptores. Por ello, se llevó a cabo su síntesis mediante una reacción de glicosidación entre el monosacárido aceptor de glicosilo 80 y el disacárido donador de glicosilo 26. (Esquema 3.40) Para dicha reacción, se empleó NIS y TfOH, obteniéndose el trisacárido 88 con un rendimiento del 80% tras purificación por cromatografía en columna de gel de sílice. Bajo las condiciones de Zemplen, el producto se mantenía parcialmente protegido. Quizás esto fuera debido a la solubilidad parcial del compuesto de partida en MeOH. Por ello, fue necesario forzar las condiciones de reacción, calentando a 50ºC y añadiendo tolueno para disolver completamente el compuesto de partida. 152 De esta manera, se consiguió obtener el derivado 74 con un rendimiento del 96%. Esquema 3.40 Síntesis del trisacárido lineal 74. La estructura del compuesto 58 fue confirmada por RMN (Figura 3.32) y espectrometría de masas. 152 Amin, M. N.; Huang, W.; Mizanur, R. M.; Wang, L.-X. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 14404. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 115 Figura 3.32 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 , 298 K) del trisacárido 88. Del mismo modo, se preparó el otro bloque estructural del epítopo Man 9 , el pentasacárido Manα1,2Manα1,3(Manα1,2Manα1,6)Manα 75. Mediante la reacción de glicosidación tipo 2+1 entre el monosacárido aceptor de glicosilo 79 y el disacárido donador de glicosilo 27, se obtuvo el correspondiente pentasacárido 89. (Esquema 3.41) Cabe señalar que la reacción de glicosidación no funcionaba cuando se utilizaba como donador de glicosilo el tiodisacárido 26. Por tanto, fue necesaria la sustitución previa del grupo S-tolilo por el tricloroacetimidato, de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente. La reacción de glicosidación se llevó a cabo en presencia de 2.6 eq del donador de glicosilo 27 y TMSOTf, a -10ºC. En estas condiciones, se obtuvo el pentasacárido 89 con un rendimiento del 70%. A continuación, se procedió a desproteger el pentasacárido 89 en las mismas condiciones que el trisacárido lineal 88 a 50ºC, obteniéndose el pentasacárido 75 desprotegido de manera cuantitativa tras purificación mediante cromatografía por exclusión por tamaños Sephadex LH20 en MeOH. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 116 Esquema 3.41 Síntesis del pentasacárido 75. Las estructuras de los compuestos 89 y 75 fueron caracterizadas mediante RMN y espectrometría de masas. A partir del mismo monosacárido aceptor 79, se sintetizó el trisacárido ramificado Manα1,3(Manα1,6)Manα 90, mediante reacción de glicosidación 2+1 con el donador de glicosilo 83 y posterior reacción de desprotección de manera análoga a los compuestos anteriores, dando lugar al producto 76. (Esquema 3.42) La reacción de glicosidación se llevó a cabo en presencia de TMSOTf a -10ºC, obteniéndose el producto 90 con un rendimiento del 68% tras purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice. Los grupos hidroxilo del producto 90 se desprotegieron en presencia de NaOMe a 50ºC. Las estructuras de los compuestos 90 y 76 fueron confirmadas por RMN y espectrometría de masas. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 117 Esquema 3.42 Síntesis del trisacárido ramificado 76. Siguiendo esta estrategia de síntesis se pueden sintetizar otros oligosacáridos, como la oligomanosa ramificada Man 5 Manα1,3[Manα1,3(Manα1,3)Manα1,6]Manα. Esta estructura está presente en muchas glicoproteínas y se genera en el aparato de Golgi a partir de Man 9 GlcNAc 2 tras la acción de las manosidasas I, por lo que es reconocida por una gran variedad de receptores e interviene en numerosos procesos biológicos. 153 Asumiendo su importancia biológica, se planteó la síntesis del epítopo 77 siguiendo la misma aproximación sintética convergente a partir de tres bloques de construcción. (Esquema 3.43) Estos bloques corresponden con el monosacárido aceptor 25, el donador tiomonosacárido 91 y el trisacárido donador de glicosilo 92. 153 a) Bewley, C. A.; Clore, G. M. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6909. b) Briken, V.; Porcelli, S. A.; Besra, G. S.; Kremer, L. Mol. Microbiol. 2004, 53, 391. c) Ritchie, G.; Harvey, D. J.; Feldmann, F.; Stroeher, U.; Feldmann, H.; Royle, L.; Dwek, R. A.; Rudd, P. M. Virology 2010, 399, 257. d) Song, E.-H.; Osanya, A. O.; Petersen, C. A.; Pohl, N. L. B. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132,11428. e) Fuijimoto, Y. K.; Green, D. F. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 19639. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 3 118 Esquema 3.43 Análisis retrosintético de la preparación del epítopo Man 5 77. El epítopo Man 5 se preparó a partir del monosacárido aceptor de glicosilo 25 utilizado en la síntesis del epítopo Man 9 que presenta únicamente la posición 3 desprotegida. En primer lugar, se llevó a cabo la reacción de glicosidación con el donador de glicosilo 91. (Esquema 3.44) Una vez purificado el intermedio formado 93, mediante cromatografía en columna de gel de sílice, se eliminó el bencilidendacetal entre las posiciones 4 y 6 en condiciones ácidas, conduciendo al derivado 94 con un rendimiento del 83%. Por último, mediante una segunda reacción de glicosidación se formó el enlace α1,6 con el tiotrisacárido 92, en presencia nuevamente de NIS y TfOH. De nuevo, aunque hay dos posiciones libres susceptibles de ser glicosidadas, debido a la mayor reactividad del hidroxilo primario en 6 y el impedimento estérico de la posición 4, se glicosila exclusivamente en la posición 6. Tras purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice, se obtuvo el pentasacárido 95 con un rendimiento del 70%. El último paso Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Síntesis y presentación multivalente de oligomanosas. Estudios de afinidad con lectinas 119 consistió en la desprotección de los grupos hidroxilo con un exceso de MeONa en una mezcla MeOH/tolueno a 50ºC, durante 2 h. Tras purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaños Sephadex LH20 en MeOH se obtuvo el epítopo Man 5 (77) funcionalizado con un espaciador que posee en el punto focal un grupo azido, que permite su posterior conjugación a otras estructuras. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 216 glioblastoma multiforme. 260 El receptor Endo180 sirve para el diagnóstico del cáncer de mama en fase metastásica, ya que estudios con humanos revelan que los niveles de este receptor son mayores en pacientes que se encuentran en esta fase frente a aquellos que se encuentran en fases tempranas de la enfermedad. 261 La línea celular MDA-MB-231, de origen embriogénico, expresa alto niveles de Endo180. 253, 257 En contraste, las líneas celulares MCF7, T47D y MCF10A de morfología epiteloide con uniones intercelulares fuertes, no lo expresan. Sin duda, los nanogeles funcionalizados con ligandos que pueden ser reconocidos por el receptor Endo180 pueden constituir una excelente estrategia para el transporte activo de fármacos antitumorales hacia células tumorales que sobreexpresan este receptor. En primer lugar, se evaluó la diferencia en los niveles de sobreexpresión del receptor de manosa Endo180 en células mamarias tumorales y no tumorales. Para ello, se eligieron las células mamarias tumorales 4T1, MDA-MB-231 y MCF7 y no tumorales MCF10A. Tras extraer las proteínas de cada una de las muestras de células, las proteínas fueron separadas mediante electroforesis en gel. Posteriormente, fueron transferidas a una membrana de PVDF e incubadas con el anticuerpo primario de Endo180 (sc-271148), capaz de unirse al fragmento peptídico que incluye los aminoácidos 1051-1350 del dominio extracelular de Endo180. A continuación, se incubó la membrana con un anticuerpo secundario marcado, capaz de reconocer el anticuerpo primario de ratón. Por último, se incubó la membrana con el sistema electroquimioluminiscente ECL, uno de los métodos más usados en Western-Blots. La luz emitida se capturó en una película fotográfica donde se pudo apreciar la diferencia en la expresión de Endo180 de las líneas celulares estudiadas. En la figura 6.4, se observa únicamente una mancha que coincide con la masa molecular del receptor Endo180 en la línea correspondiente con las células mamarias tumorales de tipo MDA-MB-231. 260 Huijbers, I. J.; Iravani, M.; Popov, S.; Robertson, D.; Al-Sarraj, S.; Jones, C.; Isacke, C. M. PLoS One 2010, 5, e9808. 261 Palmieri, C.; Caley, M. P.; Purshouse, K.; Fonseca, A.-V.; Rodriguez-Teja, M.; Kogianni, G.; Woodley, L.; Odendaal, J.; Elliott, K.; Waxman, J.; Sturge, J. Br. J. Cancer 2013, 108, 163. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 217 Figura 6.4 Análisis de Western Blot de la expresión de Endo180 en las células 4T1, MDA-MB-231, MCF7 y MCF10A. Como control se utilizó tubulina, para confirmar que la cantidad de proteína cargada en el gel en cada línea era similar. Además, de esta manera se comprobó que la eficacia de la transferencia del gel a la membrana y la incubación de los anticuerpos en las diferentes líneas eran correctas. Para cargar la misma concentración de proteínas, previamente se midió esta concentración al extraer las proteínas de las muestras de células mediante el método Brandford. La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la unión del colorante Azul de Coomassie G-250 a la proteína, comparando esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar BSA. 262 El colorante libre existe en cuatro formas iónicas. La forma azul más aniónica se une a proteínas y absorbe a 595 nm. (Figura 6.5) La concentración de proteínas puede ser evaluada determinando la cantidad de colorante en su forma iónica azul y midiendo la absorbancia de la solución a 595 nm utilizando un espectrofotómetro. El colorante se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina. 262 Kruger N. Methods Mol. Biol. 1994, 32, 9. 4T1 MCF7 MCF10A MDA-MB-231 Endo180 Tubulina 225 KDa 150 KDa 52 KDa Marcador Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 218 Figura 6.5 Estructura del colorante Azul de Coomassie G-250. Representando la absorbancia frente a la concentración de proteínas, se construye la correspondiente recta de calibrado de la proteína estándar (BSA). Con la ecuación de la recta de calibrado obtenida para muestras de BSA, se pudo calcular la concentración de proteínas en una determinada muestra al medir su absorbancia a 595 nm. De esta manera se obtuvo la concentración de cada una de las muestras de proteínas a partir del valor de absorbancia. (Figura 6.6) Para llevar a cabo el análisis por Western-Blot, se tomó el volumen necesario para que la concentración de proteína a medir fuese la misma (1.33 mg/mL). Figura 6.6 Recta de calibrado de BSA. Teniendo en cuenta la relación de intensidad del receptor Endo180 frente a la intensidad de tubulina (Figura 6.4) en cada una de las líneas celulares, se pudo evaluar la expresión de este Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 219 receptor. El mayor valor de intensidad se obtuvo en el caso de las células MDA-MB-231, indicativo de una mayor expresión de este receptor en esta línea. (Figura 6.7) Figura 6.7 Expresión del receptor Endo180 en las líneas celulares 4T1, MDA-MB-231, MCF7 y MCF10A. A partir de estos resultados, se planteó la posibilidad de dirigir selectivamente hacia las células mamarias tumorales MDA-MB-231 agentes terapéuticos, empleando para ello, sistemas funcionalizados con ligandos selectivos de Endo180 que poseen unidades de manosa. Tras el reconocimiento del sistema por este receptor, tendría lugar la internalización del sistema, lo que permitiría la liberación intracelular de los fármacos contenidos en el sistema. Para comprobar la selectividad de los sistemas de manosa por este tipo células tumorales, se utilizó como control células mamarias no tumorales MCF10A. 6.3.2 Construcción de gliconanogeles capaces de interaccionar con el receptor Endo180 Teniendo en cuenta las propiedades excelentes que presentan los nanogeles para el transporte y liberación de fármacos, se decidió usar los nanogeles de manosa para este fin. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 4T1 MDA-MB-231 MCF7 MCF10A Intensidad 4T1 MDA-MB-231 MCF7 MCF10A Intensidad Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 220 Como control, teniendo en cuenta la complejidad de las células tumorales que presentan numerosos receptores en su superficie, se decidió construir nanogeles sin carbohidratos, empleando solamente unidades de etilenglicol como ligando. Antes de preparar los nanogeles, se llevó a cabo la funcionalización del polímero, tal y como se realizó con las unidades sacarídicas. Mediante CuAAC se unió la molécula 2-[2-(2-azidoetoxi)etoxi]etanol disponible comercialmente. De esta manera, se mantiene el triazol en la cadena polimérica, y la única diferencia con el polímero empleado para la preparación de los gliconanogeles de manosa es la ausencia de carbohidratos. (Esquema 6.1) Esquema 6.1 Preparación del polímero control 125. Tras 48 h de reacción en presencia de CuSO 4 y NaAsc, el cobre presente en el medio de reacción se eliminó por adición de la resina QuadraSil ® MP. A continuación, se purificó mediante cromatografía en columna por exclusión por tamaños Sephadex LH20 en MeOH. En el espectro de 1 H-RMN del polímero control 125 puede observarse la aparición de un singlete a 7.87 ppm que se corresponde con el protón del metino del triazol formado tras la reacción CuAAC entre el alquino del derivado 105 y la azida de la molécula 2-[2-(2- azidoetoxi)etoxi]etanol. (Figura 6.8) También aparece la señal correspondiente a los protones del metileno unido al átomo de nitrógeno del triazol (OCH 2 CH 2 Ntriazol) como multiplete a 4.60 ppm. Por otro lado, se observa un desplazamiento de la señal de los protones en α al grupo alquino, ahora triazol, desde 1.94 ppm hasta 2.75 ppm. