Estudio de variantes genéticas asociadas a esofagitis eosinofílica

Universidad de Sevilla Programa de Doctorado Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica. Departamento Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología Estudio de variantes genéticas asociadas a esofagitis eosinofílica Tesis presentada por María del Robledo Ávila Castellano Sevilla 2022 “No hay sueños, ideas, ni metas que puedas cumplir sin esfuerzo y dedicación” Francisco Cayol A mi madre, hoy el sol luce radiante y cuando llegue la noche ese lucero en el que vives cuidándome, eclipsará a la luna, porque segura estoy, de que hoy, no hay nadie más orgullosa que tú. Agradecimientos Durante muchas horas, días, meses, años he intentado arrancar tiempo al tiempo para sacar este proyecto adelante, hoy enciendo el ordenador y sólo me queda por escribir los agradecimientos y realmente no sé cómo hacerlo. ¡He acabado mi tesis! Y … de repente, miro hacia atrás y me paro a pensar como he llegado hasta aquí, que o quienes han hecho que llegue hasta este momento, y se me pasan por la mente las innumerables personar a las que dar las gracias por haber hecho de este sueño una realidad. En primer lugar, deseo expresar mi agradecimiento a mi tutor Juan Miguel Guerrero Montávez y a mis directores de tesis, Dr. Raúl García Lozano (FEA del departamento de Inmunología del Hospital Universitario Virgen del Rocío) y Dr. Joaquín Quiralte Enríquez (Director de la Unidad de Gestión Clínica de Alergología). Raúl muchas gracias por tu ayuda, tu profesionalidad, por tus explicaciones repetidas, tu infinita paciencia, por el tiempo que me has dedicado y por adaptarte siempre a mis horarios. Has sido un director exigente, recto, con miles de cambios y correcciones, claro ésta que era tu papel y sin duda lo has cumplido con creces. Has sabido poner a mi disposición siempre las personas y recursos que más nos interesaban en cada momento, probablemente sin tu ayuda este proyecto no hubiera visto su fin. Joaquín, seguro que no recuerdas una anécdota que sin duda fue el inicio de esta tesis, era yo escasa R1 y pasando una consulta que por motivos diversos había quedado descubierta, me llegó un paciente derivado de Digestivo por esofagitis eosinofílica … mi cara muy probablemente palideció y salí cual R1 en busca de ayuda … Muchas cosas vendrían después de éste primer paciente, búsquedas, más de una decena de proyectos y solicitudes buscando financiación, llamando a todas las puertas, a veces con mejor suerte y la mayoría con regular. Pero siempre has estado ahí … poniendo cordura a todos estos años de locura. Has sido como un padre en mi mundo de la alergia. Me has ayudado, aconsejado en los momentos de dudas, me has animado, reñido, llamado al orden, has soportado mis altos y bajos tanto personales como profesionales, me has exigido, pero también has hecho que mi sueño de ser Doctora … ¡vea hoy la luz! Muchísimas gracias por confiar en mí y acompañarme en todo este recorrido con final feliz. Agradecimientos sin duda al servicio de Alergología del Hospital Universitario Virgen del Rocío, a todos mis compañeros que me han ayudado en la recopilación de pacientes y en especial a la enfermería que han colaborado de forma activa en la realización de las pruebas, en las extracciones sanguíneas, muchas gracias a todos, desde Lola Barcia, Elena Pascual, Eladis, María José Sierra, “me han criado”… pasando por Diego, Esteban y Carmen que son los actuales y con los que mantengo una excelente relación. VI VII Abreviaturas VIII IX Abreviaturas APC: célula presentadora de antígeno. ARNm: ARN mensajero bp: pares de bases CAPN14: calpaicina 14 CCL5: Chemokine (C-C motif) ligand 5- RANTES CDE: complejo de diferenciación epidérmica CGA: campo de gran aumento CCL16: eotaxina 3 CCR3: receptor de quimiocinas DA: dermatitis atópica DSG: desmogleina EoE: esofagitis eosinofílica. Eotaxina-3 (CCL26) EREFS: Eosinophilic Esophagitis Endoscopic Reference Scores ERGE: enfermedad por reflujo gastroesofágico FcεRI: receptor de alta afinidad de la IgE FGF-9: factor de crecimiento de fibroblastos-9 FLG: filagrina FOXP: Forkhead winged-helix transcriptional factor GWAS: Genome Wide Association Studies IgE: inmunoglobulina E ICAM-1: molécula de adhesión celular vascular tipo 1 IgE-FA: alergia alimentaria mediada por IgE IL: interleucina ILC: células linfoides innatas NKT: células T asesinas naturales IVL: involucrina MAP: de las siglas en inglés Mitogen-Activated Protein MBP: proteína básica mayor OR: odds ratio PLAU: plasminogen activator urokinase POE: peroxidasa eosinofílica X POSTN: periostina PPU: proteína principal de unión PTM: modificaciones postraduccionales RA: rinitis alérgica SERPIN: inhibidores de la serina proteasa SNP: polimorfismo de un sólo nucleótido (single nucleotide polymorphism) SPINK: inhibidores de la serina proteasa tipo Kazal TGF-β: factor de crecimiento tisular Th2: T helper tipo 2 TLR: receptores tipo Toll. TSLP: linfopoetina tímica estromal tSNP: Tag SNP T regs: células T reguladoras VEGF-A: factor vascular de crecimiento epitelial 1 Introducción 2 3 Introducción 1.1 Concepto y epidemiología La esofagitis eosinofílica (EoE) se define como una enfermedad inflamatoria crónica del esófago de etiología inmunológica, caracterizada clínicamente por la existencia de síntomas de disfunción esofágica e histológicamente por la presencia de un infiltrado inflamatorio en el epitelio del esófago, con predominio de eosinófilos como células más características (1). En condiciones normales el esófago carece de eosinófilos por lo que su presencia en el esófago denota siempre enfermedad. El esófago es un órgano inmunológicamente activo con capacidad para reclutar células inflamatorias en respuesta a diferentes estímulos. En la EoE, este estímulo es una respuesta alérgica del esófago no mediada por IgE, desencadenada en la mayoría de los casos por alérgenos alimentarios (2,3) A pesar de su caracterización como una entidad clínico-patológica propia desde hace sólo dos décadas, su prevalencia ha crecido exponencialmente hasta representar en la actualidad el trastorno gastrointestinal eosinofílico más frecuente en nuestro medio (4). Es la principal causa de disfagia en niños y adultos jóvenes y la segunda causa de esofagitis crónica después de la enfermedad por reflujo gastroesofágico (5,6). La EoE es especialmente prevalente en los países occidentales y en las regiones con un mayor nivel de desarrollo socioeconómico, afectando a individuos de cualquier raza, sexo y edad (7). La enfermedad es más frecuente en niños y adultos jóvenes, con una prevalencia de al menos un caso por cada 2.000 habitantes en Europa y EEUU (7-9). Una revisión sistemática con metaanálisis, publicada en el año 2016, que 4 resumía todos los estudios de base poblacional disponibles hasta esa fecha, mostró una incidencia global de 3,7 nuevos casos por cada 100.000 habitantes, mientras que la prevalencia media estimada fue de 22,7 casos por 100.000 habitantes. Los autores, además, mostraron un aumento progresivo en la incidencia y prevalencia de la EoE cuando se analizaron los datos obtenidos a partir de 2008 (4). En el caso particular de nuestro país, dos estudios recientes realizados en el periodo de 2007 a 2016 han determinado una incidencia anual para todas las edades en torno a 10 nuevos casos/100.000 habitantes y año, y una prevalencia de 82-112 pacientes/100.000 habitantes, lo que supone que la enfermedad afecta en la actualidad al menos a uno de cada 1.000 españoles (4,10). 1.2. Fisiopatología de la EoE. La EoE es un proceso inflamatorio multifactorial de la mucosa esofágica que ocurre en sujetos con una predisposición genética, y que combina: 1.2.1) Una barrera mucosa esofágica deficiente. 1.2.2) Una reacción inmunitaria anormal a los aeroalérgenos y trofoalérgenos mediada por interleucinas Th2; y finalmente 1.2.3) Lesiones esofágicas inmediatas y dismotilidad, asociada con remodelación y fibrosis secundarias. 5 1.2.1. La respuesta inflamatoria epitelial: una barrera mucosa esofágica deficiente. En los últimos años, el papel potencial de la inmunidad innata en la EoE es cada vez más relevante. En contraste con la inmunidad adaptativa que es altamente específica, el sistema inmunológico innato reconoce y responde a las agresiones ambientales y patógenos externos sin la necesidad de una respuesta antígeno-específica. Las células epiteliales esofágicas se han revelado como las principales células efectoras, capaces de iniciar fenómenos inflamatorios en la EoE, no sólo a través de la liberación de quimiocinas como la eotaxina-3, que participa en el reclutamiento de eosinófilos, sino también al promover el reclutamiento hacia el esófago de células T asesinas naturales (NKT) y mastocitos (11-13). Así mismo, los cambios en la composición del microbioma esofágico descritos tanto en niños como en adultos con EoE, se han reconocido como un factor de riesgo para desarrollar esta enfermedad (14- 18). Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores transmembrana de tipo I, que se expresan tanto en células epiteliales como en células de la lámina propia, y tienen la capacidad de distinguir entre microbios patógenos y comensales por el reconocimiento de patrones microbianos (19). En los seres humanos hay un total de 11 TLR diferentes (nombrados de TLR1 a TLR11), cada uno con diferentes especificidades que, una vez estimuladas, activan las vías de transducción de señales intracelulares mediadas por MAP (Mitogen- Activated Protein) quinasas y NFKB (Nuclear Factor-Kappa B), lo que finalmente desencadena una respuesta inmunitaria inflamatoria (tabla 1). La mayoría de los TLRs se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos celulares del sistema inmune (20), incluyendo células dendríticas, 12 compuesto por la cadena beta del receptor de la IL2/IL15 (CD122) y la cadena gamma común (CD132). La IL15 desempeña un papel importante en la inmunidad antiviral al favorecer el desarrollo, la supervivencia, la proliferación y la activación de múltiples linajes de linfocitos, incluidas las células NKT (72). Recientemente se ha demostrado que la IL15 apoya las respuestas inflamatorias alérgicas de tipo Th2, posiblemente promoviendo localmente la síntesis de IgE frente a alérgenos en pacientes con EoE (11,67,72,73). 