Análisis de proteínas relacionadas con estrés oxidativo en saliva y suero de enfermos de Parkinson idiopático

1 Universidad de Sevilla TESIS DOCTORAL Análisis de proteínas relacionadas con estrés oxidativo en saliva y suero de enfermos de Parkinson idiopático presentada por FÁTIMA DAMAS HERMOSO para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2021 2 3 4 5 D. Emilio Fernández Espejo, doctor en Medicina y Cirugía, catedrático jubilado de Fisiología y Académico de la Real Academia de Medicina de Cataluña CERTIFICA: Que Doña Fátima Damas Hermoso, licenciada en Medicina y Cirugía y especialista en Neurología, ha realizado bajo su dirección hasta octubre de 2019, el trabajo de investigación titulado Análisis de proteínas relacionadas con estrés oxidativo en saliva y suero de enfermos de Parkinson idiopático y que reúne todas las condiciones necesarias para ser valorado por la Comisión Académica correspondiente y presentado a Tesis Doctoral. Y para que conste y surta los efectos oportunos, se firma en Sevilla a 9 de Junio de 2021. 6 7 D. Luis Castilla Guerra, profesor asociado adscrito al Departamento de Medicina de la Universidad de Sevilla, CERTIFICA: Que Doña Fátima Damas Hermoso, licenciada en Medicina y Cirugía y especialista en Neurología, ha realizado bajo su dirección el trabajo de investigación titulado Análisis de proteínas relacionadas con estrés oxidativo en saliva y suero de enfermos de Parkinson idiopático y que reúne todas las condiciones necesarias para ser valorado por la Comisión Académica correspondiente y presentado a Tesis Doctoral. Y para que conste y surta los efectos oportunos, se firma en Sevilla a 9 de Junio de 2021. Luis Castilla Guerra Director y Tutor de la Tesis Doctoral 8 9 Doña Fátima Damas Hermoso, licenciada en Medicina y Cirugía por la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada, facultativo especialista en Neurología, HACE CONSTAR: Que ha realizado la Tesis doctoral denominada Análisis de proteínas relacionadas con estrés oxidativo en saliva y suero de enfermos de Parkinson idiopático, bajo la dirección de los profesores Emilio Fernández Espejo, investigador honorario y catedrático jubilado de Fisiología y Académico de la Real Academia de Medicina de Cataluña, y Luis Castilla Guerra, profesor asociado de Medicina, ambos de la Universidad de Sevilla. Y para que conste y surta los efectos oportunos, se firma en Sevilla a 9 de Junio de 2021. Fdo.: Fátima Damas Hermoso Autora de la tesis doctoral 16 Índice de tablas Tabla 1. Formas de EP monogénicas (modificado de Kalinderi et al. Actualización 2017) …………………………………………………….…………………………………………………………………………..33 Tabla 2. Principales haloperoxidasas, localizaciones corporales y principales haluros y seudohaluros que oxidan……………………………………………………………………………………………53 Tabla 3. Principales derivados halogenados que participan en la neurodegeneración ……………………………..……………………………………………………………………………………………………54 Tabla 4. Causas de Sindrome rigido-acinético….………………………………………………......……67 Tabla 5. Hallazgos caracteristicos en RM cerebral en EP y parkinsonismos atípicos …………………….…………………………………………………………………………………………….………………68 Tabla 6. Hallazgos sonográficos en el diagnóstico diferencial de los parkinsonismos degenerativos…………………………………………………………………………………………………………….69 Tabla 7. Patrones en la neuroimagen funcional (SPECT o PET) de los principales parkinsonismos degenerativos……………………………………………………………………..……………71 Tabla 8. Complicaciones motoras asociadas al tratamiento con levodopa…………………..73 Tabla 9. Fármacos disponibles para la EP…………………………………..…………….………………….75 Tabla 10. Parámetros clínicos en pacientes con EP y controles Media ± DEM .………….91 Tabla 11. Contenido y ratio saliva/suero de DEHAL1 en suero y saliva en pacientes con EPiy sujetos control ………………………………………………………………………..………………………….92 Tabla 12. Parámetros clínicos en pacientes con EP y controles…………………………………….96 Tabla 13. Contenido y relaciones saliva / suero de αSyn en suero y saliva en pacientes con EPi y sujetos control…………………………..…………………………………….…………………………..97 Tabla 14. Parámetros clínicos en pacientes con EP y controles…………………………………102 Tabla 15. Contenido, relación saliva/suero de melanina, Tyr y LPO en suero y saliva en pacientes con EPi y sujetos de control ………………………………………………………………………103 17 Índice de figuras Figura 1. α-sinucleína………………………………………………………………………………………………….36 Figura 2. Cuerpo de Lewy………………………………………………………….…….……………….…………37 Figua 3. Esquema de los Ganglios basales…………………………………….………………..……………39 Figura 4. Esquema de la vía indirecta dopaminérgica……………………………………….…………41 Figura 5. Esquema de la vía directa dopaminérgica………………………………………….…………42 Figura 6. Fisiopatología de los ganglios basales en condiciones normales y en el parkinsonismo……………………………………………………………………………………………………………43 Figura 7. Vías de la homeostasis redox del anión superóxido y el peróxido de hidrógeno que conducen a la formación final de agua……………………........…………………………….………45 Figura 8. Vías alternativas que se activan después del fallo de H2O2…………..................47 Figura 9. Vía de síntesis de dopamina en neurona dopaminérgica……………….………………49 Figura 10. Vía de producción de la melanina…………………………………………..………….………50 Figura 11. Esquema de la posible historia natural clínica y patológica de la EPi………………………………………………………………………………………………………………………………59 Figura 12. Concentración individual de la enzima DEHAL1 en (A) suero y (B) saliva en pacientes con EP y controles….……………………………………………………………………..…………. 93 Figura 13. Correlaciones entre la enzima DEHAL1 en saliva con las escalas de (A) Hoehn- Yahr y (B) UPDRS parte III o motora, en pacientes con EPi…………………………………………………………………………………………………….…………………….…94 Figura 14. Niveles en saliva de DEHAL1 (ng/ml) en sujetos con EP temprana, avanzada o controles……………………………………………………………………………………………………………….. 95 Figura 15. Concentración individual de αSyn en (A) suero y (B) saliva en pacientes con EPi y sujetos de control…….………………………….…………………………………………….………….….. 98 Figura 16. Correlaciones entre la αSyn salival y (A) UPDRS total y (B) UPDRS motor o parte III, en pacientes con EPi…………………………….…………………………...…………….……………99 Figura 17. Contenido individual de αSyn en saliva en pacientes con EPi con o sin síntomas no motores ………………………………………………………………………………………….……….…………100 18 Figura 18. Análisis de inmunotransferencia de (A) proteína αSyn salival y (B) proteína 3- NT-αSyn salival…..………….……………………………………………………….……………...………………101 Figura 19. (A) Contenido individual de melanina (pg/ml) en suero en pacientes con EPi y controles. (B) Contenido individual de hTyr (ng/ml) en suero en pacientes y controles. (C) Contenido individual de LPO (ng/ml) en suero en pacientes con EPi y controles……………………………………………………………………………………………..…………..…..…104 Figura 20. (A) Contenido de melanina individual (pg/ml) en saliva en pacientes EPi y controles. (B) Contenido individual de hTyr (ng/ml) en saliva en pacientes y controles. (C) Contenido individual de LPO (ng/ml) en saliva en pacientes con EPi y controles …………………………………………………………………….…………………………..…………..……...…………105 Figura 21. Correlaciones entre (A) Tyr y duración de la EP, y (B) melanina salival y duración de la EPi en años…………………..……………………………………………………………………106 19 Relación de Siglas y Acrónimos  AD: Agonistas de la Dopamina  ADo: Autosómica Dominante  AINES: Antiinflamatorios No Esteroideos  AMS: Atrofia Multisistema  AMPc: Adenosín Mono-Fosfato Cíclico  AOPP: Productos Proteicos con Oxidación Avanzada  αSyn: α-sinucleína  AR: Autosómica Recesiva  ATP13A2: ATPase cation transporting 13A2  AVD: Actividades de la Vida Diaria  Br -: Bromuro  CAT: Enzimas catalasas  CL: Cuerpos de Lewy  Cl-: Cloruro  COX: Ciclooxigenasas  Cu II: Oxido de Cobre  DA: Dopamina  DAT: Transportadores de Dopamina Activos  DAT-SPECT: Tomografía Computarizada de Emisión de Fotón Único para el Transportador de Dopamina  DaTSCAN: SPECT con Radioligando 123I-Ioflupano  DCB: Degeneración Cortico Basal  DCL: Demencia por Cuerpos de Lewy  DEHAL: Deshalogenasas  DEHAL1: Deshalogenasa tipo 1  DNAJC6: DnaJ Heat Shock Protein Family  DNAJC13: DnaJ Heat Shock Protein Family (Hsp40) Member C13  DEM: Desviación Media Estándar 20  DJ1: Deglycase  DOPA: Dihidroxifenilalanina  DOPAC: Ácido 3,4-dihidroxifenilacético  ECP: Estimulación Cerebral Profunda  EIFG4G1: Eukaryotic Translation Initiation Factor 4 Gamma 1  ELISA: Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay  Enk: Encefainas  EP: Enfermedad Parkinson  EPi: Parkinson Idiopática  EPO: Eosinófilo-peroxidasa  ERO: Especies Reactivas de Oxígeno  ERN: Especies Reactivas de Nitrógeno  Fe III: Óxido férrico  FBXO7: F-Box protein 7  Glu: Glutamato  GPe: Núcleo Pálido Externo  GPi: Globo Pálido Interno  GPx: Glutation-Peroxidasa  GR: Glutation Reductasa  GSH: Glutation Reducido  GSSG: Glutation Oxidado  GST: Glutation-S-Transferasa  HalPO: Haloperoxidasas  HSA: Albúmina Sérica Humana  HOBr: Hipobromoso  HOHal: Ácidos Hipohalosos  H2O2: Agua Oxigenada o peróxido de hidrógeno  HOCl: Ácido Hipocloroso  HOI: Hipoyodoso  HOF: Hipofluoroso 21  HTRA2: Serina Peptidasa 2  hTyr: Tirosinasa Humana  I-: ioduro  I123-B-CIT: 2β-carbometoxi-3β- (4-iodofenil) tropano  ICOMT: Inhibidores de la Catecolortometiltransferasa  IDDC: Inhibidores de la Dopamina Descarboxilasa  IMAO-B: Inhibidores de la Monoaminooxidasa tipo B  IYD: Yodotirosina-desyodasas  LRRK2: Leucine-Rich Repeat Kinase 2  L-DOPA: L-3,4 dihidroxifenilalanina  LCR: Líquido Cefalorrquídeo  LPO: Lactoperoxidasa  MAO: Monoamino-Oxidasas  MPO: Mieloperoxidasa  MPP: Movimientos Periódicos de Piernas  NL: Neuritas de Lewy  NADPH: Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato  NMDA: N-Metil-D-Aspartato  NO: Óxido Nítrico  NOS: Óxido-Nítrico Sintetasa  NOX: NADPH-oxidasa. Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato- Oxidasa  NST: Núcleo Subtalámico  NSTr: Núcleo Subtalámico Reticular  MPTP: N-metil-4-fenil-1,2,3,6tetrahidropiridina  3NT- αSyn: α-sinucleína nitrada  O2: Ión superóxido  OH: Ion Hidroxilo  ONOO-: Peroxinitrito  P: Probabilidad  PRKN: Parkina 22  PARK: Parkinson Genético  PAIDI: Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación  PET: Tomografia por Emisión de Positrones  PET – FDG: Tomografia por Emisión de Positrones 18 F-Fluorodesoxiglucosa  PINK1: PTEN (Phosphatase and tensin homolog)-induced putative kinase-1  PLA2G6 - phospholipase A2 group VI  PRDxs: Peroxiredoxinas  P-SH: Proteínas con Cisteínas  P-SON: Proteínas S-Nitrosiladas  PSP: Parálisis Supranuclear Progresiva  RM: Resonancia Mangética  Rpm: Revoluciones Por Minuto  SCN-: Tiociananato (seudohaluro)  SN: Sustancia Negra  SNpc: Sustancia Negra Par Compacta  SNr: Sustancia Negra Reticulata  SODs: Superóxido Dismutasas  SOH ~: Ácido Sulfénico Proteico  SPECT-IBF: Tomografía por Emisión de Fotón único Yodo-123 Iodobenzofurano  SPECT-IBZM: Tomografía por Emisión de Fotón único yodo-123-Benzamina  SPECT I123-FP-CIT: Tomografía por Emisión de Fotón único Yodo 123I-Ioflupano  SPECT-MIBG: Tomografía Emisión Fotón único 123 Metayodo-bencil-guanidina  SPI: Síndrome de Piernas Inquietas  SP: Sustancia P  SUR: Unión específica del radioligando  SYNJ1: Synaptojanin T1  TH: Tirosina-Hidroxilasa  TSH: Hormona estimulante del tiroides  TPO: Tiroperoxidasa  Tyr: Tirosina 23  UCHL1: Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1  UPDRS: Unified Parkinson`s Disease Rating Scale  UPP: Ubiquitina-Proteasoma  VApc: Núcleo Ventral Anterior en su subdivisión Parvocelular  VLo: Núcleo Ventral Lateral Talámico  VPS35: Retromer Complex Component 24 25 Contexto Los estudios de saliva y suero de esta tesis doctoral se integran en el Proyecto titulado “Análisis de la presencia de nitro-α-sinucleína anómala en saliva de enfermos de Parkinson”, dirigido por Emilio Fernández Espejo, Catedrático de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla, y teniendo como investigadora a Fátima Damas Hermoso. Los protocolos fueron aprobados por el Hospital Universitario Virgen Macarena (CEI Macarena, 29/10/2013), y Hospital Universitario Señora de Valme (ref. 10/05/2018), así como el Comité de Ética de Investigación de la Junta de Andalucía (PEIBA; CEI Sevilla Sur, Dictamen ref. 2017.121418738). Se obtuvieron los consentimientos informados de todos los pacientes, con el modelo oficial de Biobanco hospitalario de Sevilla. El consentimiento siguió la normativa de la Declaración de Helsinki (BMJ 1991; 302: 1194). . 32 1.2 Etiopatogenia de la enfermedad de Parkinson La etiopatogenia es desconocida, pero se considera que es el resultado de la interacción de varios factores naturales, genéticos y ambientales. - Factores naturales: En condiciones, normales, tenemos una carga de 500.000 neuronas dopaminérgicas en la sustatancia negra pars compacta. Existe una pérdida neuronal natural por el envejecimiento que comienza a los 40 años (4,7% de las células por década de forma lineal). Esta susceptibilidad a la muerte de neuronas dopaminérgicas parece estar relacionada con la producción de radicales oxidativos. No obstante, es improbable que esta pérdida por sí misma y de forma aislada sea la causa, pero sí explicaría algunos parkinsonimos farmacológicos en ancianos inducidos por fármacos antidopaminérgicos. En la EP existe un aumento de la pérdida neuronal; el 50-90% de la misma tiene lugar en los primeros años de la enfermedad. Además, los marcadores dopaminérgicos y transportadores de dopamina (DAT) manifiestan una denervación, leve sobretodo en el putamen el 1º año posdiagnóstico y moderada/intensa a los 3 años y prácticamente total a partir del 4º año. Por otra parte, existe una “selectividad lesional” de las neuronas dopaminérgicas en la EP, afectando en mayor cuantía a la sustancia negra compacta y en menor proporción a la sustanción gris periacueductal. Sin embargo, esta degeneración neuronal no es solo dopaminérgica, también se afectan neuronas colinérgicas, noradrenérgicas y serotoninérgicas. - Factores genéticos: La mayoría de los casos son esporádicos y se estima que sólo el 8-10% de los casos tiene un origen genético. Gran parte se transmiten de forma mendeliana, pero en otros el patrón de herencia es desconocido. En algunas formas incluso todavía se desconoce el gen involucrado. Se detalla en la Tabla 1. 