Biopolímeros microbianos: aplicaciones en biomedicina y farmacia

BIOPOLÍMEROS MICROBIANOS: APLICACIONES EN BIOMEDICINA Y FARMACIA NELA PATRICIA MANDUJANO TAZZA UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA 2 GRADO EN FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO BIOPOLÍMEROS MICROBIANOS: APLICACIONES EN BIOMEDICINA Y FARMACIA REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Autor: Nela Patricia Mandujano Tazza Tutora: Montserrat Argandoña Bertrán Departamento de Microbiología y Parasitología (Área Microbiología) Sevilla, junio de 2020 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA 3 RESUMEN Los biopolímeros están ganando interés no solo en la industria alimentaria, textil, agrícola, cosmética o como alternativa a los plásticos, sino también en el ámbito farmacéutico y biomédico. Estos polímeros pueden ser obtenidos a partir de fuentes animales, vegetales o microorganismos. Esta revisión se centrará en los biopolímeros que son obtenidos por fermentación microbiana ya que, a diferencia de las otras alternativas de producción, nos aporta ventajas como mayor rentabilidad del proceso, modificación de los microorganismos para incrementar la producción, uso de inductores específicos y mejora de las rutas de su biosíntesis. Los polihidroxialcanoatos y los exopolisacáridos microbianos son biopolímeros con mayor interés farmacéutico y biomédico. Los primeros se acumulan como gránulos insolubles en el interior de diversos microorganismos, los segundos, sin embargo, son producidos y secretados al exterior de la célula. Ambos biopolímeros microbianos se caracterizan por poseer propiedades especiales que otros polímeros sintéticos no tienen, como biocompatibilidad, biodegradabilidad y no toxicidad hacia las células y tejidos humanos o animales. Además, posibilitan la modificación de muchas de sus propiedades como la rigidez, elasticidad, cristalinidad y degradabilidad, de forma sencilla dando lugar a una mejor adaptación del biopolímero a su uso en diversas aplicaciones. Entre sus numerosas aplicaciones farmacéuticas destaca la modificación de la liberación del fármaco, trasporte dirigido del fármaco hacia su diana terapéutica, atravesar barreras fisiológicas y la protección de agentes terapéuticos inestables en condiciones fisiológicas. Así mismo, tienen un papel fundamental en aplicaciones biomédicas para la formación de productos sanitarios, como vendas y apósitos, andamios en ingeniería de tejido que son utilizados en la reparación de tejidos óseos, cartílagos, vasculares, piel, medula ósea y conductos nerviosos. También han demostrado ser buenos adyuvantes de vacunas y en sistemas de diagnóstico por imágenes, además, ciertos biopolímeros desempeñan actividades biológicas con potencial terapéutico. Palabras clave: Biopolymers, applications, biomedicine, polyhidroxyalkanoates, exopolysaccharides 4 GLOSARIO DE ABREVIATURAS 3HB: Ácido 3-hidroxibutírico 3HHx: Ácido 3-hidroxihexanoico 3HO: Ácido 3-hidroxioctanoico 3HV: Ácido 3-hidroxivalérico 4HB: Ácido 4-hidroxitírico ACP: acyl carrier protein Al2O3: Oxido de aluminio o alúmina CB: Celulosa bacteriana EPS: Exopolisacáridos HA: Ácido hialurónico MSC: Células madres mesenquimales NADPH: Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato P3HB4HB: poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) P(3HB): Poli(3-hidroxibutirato) P(3HV): Poli(3-hidroxivalerato) P(4HB): Poli(4-hidroxibutirato) P(4HV): Poli (4-hidroxivalerato) PHAs: Polihidroxialcanoatos PHB: Polihidroxibutirato. PHBHHX: poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) PHBHO: poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxioctanoato) PHBV: poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHHx (P3HHx): Poli (3-hidroxihexanoato) PHMV (P3MHV): Poli (3-hidroximetil-valerato) PHO (P3HO): Poli (3-hidroxioctanoato) PHP: Poli (3-hidroxipropionato) PLA: Ácido poliláctico PVOH: Alcohol polivinílico SEM: Microscopía electrónica de barrido UDP: Uridina difosfato 5 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 6 1.1 Clasificación de los biopolímeros .............................................................................. 7 2. OBJETIVOS DE LA REVISIÓN ........................................................................... 8 3. METODOLOGÍA .................................................................................................... 8 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 10 4.1 Polihidroxialcanoatos (PHAs) ................................................................................. 10 4.1.1 Clasificación y propiedades de PHAs ................................................................................. 