Métodos high-throughput para la síntesis de nuevos fármacos

MÉTODOS HIGH-THROUGHPUT PARA LA SÍNTESIS DE NUEVOS FÁRMACOS UNIVERSIDAD DE SEVILLA - FACULTAD DE FARMACIA – María Luz Martín Alonso MÉTODOS HIGH-THROUGHPUT PARA LA SÍNTESIS DE NUEVOS FÁRMACOS. TRABAJO DE FIN DE GRADO. AUTORA: MARÍA LUZ MARTÍN ALONSO Grado en Farmacia. Facultad de Farmacia Departamento de Química Inorgánica Universidad de Sevilla Tipología del trabajo: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tutor: Luis Bobadilla Baladrón Cotutora: Laura López Santos Sevilla, 5 de Septiembre de 2020 1 ÍNDICE. 1. RESUMEN 3 2. INTRODUCCIÓN 5 3. OBJETIVOS DE LA REVISIÓN 8 4. METODOLOGÍA 8 5. DESARROLLO Y DISCUSIÓN 10 5.1. TÉCNICAS DE DESARROLLO Y DISEÑO DE FÁRMACOS 10 5.2. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA HIGH-THROUGHPUT SCREENING 13 5.2.1. SÍNTESIS EN FASE SÓLIDA 13 5.2.2. VENTAJAS DE LA SÍNTESIS EN FASE SÓLIDA 13 5.2.3. ETAPAS DEL ENSAYO HTS 14 5.2.4. CRIBADO VIRTUAL 15 5.3. ETAPAS DEL DESARROLLO DE FÁRMACOS 16 5.3.1. IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA DIANA 17 5.3.2. ESTUDIOS PRECLÍNICOS 19 5.3.3. FASE CLÍNICA 20 5.4. ANALISIS DE PARÁMETROS ESTADÍSTICOS DEL MÉTODO HIGH THROUGHPUT SCREENING 23 5.5. EMPLEO DE MÉTODOS HIGH THROUGHPUT PARA COMBATIR ENFERMEDADES COMO LAS PRODUCIDAD POR TRIPANOSOMA CRUZY Y HCMV 25 5.6. INFLUENCIA DE LAS TÉCNICAS BIOFÍSICAS EN EL DESARROLLO DE FÁRMACOS MEDIANTE HTS 27 2 5.7. LIMITACIONES DEL ENSAYO HIGH THROUGHPUT SCREENING 29 5.8. ACTUALIDAD 30 6. CONCLUSIONES 32 7. REFERENCIAS 33 3 RESUMEN Gracias al uso de métodos de alto rendimiento (High-throughput), se ha conseguido potenciar el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos. En este dificultoso camino, el método de cribado de alto rendimiento HTS (High-Throughput screening) resulta ser un paso determinante aunque bastante costoso. Se expone una colección de un elevado número de compuestos con actividades biológicas diferentes frente a una diana terapéutica concreta y se obtienen rápidamente los compuestos que poseen la actividad buscada, adecuados para interaccionar con el target. Asimismo, es de gran interés conocer en profundidad las etapas que forman parte del proceso de desarrollo y diseño de un fármaco. Así como también las distintas aplicaciones que presenta la metodología de alto rendimiento combinada con la química y medicina para abordar de forma exitosa los obstáculos que se presentan a la hora de encontrar nuevos medicamentos. En consecuencia, este Trabajo de Fin de Grado recaba los conceptos necesarios para entender cómo se aborda el proceso de obtención de un fármaco. Se muestra una breve historia de la química y medicina, hasta llegar a lo que hoy se conoce como química combinatoria. Entender la importancia de esta rama de la química y las aplicaciones y características de métodos como HTS a la hora de desarrollar un fármaco, es otro de los puntos que se explican en este trabajo. Palabras claves: diseño de fármacos, HTS (High-throughput synthesis), química combinatoria, diana terapéutica. ABSTRACT The application of high-throughput synthesis methods in, drug discovery and development process has been emerged in the last three decades. In spite of their expensive cost, the utilization of this technique has become a decisive step Using this difficult process, the high-throughput screening (HTS) method turns out to be a decisive step. For collecting a large number of compounds with different biological activities which are exposed against a specific therapeutic target. The compounds with the desired activity, suitable to interact with the target, are more rapidly obtained by using 4 this method. It is also of great interest to know in depth the stages that are part of the process of development and design of a drug. As well as the different applications presented by the high-performance methodology, it is combined with chemistry and medicine to successfully address the obstacles that arise when finding new drugs. Consequently, this degree project provides the fundamental concepts to understand the drug productions processes. Furthermore, a brief history of chemistry and medicine is hown, introducing the concept of combinatorial chemistry. Understanding the importance of this branch of chemistry and the applications and characteristics of methods such as HTS when developing a drug is another of the points explained in this work. Keywords: drug design, HTS, combinatorial chemistry, therapeutic target. 