Utilización de la microencapsulación en la medicina regenerativa. Formulación y evaluación in vitro de microesferas poliméricas biodegradables de metformina fijadas en geles bioadhesivos

UTILIZACIÓN DE LA MICROENCAPSULACIÓN EN LA MEDICINA REGENERATIVA FORMULACIÓN Y EVALUACIÓN IN VITRO DE MICROESFERAS POLIMÉRICAS BIODEGRADABLES DE METFORMINA FIJADAS EN GELES BIOADHESIVOS UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Farmacia Juan Carlos Jiménez Aires Curso 2021/2022 UTILIZACIÓN DE LA MICROENCAPSULACIÓN EN LA MEDICINA REGENERATIVA. FORMULACIÓN Y EVALUACIÓN IN VITRO DE MICROESFERAS POLIMÉRICAS BIODEGRADABLES DE METFORMINA FIJADAS EN GELES BIOADHESIVOS Trabajo Fin de Máster Proyecto Experimental Grado en Farmacia Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica Tutora: Prof.a D.a María Luisa González Rodríguez Alumno: Juan Carlos Jiménez Aires Facultad de Farmacia UNIVERSIDAD DE SEVILLA Presentación: Facultad de Farmacia Fecha: diciembre de 2022 RESUMEN Metformina es un fármaco ampliamente utilizado hoy en día principalmente en la terapia de la diabetes tipo 2 por sus efectos hipoglucemiantes; sin embargo, recientes estudios sobre los efectos de este fármaco sobre otras estructuras fisiológicas han demostrado que, debido a su mecanismo de acción, puede utilizarse en el tratamiento de otras patologías cuya etiología dista en gran medida de la diabetes. Este fármaco posee un efecto osteogénico derivado de su acción sobre las células madre mesenquimales y los proteoblastos, lo que ha supuesto un nuevo campo de investigación. Son numerosos los estudios de nuevas formulaciones con esta biguanida como principio activo, en la búsqueda de conseguir terapias dirigidas a las estructuras óseas, entre ellas, la región periodontal y las estructuras maxilofaciales. Existe un continuo desarrollo de nuevas formulaciones, las cuales han permitido confirmar que la encapsulación de metformina en microesferas poliméricas de ácido poliláctico (PLA), y el uso de hidrogeles poliméricos muestran una liberación prolongada del fármaco en el lugar de acción. En elaboración de esta nueva formulación de microesferas de PLA cargadas con metformina, se siguió el método de la doble emulsión y extracción del solvente, incorporándolas posteriormente en un gel de Pluronic®/Hialuronato con el fin de obtener un medicamento mínimamente invasivo, con una liberación prolongada en el tiempo y optimizada en términos de biodisponibilidad y estabilidad. Con el fin de conseguir una formulación exitosa, se llevó a cabo una metodología basada en el Quality-by-Design que nos permitió optimizar la influencia de los factores y los niveles más importantes en la elaboración de la fórmula, obteniéndose así una formulación con la mayor eficacia y estabilidad posibles. Cada una de las formulaciones finales se caracterizó y se realizó un análisis estadístico del proceso de elaboración, así como una validación del método analítico, asegurando la calidad de la formulación final. PALABRAS CLAVE: Metformina, microesferas, doble emulsión, hidrogel, osteogénesis, validación ABSTRACT Metformin is a drug widely used today, mainly in the therapy of type 2 diabetes due to its hypoglycemic effects; however, recent studies on the effects of this drug on other physiological structures have shown that, due to its mechanism of action, it can be used in the treatment of other pathologies whose etiology is far from diabetes. This drug has an osteogenic effect derived from its action on mesenchymal stem cells and proteoblasts, which has led to a new field of research. There are numerous studies of new formulations with this biguanide as an active principle, in the search for therapies directed at bone structures, including the periodontal region and maxillofacial structures. There is a continuous development of new formulations, which have confirmed that the encapsulation of metformin in polymeric microspheres of polylactic acid (PLA), and the use of polymeric hydrogels show a prolonged release of the drug at the site of action. In the elaboration of this new formulation of PLA microspheres loaded with metformin, the method of double emulsion and solvent extraction was followed, later incorporating them into a Pluronic®/Hyaluronate gel in order to obtain a minimally invasive drug, with a release prolonged in time and optimized in terms of bioavailability and stability. In order to achieve a successful formulation, a methodology based on Quality-by-Design was carried out, which allowed us to optimize the influence of the most important factors and levels in the preparation of the formula, thus obtaining a formulation with the highest possible efficiency and stability. Each of the final formulations was characterized and a statistical analysis of the manufacturing process was carried out, as well as a validation of the analytical method, ensuring the quality of the final formulation. KEY WORDS: Metformin, microspheres, double emulsion, hydrogel, osteogenesis, validation. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................................................................................ 3 3. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................. 4 3.1. PUESTA A PUNTO DEL MÉTODO ANALÍTICO MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) ........................................................................................................................................ 4 3.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ......................................................................................... 6 3.2.1. System suitability ........................................................................................................ 6 3.2.2. Especificidad o Selectividad ........................................................................................ 7 3.2.3. Estudio de degradación forzada .................................................................................. 7 3.2.3.1. Degradación básica .............................................................................................. 8 3.2.3.2 Degradación ácida ................................................................................................. 8 3.2.3.3. Degradación oxidativa con peróxidos .................................................................. 8 3.2.3.4. Degradación solar ................................................................................................. 9 3.2.3.5. Degradación por luz ultravioleta .......................................................................... 9 3.2.4. Linealidad .................................................................................................................... 9 3.2.5. Linealidad baja .......................................................................................................... 11 3.2.6. Precisión o Repetitividad ........................................................................................... 12 3.2.7. Límite de cuantificación (LOQ) .................................................................................. 13 3.2.8. Límite de detección (LOD) ......................................................................................... 14 3.3. PREPARACIÓN Y SÍNTESIS DE MICROESFERAS DE PLA CARGADAS CON METFORMINA ........................ 14 3.4. CARACTERIZACIÓN DE LAS MICROESFERAS DE METFORMINA ......................................................... 17 3.4.1. Morfología ................................................................................................................. 17 3.4.2. Eficacia de encapsulación .......................................................................................... 17 3.4.3. Compatibilidad fármaco-excipiente .......................................................................... 17 3.4.3.1 Calorimetría diferencial de barrido ..................................................................... 17 3.4.3.2 Microscopía en platina caliente .......................................................................... 19 3.5. FORMULACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEL .............................................................................. 19 3.5.1. Composición del gel .................................................................................................. 19 3.5.2. Incorporación de microesferas en gel ....................................................................... 21 3.5.3. Caracterización de microesferas en gel .................................................................... 21 3.5.3.1. Estudio reológico ................................................................................................ 21 3.5.3.2. pH ....................................................................................................................... 22 3.5.3.3. Mucoadhesividad ............................................................................................... 22 3.5.3.4. Tiempo de gelificación ....................................................................................... 23 3.6. Estudio de permeación in vitro .................................................................................... 24 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 25 4.1. PREPARACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ..................................................................................... 25 4.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ....................................................................................... 