Efecto antiinflamatorio de la oleuropeína en células SW982

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! TATIANA%MONTOYA%GARCÍA% UNIVERSIDAD%DE%SEVILLA% FACULTAD%DE%FARMACIA% EFECTO& ANTIINFLAMATORIO& DE& LA& OLEUROPEÍNA& EN& CÉLULAS&SW982& ! Facultad!de!Farmacia! Departamento!de!Farmacología! Universidad!de!Sevilla! ! ! Trabajo'Fin'de'Grado'Experimental' Grado'en'Farmacia' ! ! ! EFECTO'ANTIINFLAMATORIO'DE'LA' OLEUROPEÍNA'EN'CÉLULAS'SW982' ' ' ' Realizado'por:'Tatiana'Montoya'García.' Dirigido'por:'Catalina'Alarcón'de'la'Lastra'Romero.'Catedrática'de' Farmacología.' ! Facultad'de'Farmacia,'Sevilla.' 7'de'julio'de'2016' ! ! 1! RESUMEN' Introducción:'La# artritis# reumatoide# (AR)# es# una# enfermedad# inflamatoria# sistémica# crónica#de#etiología#autoinmune#caracterizada#por#una#sinovitis#erosiva#en#la#cual#el#tejido#de# granulación# de# origen# sinovial# (pannus),# invade# y# erosiona# el# cartílago# y# el# hueso# de# las# articulaciones#diartrodiales.#Los#fibrobalstos#sinoviales#(FS)#o#sinoviocitos#de#tipo#fibroblástico# juegan#un#papel#fundamental#en#la#persistencia#de#la#inflamación#crónica#y#en#el#daño#articular,# siendo#unas#de#las#poblaciones#celulares#más#abundantes#del#pannus.#' La#oleuropeína#(OLE)#es#un#secoiridoide,#componente#fenólico#mayoritario#de#la#pulpa#del#fruto# y# hojas# de# Olea+ europaea+ L.#y,#que#a# su# vez,# se# encuentra# en# el# aceite# de# oliva.# Se# han# documentado# diversas# actividades# farmacológicas# del# citado# secoiridoide,# entre# las# que# se# destaca#la# antioxidante# y# antiinflamatoria.# No# obstante#no# existen,# hasta# la# fecha,# estudios# experimentales#en#fibroblastos#humanos#que#validen#su#potencial#antirreumático,#así#como#los# mecanismos#bioquímicos#y#moleculares#implicados.## Objetivos:'Este#estudio#pretende#evaluar#el#efecto#antiinflamatorio#de#OLE#en#la#línea# celular#SW982#inducida#con#IL-1β,#mediante#el#análisis#de#la#producción#de#la#producción#de# mediadores#pro-inflamatorios,#así#como,#las#vías#de#señalización#involucradas.# Materiales'y'métodos:'Las#células#SW982#fueron#cultivadas#en#DMEM#y#estimuladas# con# IL-1β#(5# ng/mL)# en#presencia#o#ausencia#de# OLE#(50# y# 100# μM).#La#viabilidad#celular#se# determinó# mediante# # un# ensayo# con# sulforrodamina# B# (SRB).# Los# niveles# de# TNF-α# e# IL-6## fueron#evaluados#por#la#técnica#ELISA.#La#expresión#de#las#proteínas#inflamatorias#COX-2#y#mPGES-1#y,#estudio#de#las#vías#de#señalización#celular#fueron#llevados#a#cabo#mediante#Western# blot.# Resultados:#El#tratamiento#con#OLE#redujo#significativamente#los#niveles#de#IL-6#y#TNFα,# y# además# disminuyó# la#sobreexpresión# de# COX-2# y# m-PGES-1.# Este# compuesto# a# las# concentraciones# ensayadas# fue#capaz,# además,# de# modular# la# activación# de# JNK# y# p38,# impidiendo#su#fosforilación.# Conclusión:'OLE#reduce#la#producción#de#citocinas#pro-inflamatorias#IL-6#y#TNF-α#y#la# expresión#proteíca#de#COX-2#y#m-PGES-1,#posiblemente#a#través#de#la#inhibición#de#la#vía#de# señalización#de#MAPK:#PJNK#y#p38,#en#fibroblastos#sinoviales#humanos#SW982#estimulados#con# IL-1β.# PALABRAS'CLAVE:'Oleuropeína'–'inflamación'–'fibroblasto'sinovial'–'SW982' ! ! 2! ÍNDICE' I. INTRODUCCIÓN'Y'ANTENCEDENTES'DEL'TEMA……………………..3' § Oleuropeína' § Actividad1farmacológica1de1la1oleuropeína' ' II. JUSTIFICACIÓN'Y'OBJETIVOS…………………………………………………17' ' III. METODOLOGÍA…………………………………………………………………….18' § Oleuropeína:1Extracción1y1caracterización1química' § Cultivo1celular' § Viabilidad1celular1 § Determinación1de1citocinas:1IL-61y1TNF-α1 § Determinación1de1la1expresión1proteíca1 § Evaluación1estadística1de1los1resultados1 1 IV. RESULTADOS………………………………………………………………………..231 § Efectos1de1la1oleuropeína1en1la1viabilidad1celular1 § Efectos1de1la1oleuropeína1en1la1producción1de1citocinas1pro-inflamatorias1 Interleucina-61 (IL-6)1 y1 Factor1 de1 Necrosis1 Tumoral1 α1 (TNF-α)1 en1 células1 SW9821 § Efectos1de1la1oleuropeína1sobre1la1expresión1de1Ciclooxigenasa-21(COX-2)1y1 Prostaglandina1E1Sintasa111microsomal1(m-PGES-1)1en1células1SW9821 § Estudio1de1vías1de1señalización1 1 V. DISCUSIÓN………………………………………………………………….………281 1 VI. CONCLUSIONES…......………………………..………………….....…….....301 1 VII. ABREVIATURAS'Y'SIGLAS……………………………………….…………….311 1 VIII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..321 1 ' ! 3! INTRODUCCIÓN*Y*ANTECEDENTES*DEL*TEMA* I. OLEUROPEÍNA* A. Características*químicas*y*distribución*en*la*naturaleza! La!oleuropeína!(OLE)!es!un!glucósido!secoiridoide!esterificado!con!un!alcohol!fenilpropanoide.! En! concreto! esta! sustancia! esta! constituida! por! la! unión! de! tres! moléculas:! hidroxitirosol,! glucosa!y!ácido!enólico.!Químicamente!se!conoce!como!un!éster!del!oleósido-11-metil-éster! (ácido!elenólico!glucosado)!con!el!3,4-dihidroxifeniletanol!ó!3,4-DHPEA!(Figura'1).! ! ! Figura'1:'Estructura'química'de'la'oleuropeína.' OLE!es!abundante!en!las!familias'Gentinaceae,'Cornaleae,'Oleaceae.!En!esta!última!familia,!el! secoiridoide!se!puede!encontrar!y!aislar!de!numerosos!géneros,!y!ha!sido!descrita!en!Fraxinus' americana' L.,' F.' excelsior' L.,' F.' chinenis' Roxb.,'(Sanz' y' cols.,' 2012)' Syringa' pubescens' Turcz.(Deng!y! cols.,'2010),! S.' josikaea' J.Jacq.!ex! Rchb.,' S.' vulgaris' L.,! S.' reticulata' (Blume)' H.Hara.,'(Bi'y'cols.,'2011),!Ligustrum'lucidum'Ait.'(Guo'y'cols.,'2011),'L.'vulgare'L.,'L.'ovalifolim' Hassk.,'Philyrea'latifolia'L.,'entre!otras!(Soler-Rivas,'2000).!Sin!embargo,!la!más!comúnmente! conocida!es!la!Olea'europaea'L.'(que!da!nombre!al!glicósido),!siendo!el!componente!fenólico! mayoritario!de!la!pulpa!de!las!aceitunas!verdes,!aunque!también!las!hojas!del!olivo!contienen! OLE!como!componente!principal;!asimismo,!se!puede!encontrar!en!el!aceite!de!oliva!virgen! extra!