Caracterización del papel de la hipoxia en senescencia y cómo su alteración contribuye a la inmortalización celular y la tumorigénesis

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA CARACTERIZACIÓN DEL PAPEL DE LA HIPOXIA EN SENESCENCIA Y CÓMO SU ALTERACIÓN CONTRIBUYE A LA INMORTALIZACIÓN CELULAR Y LA TUMORIGÉNESIS Daniel Otero Albiol Graduado en Biología Tesis doctoral Director: Amancio Carnero Moya Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) 2020 Dr. Amancio Carnero Moya y Dr. Juan José Toledo Aral, CERTIFICAN: Que el trabajo experimental presentado en esta memoria para optar al título de Doctor en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla titulado “CARACTERIZACIÓN DEL PAPEL DE LA HIPOXIA EN SENESCENCIA Y CÓMO SU ALTERACIÓN CONTRIBUYE A LA INMORTALIZACIÓN CELULAR Y LA TUMORIGÉNESIS” ha sido realizado por Daniel Otero Albiol en el grupo de Biología Molecular del Cáncer del área de Oncohematología y Genética del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) bajo la dirección del Dr. Amancio Carnero Moya y la tutela académica del Dr. Juan José Toledo Aral. Sevilla, septiembre de 2020 El doctorando, El director, El tutor académico, Daniel Otero Albiol Dr. Amancio Carnero Moya Dr. Juan José Toledo Aral i RESUMEN La senescencia celular es un estado fisiológico complejo de las células caracterizado por la parada proliferativa, los cambios en la estructura de la cromatina, modificaciones epigenéticas específicas, cambios metabólicos, alta actividad β-galactosidasa ácida, un fenotipo de secreción aumentada, además de la alteración de orgánulos, entre otras características fenotípicas. La senescencia celular puede ser inducida a través de diferentes mecanismos intrínsecos y extrínsecos como el acortamiento telomérico y la respuesta a daño en el ADN, la detección de señales oncogénicas, el estrés oxidativo o el tratamiento con terapias contra el cáncer. La senescencia es necesaria en la regulación de diversos procesos fisiológicos como la supresión tumoral, el desarrollo de estructuras del embrión, la cicatrización de tejidos y la reprogramación celular implicada en la regeneración tisular. Además, la aparición de células senescentes correlaciona con el envejecimiento de los tejidos y está implicada en los efectos deletéreos de patologías asociadas a él. A pesar de la relevancia fisiológica de la senescencia, se desconoce cómo la hipoxia, que es característica en todos los tejidos del organismo, modula su iniciación y desarrollo. De este modo, no está claro si la hipoxia actúa como un estrés que induce senescencia, o bien, se trata de un estímulo capaz de promover la proliferación y la inmortalización previa a la transformación maligna. Existen múltiples evidencias de la contribución de la hipoxia a la malignidad tumoral. Además, la hipoxia promueve el mantenimiento de la pluripotencia y la autorrenovación tanto de células madre embrionarias (ESCs) como de células madre adultas, células pluriputentes inducidas (iPSCs) y células madre tumorales (CSCs). Por tanto, decidimos estudiar el efecto de la hipoxia sobre la senescencia y la inmortalización celular y su posible contribución a la tumorigénesis. Hemos comparado la vida proliferativa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) cultivados en hipoxia (3% O2) con la de MEFs cultivados en normoxia (20% O2). Los MEFs prolongan su vida proliferativa si se cultivan en hipoxia desde el explante del embrión, mientras que aquellos que crecen en normoxia cesan la proliferación y muestran características senescentes tras 30 días de en un protocolo 3T3. Los MEFs de hipoxia presentan menor expresión de p21Cip1, p15INK4b y p16INK4a. Aunque poseen signos de estrés proliferativo en hipoxia, con altos niveles de p-H2AX (Ser139) y p-p53 (Ser15), esto no desemboca en parada proliferativa a través de la activación de p53. Estos MEFs se mantienen en cultivo ininterrumpido en hipoxia al menos durante 6 meses. Ante las evidencias de la hipoxia como un factor que promueve la autorrenovación y la pluripotencia en células madre, hemos encontrado una mayor expresión de genes de desdiferenciación y relacionados con las propiedades de células madre en las muestras de hipoxia, entre los que destacan Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf2, Klf4, c-Myc, Bmi1 y Nanog. Además, en las muestras inmortalizadas en hipoxia, se sobreexpresa Tfcp2l1, un regulador central de la pluripotencia y la autorrenovación de ESCs. ii La variación de los niveles de expresión de Tfcp2l1 puede provocar la entrada en senescencia. En el caso de la disminución de la expresión, el uso de shARNs contra el ARNm de Tfcp2l1 provoca la entrada en senescencia con parada proliferativa, alta expresión de p16INK4a y alta actividad β-galactosidasa ácida tanto en normoxia como en hipoxia. En el caso de la expresión ectópica de muy altos niveles de Tfcp2l1, se produce entrada en senescencia con alta actividad β-galactosidasa ácida, además de un aumento de la expresión de p16INK4a, p21Cip1 y, al mismo tiempo, sobreexpresión de los factores de Yamanaka Oct3/4, Sox2 y Klf4. Esto sugiere que la senescencia inducida por altos niveles de Tfcp2l1 es similar a la inducida por oncogenes (OIS) o por reprogramación (RIS). Sólo cuando se expresan ectópicamente en normoxia, niveles de Tfcp2l1 similares a los fisiológicos inducidos por la hipoxia, se consigue aumentar la vida proliferativa de los MEFs. El incremento y mantenimiento de expresión de Tfcp2l1 en hipoxia está inducido, muy probablemente, por la unión de Hif1α a un “enhancer” cercano a Tfcp2l1 en el ADN. Esto lo hemos comprobado simulando hipoxia en normoxia con inhibidores de las PHDs, con la expresión ectópica de un mutante de activación constitutiva de Hif1α en normoxia y mediante el estudio de las zonas reguladoras asociadas a Tfcp2l1 en el genoma. Además de incrementar la expresión de Tfcp2l1, la hipoxia promueve una mayor actividad de Tfcp2l1 como factor transcripcional. Hemos realizado ChIP-Seq de Tfcp2l1 en células de normoxia y de hipoxia y hemos observado que se une a un mayor número de secuencias asociadas a genes en el ADN. En concreto, Tfcp2l1 promueve la expresión de genes reguladores de la proliferación que, en muchos casos, también están relacionados con las propiedades de células madre, como son Sox2, Sox9 y Tgfa. La capacidad de Tfcp2l1 de promover la proliferación y la pluripotencia también es relevante en la reprogramación. Hemos comprobado el papel causal de Tfcp2l1 en el incremento de la eficiencia de reprogramación causada por la hipoxia. La expresión ectópica de Tfcp2l1 en normoxia incrementa el número de colonias iPSCs al igual que la hipoxia. Además, la disminución de su expresión en hipoxia mediante shARNs disminuye el número de colonias generadas. Además, la expresión de Tfcp2l1 correlaciona positivamente con la expresión de Nanog en iPSCs generadas en hipoxia y en normoxia, y negativamente con la de p21Cip1 y p16INK4a. Nuestros datos sugieren que la activación de Tfcp2l1 por la hipoxia podría ser relevante en la inmortalización previa a la transformación maligna, facilitando la tumorigénesis. Además, en el microambiente tumoral, que es hipóxico, la expresión de Tfcp2l1 podría favorecer la aparición de CSCs al promover la pluripotencia y, por tanto, la desdiferenciación celular. iii SUMMARY Cellular senescence is a complex physiological state of the cell which main features are proliferative arrest, changes in chromatin structure, specific epigenetic modifications, metabolic changes, high acid β-galactosidase activity, an increased secretion phenotype and organelle alterations. Senescence can be induced by intrinsic and extrinsic stimuli like telomer shortening and DNA damage response, oncogenic signaling detection, oxidative stress, or anti-cancer therapies. Cellular senescence is necessary for the regulation of different physiological processes like tumor suppression, development of embryo structures, wound repair and cellular reprogramming in tissue repair. Furthermore, cellular senescence correlates with tissue aging and it is involved in the deleterious effects of the diseases associated with it. Despite the physiological relevance of senescence, it is still unknown if hypoxia, which is a feature of every tissue in the organism, modulates its initiation and development. Thus, it is unclear whether hypoxia works as stress which induces senescence, or it is a stimulus able to promote proliferation and immortalization prior to malignant transformation. It has been shown that hypoxia contributes to tumor malignancy. Moreover, hypoxia supports pluripotency maintenance and self-renewal in embryonic stem cells (ESCs), adult stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs) and cancer stem cells (CSCs). For these reasons, we decided to study the effect of hypoxia on cellular senescence and immortalization and its possible contribution to tumorigenesis. We have compared the lifespan of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) when cultured in hypoxia (3% O2) to the lifespan of MEFs cultured in normoxia (20% O2). The lifespan of MEFs is increased when they are cultured in hypoxia right after their isolation from the embryo. However, those MEFs which are cultured in normoxia stop proliferating and show senescence features after 30 days in a 3T3 protocol. MEFs in hypoxia express lower levels of p21Cip1, p15INK4b and p16INK4a. MEFs have signs of proliferative stress in hypoxia, with high levels of p-H2AX (Ser139) and pp53 (Ser15), but without p53-induced proliferation arrest. Additionally, we have checked the immortalization of the MEFs in hypoxia culturing these cells, at least, for 6 months. Considering all the evidences of hypoxia as a factor promoting self-renewal and pluripotency in stem cells, we have studied the expression of differentiation/dedifferentiation and stem-related genes. We have found overexpression of dedifferentiation and stem-related genes like Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf2, Klf4, c-Myc, Bmi1 and Nanog in samples of cells cultured in hypoxia. Furthermore, we found overexpression of Tfcp2l1, which is a main regulator of pluripotency and self-renewal of ESCs, in MEFs immortalized by hypoxia. Variations in the expression levels of Tfcp2l1 can lead to cellular senescence. In the case of expression decrease, the ectopic expression of shRNAs against the mRNA of Tfcp2l1 induces senescence with proliferation arrest, high expression of p16INK4a and acid β-galactosidase activity in normoxia and hypoxia. In the case of ectopic expression of high levels of Tfcp2l1, cells senesce iv with an increase in acid β-galactosidase activity, increased p16INK4a and p21Cip1 expression levels and, also overexpression of Yamanaka factors Oct3/4, Sox2 and Klf4. This suggests that senescence induced by high levels of Tfcp2l1 is similar to oncogene induced senescence (OIS) or reprogramming induced senescence (RIS). Only the ectopic induction of expression levels of Tfcp2l1 similar to those promoted by hypoxia can produce an increase in the lifespan of MEFs in normoxia. The expression of Tfcp2l1 in hypoxia is very likely increased and maintained by the binding of Hif1α to an enhancer region close to Tfcp2l1 in the DNA. To check this, we have simulated hypoxia in normoxia using a PHDs inhibitor, we have also induced ectopic expression of a Hif1α constitutively active mutant and, finally, we have studied the regulator regions associated to Tfcp2l1 in the DNA. Hypoxia increases the expression of Tfcp2l1 and promotes its activity as transcription factor. We have performed ChIP-Seq of Tfcp2l1 in cells from normoxia and hypoxia and we found that Tfcp2l1 binds to more sequences associated to genes in MEFs immortalized in hypoxia compared to senescent MEFs cultured in normoxia. Specifically, Tfcp2l1 promotes the expression of genes which regulate proliferation, which in many cases, are also related to stem cell properties, such as Sox2, Sox9 and Tgfa. The capacity of Tfcp2l1 to promote proliferation and pluripotency is relevant in cellular reprogramming too. We have checked the causal role of Tfcp2l1 in the increase of reprogramming efficiency caused by hypoxia. As hypoxia, the ectopic expression of Tfcp2l1 in normoxia increases the number of iPSCs colonies. Moreover, the downregulation of Tfcp2l1 expression in hypoxia with shRNAs decreases the number of colonies. Additionally, the expression of Tfcp2l1 positively correlates with the expression of Nanog in iPSCs generated in hypoxia and normoxia, and negatively correlates with p16INK4a and p21Cip1. Our data suggests that the activation of Tfcp2l1 by hypoxia could be relevant in the immortalization prior to malignant transformation, facilitating tumorigenesis. Furthermore, in the tumoral microenvironment, which is hypoxic, the expression of Tfcp2l1 could support the presence of CSCs by promoting pluripotency and, consequently, cellular dedifferentiation. v ÍNDICE RESUMEN ...................................................................................................................................... i SUMMARY .................................................................................................................................... iii ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................... ix ÍNDICE DE TABLAS ..................................................................................................................... xi ABREVIATURAS .......................................................................................................................... xii INTRODUCCIÓN........................................................................................................................... 1 1. Senescencia celular .............................................................................................................. 3 2. Características de la senescencia celular ............................................................................. 3 2.1. Alteraciones de la señalización celular en senescencia ............................................... 3 2.1.1. Parada de ciclo celular .......................................................................................... 3 2.1.2. Reversibilidad de la senescencia celular .............................................................. 4 2.1.3. Resistencia a apoptosis......................................................................................... 4 2.1.4. Cambios en la cromatina ....................................................................................... 4 2.1.5. Modificaciones epigenéticas en senescencia celular ............................................ 5 2.1.6. Cambios metabólicos ............................................................................................ 6 2.1.7. Fenotipo secretor asociado a senescencia ........................................................... 7 2.2. Alteraciones estructurales y morfológicas en senescencia celular ............................... 8 2.2.1. Cambios en autofagia y lisosomas ........................................................................ 8 2.2.2. Mitocondria disfuncional ...................................................................................... 10 2.2.3. Morfología celular asociada a senescencia celular ............................................. 10 3. Mecanismos que desencadenan la senescencia celular .................................................... 10 3.1. Senescencia replicativa y daño en el ADN ................................................................. 10 3.2. Efectores de la parada proliferativa en senescencia celular ....................................... 12 3.2.1. p53 ....................................................................................................................... 12 3.2.2. Inhibidores de CDK ............................................................................................. 12 3.3. Senescencia inducida por oncogenes ........................................................................ 13 3.4. Senescencia inducida por estrés oxidativo ................................................................. 14 3.5. Senescencia inducida por terapia ............................................................................... 16 4. Implicación de la senescencia celular en procesos fisiológicos y patológicos ................... 17 4.1. Senescencia celular en desarrollo embrionario .......................................................... 17 xii ABREVIATURAS 1. 53BP1: proteína 1 de unión al supresor de tumores p53. 2. ADN: ácido desoxirribonucleico. 3. ADP: adenosín difosfato. 4. AMP: adenosín monofosfato. 5. AMPK: proteína quinasa activada por AMP. 6. ARF: marco alternativo de lectura. 7. ARN: ácido ribonucleico. 8. ARNm: ARN mensajero. 9. ATP: adenosín trifosfato. 10. Bax: regulador de la apoptosis asociado a BCL-2 asociado a X 11. BCL-2: regulador de la apoptosis BCL-2 12. CDC2: proteína 2 del control de la división celular. 13. CDKs: quinasas dependientes de ciclina. 14. CIP: cóctel de inhibidores de proteasas. 15. CKIs: inhibidores de CDKs. 16. CSCs: células madre tumorales. 17. CTCs: células de tumor circulantes. 18. DDR: respuesta a daño en el ADN. 19. DNA-SCARS: segmentos de ADN con alteraciones de cromatina que refuerzan la senescencia. 20. DSBs: roturas de doble cadena en el ADN. 21. EMT: transición epitelio-mesénquima 22. EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica. 23. ER: retículo endoplasmático. 24. ESCs: células madre embrionarias. 25. FIH1: factor inhibidor de HIF1α. 26. H2AX: variante X de la histona H2A. 27. H3K27: residuo de lisina 27 de la histona H3 28. H3K27ac: residuo de lisina 27 de la histona H3 acetilado. 29. H3K27me2/3: residuo de lisina 27 de la histona H3 dimetilidado o trimetilado. 30. H3K4: residuo de lisina 4 de la histona H3. 31. H3K4me3: residuo de lisina 4 de la histona H3 trimetilado. 32. HIFs: factores inducibles por hipoxia, en los que se incluyen las subunidades HIFα (HIF1α, HIF2α y HIF3α) y HIF1β. 33. HRE: elementos de respuesta a hipoxia. 34. IgG: inmunoglubulina G. 35. iPSCs: células madre pluripotentes inducidas. 36. MAPK: proteína quinasa activada por mitógenos. xiii 37. MEFs: fibroblastos embrionarios de ratón. 38. mTOR: diana de la rapamicina en mamíferos. 39. mTORC1 y mTORC2: mTOR complejos 1 y 2. 40. NAD+: dinucleótido de nicotinamida y adenina en su forma oxidada. 41. NADH: dinucleótido de nicotinamida y adenina en su forma reducida. 42. NFκB: factor nuclear kappa B. 43. OIS: senescencia inducida por oncogenes. 44. OSKM: factores de Yamanaka Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc. 45. PcG: grupo de proteína Polycomb. 46. PHDs: enzimas con dominio prolil hidroxilasa. 47. PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo. 48. pRB: proteína del Retinoblastoma. 49. PRC1 y PRC2: complejos de proteínas represoras 1 y 2. 50. RIS: senescencia inducida por reprogramación. 51. ROS: especies reactivas del oxígeno. 52. SADSs: distensión de satélites asociada a senescencia. 53. SAHFs: foci de heterocormatina asociados a senescencia. 54. SASP: fenotipo secretor asociado a senescencia. 55. shARN: “short hairpin” ARN, ARN artificial de interferencia. 56. TASCC: compartimento de acoplamiento espacial autofágico de mTOR. 57. TCA: ciclo de los ácidos tricarboxílicos. 58. TERT: enzima telomerasa transcriptasa reversa. 59. TIS: senescencia inducida por terapia. 60. VHL: proteína von Hippel-Lindau. 61. WT: fenotipo salvaje. 62. X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido. INTRODUCCIÓN Introducción 3 1. Senescencia celular La senescencia es un estado celular caracterizado, principalmente, por la parada proliferativa, cuyo fenotipo asociado la distingue de otros estados celulares en los que se detiene la proliferación como la quiescencia, la diferenciación terminal o el agotamiento celular típico de células madre y linfocitos T1. Aunque clásicamente se ha definido la parada proliferativa en senescencia como definitiva, algunos autores apoyan la posible recuperación de la proliferación bajo ciertas condiciones genéticas y/o transcriptomicas2. El fenotipo senescente presenta características muy variables que se adquieren en múltiples pasos y que dependen del contexto genético y el tipo celular. Sin embargo, entre esta variedad de características destacan los cambios en la estructura de la cromatina y modificaciones epigenéticas específicas, cambios metabólicos, alta actividad β-galactosidasa ácida, un fenotipo de secreción aumentada de citoquinas y quimioquinas, además de la alteración de orgánulos y la morfología citoplasmática, entre otras. La senescencia puede ser inducida a través de diferentes mecanismos intrínsecos y extrínsecos, entre ellos se incluyen el acortamiento telomérico y la respuesta a daño en el ADN, la detección de señales oncogénicas, el daño producido por quimioterápicos y radiación ionizante o el estrés oxidativo3,4. Ha sido ampliamente demostrado que la senescencia es necesaria en la regulación de diversos procesos fisiológicos. Entre ellos destaca la supresión tumoral, sobre la que se han recogido una gran cantidad de evidencias tanto en modelos in vivo como en pacientes5,6. Además de esto, la senescencia participa en el desarrollo de diversas estructuras del embrión, también regula la cicatrización de tejidos y participa en la reprogramación celular implicada en la regeneración tisular7. Por otro lado, la aparición de células senescentes correlaciona con el envejecimiento de los tejidos y está implicada en los efectos deletéreos de patologías asociadas a él8. 2. Características de la senescencia celular 2.1. Alteraciones de la señalización celular en senescencia 2.1.1. Parada de ciclo celular El ciclo celular comprende 4 fases conocidas como G1, G2, S y M. La progresión de una fase del ciclo celular a la siguiente está mediada, principalmente, por la acción conjunta de ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Participan 10 ciclinas agrupadas en 4 clases (A, B, D y E) que se sintetizan y degradan de manera específica a lo largo de las distintas fases del ciclo, regulando así la actividad de las CDKs. De estas últimas, 3 tienen función en interfase o fase S (CDK2, CDK4 y CDK6) y 1 tiene función en la mitosis (CDK1, también conocida como CDC2). Por lo general, las células senescentes poseen un contenido de ADN típico de fase G1 (2N). Esto sucede debido a la alta expresión de inhibidores de CDKs (CKIs) pertenecientes a la familia INK4 y la familia CIP/KIP. Estos CKIs inhiben la acción de CDK2, CDK4 y CDK6 y, por tanto, detienen el ciclo celular en G1. Además, durante esta fase del ciclo, existe un punto Introducción 4 de control denominado punto de restricción o punto R. Aquí se integran las señales intrínsecas y extrínsecas para permitir la transición hacia fase S. Al inducirse senescencia, diferentes factores confluyen para mantener activa a la proteína retinoblastoma (pRB) y bloquear así la transición G1/S. Entre los distintos factores, es muy importante la alta expresión de los CKIs9,10. 2.1.2. Reversibilidad de la senescencia celular Existen múltiples estudios que apoyan la entrada de nuevo en ciclo por parte de las células senescentes. Por ejemplo, la pérdida puntual de proteínas de la familia de pRB permite el reinicio del ciclo celular de fibroblastos que han alcanzado senescencia inducida por la sobreexpresión de RAS mutado11. En senescencia replicativa, la inactivación de p53 también permite la vuelta a la proliferación si los niveles de p16INK4a son bajos12. También se ha demostrado que JMJD2C y LSD1, proteínas demetilantes de H3K9, son capaces de promover la proliferación tras la parada causada por la senescencia inducida por oncogenes (OIS)13. En esta misma idea se basan los estudios que abogan por la reversibilidad de la senescencia inducida por terapia (TIS) para explicar la entrada como células durmientes de células tumorales que posteriormente puede causar la recaída en pacientes de cáncer, como se ha observado en cáncer de mama, colon, pulmón, próstata o glioblastoma14–19. 