11 4.1.2 Biosíntesis y producción de PHAs ...................................................................................... 13 4.1.3 Aplicaciones de los PHAs ................................................................................................... 15 4.1.3.1 PHAs en sistemas de vehiculización y administración de fármacos.............................. 16 4.1.3.2 PHAs en la ingeniería de tejidos .................................................................................... 17 4.2 Exopolisacáridos (EPS) microbianos ...................................................................... 19 4.2.1 Clasificación y propiedades de EPS ................................................................................... 20 4.2.2 Biosíntesis y producción de los EPS ................................................................................... 25 4.2.3 Aplicaciones de los EPS ..................................................................................................... 27 5. CONCLUSIONES ................................................................................................. 30 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 31 6 1. INTRODUCCIÓN Los biopolímeros se definen como polímeros biológicamente degradables que son producidos por organismos vivos y que no muestran un efecto negativo frente al medio ambiente (Pattanashetti et al., 2017). Son macromoléculas formadas por la unión covalente de pequeñas unidades moleculares llamadas mesómeros, que han sido obtenidos mediante un proceso de polimerización a partir de moléculas más pequeñas denominadas monómeros. Se caracterizan por ser polímeros biodegradables y biocompatibles. El termino biocompatibilidad hace referencia a la propiedad de una sustancia o molécula de no inducir efectos tóxicos o dañinos sobre los sistemas biológicos donde actúa. La biodegradación, sin embargo, hace referencia al ataque de organismos vivos, normalmente microorganismos, a estos polímeros, con el fin de descomponerlos en los elementos químicos que los componen. Ésta se origina mediante la ruptura de enlaces presentes en su cadena principal, de forma que son degradados a dióxido de carbono y agua, en condiciones aerobias, o a metano, en condiciones anaerobias (Santo-Rosa, 2013). Gracias a su biocompatibilidad y degradabilidad, los biopolímeros están siendo ampliamente estudiados como posibles sustitutos de polímeros sintéticos obtenidos fundamentalmente del petróleo. Aunque estos plásticos han sido muy utilizados desde la antigüedad por sus múltiples aplicaciones, no solo en la industria, sino también en la vida cotidiana. Actualmente su uso se ve frenado por la constante acumulación de residuos plásticos en el medio ambiente, consecuencia principalmente de su capacidad de resistir a la corrosión y a la descomposición bacteriana. En este sentido, los biopolímeros al proceder en su mayor parte de recursos renovables se convierten en una interesante alternativa a los plásticos (Valero-valdivieso, 2013). El motivo principal que frenó el empleo de los biopolímeros en épocas anteriores fue el elevado coste de producción respecto a los plásticos de origen petroquímico. Para darle solución a este problema, actualmente se investiga la posibilidad de obtención de estos biopolímeros a partir de sustratos baratos, como la glucosa, sacarosa, glicerol, lignina, xilosa, o materiales de desecho y fuentes alternativas, como suero de leche, aceite de palma, harina de girasol, entre otras. Otra alternativa para reducir el coste es realizar una producción simultánea y secuencial de biopolímeros de origen microbiano concomitante con diversos productos. Es importante también buscar estrategias de extracción y purificación del producto que permitan la reducción de los costes de su obtención para que se incremente su utilización en el mercado donde todavía predominan los derivados de petróleo (Luef et al., 2015; Zheng et al., 2019). La importancia que tienen los biopolímeros radica en su uso en una amplia gama de aplicaciones, que va desde la industria alimentaria, textil, agrícola y cosmética hasta su uso en el ámbito farmacéutico y biomédico. Estas aplicaciones son debidas a sus propiedades 7 biodegradables y biocompatibles, así como a la facilidad de modificar otras características fisicoquímicas del biopolímero con el objetivo de mejorar su adaptación al uso en diferentes ámbitos. Los biopolímeros han sido explotados fundamentalmente para su aplicación en Medicina y Farmacia, así se emplean en sistemas de administración de fármacos, ingeniería de tejidos, formación de productos sanitarios y sistemas de diagnóstico, entre otros. Posibilitan la administración de fármacos que presentan inestabilidad en el organismo o que generan muchos efectos adversos, gracias su potencial para ser usados como vehículos de diferentes fármacos con la posibilidad de dirigir el fármaco a un tejido selectivo. Son también buenos materiales para la formación de andamios, vendas o apósitos no tóxicos para el ser humano, empleados en la curación de heridas o sustitución de tejidos (Rojas Cortés et all., 2010). 