5 INTRODUCCIÓN El ser humano ha usado sus habilidades desde tiempos inmemoriales para satisfacer todas sus necesidades básicas nutricionales y para remediar cualquier problema de salud. El concepto de enfermedad se remonta al año 2800 a.C y su aparición se asociaba con hostiles castigos de los dioses. Siempre se han buscado alternativas en la naturaleza para tratar las enfermedades y es en este caso donde juegan un papel fundamental las plantas medicinales. Los egipcios extraían de las plantas el aceite de ricino, que era usado como purgante y también como combustible para las lámparas. Esta civilización tenía grandes conocimientos sobre plantas y anatomía, y usaban todo tipo de productos para curar heridas o mejorar el sueño. Estos conocimientos quedaron reflejados en los papiros que elaboraban y gracias a los cuales tenemos constancia en la actualidad. Cabe destacar el “Papiro de Ebers” que se remonta alrededor del 1.500 a.C y contiene 110 páginas que incluyen 877 recetas y menciona en torno a 700 drogas (Fernández de Ramón, Criado, 2017). La medicina griega estaba fascinada por el concepto de veneno y todo lo que este incluía, es la ciencia que hoy se conoce como Toxicología. De hecho, el primer texto conocido sobre Toxicología fue descrito por Platón, donde queda plasmado el suicidio de Sócrates tras ingerir zumos que contenían cicuta y opio (Rubira, 2008). Cada civilización contemplaba la medicina de una manera diferente, ya que eran culturas muy distintas, pero en la mayoría la magia y los conjuros formaban parte del tratamiento de cualquier dolor o enfermedad. Fue con Hipócrates, conocido como “El Padre de la Medicina”, con quien la medicina paso a ser una ciencia. Dando un salto considerable en el tiempo, es en el siglo XIX cuando aparece la Química Orgánica. Fue introducida por Jons Jacob Berzelius, en 1807, para estudiar los compuestos derivados de recursos naturales. Anterior a esto, todos los medicamentos procedían de la naturaleza pero con este importante avance se consiguió diferenciar el concepto de droga, del nuevo concepto llamado principio activo, entendido como la sustancia química contenida en la droga y responsable de su acción (Marín NL, Fernández R). El desarrollo de la química como ciencia revolucionó la medicina y gracias 6 al alto nivel de integración de ambas ciencias, cada vez se obtienen más avances y los fármacos son más específicos, eficaces y producen menos efectos adversos. A día de hoy, la naturaleza sigue siendo una fuente importante de obtención de nuevos agentes terapéuticos, e incluso se conoce y se ha estudiado una ínfima parte de los ecosistemas naturales. Pero es igualmente necesaria la obtención de compuestos de la naturaleza, como la conservación de esta para mantener unas condiciones de vida adecuadas para el ser humano. La forma más óptima es conseguir un equilibrio entre ambas premisas, es decir poner en funcionamiento la naturaleza de forma controlada y responsable a favor de mejorar la calidad de la salud humana (Chivian, Bernstein, 2015). La química aplicada a la terapéutica es lo que se conoce como química farmacéutica, mezcla de medicina, farmacología y la química llevada a cabo en laboratorios en los cuales, siempre, se ha intentado obtener fármacos inspirados en los principios activos naturales. Gracias a la aparición de la química combinatoria se pueden sintetizar de forma simultánea cientos de miles de compuestos, lo cual reduce claramente el tiempo empleado en esta tarea y además lo hace a un costo asequible. Concretamente, se ha demostrado que se pueden sintetizar entre 1.000-10.000 compuestos, todos ellos relacionados (congéneres), los cuales quedan registrados en bibliotecas combinatorias. A esta tecnología se han unido métodos de alto rendimiento (High-throughput), cambiando de forma notable el panorama de la síntesis de fármacos. Este