33 Tabla 1. Formas de EP monogénicas (modificado de Kalinderi et al. Actualización 2017) PARK Herencia Locus Gen Edad de inicio Características Clínicas PARK 1 ADo 4q21-22 αSyn 40-50 Inicio precoz PARK 2 AR 6q25.2-27 Parkina 20-40 Inicio precoz PARK 3 ADo 2p13 ¿? 60 Típico PARK 4 ADo 4q21-23 αSyn 30 Inicio precoz PARK 5 ADo 4p13 UCHL1 50 Típico PARK 6 AR 1p35-36 PINK1 20-40 Inicio precoz PARK 7 AR 1p36 DJ1 20-40 Inicio precoz PARK 8 ADo 12q12 LRRK2 >50 Típico PARK 9 AR 1p36 ATP13A2 <20 Demencia, espasticidad PARK 10 FR 1p32 ¿? >50 Típico PARK 11 ADo 2q36-37 ¿? >50 Típico PARK 12 Ligada a X Xq21-25 ¿? >50 Típico PARK 13 ADo/FR 2p12 HTRA2 >50 Típico PARK 14 AR 22q13.1 PLA2G6 20-40 Distonía PARK 15 AR 22q12-13 FBXO7 20-40 Síndrome piramidal PARK 16 FR 1q32 ¿? >50 Típico PARK 17 ADo 16q11.2 VPS35 >50 Típico PARK 18 ADo 3q27.1 EIFG4G1 >50 Atípico PARK 19 AR 1p31.3 DNAJC6 <20 Atípico PARK 20 AR 21q22.11 SYNJ1 <20 Atípico PARK 21 ADo 3q22.1 DNAJC13 >60 Típico Abreviaturas: ADo: Autosómica Dominante; AR: Autosómica Recesiva; FR: Factor Riesgo. Resto de abreviaturas y nombres oficiales de los genes: véase en el partado: Relación de Siglas y Acrónimos Actualmente se conocen alrededor de unos 21 locus afectados. Los diferentes tipos de EP se reconocen por el acrónimo PARK. Por lo general, las formas autosómicas recesivas (AR) están asociadas a una EP de inicio juvenil, la más frecuente es la mutación del gen parkina (PRKN) que codifica a una proteína con su mismo nombre. La EP autosómica dominante (ADo) es, por lo contrario, de inicio más tardío y 34 patológicamente cursa con Cuerpos de Lewy (CL). La mutación en el gen Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) es la más frecuente dentro de las formas ADo. Salvo unas pocas excepciones en algunas poblaciones, menos del 5% de todos los casos de EP son causados por mutaciones en un solo gen. Por tanto, las pruebas genéticas permitirán un diagnóstico etiológico preciso solo en la minoría de pacientes. Dado que no existe un tratamiento específico para los casos genéticos, el propósito de las pruebas genéticas en la EP está orientado fundamentalmente al paciente y sus familiares, al asesoramiento con respecto al pronóstico de la enfermedad y el riesgo genético de pacientes no afectados. Los resultados tienen implicaciones psicológicas, social y profesionales por lo que debe ser realizada por un equipo de profesionales que aporten consejo pretest y después de la prueba. En general, los estudios genéticos no son realizados en la practica clínica habitual; pero pueden considerarse en pacientes con EP juvenil, de inicio temprano e historia familiar positiva, con determinadas manifestaciones atípicas o siempre que exista una importante historia familiar (Müller et al., 2016). - Factores ambientales: Son múltiples los factores externos que se relacionan con una menor o mayor incidencia de EP. El tabaco y la cafeína son dos de ellos. Aunque su efecto protector no está reconocido, existe una incidencia mayor entre no fumadores y no consumidores de cafeína (existe la hipótesis de una menor capacidad de adicción en los pacientes con EP que explicaría esta posible asociación). En esta misma línea de protección, encontramos el consumo de antiinflamatorios no esteroideos (AINES) y el consumo moderado de alcohol. Por lo contrario, existe una mayor incidencia de EP en el ámbito rural. Diversos estudios (Broussolle E y Thobois S, 2002; Kieburtz W, 2013; Pezzoli G y Cereda E, 2013) señalan el posible papel etiológico de la exposición a herbicidas o insecticidas, consumo de sustancias tóxicas como N-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetrahidropiridina (MPTP), rotenona 35 (tóxico selectivo del complejo mitocondrial), la industrialización, historia de traumatismos cráneo encefálicos previos e ingesta de aguas de pozos. Como resultado de la intervención de estos factores naturales, genéticos y/o ambientales tiene lugar dos procesos fundamentales en esta patología: - la acumulación de proteínas anómalas, destacando la αSyn, en la sustancia negra (cuerpos y neuritas de Lewy) - la muerte neuronal dopaminérgica La αSyn es una proteína de 140 aminoácidos, con tres regiones diferenciadas. El extremo amino terminal está cargado positivamente, el segmento hidrofóbico central y el extremo carboxilo que está cargado negativamente. Posee cuatro residuos de tirosina, uno (Y39) cerca del extremo amino y tres (Y125, Y133, e Y136) cerca del extremo carboxilo. La figura 1 muestra un esquema de la proteína. El monómero proteico adopta una conformación colapsada alrededor del centro hidrofóbico. En 2011 se detectó que la αSyn fisiológica no se encuentra en forma monomérica sino oligomérica, formando tetrámeros, y que en ellos cada cadena adopta una conformación alfa-helicoidal (Bartels et al., 2011; Wang et al., 2011). Estos tetrámeros se forman por uniones ditirosínicas entre las cadenas y con dicha disposición espacial se localiza la proteína en las neuronas (principalmente en los terminales presinápticos), pero también en líquido cefalorraquídeo, espacio extracelular neuronal y sangre (Emmanouilidou et al., 2011). En sangre el 99% se encuentra unida a la membrana de los glóbulos rojos y el resto en plasma (Barbour et al., 2008). La existencia de αSyn en diversos fluidos se relaciona con el hecho que dicha proteína puede segregarse por las neuronas al medio extracelular y transportarse de neurona en neurona, fenómeno que podría estar involucrado en la progresión de la neurodegeneración en la EP. 36 Figura 1. α-sinucleína. (Izquierda) estructura plegada del monómero con los residuos de tirosina en color. (Derecha) Tetrámero con cuatro moléculas de αSyn unidas entre sí por residuos de tirosina. La principal patología molecular de la αSyn es la fosforilación, siendo sus oligómeros neurotóxicos; la αSyn anómala se pliega y forma fibrillas insolubles que se depositan en el citoplasma de las neuronas (Cuerpos de Lewy) y en las neuritas de Lewy. La αSyn mal plegada tiende a precipitar en forma de protofibrillas, que a su vez precipitan más sólidamente en forma de fibrillas, y que constituyen el núcleo del CL. La αSyn mal plegada también tiende a precipitar en agregados amorfos. La relación entre la clínica, la inclusiones proteicas anómalas y muerte neuronal es controvertida. Es bien sabido, que la clínica motora se relaciona con la pérdida neuronal pero no necesariamente con la densidad de agregados amorfos. Los CL, descritos por este autor en 1912, son inclusiones de 5 a 25 micras de diámetro, con un núcleo denso eosinofílico rodeado por un halo pálido (Figura2). En el núcleo denso se detectan depósitos de proteínas como αSyn, parkina y microfilamentos. Aunque se ha propuesto que los CL son un mecanismo citoprotector, a través del cual la célula “aisla” proteínas tóxicas, (Hurtig et al., 2000) han demostrado que cuanto mayor es el número de CL, mayor es la gravedad de la EP. Los CL se detectan en otros lugares del sistema nervioso central y periférico: como los plexos intestinales, el bulbo olfatorio, centros mesencefálicos, y glándulas salivares. Esto sugiere que estamos ante una enfermedad multisistémica, no afectando únicamente a estructuras neurológicas. Monómero Tetrámero 37 Figura 2. Cuerpo de Lewy. Neurona de sustancia negra con inclusión o cuerpo de Lewy característico, con halo claro y centro más oscuro eosinofílico. Tomado de Ellison, https://www.brightfocus.org/alzheimers/article/it-alzheimers-disease-or-lewy-body-dementia. Este hecho ha permitido enumerar una teoría patogénica sobre la EP que afirma que es de origen periférico y que podría relacionarse con un patógeno “invasor”. En la EP tiene lugar una afectación del sistema nervioso autónomo en las neuronas simpáticas posganglionares de varios órganos, y de forma característica del corazón, en el que tiene lugar una denervación simpática posganglionar que ya está presente desde fases premotoras de la enfermedad. Las alteraciones vegetativas que estos pacientes presentan se podrían explicar por la existencia de CL en los núcleos vagales bulbares, en los ganglios raquídeos simpáticos del plexo cardíaco (Iwanaga et al., 1999), y en el sistema nervioso entérico, lo que se traduciría en una alteración del tránsito intestinal, control vesical, rectal o disfunción eréctil (Wakabayashi et al., 1990). Aunque los CL son una característica significativa en la EP, no es específica; pudiendo ser encontrados en otras enfermedades (Enfermedad de Alzheimer, Demencia por CL, Esclerosis Lateral Amiotrófica, Atrofia Multisistema, Síndrome de Down, Hallervorden-Spatz). Por el contrario, hay tipos de EP como PARK2 o LRRK2 en los que no se encuentran estos CL en todos los cerebros. 38 1.3 Fisiopatología de la enfermedad de Parkinson Los ganglios basales están formados por un grupo de núcleos subcorticales relacionados directamente con el inicio y control de los movimientos voluntarios, del aprendizaje y de las acciones cognitivas y emocionales. Básicamente se dividen en tres formaciones: neoestriado, paleoestriado y núcleos suplementarios. El neoestriado comprende el núcleo caudado, el putamen y el núcleo accumbens. El paleoestriado incluye al globo pálido interno (GPi) y externo (GPe). Dentro de los núcleos sumplementarios destacan el núcleo subtalámico (NST), sustancia negra (pars compacta [SNpc] y pars reticulata [SNr]), el área tegmental ventral, el núcleo pedúnculopontino y el área motora mesopontina (Wichmann T et al., 2003). En la figura 3 se muestran los principales ganglios basales y su localización. Dentro de los ganglios basales, el neoestriado corresponde a la parte esencialmente receptora, tanto de la información cortical como de la modulación de la proyección desde los núcleos dopaminérgicos del mesencéfalo ventral. El GPi y la SNr constituyen los núcleos de salida de los ganglios basales, que conectan con el resto de núcleos funcionalmente implicados como los núcleos talámicos, el núcleo pedunculopontino y el área motora mesopontina. De esta manera existe una red de proyecciones dopaminérgicas entre los diferentes ganglios basales. La sustancia negra compacta ventral proyecta terminaciones dopaminergicas al putamen, mientras que la dorsolateral lo hace al caudado. El área tegmental ventral proyecta hacia región frontobasal y septal (núcleo acumbens). 39 Figua 3. Esquema de los Ganglios basales. Los ganglios basales se sitúan sobre una zona denominada cuerpo estriado dividida por un haz de fibras, denominado cápsula interna. Sobre ésta se van situando los ganglios basales: el núcleo caudado, el putamen, el globo pálido, el núcleo subtalámico y la sustancia negra. En el lado interno de la cápsula interna se halla el núcleo caudado (núcleo de la cola) y en su lado externo el putamen (núcleo en forma de cáscara), junto al que se sitúa el globo pálido (una estructura triangular de color gris claro con una fina capa de sustancia blanca en su mitad que, en ocasiones, se une con el putamen para formar el núcleo lentiforme). Situado al lado del globo pálido, pero más hacia el interior, se encuentra el núcleo subtalámico y, por debajo de este, la sustancia negra. El papel de los ganglios basales en el control motor normal no está del todo claro. La organización anatómica de los ganglios basales sugiere que el control motor normal puede considerarse como la consecuencia del equilibrio entre la actividad de las vías directa e indirecta nigroestriada sobre el complejo GPi/SNr. La activación de estas dos vías origina efectos antagónicos sobre las neuronas de dicho complejo. Así, la activación de la vía directa provoca una reducción de la actividad neuronal en el GPi/SNr, lo que desinhibe la proyección talamocortical y facilita la realización del movimiento iniciado en la corteza cerebral. Por el contrario, la activación de la vía indirecta conlleva un incremento de la actividad de las neuronas del GPi/SNr, lo que suprime el movimiento. Es importante reconocer que el tono del GPi/SNr en condiciones basales es siempre 40 elevado, suponiendo un papel primordial inhibitorio de los ganglios basales en el control normal del movimiento (Rodriguez- Oroz MC, 2011). La dopamina (DA) ejerce un papel fundamental en el control motor normal y patológico. Como se ha comentado, la DA tiene una función doble según en la vía en la que actúe. La estimulación dopaminérgica ejerce un efecto excitador sobre los receptores D1 de la vía directa (estriado-GPi) mientras que inhibe a los receptores D2 de la vía indirecta (estriado-GPe-NST-GPi). El resultado final de déficit dopaminérgico nigroestriado es una hiperactividad del GPi/SNr y una mayor inhibición del tálamo motor (Figura 6) porque:  Disminuye la inhibición de la vía indirecta (Figura 4).  Disminuye la activación de la vía directa (Figura 5). 41 Figura 4. Esquema de la vía indirecta dopaminergica. El circuito indirecto nace de neuronas putaminales inhibitorias mediadas por GABA y Encefalinas y van hacia GPe con proyecciones inhibitorias (región sensoriomotora del NST) y excitatorias (GPi y SNr). El resultado es una disminución de la inhibición de la vía indirecta teniendo como resultado un aumento de la supresión del movimiento. Abreviatura: glu, glutamato; enk, encefainas; GPe, núcleo pálido externo; GPi, núcleo pálido interno; SNR, sustancia negra reticulata; NST, núcleo subtalámico; NPP, núcleo pedúnculopontino. 