Inhibidores de bombas de eflujo: Nueva estrategia frente a la resistencia a los antibióticos

Trabajo de Fin de Grado (TFG) Revisión Bibliográfica Grado en Farmacia INHIBIDORES DE BOMBAS DE EFLUJO: NUEVA ESTRATEGIA FRENTE A RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS Alumna: Marta Carmona Jerez Tutora: Francine Amaral Piubeli Departamento de microbiología y parasitología Facultad de Farmacia Sevilla, julio de 2022 1 2 ÍNDICE 1. Introducción.......................................................................................................Pág. 3 2. Objetivos............................................................................................................Pág. 5 3. Metodología.......................................................................................................Pág. 5 4. Resultados y discusión.......................................................................................Pág. 6 4.1. Descripción de las familias de bombas de eflujo: Superfamilia ABC........................................................................................Pág. 6 Superfamilia de facilitadores principales (MFS)...........................................Pág. 7 Familia de expulsión de toxinas y múltiples fármacos (MATE).....................Pág. 8 Superfamilia de resistencia-nodulación-división celular (RND).....................Pág. 9 Pequeña familia de resistencia a múltiples fármacos (SMR)........................Pág. 11 Familia de eflujo de compuestos proteobacterianos (PACE).........................Pág. 12 4.2. Clasificación de los inhibidores de bombas de eflujo: Según su origen..........................................................................................Pág. 12 Según su mecanismo de acción...................................................................Pág. 17 4.3. Implicación de los inhibidores de bomba de eflujo .....................................Pág. 19 en la resistencia a los antibióticos 5. Conclusiones.....................................................................................................Pág. 24 6. Bibliografía.......................................................................................................Pág. 25 3 Resumen. En las últimas décadas, el estudio de las bombas de eflujo bacterianas ha sido clave para conocer el impacto en la multirresistencia a antimicrobianos. La resistencia puede atribuirse al uso indebido y fuera del control sanitario, tanto en el tratamiento de infecciones clínicas como su utilización en sectores alimentarios, siendo una amenaza para la salud pública que alcanza ya niveles globales. Uno de los mecanismos de resistencia más extendidos es la capacidad de exportación de medicamentos mediante sistemas de eflujo. Las bombas de eflujo no solo intervienen en la expulsión del fármaco fuera de la célula bacteriana, sino que son la causa principal de la virulencia y adaptación que inducen la resistencia a los antimicrobianos en el transcurso de la infección. La inhibición de estas bombas es una estrategia de interés, ya que el descubrimiento y la síntesis de nuevos antibióticos está disminuyendo. Esta revisión se centra en la descripción de los distintos inhibidores de bombas de eflujo (EPI: Efflux Pump Inhibitors), tanto de fuentes naturales como sintéticas, así como de las bacterias a las que afectan. Además, comprobamos el poder inhibitorio de varios EPI en bacterias significativamente clínicas como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Salmonella Typhimurium. Los resultados podrían extrapolarse a otras especies bacterianas y constituir una nueva estrategia en la búsqueda de terapias antimicrobianas. Palabras clave: resistencia, eflujo, EPI, AcrB. 1. Introducción: La resistencia a antibióticos es ya una crisis de salud pública global. “Alrededor de 33.000 personas mueren cada año en Europa como consecuencia de infecciones resistentes, unas 4.000 muertes en España, lo que supone cuatro veces más que las muertes provocadas por accidentes de tráfico” (1). Hablamos de resistencia a los antibióticos cuando las bacterias que eran sensibles a ciertos fármacos antibióticos, dejan de ser susceptibles a ellos. Esta susceptibilidad puede ser evaluada en un laboratorio mediante la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), es decir, la concentración mínima de antibiótico necesaria para inhibir el crecimiento de un patógeno bacteriano (2). Este proceso dificulta el tratamiento, aumenta la propagación de las enfermedades derivadas de la infección pudiendo aparecer formar graves y llegar a provocar la muerte (3). La OMS ya informó en 2014 de este problema de farmacorresistencia, indicando tasas de resistencia al alza en patógenos clínicamente significativos comunes como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. Lo relevante de este informe