método se basa en el uso de ordenadores y robots para analizar miles de compuestos de forma simultánea. Destacan entre estos métodos el cribado de alto rendimiento cuyas siglas en inglés son HTS (Marín NL, Fernández R). El número total de productos obtenidos mediante química combinatoria es igual al número de posibilidades de cada reactivo, elevado al número de reactivos de la reacción (Molina I, 2019). Como se observa en el esquema 1, si en lugar de combinar el reactivo 1 con el reactivo 2 para obtener el producto indicado (química convencional), se hacen reaccionar 50 reactivos del tipo 1 y 20 reactivos del tipo 2 y que se combinen, el resultado es la obtención de 1.000 productos diferentes. A este conjunto de compuestos obtenidos, se le conoce como colección combinatoria (Fullana, 2017). 13 5.2. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA HIGH THROUGHPUT SCREENING: 5.2.1. SÍNTESIS EN FASE SÓLIDA: Los compuestos empleados para HTS proceden de las bibliotecas de química combinatoria, los cuales se sintetizan mediante química en fase sólida o en solución (Eldridge et al., 2002). Normalmente, es más usada la fase sólida por el simple hecho de que aporta más ventajas que con la otra técnica. Se llama así porque presenta como elemento principal lo que se conoce como un soporte sólido polimérico e insoluble, al cual se van uniendo productos para llevar a cabo la síntesis. Este proceso evita la necesitad de aislamiento y purificación de los intermedios de síntesis, la purificación se lleva a cabo dando exhaustivos lavados al soporte para eliminar los restos de reactivo (Fullana, 2017). Figura 3. Esquema general de síntesis en fase sólida (Kennedy et al., 2008) Fue en la década de 1960 cuando el científico Merrifield llevó a cabo la síntesis de una enzima, ribonucleasa pancreática bovina A, a partir de la síntesis en fase sólida. Recibió el Premio Nobel por ello, ya que demostró un método rápido, simple y práctico de sintetizar proteínas y péptidos y que actualmente se aplica a la síntesis de gran cantidad de compuestos debido a los buenos resultados obtenidos (Sierra, 2017). 5.2.2. VENTAJAS DE LA SÍNTESIS EN FASE SÓLIDA: La síntesis en fase sólida de compuestos, es considerada una disciplina idónea para el desarrollo de moléculas potencialmente activas. Esto es consecuencia de las múltiples ventajas que presenta, entre las que se pueden destacar: el fácil manejo del proceso y sencillez, ya que solo consta de tres pasos (adición al soporte, filtración y lavado del 14 soporte). Se pueden utilizar reactivos en exceso y luego ser reciclados. La única purificación necesaria es un lavado de la resina; sólo el producto final de la síntesis necesita ser purificado. Al estar la molécula unida a la resina, en el caso de que sea tóxica, es más segura su manipulación. Presenta secuencias de reacción sencillas de automatizar debido a la sencillez del proceso (Furlán, Mata, 2012; Albericio et al., 2004). 5.2.3. ETAPAS DEL ENSAYO HTS: -VALIDAR DIANA: Uno de los requisitos fundamentales para realizar un correcto ensayo de HTS, es conocer todo lo posible la diana terapéutica, de este modo se selecciona de manera adecuada la tecnología a utilizar y las características adecuadas para conseguir ensayos con robustez. Cuando el primer objetivo está cumplido, se procede a diseñar el ensayo en el laboratorio (González, Sanz, 2013). Una vez conseguido todo lo anterior, se genera un documento llamado AESOP (Assay Electronic Source of Protocols), en este documento se recoge de forma detallada información como la diana, área terapéutica en la que está involucrada, reactivos, volúmenes, tiempo de incubación, etc. Es fundamental contar con una placa de microtitulación para poder realizar el ensayo HTS. Se trata de un recipiente de plástico, que contiene pequeños agujeros llamados “pocillos”, los cuales son usados como pequeños tubos de ensayo, donde se depositan de uno a cinco compuestos por pocillo (Real Academia de Ingeniería). -SET UP O PUESTA PUNTO DEL ENSAYO A GRAN ESCALA: Todos los ensayos y estudios llevados a cabo hasta ahora, han sido en el laboratorio y a pequeña escala. En la fase que nos concierne, lo que