Importancia de la calibración en los laboratorios de química analítica

1 UNVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA IMPORTANCIA DE LA CALIBRACIÓN EN LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA ANALÍTICA MANUEL ESPEJO CUADRADO 2 UNVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA IMPORTANCIA DE LA CALIBRACIÓN EN LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA ANALÍTICA MANUEL ESPEJO CUADRADO DICIEMBRE 2016 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA TUTORES: MARÍA DOLORES HERNANZ VILA, MARÍA ANGELES HERRADOR MORILLO TRABAJO DE REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3 INDICE 1. RESUMEN 4 2. INTRODUCCIÓN 5 2.1. Concepto de calidad 5 2.2. Validación del método analítico 6 2.2.1. Introducción 6 2.2.2. Propiedades analíticas 7 2.2.3. Propiedades supremas 8 2.3. Trazabilidad 9 2.4. Estándares analíticos. Materiales de referencia 10 3. OBJETIVOS 12 4. METODOLOGÍA 13 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 13 5.1. Calibración. Concepto y tipos 13 5.2. Calibración instrumental 14 5.2.1. Calibración de una balanza analítica 16 5.2.2. Calibración de material volumétrico 18 5.2.3. Calibración de un pH-metro 19 5.2.4. Calibración de un espectrofotómetro UV-Visible 20 5.3. Calibración metodológica 21 5.3.1. Método simple, directo o del estándar externo 24 5.3.2. Método del patrón interno 25 5.3.3. Método de la adición estándar o adición patrón 27 6. CONCLUSIONES 29 7. BIBLIOGRAFÍA 30 4 1. RESUMEN La química analítica tiene como finalidad el estudio de la composición química de una muestra, mediante métodos de laboratorio analíticos. En cualquier laboratorio de química analítica, el objetivo principal es obtener resultados fiables y consistentes, es decir, resultados de calidad. Para ello es fundamental constatar que el método que se va a usar se adecua al problema analítico que se presenta. Esto se consigue mediante la validación del método analítico. La validación se realiza mediante una serie de pruebas o procesos que permiten asegurar que se obtendrán resultados de calidad. Mediante estos procedimientos de validación, se obtendrán unas propiedades analíticas del método que indicaran si el método es válido o no para la finalidad con la que se utiliza. La determinación de dichas propiedades o parámetros se consigue entre otros, con el procedimiento de calibración del método de análisis. Dentro de química analítica existen principalmente dos tipos de métodos, los instrumentales y los no instrumentales como los volumétricos. Para cualquiera que sea el método se requiere una calibración del equipo a utilizar, que es el paso inicial en cualquier proceso analítico. Posteriormente los métodos instrumentales requieren además de una calibración metodológica, que asegura que el procedimiento es válido para el problema concreto que se presenta y el analito que se estudia. Se puede calibrar por tres técnicas, siendo la más simple y rápida la calibración simple o por estándar externo, pero también la que requiere de menos problemas relacionados con el método. La calibración por adición estándar es útil para compensar el efecto que pueden producir otras sustancias a la señal que mide el equipo. Por último, se puede utilizar el método del patrón interno, para aquellos procesos analíticos en los que se produzcan muchas variaciones entre cada operación y eso cause resultados analíticos diferentes. En este trabajo se describen los principales conceptos relacionados con la calidad de los resultados analíticos, se explican, en detalle, y se ilustran con ejemplos, los conceptos de calibración instrumental y metodológica y su implicación decisiva en la obtención de resultados de calidad. Palabras claves: calibración instrumental y metodológica, materiales de referencia, trazabilidad, calidad, validación. 5 2. INTRODUCCIÓN El principal objetivo de los laboratorios analíticos es obtener información analítica significativa, es decir, de calidad, que permita adoptar decisiones técnicamente correctas para la resolución de problemas científicos, técnicos o sociales. La Química Analítica es una ciencia metrología, se basa, por tanto, en la medición de distintos parámetros para obtener resultados analíticos. Para que estos resultados sean de calidad deben ser trazables a referencias o estándares adecuados y para conseguir este reto los analistas deben: seguir una estrategia analítica adecuada, tomar muestras representativas, aplicar métodos de medidas validados, utilizar equipos apropiados que funcionen correctamente, es decir, calibrados y verificados, y utilizar patrones o materiales de referencia adecuados para validar, calibrar y verificar. 