2.1.3. Resistencia a apoptosis Las células senescentes se caracterizan por una señalización en favor de la supervivencia que confiere resistencia a la apoptosis o muerte celular programada. En condiciones normales, ante estreses de diferente naturaleza, como los que producen daño grave en el ADN, se detecta la inviabilidad celular y se activan señales proapoptóticas. Entre estas señales destacan aquellas promovidas por la actividad de p53, como la activación de sus dianas transcripcionales BAX o NOXA20. Sin embargo, las células senescentes presentan una alta actividad de moléculas con función antiapoptótica o de supervivencia como aquellas de la familia BCL-2, BCL-xL y BCL-w, PI3K o p21CIP1 3,4,21. Se ha comprobado utilizando modelos deficientes en p21CIP1 que su señalización es esencial para la resistencia a apoptosis en senescencia. En ausencia de p21CIP1, la acumulación de daño en el ADN provoca la activación de JNK y de caspasas, vía ATM y NFκB, lo cual, permite que se lleve a cabo la apoptosis. Esta señalización en favor de la supervivencia también se ha observado en células tumorales22. Además, in vivo, la inhibición especifica de las moléculas antiapoptóticas BCL-W y BCL-XL logra eliminar células senescentes en pulmón y en la epidermis21. 2.1.4. Cambios en la cromatina Las células senescentes se caracterizan por acumular daño en el ADN, lo cual tiene consecuencias sobre la estructura de la cromatina. Así, en células senescentes se forman foci nucleares denominados segmentos con alteraciones de cromatina que refuerzan la senescencia (DNA-SCARS) y se mantienen permanentemente en la célula. Aunque contienen proteínas activas de reparación del ADN como CHK2 o p53 al igual que los foci transitorios de reparación de daño en el ADN, difieren de ellos por no contener ADN de simple cadena o ADN en síntesis, Introducción 5 además de asociarse a cuerpos nucleares PML y carecer de proteínas RPA y RAD5. Estos foci pueden promover el fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP) y la parada de ciclo celular, para la cual, necesitan de p53 y pRB, aunque su formación es independiente de ambas proteínas23. También es posible observar en células senescentes foci de heterocromatina asociados a senescencia (SAHFs). Estas estructuras coinciden con los promotores de genes de ciclo celular que responden a factores de transcripción E2F, silenciándolos en colaboración con pRB24,25. Los SAHFs se originan a partir de la reorganización espacial de marcas epigenéticas represoras como metilación de H3K9, HP1 o macroH2A y carecen de la histona “linker” H126,27. Otra alteración de la cromatina observada en senescencia es la distensión de satélites asociada a senescencia (SADSs) que consiste en la descondensación de la heterocromatina constitutiva formada por el ADN satélite pericentromérico. Esta alteración aparece con antelación a los SAHFs en células senescentes y difiere de ellos por conservar marcas epigenéticas canónicas y por ser independiente de rutas de señalización específicas de senescencia28. 2.1.5. Modificaciones epigenéticas en senescencia celular Las células sufren grandes cambios epigenéticos durante la adquisición del fenotipo senescente. Estas alteraciones tienen como consecuencia cambios en la accesibilidad de la cromatina y, por tanto, afectan a la expresión génica. Entre las modificaciones epigenéticas que sufren mayores variaciones durante la senescencia celular se hallan la metilación del ADN y las modificaciones de histonas29. La senescencia replicativa está asociada a ADN globalmente hipometilado en sitios CpG, a excepción de algunos de estos sitios que sí se encuentran hipermetilados. Esta hipometilación se asocia a la desregulación del enzima DNMT1 adquirida con el número de replicaciones y está asociada al incremento de p16INK4a y p21CIP1 29. Sin embargo, en senescencia prematura, como en la inducida por tratamiento con doxorrubicina, radiación o en sobreexpresión de RAS oncogénico no se observa esta hipometilación del ADN. Se ha sugerido que es debido a que las células no realizan el número de duplicaciones suficientes como para adquirir las modificaciones de metilación encontradas en senescencia replicativa 30–32. Las histonas son modificadas postraduccionalmente en su cola amino-terminal, alterando así la interacción entre nucleosomas y regulando la estructura de la cromatina en último lugar33. La senescencia replicativa se asocia a la disminución global de histonas y, por tanto, de histonas modificadas. Así, se ha sugerido que el represor Rap1 abandona sus sitios de unión en los extremos cromosómicos para unirse a los genes que codifican las histonas. A su vez, se ha observado una disminución generalizada de las modificaciones de histona H4K16Ac, H3K4me3, H3K9me3 y H3K27me3, y un aumento de H3K9Ac y H4K20me3, junto con p-H2AX. Esta última, se asocia con acortamiento telomérico y colocaliza con la maquinaria de reparación de roturas de doble cadena (DBS)29. Además, también se sabe que en senescencia la histona macroH2A1.1 aumenta la actividad de PARP1, dando lugar al aumento de SASP por la vía PARP/NFkB. En este caso se genera un bucle en pro de la senescencia en el que factores SASP incrementan la expresión de macroH2A134,35. Introducción 6 La modificación de histonas también puede servir para reclutar enzimas remodeladoras de la cromatina que utilizan la energía de la hidrólisis de ATP para reposicionar los nucleosomas33. Se han asociado diversos de estos procesos a la senescencia. Por ejemplo, ARID1B, que forma parte del complejo remodelador SWI/SNF, puede provocar daño en el ADN y producir especies reactivas del oxígeno (ROS). De este modo, se aumenta la expresión de p53, p21CIP1 y p16INK4a y se inicia la senescencia36,37. Además, el complejo SWI/SNF también facilita el desalojo del complejo represivo 2 (PRC2), que es parte del grupo de proteínas Polycomb (PcG), y así puede dar lugar a la activación de la expresión de los genes codificados por el locus INK4a/ARF38. 2.1.6. Cambios metabólicos A pesar de permanecer en un estado no proliferativo, las células senescentes presentan un alto nivel metabólico. Esto es debido a la alta demanda de energía y de componentes celulares que exige el fenotipo senescente3,39,40. Por un lado, el catabolismo en células senescentes se centra en un alto consumo de glucosa para generar ATP. Se sabe que la glicolisis aumenta ante estímulos oncogénicos, genotóxicos y en senescencia replicativa. Además, la mitocondria disfuncional, que es característica de la senescencia, no sólo afecta a la producción de ATP, sino también directamente al balance redox de la célula y una ratio NAD+/NADH baja conduce a la parada proliferativa41,42. Por otro lado, el anabolismo se centra en la síntesis de proteínas, para el desarrollo del fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP), y de lípidos, para llevar a cabo la autofagia y síntesis de orgánulos membranosos. Además, la síntesis de glucógeno también se ha observado aumentada en fibroblastos humanos senescentes y en el envejecimiento de diversos tejidos39. Adicionalmente, los efectos del estrés replicativo también son notables en la síntesis de ADN43. En cuanto a las rutas de señalización catabólicas alteradas en senescencia, destaca la activación de AMPK y NFkB. Por ejemplo, en el caso de la senescencia inducida por radiación ionizante, la activación de AMPK favorece el flujo glicolítico y activa NFκB, lo cual también promueve la producción de factores SASP. En cambio, se ha observado que en el caso de OIS, es necesaria pRB para la activación de la vía glicolítica. Sin embargo, la producción de lactato en ambos casos da lugar a la activación de NFkB de nuevo y al refuerzo del SASP y del fenotipo senescente40. Además, los altos niveles en la ratio AMP/ATP o ADP/ATP que caracterizan a las células senescentes pueden provocar que la activación AMPK sea crónica. Cuando esto sucede, AMPK puede activar a p53 y provocar el inicio de la senescencia44. Adicionalmente, los niveles en senescencia de NAD+/NADH pueden activar PARP y sirtuinas, capaces de promover también la expresión de NFkB y, por tanto, el SASP45. Entre las rutas anabólicas que aparecen alteradas en el fenotipo senescente, destacan la señalización de GSK3, ATM, SREBP1 y mTOR. GSK3 es un regulador principal de la glucogenogénesis que puede inactivarse al ser fosforilado por AKT. Si GSK3 se encuentra desfosforilado, se activa GS que media la formación de glucógeno a partir de glucosa-6-fosfato. Introducción 7 Se ha demostrado que la inhibición de GSK3 puede dar lugar a senescencia y acumulación de glucógeno39. En el caso de ATM, se sabe que su activación en condiciones de estrés replicativo da lugar a senescencia celular. En estas condiciones se restringe el consumo de glucosa y glutamina para disminuir la producción de dNTP a través de la ruta de las pentosas fosfato43. Por otro lado, SREBP1 es un regulador clave de la lipogénesis y su expresión es alta en células proliferativas para aumentar el número de orgánulos membranosos que repartir en la división celular. Algunas células senescentes también tienen alta expresión de este regulador y sus enzimas diana (FAS, ACC y ACL). Su sobreexpresión conduce al aumento lípidos de membrana y de la masa celular, sin embargo, también provoca la parada proliferativa por el desbalance adquirido al no suceder la mitosis46. En la regulación de SREBP1 intervienen mTOR, AMPK y GSK3. Finalmente, en cuanto a la síntesis de proteínas, se sabe que tanto GSK3 como mTOR son capaces de inhibir la traducción mediante la inhibición de EIF4 e EIF2b, respectivamente39. mTOR es una proteína quinasa con función de sensor de nutrientes que regula el metabolismo y el crecimiento celular y tiene un papel fundamental en senescencia celular. mTOR se puede encontrar formando dos complejos diferentes según las proteínas de andamiaje que lo acompañen. mTORC1 cuyo complejo lo caracteriza la proteína Raptor y mTORC2 en el que destaca Rictor. Se ha demostrado en múltiples estudios que la inhibición de mTORC1 se asocia al incremento de la esperanza de vida y puede aliviar los síntomas de patologías asociadas al envejecimiento (Síndrome de Leigh, enfermedades cardiovasculares, Alzheimer, Parkinson). Esto se ha comprobado en múltiples organismos mediante su inhibición directa con rapamicina y también mediante dieta de restricción calórica47. Se ha observado que la señalización de mTORC1 es elevada durante la senescencia replicativa, en OIS y en la inducida por ROS mitocondrial. Además, mTOR se considera responsable de la irreversibilidad de la parada proliferativa en senescencia o geroconversión. En modelos de senescencia inducida por p16INK4a y por p21CIP1, la inactivación de estos CKIs basta para la vuelta a la proliferación, mientras que, si en esas condiciones se activa mTOR, la parada es irreversible. Sin embargo, se ha comprobado que, en ciertos tipos celulares, la parada proliferativa mediada por p53 no se hace irreversible con la activación de mTOR ya que p53 puede inhibir su función en ciertos contextos. Además, mTORC1 también es capaz de promover SASP a través del aumento de IL1α y de MAPKAPK239,47,48. 2.1.7. Fenotipo secretor asociado a senescencia Los cambios genéticos y metabólicos que sufre la célula durante la adquisición del fenotipo senescente llevan a la síntesis y secreción aumentadas de una gran variedad de moléculas. El fenotipo secretor asociado a senescencia, también conocido como secretoma mensajero senescente, lo forman el conjunto de citoquinas, quimioquinas y proteasas sintetizadas por las células senescentes. Estas moléculas le sirven a la célula en la comunicación con las células y tejidos de su alrededor. El SASP es un fenotipo heterogéneo y pleiotrópico, que depende del contexto genético, el tipo celular y el microambiente. Por tanto, sus funciones son también diversas y entre ellas se han encontrado aspectos fisiológicos positivos y negativos3,49. Introducción 14 genómica característica de las células tumorales. Los mecanismos propuestos por lo que esto sucede son múltiples (disminución de nucleótidos o de factores de replicación, aumento o reducción de “origin firing”, reducción de ratio de elongación de las horquillas de replicación)103– 105. Recientemente, un estudio ha identificado y comparado los sitios de origen de replicación generados antes y después de la activación de los oncogenes CCNE1 y MYC. Se localizaron orígenes de replicación dentro de genes altamente transcritos tras la sobreexpresión de ambos oncogenes. Las horquillas de replicación en estos casos colapsaban debido al conflicto entre la transcripción y la replicación y esto se asocia con DSBs y “chromosomal rearrangement breakpoints” en el modelo celular mencionado y también en muestras de pacientes de cáncer105. Las evidencias de que la OIS es un fenómeno fisiológico son abundantes, recogidas en modelos animales y en tumores de pacientes. Por ejemplo, en nevus melanocítico adquirido y congénito (lesiones benignas derivadas de melanocitos) se ha identificado actividad βgalactosidasa ácida, alta expresión de p16INK4a y ausencia de MIB1 sin actividad proliferativa106,107. Además, en ratones transgénicos que sólo sobreexpresan BRafV600E en melanocitos se observó parada proliferativa, mientras que en combinación con la falta de genes supresores tumorales como PTEN se generaban melanomas 108,109. Igualmente, en pulmón, un modelo de expresión inducible del oncogén KRas-V12 se empleó para estudiar lesiones neoplásicas. Se pudo observar actividad β-galactosidasa ácida, expresión de p16INK4A e indicios de SAHFs solamente en los múltiples adenomas hallados. Sin embargo, los pocos adenocarcinomas que se generaron no presentaban estos marcadores de senescencia110. Del mismo modo, en un modelo de ratón de pérdida del supresor de tumores PTEN se pudo observar marcadores de senescencia en las neoplasias de estadio temprano en próstata, pero no en los tumores malignos más avanzados que se generaron solo tras eliminar también la expresión de Trp53111. Cuando se expresaba NRAS en células linfoides de ratón, se observaban evidencias de OIS. Si a esta sobreexpresión oncogénica se sumaba la mutación de Suv39h1 (Histona metiltransferasa que media silenciamiento de pRb) o del locus de p53, se producían linfomas112. También en glándula pituitaria de ratón se han hallado evidencias de OIS tras la expresión de E2F, lo que interrumpía la proliferación y evitaba la tumorigénesis113. Además, en humanos, los microadenomas de esta glándula tienen una prevalencia del 10-25%. Se han analizado evidencias que sugieren que la OIS frena un mayor desarrollo de este tipo de lesiones114. 3.4. Senescencia inducida por estrés oxidativo Existen diferentes teorías que relacionan el estrés oxidativo con la senescencia celular y el envejecimiento. Todas ellas han sido actualizadas frecuentemente desde que el Dr. Denham Harman propusiera en 1956 la teoría del envejecimiento de los radicales libres. Según esta teoría “el envejecimiento debe de estar relacionado con un ataque de los radicales libres, generalmente productos de procesos metabólicos, a los componentes celulares”115. Más tarde, se focalizó esta teoría de radicales libres hacia la mitocondria y se propuso también que sus efectos deletéreos sobre la célula eran fruto de un desbalance en el equilibrio prooxidante-antioxidante en favor de la oxidación116. Introducción 15 Los radicales libres más comunes que se producen en el metabolismo normal de la célula son el anión superóxido (O2-) y el radical hidroxilo (-OH). En concreto, la mitocondria disfuncional se caracteriza por una fuga de electrones que genera O2- como producto secundario, especialmente, de las reacciones llevadas a cabo en el complejo I (NADH deshidrogenasa) y en el complejo III (complejo del citocromo bc1). Moléculas de diferente tipo como lípidos, proteínas y ADN se dañan en presencia de estos radicales. Cuando el estrés oxidativo alcanza niveles elevados y esto se prolonga en el tiempo, la célula adquiere un fenotipo similar al senescente. Además, la acumulación de ROS parece contribuir en la inducción de OIS, en TIS y también en la senescencia mediada por p16INK4a 117. ROS puede dañar el ADN de diversas maneras: daño en una única base, uniones covalentes o cross-linking intracatenario, aductos ADN-proteína y enlaces intercatenarios118. Además, se ha relacionado a ROS con un aumento del acortamiento de los telómeros119. De este modo, ROS puede inducir DDR y el consecuente inicio de la senescencia. Sin embargo, se ha propuesto también una posible retroalimentación positiva entre la DDR inducida por estrés oxidativo y la propia producción de ROS. Este bucle sería promovido por la activación a largo plazo de p21CIP1 y trae como consecuencia el deterioro de las mitocondrias y la consecuente fuga de electrones120. Las proteínas son otra de las principales dianas de ROS en su contribución al estrés oxidativo. ROS tiene un papel importante en la señalización celular que se lleva a cabo mediante ciclos de oxidación-reducción de residuos aminoacídicos de las proteínas, generalmente metionina y cisteína. Sin embargo, existen modificaciones oxidativas que no son reversibles de manera enzimática como la carbonilación. Cuando esto ocurre, y existe un cúmulo excesivo de proteínas oxidadas, la célula debe degradarlas vía proteasoma. No obstante, las proteínas oxidadas y unidas en cross-linking inhiben el proteosoma y se acumulan dentro de los lisosomas117,121. Para evitar el daño producido por ROS, la célula posee distintos mecanismos de protección basados en moléculas antioxidantes. Esta regulación hacia la homeostasis se lleva a cabo por moléculas antioxidantes endógenas como el glutatión y enzimas como superóxido dismutasas, catalasas o tiol peroxidasas. A su vez, la célula puede tomar ventaja de moléculas exógenas como micronutrientes o vitaminas117. Existen evidencias que indican que la falta de enzimas antioxidantes contribuye a la aceleración del envejecimiento. Por ejemplo, ratones deficientes en PrxIII tienen una disminución de las capacidades fisiológicas prematura respecto al fenotipo silvestre122. La disminución de PrxI acelera la aparición de anemias hemolíticas y de tumores en ratón123. En fibroblastos humanos, la expresión de enzimas sulfóxido reductasas disminuye durante la senescencia replicativa124. Además, las moléculas antioxidantes no enzimáticas también parecen tener un papel en el retraso de la senescencia. Por ejemplo, el balance glutatión oxidado/reducido crece a favor de la oxidación con la edad en sangre de sujetos sanos y también en células madre de tejido adiposo117,125. Sin embargo, altas dosis, no citotóxicas, de antioxidantes sintéticos provoca senescencia prematura en células madre mesenquimales126. Introducción 16 A pesar de todas la evidencias y teorías clásicas, recientemente ha ido creciendo el número de estudios que ponen en entredicho el efecto deletéreo de ROS en senescencia y envejecimiento. Se ha observado en levadura y C. elegans que el incremento de ROS y el daño oxidativo no necesariamente acelera el envejecimiento127. En ratones, la modificación genética para el aumento de ROS mitocondrial tampoco acelera el envejecimiento128 y el incremento de antioxidantes no extiende la esperanza de vida129. Ha ganado interés el papel de ROS en señalización celular y homeostasis que puede promover la proliferación y la supervivencia celular en determinadas circunstancias. Por ello, se ha propuesto que aunque ROS interviene en la señalización de daño causado por envejecimiento, quizá su acumulación con la edad en el organismo no tenga por qué implicar un papel causal en el mismo130. 3.5. Senescencia inducida por terapia La senescencia inducida por terapia (TIS) es aquella iniciada en las células tumorales y en otras células de pacientes como consecuencia de un tratamiento de radioterapia, quimioterapia o terapia dirigida contra la enfermedad del cáncer88,131. Existen evidencias de la TIS desde el descubrimiento de la OIS. Varios estudios revelaron la importancia de las vías de señalización de p53 y p16INK4a en la inducción de senescencia en tumores tras el tratamiento, así como su relación con el pronóstico in vivo132–134. Este descubrimiento supuso la anulación del paradigma de la inmortalidad de las células tumorales y la creencia de que no podían adquirir un fenotipo senescente135. La mayoría de los tratamientos contra el cáncer producen daño al ADN en las células tumorales y en las células no transformadas del paciente. Esto desencadena la DDR y puede desembocar en el inicio de la senescencia. En el caso de la radiación ionizante, se ha descrito su capacidad de producir TIS de manera dependiente de dosis y de tipo celular. A nivel molecular, la parada de ciclo celular inducida por la radiación ionizante en terapia depende de p21CIP1 y del estado mutacional de p53 como se ha comprobado en tumores de mama, colorrectal y en glioblastoma136,137. Además, la radiación ionizante aumenta la producción de ROS en las células, especialmente ROS mitocondrial, y daña el ADN. También se sabe que la proteína AKT puede contribuir en el incremento de ROS que inicia p53 en la senescencia inducida por radioterapia138. In vivo, se ha comprobado que la radiación ionizante provoca daño en los progenitores hematopoyéticos de la médula ósea debido al aumento de ROS en estas células139. Múltiples agentes quimioterápicos incluidos en la práctica clínica inducen TIS. Esto incluye fármacos como docetaxel, doxorrubicina, vincristina, cisplatino, ciclofosfamida o hidroxiurea88,140. Recientemente, se estudió el efecto de más de 50 compuestos de bajo peso molecular que pueden inducir senescencia, entre los que se encuentran muchos agentes quimioterápicos. Se observó que las células tumorales podían iniciar la senescencia de igual modo que las no transformadas y que no existía una característica fenotípica común para los diferentes modelos y compuestos. Sin embargo, en la mayoría de casos existía alta actividad β-galactosidasa ácida y cambios morfológicos en las células, pero en pocos se hallaron evidencias de SASP141. También se ha comprobado, en ratones que padecen linfomas iniciados por Myc, que el Introducción 17 tratamiento con ciclofosfamida provoca fenotipo senescente con alta expresión de p53 y p16Ink4a. Esto, además, correlacionaba con un mejor pronóstico de supervivencia de los animales133. Además, se ha observado senescencia en biopsias de pacientes de cáncer de mama, pulmón y próstata sometidos a tratamiento de neoadyuvancia, correlacionando con el mejor pronóstico 6,88. También existen terapias basadas en inhibidores específicos de moléculas relevantes en el desarrollo de los tumores como las CDKs, NOTCH, CK2, MDM2, JAK2 o SKIP288. Entre los efectos positivos de la inducción de senescencia en tumores se halla la parada proliferativa y la apoptosis de las células tumorales y la consecuente anulación de la progresión de la enfermedad. También se ha sugerido como beneficiosa la inducción paracrina de la senescencia a células tumorales cercanas131. Esto se ha intentado demostrar en células tumorales, aunque no todas las líneas tumorales responden al medio condicionado por SASP iniciando también la senescencia142. Sin embargo, entre los efectos negativos se sugiere que la TIS inducida por radiación o quimioterapia en células del microambiente tumoral lleva a efectos protumorales. Por ejemplo, en células epiteliales premalignas, la producción de SASP, en concreto IL6 e IL8, da lugar a un fenotipo de malignidad e invasividad143. Otro efecto adverso para los pacientes es la salida de las células tumorales de ese estado senescente inducido por la terapia que puede significar la recaída de la enfermedad. Este fenómeno es conocido como “células durmientes” y ha sido observado en células de distintos tipos de cáncer como próstata, mama, colon, pulmón o glioblastoma14–19. Por ejemplo, en varios estudios se producen tumores al implantar células tanto en ratones inmunodeprimidos como en ratones inmunocompetentes tras inducir TIS con etopósido o doxorrubicina14. 