Papel de moxifloxacino y ampicilina frente a “listeria monocytogenes” en la Infección del sistema nervioso central

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Microbiología PAPEL DE MOXIFLOXACINO Y AMPICILINA FRENTE A Listeria monocytogenes EN LA INFECCIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL TESIS DOCTORAL María Inmaculada Pupo Ledo Sevilla, 2015 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Microbiología PAPEL DE MOXIFLOXACINO Y AMPICILINA FRENTE A Listeria monocytogenes EN LA INFECCIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Tesis que para aspirar al grado de Doctora en Medicina, presenta la Licenciada Doña María Inmaculada Pupo Ledo. Sevilla, 2015 Departamento de Microbiología Departamento de MicrobiologíaDepartamento de Microbiología Departamento de Microbiología D. Javier Aznar Martín, Catedrático de Microbiología de la Universidad de Sevilla y D. José Antonio Lepe Jiménez, Jefe de Sección del Hospital Universitario Virgen del Rocío. CERTIFICAN: CERTIFICAN:CERTIFICAN: CERTIFICAN: que el presente trabajo de investigación, titulado: PAPEL DE MOXIFLOXACINO Y AMPICILINA FRENTE A Listeria monocytogenes EN LA INFECCIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, constituye la Memoria presentada por María Inmaculada Pupo Ledo para aspirar al grado de Doctora en Medicina, y ha sido realizado bajo nuestra dirección considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación. Y para que conste, expedimos y firmamos el presente certificado en Sevilla, a 23 de Marzo de 2015. Fdo. Dr. D. Javier Aznar Martín Fdo. Dr. D. José Antonio Lepe Jiménez Agradecimientos En primer lugar quiero dar mi agradecimiento a mis dos directores de Tesis, Dr. Javier Aznar Martín y Dr. Jose Antonio Lepe Jiménez, por la oportunidad de realizar este trabajo, su apoyo tanto a nivel profesional como personal, su profesionalidad, confianza, y por su paciencia. Sin vosotros nada de esto hubiese sido posible. También quiero agradecer a los integrantes del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Dr. Fernando Docobo Pérez, Dr. Juan Domínguez Herrera, Dr. Younes Smani, Raquel Parra Millán, Gema Labrador Herrera, por sus enseñanzas y ayuda en la realización de los experimentos que llevé a cabo en este trabajo de investigación. Finalmente mi agradecimiento a todas aquellas personas que me animaron a seguir adelante, confiando en mí, incluso en los momentos que ni yo misma lo hacía. Tenéis toda mi gratitud y afecto. A mis padres A mis padresA mis padres A mis padres ÍNDICES ~ 1 ~ 1 11 1 Introducción IntroducciónIntroducción Introducción ................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ ........................................................... ...................................................... ........................... 15 1515 15 2 22 2 Justificación e Hipótesis de trabajo Justificación e Hipótesis de trabajoJustificación e Hipótesis de trabajo Justificación e Hipótesis de trabajo ................................ ................................................................ ....................................................... .............................................. ....................... 31 3131 31 3 33 3 Objetivos ObjetivosObjetivos Objetivos ................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ ................................ 34 3434 34 4 44 4 Material y métodos Material y métodosMaterial y métodos Material y métodos ................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ ................................................ ................................ ................ 36 3636 36 4.1 Aislamientos bacterianos ........................................................................... 36 4.2 Antibióticos ................................................................................................ 36 4.3 Medios de cultivo........................................................................................ 37 4.4 Actividad antimicrobiana extracelular ...................................................... 37 4.4.1 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) ........... 37 4.4.2 Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) ......... 39 4.5 Estudio farmacocinético y farmacodinámico (PK/PD) .............................. 40 4.5.1 Cálculo de la concentración máxima (C max ) de moxifloxacino y ampicilina en líquido cefalorraquídeo (LCR) mediante simulación de Monte Carlo 40 4.5.2 Evaluación PK/PD de la actividad de moxifloxacino en LCR mediante simulación de Monte Carlo ................................................................................ 41 4.5.3 Evaluación PK/PD de la actividad de ampicilina en LCR mediante simulación de Monte Carlo ................................................................................ 43 4.6 Selección de los aislamientos para los estudios de actividad antimicrobiana intra y extracelular ...................................................................... 44 4.7 Actividad antimicrobiana extracelular. Curvas de tiempo-muerte .......... 45 ~ 2 ~ 4.8 Actividad antimicrobiana intracelular ...................................................... 