1.2.2.2. Células inmunes asociadas a la respuesta Th2. El infiltrado inflamatorio que caracteriza la EoE está constituido por varios tipos celulares que contribuyen a la inmunopatología de la enfermedad: Los eosinófilos son células sanguíneas originadas en la médula ósea que participan en la respuesta inmunológica frente a parásitos y en las reacciones de hipersensibilidad alérgicas. La presencia de eosinófilos (y mastocitos intraepiteliales), que suelen estar ausentes en la lámina propia y la submucosa esofágica, define a la EoE (59,64). Los eosinófilos además de constituir el componente inflamatorio mayoritario en la EoE, contribuyen de manera relevante a la fisiopatología de la enfermedad, actuando como células efectoras finales ocasionando el daño epitelial asociado a la enfermedad (74). Se reclutan desde la reserva de sangre por quimiotaxis local y son las encargadas de iniciar y mantener la respuesta inflamatoria. Secretan la peroxidasa eosinofílica (POE), la proteína catiónica eosinofílica y la proteína principal de unión (PPU), un antagonista del receptor muscarínico M2, que causa daño celular directo y dismotilidad esofágica, lo que aumenta la flexibilidad de las células del músculo liso (59,64,74,75). 13 Los mastocitos y los productos de su desgranulación también se encuentran aumentados en el epitelio esofágico de pacientes con EoE (76-78). Participan en la activación eosinofílica, la dismotilidad y la remodelación esofágica, con la aparición de fibrosis. Su patrón de secreción de proteasas y el aumento de la expresión de carboxipeptidasa A3 y triptasa podrían ser específicos de EoE (78). Las células de Langerhans, las CPA de la capa de queratinocitos, interactúan con los antígenos al comienzo de la cascada patológica. Expresan FcεRI, que correlaciona con el nivel de respuesta Th2 en las patologías atópicas (78-80). Los basófilos, al igual que los eosinófilos, se originan en la médula ósea y se reclutan por quimiotaxis local. Expresan el receptor de TSLP que a su vez induce, una respuesta inmune Th2, aumenta el reclutamiento de basófilos y CPA (53,54,81). El infiltrado inflamatorio de la EoE presenta además una alta densidad de linfocitos T, (75% son CD8+), siendo significativamente mayor que en los sujetos sanos y que en los pacientes con reflujo gastroesofágico (44). Además, el epitelio esofágico de los pacientes adultos (82) y niños (83) con EoE presenta una pequeña proporción de linfocitos B (CD20+), qué tras su maduración a células plasmáticas, producen y secretan inmunoglobulinas. Diversos estudios recientes han destacado el papel de las células NKT en el desarrollo temprano de la EoE (12). Estas células participan en las fases iniciales de la respuesta inmune, y pueden contribuir de manera relevante a la generación de tolerancia inmunitaria o autoinmunidad. Las células NKT son atraídas a los tejidos por la quimiocina CXCL16, derivada de células 14 presentadoras de antígenos y células epiteliales, cuyos niveles se relacionan de manera directa con la densidad de células NKT (84). Las células NKT han sido reconocidas además como la principal fuente de citoquinas Th2 en la EoE, al menos en las formas infantiles (12, 27, 54). 1.2.3. Las Lesiones esofágicas En las biopsias esofágicas, la disminución de la expresión de DSG1, FLG y el ensanchamiento del espacio intercelular hacen que la barrera esofágica sea más permeable a los antígenos (66, 85, 86). La PPU y el factor de crecimiento tisular (TGF-β), proteínas y mediadores que se secretan por eosinófilos, aumentan la secreción de triptasa, quimasa y enzimas proteolíticas, que contribuyen al daño de la matriz extracelular. La estimulación de los fibroblastos por PPU, TGF-β y la fibrosis se correlaciona con la remodelación esofágica completa e irreversible (87). La fibrosis asociada con la EoE es debida a la activación de eosinófilos, y la liberación del contenido de las enzimas de sus gránulos citoplasmáticos, concretamente la proteína básica mayor (MBP). La MBP aumenta la expresión del gen del factor de crecimiento de fibroblastos-9 (FGF-9) en biopsias de pacientes con EoE (88). La FGF-9 participa en la respuesta proliferativa secundaria al daño tisular, en la activación de fibroblastos y en el depósito de matriz extracelular. Los pacientes con EoE, presentan un aumento en la densidad de mastocitos en el epitelio y en la lámina propia del esófago (44), que junto con los eosinófilos constituyen las principales fuentes de factor de 15 crecimiento tisular (TGF-B), citoquina más ampliamente relacionada con la remodelación fibrosa y que contribuye al aumento en la contractilidad de las fibras musculares lisas. Diversos investigadores han demostrado un aumento de remodelación fibrosa por depósito de colágeno subepitelial en niños y adultos con EoE con sobreexpresión de TGF-B, FGF-9, IL5 y la quimiocina CCL28 (89,90). La remodelación en los tejidos implica el desarrollo de cambios morfológicos y funcionales en el músculo liso (91), como a hipertrofia de la muscularis mucosae y de las capas longitudinal y circular de la muscular propia descritas en niños y adultos con EoE (92,93). También han sido descritas en pacientes con EoE la infiltración eosinofílica de la submucosa y del plexo mientérico neuronal (88), con una remodelación esofágica profunda con fibrosis irreversible es la principal complicación en la EoE. El tejido esofágico de pacientes con EoE muestra también niveles aumentados de diversos factores angiogénicos en comparación con los sujetos controles sanos, incluyendo CD31, factor de von Willebrand, factor vascular de crecimiento epitelial (VEGF-A) y molécula de adhesión celular vascular tipo 1 (ICAM-1) (88). Estas proteínas promueven la neo-vascularización, la remodelación angiogénica y el aumento de la permeabilidad vascular facilitando la llegada desde la médula ósea de células inflamatorias hacia el esófago, que se activan al liberar sus proteínas granulares a nivel local (74). Por tanto, la fisiopatología de la EoE es compleja, ya que están involucradas diversas vías, con muchas células inmunitarias y citocinas que contribuyen al desarrollo de esta enfermedad (59). 16 Como resumen de la fisiopatología de la EoE, podríamos decir que una agresión externa al epitelio esofágico induce la liberación de TSLP/IL33 por las células epiteliales esofágicas, lo que conduce a la estimulación de células Th2, células NK, mastocitos, basófilos e ILC2. La activación de estas células produce la liberación de IL4, qué a su vez, induce la diferenciación Th2 de las células y modula la función de las células dendríticas hacia una respuesta de tipo Th2. La IL4 y la IL13 inducidas por las células Th2 inducen la eotaxina-3 (CCL26), principal reclutador de eosinófilos en el esófago y que estimula a los eosinófilos para que secreten IL5. La IL5, secretada por las células Th2 y los mastocitos, participa en la proliferación, diferenciación, maduración y liberación de eosinófilos y mastocitos. Los mastocitos también inducen TGF-β1 que estimula los eosinófilos y los fibroblastos. IL13 induce la expresión de periostina (POSTN), y la expresión de calpaína 14 (CAPN14) responsables de la producción de STAT6 e IL33 que es responsable, en definitiva, de las principales alteraciones de la función de la barrera epitelial (disminuye la expresión local de desmogleína 1 (DSG1), filagrina (FLG) y el complejo de diferenciación epidérmica). Así mismo, induce la remodelación y fibrosis de los tejidos. 17 Figura 1. Fisiopatología EoE. Respuesta inflamatoria epitelial. IL-33 (interleucina-33), TSLP (linfopoetina tímica estromal), Treg (células T reguladoras), TGF-β (factor de crecimiento tisular), DSG1 (desmogleina 1). 18 1.3. Componentes genéticos en la esofagitis eosinofílica. 1.3.1 Variaciones genéticas en enfermedades complejas Las variantes genéticas pueden estar implicadas en la patogénesis de enfermedades complejas, como la EoE. Las manifestaciones clínicas de la EoE y la respuesta al tratamiento varían de unos individuos a otros y esta variación está determinada, al menos en parte, por factores genéticos. La secuenciación del genoma humano ha permitido la caracterización e identificación de cientos de miles variantes genéticas. La mayoría de estas variantes genéticas están presentes en el 1% de la población y son consideradas variantes polimórficas (94). Entre los diferentes tipos de polimorfismos genéticos, los más frecuentes son cambios de una sola base (SNP, single nucleotide polymorphism). Este tipo de polimorfismo representa hasta el 90% de todas las variaciones del genoma, encontrándose un SNP aproximadamente cada 1.300 pb. Los SNPs que se encuentran próximos en el genoma muestran desequilibrio de ligamiento, es decir, tienden a heredarse juntos formando los denominados bloques de ligamiento (95, 96). La combinación de los SNPs que componen estos bloques es lo que se conoce como haplotipos. Para la identificación de un haplotipo no es necesario el genotipado de todas las variantes que lo integran, sino de un conjunto informativo de las mismas. A los SNPs informativos que caracterizan un haplotipo determinado se les denomina tag SNPs (tSNPs) (97). El Proyecto Internacional HapMap se diseñó con el objetivo de identificar toda la información relativa a los bloques de ligamiento existentes a lo largo del genoma en diferentes poblaciones y estudiar la frecuencia de los tSNPs, e integrarla en una base de datos de dominio público (The International HapMap Consortium, 2005). 