(AOVE),!al!que!da!su!sabor!amargo.! La!ruta!del!ácido!mevalónico!es!la!responsable!de!la!síntesis!de!!los!secoiridoides!!oleósidos! como!OLE.!Estas!rutas!metabólicas!son!complejas!y!se!pueden!verse!afectadas!por!numerosas! variables! tales! como! la! variedad! del! fruto,! las! condiciones! del! crecimiento! y! el! estrés! ambiental,!entre!!otros!(Ryan'y'cols.,'2002).! ! 10! como!respuesta!del!sistema!inmune!frente!a!todo!tipo!de!microorganismos!(Saija'y'Uccella,' 2001).! En!cuanto! a! la!actividad!antiviral,!se!ha!demostrado! su! eficacia!sobre!células!de!carcinoma! hepatocelular! (HepG2! 2.2.15)! infectadas! frente! septicemia! hemorrágica! viral! (Micol' y' cols.,' 2005);'virus!de!la!hepatitis!B!(VHB)!(Zhao'y'cols.,'2009)!y!virus!de!inmunodeficiencia!humana! (VIH)!(Lee-Huang'y'cols.,'2007).!En!este!caso!su!mecanismo!de!acción!se!basa!en!la!inhibición! de!la!integrasa!vírica!y!alteración!de!la!envoltura!vírica.! ! D. Actividad*antitumoral! Varios! estudios! han! confirmado! la! actividad! anticancerosa/antitumoral! de! OLE!y! han! dilucidado!los!posibles!mecanismos!en!la!última!década.!Hamdi!y!Castellon!han!validado,!tanto! en! estudios! in' vivo' e'in' vitro,!que! el! secoiridoide!inhibe! el! crecimiento! celular,! movilidad! celular,!capacidad!de!invasión!e!induce!un!efecto!proapoptótico!en!líneas!celulares!cancerosas! como!glioblastoma!(LN-18),!eritroleucemia!(TF-1a),!células!de!adenocarcinoma!renal!(786-O),! carcinoma!metastásico!de!derrame!pleural!(T-47D),!adenocarcinoma!de!glándula!mamaria!o! derrame! pleural! (MCF-7),! melanoma! maligno! de! piel! o! nodo! linfático! (RPMI-7951)! ! y! adenocarcinoma! colorectal! o! región! metastásica! supraclavicular! (LoVo)! (Hamdi' y' Castellon,' 2005).! En!base!a!esto,!estudios!experimentales!en!animales!han!determinado!que!el!tratamiento!con! OLE!previene! el! desarrollo! de! cáncer! de! piel! (Kimura' y' Sumiyoshi,' 2009),! tejidos! blandos! (Hamdi'y'Castellon,'2005)!y!cáncer!de!pulmón!(Sepporta'y'cols.,'2014).' Además! de! actuar! directamente! sobre! el! tumor,! OLE!puede! desempeñar! una! función! antiangiogénica,!inhibiendo!la!proliferación!del!endotelio,!produciendo!así!una!reducción!del! número!de!vasos!sanguíneos.!Esto!fue!demostrado!por!estudios!en!membrana!corioalantoidea! de!pollo!y!en!modelos!de!ratón!(Hamdi'y'cols.,'2003).! Por!todo!esto,!Hamdi!y!Castellon!se!refieren!este!secoiridoide!como!una!nueva!clase!de!agente! anticanceroso,!que!actúa!en!la!progresión!del!tumor,!activa!!sistemas!reparadores!de!ADN!e! inhibe!de!la!angiogénesis.! ! ! ! 11! E. *Actividad*hepatoprotectora* Se! ha! observado! en! diversos! estudios! un! efecto! hepatoprotector,! demostrando! que! el! tratamiento! con! OLE!disminuye! significativamente! las! transaminasas! en! plasma,! especialmente! la! alanina! aminotransferasa!(ALT)!y! aspartato! aminotransferasa!(AST)!en! ratones! intoxicados! con! tetracloruro! de! carbono.! Estos! resultados! se! asocian! con! una! clara! regresión!de!áreas!necróticas!y!un!marcado!aumento!de!la!actividad!SOD!y!la!concentración!de! GHS.!La!inmunoquímica!también!reveló!que!OLE!atenúa!de!forma!dosis-dependiente!ERO/ERN! y!suprime!la!inflamación!(Domitrovic'´'y'cols.,'2012)(Kim'y'cols.,'2014).! Además,!en!hígado!de!rata!tratado!con!hidroxitolueno!butilado,!el!secoiridoide!fue!capaz!de! reducir!los!niveles!de!urea!nitrogenada!en!sangre,!transaminasa!glutámico!pirúvica!en!suero! (sGPT),! transaminasa! glutámico! oxalacética! (GOT),! fosfatasa! alcalina!(FA),! lactato! deshidrogenasa!(LDH),! triacilglicéridos!(TG)!y! creatinina! (Lin' y' cols.,' 2007);' además! de! minimizar!la!generación!de!fibrosis!y!necrosis!(Fang'y'cols.,'2008)(Kim'y'cols.,'2014).! Por!tanto,!estos!estudios!validan!el!potencial!hepatoprotector!de!OLE,!proponiéndola!como!un! nuevo!agente!seguro!y!protector!a!este!nivel!(Hassen'y'cols.,'2015).' ! F. Actividad*cardioprotectora! La! actividad! cardioprotectora! de! OLE!en! modelos!de! experimentación! in' vivo!ha! sido! demostrada! en! diversos! estudios.! En! ratas! con! cardiotoxicidad! aguda! inducida! por! doxorrubicina! (DXR),! se! realizaron! inyecciones! intravenosas! de! OLE,! produciéndose! un! descenso!en!el!nivel!de!creatinquinasa!(CK),!creatinquinasa!-MB!(CK-MB),!LDH,!AST!y!ALT.!A!su! vez,!la!inmunoquimica!reveló!una!reducción!en!el!contenido!de!carbonilos,!nitrotirosinas,!iNOS! y! peroxidación! lipídica! en! tejido! miocárdico;! y! en! histopatología,! la! reducción! de! la! vascularización! citoplasmática! en! cardiomiocitos! reveló!su! efecto! protector! frente! a! la! cardiotoxicidad!inducida!por!DXR!(Andreadou'y'cols.,'2007).'! El!pretratamiento!con!el!compuesto!fenólico!en!ratones!con!infarto!agudo!de!miocardio!(IAM),! mostró! un! efecto! protector! frente! al! IAM,! previniendo! el! desarrollo! de! un! fallo! cardiaco! secundario! al! mismo,! ! al! descenso! en! los! niveles! séricos! de! CK-MB,! troponina! I,! LDH! (Janahmadi'y'cols.,'2014).! ! ! ! 12! G. Actividad*neuroprotectora* Tanto! OLE!como! los! polifenoles! del! olivo! exhiben! un! efecto! neuroprotector! significativo! en!! modelos! experimentales! y! sugiriéndose! una! nueva! estrategia! terapéutica! potencial! en! enfermedades!neurodegenerativas!como!Parkinson!y!Alzheimer.! En! un! ensayo! en! ratas! OLE!mostró! un!número! mayor! de! neuronas! en! la! sustancia! negra,! respecto! a! las! ratas! sin! tratar.! De! hecho,! las! investigaciones! con! GC-MS!describieron! al! secoiridoide!como! una! molécula! de! unión! ! no! covalente! al! péptido! β-amieloide! (1-40),! contrarrestando! la! producción! y! generación! de! la! placa! amieloide! (Bazoti' y' cols.,' 2006).! En! adición,!el!secoiridoide!fue!capaz!de!inhibir!la!proteína!Tau,!que!forma!agregados!amieloides! característicos!del!Alzheimer,!en!ratones!