4. Implicación de la senescencia celular en procesos fisiológicos y patológicos 4.1. Senescencia celular en desarrollo embrionario Actualmente, existen evidencias de la presencia de tejido senescente en embriones en desarrollo de los siguientes organismos: humano, ratón, pollo, codorniz, pez cebra, axolote, rana de uñas africana y rata topo desnuda. La mayor parte de estas evidencias se han recabado en embriones de ratón entre los días de gestación 9,5 y 15,5. También se han observado células positivas en actividad β-galactosidasa ácida en embriones en estadios de desarrollo más temprano (día 5,5 de gestación). Sin embargo, no se ha podido confirmar completamente la presencia de senescencia en estos estadios debido a la falta de otras características fenotípicas7. En el embrión de ratón de 13,5 días de gestación, se ha detectado senescencia en el mesonefros o estructura renal y en el saco endolinfático del oído interno. En estas estructuras, la actividad β-galactosidasa ácida iba acompañada de parada proliferativa, de expresión de p21Cip1 y de factores SASP. La senescencia en estas estructuras depende esencialmente de p21Cip1 y en su regulación participan las rutas Tgf-β/Smad y PI3K/Foxo, pero es independiente de p16INK4a, Arf, p53 y daño en el ADN. Además de esto, los ratones deficientes en p21CIp1 tienen un desarrollo normal, compensando el fenómeno de senescencia con el de apoptosis, pero Introducción 18 presentan alteraciones morfológicas en las extremidades, los riñones y la vagina66,67. En humanos, se han hallado evidencias similares. El mesonefros y el saco endolinfático en embriones de aproximadamente 9 semanas de gestación son positivos para p21CIP1 y negativos para el marcador de proliferación Ki6766. Estas células senescentes aparecen de manera transitoria en los mismos tejidos y estadios en diferentes embriones siendo eliminadas, generalmente por apoptosis o, posteriormente, por los macrófagos. Esto evidencia que la senescencia en el desarrollo embrionario no es un mecanismo general de respuesta al daño, sino que es un proceso fisiológico altamente regulado7. 4.2. Senescencia celular en cicatrización Múltiples estudios han demostrado la importancia de la senescencia en el proceso de cicatrización de heridas en diferentes tejidos como el hígado, la piel, el corazón y el pulmón. En hígado, las células estrelladas o células de Ito producen fibrosis que contribuye a la cicatrización de tejido dañado. Estas células responden al daño proliferando y secretando la matriz extracelular que convierte el tejido en fibrótico. Sin embargo, al mismo tiempo también se detectan otras células estrelladas con fenotipo senescente. La inhibición de la senescencia con modelos de ratón deficientes en p53 e INK4a/Arf en estas condiciones de daño, lleva a la fibrosis excesiva del hígado de ratón144. En la piel, se ha demostrado que la proteína CCN1 es secretada por células senescentes en tejido dañado. CCN1 es capaz de aumentar el daño en el ADN e incrementar los niveles de ROS y la actividad de p53 y de la ruta p16INK4A/pRB. Esto desemboca en la senescencia de algunas células del tejido dañado y, en modelos deficientes en Ccn1, la ausencia de células senescentes provoca una fibrosis excesiva145. También en la piel se ha empleado un modelo de ratón que permite la visualización de células senescentes y su eliminación. Cuando se produce la herida, estas células secretan PDGF-AA, que promueve la diferenciación de miofibroblastos que contribuyen en el cierre de la herida. La eliminación selectiva de las células senescentes dificulta la cicatrización en este modelo65. Otros estudios también evidencian que la cicatrización está mediada, al menos en parte, por la senescencia. En el corazón infartado, con falta de oxígeno, se conoce la presencia de células senescentes. En estas condiciones se observa un aumento de p53 y de la secreción de citoquinas y de colágeno que también se detecta en fibroblastos cardíacos en hipoxia. La inhibición in vivo de p53 en condiciones de hipoxia disminuye la fibrosis y la infiltración de macrófagos, pero no la secreción de colágeno146. Por otro lado, la fibrosis pulmonar idiopática es una enfermedad grave en la cual se han observado células senescentes en tejido pulmonar y cuya severidad correlaciona con los niveles de expresión de p16INK4a. La eliminación in vivo de células senescentes con altos niveles de expresión de p16INK4a mediante modelos genéticos o el uso de fármacos dirigidos contra ellas, denominados senolíticos, aumenta la salud del pulmón, aunque no disminuye la fibrosis147. Introducción 19 4.3. Relación entre la senescencia celular y el envejecimiento del organismo En 2013, López-Otín et al. revisaron las características asociadas al envejecimiento del organismo y lo definieron como una disminución de la integridad fisiológica con pérdida funcional y ganancia de la vulnerabilidad a la muerte. Entre las nueve características comunes del envejecimiento que se definieron se encuentra la senescencia celular127. Ya en 1995, Dimri et al. observaron por primera vez, que la actividad β-galactosidasa ácida correlacionaba positivamente con el envejecimiento del tejido de piel64. En 1997, Serrano et al. describieron por primera vez la senescencia celular como primera respuesta a activación oncogénica en células normales100. Posteriormente, surgieron múltiples evidencias de la relevancia de la senescencia como mecanismo de supresión tumoral in vivo106–114. Sin embargo, pronto se sumarían a esos estudios, aquellos que demuestran la contribución de la senescencia, especialmente del SASP, como factor que favorece la progresión tumoral, la recaída y la metástasis, características de la enfermedad del cáncer que correlacionan positvamente con el envejecimiento del organismo148. Además, actualmente se conoce que tanto la acumulación de células senescentes en los tejidos durante el envejecimiento como la función proinflmatoria del SASP se asocian con el conjunto de efectos deletéreos que produce la activación crónica del sistema inmune durante el envejecimiento. Este fenómeno es conocido como “inflammaging” 45,149 Se ha demostrado que ciertos efectores de la senescencia incrementan su expresión con el envejecimiento como los genes del locus INK4a/ARF 150–154. Por ejemplo, las células-β de los islotes pancreáticos incrementan la expresión de p16INK4a con el envejecimiento, limitando su capacidad regenerativa152. Además, en las células satélite de músculo envejecido, se pierde la represión del locus de p16INK4a, contribuyendo a la pérdida de capacidad regenerativa155. En un modelo de ratón diseñado para inducir apoptosis en las células que expresan p16INK4a, disminuía la aparición de tumores y el deterioro asociado a la edad de órganos como el riñón o el corazón cuando se eliminaban las células que lo expresaban156. Hasta la fecha, se ha demostrado que la eliminación de células que expresan p16INK4a in vivo mejora lo síntomas de diversas enfermedades asociadas al envejecimiento como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la osteoporosis, la arteriosclerosis y la osteoartritis7. 5. Hipoxia y senescencia celular 5.1. Mecanismos de adaptación fisiológica a niveles bajos de oxígeno Aunque los niveles de oxígeno de nuestra atmósfera sean de entorno al 20%, la disponibilidad de este elemento no es tal en nuestro organismo. El oxígeno debe distribuirse desde el sistema respiratorio hacia todos los tejidos a través del flujo sanguíneo y, por tanto, todas las células no están expuestas a él del mismo modo. Por ejemplo, en el cerebro humano se detecta una concentración de oxígeno cercana al 4%, similar a la media del músculo esquelético o el hígado. El corazón presenta unos valores del 3,3% y los pulmones, pese a ser los órganos de captación de oxígeno, son nutridos por concentraciones del 5,6%. Órganos como el intestino delgado o los riñones presentan concentraciones mayores al 8% y a la piel, sin embargo, sólo llega oxígeno al 1%157. Introducción 20 En mamíferos existe una respuesta al descenso de los niveles de oxígeno a nivel sistémico y también una respuesta a nivel molecular. La respuesta fisiológica completa consiste en reflejos agudos de hiperventilación y activación simpática para incorporar más oxígeno y distribuirlo por el organismo158. Para llevar a cabo esta función existen órganos especializados formados por células sensibles a oxígeno como el cuerpo carotídeo 159,160. Cualquier circunstancia o patología que suponga una interrupción en la captación y distribución del oxígeno puede desencadenar esta respuesta. Por ejemplo, la altitud geográfica supone un descenso de la concentración de oxígeno atmosférico y desencadena una respuesta sistémica de adaptación161. Por otro lado, a nivel patológico, fallos respiratorios, de flujo sanguíneo o en los niveles de hemoglobina también pueden arrancar la respuesta a hipoxia. Algunas de las enfermedades capaces de activar los mecanismos fisiológicos de la respuesta a hipoxia son la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la apnea del sueño, la fibrosis pulmonar, la cardiopatía isquémica o el fallo cardiaco crónico. Además, se ha visto que otros trastornos y patologías como la hipertensión, la diabetes, algunas enfermedades renales y hepáticas están también relacionados con la respuesta a hipoxia.158,162 Como se ha mencionado, también existen mecanismos de adaptación a los niveles bajos de oxígeno a nivel molecular. El más relevante es el llevado a cabo por los factores inducibles por hipoxia (HIFs). Esta ruta molecular puede activarse en todas las células y su funcionamiento depende de la estabilización de las subunidades HIFα (HIF1α, HIF2α o HIF3α) en hipoxia163. Cuando esto sucede, los componentes HIFα dimerizan con HIF1β, también conocido como ARNT, y el conjunto es traslocado al núcleo. Una vez allí, el heterodímero se une a elementos de respuesta a hipoxia (HRE) (G/ACGTG) del ADN y promueven así la transcripción de los genes que las contienen164,165. La vía de regulación más relevante de las proteínas HIFα es postraduccional y la llevan a cabo los enzimas con dominio prolil-hidroxilasa (PHDs) que son sensibles a los niveles de oxígeno. Existen 4 isoformas de estos enzimas, de las cuales PHD2 es la más importante y cuyo rango de activación es óptimo en normoxia e hipoxia moderada. Las PHDs hidrolizan 1 o 2 residuos de prolina bien conservados en las proteínas HIFα, haciendo a estas proteínas afines a la ubiquitinización mediada por la proteína von Hippel-Lindau (VHL). Esta última modificación marca a las HIFα para la degradación vía proteasoma. Además, el factor inhibidor de HIF1α (FIH1), otra proteína sensible a oxígeno, también hidroxila residuos de HIFα. En este caso, sin embargo, las modificaciones son en residuos de asparagina e impiden la unión de HIFα a sus coactivadores transcripcionales p300/CBP. FIH1 es activa a niveles de oxígeno más bajos que las PHDs y se encarga de inhibir esencialmente a HIF1α, ya que se ha observado que HIF2α es, en comparación, resistente a su acción165,166. Existen notables diferencias funcionales entre las isoformas HIF1α y HIF2α. Mientras que HIF1α se considera una proteína ubicua, la actividad de HIF2α es específica de distintos tipos celulares como cardiomiocitos, células endoteliales, hepatocitos, células gliales o intersticiales de riñón. Además, se responsabiliza a HIF1α de la respuesta a hipoxia aguda y a HIF2α de la Introducción 21 respuesta a hipoxia crónica y a la provocada por la altura. Ambas proteínas comparten algunas dianas transcripcionales, tales como el canal transportador GLUT1 o VEGF, pero regulan otras de manera específica como LDHA o PGK1 en el caso de HIF1α y EPO, MMP9 u OCT4 en el caso de HIF2α. Estas especificidades dependen tanto del contexto celular como de la concentración de oxígeno167. Además, existe la tercera subunidad HIFα, denominada HIF3α y cuya expresión en tejidos adultos se localiza en el timo, el cerebro, los pulmones, el corazón y los riñones. Esta isoforma presenta múltiples “splicing” alternativos y muchos de ellos carecen del dominio transactivador que se encuentra en las subunidades HIF1α y HIF2α. Debido a esto, se ha atribuido a HIF3α una función inhibidora de la transcripción dependiente de HIF. Particularmente, uno de los productos de “splicing”, denominado IPAS, puede unirse a HIF1α y formar un heterodímero incapaz de activar la transcripción de genes que contienen HRE166,168. 5.2. Relación entre la respuesta molecular a hipoxia y senescencia celular La hipoxia es una característica de los tumores localmente avanzados, cuya falta de vascularización priva de oxígeno a las células. Además, se sabe que la hipoxia facilita la progresión tumoral y es un marcador de mal pronóstico en pacientes169,170. Sin embargo, aún queda por aclarar si la hipoxia funciona como un estrés capaz de inducir senescencia en células normales, o bien, facilita la inmortalización previa a la transformación maligna contribuyendo a la tumorigénesis. A este respecto, existen diversos estudios que describen cómo concentraciones de oxígeno diferentes, especialmente de bajos niveles de oxígeno, pueden alterar la vida proliferativa de las células. En el caso de fibroblastos humanos se consigue un aumento la vida proliferativa de vida alrededor del 20%, mientras que en fibroblastos bovinos el aumento alcanza el 80% y en los de ratón hasta el 500%171–174 (Tabla I 1). Tabla I 1. Incremento de la vida proliferativa in vitro en distintos modelos de fibroblastos de mamífero. En concreto, el aumento en la proliferación de MEFs cultivados en hipoxia respecto a normoxia ha sido justificado debido a la diferencia de daño oxidativo acumulado. Los MEFs cultivados en una atmósfera del 20% O2 acumulaban más daño que en 3% de O2 y más que fibroblastos primarios humanos sometidos a las mismas condiciones experimentales. Los MEFs proliferaban en hipoxia a pesar de conservar intacta la vía p19Arf/p53, esencial para su Modelo Celular Concentración de O2 Incremento de vida proliferativa Referencia IMR90, WI38 2 y 10% 25% Packer et al. Nature, 1977 IMR90 1, 6 y 12% 22% Saito et al. Exp. Cell Research, 1995 Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) 3% 500% Parrinello et al. Nature Cell Biology, 2003 Fibroblastos fetales bovinos (BFF) 2% 80% Betts et al. Biogerontology, 2008 Introducción 22 inmortalización175, y con niveles altos de expresión de p16INK4a. Además de esto, MEFs deficientes en diferentes proteínas implicadas en la reparación del ADN detenían la proliferación con una gran acumulación de daño en el ADN cuando eran cultivadas en 3% O2. No sucedía así cuando se suprimía la actividad telomerasa en ellos. Por tanto, se ha sugerido que la acumulación de daño en el ADN es la que induce senescencia de los MEFs en normoxia y que la alteración en la vía p19Arf/p53 en estas condiciones de oxígeno hace insensibles a las células a este daño, inmortalizándolas. También se ha sugerido la existencia de una respuesta mutagénica o adaptativa adquirida en hipoxia que permite prolongar la vida proliferativa a pesar de la actividad de p19Arf/p53 y pRb/p16INK4a. Esta adaptación solo se mantiene en normoxia en una fracción de los MEFs expuestos durante más tiempo a hipoxia. Por otro lado, también se sugiere que las células humanas, que inician la senescencia replicativa debido al acortamiento telomérico176, tienen mayor capacidad para prevenir o reparar el daño oxidativo y, por eso, la diferencia entre la proliferación en normoxia e hipoxia es mucho más baja. Esta diferencia fisiológica entre humano y ratón podría definir también la diferencia en la incidencia de cáncer y la velocidad de envejecimiento de ambas especies173. Adicionalmente, también se ha propuesto que el aumento de la glicolisis contribuye a la disminución de daño oxidativo y, así, puede facilitar la inmortalización celular. El aumento de expresión de PGM puede evitar la senescencia replicativa en MEFs, así como la senescencia inducida por Ras. Esto es debido al aumento del flujo glicolítico177. Alternativamente, se ha intentado explicar esta extensión de la vida proliferativa celular mediante la activación de distintas rutas señalización, especialmente, la mediada por los factores HIFα. Por ejemplo, se ha observado la acción de HIF1α y HIF2α sobre distintas dianas transcripcionales entre las que se incluyen p21Cip1 y c-MYC 178,179. También se ha sugerido la activación transcripcional de hTERT por parte de HIF1α, para lo que se cree que es necesaria la presencia de ROS mitocondrial180. Además de todo esto, se ha descrito la inhibición de p53 de manera dependiente e independiente a los factores HIFα181 y se ha observado supresión de la geroconversión de manera independiente a los factores HIFα y a p53182. Entre los mecanismos propuestos que promueven la senescencia vía HIF1α destacan la parada de ciclo por la activación p21Cip1 y p27Kip1 183–185 o por la inhibición de CDC25A186. A su vez, la hipoxia tiene relación con el SASP y, por tanto, con la inducción autocrina y paracrina en la senescencia. En este sentido, se ha observado la inducción transcripcional por parte de HIF1α de múltiples genes relevantes en SASP como IL8, CXCR2, GROα, IL6 o PAI1 187. De manera independiente a los factores HIFα, se ha observado inducción de senescencia en diferentes contextos. En anoxia, diferentes vías de señalización inducen la parada de ciclo sin la intervención de HIF1α187. En células con pérdida de la proteína VHL se induce senescencia debido a la acción de p400 y p27Kip1 de forma independiente a los factores HIFα188. También existen evidencias en hipoxia sobre la aparición de senescencia en células de melanoma de ratón relacionada con alta expresión de BCL-2189. Introducción 23 6. Hipoxia y capacidades de célula madre 6.1. Hipoxia y células madre embrionarias y adultas La hipoxia ha sido también asociada a las células madre. Las primeras evidencias halladas se relacionan con el desarrollo del organismo, ya que los embriones están expuestos a un estado parcial de hipoxia durante la gestación190. Asimismo, se ha demostrado que tanto las células madre embrionarias como las somáticas residen en nichos hipóxicos. En estos nichos se crea un microambiente que contiene niveles de oxígeno incluso más bajos que los órganos y tejidos donde se encuentran (1-8% O2)191. En el caso de las células madre embrionarias (ESCs) pueden mantenerse in vitro de manera indefinida cuando son cultivadas en unas condiciones concretas. Estas condiciones específicas de cultivo intentan mantener activas las principales rutas moleculares de pluripotencia y autorrenovación. En las ESCs es esencial la actividad de los factores de transcripción Oct3/4, Sox2 y Nanog que constituyen el núcleo del circuito de pluripotencia. Oct3/4 es capaz de unirse al ADN y controlar la expresión de múltiples genes relacionados con la pluripotencia. Para ello, puede actuar como heterodímero con Sox2 y regula la transcripción de genes como Lefty1, Fgf4 o los propios Oct3/4, Sox2 y Nanog. Además, Oct3/4 se une a “enhancers” (regiones reguladoras del ADN que pueden incrementar la transcripción de genes asociados a ellas cuando se les unen proteínas) de genes de pluripotencia y su expresión en ESCs está fielmente regulada ya que niveles muy altos, o muy bajos de esta proteína conducen a la diferenciación. Por su parte, Nanog actúa coordinadamente con Oct3/4 y Sox2, pero sus niveles fluctúan en las poblaciones de ESCs. Entre sus dianas transcripcionales se hallan genes relacionados con pluripotencia como Esrrb, Rif1, Foxd3 y Rest. Además de estos 3 factores de transcripción del núcleo del circuito de pluripotencia, otras proteínas se han descrito con un papel principal en el mantenimiento de las capacidades de las ESCs como son SMAD1 o STAT3 y algunos coordinadores de su actividad reguladora como Klf4, Esrrb, c-Myc y Tfcp2l1. A un nivel más general, la acción de todas estas proteínas recala en la activación de las rutas de señalización celular LIF/Stat3, Wnt/β-Catenina, FGF/ERK, TGF/SMAD y PKC192. Múltiples estudios han demostrado la ventaja de cultivar ESCs y otros tipos de células madre en condiciones de hipoxia para mantener la pluripotencia y la capacidad de renovación de las ESCs. Así, se sabe que la capacidad de autorrenovación, la pluripotencia y la expresión de muchos marcadores y efectores de célula madre, como Nanog, Oct3/4 o Sox2, están favorecidas por la hipoxia, de manera dependiente o independiente a los factores HIFα. Por ejemplo, se sabe que la baja concentración de oxígeno ayuda a la supervivencia de las células de la cresta neural o las células madre hematopoyéticas y que previene la diferenciación de las ESCs. A pesar de todas las evidencias generadas, existe gran controversia en cuanto a la influencia de la hipoxia en la capacidad de diferenciación o desdiferenciación de estas células. Esto es debido, probablemente, a la influencia que ejercen parámetros como el estadio de maduración de las células madre, la duración del cultivo en hipoxia y el nivel de oxígeno empleados en los estudios193–196. Objetivos 31 El objetivo principal de esta tesis es el estudio del efecto de la hipoxia sobre la senescencia y la inmortalización celular. Para llevarlo a cabo, se definieron los siguientes objetivos específicos: 1. Comparación de la extensión de la vida proliferativa y la aparición de características asociadas a la senescencia en fibroblastos primarios cultivados en condiciones de hipoxia y normoxia. 2. Identificación de los cambios transcripcionales responsables del aumento de la vida proliferativa y la evasión de la senescencia en hipoxia. 3. Estudio funcional de los genes responsables del aumento de la vida proliferativa y la evasión de la senescencia en hipoxia. 4. Estudio de los de los genes responsables del aumento de la vida proliferativa y la evasión de la senescencia en hipoxia como posibles responsables del efecto de la hipoxia sobre la reprogramación celular. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y métodos 35 1. Reactivos biológicos utilizados 1.1. Plásmidos Los plásmidos utilizados en esta tesis se describen en la Tabla MM 1. Tabla MM 1. Plásmidos utilizados. 1.2. Cepas bacterianas Los plásmidos utilizados se propagaron en la cepa de E.coli DH5α y E.coli Stbl3 (Invitrogen), con excepciones en el protocolo de clonación Gateway. Se crecieron en medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl pH 7,0) a 37ºC, con agitación, durante 16h. Todos los plásmidos incluían ampicilina como resistencia bacteriana y se utilizó en el medio de selección, con excepciones en el protocolo de clonación Gateway. 1.3. Antibióticos Para realizar la selección de las células en cultivo se empleó puromicina (Nucliber), blasticidina (Merck), higromicina (Life Technologies) y ampicilina (Merck). Plásmido Secuencia Resistencia en Eurcariotas Procedencia pLKO.1-Scramble shRNA Puromicina Qi-Long Ying pLKO.1-mTfcp2l1 shRNA#1 GCAGGAATGTGAGGCCAAAGA Puromicina Qi-Long Ying pLKO.1-mTfcp2l1 shRNA#2 GCTCTTCAATGCCATCAAAGG Puromicina Qi-Long Ying pLenti-CMV-MCS-GFP-SV GFP Puromicina Addgene #73582 pLenti-CMV-Tfcp2l1 Tfcp2l1 Puromicina Origene (PS100081) pLenti-CMV-rtTA3 (w756-1) rtTA3 Blasticidina Addgene #26429 pLenti-CMVtight-DEST (w769-1) - Higromicina Addgene #26433 pENTR/D-TOPO - - ThermoFisher pLenti-CMVtight-Tfcp2l1 Tfcp2l1 Higromicina Amancio Carnero pcDNA3-mHif1α-Myc (P402A/P577A/N813A) mHif1α-Myc (P402A/P577A/N813A) - Addgene #44028 pLenti-CMV-DEST (w118-1) - Puromicina Addgene #17452 pLenti-CMV- mHif1α-Myc (P402A/P577A/N813A) mHif1α-Myc (P402A/P577A/N813A) Puromicina Amancio Carnero pMXs-gw - - Shinya Yamanaka pMXs-DsRed DsRed - Shinya Yamanaka pMXs-Oct3/4 Oct3/4 - Shinya Yamanaka pMXs-Sox2 Sox2 - Shinya Yamanaka pMXs-Klf4 Klf4 - Shinya Yamanaka pMXs-c-Myc c-Myc - Shinya Yamanaka pMXs-Tfcp2l1 Tfcp2l1 - Yoshinori Yoshida psPAX2 CAG/POL - Addgene #12260 pMD2G VSV-G - Addgene #12259 Materiales y métodos 36 1.4. Tratamientos Para los tratamientos se utilizaron los siguientes compuestos: dimetiloxalilglicina, (DMOG) 6 mM (Frontier scientific), Doxiciclina 100, 500 y 1.000 ng/µl (Merck). 