es que muchas de estas bacterias ya presentaban un fenotipo que otorga resistencia a 4 múltiples fármacos (MDR), que puede ser debido a uno o más mecanismos de resistencia implicados (4). El gen de resistencia puede llegar a la bacteria por un proceso evolutivo o por mutaciones (transferencia vertical) y ser transmitido a las sucesivas generaciones por replicación. Otro de los procesos que intervienen en la adquisición de resistencia seria la transferencia horizontal de genes, a través de elementos móviles del genoma bacteriano (5,6). Los ejemplos tradicionales de resistencia bacteriana pueden suponer la modificación del objetivo de tal modo que altere la conexión de los antimicrobianos con la proteína diana, la eliminación o cambio enzimático de los antimicrobianos y/o el impedimento en el acceso a las dianas celulares por la disminución de la cantidad de fármaco producido por un fenómeno de eflujo (6). No obstante, de todos los ejemplos citados, son las bombas de eflujo las que se encuentran más extendidas tanto en bacterias Gram positivas como en bacterias Gram negativas. Mientras que algunas bombas de eflujo expulsan de manera selectiva ciertos tipos de antibióticos, otras expulsan diversas clases de fármacos, lo que conduce a la evolución de bacterias resistentes a múltiples medicamentos. Es decir, a bacterias capaces de tolerar más de un antibiótico (7). Las bombas de eflujo son proteínas transmembranales que actúan extrayendo antibióticos y múltiples fármacos de acción tóxica, por lo que son consideradas como un importante mecanismo de resistencia y protección celular bacteriano. Dependiendo del fármaco o toxina, este mecanismo puede ser el más rápido y efectivo de todos los que posee la bacteria (8). Las bombas, también llamadas de “expulsión de múltiples fármacos”, se han dividido en seis familias de transportadores en función de su estructura, el número de regiones transmembrana que abarcan, fuentes de energía y sustratos (4): 1) la superfamilia ABC, cuyos transportadores activos se consideran primarios al utilizar la energía de hidrólisis de ATP; 2) la superfamilia de facilitadores principales (MFS); 3) la familia de expulsión de toxinas y múltiples fármacos (MATE); 4) la superfamilia de resistencia-nodulación-división celular (RND), 5) la pequeña familia de resistencia a múltiples fármacos (SMR), que presenta una pequeña extensión conocida como 6) familia de eflujo de compuestos proteobacterianos (PACE). Estos cinco últimos grupos son transportadores activos secundarios que utilizan la energía electroquímica tomada de gradientes iónicos transmembrana (9). Los patrones de expresión de las bombas ponen de manifiesto una compleja regulación tanto transcripcional como postranscripcional con enlace a muchos procesos celulares, incluyendo el 5 metabolismo central. No solo juegan un papel importante en la expulsión de compuestos nocivos, sino que se ha visto que pueden transportar toxinas proteicas que aumentan los factores bacterianos de virulencia, además de promover la comunicación célula a célula y la formación de biopelículas protectoras (8). 2. Objetivos: El objetivo global del presente estudio es realizar una revisión bibliográfica acerca de la implicación de los sistemas de eflujo en la resistencia adquirida de bacterias clínicamente significativas. Para cumplir con esta finalidad, se realizaron objetivos específicos entre los que encontramos: (1) Describir en profundidad las características que diferencian a las seis familias de bombas de eflujo, sus estructuras, los sustratos a los que son afines, las bacterias que las presentan, así como los compuestos que son capaces de inactivar su función, conocidos como inhibidores de bombas de eflujo (EPIs). (2) Verificar estudios que han utilizado EPIs de origen natural y sintético como inhibidores de bombas de eflujo y mencionar sus efectos en la resistencia a los antibióticos. Se evalúan fármacos ya existentes, productos procedentes de microorganismos como la Elaiofilina e inhibidores sintetizados in silico, entre otros. 3. Metodología: Se ha realizado una revisión bibliográfica para reunir información sobre la resistencia a antibióticos mediada por bombas de expulsión de múltiples fármacos (MDR), sobre sus características, sobre los inhibidores que presentan cada una de las familias de bombas y las bacterias más significativas de cada grupo. Se han buscado diferentes artículos a través de las bases de datos de la web FAMA de la Universidad de Sevilla, de PubMed, Medline, utilizando palabras clave como “efflux pump”, “resistance”, “inhibitors”, “pathogenicity island”. Utilizando estos términos, llegamos a los artículos experimentales que sirven como base fundamental de esta revisión. Se comparan los resultados del uso de moléculas inhibidoras de bombas de eflujo para comprender los mecanismos comprometidos en el funcionamiento de las bombas de expulsión. También se seleccionaron las referencias de los artículos considerados relevantes. Además, se consultaron las páginas web de la OMS (Organización Mundial de la Salud) y la AEMPS (Asociación Española de Medicamentos y Productos Sanitarios). 