19 Los SNPs pueden estar localizados en la región codificante, en la región reguladora del gen o en la región intergénica y pueden inducir cambios en la proteína, en el patrón de expresión del gen o no tener ningún efecto en el gen. Así, variaciones en la región 5´UTR, pueden alterar los niveles de expresión, ya que es sitio de unión de factores de transcripción, pueden afectar al “splicing” del ARNm, mientras que las variantes localizadas en la región 3´UTR pueden afectar al transporte, estabilidad y vida media del ARNm. Las variaciones que se localizan en un exón pueden generar un cambio sinónimo, si el nuevo codón codifica el mismo aminoácido, o no sinónimo, si el nuevo codón codifica un aminoácido diferente, lo que alteraría la secuencia de la proteína y podría tener consecuencias en su función biológica. También puede generar la aparición de un codón prematuro de parada de la traducción y dar lugar a la síntesis de proteínas truncadas (94). Existen diferentes estrategias para investigar las asociaciones entre variantes genéticas y enfermedad. Una de las estrategias más usadas es el estudio caso-control que se basan en la comparación de un grupo de individuos que presenta una determinada característica (grupo de casos) con otro sin dicha característica (grupo de controles). Este diseño experimental es uno de los más utilizados para evaluar la asociación entre genes y enfermedades. Hay diversos tipos de estudios de asociación genética que se pueden resumir en dos: los estudios con hipótesis “a priori” y los estudios libres de hipótesis. En los estudios con hipótesis “a priori” se seleccionan genes “candidatos” entre aquellos que pueden estar directa o indirectamente relacionados con la patología; mientras que en los estudios sin hipótesis a priori se realiza un estudio sistemático de parte o de todo el genoma (94, 98). En los últimos años 20 el desarrollo tecnológico nos ha permitido disponer de herramientas para realizar estudios de genotipado masivo. En el año 2007 surgen los denominados “Genome Wide Association Studies” (GWAS) (99), que son estudios de casos y controles donde se realiza un escrutinio sistemático de los polimorfismos de todo el genoma, es decir son estudios libres de hipótesis. En estos estudios se necesita un gran número de casos y controles para alcanzar un poder estadístico, ya que el elevado número de variantes estudiadas determina que el punto de corte de la significación estadística se establezca en un valor de p=10-8 para evitar los errores estadísticos tipo I (falsos positivos)(99). Independientemente del diseño y la estrategia utilizada, la asociación de cada polimorfismo con la enfermedad se determina comparando la distribución de los alelos en el grupo de casos y controles (modelo alélico). Aunque hay que tener en cuenta que existen diferentes modelos de herencia, así tenemos el modelo dominante según el cual, una única copia de la variante de riesgo es suficiente, es decir, el riego de los portadores de 2 copias es igual al de los portadores de 1 copia; el modelo recesivo que supone que son necesarias 2 copias de la variante de riesgo y, por tanto, el riesgo de los portadores de 1 copia es igual al de los individuos que tienen 0 copias; el modelo aditivo, según el cual cada copia de la variante de riesgo tiene una influencia sumatoria, es decir, el riego de los individuos con 2 copias es el doble del riesgo de los individuos que tienen 1 copia, pero estos también tienen riesgo con respecto a los individuos con 0 copias (94,100) Otra cuestión es la necesidad de replicación de las asociaciones encontradas en los estudios genéticos. Los estudios genéticos requieren de estudios de replicación en diferentes poblaciones para asegurar su fiabilidad, 21 es decir, que se trata de una verdadera asociación (que no se ha encontrado por problemas relacionados con el diseño del estudio), y para determinar si la asociación se encuentra en distintas poblaciones (99). Paralelamente, son necesarios estudios funcionales para investigar los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la asociación con enfermedad. 1.3.2 Genética de la EoE La asociación familiar en la EoE ha sido ampliamente estudiada y descrita en la literatura científica, existiendo una asociación principalmente entre hermanos, aunque también se ha descrito para otros grados de parentesco, lo que sin duda apoya una base genética de la enfermedad (101). En los estudios de asociación familiar realizados, la frecuencia de EoE se encuentra elevada entre los familiares de primer grado (102). Los análisis de la concordancia en gemelos han proporcionado también información importante sobre la base genética de la EoE (103). El riesgo de desarrollar enfermedad en las familias de los pacientes con EoE es de un 41% en los gemelos homocigotos, un 22% en los gemelos dicigóticos, y 2,4% en los hermanos versus el 0,055% obtenido en la población general. El alto riesgo de EoE en familiares de pacientes afectos sugiere la hipótesis de la predisposición genética, pero la variabilidad en gemelos dicigóticos apoya la existencia de variables ambientales modificadoras (17,18,104,105). La epigenética es el proceso por el cual el fenotipo de un sujeto se altera mediante metilación e hidroximetilación, expresión de ARN no codificantes (ARNnc) y modificaciones postraduccionales (PTM) de proteínas histonas sin que se realicen cambios en la secuencia de nucleótidos del ADN. 28 CAPN14 (2p23) se encuentra en un “hotspot” epigenético modificado por IL13. La IL13 induce la acetilación de la histona 3 lisina 27 (H3K27) en el promotor CAPN14, y el haplotipo de riesgo asociado a la enfermedad promueve la unión de proteínas nucleares expresadas por las células epiteliales del esófago. CAPN14 produce una disminución de la expresión de DSG1, lo que contribuye junto con otras alteraciones al deterioro de la función de la barrera epitelial esofágica (111,120). STAT6 (12q13) también se ha demostrado que se asocia independientemente con EoE, se activa por IL4 e IL13, y codifica un factor de transcripción que activa muchos genes identificados dentro de EoE (59,111, 123). El papel de LRCC32 (11q13) (proteína de unión y señalización de TGF-B) en EoE aún se está investigando, se asocia de forma independiente con EoE y está altamente expresado por las células reguladoras T FOXP3 + y juega un papel en la expresión de éste en la superficie de TGF-B (124). Es de destacar que c11orf30 (también vinculado a EMSY) y ANKRD27 se asocian independientemente con EoE; sin embargo, aunque están vinculados al crecimiento de tejidos y la cicatrización de heridas, respectivamente, su papel en la patogénesis de EoE aún no se ha establecido (111,124). Algunos de los genes asociados con EoE contribuyen a la patogénesis de otras enfermedades atópicas como la dermatitis atópica (c11orf30, FLG) (125), el asma (TSLP, c11orf30, CCL26)(126), la sensibilización alérgica (TSLP, c11orf30, STAT6) (127), la rinitis alérgica (TSLP, c11orf30) (128) y los niveles de IgE sérica total (STAT6) (127). 29 1.3.3.3 Estudios de interacciones de genes en EoE: Martin et al. (129) describieron la primera interacción gen-gen en EoE al demostrar que la asociación entre EoE y TSLP se fortalecía cuando estaba acompañada por una variante en la IL4, lo que indica que esta interacción puede actuar como un circuito de retroalimentación positiva para aumentar la inflamación alérgica dentro de EoE. Cuando los individuos portaban variantes de riesgo genético de EoE en los loci TSLP e IL4, el riego de EoE aumentaba a 3,7, en comparación con 1,3 y 1,6 cuando las variantes de riesgo genético de EoE en TSLP o IL4 se estudiaban de forma aislada, respectivamente. Cómo el locus de IL4 se ha asociado, en otros estudios, con un mayor riesgo de desarrollar múltiples enfermedades alérgicas, se especuló que un fenotipo atópico subyacente podría estar magnificando los efectos del TSLP. Asimismo, Azouz et al (130) buscaron interacciones entre las variantes de riesgo genético de EoE en TSLP y aquellas cercanas a otros genes relacionados con la atopia, identificando una nueva interacción entre variantes genéticas de TSLP y PLAU. Tener ambas variantes de riesgo resultaba en una probabilidad de 2,7 para EoE, en comparación con 1,6 para las variantes de TSLP en ausencia de variantes de PLAU, y 1,3 para las variantes de PLAU en ausencia de variantes de TSLP. Sin embargo, es importante señalar que el contexto que puede modificar la fuerza de la asociación probablemente no sea estrictamente genético, ya que es probable que los factores ambientales también sean críticos para la asociación de enfermedades de muchos loci de riesgo genético. El mayor riesgo de desarrollar EoE asociado con algunos loci genéticos podría cambiar en función de factores ambientales específicos. En este sentido, 30 Jensen et al. (104), exploraron si los efectos de las variantes genéticas identificadas por los estudios de GWAs asociadas con EoE estaban condicionadas por factores existentes en una primera etapa de la vida. Si bien el tamaño de la muestra en este estudio fue pequeño, se identificó una interacción entre las variantes en CAPN14 y la lactancia materna; el alelo menor de la variante de riesgo genético CAPN14 aumentó el riesgo de desarrollar EoE (OR=5,4) cuando el niño no había recibido lactancia materna en comparación con un menor riesgo asociado con esa variante cuando el niño había realizado lactancia materna (OR=0,43). 