se lleva a cabo es una adaptación y optimización de estos ensayos antes realizados a gran escala. Esto es posible gracias al uso de plataformas robotizadas. Además, se usan diferentes parámetros estadísticos para controlar que el proceso se realice con una capacidad alta y un coste bajo. Gracias a las herramientas informáticas existentes se analizan los datos estadísticamente y se consigue apreciar con claridad los resultados, sabiendo así si el ensayo es capaz de identificar hits con precisión (Arranz, Sanz, 2014; Bejarano, 2013) 15 Los hits son moléculas que presentan actividad biológica capaces de servir de base para el desarrollo de nuevos fármacos. Cuando estos se han identificado, lo siguiente es seleccionar compuestos que presenten propiedades farmacéuticas de interés, entre las que se incluyen baja toxicidad, adecuada solubilidad, buena estabilidad. Los compuestos obtenidos de esta segunda selección son llamados «líderes o cabezas de serie». Normalmente, los hits son encontrados por tamizaje de una gran cantidad de moléculas, mientras que los compuestos líderes se consiguen a través de modificaciones químicas de los hits (Saldívar-González et al., 2017) Figura 4. Proceso de descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos (Modificada. Peláez, 2011) 5.2.4. CRIBADO VIRTUAL: El Cribado Virtual (vHTS) consiste en un filtrado computacional (in silico) dirigido a seleccionar candidatos que presenten la actividad deseada sobre una diana terapéutica concreta, a partir de moléculas sintéticamente accesibles depositadas en bases de datos. Combina varios métodos computacionales para la selección de los candidatos a fármacos, todo ello lo lleva a cabo a través de diversos filtros, los cuales se van aplicando de forma secuencial en función del nivel de requerimientos computacionales que utiliza cada método y la complejidad de la información necesaria para ellos (Skiba, 2005). 16 Este método ya se encuentra sustituyendo al tradicional (HTS), sobretodo porque permite identificar compuestos hits en un menor tiempo y con menos recursos disponibles. Las tasas de aciertos de vHTS son hasta 10 veces superiores a las técnicas empíricas de cribado (Pérez-Sánchez et al., 2015). Para realizar la técnica vHTS, hay que realizar una búsqueda en quimiotecas virtuales aquellos compuestos que sean activos frente a nuestra diana terapéutica. El cribado virtual se lleva a cabo mediante cálculos de docking y se filtran en tres niveles diferentes, según la especificidad y en función del score que tengan, aquellos compuestos que interaccionen con el centro activo de la diana. Las categorías se muestran de menor a mayor especificidad del compuesto con la diana, estas categorías serían: ‘general’ (compuestos válidos para un amplio grupo de proteínas), ‘enfocado’ (para un grupo concreto de proteínas relacionadas entre sí) y ‘dirigido’ (para una diana específica). De los únicos inconvenientes que presenta el método vHTS es que elabora una amplia lista de compuestos sin tener en cuenta factores como la tautomería o los estados de ionización en distintos medios (Borroto OM, Hernández Y, García JM et al., 2013). Las novedosas técnicas de síntesis combinatoria y los métodos High-throughput screening, aunque han agilizado el proceso de diseño de fármacos de manera exponencial, siguen siendo procesos que consumen mucho tiempo y materiales empleados; vHTS además de ser más novedosa, es una técnica mejorada que permite predecir la afinidad de una gran cantidad de compuestos, organizados en bibliotecas virtuales, con el blanco terapéutico de interés y empleando menos recursos. Desde una perspectiva más general, la química computacional ha conseguido no solo predecir la afinidad de un compuesto frente a una diana terapéutica, sino también una optimización de las propiedades farmacocinéticas (ADME) (Albadalejo, 2014). 