6 4. Resultados y discusión: 4.1. Descripción de las familias de bombas de eflujo: Superfamilia ABC (ATP Binding Casette). Los transportadores de la gran familia ABC son considerados transportadores primarios. Utilizan directamente la energía de unión e hidrólisis de ATP para mediar el porte de solutos hacia el exterior de la célula bacteriana(10) (Fig. 1). Estructuralmente, los transportadores ABC manifiestan dominios transmembrana (TMD) que presentan zonas de unión a sustratos y dominios de unión a nucleótidos (NBD) donde se hidroliza el ATP para promocionar el ciclo de transporte de compuestos y toxinas nocivos para la bacteria (8). Estas bombas de eflujo pueden separarse en dos subgrupos, transportadores homodiméricos y heterodiméricos. Los transportadores tipo ABC heterodiméricos tienen especial importancia en la resistencia antibiótica tanto intrínseca como adquirida de bacterias Gram positivas (7). Los transportadores tipo ABC homodiméricos tienen dos dominios semejantes de unión a nucleótidos, en tanto que los de tipo heterodimérico solo poseen un lugar de unión que no participa en la hidrólisis de ATP (11). “El contacto de la molécula de ATP en este dominio degenerado sirve como comunicación a través de la interfaz del dímero NBD-NBD y así impedir que se disocien completamente”. Por tanto, es una información relevante para poder diferenciar los subtipos ABC heterodiméricos y homodiméricos (12). El análisis estructural y funcional de los procesos de exportación e importación sugieren que son llevados a cabo mediante la sucesión de cambios conformacionales. Varían de un estado abierto hacia adentro, a un estado cerrado u ocluido y a un estado abierto hacia afuera para exportar los sustratos a través de la bicapa (7,13). Esta sucesión de cambios está ligados a la dimerización y disociación del dominio NBD gracias a la hidrólisis de la molécula de ATP (8). Las bombas de eflujo tipo ABC están presentes en bacterias clínicamente significativas tales como las pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, que gracias a la bomba MacAB-TolC han adquirido resistencia a los macrólidos como la eritromicina (14); Staphylococcus aureus que emplea una bomba conocida como MsrA que le confiere resistencia a los macrólidos y estreptograminas (15); y Streptococcus spp. que a través de la bomba PatAB provoca una neumonía resistente a fluoroquinolonas (15). En bacterias Gram negativas, la bomba MacAB-TolC aporta resistencia a fármacos como antimicrobianos y contribuye a la virulencia. MacB conforma una estructura triple ensamblada con la proteína externa de membrana TolC y con la proteína periplásmica MacA (Fig. 1). “Esta bomba produce la salida de antibióticos macrólidos y, además, el transporte de lipopéptidos de 7 la membrana externa, protoporfirina, factores de virulencia de polipéptidos y lipopolisacáridos”. La hidrólisis de ATP es producida por la proteína MacB, que impulsa el ciclo de transporte (8). Superfamilia de facilitadores principales (MFS). Es la familia de transportadores más amplia y con mayor diversidad de las descritas. Presentan un tamaño muy grande en relación con las demás familias de bombas de eflujo en estudio y se ha comprobado que los transportadores tipo MFS están presentes en cada uno de los dominios de la vida (8). La mayor parte de los componentes de esta superfamilia funcionan como unidades monoméricas únicas. Su longitud oscila entre los 400 y los 600 residuos de aminoácidos; y entre 12 y 14 hélices transmembrana (TMH) estructuradas en dos dominios. Cada dominio está compuesto de seis hélices cada uno (16). Los miembros MFS pueden subdividirse en uniportadores, simportadores o antiportadores según sea impulsado su ciclo de transporte. Los uniportadores mueven los sustratos mediante la bicapa lipídica sin necesidad de acoplar un gradiente de iones; los simportadores mueven los sustratos gracias al acoplamiento con un gradiente iónico en la misma dirección que el sustrato; y los antiportadores en su caso, trasladan los sustratos acoplados también a un gradiente de iones, pero en sentido opuesto a la dirección del sustrato (8). Las referencias estructurales recopiladas avalan la sucesión de cambios conformacionales muy parecidos a los descritos en los transportadores tipo ABC (17). El simportador permeasa de lactosa LacY es el prototipo por excelencia de la superfamilia MFS (16). La información Fig. 1. Esquema representativo de las bombas de eflujo en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, respectivamente (Rosner, 1993). 