1.4. EoE y enfermedades alérgicas Aunque no es posible identificar un alérgeno específico en todos los pacientes, en general se piensa que la exposición a alérgenos es una característica central de la patogénesis de la EoE. Los estudios de cohortes de los principales centros de referencia han revelado que los alimentos más comúnmente asociados a EoE son la leche, el huevo, la soja y el trigo, qué a su vez, coinciden con los alimentos más comúnmente implicados en la alergia alimentaria mediada por IgE (AA-IgE). Al igual que la AA-IgE, el objetivo principal del tratamiento de la EoE es identificar y evitar el alimento causante, siempre que sea posible (131,132). Se han establecido asociaciones epidemiológicas significativas entre la EoE y algunas enfermedades alérgicas (133). La dermatitis atópica (DA) (134, 135), la AA-IgE, el asma (134-136), la rinitis alérgica (RA) (134,135,137) y el síndrome polen-alimentos de origen vegetal (138, 139) son comorbilidades comunes en los pacientes con EoE. Los pacientes con DA, AA-IgE, asma o RA 31 tienen un mayor riesgo de ser diagnosticados de EoE en el futuro (140). Los pacientes con AA-IgE desarrollan EoE casi nueve veces más que la población general (141). Además, la relación de riesgo entre la EoE y la RA parece ser bidireccional, ya que cada afección supone un riesgo para el posterior diagnóstico de la otra (140). Esta última observación es coherente con los datos que sugieren que los síntomas de la EoE pueden ser desencadenados también por alérgenos ambientales específicos (26,142,143). Un metaanálisis ha demostrado la carga atópica en pacientes con EoE, mostrando probabilidades significativamente mayores de padecer DA (OR 2,85, IC del 95%, 1,87-4,34), asma (OR 3,01, IC del 95% 1,96-4,62) y RA (OR 5,09, IC del 95% 2,91-8,90) en aquellos pacientes con EoE en comparación con los individuos sanos (135). También se llevó a cabo un amplio análisis en el que se evaluó a los niños con y sin EoE en una población de la red de atención primaria pediátrica (144). En este estudio, se observó que las tasas de enfermedades atópicas eran significativamente mayores en los sujetos con EoE en comparación con los niños sanos, e incluían RA (60% de EoE frente a 17% sin EoE; OR 7,1, IC 95% 5,8-8,6), asma (60% de EoE frente a 21% sin EoE; OR 5,2, IC 95% 4,3-6,3) y DA (18% de EoE frente a 7% sin EoE; OR 3,1, IC 95% 2,4-4,0). Por último, en una evaluación multicéntrica de pacientes con EoE del Consorcio para la Investigación de Alergias Alimentarias, se observó una enfermedad alérgica concomitante en el 91% de la población del estudio (145). 32 Tabla 4. Resumen de la frecuencia (y odds ratio) de las enfermedades alérgicas en pacientes con esofagitis eosinofílica entre 2015-2019. Nº pacient es Població n Rinitis alérgica Asma Dermatitis atópica AA-IgE Autor/Año [Ref] 81 Adultos 62% 27% 6% 43% Dellon et al. 2015 [ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"45] 23 niños 57% 57% 30% 30% Leung et al. 2015[ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"46] 4.423 Ambos - OR: 4.0 OR: 3.0 - Peterson et al. 2015[ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"47] 4.009 Ambos - OR: 3.95 - - Duffeyet et al. 2016 [ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"48] 53.542 a Ambos OR: 5.09 OR: 3.01 OR: 2.85 - González-Cervera et al. 2017[ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"21] 1.795 Niños - - - 68% Hill et al. 2017[ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"28] 428 Niños 60% OR 7.1 60% OR: 5.2 18% OR: 3.1 - Capucilli et al. 2018[ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"49] 705 Ambos 60% 45% 46% 67%, 27% b Chehade et al. 2018 [HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"50] 950 Adultos 70% 36% 14% 24% Leigh et al. 2019 [ HYPERLINK "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/p mc/articles/PMC6626558/"51] a Datos obtenidos de metaanálisis b Datos relacionados con anafilaxia inducida por alimentos 33 La prevalencia global de enfermedades alérgicas específicas en la EoE se representa en la figura 2. Figura 2. EoE y comorbilidades alérgicas. Dadas las asociaciones clínicas entre la EoE y las demás manifestaciones alérgicas, la EoE podría considerarse por algunos autores como parte de la marcha alérgica (o atópica) (140,146). La marcha alérgica se refiere a la historia natural de las manifestaciones de la enfermedad alérgica y a la progresión temporal de estas enfermedades a lo largo de la infancia y la vida adulta (147). La edad máxima de diagnóstico de la EoE es de aproximadamente 3 años después de la aparición de la DA, la AA-IgE y el asma (aunque la incidencia real de la EoE puede ser anterior dados los obstáculos conocidos para el diagnóstico) (146). Posteriormente, en un análisis 34 de más de 130.000 niños de una gran cohorte de atención primaria, se observó que la presencia de DA, AA-IgE, asma y RA se asociaba de forma independiente y acumulativa con el posterior diagnóstico de EoE (140). A pesar de estas observaciones, hay que tener en cuenta que existen diversos grados de presentación de la EoE, y que no siempre se identifica un desencadenante alérgico. Este hecho habla de la complejidad del proceso de esta enfermedad y de la posible existencia de múltiples endotipos de la enfermedad con distintos grados de fisiopatología alérgica (148). 35 Hipótesis, Objetivos y diseño experimental 36 37 Hipótesis de trabajo. La EoE es una enfermedad inflamatoria crónica que parece deberse a una alteración de la regulación de la respuesta inmune del huésped frente a la microbiota y a otros antígenos intraluminales (especialmente alergenos alimentarios) en sujetos susceptibles genéticamente, produciéndose alteraciones en la función y regulación del sistema inmune innato y adaptativo, así como una disfunción de la barrera epitelial que daría lugar al proceso inflamatorio y posterior remodelado de este epitelio esofágico. La hipótesis de este proyecto de investigación es que determinadas variantes de los genes TSLP, TLR3. TLR4, FOXP3 y FLG pueden influir en la susceptibilidad a padecer EoE y repercutir en los distintos fenotipos (modos de expresión clínica) de esta enfermedad. Objetivos: 1. Evaluar la asociación de variantes en los genes TSLP, TLR3, TLR4, FOXP3 y FLG con la susceptibilidad a desarrollar EoE en la población española. 2. Evaluar la asociación de las variantes de los genes TSLP, TLR3, TLR4, FOXP3 y FLG con las comorbilidades alérgicas asociadas a la EoE. 44 Consideraciones éticas del estudio El diseño del estudio fue presentado y aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Clínica del HUVR, el 9 de abril de 2012 con el código de registro 2012PI/079 (anexo I). Todos los individuos seleccionados fueron informados del carácter del estudio por el médico responsable y dieron su consentimiento por escrito a la participación en el mismo (anexo II). El protocolo de estudio se ajusta a las pautas de ética de la Declaración de Helsinki de 1975 (150). Recogida y registro de la información La recogida de la información se realizó de forma estandarizada utilizando una “hoja de recogida de datos” diseñada específicamente para el estudio. A cada paciente se le asignó, según su centro de procedencia, un código formado por el número del hospital (2 dígitos) seguido de otros 3 dígitos que identificaban al paciente (ej. 01- 001). Las principales variables recogidas en el estudio fueron las siguientes: a) Variables demográficas y clínicas. Edad, sexo, fecha de nacimiento, antecedentes patológicos personales e historia detallada sobre la existencia de enfermedad alérgica respiratoria (rinitis y/o asma bronquial) y alergia a alimentos de origen animal o vegetal. 45 b) Variables relacionadas con los hallazgos del prick-test a aeroalérgenos y trofoalérgenos. Se realizaron pruebas de punción intraepidérmica en la superficie flexora del antebrazo colocando una pequeña cantidad del extracto alergénico (una gota) sobre las que se efectuó una leve punción con una lanceta de punta corta tipo Morrow-Brown. Se utilizó un panel de 17 aeroalérgenos (ácaros del polvo doméstico, epitelios de mamíferos, hongos y pólenes) y 22 alimentos de origen animal y vegetal (leche, huevo, marisco, frutos secos, leguminosas y harinas de cereales) (anexo III). Las pruebas se consideraron positivas si el diámetro de la pápula fue mayor o igual a 3 mm del obtenido con el control negativo. Como control negativo se utilizó suero salino y como control positivo una solución de 10 mg/ml de hidrocloruro de histamina. La sensibilización a los aeroalérgenos y/o trofoalérgenos se consideró una variable dicotómica y los pacientes con EoE se clasificaron como “fenotipo atópico” o “fenotipo no atópico” según el resultado de la prueba (positividad o negatividad, respectivamente). c) Variables genéticas (tSNP). Se registró el genotipado de cada uno de los tSNP de los genes estudiados. 2. Métodos Obtención del ADN de pacientes y controles Como material de partida, se utilizó sangre periférica obtenida por venopunción y recogida directamente en tubos estériles con EDTA, o ACD como anticoagulante y congelada a -20°C. El ADN fue extraído a partir de células totales con el kit comercial “QIAamp DNA Mini Kit” (Qiagen®) siguiendo 46 las instrucciones del fabricante. La cantidad y calidad del ADN se determinó espectrofotométricamente con un NanoDrop2000 (Thermo Scientific, USA). Se consideró aceptable en calidad, las muestras de ADN con ratio de absorbancia 260/280 próximo a 1,8 y la concentración se ajustó a 15 ng/μl. El ADN obtenido se conservó a -20 °C hasta su utilización. Selección de los “Tag SNPs” Utilizamos la base de datos del proyecto HapMap (relase 28, fase II+III, NCBI build 36 assemble, dbSNP b126, http:www.hapmap.org/index.htlm.en) para seleccionar los Tag SNPs (tSNPs) con frecuencia del alelo minoritario (MAF) igual o superior al 0,05 en población CEU, que nos permitieran capturar en cada una de las regiones el 100% de los SNPs con r2>0,8. En las siguientes figuras se muestran los SNPs incluidos en el proyecto HapMap y los SNPs con una MAF≥0,05 El código de colores mostrado en estas figuras es el siguiente: blanco (r2=0), gris (0< r2<1) y negro (r2=1). Los polimorfismos subrayados son los que se seleccionaron como tSNPs para el estudio de asociación, los otros SNPs están en desequilibrio de ligamiento (r2>0,8) y por tanto pueden excluirse (ver tablas). Los haplotipos se construyeron por combinación de los diferentes tSNPs de cada uno de los genes en los sujetos controles mediante el programa Haploview (versión 4.1), disponible en: www.broad.mit.edu/mpg/haploview/ download.php. La asignación de los haplotipos en pacientes y controles se realizó con el programa FamHamp disponible en http://iweb.meb.unibonn.de/famhap/. 