48 4.8.1 Aislamientos bacterianos y condiciones de crecimiento ...................... 48 4.8.2 Cultivo e infección de las células humanas ......................................... 48 4.8.3 Valoración de la actividad intracelular ............................................... 49 5 55 5 Resultados ResultadosResultados Resultados ................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ ............................................................. .......................................................... ............................. 52 5252 52 5.1 Actividad antimicrobiana extracelular. Microdilución en caldo ............... 52 5.1.1 Determinación de la CMI y CMB ......................................................... 52 5.1.2 Estudio de la CMI y CMB por serotipos .............................................. 64 5.1.2.1 Moxifloxacino ................................................................................ 64 5.1.2.2 Ampicilina ..................................................................................... 67 5.1.3 Estudio de la CMI y CMB por clones epidémicos (EC) vs no epidémicos 69 5.1.3.1 Moxifloxacino ................................................................................ 69 5.1.3.2 Ampicilina ..................................................................................... 71 5.1.4 Estudio de la CMI y CMB de los pulsotipos (PFGE) más importantes 74 5.1.4.1 Moxifloxacino ................................................................................ 74 5.1.4.2 Ampicilina ..................................................................................... 75 5.2 Estudio PK/PD ........................................................................................... 77 5.2.1 Cálculo de la C max de moxifloxacino en LCR por simulación de Monte Carlo 77 ~ 3 ~ 5.2.2 Cálculo de la C max de ampicilina en LCR por simulación de Monte Carlo 78 5.2.3 Análisis PK/PD de la actividad de moxifloxacino en SNC .................. 80 5.2.3.1 Dosis de 400 mg/Kg/día ................................................................. 80 5.2.3.2 Dosis de 800 mg/Kg/día ................................................................. 81 5.2.4 Punto de corte PK/PD para moxifloxacino........................................... 82 5.2.5 Análisis PK/PD de la actividad de ampicilina en sistema nervioso central (SNC) ...................................................................................................... 83 5.2.5.1 Dosis de 200 mg/día ...................................................................... 83 5.2.5.2 Dosis de 400 mg/día ...................................................................... 85 5.3 Actividad antimicrobiana extracelular. Curvas de tiempo-muerte .......... 86 5.3.1 Cepas incluidas en el estudio ............................................................... 86 5.3.2 Actividad extracelular de moxifloxacino .............................................. 87 5.3.3 Actividad extracelular de ampicilina ................................................. 100 5.3.4 Actividad extracelular de ampicilina más moxifloxacino .................. 112 5.4 Actividad antimicrobiana intracelular .................................................... 125 5.4.1 Moxifloxacino...................................................................................... 125 5.4.2 Ampicilina .......................................................................................... 130 6 66 6 Discusión DiscusiónDiscusión Discusión ................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ ............................................................. .......................................................... ............................. 137 137137 137 7 77 7 Bibliografía BibliografíaBibliografía Bibliografía ................................ ................................................................ ................................................................ ................................................................ .......................................................... .................................................... .......................... 153 153153 153 ~ 10 ~ Índice de tablas Tabla 1. Características de las cepas seleccionadas para los estudios de actividad antimicrobiana intra y extracelular. .............................................. 45 Tabla 2. Valores modales de CMI y CMB para moxifloxacino y ampicilina. 53 Tabla 3. Serotipo, pulsotipo, CMI y CMB de moxifloxacino y ampicilina de las cepas estudiadas........................................................................................ 54 Tabla 4. Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los serotipos. .................................................................................................... 65 Tabla 5. Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los serotipos. ............................................................................................. 66 Tabla 6. Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los serotipos. ......................................................................................................... 