1.1 Clasificación de los biopolímeros Los biopolímeros los podemos clasificar en función de su origen en tres grupos: biopolímeros extraídos directamente de la biomasa, biopolímeros sintetizados a partir de monómeros de la biomasa (bio-derivados) y biopolímeros producidos directamente por microorganismos (Figura 1) (Armentano et al., 2013; Valero-valdivieso, 2013). Los polímeros extraídos directamente de la biomasa como los polisacáridos, proteínas (caseína, suero de leche, gelatina, gluten y soja) y lípidos, son obtenidos generalmente de plantas y animales, la mayoría se suelen caracterizar por su naturaleza hidrofílica y algo cristalina Biopolímeros Extraídos de la biomasa Polisacáridos Proteínas Lípidos Sintetizados a partir de monómeros de biomasa Ácido poliláctico Otros poliésteres como el PVOH Producidos por microorganismos PHA Figura 1. Clasificación de los biopolímeros biodegradables. 8 (Labeaga, 2018). De los polímeros obtenidos a partir de biomonómeros, el más destacable es el ácido poliláctico (PLA) por sus aplicaciones médicas y a nivel industrial. Los polímeros derivados, se suelen obtener por polimerización directa a partir del ácido láctico, monómero que puede sintetizarse por vía química o por vía biotecnológica (fermentación microbiana) (Herryman Munilla y Blanco Carracedo, 2005). Los polímeros del último grupo, producidos por microorganismos, son los polihidroxialcanoatos (PHAs) y algunos polisacáridos. Los PHAs son polímeros lineales constituidos por unidades de hidroxialcanoatos mientras que los polisacáridos son polímeros constituidos por monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. Los polisacáridos microbianos pueden situarse en el interior de la célula, actuando generalmente como reserva energética, pueden formar parte de la estructura celular o secretarse al exterior de la célula (Schmid et al., 2015). Los polisacáridos microbianos extracelulares, también denominados exopolisacáridos, son importantes para la formación de biopelículas y la patogenicidad. Esta revisión se centrará en aquellos biopolímeros que son producidos por microorganismos y que tienen potencial de aplicación en Biomedicina y Farmacia, como es el caso de los PHAs y exopolisacáridos (EPS). 2. OBJETIVOS DE LA REVISIÓN El objetivo principal de este trabajo es llevar a cabo una revisión bibliográfica de las aplicaciones más actuales y relevantes de los PHAs y EPS microbianos en el ámbito biomédico y farmacéutico. Para ello es importante conocer los diferentes tipos de PHAs y EPS que se utilizan, así como las propiedades que los caracterizan. Además, es fundamental tener conocimiento de las principales rutas biosintéticas y los factores que influyen en su biosíntesis, así como conocer los microorganismos que son capaces de producirlos y saber cómo se lleva a cabo esa producción biotecnológica. 3. METODOLOGÍA La metodología seguida para la elaboración del presente trabajo de revisión bibliográfica consistió en la recopilación de información encontrada en artículos procedentes de distintas bases de datos tanto multidisciplinares como especializadas, entre ellas, Scopus, Science Direct, PubMed, Google académico y Dialnetplus. Estas dos últimas se usaron fundamentalmente para conocer aspectos generales de los biopolímeros que nos permitió tener una idea general del tema. La búsqueda de información se fue moldeando en función de la información que se quería obtener para cada parte del trabajo. Se han estudiado aquellos artículos relacionados con la clasificación, biosíntesis y producción tanto de los exopolisacáridos como de los polihidroxialcanoatos. Para 9 esto se utilizaron palabras claves en inglés de “polyhidroxyalkanoates”, “exopolysaccharides” acompañados de “synthesis” o “production”. Según el interés, no se aplicó ninguna limitación del año de publicación. La búsqueda de aplicaciones de los biopolímeros se inició usando palabras clave como “biopolymers”, “applications”, “biomedicine” y “pharmacy”, y se continuó con una búsqueda enfocada hacia aplicaciones más concretas para polihidroxialcanoatos y los diferentes tipos de exopolisacáridos. En este caso se realizó un refinamiento de