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 221 Figura 6.8 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, D 2 O, 298 K) del polímero 125. En el espectro de 13 C-RMN del derivado 125, se observó la aparición de la señal de carbono del metino del triazol (126.4 ppm), la señal de los carbonos correspondiente a los metilenos unidos en α al triazol (o, 52.5 ppm y c, 26.7 ppm), así como la desaparición de la señal del carbono del metileno en α al tripe enlace (17.9 ppm). (Figura 6.9) ao m l m c d e Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 222 Figura 6.9 Espectro de 13 C-RMN (100 MHz, D 2 O, 298 K) del polímero 125. Con el objetivo de llevar a cabo diferentes estudios biológicos, se prepararon los diferentes nanogeles a una escala mayor que la descrita anteriormente (10 veces mayor). En este caso, no fue necesario modificar las condiciones de preparación, simplemente se escalaron los tiempos y las cantidades de los reactivos y disolventes. Mediante polimerización de radicales libres en miniemulsión inversa se obtuvieron el nanogel funcionalizado con manosa 126 y el nanogel control 127. (Esquema 6.2) Esquema 6.2 Preparación del nanogel control 127. Las medidas de DLS demostraron que no había diferencias significativas en el tamaño de los nanogeles sintetizados a mayor escala. (Figura 6.10) El tamaño del nanogel de manosa 126 era 130.1±0.7 nm y el tamaño del nanogel control 127 era 117.2±0.7 nm fc de k m l a o i h Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 223 Figura 6.10 Histogramas de DLS de los nanogeles: a) 126 y b) 127. 6.3.3 Evaluación de la citotoxicidad de los gliconanogeles En primer lugar, se evaluó la concentración a la que estos sistemas son citotóxicos con células mamarias tumorales (MDA-MB-231) y no tumorales (MCF10A). El método MTS es un método colorimétrico utilizado para medir la viabilidad celular, la proliferación celular y la citotoxicidad in vitro. 263 Consiste en la reducción enzimática del 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2- (4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) en presencia de metosulfato de fenazina (PMS, del inglés phenazine methosulfate) a formazán, soluble en agua. (Esquema 6.3) Este proceso está catalizado por enzimas deshidrogenasas, como el fosfato del dinucleótido de nicotinamida-adenina (NADPH) presente en las células metabólicamente activas. Cuando se produce dicha reacción, se produce un cambio colorimétrico, pasando de amarillo a morado. El producto formazán se analiza espectroscópicamente a 490 nm. La cantidad de formazán generado es proporcional al número de células y al tiempo de incubación de las mismas. 263 Cory, A. H.; Owen, T. C.; Barltrop, J. A.; Cory, J. G. Cancer Commun. 1991, 3, 207. Intensidad (%) 4 12 10 1000 Diámetro (nm) 100 a) b) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 224 Esquema 6.3 Reducción enzimática de MTS. El ensayo MTS se utilizó para evaluar el efecto de los nanogeles de manosa y control en las células MDA-MB-231 y MCF10A. La supervivencia de las células se midió tras 72 h de tratamiento con disoluciones de los nanogeles 126 y 127 a diferentes concentraciones, añadiendo una disolución MTS/PMS (20:1) e incubando durante 3 h más. De esta manera, se comprobó que el nanogel de manosa 126, respecto al nanogel control 127, presentaba menor toxicidad frente a las células MDA-MB-231. Se observaron valores bajos de viabilidad celular para el nanogel de manosa 126 a 1 mg/mL y para el nanogel control 127 a 0.5 mg/mL. (Figura 6.11) Sin embargo, valores inferiores de nanogel no presentaban citotoxicidad en esta línea celular. Figura 6.11 Viabilidad de las células MDA-MB-231 en presencia del nanogel: a) 126 y b) 127. Por otro lado, el nanogel de manosa 126 presentan niveles tóxicos en las células mamarias MCF10A a concentraciones superiores a 0.3 mg/mL, mientras que en el caso de el nanogel control 127 se observaba toxicidad a concentraciones superiores a 0.15 mg/mL. (Figura 6.12) 0 20 40 60 80 100 120 0 0,05 0,1 0,25 0,5 Viabilidad celular (%) [127] (mg/ml) 0 20 40 60 80 100 120 0 0,1 0,25 0,5 1 3 Viabilidad celular (%) [126] (mg/ml) a) b) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 225 Figura 6.12 Viabilidad de las células MCF10A en presencia del nanogel: a) 126 y b) 127. Conocido el intervalo en el que los nanogeles son inocuos para este tipo de células se plantearon el resto de estudios biológicos. 6.3.4 Evaluación de la capacidad de internalización de los gliconanogeles en células mamarias Para estudiar el proceso de internalización, es necesario que los nanogeles estén marcados de alguna forma, como por ejemplo con agentes fluorescentes. Se utilizó para ello, el marcador fluorescente Oregon-Green (OG), cuya longitud de onda máxima de excitación se encuentra en 492 nm, mientras que su longitud de onda máxima de emisión corresponde a 524 nm (zona verde del espectro visible), próximas a la fluoresceína. Sin embargo, la forma monoaniónica de la fluoresceína aparece a un pKa relativamente alto de 6.5, lo que hace que este fluoróforo sea mucho menos fluorescente en disoluciones ácidas. Además, la fluorescencia de la fluoresceína varía con el pH y es relativamente susceptible al foto-blanqueo, que involucra reacciones con oxígeno molecular y reacciones inducidas. El OG es el derivado 2',7'-difluoro de la fluoresceína, menos sensible al pH. Los átomos de flúor agregados reducen el pKa de este fluoróforo a 4.8, mejorando sustancialmente la fluorescencia a pH bajo. Este compuesto también es significativamente más fotoestable que la fluoresceína, por lo que es idóneo para aplicaciones como citometría de flujo o confocal. 264 En primer lugar, se conjugó el marcador fluorescente al polímero, formándose un enlace amida. Para facilitar esta reacción se utilizó un derivado de OG, disponible comercialmente, que posee un grupo éster activado en forma de N- hidroxisuccinimida 128. La reacción se llevó a 264 Mottram, L.; Boonyarattanakalin, S.; Kovel, R. E.; Peterson, B. R. Org. Lett. 2006, 8, 581. 0 20 40 60 80 100 120 0 0,025 0,05 0,075 0,15 0,3 0,5 Viabilidad celular (%) [126] (mg/ml) 0 20 40 60 80 100 120 0 0,025 0,05 0,075 0,15 0,3 Viabilidad celular (%) [127] (mg/ml) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 232 Tabla 6.2 Porcentaje de células vivas MDA-MB-231 y que emiten en la zona verde tras el tratamiento con los nanogeles 132 y 133. Células mamarias tumorales MDA-MB-231 Nanogel Viabilidad celular Células marcadas 132 90.9% 43.2% 133 86.6% 3.8% Tabla 6.3 Porcentaje de células vivas MCF10A y que emiten en la zona verde tras el tratamiento con los nanogeles 132 y 133. Células mamarias no tumorales MCF10A Nanogel Viabilidad celular Células marcadas 132 72.2% 3.5% 133 41.2% 9.3% Atendiendo a los porcentajes de células vivas que emiten en la zona verde, se observó que el nanogel de manosa 132 marcado fluorescentemente internalizaba en casi el 50% de células mamarias tumorales vivas. Sin embargo, el nanogel control 133, que no posee unidades de manosa en su superficie, no fue capaz de internalizarse de forma efectiva en estas células tumorales. Este hecho puso de manifiesto que el nanogel 132 fue capaz de internalizarse en las células tumorales MDA-MB-231 vía receptor Endo180. Como era de esperar, el nanogel de manosa 132 no fue internalizado por las células no tumorales MCF10A, ya que este tipo de células no presentan receptores específicos de manosa. Además, los porcentajes de viabilidad concuerdan con los resultados obtenidos en los experimentos MTS realizados, siendo la viabilidad celular menor para las células no tumorales en presencia de 0.5 mg/mL del nanogel control 133. Los bajos porcentajes de internalización mostrados en las tablas para las células MCF10A y para las células MDA-MB-231 (tras el tratamiento con el nanogel 133, se deben a la zona seleccionada en el gráfico dot-plot). 6.3.5 Aumento de la multivalencia del gliconanogel de manosa Teniendo en cuenta los resultados de afinidad de los nanogeles con la ConA descritos en el capítulo 5, se decidió aumentar la multivalencia del sistema utilizando glicodendrones para Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 233 conjugar al polímero que forma el gliconanogel. De esta manera, se pretende mejorar la internalización de los nanogeles en las células tumorales. Para ello, se decidió preparar como vehículos para el transporte de fármacos antitumorales, el nanogel del dendrón de 9 unidades de manosa. En primer lugar, antes de preparar el sistema más complejo conjugado al fármaco, se decidió evaluar el proceso de internalización con el nanogel marcado fluorescentemente 134 que presenta solamente el glicodendrón de 9 unidades de manosa. El nanogel 134 se preparó siguiendo el mismo procedimiento utilizado para el nanogel de manosa 132 pero empleando 25% en moles del polímero 131 funcionalizado con el marcador fluorescente, con el objetivo de aumentar la proporción de OG en el nanogel. (Esquema 6.6) Esquema 6.6 Preparación del nanogel funcionalizado con el glicodendrón de 9 manosas 134 marcado fluorescentemente con OG. Así, se consiguió aumentar el grado de marcaje del nanogel en masa a 0.36% (calculado con la recta de calibrado Figura 6.13). Mediante el método del ácido sulfúrico UV, se calculó el porcentaje del ligando 71 en el nanogel 134, siendo del 8.6% en masa. Al igual que para el resto de nanogeles, se determinó el tamaño del nanogel 134 por DLS (102.0±2.3 nm). (Figura 6.17) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 234 Figura 6.17 Histrograma de DLS del nanogel 134 del glicodendrón de 9 manosas marcado fluorescentemente. Con el nanogel 134, se están llevando a cabo actualmente los estudios de internalización en células MDA-MB-231 y células MCF10A. Para la obtención del PEG funcionalizado con el OG, se cambió el orden de etapas, introduciendo al final el marcador fluorescente para evitar que pueda sufrir transformaciones durante la funcionalización del otro extremo del polímero. A partir del polímero ya funcionalizado con el grupo acrilato 136 con un grupo amino libre, se llevó a cabo la reacción con el marcador fluorescente OG (128). (Esquema 6.7) Esquema 6.7 Preparación del polímero 131. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 235 Se hizo reaccionar el polímero 106 con cloruro de acriloilo, en presencia de Et 3 N a temperatura ambiente durante una noche. Tras purificar el intermedio 135 mediante cromatografía de exclusión por tamaño Sephadex LH20 en MeOH, se obtuvo el producto de manera cuantitativa. En el espectro de 1 H-RMN, se observó la aparición de las señales de los protones del doble enlace CH-CH 2 de la acrilamida formada (a campo bajo). (Figura 6.18) La integral de estas señales respecto a la integral de la señal singlete de los protones de los metilos del grupo Boc y al multiplete que corresponde con los protones del metileno unido al grupo amino unido a su vez al grupo protector Boc, guarda la relación esperada, demostrándose la completa funcionalización del grupo amino libre del polímero de partida. Además, se observó una nueva señal ancha a 6.71 ppm del protón unido al nitrógeno de la amida formada. Figura 6.18 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 , 298 K) del polímero 135. En el espectro de 13 C-RMN, se observaron las señales de los carbonos del doble enlace C-C, a 131.0 ppm y 125.9 ppm. El carbono del metileno en α al grupo amino del polímero previamente se encontraba a 41.7, al formarse la correspondiente amida, el desplazamiento del carbono metilénico se mueve a 39.2 ppm. a a b j g d f Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 236 A continuación, el intermedio 135 fue tratado con TFA en DCM para desproteger el grupo amino. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 h, no observándose reacciones colaterales ni polimerizaciones en medio ácido. Tras purificación mediante cromatografía mediante exclusión por tamaños Sephadex LH20 en MeOH el compuesto 136 se obtuvo de manera cuantitativa. En el espectro de 1 H-RMN, se observó la desaparición de la señal singlete de los metilos del grupo Boc y de la señal ancha correspondiente al protón del grupo carbamato (5.05 ppm). A campo más bajo apareció una nueva señal ancha cuya integral coincidía con 3 protones, que corresponden con los protones del grupo amonio generado en la reacción. En el espectro de 13 C-RMN del compuesto 136, el cambio más significativo que se observó respecto al espectro de 13 C-RMN del producto 135, fue la desaparición de las señales de carbono a 28.3 ppm y a 156.0 ppm, correspondientes al carbono del metilo y al carbono cuaternario del grupo Boc, respectivamente. (Figura 6.19) Figura 6.19 Espectros de 13 C-RMN (100 MHz, CDCl 3 , 298 K) de los intermedios 135 y 136 cb aef j ch aef b Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 237 Por último, se hizo reaccionar el grupo amino del polímero 136 con el éster activado presente en la molécula del marcador fluorescente comercial 128, en presencia de Et 3 N, en DMF anhidra. Tras una noche de reacción, se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaños LH-20 en MeOH para eliminar el ligero exceso añadido del compuesto 128, obteniéndose el producto 131 de manera cuantitativa. En el espectro de 1 H-RMN del producto aislado, se observó la desaparición de la señal del metileno unido al grupo amonio libre del polímero precursor 136 y la aparición de las señales de los 7 protones aromáticos de la molécula de OG en la zona del espectro comprendida entre 8.46 ppm y 6.30 ppm. (Figura 6.20) Figura 6.20 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 , 298 K) del producto 131. Del mismo modo, en el espectro de 13 C-RMN se observó la aparición de los carbonos de los metinos de los anillos aromáticos de la fluoresceína a campo bajo. Además, se determinó el valor de la absorbancia de una disolución de concentración 0.05 mg/mL (1.49 10 -5 M) de 131 a 492 nm. De acuerdo con la ecuación de la recta construida a diferentes concentraciones de OG comercial (similar a la recta de calibrado de la Figura 6.13), se calculó la concentración de OG en dicha disolución del polímero 131, obteniéndose un valor similar en mol/L de OG. De esta manera, se demostró que el polímero 131 estaba completamente funcionalizado con OG. a a b dg Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 238 6.3.6 Conjugación del fármaco paclitaxel Una vez estudiado el proceso de internalización, se analizará la capacidad de los gliconanogeles en el transporte de fármacos. Como agente antitumoral se ha elegido el paclitaxel (PTX, 137), capaz de promover la unión de microtúbulos e inhibir la despolimerización de los mismos (IC 50 = 4nM), 266 (Figura 6.21) inhibiendo la mitosis y la proliferación celular. Este fármaco presenta una gran actividad antitumoral frente al cáncer de ovario, de mama y pulmonar. 