5.3. ETAPAS DEL DESARROLLO DE FÁRMACOS: El proceso de desarrollo y descubrimiento de fármacos, no es un proceso estático, ha ido evolucionando a lo largo del tiempo (Peláez, 2011). Hay muchas etapas en la investigación y desarrollo de un fármaco, en las que se trata de demostrar la eficacia y seguridad, para que este pueda ser recetado con un uso clínico. Los ensayos clínicos son necesarios para entender cómo actúa el compuesto frente a una patología dada. El 17 proceso de producción de moléculas exitosas, a las que llamarán hits, destinadas a subsanar una necesidad clínica concreta consta entonces de estas diferentes etapas según la FDA (Food and Drug Administration)4 (Marovac, 2001). Tabla 1. Proceso completo del desarrollo de un fármaco (Portal del Medicamento) 5.3.1. IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA DIANA: Mayoritariamente suele ser una proteína involucrada en algún proceso patológico. Es una de las premisas más importantes para llevar a cabo el proceso de obtención de un fármaco ya que no se puede conseguir ningún fármaco que sea eficaz sin saber dónde tiene que ejercer su acción, de ahí que el primer paso se base en la determinación de la diana terapéutica (San Román, 2013). Como ejemplo se muestra el siguiente: la trombina es una enzima fisiológica que actúa sobre el fibrinógeno dando lugar a la formación de fibrina, ayudando así a la coagulación de la sangre. Los NACOs (Nuevos Anticoagulantes Orales) actúan inhibiendo a esa enzima para evitar así la coagulación sanguínea (Oyonarte M, 2015). Queda claro entonces que la diana en la que el fármaco debe ejercer su acción farmacológica es la trombina. 18 Una vez identificada, debe ser validada, demostrando así el papel determinante que tiene en la patología. La validación requiere que se lleven a cabo experimentos in vivo e in vitro. Las dianas más estudiadas en HTS han sido: GPCR, Canales iónicos, Receptores nucleares y Proteinquinasas (González I, Sanz A, 2013). Cabe destacar, que en muchas ocasiones el efecto clínico es responsabilidad de la interacción de un fármaco con más de una diana terapéutica. Surge así el concepto de polifarmacología. En este caso, el diseño del fármaco debería ir enfocado simultáneamente a varios blancos terapéuticos (Saldívar-González et al., 2019). Posiblemente aún queden por estudiar posibles miles de dianas farmacológicas (Ritter J, Flower R, Henderson G et al., 2020). Figura 5. Representación tridimensional de SFRP1, nueva diana terapéutica para tratar el Alzheimer. (Carrasco-Rubio et al., 2019) Una vez identificado el objetivo terapéutico, se lleva a cabo un tamizaje (screening) de millones de sustancias para poder seleccionar las que tengan la acción deseada. Es aquí donde actúan las técnicas de alto rendimiento, permitiendo encontrar la molécula activa y adecuada para combatir un microorganismo o bloquear, inhibir o activar alguna enzima del organismo. Se utilizan como herramientas sistemas robóticos y automatizados y se cuenta con las bibliotecas de compuestos químicos (Banerjee P, Rosfsky M, 1997). Estos compuestos pueden obtenerse de la naturaleza ya que se consiguen de las plantas o lo producen determinados microorganismos, como ocurrió con el gran descubrimiento de la penicilina que es un antibiótico (San Román, 2013). Aunque los compuestos también pueden ser creados en laboratorios a partir de técnicas como la química combinatoria de alta velocidad, genómica, diseño racional de moléculas. Pueden ser visualizados y modificados tridimensionalmente en pantallas 19 computacionales. Se tiene como ejemplo a la insulina recombinante, que fue el primer fármaco obtenido mediante ingeniería genética, seguido de la hormona del crecimiento. Una vez que se selecciona el compuesto, se procede a comprobar si es seguro y efectivo como futuro medicamento, este proceso es conocido como la validación del compuesto leader, e incluyen ensayos in vivo, dentro de un organismo vivo, en animales, e in vitro, llevados a cabo en el laboratorio y fuera de un organismo vivo. Una vez conseguido todo esto, se da un salto a la siguiente etapa del descubrimiento de un fármaco, etapa conocida como los estudios preclínicos (Marovac, 2001). Figura 6. Abordaje biológico y químico en el desarrollo de un nuevo fármaco (Modificada. Patel, 2006). 