limitación de años cercanos al 2020-2021 con objetivo que hallar las ultimas aplicaciones al respecto. Se considera a destacar en este trabajo, el número de los estudios e investigaciones que se han llevado a cabo durante los años 2000-2019 con el objetivo de poner de manifiesto el incremento de importancia que se les está dando a los biopolímeros en los últimos años. La gráfica de la figura 2 se elaboró utilizando la base de datos Science Direct, usando como palabra clave “biopolymers” sin ninguna limitación de búsqueda. La gráfica representa el número de publicación sobre biopolímeros por año, desde el año 2000 hasta el año 2019. Se observa que el número de publicaciones sobre biopolímeros aumenta conforme pasan los años, alcanzando las 7430 publicaciones en el año 2019. Figura 2. Número de publicaciones sobre biopolímeros por año en el recurso electrónico Science Direct. 16 cartílagos y tejidos nerviosos. Además, se ha comprobado con éxito que los implantes de PHA son completamente biocompatibles y no inmunogénicos (Michalak et al., 2017). 4.1.3.1 PHAs en sistemas de vehiculización y administración de fármacos La administración de fármacos de forma tradicional ya sea por vía extravascular o intravenosa, posibilita la aparición de algunos inconvenientes como la distribución inespecífica del fármaco en el organismo, incapacidad de mantener concentraciones de fármacos a lo largo del tiempo, aparición de efectos indeseables o tóxicos y escasa biodisponibilidad oral (Korde y Kandasubramanian, 2020). Estos inconvenientes llevaron al desarrollo de sistemas que proporcionen una cinética de liberación de fármacos predecible, que permita reducir los efectos indeseables y las pérdidas del fármaco por degradación o desactivación, así como disminuir las fluctuaciones de concentración de fármaco en el organismo (Tarrahi et al., 2020). Se trata de formulaciones o dispositivos farmacéuticos que aportan perfiles de administración de fármacos más adecuados que los dispositivos convencionales. Se han estudiado diferentes materiales como portadores de fármacos, entre los que destacan los biopolímeros por ser materiales biocompatibles y biodegradables, cuyos productos finales son menos tóxicos en comparación con otros materiales poliméricos diferentes. Los PHAs son utilizados como portadores micro o nanométricos de fármacos hidrófobos, proteínas, vacunas, ácidos nucleicos y macromoléculas biológicas, generalmente en forma de esferas o cápsulas (Li y Lim, 2018). Se han realizado numerosos estudios sobre la formación de micropartículas en forma de microesferas o microcápsulas con objetivo de obtener y estudiar los sistemas de liberación controlada de diversos fármacos. Entre ellos se encuentra la tetraciclina que se carga en microesferas y microcápsulas de poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV) (Sendil et al., 1999), gentamicina en microesferas de PHBV y wollastonita bioactiva (Li y Chang, 2005), rubomicina depositada en micropartículas poliméricas (Shishatskaya et al., 2008) y paclitaxel en microesferas basadas en PHB (Bonartsev et al., 2012). Sin embargo, actualmente hay un gran auge en cuanto a la investigación de sistemas de administración de fármacos de tamaño nanométrico. Esta se basa en ciertas características que presentan las nanopartículas como una alta capacidad de atravesar pequeños capilares, facilitar la disminución de la dosis de administración y los efectos secundarios indeseables o posibilidad de ser dirigidos e infiltrarse en algunos tejidos o células. Además, no suelen ser detectados por los fagocitos y son capaces de circular en el torrente sanguíneo durante periodos prolongados de tiempo (Tarrahi et al., 2020). 17 Las nanopartículas mejoran el perfil de administración de ciertos fármacos como la hidrocortisona, que requiere de administraciones continuadas para mantener su actividad antiinflamatoria a nivel ocular. La administración oftálmica tópica de hidrocortisona en nanopartículas de PHBV aumenta el tiempo de residencia del fármaco y la penetración en capas más profundas. Lleva a la reducción de los efectos secundarios indeseables por disminución de la frecuencia de administración (Álvarez et al., 2019). La formación de bionanocompuestos mejora las propiedades estructurales, así como la estabilidad térmica y la actividad de ciertos fármacos. Este es el caso del bionanocompuesto PHB-Co3O4 que presenta una mayor actividad antibacteriana evaluada mediante unidades formadoras de colonias y métodos de difusión en disco (Safaei et al., 2020). El uso en clínica de numerosos fármacos se ve afectada por sus efectos tóxicos a nivel sistémico, estos efectos