26 4.2.1. System Suitability ...................................................................................................... 26 4.2.2. Especificidad o Selectividad ...................................................................................... 26 4.2.3. Estudios de degradación forzada .............................................................................. 26 4.2.4. Linealidad .................................................................................................................. 26 4.2.5. Linealidad a baja escala ............................................................................................. 28 4.2.6. Precisión o Repetitividad ........................................................................................... 30 4.2.7. Límite de cuantificación ............................................................................................ 31 4.2.8. Límite de detección ................................................................................................... 31 4.3. OPTIMIZACIÓN DE LA FORMULACIÓN MEDIANTE DISEÑO EXPERIMENTAL ......................................... 32 4.3.1. Estudio ANOVA: Análisis de la Varianza .................................................................... 33 4.3.2. Estudio ANOM: Análisis de las medias marginales ................................................... 35 4.3.3. Diagrama de Pareto ................................................................................................... 37 4.3.4. Análisis de regresión y superficies de respuesta ....................................................... 39 4.4. CARACTERIZACIÓN DE LAS MICROESFERAS ................................................................................. 41 4.4.1. Morfología ................................................................................................................. 41 4.4.2. Calorimetría diferencial de barrido ........................................................................... 42 4.4.3. Microscopía en platina caliente ................................................................................ 44 4.5. CARACTERIZACIÓN DEL HIDROGEL ............................................................................................ 44 4.5.1. Reología ..................................................................................................................... 44 4.5.2. pH .............................................................................................................................. 47 4.5.3. Mucoadhesividad ...................................................................................................... 48 4.5.4. Tiempo de gelificación .............................................................................................. 48 4.6. ESTUDIO DE PERMEACIÓN IN VITRO .......................................................................................... 49 5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 52 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 53 7. ANEXO 1 .................................................................................................................... 57 1 1. INTRODUCCIÓN Metformina (MF) es un derivado de biguanida ampliamente utilizado en la práctica clínica como fármaco antidiabético. Inhibe la gluconeogénesis hepática y desencadena la captación de glucosa en el músculo esquelético. El fármaco se tolera bien, es seguro y con una farmacocinética conocida. Debido a sus propiedades, metformina es actualmente el fármaco de primera línea para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Sin embargo, la investigación clínica con este fármaco se encuentra en un punto de rápido crecimiento, y ha sido capaz de demostrar en los últimos tiempos el potencial de este principio activo en la terapia de múltiples trastornos distintos de la diabetes. Así, diversos análisis epidemiológicos han informado que MF puede mejorar el pronóstico de los pacientes con cáncer y también puede prevenir el inicio del tumor (De Censi et al., 2010; Sreenivasan et al., 2014). Además, hay evidencias que sugieren que esta biguanida actúa como un factor antienvejecimiento y modula la microbiota, promoviendo así la salud del paciente (Pryor y Cabreiro, 2015). Hoy en día, son cada vez más los estudios que indican que MF tiene un efecto osteogénico al promover la diferenciación de las células madre mesenquimales (MSC) y los preosteoblastos (Gao et al., 2008), (Cortizo et al., 2006). De hecho, a inicios de la pasada década, se demostró que este fármaco era capar de inducir la diferenciación y mineralización de preosteoblastos en osteoblastos a través de la activación de la vía de señalización de la quinasa activada por AMP (AMPK) (Molinuevo et al., 2010). Es decir, se demostró que la metformina posee la capacidad de regenerar estructuras óseas en determinadas ocasiones, como resultado de su acción sobre las células encargadas de formar los huesos en nuestro organismo. Los mecanismos precisos de acción de MF aún no se han dilucidado completamente, pero se sabe que en ellos pueden estar involucradas muchas vías. El mecanismo ampliamente aceptado de la acción de este fármaco es la estimulación de la proteína quinasa activada por monofosfato de adenosina (AMPK) (Zhou et al., 2001). La AMPK se activa por un aumento en la relación AMP: ATP en condiciones de estrés metabólico, incluidas la hipoxia y la deficiencia de glucosa (Hardie et al., 2007). Por lo tanto, AMPK 8 producto, de forma que, si ante estas condiciones, la MF en nuestro caso, no sufriera degradación, entonces sería completamente estable en condiciones normales. El estudio de degradación forzada se llevó a cabo bajo diferentes condiciones posibles de inestabilidad del fármaco, resistencia a bases, ácidos, peróxidos, luz, o luz ultravioleta, cada uno de ellos será descrito posteriormente. Para comenzar el procedimiento, se elaboraron 3 soluciones madre, una solución básica de NaOH (0.1 M), otra ácida de HCl (0.1 M) y otra solución con peróxido de hidrógeno 3 % v/v). Una vez se prepararon las tres soluciones madre, se procedió a preparar cada prueba de degradación forzada. 3.2.3.1. Degradación básica Tras pesar 2.5 mg de MF, estos se llevaron a un matraz aforado de 25 mL y se disolvieron con 1 mL de agua al que se añadieron 0.5 mL de la solución preparada de NaOH 0.1M. Se dejó reposar la mezcla en el matraz durante 5 horas; posteriormente, se añadieron 0.5 mL de la solución de HCl 0.1 M para neutralizar el pH y se diluyó llenando el matraz con agua purificada hasta su aforo. 3.2.3.2 Degradación ácida Se pesaron, como en la anterior prueba, 2.5 mg de MF los cuales se llevaron a un matraz aforado de 25 mL y se disolvieron con 1 mL de agua, a lo que posteriormente se le añadió 0.5 mL de HCl 0.1 M, de modo que, al contrario que la anterior prueba, en la que se medía la resistencia a las bases de la metformina, en esta ocasión se midió la resistencia al ácido del principio activo. Para ello, también se dejó reposar la mezcla 5 horas, tras las cuales se añadieron 0.5 mL de la solución de NaOH 0.1 M y se llenó el matraz hasta aforo con agua purificada. 3.2.3.3. Degradación oxidativa con peróxidos Se pesaron 2.5 mg de MF, que se llevaron a un matraz aforado de 25 mL, al cual se le añadieron 1 mL de agua y 1 mL de la solución madre de peróxido de hidrógeno al 3 % v/v. Esta mezcla se dejó reposar durante 8 horas y tras ello se enrasó el matraz con agua purificada. 9 3.2.3.4. Degradación solar Se pesaron 2.5 mg de MF y se llevaron a un matraz aforado de 25 mL al cual también se añadieron 15 mL de agua purificada y se dejaron reposar a luz de sol directa durante 5 horas. Transcurrido este tiempo, se enrasó el matraz con agua purificada. 3.2.3.5. Degradación por luz ultravioleta Se pesaron 2.5 mg de MF y se llevaron a un matraz aforado de 25 mL; en él se disolvió la MF con 15 mL de agua purificada y la mezcla se llevó a una campana de bioseguridad con luz ultravioleta a 254 nm durante 8 horas, tiempo tras el cual se recuperó el matraz y se enrasó con agua purificada. Tras realizar cada uno de estos procedimientos, se recolectaron los 5 matraces de 25 mL y se extrajo una pequeña alícuota de aproximadamente 1 mL de cada uno de ellos, la cual se filtró con un filtro de jeringa de 0,45 micras y se llevaron respectivamente a 5 viales topacio para HPLC; de esta forma, se comenzó un nuevo análisis cromatográfico a la longitud de onda de absorción de la MF y se comprobaron las áreas correspondientes a cada muestra comparándolas siempre con un estándar de MF elaborado en ese mismo día. 3.2.4. Linealidad Este parámetro nos permite verificar que cada una de las muestras analizadas se encuentran dentro de un rango en el cual las respuestas del equipo se corresponden proporcionalmente con las variaciones de concentración de metformina en cada muestra. El estudio se llevó a cabo mediante la preparación de distintos niveles de concentración, en porcentaje, de una cantidad definida de metformina en solución. Esta se fijó en 0.2 mg/mL, la cual supondría una muestra definida como 100 % de MF. Posteriormente se elaborarían los demás niveles correspondientes al 50 %, 75 %, 125 % y 150 % del fármaco, es decir, variaciones en la concentración del principio activo en solución. Para comenzar, se elaboró una solución madre con una concentración de 0.5 mg/mL. Posteriormente, a partir de la solución madre se obtuvo el estándar de MF de concentración 0.2 mg/mL representando la muestra de 100 %. Al