47 Gen TSLP Figura 3. Gen TSLP. En esta figura se muestran todos los SNP incluidos en el proyecto HapMap en la población CEU del gen TSLP. El código de colores es el siguiente: blanco (r2=0), gris (0< r2<1) y negro (r2=1). 48 Figura 4: Gen TSLP: En esta figura se muestran los SNPs con una frecuencia del alelo minoritario, MAF ≥0,05 del gen TSLP. Los SNP subrayados son los seleccionados para el estudio. Tabla 5. SNPs del gen TSLP en desequilibrio de ligamiento con los tSNPs seleccionados. tSNPs SNPs con r2 = 1 rs2289276 rs11466741 rs10062929 rs11466750 49 Gen TLR-3 Figura 5. Gen TLR3: SNPs incluidos en el proyecto HapMap en la población CEU. El código de colores es el siguiente: blanco (r2=0), gris (0< r2<1) y negro (r2=1). Figura 6. Gen TLR3: SNPs con una frecuencia del alelo minoritario, MAF ≥0,05. Los SNP subrayados son los seleccionados para el estudio. 50 Tabla 6. SNPs de TLR3 en desequilibrio de ligamiento con los tSNPs seleccionados. tSNPs SNPs con r2 = 1 rs5743303 rs5743312, rs3775296 rs11721827 rs11730143, rs11732384 rs7657186 rs13108688 rs13126816 rs6552950 Gen TLR4 Figura 7. Gen TLR4. SNPs incluidos en el proyecto HapMap en la población CEU. El código de colores es el siguiente: blanco (r2=0), gris (0< r2<1) y negro (r2=1). 51 Figura 8. Gen TLR4: SNPs con una frecuencia del alelo minoritario, MAF ≥0,05. Los SNP subrayados son los seleccionados para el estudio. Tabla 7. SNPs de TLR4 en desequilibrio de ligamiento con los tSNPs seleccionados. tSNPs SNPs con r2 = 1 rs1927914 rs2149356, rs1927911 rs10759932 rs1927907, rs5030717 rs5030728 rs2770146 52 Gen FLG Figura 9. Gen FLG: SNPs incluidos en el proyecto HapMap en la población CEU. El código de colores es el siguiente: blanco (r2=0), gris (0< r2<1) y negro (r2=1). Figura 10. Gen FLG. SNPs con una frecuencia del alelo minoritario, MAF ≥0,05. Los SNP subrayados son los seleccionados para el estudio. 53 Tabla 8. SNPs en desequilibrio de ligamiento con los tSNPs seleccionados. tSNPs SNPs con r2 = 1 rs2065956 rs7522925, rs12407748 rs11204981 rs2184953, rs3126066, rs11584340, rs3120659, rs11204980, rs6587666 rs11586114 rs11204978, rs2065955 Gen FOXP3 Figura 11. Gen FOXP3. SNP incluidos en el proyecto HapMap en la población CEU. El código de colores es el siguiente: blanco (r2=0), gris (0< r2<1) y negro (r2=1). 60 61 Resultados 62 63 Resultados 1.- Características demográficas y fenotipado clínico de los pacientes con EoE. Se incluyeron 218 pacientes con EoE en el estudio, 170 hombres y 48 mujeres, con una edad media en el momento del diagnóstico de 35,4 años. El 41% padecían como comorbilidad atópica principal una rinoconjuntivitis (RC), el 42% RC y asma bronquial y el 1% de los pacientes asociaban otras comorbilidades (urticaria, dermatitis atópica, etc). Ciento ochenta y cinco pacientes (84,86 %) eran atópicos. Cincuenta y uno tenían test cutáneos positivos sólo frente a aeroalérgenos y 21 pacientes tenían una sensibilización exclusiva a alimentos de origen animal y/o vegetal. Los 113 pacientes restantes presentaban una sensibilización simultánea a inhalantes y alimentos. Treinta y tres pacientes (15,14 %) fueron no atópicos. Figura 15. Distribución de los fenotipos clínicos. 15% 23% 10% 52% No atópicos Atopicos Inhalantes Alimentos Inh + Alimentos 64 2.- Análisis de asociación de las variantes genéticas de los Loci TLR3, TLR4, TSLP, FOXP3, y FLG con EoE. El genotipado de todos los tSNPs incluidos en el estudio se realizó con un éxito del 98% en pacientes y controles. Las frecuencias genotípicas de todos los tSNPs estudiados estaban en Equilibrio de Hardy-Weinberg (p > 0,05) en la población control, lo que indicaba que el tamaño de muestra era adecuado y no había habido errores en las técnicas de genotipado. Gen TSLP En la tabla 11 se muestran las frecuencias en pacientes y controles del alelo minoritario de los tSNPs estudiados en el gen TSLP. Con la excepción del rs2289278, existen diferencias estadísticamente significativas entre pacientes y controles (pc<0,05), destacando rs10062929 y rs2289277 con una pc<0,0001. La frecuencia de los alelos minoritarios, excepto rs1898671, es mayor en los controles que en los pacientes, por lo que serían factores de protección (OR<1), es decir, los individuos con estos alelos tendrían menos probabilidad de padecer la enfermedad. Por el contrario, el alelo minoritario del rs1898671 sería un factor de riesgo (OR>1). 65 Tabla 11. Frecuencias de los tSNPs estudiados del gen TSLP en pacientes EoE y controles. tSNP MA Controles Pacientes p-valor pc-valor OR (95% IC) rs2289276 T 0,309 0,233 0,007 0,043 0,68 (0,51-0,90) rs1898671 T 0,389 0,484 0,002 0,011 1,48 (1,15-1,90) rs10062929 A 0,123 0,036 6,18x10-6 <1x10-4 0,26 (0,14-0,49) rs2289277 G 0,431 0,298 1,73x10-5 <1x10-4 0,56 (0,43-0,73) rs2289278 G 0,046 0,045 ns ns rs11466749 G 0,135 0,071 0,002 0,009 0,49 (0,31-0,77) MA: Alelo minoritario; pc: test de 10.000 permutaciones; ns = no significativo p>0,05. OR: odds ratio. IC: intervalo de confianza Posteriormente se realizó un análisis de haplotipos con todos los tSNPs estudiados utilizando el programa Haploview. Los haplotipos con frecuencia mayor de 0,05 se muestran en la tabla 12. Se puede observar que los haplotipos 1 y 3 son de riesgo (OR>1), mientras que los haplotipos 2 y 4 son de protección (OR<1). También se puede ver que el rs2289277 es el SNP que marca la susceptibilidad para EoE, ya que los haplotipos de riesgo presentan el alelo C, mientras que los haplotipos de protección presentan el alelo G. El resto de SNPs están asociados por desequilibrio de ligamiento, así, en el caso del alelo A del rs10062929 y el alelo G del rs11466749, siempre van asociados al alelo G del rs2289277. Por tanto, el estudio de rs2289277 nos indicaría si un individuo presenta susceptibilidad para EoE. 66 Tabla 12. Frecuencias de los haplotipos en pacientes EoE y controles sanos construidos con la combinación de todos los SNPs estudiados con frecuencia >0,05. OR: odds ratio. IC: intervalo de confianza Haplotipos Controles Pacientes p-valor OR (IC 95%) r s 2 2 8 9 2 7 6 r s 1 8 9 8 6 7 1 r s 1 0 0 6 2 9 2 9 r s 2 2 8 9 2 7 7 r s 2 2 8 9 2 7 8 r s 1 1 4 6 6 7 4 9 1 C T C C C A 0,39 0,48 0,0028 1,47 (1,14-1,89) 2 T C C G C A 0,29 0,22 0,0113 0,69 (0,51-0,92) 3 C C C C C A 0,13 0,17 0,0386 1,45 (1,03-2,05) 4 C C A G C G 0,12 0,06 0,0034 0,50 (0,31-0,81) Seguidamente, estudiamos el modelo de herencia de los dos SNP con pc<0,000, rs10062929 y rs2289277, y para ello calculamos las frecuencias genotípicas (tabla 13). El rs10062929 sigue un modelo de herencia dominante, basta con tener un único alelo A para actuar como factor de protección. Por el contrario, el rs2289277 sigue un modelo de herencia recesivo, sólo los individuos homocigotos para el alelo G tienen factor de protección. Relacionando estos resultados con los de los haplotipos, podríamos concluir que aquellos individuos que tengan una copia del haplotipo 4 tendrían menor 67 riesgo de padecer la enfermedad, mientras que con respecto al haplotipo 2, sería necesario ser homocigotos para tener menor riesgo. Tabla 13. Frecuencias genotípicas de los rs10062929 y rs2289277 en pacientes EoE y controles. SNP Genotipos Controles Pacientes p-valor OR (IC 95%) rs10062929 CC 0,771 0,934 CA+AA 0,229 0,066 4,24x10-6 0,23 (0,11-0,46) rs2289277 CC+CG 0,807 0,940 GG 0,193 0,060 3,27x10-5 0,26 (0,13-0,51) Gen TLR3 En la tabla 14 se muestran las frecuencias del alelo minoritario de los tSNPs estudiados en el gen TLR3. Existen diferencias estadísticamente significativas entre pacientes y controles (p<0,05), en los polimorfismos rs5743305 y rs3775292, pero después de calcular la pc, únicamente el rs3775292 seguía asociado estadísticamente (pc<0,05). La frecuencia de los alelos minoritarios en ambos era mayor en los controles que en los pacientes, por lo que serían factores de protección (OR<1), es decir, los individuos con estos alelos tendrían menos probabilidad de padecer la enfermedad. 68 Tabla 14. Frecuencias de los SNPs estudiados del gen TLR3 en pacientes EoE y controles. tSNP MA Controls Patients p pc OR (95% CI) rs5743303 T 0.192 0.210 0.5072 ns rs5743305 A 0.415 0.344 0.0172 0.0584 rs11721827 C 0.082 0.077 0.7728 ns rs7657186 A 0.251 0.194 0.0247 ns rs13126816 A 0.246 0.305 0.0298 ns rs7668666 A 0.276 0.273 0.9166 ns rs3775292 C 0.271 0.196 0.0039 0.0288 0.65 (0.49-0.87) rs3775291 T 0.309 0.334 0.3732 ns MA: Alelo minoritario; pc: test de 10.000 permutaciones; ns = no significativo p>0,05 OR: odds ratio. IC: intervalo de confianza Posteriormente se realizó el análisis de haplotipos y en la tabla 15 se muestran los haplotipos con frecuencia mayor de 0,05. Se puede observar que el haplotipo 2 es el único asociado estadísticamente con la enfermedad, y dado que la OR obtenida es <1 (OR=0,64 IC 95% = 0,45-0,89) sería un factor de protección de la enfermedad. Este haplotipo es el único portador del alelo C del rs3775292, que confirmaría la asociación de éste tSNP con la enfermedad. 