48 1.4.2 Estrés oxidativo por derivados de la melanina La EP se caracteriza porque hay una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas pigmentadas del sistema nervioso. La pigmentación neuronal es causada por la melanina neuronal o neuromelanina. Parece ser que el Parkinson se relacionaría con exceso inicial de dopamina, neuromelanina y quinonas de dopamina (metabolito de dopamina oxidada) en las neuronas de la sustancia negra (Zecca et al. 2002; Wang et al. 2019). La producción de neuromelanina estaría exacerbada si hay exceso de DA en el citosol neuronal, y ello da lugar a derivados tipo quinonas de dopamina que inducen muerte neuronal (Sulzer et al., 2000; Hunot y Hirsch 2003; Jenner, 2003; Norris et al., 2005; Paris et al., 2007; Zecca et al., 2008; Dias et al., 2014; Schapira et al., 2014; Navarro-Yepes et al., 2014; Segura-Aguilar et al., 2014; Carballo- Carbajal et al., 2019). La melanina per se podría participar también en la patogénesis de la EP (Metodiewa y Dunford, 1991; Segura-Aguilar 1996; Reszka et al., 1998; Galzigna et al., 2000). La hTyr es la enzima principal requerida para la síntesis de melanina (Körner y Pawelek 1982; Sánchez-Ferrer et al., 1995; Galzigna et al., 2000; Thompson et al., 2000; Pan et al., 2011). Su papel en el sistema nervioso y en la EP es discutido (Foley y Baxter 1958; Xu et al., 1997; Tief et al., 1998; Greggio et al., 2005; Hasegawa 2010). Dicha enzima se estudia en esta tesis doctoral. La tirosina (Tyr) es uno de los veinte aminoácidos que forman las proteínas. Se clasifica como un aminoácido no esencial en los mamíferos ya que su síntesis se produce a partir de la hidroxilación de otro aminoácido: la fenilalanina. Es un precursor de las hormonas del tiroides, de las catecolaminas (adrenalina, DA, noradrenalina) y de la melanina. En el caso de la DA, la tirosina-hidroxilasa (TH) es la enzima que produce la hidroxilación de la Tyr dando lugar a L-3,4 dihidroxifenilalanina (L-DOPA) que a su vez por carboxilación (mediada por la descarboxilasa de aminoácidos aromáticos) se convierte en el neurotransmisor DA como podemos observar en la figura 9. 49 Figura 9. Vía de síntesis de dopamina en neurona dopaminérgica. La síntesis del neurotransmisor tiene lugar en las terminales nerviosas dopaminérgicas donde se encuentran en alta concentración las enzimas responsables, la TH y la descarboxilasa de aminoácidos aromáticos o L-DOPA descarboxilasa. La hidroxilación del aminoácido L-tirosina es el punto de regulación de la síntesis de catecolaminas en el sistema nervioso central y la TH es la enzima limitante de la síntesis de la dopamina, la noradrenalina y la adrenalina. La TH es una oxidasa que utiliza L-tirosina y oxígeno como sustratos y tetrahidrobiopterina como cofactor para adicionar un grupo hidroxilo al aminoácido para formar L-DOPA Para la conversión de Tyr a melanina se requiere de la participación de la enzima hTyr, como se ha comentado. Los melanocitos normales y las neuronas pigmentadas como las de la SN, convierten la Tyr a dihidroxifenilalanina (DOPA), ésta se convierte en dopaquinona y por oxidación a melanina como muestra la figura 10. Existen dos tipos de melaninas y tres de pigmentos: 50  Eumelaninas: Es la más común. Tienen un color negro o pardo y proporcionan una coloración oscura. Contienen azufre.  Feomelaninas: son pigmentos amarillos o rojizos que aportan mayor cantidad de azufre que las eumelaninas y producen una coloración clara.  Tricocromos (denominados anteriormente tricosiderinas) son pigmentos producidos por la misma ruta metabólica que la eumelanina y feomelanina pero a diferencia de ellas tienen bajo peso molecular. Se los encuentra en algunas formas de cabello pelirrojo. La neuromelanina (eumelanina del sistema nervioso) es el pigmento oscuro presente en las neuronas que recubren cuatro núcleos del cerebro: SNpc, locus coereleus, el núcleo dorsal motor del nervio vago (nervio craneal X) y la parte media del núcleo del puente de Varolio. Tanto la SN como el locus coeruleus pueden identificarse fácilmentes en una autopsia debido a su pigmentación oscura; en los humanos este núcleo no se encuentra pigmentado en el nacimiento, sino que el pigmento aparece tras la madurez. La pérdida de color en el núcleo del cerebro se ha observado en ciertas enfermedades neurodegenerativas. Figura 10. Vía de producción de la melanina. Tiene lugar en el interior de los melanosomas a partir de la tirosina. Una sucesión de oxidaciones de tirosina catalizada por la tirosinasa conduce a la síntesis de DOPA para producir, a continuación, un compuesto intermediario común: la dopaquinona. A partir de este punto, dos vías distintas conducen a la formación de las eumelaninas y de las feomelaninas. 51 1.4.3 Estrés oxidativo por especies reactivas de nitrógeno Respecto al estrés de ERN, se debe a un exceso de producción de óxido nítrico (NO), generalmente por exceso de superóxido, otras especies reactivas o calcio citosólico que estimulen la óxido-nítrico sintetasa (NOS). El NO puede seguir diversas vías para originar ERN, y las que interesan a esta tesis doctoral y más importantes son la nitración y la S-nitrosilación. La nitración es la formación de proteínas 3-nitrotirosinadas, un producto de la nitración del carbono-3 de la tirosina. El estrés nitrativo se asocia a diversas patologías (Ischiropoulos, 2009). La S-Nitrosilación es la incorporación de grupos NO a otra molécula en residuos de cisteína. Generalmente se debe a la exposición a trióxido de nitrógeno en presencia de GSH o a otras proteínas nitrosiladas (trans-nitrosilación). El NO se une a residuos sulfidrilos/tioles de proteínas con cisteínas (P-SH) formándose S-nitrosotioles (P-SNO). Se sabe que existe una S-nitrosilación fisiológica de alrededor de 171 proteínas plasmáticas, lo que sugiere que hay un estado redox basal de nitrógeno. El estrés de ERN daría lugar a la S-nitrosilación de nuevas proteínas o exceso de S-nitrosilación de otras. Este estrés también se asocia a alteración de la estructura y funcionalidad proteica, así como a diversas patologías (Lipton et al., 1993; Stamler, 1994; Nakamura y Lipton, 2011). La S-nitrosilación es mediada por nitrosilasas, y es un mecanismo reversible generalmente controlado por denitrosilasas, tiorredoxinas o el GSH (Anand y Standler, 2012; Benhar et al., 2008). El estrés S-nitrosilativo se puede detectar porque hay incremento de proteínas S-nitrosiladas (P-SNO) o alteraciones de las enzimas nitrorreductasas. La DEHAL1 es una enzima nitrorreductasa que se estudia en esta tesis doctoral. La nitración es importante en la patogénesis de la EP, pues afecta a las proteínas muy relacionadas con la enfermedad como la αSyn. La α-sinucleína nitrada (3NT- αSyn) es un importante candidato a biomarcador para el estrés nitrativo en la EP, y se estudia en esta tesis doctoral. El metabolismo acelerado de la DA también genera varios agentes nitrativos y puede inducir la agregación de αSyn (Xu et al., 2002). Las inclusiones de αSyn en los cerebros de EP pueden marcarse con anticuerpos anti-3-nitrotirosina, lo que 52 indica que la αSyn es objetivo de nitración (Trojanowski et al. 2008). Esta proteína contiene 140 aminoácidos con cuatro residuos de Tyr (Tyr-39, Tyr-125, Tyr-133, Tyr- 136), que se nitran fácilmente, y se sabe que los aminoácidos nitrados pueden modificar la actividad funcional de la proteína. Por lo tanto, el exceso de nitración de los residuos de tirosina de αSyn reduce su unión a las vesículas y la tasa de degradación (Hodara et al., 2004). La nitración de los residuos Tyr-39 y Tyr-125/136 aumenta la agregación de αSyn, un hecho que se considera importante en la patogénesis de la EP porque la conversión de αSyn soluble en forma agregada insoluble es un factor crucial en esta enfermedad (Yanamandra et al., 2012). 1.4.4 Estrés oxidativo halogenativo Un tipo de estrés oxidativo de interés para esta tesis doctoral es el halogenativo. Siguiendo la definición clásica, el estrés halogenativo sería causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas halogenadas, y los sistemas de defensa deshalogenantes. Las reacciones de halogenación están mediadas principalmente por las haloperoxidasas, un grupo de enzimas que catalizan la conversión de H2O2 en oxiácidos halogenados como el ácido hipocloroso, tras la incorporación de halógenos (Harrison y Schultz, 1976; Dunforb, 1999). Las fuentes enzimáticas de H2O2 más importantes son la NADPH oxidasa (presente en fagocitos sanguíneos, microglía, neuronas y endotelio vascular), monoamino-oxidasas o MAO (MAO-A de neuronas, MAO-B glial y neuronal), ciclooxigenasas (COX), y xantino-oxidasas. Los oxiácidos halogenados principales son el ácido hipocloroso (HOCl), hipobromoso (HOBr), hipoyodoso (HOI) e hipofluoroso (HOF). Diferentes haloperoxidasas median distintos procesos de halogenación. La tabla 2 muestra las principales haloperoxidasas y su localización. Las haloperoxidasas de las células blancas sanguíneas y microglia, en concreto, la MPO y la eosinófilo-peroxidasa (EPO), median la formación de HOCl y HOBr como mecanismos defensivos del organismo. La TPO media la formación de HOI, y está presente en la glándula tiroides, glándulas salivares e intestinales. La LPO cataliza la formación de HOI e HOBr en mucosas y líquidos corporales como saliva y leche, e incluso LCR (Fernández-Espejo y Jiménez- Caballero, 2019). La LPO es una enzima de interés para esta tesis doctoral, y se estudian 53 sus niveles en saliva y suero. La LPO, además de ser una haloperoxidasa, induciendo derivados halogenados, puede participar en la síntesis de derivados peroxidados de la dopamina como la melanina. Los oxiácidos halogenados reaccionan a su vez con aminoácidos, proteínas, lípidos y aminas biógenas, dando productos halogenados. Los oxiácidos son degradados principalmente por deshalogenasas (Harrison y Schultz, 1976; Dunforb, 1999; Witko- Sarsat et al., 2003; Yap et al., 2007; Curtis et al., 2011). Entre los aminoácidos halogenados, aquellas que se derivan de Tyr son de sumo interés para la EP, como clorotirosinas o yodotirosinas, pues estas sustancias han demostrado toxicidad sobre neuronas de DA (Scholz et al., 2008; Garcia-Moreno et al., 2013). Los aminoácidos clorados, como clorocisteína o clorolisina, también dañan las neuronas de DA al alterar las proteínas de membrana (Robaszkiewicz et al., 2008). Dentro de la familia de proteínas halogenadas destacan las proteínas modificadas por hipoclorito y los productos proteicos con oxidación avanzada o AOPP (en inglés advanced oxidation protein products). Las proteínas modificadas por hipoclorito suelen sufrir procesos de cloración en residuos de cisteínas. Las AOPP presentan residuos ditirosínicos clorados que forman puentes cruzados, como característica principal (Witko-Sarsat et al., 1996, 1998). Tabla 2. Principales haloperoxidasas, localizaciones corporales y principales haluros y seudohaluros que oxidan Haloperoxidasa Localización Haluros y seudohaluros que oxidan Mieloperoxidasa (MPO) Neutrófilos, macrófagos, microglia Cl -, I - , SCN -, Br - Eosinófilo-peroxidasa (EPO) Eosinófilos, mucosa intestinal Cl -, I - , SCN -, Br - Lactoperoxidasa (LPO) Glándulas salivares, glándulas lacrimares, mucosa gástrica, mucosa intestinal, células ductales de la mama, cerebro I - , SCN -, Br - Peroxidasa salivar (SPO) Glándulas salivares y lacrimares I - , SCN -, Br - Tiroperoxidasa (TPO) Tiroides, tejidos extratiroideos I -, Br - Abreviatura: Cl-: cloruro; Br -: bromuro; I-: ioduro; SCN-: tiociananato (seudohaluro). 