267 Figura 6.21 Estructura del PTX (137). El PTX presenta una baja solubilidad en agua, por lo que se suele formular como una disolución concentrada de Cremophor EL y etanol. 268 Desafortunadamente, el Cremophor es un aceite de ricino polioxietilado con numerosos efectos colaterales, como hipersensibilidad y 266 a) Schiff, P. B.; Fant, J.; Horwitz, S. B. Nature 1979, 277, 665. b) Singla, A. K.; Garg, A.; Aggarwal, D. Int. J. Pharm. 2002, 235, 179. c) Jiang, P.; Mukthavaram, R.; Mukthavavam, R.; Chao, Y.; Bharati, I. S.; Fogal,V.; Pastorino, S.; Cong, X.; Nomura, N.; Gallagher, M.; Abbasi, T.; Vali, S.; Pingle, S. C.; Makale, M.; Kesari, S. J. Transl. Med. 2014, 12, 13. 267 a) McGuire, W. P.; Rowinsky, E. K.; Rosenshein, N. B.; Grumbine, F. C.; Ettinger, D. S.; Armstromg, D. K.; Donehover, R. C. Ann. Intern. Med. 1989, 111, 273. b) Nicolaou, K. C.; Yang, Z.; Liu, J. J.; Ueno, H.; Nantermet, P. C.; Guy, R. K.; Claiborne, C. F.; Renaud, J.; Couladouros, E. A.; Paulvannan, K.; Sorensen, E. J. Nature 1994, 367, 630. c) Spencer, C. M.; Faulds, D. Drugs 1994, 48, 794. d) Crown, J.; O’Leary, M. Lancet 2000, 355, 1176. 268 Weiss, R. B.; Donehower, R. V.; Wiernik, P. H.; Ohnuma, T.; Gralla, R. J.; Trump, D. L.; Baker, J. R.; Van Echo, D. A.; Von Hoff, D. D.; Leyland-Joness, B. J. Clin. Oncol. 1991, 9, 1261. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 239 neurotoxicidad. 269 Además, como el resto de agentes antitumorales, el PTX presenta una falta de selectividad hacia las células tumorales dando lugar a severos efectos secundarios. 270 Por ello, encontrar métodos para vehiculizar selectivamente este fármaco es un tema de gran interés. Para conjugar el fármaco al polímero, se decidió utilizar enlaces que no fueran sensibles a las enzimas hidrolíticas o esterasas, para que dicho fármaco puediera alcanzar los compartimentos intracelulares. El objetivo es conseguir que la liberación del fármaco se produzca en el medio ácido de los endosomas o lisosomas, una vez que el nanogel se haya internalizado en las células diana, impidiendo que se hidrolice a pH fisiológico. Para alcanzar este objetivo, una de las opciones es la formación de enlaces hidrazona entre el polímero y el fármaco. Para ello, se utilizó el método descrito por Willner y col. 271 para conjugar el agente antitumoral DOX a anticuerpos monoclonales mAb (del inglés monoclonal antibodies). Posteriormente, este método fue empleado por Rodrigues y col. 272 para conjugar PEG y PTX. El método consiste en la introducción de un espaciador en la molécula de PTX provisto de una maleimida y del enlace hidrazona. A continuación, se conjuga con el polímero mediante la reacción entre la maleimida y el grupo tiol existentes en el polímero. En nuestro caso, siguiendo este método se propuso la conjugación de PTX al PEG tal y como se encuentra recogido en el Esquema 6.8. 269 Brown, T.; Havlin, K.; Cagnola, J.; Koeller, J.; Kuhn, J.; Rizzo, J.; Craig, J.; Philips, J.; Von Hoff, D. J. Clin. Oncol. 1991, 9, 1261. 270 McGuire, W. P.; Rowinsky, E. K. Paclitaxel in Cancer Treatment. Marcel Dekker. Bethesda, MD, 1995. 271 Willner, D.; Trail, P. A.; Hofstead, S. J.; King, H. D.; Lasch, S. J.; Braslawsky, G. R.; Greenfield, R. S.; Kaneko, T.; Firestone, R. A. Bioconjugate Chem. 1993, 4, 521. 272 Rodrigues, P. C. A.; Scheuermann, K.; Stockmar, C.; Maier, G.; Fiebig, H. H.; Unger, C.; Mülhaupt, R.; Kratz, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 355. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 240 Esquema 6.8 Análisis retrosíntetico de la preparación de PEG-PTX (138). Para obtener el derivado 139, fue necesaria la sustitución del alcohol alifático secundario presente en la estructura de PTX. (Esquema 6.9) A pesar de que en la molécula de PTX existe una cetona que puede dar lugar a una hidrazona, ésta se encuentra impedida estéricamente. Por ello, fue necesario introducir una cetona mediante tratamiento con un ligero exceso del cloruro del ácido 4-acetilbenzoico (141), en presencia de Et 3 N y diclorometano como disolvente anhidro. La reacción transcurrió a temperatura ambiente durante toda la noche para asegurar la completa funcionalización. Tras purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice, se obtuvo el intermedio 142 con un rendimiento del 91%. 272 A continuación, el producto 142 se hizo reaccionar con un exceso del espaciador 143 que posee la sal de hidrazonio y la maleimida en la misma estructura. 252 Tras una noche de reacción a temperatura ambiente, se formó un precipitado que correspondía con el derivado de PTX 139 sustituido con la maleimida y que contenía la hidrazona en su estructura. Tras lavados con Et 2 O, se obtuvo un sólido blanquecino con un rendimiento del 95%. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 241 Esquema 6.9 Síntesis del derivado de PTX-maleimida 139. En el espectro de masas ESI del producto 139, se observa la señal correspondiente a los iones [M+Na] + : m/z 1229.37 y [M+K] + : m/z 1245.31. (Figura 6.22) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 248 Figura 6.25 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, DMSO-d 6 , 298 K) del producto obtenido 138 no funcionalizado completamente. Teniendo en cuenta los problemas observados a la hora de acoplar la maleimida y el tiol, se decidió cambiar la estrategia. Se decidió utilizar un espaciador funcionalizado con un grupo azido, para llevar a cabo la reacción de acoplamiento, tal y como se había llevado a cabo con los azúcares. Una de las posibles razones que podría explicar por qué la reacción no se completaba, podría ser la inestabilidad de la hidrazona formada o bien las posibles reacciones intramoleculares que pudieran darse. Por ello, se creyó conveniente utilizar otra sal de Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 249 hidrazonio, para la formación del conjugado PEG-PTX. En concreto, se eligió como producto de partida para preparar la sal de hidrazonio, el ácido 4-azidobenzoico (152). De esta forma, la nueva hidrazona se encontraría estabilizada por resonancia. (Esquema 6.13) Esquema 6.13 Síntesis del conjugado PEG-PTX 156. En primer lugar, el ácido 4-azido benzoico (152) se preparó a partir del 4-aminobenzoico (151) siguiendo el procedimiento descrito en la bibliografía, que consistía en la adición del catión nitrosilo al carbono unido al grupo amino del anillo, formándose el correspondiente Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 250 catión arilo. 273 Tras la adición de azida sódica se forma un aducto entre el núcleo y el ión diazonio y posteriormente se elimina el nitrógeno, dando lugar al compuesto 152. A continuación, se llevó a cabo la introducción de la hidracina en este anillo mediante reacción con carbazato de tert-butilo (147), en presencia de EDCI. 274 Se comprobó que usando DCC y NHS, la reacción no evolucionaba hacia la formación de la hidracina deseada, se quedaba en forma del éster de la N-hidroxisuccinimida (2,5-dioxopirrolidin-1-il 4-azidobenzoato). El acoplamiento con el polímero 105 se llevó a cabo mediante reacción CuAAC siguiendo las condiciones habituales, en una mezcla de disolventes t BuOH y agua (1:1), siendo la concentración del polímero 105 0.05 M, a temperatura ambiente durante 48 h. A continuación, los restos de cobre se eliminaron por adición de la resina QuadraSil ® MP y el compuesto se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaños Sephadex LH-20 en MeOH. Se confirmó la completa funcionalización por RMN. En el espectro de 1 H-RMN se observó la aparición de la señal del protón del metino del triazol (7.95 ppm), las señales aromáticas del anillo (sistema AB) y el singlete de los protones de los metilos del grupo Boc (1.50 ppm), correspondientes al compuesto 154. (Figura 6.26) La relación de las integrales de las señales nuevas estaba en concordancia con las integrales de las señales del polímero 105, como las señales de los protones del doble enlace C-C del grupo acrilato. Además, se observó el desplazamiento de la señal de los protones del metileno unido al alquino, ahora triazol desde 1.94 ppm hasta 2.86 ppm. 273 Raiguel, S.; Thomas, J.; Binnemans, K.; Dehaen, W. Eur. J. Org. Chem. 2018, 4850. 274 Braslau, R.; Anderson, M. O.; Rivera, F.; Jimenez, A.; Haddad, T.; Axon, J. R. Tetrahedron 2002, 58, 5513. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 251 Figura 6.26 Espectro de 1 H-RMN (400MHz, CDCl 3 , 298 K) del derivado 154. Así mismo, en el espectro de 13 C-RMN del producto 154 se observó la aparición de las señales de los carbonos aromáticos, así como el carbono del carbonilo del carbamato, en la zona del espectro comprendida entre 172.6 ppm y 119.3 ppm y los carbonos de los metilos del grupo protector Boc (28.2 ppm). A continuación, la hidracina del polímero 154 se desprotegió en presencia de TFA durante 1h de reacción. Transcurrido este tiempo, se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaños Sephadex LH20 en MeOH, obteniendose el producto 155 cuantitativamente. La completa eliminación del grupo protector se confirmó por 1 H-RMN, ya que se observó la desaparición de la señal de los protones de los metilos del grupo protector Boc y el desplazamiento de la señal del protón del grupo amino unido al grupo protector que ahora se encuentra en forma de amonio. Del mismo modo, en el espectro de 13 C-RMN del intermedio 155 se observó la desaparición de la señal de los carbonos de los metilos a 30 ppm. Por último, con el objetivo de formar la correspondiente hidrazona, se hizo reaccionar el derivado 155 que presenta la sal de hidrazonio con un ligero exceso del derivado de PTX 142, en EtOH durante a a b w m k j io p d g Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 252 dos días. Tras purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaños Sephadex LH-20 en MeOH, se analizó por 1 H-RMN el grado de funcionalización del polímero 156, estudiando nuevamente la integral de las señales mencionadas anteriormente. La primera vez que se llevó a cabo esta reacción se consiguió funcionalizar un 84% el polímero 156. (Figura 6.27) A pesar de que se han empleado exactamente las mismas condiciones de reacción, sin alterar ninguna condición, no se ha podido reproducir este resultado. Figura 6.27 Espectro de 1 H-RMN (400 MHz, DMSO-d 6 , 298 K) del producto 156 funcionalizado al 84% con PTX. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Evaluación de la capacidad de los gliconanogeles para internalizar en células tumorales 253 Cuando la funcionalización del polímero 156 no era completa, se optaba por poner de nuevo la reacción, añadiendo mayor número de equivalentes del derivado 142 pero esto no producía ningún cambio en la proporción de PTX en el polímero. Por ello, se probó partir de mayor proporción de PTX, sin observar nuevamente la funcionalización completa del polímero 156. Se probó añadir TFA como catalizador de la reacción, e incluso, ácidos de Lewis, como CeCl 3 7H 2 O, sin observar la funcionalización completa. También, se partió de la correspondiente hidrazida, no observándose que la reacción funcionase. Incluso se cambió de disolvente, usando MeOH anhidro, sin mejoras en el grado de funcionalización. Actualmente, se están llevando a cabo nuevas aproximaciones para la conjugación del polímero con el fármaco PTX. Una vez que se consiga dicho polímero junto con el glicopolímero de dendrón de 9 manosas se formará el correspodiente gliconanogel con PTX incorporado de manera covalente. Este nanogel será estudiado como transportador de PTX en células tumorales que sobreeexpresan el receptor Endo180, es decir, las células mamarias tumorales MDA-MB-231. De esta manera, se pretenden reducir los efectos secundarios de la quimioterapia, como problemas neurotóxicos y aumentar la eficacia terapéutica del PTX. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 6 254 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc CAPÍTULO 7 CONCLUSIONES Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Conclusiones 255 • Se ha preparado el epítopo Man 9 con configuración α en el extremo reductor funcionalizado con espaciadores de diferente longitud, siguiendo una estrategia convergente, tal y como ha descrito recientemente nuestro grupo de investigación. Se han sintetizado los derivados con configuración α para reducir el esfuerzo sintético que supone obtener el otro anómero. La ruta sintética empleada permite obtener de forma eficiente, en pocos pasos de síntesis y con un elevado ahorro económico el ligando Man 9 . • Se ha seguido una estrategia sintética convergente para preparar dendrones trivalentes que presentan ligandos Man 9 con diferente configuración en el extremo reductor. Para ello, se ha llevado a cabo el acoplamiento entre un núcleo que presenta tres grupos alquinos y los correspondientes ligandos desprotegidos, funcionalizados en su extremo reductor con espaciadores de diferente longitud que presentan grupos azida, obteniéndose las correspondientes estructuras dendríticas con buenos rendimientos. • Se han llevado a cabo experimentos de afinidad entre DC-SIGN ECD y los ligandos con diferente configuración en el extremo reductor, así como sus correspondientes dendrones, usando la técnica de polarización de fluorescencia. En estos experimentos, se ha demostrado que la configuración del extremo reductor del epítopo Man 9 no influye en la afinidad por el receptor DC-SIGN, implicado en numerosos procesos de infección e inmunológicos. Además, los resultados indican que la afinidad relativa de la interacción con estas estructuras está en el rango bajo micromolar y los valores de afinidad obtenidos con las estructuras dendríticas son muy superiores a los mostrados para los ligandos monovalentes. • Se ha estudiado la afinidad que presentan ligandos dendríticos de manosa y del disacárido Manα1,2Man, ampliamente utilizados en nuestro grupo de investigación, por la lectina ConA, mediante polarización de fluorescencia. En comparación con el ligando natural Man 9 , el dendrón que presenta 9 unidades de manosa y el dendrón de 3 unidades del disacárido muestran valores de K D similares. Del mismo modo, los valores de afinidad del glicodendrón de 9 unidades del disacárido y del glicodendrón trivalente de Man 9 por ConA demuestran que no es necesario la preparación de los ligandos oligosacáridicos complejos como el Man 9 , pudiéndose utilizar ligandos de menor complejidad desde el punto sintético para interaccionar de forma efectiva con esta lectina. • Se ha empleado el método convergente puesto a punto en nuestro grupo de investigación para la síntesis del epítopo natural Man 9 , para obtener oligomanosas de igual o menor complejidad estructural, tanto lineales como ramificadas. En concreto, se han preparado Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 260 2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA), trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2- propenylidene]malononitrile (DCTB) and α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) and NaCl and trifluoroacetic acid (TFA) were used as cationization agents. UV measurements were carried out with a JASCO V-650 Spectrometer. DLS measurements were performed on a Malvern Nano ZS (Malvern Instruments, U.K.) operating at 633 nm with a 173º scattering angle. Nanogels were dissolved in MilliQ water and the solutions were filtered through a 0.45 μm nylon filter before the measurements. The stated mean values resulted from at least 3 measurements. 8.2 SYNTHETIC PROCEDURES, STRUCTURAL CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ASSAYS Please note that only non-previously described compounds, or those whose synthesis have been improved, are included in the following sections. The rest of compounds in this PhD Thesis have been synthesized following literature procedures. 8.2.1 Synthesis and multivalent presentation of oligomannoses. Studies of their affinity for lectins 2-[2-(2-chloroethoxy)ethoxy]ethyl 4,6-O-benzylidene-2-O-(prop-2-ynyl)-3-O-p- methoxybenzyl-β- D -mannopyranoside (4). To a solution of donor 3 125 (2.28 g, 4.29 mmol), BSP (1.11 g, 5.15 mmol), TTBP (1.65 g, 6.43 mmol), and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (40 mL), at -60ºC, Tf 2 O (940 μL, 5.58 mmol) were added. After 30 min of stirring at -60ºC, 2-[2-(2-chloroethoxy)ethoxy]ethanol (17) (1.95 mL, 12.87 mmol) was added. The reaction mixture was stirred for further 1 more h at -60ºC, and allowed to reach room temperature (rt). Then, the reaction mixture was filtered through celite and washed with CH 2 Cl 2 and NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic layer was separated, Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 261 dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 1:7 → 1:2) to give the compound 4 (717 mg, 1.24 mmol, 29%) as a yellow solid. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 7.49 (m, 2H, H-Ar), 7.42-7.30 (m, 5H, H-Ar), 6.85 (d, J = 8.6 Hz, 2H, H-Ar), 5.58 (s, 1H, H acetal ), 4.74 (AB system, 2H, CH 2,PMB ), 4.60-4.54 (m, 3H, H-1, CH 2 CCH), 4.29 (dd, 1H, J = 10.4 and 4.8 Hz, H-6a), 4.16 (m, 1H, H-2), 4.09 (t, J = 9.6 Hz, 1H, H-4), 3.99 (m, 1H, H-1’a), 3.89 (t, J = 10.3 Hz, 1H, H- 6b), 3.80 (s, 3H, CH 3,PMB ), 3.77-3.56 (m, 12H, H-1’b, CH 2 O), 3.31 (td, J = 9.7 and 4.9 Hz, 1H, H-5), 2.48 (t, J = 2.4 Hz, 1H, CCH); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 158.8 (C ipso -Ar), 137.3 (C ipso -Ar), 129.9 (C ipso -Ar), 128.9 (C-Ar), 128.4 (C ipso -Ar), 127.8 (C-Ar), 125.7 (C-Ar), 113.3 (C-Ar), 101.5 (C-1), 100.9 (CH acetal ), 80.0 (CCH), 77.9 (C-4), 76.5 (C-3), 74.9 (CCH), 74.7 (C- 2), 72.1 (CH 2,PMB ), 71.5 (CH 2 O), 70.9 (CH 2 O), 70.2-69.9 (CH 2 O), 68.7 (CH 2 O), 68.1 (C-6), 67.0 (C-5), 61.2 (CH 2 O), 59.6 (CH 2 CCH), 54.8 (CH 3,PMB ), 42.5 (CH 2 Cl); ESI-MS: m/z calcd. for C 30 H 37 ClO 9 : 576.2; found: 599.3 [M+Na] + . 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl 4,6-O-benzylidene-2-O-(prop-2-ynyl)-3-O-p- methoxybenzyl-β- D -mannopyranoside (5). Method A: To a solution of chloro derivative 4 (715 mg, 1.24 mmol) in DMF (10 mL), NaN 3 (807 mg, 12.41 mmol) was added, and the mixture was stirred at 70ºC for 48 h. After evaporation of the solvent, the residue was diluted with CH 2 Cl 2 , and washed with water. The organic phase was dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude product was purified by silica gel column chromatography (EtOAc/n-hexane 1:1), to give the compound 5 (282 mg, 0.48 mmol, 39%) as a yellow oil. Method B: To a solution of donor 3 (568 mg, 1.07 mmol), BSP (276 mg, 1.28 mmol), TTBP (410 mg, 1.60 mmol), and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (12 mL), at -60ºC, Tf 2 O (233 μL, 1.39 mmol) were added. After 30 min of stirring at -60ºC, 2-[2-(2- azidoethoxy)ethoxy]ethanol (1.95 mL, 12.87 mmol) was added. The reaction mixture was stirred for further 1 more h at -60ºC, and allowed to reach rt. Then, the reaction mixture was filtered through celite and washed with CH 2 Cl 2 and NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic layer Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 262 was separated, dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 1:3) to give the compound 5 (222 mg, 0.38 mmol, 36%) as a yellow oil. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 7.48 (m, 2H, H-Ar), 7.44-7.27 (m, 5H, H-Ar), 6.84 (d, J = 8.6 Hz, 2H, H-Ar), 5.57 (s, 1H, H acetal ), 4.73 (AB system, 2H, CH 2,PMB ), 4.63-4.50 (m, 3H, H-1, CH 2 CCH), 4.29 (dd, 1H, J = 10.4 and 4.9 Hz, H-6a), 4.15 (m, 1H, H-2), 4.09 (t, J = 9.6 Hz, 1H, H-4), 3.99 (m, 1H, H-1’a), 3.88 (t, J =10.3 Hz, 1H, H-6b), 3.79 (s, 3H, CH 3,PMB ), 3.75-3.56 (m, 10H, H-1’b, CH 2 O), 3.37 (t, J = 5.1 Hz, 1H, H-6’), 3.31 (td, J = 9.7 and 4.9 Hz, 1H, H-5), 2.47 (t, J = 2.4 Hz, 1H, CCH); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 159.2 (C ipso -Ar), 137.6 (C ipso -Ar), 130.3 (C ipso -Ar), 129.4 (C-Ar), 128.9 (C ipso -Ar), 128.2 (C-Ar), 126.1 (C-Ar), 113.8 (C-Ar), 102.0 (C-1), 101.4 (CH acetal ), 80.4 (CCH), 78.4 (C-4), 76.7 (C-3), 75.4 (CCH), 74.8 (C-2), 72.1 (CH 2,PMB ), 70.8 (CH 2 O), 70.5 (CH 2 O), 70.1 (CH 2 O), 69.2 (CH 2 O), 68.6 (C-6), 67.5 (C-5), 60.1 (CH 2 CCH), 55.3 (CH 3,PMB ), 50.7 (CH 2 N 3 ); ESI-MS: m/z calcd. for C 30 H 37 N 3 O 9 : 583.3; found: 606.3 [M+Na] + and 622.2 [M+K] + . 2-azidoethyl 2-O-benzoyl-4,6-O-benzylidene-α- D -mannopyranoside (24). To a solution of 2-azidoethoxy -α- D -mannopyranose (22) 82 (800 mg, 3.21 mmol) in CH 3 CN (8 mL), CSA (186 mg, 0.8 mmol) and benzaldehyde dimethyl acetal (0.5 mL, 3.55 mmol) were added at rt. The reaction mixture was stirred on and the mixing became solidified during addition of the reagent, which indicates the progress of the reaction. The reaction mixture was quenched with Et 3 N (250 μL) and dissolved in excess of EtOAc and water. The reaction mixture was extracted twice with EtOAc and the combined organic layers were dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. After being dissolved in anh. toluene (29 mL), dibutyltin oxide (879 mg, 3.55 mmol) was added to the resulting mixture containing the 4,6-O- benzylidene derivative. The reaction mixture was kept under reflux at 110 °C for 4 h, cooled to rt and PMBCl (0.5 mL, 3.55 mmol) and TBAI (370 mg, 3.55 mmol) were added to it under Ar atmosphere. The reaction mixture was kept under reflux at 110 °C for 1 h. After removal the solvent, the crude was diluted with CH 2 Cl 2 and washed with water. The organic layer was dried Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 263 over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. To the resulting mixture containing 4,6-O-benzylidene-3-O-p-methoxybenzyl derivative in CH 2 Cl 2 (15 mL), Bz 2 O (1.5 g, 6.42 mmol), Et 3 N (1.3 mL, 9.63 mmol) and a catalytic amount of DMAP were subsequently added and the reaction was stirred at rt for 1 h. The reaction mixture was washed with NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic phase was dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. Finally, to a stirred solution of the α- D -mannoside derivative in CH 2 Cl 2 (70 mL) and water (2.7 mL), DDQ (2.23 g, 9.63 mmol) was added at rt. After 1 h, NaHCO 3 sat. aq. soln. was added, and the mixture was extracted with CH 2 Cl 2 . The extract was washed several times with NaHCO 3 sat. aq. soln. and then dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 1:3) to give the compound 24 (320 mg, 0.72 mmol, 26%) as a colourless oil. = - 37 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.11 (m, 2H, H-Ar), 7.60 (m, 1H, H-Ar), 7.56-7.45 (m, 4H, H- Ar), 7.43-7.35 (m, 3H, H-Ar), 5.67 (s, 1H, H acetal ), 5.52 (dd, J = 3.6 and 1.6 Hz, 1H, H-2), 5.01 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-1), 4.41 (dt, J = 9.6 and 3.9 Hz, 1H, H-3), 4.33 (dd, J = 9.9 and 4.4 Hz, 1H, H-6a), 4.06 (t, J = 9.5 Hz, 1H, H-4), 4.03-3.84 (m, 3H, H-5, H-6b, H-1’a), 3.73-3.63 (m, 1H, H-1’b), 3.55-3.40 (m, 2H, H-2’), 2.32 (d, J OH,3 = 4.2 Hz, 1H, OH). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.0 (CO), 137.1 (C ipso -Ar), 133.5 (C-Ar), 129.9 (C-Ar), 129.5 (C ipso -Ar), 129.3 (C- Ar), 128.5 (C-Ar), 128.3 (C-Ar), 126.3 (C-Ar), 102.2 (C acetal ), 98.7 (C-1), 79.2 (C-4), 72.5 (C-2), 68.7 (C-6), 67.1 (C-3), 66.9 (CH 2 O), 63.8 (C-5), 50.4 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 22 H 23 N 3 O 7 : 441.2; found: 464.2 [M+Na] + and 905.4 [2M+Na] + . 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl 2-O-benzoyl-4,6-O-benzylidene-α- D -mannopyranoside (25). To a solution of 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl-α- D -mannopyranose (23) 137 (4.74 g, 14.1 mmol) in CH 3 CN (40 mL), CSA (833 mg, 3.5 mmol) and benzaldehyde dimethyl acetal (2.3 mL, 15.5 mmol) were added at rt. The reaction mixture was stirred on and the mixing became solidified during addition of the reagent, which indicates the progress of the reaction. The [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 264 reaction mixture was quenched with Et 3 N (1.5 mL) and dissolved in an excess of EtOAc and water. The reaction mixture was extracted twice with EtOAc and the combined organic layers were dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. After being dissolved in anh. toluene (100 mL), dibutyltin oxide (3.85 g, 15.5 mmol) was added to the resulting mixture containing the 4, 6-O-benzylidene derivative. The reaction mixture was kept under reflux at 110 °C for 4 h, cooled to rt and then PMBCl (2.1 mL, 15.5 mmol) and TBAI (5.83 g, 15.5 mmol) were added under Ar atmosphere. The reaction mixture was kept under reflux at 110 °C for 1 h. After removal the solvent, the crude was diluted with CH 2 Cl 2 and washed with water. The organic layer was dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. To the resulting mixture containing 4,6-O-benzylidene-3-O-p-methoxybenzyl derivative in CH 2 Cl 2 (100 mL), Bz 2 O (6.4 g, 28.1 mmol), Et 3 N (5.9 mL, 42.2 mmol) and a catalytic amount of DMAP were subsequently added and the reaction was stirred at rt for 1 h. The reaction mixture was washed with NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic phase was dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. Finally, to a stirred solution of the α- D -mannoside derivative in CH 2 Cl 2 (100 mL) and water (4 mL), DDQ (9.8 g, 42.2 mmol) was added at rt. After 1 h, NaHCO 3 sat. aq. soln. was added, and the mixture was extracted with CH 2 Cl 2 . The extract was washed several times with NaHCO 3 sat. aq. soln. and then dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 1:3) to give the compound 25 (1.92 g, 3.62 mmol, 26%) as a colourless oil. = - 17 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.10 (m, 2H, H-Ar), 7.58 (m, 1H, H-Ar), 7.55-7.43 (m, 4H, H-Ar), 7.43-7.32 (m, 3H, H-Ar), 5.64 (s, 1H, H acetal ), 5.48 (dd, J = 3.6, J = 1.6 Hz, 1H, H-2), 4.97 (d, J = 1.6, 1H, H-1), 4.42-4.24 (m, 2H, H-3, H-6a), 4.08-3.92 (m, 2H, H-4, H-5), 3.92-3.79 (m, 2H, H-6b, H-1’a), 3.73-3.61 (m, 9H, CH 2 O), 3.34 (t, J = 5, 1 Hz, CH 2 N 3 ), 2.68 (br s, 1H, OH). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.1 (CO), 137.3 (C ipso -Ar), 133.5 (C-Ar), 129.9 (C-Ar), 129.6 (C ipso -Ar), 129.2 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.3 (C-Ar), 126.3 (C-Ar), 100.2 (C acetal ), 98.6 (C-1), 79.5 (C-4), 72.7 (C-2), 70.9, 70.7, 70.2, 70.1, 68.9 (CH 2 O), 67.4 (C-6), 67.2 (C-3), 63.5 (C-5), 50.7 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 26 H 31 N 3 O 9 : 529.2; found: 552.3 [M+Na] + y 1081.5 [2M+Na] + . [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 265 Tetrasaccharide 36. To a solution of aceptor 24 (49 mg, 0.11 mmol), donor 33 87 (275 mg, 0.17 mmol) and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (5.8 mL) were added and the mixture was stirred at -20ºC for 30 min. Then, NIS (39 mg, 0.17 mmol) and TfOH (2.9 μL, 0.03 mmol) were added and the reaction was stirred at -20ºC for 15 min. The reaction was quenched with NaHCO 3 sat. aq. soln. The reaction mixture was filtered through Celite and washed several times with CH 2 Cl 2 . The organic layer was washed with Na 2 S 2 O 3 sat. aq. soln. and then dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 1:2 1:1.25) to give the tetrasaccharide 36 (193 mg, 0.10 mmol, 88%) as a white solid. = - 22 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.22 (m, 1H, HAr), 8.19-8.12 (m, 2H, HAr), 8.09-7.92 (m, 7H, HAr), 7.92-7.81 (m, 7H, HAr), 7.76-7.68 (m, 2H, HAr), 7.64-7.19 under CDCl 3 (m, 36H, HAr), 7.14-6.95 (m, 4H), 6.78 (m, 1H), 6.05-5.81 (m, 5H), 5.79-5.69 (m, 2H), 5.64 (dd, J = 9.2, J = 3.1 Hz, 1H), 5.57 (s, 1H, H-1), 5.49 (br s, 1H, H- acetal), 5.35 (s, 1H, H-1), 5.05 (d, J = 1.5 Hz, 1H, H-1), 4.91 (s, 1H, H-1), 4.72-4.50 (m, 4H), 4.47 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.35-4.13 (m, 4H), 4.07-3.94 (m, 3H), 3.94-3.79 (m, 3H), 3.65 (m, 1H), 3.35 (m, 2H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.4 (CO), 166.0 (CO), 165.9 (CO), 165.8 (CO), 165.5 (CO), 165.3 (CO), 165.3 (CO), 165.2 (CO), 165.2 (CO), 165.0 (CO), 164.8 (CO), 137.0 (C-Ar), 133.7 (C-Ar), 133.5 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.2 (C-Ar), 133.1 (C- Ar), 133.1 (C-Ar), 133.1 (C-Ar), 133.0 (C-Ar), 132.8 (C-Ar), 130.1-129.6 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (C-Ar), 129.2 (2C-Ar), 129.1 (2C-Ar), 128.9-128.3 (C-Ar) 101.9 (C-1), 99.8 (C-1, C-1), 90.1 (C-1), 79.1, under CDCl 3 (1C), 71.9, 71.4, 70.4, 70.1, 69.8, 69.7, 69.5 (2C), 68.8, 67.6, 67.2, 67.0, 66.3, 64.1, 63.6, 63.5, 62.9 (2C), 62.5, 50.4 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 266 C 110 H 93 N 3 O 32 : 1967.6; found: 1990.4 [M+Na] + and 1006.5 [M+2Na] 2+ . ESI-HRMS: m/z calcd. for C 110 H 93 N 3 O 32 Na [M+Na] + : 1990.5634; found: 1990.5609. Tetrasaccharide 37. To a solution of aceptor 25 (132 mg, 0.25 mmol), donor 33 87 (535 mg, 0.32 mmol) and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (13 mL) were added and the mixture was stirred at -20ºC for 30 min. Then, NIS (77 mg, 0.32 mmol) and TfOH (4.4 μL, 0.05 mmol) were added and the reaction was stirred at -20ºC for 15 min. The reaction was quenched with NaHCO 3 sat. aq. soln. The reaction mixture was filtered through Celite and washed several times with CH 2 Cl 2 . The organic layer was washed with Na 2 S 2 O 3 sat. aq. soln. and then dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude was purified by column chromatography on silica gel (Toluene/Acetone 4:1) to give the tetrasaccharide 37 (440 mg, 0.21 mmol, 86%) as a white solid. = - 11 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.28-8.13 (m, 4H, H-Ar), 8.09-7.81 (m, 17H, H-Ar), 7.72 (m, 2H, H-Ar), 7.64-7.54 (m, 2H, H-Ar), 7.53-7.20 under CDCl 3 (m, 29H, H-Ar), 7.16-6.95 (m, 5H, H-Ar), 6.79 (m, 1H, H-Ar), 6.06-5.82 (m, 5H), 5.76 (m, 1H), 5.71 (dd, J = 3.8, J = 1.5 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 9.2, J = 3.0 Hz, 1H), 5.57 (s, 1H, H-1), 5.46 (br s, 1H, H acetal ), 5.35 (s, 1H, H-1), 5.06 (s, 1H, H-1), 4.91 (s, 1H, H-1), 4.75-4.52 (m, 4H), 4.47 (t, J = 2.7 Hz, 1H, H-2), 4.41-4.12 (m, 5H), 4.09-3.94 (m, 3H), 3.91-3.77 (m, 3H), 3.75- 3.57 (m, 10H), 3.35-3.28 (m, 2H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.5 (CO), 166.1 (CO), 166.0 (CO), 165.8 (CO), 165.7 (CO), 165.5 (2CO), 165.3 (CO), 165.2 (2CO), 165.0 (CO), 164.8 (CO), 137.1 (C-Ar), 133.8 (C-Ar), 133.6 (C-Ar), 133.5 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.2 (C-Ar), 133.0 (C-Ar), 132.9 (C-Ar), 130.1-129.7 (C-Ar), 129.4 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (2C-Ar), 129.1 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.9 (C-Ar), 128.7-128.3 (C-Ar), 125.8 (C-Ar), OO O O O O O O O O O BzO BzO BzO BzO BzO BzO BzO BzO BzO OBz OBz Ph ON3 [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 267 101.7 (C-1), 99.8 (C-1), 99.7 (2C-1), 98.9 (C-1), 79.2, 72.1, 71.8, 70.9-70.8, 70.4-70.1, 69.8, 69.7, 69.6, 69.4, 69.0, 68.9, 67.1, 67.0, 66.4, 63.7, 63.0, 62.6, 50.7 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 114 H 101 N 3 O 34 : 2055.6; found: 2094.4 [M+K] + , 2078.6 [M+Na] + , 1050.7 [M+Na] + . ESIHRMS: m/z calcd. for C 114 H 101 N 3 O 34 Na [M+Na] + : 2078.6159; found: 2078.6139. Tetrasaccharide 38. p-Toluenesulfonic acid monohydrate (25 mg, 0.13 mmol) was added to a stirred solution of tetrasaccharide 36 (173 mg, 0.09 mmol) in CH 3 CN (4.4 mL) at rt. After 24 h, the reaction mixture was quenched with Et 3 N (30 μL) and concentrated under vacuum. The residue was purified by column chromatography on silica gel (acetone/toluene 1:5) to give the tetrasaccharide 38 (130 mg, 0.07 mmol, 78%) as a white amorphous solid. = - 15 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.14 (m, 2H, HBz), 8.07-7.93 (m, 13H, HBz), 7.90- 7.82 (m, 4H, HBz), 7.70 (m, 2H, HBz), 7.61-7.18 under CDCl 3 (m, 34H, HBz), 6.13 (t, J = 10.2 Hz, 1H), 6.03-5.90 (m, 3H), 5.84-5.72 (m, 2H), 5.67-5.57 (m, 3H, H-1), 5.52 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-1), 5.09 (br s, 1H, H-1), 5.00 (d, J = 1.7 Hz, 1H, H-1), 4.73-4.31 (m, 12H), 4.31-4.15 (m, 2H), 4.01 (m, 2H), 3.95-3.78 (m, 3H), 3.59 (dt, J = 10.4 and 4.8 Hz, 1H), 2.34 (m, 2H). 13 C- NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.4 (2CO), 166.3 (CO), 166.0 (CO), 165.9 (CO), 165.7 (2CO), 165.5 (CO), 165.2 (2CO), 164.9 (CO), 133.6 (C-Ar), 133.5 (C-Ar), 133.4 (2C-Ar), 133.3 (C- Ar), 133.2 (2C-Ar), 133.0 (C-Ar), 130.2-129.8 (C-Ar), 129.6 (C-Ar), 129.5 (C-Ar), 129.4 (C- Ar), 129.3 (C-Ar), 129.1 (C-Ar), 129.0 (2C-Ar), 128.9 (C-Ar), 128.6-128.4 (C-Ar), 100.8 (C-1), 99.4 (C-1), 98.1 (2C-1), 76.4, 73.3, 72.4, 70.5, 70.3, 69.9, 69.7-69.6, 69.4, 68.2, 67.8, 67.0, 66.6, 63.9-63.8, 62.6, 62.3, 50.4 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 103 H 89 N 3 O 32 : 1879.5; found: [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 268 1902.4 [M+Na] + and 962.5 [M+2Na] 2+ . ESI-HRMS: m/z calcd. for C 103 H 89 N 3 O 32 Na [M+Na] + : 1902.5321; found: 1902.5307. Tetrasaccharide 39. p-Toluenesulfonic acid monohydrate (57 mg, 0.29 mmol) was added to a stirred solution of tetrasaccharide 37 (402 mg, 0.19 mmol) in CH 3 CN (10 mL) at rt. After 24 h, the reaction mixture was quenched with Et 3 N (60 μL) and concentrated under vacuum. The residue was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/toluene 1:5) to give the tetrasaccharide 39 (257 mg, 0.13 mmol, 67%) as a white amorphous solid. = - 12 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.13 (m, 2H, HBz), 8.07-7.93 (m, 15H, HBz), 7.91-7.82 (m, 4H, HBz), 7.71 (dd, J = 8.4, J =1.4 Hz, 2H, HBz), 7.61-7.18 under CDCl 3 (m, 32H, HBz), 6.13 (t, J = 10.1 Hz, 1H), 6.00-5.89 (m, 3H), 5.85-5.72 (m, 2H), 5.66-5.56 (m, 3H, H-1), 5.52 (d, J =1.8 Hz, 1H, H-1), 5.09 (br s, 1H, H-1), 5.00 (d, J =1.8 Hz, 1H, H-1), 4.66-4.15 (m, 12H), 4.06-3.93 (m, 2H), 3.93-3.78 (m, 3H), 3.74-3.56 (m, 11H), 3.37 (t, J = 5.1 Hz, 2H, CH 2 N 3 ); 13 C- NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.4 (CO), 166.2 (CO), 165.9 (CO), 165.9 (CO), 165.6 (CO), 165.6 (CO), 165.4 (CO), 165.1 (CO), 165.1 (CO), 164.9 (CO), 133.5 (C-Ar), 133.4 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.1 (C-Ar), 133.0 (C-Ar), 130.1 (C-Ar), 130.0 (C-Ar), 129.9 (C-Ar), 129.9 (C- Ar), 129.8 (C-Ar), 129.6 (C-Ar), 129.6 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (C-Ar), 129.1 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.9 (C-Ar), 128.8 (C-Ar), 128.6 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.4 (C-Ar), 100.8 (C-1), 99.4 (C-1), 97.9 (C-1), under CDCl 3 (1C), 72.8, 72.4, 70.7, 70.7, 70.5, 70.3, 70.2, 70.1, 69.8, 69.7, 69.6, 69.2, 68.5, 67.7, 67.1, 66.5, 63.7, 62.6, 62.4, 50.7 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 107 H 97 N 3 O 34 : 1967.6; found: 1990.4 [M+Na] + and 1006.5 [M+2Na] 2+ . ESI-HRMS: m/z calcd. for C 107 H 97 N 3 O 34 Na [M+Na] + : 1990.5846; found: 1990.5808. [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 269 Nonasaccharide 40. To a solution of aceptor 38 (110 mg, 0.06 mmol), donor 29 87 (228 mg, 0.09 mmol) and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (4.1 mL) were added and the mixture was stirred at -20ºC for 30 min. Then, NIS (42 mg, 0.09 mmol) and TfOH (3.1 μL, 17.55 μmol) were added and the reaction was stirred at -20ºC for 15 min. The reaction was quenched with NaHCO 3 sat. aq. soln. The reaction mixture was filtered through Celite and washed several times with CH 2 Cl 2 . The organic layer was washed with Na 2 S 2 O 3 sat. aq. soln. and then dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. The crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 4:5 → 1:1) to give the nonasaccharide 40 (185 mg, 0.04 mmol, 73%) as a white solid. = - 19 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.30-7.67 (m, 52H, HBz), 7.56-7.18 (m, 80H, HBz), 6.99 (m, 2H, HBz), 6.81 (t, J = 7.5, 1H, HBz), 6.22-5.64 (m, 18H, H-1), 5.55 (s, 1H, H-1), 5.46 (m, 2H, 2H-1), 5.32 (s, 1H, H-1), 5.18 (s, 1H, H-1), 5.05 (m, 2H, 2H-1), 4.74-4.02 (m, 37H, H-1), 3.84-3.72 (m, 2H), 3.49-3.32 (m, 3H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.5 (CO), 166.4 (CO), 166.4 (CO), 166.3 (CO), 166.1 (CO), 166.0 (CO), 165.8 (CO), 165.6 (CO), 165.6 (CO), 165.4 (CO), 165.4 (CO), 165.3 (CO), 165.0 (CO), 165.0 (CO), 164.8 (CO), 164.8 (CO), 164.6 (CO), 133.5 (CBz), 133.4 (CBz), 133.4 (CBz), 133.2 (CBz), 133.2 (CBz), 133.1 (CBz), 130.2-129.5 (CBz), 129.5 (CBz), 129.5 (CBz), 129.3 (CBz), 129.2 (CBz), 129.2 (CBz), 129.0 (CBz), 129.0 (CBz), 128.9 (CBz), 128.9 (CBz), 128.7-128.3 [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 276 Glycodendron 50. To a solution of glycodendron 47 (20.0 mg, 3.94 μmol) in DMF (1 mL) sodium azide (2.6 mg, 39.36 μmol) was added. The mixture was stirred at 70ºC for 2 days. After that time, the solvent was evaporated under vacuum and the crude was purified using Amicon Ultra-15 centrifugal filters (MWCO 3 KDa), yielding the glycodendron 50 (20 mg, 3.94 μmol, quant.) as a white amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.05 (s, 3H, 3H triazole ), 5.41 (br s, 1H, 3H-1), 5.34-5.29 (m, 6H, 6H-1), 5.15 (br s, 3H, 3H-1), 5.07-5.03 (m, 9H, 9H-1), under D 2 O (3H, 3H- 1), 4.68 (m, 3H, OCHHC triazole ), 4.60-4.55 (m, 6H, H-1, OCH 2 CHHN), 4.12-3.46 (m, 198H). 13 C-NMR (100 MHz, D 2 O) δ: 144.1, (C triazole ), 125.5 (CH triazole ), 102.3 (C-1), 102.2 (2C-1), 100.8 (C-1), 100.7 (C-1), 100.6 (C-1), 99.9 (C-1), 99.5 (C-1), 98.0 (C-1), 80.9, 78.9-78.4, 74.0, 73.3-73.2, 72.7, 72.0, 71.1, 70.3-69.9, 69.7-69.5, 69.2, 68.3, 67.7, 66.9-66.8, 65.6-65.2, 63.5 (OCH 2 C triazole ), 62.4, 61.1-61.0, 50.2 (CH 2 N 3 ), 50.1 (OCH 2 CH 2 N), 44.7 (CCH 2 O). ESI-MS: m/z calcd. for C 191 H 320 N 12 O 145 : 5087.2; found: 2566.5 [M+2Na] +2 , 1717.9 [M+3Na] +3 and 1293.9 [M+4Na] +4 . α-Man 9 -fluorescein (51). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (2.67 mg, 6.48 μmol) and the epitope α-Man 9 13 (5 mg, 3.24 μmol) in DMSO (300 µL), another solution of CuBr (3.24 µmol) and TBTA (6.48 µmol) in the same solvent (150 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 51 (6.3 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.22-7.87 (m, 3H), 7.68 (br s, 1H), 7.30-7.07 (m, 2H), 6.87-6.54 (m, 4H), 5.40-5.24 (m, 3H, 3H-1), 5.11 (br s, 1H, 1H-1), 5.04 (br s, 3H, 3H-1), under D 2 O (2H, 2H-1), 4.64 (m, 2H), 4.12-3.57 (m, 58H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O) δ: 131.2 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 127.9 (C-Ar), 121.7 (CH triazole ), 103.0 (C‐Ar), 102.2 (2C-1), 100.8 (2C-1), 100.6 (2C-1), 100.0 (C-1), 99.5 (C-1), 98.0 (C-1), 78.8-78.5, 73.2, 73.2, 72.7, 71.1, 71.1, 70.3- Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 277 70.0, 69.6, 66.9, 66.8, 66.6, 65.7, 65.5, 65.2, 61.2-61.0, 50.3, 43.8. ESI-MS: m/z calcd. for C 80 H 110 N 4 O 52 : 1958.6; found: 978.1 [M - 2H] 2- . β-Man 9 -fluorescein (52). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (6.6 mg, 10.36 μmol) and the epitope β-Man 9 44 87 (8 mg, 5.18 μmol) in DMSO (300 µL), another solution of CuBr (5.18 µmol) and TBTA (10.36 µmol) in the same solvent (150 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 52 (10.1 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.05- 7.98 (m, 2H), 7.94 (m, 1H), 7.57 (br s, 1H), 7.15-7.07 (m, 2H), 6.69-6.63 (m, 4H), 5.37 (br s, 1H, H-1), 5.31-5.26 (m, 2H, 2H-1), 5.10 (br s, 1H, H-1), 5.06-5.00 (m, 4H, 4H-1), 4.65 (m, 2H, CH 2 C triazole ), 4.59 (m, 2H, CH 2 CH 2 N ), 4.49 (br s, 1H, H-1), 4.21 (m, 1H), 4.12-4.05 (m, 6H), 4.03-3.92 (m, 6H), 3.90-3.60 (m, 42H), 3.41 (m, 1H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O) δ: 131.0 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 127.9 (C-Ar), 121.7 (CH triazole ), 103.0 (C‐Ar), 102.3 (C-1), 102.1 (2xC-1), 100.7 (2xC-1), 100.5 (C-1), 99.9 (C-1), 99.5 (C-1), 97.9 (C-1), 81.0, 78.9, 78.6, 78.5, 78.4, 74.0, 73.2-73.1, 72.6, 71.1, 70.3-69.9, 69.4, 68.4, 66.9-66.8, 65.6-65.4, 61.1-60.9, 50.4, 35.6. ESI-MS: m/z calcd. for C 80 H 110 N 4 O 52 : 1958.6; found: 1957.0 [M - H] - and 977.7 [M - 2H] 2- . (α-Man 9 ) 3 -fluorescein (53). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (1.3 mg, 3.14 μmol) and the trivalent glycodendron of α-Man 9 48 (8 mg, 1.57 μmol) in DMSO (400 µL), another solution of CuBr (1.57 µmol) and TBTA (3.14 µmol) in the same solvent (200 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 53 (8.7 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 278 δ: 8.06-7.78 (m, 6H), 7.57 (br s, 1H), 7.07-6.88 (m, 2H), 6.62-6.42 (m, 4H), 5.35-5.16 (m, 9H, 9H-1), 5.06 (br s, 3H, 3H-1), 4.96 (br s, 9H, 9H-1), under D 2 O (6H, 6H-1), 4.55-4.29 (m, 6H), 4.07-3.11 (m, 213H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O) δ: 126.8 (C-Ar), 122.9 (CH triazole ), 102.9 (C-Ar), 102.3 (3C-1), 100.7 (3C-1), 99.8 (C-1), 99.5 (C-1), 98.0 (C-1), 78.8-78.4, 73.3-73.2, 72.0, 71.1-71.0, 70.3-69.9, 69.7-69.5, 66.9-66.8, 65.9, 65.6, 65.4, 65.2, 63.4, 62.5, 61.1-61.0, 50.5 (OCH 2 CH 2 N triazole ), 35.4 (triazoleCH 2 NHCO). ESI-MS: m/z calcd. for C 215 H 335 N 13 O 151 : 5500.9; found: 2747.8 [M - 2H] 2- and 1830.6 [M - 3H] 3- . (α-Man 9 ) 3 -fluorescein (54). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (1.2 mg, 2.84 μmol) and the trivalent glycodendron of α-Man 9 49 (7.6 mg, 1.42 μmol) in DMSO (100 µL), another solution of CuBr (1.42 µmol) and TBTA (2.84 µmol) in the same solvent (50 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 54 (8.2 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.14-7.90 (m, 6H), 7.67 (br s, 1H), 7.20-7.02 (m, 2H), 6.85-6.57 (m, 4H), 5.46-5.28 (m, 9H, 9H-1), 5.16 (br s, 3H, 3H-1), 5.06 (br s, 9H, 9H-1), under D 2 O (6H, 6H-1), 4.66 (m, 2H, CH 2 C triazole ), 4.61-4.48 (m, 9H), 4.42 (br s, 3H), 4.15-3.04 (m, 216H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O): δ 131.4 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 124.6 (CH triazole ), 122.6 (CH triazole ), 103.4 (C-Ar), 102.3 (C-1), 102.2 (2C-1), 100.7 (2C- 1), 100.6 (C-1), 100.1 (C-1), 99.5 (C-1), 98.0 (C-1), 78.9-78.4, 73.2, 72.7, 72.0, 71.1, 70.8, 70.5, 70.3-70.0, 69.7-69.6, 69.2, 68.8, 68.3, 66.9-66.6, 65.7, 65.4, 65.0, 63.5, 62.5, 61.1-60.9, 50.5 (OCH 2 CH 2 N triazole ), 35.1 (triazoleCH 2 NHCO). ESI-MS: m/z calcd. for C 226 H 357 N 13 O 157 : 5765.0; found: 2880.2 [M - 2H] 2- , 1918.7 [M - 3H] 3- and 1438.3 [M - 4H] 4- . (β-Man 9 ) 3 -fluorescein (55). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (2.3 mg, 5.5 μmol) and the trivalent glycodendron of β-Man 987 50 (14 mg, 2.75 μmol) in DMSO (180 µL), another solution of CuBr (2.75 µmol) and Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 279 TBTA (5.5 µmol) in the same solvent (90 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 55 (15.0 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.02-7.80 (m, 6H), 7.54 (br s, 1H), 7.01-6.87 (m, 2H), 6.58-6.46 (m, 4H), 5.40-5.30 (m, 6H, 6H-1), 5.21 (m, 6H, 6H-1), 5.06 (br s, 3H, 3H-1), 4.96 (m, 9H, 9H-1), 4.53-4.41 (m, 12H, 3H- 1), 4.29 (br s, 6H), 4.07-3.05 (m, 204H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O) δ: 131.0 (C-Ar), 129.6 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 124.0 (CH triazole ), 122.4 (CH triazole ), 103.8 (C‐Ar), 102.3 (C-1), 102.2 (2C-1), 100.8 (C-1), 100.7 (C-1), 100.6 (C-1), 99.9 (C-1), 99.5 (C-1), 98.0 (C-1), 80.9, 78.9-78.4, 74.0, 73.3-73.2, 72.7, 72.0, 71.1, 70.3-69.9, 69.7-69.5, 69.2, 68.3, 67.7, 66.9-66.8, 65.6-65.2, 63.5, 62.4, 61.1-61.0, 50.3 (OCH 2 CH 2 N triazole ), 35.3 (triazoleCH 2 NHCO). ESI-MS: m/z calcd. for C 215 H 335 N 13 O 151 : 5500.9; found: 2748.5 [M - 2H] 2- , 1830.8 [M - 3H] 3- and 1372.5 [M - 4H] 4- . (Manα1,2Man) 3 -fluorescein (56). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (10.8 mg, 0.026 mmol) and the trivalent glycodendron of Manα1,2Manα 61 81e (22 mg, 0.013 mmol) in DMSO (844 µL), another solution of CuBr (0.013 mmol) and TBTA (0.026 mmol) in the same solvent (422 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 56 (27.4 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.07 (m, 1H), 7.94-7.89 (m, 2H), 7.92 (br s, 3H), 7.64 (br s, 1H), 7.12-7.02 (m, 2H), 6.65-6.54 (m, 4H), 5.03 (br s, 3H, 3H-1), 4.94 (br s, 3H, 3H-1), 4.68-4.54 (m, 10H), 4.39 (br s, 6H, CH 2triazole ), 4.10-3.99 (m, 6H), 3.95-3.78 (m, 14H), 3.78-3.50 (m, 27H), 3.46-3.27 (m, 9H), 3.24 (br s, 4H), 3.16 (br s, 1H), 3.03 (m, 3H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O) δ: 131.0 (C-Ar), 128.7 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 124.6 (CH triazole ), 123.2 (CH triazole ), 119.0 (C-Ar), 103.2 (C‐Ar), 102.2 (C-1), 97.9 (C-1), 78.6, 73.2, 72.7, 70.5, 70.2, 70.0, 69.9, 69.5, 69.2, 66.8, 66.5, 65.6, Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 280 63.5, 61.1, 60.6, 50.2 (OCH 2 CH 2 N triazol ), 35.4 (triazoleCH 2 NHCO). ESI-MS: m/z calcd. for C 88 H 123 N 13 O 46 : 2097.8; found: 2097.0 [M - H] - and 1047.7 [M - 2H] 2- . Dendron of 9 mannoses-fluorescein (57). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (8.7 mg, 0.022 mmol) and the nonavalent glycodendron of α- D -Mannose 71 81d (40 mg, 0.011 mmol) in DMSO (690 µL), another solution of CuBr (0.011 mmol) and TBTA (0.022 mmol) in the same solvent (345 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 57 (44.4 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.09-7.93 (m, 12H), 7.89 (br s, 3H), 7.64 (br s, 1H), 7.07- 6.95 (m, 2H), 6.69-6.51 (m, 4H), under D 2 O (9H, 9H-1), 4.67-4.43 (m, 45H), 4.38 (br s, 4H), 4.05 (m, 9H), 3.93-3.78 (m, 27H), 3.76-3.55 (m, 36H), 3.55-3.19 (m, 58H), 3.07 (m, 9H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O) δ: 131.2 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 125.7 (C-Ar), 124.0 (C-Ar), 124.0 (CH triazole ), 122.9 (CH triazole ), 103.5 (C‐Ar), 99.5 (C-1), 72.7, 70.4, 69.9, 69.6, 68.7, 68.2, 66.3, 65.4, 63.5, 60.6, 50.3 (OCH 2 CH 2 N triazole ), 50.1 (OCH 2 CH 2 N triazole ), 35.3 (triazoleCH 2 NHCO). ESI-MS: m/z calcd. for C 172 H 258 N 40 O 82 : 4195.7; found: 2095.0 [M - 2H] 2- . (Manα1,2Man) 9 -fluorescein (58). To a solution of the FAM-alkyne 6-isomer (3.9 mg, 9.54 μmol) and the nonavalent glycodendron of Manα1,2Man 72 81e (25 mg, 4.77 μmol) in DMSO (400 µL), another solution of CuBr (4.77 μmol) and TBTA (9.54 μmol) in the same solvent (200 µL) was added. The reaction mixture was stirred on at rt. Thereafter, a metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20, H 2 O/MeOH 9:1), yielding the fluorescent probe 58 (27.0 mg, quant.) as an orange amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.18-7.89 (m, 15H), 7.67 (br s, 1H), 7.14-6.93 (m, 2H), Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 281 6.79-6.44 (m, 4H), 5.06 (br s, 9H, 9H-1), 4.98 (br s, 9H, 9H-1), 4.70-4.58 (m, 15H), 4.58-4.45 (m, 18H), 4.15-4.01 (m, 21H), 3.96-3.59 (m, 121H), 3.57-3.20 (m, 58H), 3.06 (m, 9H). 13 C‐NMR (100 MHz, selected data obtained from HSQC, D 2 O) δ: 130.1 (C-Ar), 124.6 (C-Ar), 124.3 (C-Ar), 123.7 (C-Ar), 123.5 (CH triazole ), 123.3 (CH triazole ), 121.8 (C-Ar), 102.7 (C‐Ar), 102.2 (C-1), 97.9 (C-1), 78.6, 73.2, 72.8, 70.4, 70.2, 70.0, 69.9 , 69.6, 69.2, 68.7, 68.2, 66.8, 66.5, 65.5, 63.6, 61.1, 60.6, , 49.6 (OCH 2 CH 2 N triazole ), 49.4 (OCH 2 CH 2 N triazole ), 34.8 (triazoleCH 2 NHCO). ESI-MS: m/z calcd. for C 226 H 348 N 40 O 127 : 5654.2; found: 2824.4 [M - 2H] 2- , 1881.4 [M - 3H] 3- and 1410.4 [M - 4H] 4- . Fluorescence polarization measurements. The measurements were performed in 384-well microplates (black polystyrene, non-treated, Corning). The fluorescence polarization was recorded using a TRIAD multimode microplate reader (from Dynex) with excitation and emission wavelengths of 485 and 535 nm, respectively. Fluorescent probes 51-55, DC-SIGN-ECD, and inhibitors were dissolved in Tris buffer (25 mM, pH 8, NaCl 150 mM, 4 mM CaCl 2 ). For direct binding, 15 μL of a fluorescent probe solution (20 nM) were transferred to each well. Then, 15 μL of protein (concentration ranging from 75 nM to 28 μM) were added and the microplate was shaked in the dark for 5 min, before reading. The total sample volume in each well was 30 μL. Control wells contained 15 μL of the fluorescent probe solution and 15 μL of buffer. Blank wells contained 15 μL of the DC-SIGN- ECD solution and 15 μL of buffer and their measurements were subtracted from all values. All experiments on samples were performed in replicates of three. The experiments with ConA and fluorescent probes 52, 55-58 were performed identically. The concentration of protein solutions ranging 28 μM to 75 nM. The average polarization values of three replicate wells were plotted against the concentration of the protein, and the curve was fitted to the equation for a one-site binding: y = B máx x/[k D +x] where B máx is the maximal value of polarization, respectively, and k D is the dissociation constant. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 282 (2-bromoethoxy) O-(3,4,6-tri-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl)-(1→2)-2,3,4,6-tetra-O- benzoyl-α- D -mannopyranoside (62) A solution of 26 87 (427 mg, 0.36 mmol), 2-bromo ethanol 16 (81 μL, 1.09 mmol) and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (10 mL) was stirred at -20ºC for 30 min. Then, NIS (233 mg, 1.09 mmol) and TfOH (9.6 µl, 0.11 mmol) were added and the resulting mixture was stirred for 30 min at -20ºC. The reaction was quenched with NaHCO 3 sat. aq. soln. (150 μL), and the mixture was diluted with CH 2 Cl 2 and filtered through Celite. The filtrate was washed with Na 2 S 2 O 3 sat. aq. soln. and NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic layer was dried over anh. MgSO 4 , concentrated and purified by column chromatography on silica gel (Acetone/toluene, 1:20) to obtain the disaccharide 62 (350 mg, 0.29 mmol, 82%) as a white amorphous solid. ESI-MS: m/z calcd. for C 63 H 53 N 3 O 11 : 1176.2; found: 1199.2 [M + Na] + . 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl-2-O-acetyl-4-O-benzoyl-α- D -mannopyranoside (79) To a solution of 78 148 (860 mg, 1.5 mmol) and CSA (35 mg, 0.15 mmol) in CH 3 CN (7.5 mL), trimethyl orthoacetate (0.6 mL, 4.5 mmol) was added. The mixture was stirred at rt for 30 min. After that, the reaction mixture was quenched with Et 3 N and the solvent was evaporated. Then, the residue was dissolved in CH 2 Cl 2 (11 mL), Bz 2 O (676 mg, 3.0 mmol), Et 3 N (0.6 mL, 4.5 mmol) and DMAP (18 mg, 0.15 mmol) were subsequently added. The reaction mixture was stirred at rt for 1 h and the solvent was removed under vacuum. To a solution of the resulting residue in EtOAc (20 mL), 1M HCl (20 mL) was added. The reaction mixture was stirred at rt for 1 h. Then, the organic phase was separated and dried over anh. MgSO 4 , filtered and Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 283 concentrated under vacuum. To a mixture of the resulting residue and acetic acid (0.3 mL, 4.7 mmol) in anh. THF (11 mL), a cold solution of HF-pyridine complex (1.8 mL, 20.0 mmol) was slowly added. The reaction mixture was stirred at rt for 3 h. Then, the residue was dissolved with EtOAc and washed with NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic phase was dried over anh. MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated. The residue was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane, 1:1) to obtain the product 79 (418 mg, 0.86 mmol, 58%) as a colorless oil. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.04 (m, 2H, H-Ar), 7.58 (m, 1H, H-Ar), 7.45 (m, 2H, H-Ar), 5.31 (t, 1H, J = 9.9, H-4), 5.17 (dd, 1H, J = 3.6, J = 1.7, H-2), 4.96 (d, 1H, J = 1.7, H-1), 4.32 (dd, 1H, J = 9.8, J = 3.6, H-3), 3.94 (m, 1H, H-5), 3.83 (m, 1H, CHHO), 3.79-3.56 (m, 11H, H-6 CH 2 CH 2 N 3 , CH 2 O), 3.37 (m, 2H, CH 2 N 3 ), 2.16 (s, 3H, OCOCH 3 ); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 170.8 (CO), 167.0 (CO), 133.5 (C ipso -Ar), 129.8 (2C-Ar), 129.2(C ipso -Ar), 128.5 (2C-Ar), 97.5 (C-1), 72.4 (C-2), 70.6 (CH 2 O, C-4, C-5), 70.2 (CH 2 O), 70.1 (CH 2 O), 70.0 (CH 2 O), 67.9 (C-3), 67.1 (CH 2 O), 61.3 (CH 2 O), 50.5 (CH 2 N 3 ), 20.9 (COCH 3 ); ESI-MS: m/z calcd. for C 33 H 35 N 3 O 11 : 483.2; found: 522.4 [M + K] + . ESI-HRMS: m/z calcd. for C 21 H 29 N 3 O 10 Na [M + Na] + : 506.1745; found: 506.1745. 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-3,4,6-tri-O-benzoyl-α- D -mannopyranoside (80) 147 To a solution of 78 (1.16 g, 2.01 mmol) and CSA (47 mg, 0.20 mmol) in CH 3 CN (10 mL), trimethyl orthoacetate (0.76 mL, 6.03 mmol) was added. The mixture was stirred at rt for 30 min. After that, the reaction mixture was quenched with Et 3 N and the solvent was evaporated. Then, the residue was dissolved in EtOAc and 1M HCl and the reaction was stirred at rt for 1 h.The organic phase was separated and dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum.To a solution of the resulting residue in CH 2 Cl 2 (15 mL), Bz 2 O (1.82 g, 8.04 mmol), Et 3 N (1.7 mL, 12.06 mmol) and DMAP (49 mg, 0.40 mmol) were subsequently added. The reaction mixture was stirred at rt for 1 h and the solvent was removed. To a mixture of the resulting residue and acetic acid (0.36 mL, 6.29 mmol) in anh. THF (15 mL), a cold solution of HF-pyridine complex (2.4 mL, 26.63 mmol) was slowly added. The reaction mixture was stirred Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 284 at rt for 3 h. Then, the solvent was evaporated and the residue was dissolved with EtOAc and washed with NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic phase was dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated under vacuum. To a solution of the crude in CH 2 Cl 2 (15 mL), Bz 2 O (909 mg, 4.02 mmol), Et 3 N (0.8 mL, 6.03 mmol) and DMAP (24 mg, 0.20 mmol) were subsequently added. The reaction mixture was stirred at rt for 1 h. Then, the crude was washed with NaHCO 3 sat. aq. soln. and the organic phase was dried over anh. MgSO 4 , filtered and concentrated. Finally, to the resulting residue in CH 3 CN (8 mL), a solution of HCl 7% in MeOH (40 mL) was added and the reaction was stirred at rt for 24 h. Then, the solvent was removed, the residue was dissolved in EtOAc and washed with NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic phase was dried over anh. MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated. The residue was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane, 1:1) to obtain the product 80 (809 mg, 1.25 mmol, 62%) as a white solid. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.02 (m, 2H, H-Ar), 7.95 (m, 4H, H-Ar), 7.51 (m, 3H, H-Ar), 7.37 (m, 6H, H-Ar), 5.94 (t, 1H, J = 10.0, H-4), 5.70 (dd, 1H, J = 10.0, J = 2.8, H-3), 5.06 (br s, 1H, H-1), 4.59 (dd, 1H, J = 11.9, J = 2.3, H-6a), 4.47 (m, 1H, H- 6b), 4.41 (m, 1H, H-5), 4.35 (m, 1H, H-2), 3.93 (m, 1H, CHHO), 3.82-3.72 (m, 3H, CHHO, CH 2 O), 3.72-3.65 (m, 6H, CH 2 CH 2 N 3 , CH 2 O), 3.38 (t, 2H, J = 4.9, CH 2 N 3 ); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.3 (CO), 165.7 (CO), 165.4 (CO), 133.3 (2 x C-Ar), 133.0 (C-Ar), 129.9(C- Ar), 129.8 (C-Ar), 129.7 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.4 (C-Ar), 128.4 (C-Ar), 100.0 (C-1), 72.7 (C-3), 70.8 (CH 2 O), 70.7 (CH 2 O), 70.2 (CH 2 O), 70.1 (CH 2 O), 69.3 (C-2), 68.7 (C-5), 67.2 (C-4, CH 2 O), 63.6 (C-6), 50.7 (CH 2 N 3 ); ESI-MS: m/z calcd. for C 33 H 35 N 3 O 11 : 649.2; found: 672.4 [M + Na] + ; ESI-HRMS: m/z calcd. for C 33 H 35 N 3 O 11 Na [M + Na] + : 672.2164; found: 672.2155. 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-(3,4,6-tri-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl)-(1→2)- 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranoside (84) 147 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 285 A solution of 80 (361 mg, 0.56 mmol), 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl trichloroacetimidate 83 151 (617 mg, 0.83 mmol) and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (8 mL) was stirred at 0ºC for 30 min. Then, TMSOTf (20 µl, 0.11 mmol) was added and the resulting mixture was stirred for 1 h at 0ºC. The reaction was quenched with Et 3 N (150 μL), and the mixture was diluted with CH 2 Cl 2 , filtered through Celite and washed with CH 2 Cl 2 . After removal of the solvent, the crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane, 1:2 → 1:1) to obtain the disaccharide 84 (546 mg, 0.44 mmol, 80%) as a white amorphous solid. 1 H-NMR(400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.08 (m, 4H, H-Ar), 8.03 (m, 2H, H-Ar), 7.95 (m, 6H, H-Ar), 7.87 (m, 2H, H-Ar), 7.51 (m, 5H, H-Ar), 7.35 (m, 16H, H-Ar), 6.10 (t, 1H, J = 9.9, J = 6.1, H-4 man,B ), 6.06-5.99 (m, 2H, H-3 manB , H-4 manA ), 5.94-5.89 (m, 2H, H-2 manB , H- 3 manA ), 5.27 (d, 1H, J = 1.7, H-1 manB ), 5.22 (s, 1H, J = 1.6, H-1 manA ), 4.69-4.52 (m, 4H, H-5 manB , H-6 manA, H-6 manB,a ), 4.50-4.43 (m, 2H, H-5 manA , H-6 manB,b ), 4.41 (dd, 1H, J = 3.2, J = 1.8, H- 2 manA ), 3.87 (m, 1H, CHHO), 3.70-3.59 (m, 9H, CHHO, CH 2 O, CH 2 CH 2 N 3 ), 3.35 (m, 2H, J = 5.0, CH 2 N 3 ). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.5 (CO), 166.2 (CO), 165.8 (CO), 165.7 (CO), 165.4 (CO), 165.2 (CO), 165.0 (CO), 133.5 (C-Ar), 133.4 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.2 (C-Ar), 133.2 (C-Ar), 133.1 (C-Ar), 130.1 (C-Ar), 130.0 (C-Ar), 129.9 (C-Ar), 129.8 (C-Ar), 129.7 (C- Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.9 (C-Ar), 128.6 (C-Ar), 128.6 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.4 (C-Ar), 99.7 (C-1 manB ), 98.8 (C-1 manA ), 77.3 (C-2 manA ), 70.9 (CH 2 O), 70.8 (CH 2 O), 70.3 (CH 2 O), 70.2 (C-2 manB , C-3 manA ), 69.9 (C-3 manB , C-5 manB ), 68.9 (C-5 manA ), 67.7 (C-4 manA ), 67.4 (CH 2 O), 66.9 (C-4 manB ), 63.8 (C-6 manA ), 63.0 (C-6 manB ), 50.7 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 67 H 61 N 3 O 20 : 1227.4; found: 1250.4 [M + Na] + ; ESI-HRMS: m/z calcd. for C 67 H 61 N 3 O 20 Na [M + Na] + : 1250.3741; found: 1250.3725. 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl α- D -mannopyranosyl)-(1-2)-α- D -mannopyranoside (73) 147 To a solution of 84 (869 mg, 0.71 mmol) in anh. MeOH (7.5 mL), a solution of sodium methoxide (76 mg, 1.42 mmol) in anh. MeOH (7.5 mL) was added. The reaction was stirred at Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 292 2H), 3.93-3.81 (m, 7H), 3.79-3.58 (m, 26H), 3.42 (t, J = 4.8 Hz, 2H, CH 2 N 3 ), 3.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H). 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ: 104.1, 103.9, 102.2, 101.8, 99.9, 80.5, 80.4, 79.9, 75.0-74.8, 74.4, 73.4, 72.4, 72.1, 72.0, 71.8, 71.6, 71.5, 71.3, 71.2, 69.1, 68.9, 68.7-68.6, 67.9, 67.5, 67.3, 63.0-62.9, 51.7 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 36 H 63 N 3 O 28 : 985.4; found: 1008.2 [M +Na] + ; ESI-HRMS: m/z calcd. for C 36 H 63 N 3 O 28 Na [M +Na] + : 1008.3490; found: 1008.3482. 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-(2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl)-(1→3)- (2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl)-(1→6)-2-O-acetyl-4-O-benzoyl-α- D - mannopyranoside (90) The mixture of diol acceptor 79 (97 mg, 0.20 mmol), 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D - mannopyranosyl trichloroacetimidate 83 151 (445 mg, 0.60 mmol) and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (5 mL) was stirred at -10ºC for 30 min. Then, TMSOTf (11 μL, 0.06 mmol) was added. After 45 min, the reaction mixture was neutralized with Et 3 N (88 μL), filtered through Celite and washed several times with CH 2 Cl 2 . After removal of solvent, the crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 2:3) to afford the trisaccharide 90 (224 mg, 0.14 mmol, 68%) as a white amorphous solid. = - 17 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H- NMR(400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.14 (dd, 2H, J =8.3, J = 1.4, H-Ar), 8.10-8.00 (m, 8H, H-Ar), 7.97 (dd, 2H, J =8.3, J = 1.4, H-Ar), 7.85-7.73 (m, 6H, H-Ar), 7.62-7.47 (m, 6H, H-Ar), 7.47-7.33 (m, 13H, H-Ar), 7.33-7.20 (m, 8H, H-Ar), 6.14-6.04 (m, 2H, H-4, H-4), 5.95 (dd, 1H, J = 10.1, J = 3.3, H-3), 5.81-5.71 (m, 3H, H-2, H-3, H-4), 5.54 (dd, 1H, J = 3.5, J = 1.7, H-2), 5.39 (dd, 1H, J = 3.3, J = 1.8, H-2), 5.30 (d, 1H, J = 1.9, H-1), 5.13 (d, 1H, J = 1.8, H-1), 5.01 (d, 1H, J = 1.7, H-1), 4.72 (dd, 1H, J = 12.3, J = 2.4, H-6), 4.64-4.45 (m, 5H, H-3, H-5, H-5, H-6, H-6), 4.39 (dd, 1H, J = 12.2, J = 4.3, H-6), 4.26 (ddd, 1H, J = 9.6, J = 6.2, J = 2.1, H-5), 4.09 (dd, 1H, J = 10.9, J = 6.3, H-6 a ), 4.00 (m, 1H, H-6 b ), 3.80-3.59 (m, 11H, H-5, CH 2 O, CH 2 CH 2 N 3 ), 3.32 (t, 2H, J = 5.1, CH 2 N 3 ), 2.37 (s, 3H, CH 3 COO); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 170.1 (CO), [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 293 166.2 (CO), 166.2 (CO), 165.6 (2CO), 165.5 (CO), 165.3 (CO), 165.3 (CO), 165.1 (CO), 164.5 (CO), 133.4 (C-Ar), 133.4 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.1 (C-Ar), 133.0 (C-Ar), 130.0 (C-Ar), 129.9 (C-Ar), 129.9 (C-Ar), 129.8 (C-Ar), 129.7 (C-Ar), 129.7 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (C- Ar), 129.2 (C-Ar), 129.1 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.9 (C-Ar), 128.6 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.4 (C-Ar), 128.3 (C-Ar) 128.2 (C-Ar), 99.4 (C-1), 97.7 (C-1), 97.5 (C-1), 74.8 (C-2), 71.1, 70.7 (CH 2 O), 70.4, 70.3, 70.2, 70.1, 69.7, 69.6, 69.3, 69.1, 68.9, 67.2, 66.8, 66.8, 66.5, 62.8 (C-6), 62.6 (C-6), 50.6 (CH 2 N 3 ), 21.1 (OCOCH 3 ); ESI-MS: m/z calcd. for C 89 H 81 N 3 O 28 : 1639.5; found: 1662.4 [M + Na] + and 1678.3 [M + K] + . 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-α- D -mannopyranosyl(1→3)[O-α-D- mannopyranosyl(1→6)]-α- D -mannopyranoside (76). To a solution of protected trisaccharide 90 (130 mg, 0.08 mmol) in anh. MeOH/anh. toluene (3:1 2.7 mL), NaOMe (8.5 mg, 0.16 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at rt for 3 h. Then, the mixture was neutralized with Amberlite IR 120 H + resin, filtered and the solvent was removed under vacuum. The crude was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20 MeOH), to give the trisaccharide 76 as a white amorphous solid (49 mg, 94%). 1 H-NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ: 5.10 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1), under D 2 O (1H, H-1), 4.79 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1), 4.09 (m, 1H, H-2), 4.01 (dd, J = 3.4 and 1.8 Hz, 1H, H-2), 3.92- 3.81 (m, 7H), 3.81-3.58 (m, 19H), 3.42 (m, 2H, CH 2 N 3 ). 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ: 102.6 (C-1), 100.5 (C-1), 100.0 (C-1), 79.5, 73.5, 73.0, 71.9, 71.2, 71.1, 70.7-70.7, 70.3, 70.2, 70.0- 70.0, 69.8, 67.4, 67.2, 66.5, 66.1, 65.9, 61.5, 50.4 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 24 H 43 N 3 O 18 : 661.3; found: 684.4 [M +Na] + ; ESI-HRMS: m/z calcd. for C 24 H 43 N 3 O 18 Na [M +Na] + : 684.2434; found: 684.2431. S-Tolyl 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D - mannopyranosyl-(1→6)]-2,4-di-O-benzoyl-α- D -mannopyranoside (92). Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 294 The mixture of diol acceptor 28 (168 mg, 0.34 mmol), 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D - mannopyranosyl trichloroacetimidate (83) 151 (752 mg, 1.02 mmol) and 4 Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (5 mL) was stirred at -10ºC for 30 min. Then, TMSOTf (20 μL, 0.10 mmol) was added. After 30 min, the reaction mixture was neutralized with Et 3 N (160 μL), filtered through Celite and washed several times with CH 2 Cl 2 . After removal of solvent, the crude was purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/toluene 1:10) to afford the trisaccharide 92 (449 mg, 0.27 mmol, 80%) as a white solid. = - 25 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR(400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.30 (dd, 2H, J = 7.5 and J = 2.1 Hz, H-Ar), 8.19-8.10 (m, 4H, H-Ar), 8.07-7.98 (m, 6H, H-Ar), 7.90-7.83 (m, 4H, H-Ar), 7.80 (d, 2H, J = 7.8 Hz, H-Ar), 7.72 (d, 2H, J = 7.7 Hz, H- Ar), 7.62-7.24 (m, 30H, H-Ar), 7.24-7.15 (m, 4H), 6.12 (t, 1H, J = 10.1 Hz, H-4), 6.07-5.92 (m, 4H, H-2, 3H-3), 5.81 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-2), 5.78-5.69 (m, 2H, H-1, H-2), 5.42-5.34 (m, 2H, H-1), 5.13 (s, 1H, H-1), 4.85 (m, 1H, H-5), 4.67-4.28 (m, 7H, 4H-6), 4.21 (m, 1H, H-6), 3.80 (d, 1H, H-6), 2.21 (s, 3H, CH 3 Ph); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.3 (CO), 166.3 (CO), 166.2 (CO), 165.7 (CO), 165.6 (CO), 165.4 (CO), 165.3 (CO), 164.8 (CO), 138.7 (C-Ar), 133.8 (C- Ar), 133.6 (C-Ar), 133.5 (C-Ar), 133.4 (C-Ar), 133.4 (C-Ar), 133.2-133.1 (C-Ar), 132.9 (C-Ar), 130.3 (C-Ar), 130.2 (C-Ar), 130.1 (C-Ar), 130.0 (C-Ar), 130.0 (C-Ar), 129.8 (C-Ar), 129.7 (C- Ar), 129.4 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (C-Ar), 129.1 (C-Ar), 129.1 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.7 (C-Ar), 128.6 (C-Ar) 128.6 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.4 (C-Ar), 128.3 (C-Ar), 99.7 (C-1), 98.1 (C-1), 86.7 (C-1), 73.4, 70.8, 70.5, 70.3 (CH 2 O), 69.9, 69.5, 69.0, 68.8, 67.3, 66.7, 66.6, 62.8, 62.7, 21.2 (CH 3 Ph); ESI-MS: m/z calcd. for C 95 H 78 O 25 S: 1651.5; found: 1674.0 [M + Na] + ; ESI-HRMS: m/z calcd. for C 95 H 78 O 25 SNa [M + Na] + : 1550.4177; found: 1673.4457. 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl-(1→3)-2- O-benzoyl-4,6-O-benzylidene-α- D -mannopyranoside (93). [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 295 The solution of monosaccharide donor 91 (342 mg, 0.49 mmol), acceptor 25 (172 mg, 0.32 mmol) and 4Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (8.0 mL) was stirred at - 20ºC for 30 min. Then, NIS (115 mg, 0.49 mmol) and TfOH (8.6 μL, 0.10 mmol) were added. The mixture was filtered through Celite and the filtrate was washed successively with Na 2 S 2 O 3 sat. aq. soln., NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic layer was dried over anh. MgSO 4 , concentrated and purified by column chromatography on silica gel (acetone/toluene 1:8) to obtain the disaccharide 93 (271 mg, 0.24 mmol, 75%) as a white amorphous solid. = - 52 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.31 (m, 2H, H-Ar), 8.18 (m, 2H, H-Ar), 8.03 (m, 2H, H-Ar), 7.92 (m, 2H, H- Ar), 7.82 (m, 2H, H-Ar), 7.68 (m, 1H, H-Ar), 7.65-7.49 (m, 7H), 7.48-7.23 (m, 12H), 6.17 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H-4 man,B ), 5.85 (dd, J = 3.3 and 1.9 Hz, 1H, H-2 man,B ), 5.83-5.77 (m, 2H, H-3 manB , H acetal ), 5.73 (dd, J = 3.7 and 1.5 Hz, 1H, H-2 manA ), 5.55 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-1 manB ), 5.13 (d, J = 1.5 Hz, 1H, H-1 manA ), 4.79 (dd, J = 12.3 and 2.4 Hz, 1H, H-6 manB,a ), 4.69-4.58 (m, 2H, H-3 manA , H-5 manB ), 4.48 (dd, J = 12.4 and 3.5 Hz, 1H, H-6 manB,b ), 4.40 (dd, J = = 10.1 and 4.7 Hz, 1H, H- 6 manA,a ), 4.33 (t, J = 9.7 Hz, 1H, H-4 manA ), 4.11 (td, J = 9.8 and 4.7 Hz, 1H, H-5 manA ), 3.97 (t, J = 10.2 Hz, 1H, H-6 manA,b ), 3.90 (m, 1H, CHHO), 3.79-3.65 (m, 9H, CH 2 O, CH 2 CH 2 N 3 ), 3.35 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CH 2 N 3 ). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.3 (CO), 166.2 (CO), 165.3 (CO), 165.2 (CO), 165.0 (CO), 137.1 (C-Ar), 133.6 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.1 (C-Ar), 133.0 (C-Ar), 130.1 (C-Ar), 130.1 (C-Ar), 129.9 (C-Ar), 129.8 (C-Ar), 129.7 (C-Ar), 129.6 (C-Ar), 129.4 (C- Ar), 129.3 (C-Ar), 129.1 (C-Ar), 128.8 (C-Ar), 128.6 (C-Ar), 128.5 (C-Ar), 128.4 (C-Ar), 128.3 (C-Ar), 128.2 (C-Ar), 126.0 (C-Ar), 101.4 (C acetal ), 99.1 (C-1 manB ), 98.7 (C-1 manA ), 78.9 (C- 4 manA ), 73.3 (C-3 manA ), 72.2 (C-2 manA ), 70.9, 70.7, 70.2-70.0 (CH 2 O, C-2 manB , C-3 manB ), 69.4 (C- 5 manB ), 68.7 (C-6 manA ), 67.1 (CH 2 O), 66.6 (C-4 manB ), 63.6 (C-5 manA ), 62.6 (C-6 manB ), 50.6 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 60 H 57 N 3 O 18 : 1107.4; found: 1130.3 [M + Na] + . ESI-HRMS: m/z calcd. for C 60 H 57 N 3 O 18 Na [M + Na] + : 1130.3529; found: 1130.3525. 