igual que se preparó esta solución, también se siguieron los mismos cálculos para le preparación de los demás niveles: 10 • Nivel 100 %: 0.2 mg/mL (4 mL de la solución madre y llevados a 10 mL con agua miliQ). • Nivel 50 %: 0.1 mg/mL (2 mL de la solución madre y llevados a 10 mL con agua miliQ) • Nivel 75 %: 0.15 mg/mL (3 mL de la solución madre y llevados a 10 mL con agua miliQ) • Nivel 125 %: 0.25 mg/mL (5 mL de la solución madre y llevados a 10 mL con agua miliQ) • Nivel 150 %: 0.3 mg/mL (6 mL de la solución madre y llevados a 10 mL con agua purificada) Una vez se elaboraron por triplicado cada una de las soluciones descritas, se extrajo una alícuota de aproximadamente 1 mL de cada una de ellas, y se pasó por un filtro de jeringa de 0.45 micras, y se analizaron por HPLC. - Test de homogeneidad de varianzas: Con el fin de determinar si la concentración de los analitos representa un factor de influencia en la variabilidad de los resultados, se llevó a cabo el test de Cochran o también denominado de homogeneidad de varianzas, en el cual se compara el valor de G calculada (Gexp) y G tabulada (Gtab), de forma que si se cumple que Gexp < Gatb entonces existe una homogeneidad de varianza en el estudio de la relación concentración-área realizado. Para ello se calcularon en primer lugar los factores de respuesta (Figura 1) y las varianzas de las tres repeticiones de cada uno de los niveles dispuestos para el cálculo de la linealidad. Se escogió la varianza máxima de todas ellas, y entre ellas se dividió el sumatorio del resto de varianzas, obteniéndose así la Gexp a partir de su fórmula (Figuras 2), posteriormente, se hizo una comparativa con la Gtab para resolver la homogeneidad o heterogeneidad de las varianzas en este caso. Figura 2. Fórmula para el cálculo de factor de respuesta. Figura 1. Fórmula para el cálculo de Gexp. 11 -Test de proporcionalidad: Con el fin de obtener una visión general de la proporcionalidad de los resultados obtenidos del cálculo de área a partir de una determinada concentración definida en HPLC, se decidió llevar a cabo este estudio, el cual en condiciones ideales debería resultar en una recta con la mínima curvatura posible, indicado así la proporcionalidad de los valores obtenidos con el uso del método analítico seleccionado. Esto nos permite establecer el criterio de aceptación, de forma que para que el test de proporcionalidad sea válido, el valor del coeficiente de correlación (r2) en la recta de regresión debe ser r2 ≥ 0.990 - Test de la pendiente: La función que sigue un procedimiento analítico, es la relación existente, dentro de un rango específico, entre el área y la concentración del analito. De esta forma, para cada nivel concentración descrito en la linealidad, existirá un factor de respuesta (f), el cual sigue la fórmula f= área/concentración. Al representar cada uno de los valores de área con respecto a la concentración, se obtendrá una recta. Con el fin de establecer un criterio de aceptación para este ensayo, se estableció que el RSD del factor de respuesta debía ser ≤ 2%. 3.2.5. Linealidad baja Para asegurar que la linealidad del método se mantiene aún en rangos de valores muy bajos o incluso casi indetectables para otros instrumentos, se llevó a cabo la medición de la linealidad a baja escala. Esta medida se realizó diluyendo cien veces todas las muestras del apartado anterior que se usaron para el cálculo de la linealidad, es decir, tomamos 1 mL de las muestras y lo llevamos a un matraz de 100 mL el cual se enrasó con agua miliQ, consiguiendo así una dilución 1:100. De estos matraces se recogió 1 mL y se llevó esta alícuota a viales topacio para volver a realizar mediciones en HPLC. Del mismo modo que con la linealidad, se llevaron a cabo en este apartado también tres estudios adicionales que permitiesen asegurar el cumplimiento de la linealidad baja del método analítico. - Test de homogeneidad de varianzas: Al igual que se hizo en el estudio de linealidad, se calcularon las varianzas de las tres repeticiones de cada uno de los niveles, esta vez mucho menores, que fueron establecidos para el cálculo de la linealidad baja. Posteriormente se calculó Gexp siguiendo la fórmula de las Figura 2, y se comparó con 12 Gtab. En este estudio, el criterio de aceptación se fijó igualmente en el cumplimiento de Gexp < Gatb. - Test de proporcionalidad: Se elaboró una recta de calibrado comparando los valores área/concentración, y se obtuvo la línea de tendencia de la recta obtenida, así como su coeficiente de regresión, considerándose como criterio de aceptación para el test, el requisito de que r2 ≥ 0,990. - Test de la pendiente: Al igual que se realizó una gráfica en el test de la pendiente para el cálculo de la linealidad, en este caso también se llevó a cabo la elaboración de una recta factor de respuesta/concentración, y se calculó la media total de desviación estándar relativa (%RSD), con el fin de comprobar si el resultado del test cumpliese el criterio de aceptación %RSD ≤ 2%. 3.2.6. Precisión o Repetitividad Este parámetro nos permite evaluar la existencia de errores en el instrumento de medición, en este caso del HPLC, o errores aleatorios en el proceso de medida del método analítico. - Repetibilidad de la inyección Para ello, se preparó una solución estándar de metformina con una concentración de 0.2 mg/mL se llevó aproximadamente 1 mL a un vial topacio para HPLC previamente filtrado con filtro de jeringa de 0.45 micras y se procedió a analizar la muestra 10 veces consecutivas. Posteriormente, se llevó a cabo el cálculo de la desviación estándar relativa, con el mismo criterio de aceptación que el apartado anterior, es decir, no debiendo superar 2 %. - Repetibilidad del análisis Para llevar a cabo este estudio, se elaboraron diluciones de una solución de metformina estándar con el fin de comprobar si el método conservaba su repetibilidad en un rango de concentraciones de la muestra, distinto del valor estándar de 0.2 mg/mL, de esta forma se elaboraron una solución de 0.1 mg/mL que representaría un valor del 50 % de la concentración estándar, y otra solución de 0.3 mg/mL representando un 150 % de la concentración estándar. Una vez preparada cada una de las tres diluciones, se realizaron 13 inyecciones en HPLC de cada una de ellas por triplicado. Una vez obtenidas las áreas de cada medida, se llevó a cabo el cálculo de desviación estándar relativa (RSD), el cual debe ser menor al 2 % para cumplir el criterio de aceptación. - Precisión intermedia Con el fin de evaluar las diferencias en los resultados y su significancia en el proceso analítico, derivadas del analista, se realizó el estudio de precisión intermedia el cual permite comparar los resultados de distintos operadores, y aportar un mayor análisis de la repetibilidad del método. Para ello, se llevó a cabo el estudio de la siguiente forma. Cada operario realizó dos inyecciones al día durante dos días de un estándar de metformina. Se prepararon 2 estándares de MF en solución, por tanto, cada operario repitió el proceso dos veces; dos inyecciones al día del Estándar 1 y dos inyecciones al día del Estándar 2, durante dos días ambas. Posteriormente, se calculó la media de cada grupo de datos obtenido, y se llevó a cabo el cálculo de la desviación estándar relativa (RSD), a fin de comprobar si se cumplía el criterio de aceptación de RSD menor al 2 %. 3.2.7. Límite de cuantificación (LOQ) El límite de cuantificación es la concentración mínima a la cual una muestra puede ser cuantificada mediante un equipo de análisis con un nivel de exactitud y precisión aceptables. Para llevar a cabo este estudio, se realizaron una serie de diluciones de una muestra de metformina en solución, y se analizaron todas ellas, en orden de concentración decreciente en HPLC, de forma que cada muestra presentara un menor valor de área debido a la bajada de concentración progresiva de metformina en cada una de las muestras, hasta el punto en el cual el área de pico de metformina en el espectro de HPLC no puede ser cuantificada conservando la exactitud y precisión, en este punto de concentración se establece el LOQ. Para realizar el ensayo se preparó una solución madre de MF de concentración 0.2 mg/mL que representa el 100 % de concentración; a partir de ella se realizaron diluciones de concentración decreciente que representaban los valores de 1 %, 0.75 %, 0.5 % y 0.25 %. Una vez se prepararon, se llevaron al HPLC para determinar sus áreas, hasta alcanzar la última área que podía ser cuantificable del grupo de muestras. 