2. Técnicas básicas de biología molecular 2.1. Transformación de células quimiocompetentes A 100 μl de bacterias quimiocompetentes se les añadió una cantidad apropiada de ADN (habitualmente 100 ng de plásmido purificado). La mezcla de bacterias y ADN se incubó durante 30 minutos en hielo y después se dio un choque térmico a 42ºC en un termobloque durante 45 segundos. A continuación, se mantuvieron las células en hielo durante 2 minutos y se añadieron 900 μl de medio SOC (20 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM) a temperatura ambiente. Se incubaron 1 hora a 37ºC en agitación. Después se centrifugaron durante 2 minutos a 8.000 rpm y se resuspendieron en 100 μl de medio SOC. Se extendió el cultivo en placas de LB-agar con el antibiótico de selección apropiado y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. 2.2. Extracción de ADN plasmídico El protocolo se basa en una lisis alcalina seguida de la precipitación y purificación del ADN en una columna de intercambio iónico (sílice-dietilaminoetanol). El ADN se une a la columna en condiciones apropiadas de pH y baja concentración de sales, los contaminantes se eliminan en un lavado con tampón de fuerza iónica intermedia y el ADN se eluye en un tampón de alta concentración de sales. Por último, el ADN se precipita con isopropanol para concentrarlo y eliminar sales. En todos los casos (maxi o midi según el volumen de cultivo) utilizamos el kit JetStar2.0 Plasmid purification (Genomed) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se creció el cultivo líquido en medio selectivo (LB con el antibiótico apropiado según el plásmido) durante 12-16 h a 37ºC, con agitación. El volumen de cultivo dependía de si era una maxi o midi (250 o 100 ml respectivamente). Las células se recuperaron por centrifugación durante 5 minutos y se resuspendieron en la solución de resuspensión (Tris HCl 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM, ARNasa A 100 μg/ml). Después se añadió la solución de lisis (NaOH 0,2 M, SDS 1%), mezclando por inversión e incubando 5 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se neutralizó al añadir acetato potásico 3M pH 5.5, mezclando inmediatamente. Después se centrifugó durante 10 minutos y el sobrenadante se vertió en una columna previamente equilibrada, dejándolo caer por gravedad. Después, la columna se lavó dos veces con tampón de lavado (NaCl 1 M, MOPS 50 mM pH 7,0, 15% isopropanol) y el ADN se eluyó con tampón de elución (NaCl 1,25 M, MOPS 50 mM pH 8,5, 15% isopropanol). A continuación, el ADN se precipitó por adición de isopropanol y centrifugación durante 30 minutos a 4ºC. Se lavó con etanol 70% y se centrifugó durante 5 minutos a 4ºC. Finalmente, se secó el pellet de ADN obtenido al aire y se resuspendió en un volumen apropiado de agua destilada libre de nucleasas. Materiales y métodos 37 Todas las centrifugaciones de este protocolo se realizaron en una centrífuga Evolution RC6 plus a una velocidad de 12.000 g. 2.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Se preparó una mezcla que contenía 0,2 mM de cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 pmol de cada uno de los cebadores, 2 mM de MgCl2, 1 U de polimerasa Taq y la cantidad adecuada de ADN molde (entre 30-100 ng), todo ello diluido en tampón de reacción contenido en el kit (Promega). Las reacciones se realizaron en termocicladores Bioer XP Cycler. Las condiciones de reacción fueron específicas para cada caso, pero se siguió un programa estándar de partida: 1 minuto a 95ºC, 35 ciclos de amplificación (1 minuto a 95ºC, 2 minutos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC) y una extensión final de 5 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. 2.4. Reacciones de digestión sobre el ADN Se preparó una mezcla constituida por 1μg de ADN plasmídico, 12 U de las enzimas de restricción EcoRI y NotI (New England Biolabs), 3 μg de BSA acetilado y el tampón apropiado para las enzimas de restricción en un volumen total de 30 μl. La mezcla se incubó 1 hora a 37ºC. Adicionalmente, se realizaba una inactivación de la enzima mediante un choque térmico de 15 minutos a 65ºC cuando el enzima lo requería. Por último, se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. 2.5. Clonación mediante la tecnología de recombinación Gateway 2.5.1. Clonación de productos de PCR Para permitir el clonaje direccional el cebador “forward” contenía la secuencia CACC seguido de ATG. De este modo, se permitió que el codón de inicio se hallase en el contexto de una secuencia Kozak. El protocolo de PCR empleado fue el detallado anteriormente, realizando modificaciones en los ciclos exclusivamente cuando las características de los cebadores lo requerían. La correcta amplificación de los fragmentos deseados se comprobó mediante reacción de restricción. 2.5.2. Reacción TOPO Para introducir el fragmento de interés en el vector de entrada, se llevó a cabo una reacción con el vector pENTR/D-TOPO (ThermoFisher Scientific). Se emplearon de 1 a 10 ng de producto de PCR, 1 μl de solución salina provista por el kit, 1 μl de vector y se completó hasta 5 μl con agua estéril. Seguidamente, se incubó la reacción durante 5 minutos a temperatura ambiente y se procedió a la transformación de bacterias quimiocompetentes E.coli One Shot Mach1 (ThermoFisher Scientific). Se crecieron las bacterias en placas con medio LB/agar y se extrajo ADN. La correcta inserción y orientación del fragmento de interés se comprobó mediante PCR y reacciones de restricción. Materiales y métodos 38 2.5.3. Reacción de recombinación LR Los vectores de destino Gateway se amplificaron en bacterias ccdB resistentes E.coli ccdB Survival 2 (TermoFisher). Posteriormente, el gen de interés se clonó en el vector de destino Gateway seleccionado mediante la reacción de recombinación LR. Para ello, se mezclaron 50- 300 ng de vector de entrada pENTR/D-TOPO conteniendo el fragmento de interés clonado con 300 ng del vector de destino Gateway, 1 μl de enzima LR Clonasa II (ThermoFisher Scientific) y 1 μl de agua estéril. Por último, se transformaron bacterias quimiocompetentes con μl del producto de reacción. Los clones que crecieron en placas con medio LB/agar y el antibiótico de selección adecuado fueron analizados mediante PCR y las reacciones de restricción adecuadas. 3. Cultivos celulares 3.1. Líneas celulares En la Tabla MM 2 se describen las características de las líneas celulares utilizadas en este trabajo. Se incluye el medio de cultivo en el que se crecieron, el origen y el tipo celular que representan. Tabla MM 2. Líneas celulares utilizadas. WT: fenotipo silvestre. ATCC: colección americana de cultivos tipo. 3.2. Cultivo y conservación de las líneas celulares Todas las líneas, con excepciones en el protocolo de iPSCs, se cultivaron en medio DMEM con glutamina estable, suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; Life Technologies), 40 μg/ml de penicilina, 40 μg/ml de estreptomicina (Merck). Las células se crecieron en placas de 10 centímetros (Falcon) y se subcultivaron 1:3 - 1:12, según la línea celular, cada 3-4 días mediante tratamiento con tripsina/EDTA 0,25% (Life Technologies). Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37ºC en una atmósfera de 5% CO2 al 20% de O2 o al 3% de O2 en el caso de las condiciones de hipoxia. Esto se consiguió utilizando un sensor y regulador de O2 y ajustando su concentración mediante la inyección de nitrógeno (ThermoFisher Scientific). Todas las manipulaciones se hicieron en una campana de flujo laminar de Clase II Bio-II-A (nivel de seguridad biológica 2; Telstar). Para su almacenamiento a largo plazo, las células se conservaron en un contenedor de nitrógeno líquido, en criotubos de 2 ml, en su medio de cultivo normal o FBS, con 8% de DMSO. Línea Celular Especie Tipo celular Medio de cultivo Crecimiento Origen MEFs-WT Ratón Fibroblasto DMEM Adherente Primario; Amancio Carnero MEFs-Nanog- GFP Ratón Fibroblasto DMEM Adherente Primario; Yoshinori Yoshida HEK-293-T Humana Tejido renal embrionario DMEM Adherente ATCC Plat-E Humana Tejido renal embrionario DMEM Adherente Cell biolabs, INC. MSTO SNL Feeder Layer- PuroR-HygroR Ratón Fibroblasto Medio MSTO Adherente Yoshinori Yoshida Materiales y métodos 39 Para periodos de almacenamiento más cortos las células se conservaron a -80ºC. Para descongelar un vial, se sumergió en un baño de agua a 37ºC durante 2 minutos; se centrifugó el contenido en 5 ml de medio y las células se resuspendieron en su medio de cultivo habitual. 3.3. Generación de MEFs Los MEFs se generaron a partir de embriones de ratones de 13,5 días. Se sacrificó a la hembra preñada a los 13,5 días de dar tapón mucoso, y se extrajo el útero con todos los embriones en su interior. A partir de este momento se trabajó en esterilidad, en campana de flujo laminar. Se procedió a la separación de cada uno de los embriones, los cuales, tras retirar los órganos diferenciados (cabeza y tejidos rojos), se recogieron individualmente en placas de 10 cm donde se disgregaron con un bisturí estéril. Seguidamente, los fragmentos de tejido se sometieron a una digestión enzimática primero con tripsina 2,5% (Invitrogen) y después con una solución de enzima colagenasa tipo IV (Merck) diluida en medio DMEM y agua. Por último, el tejido disgregado se sembró en placas o flascos y se incubó a 37ºC como se detalló para el resto de células anteriormente. 3.4. Infección lentiviral 3.4.1. Transfección células HEK-293-T mediante reactivo polietilenimina (PEI) A 24 horas de la transfección, se sembraron las células HEK-293T con tal de que su confluencia alcanzase el 70-80%. Se mezclaron en 900 μl de medio de cultivo DMEM, 80 µl de solución PEI 1mg/ml, 10 µg del ADN de interés a transducir, 8 µg de vector psPAX2 (que contiene los genes GAG y POL) y 2 µg de vector pMD2G (que contiene el gen VSV-G) para la producción de las partículas lentivirales. Posteriormente, se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente y se añadió a las células. 3.4.2. Producción de virus e infección/transducción Se cambió el medio de las células HEK-293T 16 horas después de la transfección, añadiendo 6 ml de DMEM fresco a cada placa. Tras 24 horas a 37ºC, se recogió ese medio conteniendo las partículas lentivirales producidas y se pasó por un filtro de acetato de celulosa de 0,45 µM (VWR) para evitar la contaminación de las células a infectar. Se realizó una dilución 1:4 de este sobrenadante con DMEM. Este medio fue suplementado con 8 µg/ml de polibreno (Merck). Para la infección y transducción, se reemplazó el medio de cultivo de las células receptoras por medio nuevo con el sobrenadante lentiviral y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 6 horas. Después, se cambió el medio y se mantuvieron 24 horas a 37ºC, momento en el que se comenzó la selección con el antibiótico apropiado. 3.5. Selección de células infectadas Tras 24 horas de incubación se tripsinizaron las células, se dividieron 1:4 y se comenzó la selección con el antibiótico apropiado. Este se mantuvo durante el tiempo necesario para que se produjera la muerte de las células sin infectar. Una vez finalizada la selección, para el mantenimiento, se redujo la concentración del antibiótico a la mitad. Materiales y métodos 46 centrifugó durante 5 minutos a 2500 g a 4ºC. Los pellets recogidos se lavaron con 500 μl de tampón de lisis celular y se centrifugaron de nuevo durante 5 minutos a 2.500 g a 4ºC. A continuación, se resuspendió el pellet en 667 μl de tampón de lisis nuclear (Tris-HCl pH 7.5 50 mM, EDTA 10 mM, SDS 1% y CIP) y se incubó en hielo durante 5 minutos. El lisado nuclear recogido se diluyó añadiendo 1.333 μl de tampón de dilución de ChIP (Tris-HCl pH 7.5 16,7 mM, EDTA 1,2 mM, NaCl 167 mM, SDS 0,01% y Triton-X100 1,1%). Después, la cromatina se sonicó en un sonicador Covaris M220 (10% del ciclo de trabajo, PIP 75 W, 100 “cycles/burst”, 10 minutos) y se centrifugaron durante 5 minutos a 18.000 g a 4ºC. El sobrenadante recuperado contenía cromatina soluble y fue utilizada en el ChIP o congelada a -80ºC tras la comprobación del tamaño de los fragmentos generados en la sonicación. Se retiraron 20 μl de la solución de cromatina sonicada que se utilizaron como control “INPUT” y se guardaron a 4ºC. Se tomaron también 200 μl de muestra que se incubaron con 2 μg de anti-Tfcp2l1 (Novus Biologicals) en rotación a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente, se añadió a las muestras 20 μl de bolitas magnéticas “protein G Dynabeads” (Invitrogen), que fueron previamente lavadas dos veces con tampón de dilución de ChIP y resuspendidas en 50 μl del mismo tampón. La cromatina inmunoprecipitada se incubó entonces con bolitas magnéticas lavadas durante 1 hora en rotación a 4ºC. Tras esto, se lavó dos veces con tampón de lavado 1 (Tris-HCl pH 7.5 20 mM, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, SDS 1%, Triton-X100 1%), tampón de lavado 2 (Tris-HCl pH 7.5 20 mM, EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, SDS 0.1%, Triton-X100 1%), tampón de lavado 3 (Tris-HCl pH 7.5 10 mM, EDTA 1 mM, LiCl 250 mM, NP-40 1%, Na-desoxicolato 1%) y Tris-HCl pH 8.0 10 mM, usando una gradilla magnética en frío (Invitrogen). Después, las bolitas magnéticas se resuspendieron en 25 μl de mezcla de reacción de “TAGmentation” (Tris-HCl pH 8.0 10mM, MgCl2 5mM, 10% w/v dimetilformamida), se le añadió 1 μl de enzima Tn5 y se incubó 1 minuto a 37ºC. Se retiró el sobrenadante de la reacción de “TAGmentation” utilizando una gradilla magnética en frío. Las bolitas fueron lavadas de nuevo 2 veces con tampón de lavado 1 y TE 1x. Entonces, para resuspender la solución, se incubó 2 veces durante 15 minutos en 100 μl de tampón de elución (NaHCO3 pH 8.8 50 mM, SDS 1%). Los 200 μl de cromatina resultante se incubaron a 65ºC durante 6 horas con 10 μl de NaCl 4M y 1 μl de proteinasa K 10 mg/ml para deshacer los enlaces covalentes de la fijación. Finalmente, el ADN fue purificado utilizando el Kit “Minelute PCR Purification Kit” (Qiagen) y se eluyó en 20 μl. Se generaron las librerías de secuenciación mediante amplificación por PCR, para lo que utilizó “NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix” (NEB) y los oligonucleótidos usados en Buenrostro et al. 2013246 con códigos de barras que permiten la combinación de varios experimentos en un mismo carril de secuenciación. La librería resultante fue agrupada y secuenciada en un secuenciador “Hi-Seq 4000 pair-end lane” lo que produjo alrededor de 20M de lecturas “pair-end” de 49 pares de bases. Materiales y métodos 47 7.1.2. Análisis de los resultados de secuenciación del ChIP-Seq Las lecturas se alinearon o mapearon con el genoma de ratón de referencia “Mouse Dec. 2011 (GRCm38/mm10)” usando “Bowtie”247. La conversión de los archivos “SAM” de alineamiento a archivos “BAM” se llevó a cabo con el paquete “Samtools”248. La conversión de archivos “BAM” a “BED”, el análisis de picos y los solapamientos y mezclas se realizaron con el paquete Bedtools249. Para la conversión de archivos “BED” a “BigWig” se utilizó la herramienta “genomecov” de “Bedtools” y “wigToBigWig” de la UCSC. Los “heatmaps” y perfiles promedio se generaron utilizando las herramientas “compute-Matrix”, “plotHeatmap”, y “plotProfile” del paquete “Deeptools 2.0 toolkit”250. La identificación de picos o “Peak calling” se realizó con el algoritmo “MACS2”251 con q-valor<0.01. El análisis de enriquecimientos de motivos de factores de transcripción se llevó a cabo utilizando el “script” “FindMotifsGenome.pl” del software “Homer”252. Para la asociación de genes a los picos, se usó la herramienta “GREAT”253 con la regla de asociación “basal más extensión” y parámetros estándar de distancia al sitio de inicio de la transcripción del gen (5 Kb aguas arriba, 1 Kb aguas abajo, 1Mb de extensión máxima). Para el análisis funcional de los genes asociados a picos en el experimento de ChIPmentation utilizamos la herramienta “Enrichr” 254,255. Mediante esta herramienta, se calcularon los enriquecimientos de términos ontológicos “Biological Process” de “Gene Ontology” (GO)256,257. Los 20 términos más representativos según su p-valor se clasificaron mediante la herramienta “CateGOrizer” en sus términos superiores o ancestrales. Posteriormente, se englobaron estos términos superiores en categorías que definían los procesos biológicos generales de los que formaban parte y se estudió el porcentaje de genes incluidos en ellos respecto al total estudiado. Finalmente, los resultados se representaron a modo de diagrama de Venn utilizando la herramienta online del grupo de Bioinformática y Genómica evolutiva de la Universidad de Gante (Bélgica) (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/). 7.2. ChIP-qPCR de validación Los picos asociados a genes en las muestras del experimento de ChIP-Seq se validaron mediante ChIP-qPCR. El procedimiento fue el siguiente: Se fijaron 24 millones de células añadiendo 900 μl de una solución tampón (Hepes pH 8, 50mM, NaCl 0,1mM, EDTA pH8, 1 mM, EGTA 0,5 mM y formaldehído 11%) a 10 ml de medio de cultivo. La reacción de fijación se realizó a 37ºC durante 10 minutos. Para detener esta reacción se añadió de nuevo al medio de cultivo glicina 125 mM y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tras esto, se lavaron las células con PBS frío y se retiraron de la placa de cultivo utilizando PBS frío al que se añadieron CIP y PMSF 100 mM para, finalmente, centrifugarlas en frío. Las células recogidas anteriormente se resuspendieron en tampón de lisis celular (Pipes pH8 5mM, KCl 85 mM, NP-40 0,5%) al que se añadieron CIP y PMSF y se incubaron en hielo Materiales y métodos 48 durante 10 minutos. Posteriormente, las células se centrifugaron para después resuspenderlas en tampón de lisis nuclear (SDS 1%, EDTA 10 mM, Tris-HCl pH 8,1 50 mM) al que se añadieron CIP y PMSF. En este mismo tampón se sonicaron las células ya lisadas utilizando un Bioruptor (Diagenode) con ciclos de 30 segundos de sonicación y 30 segundos de pausa durante 15 minutos en frío. El extracto de cromatina sonicada se retiró del resto de componentes celulares mediante centrifugación. Para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN generados se purificó este material mediante protocolo estándar de precipitación con etanol y sales. Se inmunoprecipitaron 200 μl del extracto de cromatina en 800 μl de tampón (SDS 0,01%, Tritón X-100 1,1%, EDTA 1,2 mM, Tris-HCl pH 8,1 16,7 mM, NaCl 167 mM) con CIP, PMSF y los anticuerpos contra las proteínas de interés. Se utilizaron los anticuerpos anti-Tfcp2l1 (Novus Biologicals) y anti-RNA polimerasa II (POLR2A, ThermoFisher Scientific) como control positivo. Las mezclas se incubaron 16 horas a 4ºC. Después de la incubación, se añadieron bolitas magnéticas “ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads” (Cell Signaling) a la mezcla de cromatina y anticuerpo y se incubaron durante 2 horas a 4ºC. Tras esto, se realizó un lavado con un tampón de lavado con baja concentración en sales (SDS 0,1%, Tritón x-100 1%, EDTA 2mM, Tris-HCl pH8,1 20 mM, NaCl 150 mM), con un tampón de lavado de alta concentración en sales (SDS 0,1%, Tritón x-100 1%, EDTA 2mM, Tris-HCl pH8,1 20 mM, NaCl 500 mM) y un tampón de lavado con LiCl (LiCl 0,25 M, NP-40 1%, NaDoc 1%, EDTA 1%, Tris-HCl pH8,1 10 mM) utilizando una gradilla magnética (ThermoFisher Scientific). Después, se procedió a retirar las bolitas magnéticas tras lavar con tampón TE y TESDS 1% y hacer incubaciones de la mezcla a 65ºC. En último lugar, se purificó el ADN de la cromatina inmunoprecipitada mediante un protocolo estándar de precipitación con etanol y sales. Este ADN se sometió a qPCR utilizando cebadores diseñados en el laboratorio para las regiones donde se localizaban los picos del experimento de ChIP-Seq. Para el diseño de los cebadores, se localizaron los picos diana con el UCSC Genome Browser y se usó su secuencia de ADN. También se utilizaron cebadores contra una región no codificante del genoma (“Gene desert”, control negativo en todas las muestras) y contra el primer exón de α-tubulina (control positivo en muestra inmunoprecipitada con POLR2A) (Tabla MM 5). La qPCR se realizó en el termociclador ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). El programa de PCR consistió en un paso inicial de 30 segunddos a 95ºC seguidos por 40 ciclos de 5 segundos a 95ºC y 35 segundos a 55ºC. Finalmente, una última fase de 15 segundos a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y un último paso de 15 segundos a 95ºC. El análisis de amplificación se realizó con el software “SDS 2.4” (Applied Biosystems) para obtener la cuantificación absoluta. Los datos de Ct se analizaron mediante el método cuantificación relativa cuyo resultado (expresado en porcentaje de ADN de la muestra respecto al control negativo INPUT) se representó relativizando la muestra inmunoprecipitada con anti-Tfcp2l1 a la inmunoprecipitada con IgG (inmunoglubulina G). Materiales y métodos 49 Tabla MM 5. Cebadores utilizados en ChIP-qPCR. Localización en el genoma: se muestra el rango de localización del pico diana para el genoma de referencia “Mouse Dec. 2011 (GRCm38/mm10)” 8. Análisis bioinformáticos de datos públicos 8.1. Análisis de regiones reguladoras asociadas a Tfcp2l1 En primer lugar, se visualizó la estructura 3D de la cromatina en el locus de Tfcp2l1 utilizando datos de HiC (captura de conformación de cromatina a nivel del genoma completo) en el navegador “WashU Epigenome Browser” procedentes del repositorio público ENCODE (GSE74055) 258. A continuación, se analizaron las posibles regiones reguladoras (promotores y enhancers activos) en dicho locus usando datos de ChIP-seq de las modificaciones de histonas H3K4me3 y H3K27ac (GSE49847)259,260 que se visualizaron en el UCSC Genome Browser. Se seleccionaron los picos de estas marcas de histonas que, en base a los datos de HiC, podrían contactar con el promotor de Tfcp2l1 para regular su expresión. Finalmente, estas secuencias se introdujeron en la herramienta “Jaspar”261 donde se realizó la búsqueda de los motivos de unión al ADN de Hif1α, Arnt (también conocido como Hif1β) y el dímero formado por Arnt-Hif1α, obteniéndose sus valores de predicción y considerándose sólo los más significativos (superiores a 8). 