8 proporcionada del mecanismo de funcionamiento de LacY muestra que la importancia en la unión del protón y el sustrato en la proteína es la formación un complejo ternario(8). En concordancia con los datos proporcionados, tras la formación del complejo se alternarían los estados de apertura externa y apertura interna similares a los descritos en la superfamilia ABC (16). Entre las bacterias que utilizan transportadores tipo MFS, destacan la familia Enterobacteriaceae, que emplea la bomba EmrAB-TolC (Fig. 1), otorgando resistencia a novobiocina y fluoroquinolonas (18); Staphylococcus aureus resistente a fluoroquinolonas hidrofílicas, biocidas y antisépticos por su exportación gracias a NorA y QacAB (15) (Fig. 1); Mycobacterium tuberculosis implacable frente a isoniazida, fluoroquinolonas, tetraciclina y clofazimina mediante el uso de EfpA (19); y Streptococcus neumoniae emplea PmrA para crear resistencia a fluoroquinolonas (15). Familia de expulsión de toxinas y múltiples fármacos (MATE: Multimicrobiane Toxical Extrusion). Los integrantes de la familia MATE se organizan en subfamilias como NorM, DinF y eucariotas por analogía en su secuencia de aminoácidos (20). Un análisis estructural revela que los transportadores de las subfamilias NorM y DinF presentan dos paquetes de seis hélices transmembrana (TMH), siendo distintos en su topología a los presentes en la superfamilia MFS (21). En el caso que nos ocupa, los TMH se adaptan en un dominio central con aspecto de V expuesto hacia el espacio extracelular. Por ejemplo, transportador NorM de Neisseria gonorrhoeae presenta una cavidad de unión al fármaco cerca de la interfaz membrana-periplasma (22). Este cambio favorece la asimilación del sustrato (23). En el acoplamiento, intervienen enlaces iónicos y de hidrógeno (22,24). Los transportadores MATE bacterianos impulsan los distintos sustratos mediante fuerza protónmotriz a través de la membrana y/o utilizando gradientes de Na+ (Fig. 1). Los fármacos que se exportan son de carácter poliaromático y catiónico (20). El transportador NorM de Neisseria gonorrhoeae presenta tres residuos importantes que participan en la coordinación de Na+ (Y294, E261 y D377), conservados en gran medida tanto en la subfamilia NorM como en eucariotas y que participarían en el ciclo de transporte (24). La bomba NorM de Vibrio cholerae puede expulsar los sustratos mediante las dos vías mencionadas, tanto por gradiente de protones como de Na+. Aquí, un residuo de aspartato, D371, es el que interviene en el acoplamiento de H+ (25). 15 acción de fluoroquinolonas, macrólidos y cloranfenicol, en bacterias Gram negativas gracias a su acción inhibidora sobre las bombas tipo RND (62). Una importante bacteria Gram negativa, Pseudomonas aeruginosa, que expresa bombas RND tipo MexAM-OprM, incrementó la susceptibilidad a levofloxacino al administrarse junto a PAβN. Se vio potenciada la actividad de levofloxacino tanto en cepas silvestres de P. aeruginosa como en aquellas que son capaces de sobre expresar MexAB-OprM. También se vieron inhibidos otros sistemas de eflujo como MexCD-OprJ y MexEF-OprN. Además, PAβN pasó a tener categoría de EPI de amplio espectro por mostrar una actividad inhibitoria similar en sistemas de eflujo característicos de bacterias Gram positivas como la superfamilia ABC, con la bomba AcrAB-TolC (9,63). Sin embargo, inestabilidad de PAβN mostrada en ensayos preclínicos (ratones y suero humano), llevó a sintetizar un análogo conocido como MC-02,595 (64). Con este nuevo compuesto se pudo solventar cualquier problema anterior, siendo estable en sistemas biológicos y potenciando la acción de levofloxacino al nivel de la molécula original de PAβN, tanto in vivo como in vitro, contra P. aeruginosa (65). • Quinolina y derivados. El estudio de la estructura-actividad de estas moléculas orgánicas sintéticas puso de manifiesto que la capacidad como EPI es debido al anillo heterocíclico y a una cadena de alquilo lateral que presentan en su esqueleto (63). Las quinolinas y sus derivados, como la quinazolina, puede reestablecer la susceptibilidad de norfloxacino en E. aerogenes que sobre expresa AcrAB-TolC, mediante la inhibición competitiva de los exportadores RND (66). La CMI de cloranfenicol, tetraciclina y norfloxacino disminuyeron considerablemente en aislados in vitro de Klebsiella pneumoniae y Klebsiella aerogenes (anteriormente conocida como Enterobacter aerogenes) cuando se administraron conjuntamente (9). Otros derivados, como la 2-fenil-4(1H)-quinolona y la 2-fenil-4-hidroxiquinolina, que fueron creadas a partir de la transmutación de flavonas, tienen acción como inhibidores de NorA (familias MFS) en Staphylococcus aureus (9). • Arilpiperazinas y derivados. La estructura que funciona como espaciador entre el anillo de piperazina y el de benceno, junto a la presencia de halógenos en el anillo de benceno, son los encargados de la actividad inhibitoria de estas moléculas N-heterocíclicas. El cribado de alto rendimiento reveló que la 1-(1-naftil metil)-piperazina (NMP), era la molécula que presentaba mayor potencia de todos los derivados de arilpiperazinas probados (67). 