14 3.2.8. Límite de detección (LOD) El límite de detección se define como la concentración más baja a la cual un analito puede ser detectado, aunque este pueda no ser cuantificado necesariamente, es decir, en este estudio se buscó la mínima concentración que produjera señal de área de MF en el cromatograma, aunque esta misma área no pueda cuantificarse. Para llevar a cabo el estudio se realizaron, al igual que en el estudio del LOQ, diluciones de concentraciones con valor de 1 %, 0.75 %, 0.5 % y 0.25 % y además se preparó una última de 0.1 % ya que la anterior seguí siendo detectable y también cuantificable. De la misma forma, se siguió el procedimiento de análisis en HPLC de cada una de las muestras hasta llegar a la concentración mínima detectable por el equipo, fijándose así el valor de LOD. 3.3. Preparación y Síntesis de Microesferas de PLA cargadas con Metformina La microencapsulación por evaporación de solventes se usa principalmente en la industria farmacéutica para obtener formulaciones de liberación controlada. Existen diferentes métodos disponibles para usar la microencapsulación mediante la técnica de evaporación de solventes. La selección de un método que proporcione una encapsulación adecuada del fármaco generalmente depende de la hidrofilia o lipofilia de las moléculas activas (Li et al., 2008). Así, el método de aceite en agua (o/w) generalmente se adopta para la encapsulación de agentes activos insolubles o poco solubles en agua. Sin embargo, esta técnica falla cuando se trata de la encapsulación de agentes altamente hidrofílicos. Esto se debe a que el agente activo puede difundir en la fase continua durante la formulación o puede no disolverse en el solvente orgánico. En estos casos, las emulsiones múltiples juegan un papel fundamental. El tipo más común de emulsiones múltiples es la emulsión de agua en aceite (w1/o/w2) de forma que la mayoría de los fármacos hidrófilos se han encapsulado mediante este método (Crotts y Park, 1998; Okochi y Nakano, 2000; Sinha y Trehan, 2003). El agente soluble en agua se solubiliza dentro de la fase W1 (fase interna de la primera emulsión), que luego muestra una liberación prolongada del fármaco, efectos tóxicos menores y alta eficacia de encapsulación del agente activo (Nakhare y Vyas, 1996). 15 Debido a que MF es una molécula hidrófila, se decidió llevar a cabo el método de la doble emulsión seguido de evaporación del solvente, a fin de obtener microesferas estables y con alta eficacia de encapsulación. En cuanto al procedimiento detallado de la elaboración de la formulación, se llevaron a cabo estudios preliminares para intentar optimizar el proceso de síntesis de las microesferas. Entre los estudios preliminares, con el fin de encontrar la forma más sencilla, rápida y sobre todo efectiva en términos de evitar pérdidas de principio activo, se realizó un estudio de cribado de varios de los factores descritos hasta el momento mediante un diseño experimental del tipo matriz ortogonal de Taguchi L9, que nos permitiese elegir la combinación de factores que proporcionaban una formulación de mayor calidad. Entre los factores elegidos para llevar a cabo el estudio del diseño experimental final, se escogieron las cantidades de MF (10 mg, 25 mg o 40 mg) y NaCl (1 %, 3 % o 5 %) totales en la formulación, el proceso de evaporación de solvente orgánico (Evaporación en campana, en rotavapor a temperatura ambiente, o rotavapor a 40 °C) y el número de lavados de la formulación antes de su secado (1, 2 o 3). Con todos estos parámetros, se creó el siguiente diseño experimental (Tabla 3): Experimento Metformina (mg) NaCl (%) Proceso de evaporación Número de lavados 1 10 1 Campana 1 2 10 3 Rotavapor TA 2 3 10 5 Rotavapor 40 °C 3 4 25 1 Rotavapor TA 3 5 25 3 Rotavapor 40 °C 1 6 25 5 Campana 2 7 40 1 Rotavapor 40 °C 2 8 40 3 Campana 3 9 40 5 Rotavapor TA 1 Tabla 3. Diseño experimental. Matriz ortogonal de Taguchi L9 (TA: temperatura ambiente). 16 Tras realizar estos ensayos y caracterizar las muestras obtenidas de una forma rápida y sencilla basándonos principalmente en el aspecto visual de las microesferas al microscopio y comparando con las formulaciones realizadas anteriormente, se concluyó que la liofilización no era un proceso rentable en cuanto al coste/tiempo/calidad de la fórmula; por tanto, se descartó este proceso y tras una breve revisión bibliográfica, se decidió filtrar el producto acuoso de la doble emulsión obteniendo así las microesferas húmedas en papel de filtro, del mismo modo se comprobaron que parámetros nos permitían obtener mejores lotes, y finalmente se elaboró el procedimiento final. Los lotes finales se prepararon mediante el proceso descrito anteriormente, de doble emulsión W1/O/W2 con extracción de solvente. Para ello, se disolvieron 100 mg de PLA- A (Resomer L207S) en 5 mL de diclorometano (DCM). A esta mezcla se añadieron 50 microlitros de Span® 80. En otro vial distinto con 0.5 mL de agua, se disolvieron 40 mg de MF y 25 mg de NaCl. Mediante goteo, con ayuda de una jeringa de 5 mL se añadieron los 0.5 mL de fase acuosa sobre la fase orgánica mientras se emulsionaba en frío a 9000 rpm durante 1 minuto en el homogeneizador UltraTurrax. Una vez terminado este proceso, se ha obtenido la emulsión W1/O. Para formar la segunda emulsión, se usó un homogeneizador IKA el cual se sometió a 1000 rpm durante 2 min agitando 7.5 mL de una solución acuosa de alcohol polivinílico (PVA) pH 4 al 2 % p/v. Sobre esta solución de PVA se añadió mediante goteo, y en frío, la emulsión formada anteriormente, y por acción del homogeneizador se dispersará la misma y se formará la doble emulsión W1/O/W2 ya estable. En este punto, la obtención de microesferas sólidas tuvo lugar añadiendo 10 mL más de PVA; todo ello se vertió en un vaso de precipitado de 100 mL con agitador mecánico, y se introdujo en campana de extracción con un agitador IKA RT1 Werke a una velocidad de 400 rpm hasta evaporación del DCM; una vez evaporado el solvente, se procedió a la filtración de la formulación, usando Kitasato con bomba de vacío. Se realizaron dos filtraciones consecutivas con cambio de filtro. Para las filtraciones se usaron, en primer lugar, un filtro grosero, del cual se recogió tras la primera filtración gran parte de producto, y en segundo lugar filtros de 0.45 micras de tamaño de partícula evitando así con la primera filtración una colmatación temprana de este filtro más fino. Tras la recolección del líquido filtrado de la primera filtración, este mismo se hace pasar por el filtro de 0.45 micras y se recoge el 17 producto sólido filtrado. Antes de desechar este filtro, se realizó un lavado con 10 mL de agua purificada y se recogieron cada uno de los líquidos filtrados sucesivamente para su posterior análisis en HPLC. Finalmente, el producto sólido obtenido se introdujo en un eppendorf y se llevó a una estufa programada a 37 °C durante 24 horas para el secado de las microesferas. Transcurrido el tiempo se obtuvo un polvo blanco de microesferas que pasaron a ser caracterizadas 3.4. Caracterización de las microesferas de metformina Para llevar a cabo la caracterización de las microesferas de MF se llevaron a cabo diferentes análisis que nos permitieron evaluar aspectos morfológicos, químicos y funcionales de las mismas. Por ello se decidieron realizar los siguientes estudios al finalizar el proceso de elaboración de las mismas para evaluar su calidad final. 3.4.1. Morfología Probablemente fue uno de los estudios más sencillos debido a que se realizó mediante examen en microscopio óptico. Este análisis no precisó de cálculos adicionales, sino simplemente un estudio a simple vista de una alícuota de microesferas secas dispersas en una gota de agua. Para realizar este estudio se utilizó el microscopio óptico Olympus BH-2 en un rango de distinto objetivos 10X, 40X y 100X. 3.4.2. Eficacia de encapsulación Para llevar a cabo el cálculo de la eficacia de encapsulación, se recolectó el líquido sobrante tras el filtrado de las microesferas ya elaboradas, el cual contendría en solución la MF que no había sido encapsulada dentro de las microesferas. De esta forma, al calcular en HPLC la concentración de MF en el líquido, sabríamos la cantidad de fármaco no encapsulado, y mediante un sencillo calculo por diferencia, podríamos también conocer la cantidad que sí se había conseguido incorporar dentro de las microesferas. A partir de este dato, se efectuó el cálculo de la eficacia de encapsulación en porcentaje. 3.4.3. Compatibilidad fármaco-excipiente 3.4.3.1 Calorimetría diferencial de barrido La Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) es una técnica de análisis térmico adecuada para determinar la pureza, las formas polimórficas y el punto de fusión de una muestra en la Industria Farmacéutica. También se considera una herramienta para estudiar el 24 pasando de geles muy fluidos a geles muy sólidos o viceversa con cambios de unos pocos grados centígrados. Debido a que la composición del gel formulado en nuestro trabajo era una mezcla de dos geles y otros componentes integrados con las microesferas, era interesante y necesario determinar el tiempo de gelificación por el método de inversión de cada una de las formulaciones: gel blanco, gel con MF y gel con microesferas, en un vial. Para llevar a cabo el método de inversión, se preparó un baño termostatizado a 37 °C y 3 viales, cada uno de los cuales portaba una muestra de gel de 1 gramo de las descritas anteriormente. Se sumergieron cada uno de los viales en el baño y se sacaron en intervalos de 5 segundos, dejando entre intervalo un tiempo para la estabilización de la muestra y observar si se había producido la gelificación o, por el contrario, era necesario más tiempo a la temperatura del baño, la cual simulaba la temperatura de la cavidad bucal en la que serían aplicados los geles en la práctica real. Tras extraer los geles del baño cada 5 segundos, la comprobación que se realizaba para visualizar la gelificación era una simple inversión del vial, observándose desplazamiento por gravedad del gel si este no había gelificado, o manteniéndose en el fondo si por el contrario sí había gelificado. 