67 Tabla 7. Distribución de los valores de CMB de ampicilina en relación con los serotipos. .................................................................................................... 68 Tabla 8. Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los clones epidémicos. ..................................................................................... 69 Tabla 9. Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los clones epidémicos. ............................................................................... 70 Tabla 10. Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los clones epidémicos. ..................................................................................... 71 Tabla 11. Distribución de los valores de CMB de ampicilina en relación con los clones epidémicos. ..................................................................................... 72 ~ 11 ~ Tabla 12. Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y P9. ............................................................................ 74 Tabla 13. Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y P9. ............................................................................ 75 Tabla 14. Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. .................................................................................. 75 Tabla 15. Distribución de los valores de CMB de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. .................................................................................. 76 Tabla 16. Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg/día i.v. de moxifloxacino en función de la CMI. ....................................... 81 Tabla 17. Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día i.v. de moxifloxacino en función de la CMI. ....................................... 82 Tabla 18. Probabilidad de alcanzar el objetivo Cmax/CMB a dosis de 200 mg/Kg/día i.v. de ampicilina en función de la CMI. ...................................... 84 Tabla 19. Probabilidad de alcanzar el objetivo Cmax/CMB a dosis de 400 mg/Kg/día i.v. de ampicilina en función de la CMI. ...................................... 86 Tabla 20. Cepas representativas de las 150 cepas estudiadas. .................... 86 Tabla 21. Recuento bacteriano de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a moxifloxacino. ................................................................ 88 Tabla 22. Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a moxifloxacino. ................................................................ 89 Tabla 23. Reducción logarítmica de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a moxifloxacino. .................................................... 91 ~ 12 ~ Tabla 24. Reducción logarítmica media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino................................................................................................... 92 Tabla 25. Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a moxifloxacino. ..................................................................... 96 Tabla 26. Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino................................................................................................... 97 Tabla 27. Recuento bacteriano de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a ampicilina. .................................................................... 101 Tabla 28. Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a ampicilina. .................................................................... 102 Tabla 29. Reducción logarítmica de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a ampicilina. ........................................................ 104 Tabla 30. Reducción logarítmica media de las 6 cepas representativas a ampicilina. ..................................................................................................... 105 Tabla 31. Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo-muerte a ampicilina. ........................................................................ 108 Tabla 32. Área bajo la curva de las 6 cepas representativas a ampicilina. 109 Tabla 33. Recuento bacteriano de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo-muerte. ........................................ 113 Tabla 34. Recuento logarítmico de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo-muerte. ........................................ 114 Tabla 35. Reducción logarítmica de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo-muerte. ........................................ 116 ~ 13 ~ Tabla 36. Reducción logarítmica media de las 6 cepas representativas a ambos antibióticos......................................................................................... 117 Tabla 37. Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo-muerte. ........................................ 121 Tabla 38. Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a ambos antibióticos. ................................................................................................... 122 Tabla 39. Recuento bacteriano inicial y porcentaje de reducción de la actividad intracelular de moxifloxacino. ...................................................... 126 Tabla 40. Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad intracelular de moxifloxacino a dos concentraciones distintas. ........................................................................................................ 126 Tabla 41. Media de reducción en el crecimiento de las seis cepas tratadas con moxifloxacino. ......................................................................................... 130 Tabla 42. Recuento bacteriano y porcentaje de reducción de la actividad intracelular de ampicilina. ........................................................................... 131 Tabla 43. Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad intracelular de ampicilina a dos concentraciones distintas. ....................................................................................................................... 131 Tabla 44. Media de reducción en el crecimiento de las seis cepas tratadas con ampicilina. .............................................................................................. 135 ~ 14 ~ INTRODUCCIÓN ~ 15 ~ 1 Introducción La listeriosis, cuyo agente etiológico es Listeria monocytogenes , es una enfermedad rara incluida en ORPHANET, el sistema de información europeo de referencia en enfermedades raras y medicamentos huérfanos, con la referencia ORPHA533. Por tanto, L. monocytogenes es causa poco frecuente de enfermedad en la población general, sin embargo, en algunos grupos poblacionales como : ancianos, inmunodeprimidos, receptores de trasplante y otros individuos con alteraciones de la inmunidad celular, este microorganismo es una importante causa de bacteriemia y meningoencefalitis. El género Listeria está constituido por bacilos grampositivos cortos, regulares y de extremos redondeados, con una longitud entre 1-2 µm y un diámetro entre 0,4-0,5 µm. Su movilidad depende de la temperatura, todas las especies de Listeria poseen de 2 a 6 flagelos peritricos en su superficie cuando crecen a temperaturas menores a 30ºC, siendo reprimidos a temperaturas de 37ºC, condición necesaria para la completa virulencia de la bacteria. Son bacterias anaerobias facultativas y no tienen capacidad de formar cápsula ni esporas. En medios de cultivo sólidos ricos en nutrientes, y tras una incubación de 24-48 horas a 37ºC, forman colonias redondas, translúcidas y ligeramente convexas, con un diámetro entre 0,5-1,5 µm. ~ 16 ~ Listeria puede cultivarse bien en medios generales como agar sangre y agar infusión cerebro corazón (BHI). Los límites de temperatura de crecimiento se encuentran entre 0 y 45ºC, pudiendo crecer, por tanto, a temperaturas de refrigeración. El rango de pH permisivo para L. monocytogenes se encuentra definido entre 5 y 9, tolerando medios con una concentración de 10% de cloruro sódico (1). Debido a su ubicuidad, L. monocytogenes se puede incorporar fácilmente a la cadena alimentaria a través de las materias primas utilizadas en la elaboración de alimentos, constituyendo un problema emergente para la industria alimentaria, que ha dado lugar en los países desarrollados a un aumento de la incidencia y a brotes asociados al consumo de alimentos contaminados. El control de L. monocytogenes en las plantas de procesado conlleva una gran dificultad, siendo prioritario en los planes de análisis de peligros y puntos de control críticos (2). El género Listeria incluye a 10 especies reconocidas: L. monocytogenes , Listeria grayi , Listeria innocua , Listeria welschimeri , Listeria seeligeri , Listeria ivanovii , Listeria marthii , Listeria rocourtiae, Listeria fleischmannii y Listeria weihenstephanensis (2 bis) , de las cuales, sólo L. monocytogenes y L. ivanovii han sido descritas en patología humana (3). Sin embargo, L. ivanovii infecta casi exclusivamente a rumiantes, rara vez ha sido descrita en humanos (4) y no se ha determinado que sea capaz de difundir al Sistema Nervioso Central (SNC), por lo tanto L. ~ 17 ~ monocytogenes es la única especie que provoca infección del SNC, tanto en humanos como en rumiantes domésticos (5, 6). La listeriosis es una de las enfermedades de transmisión alimentaria con mayor tasa de mortalidad, lo que hace que sea considerada una enfermedad prioritaria tanto a nivel de salud pública humana como de sanidad animal. La infección, que se produce a nivel mundial, es una enfermedad de declaración obligatoria en Europa, al igual que en España desde el año 2007; aunque en Andalucía ya lo era desde 1997. Si bien, la listeriosis ocurre infrecuentemente (0,3 casos/100.000 habitantes) en el total de la población de la Unión Europea (UE) (7); en 2011, 26 miembros de la UE informaron 1476 casos confirmados de listeriosis en humanos, alcanzando unas tasas promedio de hospitalización del 93.6%, llegando a ser la zoonosis con mayor requerimiento de hospitalización en Europa. En un informe conjunto de 19 países miembros de la UE, se documentó un total de 134 muertes sobre 1054 casos confirmados en los que se recogió dicha información, calculándose una tasa de mortalidad de un 12.7%. En ese mismo año se informaron tres brotes alimentarios causados por L. monocytogenes en Europa, afectando a un total de 16 personas (11 de ellas en un solo brote). Todos los casos requirieron hospitalización, y cuatro de