2.1. Concepto de calidad La calidad en el ámbito analítico, tiene dos vertientes o dos puntos de vista claros. La calidad como concepto básico, puede definirse como un conjunto de características, propiedades, atributos o capacidades de una entidad que la hacen mejor, peor, o igual que otras entidades del mismo tipo. La calidad también puede definirse desde un punto de vista más aplicado como la totalidad de características de una entidad que la capacitan para satisfacer las necesidades específicas o implícitas impuestas por el cliente o la legislación (Valcárcel y Ríos, 1992). En la primera definición se habla de propiedades o características que sirven para evaluar la calidad analítica, que engloba la calidad de los resultados, del proceso analítico y de los materiales y equipos utilizados. Básicamente existen cuatro acciones para el aseguramiento de la calidad analítica: calibración del instrumental a usar, validación del método, verificación de los instrumentos, y realizar controles de calidad, de los resultados (Hernández, 2013). Desde un punto de vista aplicado, la calidad está representada por la coherencia que debe existir entre la información que el cliente solicita y la que se proporciona en los resultados. Esto se conoce como “fit-for-purpose”. La representividad y coherencia entre la información de ambas partes es un factor decisivo para la calidad de un proceso analítico (Compaño y Ríos, 2002). 6 Además, todos los laboratorios de química analítica, deberán asegurar su calidad y competencia mediante el cumplimiento de los sistemas de calidad vigentes, siendo la norma ISO 9001/2008 y la norma ISO 17025/2005 necesarias implantación y cumplimiento en el ámbito analítico. La guía Eurachem (Eurolab, 2016) engloba todos estos aspectos en seis principios de las buenas prácticas analíticas. En ellos, se describe que es necesario medidas analíticas para satisfacer los requisitos acordados “fit-for-purpose”, la necesidad de la utilización de métodos y equipos probados (validación, calibración y verificación), de la evaluación del desempeño técnico del laboratorio mediante controles de calidad, y de la obligación de la definición de procedimientos adecuados de control y por último, del aseguramiento de calidad. 2.2. Validación del método analítico 2.2.1. Introducción Validar un método analítico, es verificar y documentar su calidad y su adecuación a unos determinados requisitos establecidos, es decir que se verifica si es adecuado siempre para su finalidad, para el problema analítico que se presenta (Rius y cols., 2000). La validación de la metodología analítica es clave para asegurar la calidad del análisis químico. El objetivo de la validación es obtener resultados precisos, reproducibles y confiables. Esto se puede conseguir con una calibración tanto instrumental, del equipo, como del método a validar. También es necesario un correcto uso de estándares de referencia, la presencia de personal analítico cualificado, y tener todo el proceso bien descrito y documentado. (OMS, 2002). Por tanto el objetivo de resultados precisos y confiables, solo se puede conseguir con procedimientos de análisis validados. Según el tipo de método utilizado la actuación respecto a la validación será distinta. Los métodos analíticos se pueden agrupar principalmente en dos grandes grupos, los métodos normalizados y los métodos no normalizados. Se consideran métodos normalizados aquellos que están desarrollados por un organismo reconocido y son generalmente aceptados por el sector técnico correspondiente. Los métodos no normalizados son desarrollados por un tercero o que han sido adaptados por el laboratorio a partir de un método normalizado (IAAC, 2010). Los métodos normalizados no necesitan ser validados, a no ser que se le hayan incorporado mejoras, que sea usado para una especificación para la que no estaba validado, o que se utilice diferente instrumental. Si se deberán validar (Eurolab, 2016): 7  Métodos no normalizados  Métodos cuyo control de calidad indica que han sufrido modificaciones con el tiempo  Métodos nuevos con los que se quiera demostrar la equivalencia con uno anterior, de referencia. Para validar un método, existen una serie de propiedades que tienen como finalidad demostrar que cumple con los requisitos analíticos para los que se ha desarrollado. Estos se conocen como propiedades analíticas. 