54 Los oxiácidos halogenados también pueden reaccionar con lípidos, dando lugar a moléculas altamente oxidantes, así como con aminas biógenas, alterando de esta forma su funcionalidad. La acción sobre lípidos es de amplio espectro, y es capaz de modificar lípidos vitales para el sistema nervioso (Nusshold et al., 2010). Así, la acción sobre el colesterol da lugar a halohidrinas de colesterol y colesterol diclorinado. La acción sobre fosfolípidos da lugar a halohidrinas y haloaminas. La acción sobre las glicero-fosfoetanolaminas da lugar a aldehídos grasos halogenados altamente oxidantes. Los principales derivados halogenados, y que se relacionan con la neurodegeneración, se presentan en la tabla 3. Tabla 3. Principales derivados halogenados que participan en la neurodegeneración Tipo de molécula Derivado halogenado Aminoácidos Cloro-tirosinas, yodo-tirosinas, cloro-cisteína, cloro-lisina Proteínas Proteínas modificadas por hipoclorito, productos proteicos con oxidación avanzada o AOPP, proteínas oxidadas en metioninas Lípidos Halohidrinas de cholesterol, colesterol diclorado, halohidrinas de fosfolípidos, haloaminas, clorohidrinas, 2-clorohexadecanal 1.4.5 Las deshalogenasas En la generación del estrés halogenativo existe una descompensación entre la formación de compuestos halogenados y la actividad de los mecanismos deshalogenantes. Entre los mecanismos deshalogenantes se encuentra el sistema del glutatión, ya descrito, y otros, como por ejemplo las enzimas catalasas (CAT) y DEHAL. Estas enzimas tipo DEHAL participan en la degradación de oxiácidos de halógenos a hidrácidos, y también en la degradación de haloaminas y haloaminoácidos. Dentro de las deshalogenasas, destacamos las yodotirosina-desyodasas (IYD). Estas enzimas presentan 2 isoformas principales DEHAL1 y 1B, y pertenecen al grupo de enzimas oxidorreductasas, codificadas por el gen IYD en humanos (Fernández-Espejo, 2019). Además del dominio deshalogenasa, la DEHAL1 posee un dominio nitrorreductasa, cuya actividad depende de la flavina como grupo protéico (Iglesias et al., 2014; Moreno et al., 2008). La DEHAL1 se encarga de la liberación del yoduro a partir 55 de mono y diyodotirosina, proceso que permite la reutilización del yoduro en el proceso de síntesis de las hormonas tiroideas. También actúa en tejidos extratiroideos, como las glándulas salivares. La DEHAL1 nativa se encuentra anclada en la membrana celular mediante una única secuencia N-terminal, y emplea el NADPH reductor de forma indirecta a través de la acción coordinada de una reductasa (Moreno y Visser, 2010). DEHAL1 se sitúa en el cromosoma 6 humano, y se organiza en 6 exones. Su máxima expresión se encuentra en el tiroides, aunque también lo hace, en niveles más bajos, en hígado y riñón y fluido gastrointestinal (en esta tesis doctoral se estudia en la saliva). El ARNm de DEHAL1 se regula por el nucleótido adenosín monofosfato cíclico (AMPc) estimulado por la hormona estimulante del tiroides (TSH), así como por la administración de yoduro. Existen varias en el ARNm de DEHAL1 generadas por splicing alternativo. La isoforma A, que es la más abundante en el tiroides, codifica la proteína con actividad desyodasa, mientras que las isoformas B y C, generan formas inactivas (Iglesias et al., 2014). Como se mencionó anteriormente, en los procesos de estrés halogenativo se produce tanto un exceso de compuestos oxidantes como un déficit en los mecanismos de protección frente a los mismos. La alteración de la acción deshalogenante resulta de interés, ya que algunos aminoácidos halogenados, como yodotirosina, parecen ser sustancias con toxicidad sobre las neuronas dopaminérgicas (Fernández-Espejo y Bis- Humbert, 2018). En esta tesis docotral se estudia los niveles de DEHAL1 en suero y saliva de pacientes con EP y su relación con variables clínicas. Es preciso resaltar que en los pacientes de EP se detectan anomalías de interés relacionadas con el manejo y metabolismo de halógenos. Ejemplo de ello son, el incremento en la actividad y/o niveles de haloperoxidasas como TPO y LPO, así como disfunción de DEHAL (Choi et al., 2005; Yap et al., 2007; Nusshold et al., 2010; Navarro- Yepes et al., 2014; Fernández Espejo et al., 2014; Fernández Espejo, 2106). Las TPO y LPO sintetizan halotirosinas, utilizando haloácidos como hipoyodito o hipoclorito como intermediarios y dadores de halógenos (Navarro-Yepes et al., 2014; Choi et al., 2005; Fernández Espejo et al., 2014). Las DEHAL degradan halotirosinas y haloácidos (Choi et al., 2005; Moreno y Visser, 2010; Iglesias et al., 2014). En modelos animales de 56 párkinson, la eliminación de la MPO mejora el cuadro motor y lesional nigroestriado (Choi et al., 2005). En la EP se ha determinado una cantidad elevada de MPO en el tejido cerebral de los enfermos (Choi et al., 2005; Teissman, 2014) o de TPO en suero y de LPO en LCR (Fernández Espejo et al., 2014, 2019). Otros autores han postulado incluso que la LPO podría detectarse en tejido cerebral (Everse y Coates, 2004). Como se ha comentado, la LPO puede inducir derivados peroxidados de la DA, como la melanina, la cual, puede participar también en la patogénesis de la EP (Metodiewa and Dunford, 1991; Segura- Aguilar 1996; Reszka et al., 1998; Galzigna et al., 2000). En esta tesis doctoral se estudia la presencia de LPO en suero y saliva de enfermos de EP. Los pacientes de Parkinson sufren también de estrés halogenativo, principalmente clorado, a nivel cerebral y diversos fluidos, caracterizado por el exceso de productos proteicos halogenados, 3-clorotirosina y proteínas y aminas modificadas por hipoclorito (Choi et al., 2005; Yap et al., 2007; Nusshold et al., 2010; García-Moreno et al., 2013). La fuente enzimática principal de agua oxigenada es la NADPH oxidasa. Se sabe que la NADPH oxidasa está regulada al alza en la EP (Gao et al., 2003). De hecho, la hiperactividad de esta enzima facilita la degeneración en modelos animales de EP como el de rotenona y el de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina o MPTP (Gao et al., 2003). Entre los productos proteicos halogenados, destacan las AOPP. Las AOPP se detectan en casi 1/3 de pacientes de EP en el LCR, cuando es indetectable en sujetos sanos (García-Moreno et al., 2013). Las AOPP se pueden conjugar con la albúmina sérica humana (HSA) dando lugar a aductos AOPP-HSA. Estos aductos pueden estimular la producción de factores inflamatorios a través de la “activación” de neutrófilos, monocitos y linfocitos. La rotura anómala de las proteínas halogenadas, mediada por un sistema ubiquitina-proteosoma alterado, podría dar lugar a su vez a amidas tóxicas para las neuronas (Mani et al., 2007). Un reciente artículo, pone de manifiesto que el HOCL puede reaccionar con la dopamina, y precipitar en forma de agregados clorados similares a la neuromelanina (Jeitner et al., 2015). Además, el HOCl da lugar a cloro-dopamina, sustancia tóxica al menos para el ratón pues daña la SN de un modo similar al de la MPTP (Jeitner et al, 57 2016). Es conocido que en ratones tratados con MPTP, los niveles de proteínas modificadas por hipoclorito se incrementan en el tejido cerebral (Choi et al., 2005). También nuestro grupo de investigación ha aportado otros datos de la existencia de estrés halogenativo en los pacientes, pues el 30% de los pacientes estudiados muestran niveles elevados de TPO en suero (Fernández Espejo et al., 2014). La tiroperoxidasa media la síntesis de yodotirosinas y yodoproteínas, aunque no se han detectado aumentos de estas moléculas yodadas en suero o LCR de los pacientes. La TPO es abundante en la glándula tiroidea, la cual, ha sido vinculada con la EP por varios autores. Así se ha detectado una mayor prevalencia de disfunción tiroidea en los pacientes de EP, y es frecuente detectar denervación simpática en la tiroides, un “sello” de la enfermedad que ocurre en diversos órganos de la economía (García-Moreno y Chacón, 2002; Matsui et al., 2005; Tandeter et al., 2001; Tipre y Goldstein, 2005). También la TPO sérica puede tener un origen extratiroideo glandular. Conviene recordar que en la EP existe denervación simpática en tejidos glandulares como las glándulas salivares (Del Tredici y Braak, 2012). Es posible que un exceso de TPO, ácido hipoyodoso y derivados yodados pueda afectar el curso de la EP. 1.4.6 Estrés oxidativo y daño de la sustancia negra El estrés oxidativo, en sus diversas vertientes, ocasiona daño en proteínas, lípidos, ADN/ARN y glúcidos en SN. Así los niveles de proteínas nitradas y carboniladas, marcadores de oxidación proteica, están aumentados más de dos veces en la sustancia negra de enfermos de EP. Los niveles de hidroperóxidos lipídicos, marcadores de oxidación de lípidos, están aumentados diez veces. La 8-hidroxiguanosina, un marcador de ARN y ADN oxidado, también está aumentada en la SN más de tres veces. El fuerte estrés oxidativo en la SN (y otras estructuras) lleva a un plegamiento anormal de proteínas como la Syn y la parkina (Wang et al., 2010). La pérdida de SYN (que precipita en forma de cuerpos y neuritas de Lewy) también altera la normal función vesicular llevando a un exceso de DA intracelular, que contribuiría a aumentar el estrés oxidativo. Además, la acumulación de αSyn anormal puede saturar y perjudicar la función de la vía de la UPP, que como se ha dicho anteriormente, es un sistema celular 64 presencia de alteraciones no motoras, o “premotoras”, de baja intensidad, en las que destaca el estreñimiento, hiposmia/anosmia, desorden del sueño, o disfunciones sexuales (Fearnley and Lees 1991; Schwarz et al 2004; Reichman, 2017). Muchas manifestaciones clínicas premotoras son de naturaleza vegetativa, y sugieren una afectación temprana del sistema nervioso autónomo (disfagia, disartria, hipotensión ortostática, sialorrea, etc) (Fahn y Halliday, 2011). En esta tesis se valoran síntomas no motores y su relación con diversas moléculas relacionadas con estrés oxidativo y la EP. Para ello, se ha empleado una escala premotora que recoge los síntomas no motores más frecuentes (ver Anexos). Por otra parte, la caída exponencial de la señal SPECT también indica que hay una fase prodrómica antes de la premotora, que comienza hasta 20 años antes del diagnóstico motor (Schwarz et al 2004). Esta fase estaría libre de síntomas clínicos, pero el daño neuronal ya se ha iniciado. En realidad, cuando aparecen los déficits motores que llevan al paciente a ver al médico, la muerte neuronal en la sustancia negra es superior ya al 50%. Los sintomas premotores más comunes son los siguientes: Fatiga. Es muy común la fatiga o el cansancio excesivo con esfuerzos leves. Se acentúa con el calor y se puede combinar con la somnolencia diurna. Alteraciones vegetativas. El “fallo disautonómico puro” es un síndrome que tiene como base una sinucleinopatía y que con el tiempo puede evolucionar hacia una EP, AMS o incluso una demencia. El primer trastorno disautonómico es la pérdida de arritmia sinusal respiratoria por denervación cardíaca junto con la hipotensión ortostática que no suelen ser sintomáticas. En ocasiones son causas de síncopes y se relacionan con mayor frencuencia con la AMS. La disautonomia cardiaca en EP es posganglionar y se detecta una denervación cardíaca en el SPECT-MIBG y preganglionar en la AMS (SPECTMIBG normal). La hiperactividad del detrusor también es frecuente provocando polaquiuria con urgencia miccional. Como complicaciones, encontramos las infecciones urinarias de repetición, cólicos renales y el reflujo vesicouretral. La sialorrea se debe a la hipocinesia de la deglución. La seborrea se debe al aumento de la secreción grasa del 65 sudor por alteración de las glándulas sudoríparas, pero también como consecuencia del tratamiento con levodopa. El estreñimiento es casi universal en la EP junto con la gastroparesia; si bien pueden estar presentes antes que la sintomatología motora, también pueden ser consecuencia del tratamiento con levodopa. La disfunción eréctil es frecuente, pero no es tan precoz ni tan intensa como en la AMS. Trastornos afectivos. La ansiedad y depresión son los más comunes. Ambos trastornos pueden ser reflejo de las alteraciones neuroquímicas (serotoninérgicos) de la enfermedad como reactivos a las limitaciones propias de la enfermedad. Hiposmia. Es uno de los síntomas más característicos y puede preceder en varios años a los motores. Desde fases muy precoces, hay depósitos de αSyn en el bulbo olfatorio, pero la anosmia se correlaciona mejor con la pérdida neuronal en la vía olfatoria central. Rara vez el paciente lo expresa de forma espontánea. Trastornos cognitivos. Son frecuentes en los estadios iniciales de la enfermedad. Afecta sobre todo a funciones frontales siendo la clínica muy diversa como retraso en la integración y ejecución de órdenes y pensamientos aunque las respuestas sean correctas, dificultades en la planificación, ejecución e iniciación de conductas voluntarias, disminución de la fluencia verbal y alteración del aprendizaje y del recuerdo. Dolor y trastornos sensitivos. Aunque no hay afectación del sistema nervioso periférico, es frecuente observar alteraciones sensitivas cinestésicas. Más del 50% refieren dolor, entumecimiento, parestesias en brazos, piernas o espalda. El dolor es de tipo musculoesquelético (bursitis, tendinitis, algias generalizadas) diferenciándolo del distónico (en periodos off o distonías de la enfermedad). Alteraciones visuales. Algunas alteraciones en la agudeza visual, contraste o color, son precoces, subclínicas, y asociadas a alteraciones dopaminérgicas retinianas. Posteriormente comienzan con alteraciones visuales centrales como la percepción de objetos, integración visuoespacial, movimiento de las caras, etc. 66 Alteraciones del sueño. El sueño tiende a estar fragmentado en fases precoces de la enfermedad. Es frecuente el sueño REM sin atonía, base del trastorno de conducta del sueño REM (sueños vívidos asociados con comportamientos simples o complejos durante el sueño REM), que puede preceder en años a la sintomatología motora. Con el avance de la enfermedad, el sueño REM se reduce y son muy frecuentes los movimientos periódicos de piernas y síndrome de piernas inquietas. Además, la calidad del sueño es baja por coexistencia de diferentes factores: calambres, distonías off, nicturia. 1.6 Diagnóstico de la enfermedad de Parkinson El diagnóstico de la EP es fundamentalmente clínico. Habitualmente se realiza con retraso dada la sutil e inespecífica presentación clínica que puede tener al incio. En la tabla 4 se muestra las principales patologías con las que se hace su diagnóstico diferencial (Südemeyer M et al., 2011). Desde el punto de vista clínico, la herramienta más usada es la escala UPDRS (ver Anexos) que permite valuar y cuantificar los signos y síntomas de la EP. Valora el estado motor, cognitivo y las actividades de la vida diaria del paciente (AVD). Se suele usar junto a otras escalas como la de Hoehn y Yahr y la Schwab y England que estiman etapa motora y dependencia en las AVD del paciente respectivamente (ver Anexos). La UPDRS consta de 4 partes: I. Cognición, estado de ánimo y conducta II. Actividades de la vida diaria III. Examen motor IV. Complicaciones del tratamiento en la última semana La tercera parte, que corresponde al examen motor, es la más empleada en las consultas de práctica clínica habitual. El resto de información se suele obtener en la anamnesis que se realiza durante la entrevista médica. 