(Daccache' y'cols.,'2011).'Estos!resultados!avalan!a! esta! molécula! como! una! novedosa! diana! farmacológica! en! la! prevención! o! atenuación! del! daño!o!pérdida!de!neuronas!dopaminérgicas!en!patologías!neurodegenerativas.! ! H. Actividad*antienvejecimiento* Los!FS!sufren!la!senescencia!por!la!influencia!de!factores!genéticos!y!ambientales.!La!función! fisiológica!del!proteosoma,!una!proteasa!no!liposomal!multicatalítica,!se!deteriora!con!el!paso! del!tiempo,!de!forma!más!acentuada!en!fibroblastos!durante!la!senescencia.!Katsiki!y! cols.,! demostraron!que!OLE!mejora!la!actividad!de!los!proteosomas!in'vitro,!de!forma!más!eficaz!que! otros!quimioactivadores! conocidos,! posiblemente! mediante! cambios! en! la! conformación! de! éstos.!Además,!el!tratamiento!continuo!de! fibroblastos!embrionarios!en!fase!temprana!con! OLE,!disminuyó!los!niveles!intracelulares!de!ERO,!reduciendo!la!cantidad!de!proteínas!oxidadas! mediante! el! incremento! de! la! tasa! de! degradación! mediada! por! proteosomas! y,! manteniéndose! la! función! del! proteosoma! ! durante! la! senescencia! replicativa.! De! forma! importante,!los!cultivos!celulares!tratados!con!OLE!exhibieron!una!demora!en!la!aparición!de! la! senescencia,! y! su! tiempo! de! vida! se! extendió! aproximadamente! un! 15%! (Katsiki' y' cols.,' 2007).' ' I. Actividad*antiinflamatoria* La!inflamación!es!una!respuesta!fundamental!inducida!por!el!sistema!inmune!para!proteger!el! organismo!contra!patógenos,!daño!tisular!y!!estrés.!! Una!amplia!variedad!de!estudios!han!demostrado!la!evidencia!de!la!contribución!de!citocinas! en!la!inflamación!y!el!tejido!dañado.!Las!citocinas!pro-inflamatorias!como!IL-6,!IL-!1β!y!el!factor! ! 13! de!necrosis!tumoral!α!(TNF-α)!se!activan!por!vías!de!señalización!implicadas!en!la!inflamación,!! entre!las!que!se!incluyen!los!factores!nucleares!de!transcripción!NF-kB!y!las!proteínas!cinasas! activadas! por! mitógenos! (MAPK):! c-Jun! NH2! –terminal! cinasa! (JNK),! p38! cinasa! y! cinasa! regulada!por!señal!extracelular!(ERK),!fundamentalmente!(Aupperle!y!cols.,!2001;!McInnes!y! Schett,!2011).! El!factor!de!transcripción!NF-ĸB!juega!un!papel!fundamental!en!la!función!biológica!y! en!la!patogenia!de!desórdenes!inflamatorios!y!autoinmunes!(Sun'y'cols.,'2013).!Es!un!factor! transcripcional! regulador! de! la! expresión! de! numerosos! genes! que! codifican! moléculas! involucradas!en!el!proceso!inflamatorio,!entre!los!que!podemos!incluír!ciclooxigenasa-!2!(COX2),!óxido!nítrico!sintasa!inducible!(iNOS),!protaglandina!E!sintasa-1!microsomal!(m-PGES-1)!y! ciertas!citocinas!proinflamatorias!entre!las!cuales!se!incluyen!TNF-!α,!IL-1β,!IL-6,!IL-17!e!IL-23! (Cho,'2006;'Neurath'y'cols.,'1998).!! El!NF-κβ!está!regulado!por!la!vía!de!las!MAPK,!que!en!su!estado!inactivo!(no!fosforilado)! residen! en! el! citoplasma,! pero! cuando! se! activan! son! fosforiladas! y! a! su! vez! fosforilan! en! serinas!y!treoninas!a!los!factores!de!transcripción.!Estos!últimos!promueven!la!transcripción!de! genes! responsables! de! la! activación! de! las! células! inflamatorias! e! inmunocompetentes! y! la! expresión!de!proteínas!mediadoras!clave!con!el!consiguiente!efecto!biológico!(Ghosh'y'cols.,' 2003).!! La!vía!de!las!MAPK!parece!jugar!un!papel!importante!en!el!control!de!la!inflamación!(Wei'y' Feng,' 2010).! !Las! vías! de! la! cinasa! N-! terminal! p38! y! ! JNK! ! se! activan! por! el! estrés! celular! (Kyriakis' y!Avruch,' 2001).! La! MAPK! p38! también! está! involucrada! en! el! control! posttranscripcional! de! la! expresión! génica! mediante! la! estabilización! de! los! ARN! mensajeros! (ARNm).! De! igual! manera,! se! ha! descrito! que! puede! regular! la! producción! de! citocinas! en! respuesta!a!una!variedad!de!estímulos!y!la!sobreexpresión!de!COX-2!(Hommes'y'cols.,'2002)! (Figura'4).!! El!efecto!antiinflamatorio!de!OLE!esta!mediado!por!su!capacidad!de!inhibir!la!actividad!proinflamatoria!de!ERO!libres!producidas!por!enzimas,!como!la!COX-2!e!iNOS!y!modular!diferentes! vías!de!señalización:!inhibición!del!NF-kβ!y!su!translocación!al!núcleo,!IL-1β,!MAPK,!mediante! la!alteración!de!los!procesos!redox!en!células!inmunes!sensibles'(Cárdeno'y'cols.,'2013).' ! ! 14! ! Figura'4:'Esquema'del'mecanismo'antiinflamatorio'de'compuestos'fenólicos'(Cárdeno'y'cols.,' 2013).' A! continuación,! se! incluyen! los! estudios! in' vitro' e! in' vivo!más! significativos! que! avalan! la! actividad!antiinflamatoria!de!OLE.! o Estudios!in'vitro'con!OLE' Dell’Agli!y!cols.,!investigaron!el!efecto!del!aglicón!OLE,!extraído!de!aceite!de!oliva!virgen!extra! (AOVE),!en!la!expresión!de!metaloproteasas!de!la!matriz-9!(MMP-9)!en!células!de!leucemia! aguda!monocítica!(THP-1),!el!cual!previene!la!estimulación!de!la!expresión!de!dicha!enzima!en! células!THP-1!estimuladas!con!TNF-α,!debido!a!la!alteración!en!la!!señalización!de!NF-kB.!Esto! evidenció!el!mecanismo!por!el!que!el!AOVE!reducía!la!inflamación!asociada!a!enfermedades! (Dell’Agli'y'cols.,'2010).! Otros!estudios,!en!la!línea!celular!RAW-264.7!(macórgafos!monocíticos!inducidos!por!el!virus! de! leucemia! murina! de! Abselon),! estimulada! con! lipopolisacáridos! (LPS)! pusieron! de! manifiesto! que! el! compuesto! fenólico!inhibe! la! producción! de! citocinas! pro-inflamatorias! como! la! IL-1β! e! IL-6! y! la! generación! de! óxido! nítrico! (NO),! mediante! la! supresión! de! la! expresión! de! enzimas! pro-inflamatorias,! iNOS! y! COX-2.! Así! mismo,se! observó! una! disminucuión!de!la!activación!de!las!MAPK!(ERK1/2!y!JNK),!las!cuales!se!asocian!al!proceso!de! inflamación!(Ryu'y'cols.,'2015).! Membrane(Phospholipids Araquidonic Acid PGG2 PGH2 PGD2,'PGE2,' PGF2,PGI2 (TxA2)'''''''''TxB2 PG(synthases TX(synthase PLA2 COX-2 OLIVE'OIL'POLYPHENOLS MMP-9 NF-ƘB IƘBα p65 p50 NF-ƘB STAT-1 p STAT-1 STAT-1 p STAT-1 p STAT-1 p MAPKs p38,(JNK,(ERK iNOS NO Pro-inflammatory' cytokines Transcription(of( target(genes ! 