2.2.2. Propiedades analíticas Son las propiedades o criterios que definen los requisitos analíticos y que un método debe tener para poder resolver el problema analítico (Eurolab, 2016). Según Valcárcel (1999) son indicadores de calidad que permiten evaluar, comparar y validar diversas facetas de la química analítica de forma fundamental y eficaz. Dentro de las propiedades analíticas, no todas tienen el mismo nivel de importancia. Existen clasificaciones de jerarquía según la trascendencia que tenga para garantizar la calidad del método tal como se aprecia en la Figura 1. Figura 1. Clasificación jerárquica de las propiedades analíticas (Valcarcel, 1999). 8 Se suelen clasificar en tres grupos, destacando las propiedades supremas como aquellas que tienen una mayor importancia en la calidad de los resultados. Los otros dos grupos jerárquicos engloban una serie de propiedades que atributos del proceso analítico (Compaño y Ríos, 2002). Propiedades supremas:  Exactitud: es la diferencia entre una medida y el valor verdadero, y se expresa en forma de error.  Representatividad: es la coherencia entre el resultado y las necesidades del cliente. Propiedades básicas:  Precisión: mide la concordancia que se tiene, de resultados, sobre una misma muestra durante un periodo de repeticiones.  Sensibilidad: capacidad de un método para diferenciar dos analitos de similar concentración o determinar pequeñas concentraciones de un analito en la muestra.  Selectividad: capacidad de que un método sea específico para el analito problema, para su identificación o cuantificación.  Robustez: capacidad de resistencia al cambio de la respuesta de un método cuando se la cambian las condiciones experimentales. Propiedades complementarias  Rapidez y coste: mayor productividad posible, es decir, número de muestras procesadas por unidad de tiempo y valor económico por cada análisis.  Factores personales: profesionales cualificados y trabajo en condiciones de seguridad y comodidad. 2.2.3. Propiedades Supremas La elección de propiedades adecuadas, es clave en la validación del método, porque resulta prácticamente imposible conseguir valores de calidad para cada propiedad, con lo cual se ha de lograr un equilibrio entre los parámetros o priorizar según los requisitos analíticos (Maroto y cols., 2007). Las propiedades supremas, exactitud y representatividad, son las que resultan más imprescindibles para alcanzar calidad de resultados. Así, por ejemplo, un resultado que tenga una gran valor de exactitud, pero que no cumple con la representatividad del problema, no será un resultado de calidad (Valcárcel, 1999). 9 La representatividad es un parámetro que se refiere a un muestreo correcto y se consigue encontrando una concordancia entre los resultados y la muestra, el objeto, el problema analítico y otros factores socioeconómicos. La exactitud como concepto teórico, viene caracterizado por el error sistemático. Los errores en los procedimientos analíticos incluyen dos componentes, uno aleatorio y otro sistemático. Los errores sistemáticos son originados por fallos en el diseño o de los equipos empleados, y seguirá siendo el mismo aunque se repita el experimento. El error sistemático puede ser estimado y debe ser corregido (Harris, 2006). Los otros errores, los aleatorios, están relacionados principalmente con una propiedad de calidad básica, la precisión. Estos tipos de errores surgen durante el proceso de medición y son errores impredecibles e incorregibles. Como son impredecibles y no se pueden estimar, se introduce el concepto de la incertidumbre. La incertidumbre de medida es otro parámetro muy usado en la química analítica, que establece un intervalo de valores dentro del cual se estima que se encuentra el valor real de la medición (Gella, 2012). 2.3. Trazabilidad En un contexto de globalización de mercados como es el actual, conseguir resultados trazables, resultados que puedan ser comparables con los de otros laboratorios y que sean considerados exactos, resulta fundamental. La trazabilidad se define según el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM, 2012) como “propiedad del resultado de una medición (o el valor de un estándar) que consiste en que se pueda establecer el resultado previsible de su comparación directa con los patrones apropiados, generalmente nacionales o internacionales, mediante una cadena ininterrumpida de comparaciones reales, todas con incertidumbres conocidas”. Atendiendo a su definición, se puede considerar que el concepto de trazabilidad consta de seis elementos principales (Benítez, 2004): - Cadena ininterrumpida de comparaciones: se inicia en los patrones nacionales o internacionales y termina con el valor del resultado de una medición. Se trata de una cadena documentada de calibraciones hasta una referencia, mediante unos procesos de medición, que permiten relacionar los resultados de medida, en general a las unidades del Sistema Internacional, con su incertidumbre de medida conocida (Rivera, 2015). 