67 Sin embargo, en muchas ocasiones nos ayudamos de las pruebas complementarias que nos aproximan al diagnóstico con una gran fiabilidad, aunque el diagnóstico definitivo es anatomopatológico. Fundamentalmente estas pruebas complementarias nos permiten excluir otras causas parkinsonianas (Südemeyer M et al., 2011). Tabla 4. Causas de Síndrome rígido-acinético ETIOLOGIA DEL SINDROME RIGIDO ACINÉTICO PRIMARIO  Enfermedad de Parkinson idiopático  Enfermedad de Parkinson genéticamente determinada  Otras enfermedades neurodegenerativas o Atrofia multisistema o Parálisis supranuclear progresiva o Degeneración corticosubcortical o Atrofias palidales progresivas o Neurodegeneración con acumulación de hierro o Enfermedad Huntington o Enfermedad de Alzheimer y otras demencias o Parkinsonismo-distonía hereditarios o Complejo parkinsonismo-demencia-escleroris lateral amiotrófica de Guam o Demencia fronto-temporal/Parkinson (genes MAPT, PGN, FUS) o Ataxias dominantes (SCA2 y SCA3) SECUNDARIO  Postencefalítico  Iatrogénico (farmacológico)  Tóxicos exógenos: manganeso, monóxido de carbono, MPTP, metanol, mercurio  Parkinsonismo del Caribe  Vascular  Encefalopatía postramática crónica  Metabólico: hipoparatiroidismo y calcificaciones hereditarias de los ganglios basales  Encefalopatía portosistemática  Enfermedad de Wilson 68 Hoy en día, la neuroimagen convencional como la tomografía computarizada (TC craneal) y la resonancia magnética (RM) craneales son las más utilizadas, como se ha comentado antes, para el diagnóstico diferencial con otros parkinsonismos como se muestra en la tabla 5. Tabla 5. Hallazgos característicos en RM cerebral en EP y parkinsonismos atípicos EPI AMS PSP RM CONVENCIONAL Normal ++ - - Atrofia putaminal - ++ ++ Halo hiperintenso putaminal + ++ + Hipodensidad putaminal - ++ - Atrofia pontina y cerebelo-vermiana - ++ + Cambios de señal en protuberancia o pedúnculo cerebeloso medio, incluido el signo de la cruz y/o del santiaguiño - ++ - Atrofia mesencéfalica, incluyendo signos indirectos (silueta del pingüino o colibrí) - - + PLANIMETRÍA Reducción del diámetro mensencefálico anteroposterior - + ++ Reducción de la proporción entre área mesencefálica y pontina - - +++ IMÁGENES POTENCIADAS EN DIFUSIÓN Aumento de la difusividad puntaminal - +++ ++ Aumento de la difusividad del pedúnculo cerebeloso superior - - +++ RM DE 3 TESLAS Hipodensidad putaminal + +++ + Nuevos equipos (RM de alto campo) o técnicas especiales (imágenes con susceptibilidad ponderada o cuantificación de neuromelanina en la SN) parecen prometedores, pero se requieren protocolos estandarizados para aumentar su precisión diagnóstica. 69 Otra técnica que se utiliza (que requiere personal muy cualificado) es la ecografía transcraneal en la que la SN tiene una importante hiperecogenicidad por acumulación de hierro. Observando este dato en el 87-90% de los pacientes con EPi y en el 8-10% de los sujetos sanos, con una sensibilidad del 90% y especificidad del 82%. Sin embargo, es útil para diferenciar la EPi el temblor esencial con una sensibilidad del 75-91% y una especificidad del 84-94% (Niñerola-Baizán A et al., 2018). Los pacientes con temblor esencial que tienen este signo en la ecografía transcraneal tienen un riesgo relativo de 7 para desarrollar EPi a los 6 años. Varios trabajos han mostrado utilidad para el diagnóstico diferencial con otros parkinsonismos plus. Los hallazgos sonográficos más relevantes se resumen en la tabla 6. Tabla 6. Hallazgos sonográficos en el diagnóstico diferencial de los parkinsonismos degenerativos. Hallazgos sonográficos La hiperecogenicidad de la SN sugiere EPI frente a PSP o AMP La hiperecogenicidad del núcleo lenticular sugiera AMS o PSP frente a EPI La dilatación del tercer ventrículo sugiere PSP frente a AMS La dilatación del tercer ventrículo, junto a normoecoginicidad del a SN, sugiero PSP frente DCB (tercer ventrículo normal e hiperecogenicidad de la SN) La dilatación del tercer ventrículo, junto a hiperecogenicidad de la SN bilateral sugiere DCL La tomografía por emisión de positrones (PET) y la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) se han empleado para el estudio del sistema dopaminérgico pre- y postsináptico, mediante el desarrollo de radiotrazadores específicos que permiten estudiar distintos aspectos de la función dopaminérgica. Los radiotrazadores con afinidad por moléculas que participan en la síntesis de dopamina y por los transportadores de dopamina evalúan la neurona presináptica o nigroestriatal. Los radiotrazadores con afinidad por los receptores dopaminérgicos valoran la integridad de las neuronas postsinápticas. Se ha demostrado que el DaT está presente 70 exclusivamente en las neuronas que sintetizan dopamina, y por ello es considerado como un marcador específico de estas neuronas en el sistema nervioso central. De los radiotrazadores de DaT utilizados en SPECT, el I123-FP-CIT (yodo 123I-Ioflupano) es el más común (DaTSCAN). Estima la densidad de DaT en las terminales del estriado (caudado y putamen), siendo un marcador indirecto de degeneración de la vía nigroestriatal. En los sujetos sanos ofrece una imagen característica del estriado “en forma de comilla”, mientras que en pacientes con EP se va perdiendo de forma asimétrica y progresiva “la cola” (putamen) con mayor preservación de las cabezas de los caudados (Niñerola-Baizán A et al., 2018). En el PET uno de los más utilizados es la fluorodopa (marcador de la síntesis de dopamina en la terminal dopaminérgica). Ambos detectan un defecto dopaminérgico presináptico pero sin poder distinguir entre los diferentes “parkinsonismos presinápticos” como la EP, AMS o PSP (Morrish PK et al., 1996). Mediante otros ligandos como yodo-123 iodobenzofurano (SPECT-IBF) y yodo- 123-benzamina (SPECT-IBZM) se puede evaluar la densidad de receptores D2 postsinápticos (estriatales). Estos receptores están intactos en la EP pero reducidos en otros parkinsonismos como AMS, PSP o DCB. Las técnicas de neuroimagen funcional también permiten el estudio del metabolismo cerebral mediante PET con 18F-Fluorodesoxiglucosa (FDG). En la EPi existe un hipermetabolismo del núcleo lenticular (en la porción dorsolateral del putamen), tálamo, protuberancia, cerebelo y corteza sensitivomotora (se normaliza tras el tratamiento dopaminérgico o con la estimulación cerebral profunda). En la AMS se observa un marcado hipometabolismo del putamen, protuberancia y cerebelo; mientras que en la PSP el hipometabolismo se encuentra principalmente en el córtex frontal medial y dorsal, mesencéfalo y protuberancia, además de caudado, putamen y tálamo. En la DCB se observa un hipometabolismo cortical frontoparietal y estriatal y talámico contralateral al hemicuerpo más afectado. Esta prueba se realiza únicamente en investigación (Escamilla-Sevilla F et al., 2017). Podemos observar un resumen de los hallazgos en las diferentes pruebas neurofuncionales en la tabla 7. 71 Tabla 7. Patrones en la neuroimagen funcional (SPECT o PET) de los principales parkinsonismos degenerativos. ESTUDIO Sistema dopaminérgico presináptico Sistema dopaminérgico postsináptico D2 Metabolismo PATOLOGIA EPI Hipocaptación Captación normal o aumentada Hipercaptación AMS Hipocaptación Hipocaptación Hipocaptación PSP Hipocaptación Hipocaptación Hipocaptación DCB Hipocaptación Captación normal o reducida Hipocaptación La gammagrafía cardíaca también se puede utilizar para el diagnóstico diferencial de otros parkinsonismos. Sin embargo, en la práctica clínica habitual no se lleva a cabo de forma rutinaria. Como se ha comentado anteriormente, se observa una denervación en el SPECT-MIBG en la EP y no muestra alteración en los parkinsonismos. Desde hace décadas, numerosos estudios han confirmado que hay una afectación autonómica cardíaca precoz en la EPI al igual que en otras sinucleopatías, como la demencia con CL. Sin embargo, no es patognomónica, pues puede ocurrir en otras entidades neurológicas (ataxia cerebelo-espinal tipo2), sistémicas (diabetes, hipertensión arterial, cardiopatía isquémica, polineuropatías) o por fármacos (betabloqueantes, trazodona, antidepresivos tricíclicos…). El LCR es otra fuente de estudio (Fernández Espejo E et al.,2016). Se han descritos dos hallazgos importantes (objetos de estudio y mención en esta tesis): - El nivel total reducido de la αSyn nativa en la EP - La detección elevada de αSyn anómala (fosforilada) en la EP y otras sinucleinopatías Estos parámetros actualmente solo se utilizan en investigación. Además, se trata de una prueba invasiva que de momento no se realiza de forma rutinaria. 72 1.7 Tratamiento en la enfermedad de Parkison 1. 7.1 Primera línea. Tratamiento farmacológico La mayoría de los fármacos desarrollados hasta el momento para la EP apuntan a la señalización de la DA con el fin de aliviar los síntomas motores, motivo de consulta de los pacientes con EP. El patrón oro para el tratamiento de los síntomas motores es la levodopa, un precursor de la DA, y lo ha sido desde su introducción a principios de los años 60. Desafortunadamente, el uso a largo plazo de la levodopa (5-10años) no evita la progresión de la enfermedad, siendo ineficaz para algunos síntomas que no responden al estímulo dopaminérgico, asociándose, en general, con complicaciones que pueden resultar incapacitantes (Scottish Intercollegiate Guidelines Network, 2010). Se han desarrollado diferentes agonistas de la dopamina (AD) que proporcionan un control moderado de los síntomas motores y muestran la disminución de la frecuencia de complicaciones motoras. De este modo, y en dependencia de la edad y otros factores del sujeto, se recomiendan los AD para la EP en fase temprana, y, a medida que la EP progresa y alcanza las fases moderada y severa, realizar un tratamiento combinado de levodopa y otros fármacos (Escamilla-Sevilla F et al., 2017). Levodopa. También conocida como L-dopa, es un precursor del neurotransmisor DA. Posee la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica, mientras que la DA no la posee, haciéndola ideal como tratamiento para la depleción de la DA endógena en la EPI. Sin embargo, la L-dopa puede ser convertida a DA en el sistema nervioso periférico por la DA carboxilasa antes de alcanzar el sistema nervioso central. Por lo tanto, es administrada en combinación con inhibidores de la DA descarboxilasa (IDDC) para evitar la conversión prematura (Tomlison CL et al.,2010). Los IDDC no pueden atravesar la barrera hematoencefálica, de manera que se inhibe la conversión periférica pero no en el sistema nervioso central. Al administrase junto con la L-dopa, permiten el tratamiento con dosis menores de L-dopa. No se asocian efectos adversos propios a los IDDC. Los efectos adversos comunes de la L-dopa son las complicaciones motoras como se muestra en la tabla 8. 73 Tabla 8. Complicaciones motoras asociadas al tratamiento con levodopa Desgaste: el tratamiento inicial con levodopa DA proporciona 8 horas de alivio sintomático; no obstante, puede haber un efecto de “desgaste” antes de la siguiente dosis. Después de varios años de uso y progresión de la enfermedad, el “desgaste” ocurre más rápidamente tras la administración de la dosis Fluctuaciones motoras: algunos pacientes pueden experimentar fluctuaciones súbitas en el control motor, que pueden no estar relacionadas con el momento de la toma. Este fenómeno se denomina fluctuación motora impredecible o fenómeno “on-off” Discinesias: algunos pacientes experimentan movimientos involuntarios anormales (discinesias), de los cuales hay múltiples tipos, tales como corea o distonía. Los episodios de discinesia corresponden a picos, depresiones (o ambos) de las concentraciones plasmáticas de levodopa, y se observan entre los 5-10 años de tratamiento Inhibidores de la catecol-orto-metiltransferasa (ICOMT). Los ICOMT inhiben la acción de la catecolortometiltransferasa, enzima que degrada neurotransmisores, entre ellos la dopamina. Se administran siempre en combinación con L-dopa/IDDC para prolongar su vida media, pero no se recomienda como monoterapia. Han demostrado ser efectivos para el tratamiento de las complicaciones motoras del tratamiento con L-dopa por lo tanto son una herramienta adyuvante en la EP avanzada (Talati R et al, 2009). Los efectos adversos incluyen orina oscura (anaranjada) y exacerbación de los efectos de la L-dopa. Agonistas dopaminérgicos (AD). Son pequeñas moléculas que activan directamente los receptores de dopamina, compensando los bajos niveles de dopamina disponibles en el cerebro de un paciente con EP. Se clasifican en dos tipos: ergóticos y no ergóticos. Los AD ergos fuerticos son los primeros en desarrollarse, actúan sobre múltiples receptores y provocan importantes efectos secundarios. Los AD no ergóticos se desarrollaron posteriormente, actúan sobre menos tipos de receptores y producen menos efectos adversos. Los AD ofrecen un control moderado de los síntomas motores de la EP y se 80 totales de αSyn en LCR se reducen en pacientes con EP respecto a los controles, lo que podría relacionarse con el proceso de degeneración y muerte neuronal en los núcleos catecolaminérgicos (Shi et al, 2011; Mollenhauer et al, 2008, 2011, 2013; Hong et al, 2010; Kang et al, 2013; Fernández et al, 2013; Andersen et al, 2017; Goldman et al, 2018). Por otro lado, los niveles de αSyn en plasma/suero y saliva en la EP han arrojado resultados contradictorios (Barbour et al, 2008; Devic et al, 2011; Fernández et al. 2013; Stewart et al, 2014; Shi et al, 2014; Kang et al, 2016; Vivacqua et al, 2016, 2019; Goldman et al, 2018; Cao et al, 2019). Solo un estudio ha investigado las correlaciones entre el LCR, el plasma y la αSyn salivar en la EP (Goldman et al, 2018). Este estudio llamado BioFIND informa que los niveles de αSyn en LCR, plasma y saliva no están correlacionados entre sí. Varios estudios han examinado la relación de αSyn de plasma/suero y salival, con las características clínicas motoras y no motoras de la EP como la estadificación de Hoehn-Yahr o las escalas UPDR, con resultados contradictorios (Tokuda et al, 2006; Devic et al, 2011; Vivacqua et al, 2016; Goldman et al, 2018; Cao et al, 2019). Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha examinado la relación entre la αSyn salival y en plasma y las características no motoras o de neuroimagen de la EPi. Es de destacar que síntomas como la hiposmia, el estreñimiento o la depresión pueden anteceder en años a los síntomas motores (Reichmann, 2017), y sería de gran interés estudiar también su relación con los niveles de αSyn en los fluidos biológicos. Respecto a la degeneración neuronal catecolaminérgica que tiene lugar en la EP, debemos hablar de las neuronas pigmentadas que contienen dopamina. Dicha pigmentación es causada por la neuromelanina, y la muerte neuronal de DA en la EP se relaciona con una disminución del contenido de neuromelanina en la SN (Zecca et al. 2002; Wang et al. 2019). La síntesis de neuromelanina está impulsada por el exceso de dopamina en el citosol de las neuronas de dopamina, y se cree que la síntesis excesiva de neuromelanina podría desempeñar un papel en la neurodegeneración parkinsoniana (Sulzer et al. 2000; Hunot y Hirsch 2003; Jenner 2003; Norris et al. 2005; Paris et al. 2007; Zecca et al. 2008; Dias et al. 2014; Schapira et al, 2014; Navarro-Yepes et al, 2014; Segura-Aguilar et al, 2014; Carballo-Carbajal et al, 2019). Además de la neuromelanina, el cuerpo contiene melanina no neuronal o melanina propiamente dicha, que se 81 produce en los melanocitos e incluso en los plexos coroideos. Esta melanina se detecta principalmente en la piel, la mucosa, el cabello y la sangre. Sin embargo, no se conoce bien el papel que representa su presencia en suero y saliva en la EP. Además, las anomalías en la melanina se correlacionan con cánceres de piel como el melanoma, el cual se ha relacionado con un mayor riesgo de padecer neurodegeneración parkinsoniana (Pan et al. 2011). La hTyr es la enzima principal requerida para la síntesis de melanina (Körner y Pawelek 1982; Sánchez-Ferrer et al. 1995; Galzigna et al. 2000; Thompson et al. 2000; Pan et al. 2011). En el sistema nervioso, hTyr parece no participar en la síntesis de neuromelanina, y de hecho hay albinos sin hTyr funcional pero con neuromelanina en la SN (Foley y Baxter 1958). Además, la presencia de hTyr en los núcleos pigmentados del sistema nervioso central es controvertida (Xu et al. 1997; Tief et al. 1998; Greggio et al. 2005; Hasegawa 2010). Algunos autores han detectado la proteína hTyr en el cerebro humano (Miranda et al. 1984), pero no otros (Ikemoto et al, 1998; Tribl et al. 2007). La hTyr parece no estar relacionada con la EP (Greggio et al. 2005), aunque es llamativo que la pérdida de función hTyr en el albinismo se ha asociado a un mayor riesgo de EP (Lubbe et al. 2016). La síntesis de melanina podría ser llevada a cabo en el cerebro humano y en la periferia por enzimas distintas de la hTyr. Por ejemplo, las enzimas con actividad peroxidasa como la LPO y la DA beta-monooxigenasa podrían participar en la formación de melanina y neuromelanina (Metodiewa y Dunford, 1991; Segura-Aguilar 1996; Reszka et al.1998; Galzigna et al.2000). Con respecto a la LPO, se encuentra principalmente en las secreciones de las glándulas exocrinas, como la leche, las lágrimas y la saliva, donde protege contra bacterias y hongos (Bafort et al. 2014), y está relacionada con la "línea de defensa halogenativa". El exceso de actividad de LPO podría dar lugar a un aumento de radicales libres de melanina y estrés halogenativo (Reszka et al. 1998). Se ha encontrado que esta haloperoxidasa está elevada en el LCR de pacientes con EP, y se ha propuesto que participa en la neurodegeneración parkinsoniana (Everse y Coates 2004; Fernández-Espejo, 2019). En esta tesis doctoral se estudia el papel de estas enzimas relacionadas con la melanina y posiblemente con la EP, tanto en saliva como suero, dos fluidos periféricos. 82 Las hipótesis que se plantean en esta tesis doctoral son: 1. Las enzimas oxirreductasas, en particular la DEHAL1, contribuyen a la generación del extrés oxidativo en la EP y pueden relacionarse con las características clínicas y diferentes estadios de la EP. 2. La presencia de αSyn y sus niveles en suero y saliva son un marcador sensible e importante en la EPi. Además, se correlacionan con las características clínicas y diferentes estadios de la EP. 3. Existe una asociación entre los niveles de melanina no neuronal, hTyr y LPO en suero y saliva con las características clínicas y diferentes estadios de la EP. 83 CAPÍTULO III - OBJETIVOS El objetivo principal de esta tesis es: “Evaluar la presencia, importancia e implicación de los diferentes tipos de estrés oxidativo en la fisiopatología de la EP, así como analizar el comportamiento de diversas sustancias proteicas que participan en algún tipo de estrés oxidativo en el sistema nervioso central y correlacionarlo con las diferentes características clínicas y evolutivas de la enfermedad”. En base a este objetivo, planteamos unos objetivos secundarios: 1. Analizar la actividad de las enzimas DEHAL1 y correlacionarlo con las diferentes características clínicas y evolutivas de la enfermedad. 2. Analizar la actividad de la αSyn nativa y nitrada y correlacionarlo con las diferentes características clínicas y evolutivas de la enfermedad. 3. Analizar la actividad de la melanina no neuronal, hTyr y LPO y correlacionarlo con las diferentes características clínicas y evolutivas de la enfermedad. 84 85 CAPÍTULO IVMATERIAL Y MÉTODO  Selección de muestra Planteamos un estudio observacional, analítico tipo casos-controles de práctica clínica. Los pacientes y controles fueron seleccionados de forma aleatoria en los hospitales Macarena y Valme de Sevilla, dando su consentimiento informado para ser incluidos. Los pacientes fueron seleccionados de la Unidad de Trastornos del Movimiento de Neurología, diagnosticados de EP por neurólogos expertos en base a criterios clínicos y de neuroimagen (señal de ganglios basales en DAT-SPECT). Todos los pacientes estaban en tratamiento farmacológico en función de sus necesidades clínicas consistente en uno o más agentes dopaminérgicos, tenían una duración de la enfermedad > 3 años y una edad de aparición entre los 40 y 75 años. Para excluir las formas hereditarias de parkinsonismo, se descartaron aquellos pacientes con familiares con EP, menores de 40 años o con síntomas atípicos, siguiendo las recomendaciones de una guía española para neurólogos de la EP (Escamilla-Sevilla y Olivares-Romero 2018). Los sujetos controles, libres de trastornos neurológicos conocidos, fueron seleccionados de voluntarios sometidos a anestesia intradural en la Unidad de Anestesia del hospital Macarena, bajo la supervisión del Dr. Ángel Martín de Pablos, doctor anestesiólogo. Todos los sujetos controles fueron operados por fractura de cadera, hernia umbilical o cirugía perianal. La anestesia y la cirugía en sí no tuvieron impacto en los parámetros de biofluidos a analizar, porque todos los fluidos corporales se obtuvieron antes del procedimiento quirúrgico. También hubo controles procedentes de familiares de los pacientes, que no tuvieran alteración neurológica conocida o familiar de primer grado con EP. Los controles fueron agrupados por edad y sexo con los sujetos con EP, y fueron excluidos si tenían un familiar de primer grado con EP. En el estudio de DEHAL1 se obtuvieron 25 muestras de pacientes de EPi y 25 sujetos controles. Por motivos técnicos y de metodología (niveles alto de hemoglobina en saliva, recogida defectuosa, escasa cantidad), se aceptaron finalmente solo 15 86 muestras de suero y 20 de saliva de pacientes y 20 muestras tanto de saliva como de suero de los sujetos controles. En el estudio de αSyn nativa y 3-NT- αSyn, se obtuvieron 40 muestras de suero y 27 de saliva de pacientes y 20 muestras (suero y saliva) de los sujetos controles. En el estudio de melanina, hTyr y LPO se obtuvieron 25 muestras de suero y saliva de pacientes, pero se descartaron 4 muestras de saliva debido a una alta concentración de hemoglobina o problemas técnicos. De esta manera, se aceptaron finalmente 25 muestras de suero y 21 de saliva de pacientes y 20 muestras tanto de saliva como de suero de los sujetos controles. - Información demográfica y clínica La información demográfica se obtuvo directamente de los pacientes. Se incluyó edad, sexo, índice de masa corporal, educación (años) y tratamiento antiparkinsoniano (levodopa, AD y otros). No se incluyeron las personas que presentaban enfermedades hepáticas, renales, cardiovasculares o hematológicas, cáncer, trastornos autoinmunes o SIDA (los marcadores de suero y saliva pueden estar alterados en tales condiciones). Además, se excluyeron a aquellos sujetos que fueran fumadores, bebedores excesivos de alcohol o café, según los criterios especificados a continuación. El índice de “Fumar” se definió como el fumador actual que consumía cigarrillos a diario o los fumadores ocasionales que consumían cigarrillos menos que a diario. El abuso de alcohol se definió como beber> 210 g de alcohol por semana. Beber café se definió como la ingesta diaria de café con más de 300 mg de cafeína al día (por ejemplo, tres tazas de 45-60 ml de café expreso). - Datos clínicos de la EP Los datos clínicos incluyeron la estadificación de Hoehn-Yahr modificada, la Escala de calificación de la EP unificada UPDRS, la escala modificada de Schwab-England de actividades de la vida diaria, y un cuestionario no motor realizado para esta tesis doctoral y que se presenta en anexos (Hoehn y Yahr, 1967; Schwab-England, 1969; Fahn 87 y Elton, 1987; Fahn, 2003; Reichmann, 2017). Las escalas UPDRS se pasaron en su totalidad (parte I-II-III-IV). El cuestionario no motor incluyó síntomas como hiposmia/anosmia, estreñimiento, depresión, dolor/dolor de cabeza, trastornos urinarios/sexuales y trastornos del sueño. Se preguntó a los pacientes si sufrían o no uno o más síntomas no motores en el momento de la entrevista y antes del inicio de los síntomas motores. Se evaluaron también la edad de comienzo de la enfermedad, el año de primeros síntomas no motores y la duración de la enfermedad en años, según el primer síntoma motor referido por el paciente. Los estudios de referencia Dat-SPECT se realizaron de acuerdo con un protocolo estandarizado en el Servicio de Medicina Nuclear del Hospital (De Bonilla-Damiá et al, 2011). Se utilizó el DaTSCAN, que ha demostrado ser una herramienta de diagnóstico para clasificar el grado de pérdida de células dopaminérgicas. El 123I-Ioflupano tiene una alta afinidad de unión por el transportador presináptico de dopamina. Se calculó la unión específica del radioligando o la relación de absorción específica (SUR) en el estriado dorsal, caudado y putamen (Morano y Seibyl, 2003; Schwarz et al, 2004; Crespo et al, 2008; Maetzler et al, 2009; Varrone y Halldin, 2010; Fang et al, 2015; Niñerola- Bazán et al, 2018).  Recolección de muestras Todos los fluidos corporales se obtuvieron de 9:00 a 11:00 a.m. - Recolección de suero Se recogió suero sanguíneo por punción de la vena cefálica. Se recogieron 5 ml de sangre en tubos recubiertos de gel para inducir la coagulación de la sangre y para obtener suero (Becton Dickinson Vacutainer, Tubo de suero con activador de coágulo, cat. 368380). El suero se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos para separar las células coaguladas y atrapadas, y luego se congeló inmediatamente a -80ºC en alícuotas de 0,5 ml. 88 - Recolección de saliva Se ha seguido el siguiente protocolo: Precauciones previas a la recolección 1. Entre 30-60 minutos antes de la toma de la muestra no ingerir alimentos ni bebidas. 2. No fumar ni mascar chicles 30 minutos antes de la toma de la muestra. 3. Evitar productos de cosmética en los labios y zona peribucal el día de la toma. Pasos para la recolección 1. Sostener el tubo en posición vertical con una mano 2. Llenar el recipiente con saliva (sin contar la espuma) hasta alcanzar la señal del tubo (aproximadamente 2ml) 3. Utilizar el tapón para cerrar el tubo herméticamente Se recogieron 3 ml de saliva en tubos de polipropileno Greiner Bio-One de 5 ml (Fisher Scientific), y se centrifugaron a 2500 rpm durante 10 minutos para precipitar las células. Posteriormente, se congelaron alícuotas de 0,5 ml cada una de la porción líquida a -80ºC. La concentración de hemoglobina en una nueva alícuota de saliva de 0,5 ml se cuantificó según lo recomendado (Kang et al. 2013; Goldman et al. 2018), con una técnica ELISA (kit de detección colorimétrica de hemoglobina, cat. #EIAHGBC, ThermoFisher Scientific). Aquellas muestras con concentración de hemoglobina> 1200 mg / ml fueron descartadas.  Análisis de bioespecímenes Las alícuotas de suero y saliva, recuperadas del biobanco de Hospitales de Sevilla, se descongelaron y fueron sonicadas con solución homogeneizadora (NaCl 150 mM, HEPES 50 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, leupeptina 0,6 µm, y Triton X-100 al 1%, pH 7,4). Con el fin de evitar diferencias por localización y uso del análisis, el estudio se hizo en muestras no descongeladas previamente, en el mismo laboratorio y con el mismo personal técnico. 