3.6. Estudio de permeación in vitro Una vez incorporadas las microesferas en el gel y caracterizada la formulación, se decidió llevar a cabo un ensayo de permeación in vitro a través de membranas artificiales utilizando celdas de difusión de Franz, con el fin de evaluar la capacidad del gel de permear a través de la membrana a través del tiempo y calcular la cantidad de principio activo capaz de difundir de la formulación a la celda a lo largo del tiempo. Para llevar a cabo este ensayo, se necesitaron varios equipos, como una bomba peristáltica con tubos de silicona, y un equipo de permeación dotado de termostato y celdas de difusión de Franz. Al igual que los anteriores ensayos, uno de los objetivos del estudio de permeación es replicar de la forma más precisa posible las condiciones de la cavidad bucal, ya que será el tejido diana de aplicación de nuestra formulación final, para conseguir asimilar lo 25 máximo posible nuestro instrumento de laboratorio con las estructuras fisiológicas de la boca. Para ello, se se utilizó saliva artificial cuya composición fue descrita anteriormente, membranas sintéticas de nitrato de celulosa de 0.22 micras hidratadas con tampón PBS de dihidrógeno de fosfato e hidrogenofosfato de potasio a pH 7.4 estabilizadas durante 1 hora, y agua recirculante alrededor de las celdas a una temperatura de 37 °C. Para comenzar el ensayo, se llenaron los compartimentos receptores de las celdas con la solución PBS en agitación continua con imán y se sellaron con papel de Parafilm evitando su evaporación y se activó circuito de agua recirculante a temperatura fisiológica; posteriormente, se colocaron las membranas de nitrato de celulosa y se acoplaron sobre ellas cada uno de los compartimentos donadores. Sobre los compartimentos donadores se incorporó 1 g de gel conteniendo 35 mg de microesferas, y se añadió 0.5cmL de saliva artificial para favorecer la liberación, tal y como ocurriría en un caso real en la boca. llenándose en total seis celdas, en las que se encontraban las muestras por duplicado de gel con MF, gel con microesferas y una solución control de MF. De esta forma, a intervalos determinados de tiempo establecidos a las 1,2, 3, 4, 5, 6, 24 h tras comenzar el ensayo, se tomaron alícuotas de 1 mL del compartimento aceptor, reponiendo en el mismo el volumen extraído con tampón PBS permitiendo así la existencia de una cantidad constante de tampón a lo largo del estudio. Finalmente, se llevaron las alícuotas a viales topacio para su cuantificación en HPLC, permitiéndonos así calcular la cantidad de MF que difundió a través de la membrana a lo largo del estudio, hora por hora, y el fármaco total permeado al final del estudio en cada una de las celdas. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Preparación del método analítico En este caso, se diferenció claramente que la fase acuosa debía ser tampón fosfato para conseguir buenos resultados, y a esto se le sumó un flujo de 1.5mL y los valores de ratio de fase acuosa/orgánica y temperatura del horno ya descritos al principio de este 26 apartado. Al analizar cada pico de los 8 ensayos, se observó que ciertos Run, como el 3 y 4, presentaban buena área, simetría y tiempos de retención acordes a la metformina pura, pero se observaba cierto “Peak Tailing” que se intentó solucionar por medio de cambios en pH de la fase móvil (Acetonitrilo por Metanol), e incluso con cambios de columna de HPLC, que sin embargo no dieron resultado, por lo que se aceptó el método descrito y su asimetría de pico que se situaba en torno a 1.95. 4.2. Validación del método analítico 4.2.1. System Suitability Tras realizar las 6 inyecciones en HPLC de un estándar de MF de concentración 0.2 mg/mL, los resultados de áreas fueron los recogidos en el punto 7 de este trabajo (Anexo 1; Tabla 1). Tras calcular la deviación estándar relativa de las muestras, esta resultó ser de 1.01 %, por lo que el método cumple con la idoneidad. 4.2.2. Especificidad o Selectividad Una vez realizadas las medidas de cada uno de los componentes de la formulación por duplicado, se recogieron los resultados en la segunda tabla del anexo. (Anexo 1; Tabla 2). Como se aprecia, ninguna de las muestras, por duplicado, nos dan valor de área, es decir, en ninguna de ellas existe algún componente que absorba luz a la longitud de onda de la MF, por lo que en las muestras que se analizaran con la formulación completa, ninguno de los componentes de la doble emulsión interferiría en la medida del área de la MF en HPLC. De esta forma podemos confirmar que el método analítico es selectivo. 4.2.3. Estudios de degradación forzada Los resultados, por duplicado, de cada una de las medidas nos mostraron que las áreas de cada muestra no distaban apenas del área del estándar de MF (Anexo 1; Tabla 3), lo que podría interpretarse como que ninguna de las condiciones de degradación forzada afectaba a la estructura de la MF ni a la calidad de la solución; por tanto, pudo afirmarse que este el fármaco era resistente a estas condiciones y no estaba siendo destruido a lo largo del proceso de elaboración de las microesferas. 4.2.4. Linealidad Los resultados de las áreas por niveles de concentración se recogen en el Anexo 1, tabla 4. Para comprobar la linealidad de las áreas resultantes del HPLC de cada una de las muestras y demostrar que el método por tanto es lineal, a partir del estándar, y de la señal del instrumento de medición, calcularemos la concentración teórica de la muestra, 27 la cual debería ser muy cercana o prácticamente igual a la concentración real conocida debido a la alta resolución del HPLC. Se pudo comprobar que todos los cálculos teóricos de concentraciones de cada muestra se correspondían con los valores de concentración real de cada una de ellas, por lo que podría asegurarse que el método es lineal. - Test de homogeneidad de varianzas: Una vez calculadas las varianzas de cada grupo de áreas resultantes del análisis de cada muestra por triplicado, podemos calcular la Gexp a partir de la fórmula que podemos observar en la imagen (Figuras 1 y 2). Una vez hemos obtenido que Gexp= 0.476 debemos comparar con la Gtab en las tablas estadísticas del test de Ccochran, sabiendo que en nuestro estudio n=3 y k=5, de esta forma se concluyó que Gtab=0.5981 y por tanto Gexp<Gtab. Se pudo concluir que existe una homogeneidad de la varianza en nuestro estudio. - Test de proporcionalidad: Como se puede observar en el gráfico (Figura 4) al representar la recta de regresión lineal resultante de relacionar área y concentración en el cálculo de la linealidad, se obtiene un coeficiente de correlación de 0,9971 concluyéndose que se cumple el test de proporcionalidad al ser r2 ≥ 0,990. Figura 4. Gráfica Test de Proporcionalidad para la Linealidad. 28 - Test de la pendiente: Una vez se calcularon los factores de respuesta de cada una de las tres repeticiones, de los cinco niveles de muestras analizadas, se realizó el cálculo de la media y desviación estándar de cada grupo de 3 repeticiones, y se calculó el %RSD de cada uno de ellos también. Finalmente se calculó la media de todos los %RSD obtenidos (Anexo 1; Tabla 11), concluyendo de esta forma que la desviación estándar relativa promedio del ensayo se situó justo en un 2 %, es decir, aunque al límite, se cumplió el test de la pendiente, asegurándose así mediante una prueba más, la linealidad del método analítico llevado a cabo. 4.2.5. Linealidad a baja escala Una vez obtenidos los resultados arrojados por el HPLC (Anexo 1; Tabla 5), los resultados de las áreas se corresponden con valores 100 veces menores, lo que es un indicativo de que el método es efectivo. Al igual que en el cálculo de la linealidad en el apartado anterior, se realizaron los mismos cálculos en este apartado, teniendo en cuenta que todo está diluido 100 veces respecto a las concentraciones del apartado anterior. Figura 5. Gráfica Test de la Pendiente para la Linealidad. 29 Tal y como se demostró en el apartado anterior; la linealidad del método analítico, en este apartado también podemos confirmar que el mismo es lineal a escala baja, es decir, se mantiene, aunque se utilice con muestras de muy pequeño valor de concentración, y por consiguiente resulten en pequeñas áreas. -Test de homogeneidad de varianzas: Al calcular las varianzas de cada grupo de áreas medidas por triplicado, se obtuvo el valor de Gexp , el cual resultó en 0.22. Esto permitió concluir que Gexp<Gtab, ya que la Gtab en este caso es igual a 0.5981. Por tanto, se cumplió el criterio de aceptación. - Test de proporcionalidad: Al realizar la recta de calibrado (Figura 6) en la cual se enfrentan área/concentración, se concluyó que el valor del coeficiente de correlación era de 0,9929 el cual, siendo mayor a 0.990, permitió concluir que se cumplía el criterio de aceptación para el test de proporcionalidad en el ensayo de linealidad baja. - Test de la pendiente: Del mismo modo que en el ensayo de la linealidad, se calcularon media y desviación estándar de cada grupo de 3 repeticiones, y se calculó el %RSD de cada uno de los grupos de repeticiones del mismo nivel (Anexo 1; Tabla 12). Posteriormente, se hizo una media de los %RSD de cada grupo de repeticiones, y se Figura 6. Gráfica Test de proporcionalidad para la Linealidad Baja. 30 calculó el %RSD total, que tuvo como valor 1,64. Por tanto, se cumplió el criterio de aceptación ya que el %RSD total fue menor al 2 %. 