16 NMP fue capaz de reestablecer la susceptibilidad debido a que producía un aumento intracelular dosis-dependiente de ciertos antibióticos. Un ejemplo de ello fue el incremento de la susceptibilidad de levofloxacino sobre en E. coli que expresa AcrAB. Además de disminuir la CMI de claritromicina, rifampicina y cloranfenicol (68). El único inconveniente que presentan estos compuestos y sus derivados es la toxicidad en mamíferos por su acción inhibitoria en la recaptación de serotonina (67). Otro derivado, la 3-arilpiperidina potencia la acción de linazolid al aumentar su acumulación en E. coli. Afecta a la función de la bomba AcrAB-TolC, aunque de forma parcial (69). • Piranopiridirina, piridopirimidina y derivados. Se ha informado que análogos de piridopirimidina, como D2 y D13-9001, funcionan como EPIs específicos de la bomba de eflujo MexAB-OprM de Pseudomonas aeruginosa. Tanto en condiciones in vitro como en ensayos in vivo (69). D13-9001 es capaz de inhibir el eflujo al unirse a los principales sitios de unión en las bombas (AcrB en E. coli y MexB en P.aeruginosa). El resto hidrofóbico que presenta en su estructura evita los cambios conformacionales que provocan el eflujo; el resto hidrófilo, evita la unión de los sustratos a la bomba (64). Un derivado sintético, MBX2319, restablece la susceptibilidad de ciprofloxacino, levofloxacino y piperacilina de E. coli AB1157. También se observó el aumento en la acumulación intracelular de colorante Hoechst tanto en la cepa salvaje como en E. coli que sobre expresa transportadores AcrAB-TolC (70). Un nuevo derivado, MBX3132, se ha informado de que interacciona con AcrB de Enterobacteriaceae, inhibiendo de forma alostérica el flujo en bacterias Gram negativas que sobre expresan AcrAB-TolC (71). EPIs derivados de microorganismos: Existen estructuras conocidas como EA-371α y EA-371d, extraídas de la fermentación con Streptomyces spp., identificadas específicamente como inhibidores de la bomba MexAB-OprM presente en Pseudomonas aeruginosa (72). El hecho de que haya una pequeña cantidad de inhibidores de bombas de eflujo procedentes de microorganismos abre una nueva puerta para crear derivados que presenten mayor potencia, biodisponibilidad y menos toxicidad que sus antecesores naturales o sintéticos (9). 17 4.2.2. Según su mecanismo de acción: EPIs que intervienen en la generación de energía. Procesos como la hidrólisis de ATP, el gradiente de Na+ o el gradiente de protones son mecanismos generadores de energía de los que dependen las bombas de eflujo (9). Dentro de este grupo, el más popular y utilizado en los laboratorios en la actualidad sigue siendo el cianuro de carbonilo-m-clorofenilhidrazona, más conocido como CCCP. “Dificulta la fuerza motriz del protón al afectar el potencial transmembrana (Δψ) y el pH transmembrana (ΔpH)” (73). Es decir, se ve afectado el metabolismo energético de la célula produciendo la inactivación de la bacteria por completo. Se consiguió reestablecer la susceptibilidad de la tetraciclina gracias a CCCP en Helicobacter pylori y Klebsiella spp. (74,75). A pesar de las buenas expectativas que ofrece, aún sigue siendo un EPI experimental por su toxicidad en mamíferos (76). Una molécula sintética, conocida como IITR08027, fue investigada por tener la propiedad de detener el gradiente de protones, pero afectar mínimamente al potencial transmembrana (Δψ) (73). El estudio demostró en primer lugar el aumento de la potencia de ciprofloxacino (76), al que se sumaron las fluoroquinolonas en Escherichia coli y Acinetobacter baumannii que sobreexpresan bombas de eflujo AbeM de tipo MATE (73). Demostró tener una toxicidad mucho menor que el CCCP en células de mamífero por lo que se convierte en un buen candidato para su evaluación pre-clínica (73). EPIs de unión directa a bombas de eflujo. Como cualquier proteína, la bomba de eflujo puede regularse mediante mecanismos alostéricos. “La unión puede ser competitiva, es decir, la unión del EPI al mismo lugar que el sustrato de la bomba de eflujo de tal manera que la unión del sustrato esté completamente obstruida. Otro tipo de unión puede ser no competitiva, es decir, la unión a la bomba de eflujo de tal manera que su afinidad hacia el sustrato se reduce” (7). En un estudio con PAβN (también conocido como MC-207,110), sustrato de bombas tipo RND, se advirtió que aumentaba la potencia de antibióticos como levofloxacina, eritromicina y cloranfenicol en Pseudomonas aeruginosa que expresa MexAB, MexCD y MexEF por unión competitiva (77). Sin embargo, no ocurría lo mismo con tetraciclina y carbenicilina, lo que llevó a pensar que PAβN, en este caso, presentaba sitios de unión distintos en la proteína que ambos antibióticos (62). Otro mecanismo por el que puede actuar PAβN es bloqueando los cambios conformacionales de la proteína que producen el eflujo de la bomba (78). Compuestos derivados de indoles han demostrado ser inhibidores específicos al unirse a la cavidad de salida de la bomba de eflujo y cerrar el canal TolC en E. coli (79). 