16 Resultados (Riu y cols., 2001):  Estimación de los errores del instrumento de medida, del sistema de medida o de la medida materializada.  Determinación de otras propiedades metrológicas: incertidumbre o diferentes valores de precisión.  El resultado debe ser recogido en un documento denominado certificado de calibración. Información: se obtiene información sobre la capacidad de medida del equipo, y se garantiza la comparabilidad mediante (Riu y cols., 2001):  Valor de relación entre el valor del equipo y el proporcionado por el patrón, concepto que en química analítica se conoce como corrección. Es un valor que se utiliza para obtener valores reales de la medición.  Incertidumbre: el valor numérico de la corrección o la función de la respuesta obtenida, tendrá una incertidumbre asociada debida al método y a los patrones utilizados. Se puede calcular con la información generada en la calibración, aunque que la incertidumbre no solo proviene de ahí, sino también del uso que se dé a diario al instrumento de medida.  Trazabilidad: la operación de calibración tiene como objetivo demostrar que los resultados sean comparables con el resto de laboratorios y el certificado de calibración garantiza la trazabilidad de los resultados a patrones apropiados.  Evaluación de los resultados de la calibración. El equipo encargado de hacerlo analiza los resultados y decide que se debe hacer con el equipo. Con el fin de desarrollar con más profundidad la calibración instrumental en un laboratorio de química analítica, se van a detallar los procedimientos de calibración del instrumental de mayor uso diario en cualquier laboratorio. 5.2.1. Calibración de una balanza analítica Cualquier instrumento de pesada se va a calibrar por comparación directa (Figura 3). Cabe apuntar que la calibración queda invalidada si se cambiase de ubicación de la balanza, salvo que se haya demostrado que el instrumento no es sensible a estos cambios (CEM, 2004). Patrones: pesas normalmente de acero inoxidable pulido, latón o aluminio. Según la Organización Internacional de Metrología Legal, las pesas son de siete tipos diferentes:  Clase E: E1 y E2, exactitud grande. Usado por laboratorios de calibración. 17  Clase F: F1 y F2, gran exactitud, patrones de referencia por los organismos de metrología.  Clase M: M1, M2 y M3, pesas con menor exactitud, pero mayor tolerancia. Usadas como patrones de trabajo. (OILML R 111-1, 2004). Procedimiento de calibración: generalmente, un proceso de calibración de una balanza analítica, o de otro instrumento de pesaje, consta de cinco etapas que se esquematizan en la Figura 4. 1. Repetibilidad de las lecturas: es una medida de como la balanza será capaz de medir de forma repetitiva una masa, en la que se determina el valor de la desviación estándar. Se Figura 3. Calibración de una balanza analítica usando pesas certificadas. Figura 4. Etapas del procedimiento de calibración de una balanza analítica. 18 realiza una serie de lecturas repetidas. El valor de desviación estándar obtenido nunca deberá ser mayor que tres veces la resolución de la balanza. El procedimiento es simple, primero se ajusta a cero la balanza, se coloca la pesa patrón un número de veces acorde a lo dicho anteriormente (CEM, 2004). 2. Efecto del descentramiento de carga: esta prueba determina las posibles variaciones para un mismo valor de masa producidas al poner la carga en distintos puntos de la balanza. Se deben colocar las cargas dentro de los límites establecidos por el fabricante colocando siempre en primera posición la pesa en el centro del platillo, ya que el valor obtenido, es el resultado de la diferencia del valor en medio del platillo, con respecto a las otras posiciones (Kremer y Putrele, 2016). 3. Prueba de desvió de ajuste: en esta prueba se calcula el desvío, como la diferencia entre la lectura del valor del pesaje y el valor de la pesa. 4. Prueba de linealidad: se verifica, en todo el intervalo de pesada que la indicación de instrumento sea acorde con la carga aplicada dentro de los límites especificados por el fabricante. 5. Movilidad: consiste en depositar sin choque, una carga en la balanza o se retira suavemente del instrumento en equilibrio. Se debe producir una variación en la indicación de la balanza, si no es así, se aumentara la sobrecarga hasta que se produzca la variación del valor (INTI, 2012). 5.2.2. Calibración de material volumétrico. En la calibración de material volumétrico (Figura 5), se realiza una calibración directa pero por el método de reproducción de la definición de la magnitud. Se calibra el material volumétrico mediante pesada y se calculan los valores de la magnitud deseada a partir de la densidad (Riu y cols., 2002). Figura 5. Material volumétrico de uso frecuente en los laboratorios. 