15! Además,! se! demostró!que! OLE!reducía! el! efecto! de! la! mieloperoxidasa! (MPO)! (enzima! que! cataliza!la!formación!de!ácido!hipocloroso)!en!neutrófilos!humanos!de!forma!concentracióndependiente!(Czerwisńka'y'cols.,'2012).* o Estudios!in'vivo'con!OLE' La!eficacia!de!OLE!en!modelos!in'vivo!de!inflamación!ha!sido!probada!con!gran!extensión.!Este! secoiridoide!también!ha!mostrado!unos!buenos!beneficios!preventivos!a!nivel!gastrointestinal,! en!el!modelo!de!úlcera!gástrica!inducida!con!etanol,!disminuyendo!el!índice!de!ulceración!e! incrementando!la!actividad!de!enzimas!con!actividad!antioxidante!en!ratas,!el!contenido!de! GHS,!SOD!y!CAT!en!tejido!gástrico!(Alirezaei'y'cols.,'2012).!! De!la!misma!forma,!se!ha!reportado!que!OLE!atenúa!la!extensión!y!severidad!en!colitis!aguda! inducida!con!DSS!a!la!vez!que!reduce!la!infiltración!de!neutrófilos,!la!producción!de!NO,!IL-1β,! IL-6!y!TNF-α,!los!niveles!expresión!génica!de!proteína!iNOS,!COX-2,!MMP-9!y!la!translocación!al! núcleo!subunidad!p65!de!NF-kB!en!tejido!de!colón!(Giner'y'cols.,'2011,'2013).! Son!conocidos!los!efectos!antiinflamatorios!del!aglicón!OLE!en!ratones!con!artritis!colágenoinducida! (CIA).! Por! ejemplo,! el! aglicón! OLE!atenúa! el! desarrollo! de! la! artritis! causada! por! inyección! de! colágeno! tipo! II!en! ratones,! mejorando! el! estado! histológico! tanto! en! la! articulación!como!en!la!pata,!el!grado!de!daño!oxidativo!y!nitrosativo!y!los!niveles!plasmáticos! de!citocinas!pro-inflamatorias!(Impellizzeri'y'cols.,'2011).!Asimismo,!el!tratamiento!con!aglicón! OLE!disminuyó! significativamente! el! daño! histológico,! la! producción! de! citocinas! proinflamatorias!(TNF-α!e!IL-1β),!la!expresión!de!iNOs,!la!infiltración!de!neutrófilos,!la!formación! de!nitrotirosina!y!!los!niveles!de!factor!neurotrófico!derivado!de!células!gliales!(GDNF),!a!través! de!la!inhibición!de!la!vía!de!señalización!!NF-kB!e!!impidiendo!la!!degradación!!de!la!proteína! inhibitoria! IKB-α.! Del! mismo! modo,! el! aglicón! OLE!!fue! capaz! de! ! reducir! actividad! de! la! proteinquinasa!A!(PKA),!y!estimuló!la!apoptosis,!en!el!mismo!modelo!experimental!en!ratones! (Impellizzeri'y'cols.,'2012)'(Tabla'2).' ' ' ' ' ' ! 16! Tabla'2:'Estudios'in'vivo'e'in'vitro'de'la'actividad'antiinflamatoria'de'la'oleuropeína.'' Referencia! Polifenol! Método!de! experimentación! Mecanismos!de!acción! Dosis! usadas! In'Vitro! ! Dell’Agli'y' cols.,'2010' ! Aglicón!OLE! Células!THP-1! TNF-α! estimuladas! Inhibición!de!la!expresión! anómala!de!MMP-9! mediante!la!señal!NF-kB! ! 2.5-50μM! Ryu'y'cols.,' 2015' ! OLE! RAW!264.7! LPS!estimuladas! Supresión!de!la!producción! de!iNOS,!COX-2,!IL-1β,!IL-6! y!MAPK! 100,!200,! 300!μM! Czerwisńka'y' cols.,'2012' OLE! Neutrófilos! humanos! Reducción!de!MPO! 5-50!μM! In'Vivo' ! ! Alirezaei'y' cols.,'2012! ! ! ! OLE! ! ! Úlcera!gástrica! inducida!con! etanol!en!ratas! Elevación!de!la!actividad!de! enzimas!antioxidantes,! aumento!del!índice!de! úlceras!inhibidas,!el! contenido!de!GSH,!SOD!y! CAT!en!el!tejido!gástrico! ! ! ! 12!y!18! mg/kg! ! Giner'y'cols.,' 2011! ! ! OLE! ! Colitis!aguda! inducida!con!DSS! Reducción!de!la!infiltración! de!neutrófilos,!la! producción!de!NO,!IL-1β,! IL-6,!y!TNF-α;!la!expresión! de!iNOS,!COX-2,!y!MMP-9;! y!la!translocación!al!núcleo! de!la!subunidad!p65!NF-kB!! ! ! 2%!OL!en! dieta! ! ! ! Impellizzeri'y' cols.,'2011' Impellizzeri'y' cols.'2012! ! ! ! ! ! Aglicon!OLE! ! Enfermedad!de!la! médula!espinal! en!ratón! Artritis!(colágeno! tipo!II)!en!ratón! Disminución!del!daño! histológicamente,!!TNF-α!e! IL-1β,!iNOS,!inlfiltración!de! neutrófilos,!peroxidación! lipídica,!nitrotirosina,! formación!de!PKA,!niveles! de!GDNF,!inhibición!de!la! expresión!de!NF-kB,!! degradación!de!IkB-α!e! inducción!de!apoptosis! ! ! ! ! ! 20,!40,!100! μg/kg! * * * * ! 17! JUSTIFICACIÓN*Y*OBJETIVOS* Según!la!Organización!Mundial!de!la!Salud,!las!enfermedades!reumáticas!son!una!de!las!causas! más!frecuentes!de!incapacidad!en!el!mundo.!En!España!estas!patologías!están!relacionadas! con! el! 50,7%! de! las! incapacidades! laborales! y! son! la! principal! causa! de! bajas! laborales! permanentes.!Especial!relevancia!tiene!la!AR,!por!sus!repercusiones!sobre!la!calidad!de!vida!de! los!pacientes!y!el!deterioro!progresivo!que!produce!esta!enfermedad.!!! AR!es!una!enfermedad!autoinmune,!inflamatoria,!crónica!y!sistémica!que!se!caracteriza!por! una!sinovitis!erosiva!simétrica,!en!la!cual!el!tejido!de!granulación!de!origen!sinovial!(pannus),! invade!y!erosiona!el!cartílago!y!el!hueso!de!las!articulaciones!diartrodiales.!Los!FS!juegan!un! papel!fundamental!en!la!persistencia!de!la!inflamación!crónica!y!en!!el!daño!articular,!siendo! unas! de! las! poblaciones! celulares! más! abundantes! en! el! pannus.! Actúan! directamente! degradando!la!matriz!del!cartílago,!e!indirectamente!sobre!el!hueso!como!inductores!de!la! diferenciación!y!activación!de!los!osteoclastos!(Fauci,'2010).! El! abordaje! terapéutico! de! la! AR! es! multidisciplinar,! dirigida! a! la! supresión! inespecífica! del! proceso! inflamatorio,! con! el! objetivo! de! mitigar! los! síntomas! y! signos! de! la! enfermedad,! englobando!tratamiento!fisioterápico!y!farmacológico.!No!obstante,!!dado!las!limitaciones!!en! eficacia!y!seguridad!!de!la!farmacoterapia!actual!antirreumática,!se!ha!generado!en!los!últimos! años,! un! auge! en! el! uso! de! otras! estrategias! terapéuticas,! entre! las! que! destaca! la! terapia! nutricional!y!el!uso!de!nutracéuticos!