indeseables pueden reducirse con la administración de nanopartículas cargadas con el fármaco. Uno de los ejemplos son las nanopartículas de PHBV cargadas con sunitinib, fármaco ampliamente utilizado en cáncer de pulmón (Otroj et al., 2020). Se ha demostrado también que las nanopartículas tienen un gran potencial para ser utilizadas como portadores de genes, este es el caso de nanopartículas de PHB-co-PEI (polietilenimina) (Memari et al., 2020). En numerosas enfermedades, como el cáncer, es de especial interés que el fármaco llegue y actúe en las células o tejidos objetivos alterados o dañados y no en las células o tejidos sanos, en este sentido, las nanopartículas de PHAs permiten la unión de ligandos específicos de células como folatos, péptidos y azucares que dan lugar a tratamientos mucho más específicos y selectivos, reduciendo los efectos tóxicos e indeseables asociados a la misma. Así, se han diseñado sistemas de administración de fármacos dirigidos a células cancerosas utilizando como ligando el ácido fólico. Como ejemplos se encuentran las nanopartículas a base de poli (3- hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (PHBHHX) cargadas con etopósido (Kiliay et al., 2011) y las nanopartículas constituidas por poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxioctanoato) (PHBHO) cargadas con doxorrubicina (Zhang et al., 2010). El hecho de que ambos sistemas de administración contengan ácido fólico hace que la terapia contra el cáncer sea dirigida y más selectiva. 4.1.3.2 PHAs en la ingeniería de tejidos La ingeniería de tejidos se centra en la creación de tejidos vitales mediante la combinación de biomateriales, células y moléculas bioactivas y tiene como objetivo reparar los órganos y tejidos dañados o alterados. La alta biocompatibilidad de los PHAs así como sus propiedades mecánicas y los tiempos de degradación adecuados, los convierten en candidatos ideales para la producción de andamios. Estos pueden ser utilizados en la reparación del daño de varios tejidos 18 (duros y blandos) como los tejidos óseos, vasculares, cartílagos, piel, medula ósea y conductos nerviosos (Rodriguez-Contreras, 2019). La ingeniería de tejidos implica el uso de un andamio biocompatible adecuado (figura 7). Los PHAs desempeñan un papel importante en este campo ya que poseen la mayoría de las propiedades requeridas como biomaterial para la formación de andamios, como biodegradabilidad, biocompatibilidad, vascularización y suficiente resistencia mecánica (Lim et al., 2017). Estas propiedades pueden ser mejoradas con la combinación del PHA con sustancias inorgánicas, hidroxiapatita (HA), hidrogeles e incluso otros polímeros biocompatibles (Rodriguez-Contreras, 2019). Numerosas investigaciones demuestran que los PHAs pueden ser utilizados para la formación de andamios óseos. Uno de los más actuales estudia la regeneración de defectos óseos de tamaño crítico del hueso parietal en ratas, mediante el uso de andamios de PHB/hidroxiapatita rellenos con un hidrogel de alginato sembrados con células madre mesenquimales (MSC). Los resultados obtenidos de este estudio demuestran que el andamio de PHB/HA relleno con hidrogel de alginato que contiene MSC mejora la regeneración ósea, debido a las propiedades osteoinductoras de los andamios y al potencial regenerativo de las MSC (Volkov et al., 2020). Los PHAs también tienen las características adecuadas para ser empleados en la formación de cartílagos, algunas investigaciones demuestran que el uso de PHAs puede ser una alternativa importante a los procedimientos quirúrgicos actuales en la reparación de cartílagos, en los cuales no se pueden restaurar la función normal del mismo (Rodriguez-Contreras, 2019). En un estudio Figura 7. Aspecto y microestructura de andamios porosos de PHB. A: apariencia del andamio de PHB; B: microfotografía del andamio de PHB con prueba de tinta; C y D: estructura porosa del andamio de PHB con SEM × 150 (C), × 1000 (D) (Volkov et al., 2020). 