19 Patrones: no se utilizan patrones trazables al sistema internacional de unidades, pero el instrumental que mide la pesada debe estar calibrado. Procedimiento de calibración: se selecciona un volumen máximo, mínimo e intermedio del instrumento a calibrar, y se realizan las siguientes operaciones para cada uno de los volúmenes: Se coloca el recipiente para la pesada y se apunta el valor, que se tendrá en cuenta para el cálculo de la incertidumbre y se ajusta a cero. Para finalizar el proceso, se añade el agua destilada al material volumétrico y se anota la pesada. Con los valores obtenidos se podrá calcular, mediante operaciones matemáticas, el volumen de cada una de las calibraciones, utilizando parámetros como la densidad del agua, empuje del aire, temperatura y coeficiente de dilatación del vidrio. La relación que existe entre el volumen calculado y el volumen nominal, que es el correspondiente al material volumétrico, es el dato para calcular la corrección y la incertidumbre de los resultados. 5.2.3. Calibración de un pH-metro Se lleva a cabo una calibración por comparación directa. Patrones: se utilizan disoluciones reguladoras de referencia con distintos valores de pH, 4, 7 y 10 generalmente (Figura 6). Procedimiento de calibración (CEM, 2007): 1. Lectura inicial: se procede a la lectura, de forma ordenada, de todo el campo de medida del pH-metro, utilizando disoluciones reguladoras que abarquen dicho intervalo. Se inicia con el patrón de menor pH. Figura 6. Disoluciones de referencia para calibración pH-metro. 20 2. Ajuste: si la lectura de la disolución reguladora no coincide con la certificada, se procede a su ajuste manual o automático según el pH-metro utilizado. 3. Lectura tras ajuste: se vuelven a leer sucesivamente todas las disoluciones y se comprueba que el ajuste ha sido correcto. 5.2.4. Calibración de un espectrofotómetro UV-Visible. Un espectrofotómetro mide la cantidad de energía radiante absorbida por las moléculas de una muestra en función de las longitudes de onda específicas. La energía absorbida o absorbancia (A) y la longitud de onda () son los parámetros que intervienen y los que hay que considerar a la hora de calibrar el equipo cuyos componentes se esquematizan en la Figura 7. Para asegurar la trazabilidad de las mediciones realizadas con un espectrofotómetro se calibra el instrumento mediante una serie de pruebas. Cada prueba usa un patrón distinto. Patrones: disoluciones de: oxido de holmio en acido perclórico, sulfato de cobre en ácido sulfúrico, dicromato potásico en ácido sulfúrico y nitrito de sodio. Procedimiento de calibración: se realizan las siguientes pruebas para determinar (Azcarate y cols., 2016; Martínez y de los Ángeles, 2009): 1. Exactitud de la longitud de onda: este parámetro se verifica midiendo el estándar de óxido de holmio (III) en acido perclórico, con sus picos bien definidos, comparándolo con la longitud de onda de dichos picos obtenidos al medir con el espectrofotómetro A Figura 7. Esquema de los componentes básicos de un espectrofotómetro.  21 2. Exactitud fotométrica: se obtiene comparando la absorbancia de las disoluciones de referencia (sulfato de cobre en ácido sulfúrico, dicromato potásico en ácido sulfúrico) con la obtenida en el instrumento, a las mismas longitudes de onda. Es recomendable comparar a distintas longitudes de onda 3. Luz difusa o parasita: es la radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada que se detecta. Esta luz difusa causa disminución de la absorbancia y reduce el rango lineal del instrumento. Se utiliza una disolución de nitrito de sodio medida a tres longitudes de onda. 4. Linealidad fotométrica: el análisis de la linealidad fotométrica sirve para establecer el rango de absorbancia en el que el espectrofotómetro tiene respuesta lineal. Como patrones se utilizan disoluciones de dicromato potásico a distintas concentraciones, utilizando una disolución de ácido sulfúrico para el ajuste del equipo. 