4.2.6. Precisión o Repetitividad - Repetibilidad de inyección: Los resultados de áreas de cada repetición por HPLC se recolectaron en la siguiente tabla (Anexo 1; Tabla 6) y se calculó el valor de desviación estándar relativa, el cual resulto en un 0.82 %, es decir, cumple con el criterio de aceptación para considerarse un método preciso en la medida de MF. - Repetibilidad de análisis: Como podemos observar en la tabla (Anexo 1; Tabla 7), la media de las desviaciones estándar relativas de los grupos de datos resulta en un 1.86 %, lo que nos indica que el estudio de repetibilidad de análisis cumple el criterio de aceptación y, por tanto, el análisis de las muestras es repetible en un rango de concentraciones distintas entre sí. - Precisión Intermedia: De esta forma, tras comparar los resultados de áreas resultantes de cada muestra en HPLC (Anexo 1; Tablas 8 y 9) se obtuvieron los dos %RSD, correspondientes a cada Figura 7. Gráfica Test de la Pendiente para la Linealidad Baja. 31 uno de los estándares de metformina usados en el análisis, para posteriormente calcular el %RSD total del estudio de precisión intermedia, realizando la media de los dos valores comentados anteriormente la cual resultó de la siguiente forma: %RSD Total = 0.56. Por tanto, el estudio cumple el criterio de aceptación marcado al ser la desviación estándar relativa menor al 2 %. 4.2.7. Límite de cuantificación Como resultado del cálculo del límite de cuantificación, se pudo determinar que el instrumento de medida, en este caso, HPLC, tuvo un límite de detección de metformina en solución de 0.0005 mg/mL, es decir, un 0.25 % del estándar de metformina de 0.2 mg/mL tal y como se puede observar en la tabla del apartado 6. (Anexo 7; Tabla 10). 4.2.8. Límite de detección Tras realizar el análisis en HPLC de cada una de las soluciones de metformina preparadas, se pudo comprobar que la mínima concentración detectable por el equipo fue la de 0.1 % respecto a la solución madre de 0.2 mg/mL, o sea, una concentración de 0.0002 mg/mL. Por tanto, el LOD de nuestro estudio se fijó en 0.0002 mg/mL, apreciándose un pequeño pico de área en el cromatograma (Figura 8), el cual no puede ser cuantificado con exactitud y precisión y apenas puede ser distinguido del ruido del equipo. Figura 8. Espectrograma de una muestra de MF en solución. LOD. 32 4.3. Optimización de la formulación mediante diseño experimental Tal y como se explicó en el apartado de metodología anterior (3.2 Preparación y Síntesis de Microesferas de PLA cargadas con Metformina), a fin de obtener una formulación de la mayor calidad posible, se llevaron a cabo múltiples estudios preliminares. Finalmente, se planteó un diseño experimental, con el fin de valorar estadísticamente como influían diversos parámetros de la formulación sobre la eficacia de encapsulación de MF. Para realizar estos estudios fue necesario, en primer lugar, obtener los datos de eficacias de encapsulación (EE) de cada lote incluido en el diseño experimental, los cuales se muestran en la tabla 5. Número de Experimento EE (%) Repetición 1 EE (%) Repetición 2 1 30.26 30.99 2 20.20 17.19 3 30.34 31.69 4 32.47 32.83 5 37.46 39.83 6 38.24 38.50 7 29.70 31.72 8 36.71 37.83 9 40.70 40.17 A partir de estos resultados, se hizo posible llevar a cabo un análisis estadístico completo de los mismos. Para ello, se introdujeron los valores de eficacia de encapsulación en el Software DoE Pack y se llevaron a cabo los siguientes análisis estadísticos: - Análisis de varianza ANOVA - Análisis de medias marginales ANOM - Diagrama de Pareto - Análisis de regresión y superficies de respuesta Tabla 5. Eficacias de encapsulación de lotes elaborados a partir de la matriz ortogonal de Taguchi L9. 33 Estos estudios nos permitieron calcular la influencia de cada factor en la formulación, cuáles de ellos suponían cambios estadísticamente significativos y cuales no sobre la eficacia de encapsulación, y por tanto, en última instancia, sobre la formulación y el producto final. 4.3.1. Estudio ANOVA: Análisis de la Varianza Este estudio nos permite calcular la influencia de cada uno de los factores en la formulación, y por tanto, considerar cuál de ellos supone un cambio estadístico en la respuesta estudiada, en este caso la eficacia de encapsulación. En la figura 9 observan, nombrados con las letras A-H, los factores y los niveles de cada uno de ellos que fueron estudiados, así como todos los parámetros estudiados en el análisis; entre ellos, se destacan el porcentaje de la contribución del factor a la eficacia de encapsulación de la formulación final y los valores de cada uno de los efectos, denominados I-hat. Es importante dividir los factores en dos grupos dependiendo de su forma de ser medidos: en los cuatro primeros factores A, B, C y D se compararon dos niveles (inferior y superior), que son representados como +1 y -1. En los últimos cuatro factores E, F, G y H se compararon los valores medios de los extremos frente a los valores del nivel medio. 40 Como se puede observar en los gráficos (Figuras 5, 6 y 7), los niveles óptimos de cada factor fueron 40 mg de MF, 5 mg de NaCl y 1 lavado, con evaporación en campana a temperatura ambiente, resultados que coincidían con todos los estudios llevados a cabo anteriormente, lo que nos permitió confirmar las conclusiones y elaborar el protocolo definitivo de elaboración de microesferas de MF con estos niveles de los factores descritos. Uno de los puntos positivos del análisis de regresión, es que a partir del gráfico tridimensional puede extraerse una fórmula de regresión a la cual obedece el gráfico. Esta ecuación se obtuvo por medio del software usado hasta el momento, resultando en: EE = 24.3 + 0.312MF + 1.32NaCl – 1.46Lavados Esta fórmula de regresión nos permite comprender con exactitud el comportamiento de la formulación en términos de eficacia de encapsulación y nos permitió conocer las variables que mayor influencia ejercían sobre el proceso de elaboración de las microesferas de MF y, por tanto, mejorarlas tanto cuanto fue posible, llegando a niveles de eficacia de encapsulación muy cercanos al 50 %. Figura 14. Superficie de respuesta para el factor “Número de lavados”. 41 4.4. Caracterización de las microesferas 4.4.1. Morfología Tras llevar a cabo un estudio visual al microscopio óptico de las microesferas de MF formadas en varias de las etapas de elaboración, se pudo concluir que, tal y como se puede observar en las figuras 15 y 16, las microesferas obtenidas poseían una forma esférica, pero tamaños heterogéneos y diferentes según el lote observado. Ello puede deberse a la diferencia de proporciones en los componentes de la muestra o a la velocidad de agitación, homogeneización de las microesferas, e incluso también debido al método y tiempo de secado, pudiendo formarse microesferas de menor o mayor tamaño, aunque siempre en escala micrométrica, y conservando su forma esférica procedente de las gotículas de doble emulsión. Figura 15. Microesferas de metformina con objetivo 10x. Figura 16. Microesferas de metformina con objetivo 40x. 42 4.4.2. Calorimetría diferencial de barrido El análisis de los termogramas (Figura 17) obtenidos por DSC se basó principalmente en la búsqueda de picos endotérmicos y exotérmicos y las temperaturas a las cuales estos aparecían junto a la entalpía del proceso en el momento en el que se alcanzaron estos picos, permitiéndonos asegurar la pureza de los compuestos en el caso de las muestras de compuestos únicos, y la existencia de variaciones y aparición o desaparición de características de los compuestos por efectos térmicos en el caso de las muestras compuestas por mezclas de compuestos. En el caso de la muestra de MF, tal y como se observa en el termograma (línea azul claro en (figura 17), esta presentó un pico agudo endotérmico a una temperatura de 234 °C correspondiéndose con una entalpía del proceso de -26 J/g, coincidiendo con la fusión del principio activo, ambos parámetros que se corresponden con los datos fisicoquímicos de la MF pura. El ácido poliláctico (PLA) (en naranja) del mismo modo, mostró un pico endotérmico a una temperatura de 165 °C, y una entalpía de -11 J/g marcando su punto de fusión, parámetros que también coinciden con los datos bibliográficos del PLA, aunque existan pequeñas variaciones debido a los numerosos tipos de polilácticos por su composición y morfología variable. Figura 17. Termograma de metformina, microesferas, componentes de la formulación y mezclas de componentes. 43 En cuanto al NaCl (color gris), cabe mencionar que, al contrario que los dos compuestos anteriores, no mostró ningún pico endotérmico, debido a que el punto de fusión del NaCl es de más de 800 °C, temperatura que se encuentra fuera del rango de estudio de nuestro calorímetro. Finalmente, para terminar con el análisis de las muestras de compuestos puros, se estudió el termograma de PVA (línea amarilla), el cual presentó 2 picos endotérmicos, uno de ellos a 88 °C y el siguiente a 195 °C, que pueden deberse a la evaporación de la humedad de la muestra (el primer pico) y la fusión del PVA puro (el segundo pico). Por otro lado, en cuanto a las mezclas de los diferentes componentes de la formulación, también se llevó a cabo un análisis con el fin de determinar la posible existencia del cambio de alguna propiedad física de los materiales por efectos térmicos. Como se puede observar en el termograma (líneas verde y azul oscuro), las mezclas Metformina+PLA, independientemente de la proporción entre ellas, muestran dos picos iguales en sus gráficas, los cuales solo se diferencian en intensidad de pico, la cual sí es debida a la mayor o menor cantidad de cada componente en cada una de las mezclas. Esto nos permite concluir que no existe ninguna interacción entre los dos componentes de la formulación en estado sólido, pues los dos picos que aparecen se corresponden al mismo pico que los compuestos por separado, sin que aparezcan o desaparezcan picos adicionales en el termograma, que sí podrían indicar algún cambio en las propiedades de los elementos de la mezcla. En cuanto al termograma de las muestras de microesferas (en rojo, y ampliada), existen picos tanto endotérmicos como exotérmicos, por lo que deben existir varios cambios físicos dependientes de la temperatura con respecto a cada uno de los compuestos por separado. En primer lugar, se puede observar un pico exotérmico en torno a los 95 °C, el cual podría deberse a cambios en la morfología de las microesferas, como cristalizaciones o simplemente descomposición de las mismas. Posteriormente, también se puede observar la existencia de varios picos conjuntos cercanos al mismo rango de temperaturas, un pico endotérmico de fusión en torno a los 170 °C que se correspondería con la fusión del compuesto que anteriormente ya sufrió una cristalización, al no compartir temperatura con ningún componente puro en el estudio, o quizás se podría deber a una bajada en el punto de fusión de la metformina y fusión a 44 esa temperatura como consecuencia de una cristalización resultante de la mezcla de los productos en la formulación. 