89 En el estudio de la DEHAL1, se ha evaluado dicha enzima por medio de kits ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se ha empleado el kit “Human Iodotyrosine Dehalogenase 1 (IYD) Elisa kit, number MBS7217967, de MyBioSource. Cada muestra se analizó por duplicado con cada kit ELISA (suero, dilución 1/200; saliva, sin dilución). Para el estudio de αSyn nativa y 3-NT- αSyn, el contenido de αSyn en los fluidos se evaluó con un kit de ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas disponible comercialmente (kit ELISA de αSyn humana, cat. YHB0151Hu, Shanghai Yehua Biological Technology Co., Ltd., China), siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada muestra se analizó por duplicado con cada kit ELISA. Hasta la fecha, no existen kits ELISA para cuantificar la 3-NT- αSyn por lo que solo se evaluó con inmunotransferencia tipo Western. Las muestras se lisaron en glicerol al 10%, NaCl 137 mM y Tris HCl 20 mM pH 7,5, que contenía inhibidores de peptidasa (aproteinina y leupeptina 1 µg / ml, PMSF 1 mM). Los niveles de proteínas se cuantificaron mediante el método de Bradford. Las muestras se hirvieron y las alícuotas que contenían 25 µg de proteína cada una se sometieron a electroforesis en gel de SDS/poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a membranas de PVDF. El inmunomarcaje se realizó con anticuerpos primarios para αSyn nativa (anticuerpo monoclonal contra αSYN, ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Syn211, cat. #32-1800), 3-NT-αSyn (anticuerpo anti-nitro-α/β-sinucleína, clon nSyn12, cat. 36-011, Merck) y β-actina como proteína de control (anticuerpo anti-beta actina, gato A5316, Merck). Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos secundarios unidos a peroxidasa con quimioluminiscencia mejorada y autorradiografía. Las densidades de banda de los autoradiogramas resultantes se cuantificaron utilizando el programa Scion Image para PC (NIH, EE. UU.). La densidad de las bandas de proteínas se midió en unidades arbitrarias de Scion. Los valores se dan como proporción de la densidad de la banda 3-NT- αSyn versus la densidad de la banda control de β-actina. Para el estudio de melanina, hTyr y LPO en saliva y suero de enfermos de EPi, las concentraciones de melanina, hTyr y LPO se evaluaron con kits ELISA o de inmunoadsorción ligados a enzimas disponibles en el mercado (kit ELISA de melanina 96 2.Estudios sobre α-sinucleína nativa y nitrada en saliva y suero, y su relación con características clínicas en la enfermedad de Parkinson idiopática  Características de los participantes Las características demográficas y clínicas principales no fueron diferentes entre los controles y los pacientes con EP (Tabla 12). Tabla 12. Parámetros clínicos en pacientes con EP y controles Clinical parameters EP (n=56) Control (n=20) P Edad (Años) 63,2±15 59.6±17 NS Género, masculino n (%) 30(53,5) 8 (40) NS Índice de masa corporal 24,3±2 24,4±3,5 NS Educación (años) 17,1±3,2 17,4±3,3 NS L-Dopa n (%) 14 (25) Dosis de L-Dopa (mg por día) 439±75 Agonista dopaminérgico n (%) 21 (37,5) Duración de la enfermedad (años) 11,4±7,5 Edad al inicio de la EP (años) 55,8±12,9 Etapa Hoehn-Yahr 2,2±0,8 Schwab-Inglaterra modificada 84±20 UPDRS parte III (on) 22,8±14 UPDRS total (I-III) (on) 36,3±23 UPDRS parte IV 1,1±2,3 Media ± DEM. Abreviaturas: EP, enfermedad de Parkinson; NS, no significativo; UPDRS, Escala de calificación de la enfermedad de Parkinson unificada; P, probabilidad. 97  αSyn en pacientes con EP y controles Los niveles de αSyn nativa en suero y en saliva de enfermos de EP y de controles se presentan en la tabla 13. Tabla 13. Concentración en suero y saliva y ratio saliva/suero de αSyn en pacientes con EPi y sujetos control Concentración de αSyn EPi Control P Suero (pg/ml) 102421±44317 (n=40) 109643±40868 (n=20) NS Saliva (pg/ml) 367,7±91 (n=27) 362,5±79 (n=20) NS Ratio saliva/suero Epi Control αSyn nativa 0,005±0,001 0,003±0,002 NS Media ± DEM. Abreviaturas: EPi, enfermedad de Parkinson idiopática; αSyn, α-sinucleina; NS, no significativo; P, probabilidad. Los niveles de αSyn en suero y saliva no difirieron entre pacientes y controles. No se encontró correlación entre el contenido de αSyn en suero y saliva (r =.038, NS). Los valores individuales de la concentración de αSyn en suero y saliva se presentan en la figura 15. 98 Figura 15. Concentración individual de αSyn en (A) suero y (B) saliva en pacientes con EPi y sujetos de control. La media y la desviación estándar se representan con líneas continuas. Abreviatura: αSyn, α-sinucleína. Número de participantes: pacientes (suero, 40; saliva, 27), controles (20 de cada grupo de biofluidos)  Correlaciones clínicas de αSyn sérico y salival Las ratios αSyn nativa de saliva/suero fueron en pacientes de ~1:200 y en controles de ~1:300, lo que confirma su falta de correlación. No se encontraron correlaciones estadísticas entre los niveles séricos de αSyn y los parámetros clínicos. En la saliva, se encontró que el nivel de αSyn salival estaba correlacionado con la puntuación motora UPDRS o parte III (r = +0.542, p = 0.0062) y el UPDRS total (r = +0.524, p = 0.0086), como se muestra en la Figura 16. La correlación positiva indica que hay un incremento progresivo de los niveles de αSyn salival con el deterioro motor de la enfermedad, pero sin llegar a existir diferencias significativas. 99 Se observó en la saliva (n=27) que la presencia (n = 15) o ausencia (n = 12) de algún síntoma no motor de los estudiados está altamente correlacionada con los niveles de αSyn salival (r = 0.669, p <0.0001). Se empleó la escala de síntomas no motores desarrollada (ver anexos). Se encontró que los niveles de αSyn salival eran significativamente más bajos en pacientes que informaron sobre la presencia de síntomas no motores que en los restantes (con síntomas no motores, 308,2 ± 42 pg/ml; sin síntomas no motores, 425,9 ± 89 pg/ml; t = 4,5439, p <0.0001). Los niveles individuales de αSyn en la saliva en estos dos grupos de pacientes se muestran en la Figura 17. Con respecto a los subgrupos de pacientes con síntomas no motores (n=15), el número de pacientes que sufren cada uno de ellos fue el siguiente: estreñimiento, n= 8; depresión, n= 7; hiposmia, n= 2; dolor/dolor de cabeza, n= 3. Los niveles de αSyn en los dos subgrupos con mayor número de participantes fueron los siguientes: estreñimiento, 301,2 ± 49 pg / ml; depresión, 310,6 ± 42 pg / ml; ambos grupos p <0,001 versus pacientes sin síntomas no motores y controles). Figura 16. Correlaciones entre la αSyn salival y (A) UPDRS total y (B) UPDRS motora o parte III, en pacientes con EPi. Abreviaturas: UPDRS, escala unificada de clasificación de la enfermedad de Parkinson. Número de participantes: pacientes, 27; controles, 20. 100 Figura 17. Contenido individual de αSyn en saliva en pacientes con EPi con o sin síntomas no motores. Abreviaturas: αSyn, α-sinucleína.  Análisis de inmunotransferencia de αSyn nativa y 3-NT- αSyn en saliva La transferencia Western reveló la presencia de 3-NT-αSyn en la saliva, aparte de la proteína nativa, tanto en pacientes como controles (Figura 17). No se encontraron diferencias significativas en las ratios de densidad de αSyn/β-actina y 3-NT-αSyn/βactina entre pacientes y controles, como se muestra en la Figura 18. Los valores fueron: ratio de αSyn/β-actina (unidades Scion), pacientes, 0,61±0,1; controles, 0,58±0,1; ratio de 3-NT-αSyn/β-actina, pacientes, 0,34±0,1; controles, 0,32±0,1; media±DEM). 101 El monómero αSyn posee una masa molecular de ~ 14.4 kDa; sin embargo, las bandas de proteína αSyn y 3-NT-αSyn se detectaron en puntos de masa molecular que varían de 50 a 75 kDa, lo que sugiere que la molécula αSyn nitrada está presente como una molécula tetramérica. No se detectaron correlaciones clínicas entre la densidad de bandas de αSyn nativa y 3-NT-αSyn y los parámetros clínicos evaluados. Figura 18. Análisis de inmunotransferencia de (A) proteína αSyn salivar y (B) proteína 3-NT- αSyn salival. (A) Dos inmunotransferencias representativas de controles y pacientes con EPi después de la inmunotinción contra la proteína αSyn y β-actina sérica. (B) Dos inmunotransferencias representativas de controles y pacientes con EPi después de la inmunotinción contra la proteína salina 3-NT-αSyn y β-actina. Abreviaturas: αSyn, α-sinucleína; 3-NT-αSyn, 3-nitrotirosina α-sinucleína; EPi, enfermedad parkinson idiopático; c, control; p, paciente con EP. 102 3. Estudio de melanina, tirosinasa humana y lactoperoxidasa en saliva y suero de enfermos de Parkinson idiopático  Características de los participantes No se encontraron diferencias significativas entre las características clínicas y demográficas de los controles y los pacientes con EP, como se muestra en la tabla 14. Tabla 14. Parámetros clínicos en pacientes con EP y controles Parámetros clínicos EP (n=42) Control (n=20) P Edad (años) 64,5±15 65,3±14,5 NS Género, masculino n (%) 20(42) 8 (40) NS Índice de masa corporal 24,1±3 24,2±3,5 NS Educación (años) 17,2±3,1 17,3±3,5 NS L-Dopa n (%) 29 (60) Dosis de L-Dopa (mg por día) 608,3±72 Agonista dopaminérgico n (%) 19 (40) Duración de la enfermedad (años) 12±7,4 Edad al inicio de la EP (años) 56,6±13 Etapa Hoehn-Yahr 2,2±0,8 Schwab-England modificada 81±23 UPDRS parte III (fase ON) 21,2±14,9 UPDRS total (I-III) (fase ON) 34±23 UPDRS parte IV 1,3±2,6 Media ± DE. Abreviaturas: EP, enfermedad de Parkinson; NS, no significativo; UPDRS, Escala de calificación de la enfermedad de Parkinson unificada; P, probabilidad 103  Contenido sérico y salival de melanina, hTyr y LPO Se detectó melanina en todos los biofluidos, y no se encontró que sus niveles fueran significativamente diferentes entre los pacientes con EP y los controles. En cuanto a la hTyr, se encontraron niveles tanto en suero como en saliva, dato importante pues no se detecta en tejido cerebral humano según diversos autores. Además, se encontró que los niveles de suero y saliva de hTyr eran similares en pacientes y controles. Por otra parte, la LPO estaba presente en todos los fluidos. No se encontró que los niveles de LPO en suero y saliva fueran diferentes entre pacientes y controles. Las ratios saliva/suero de todas las moléculas fueron similares en pacientes y controles, como se muestra en la Tabla 15. Tabla 15. Contenido, ratio saliva/suero de melanina, hTyr y LPO en suero y saliva en pacientes con EPi sujetos de control Suero Epi Control Melanina (pg / ml) 89,75±25,8 78,65±31,1 NS Tirosinasa (pg / ml) 6,588±2,528 5,511±3,005 NS LPO (ng / ml) 1.024±412 951,2±394 NS Saliva Melanina (pg / ml) 160,78±26 169,7±22,8 NS Tirosinasa (pg / ml) 5,070±3,933 4,457±1,684 NS LPO (ng / ml) 7,08±4,3 7,67±4,1 NS Relación saliva/suero Melanina 1,81±0,85 2,43±0,96 NS Tirosinasa 1,23±0,74 1,21±1,05 NS LPO 0,014±0,02 0,011±0,01 NS Media ± DE. Abreviaturas: EPi, enfermedad de Parkinson idiopática; LPO, lactoperoxidasa; NS, no significativo. 104 Los niveles individuales en suero y saliva de melanina, hTyr y LPO se presentan en las figuras 19 y 20 respectivamente. Se observa que no hay diferencias significativas entre pacientes y controles. Figura 19. (A) Contenido de melanina individual (pg /ml) en suero en pacientes con EPi y controles. (B) Contenido individual de hTyr (ng /ml) en suero en pacientes y controles. (C) Contenido individual de LPO (ng/ml) en suero en pacientes con EPi y controles. Número de participantes: pacientes, 25; controles, 20. La media y la DEM se representan con líneas continuas. 105 Figura 20. (A) Contenido de melanina individual (pg/ml) en saliva en pacientes con EPi y controles. (B) Contenido individual de hTyr (ng/ml) en saliva en pacientes y controles. (C) Contenido individual de LPO (ng/ml) en saliva en pacientes con EPi y controles. Número de participantes: pacientes, 21; controles, 20. La media y la desviación estándar se representan con líneas continuas. 112 glándulas salivares con el curso de la enfermedad como se sabe, ello podría afectar al contenido de melanina salival. Respecto a la hTyr, se ha comentado que es la enzima principal requerida para la síntesis de melanina (Körner y Pawelek 1982; Sánchez-Ferrer et al. 1995; Galzigna et al. 2000; Thompson et al. 2000; Pan et al. 2011). En el sistema nervioso, hTyr parece no participar en la síntesis de neuromelanina, y de hecho hay albinos sin hTyr funcional pero con neuromelanina en la sustancia negra (Foley y Baxter 1958). Por tanto, la hTyr cerebral parece no estar relacionada con la EP (Greggio et al. 2005), aunque es llamativo que la pérdida de función de hTyr general en el albinismo se ha asociado a un mayor riesgo de EP (Lubbe et al. 2016). Este hecho podría relacionarse con la hTyr fuera del sistema nervioso, la cual hemos estudiado en suero y saliva. Los resultados indican que la hTyr sérica guarda cierta relación con un parámetro clínico, que es el tiempo de evolución de la EP. Como ocurre con la melanina salival, no está claro el significado de este decremento de hTyr sérica con el curso de la enfermedad. Como se ha dicho, la hTyr general se ha relacionado con un mayor riesgo de padecer la EP, y podría existir una relación entre esta enzima y el curso de la enfermedad. Esto requiere más estudios. Respecto a la LPO, esta enzima se relaciona con los mecanismos de síntesis de melanina y neuromelanina y con el estrés peroxidativo (Metodiewa y Dunford, 1991; Segura-Aguilar, 1996; Rezka et al, 1998). La LPO es principalmente una molécula antimicrobiana, de carácter halogenativo/peroxidativo, y en los procesos de peroxidación facilita la síntesis de radicales oxidativos y derivados de melanina (Dexter et al, 1986, 1989; Galzigna et al, 2000; Buhmann et al, 2004; Shamoto-Nagai et al, 2007; Bafort et al, 2014; Navarro-Yepes et al, 2014; Martin de Pablos et al, 2015). Por ejemplo, produce dopaminocromos desde la melanina, que son moléculas oxidantes que aceleran la progresión de la enfermedad y facilitan la agregación de la αSyn (Norris et al, 2005; Paris et al, 2007). Por su relación con derivados oxidativos de la melanina y el estrés peroxidativo, ha sido estudiada en esta tesis. No se ha observado ningún cambio del contenido de LPO en suero o saliva en los pacientes, ni ninguna correlación con parámetros clínicos. Ello indica que la LPO sérica y salival no intervienen en la 113 sintomatología de la EP. Finalmente, los niveles de melanina, hTyr o LPO en suero y saliva no están correlacionados entre sí, indicando que no hay un origen común entre estas moléculas. En conclusión, se ha observado en el estudio que los niveles de melanina salival y la hTyr en suero se reducen con el progreso de la EP, lo que sugiere que podrían ser indicadores periféricos útiles para valorar la progresión de la EP. mi Limitaciones y fortaleza del estudio Finalmente, es necesario señalar que los estudios descritos en esta tesis doctoral tienen algunas limitaciones que deben reconocerse. En nuestro estudio no podemos inferir causalidad, porque es un diseño de casos-controles. El tamaño muestral fue relativamente pequeño, y la generalización de los resultados del estudio está limitada por él. Además, los sesgos de selección e información hacen carecer de correlaciones clínico-patológicas por lo que impiden las asociaciones neuropatológicas. Sin embargo, las fortalezas de nuestro estudio incluyen una población de pacientes que fue cuidadosamente seleccionada, estudiada con una valoración completa, sistemática y exhaustiva de la situación clínica de su enfermedad, tratando de evitar cualquier fuente de sesgo, y la medición simultánea de proteínas y enzimas a través de varias fuentes de biofluidos. 