5.3.2. ESTUDIOS PRECLÍNICOS: A continuación, antes de que el compuesto escogido sea probado en humanos se ensaya detalladamente en animales y modelos fisiológicos en el laboratorio para establecer un primer perfil de seguridad y eficacia. Se analizan las propiedades fisicoquímicas del candidato a fármaco, utilizando modelos informáticos y pruebas de laboratorio. Lo que se pretende determinar con estas pruebas es el grado de absorción y cómo se distribuye, elimina o metaboliza en el organismo (Herrera, Ruíz, 2013). Se llevan a cabo también, 20 estudios de toxicidad aguda y crónica, los efectos que tiene en la reproducción y progenie. Las moléculas en esta etapa del proceso deben ser ensayadas en varias especies de animales, debido a que posiblemente afecten a cada especie de manera distinta (Marovac, 2001). Si los estudios resultan ser esperanzadores, se solicita la patente del compuesto. Además, se solicita un permiso a la FDA en EEUU (Estados Unidos) o a EMEA (Agencia Europea de Medicamentos). Este permiso llamado IND (investigational New Drug Application) por la FDA, autoriza al patrocinador, generalmente una compañía farmacéutica, a realizar los estudios clínicos. Ya se podría continuar con la siguiente fase que conlleva realizar estudios en humanos (Cruces, 2015). 5.3.3. FASE CLÍNICA: En este punto de la investigación, se observa el comportamiento del fármaco en los seres humanos y así poder confirmar si se trata de un compuesto adecuado para tratar la enfermedad. Los estudios realizados en esta fase deben llevarse a cabo de acuerdo a las Buenas Prácticas de Laboratorio. Esto le da la validez adecuada a los estudios realizados en Europa para el registro de productos de EEUU o Japón (Marovac, 2001). Los investigadores deben redactar de forma detallada los ensayos clínicos que van a hacerse: número de participantes, criterios de selección de pacientes entre otros parámetros a tener en cuenta. Hay que tener en cuenta que cuando se trata de un medicamento destinado al uso humano, estos ensayos clínicos requieren la aprobación de comités éticos de investigación clínica, los cuales se encargan de supervisar que no se abolan los derechos y el bienestar de los pacientes (Merck et al., 2016). Este punto ha generado siempre cierta controversia, fundamentalmente con la participación de mujeres y niños en los ensayos clínicos. Es por eso, que los niños no están incluidos en los ensayos hasta que el fármaco ya se ha estudiado por completo en adultos y se conoce, a no ser que el medicamento sea de uso pediátrico. Las mujeres fértiles en un principio fueron excluidas, pero luego volvieron a tenerse en cuenta a la hora de realizar estos estudios, evitando a las embarazadas (Marovac, 2001). Lo cierto es que cuanto más heterogéneos 21 sean los grupos de estudio, más se asemejarán a la población real y más exactos serán los resultados. Se estima que muchos de los efectos secundarios producidos por los fármacos en estudio, no se identifican en la fase preclínica, sino que estos aparecen en los ensayos clínicos que se realizan a humanos (Guerrero, Lorenzana-Jiménez, 2009). -FASE UNO: es llamada fase de farmacología clínica, es donde por primera vez se pone en contacto el fármaco con los humanos. Los estudios se realizan en voluntarios sanos, siendo estos entre 20-100 y se prueban en ellos varias dosis. En esta fase se pretende determinar la toxicidad, perfil de seguridad, rango de dosis eficaz y vía de administración. También se empiezan a observar las primeras reacciones adversas comunes. Las pruebas realizadas suelen ser no ciegas, es decir, tanto el investigador como el sujeto en estudio son conscientes del fármaco que se está administrando y suelen durar entre seis meses y un año (Guerrero, Lorenzana-Jiménez, 2009). -FASE DOS: si el fármaco supera con éxito la fase 1, pasa a ser probado en pacientes con una enfermedad concreta a tratar. El propósito primordial de esta etapa es valorar la eficacia, mediante la relación dosis-respuesta, frente a la enfermedad para la cual ha sido desarrollado. Esta etapa, requiere a un número de 50-500 pacientes con la enfermedad. El personal encargado de realizar esta fase debe estar lo suficientemente cualificado y debe ser conocedor en profundidad de la patología a tratar. Se realizan dos grupos, a uno de ellos se les dará el fármaco en cuestión y al otro grupo un