4.4.3. Microscopía en platina caliente Como se comentó previamente en el estudio, una de las utilidades de este proceso es complementar de una forma efectiva los resultados del DSC. Debido a esto, al realizar el análisis de las muestras en microscopía de platina caliente, visualmente, por desaparición de las microesferas en su totalidad, se pudo confirmar que el punto endotérmico situado a los 170 °C en el termograma de las microesferas no se correspondía con la bajada en la temperatura de fusión de la MF por condiciones de cristalización. Con el fin de confirmar el hecho de que la presencia de ciertos componentes en la fórmula podría alterar las propiedades termodinámicas de MF, se realizó un ensayo de microscopía en platina caliente esta vez de la muestra de mezcla de MF+PLA en proporciones iguales a las de la muestra de microesfera. Como se puede observar en las imágenes, la presencia de PLA no provocó que el fármaco fundiera, ya que a una temperatura de 210 °C la MF aparecía aún en estado sólido, y a 225 °C, punto de fusión de la MF pura, apareció en estado líquido, esto nos confirma que la presencia de PLA no indujo cambios termodinámicos en el principio activo. Con el fin de concretar la razón por la cual existen de este modo puntos anómalos en el termograma de la muestra de microesferas se deberían llevar a cabo estudios de mayor extensión que pudieran confirmar qué componente de la mezcla de ellos en la formulación final sería el responsable de la cristalización de la MF y, por tanto, de sus cambios en el punto de fusión. 4.5. Caracterización del hidrogel 4.5.1. Reología En nuestro estudio, se evaluó la reología del gel resultante de combinar Pluronic® F127 e hialuronato sódico. La mezcla formada por ambos geles podría modificar los parámetros de gelificación, entre otros, la temperatura, como se ha demostrado en estudios anteriores (Nascimiento et al., 2018). Debido a esto, se hizo necesario llevar a cabo un estudio en mayor profundidad de las características reológicas de los componentes del hidrogel final por separado, del hidrogel compuesto por la mezcla de 45 sus componentes, y del hidrogel final junto a las micropartículas como producto final de la formulación. Aunque hoy en día se están explorando otras propiedades fisicoquímicas para caracterizar el rendimiento potencial de los geles (Fagien et al., 2019), el método elegido para llevar a cabo el estudio reológico de cada uno de estos geles fue el cálculo de la intersección entre el módulo de almacenamiento (G’) y el módulo d pérdida (G’’) de forma que gráficamente pudiera encontrarse la temperatura en la cual ambos módulos se cruzasen, temperatura a la cual se cumpliría la relación matemática en la cual la tangente entre ambos módulos se iguala a 1, punto en el cual se establece la temperatura de gelificación. En la figura 18a se puede observar que no existe ningún punto de corte o entrecruzamiento entre los módulos de almacenamiento y pérdida; esto es debido a que, en este caso, el gel está formado únicamente por Pluronic y agua, y la concentración del mismo es tan baja (17 % p/v) que se hace realmente imposible para el hidrogel llegar al punto de gelificación, aunque la temperatura aumente considerablemente, algo que concuerda con los datos que aporta la bibliografía ya que ciertos autores sostienen que la concentración de polímero tiene un efecto positivo sobre la viscosidad, lo que indica que a mayor concentración de polímero, mayor será la viscosidad (Fernández-Romero et al., 2021). La estructura del pluronic en agua es de tipo micelar, por lo que se necesitan concentraciones relativamente altas para que las micelas se entrecrucen en la solución acuosa hasta llegar a formar enlaces lo suficientemente fuerte como para gelificar. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la temperatura es un factor determinante para la gelificación del Pluronic, siempre que la concentración sea adecuada, está reconocido por diversos autores (Brown et al., 1992) que las soluciones acuosas de Pluronic experimentan una transición de solución a gel medida que aumenta la 46 temperatura, algo de gran importancia para la encapsulación de fármacos (Moon et al., 2012). Figura 18. Módulos de almacenamiento y pérdida de: A) Pluronic + agua. B) Pluronic + HA + agua. C) Pluronic + HA + agua + microesferas. En la figura 18b, como se puede apreciar, sí existe un cambio en el sistema, debido a un cruce entre los módulos de almacenamiento y pérdida a una temperatura realmente baja, aproximadamente en torno a los 16 °C. Como se puede comprobar, este gel actuaba de forma contraria a lo esperado de forma que, a medida que la temperatura aumentaba, los módulos G’ y G’’ se separaron progresivamente, lo que nos permitió concluir que la unión de estos geles resultaba en un tipo de gel cuya tangente se igualaría a 1 a temperaturas muy bajas, es decir, la temperatura de gelificación no se alcanza a valores de temperatura cercanos a la fisiológica, lo que podría suponer problemas en la administración como sistema de liberación sostenida en la cavidad bucal. Estos cambios 47 pueden deberse a la gran variabilidad de las propiedades reológicas y químicas de geles de ácido hialurónico, que han sido descritas en estudios anteriores (Fagien et al., 2019) sosteniendo que la reología del gel de hialurónico viene determinada por múltiples factores, incluyendo reacciones de reticulación en gran medida, además del peso molecular del sustrato del ácido hialurónico, la concentración del mismo, y el proceso utilizado para fragmentar el polímero. En la figura 18c también se puede apreciar que la combinación de Pluronic y HA junto con las micropartículas dan como resultado un tipo de gel muy viscoso y que no alcanza el punto de gelificación ya que no se produce entrecruzamiento de los módulos G’ y G’’ en ninguno de los puntos del rango de temperaturas estimadas en el estudio. En la bibliografía (Nascimiento et al., 2018) se menciona que la incorporación de hialuronato no modifica la temperatura de gelificación para todos los geles, pero en el caso de Pluronic F127 se observaron temperaturas de gelificación significativamente menores que para el hidrogel de Pluronic puro. Siendo, por tanto, en este caso mayor aún la dificultad para alcanzar la gelificación del hidrogel se sospechaba de algunas interacciones entre los componentes de las microesferas con el hidrogel, impidiendo su gelificación. Acorde a nuestras sospechas de ciertas interacciones entre las microesferas y el hidrogel, la literatura mostró que al igual que existe un aumento en los valores de viscosidad en estas formulaciones, también existen un aumento de la temperatura de gelificación tras la adición de fármacos (Nacimiento et al., 2018), como ocurre en nuestro caso. 4.5.2. pH La solución de Pluronic poseía un pH de 6–7, mientras que el Hialuronato Sódico tenía un pH de 7. Lógicamente, la adición de hialuronato de sodio aumentará el pH, aunque este aumento sea mínimo, algo que concordaba con la bibliografía consultada (Fernández-Romero et al., 2021) Una vez se formó el hidrogel como producto final se realizaron varias mediciones de pH las cuales resultaron en un pH medio de 6.8, algo que cobra sentido cuando atendemos a los valores de cada componente del gel y sus proporciones, 80 % en el caso de Pluronic y 20 % en el caso de Hialuronato Sódico. 48 4.5.3. Mucoadhesividad Con el fin de calcular el tiempo de retención del hidrogel formado por la combinación Pluronic + HA, se llevó a cabo el método descrito en la bibliografía, cronometrando el tiempo que tardaba 1 g de gel en fluir desde el centro de la placa de Petri con agar/mucina hasta el extremo de la placa, teniendo en cuenta que existía un flujo continuo por goteo de saliva artificial a 37 °C sobre el gel. Debido a este último parámetro descrito, se explicarían los resultados de la mucoadhesividad de este hidrogel, la cual fue realmente baja en términos de tiempo de retención, no llegando a concluirse 5 min desde el inicio del ensayo cuando el hidrogel coloreado había desaparecido prácticamente de la placa de Petri al encontrarse en un estado de gran fluidez y siendo arrastrado sin dificultad por la saliva artificial. Como se ha comentado, algo a tener en cuenta para este ensayo es que la temperatura de gelificación de la mezcla Pluronic + HA + Agua es realmente baja, y fue suficiente con dejar el hidrogel a temperatura ambiente para que este perdiera en gran parte su consistencia de gel y sus propiedades mucoadhesivas, algo que sin duda fue agravado por la temperatura fisiológica a la que era goteada la saliva artificial. 