ellos murieron a causa de la infección (8). Los últimos datos publicados en Andalucía corresponden a 2010, donde se declararon 50 nuevos casos, con una tasa de 0,60 casos/100.000 habitantes, el doble que el declarado en la población europea, incrementándose respecto a los 0,54 casos/100.000 ~ 18 ~ habitantes del periodo 2003-2009 (datos obtenidos del boletín del SVEA Vol. 16, nº 30, 29 de julio de 2011). Además, la incidencia y número de casos de la enfermedad en mayores de 65 años es, en general, 2,5 veces mayor que en otros grupos (7), existiendo una asociación importante entre la enfermedad y algunas patologías de base (neoplasias y trasplantados) (9). La infección, con la excepción de los neonatos, se adquiere por la ingesta de alimentos contaminados. L. monocytogenes atraviesa la mucosa intestinal por endocitosis activa de las células epiteliales y posteriormente se disemina por vía hematógena, principalmente al SNC (10). La listeriosis en adultos está típicamente asociada (50-70% de los casos) con infección del SNC en forma de meningitis y, más a menudo de meningoencefalitis, generalmente asociadas a bacteriemia. Las características clínicas de la meningitis por L. monocytogenes difiere de las causadas por otras bacterias al presentar un curso subagudo, generalmente con sintomatología de más de 24 horas a la admisión, y asociada a mareos y alteraciones en el nivel de consciencia (11). La capacidad de L. monocytogenes de causar tanto meningitis aguda como infección del parénquima cerebral, diferencia a ésta de otras bacterias frecuentemente causantes de meningitis como son Streptococcus pneumoniae , Neisseria meningitidis y Haemophilus influenzae , y la asemeja a las infecciones producidas por Mycobacterium tuberculosis (12). Asimismo, más de una cuarta parte de las encefalitis afectan al tronco cerebral ~ 19 ~ (romboencefalitis) aunque esta situación probablemente esté inestimada (13, 14). Los abscesos en cerebro o cerebelo son manifestaciones menos frecuentes de infección del SNC. En una pequeña proporción de las infecciones del SNC por L. monocytogenes , alrededor del 10% (la mitad de la cuales producidas en pacientes inmunodeprimidos), aparecen abscesos cerebrales macroscópicos localizados en áreas subcorticales, tálamo o médula espinal sin compromiso meníngeo (15). Estas localizaciones inusuales parecen patognomónicas de infección por L. monocytogenes (16). La mortalidad de la infección del SNC varía entre el 20 y el 60%, dependiendo del grado y evolución de la infección así como de la enfermedad de base del paciente. En algunos grupos de riesgo, como los pacientes con neoplasias, L. monocytogenes es la primera causa de meningitis bacteriana (11). Los mecanismos a través de los cuales L. monocytogenes accede al SNC son poco conocidos, pero en base a observaciones in vitro e in vivo parece que existen dos posibles rutas implicadas. Una ruta neuronal retrógrada a través del epitelio oral y probablemente asociada a la enfermedad en rumiantes y que justificaría la romboencefalitis como la principal manifestación de infección del SNC en estos animales, en contraste con la enfermedad en humanos donde la ruta es por vía hematógena a través de los leucocitos circulantes que cruzarían la barrera ~ 26 ~ ciprofloxacino, que no parecía estar relacionada con su acumulación a nivel intracelular, similar en ambos fármacos, sino con la diferencia entre los valores de CMI de los dos fármacos frente a L. monocytogenes . Un análisis detallado mostró que aunque la concentración de moxifloxacino en LCR fue sólo de un 20 a un 50% de la obtenida en plasma, y que a nivel intracelular moxifloxacino mostraba 1/7 de su actividad a nivel extracelular, la baja CMI de L. monocytogenes le permitía ejercer una excelente actividad bactericida. En otro trabajo de Grayo et al. (43) comparan la actividad in vitro de moxifloxacino y ampicilina, mediante curvas de tiempo-muerte e inhibición del crecimiento intracelular en macrófagos infectados por L. monocytogenes . Demuestran que tanto moxifloxacino como amoxicilina fueron bactericidas en caldo contra las formas extracelulares de la bacteria. Sin embargo, moxifloxacino fue más rápidamente bactericida, comenzando a ejercer sus efectos en las primeras 3 horas, y logrando la esterilización completa del caldo a las 24 horas de incubación. Además, moxifloxacino presentó un rápido efecto bactericida a nivel intracelular, mientras que amoxicilina fue sólo bacteriostática. Adicionalmente aquel previno la lisis celular, la posterior propagación bacteriana a las células adyacentes, y no seleccionó bacterias resistentes durante los experimentos in vitro . En otro trabajo, el mismo grupo corrobora los resultados anteriores en un modelo murino de infección del SNC (44). La eficacia in vivo de moxifloxacino y amoxicilina se comparó mediante ensayos de supervivencia y estudio de la cinética de crecimiento bacteriano en sangre y distintos ~ 27 ~ órganos. Se constató que la muerte se retrasó significativamente en los animales tratados con una dosis única de moxifloxacino en comparación con una dosis única de amoxicilina. Se observó la rápida eliminación de bacterias en la sangre y órganos de los animales tratados