8.2. Meta-análisis de expresión de iPSCs Se estudiaron experimentos de “Microarray” o micro-matrices de expresión génica realizados previamente por el grupo de investigación del Dr. Shinya Yamanaka con “SurePrint G3 Mouse Gene Expression 8x60 Kit” (Agilent Technology) en un escáner “Microarray Scanner Gen o región diana Localización en el genoma Secuencia del cebador (5'-3') Sox2 chr3:34172891-34173202 Fw: ACCAGGGCTGTGTTAAATGC Rv: GAGTGAGCAGGGGAAGGAAC Sox9 pico 1 chr11:112778911-112779210 Fw: TTTTGGAGCAGGGAGGGTTG Rv: gtgtgtgtgtgtTGAGAGGG Sox9 pico 2 chr11:113040573-113040872 Fw: GGCAACAAACCTGATACGCA Rv: CGAGTTCTAGGGTGGTCTGG Tgfa chr6:86285454-86285782 Fw: CATCCACTGGTGCTGCTAAG Rv: GGTCCTCAGTGTAGTCCAGG Gene Desert Fw: CACTCTTCTTATAGGACCCTTTG Rv: CTGTCTACCTGTTCTTTACATTCT α-Tubulina Fw: GCACCAATCACCACTCTCCT Rv: AGGCGGTCGATGTAAGAGAA Materiales y métodos 50 System” (Agilent Technology). Finalmente, los datos se analizaron utilizando “GeneSpring” (Agilent Technology). RESULTADOS Resultados 53 1. Efecto de la hipoxia sobre la senescencia celular 1.1. Efecto de la hipoxia sobre el crecimiento y la aparición de características de senescencia celular Para comenzar el estudio del efecto de la hipoxia sobre la senescencia celular comparamos la proliferación y entrada en senescencia de MEFs en dos condiciones diferentes de oxígeno, normoxia (20% O2) e hipoxia (3% O2). Para ello, en primer lugar, explantamos embriones de ratón en día de gestación 13,5 y los cultivamos hasta alcanzar el cultivo puro de MEFs en normoxia (normoxia inicial). Este proceso se realizó durante 3 días. A continuación, seguimos el crecimiento y la aparición de características de la senescencia celular realizando un protocolo 3T3 (Figuras R1 A y B). Observamos que los MEFs cultivados exclusivamente en normoxia crecían hasta los 30 días, deteniendo en este momento su crecimiento; momento en el que se observaba en ellos un fenotipo morfológico senescente y alta actividad β-galactosidasa ácida (Figuras R1 A, C y D). Además de esto, se observó que sólo el 50% de los embriones explantados en normoxia que luego seguían el protocolo 3T3 en hipoxia, mantenían su proliferacion más allá de los 60 días. Sin embargo, el otro 50% de esos MEFs tenía una esperanza de vida similar a aquellos cultivados exclusivamente en normoxia, entrando en senescencia de la misma manera (Figura R1 A). A continuación, modificamos ligeramente el protocolo realizando la extracción y explante de embriones y la generación del cultivo de MEFs también en hipoxia (hipoxia inicial). En este caso, se podía obtener el cultivo puro en 1 solo día. Posteriormente, realizamos el protocolo 3T3 en hipoxia o normoxia. Un 75% de los los embriones de hipoxia inicial que seguían el protocolo 3T3 en normoxia, tenían extensión de vida proliferativa más allá de los 60 días. En cambio, el otro 25% sólo mantenían su crecimiento hasta 45 días (Figura R1 B), entrando en senescencia. En cambio, todos los MEFs cultivados sólo en hipoxia crecían más allá de los 60 días sin observar el fenotipo senescente (Figuras R1 B, C y D). Para comprobar la duración de la extensión de la vida proliferativa, varios de los cultivos se mantuvieron durante 6 meses, no observando en ese tiempo parada proliferativa ni entrada en senescencia. Debido a la variabilidad, decidimos trabajar con MEFs cultivados exclusivamente en hipoxia y MEFs cultivados exclusivamente en normoxia para comparar su crecimiento y características asociadas a senescencia. Para estudiar el efecto fisiológico de la hipoxia en la senescencia celular, se analizaron muestras de ARN y proteína de los MEFs a los 24, 36, 48 y 60 días de cultivo. Como control del efecto de la hipoxia, se verificó la activación de Hif1α indirectamente, midiendo los niveles de ARNm de dos de sus dianas transcripcionales, Ldha y Vegfa167. Ambos genes resultaron sobreexpresados en hipoxia respecto a normoxia en todos los puntos del experimento (Figura R2 A). Resultados 54 A continuación, estudiamos la expresión de efectores de la parada proliferativa en senescencia. Los niveles transcripcionales de los CKIs p21Cip1, p16INK4a y p15Ink4b disminuían con el tiempo de cultivo en hipoxia y eran siempre significativamente menores a los del control proliferativo en normoxia (día 24) (Figura R2 A). También observamos una reducción de los niveles de proteína con el tiempo en hipoxia en p21Cip1 y p16Ink4a (Figura R2 B). Figura R1. La hipoxia puede retrasar la aparición de senescencia celular in vitro. A) Crecimiento de MEFs cultivados en normoxia inicial. MEFs se extrajeron y cultivaron inmediatamente en normoxia para su amplificación, se observó su crecimiento posteriormente en normoxia e hipoxia. B) Crecimiento de MEFs cultivados en hipoxia inicial. MEFs se extrajeron y cultivaron inmediatamente en hipoxia para su amplificación, se observó su crecimiento posteriormente en normoxia e hipoxia. C) Porcentaje de células positivas para actividad β-galactosidasa ácida. Se cuantificó la actividad β-galactosidasa ácida en células cultivadas exclusivamente en hipoxia o en normoxia realizando tinción con reactivo X-Gal. D) Morfología celular senescente y tinción X-Gal. Se observó la morfología citoplásmatica en las células empleadas para cuantificar la actividad β-galactosidasa ácida. Para el análisis estadístico se utilizó el test t-Student en el caso del estudio de crecimiento. Para el estudio de la actividad β-galactosidasa ácida se empleó el test Anova (One way) para comparar cada condición al control proliferativo de normoxia (24 días). Las gráficas muestran la media de, al menos, 3 repeticiones independientes (*p<0,05; **p<0,01; ***<0,001). ND: no determinado. Para comparar la actividad de p53 en hipoxia y normoxia, medimos los niveles de proteína p-p53 (Ser15) que es la forma activa de p53 cuando se produce estrés celular262,263. Pudimos observar una mayor cantidad de esta proteína fosforilada en normoxia en comparación con hipoxia. Sin embargo, los niveles de p-p53 (Ser15) aumentaban con el tiempo en hipoxia. Esto coincidía con los niveles de la histona modificada p-H2AX (Ser139) que eran mayores en hipoxia que en normoxia y que sugieren un posible estrés replicativo264 (Figura R2 B). También se midieron los niveles de la diana transcripcional de p53, Bax20. La expresión de este gen también disminuía con el tiempo en hipoxia, aunque al inicio del experimento los niveles eran mayores que en normoxia. Esto, junto a la disminución de expresión de p21Cip1, mencionada anteriormente, sugieren una menor activación transcripcional de p53 en hipoxia a pesar de una mayor fosforilación en el residuo S15 (Figura R2 A). Resultados 55 Figura R2. La hipoxia puede retrasar la expresión de marcadores de senescencia celular. A) Análisis transcripcional de genes relacionados con la hipoxia o la senescencia celular. Se analizaron mediante qRT-PCR los niveles de ARNm de Ldha, Vegfa, p21Cip1, p16INK4a, p15Ink4b y Bax de MEFs cultivados exclusivamente en normoxia o en hipoxia. Los niveles de expresión se normalizaron usando como referencia la muestra de control proliferativo de normoxia (día 24). B) Análisis de los niveles de proteínas relacionadas con la senescencia celular. Se compararon mediante western blot los niveles de proteína de p16Inka, p21Cip1, p-y-H2AX, p-p53 (Ser15) usando α-tubulina como control de carga. Para el análisis estadístico en los niveles de ARNm se utilizó el test t-Student. Las gráficas muestran la media de, al menos, 3 repeticiones independientes medidas en triplicado (*p<0,05; **p<0,01; ***<0,001). 1.2. Efecto de la hipoxia sobre la expresión de genes relacionados con las propiedades de células madre El cultivo de hipoxia produce extensión de la vida proliferativa de fibroblastos diferenciados, asemejando el potencial replicativo ilimitado de las células madre. Por tanto, medimos si los cultivos en hipoxia podrían aumentar las características de células madre de estas células proporcionándoles así este potencial replicativo ilimitado. Para ello, realizamos PCR array con una matriz de genes prediseñada. Este PCR array incluía sondas específicas para genes marcadores de células diferenciadas, células indiferenciadas, células madre y genes relacionados con las propiedades de células madre. Para el análisis resumimos estos grupos de genes en 2 categorías: diferenciación y desdiferenciación/células madre. Este último incluía marcadores de células indiferenciadas, y genes relacionados con las propiedades de células madre. Estudiamos con este array muestras de células cultivadas exclusivamente en normoxia o en hipoxia que fueron recogidas en 2 puntos distintos de nuestro cultivo 3T3. El primer punto fue tomado al inicio del experimento cuando las células en normoxia aún tenían capacidad proliferativa normal. Llamamos a estas muestras Norm-Pro e Hip-Pro. El segundo punto experimental fue tomado cuando las células de normoxia alcanzaron la senescencia replicativa. En este punto las células cultivadas en hipoxia mantenían la capacidad proliferativa. Llamamos Resultados 62 Posteriormente, comprobamos el aumento de los niveles de proteína Tfcp2l1 en MEFs- Tfcp2l1 respecto a MEFs-Vector. Esto iba acompañado de altos niveles de los CKIs, p16Ink4a y p21Cip1 en las células que detuvieron su crecimiento (Figura R8 A). Además, estudiamos los niveles de ARNm de Tfcp2l1 y observamos una sobreexpresión más de 1000 veces superior a la obtenida en los MEFs-Vector (Figura R8 B). Esta alta sobreexpresión es unas 100 veces mayor a la hallada en hipoxia respecto a normoxia en el experimento 3T3 con MEFs-WT (Figura R3 C). Por último, estudiamos los niveles de ARNm de diferentes genes que previamente habíamos encontrado sobreexpresados en hipoxia. Así, en MEFs-Tfcp2l1 de normoxia encontramos sobreexpresión de p16INK4a y p21Cip1, al igual que a nivel proteico, y también de los genes relacionados con las propiedades de células madre Oct3/4, Sox2, Klf4 y Nanog. En el caso de c-Myc, observamos una pequeña disminución de la expresión al igual que en experimentos con MEFs-WT en hipoxia (Figura R4). Por último, hallamos sobreexpresión también en genes involucrados en la ruta de señalización de Tfcp2l1 en el mantenimeinto de la pluripotencia de mESCs265,266. Estos son Esrrb, Tbx3 y Klf2, así como Hes1 y Hey1, de la vía de Notch, que es regulada por Tfcp2l1 en el desarrollo267 (Figura 8C). Estos resultados sugerían que los niveles de expresión de Tfcp2l1 suprafisiológicos podrían actuar como oncogénicos induciendo una señal de OIS en MEFs independientemente de los niveles de oxígeno. Figura R8. La sobreexpresión de Tfcp2l1 en normoxia afecta a los niveles de ARNm y proteína de genes alterados por la hipoxia. A) Niveles de proteína de Tfcp2l1 y CKIs. Se analizaron los niveles de proteína de Tfcp2l1, p16Ink4a y p21Cip1 en muestras MEFs infectados y seleccionados tras los primeros 3 días de protocolo 3T3-modificado. B) Niveles de ARNm de Tfcp2l1. Se analizó los niveles de ARNm Tfcp2l1 en muestras a los 3 primeros días de protocolo 3T3- modificado. C) Niveles de ARNm de CKIs, genes relacionados con las propiedades de células madre y genes relacionados con la ruta de señalización de Tfcp2l1 en mESCs. Se midieron por qRT-PCR los niveles de expresión de los genes p16INK4a, p21Cip1, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc y Nanog, Esrrb, Hes1, Hey1, Klf2 y Tbx3. Para el análisis estadístico en los niveles de ARNm se utilizó el test t-Student. Las gráficas muestran la media de, al menos, 3 repeticiones independientes medidas por triplicado (*p<0,05; **p<0,01; ***<0,001). Resultados 63 A continuación, utilizamos un sistema de expresión inducible por doxiciclina para expresar Tfcp2l1 a niveles similares a los obtenidos en el cultivo de hipoxia en MEFs cultivados exclusivamente en normoxia (MEFs-Tfcp2l1-Inducible). Cultivamos los fibroblastos añadiendo doxiciclina al medio de cultivo a distintas concentraciones (100, 500 y 1000 ng/µl) y comparamos su crecimiento respecto al control sin doxiciclina en un experimento 3T3. Observamos un aumento de la proliferación y una extensión de la vida proliferativa en normoxia sólo de los MEFs- Tfcp2l1-Inducible cultivados con 500 ng/µl de doxiciclina. El resto de los cultivos de fibroblastos no crecieron más allá de los 20 días (Figura R9 A). Obtuvimos un incremento en los niveles de ARNm de Tfcp2l1 con el aumento de concentración de doxiciclina. Pudimos observar un incremento en la expresión de genes relacionados a las propiedades de célula madre en los días 3 y 6 en los MEFs-Tfcp2l1-Inducible cultivados con 500 ng/µl de doxiciclina. Estos genes fueron Oct3/4, c-Myc, Nanog, Sox2, Sox9, Bmi1 y Klf2. Pero esta sobeexpresión se reducía en el día 15 (Figura R9 B). También se obtuvo esta sobreexpresión en Stat3 y Tbx3, cuyo aumento se prolongó hasta el día 15. En el caso de Gbx2 sólo hubo incremento en los niveles de ARNm con doxiciclina en el día 9 (Figura R9 C). Además, medimos la expresión transcripcional de los CKIs p21Cip1 y p16INK4a. En el caso de p21Cip1 se observó un incremento de la expresión con la adición de doxiciclina que aumentó con el tiempo en cultivo. Sin embargo, no observamos diferencias en los niveles de ARNm de p16INK4a, a excepción de una disminución en la muestra cultivada con doxiciclina a 500 ng/µl en el día 15. Por último, observamos un incremento en los niveles de expresión de Bax, que se igualaron a los del control en el día 15 (Figura R9 D). Estos datos demuestran que sólo los niveles de expresión de Tfcp2l1 similares a los inducidos por la hipoxia pueden aumentar la vida proliferativa de los MEFs, mientras que la reducción de su expresión o el aumento en niveles muy superiores desembocan en senescencia. Además, estos niveles óptimos simulados en el experimento con la adición de doxiclina a 500 ng/μl, logran promover la expresión de genes que hemos visto sobreexpresados en nuestros cultivos de MEFs en hipoxia y disminuyen la expresión de p16INK4a para permitir la extensión de la vida proliferativa. Resultados 64 Figura R9. La sobreexpresión de Tfcp2l1 en niveles similares a los alcanzados por la hipoxia extiende la vida proliferativa de MEFs cultivados en normoxia. A) Crecimiento celular relativo de MEFs-Tfcp2l1-inducible en normoxia tratados con doxiciclina. MEFs fueron cultivados normoxia e infectados con lentivirus para la transducción de un vector de expresión de ADNc de Tfcp2l1 y un vector con el transactivador sensible a doxiciclina, tras la selección de las células que incorporaron los vectores, se sometieron a protocolo 3T3. Se les añadió doxiclina cada 3 días a las concentraciones de 100, 500 y 1000 ng/ul. B) Niveles de ARNm de Tfcp2l1 y genes relacionados con las propiedades de células madre. Se analizaron los niveles de ARNm Tfcp2l1, Oct3/4, c-Myc, Nanog, Sox2, Sox9, Bmi1 y Klf2 en muestras a los 3, 9 y 15 días de protocolo 3T3. C) Niveles de ARNm genes relacionados con la ruta de señalización de Tfcp2l1 en mESCs. Se midieron por qRT-PCR los niveles de expresión de los genes Stat3, Tbx3 y Gbx2. C) Niveles de ARNm de CKIs y Bax. Se midieron por qRT-PCR los niveles de expresión de los genes p16INK4a, p21Cip1 y Bax en muestras a los 3, 9 y 15 días de protocolo 3T3. 3. Estudio de la activación transcripcional de Tfcp2l1 en hipoxia A continuación, estudiamos cómo se induce la expresión de Tfcp2l1 en hipoxia. En primer lugar, añadimos DMOG, un inhibidor específico de las PHDs, al medio de cultivo de células en normoxia. Estas proteínas se encargan de hidroxilar residuos de los factores Hifα, marcándolos para su posterior ubiquitinización mediada por Vhl y su degradación vía proteasoma166. Como control de activación de las rutas de señalización en hipoxia, verificamos los niveles de Ldha, Resultados 65 diana transcripcional directa de Hif1α, comprobando que los niveles de ARNm se elevaban significativamente por encima de los del control y los de hipoxia. Pudimos observar un aumento de los niveles de proteína de Tfcp2l1 en los MEFs tratados (DMOG), que se elevaban por encima de los niveles de MEFs cultivados en normoxia (Control), similares a los de MEFs cultivados en hipoxia (Hipoxia) (Figura R10 A). A nivel de ARNm, observamos el mismo patrón de expresión de Tfcp2l1. También pudimos observar sobreexpresión en algunos genes relacionados con las propiedades de célula madre en los MEFs tratados con DMOG, como los factores de Yamanaka Oct3/4, Sox2, Klf4 y Nanog, aunque detectamos cierta variabilidad en las muestras tratadas con DMOG para este último gen. (Figura R10 B). Figura R10. DMOG aumenta los niveles de Tfcp2l1 y de genes cuya expresión es alterada por la hipoxia. A) Niveles de proteína de Tfcp2l1 en MEFs tratados con DMOG. Se trataron MEFs con DMOG durante 24 horas tras las que se realizó extracto total de proteínas y se comparó con MEFs cultivados en normoxia y MEFs cultivados en hipoxia. B) Niveles de ARNm en MEFs tratados con DMOG. Se trataron MEFs con DMOG durante 24 horas y se trajeron muestras de ARN. Se midió la expresión transcripcional por qRT-PCR de los genes Ldha, Tfcp2l1, Oct3/4, Sox2, Klf4 y Nanog. Para el análisis estadístico en los niveles de ARNm se utilizó el test t-Student. Las gráficas muestran la media de, al menos, 3 repeticiones independientes medidas por triplicado (*p<0,05; **p<0,01; ***<0,001). Para determinar si la sobreexpresión de Tfcp2l1 podría estar causada directa o indirectamente por Hif1α, decidimos sobreexpresar esta proteína en normoxia. Para ello, utilizamos una versión mutante del ADNc de Hif1α, cuya traducción resulta en la sustitución de 3 aminoácidos (Pro402, Pro577 y Asp813 por 3 residuos Ala). Esto reemplaza los residuos diana de las PHDs por otros que no son capaces de hidroxilar. De este modo, se confiere estabilidad a la proteína en presencia de oxígeno, simulando una activación constitutiva268. En primer lugar, llevamos a cabo la infección lentiviral de los vectores control (Vector) y el ADNc de Hif1α triplemente mutado (Hif1α-3M) y la selección de las células transducidas en normoxia. En primer lugar, observamos la parada proliferativa de las células y la adquisición de alta actividad β-galactosidasa ácida en MEFs-Hif1α-3M (Figura R11 A). Comprobamos la sobreexpresión de Hif1α mediante western blot, detectando los niveles de proteína Hif1α, así como los de la etiqueta que incluye el ADNc del vector transducido (Myc-Tag) y de Tfcp2l1. Detectamos sobreexpresión en todos los casos en MEFs-Hif1α-3M (Figura R11 B). A continuación, medimos los niveles de ARNm de diferentes genes cuya expresión observamos alterada previamente en hipoxia. En los MEFs-Hif1α-3M se producía una sobreexpresión de las dianas de Hif1α, Vegfa y Ldha. Esto se correspondía con una correcta Resultados 66 actividad transcripcional de Hif1α en las células. Encontramos también mayores niveles de Tfcp2l1 en MEFs-Hif1α-3M, confirmando la inducción por hipoxia de la expresión de Tfcp2l1. En cuanto a genes efectores de senescencia, pudimos observar un incremento de la expresión de los CKIs, p16INK4a y p21Cip1. Además de la sobreexpresión de Tfcp2l1 en MEFs-Hif1α-3M respecto a MEFs-Vector, se produjo un incremento de los niveles de ARNm de Oct3/4, Klf4 y c-Myc. También estudiamos la expresión de genes de la ruta de señalización de Tfcp2l1 en mESCs y pudimos observar un incremento en Esrrb, Stat3, Tbx3 y Gbx2 (Figura R11 C). Estos datos en su conjunto también sugieren que la activación constitutiva de Hif1α, mediante la sobreexpresión de una forma mutante, podría desencadenar, al igual que Tfcp2l1, una señal de OIS que disminuiría la capacidad proliferativa manteniendo activos los CKIs, a pesar de la activación de ciertas señales de pluripotencia. Figura R11. La sobreexpresión de Hif1α-3M activa dianas de la hipoxia en condiciones de normoxia y provoca senescencia prematura. A) Morfología celular senescente y tinción X-Gal. Se observó la morfología citoplásmatica en MEFs infectados y seleccionados que fueron fijados para su tinción con reactivo X-Gal. B) Niveles de proteína Hif1α y Tfcp2l1 inducidos por la sobreexpresión de Hif1α-3M. Se cuantificaron mediante wetern blot los niveles de proteína de Hif1α y la etiqueta Myc-Tag en MEFs-Hif1α-3M respecto a MEFs-Vector. También se midieron los niveles de Tfcp2l1. C) Niveles de ARNm de controles de activación de la hipoxia, CKIs, genes relacionados con las propiedades de células madre y la pluripotencia, y genes de la ruta de señalización de Tfcp2l1 inducidos por la expresión de Hif1a-3M. Se midió la expresión transcripcional mediante qRT-PCR de los genes Vegfa, Ldha, p16INK4a, p21Cip1, Tfcp2l1, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Esrrb, Stat3, Tbx3 y Gbx2. Para el análisis estadístico en los niveles de ARNm se utilizó el test t-Student. Las gráficas muestran la media de, al menos, 3 repeticiones independientes medidas por triplicado (*p<0,05; **p<0,01; ***<0,001). Los datos de activación de Tfcp2l1 por el mutante activo Hif1α-3M sugieren que Hif1α puede ser el factor de transcripción que active la expresión de Tfcp2l1 uniéndose a su promotor o un enhancer. Para ello, decidimos estudiar la posible interacción entre Hif1α y regiones reguladoras cercanas al gen Tfcp2l1 en el ADN. En primer lugar, observamos la proximidad a Tfcp2l1 de otro Resultados 67 gen con función relevante en desarrollo, Gli2. Para determinar qué regiones potencialmente reguladoras podrían actuar sobre Tfcp2l1 y no sobre Gli2 u otro gen cercano, realizamos un estudio de los dominios del ADN asociados topológicamente (TADs). Para ello, hicimos un análisis HiC de datos públicos procedentes de células ES-E14258. Tanto Tfcp2l1 como Gli2 pertenecen a un mismo TAD que, a su vez, está dividido en varios subTADs, de forma que ambos están ocupando subTADs diferentes. Esto restringe la búsqueda de potenciales elementos reguladores específicos de Tfcp2l1 a una región más concreta. Figura R12. Tfcp2l1 comparte un TAD junto a Gli2, pero forma su propio subTAD dentro de este. Se muestran los resultados de HiC para TADs cercanos a Tfcp2l1 en MEFs. Los datos se obtuvieron desde el repositorio público ENCODE (GSE74055), fueron visualizados con WashU Epigenome Browser y se señalaron los subTADs encontrados. A continuación, estudiamos la existencia de posibles elementos reguladores en las regiones cercanas a la secuencia de Tfcp2l1 en el ADN. Para ello, se analizaron datos de ChIP- seq públicos para las modificaciones de histonas H3K27ac (que marca enhancers y promotores activos) e H3K4me3 (que marca promotores activos, pero no enhancers)260 en fibroblastos derivados de embriones en día de desarrollo 13,5 259. Para ambos marcadores, observamos un alto número de picos en las regiones cercanas a Gli2 y entre los genes Tsn y SNORA17, así como en las proximidades de Tfcp2l1, aunque estos picos eran menos pronunciados, indicando, posiblemente, una menor actividad reguladora (Figura R13). Resultados 68 Figura R13. Existen múltiples posibles promotores y enhancers en las regiones cercanas a Tfcp2l1 en el ADN. Se muestran los resultados de ChIP-Seq para H3K27ac y H3K4me3 cercanos a Tfcp2l1 en MEFs. Se analizaron los datos publicados (GSE49847) y se obtuvieron los picos para la región que ocupa el subTAD asociado a Tfcp2l1 en el genoma localizado en el análisis anterior. Finalmente, analizamos mediante la herramienta Jaspar las secuencias donde se hallaron evidencias de la presencia de las modificaciones de histona H3K27ac y de H3K4me3. Analizamos todos los picos entre el gen Tsn y la zona intergénica existente entre Gli2 e Inhbb. Con esta herramienta, tratamos de identificar si en dichas secuencias se encontraba el motivo de unión de Hif1α al ADN. Como resultado, obtuvimos varias predicciones con un alto valor de significación estadística en la predicción. En la tabla, se recogen los valores de predicción para los motivos de unión por los que se une al ADN Hif1α, Arnt (también conocido como Hif1β) y el dímero formado por Arnt-Hif1α. Se muestran los valores de predicción partir de valor 8 (Tablas R1 y Tabla R2). Tabla R1. Es probable encontrar motivos de unión de Hif1α al ADN junto a marcas H3K4me3 cerca del gen Tfcp2l1. Se obtuvieron las secuencias de los H3K4me3 analizados previamente. Se introdujeron estas secuencias en la herramienta Jaspar y se anotaron los valores de predicción superiores a 8. Se destacan en negrita los valores superiores a 10 o cercanos a 10 con redundancia en la misma secuencia. Picos H3K4me3 Valores de predicción Nº Coordenadas Hif1α (Hs) Arnt-Hif1α (Mm, Hs) Arnt (Mm) 1 chr1 120207069 120208069 8,9+8,6 10,35(x2) 2 chr1 120218264 120219264 10,35(x2) 3 chr1 120284832 120285832 4 chr1 120353476 120354476 5 chr1 120355828 120356828 6 chr1 120524203 120525203 7 chr1 120878169 120879169 11,44 9,65 8,6 8 chr1 120944066 120945066 9 chr1 120948708 120949708 10 chr1 121048448 121049448 8,6 Resultados 69 Tabla R2. Es probable encontrar motivos de unión de Hif1α al ADN junto a marcas H3K27ac cerca del gen Tfcp2l1. Se obtuvieron las secuencias de los H3K27ac analizados previamente. Se introdujeron estas secuencias en la herramienta Jaspar y se anotaron los valores de predicción superiores a 8. Se destacan en negrita los valores superiores a 10 o cercanos a 10 con redundancia en la misma secuencia. Estos