18 Otros estudios han informado de que verapamilo es un sustrato natural de las bombas de eflujo DinD y NorM tipo MATE. Resulta menos tóxica en aquellas bacterias en las que no existe la expresión de estas bombas, lo que indica su especificidad hacia las bombas de eflujo tipo MATE, además de la inhibición competitiva (22). En Mycobacterium tuberculosis, verapamilo incrementa la actividad de bedaquilina y ofloxacino (80). El derivado sintético NMP aumenta la acción de oxacilina, rifampicina, cloranfenicol, claritromicina, fluoroquinolonas, azitomicina, clindamicina, nitrofurantoína y doxicilina aunque en menor medida. Además de potenciar la actividad de levofloxacino, donde se ha observado un incremento de la acumulación en E. coli que sobre expresa bombas de eflujo AcrAB y AcrEF (67). La molécula también presenta una acción antibacteriana cuando se utiliza a una concentración mayor de la utilizada como EPI (9). Tabla 1. Inhibidores de bombas de eflujo. EPIs de origen natural EPI Bomba de eflujo que inhibe Bacteria(s) que afecta Sustrato Baicaleína TetK S. aureus MRSA Ciprofloxacino Tetraciclina β-lactámicos 5’-MHC NorA S. aureus Berberina Norfloxacino Genisteína Orobol Biochanina A NorA S. aureus M. smegmatis Berberina Norfloxacino Chalconas NorA S. aureus Cloranfenicol Reserpina NorA, Bmr B. subtillis S. aureus Norfloxacino Tetraciclina Piperina NorA Rv1258c S. aureus Mycobacterium spp. Ciprofloxacino Rifampicina Ácido carnósico y carnosol MsrA, TetK S. aureus Tetraciclina Eritromicina Totarol NorA S. aureus Norfloxacino Bromuro de etidio Geraniol AcrAB-TolC Klebsiella aerogenes Cloranfenicol Galato de epicatequina, galato de epigalocatequina NorA, TetK S. aureus MRSA, Campylobacter spp. Tetraciclina Eritromicina Ciprofloxacino 19 Quinazolina AcrAB-TolC K. pneumoniae K. aerogenes Norfloxacino Cloranfenicol Tetraciclina EPIs de origen sintético 3-nitro-6-aminoindol AcrAB-TolC E. coli Cloranfenicol Eritromicina Ciprofloxacino Tetraciclina PAβN MexAM-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, AcrAB-TolC P. aeruginosa Levofloxacino Fluoroquinolonas Macrólidos 2-fenil-4(1H)- quinolona, 2-fenil-4- hidroxiquinolina NorA S. aureus Norfloxacino Ciprofloxacino NMP AcrAB, AcrEF E. coli Levofloxacino Claritromicina Rifampicina Cloranfenicol 3-arilpiperidina AcrAB-TolC E. coli Linazolid Verapamilo DinD, NorM M. tuberculosis Bedaquilina Ofloxacino MBX2319 AcrAB-TolC E. coli AB1157 Ciprofloxacino Levofloxacino Piperacilina IITR08027 AbeM A. baumanii E. coli Ciprofloxacino Fluoroquinolonas EPIs derivados de microorganismos EA-371α, EA-371d MexABOprM P. aeruginosa Levofloxacino (5’-MHC: 5’-metoxi-hidnocarpina; PAβN: fenilalanina-arginina-beta-naftilamida; NMP: 1-(1-naftil metil)-piperazina). 4.3. Implicación de los inhibidores de bomba de eflujo en la resistencia a los antibióticos: La literatura muestra que la asociación de fármacos antimicrobianos en el tratamiento de resistencias bacterianas ha tenido una gran acogida para la terapia de infecciones en clínica. El éxito de algunos ensayos de combinación de antibióticos con sustancias de origen natural, como derivados vegetales o productos derivados de microorganismos; o sustancias de origen sintético 20 como peptidomiméticos, se plantean como una estrategia potencial en la reducción de resistencias. Y resulta de gran importancia en bacterias clínicamente significativas (81,82). Se posiciona como una alternativa de mejora de antibióticos ya existentes, ya que el descubrimiento y síntesis de nuevos antibióticos se ha visto reducido en la última década (83). La Elaiofilina, un compuesto natural con actividad antimicrobiana producida por Streptomyces hygroscopicus (84), presenta propiedades biológicas de interés, tales como actividad antineoplásica (85), de inmunosupresión celular (86), actividad antiviral y antibacteriana (87,88). En el estudio llevado a cabo por Barbosa y colaboradores (2021) (83) se evaluó la aptitud de la Elaiofilina como potenciador de la susceptibilidad en cepas de Staphylococcus aureus resistentes, hacia norfloxacino y bromuro de etidio. Para ello, los autores utilizaron mutantes conocidos como SA-1199 (cepa salvaje) y SA-1199B (cepas que sobre-expresan el transportador NorA). Los autores manifestaron que los resultados obtenidos apuntan al incremento de la eficacia