19 reciente se evaluó las propiedades mecánicas y la viabilidad celular del andamio compuesto por PHB/quitosano reforzado con Al2O3 (alúmina) para la ingeniería de tejidos de cartílago. Los resultados de los estudios celulares mostraron que las células de condrocitos se diseminaron mejor en andamios de PHB/quitosano al 3% de Al2O3 que en andamios únicamente compuestos por PHB. Estos resultados indican que el andamio de PHB/ quitosano al 3% Al2O3 es un material prometedor para ser aplicado como un andamio de ingeniería de tejidos de cartílago (Toloue et al., 2019). Los PHAs se han investigado ampliamente en ingeniería cardiovascular para ser utilizados en injertos vasculares, incremento de arterias, válvulas cardiacas, stents cardiológicos y parches pericárdicos (Israni y Shivakumar, 2019). Algunos de los más estudiados, son los mcl-PHAs, que han demostrado tener propiedades excepcionales para ser aplicados en ingeniería del tejido cardíaco. Así, en un estudio reciente, se analizaron andamios formados por una mezcla de mcl- PHA y policaprolactona sembrados con células madre cardíacas marcadas, que se implantaron y estudiaron in situ en el corazón murino post mortem. El andamio demostró tener un tremendo potencial para el suministro controlado de células progenitoras cardíacas así como la capacidad de maximizar la regeneración de tejidos en el infarto de miocardio (Constantinides et al., 2018). Los PHAs también han ganado importancia en la regeneración nerviosa, dentro de ellos se encuentra el PHB, PHBV, P3HB4HB y PHBHHx, los cuales han demostrado resultados prometedores para la viabilidad, el crecimiento y proliferación de células madre neurales, la mejora de la supervivencia neural y el apoyo a la segregación de dendrita axónica (Israni y Shivakumar, 2019). 4.2 Exopolisacáridos (EPS) microbianos Los EPS son biopolímeros producidos y secretados por microorganismos que pueden ser encontrados en forma de cápsula, formando capas mucosas que permanecen asociadas con la superficie celular, o en forma de limo, en el que los polisacáridos se unen libremente a la superficie celular (Rehm, 2009). Químicamente, los EPS están compuestos en su mayoría por carbohidratos, pudiendo presentar sustituyentes orgánicos e inorgánicos además de azucares. Los monosacáridos que con más frecuencia se suelen repetir en los EPS microbianos son la D-glucosa, D-galactosa y D-manosa, aunque también es posible encontrar monómeros de L-ramnosa, L- fucosa, entre otras. Los diferentes sustituyentes que presentan los EPS se unen a ellos por enlace éster o cetal. Se pueden encontrar sustituyentes orgánicos como restos acetato, que no contribuyen a la carga total de la molécula polisacárida, piruvato que junto a los ácidos urónicos (D- glucurónico, D-galacturónico) confieren naturaleza polianiónica a los EPS y algunos aminoácidos. Es posible también encontrar sustituyentes inorgánicos como grupos fosfatos y 20 sulfatos. La presencia de grupos fosfatos es la que se encuentra con mayor frecuencia respecto a otros sustituyentes inorgánicos, y se caracteriza por presentar semejanza a los ácidos teicoicos presente en la pared de las bacterias Gram positivas. La presencia de grupos sulfato se encuentra limitada en organismos procariotas (Sutherland, 1994) . Los EPS producidos por microorganismos desempeñan múltiples funciones, generalmente beneficiosas para los mismos. Se cree que los EPS en su entorno natural, además de facilitar la adhesión microbiana a superficies sólidas y formación de biopelículas, ofrecen protección frente a la desecación, la fagocitosis y el ataque de fagos, estrés osmótico y reconocimiento celular. También actúan como mecanismo de defensa frente a agentes antimicrobianos o compuestos tóxicos (iones metálicos tóxicos, dióxido de azufre, etanol). No es probable que los exopolisacáridos sirvan como reserva de energía ya que la mayoría de las bacterias que las producen no son capaces de catabolizarlo (Cerning, 1990). 4.2.1 Clasificación y propiedades de EPS Existe una gran variedad de exopolisacáridos debido a la diversidad de las unidades básicas que los constituyen, la cantidad en que están presentes y los distintos tipos de enlace que determinan la configuración (Cerning, 1990). Los EPS microbianos se pueden clasificar en función de su estructura y su composición en homopolisacáridos y heteropolisacáridos. Los homopolisacáridos son compuestos que están constituidos por un único tipo de unidades glucídicas y suelen ser neutras, mientras que los heteropolisacáridos están constituidos por diferentes tipos de monosacáridos y suelen ser polianiónicos. Los heteropolisacáridos suelen ser mayoritarios dentro de los EPS microbianos (Sutherland, 1994). A continuación, se va a realizar una breve descripción sobre los exopolisacáridos con mayor repercusión en el ámbito farmacéutico y biomédico obtenido a partir de microorganismos. En la tabla 2 se puede apreciar las propiedades destacables de algunos EPS y el microorganismo productor a nivel industrial. Dentro de los homopolisacáridos podemos destacar a: - Celulosa bacteriana (CB): polímero neutro constituido por moléculas D-glucosa unidas por enlaces β-1,4 (figura 8), forman una cadena lineal las cuales se asocian principalmente por puentes de hidrógeno para originar una estructura denominada “microfibrillas”. Es sintetizada