69 Tabla 15. Frecuencias de los haplotipos en pacientes EoE y controles sanos construidos con la combinación de todos los SNPs estudiados. Haplotipos Controles Pacientes p-valor OR (IC 95%) rs 574 330 3 rs 57 433 05 rs 11 72 18 27 rs 765 718 6 rs 13 126 816 rs 766 866 6 rs 377 529 2 rs 377 529 1 1 A T A G A C G T 0,194 0,211 2 A A A A G C C C 0,183 0,126 0,0095 0,64 (0,45- 0,89) 3 T T A G G A G C 0,147 0,154 4 A T C G G C G C 0,072 0,076 5 A A A G G C G T 0,075 0,069 6 A A A G G A G C 0,057 0,057 7 A A A A G C G C 0,052 0,048 Estudiamos el modelo de herencia del rs3775292 y para ello calculamos las frecuencias genotípicas (tabla 16). El rs3775292 sigue un modelo de herencia dominante, basta con tener un único alelo C para actuar como factor de protección. Relacionando estos resultados con los de los haplotipos, podríamos concluir que aquellos individuos que sean heterocigotos para el haplotipo 2 tendrían menor riesgo de padecer la enfermedad. 76 4.- Estudio de interacción entre los genes de TSLP y TLR3 Para descartar si la asociación de los genes TSLP y TLR3 con la susceptibilidad a la EoE detectada en el análisis individual de cada gen, fuese debido a un posible sesgo atribuible al genotipo del otro gen, y estimar la fuerza de asociación de cada gen de una manera independiente, es decir eliminando la posibilidad de que un gen confunda el efecto del otro, se realizó una prueba de regresión logística entre los dos polimorfismos con la mayor significación estadística (rs10062929 del TSLP y rs3775292 del TLR3). En ambos polimorfismos, como hemos comentado con anterioridad, se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes y los controles en un modelo dominante (tablas 13 y 16 respectivamente). Por lo tanto, los pacientes y los controles portadores del alelo C (CG o CC) en rs3775292 se clasificaron como TLR3+. Del mismo modo, los individuos portadores del alelo A (AA o AC) en rs10062929 se clasificaron como TSLP+. Los individuos con 0 copias de ambos alelos SNPs (TLR3–/TSLP–) se utilizaron como grupo de referencia. En el estudio de regresión logística se observa una susceptibilidad menor a EoE estadísticamente significativa en individuos portadores de genotipo TLR3+/TSLP– y TLR3–/TSLP + en comparación con individuos portadores del genotipo TLR3–/TSLP– con OR=0,66 (p=0,036) y 0,23 (p=0,00014), respectivamente. Además, la susceptibilidad a la EoE se reduce sustancialmente entre individuos que portaban TLR3+ / TSLP + con un OR= 0,16 (p=0,0001) (Tabla 21). Estos resultados demuestran una asociación individual de cada gen la enfermedad. Para complementar los análisis de regresión logística, se utilizó el programa MDR para evaluar las interacciones gen-gen y analizar si la 77 interacción observada entre ambos genes, tenía un efecto epistático al encontrarse en la misma ruta biológica. En el análisis encontramos un valor de ganancia de interacción negativa (IG=–4.52%) (Tabla 22). Este valor negativo ocurrió porque el porcentaje de entropía eliminada por la interacción de TLR3 y TSLP fue 3.36% menos que la suma del porcentaje de entropía eliminada por cada gen (0.78% y 7.09%, respectivamente). Este resultado sugiere que la interacción de ambos genes tenía redundancia, es decir, que ambos genes se asociaban independientes con la EoE. Tabla 21 Frecuencias de combinaciones de rs3775292 (TLR3) y rs10062929 (TSLP) en pacientes con EoE y controles TLR3- / TSLPTLR3+ / TSLPTLR3- / TSLP+ TLR3+ / TSLP+ Pacientes (n=218) 127 (58.25%) 77 (35.33%) 9 (4.13%) 5 (2.29%) Controles (n=360) 145 (40.27%) 132 (36.65%) 46 (12.77%) 37 (10.27%) OR (95% CI) 1 0.66 (0.44-0.96) 0.23 (0.10-0.53) 0.16 (0.05-0.47) p <0.0001 0.036 0.00014 0.00010 OR, 95% IC y valor de p fueron calculados usando un test de regresión logística 78 Tabla 22. La ganancia de información estimada para cada locus individual y la combinación de ambos loci. Attributes Information gain by each locus Information gain by combination of both loci Interaction gain H(A) H(A|C) H(B) H(B|C) I(A;C) I(B;C) H(AB) H(AB|C) I(AB;C) IG(A;B;C) TLR3 1.2493 1.2414 0.0078 (0.78%) TSLP 0.9629 0.892 0.0709 (7.09%) TLR3 / TSLP 0.9987 0.9651 0.0336 (3.36%) -0.0452 (- 4.52%) H(A), H(B), H(AB): Entropy attributed to TLR3 and TSLP individually and the combination of both loci H(A|C), H(B|C), H(AB|C): Conditional entropy attributed to TLR3 and TSLP individually and the combination of both loci I(A;C)=H(A)-H(A|C): Information gain (percentage of entropy removed) by TLR3 attribute (main effect) I(B;C)=H(B)-H(B|C): Information gain (percentage of entropy removed) by TSLP attribute (main effect) I(AB;C)=H(AB)-H(AB|C): Information gain (percentage of entropy removed) by the combination of both attributes (interaction effect) IG(A;B;C)=I(A;C)+I(B;C)-I(AB;C): Interaction gain by the combination of both attributes 5.- Estudio de asociación entre los genes TSLP y TLR3 y el fenotipo atópico Finalmente, se investigaron las posibles asociaciones entre los genes TSLP y TLR3 y el fenotipo alérgico de los pacientes con EoE. En la tabla 24 se muestran las frecuencias alélicas de los tSNPs. No se encuentran diferencias estadísticamente significativas entre TSLP y la sensibilización a los alérgenos alimentarios o inhalantes. Sin embargo, se encontró que 2 tSNP en el gen 79 TRL3, rs11721827 y rs5743303, estaban asociados a sensibilización a los aeroalergenos y los alimentos, respectivamente. La frecuencia del alelo rs11721827C fue significativamente mayor entre los pacientes con EoE sensibilizados a aeroalergenos (9,4% vs. 1,1% en pacientes no sensibilizados, pc=0,025, OR=9,67). En contraste, la frecuencia del alelo rs5743303T fue más baja entre los pacientes con EoE que estaban sensibilizados a los alimentos (17,5 vs. 28,5%; pc=0,048; OR=0,53) (Tabla 23). Tabla 23. Frecuencias alélicas menores de los SNP estudiados en el gen TLR3 en pacientes con EoE TLR3 SNP AM Aeroalergenos p pc OR (95%CI) Alergia alimentaria p pc OR (95%CI) Negat ivo (n=54) Positiv o (n=164) Negat ivo (n=84) Positiv o (n=134) rs5743303 T 0.255 0.199 0.2521 ns 0.285 0.175 0.014 0.048 0.53 (0.32- 0.88) rs5743305 A 0.362 0.351 0.8575 ns 0.331 0.367 0.4906 ns rs11721827 C 0.011 0.094 0.0071 0.0255 9.67 (1.29- 72.28) 0.038 0.092 0.0603 ns rs7657186 A 0.196 0.204 0.8569 ns 0.190 0.208 0.6861 ns rs13126816 A 0.315 0.303 0.8297 ns 0.294 0.314 0.698 ns rs7668666 A 0.277 0.268 0.873 ns 0.308 0.250 0.2329 ns rs3775292 C 0.234 0.196 0.4262 ns 0.223 0.196 0.5358 ns rs3775291 T 0.394 0.326 0.2337 ns 0.346 0.342 0.9308 ns SNP: single-nucleotide polymorphism; MA: alelo minoritario; OR (95%CI): odds ratio con 95% de intervalo de confianza; ns: no significativo p>0.05. pc:test de 10.000 permutaciones 80 81 Discusión 82 83 Discusión En este estudio, hemos analizado la asociación de 5 genes relacionados con la inmunidad innata o la integridad de la mucosa esofágica con la susceptibilidad de desarrollar EoE. Hemos descrito por primera vez una asociación del gen TLR3 con susceptibilidad a padecer EoE y replicamos, también por primera vez, la asociación del gen TSLP con susceptibilidad a EoE en una población europea (153). La fisiopatología de la EoE se ha definido por una respuesta inmune Th2 inducida por ciertos trofoalérgenos, que en contacto con la mucosa esofágica, conducen a eosinofilia tisular y sistémica, inflamación de las mucosas, disfunción epitelial y fibrosis subepitelial a largo plazo (1). La disfunción de la barrera epitelial juega un papel fundamental en este proceso porque promueve la exposición continua a los alérgenos y a la microbiota en la luz esofágica, lo que estimula, a su vez, a las células epiteliales y leucocitos para liberar quimiocinas y citocinas (63,154,155). Así, la fisiopatología de la EoE no se define únicamente por la inflamación predominante de eosinófilos, sino también por una morfología y funciones anormales de la barrera epitelial (85). Como consecuencia del aumento de la permeabilidad del epitelio esofágico se perpetúa la enfermedad, al permitir que los alérgenos y microbios penetren a través de la barrera mucosa (59). El sistema inmune innato desempeña un importante papel en la regulación de las interacciones entre microbiota y la inmunidad del huésped. Cada vez son más los estudios que han demostrado que la EoE podría asociarse a cambios en la composición cuantitativa y cualitativa de la microbiota esofágica (14,108,156,157). Los TLRs representan uno de los 84 mecanismos de reconocimiento de la microbiota mejor estudiados y su papel en múltiples enfermedades inmunológicas y alérgicas es motivo de constante investigación (30,33,158). Los TLRs son una familia de receptores transmembrana y/o intracelulares responsables, entre otras funciones, del reconocimiento de patógenos implicados en la respuesta inflamatoria, y constituyen un nexo de unión entre el sistema inmune innato y el sistema inmune adaptativo. Las células de sistema inmunitario innato procesan además los antígenos y los presentan a los linfocitos. La activación y maduración de estas células presentadoras de antígenos y de las células T reguladoras dependen, en parte, de las vías de señalización mediadas por TLRs. Una de las vías de activación de los mastocitos depende también de la señalización mediada por TLRs. De esta forma, los TLRs podrían influir decisivamente en la homeostasis inmune de la mucosa esofágica y en la pérdida de la tolerancia que se produce en la EoE. Por lo tanto, las interacciones de la microbiota esofágica con los componentes del sistema inmune innato a través de los TLRs y sus vías de señalización y conexión con el sistema inmune adaptativo podrían desempeñar un papel relevante en la fisiopatología de la EoE. Son varios los estudios que han puesto de manifiesto una expresión elevada de TLR2 y TLR3 en las células epiteliales esofágicas comparando individuos con y sin EoE (25). Otros autores han demostrado que los pacientes con EoE activa tienen una sobreexpresión de TLR1, TLR2, TLR4 y TLR9 en las biopsias de la mucosa esofágica en comparación con los controles sanos, que vuelve a la normalidad después de la remisión inducida tras la retirada empírica de 6 alimentos (33). Este estudio, sin embargo, no muestra cambios en la expresión de TLR3 y TLR6. 