(Fauci,'2010).! Recientemente! nuestro! grupo! de! investigación! ha! puesto! de! manifiesto! el! potencial! antirreumático!del!AOVE,!base!de!nuestra!dieta!mediterránea,!!de!su!fracción!polifenólica!y!!de! un!!uno!de!sus!fenoles!derivado!del!hidroxitirosol!(acetato!de!hidroxitirosol)!!(Rosillo'y'cols.,'' 2014,'2015,'2016)!!en!un!modelo!in'vivo'de!artritis!inducida!por!colágeno!en!ratones!DBA/1.! No!obstante,!no!existen!hasta!la!fecha,!estudios!experimentales!in'vitro'en!células!humanas' que!validen!el!potencial!antirreumático!de!los!!secoiridoides,!y!en!particular!de!OLE!así!como! los!!mecanismos!bioquímicos!y!moleculares!!implicados.!!!! En! base!a! la! actividad! antiinflamatoria! de! OLE!puesta! de! manifiesto! en! modelos!! experimentales!in' vitro!e!in' vivo,!se!plantea! llevar!a!cabo!un! desarrollo!experimental!! cuyo! objetivo!principal!es!llegar!al!conocimiento!del!funcionalismo!de!este!secoiridoide!!en!una!línea! celular! validada! para! el! estudio! de! la! AR! de! FS! humanos! (SW982)!y!dilucidar! los! posibles! mecanismos!moleculares,!así!como,!las!!vías!de!señalización!involucradas.!!! ! 18! METODOLOGÍA* 1. Oleuropeína:*Extracción*y*caracterización*química* Para! la! extracción! de!OLE! a! partir! de! hojas! de! olivo,! se! siguió! el! método! descrito! por! (Stamatopoulos' y' cols.,' 2014).! Posteriormente,! el! extracto! se! concentró! a! sequedad! y! el! residuo! se! purificó! mediante! cromatografía! en! columna! de! gel! de! sílice! (Diclorometanometanol! 10:1--->5:1)! obteniéndose! OLE!como! un! sólido! débilmente! amarillo! que! fue! analiazado!posteriormente!por!RMN!de!alta!resolución!(Servicios!Generales!de!la!Universidad! de!Sevilla,!Citius,!que!cuenta!con!equipos!Bruker!Advance!III!500!y!700!MHz).! * 2. Cultivo*celular* La!línea! celular! de! FS!humanos! SW982! se! obtuvo!de! American! Tissue! Culture! Collection! (ATTC®,!Number!HTB-93!(Manassas,!VA,!EE.UU.)).!Las!células!SW982!se!cultivaron!en!flasks!T150!(NuncTM,!Barcelona,!España),!con!Dulbecco's!Modified!Eagle!Medium!(DMEM)!con!2!mM! de!L-glutamina,!suero!fetal!bovino!al!10%!(SFB)!y!penicilina-estreptomicina!al!1%,!a!37ºC!y!5%! CO2.! 3. Viabilidad*celular* Las!células!fueron!sembradas!en!placas!de!96!pocillos!(1!x!105!células/pocillo)!e!incubadas!en! presencia!o!ausencia!de!OLE!durante!24!h.!Transcurrido!este!tiempo!de!exposición,!el!efecto! del!compuesto!en!la!viabilidad!celular!fue!analizado!mediante!el!ensayo!de!la!sulforrodamina!B! (SRB)! (Skehan' y' cols.,' 1990).! Después!del!periodo!de! incubación,!las!células! adherentes! del! cultivo! fueron!fijadas! a! la! placa,! añadiendo! 50! mL! de! ácido! tricloroacético!(50%!p/v)!frío! (Sigma-Aldrich®,!Madrid,!España)!e!incubadas!durante!60!minutos!a!4ºC.!El!sobrenadante!se! descartó,!y!las!placas!se!lavaron!cinco!veces!con!agua!destilada!y!se!secaron!al!aire.!Se!añadió!a! cada! pocillo! 50!µL!de! solución! SRB! (Sigma-Aldrich®,! Madrid,! España)! (0.4%! p/v)! en! ácido! acético!al!1%!(Panreac®,!Barcelona,!España)!y!se!incubó!durante!30!minutos!a!temperatura! ambiente.! Se! eliminó! la!solución! SRB! de! las! placas! y!posteriormente,!fueron!lavadas! cinco! veces!con!ácido!acético!al!1%.!Seguidamente,!se!secaron!las!placas!y!se!añadieron!100!µL!por! pocillo! de!Tris! base! (100! mmol/L,! pH! 10.5)! (Sigma-Aldrich®,! Madrid,! España),! leyendo,! a! continuación,! la! absorbancia! a! 510!nm! utilizando! un! lector! de! placas!(BioRad®,! Madrid,! España).!Finalmente,!la!viabilidad!de!las!células!se!calculó!como!el!porcentaje!de!absorbancia! comparado!con!el!obtenido!en!las!células!sin!tratar,!a!los!que!se!les!asignó!el!valor!100%.! ! ! 19! 4. Determinación*de*citocinas:*IL-6*y*TNF-α! Las! células! SW982! se! sembraron!en! placas! de! 24! pocillos! (2.5x105!células/pocillo).! 48! h! después!de!sembrarlas,!se!incubaron!en!presencia!o!ausencia!de!OLE!(50!y!100!µM)!durante!24! h! en! DMEM! con! 10%! (v/v)! de! SFB! en! una! atmósfera! del! 5%! CO2!a! 37ºC.! Seguidamente,!se! estimularon!con!IL-1β!(5ng/mL)!y!se!incubaron!durante!24!h.!Los!sobrenadantes!del!cultivo! fueron!recogidos!y!conservados!a!-80!ºC.! Los!niveles!de!IL-6!y!de!TNF-α!se!han!valorado!mediante!un!enzimoinmunoanálisis!(ELISA)!tipo! competitivo!usando! un!kit!comercial!de!eBioscience®(!San!Diego,!CA,!EE.UU.),!siguiendo!las! instrucciones!indicadas!en!los!mismos.!El!método!estuvo!basado!en!la!competición!entre!la!IL6!y!TNF-α!de!la!muestra,!y!un!estándar!por!la!unión!a!un!anticuerpo!(Ac)!policlonal!anti-IL-6!o! anti-TNF-α!que!revestía!la!placa.!Tras!la!incubación,!se!añadió!un!Ac!monoclonal!que!se!unió!al! anterior,!y!!esta!ligado!a!la!enzima!catalasa!(enzima!de!detección).!Tras!un!nuevo!lavado,!se! adicionó!el!substrato!y!la!reacción!enzimática!produjo!un!color!cuya!intensidad!se!midió!a!450! nm! en! lector! de! placa! Labsystems! Multiskan! Ex.! (Helsinki,! Finlandia)! siendo! directamente! proporcional!a!la!cantidad!de!IL-6!o!de!TNF-α!de!las!muestras.'' ' 5. Determinación*de*la*expresión*proteica** Con!este! estudio,! se! determinaron! los! cambios! en!la! expresión! de! determinadas! proteínas! presentes! en! las! células! SW982! mediante! electroforesis! en! gel! de! dodecil!sulfato!sódico! (SDS)/poliacrilamida!y,!posterior!transferencia!a!una!membrana!de!nitrocelulosa,!y!detección! mediante! una! reacción! de! quimioluminiscencia! empleando! anticuerpos! específicos! de! la! proteína!de!interés!(Western'blot)(Figura'5).! Las! células! se! incubaron! en! presencia! o! ausencia! de!OLE!(50! y! 100! µM)!durante! 24! h! y!se! estimularon!con!IL-1β!(5ng/mL)!a!distintos!tiempos,!dependiendo!de!la!proteína!estudiada!(30! min!o!24!h).!Pasado!el!tiempo!de!estímulo,!las!células!se!lisaron!utilizando!un!tampón,!que! contenía!un!cocktail!de!inhibidores!de!proteasas!y!fosfatasas,!y!se!procesaron!según!describen! Sánchez-Hidalgo!y!cols.!