con alta productividad por algunas bacterias como el Gluconacetobacter xylinum (anteriormente Acetobacter xylinum). Las CB a diferencia de otras celulosas producidas por plantas, están libres de moléculas contaminantes 21 como lignina, hemicelulosa y pectina (Ross et al., 1991). Debido a características como su alta cristalinidad, pureza, hidrofilia, resistencia a la tracción, potencial de formación de estructuras, biocompatibilidad y biodegradabilidad, hacen que la CB sea un material prometedor en aplicaciones biomédicas (Huang et al., 2014; Keshk, 2014). Figura 8. Estructura química de la celulosa bacteriana - Dextrano: polímero neutro constituido por residuos D-glucosa unidos por enlaces α-1,6 en su mayoría, estas representan la cadena principal. Hasta un 50% de los enlaces pueden ser α-1,2, α -1,3 y α-1,4, y son las que constituyen las ramificaciones (Kim y Robyt, 1995) (figura 9). Su producción industrial se realiza principalmente a partir de Leuconostoc mesenteroides que origina EPS con un 95% de enlaces α-1,6 y un 5% de unión α -1,3 (Vettori et al., 2012). Gracias a su buena estabilidad y su comportamiento de fluido Newtoniano, el dextrano es utilizado en la industria farmacéutica como expansor de volumen plasmático y en cromatografía (Nwodo et al., 2012). Figura 9. Estructura química del dextrano - Pululano: polímero neutro constituido por unidades repetidas de maltotriosa (tres unidades de glucosa unidas entre sí por enlaces glicosídicos α-1,4) que se unen a través de enlaces α-1,6 (figura 10). Es sintetizado por el hongo polimórfico Aureobasidium pullulans. Sus aplicaciones en el ámbito farmacéutico se basan en propiedades como su gran solubilidad, no ser tóxico ni mutagénico o su capacidad para formar películas adhesivas e impermeables al oxígeno (Haghighatpanah et al., 2020; Moscovici, 2015). 22 Figura 10. Estructura química del pululano Dentro de los heteropolisacáridos destaca: - Alginato bacteriano: es un polímero aniónico, cuya estructura está compuesta por monómeros de ácido D-manurónico (M) unidos por enlace β-1,4 y ácido L-gulurónico (G) unidos por enlace α-1,4. Estos se agrupan o se distribuyen en secciones constituyendo bloques homopoliméricos de tipo G (-GGG-), bloques M (-MMM-) o heteropolímeros en los que los M y G se alternan (-MGMG-) (figura 11). El aginato es sintetizado como mucílago extracelular por bacterias como Pseudomonas spp. y Azotobacter vinelandii. Se diferencia del ácido algínico obtenido por algas por la presencia de un mayor número de grupos O-acetilo, es decir, se encuentra más acetilado (Garcia-Cruz et al., 2008). Las aplicaciones de los alginatos bacterianos se basan en sus propiedades como espesantes, alta capacidad de retener agua, capacidad de formar gel a partir de una serie de reacciones químicas de intercambio iónico (iones sodio por cationes divalentes) y de formar películas (McHugh, 1987). Figura 11. Estructura de los bloques homopoliméricos y heteropoliméricos de los alginatos bacterianos. El A representa bloques tipos M, el B bloques G y el C bloques tipo MG. - Xantano: polímero de naturaleza aniónica sintetizado por Xanthomonas campestris. Su estructura primaria (figura 12) se basa en una cadena lineal de moléculas de D- glucosa unidas por enlace β-1,4 con una cadena lateral de trisacárido en la posición C3 de los residuos D-glucosídicos alternos. Esta cadena lateral contiene un residuo de ácido glucurónico unido por enlace β-1,4 a una unidad de manosa terminal, y por enlace 23 β-1,2 a una segunda manosa. Esta última se conecta con la cadena D-glucosa por enlace α-1,3. La manosa terminal presenta grupos piruvato en las posiciones 4 y 6; y la unidad de manosa interna se encuentra acetilada en la posición 6 (Jasson et al., 1967; Sanderson et al., 1976). Su empleo en la industria farmacéutica se debe a sus propiedades como espesante y estabilizador de suspensiones y emulsiones. Se caracteriza por exhibir propiedades pseudoplásicas en las soluciones, de ser estable a pH tanto ácido como alcalino y a que, concentraciones relativamente bajas de polisacárido, producen soluciones altamente viscosas las cuales se mantienen estables al elevar la temperatura (Patel y Patel, 2011). Figura 12. Estructura química de Xantano - Gelano: heteropolisacárido lineal aniónico producido por la cepa no patógena de Sphingomonas elodea ATCC 31461 (originalmente denominado Pseudomonas elodea; también denominado Sphingomonas paucimobilis). Está constituido por la repetición de un tetrasacárido compuesto por D-glucosa, ácido D-glucurónico y L-ramnosa en proporción 2:1:1. Presenta dos sustituyentes acilos (O-acetilo y O-L-glicerilo) unidos al