5.3. Calibración metodológica. La calibración metodológica o analítica, es una operación necesaria para algunos métodos de análisis en los cuales no basta con una calibración instrumental. Los métodos utilizados en un laboratorio analítico se pueden clasificar en dos grandes grupos: Métodos clásicos: son los métodos más antiguos utilizados para medir la cantidad de sustancia en una muestra. La gravimetría y volumetría son ejemplos de ellos. Se caracterizan por ser métodos de alta precisión, mayor que la de los análisis instrumentales. Son considerados métodos absolutos porque es posible encontrar una relación directa entre la medida analítica y la concentración analítica sin necesitar de estándares o patrones que contengan el analito en cuestión, tan solo utilizan reacciones químicas y coeficientes estequiométricos para calcular la concentración final de analito (Valcárcel y Ríos, 1992). Métodos instrumentales: son métodos que utilizan técnicas más modernas, como son las técnicas ópticas, térmicas, radioquímicas, másicas, etc. Suelen tener gran sensibilidad y gran capacidad de analizar, de forma rápida, muchas muestras. Además, al usar instrumentos y técnicas más avanzadas, los resultados de los análisis están computarizados y automatizados. Aun así, los métodos instrumentales presentan una desventaja frente a los clásicos, son menos precisos y esto es debido al error de calibración. Las técnicas instrumentales son técnicas relativas, la señal obtenida de la medición de la muestra a analizar se compara con otras 22 medidas para determinar la concentración analítica. Los patrones utilizados ya contienen un error de medida, y este error se arrastra y se añade al resto de errores, tanto aleatorios como sistemáticos, que aparecen en el proceso de calibración, incrementando el posible error de la determinación de la concentración (Valcárcel, 1999). A diferencia de lo que ocurre con los métodos clásicos, los métodos instrumentales requieren el uso de estándares químico-analíticos adecuados que contengan el analito a estudiar. Y la forma más común de determinar la concentración de una muestra usando estándares pasa por la elaboración de gráficas de calibrado con la correspondiente recta de calibración. El procedimiento para elaborar las gráficas de calibrado es el siguiente: se toman una serie de patrones de calibración de los que se conoce la concentración del analito. Estos patrones se miden en el instrumento analítico, y se representa gráficamente la concentración de cada uno de los patrones frente a las respuestas de medición. Una vez elaborada la gráfica de calibrado, se puede obtener mediante interpolación (menos en algún caso que se hace por extrapolación) la concentración de la muestra a determinar midiendo ésta con el instrumental analítico en las mismas condiciones en las que se hizo la medida de los patrones (Miller y Miller, 2002). Para ello, es necesario encontrar la forma de obtener una curva de calibración lo más recta posible, ajustándose a una serie de puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable X (variable independiente, concentración del analito) y una variable Y (variable dependiente, respuesta instrumental) (Riu y Boqué, 2003). Los puntos de calibración tienen un error aleatorio causado por la respuesta instrumental, en el valor de Y. Hay que buscar la mejor recta que pase por los puntos de calibración y calcular la ordenada en el origen y la pendiente de la misma. El método usado para conseguir una recta que pase por los puntos de calibración, se conoce como regresión lineal simple o método de los mínimos cuadrados (Coello y Maspoch, 2007). Además de las propiedades analíticas desarrolladas en la introducción, existen una serie de parámetros o propiedades que se determinan a partir de la curva de calibración, que también van a ser importantes para valorar la calidad de un método (Figura 8). Son los siguientes (PAHO, 2008): - Linealidad se define como la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro del intervalo de trabajo. A partir de la curva de calibración, se puede obtener la ecuación de la recta de la que se obtiene un coeficiente de correlación r2. Para una buena garantía de linealidad, será conveniente medir en cinco niveles de concentración, que abarquen el intervalo de trabajo, y 23 repetir este proceso tres veces. Se considera que un valor de r2 representa un buen ajuste lineal, cuanto más próximo a 1 se encuentre. - Límite de detección se define como la cantidad mínima de analito en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo unas condiciones establecidas. Existen diferentes procedimientos para determinar este límite, uno de ellos es usando la curva de calibración mediante la relación entre tres veces la desviación estándar de la respuesta lineal Sb, y la sensibilidad que en la ecuación de la recta corresponde a la pendiente b. Se calcula midiendo una señal de un blanco más tres veces su desviación estándar. - Límite de cuantificación es la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo unas condiciones establecidas para dicho método, con una exactitud y precisión adecuada. El método de determinarlo es casi