picos con alto valor de predicción coincidían con el promotor de Tsn (pico 1 en ambos ChIP-Seq, Tablas R1 y R2) otro, aguas arriba de Clasp1 (pico 6 de H3K27ac Tabla R2), otro en el primer intrón de este mismo gen (picos 12 y 13 en el ChIP-Seq de H3K27ac Tabla R2) y uno último aguas abajo de Tfcp2l1 (pico 20 de H3k27ac y pico 7 de H3K4me3 Tablas R1 y R2). De entre todos, la mayor concentración de valores de predicción altos se encontró aguas abajo de Tfcp2l1. Esto sugiere una alta probabilidad de unión de Hif1α a un enhancer activo perteneciente al subTAD de Tfcp2l1 y, por tanto, que Hif1α podría regular la expresión de Tfcp2l1 durante la hipoxia. Picos H3K27ac Valores de predicción Nº Coordenadas Hif1α (Hs) Arnt-Hif1α (Mm, Hs) Arnt (Mm) 1 chr1 120207404 120208404 8,9 10,35(x2) 2 chr1 120221282 120222282 3 chr1 120255176 120256176 8,9 10,35(x2) 4 chr1 120265167 120266167 8,6 5 chr1 120285203 120286203 8,9 6 chr1 120295951 120296951 11,33 10,32 7 chr1 120334277 120335277 8,66 8 chr1 120349335 120350335 9 chr1 120353439 120354439 10 chr1 120355455 120356455 11 chr1 120421418 120422418 8,9 12 chr1 120601335 120602335 11,33+9(x2) 9-10(x4) 10,35(x4) 13 chr1 120601816 120602816 10+11+9(x3) 9,5(x2) 10,35(x4) 14 chr1 120721954 120722954 15 chr1 120770136 120771136 16 chr1 120832188 120833188 17 chr1 120848959 120849959 18 chr1 120849606 120850606 19 chr1 120872555 120873555 20 chr1 120878507 120879507 11,44 9,7 8,6 21 chr1 120889798 120890798 9,1 22 chr1 120893574 120894574 23 chr1 120918933 120919933 24 chr1 120929983 120930983 25 chr1 120948747 120949747 26 chr1 121004587 121005587 8,6 27 chr1 121022115 121023115 28 chr1 121025014 121026014 9,4 29 chr1 121026023 121027023 30 chr1 121040365 121041365 31 chr1 121049700 121050700 Resultados 70 4. Estudio de las dianas transcripcionales de Tfcp2l1 en hipoxia y normoxia Para estudiar las dianas reguladas por Tfcp2l1 en hipoxia y, en concreto, aquellas posibles responsables de su efecto de extensión de vida proliferativa, realizamos ChIP-Seq (mediante protocolo ChIPmentation) inmunoprecipitando Tfcp2l1 en una muestra de normoxia senescente (Sen) y una muestra de hipoxia inmortalizada (Inm). Los resultados de secuenciación se analizaron mediante el mapeo o alineamiento con el genoma de ratón Mouse Dec. 2011 (GRCm38/mm10) y, posteriormente, realizando la identificación de picos estadísticamente significativos o peak calling. Se estableció q-valor<0,01 como nivel de significación estadística para reducir falsos positivos. De este modo, pudimos distinguir 3 grupos de picos: uno de señal específica en la muestra de senescencia (Sen, 198 picos); otro de señal específica en la muestra inmortalizada (Inm, 418 picos); y un tercer grupo con señal común en ambas muestras al que denominamos Com (194 picos) (Figura R14). Figura R14. Tfcp2l1 se une a un mayor número de secuencias asociadas a genes en inmortalización (Inm). Se muestra la señal de secuenciación del ChIP-Seq de Tfcp2l1 en senescencia (Sen) e inmortalización (Inm). Media del número de lecturas entorno a los picos de Tfcp2l1 en la muestra de normoxia senescente (Sen), y en la de hipoxia inmortalizada (Inm). Se observa una señal específica de cada muestra y una señal común en los perfiles de ambas muestras y en el heatmap. Posteriormente, realizamos un análisis de enriquecimiento de motivos de unión al ADN de factores de transcripción (TFs) en los 3 grupos de picos. En el caso de los picos asociados a la muestra senescente (Sen), se hallaron los motivos descritos para los TFs ETS:RUNX, KLF10, NFkB-p50-p52 y NFAT. El p-valor de estos 4 motivos no era inferior a 10-2. En cambio, en el grupo de picos comunes (Com), los motivos encontrados eran más numerosos y de menor pvalor. Los 5 motivos más significativos fueron aquellos descritos para los TFs HIF-1b, Tfcp2l1, Resultados 71 Atf, HIF-2a y NFAT-AP1. Por último, en el grupo de picos de la muestra de hipoxia inmortalizada (Inm) se encontraron enriquecidos 2 motivos de TFs, siendo el de menor p-valor el motivo de Tfcp2l1 y el segundo, el motivo formado por RAR:RXR. La presencia del motivo de unión de Tfcp2l1 al ADN es indicativo de la especificidad de los picos encontrados en la muestra tomada durante la inmortalización (Figura R15). Figura R15. El motivo de unión al ADN de Tfcp2l1 se encuentra enriquecido en los picos comunes (Com) y en los de la muestra de células inmortalizadas (Inm). Análisis de enriquecimiento de motivos en los 3 grupos de picos del ChIP-Seq. Se muestran por orden de p-valor los enriquecimientos más significativos estadísticamente en cada grupo junto con el porcentaje de secuencias diana (picos) y secuencias inespecíficas (control aleatorio o “background”) en los que se han encontrado los motivos. Resultados 78 Tabla R3. Genes asociados a la regulación de la proliferación en las células inmortalizadas en hipoxia (Inm). Se muestra la relación de genes incluidos en los términos GO relacionados con la proliferación que resultaron estadísticamente significativos en el análisis funcional de la muestra de inmortalización en hipoxia (Inm). Dichos términos GO son: “regulation of cell proliferation” (GO:0042127), “negative regulation of epithelial cell proliferation” (GO:0050680), “positive regulation of cell proliferation” (GO:0008284). Pudimos comprobar que la señal era muy leve en la muestra de MEFs senescentes (Sen) y muy alta, por el contrario, en las muestras de MEFs inmortalizados en hipoxia (Inm) (Figura R22), confirmando la especificidad de estos picos en condiciones de hipoxia/inmortalización. Figura R22. Tfcp2l1 se une a genes relacionados con la regulación de la proliferación en células inmortalizadas en hipoxia (Inm) de manera específica. Representación del perfil de la señal de secuenciación obtenida en los ChIPs de Tfcp2l1 para los picos a los que se asocian los 46 genes de regulación de la proliferación hallados en el análisis funcional de las células inmortalizadas en hipoxia (Inm). Algunos ejemplos de los genes relacionados con funciones de proliferación asociados a estos picos son Il1b, Il2, Klf10, Pdgfra, Rgcc, Sox2, Sox9, Sox11, Tdgf1 y Tgfa (Figura R23). Genes asociados a regulación de la proliferación - Inm Adra1a Ier5 Pdcd5 Slc25a33 Azgp1 Il1b Pdgfra Smarca2 Chrna10 Il2 Plpp1 Sox11 Dlg5 Il21 Prkch Sox2 Fbxw7 Il7 Pten Sox9 Fer Irs2 Ptn Tdgf1 Flt4 Klf10 Ptprc Tgfa Fn1 Kmt2d Rgcc Thbs1 Folr2 Myo16 Runx3 Utp20 Garem1 Nacc2 Scgb3a1 Xiap Gata3 Npr3 Sfrp2 Grem1 Nrg1 Six3 Resultados 79 Resultados 80 Figura R23. Ejemplos de picos asociados a genes relacionados con la regulación de la proliferación en las células inmortalizadas en hipoxia (Inm). Se muestran imágenes obtenidas desde UCSC Genome Browser tras el mapeo o alineamiento de la secuenciación resultante del experimento ChIP-Seq con el genoma de referencia Mouse Dec. 2011 (GRCm38/mm10). Los picos asociados a los genes indicados son específicos de las células inmortalizadas en hipoxia (Inm). Resultados 81 Posteriormente, decidimos validar algunos de estos picos mediante ChIP-qPCR inmunoprecipitando Tfcp2l1 de nuevo en muestras senescentes (Sen) e inmortalizadas por la hipoxia (Inm) y utilizando cebadores diseñados para las regiones donde se localizaban dichos picos. Pudimos confirmar la unión de Tfcp2l1 en muestras inmortalizadas por la hipoxia (Inm) para los picos asociados a Tgfa, Sox2 y Sox9. Utilizamos cebadores diseñados contra una zona no codificante o desértica del genoma (“Gene Desert”) como control negativo de amplificación y obtuvimos una señal de amplificación menor a la de la muestra IgG en todos los casos (Figura R24 A). Además de esto, analizamos los niveles de ARNm de Tgfa en dos puntos diferentes del experimento 3T3. El primer punto se tomó cuando las células de normoxia conservaban la capacidad proliferativa (Pro). El segundo punto se tomó cuando los MEFs de normoxia entraron en senescencia (Sen) y los de hipoxia seguían proliferando (Inm). Encontramos sobreexpresión en las muestras de hipoxia respecto a las de normoxia (Figura R24 B) También hemos observado la sobreexpresión de Sox2 y Sox9 en muestras similares de hipoxia respecto a muestras de normoxia en experimentos 3T3 (Figura R4 A). Esto validaba los datos de ChIP-Seq y sugiere que Tfcp2l1 podía estar activando la transcripción de estos genes en hipoxia. Figura R24. En los MEFs inmortalizados en hipoxia Tfcp2l1 se une al ADN cerca de las secuencias de Tgfa, Sox2 y Sox9 cuya expresión aumenta en estas condiciones. A) Validación de la unión de Tfcp2l1 al ADN en regiones asociadas a Sox2, Sox9 y Tgfa. Se diseñaron cebadores específicos contra las regiones ocupadas por picos de Tfcp2l1 en el ChIP-Seq realizado previamente y se analizó mediante qPCR el ADN inmunoprecipitado con anti-Tfcp2l1 de nuevo en muestras de MEFs senescentes de normoxia (Sen) e inmortalizados en hipoxia (Inm). Se utilizaron cebadores contra una región no codificante del genoma como control negativo (Gene desert). Como control positivo se utilizó la inmunoprecipitación de las muestras con anti-RNA polimerasa II y cebadores contra el primer exón de α-tubulina. Los datos de Ct se analizaron mediante el método cuantificación relativa cuyo resultado (expresado en porcentaje de ADN de la muestra respecto al control negativo INPUT) se representó relativizando la muestra inmunoprecipitada con anti- Tfcp2l1 a la inmunoprecipitada con IgG. B) Expresión transcripcional de Tgfa. Se analizaron mediante qRT-PCR los niveles de ARNm de Tgfa en MEFs en normoxia y en hipoxia al inicio del experimento 3T3 (Pro) y cuando entraron en senescencia en normoxia (Sen), pero proliferaban en hipoxia (Inm). Se muestra la media de, al menos, 2 réplicas biológicas analizadas por triplicado. Resultados 82 En conjunto, estos resultados indican que el incremento de la expresión de Tfcp2l1 en hipoxia se corresponde con una mayor unión de este factor de transcripción al ADN y, en concreto, a regiones asociadas a genes con relevancia en la regulación de la proliferación entre los que destacamos, tras su validación, Sox2, Sox9 y Tgfa. 5. Estudio del papel de Tfcp2l1 en el efecto causado por la hipoxia en la generación de iPSCs 5.1. Efecto de la sobreexpresión de Tfcp2l1 en reprogramación celular Para estudiar la implicación de Tfcp2l1 en el efecto que causa la hipoxia sobre la reprogramación celular, decidimos comparar la capacidad de generación de iPSCs de células que sobeexpresaban Tfcp2l1 y células tratadas con hipoxia. Para ello, utilizamos MEFs de ratones transgénicos que poseían un cassette reportero para la expresión de Nanog (GFP-IRES- Puro introducido en la región no traducida 5’ del gen Nanog198). Se infectaron esos MEFs-Nanog-GFP con vectores para la expresión de los 4 factores de Yamanka Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc (4F) y los 4 factores más Tfcp2l1 (4F-Tfpc2l1). Los niveles de sobreexpresión de Tfcp2l1 se comprobaron a los 4 días postransducción (Figura R25 A). Además, MEFs-4F se cultivaron en hipoxia (4F-Hipoxia) durante un periodo de 9 días. Tras esto, se devolvieron a normoxia y se seleccionaron con puromicina aquellas colonias que expresaban Nanog en todas las condiciones. Finalmente, se contaron las colonias Nanog-GFP+ a los 21 días (Ver materiales y métodos, Figura MM 1). Pudimos observar un aumento estadísticamente significativo en la generación de colonias iPSCs (Nanog-GFP+) en las condiciones 4F-Hipoxia y 4F-Tfcp2l1 respecto a la condición control 4F de normoxia. Sin embargo, no hallamos diferencias significativas entre las condiciones 4F-Hipoxia y 4F-Tfcp2l1. Esto podría sugerir que Tfcp2l1 es capaz de replicar el efecto de la hipoxia sobre la eficiencia de generación de iPSCs (Figura R25 B y C). 5.2. Efecto de la reducción de la expresión de Tfcp2l1 en reprogramación celular Posteriormente, decidimos comprobar el efecto de la disminución de Tfcp2l1 en la generación de iPSCs tratadas con hipoxia. Para ello, realizamos el mismo experimento anterior y sobreexpresamos 2 moléculas diferentes de shARN (Sh#1 y Sh#2) y una molécula contol (Sc) en MEFs-4F en hipoxia y también en normoxia como condición control. Comprobamos la disminución de la expresión de Tfcp2l1 a los 4 días postraducción y hallamos una reducción en todas las condiciones respecto al control Sc de normoxia, especialmente en el caso del Sh#2 (Figua R26 A). De nuevo, comparamos la capacidad de generación de iPSCs contando el número de colonias Nanog-GFP+ a los 21 días postransducción. En MEFs-4F-Sc, se observó un aumento estadísticamente significativo del número de colonias Nanog-GFP+ en hipoxia respecto a normoxia. Se produjo también una reducción del número de colonias con la expresión de ambos shARN respecto al Sc en cada condición de oxígeno. Resultados 83 Por otro lado, comparamos la generación de colonias en hipoxia durante la sobreexpresión de los ARNsh a la de normoxia. Observamos que el número de colonias se reducía a valores similares, especialmente en 4F-Sh#2 de hipoxia donde no se encontraron diferencias significativas respecto a 4F-Sc en normoxia (Figura R26 B y C). Figura R25. La sobreexpresión de Tfcp2l1 puede replicar el efecto de la hipoxia en reprogramación. A) Expresión transcripcional de Tfcp2l1. A 4 días postransducción se recogieron muestras de todas las condiciones y se midieron los niveles de ARNm de Tfcp2l1 mediante qRT-PCR. El resultado de expresión se relativizó a la media del control 4F de normoxia B) Número de colonias GFP+. Se contaron las colonias GFP+ a 21 días postransducción en las diferentes condiciones. C) Colonias iPSCs. MEFs-NanogGFP-IRES-Puro transducidos con los factores indicados se seleccionaron para la expresión de Nanog en todas las condiciones y se observaron al microscopio de fluorescencia a 21 días postransducción. Para el análisis estadístico en los niveles de ARNm se utilizó el test Anova (One way). En el análisis de crecimiento se compararon todas las muestras entre sí mediante el test múltiple Anova. Las gráficas muestran la media de, al menos, 3 repeticiones independientes medidas por triplicado (*p<0,05; **p<0,01; ***<0,001). ND: no determinado. Resultados 84 Figura R26. La reducción de la expresión de Tfcp2l1 puede reducir el efecto de la hipoxia en reprogramación. A) Expresión transcripcional de Tfcp2l1. 4 días postransducción se recogieron muestras de todas las condiciones y se midieron los niveles de ARNm de Tfcp2l1 mediante qRT-PCR. B) Número de colonias GFP+. Se contaron las colonias GFP+ a 21 días postransducción en las diferentes condiciones. C) Colonias iPSCs. MEFs-NanogGFP-IRES-Puro transducidos con los factores indicados y ARNsh se seleccionaron para la expresión de Nanog en todas las condiciones y se observaron al microscopio de fluorescencia a 21 días postransducción. Para el análisis estadístico en los niveles de ARNm y de crecimiento se utilizó el test Anova (One way) y se eligió como condición de referencia la muestra 4F-Sc de normoxia. Las gráficas muestran la media de, al menos, 3 repeticiones independientes medidas por triplicado (*p<0,05; **p<0,01; ***<0,001). Resultados 85 5.3. Meta-análisis de la expresión de Tfcp2l1 en reprogramación Por último, estudiamos en iPSCs la expresión de genes que podrían intervenir en el proceso de inmortalización celular. Para ello, realizamos un meta-análisis en el que analizamos la expresión de genes que previamente habíamos observado alterados por la hipoxia y por la sobreexpresión de Tfcp2l1 en nuestro modelo de MEFs. Utilizamos datos de expresión de ARNm generados por el grupo de investigación del Dr. Shinya Yamanaka en experimentos de reprogramación con MEFs en condiciones similares a las de nuestros experimentos anteriores. En primer lugar, comparamos la expresión de distintos genes en iPSCs generadas con un tratamiento de hipoxia similar al de nuestro experimento anterior. MEFs infectados con los 4 factores de Yamanaka se expusieron a concentraciones del 1% y 5% O2 durante 9 días201. Pudimos observar un incremento de Tfcp2l1 en ambas condiciones de hipoxia, siendo mayor a 5% de O2. En cambio, los efectores de la senescencia p21Cip, p16INK4a y Tp53 disminuían su expresión con la reducción de los niveles de oxígeno. Además de esto, comprobamos la sobreexpresión de Nanog en hipoxia, cuyo incremento era mayor al 1% O2 (Figura R27 A). A continuación, comparamos la expresión de estos genes en diferentes estadios de la reprogramación con mESCs y células somáticas sin reprogramar. Así, observamos los niveles de ARNm en MEFs a días 2, 4, 8, 18 de reprogramación y también en iPSCs consideradas maduras. Tanto la expresión de Tfcp2l1 como de Nanog aumentaban a lo largo del proceso de reprogramación, encontrándose los niveles más altos en iPSCs maduras. Estos niveles altos de las iPSCs eran similares en mESCs. Sin embargo, la expresión de Tfcp2l1 y de Nanog era muy reducida en las muestras de células somáticas sin reprogramar. De nuevo, encontramos una correlación negativa entre la expresión de Tfcp2l1 y de p21Cip1 y p16Ink4a, al igual que en nuestro modelo experimental de MEFs. Aunque los niveles de ARNm son altos en los primeros días de reprogramación, se produce una caída de la expresión en las iPSCs maduras e igualmente en mESCs, coincidiendo con los niveles más altos de Tfcp2l1. Por último, se observaron niveles más altos de Tp53 en iPSCs y mESCs que en los estadios intermedios de reprogramación y que en células somáticas sin reprogramar (Figura R27 B). Resultados 86 Figura R27. La expresión de Tfcp2l1 correlaciona positivamente con Nanog y negativamente con efectores de la senescencia en el proceso de reprogramación y en hipoxia. A) Niveles de ARNm en iPSCs cultivadas en hipoxia y normoxia. Se comparó la expresión de Tfcp2l1 con la de p21Cip1, p16Ink4a, Tp53 y Nanog en iPSCs cultivadas en normoxia y a 5% y 1% de O2. B) Niveles de expresión durante el proceso de reprogramación y en mESCs. Se compararon niveles de ARNm de Tfcp2l1, Nanog, p21Cip1, p16Ink4a, y Tp53 en MEFs a los 2, 4, 8 y 18 días de la transducción de OSKM, además de iPSCs maduras, mESCs y células somáticas sin reprogramar. DISCUSIÓN Discusión 94 con esta concentración de doxiciclina en los días 3 y 6, que se correspondía con los días de inducción de la expresión de Tfcp2l1. También observamos sobreexpresión de Bmi1 y Klf2 en estos días. Y de Sox9 algo más tardía en el tiempo. En cuanto a los componentes de la ruta de señalización de Tfcp2l1, pudimos observar un aumento de los niveles de ARNm de Stat3 en los días 3 y 9, posiblemente por retroalimentación ya que Stat3 activa la transcripción de Tfcp2l1 tras la señalización de Lif en ESCs265. La expresión de Tbx3 también aumentó del mismo modo y la de Gbx2, aunque más tarde en el tiempo. En paralelo observamos una disminución de p16INK4a a día 15 en MEFs cultivados con 500 ng/μl de doxiciclina. Sin embargo, observamos un ligero aumento de expresión con el tiempo en p21Cip1, al igual que Bax, indicando la posible existencia de estrés en las células de cultivo y la activación de la vía de señalización de p53. Es posible que este estrés proceda de la selección de los fibroblastos primarios transducidos con los 2 vectores que forman el sistema de expresión inducible por doxiciclina. En conjunto, nuestros datos sugieren que sólo los niveles de Tfcp2l1 similares a los fisiológicos producidos por la hipoxia son capaces de facilitar la inmortalización. Como primera evidencia, mostramos que se produce una inducción de senescencia cuando se sobreexpresan niveles altos de Tfcp2l1 respecto a los promovidos por la hipoxia. También debe tenerse en cuenta la sobreexpresión de genes relacionados con Tfcp2l1, que sólo se produjo cuando el cultivo era suplementado con niveles medios de doxiciclina, induciendo niveles moderados de sobreexpresión de Tfcp2l1 y se confirmó con un número elevado de genes de pluripotencia. Por último, como evidencia adicional, se sabe que sólo cuando los niveles de Tfcp2l1 son similares a los inducidos por Lif en el cultivo de ESCs, se consigue replicar su efecto sobre la pluripotencia y la autorrenovación en estas células265. De una manera similar sucede para el factor de núcleo de pluripotencia Oct3/4. En su caso, niveles muy altos, o muy bajos de expresión dan lugar a diferenciación de las ESCs192. Esto es indicativo de que la expresión de Tfcp2l1 es fielmente regulada en las células ya que niveles por encima o por debajo de los fisiológicos no promueven la autorrenovación celular. Niveles de Tfcp2l1 fuera de la ventana fisiológica podrían inducir senescencia celular como consecuencia de su ausencia o bien de efecto de OIS. Activación de la expresión de Tfcp2l1 inducida por la hipoxia En primer lugar, simulamos hipoxia en normoxia utilizando un inhibidor de las PHDs, impidiendo la degradación de las proteínas Hifα y bservamos un aumento de Tfcp2l1. Esto sugiere que Tfcp2l1 puede ser diana transcripcional de alguna de las isoformas de Hifα. En estas condiciones, con la inhibición química de las PHDs, observamos un aumento de los niveles de ARNm de Oct3/4, Sox2 y Klf4 al igual que en MEFs en hipoxia. Ya que la expresión de Tfcp2l1 aumenta con la inhibición de las PHDs, utilizamos un mutante de activación constitutiva de Hif-1α, que expresamos ectópicamente en MEFs, para ver si la activación era regulada por esta proteína. La expresión de Hif1α en normoxia provocó la parada proliferativa de las células. Se sabe que Hif1α puede provocar senescencia a través de Discusión 95 p21Cip1, p27Kip1, la inhibición de CDC25A o el SASP183–187. En nuestros experimentos, la parada de la proliferación fue acompañada de un fenotipo senescente con alta actividad β-galactosidasa ácida, cambio morfológico y expresión elevada de p21Cip1 y p16INK4a. Con la expresión ectópica del mutante de activación constitutiva de Hif1α observamos el aumento de Tfcp2l1 en ARNm y proteína, así como un aumento de expresión de Oct3/4, Klf4 y c-Myc coincidiendo con el aumento de Tfcp2l1. Además, se produjo la activación de la expresión de algunos de los componentes de la ruta de señalización de Tfcpl21 como Esrrb, Tbx3, Gbx2 y Stat3. Por tanto, Hif1α activa directa o indirectamente la expresión de Tfcp2l1 y de genes activados en MEFs cultivados en hipoxia. Ante estas evidencias, para observar si había un efecto transcripcional directo sobre Tfcp2l1, decidimos estudiar la probabilidad de que Hif1α se uniera a una región reguladora cercana a Tfcp2l1 en el ADN. Tfcp2l1 comparte un TAD con Gli2, otro gen importante en desarrollo. Sin embargo, esta región se divide en 2 subTADs diferentes y Tfcp2l1 ocupa uno solo de ellos. Localizamos las posibles regiones reguladoras utilizando datos públicos de ChiP-Seq de modificaciones de histona para identificar posibles enhancers y promotores activos260. Por último, estudiamos la presencia de los motivos de unión por los que Hif1α se une al ADN y encontramos una alta probabilidad de unión de Hif1α a un enhancer activo perteneciente al subTAD de Tfcp2l1. Por lo tanto, el aumento de la expresión de Tfcp2l1 en hipoxia es, probablemente, causado por Hif1α y es responsable del incremento de la vida proliferativa y escape de la senescencia en MEFs. Dianas transcripcionales de Tfcp2l1 en hipoxia Para conocer las dianas transcripcionales a través de las que Tfcp2l1 contribuye a este efecto fisiológico de la hipoxia, realizamos ChIP-Seq en una muestra senescente de normoxia (Sen) y una muestra de hipoxia que había prolongado su capacidad proliferativa y que consideramos inmortalizada (Inm). De este modo, pudimos comparar la actividad diferencial de Tfcp2l1 como factor de transcripción en los estados proliferativo (Inm) y no proliferativo (Sen) que se alcanzan en las dos condiciones de oxígeno durante nuestro experimento 3T3. En los resultados de secuenciación encontramos una alta señal común a las dos muestras. Esto podría indicar que Tfcp2l1 tiene una actividad basal sobre dianas comunes en las dos condiciones de oxígeno y en ambos estados proliferativos de las células. El motivo de unión al ADN