4.5.4. Tiempo de gelificación De la misma forma que en el ensayo anterior, las propiedades de gelificación de la mezcla Pluronic + HA + Agua, actuaron en gran medida como factor predisponente para el ensayo del tiempo de gelificación de este hidrogel. A pesar de las propiedades termodinámicas del gel Pluronic puro, el cual sufre una gelificación a temperatura y pH casi fisiológicos (Wen et al., 2020) (siempre que este mismo se encuentre a concentración adecuada), las propiedades gelificantes de la mezcla distaban mucho de las de sus componentes por separado. En este ensayo se introdujeron los viales con hidrogel en blanco, hidrogel con microesferas e hidrogel con MF, resultando en todos ellos que a 37 °C a los que se encontraba el baño termostatizado, los hidrogeles se hicieron más viscosos, aumentándose por tanto en gran medida el tiempo de gelificación, tanto que podría considerarse infinito, o gelificación prácticamente nula. Es decir, debido a la mezcla de geles en la formulación el resultado de este ensayo fue justo el contrario al esperado, planteándose así la cuestión de si este hidrogel debería utilizarse para administración 49 en la mucosa bucal con estas características, o si por el contrario debería cambiarse la composición, o en su defecto la concentración de sus componentes para conseguir una gelificación más eficaz a temperaturas fisiológicas. 4.6. Estudio de permeación in vitro Con el fin de conocer la velocidad de liberación del principio activo desde la formulación final hasta su punto de acción, y su capacidad para atravesar membranas, como ocurriría en el cuerpo humano con la mucosa bucal, se diseñó el estudio de permeación en el cual se consiguió una aproximación bastante acertada de lo que ocurre fisiológicamente, a partir del uso de celdas de difusión de Franz, midiendo el paso o liberación del fármaco a través de una membrana artificial in vitro. Tras recoger cada una de las muestras de tampón de la celda aceptora del instrumento, se llevaron al HPLC obteniéndose los resultados de área a distintos tiempos dependiendo de la concentración de cada muestra. A partir de estos datos se elaboraron distintas gráficas para representar la liberación de la metformina a lo largo del tiempo de cada fórmula, permitiéndonos así comparar la liberación de la metformina en solución, la metformina en el hidrogel y la metformina en microesferas dispersas en el hidrogel. En la figura 19 podemos observar la comparativa en los perfiles de liberación de la metformina en gel y en solución. Figura 19. Perfiles de liberación de metformina en gel y en solución. 56 • Viollet B, Guigas B, Sanz Garcia N, Leclerc J, Foretz M, Andreelli F. Cellular and molecular mechanisms of metformin: an overview. Clin Sci (Lond). 2012; 122(6): 253-270. • Wang S, Xia Y, Ma T, Weir M, Ren K, Reynolds MA, et al. Novel metformin-con- taining resin promotes odontogenic differentiation and mineral synthesis of dental pulp stem cells. Drug Deliv Transl Res. 2019; 9(1): 85-96. • Wen Q, Zhang Y, Luo J, Xiong K, Lu Y, Wu Z, et al. Therapeutic efficacy of thermosensitive Pluronic hydrogel for codelivery of resveratrol microspheres and cisplatin in the treatment of liver cancer ascites. Int J Pharm. 2020; 582: 119334. • Ye M, Kim S, Park K. Issues in long-term protein delivery using biodegradable microparticles. J Control Release. 2010; 146(2): 241-260. • Zheng L, Li C, Huang X, Lin W, Yang F, Chen T. Thermosensitive hydrogels for sustained-release of sorafenib and selenium nanoparticles for localized synergistic chemoradiotherapy. Biomaterials. 2019; 216: 119220. • Zhou G, Myers R, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, et al. Role of AMP- activated protein kinase in mechanism of metformin action. J Clin Invest. 2001; 108(8): 1167-1174. 57 7. ANEXO 1 -Tabla 1: Área Repetición 1 27033202 Repetición 2 27354641 Repetición 3 26929175 Repetición 4 27267964 Repetición 5 27318576 Repetición 6 26650991 -Tabla 2: MUESTRA ÁREA Solución NaCl Repetición 1 0 Solución NaCl Repetición 2 0 Solución PVA Repetición 1 0 Solución PVA Repetición 2 0 Solución PLA Repetición 1 0 Solución PLA Repetición 2 0 Solución Span 80 Repetición 1 0 Solución Span 80 Repetición 2 0 Tabla 1. Repeticiones de medidas de área en HPLC. System suitability. Tabla 2. Medidas de área de ensayo de especificidad o selectividad en HPLC de los distintos componentes de la formulación. 58 -Tabla 3: Muestra Concentración Estándar Metformina 0.1 mg/mL 12463500 Degradación Ácida 12837310 Degradación Básica 12223369 Degradación oxidativa 12928893 Degradación solar 12232351 Degradación UV 11882974 Tabla 3. Comparativa de áreas en HPLC entre muestra de metformina estándar, y muestras bajo condiciones de degradación forzada. 59 -Tabla 4: Niveles Muestra Área 50% 0.1mg/mL Repetición 1 13977774 0.1mg/mL Repetición 2 13691793 0.1mg/mL Repetición 3 14182873 75% 0.15mg/mL Repetición 1 19132178 0.15mg/mL Repetición 2 20961900 0.15mg/mL Repetición 3 20245254 100% 0.2mg/mL Repetición 1 27481874 0.2mg/mL Repetición 2 27765444 0.2mg/mL Repetición 3 27181539 125% 0.25mg/mL Repetición 1 33420830 0.25mg/mL Repetición 2 34300196 0.25mg/mL Repetición 3 33860513 150% 0.3mg/mL Repetición 1 40969088 0.3mg/mL Repetición 2 40084023 0.3mg/mL Repetición 3 41314518 Tabla 4. Medidas de área en HPLC. Cálculo de linealidad a partir de distintas concentraciones de muestra en varios niveles. 60 -Tabla 5: Niveles Muestra Área 0.5% 0.001 mg/mL Repetición 1 123244 0.001 mg/mL Repetición 2 125606 0.001 mg/mL Repetición 3 121367 0.75% 0.0015 mg/mL Repetición 1 209803 0.0015 mg/mL Repetición 2 202324 0.0015 mg/mL Repetición 3 205924 1% 0.002 mg/mL Repetición 1 264782 0.002 mg/mL Repetición 2 268846 0.002 mg/mL Repetición 3 263084 1.25% 0.0025 mg/mL Repetición 1 342528 0.0025 mg/mL Repetición 2 334312 0.0025 mg/mL Repetición 3 332014 1.50% 0.003 mg/mL Repetición 1 401018 0.003 mg/mL Repetición 2 429655 0.003 mg/mL Repetición 3 409658 Tabla 5. Medidas de área en HPLC. Cálculo de linealidad baja a partir de distintas concentraciones de muestra en varios niveles. 61 -Tabla 6: Estándar 0.2mg/mL Área Repetición 1 27404968 Repetición 2 27337588 Repetición 3 27304312 Repetición 4 27630869 Repetición 5 27110236 Repetición 6 27340482 Repetición 7 27302209 Repetición 8 27804728 Repetición 9 27349307 Repetición 10 27028040 Media 27361274 Desviación Estándar 224395 % RSD 0,82 -Tabla 7: Niveles Repetición Concentración Área Media Desviación %RSD 50% 1 0.1 mg/mL 13066566 12981104 93276 0.72 2 0.1 mg/mL 12995142 3 0.1 mg/mL 12881605 100% 1 0.2 mg/mL 26901213 266447402 420733 1.57 2 0.2 mg/mL 26879247 3 0.2 mg/mL 26161747 150% 1 0.3 mg/mL 37759704 37061398 1250791 3.3 2 0.3 mg/mL 37807122 3 0.3 mg/mL 35617368 Media %RSD 1.86 Tabla 6. Medidas de área en HPLC de una misma muestra pinchada diez veces Tabla 7. Medidas de área en HPLC de muestras de estándar de metformina a distintos niveles por triplicado. 62 -Tabla 8: Estándar Metformina 1 Día 1 Día 2 Analista 1 29644401 29862107 Analista 2 29509833 29583142 Media 29649871 Desviación estándar 151808 %RSD 0.51 -Tabla 9: Estándar Metformina 2 Día 1 Día 2 Analista 1 25820961 25927113 Analista 2 25601425 25624266 Media 25743441 Desviación Estándar 157179 %RSD 0.61 Tabla 8. Comparación de medidas de estándares de metformina entre diferentes analistas, diferentes días y diferentes muestras Tabla 9. Comparación de medidas de estándares de metformina entre diferentes analistas, diferentes días y diferentes muestras 63 -Tabla 10: Niveles Repetición Concentración Área Factor de respuesta 1% 1 0.002 mg/mL 263084 131542000 2 0.002 mg/mL 268846 134423000 3 0.002 mg/mL 264782 132391000 * 0.75% 1 0.0015 mg/mL 205924 137282666,7 2 0.0015 mg/mL 202324 134882666,7 3 0.0015 mg/mL 209803 139868666,7 0.5% 1 0.001 mg/mL 121367 121367000 2 0.001 mg/mL 125606 125606000 3 0.001 mg/mL 143244 143244000 0.25% 1 0.0005 mg/mL 0 0 2 0.0005 mg/mL 0 0 3 0.0005 mg/mL 0 0 Media 133400777 Desviación Estándar 6773825 % RSD 5 Tabla 10. Resultados de áreas en cálculo de límites de cuantificación en HPLC. 64 - Tabla 11: Concentración (mg/mL) Área Factor de Respuesta Media Desviación %RSD 0.1 13977774 139777740 139508133,3 2466476,23 1,76 0.1 13691793 136917930 0.1 14182873 141828730 0.15 19132178 127547853,3 133865182,2 5844356,99 4,36 0.15 20861900 139079333,3 0.15 20245254 134968360 0.2 27481874 137409370 137381428,3 1459963,05 1,06 0.2 27765444 138827220 0.2 27181539 135907695 0.25 33420830 133683320 135442052 1758732 1,29 0.25 34300196 137200784 0.25 33860513 135442052 0.3 40969088 136563626,7 135964032,2 2115542,08 1,55 0.3 40084023 133613410 0.3 41314518 137715060 Media %RSD 2% Tabla 11. Cálculo de %RSD total. Evaluación del Test de la Pendiente para la Linealidad. 65 -Tabla 12: Concentración (mg/mL) Área Factor de Respuesta Media Desviación %RSD 0,001 123244 123244000 123405666,7 2124119,19 1,72 0,001 125606 125606000 0,001 121367 121367000 0,0015 209803 139868666,7 137344666,7 2493578,152 1,81 0,0015 202324 134882666,7 0,0015 205924 137282666,7 0,002 264782 132391000 132785333,3 1480427,078 1,11 0,002 268846 134423000 0,002 263084 131542000 0,0025 342528 137011200 134513866,7 2211048,958 1,64 0,0025 334312 133724800 0,0025 332014 132805600 0,003 401018 133672666,7 137814555,6 4896346,669 3,55 0,003 429655 143218333,3 0,003 409658 136552666,7 Media %RSD 1,64% Tabla 12. Cálculo de %RSD total. Evaluación del Test de la Pendiente para la Linealidad Baja.