antimicrobiana. La asociación de norfloxacino (NOR) con Elaiofilina produjo una disminución de la CMI para el mutante SA-1199 (de 64 μg/mL a 1,0 μg/mL) y para el mutante SA-1199B (256 μg/mL a 1,0 μg/mL). De la misma manera, el uso concomitante de Elaiofilina y el bromuro de etidio (BrEt), demostró un descenso de la CMI de 64 μg/mL a 1,0 μg en el mutante SA-1199 y de 32 μg/mL a 1,0 μg/mL en SA-1199B. Se vio potenciada la susceptibilidad de las cepas de S. aureus de forma general, con ambos EPI (83). Los resultados obtenidos en este trabajo se resumen en la tabla 2. Tabla 2. Evaluación de la capacidad de modificación de la CIM del antibiótico Norfloxacina (NOR) y del Bromuro de Etidio (BrEt) por asociación con Elaiofilina (Barbosa et al., 2021). CMI intrínseco (μM) CMI en presencia de Elaiofilina (μM) NOR BrEt Elaiofilina + NOR Elaiofilina + BrEt SA-1199 (cepa salvaje) 64 64 1,0 1,0 SA-1199B (mutante de sobreexpresión de NorA) 256 32 1,0 1,0 En otro estudio, Mahey y colaboradores (2021) (89) propusieron la utilización de medicamentos ya existentes y aprobados en clínica para averiguar si alguno de ellos presentaba una actividad parecida a los sustratos naturales de NorA que funcionara como inhibidores de las bombas de eflujo. Para ello, los autores evaluaron seis compuestos con potencial de unión a NorA: raloxifeno (presenta el potencial de acoplamiento más alto) > nefazodona > ezetimiba > clorprotixeno > propafenona > pirvinio. Los ensayos se realizaron en las mismas cepas mutantes 21 que se utilizaron en el estudio de Barbosa et al., (2021) (83), al que se añadió un tercer mutante de deleción de norA conocido como K1758. El objetivo era probar la combinación de estos compuestos con norfloxacino y ciprofloxacino, y así establecer la posible existencia de un efecto sinérgico. Los autores han manifestado que al utilizar “concentraciones subinhibitorias” (CMI/4), las CMI de ciprofloxacino (CIP) y norfloxacino (NOR) se vieron reducidas entre 2 y 4 veces en la cepa salvaje SA-1199 (Tabla 3) en comparación con el mutante que sobre-expresa el transportador NorA, cuyo efecto disminuyó de 8 a 16 veces (Tabla 4). Además, el mutante de deleción, K175B no reveló una disminución de la CMI en ninguno de los dos antibióticos estudiados (Tabla 4). Los autores afirman que los resultados encontrados sugieren que eflujo puede ser consecuencia de la sobreexpresión de las bombas NorA, ya la cepa salvaje que expresa NorA a niveles basales, produce un aumento en la potencia de los antibióticos de forma débil (89). Tabla 3. CMI de ciprofloxacino (CIP) y norfloxacino (NOR) en combinación para S. aureus SA-1199 (modificación de Mahey et al., 2021). CMI intrínseco (μM) Conc. usada (μM) CMI en presencia de EPIs (μM) CIP NOR 0,5 1 Raloxifeno >200 50 0,125 0,25 Ezetimiba >200 50 0,25 0,25 Propafenona >200 50 0,25 0,5 Clorprotixeno >200 50 0,25 0,5 Pirvinio 3,125 0,78 0,125 0,25 En cuanto a bacterias Gram negativas, Wang-Kan y colaboradores (2017) (90) demostraron que la inactivación de la bomba AcrB, producía una disminución de la virulencia de Salmonella enterica serovar Typhimurium. Como se describió anteriormente, el sistema de eflujo AcrAB- TolC de la familia RND, está formado por la bomba de eflujo AcrB, la proteína externa de membrana TolC y la proteína periplásmica adaptadora AcrA. Constituye el complejo de expulsión más importante dentro de la familia Enterobacteriaceae (91). 22 Tabla 4. CMI de ciprofloxacin, norfloxacino, fármacos para S. aureus SA-1199B, K1758 solo, y CMI de antibióticos en combinación con diferentes fármacos (modificación de Mahey et al., 2021). CMI intrínseco (μM) Conc. usada (μM) CMI en presencia de EPIs (μM) S. aureus SA-1199B S. aureus K1758 CIP NOR CIP 8 64 0,125 Raloxifeno 200 50 0,5 4 - Ezetimiba 200 50 0,5 4 - Propafenona 800 50 1 8 - Clorprotixeno 200 50 1 8 0,0625 Pirvinio 1,56 0,39 0,5 4 - Se compararon los datos de la CMI obtenidos de la cepa salvaje SL1344, con la mutante D408A (cepa que sobre-expresa AcrB) y a su vez, con la mutante de deleción ΔacrB, que presenta una ausencia total de la proteína AcrB y no solo una pérdida de función (Tabla 5). Al igual que en el estudio de Mahey et al., (2021) (89), los resultados obtenidos por los autores apuntaban a que el aumento en la susceptibilidad a los antimicrobianos por parte de S. typhimurium podría deberse a la sobreexpresión de la bomba de eflujo MacAB-TolC. En tabla 5 se resume los resultados obtenidos en dicho estudio. Tabla 5. CMI de sustratos AcrB para mutantes SL1344 y AcrB (modificación de Wuang-Kan et al., 2017). CMI (μM) de los EPIs ACR ETBR CIP NAL CHL TET NOV FUS ATM CAZ CTX ERY OX MIN SL1344 512 >2,048 0,030 4 8 2 512 2,048 0,50 1 0,500 256 512 2 ΔacrB 64 32 0,008 1 2 0,5 8 32 0,12 0,25 <0,008 8 16 0,25 D408A 32 32 0,008 1 2 0,5 8 16 0,12 0,25 <0,008 8 16 0,25 (ACR: acriflavina; ETBR: bromuro de etidio; CIP: ciprofloxacino; NAL: ácido nalidíxico; CHL: cloranfenicol; TET: tetraciclina; NOV: novobiocina; FUS: ácido fusídico: ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; CTX: cefoxitina; ERY: eritromicina; OX: oxaciclina; MIN: minociclina) Por otro lado, Yuan y colaboradores (2021) (50), descubrieron nuevos EPIs que actúan en las bombas de P. aeruginosa, otra bacteria multirresistente de gran importancia por la tasa morbimortalidad que presenta. El compuesto conocido como TXA01182 (indol 2-carboxiamida) (Fig.2) fue sintetizado específicamente para el ensayo y expone un aumento de la potenciación de levofloxacino hacia P. aeruginosa de tipo salvaje (ATCC 27853). Cabe destacar que, en el ensayo llevado a cabo por los autores, se utilizó la cepa salvaje, ya que en las cepas de P. aeruginosa 23 que sobre-expresan bombas tipo RND (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN y MexXY- OprM), no se produjo ningún incremento de la potencia de forma significativa en comparación con ATCC 27853. Probablemente TXA01182, inhiba a los mutantes de sobre-expresión a través de una bomba de eflujo distinta (50). Fig. 2. Estructura líder de los compuestos del cribado virtual (Yuan et al., 2021) El principal objetivo planteado por Yuan y colaboradores (2021) (50), fue “optimizar la estabilidad metabólica de los EPI en comparación con los peptidomiméticos”, ya que hasta este momento eran considerados los EPI de amplio espectro más potentes contra fluoroquinolonas pero presentaban un alto riesgo de producir toxicidad renal (92). En este sentido, el compuesto TXA01182 fue evaluado en profundidad junto a distintos grupos de antibióticos en la cepa ATCC 27853 (Tabla 6) (50). Tabla 6. Potenciación de diferentes clases de antimicrobianos por TXA01182 frente a P. aeruginosa ATCC 27853 (modificación de Yuan et al., 2021) CMI intrínseco (μM) CMI en presencia de TXA01182 (μM) A) Levofloxacino 1 0,125 B) Ciprofloxacino 0,25 0,125 C) Levofloxacino 1 0,125 D) Doxiciclina 32 2 E) Minociclina 32 1 F) Tigeciclina 16 4 G) Clotrimoxazol >256 16 H) Cloranfenicol >256 32 I) Imipenem 4 4 J) Gentamicina 2 2 24 K) Aztreonam 8 2 L) Azitromicina 64 32 M) Cefepima 2 1 N) Ceftazidima 2 1 Aun según el estudio llevado a cabo por Yuan y colaboradores (2021) (50), los autores afirman que las fluoroquinolonas, como levofloxacino, ciprofloxacino y moxifloxacino, se vieron potenciadas débilmente por TXA01182. Según los autores, esta evidencia podría justificarse por el hecho de que la CMI de estos antibióticos ya es muy baja en solitario o porque pueden ser expulsadas por otra bomba distinta a la que afecta TXA01182. En relación con las tetraciclinas (dixiciclina, minociclina y tigeciclina), los autores destacan la acción de minociclina de manera significativa, con un aumento de la potencia de 32 veces la CMI original, echo ya esperado por los autores debido a que la minociclina presenta un mayor índice de acoplamiento para las bombas de eflujo y, por tanto, se posiciona como mejor sustrato (93). En el caso del cotrimoxazol y el cloranfenicol, los autores mencionan que la tasa de resistencia fue muy alta (no presentan CMI para P. aeruginosa en solitario), cuando comparado con el valor obtenido al combinarse con TXA001182, según los autores este resultado fue un hito del ensayo. Por otra parte, los antibióticos que no eran sustratos de las bombas RND de P. aeruginosa, como el imipenem y gentamicina, no sufrieron ningún tipo de potenciación combinados. Finalmente, la unión de TXA01182 con aztreonam, azitromicina, cefepima y ceftazidima expuso una potenciación muy débil, lo que también apunta a que no son sustratos de RND y, por tanto, no inhiben a estas bombas (50). Todos los resultados aquí mencionados están plasmados de forma resumida en la tabla 6. 5. Conclusiones: • Las bombas de eflujo son proteínas de membrana cuya función consiste en exportar sustratos nocivos para las bacterias. Así constituyen un mecanismo de protección celular de gran importancia en la adquisición de multirresistencias. • De todas las vías por las que los microorganismos pueden disminuir la susceptibilidad a antimicrobianos, son las bombas de eflujo las que se encuentran más extendidas tanto en bacterias Gram positivas, como en bacterias Gram negativas. • Cada una de las familias de bombas de eflujo otorga una propiedad distinta en cuanto a la afinidad de los sustratos que exporta: mientras que unas bombas son 31 92. Lomovskaya O, Bostian KA. Practical applications and feasibility of efflux pump inhibitors in the clinic—A vision for applied use. Biochemical Pharmacology. 2006 Mar;71(7):910–8. 93. Fluit AC, Florijn A, Verhoef J, Milatovic D. Presence of tetracycline resistance determinants and susceptibility to tigecycline and minocycline. Antimicrob Agents Chemother. 2005 Apr;49(4):1636–8. 32