descrito para Tfcp2l1 se encuentra enriquecido en el grupo de picos comunes a las dos muestras (Com) y también en la muestra de células inmortalizadas en hipoxia (Inm). Esto sirve como evidencia de la especificidad de los resultados, aunque no excluye la posibilidad de unión al ADN mediante motivos de unión alternativos no descritos o mediante la unión a otros factores de transcripción. Esto es lo que podría ocurrir en la muestra senescente (Sen). Además, encontramos enriquecidos los motivos de unión descritos para Hif1β Discusión 96 y Hif2α en los picos comunes (Com). Esto podría indicar una posible cooperación entre los factores de respuesta a hipoxia y Tfcp2l1 para unirse a dianas comunes, aunque serían necesarios estudios adicionales sobre esta interacción para generar evidencias al respecto. Tfcp2l1 se une a un mayor número de secuencias asociadas a genes en la muestra de células inmortalizadas en hipoxia (Inm). Esto coincide con la mayor expresión de Tfcp2l1 en estas muestras respecto a las de normoxia. De este modo, la hipoxia estimula no solo la expresión de Tfcp2l1, sino también su actividad de unión al ADN y, probablemente, su actividad como factor de transcripción. El número de picos específicos de la muestra senescente de normoxia (Sen) fue similar al número de picos comunes (Com) asociados a genes, 236 y 249, respectivamente, 2,5 veces menor que en la muestra inmortalizada de hipoxia (Inm). Entre los genes a los que se asociaban los picos comunes de ambas muestras (Com) destacan aquellos que codifican para componentes de la ruta de señalización de Notch (Axin2, Hes7, Hey2). Esta ruta ha sido descrita como diana transcripcional de Tfcp2l1 en su función de regulación del desarrollo del túbulo colector del riñón267. Además, hemos observado sobreexpresión de algunos de los componentes de esta ruta con la expresión ectópica de Tfcp2l1. Por tanto, puede que Tfcp2l1 regule esta ruta de señalización en ambas condiciones de oxígeno, pero que esto no sea suficiente para evadir la senescencia en normoxia. Hemos señalado como ejemplos representativos de los picos asociados a genes en la muestra senescente (Sen) a dos dianas descritas de Tfcp2l1, Gbx2 y Tet2. En el caso de Gbx2, observamos una sobreexpresión en hipoxia en MEFs. Por eso, es necesario tener en cuenta la posible función de Tfcp2l1 también como factor represor de la transcripción que ha sido descrita previamente265. Algo similar puede ocurrir en el caso de Tet2, que ha sido descrito previamente como diana transcripcional de Tfcp2l1. Tet2 es una proteína demetiladora que puede unirse a Tfcp2l1 para aumentar la accesibilidad de los promotores de Nanog y Klf4, promoviendo la pluripotencia y facilitando la reprogramación277. Es posible que Tfcp2l1 actúe como represor en normoxia, disminuyendo la expresión de Tet2 y evitando la accesibilidad a los promotores de estos genes que se expresan menos en normoxia que en hipoxia. En el caso de los picos mostrados de la muestra de hipoxia, tienen especial relevancia como diana de Tfcp2l1 los genes de proliferación. Tbx6 tiene función en desarrollo y es similar en función y estructura a Tbx3, que forma parte de la ruta de señalización de Tfcp2l1 que mantiene la autorrenovación y la pluripotencia en ESCs. Además, Tbx6 puede actuar junto con Sox2 para unirse a enhacers en el desarrollo neural288. Sox5 forma parte de la familia Sox y está involucrado en el desarrollo del embrión, además está descrito que puede unirse a Sox9 para actuar en conjunto sobre regiones reguladoras289. En el caso de Il2-Il21, sería necesario un estudio en más profundidad de la región reguladora que ocupa el pico de Tfcp2l1 para determinar si puede encargarse de la regulación de una de las 2 interleuquinas o de ambas al ocupar este sitio del genoma. Discusión 97 Al estudiar los términos GO (Biological Process) en ambas muestras encontramos gran variedad de términos en los resultados. El enriquecimiento en estos términos fue mucho más bajo en la muestra senescente (Sen). Sin embargo, fue mucho más significativo en la muestra inmortalizada en hipoxia (Inm). Aunque en ambos casos encontramos procesos tales como “Desarrollo y difrenciación”, “Metabolismo” o “Señalización” representados entre los términos ontológicos, estos hacían referencias a procesos muy diversos difíciles de relacionar entre sí en cada categoría. Sin embargo, encontramos entre los términos más enriquecidos de la muestra inmortalizada en hipoxia (Inm) 3 términos referentes a la regulación de la proliferación y cuyo “gene ratio” era alto. Al englobarlos en una categoría única a la que denominamos “proliferación” sumaban 46 genes, suponiendo casi la mitad (45,5%) de los genes estudiados en los 20 términos más representativos. La unión de Tfcp2l1 a estos genes implicados en la regulación de la proliferación es específica de la muestra inmortalizada (Inm) como pudimos comprobar en el perfil promedio de unión de Tfcp2l1 a estos genes. Todo esto sugiere que la hipoxia no sólo aumenta la expresión de Tfcp2l1, sino que también promueve la proliferación a través de la unión de Tfcp2l1 a este conjunto de genes. Entre los 46 genes asociados a estos términos ontológicos destacamos Il1b, Il2, Klf10, Pdgfra, Rgcc, Sox2, Sox9, Sox11, Tdgf1 y Tgfa. La regulación transcripcional de estos genes por parte de Tfcp2l1 explica su función en el incremento proliferativo de hipoxia y el aumento de la vida proliferativa, así como la adquisición de un perfil de expresión de genes relacionados con las propiedades de células madre. Las muestras de hipoxia de nuestro experimento 3T3 sobreexpresan Tgfa, Sox2 y Sox9 en hipoxia al inicio y al final del experimento 3T3. Esto junto a la validación de la unión de Tfcp2l1 a los sitios del ADN donde se localizan sus picos asociados, sugiere que Tfcp2l1 promueve su transcripción de forma directa. Esto explica, funcionalmente, el papel causal de Tfcp2l1 en el efecto fisiológico de la hipoxia en MEFs. Tfcp2l1 incrementa la expresión de Tgfa, que es un factor de crecimiento que activa las rutas de proliferación en la célula290. Además, Tfcp2l1 aumenta la expresión de Sox2 que forma parte del núcleo de pluripotencia198 y de Sox9 que participa en el mantenimiento de la pluripotencia al expresarse en células madre de tejido adulto282. Tfcp2l1 en reprogramación celular Tfcp2l1 es el responsable del incremento de la proliferación en MEFs en hipoxia que produce un aumento de la expresión de genes relacionados con las propiedades de células madre y va acompañado de la disminución de la expresión de CKIs. Estos son eventos necesarios para la reprogramación celular ya que con ella se consigue la pluripotencia y la senescencia es una barrera que puede impedirlo198,205,206. De este modo, nuestros resultados apoyan la hipótesis de que Tfcp2l1 puede ser responsable del efecto de aumento de la eficiencia de la reprogramación descrito previamente en hipoxia201. Discusión 98 La expresión ectópica de Tfcp2l1 incrementa el número de colonias iPSCs Nanog-GFP+ en MEFs-Nanog-GFP transducidos con los 4 factores de Yamanaka, al igual que lo hace la exposición a hipoxia en estas células. Además, la expresión de shARN contra el ARNm de Tfcp2l1 consigue disminuir el número de colonias iPSCs Nanog-GFP+. Esto sucede tanto en normoxia como en hipoxia. Sin embargo, al producirse un mayor número de colonias iPSCs en hipoxia, los MEFs-4F-Sh reducen su número de colonias hasta ser similares a los del control de normoxia. Con ello, demostramos que la expresión de Tfcp2l1 es necesaria para el incremento de eficiencia en la generación de iPSCs. Este efecto de shARNs contra Tfcp2l1 es similar al observado en MEFs durante el experimento 3T3 en normoxia e hipoxia. La expresión de Tfcp2l1, necesaria para la proliferación, incrementa la capacidad de reprogramación celular. Mediante el meta-análisis de datos generados por el laboratorio del Dr. Shinya Yamanaka, pudimos comprobar que la expresión de Tfcp2l1 y Nanog aumentaban en hipoxia al 5% y al 1% y que los CKIs, p16INK4a y p21Cip1, disminuían en estas condiciones, al igual que en nuestro experimento de extensión de vida proliferativa en hipoxia. Esto supone una evidencia indirecta del incremento de expresión de Tfcp2l1 en hipoxia en el contexto de la reprogramación, en el que es necesario evitar la senescencia, al igual que en el proceso de inmortalización. Obtuvimos evidencias adicionales de la expresión de Tfcp2l1 en reprogramación cuando analizamos su expresión en estadios intermedios del proceso de reprogramación. En estas muestras, la expresión de Tfcp2l1 aumentaba con el tiempo al igual que la expresión de Nanog, lo que revela su importancia en el establecimiento de la pluripotencia. Pudimos comparar también esta expresión con la de mESCs, en la que ambos genes tenían una expresión similar a la de iPSCs. Por eso, es posible que Tfcp2l1 sea relevante en el establecimiento y mantenimiento de la pluripotencia en iPSCs, al igual que en mESCs265,266, además de favorecer la proliferación. Del mismo modo que en el análisis anterior, comprobamos la disminución de expresión de p21Cip1 y p16INK4a durante la reprogramación, cuyos niveles finales coincidían con los de mESCs. De nuevo, los niveles de Tfcp2l1 coinciden con niveles bajos de los CKIs. No sucede lo mismo en este caso con la expresión de Tp53, que es mayor en iPSCs y en mESCs que en los estadios intermedios de la reprogramación y en células somáticas. Esto sugiere que la expresión de Tfcp2l1 no es incompatible con la expresión transcripcional de Tp53. En resumen, nuestro trabajo muestra cómo la hipoxia, a través de la activación transcripcional de Tfcp2l1, consigue aumentar la vida replicativa de MEFs. Esto se produce a través de la unión de Tfcp2l1 al ADN en regiones reguladoras de genes implicados en la proliferación como Sox2, Sox9 y Tgfa, que también incrementan su expresión en hipoxia. Algunos de estos genes están relacionados con las propiedades de células madre o son genes implicados en pluripotencia. De este modo, Tfcp2l1 también es responsable del aumento de eficiencia de la reprogramación celular en hipoxia. Los niveles de expresión de Tfcp2l1 están finamente regulados en la célula, ya que un incremento excesivo de estos provoca la entrada en senescencia de un modo similar a como se produce en OIS. Así, los niveles fisiológicos de Tfcp2l1 alcanzados en hipoxia son suficientes para promover la proliferación y la expresión de Discusión 99 genes relacionados con las propiedades de células madre sin suponer un estrés de hiperproliferación. Este incremento de la expresión es llevado a cabo, muy probablemente, por la unión de Hif1α a un enhancer cercano a Tfcp2l1 en el ADN. Todo esto supone que la activación de Tfcp2l1 por la hipoxia podría ser relevante en la inmortalización previa a la transformación maligna, facilitando la tumorigénesis. Además, en el microambiente tumoral, que es hipóxico, la expresión de Tfcp2l1 podría favorecer la aparición de CSCs al favorecer la pluripotencia y, por tanto, la desdiferenciación celular. CONCLUSIONES Conclusiones 103 1. La vida proliferativa de MEFs cultivados exclusivamente en hipoxia (3% O2) se prolonga de manera ilimitada, mientras que aquellos cultivados en normoxia (20% O2) entran en senescencia replicativa. 2. La hipoxia provoca la evasión de la senescencia en MEFs disminuyendo, en comparación con los MEFs de normoxia, la actividad β-galactosidasa ácida, la expresión de p21Cip1, p15INK4b y p16INK4a, y produciendo signos de estrés proliferativo con un aumento de p-H2AX (Ser139) y p-p53 (Ser15) que no conducen a la parada proliferativa vía p53. 3. La hipoxia promueve en MEFs la expresión de genes de desdiferenciación y genes relacionados con las propiedades de células madre entre los que destacan Tfcp2l1, Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf4, Klf2, cMyc y Bmi1. 4. La expresión ectópica a niveles suprafisiológicos o la reducción de los niveles de expresión de Tfcp2l1 provoca la entrada en senescencia de MEFs en cultivos en normoxia e hipoxia. 5. Sólo la expresión ectópica de Tfcp2l1 a niveles similares a los fisiológicos inducidos por la hipoxia logra un incremento de la vida proliferativa de MEFs en normoxia con variaciones en la expresión de genes semejantes a las provocadas por la hipoxia. 6. La activación constitutiva de Hif1α en normoxia induce, directa o indirectamente, la expresión de Tfcp2l1. 7. La hipoxia promueve la actividad de Tfcp2l1 como factor de transcripción, que se une a un mayor número de zonas del ADN asociadas a genes en MEFs inmortalizados en hipoxia en comparación con MEFs senescentes de normoxia. 8. En MEFs inmortalizados por la hipoxia, Tfcp2l1 se une a zonas del ADN asociadas a genes reguladores de la proliferación que, en muchos casos, también están relacionados con las propiedades de células madre y que se sobreexpresan en hipoxia, como son Sox2, Sox9 y Tgfa 9. La expresión de Tfcp2l1 aumenta la reprogramación celular y la disminución de su expresión mediante shARNs específicos reduce el incremento de eficiencia de reprogramación causado por la hipoxia. Bibliografía 111 1. He, S. & Sharpless, N. E. Senescence in Health and Disease. Cell 169, 1000–1011 (2017). 2. Lee, S. & Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nat. Cell Biol. 21, 94–101 (2019). 3. Herranz, N. & Gil, J. Mechanisms and functions of cellular senescence. J. Clin. Invest. 128, 1238–1246 (2018). 4. Hernandez-Segura, A., Nehme, J. & Demaria, M. Hallmarks of Cellular Senescence. Trends Cell Biol. 28, 436–453 (2018). 5. Chandeck, C. & Mooi, W. J. Oncogene-induced cellular senescence. Advances in Anatomic Pathology (2010) doi:10.1097/PAP.0b013e3181c66f4e. 6. Collado, M. & Serrano, M. Senescence in tumours: Evidence from mice and humans. Nat. Rev. Cancer 10, 51–57 (2010). 7. Rhinn, M., Ritschka, B. & Keyes, W. M. Cellular senescence in development, regeneration and disease. Dev. (2019) doi:10.1242/dev.151837. 8. van Deursen, J. M. Senolytic therapies for healthy longevity. Science (2019) doi:10.1126/science.aaw1299. 9. Malumbres, M. & Barbacid, M. To cycle or not to cycle: A critical decision in cancer. Nat. Rev. Cancer 1, 222–231 (2001). 10. Malumbres, M. & Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: A changing paradigm. Nat. Rev. Cancer 9, 153–166 (2009). 11. Sage, J., Miller, A. L., Pérez-Mancera, P. A., Wysocki, J. M. & Jacks, T. Acute mutation of retinoblastoma gene function is sufficient for cell cycle re-entry. Nature (2003) doi:10.1038/nature01764. 12. Beauséjour, C. M. et al. Reversal of human cellular senescence: Roles of the p53 and p16 pathways. EMBO J. (2003) doi:10.1093/emboj/cdg417. 13. Yu, Y. et al. Targeting the Senescence-Overriding Cooperative Activity of Structurally Unrelated H3K9 Demethylases in Melanoma. Cancer Cell (2018) doi:10.1016/j.ccell.2018.01.002. 14. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L. & Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapyinduced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Res. (2019) doi:10.1158/0008-5472.CAN-18-3437. 15. Ameri, K. & Maltepe, E. HIGD1A-mediated dormancy and tumor survival. Molecular and Cellular Oncology (2015) doi:10.1080/23723556.2015.1030537. Bibliografía 112 16. Axelson, H., Fredlund, E., Ovenberger, M., Landberg, G. & Påhlman, S. Hypoxiainduced dedifferentiation of tumor cells - A mechanism behind heterogeneity and aggressiveness of solid tumors. Seminars in Cell and Developmental Biology (2005) doi:10.1016/j.semcdb.2005.03.007. 17. Kobayashi, A. et al. Bone morphogenetic protein 7 in dormancy and metastasis of prostate cancer stem-like cells in bone. J. Exp. Med. (2011) doi:10.1084/jem.20110840. 18. Wang, N. et al. Mitotic quiescence, but not unique ‘stemness,’ marks the phenotype of bone metastasis-initiating cells in prostate cancer. FASEB J. (2015) doi:10.1096/fj.14- 266379. 19. Hofstetter, C. P. et al. Protein phosphatase 2A mediates dormancy of glioblastoma multiforme-derived tumor stem-like cells during hypoxia. PLoS One (2012) doi:10.1371/journal.pone.0030059. 20. Moll, U. M. & Zaika, A. Nuclear and mitochondrial apoptotic pathways of p53. FEBS Letters (2001) doi:10.1016/S0014-5793(01)02284-0. 21. Yosef, R. et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCLXL. Nat. Commun. (2016) doi:10.1038/ncomms11190. 22. Yosef, R. et al. p21 maintains senescent cell viability under persistent DNA damage response by restraining JNK and caspase signaling . EMBO J. (2017) doi:10.15252/embj.201695553. 23. Rodier, F. et al. DNA-SCARS: Distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J. Cell Sci. (2011) doi:10.1242/jcs.071340. 24. Carnero, A. Markers of cellular senescence. Methods Mol. Biol. (2013) doi:10.1007/978- 1-62703-239-1_4. 25. Campisi, J. & D’Adda Di Fagagna, F. Cellular senescence: When bad things happen to good cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 729–740 (2007). 26. Salama, R., Sadaie, M., Hoare, M. & Narita, M. Cellular senescence and its effector programs. Genes and Development (2014) doi:10.1101/gad.235184.113. 27. Chandra, T. et al. Independence of Repressive Histone Marks and Chromatin Compaction during Senescent Heterochromatic Layer Formation. Mol. Cell (2012) doi:10.1016/j.molcel.2012.06.010. 28. Swanson, E. C., Manning, B., Zhang, H. & Lawrence, J. B. Higher-order unfolding of satellite heterochromatin is a consistent and early event in cell senescence. J. Cell Biol. (2013) doi:10.1083/jcb.201306073. Bibliografía 113 29. Cheng, L. Q., Zhang, Z. Q., Chen, H. Z. & Liu, D. P. Epigenetic regulation in cell senescence. Journal of Molecular Medicine (2017) doi:10.1007/s00109-017-1581-x. 30. Koch, C. M. et al. Pluripotent stem cells escape from senescenceassociated DNA methylation changes. Genome Res. (2013) doi:10.1101/gr.141945.112. 31. Sakaki, M. et al. Potential roles of DNA methylation in the initiation and establishment of replicative senescence revealed by array-based methylome and transcriptome analyses. PLoS One (2017) doi:10.1371/journal.pone.0171431. 32. Bielak-Zmijewska, A. et al. A comparison of replicative senescence and doxorubicininduced premature senescence of vascular smooth muscle cells isolated from human aorta. Biogerontology (2014) doi:10.1007/s10522-013-9477-9. 33. Bannister, A. J. & Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research (2011) doi:10.1038/cr.2011.22. 34. Chen, H. et al. MacroH2A1 and ATM Play Opposing Roles in Paracrine Senescence and the Senescence-Associated Secretory Phenotype. Mol. Cell (2015) doi:10.1016/j.molcel.2015.07.011. 35. Ohanna, M. et al. Senescent cells develop a parp-1 and nuclear factor-κB-associated secretome (PNAS). Genes Dev. (2011) doi:10.1101/gad.625811. 36. Khursheed, M. et al. ARID1B, a member of the human SWI/SNF chromatin remodeling complex, exhibits tumour-suppressor activities in pancreatic cancer cell lines. Br. J. Cancer (2013) doi:10.1038/bjc.2013.200. 37. Tordella, L. et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. (2016) doi:10.1101/gad.286112.116. 38. Sarnowska, E. et al. The Role of SWI/SNF Chromatin Remodeling Complexes in Hormone Crosstalk. Trends in Plant Science (2016) doi:10.1016/j.tplants.2016.01.017. 39. Kwon, S. M., Hong, S. M., Lee, Y. K., Min, S. & Yoon, G. Metabolic features and regulation in cell senescence. BMB Rep. 52, 5–12 (2019). 40. Nacarelli, T. & Sell, C. Targeting metabolism in cellular senescence, a role for intervention. Mol. Cell. Endocrinol. (2017) doi:10.1016/j.mce.2016.08.049. 41. Birsoy, K. et al. An Essential Role of the Mitochondrial Electron Transport Chain in Cell Proliferation Is to Enable Aspartate Synthesis. Cell (2015) doi:10.1016/j.cell.2015.07.016. 42. Sullivan, L. B. et al. Supporting Aspartate Biosynthesis Is an Essential Function of Respiration in Proliferating Cells. Cell (2015) doi:10.1016/j.cell.2015.07.017. 43. Aird, K. M. & Zhang, R. Nucleotide metabolism, oncogene-induced senescence and Bibliografía 114 cancer. Cancer Letters (2015) doi:10.1016/j.canlet.2014.01.017. 44. Birch, J. & Passos, J. F. Targeting the SASP to combat ageing: Mitochondria as possible intracellular allies? BioEssays (2017) doi:10.1002/bies.201600235. 45. Gorgoulis, V. et al. Cellular Senescence: Defining a Path Forward. Cell 179, 813–827 (2019). 46. Kim, Y. M. et al. Sterol Regulatory Element-binding Protein (SREBP)-1-mediated lipogenesis is involved in cell senescence. J. Biol. Chem. (2010) doi:10.1074/jbc.M110.120386. 47. Stallone, G., Infante, B., Prisciandaro, C. & Grandaliano, G. MTOR and aging: An old fashioned dress. International Journal of Molecular Sciences (2019) doi:10.3390/ijms20112774. 48. Blagosklonny, M. V. Geroconversion: Irreversible step to cellular senescence. Cell Cycle (2014) doi:10.4161/15384101.2014.985507. 49. McHugh, D. & Gil, J. Senescence and aging: Causes, consequences, and therapeutic avenues. J. Cell Biol. 217, 65–77 (2018). 50. Acosta, J. C. et al. Chemokine Signaling via the CXCR2 Receptor Reinforces Senescence. Cell (2008) doi:10.1016/j.cell.2008.03.038. 51. Acosta, J. C. et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat. Cell Biol. (2013) doi:10.1038/ncb2784. 52. Kuilman, T. et al. Oncogene-Induced Senescence Relayed by an Interleukin-Dependent Inflammatory Network. Cell (2008) doi:10.1016/j.cell.2008.03.039. 53. Kang, T. W. et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature (2011) doi:10.1038/nature10599. 54. Coppe, J. P., Kauser, K., Campisi, J. & Beauséjour, C. M. Secretion of vascular endothelial growth factor by primary human fibroblasts at senescence. J. Biol. Chem. (2006) doi:10.1074/jbc.M603307200. 55. Di Mitri, D. et al. Tumour-infiltrating Gr-1 + myeloid cells antagonize senescence in cancer. Nature (2014) doi:10.1038/nature13638. 56. Eggert, T. et al. Distinct Functions of Senescence-Associated Immune Responses in Liver Tumor Surveillance and Tumor Progression. Cancer Cell (2016) doi:10.1016/j.ccell.2016.09.003. 57. Laberge, R. M. et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. Nat. Cell Biol. (2015) doi:10.1038/ncb3195. Bibliografía 115 58. Carroll, B. & Korolchuk, V. I. Dysregulation of mTORC1/autophagy axis in senescence. Aging (2017) doi:10.18632/aging.101277. 59. Narita, M. et al. Spatial coupling of mTOR and autophagy augments secretory phenotypes. Science (80-. ). (2011) doi:10.1126/science.1205407. 60. Dou, Z. et al. Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature (2015) doi:10.1038/nature15548. 61. Slobodnyuk, K. et al. Autophagy-induced senescence is regulated by p38α signaling. Cell Death Dis. (2019) doi:10.1038/s41419-019-1607-0. 62. Brusuker, I., Rhodes, J. M. & Goldman, R. β‐Galactosidase—An indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J. Cell. Physiol. (1982) doi:10.1002/jcp.1041120312. 63. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V. & Rafii, S. β-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol. Histopathol. (2007) doi:10.14670/HH-22.971. 64. Dimri, G. P. et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1995) doi:10.1073/pnas.92.20.9363. 65. Demaria, M. et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev. Cell (2014) doi:10.1016/j.devcel.2014.11.012. 66. Muñoz-Espín, D. et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell (2013) doi:10.1016/j.cell.2013.10.019. 67. Storer, M. et al. Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning. Cell (2013) doi:10.1016/j.cell.2013.10.041. 68. Chapman, J., Fielder, E. & Passos, J. F. Mitochondrial dysfunction and cell senescence: deciphering a complex relationship. FEBS Letters (2019) doi:10.1002/1873-3468.13498. 69. Dasari, A., Bartholomew, J. N., Volonte, D. & Galbiati, F. Oxidative stress induces premature senescence by stimulating caveolin-1 gene transcription through p38 mitogen-activated protein kinase/Sp1-mediated activation of two GC-rich promoter elements. Cancer Res. (2006) doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-1236. 70. Freund, A., Laberge, R. M., Demaria, M. & Campisi, J. Lamin B1 loss is a senescenceassociated biomarker. Mol. Biol. Cell (2012) doi:10.1091/mbc.E11-10-0884. 