placebo. Con lo cual los estudios se realizan en ciego, donde los sujetos desconocen el tratamiento que se les está administrando. Todo este proceso suele transcurrir entre 2 y 5 años y es la etapa donde más moléculas son eliminadas del estudio por no superar los requisitos exigidos. Aquí se decide si avanzar a la siguiente fase y proceder a realizar los ensayos clínicos a un número de personas mucho mayor (Bustamante, 2001). -FASE TRES: antes de esta fase se ha establecido la eficacia y seguridad del fármaco en estudio. (Manual MSD) Lo que se procede a hacer entonces es un estudio a gran escala, donde el número de pacientes es de decenas de miles; para lograrlo, el mismo ensayo se lleva a cabo en distintos centros hospitalarios y hasta en distintos países. En estos estudios la selección de sujetos es mucho menos estricta que en las dos fases anteriores. 22 Por tanto, las características con las que cuentan estos estudios son: de acceso expandido, multicéntricos, emplean investigadores menos especializados, una población más general y son de más larga duración (Campillo, Fernández, 2018). Para evitar sesgos, los participantes son asignados aleatoriamente al grupo donde se administra el fármaco o al grupo control (donde se administra el placebo), con el fin de que los grupos sean homogéneos. Además, los estudios son realizados en doble ciego, donde ni el investigador ni los pacientes sometidos al estudio tienen conocimiento del tratamiento que se les está dando. En esta fase se pretenden documentar la mayoría de los efectos adversos, incluso efectos secundarios graves que no han aparecido en las fases anteriores. Por último, en esta fase se incluyen también los estudios de superioridad y los de no inferioridad, todo ello se lleva a cabo exponiendo la droga en estudio con un comparador y así poder establecer el efecto terapéutico. Este es el último paso antes de ser aprobado para que se comercialice (Rendón-Macías, 2019). -FASE CUATRO: una vez superados los estudios preclínicos y las tres etapas de la fase clínica, el fármaco queda validado y puede ser comercializado. Pero la incertidumbre sobre la eficacia y seguridad del fármaco siguen existiendo, como su influencia sobre la morbilidad y mortalidad. En esta fase los estudios que se realizan son estudios de cohortes, realizados a poblaciones mucho más grandes y en períodos de tiempo más largos que los implicados en el resto de fases anteriores. Otra de las diferencias con los estudios de las otras fases recae en que carecen de grupo control, ya que se trata de estudios epidemiológicos. El principal objetivo en este punto del proceso es evaluar el beneficio/riesgo del medicamento ya comercializado tras administrarlo en largos períodos de tiempo (Herrero F, Tato F, 1999). El control en esta etapa es esencial por parte de las agencias regulatorias, cada tres meses, durante el primer año, cada seis meses, durante el segundo y finalmente cada año, se deben mandar informes sobre posibles efectos adversos, daños colaterales, reacciones alérgicas o posibles errores a la hora de ejercer su acción farmacológica (Magos, Lorenzana-Jimenez, 2009). Se han dado casos en los que fármacos aprobados por la FDA, tras haber pasado los estudios de fase 3, han sido retirados del mercado debido a que se han detectado efectos adversos graves en la fase 4 (Armijo JA, Adin J, 2003). 29 Tabla 3. Muestra las características de dos proyectos fallidos en el intento de desarrollar nuevos fármacos (Rutger, 2016). 5.7. LIMITACIONES DEL ENSAYO HIGH THROUGHPUT SCREENING: Como cualquier proceso, el método de cribado de alto rendimiento (HTS) presenta algunas limitaciones y puntos concretos del proceso que aunque se están abordando, hay que combatirlos. Las necesidades más notables de dicho método en el laboratorio suelen ser la falta de ensayos más robustos y un equipo más numeroso, seguidos de mejoras en los procesos y equipos de manipulación de líquidos y una mejoría también en las bibliotecas de compuestos. Mejorando la calidad de estos cuatro elementos las probabilidades de éxitos serían aún mayores (Granados G et al., 2014). En la figura 9 se observa gráficamente cuales son los cuatro