mismo residuo de glucosa (figura 13). La presencia o no de estos restos acetilos determina las propiedades del gel originado por este polímero (Fialho et al., 2008). La forma nativa contiene sustituyentes de acilo, que si no son de interés, se pueden eliminar fácilmente mediante hidrolisis alcalina (Moscovici, 2015). El gelano tiene muchas ventajas respecto a otros polisacáridos como su estabilidad térmica y ácida, alta transparencia, elasticidad y rigidez del gel, que pueden ser variables en función de la presencia y la cantidad de sustituyentes acilos. Posee una amplia gama de aplicaciones como agente estabilizante, espesante, emulsionante y gelificante debido a sus excelentes características reológicas (Fialho et al., 2008). 24 Figura 13. Estructura química de la unidad repetitiva de la goma de gelano nativa (a) y desacetilada (b). - Ácido hialurónico (HA): pertenece al grupo de los glicosaminoglicanos. Se trata de un polisacárido lineal aniónico producido a escala industrial por Streptococcus zooepidemicus y Bacillus subtilis. Está constituido por unidades disacáridas compuestas por ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina que se encuentran unidas alternativamente por enlaces glucosídicos β-1,4 y β-1,3 (figura 14). Están presentes en una amplia gama de aplicaciones como humectantes de la piel, en lágrimas artificiales, tratamiento de osteoartritis, cicatrización de heridas, entre otras. Sus aplicaciones son debidas a su viscoelasticidad, biocompatibilidad, alta hidrofilia y solubilidad (Liu et al., 2011; Mishra y Jha, 2013). Figura 14. Estructura química del ácido hialurónico 25 Principal microorganismo productor Propiedades Celulosa bacteriana Acetobacter xylinum - Alta cristalinidad y pureza - Alta resistencia a la tracción - Gran potencial de formación de estructuras Dextrano Leuconostoc mesenteroides - Buena estabilidad - Comportamiento de fluido Newtoniano Pululano Aureobasidium pullulans - Capacidad para formar películas adhesivas - Impermeabilidad al oxígeno Alginato bacteriano Pseudomonas spp. Azotobacter vinelandii - Espesante - Capacidad gelificante - Formación de películas Xantano Xanthomonas campestris - Espesante y estabilizador - Propiedades pseudoplásticas en soluciones - Estabilidad en amplios rangos de temperatura y pH Gelano Sphingomonas elodea - Capacidad de gelificación - Elasticidad y rigidez del gel ajustables - Estabilidad a la temperatura y pH Ácido hialurónico Streptococcus zooepidemicus Bacillus subtilis - Biocompatibilidad - Alta hidrofilia y solubilidad - Actividad biológica 4.2.2 Biosíntesis y producción de los EPS La biosíntesis de EPS ocurre en diferentes fases del crecimiento celular y depende tanto de las condiciones ambientales (temperatura, pH y nutrientes) como del organismo utilizado en su producción. De forma general se puede considerar que la biosíntesis de los EPS ocurre en cuatro etapas principales (figura 15) ; ingreso del sustrato al citoplasma, metabolismo intermediario (síntesis de glucosa-1-fosfato), polimerización, modificación y liberación de los EPS (De Vuyst y Degeest, 1999). La biosíntesis de los EPS se inicia con el ingreso de moléculas de azúcar a la célula por uno o varios de los siguientes mecanismos según el tipo de microorganismo involucrado y del sustrato: transporte activo, difusión simple o traslocación de grupo. El sustrato que ha ingresado a la célula se fosforila y puede seguir una ruta catabólica, hacia la obtención de energía, o una ruta anabólica hacia la formación de polisacáridos. La enzima intracelular hexoquinasa fosforila la glucosa a glucosa-6-fosfato que, posteriormente, se convierte en glucosa-1-fosfato por la acción de la fosfoglucomutasa. La glucosa-1-fosfato es un metabolito central que se utiliza para la formación de derivados de nucleótidos como UDP-glucosa y dTDP-glucosa (se pueden interconvertir en otros azúcares como UDP-galactosa y dTDP-ramnosa) a través de la acción de UDP-glucosa pirofosforilasa y dTDP-glucosa pirofosforilasa, respectivamente. Posteriormente, se produce la transferencia secuencial de los correspondientes precursores activados, a un lípido aceptor intermediario identificado como alcohol isoprenoide. La formación de este glicolípido Tabla 2. Principales propiedades y microorganismos productores de diversos exopolisacáridos. 32 electrochemical sensing platform: A smart material for miniaturized biosensors. Electrochim Acta 2020;349:136341. - González García Y, Meza Contsrerass JC, González Reynoso O, Córdova López JA. Síntesis y biodegradación de polihidroxialcanoatos: Plásticos de origen microbiano. 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