(2005)!para!aislar!las!proteínas.! La!concentración!proteica!de!cada!muestra!se!determinó!de!acuerdo!al!método!colorimétrico! descrito!por!Bradford.!En!este!ensayo,!5!µl!de!cada!una!de!las!muestras!a!determinar!fueron! añadidos!y!mezclados!con!el!reactivo!de!Bio-Rad'protein'assay'(Bio-Rad®),!el!cual!alcanza!una! absorbancia!máxima!a!595!nm,!permitiendo!su!posterior!lectura!en!un!espectrofotómetro.!! ! 26! La!expresión!de!m-PGES-1!(Figura'8),!fue!incrementada!en!FS!tras!la!estimulación!con!IL-1β!con! respecto!a!los!que!no!fueron!estimulados!con!la!citocina!(***'p<0.001'vs.'células'control'no' estimuladas).!No! obstante,! el! tratamiento! con! ambas! dosis! de! OLE!causó! una! disminución! estadísticamente!significativa!de!la!expresión!de!dicha!proteína!respecto!a!las!células!control! tras!la!estimulación!con!IL-1β'(++'p<0.01'vs.'células'control'estimuladas'con'IL-1 β ).! ! !!!!!!!!!!!!!!! ! Figura'8.'Expresión'proteica'de'm-PGES-1'tras'el'tratamiento'con'OLE'en'células'SW982.'Las' células'fueron'no'tratadas'o'tratadas'con'OLE'(50'y'100'μM)'durante'24'h'en'presencia'de'IL-1 β ' (5'ng/mL).'Las'células'control'no'estimuladas'fueron'incubadas'en'ausencia'de'IL-1 β .'El'gráfico' representa'la'intensidad'de'la'banda.'La' β -actina'sirvió'como'control'para'la'normalización'de' la' igualdad' de' carga.' Los' datos' mostrados' son' medias' ±' SEM!(n=4).' ***p<0.001'vs.' células' control'sin'estimular;'++p<0.01'células'control'estimuladas'con'IL-1 β .' ' 4. Estudio*de**vías*de*señalización* Para! explorar! el! posible! mecanismo! molecular! de! la! actividad! farmacológica! de! OLE! en! FS! humanos,!determinamos!sus!efectos!potenciales!en!la!vía!de!señalización!de!las!MAPK:!JNK!y! p38,!tras!30!minutos!de!estimulo!con!IL-1β.! Nuestros!resultados!pusieron!de!manifiesto!que!los!FS!de!la!línea!SW982!estimulados!con!IL1β,! inducían! un! aumento! significativo! de! la! fosforilación! de! las! proteínas! JNK! y! p38,! en! comparación!con!los!fibroblastos!control!no!estimulados.!Por!el!contrario,!el!tratamiento!con! β-actina 46 kDa m-PGES-1 16 kDa ! 27! OLE!(50!y!100!μM)!redujo!significativamente!la!fosforilación!de!ambas!MAPK:!JNK!y!p38,!tras! 30!minutos!de!estímulo!con!IL-1β!(++'p<0.01'y'+++'p<0.001'vs.'células'control'estimuladas'con' IL-1 β )'(Figura'9).! ! ! Figura'9.'Expresión'proteica'de'las'proteínas'MAPK:'pp38'y'pJNK.'Las'células'fueron'tratadas' con'OLE'(50'y'100'μM)'durante'24'h'y'estimuladas'con'IL-1 β '(5'ng/mL)'durante'30'minutos.'Las' células' control' no' estimuladas' se' incubaron' en' ausencia' de' IL-1 β .' El' gráfico' muestra' la' intensidad'de'la'banda.'El'análisis'densitométrico'se'realizó'tras'la'normalización'con'los'genes' de'control'(JNK'y'p38)'para'la'igualdad'de'carga.'Los'datos'mostrados'son'medias'±'SEM!(n=6).' ***p<0.001'vs.'células' control' sin' estimuladas;' ++p<0.01' y' +++p<0.001' vs.' células' control' estimuladas'con'IL-1 β .' ' ' ' ' pJNK JNK 46 KDa 46 KDa 38 kDa 38 kDa P38 pp38 ! 28! DISCUSIÓN* Los!FS!desempeñan!una!función!relevante!en!la!patogenia!de!la!AR.!En!la!membrana!sinovial! reumatoide,!los!FS!aumentan!en!número!y!muestran!un!fenotipo!alterado.!Este!tipo!de!células! producen! citocinas,! que! junto! con! la! producción! de! anticuerpos! e! inmunocomplejos,! mantienen!la!inflamación!crónica!y!destruyen!el!tejido,!debido!sobretodo!a!la!sobreexpresión! local!de!mediadores!inflamatorios,!como!IL-6,!entre!otros!(Izquierdo'y'Pablos,'2013).' 'Son! varios! los! estudios! llevados! a! cabo! por! nuestro! grupo! de! investigación! con! distintos! compuesto!fenólicos!en!modelos!in'vivo'e'in'vitro!!de!AR!(Rosillo'y'cols.,'2014,'2015,'2016).!Sin! embargo,!hasta!la!fecha,!no!se!conoce!el!potencial!antirreumático!de!OLE!en!los!fibroblastos! sinoviales!humanos.!' Entre! las! principales! citocinas!pro-inflamatorias! implicadas! en! la! patogénesis! de! AR! se! encuentran:!TNF-α,!IL-1β!e! IL-6.!Principalmente,!la!IL-6!se! encuentra!en! células!sinoviales!y! macrófagos!promoviendo!la!degradación!del!cartílago!y!la!activación!de!osteoclastos!(Baillet'y' cols.,'2015).!Nuestro!estudio!demostró!como!la!estimulación!con!IL-1β,!producía!un!aumento! en!la!expresión!de!IL-6!y!TNF-α!en!las!células!SW982,!mientras!que!el!pretratamiento!con!OLE! disminuyó!de!forma!significativa!los!niveles!de!ambas!citocinas.! Así!mismo,!la!COX-2,!isoforma!inducible!de!COX,!es!una!enzima!clave!que!cataliza!la!biosíntesis! de!PG!a!partir!de!ácido!araquidónico,!y!a!su!vez,!de!!m-PGES-1,!y!juega!un!papel!clave!en!la! respuesta!inflamatoria.!Nuestros!resultados!pusieron!de!manifiesto!como!la!expresión!proteica! de!ambas!enzimas! (COX-2!y!m-PGES-1)! aumentaba!de!forma!significativa!en! células!SW982! estimuladas!por!IL-1β;!no!obstante,!el!tratamiento!con!OLE!indujo!un!descenso!considerable! de!la!expresión!de!estas!enzimas!inflamatorias.!! Estos!resultados!concuerdan!con! los!obtenidos!en! otros!estudios,! en!los! que! se! demuestra! como!OLE!es!capaz!de!reducir!la!repuesta!inflamatoria!mediante!una!disminución!en!en!los! niveles! de! COX-2,! m-PGES-1,! IL-6,! TNF-α,! entre! otros! (Ryu' y' cols.,' 2015;' Impellizzeri' y' cols.,' 2011;'Corona'y'cols.,'2007).! Entre!las!vías!de!señalización!implicadas!en!la!AR!se!encuentra!la!vía!de!las!MAPK!(Smolen'y' Steiner,'2003).!Las!MAPK!activadas,!ERK,!JNK!y!p38!se!localizan!en!el!tejido!sinovial!y!pueden! ser!estimuladas!por!citocinas!proinflamatorias! como! IL-1β! (Schett' y' cols.,' 2000).!Del!mismo! modo,!en!nuestro!trabajo!pudimos!demostrar!como!cuando!estas!células!son!tratadas!con!OLE! se!reducía!la!fosforilación!de!ambas!MAPK:!JNK!y!p38,!datos!coincidentes!con!los!obtenidos! ! 29! por! nuestro! grupo! de! investigación! en! estudios! llevados! a! cabo! con! otros! compuestos! fenólicos!en!modelos!murinos!inducidos!de!artritis!