85 La estimulación de TLR2 aumenta la expresión de proteínas implicadas en la integridad de la barrera epitelial (TJ, Claudina-1 y Zo- 1), TRL3 no se implica en esta vía, pero sin embargo, la estimulación de TLR3 se ha demostrado que activa el NF-κB, dando lugar a la secreción de IL8 y TSLP (24). Por lo tanto, aunque la estimulación de la vía TLR3 no afecte a la función de barrera en este estudio, esto no excluye la que la vía de TLR3 pueda activar otros mecanismos efectores innatos epiteliales adicionales que no hayan sido analizados. En este trabajo, hemos investigado la asociación de TLR3 y TLR4 con susceptibilidad a padecer EoE. Hemos demostrado que TLR3 está asociado con la susceptibilidad a EoE. Dos SNPs, rs5743305 y rs3775292, están asociado a EoE antes de corregir la “p”, sin embargo, después de la corrección el rs5743305 pierde la significación estadística, pc=0,058, aunque posiblemente aumentado el tamaño muestral (número de pacientes y controles) pueda llegar a la significación. Los alelos minoritarios del rs5743305(A) y rs3775292(C), son alelos de protección, es decir, los individuos con estos alelos tendrían menos probabilidad de sufrir la enfermedad. En el estudio de haplotipos se observa que sólo uno de los haplotipos mayoritarios es portador del alelo rs3775292(C), y el estudio de asociación nos muestra que la susceptibilidad está fuertemente influenciada por este haplotipo, lo que confirmaría la asociación del alelo rs3775292(C) con la enfermedad. El alelo rs3775292(C) sigue un modelo de herencia dominante, es decir basta con tener un único alelo C para actuar como factor de protección, por tanto, podríamos concluir que aquellos individuos que sean heterocigotos para este haplotipo tendrían menor riesgo de padecer la enfermedad. El rs3775292 está localizado en una región intrónica, 92 todos los SNPs en ambos géneros. Es decir, que la dirección del riesgo de enfermedad (OR) era similar en pacientes masculinos y femeninos. Probablemente aumentando el tamaño de la población en estudio, obtendríamos un resultado estadísticamente significativo. Como hallazgos más relevantes del estudio, hemos descrito un nuevo locus de susceptibilidad de EoE en el gen TLR3 y confirmamos los previamente descritos en el gen de TSLP. Para descartar si la asociación de los genes TSLP y TLR3 con la susceptibilidad a la EoE detectada en análisis individuales de cada gen, fuese debido a un posible sesgo atribuible al otro gen, y estimar la fuerza de asociación de cada gen de una manera independiente, realizamos una prueba de regresión logística. Nuestros resultados apoyan la asociación de forma independiente de TSLP y TLR3 con EoE. Hemos demostrado que cuando el modelo dominante de ambos polimorfismos de TRL3 y TSLP (llamados en nuestro estudio TLR3+ y TSLP+) están presentes, actúan de manera independiente como factor de protección frente a la enfermedad (OR=0,66 y 0,23 respectivamente). Por otra parte, observamos que cuando ambos polimorfismos están presentes en un individuo (TLR3+/TSLP+), el nivel de protección que confieren frente a la enfermedad aumenta de forma significativa. (OR=0,16). La interacción de varios genes con EoE ha sido previamente demostrada. Un estudio reciente investigó la relación entre atopia, EoE y riesgo genético [66]. En este estudio, se evaluaron 63 genes asociados con atopia y EoE, tanto en individuos atópicos como no atópicos. Los resultados sugirieron una interacción mecanicista gen-gen mediante la cual los genes relacionados con la atopía y los genes específicos de EoE (en particular los de IL4 y TSLP) 93 cooperan sinérgicamente para aumentar el riesgo de EoE. Es decir, la susceptibilidad genética del desarrollo de EoE está mediada por genes asociados con atopia común y genes específicos de EoE que, cuando están presentes juntos, actúan sinérgicamente para aumentar la susceptibilidad al desarrollo de enfermedades alérgicas. TSLP y TLR3 se encuentran en la misma línea biológica, TLR3 se ha reconocido como un regulador clave de expresión y función de TSLP (51). TLR3 reconoce ARN bicatenario, que se encuentra en algunos virus. La estimulación de las células epiteliales primarias del esófago con poli I: C (un mimético de dsRNA) induce la expresión de ARNm de TSLP. En esta línea estudiamos la posible interacción epistática entre los genes de TLR3 y TLSP utilizando el método MDR (Reducción de la Dimensionalidad Multifactorial) (151). Epistasis es una circunstancia en la que la expresión de un gen se ve afectada por la expresión de uno o más genes heredados de forma independiente. La epistasis se presenta entre genes que se encuentran en la misma ruta bioquímica o reguladora, como es el caso de TLR3 y TSLP. En este caso, hemos estudiados si la acción de TLR3, que se encuentra al inicio de la ruta, modifica la acción de TSLP. En nuestro estudio, el análisis de entropía de interacción no reveló epistasis estadística entre los genes TLR3 y TSLP (IG=–4,52%). Si bien la ausencia de epistasis estadística no implica necesariamente ausencia de epistasis biológica (genética), nuestros resultados sugieren un efecto no epistático entre ambos loci (TLSP y TLR3). Es decir, aunque ambos genes se encuentran en la misma ruta, las interacciones de ambos genes tienen redundancia o efectos independientes. 94 Las asociaciones clínicas y epidemiológicas entre la EoE y otras comorbilidades alérgicas están bien establecidas (133). Del 68 a 70% de los pacientes con EoE tienen asociadas comorbilidades atópicas, como la dermatitis atópica, alergia alimentaria mediada por IgE, asma y rinitis alérgica, cada una de estas manifestaciones alérgicas implica un riesgo individual y acumulativo para el diagnóstico posterior de EoE (135,140). La exposición a alérgenos es una característica central de la patogénesis de la EoE, aunque no se identifique un alérgeno específico en cada paciente. Este hecho viene apoyado por la remisión de la enfermedad tras realización de dietas elementales, por el empeoramiento estacional que se ha visto en algunos pacientes con EoE, y cuando no es posible identificar un alérgeno como responsable, la respuesta adecuada a los corticoides de forma tópica, al igual que en otras enfermedades alérgicas como la rinitis alérgica, el asma y la dermatitis atópica. La relación entre estas afecciones es probablemente el resultado de características genéticas, ambientales e inmunológicas compartidas, que pueden dar lugar a la existencia de distintos endotipos de esofagitis, aún por definir (figura 16). Por ejemplo, es probable que haya un subconjunto de pacientes con EoE que estén significativamente predispuestos a desarrollar EoE como resultado solamente de su genética. Sin embargo, otros pueden requerir de factores ambientales y/o inflamación de tipo Th2 concurrente en un lugar distintos al esófago para potenciar el desarrollo de la EoE. Los estudios futuros deben centrarse en establecer las contribuciones relativas de estos "determinantes alérgicos" al desarrollo de la EoE, con especial atención a los 95 mecanismos inmunológicos que vinculan una manifestación alérgica con el desarrollo de otra (133). A Genética ………………………………… EoE B Genética …….. EoE C Genética ………………………. EoE Figura 16. Endotipos en EoE. Con el objetivo de estudiar la relación entre los genes de TSLP y TLR3 con el fenotipo atópico, examinamos la asociación de ambos genes con la sensibilización a aeroalergenos y alimentos en los pacientes con EoE. Con respecto al gen TSLP, no encontramos diferencias estadísticamente significativas entre TSLP y la sensibilización a los alérgenos alimentarios o Factores ambientales Factores ambientales Inflamación T2 96 inhalantes en pacientes con EoE. En nuestro estudio, el gen TSLP se asocia con EoE de forma independiente al fenotipo atópico de estos pacientes. Sin embargo, hemos encontrado dos SNPs en el gen TRL3, rs11721827 y rs5743303, estadísticamente asociados con sensibilización a los aeroalergenos y a los alimentos, respectivamente, lo que sugiere la posibilidad de que las dos variantes puedan actuar como marcadores de variantes endotípicas en la EoE. Al igual que sucedía con el SNP rs3775292, estos SNPs están localizados en regiones intrónicas, tratándose, por tanto, de polimorfismos que no producen cambios de aminoácido en la proteína y la influencia de estas variantes podría estar relacionadas con los niveles de expresión del ARNm o formas alternativas de la proteína traducida. Nuestros resultados demuestran una asociación del gen TLR3 con la patogenia de la EoE, tanto con la susceptibilidad como con las distintas variantes fenotípicas. Esto parece indicar que determinados alelos de TLR3 estén implicados en la sensibilización tanto a aeroalérgenos como alimentos en pacientes genéticamente predispuestos. En base a todo esto, proponemos que la activación del sistema inmunológico innato en el epitelio esofágico que involucra la señalización TLR3 y la expresión de ARNm de TSLP, interactúa con respuestas alérgicas adaptativas desencadenadas por alérgenos. Con los resultados de nuestro estudio, proponemos un modelo fisiopatológico, que por primera vez en la literatura explicaría la activación desde la barrera epitelial, y como un daño en ésta es capaz de activar en primera instancia a la respuesta inmune innata y posteriormente la activación de una respuesta de tipo Th2, ampliamente descrita con anterioridad en la EoE y que dará paso en definitiva a todas esas alteraciones y disfunciones en la 97 barrera epitelial que darían lugar a la EoE. Proponemos que diversos factores medioambientales (como alteraciones en la microbiota, existencia de reflujo gástrico, infecciones, alergenos