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl-(1→3)-2- O-benzoyl-α- D -mannopyranoside (94). [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 296 p-Toluenesulfonic acid monohydrate (62 mg, 0.32 mmol) was added to a stirred solution of the disaccharide 93 (236 mg, 0.21 mmol) in CH 3 CN (10 mL) at rt. After 24 h, the reaction mixture was quenched with Et 3 N (30 μL) and concentrated under vacuum. The residue was purified by column chromatography on silica gel (acetone/toluene 1:4) to give the disaccharide 94 (180 mg, 0.18 mmol, 83%) as a white amorphous solid. = - 27 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR(400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.21 (m, 2H, H-Ar), 8.12 (m, 2H, H-Ar), 7.96 (m, 2H, H-Ar), 7.80 (m, 2H, H-Ar), 7.70 (m, 2H, H-Ar), 7.60-7.36 (m, 9H, H-Ar), 7.33-7.20 (m, 6H), 6.13 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H- 4 man,B ), 5.86 (dd, J = 3.2 and 1.9 Hz, 1H, H-2 man,B ), 5.75 (dd, J = 10.1 and 3.2 Hz, 1H, H-3 manB ), 5.62 (dd, J = 3.2 and 1.7 Hz, 1H, H-2 manA ), 5.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-1 manB ), 5.10 (d, J = 1.7 Hz, 1H, H-1 manA ), 4.67 (dd, 1H, J = 12.5 and 2.5 Hz, H-6 manB,a ), 4.49-4.30 (m, 4H, H-3 manA , H- 4 manA, H-5 manB , H-6 manB,b ), 4.07-4.00 (m, 2H, 2H-6 manA ), 3.94-3.82 (m, 2H, H-5 manA , CHHO), 3.73-3.61 (m, 9H, CH 2 O, CH 2 CH 2 N 3 ), 3.37 (m, 2H, CH 2 N 3 ). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.1 (CO), 166.1 (CO), 165.7 (CO), 165.4 (CO), 165.1 (CO), 133.5 (C-Ar), 133.4 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.2 (C-Ar), 133.0 (C-Ar), 130.0-129.6 (C-Ar), 129.2 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.9 (C-Ar), 128.7-128.3 (C-Ar), 99.9 (C-1 manB ), 97.7 (C-1 manA ), 79.2 (C-4 manA ), 77.4, 72.3- 72.3, 70.8-70.7, 70.5, 70.2-70.1 (CH 2 O, C-2 manA , C-2 manB , C-3 manA , C-3 manB, C-5 manA ), 69.5 (C- 5 manB ), 67.1 (CH 2 O), 66.2 (C-4 manB ), 62.4 (C-6 manB ), 62.2 (C-6 manA ), 50.6 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 53 H 53 N 3 O 18 : 1019.3; found: 1042.2 [M + Na] + . ESI-HRMS: m/z calcd. for C 53 H 53 N 3 O 18 Na [M + Na] + : 1042.3216; found: 1042.3209. [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 297 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl-(1→3)- {2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α- D - mannopyranosyl)-(1→6)]-2-O-benzoyl-α- D -mannopyranosyl)-(1→6)}-2-O-benzoyl-α- D - mannopyranoside (95). The solution of trisaccharide donor 92 (387 mg, 0.23 mmol), acceptor 94 (159 mg, 0.16 mmol) and 4Å molecular sieves in anh. CH 2 Cl 2 (8.0 mL) was stirred at -20ºC for 30 min. Then, NIS (55 mg, 0.23 mmol) and TfOH (4 μL, 0.046 mmol) were added. The mixture was filtered through Celite and the filtrate was washed successively with Na 2 S 2 O 3 sat. aq. soln., NaHCO 3 sat. aq. soln. The organic layer was dried over anh. MgSO 4 , concentrated and purified by column chromatography on silica gel (EtOAc/n-hexane 2:3) to obtain the pentasaccharide 95 (316 mg, 0.12 mmol, 70%) as a white solid. = - 30 (c 1.00, CHCl 3 ). 1 H-NMR(400 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.27 (d, 2H, J = 7.1, H-Ar), 8.20-8.03 (m, 10H, H-Ar), 8.01-7.96 (m, 4H, H-Ar), ), 7.88-7.81 (m, 6H, H-Ar), ), 7.73-7.66 (m, 8H, H-Ar), 7.64-7.49 (m, 10H, H-Ar), 7.48-7.16 (m, 33H, H-Ar), 7.14 (t, 2H, J = 7.6, H-Ar), 6.14 (t, 1H, J = 10.0, H-Ar), 6.10-6.01 (m, 3H), 5.88 (t, 1H, J = 10.0), 5.83 (dd, J = 3.5, J = 1.6, 1H), 5.75 (dd, 1H, J = 3.2, J = 1.8), 5.73-5.67 (m, 3H), 5.63 (m, 1H), 5.43 (d, 1H, J = 1.5, H-1), 5.39 (dd, 1H, J =3.2, J = 1.9), 5.36 (m, 2H, H-1, H-1), 5.19 (d, 1H, J = 1.8, H-1), 5.12 (d, 1H, J = 1.6, H-1), 4.72 (dd, 1H, J =9.7, J =3.5), 4.66-4.11 (m, 17H), 3.95 (m, 1H), 3.82 (dd, 1H, J = 10.9, J =2.0), 3.78-3.51 (m, 9H), 3.29 (m, 2H, CH 2 N 3 ); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: 166.3 (CO), 166.2 (3CO), 166.1 (2CO), 166.0 (CO), 165.6 (CO), 165.4 (CO), 165.2 (3CO), 165.0 (CO), 164.8 (CO), 164.8 (CO), 133.7 (C-Ar), 133.5 (C-Ar), 133.4 (C-Ar), 133.3 (C-Ar), 133.2 (C-Ar), 133.0 (C-Ar), 130.3-129.5 (C-Ar), 129.4 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.3 (C-Ar), 129.2 (C-Ar), 129.1 (C-Ar), 129.0 (C-Ar), 128.8- 128.0 (C-Ar), 99.9 (C-1), 99.9 (C-1), 97.5 (C-1), 97.5 (C-1), 96.7 (C-1), 79.0, under CDCl 3 [ ] 20 D α Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 298 (2C), 72.4, 72.1, 70.8, 70.6, 70.4, 70.4, 70.3, 70.2, 70.1, 69.8, 69.7, 69.7, 69.5, 69.0, 68.8, 67.7, 67.0, 66.7, 66.4, 66.3, 62.8, 62.6, 62.3, 50.7 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 143 H 123 N 3 O 43 : 2546.7; found: 2569.5 [M + Na] + and 1296.2 [M + 2Na] 2+ ; ESI-HRMS m/z calcd. for C 143 H 123 N 3 O 43 Na [M + Na] + : 2568.7423; found: 2568.7351. 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethyl O-α- D -mannopyranosyl-(1→3)-{α- D -mannopyranosyl- (1→3)-[α- D -mannopyranosyl)-(1→6)]-O-α- D -mannopyranosyl)-(1→6)}-O-α- D - mannopyranoside (77). To a solution of protected pentasaccharide 95 (300 mg, 0.12 mmol) in anh. MeOH/anh. toluene (2:1 2.7 mL), NaOMe (19 mg, 0.35 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at rt for 3 h. Then, the mixture was neutralized with Amberlite IR 120 H + resin, filtered and the solvent was removed under vacuum. The crude was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH-20 MeOH), to give the pentasaccharide 77 as a white amorphous solid (110 mg, 95%). 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 5.15 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-1), 5.13 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-1), 4.92 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-1), 4.91-4.85 (m, 2H, 2H-1), 4.19-4.13 (m, 2H, 2H-2), 4.13-4.06 (m, 2H, 2H-2), 4.03-3.98 (m, 2H, H-2), 3.96-3.83 (m, 12H), 3.82-3.64 (m, 22H), 3.52 (m, 2H). 13 C- NMR (100 MHz, D 2 O) δ: 102.4, 102.3, 100.2, 99.4, 99.3, 78.7-78.5, 73.3-73.3, 72.7, 70.9-70.9, 70.6, 70.4, 70.1-70.0, 69.7-69.6, 69.3, 66.7, 65.8-65.6, 65.3, 61.0-60.9, 50.1 (CH 2 N 3 ). ESI-MS: m/z calcd. for C 36 H 63 N 3 O 28 : 985.4; found: 1008.1 [M +Na] + ; ESI-HRMS: m/z calcd. for C 36 H 63 N 3 O 28 Na [M +Na] + : 1008.3490; found: 1008.3478. Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 299 Glycodendron 96. The pentasaccharide 77 (50 mg, 50.74 μmol) and [2-[2-(2- Chloroethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxymethyl trikis(2-propyniloxymethyl)-methane (43) (5.6 mg, 12.68 μmol) were dissolved in H 2 O/DMSO (1:1, 0.8 mL). Fresh solutions of CuSO 4 ·5H 2 O (6.74 μmol), tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) (12.68 μmol) and sodium ascorbate (19.03 μmol) were added to a sealed microwave vial. The solution was heated at 60ºC in a microwave oven for 30 min. A metal scavenger resin, QuadrasilMP, was added to the reaction solution and stirred for 20 min at rt. After that, the mixture was filtered and the resulting solution was purified by size-exclusion chromatography (Sephadex LH20 MeOH) yielding the glycodendron 96 (30 mg, 8.88 μmol, 70%) as a white amorphous solid. 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.04 (s, 3H, 3H triazole ), 5.14 (br s, 3H, 3H-1), 5.10 (br s, 3H, 3H-1), 4.91 (br Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 300 s, 3H, 3H-1), 4.86 (br s, 3H, 3H-1), 4.84 (br s, 3H, 3H-1), 4.63 (t, J = 5.0 Hz, 6H, OCH 2 CHHN), 4.57 (br s, 6H, OCHHC triazole ), 4.20-4.11 (m, 6H), 4.11-4.05 (m, 6H), 4.03-3.61 (m, 128H), 3.54 (m, 1H), 3.44 (br s, 2H), 3.39 (br s, 1H). 13 C-NMR (100 MHz, D 2 O) δ: 144.2, (C triazole ), 125.3 (CH triazole ), 102.4 (C-1), 102.3 (C-1), 100.2 (C-1), 99.4 (C-1), 99.2 (C-1), 78.7, 78.5, 73.3-73.3, 72.7, 70.9-70.8, 70.6, 70.4, 70.1-70.0, 69.7-69.5, 68.8, 68.3, 66.7-66.6, 65.7, 65.5, 65.2-65.1, 63.5 (OCH 2 C triazole ), 61.0-60.9, 50.0 (OCH 2 CH 2 N), 44.7 (CCH 2 O), 43.2 (CH 2 Cl). ESI-MS: m/z calcd. for C 130 H 222 N 9 O 91 Cl: 3401.3; found: 1723.7 [M+2Na] +2 and 1156.7 [M+3Na] +3 . Glycodendron 97. 3 3 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Parte Experimental 301 To a solution of glycodendron 96 (27.0 mg, 7.94 μmol) in DMF (1.5 mL) sodium azide (5.2 mg, 79.38 μmol) was added. The mixture was stirred at 70ºC for 2 days. After that time, the solvent was concentrated and the crude was purified using Amicon Ultra-15 centrifugal filters (MWCO 3 KDa), yielding the glycodendron 97 (27 mg, quantitative) as a white amorphous solid. 1 H- NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.04 (s, 3H, 3H triazole ), 5.14 (br s, 3H, 3H-1), 5.10 (br s, 3H, 3H-1), 4.91 (br s, 3H, 3H-1), 4.86 (br s, 3H, 3H-1), 4.84 (br s, 3H, 3H-1), 4.63 (t, J = 5.0 Hz, 6H, OCH 2 CHHN), 4.57 (br s, 6H, OCHHC triazole ), 4.20-4.11 (m, 6H), 4.11-4.05 (m, 6H), 4.03-3.61 (m, 128H), 3.54 (m, 1H), 3.44 (br s, 2H), 3.39 (br s, 1H). 13 C-NMR (100 MHz, D 2 O) δ: 144.1, (C triazole ), 125.3 (CH triazole ), 102.4 (C-1), 102.3 (C-1), 100.2 (C-1), 99.4 (C-1), 99.2 (C-1), 78.7- 78.5, 73.3-73.3, 72.7, 70.9-70.8, 70.6, 70.4, 70.1-70.0, 69.7-69.5, 69.2, 68.8, 68.3, 66.7-66.6, 65.7, 65.5, 65.2-65.1, 63.5 (OCH 2 C triazole ), 61.0-60.9, 50.1 (CH 2 N 3 ), 50.0 (OCH 2 CH 2 N), 44.7 (CCH 2 O). ESI-MS: m/z calcd. for C 130 H 222 N 12 O 91 : 3407.8; found: 1726.9 [M+2Na] +2 , 1158.9. [M+3Na] +3 . 8.2.2 Evaluation of immune response of glycodendrons and neoglycoproteins Monocytes CD14 + isolation. Peripheral blood was obtained from healthy donors in Hospital Sa o Joa o (Porto, Portugal) and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by density gradient centrifugation using Lymphoprep™ (STEMCELL Technologies). The interface of PBMCs was collected and washed with PBS by centrifugation. The pellet was resuspended in MACS buffer (PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA) to get a final concentration of 10 7 cells in 80 μL of buffer. 15 μL of microbeads CD14 + (Miltenyi Biotec) were added to 10 7 cells and incubated 15 min at 4ºC. Then, the cell suspension was added in the LS column (Miltenyi Biotec) placed in the magnetic field and the CD14 - fraction was collected. After washing, the magnetic field was removed and MACS buffer was added to flush out the fraction with the magnetically labeled cells. After centrifugation the pellet was resuspended in complete RPMI media supplemented with 50 ng/mL of recombinant IL-4 and GM-CSF (Peprotech) in the concentration of 10 6 cells/mL. In 6 well plates, 5 mL of supplemented media was added in each well and change the medium after 3 days. At 6 th day, the dendritic cells were collected and were counted. In 96 well plate, 5x10 4 Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc Capítulo 8 308 MP was added to the crude product and the mixture was shaken for 20 min to remove the copper catalyst. After filtration, the crude was purified by ultrafiltration in H 2 O with YM5 membranes to obtain the compound 118 (90 mg, 62% yield). 1 H-RMN (400 MHz, D 2 O) δ: 8.02 (s, 9H), 7.97 (s, 3H), 7.83 (s, 1H), 6.36-6.15 (m, 2H), 5.78 (dd, J = 9.9 Hz, J = 1.6 Hz, 1H), 4.79 (under D 2 O, 9H), 4.67-4.60 (m, 12H), 4.58-4.50 (m, 20H), 4.50-4.46 (m, 3H), 4.15-4.01 (m, 9H), 3.96-3.27 (m, 450H), 3.15-3.03 (m, 9H), 2.70 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.93 (m, 2H). 13 C-NMR (100 MHz, D 2 O) δ: 176.2, 168.4, 144.3, 144.2, 129.9, 127.4, 125.3, 125.1, 123.6, 99.6, 72.8, 70.5, 69.9, 69.6, 68.9, 68.8-68.7, 68.2, 67.5, 66.4, 65.4, 63.6, 60.7, 50.0, 49.8, 44.8, 39.0, 38.9, 35.0, 25.1, 24.0. MALDI-TOF MS: MS (CHCA): m/z calcd: M p 7101; found: M p 7137. Glycopolymer 119. The building block 105 (27 mg, 0.009 mmol) and mannosyl nonasaccharide Man 9 44 87 (33 mg, 0.022 mmol) were dissolved in t BuOH/H 2 O (1:1, 0.05 M final concentration of polymer). Fresh solutions of CuSO 4 pentahydrate (0.006 mmol) and sodium ascorbate (0.028 mmol) were added and the mixture was stirred at rt for 48 h protected from light. A small amount of Quadrasil® MP was added to the crude product and the mixture was shaken for 20 min to remove the copper catalyst. After filtration, the crude was purified by Sephadex LH20 in MeOH to obtain the compound 119 (35 mg, 87% yield). 1 H-RMN (400 MHz, D 2 O) δ: 7.88 (s, 1H), 6.36-6.16 (m, 2H), 5.79 (dd, J = 9.9 Hz, J = 1.8 Hz, 1H) 5.41 (br s, 1H), 5.35-5.28 (m, 2H), 5.15 (br s, 1H), 5.09-5.02 (m, 3H), 4.87 (br s, 1H), 4.67-4.60 (m, 2H), 4.57 (br s, 1H), 4.31-4.20 (m, 1H), 4.18- 3.46 (m, 491H), 3.40-3.36 (m, 2H), 2.75 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.98 (m, 2H). 13 C-NMR (100 MHz, D 2 O) δ: 176.2, 168.5, 129.9, 127.4, 123.6, 102.3, 102.2 (2C), 100.7, 100.6 (2C), 99.6, 99.5, 98.0, 86.0, 78.9, 78.6, 78.5, 73.2-73.1, 72.7, 71.6, 70.3, 70.1, 70.0, 69.6, 68.8, 68.7, 67.5, 66.9-66.8, 61.2-60.9, 53.0, 39.0, 38.9, 34.9, 25.1, 24.0. MALDI-TOF MS: MS (CHCA): m/z calcd: M p 4865; found: M p 5016. General procedure for the preparation of nanogels 120-124. Nanogels were synthesized by free radical polymerization using a miniemulsion technique to template the nanogels formation. In a representative example, mannose-polymer 109 (23 mg, Código seguro de Verificación : GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc 28/04/2020 08:56:31 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000018397 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-28b5-113d-b76a-4932-83f3-4bdf-82d4-e8bc [Document text truncated for crawler view.]