(Rosillo'y' cols.,'2015),!donde!se!puso!de! manifiesto! el! efecto! antirreumático! de! estos! compuestos! fenólicos! mediante! la! drástica! disminución!de!la!activación!de!las!MAPK.!! ! En!resumen,!los!resultados!de!este!Trabajo! Fin! de!Grado! ponen!de! manifiesto!un!marcado! efecto!antiinflamatorio!de!OLE!sobre!fibroblastos!sinoviales!humanos!(SW982),!caracterizado! por! una! ! disminución! en! los! niveles! de! citocinas! pro-inflamatorias:! IL-6! y! TNF-α.! Entre! los! distintos!mecanismos!de!acción!posiblemente!implicados!figuran!el!descenso!de!la!expresión! de!la!enzima!inducible!COX-2,!y!por!tanto,!de!m-PGES-1,!a!través!de!la!inhibición!de!la!vía!de! señalización!de!MAPK.! * ! * * * * * * * ! 30! CONCLUSIÓN* Los!resultados!de!este!Trabajo!Fin!de!Grado!permiten!concluir!que:! 1. La!OLE!presenta!un!marcado!efecto!antiinflamatorio!sobre!los!FS!humanos!(SW982),! caracterizado!por!una!disminución!en!los!niveles!de!citocinas!pro-inflamatorias:!IL-6!y! TNF-α.!Entre!los!distintos!mecanismos!de!acción!posiblemente!implicados!figuran!el! descenso!de!la!expresión!de!la!enzima!inducuble!COX-2,!y!por!tanto,!de!m-PGES-1,!a! través!de!la!inhibición!de!la!vía!de!señalización!MAPK.! ! 2. Estos!resultados!preliminares!sugieren!que!OLE!podría!participar!en!el!desarrollo!de! una! nueva! estrategia! terapéutica! dirigida! a! los! elementos! del! sistema! inmunitario,! cuyas! limitaciones! en! eficacia! y! seguridad! son! bien! conocidas,! y! constituir! un! complemento! nutricional! de! gran! valor! en! tratamiento! y/o! prevención! de! la! AR! al! actuar!sobre!porcesos!FS-dependientes.! * * * * * * * * ! 31! ABREVIATURAS*Y*SIGLAS* ! ! o Ac:!Anticuerpo! o ALMT:! Ácido! logánico! metiltransferasa! o ALT:!Alanina!aminotransferasa! o AOVE:!Aceite!de!oliva!virgen!extra! o AR:!Artritis!reumatoide! o ARNm:!ARN!mensajero! o AST:!Aspartato!aminotransferasa! o CAT:!Catalasa! o CCF:!Cromatografía!de!capa!fina! o CE:!Electroforesis!capilar! o CIA:!Artritis!colágeno-inducida! o CK-MB:!Creatinquinasa-MB! o CK:!Creatinquinasa! o COX-2:!Ciclooxigenasa!2! o DMEM:!Dulbecco's!Modified!Eagle! Medium! o DXR:!Doxorrubicina! o ELISA:!Enzimoinmunoanálisis! o ERK:! Cinasa! regulada! por! señal! extracelular! o ERN:! Especies! reactivas! de! nitrógeno! o ERO:!Especias!reactivas!de!oxígeno! o ESI-MS/MS:! Ionización! por! electrospray-espectrocopía! de! masa! o FA:!Fosfatasa!alcalina! o FAMS:! Full! Automatic! Modelling! System! o FS:!Fibroblastos!sinoviales! o GC-MS:! Cromatografía! de! masasespectrometría!de!masas! o GDNF:! Factor! neutrófico! derivado! de!células!gliales! o GE10H:!Geraniol!10-hidroxilasa! o GES:!Geraniol!sintasa! o GHS:!Glutation! o GOT:! Transaminasa! glutámico! oxalacética! o GPx:!Glutation!peroxidasa! o GRx:!Glutation!reductasa! o GT:!Glucosiltransferasa! o HPLC:!Cromatografía!líquida!de!alta! eficacia! o IAM:!Infarto!agudo!de!miocardio! o IL:!Interleucina! o iNOS:! Óxido! nítirico! sintasa! inducible! o JNK:!c-Jun!NH2!–terminal!cinasa! o LDH:!Lactato!deshidrogenasa! o LPS:!Lipopolisacáridos! o m-PGES-1:Prostaglandina!E!sintasa1!microsomal! o MAPK:!Proteínas!cinasas!activadas! por!mitógenos!! o MMP:!Metaloproteasa!de!la!matriz! o MPO:!Mieloperoxidasa! o NDHI:!NADH!deshidrogenasa! o NO:!Óxido!nítrico! o OLE:!Oleuropeína! o PG2:!Prostaglandina!E2! o PKA:!Proteinquinasa!A! o SDS:!Dodecil!sulfato!sódico! o SEM:!Error!estándar!de!la!media! o SFB:!Suero!fetal!bovino! o sGPT:! Transaminasa! glutámico! pirúvica!en!suero! o SLS:!Secologanina!sintasa! o SOD:!Superóxido!dismutasa! o SRB:!Sulforrodamina!B! o TG:!Triacilglicéridos! o TNF:!Factor!de!necrosis!tumoral! o VHB:!Virus!de!la!hepatitis!B! o VIH:!Virus!de!la!inmonodeficiencia! humana! ! ! * ! 32! BIBLIOGRAFÍA* o Ahmad-Qasem!MH,! Barrajón-Catalán! E,! Micol! V,! Mulet! A,! García-Pérez! JV.! 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Evaluation!of!serum!interleukin-6!level!as!a!surrogate!marker!of!synovial!inflammation!and! as! a! factor! of! structural! progression! in! early! rheumatoid! arthritis:! results! from! a! French! national!multicenter!cohort.!Arthritis!Care!Res!(Hoboken).!2015;!67(7):!905-912.! ! 33! o Barbaro&B,"Toietta"G,"Maggio"R,"Arciello"M,"Tarocchi"M,"Galli"A"et"al."Effects"of" the" olive-derived" polyphenol" oleuropein" on" human" health." Int" J" Mol" Sci." 2014;" 15(10):" 18508-18524." o Bazoti&FN,"Bergquist"J,"Markides"KE,"Tsarbopoulos"A."Noncovalent"interaction" between"amyloid-β-peptide"(1–40)"and"oleuropein"studied"by"electrospray"ionization"mass" spectrometry."J"Am"Soc"Mass"Spectrom."2006;"17(4):"568–575." o Bi&X,"Li"W,"Sasaki"T,"Li"Q,"Mitsuhata"N,"Asada"Y"et"al."Secoiridoid"glucosides"and" related"compounds"from"Syringa"reticulata"and"their"antioxidants"activities."Bioorg"Med" Chem"Lett."2011;"21(21):"6426–"6429." o Bisignano& G,"Tomaino"A,"Lo"Cascio"R,"Crisafi"G,"Uccella"N,"Saija"A."On"the"in" vitro" antimicrobial"activity"of"oleuropein"and"hydroxytyrosol."J"Pharm"Pharmacol."1999;" 51(8):"971–974." o Boccio& P," DiDeo" A," De" Curtis" A," Celli" N," Iacoviello" L," Rotilio" D." Liquid" chromatography-tandem" mass" spectrometry" analysis" of" oleuropein" and" its" metabolite" hydroxytyrosol"in"rat"plasma"and"urine"after"oral"administration."J" Chromatogr"B."2003;" 785(1):"47–56."" o Bouaziz&M,"Jemai"H,"Khabou"W,"Sayadi"S."Oil"content,"phenolic"profiling"and" antioxidant"potential"of"Tunisian"olive"drupes."J"Sci"Food"Agric."2010;"90(10):"1750–1758."" o Bradford&MM."A"rapid"and"sensitive"method"for"the"quantitation"of"microgram" quantities"of"protein"utilizing"the"principle"of"protein-dye"binding."Anal"Biochem."1976;"72:" 248-254." o Čabarkapa& A," Živkovic´" L," Žukovec" D," Djelic´" N," Bajic´" V," Dekanski" D" et" al." Protective" effect" of" dry" olive" leaf" extract" in" adrenaline" induced" DNA" damage" evaluated" using"in"vitro"comet"assay"with"human"peripheral"leukocytes."Toxicol"In"Vitro."2014;"28(3):" 451–456." o Caponio& F," Alloggio" V," Gomes" T." Phenolic" compounds" of" virgin" olive" oil:" Infuence"of"paste"preparation"techniques."Food"Chem."1999;"64(2):"203–209."" o Cárdeno&A,&Sánchez-Hidalgo"M,"Alarcón-de-la-Lastra"C."An"up-date"of"olive"oil" phenols"in"inflammation"and"cancer:"Molecular"mechanisms"and"clinical"implications."Curr" Med"Chem."2013;"20:"4758-4776." o Carrera-González&MP,"Ramírez-Expósito"MJ",Mayas"MD,"Martínez-Martos"JM." Protective"role"of"oleuropein"and"its"metabolite"hydroxytyrosol"on"cancer."Trends""Food"Sci" Tech."2013;"31(2):"92–99." ! 