71. Wang, A. S., Ong, P. F., Chojnowski, A., Clavel, C. & Dreesen, O. Loss of lamin B1 is a biomarker to quantify cellular senescence in photoaged skin. Sci. Rep. (2017) doi:10.1038/s41598-017-15901-9. 72. Hayflick, L. & Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 25, 585–621 (1961). Bibliografía 116 73. de Magalhães, J. P. & Passos, J. F. Stress, cell senescence and organismal ageing. Mechanisms of Ageing and Development (2018) doi:10.1016/j.mad.2017.07.001. 74. Blasco, M. A. Telomeres and human disease: Ageing, cancer and beyond. Nat. Rev. Genet. 6, 611–622 (2005). 75. Martínez, P. & Blasco, M. A. Telomere-driven diseases and telomere-targeting therapies. 216, 875–887 (2017). 76. Olovnikov, A. M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. J. Theor. Biol. (1973) doi:10.1016/0022-5193(73)90198-7. 77. Harley, C. B., Futcher, A. B. & Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature (1990) doi:10.1038/345458a0. 78. Greider, C. W. & Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in tetrahymena extracts. Cell (1985) doi:10.1016/0092- 8674(85)90170-9. 79. Bodnar, A. G. et al. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science (80-. ). (1998) doi:10.1126/science.279.5349.349. 80. Blasco, M. A. et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell (1997) doi:10.1016/S0092-8674(01)80006-4. 81. Rudolph, K. L. et al. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerasedeficient mice. Cell (1999) doi:10.1016/S0092-8674(00)80580-2. 82. Jaskelioff, M. et al. Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice. Nature (2011) doi:10.1038/nature09603. 83. Campisi, J. Aging, Cellular Senescence, and Cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685–705 (2013). 84. Itahana, K., Campisi, J. & Dimri, G. P. Mechanisms of cellular senescence in human and mouse cells. Biogerontology 5, 1–10 (2004). 85. Calado, R. T. & Dumitriu, B. Telomere dynamics in mice and humans. Semin. Hematol. (2013) doi:10.1053/j.seminhematol.2013.03.030. 86. Sharpless, N. E. & Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer (2015) doi:10.1038/nrc3960. 87. Rodier, F. & Campisi, J. Four faces of cellular senescence. J. Cell Biol. 192, 547–556 (2011). 88. Calcinotto, A. et al. Cellular senescence: Aging, cancer, and injury. Physiol. Rev. 99, Bibliografía 117 1047–1078 (2019). 89. D’Adda Di Fagagna, F. Living on a break: Cellular senescence as a DNA-damage response. Nat. Rev. Cancer 8, 512–522 (2008). 90. Zhang, Y., Xiong, Y. & Yarbrough, W. G. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppression pathways. Cell (1998) doi:10.1016/S0092-8674(00)81401-4. 91. Rufini, A., Tucci, P., Celardo, I. & Melino, G. Senescence and aging: The critical roles of p53. Oncogene (2013) doi:10.1038/onc.2012.640. 92. Pantoja, C. & Serrano, M. Murine fibroblasts lacking p21 undergo senescence and are resistant to transformation by oncogenic Ras. Oncogene (1999) doi:10.1038/sj.onc.1202880. 93. Martín-Caballero, J., Serrano, M., Flores, J. M. & García-Palencia, P. Tumor susceptibility of p21waf1/cip1-deficient mice. Cancer Res. (2001). 94. Quereda, V., Porlan, E., Canãmero, M., Dubus, P. & Malumbres, M. An essential role for Ink4 and Cip/Kip cell-cycle inhibitors in preventing replicative stress. Cell Death Differ. 23, 430–441 (2016). 95. Kim, W. Y. & Sharpless, N. E. The Regulation of INK4/ARF in Cancer and Aging. Cell 127, 265–275 (2006). 96. Classon, M. & Harlow, E. The retinoblastoma tumour suppressor in development and cancer. Nature Reviews Cancer (2002) doi:10.1038/nrc950. 97. Beroukhim, R. et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature (2010) doi:10.1038/nature08822. 98. Esteller, M., Corn, P. G., Baylin, S. B. & Herman, J. G. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res. (2001). 99. LaPak, K. M. & Burd, C. E. The molecular balancing act of p16ink4a in cancer and aging. Molecular Cancer Research (2014) doi:10.1158/1541-7786.MCR-13-0350. 100. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D. & Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16(INK4a). Cell (1997) doi:10.1016/S0092-8674(00)81902-9. 101. Lin, A. W. et al. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. (1998) doi:10.1101/gad.12.19.3008. 102. Di Micco, R. et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature (2006) doi:10.1038/nature05327. Bibliografía 118 103. Bartkova, J. et al. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature (2006) doi:10.1038/nature05268. 104. Halazonetis, T. D., Gorgoulis, V. G. & Bartek, J. An oncogene-induced DNA damage model for cancer development. Science (2008) doi:10.1126/science.1140735. 105. Macheret, M. & Halazonetis, T. D. Intragenic origins due to short G1 phases underlie oncogene-induced DNA replication stress. Nature (2018) doi:10.1038/nature25507. 106. Michaloglou, C. et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature (2005) doi:10.1038/nature03890. 107. Gray-Schopfer, V. C. et al. Cellular senescence in naevi and immortalisation in melanoma: A role for p16? Br. J. Cancer (2006) doi:10.1038/sj.bjc.6603283. 108. Dankort, D. et al. BrafV600E cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nat. Genet. (2009) doi:10.1038/ng.356. 109. Dhomen, N. et al. Oncogenic Braf Induces Melanocyte Senescence and Melanoma in Mice. Cancer Cell (2009) doi:10.1016/j.ccr.2009.02.022. 110. Collado, M. et al. Senescence in premalignant tumours. Nature (2005) doi:10.1038/436642a. 111. Chen, Z. et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Ptendeficient tumorigenesis. Nature (2005) doi:10.1038/nature03918. 112. Braig, M. et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature (2005) doi:10.1038/nature03841. 113. Denchi, E. L., Attwooll, C., Pasini, D. & Helin, K. Deregulated E2F Activity Induces Hyperplasia and Senescence-Like Features in the Mouse Pituitary Gland. Mol. Cell. Biol. (2005) doi:10.1128/mcb.25.7.2660-2672.2005. 114. Mooi, W. J. Oncogene-induced cellular senescence: Causal factor in the growth arrest of pituitary microadenomas? in Hormone Research (2009). doi:10.1159/000192442. 115. HARMAN, D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol. (1956) doi:10.1093/geronj/11.3.298. 116. Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology (2015) doi:10.1016/j.redox.2015.01.002. 117. Höhn, A. et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biol. 11, 482–501 (2017). 118. Cadet, J. & Richard Wagner, J. DNA base damage by reactive oxygen species, oxidizing agents, and UV radiation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. (2013) Bibliografía 119 doi:10.1101/cshperspect.a012559. 119. Von Zglinicki, T. Oxidative stress shortens telomeres. Trends in Biochemical Sciences (2002) doi:10.1016/S0968-0004(02)02110-2. 120. Passos, J. F. et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Mol. Syst. Biol. (2010) doi:10.1038/msb.2010.5. 121. Höhn, A., Jung, T. & Grune, T. Pathophysiological importance of aggregated damaged proteins. Free Radical Biology and Medicine (2014) doi:10.1016/j.freeradbiomed.2014.02.028. 122. Zhang, Y. G. et al. Featured Article: Accelerated decline of physical strength in peroxiredoxin-3 knockout mice. Exp. Biol. Med. (2016) doi:10.1177/1535370216642039. 123. Nyström, T., Yang, J. & Molin, M. Peroxiredoxins, gerontogenes linking aging to genome instability and cancer. Genes and Development (2012) doi:10.1101/gad.200006.112. 124. Picot, C. R., Perichon, M., Cintrat, J. C., Friguet, B. & Petropoulos, I. The peptide methionine sulfoxide reductases, MsrA and MsrB (hCBS-1), are downregulated during replicative senescence of human WI-38 fibroblasts. FEBS Lett. (2004) doi:10.1016/S0014-5793(03)01530-8. 125. Liao, N. et al. Antioxidants inhibit cell senescence and preserve stemness of adipose tissue-derived stem cells by reducing ROS generation during long-term in vitro expansion. Stem Cell Res. Ther. (2019) doi:10.1186/s13287-019-1404-9. 126. Kornienko, J. S. et al. High doses of synthetic antioxidants induce premature senescence in cultivated mesenchymal stem cells. Sci. Rep. (2019) doi:10.1038/s41598- 018-37972-y. 127. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M. & Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell 153, 1194 (2013). 128. Van Remmen, H. et al. Life-long reduction in MnSOD activity results in increased DNA damage and higher incidence of cancer but does not accelerate aging. Physiol. Genomics (2004) doi:10.1152/physiolgenomics.00122.2003. 129. Pérez, V. I. et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell (2009) doi:10.1111/j.1474-9726.2008.00449.x. 130. Hekimi, S., Lapointe, J. & Wen, Y. Taking a ‘good’ look at free radicals in the aging process. Trends in Cell Biology (2011) doi:10.1016/j.tcb.2011.06.008. 131. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A. & Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences (2020) doi:10.1007/s00018-019-03261-8. Bibliografía 126 220. Conley, S. J. et al. Antiangiogenic agents increase breast cancer stem cells via the generation of tumor hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2012) doi:10.1073/pnas.1018866109. 221. Iriondo, O. et al. Distinct breast cancer stem/progenitor cell populations require either HIF1α or loss of PHD3 to expand under hypoxic conditions. Oncotarget (2015) doi:10.18632/oncotarget.5564. 222. Bhagat, M. et al. HIF-2α mediates a marked increase in migration and stemness characteristics in a subset of glioma cells under hypoxia by activating an Oct-4/Sox-2- Mena (INV) axis. Int. J. Biochem. Cell Biol. (2016) doi:10.1016/j.biocel.2016.02.017. 223. Johansson, E. et al. CD44 Interacts with HIF-2α to Modulate the Hypoxic Phenotype of Perinecrotic and Perivascular Glioma Cells. Cell Rep. (2017) doi:10.1016/j.celrep.2017.07.049. 224. Das, B. et al. MYC Regulates the HIF2a Stemness Pathway via Nanog and Sox2 to Maintain Self-Renewal in Cancer Stem Cells versus Non-Stem Cancer Cells. Cancer Res. (2019) doi:10.1158/0008-5472.CAN-18-2847. 225. Wu, L. et al. HIF-2α mediates hypoxia-induced LIF expression in human colorectal cancer cells. Oncotarget (2015) doi:10.18632/oncotarget.3017. 226. Derynck, R. & Weinberg, R. A. EMT and Cancer: More Than Meets the Eye. Developmental Cell (2019) doi:10.1016/j.devcel.2019.04.026. 227. Krishnamachary, B. et al. Hypoxia-inducible factor-1-dependent repression of E-cadherin in von Hippel-Lindau tumor suppressor-null renal cell carcinoma mediated by TCF3, ZFHX1A, and ZFHX1B. Cancer Res. (2006) doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3719. 228. Moreno-Bueno, G., Portillo, F. & Cano, A. Transcriptional regulation of cell polarity in EMT and cancer. Oncogene (2008) doi:10.1038/onc.2008.346. 229. Hugo, H. J. et al. Direct repression of MYB by ZEB1 suppresses proliferation and epithelial gene expression during epithelial-to-mesenchymal transition of breast cancer cells. Breast Cancer Res. (2013) doi:10.1186/bcr3580. 230. Wang, T. et al. Hypoxia-inducible factors and RAB22A mediate formation of microvesicles that stimulate breast cancer invasion and metastasis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2014) doi:10.1073/pnas.1410041111. 231. King, H. W., Michael, M. Z. & Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer (2012) doi:10.1186/1471-2407-12-421. 232. Easwaran, H., Tsai, H. C. & Baylin, S. B. Cancer Epigenetics: Tumor Heterogeneity, Plasticity of Stem-like States, and Drug Resistance. Molecular Cell (2014) doi:10.1016/j.molcel.2014.05.015. Bibliografía 127 233. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science (80-. ). (1956) doi:10.1126/science.123.3191.309. 234. Kim, J. W., Tchernyshyov, I., Semenza, G. L. & Dang, C. V. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: A metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab. (2006) doi:10.1016/j.cmet.2006.02.002. 235. Chen, C., Pore, N., Behrooz, A., Ismail-Beigi, F. & Maity, A. Regulation of glut1 mRNA by hypoxia-inducible factor-1: Interaction between H-ras and hypoxia. J. Biol. Chem. (2001) doi:10.1074/jbc.M010144200. 236. Mimura, I. et al. Dynamic Change of Chromatin Conformation in Response to Hypoxia Enhances the Expression of GLUT3 (SLC2A3) by Cooperative Interaction of Hypoxia- Inducible Factor 1 and KDM3A. Mol. Cell. Biol. (2012) doi:10.1128/mcb.06643-11. 237. Shibuya, K. et al. Targeting the facilitative glucose transporter GLUT1 inhibits the selfrenewal and tumor-initiating capacity of cancer stem cells. Oncotarget (2015) doi:10.18632/oncotarget.2892. 238. Tahiliani, M. et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science (80-. ). (2009) doi:10.1126/science.1170116. 239. Wu, M. Z. et al. Interplay between HDAC3 and WDR5 Is Essential for Hypoxia-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition. Mol. Cell (2011) doi:10.1016/j.molcel.2011.07.012. 240. Kulshreshtha, R. et al. A MicroRNA Signature of Hypoxia. Mol. Cell. Biol. (2007) doi:10.1128/mcb.01395-06. 241. Han, M. et al. Antagonism of miR-21 reverses epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell phenotype through AKT/ERK1/2 inactivation by targeting PTEN. PLoS One (2012) doi:10.1371/journal.pone.0039520. 242. Ferraro, A. et al. Epigenetic regulation of miR-21 in colorectal cancer: ITGB4 as a novel miR-21 target and a three-gene network (miR-21-ITGB44-PCDC4) as predictor of metastatic tumor potential. Epigenetics (2014) doi:10.4161/epi.26842. 243. Van Den Beucken, T. et al. Hypoxia promotes stem cell phenotypes and poor prognosis through epigenetic regulation of DICER. Nat. Commun. (2014) doi:10.1038/ncomms6203. 244. Zhang, C. et al. Hypoxia-inducible factors regulate pluripotency factor expression by ZNF217-and ALKBH5-mediated modulation of RNA methylation in breast cancer cells. Oncotarget (2016) doi:10.18632/oncotarget.11743. 245. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C. & Bock, C. ChIPmentation: Fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat. Methods (2015) Bibliografía 128 doi:10.1038/nmeth.3542. 246. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y. & Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods (2013) doi:10.1038/nmeth.2688. 247. Langmead, B. & Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 : Nature Methods : Nature Publishing Group. Nat Meth (2012). 248. Li, H. et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics (2009) doi:10.1093/bioinformatics/btp352. 249. Quinlan, A. R. & Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics (2010) doi:10.1093/bioinformatics/btq033. 250. Ramírez, F. et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. (2016) doi:10.1093/nar/gkw257. 251. Zhang, Y. et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. (2008) doi:10.1186/gb-2008-9-9-r137. 252. Benner, C., Heinz, S. & Glass, C. K. HOMER - Software for motif discovery and next generation sequencing analysis. Http://Homer.Ucsd.Edu/ (2017). 253. Hiller, M. et al. Computational methods to detect conserved non-genic elements in phylogenetically isolated genomes: Application to zebrafish. Nucleic Acids Res. (2013) doi:10.1093/nar/gkt557. 254. Chen, E. Y. et al. Enrichr: Interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool. BMC Bioinformatics (2013) doi:10.1186/1471-2105-14-128. 255. Kuleshov, M. V. et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. (2016) doi:10.1093/nar/gkw377. 256. Ashburner, M. et al. Gene ontology: Tool for the unification of biology. Nature Genetics (2000) doi:10.1038/75556. 257. The Gene Ontology, C. et al. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Res. (2019) doi:10.17863/CAM.36439. 258. Yan, J. et al. Histone H3 lysine 4 monomethylation modulates long-range chromatin interactions at enhancers. Cell Res. (2018) doi:10.1038/cr.2018.1. 259. Yue, F. et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature (2014) doi:10.1038/nature13992. 260. Calo, E. & Wysocka, J. Modification of Enhancer Chromatin: What, How, and Why? Bibliografía 129 Molecular Cell (2013) doi:10.1016/j.molcel.2013.01.038. 261. Fornes, O. et al. JASPAR 2020: Update of the open-Access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. (2020) doi:10.1093/nar/gkz1001. 262. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y. & Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell (1997) doi:10.1016/S0092-8674(00)80416-X. 263. Tibbetts, R. S. et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. (1999) doi:10.1101/gad.13.2.152. 264. Olcina, M., Lecane, P. S. & Hammond, E. M. Targeting hypoxic cells through the DNA damage response. Clinical Cancer Research (2010) doi:10.1158/1078-0432.CCR-10- 0286. 265. Martello, G., Bertone, P. & Smith, A. Identification of the missing pluripotency mediator downstream of leukaemia inhibitory factor. EMBO J. (2013) doi:10.1038/emboj.2013.177. 266. Ye, S., Li, P., Tong, C. & Ying, Q. L. Embryonic stem cell self-renewal pathways converge on the transcription factor Tfcp2l1. EMBO J. (2013) doi:10.1038/emboj.2013.175. 267. Werth, M. et al. Transcription factor TFCP2l1 patterns cells in the mouse kidney collecting ducts. Elife (2017) doi:10.7554/eLife.24265. 268. Hu, C. J., Sataur, A., Wang, L., Chen, H. & Simon, M. C. The N-terminal transactivation domain confers target gene specificity of hypoxia-inducible factors HIF-1α and HIF-2α. Mol. Biol. Cell (2007) doi:10.1091/mbc.E06-05-0419. 269. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A. & Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J. Biol. Chem. (2001) doi:10.1074/jbc.C100466200. 270. Wrann, S., Kaufmann, M. R., Wirthner, R., Stiehl, D. P. & Wenger, R. H. HIF mediated and DNA damage independent histone H2AX phosphorylation in chronic hypoxia. Biol. Chem. (2013) doi:10.1515/hsz-2012-0311. 271. Rezaeian, A. H. et al. A hypoxia-responsive TRAF6-ATM-H2AX signalling axis promotes HIF1α activation, tumorigenesis and metastasis. Nat. Cell Biol. (2017) doi:10.1038/ncb3445. 272. Tafani, M. et al. The Interplay of Reactive Oxygen Species, Hypoxia, Inflammation, and Sirtuins in Cancer Initiation and Progression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity (2016) doi:10.1155/2016/3907147. 273. Chang, Y. T. et al. REST is a crucial regulator for acquiring EMT-like and stemness Bibliografía 130 phenotypes in hormone-refractory prostate cancer. Sci. Rep. (2017) doi:10.1038/srep42795. 274. Gao, Z., Ding, P. & Hsieh, J. Profiling of REST-dependent micrornas reveals dynamic modes of expression. Front. Neurosci. (2012) doi:10.3389/fnins.2012.00067. 275. Ivanova, N. et al. Dissecting self-renewal in stem cells with RNA interference. Nature (2006) doi:10.1038/nature04915. 276. Chen, X. et al. Integration of External Signaling Pathways with the Core Transcriptional Network in Embryonic Stem Cells. Cell (2008) doi:10.1016/j.cell.2008.04.043. 277. Sardina, J. L. et al. Transcription Factors Drive Tet2-Mediated Enhancer Demethylation to Reprogram Cell Fate. Cell Stem Cell (2018) doi:10.1016/j.stem.2018.08.016. 278. Wang, X. et al. the transcription factor TFCP2L1 induces expression of distinct target genes and promotes self-renewal of mouse and human embryonic stem cells. J. Biol. Chem. (2019) doi:10.1074/jbc.RA118.006341. 279. Dean, R., Kim, S. S. & Delgado, D. Expression of c-myc oncogene in human fibroblasts during in vitro senescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1986) doi:10.1016/0006- 291X(86)90948-4. 280. Chappell, J. & Dalton, S. Roles for MYC in the establishment and maintenance of pluripotency. Cold Spring Harb. Perspect. Med. (2013) doi:10.1101/cshperspect.a014381. 281. Qiu, D. et al. Klf2 and Tfcp2l1, Two Wnt/β-Catenin Targets, Act Synergistically to Induce and Maintain Naive Pluripotency. Stem Cell Reports (2015) doi:10.1016/j.stemcr.2015.07.014. 282. Jo, A. et al. The versatile functions of Sox9 in development, stem cells, and human diseases. Genes and Diseases (2014) doi:10.1016/j.gendis.2014.09.004. 283. Siddique, H. R. & Saleem, M. Concise review: Role of BMI1, a stem cell factor, in cancer recurrence and chemoresistance: Preclinical and clinical evidences. Stem Cells (2012) doi:10.1002/stem.1035. 284. Aldaz, P. et al. SOX9 promotes tumor progression through the axis BMI1-p21CIP. Sci. Rep. (2020) doi:10.1038/s41598-019-57047-w. 285. Herreros-Villanueva, M. et al. SOX2 promotes dedifferentiation and imparts stem cell-like features to pancreatic cancer cells. Oncogenesis (2013) doi:10.1038/oncsis.2013.23. 286. Lee, J., Go, Y., Kang, I., Han, Y. M. & Kim, J. Oct-4 controls cell-cycle progression of embryonic stem cells. Biochem. J. (2010) doi:10.1042/BJ20091439. 287. Lu, Y. et al. OCT4 maintains self-renewal and reverses senescence in human hair follicle Bibliografía 131 mesenchymal stem cells through the downregulation of p21 by DNA methyltransferases. Stem Cell Res. Ther. (2019) doi:10.1186/s13287-018-1120-x. 288. Takemoto, T. et al. Tbx6-dependent Sox2 regulation determines neural or mesodermal fate in axial stem cells. Nature (2011) doi:10.1038/nature09729. 289. Liu, C. F. & Lefebvre, V. The transcription factors SOX9 and SOX5/SOX6 cooperate genome-wide through super-enhancers to drive chondrogenesis. Nucleic Acids Res. (2015) doi:10.1093/nar/gkv688. 290. Hsuan, J. J. Transforming Growth Factor (TGF) Alpha. in Encyclopedia of Endocrine Diseases (2004). doi:10.1016/b0-12-475570-4/01317-2. ANEXO: CONTRIBUCIONES CIENTÍFICAS DURANTE LA ETAPA DE DOCTORADO Anexo 135 PUBLICACIONES 1. Muñoz-Galván S; Felipe-Abrio B; García-Carrasco M; Domínguez-Piñol J; Suarez- Martinez E; Verdugo-Sivianes EM; Espinosa-Sánchez A; Navas LE; Otero-Albiol D; Marin JJ; Jiménez-García MP; García-Heredia JM; Quiroga AG; Estevez-Garcia P; Carnero A. New markers for human ovarian cancer that link platinum resistance to the cancer stem cell phenotype and define new therapeutic combinations and diagnostic tools. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 38 - 234, pp. 1 - 14. BMC. 03/06/2019. ISSN 1756-9966 2. Munoz-Galvan, S; Lucena-Cacace, A; Perez, M; Otero-Albiol, D; Gomez-Cambronero, J; Carnero, A. Tumor cell-secreted PLD increases tumor stemness by communication with microenvironment. Oncogene. 38, pp. 1309 - 1323. Nature. 10/10/2018. ISSN 0950- 9232 3. Lucena-Cacaece, A; Otero-Albiol, D; Jiménez-García, MP; Muñoz-Galvan, S; Carnero, A. NAMPT is a Potent Oncogene in Colon Cancer Progression that Modulates Cancer Stem Cell Properties and resistance to therapy through Sirt1 and PARP. Clinical Cancer Research. 24 - 5, pp. 1 - 15. American Association for Cancer Research Journals. 01/03/2018. ISSN 1078-0432 4. Lucena-Cacaece, A; Otero-Albiol, D; Jiménez-García, MP; Peinado-Serrano, J; Carnero, A. NAMPT overexpression induces pluripotency and defines a novel tumor signature for glioma prognosis. Oncotarget. 8 - 59, pp. 99514 - 99530. Impact Journals. 21/11/2017. ISSN 1949-2553 5. Otero-Albiol D; Felipe-Abrio B. MicroRNA regulating metabolic reprogramming in tumor cells: New tumor markers. Cancer Translational Medicine. 2 - 6, pp. 175 - 181. Wolters Kluwer. 15/11/2016. ISSN 2395-3977 6. Lopez-Guerra JL; Verdugo-Sivianes EM; Otero-Albiol D; Vieites B; Ortiz-Gordillo MJ; De León JM; Praena-Fernandez JM; Marin JJ; Carnero A. High casein kinase 1 epsilon levels are correlated with better prognosis in subsets of patients with breast cancer. Oncotarget. 6 - 30, pp. 30343 - 30356. Impact Journal. 06/10/2015. ISSN 1949-2553 CONTRIBUCIONES A CONGRESOS 1. 25th Biennial Congress of the European Association for Cancer Research (EACR). Amsterdam (Holanda). 30/06/2018 - 03/07/2018. Póster 1: Otero-Albiol D, Munoz-Galvan S, Suarez-Martínez E, Verdugo-Sivianes EM, Jiménez-García MP, Navas L, Perez M, García-Heredia JM, Peinado-Serrano J, Carnero A. (2018). Hypoxia-induced PLD2 promotes tumorigenesis and stem cell-like properties in tumor cells. Póster 2: Verdugo-Sivianes EM, Felipe-Abrio B, Otero-Albiol D, Jiménez-García MP, Navas L, Peinado-Serrano J, Munoz-Galván S, Perez M, García-Heredia JM, Carnero A. (2018). Prognostic relevance of PP1 in breast cancer.