principales requisitos a mejorar en el método HTS, destacando en primer lugar la robustez de los ensayos, en segundo lugar, 30 un aumento del equipo de laboratorios y ambos seguidos de mejoras en el proceso y manejo de los equipos con compuestos líquidos y una mayor diversidad de compuestos. Figura 9. Muestra los cuatro elementos a mejorar según varias entrevistas a directores de laboratorios especializados en HTS (HighTech Business Decisions, 2007). Las técnicas para obtener fármacos, deben cambiar conforme se van dando más avances. Afortunadamente, los métodos de alto rendimiento están tratando de acoplarse a las nuevas exigencias y así vencer los principales obstáculos que se les presentan: 1. Métodos de ensayo y detección (bioware). 2. Manejo de líquidos y robótica (hardware). 3. Flujo de procesos y gestión de la información (software). 5.8. ACTUALIDAD: Los métodos computacionales de alto rendimiento podrían acabar teniendo un papel crucial en la investigación de la COVID19 ya que, ayudarían a conseguir acelerar el 31 desarrollo de alguna terapia o vacuna efectiva contra este virus. Los sistemas de cómputo de alto rendimiento con altísimas capacidades de rendimiento (FLOPS) podrían ampliar en gran medida la capacidad de analizar nuevos compuestos con actividad antivírica y permiten experimentar a gran velocidad la búsqueda de algún compuesto activo frente a una enfermedad. Contar con una plataforma de cribado da la posibilidad de probar las colecciones de posibles compuestos antivirales, ya sean naturales o productos sintéticos, junto con la propia enfermedad. La plataforma entonces obtiene qué compuestos son activos a determinado patógeno productor de la enfermedad. El método High-throughput screening (HTS), presenta una gran amplitud de detección, lo que evita tener que realizar pruebas in vivo (Charlebois et al., 2020). Esta técnica podría llegar a ser un gran aliado en el descubrimiento de nuevos antivirales. 32 6. CONCLUSIONES Como consecuencia de los numerosos avances desarrollados en los últimos tiempos, el largo camino del descubrimiento de nuevos fármacos por medio de los métodos Highthroughput, ha supuesto un aumento de las posibilidades de encontrar nuevas moléculas activas que llegan a ser comercializadas, por ser eficaces frente a determinadas enfermedades. Afortunadamente, a día de hoy la gran mayoría de enfermedades agudas cuentan con su tratamiento específico, el problema recae en las de origen crónico, tales como diabetes, artritis reumatoide, SIDA. El desafío para la ciencia es entonces encontrar terapias que consigan actuar en el blanco exacto, es decir fármacos lo más específicos posibles con el fin de minimizar efectos adversos y mejorar la calidad de vida de pacientes con enfermedades de carácter crónico. Las técnicas Hight-throughtput podrían conseguir que la meta estuviera un poco más cerca. Hasta la fecha, no se conoce ningún tratamiento contra la COVID-19, encontrar una terapia o un compuesto capaz de destruir al virus patógeno es desde hace varios meses el principal objetivo de la ciencia. Estos ensayos computacionales podrían acelerar el desarrollo de un fármaco efectivo. De cualquier manera, se espera que las aportaciones de los métodos de alto rendimiento mejoren el diseño de fármacos prácticamente en todos los aspectos. 33 7. REFERENCIAS Albaladejo G. "Diseño de fármacos basado en la estructura." 2016. Albericio F. "Developments in peptide and amide synthesis." Current opinion in chemical biology. 2004; 211-221. Arranz JN, Sanz AI. Empleo de ensayos de High Throughput Screening (HTS) aplicado al estudio de canales iónicos y otras dianas terapéuticas. Dianas (UAH). 2014; 1:8. Armijo JA, Adin J. "Farmacología clínica: objetivos y metodología." Farmacología humana, 4ª ed. Barcelona: Masson. 2003; 191-218. Bader A, Onken A, Tracht K. "Order Release for Temporary Paced Sequences in Flexible High Throughput Systems." Procedia CIRP. 2018; 689-694. Banerjee P, Rosfsky M, 1997. Bejarano Alberto. Cell-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of G-Protein-Coupled Receptors Agonists and Antagonists. Dianas. 2013; 2. 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