34! o Caturla'N,"Perez"Fons"L,"Estepa"A,"Micol"V."Differential"effects"of"oleuropein,"a" biophenol" from" Olea" europaea," on" anionic" and" zwiterionic" phospholipid" model" membranes."Chem"Phys"Lipids."2005;"137(1-2):"2–17." o Charoenprasert'S,"Mitchell"A."Factors"influencing"phenolic"compounds"in"table" olives"(Olea"europaea)."J"Agric"Food"Chem."2012;"60(29):"7081–7095." o Cho' JH." Recent" progress" in" inflammatory" bowel" disease." Adv" Exp" Med" Biol." 2006;"579:"24-34." o Cicerale'S,"Lucas"LJ,"Keast"RS."Antimicrobial,"antioxidant"and"anti-inflammatory" phenolic"activities"in"extra"virgin"olive"oil."Curr"Opin"Biotechnol."2012;"23(2):"129–135." o Corona' G," Deiana" M," Incani" A," Vauzour" D," Dessì" MA," Spencer" JPE." (2007)." Inhibition" of" p38/CREB" phosphorylation" and" COX-2" expression" by" olive" oil" polyphenols" underlies" their" anti-proliferative" effects." Biochem" "Biophys" Res" Commun." 2007;" 362(3)," 606–611." o Czerwisńka'M,"Kiss"AK,"Naruszewicz"M."A"comparison"of"antioxidant"activities" of" oleuropein" and" its" dialdehydic" derivative" from" olive" oil," oleacin." Food" Chem." 2012;" 131(3):"940–947." o Daccache' A," Lion" C," Sibille" N," Gerard" M," Slomianny" C," Lippens" G," Cotelle" P." Oleuropein" and" derivatives" from" olives" as" Tau" aggregation" inhibitors." Neurochem" Int." 2011;"58(6):"700–707." o Damtoft' S," Franzyk" H," Jensen" SR." Biosynthesis" of" iridoids" in" Syringa" and" Fraxinus:"carbocyclic"iridoid"precursors."Phytochemistry."1995;"40(3):"785–792." o De'La'Torre-Carbot'K,"Jauregui"O,"Gimeno"E,"Castellote"AI,"Lamuela-Raventós" RM," López-Sabater" MC." Characterization" and" quantification" of" phenolic" compounds" in" olive"oils"by"solid-phase"extraction,"HPLC-DAD,"and"HPLC-MS/MS."J"Agric"Food"Chem."2005;" 53(11):"4331-4340."" o Dell’Agli'M,"Fagnani"R,"Galli"GV,"Maschi"O,"Gilardi"F,"Bellosta"S"et"al."Olive"oil" polyphenols"modulate"the"expression"of"metalloproteinase"9"in"THP-1"cells"by"acting"on" nuclear"factor-kβ"signalling."J"Agric"Food"Chem."2010;"58(4):"2246–2252." o Deng' RX," Yuan" H," Yin" WP," Wang" XS," Zhao" TZ." Chemical" constituents" from" Syringa"pubescens"Turcz."Biochem"Syst"Ecol."2010;"38:"813–815." o Domitrovic´'R,"Jakovac"H,"Marchesi"VV,"Šain"I,"Romic´"Ž,""Rahelic´"D.""Preventive" and"therapeutic"effects"of"oleuropein"against"carbon"tetrachloride-induced"liver"damage"in" mice."Pharmacol"Res."2012;"65(4):"451–464." o Esti'M,"Cinquanta"L,"la"Notte"E."Phenolic"compounds"in"different"olive"varieties." J"Agric"Food"Chem."1998;"46(1):"32–35." ! 35! o Fang% HL,!Lai! JT,! Lin! WC.! Inhibitory! effect! of!olive! oil! on! fibrosis! induced! by! carbon!tetrachloride!in!rat!liver.!Clin!Nutr.!2008;!27(6):!900–907.! o Fauci% AS,! Langford! CA.! Harrison! Reumatología! (2nd! ed.).! Mc-Graw-Hill! Interamericana.!2010.! o Fernández-Bolaños%J,!Rodríguez!G,!Rodríguez!R,!Heredia!A,!Guillén!R,!Jiménez! A.!Production!in!largue!quantities!of!highly!purified!hydroxytyrosol!from!liquid-solid!waste! of!two-phase!olive!oil!processing!or!“Alperujo”.!J!Agric!Food!Chem.!2002;!50!(23):!68046811.! o Fuentes% E,! Palomo! I.! Antiplatelet! effects! of! natural! bioactive! compounds! bymultiple!targets.!Food!and!drug!interactions.!J!Funct!Foods.!2014;!6(1):!73–81.! o Furneri%PM,!Marino!A,!Saija!A,!Uccella!N,!Bisignano!G.!In!vitro!antimycoplasmal! activity!of!oleuropein.!Int!J!Antimicrob!Agents.!2002;!20(4):!293–296.! o Ghosh%S,!Goldin!E,!Gordon!FH,!Malchow!HA,!Rask-Madsen!J,!Rutgeerts!P!et!al.! Natalizumab!for!active!Crohn’s!disease.!N!Engl!J!Med.!2003;!348(1):!24-32.! o Giner%E,!Andújar!I,!Recio!MC,!Ríos!JL,!Cerdá-Nicolás!JM,!Giner!RM.!Oleuropein! ameliorates!acute!colitis!in!mice.!J!Agric!Food!Chem.!2011;!59(24):!!12882–!12892.!! o Giner% E,! Recio! MC,! Ríos! JL,! Giner! RM.! Oleuropein! protects! against! dextran! sodium!sulfate-induced!chronic!colitis!in!mice.!J!Nat!Prod.!2013;!76(6),!1113–!1120.! o Goldsmith% CD,! Stathopoulos! CE,! Golding! JB,! Roach! PD.! Fate! of! the! phenolic! compounds!during!olive!oil!production!with!the!traditional!press!method.!Int!Food!Res!J! 2014;!21(1):!101–109.! o !González% M,! Zarzuelo! A,! Gamez! MJ,! Utrilla! MP,! Jimenez! J,! Osuna! I.! Hypoglycemic!activity!of!olive!leaf.!Planta!Med.!1992;!58(6):513–515.!! o Guo% N,! Yu! Y,! Ablajan! K,! Li! L,! Fan! B,! Peng! J! et! al.! Seasonal! variations! in! metabolites! profiling! of! the! fruits! of! Ligustrum! lucidum! Ait.! Rapid! Commun! Mass! Spectrom.!2011;!25(12):!1701–1714.!! o Hamdi%HK,!Castellon!R.!Oleuropein,!a!non-toxic!olive!iridoid,!is!an!anti-tumor! agent!and!cytoskeleton!disruptor.!Biochem!Biophys!Res!Commun.!2005;!334(3):!769–778.! o Hassem%I,!Casabianca!H,!Hosni!K.!Biological!activities!of!the!natural!antioxidant! oleuropeína:!Exceeding!the!expectation-!A!mini-review.!J!Funct!Foods.!2015;!18:!926-40.! o Hommes%D,!van!den!Blink!B,!Plasse!T,!Bartelsman!J,!Xu!C,!Macpherson!B!et!al.! Inhibition! of! stress-activated!MAP!kinases! induces!clinical!improvement! in!moderate!to! severe!Crohn’s!disease.!Gastroenterol.!2002;!122(1):!7-14.!