alimentarios y aeroalergenos) inducirían en individuos predispuestos genéticamente, por agresión directa a la células epiteliales esofágicas la activación de los receptores TLR3 en las células epiteliales esofágicas. La activación de TLR3 como señal de daño endógeno de las células esofágicas, induciría la liberación de diversas señales de alarma (TSLP, IL15, IL33), que conduciría a través de ILC2 y basófilos, a una respuesta inmune Th2 orquestada por la liberación de citocinas (fundamentalmente IL4, IL5, IL9 y IL13). TSLP juega un papel importante en la promoción de la diferenciación de células Th2 al inducir la capacidad de polarización Th2 de las células dendríticas (45,46). Variantes del gen TSLP aumentan la respuesta Th2 (45), se asocian a un mayor riesgo de EoE y además los niveles de TSLP son significativamente más altos en pacientes con EoE (118). Las células Th2 activadas producen citocinas como IL4, IL5 e IL13. IL4 promueve la diferenciación de células T en células Th2 y B, que eventualmente conduce a la secreción de IgE. IL5 e IL13 inducen la secreción de eotaxina-3 por las células epiteliales. El gen de la eotaxina-3, induce el reclutamiento de eosinófilos en el esófago. IL13 reduce los niveles de expresión de genes del complejo de diferenciación epidérmica (EDC), DSG-1, filagrina e involucrina, lo que debilita la función de barrera del epitelio esofágico. IL13 induce también la producción de CAPN-14 (enzima proteolítica específica del esófago), que a su vez inhibe la expresión de DSG-1 contribuyendo a la pérdida de la integridad de la barrera epitelial. Así mismo la IL13 induce la remodelación esofágica, 98 depósitos de colágeno y angiogénesis. Al mismo tiempo, los eosinófilos y mastocitos activados localmente producen TGF-1, que desencadena cambios en la pared esofágica, que a su vez está mediada por fibroblastos y periostina, lo que conduce a disfunción del músculo liso. Es decir, originándose los efectos posteriores de las citoquinas afectando a la remodelación y disfunción del epitelio, la lámina propia, la submucosa y el músculo liso (hiperplasia, alteración de la barrera; fibrosis en la lámina propia y submucosa; y dismotilidad del músculo liso dentro de la muscularis interna y externa) característicos de la EoE. Figura 17. Modelo fisiopatológico de la EoE. La alteración de la integridad de la función de barrera epitelial parece ser fundamental para la fisiopatología de la EoE. FLG (filagrina), DSG1 (desmogleina-1), CAPN14(calpaicina14), SPINK7 (inhibidores de la serina proteasa tipo Kazal), CCL26 (eotaxina3), TSLP (linfopoetina tímica estromal) , POSTN (periostina), TLR3 (receptor tipo Toll 3), TGFB (factor de crecimiento tisular), IL13 (interleucina-13). 99 Conclusiones 100 101 Conclusiones • En este estudio se describe por primera vez en la literatura una asociación del gen TLR3 con la susceptibilidad a padecer EoE. Este hallazgo supone un hecho de relevancia científica ya que proporciona un paso clave inicial en la fisiopatología de la EoE, a través la activación de la respuesta inmune innata en las células epiteliales esofágicas, que desencadenará posteriormente una respuesta inflamatoria tipo Th2 propia de la EoE. • Demostramos, también por primera vez la replicación de la asociación del gen TSLP con susceptibilidad a la EoE, en una población europea. • Asumimos un rol equivalente para TLR3 y TSLP en ambos sexos. En el análisis estratificado por sexos de ambos genes sólo es estadísticamente significativo en los hombres, aunque la tendencia de frecuencias es las misma en el grupo de las mujeres que en los hombres. • Aunque ambos genes relacionados con EoE (TLR3 y TSLP) se encuentran en la misma línea biológica, en el estudio de interacción de ambos genes demostramos un efecto independiente de ambos genes en la susceptibilidad de desarrollar EoE. • Hemos examinado la asociación de ambos genes (TLR3 y TSLP) con la sensibilización a aeroalergenos y alimentos en los pacientes con EoE concluyendo que: • El gen TSLP se asocia con EoE de forma independiente al fenotipo atópico de estos pacientes. 108 aeroalérgenos y alimentos en pacientes con EoE (OR=9,67, pc=0,025 y OR=0,53, pc=0,048, respectivamente). No se encontraron diferencias significativas en el resto de los genes estudiados (TLR4, FOXP3 y filagrina). 6. Conclusiones: - Se describe por primera vez en la literatura una asociación del gen TLR3 con la susceptibilidad a padecer EoE. - Demostramos, también por primera vez la replicación de la asociación del gen TSLP con susceptibilidad a la EoE, en una población europea. - En el estudio de interacción de ambos genes (TLR3y TLSP) demostramos que las interacciones de ambos genes tienen redundancia o efectos independientes en la susceptibilidad de desarrollar EoE. - Describimos por primera vez en la literatura, que variantes en el gen TLR3 están estadísticamente asociadas con sensibilización a los aeroalérgenos y a los alimentos, sugiriendo la posibilidad de que estas variantes puedan actuar como marcadores de los diferentes endotipos de la EoE. 109 Bibliografía 110 111 Bibliografía: 1. Lucendo AJ, Molina-Infante J, Arias Á, von Arnim U, Bredenoord AJ, Bussmann C, et al. 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Pteronyssinus - Olea europea - Glyciphagus - Phleum - Cupressaceas Hongos: - Platanus acerifolia - Alternaria alternata - Artemisia - Aspergillus - Salsola Kali - Parietaria juadaica Epitelio de animales: - Prup p 3 (melocotón) - Perro - Gato - Caballo Anisakis Látex 2. Panel de alimentos de origen animal y vegetal: A Animal A. Vegetal Harinas Leche Melón Avena Huevo clara Nuez Centeno Huevo yema Cacahuete Trigo Gamba Lentejas Maíz Almeja Tomate Arroz Calamar Kiwi Cebada Bacalao Melocotón piel Soja Merluza 129 Anexo IV. Producción científica del doctorando en relación con el tema de investigación. Artículos publicados: 1. Ávila-Castellano R, García-Lozano JR, Cimbollek S, Lucendo AJ, Bozada JM, Quiralte J. Genetic variations in the TLR3 locus are associated with eosinophilic esophagitis. United European Gastroenterol J. 2018;6(3):349-357. doi:10.1177/2050640617732643 2. Ávila Castellano Robledo, Stefan Cimbollek, Joaquin Quiralte. Defining the role of food allergy in a populations of adults patients with Eosinophilic Esophagitis. Inflammations & Allergy- Drug Targets, 2010; vol9: nº 3. 3. Elisa Gómez Torrijo, Charo Gónzalez Mendoliola, Manuela Alvarado, Robledo Ávila, Alicia Prieto García, Teresa Balbuena et al. Eosinophilic esophagitis:review and Update. Frontiers in medicine. October 2018. Vol 5 Article 247. Comunicaciones a congresos internacionales: 1. Genetics variants in the TLR3 locus are associated with eosinophilic esophagitis in Spanish population. EAACI Congress 1-5 Junio 2019. Lisboa. (Portugal). Sociedad Europea de Alergología e Inmunología clínica. 2. Genetics variants in the TLSP locus here associated with eosinophilic esophagitis in Spanish population. EAACI Congress 1-5 Junio 2019. Lisboa. (Portugal). Sociedad Europea de Alergología e Inmunología clínica. 3. Clinical food allergy phenotypes in a population patients with eosinophilic esophagitis. XXIX Congress of the European Academy of 130 Allergy and clinical Inmunology. Londres. Reino Unido, 5-9 Junio 2010. Comunicaciones a congresos nacionales: 1. Estudio De Polimorfismos Genéticos Asociados a la Esofagitis Eosinofílica. Simposium internacional avences y perspectivas en alergia cutánea. SEAIC. Maspalomas 23-26 Octubre de 2019. 2. Tratamiento dietético en Esofagitis eosinofílica: estudio observacional retrospectivo. XXXI Congreso de la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica. Valencia, 24 al 27 de octubre de 2018 3. Fenotipos clínica de alergia alimentaria en una población de pacientes adultos con esofagitis eosinofílica. XVII Congreso de la Sociedad Española de Alergología e Inmunología clínica. Madrid 10-13 de Noviembre, 2010. Comunicaciones a congresos regionales: 1. Patrón de sensibilización a alimentos en 14 pacientes con Esofagitis Eosinofílica. XXXVIII Reunión Alergosur. 21,22 y 23 de Mayo de 2009. 131 Ponencias en congresos nacionales: 1. De ámbito nacional: (3) • Esofagitis eosinófílica: diagnóstico, tratamiento y seguimiento. Simposio Internacional de Alergia Alimentaria. 100 años de Inmunoterapia. Barcelona 10-12 Noviembre 2011. 1 hora. • Enteropatías eosinofílicas: punto de vista alergológico. XXIX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica. Salamanca. 22 a 25 de Octubre de 2014. 1 hora. • Dietas en Esofagitis Esosinofílica. Jornadas de la Cloenda de la Societat Catalana dÁl-lérgia i Inmunologia Clínica. Barcelona 29 de Mayo de 2015. 1 hora. 2. De ámbito regional: (1) • Ponencia Alergia Alimentaria. Manejo del paciente con esofagitis eosinofílica. Experiencia de diferentes protocolos de tratamiento. Reunión XLVIII Alergosur. Jaén 20-22 de Junio 2019. Sevilla. Premios y becas recibidos por el doctorando en relación al tema de investigación: - Premio de la Convocatoria de Becas de la Fundación Alergosur 2015, otorgado durante la celebración de la XLIV Reunión Alergosur. 28-30 de Mayo 2015. Granada. Título del proyecto: Estudio de expresión de marcadores inflamatorios en biopsias de pacientes con EoE dependiente de alimentos pre y post intervención dietética. - Premio de la Convocatoria de Becas de la Fundación Alergosur 2013, otorgado durante la celebración de la XLII Reunión Alergosur, 31-1 Junio 132 de 2013. Zahara de los Atunes. Título del proyecto: La alergia a alimentos en la Esofagitis Eosinofílica: diseñando un tratamiento eficaz a través de biomarcadores de actividad clínica, inflamatorios y genéticos. - Premio a la mejor comunicación oral: Patrón de sensibilización a alimentos en 14 pacientes con Esofagitis Eosinofílica. XXXVIII Reunión Alergosur. Jaén 21,22 y 23 de Mayo de 2009. 133