idéntico al del límite de detección, se distingue en que este requiere una relación de diez veces la desviación estándar frente a la pendiente. Se calcula midiendo una señal de un blanco más diez veces su desviación estándar. - Rango o intervalo lineal se define como el intervalo de concentración en que el analito puede ser determinado mediante la curva de calibración. Esta comprendido entre el límite de cuantificación y el punto en el que la curva deja de ser lineal. Figura 8. Parámetros relacionados con la calibración metodológica 24 5.3.1. Método simple, directo o del estándar externo Un estándar o patrón externo, es aquel que se prepara fuera de la muestra problema. Se aplica este método cuando se desea determinar la concentración de un analito en la que, ni los componentes de la matriz de la muestra ni los reactivos usados en el procedimiento interfieren en el análisis. También se puede usar en el caso en que las interferencias se conozcan y se mantengan siempre constantes en las medidas, con lo cual se podrán corregir estas posteriormente (Sánchez, 2016). Procedimiento: se preparan una serie de estándares externos de concentración conocida. La cantidad óptima de estándares debe ser como mínimo de tres a cinco, aunque en análisis rutinarios se podrá confiar en calibraciones con dos patrones. Se mide las señales y se representan frente a la concentración de los patrones obteniendo una línea recta. Previa a las medidas de los estándares, se utiliza un blanco, que es una muestra idéntica a la problema pero sin el analito. El blanco corrige la respuesta analítica original (Figura 9) (Skogg y cols., 2005). Ventajas: método simple y rápido. Usando un número necesario de patrones se puede analizar múltiples muestras. Inconvenientes: este método se basa en la suposición de que la respuesta instrumental del analito en la muestra será la misma que la respuesta del analito en la muestra patrón. Aunque se corrige con blanco, hay muchos factores que pueden hacer que esta suposición no se cumpla. Los más comunes son: los efectos de la matriz, la contaminación de muestras durante la preparación y la incorrecta elaboración de blancos o patrones. Aplicación: la calibración por el método de estándar externo se ha aplicado en la determinación de norisoprenoides en frutas y verduras. Así, en el estudio llevado a cabo por Figura 9. Esquema del procedimiento de una calibración directa. Señal analítica concentración 25 Stinco y cols. (2014) se desarrolla y valida un método cromatográfico que permite determinar nueve carotenoides, cuatro tocoferoles y cuatro clorofilas. Las curvas de calibrado presentan una buena linealidad en un amplio rango de concentración (Figura 10). A partir de la ecuación de la recta de calibrado se calculan las concentraciones de las muestras problemas por interpolación en la misma. 5.3.2. Método del patrón interno Método utilizado para compensar errores debidos a fluctuaciones debidas a la técnica analítica. Los patrones internos, además, se consideran muy útiles, cuando la concentración de la muestra o la respuesta instrumental varia cada vez que se utiliza, por razones desconocidas y difíciles de controlar. También es un método de utilidad cuando se producen perdidas del analito durante el proceso. Se utiliza como estándar interno, una sustancia diferente al analito pero que tengan propiedades físico-químicas similares, provocando que se vean afectadas de forma similar durante el análisis. Añadiendo un patrón de propiedades parecidas al analito, la relación de concentración perdida de ambas se mantiene constante (Sánchez, 2016). Procedimiento: se empieza por la adición de la sustancia pura a la muestra y a los patrones en concentración fija (Figura 11). Primero se determina la respuesta del equipo a las disoluciones Figura 10. Gráfica de determinación de isoprenoides por calibración simple. 32 Nacional, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Argentina. [Consultado en Abril 2016]. 16. Leiva-Guzmán MA. Materiales de Referencia y Comparaciones Interlaboratorio. Herramientas para el control de la calidad en laboratorios de ensayo. Chile: Centro Nacional del Medio Ambiente; 2006. 17. Martínez Osorio FS, de los Ángeles Pérez Espinoza I. Calibración de un espectrofotómetro UV-Visible y evaluación de la incertidumbre. Tesis para optar al título de: Licenciado en Química. Nicaragua: Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua, Facultad de Ciencias y Tecnología, Departamento de Química. 2009. 18. Miller JC, Miller JN. Estadística para química analítica, 4ª ed. Madrid, España: Prentice Hall. 2002. 19. 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