114 115 CAPÍTULO VII - CONCLUSIONES 1. Los niveles de DEHAL1 salival y sérica en pacientes y controles son similares. Por tanto, no son marcadores válidos para el diagnóstico de la EP. 2. La enzima DEHAL1 de la saliva se correlaciona con la enzima DEHAL1 sérica, siendo la relación saliva/sangre ~1:250 en todos los sujetos. Ello indica que la enzima DEHAL1 de la saliva es formada a partir de la sangre, y, por tanto, no se afecta con la enfermedad. 3. Hay una correlación inversa entre el contenido de DEHAL1 en saliva, la escala de Hoehn-Yahr y el déficit motor en la EP medido por la escala UPDRS parte III. Existiendo una disminución progresiva de la cantidad y actividad de la DEHAL1 (hasta ahora no valoradas en estudios previos), lo que posiblemente influya en la sintomatología motora de la EP, siendo de utilidad como biomarcador para predecir o discernir la gravedad clínica de la enfermedad. 4. Los niveles de αSyn nativa séricos y salivares son similares en pacientes y controles, por lo que no serían marcadores válidos para el diagnóstico de la EP. 5. Los niveles de αSyn nativa en suero y saliva no están correlacionados entre sí, siendo moléculas de distinto origen. 6. Se demuestra la presencia de 3-NT- αSyn en saliva (estudiada por primera vez en la EP) tanto en pacientes como controles, sin diferencias entre ambos grupos por lo cual, no constituiría un marcador válido para el diagnóstico de la EP. 7. La αSyn nativa y la 3-NT- αSyn salival se detectan con una masa molecular de 50 a 75 kDa, lo cual indica que se encuentran en forma tetramérica en la saliva, no monomérica ni dimérica. El significado biológico de este hecho no es conocido. 8. Hay una correlación directa entre los niveles de αSyn nativa salival y la sintomatología motora y global medida por la escala UPDRs. Existiendo un aumento paralelo de los niveles de αSyn en relació a la gravedad de la EP. 116 9. Los niveles salivares de αSyn son significativamente más bajos en pacientes que presentan síntomas no motores que en aquellos sin dichos síntomas, independintemente del estadio de la EP. 10. Por tanto, el nivel salival de αSyn sería un indicador de fácil acceso, útil para discernir la gravedad clínica motora y la presencia/ausencia de síntomas no motores. Siendo los síntomas no motores más correlacionados con sus niveles, según nuestro estudio, el estreñimiento y la depresión. 11. No se han detectado diferencias en los niveles de melanina, hTyr o LPO en suero ni saliva entre pacientes y controles. No son marcadores válidos para el diagnóstico de la EP. Además, no encontramos correlaciones entre los niveles de estos marcadores. 12. La melanina salival y la hTyr sérica tienen una correlación inversa con la duración de la EP, y por tanto podrían ser indicadores de los años de evolución de la EP. 117 BIBLIOGRAFÍA Adler CH, Dugger BN, Hinni ML, Lott DG, Driver-Dunckley E, Hidalgo J, Henry-Watson J, Serrano G, Sue L.I, Nagel T, Duffy A, Shill H.A, Akiyama H, Walker DG, Beach TG. Submandibular gland needle biopsy for the diagnosis of Parkinson disease. 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Alteración funcional discreta, pero evidente en el hogar con necesidad de recordarle ocasionalmente las cosas. 3 = Pérdida grave de memoria con desorientación temporal y, con frecuencia, espacial. La capacidad para resolver problemas está muy alterada. 4 = Pérdida grave de memoria, conservando solamente la orientación personal. Incapacidad para elaborar juicios o resolver problemas. Requiere mucha ayuda para mantener el cuidado personal. No se puede quedar solo 2. TRASTORNOS DEL PENSAMIENTO (Por demencia o intoxicación por fármacos): 0 = No hay. 1 = Ensueños vívidos. 2 = Alucinaciones «benignas», conservando la capacidad de discernir. 3 = Alucinaciones o delirios de ocasionales a frecuentes. Sin capacidad de discernir. Pueden interferir con las actividades diarias. 4 = Alucinaciones o delirios persistentes o psicosis florida. Incapaz de cuidar de sí mismo. 3. DEPRESIÓN: 0 = No hay. 1 = Períodos de tristeza o sentimientos de culpa mayores de lo normal, aunque nunca mantenidos durante días o semanas. 2 = Depresión mantenida (1 semana o más). 150 3 = Depresión mantenida con síntomas vegetativos (insomnio, anorexia, pérdida de peso, pérdida de interés). 4 = Depresión mantenida, con síntomas vegetativos y pensamientos o intento de suicidio. 4. MOTIVACIÓN-INICIATIVA: 0 = Normal. 1 = Menos pujante de lo habitual; más pasivo. 2 = Pérdida de iniciativa o desinterés en cuanto a actividades opcionales (no rutinarias). 3 = Pérdida de iniciativa o desinterés en las actividades de cada día (rutinarias). 4 = Aislado, apartado; pérdida total de la motivación. PUNTUACIÓN TOTAL SUBESCALA I: /16. II. ACTIVIDADES DE LA VIDA DIARIA 5. LENGUAJE: 0 = Normal 1 = Discretamente alterado. No hay dificultad para entender 2 = Moderadamente alterado. A veces hay que pedirle que repita algo. 3 = Muy alterado. Hay que pedirle con frecuencia que repita. 4 = Ininteligible la mayor parte del tiempo. 6. SALIVACIÓN: 0 = Normal. 1 = Exceso de saliva en la boca, discreto pero evidente; puede haber babeo durante la noche. 2 = Moderado exceso de saliva; puede haber mínimo babeo. 3 = Marcado exceso de saliva con cierto grado de babeo. 4 = Marcado babeo; requiere constantemente gasa o pañuelo. 7. DEGLUCIÓN: 0 = Normal. 1 = Rara vez se atraganta. 2 = Se atraganta ocasionalmente. 3 = Requiere dieta blanda. 4 = Requiere alimentación por sonda nasogástrica o gastrostomía. 8. ESCRITURA: 0 = Normal 1 = Discretamente lenta o pequeña. 2 = Moderadamente lenta o pequeña; todas las palabras son legibles. 3 = Muy alterada; no son legibles todas las palabras. 4 = La mayoría de las palabras son ilegibles. 9. CORTAR ALIMENTOS Y MANEJAR CUBIERTOS: 0 = Normal. 1 = Algo lento y torpe, pero no necesita ayuda. 2 = Puede cortar la mayoría de los alimentos, aunque con torpeza y lentitud; necesita cierta ayuda. 3 = Le tienen que cortar los alimentos, pero aún puede alimentarse con lentitud. 4 = Necesita ser alimentado. 151 10. VESTIDO: 0 = Normal. 1 = Algo lento, pero no requiere ayuda. 2 = Requiere ayuda en ocasiones para abotonarse, introducir los brazos por las mangas. 3 = Requiere bastante ayuda, puede hacer algunas cosas solo. 4 = Incapacitado. 11 HIGIENE: 0 = Normal 1 = Algo lento, pero no necesita ayuda. 2 = Necesita ayuda para ducharse o bañarse, o es muy lento en las actividades higiénicas 3 = Requieren ayuda para lavarse, cepillarse los dientes, peinarse, ir al retrete. 4 = Sonda de Foley u otras ayudas mecánicas. 12 DAR VUELTAS EN CAMA Y AJUSTAR LA ROPA DE CAMA: 0 = Normal. 1 = Algo lento y torpe, pero no precisa ayuda. 2 = Puede volverse solo o ajustar las sábanas, pero con gran dificultad. 3 = Puede iniciar la acción, pero no puede volverse o ajustar las sabanas solo. 4 = Incapacitado. 13. CAÍDAS (Sin relación con el fenómeno de "congelación"): 0 = Ninguna. 1 = Rara vez. 2 = Se cae ocasionalmente (menos de una vez al día). 3 = Se cae un promedio de una vez al día. 4 = Se cae más de una vez al día. 14. "CONGELACIÓN" AL CAMINAR: 0 = No hay. 1 = Rara vez aparece «congelación» al caminar; puede haber titubeo al inicio. 2 = «Congelación» ocasional al caminar. 3 = «Congelación» frecuente. A veces se cae por causa de este fenómeno. 4 = Caídas frecuentes por «congelación». 15. CAMINAR: 0 = Normal. 1 = Leve dificultad. Puede no balancear los brazos o puede tender a arrastrar las piernas. 2 = Dificultad moderada, pero requiere poca o ninguna ayuda. 3 = Trastorno grave de la marcha que requiere ayuda. 4 = No puede caminar, incluso con ayuda. 16. TEMBLOR: 0 = Ausente. 1 = Discreto; infrecuentemente presente. No resulta molesto para el paciente. 2 = Moderado; molesto para el paciente. 3 = Intenso; interfiere con muchas actividades. 4 = Marcado; interfiere la mayoría de las actividades. 17. SINTOMAS SENSORIALES RELACIONADOS CON EL PARKINSONISMO 152 0 = Normal 1 = Ocasionalmente tiene entumecimiento, hormigueo o dolorimiento discreto. 2 = Con frecuencia tiene entumecimiento, hormigueo o dolormiento discreto; no resulta penoso. 3 = Frecuentes sensaciones dolorosas 4 = Dolor extremo. PUNTUACION TOTAL SUBESCALA II: /52 III. EXPLORACIÓN DE ASPECTOS MOTORES 18. LENGUAJE: 0 = Normal. 1 = Pérdida discreta de expresión, dicción y/o volumen. 2 = Monótono; farfullado, pero comprensible; moderadamente alterado. 3 = Muy alterado, difícil de comprender. 4 = Ininteligible. 19. EXPRESIÓN FACIAL: 0 = Normal. 1 = Mínima hipomimia; podría ser una cara inexpresiva («cara de póker») normal. 2 = Disminución discreta, pero claramente anormal, de la expresión facial. 3 = Hipomimia moderada; labios separados la mayor parte del tiempo. 4 = Cara «de máscara» o expresión fija con pérdida acusada o completa de la expresión facial; labios separados más de 6 mm. 20. TEMBLOR DE REPOSO EN MMSS: 0 = Ausente. 1 = Discreto e infrecuentemente presente. 2 = Discreto en amplitud y persistente, o de amplitud moderada pero presente sólo de forma intermitente. 3 = De amplitud moderada y presente la mayor parte del tiempo. 4 = De gran amplitud y presente la mayor parte del tiempo. 21. TEMBLOR DE REPOSO EN MMII: 0 = Ausente. 1 = Discreto e infrecuentemente presente. 2 = Discreto en amplitud y persistente, o de amplitud moderada pero presente sólo de forma intermitente. 3 = De amplitud moderada y presente la mayor parte del tiempo. 4 = De gran amplitud y presente la mayor parte del tiempo. 22. TEMBLOR DE ACCION O POSTURAL DE LAS MANOS: 0 = Ausente. 1 = Leve; presente con la acción. 2 = De amplitud moderada; presente con acción. 3 = De amplitud moderada al mantener la postura en el aire; así como con la acción. 4 = De gran amplitud; interfiere la alimentación. 23. RIGIDEZ AXIAL: (Valorada según el movimiento pasivo de las grandes articulaciones, con el paciente relajado y sentado). 153 0 = Ausente. 1 = Discreta o detectable solamente cuando se activa por movimientos en espejo o de otro tipo. 2 = Discreta a moderada. 3 = Intensa pero se consigue con facilidad el movimiento en toda su amplitud. 4 = Muy intensa; la amplitud del movimiento se logra con dificultad. 24. RIGIDEZ EN MMSS: (Valorada según el movimiento pasivo de las grandes articulaciones, con el paciente relajado y sentado. No considerar la rigidez «en rueda dentada»): 0 = Ausente. 1 = Discreta o detectable solamente cuando se activa por movimientos en espejo o de otro tipo. 2 = Discreta a moderada. 3 = Intensa, pero se consigue con facilidad el movimiento en toda su amplitud. 4 = Muy intensa; la amplitud del movimiento se logra con dificultad. 25.RIGIDEZ EN MMII. (Valorada según el movimiento pasivo de las grandes articulaciones, con el paciente relajado y sentado. No considerar la rigidez «en rueda dentada»): 0 = Ausente. 1 = Discreta o detectable solamente cuando se activa por movimientos en espejo o de otro tipo. 2 = Discreta a moderada. 3 = Intensa, pero se consigue con facilidad el movimiento en toda su amplitud. 4 = Muy intensa; la amplitud del movimiento se logra con dificultad. 26. GOLPETEO DE LOS DEDOS. (El paciente golpea el pulgar con el índice en rápida sucesión y con la mayor amplitud posible; realizar con cada mano por separado). 0 = Normal (15/5 segundos). 1 = Enlentecimiento discreto y/o reducción de la amplitud (11-14/5 segundos). 2 = Moderadamente alterado. Fatigoso de manera evidente y precoz. Puede haber detenciones ocasionales en el movimiento (7-10/5 segundos). 3 = Muy alterado. Frecuentes titubeos al iniciar los movimientos o detenciones mientras se realiza el movimiento (3-6/5 segundos). 4 = Apenas puede realizar la acción (0-2/5 segundos). 27. MOVIMIENTOS ALTERNANTES CON LAS MANOS. (El paciente abre y cierra las manos rápida sucesión con la mayor amplitud posible). 0 = Normal. 1 = Discreto enlentecimiento y/o reducción de la amplitud. 2 = Alteración moderada. Fatigoso de manera evidente y precoz. Puede haber detenciones ocasionales en el movimiento. 3 = Muy alterados. Frecuentes titubeos al iniciar los movimientos o detenciones mientras se realizan los movimientos. 4 = Apenas puede realizarlos. 28. MOVIMIENTOS RAPIDOS ALTERNANTES DE MMSS. (movimientos de pronación-supinación de las manos, en sentido vertical, con la mayor amplitud posible y simultáneamente con ambas manos): 0 = Normal 1 = Discreto enlentecimiento y/o reducción en amplitud.