con moxifloxacino, y además, la disminución en los recuentos bacterianos en sangre y tejido cerebral se correlacionó con las concentraciones en plasma y LCR del antibiótico, demostrándose que moxifloxacino atraviesa la barrera hematoencefálica y se difunde en el parénquima cerebral muy rápidamente. Concluyen, que la eficacia in vivo de moxifloxacino es consecuencia de su rápida actividad bactericida a nivel intracelular en los distintos focos de infección del SNC, principalmente a nivel de los abscesos cerebrales. En otro estudio in vitro , Seral et al. (45) estudian la actividad de distintas quinolonas frente a formas extracelulares e intracelulares de L. monocytogenes , llegando a la conclusión que la actividad de las quinolonas está reducida intracelularmente, de forma que sólo una parte de la concentración del antibiótico acumulado ejerce efecto antibacteriano debido a las condiciones locales o a que las bacterias intracelulares responden de forma escasa a las quinolonas. No obstante, moxifloxacino fue con el que se obtuvo mejor resultado con reducciones de 2 log sobre los recuentos bacterianos iniciales. Sin embargo, en otro trabajo experimental de Sipahi et al. (46), donde comparan moxifloxacino versus (vs.) ampicilina más gentamicina en un modelo de meningitis experimental en conejos, se muestra que la actividad ~ 28 ~ de ambos tratamientos fue similar. Aunque, los mismos autores reconocen que el modelo de meningitis en conejo no refleja adecuadamente el proceso fisiopatológico en humanos. De todo lo anterior, se deduce que las pruebas de sensibilidad in vitro no tienen en cuenta otras variables biológicas del hospedador infectado que podrían afectar al resultado clínico. Además, evaluando los trabajos anteriores, se observa que el problema fundamental de todos ellos es que realizan los estudios con una sola cepa de colección que lógicamente no refleja el universo de L. monocytogenes con capacidad de producir infección; no teniendo en cuenta la virulencia de los aislamientos, y no efectuando las pruebas in vitro en condiciones de expresión similares a las encontradas in vivo y con una CMI representativa del peor escenario (CMI 90 ), además de no considerar las concentraciones teóricas del antibiótico presentes en LCR, aspecto relevante para otras bacterias grampositivas como S. pneumoniae , para la cual, la organización norteamericana “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) y la europea “The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” (EUCAST) proponen puntos de corte especiales de sensibilidad y resistencia. En conclusión, el tratamiento de la listeriosis y, más concretamente, de la infección del SNC, presenta facetas no bien resueltas. Asimismo, los métodos de estudio de la efectividad in vitro de los antibióticos no parecen correlacionarse con el resultado clínico, en parte por la naturaleza ~ 29 ~ intracelular de la infección y, por otra, por la no expresión de los factores de virulencia in vitro por parte la bacteria. ~ 30 ~ JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS DE TRABAJO ~ 31 ~ 2 Justificación e Hipótesis de trabajo La listeriosis es una de las enfermedades de transmisión alimentaria con mayor tasa de mortalidad, normalmente asociada en adultos (50-70% de los casos) con infección del SNC en forma de meningitis, y generalmente con bacteriemia concomitante. La mortalidad de la infección del SNC varía entre el 20 y el 60%, dependiendo del grado y evolución de la infección así como de la enfermedad de base del paciente. Actualmente, el tratamiento de la infección por L. monocytogenes , basado en una combinación de dosis altas de ampicilina asociada a gentamicina por vía i.v., no tiene en cuenta la localización en el SNC como un caso particular de tratamiento. La evidencia más importante de este efecto sinérgico entre ambos antibióticos proviene del trabajo clásico de Scheld et al. (año 1979), donde en un modelo experimental de meningitis en conejos, demostraban que la asociación de ampicilina más gentamicina era el tratamiento más efectivo. Sin embargo, a pesar de usar el tratamiento de elección, la listeriosis está asociada a un alto porcentaje de mortalidad (30%), especialmente cuando la infección compromete al SNC. Debido a la naturaleza intracelular de L. monocytogenes , los métodos convencionales de estudio de la sensibilidad a los antibióticos in vitro no parecen adecuados, por lo que el estudio de la eficacia de los antibióticos en cultivos celulares podría ser la mejor aproximación para valorar el potencial ~ 32 ~ terapéutico de los antimicrobianos. Más aún, cuando en los modelos animales no pueden reproducir eficazmente la listeriosis humana. Moxifloxacino es un potente antimicrobiano que atraviesa la barrera hematoencefálica y difunde en el parénquima cerebral muy rápidamente. Su eficacia in vivo es consecuencia de su rápida actividad bactericida a nivel intracelular, y en algunos trabajos, con un número muy reducido de cepas, ha demostrado actividad in vitro e in vivo en las infecciones del SNC por L. monocytogenes. Por todo lo anteriormente expuesto, nos hemos planteado como hipótesis de trabajo las siguientes: 1. Moxifloxacino es una alternativa terapéutica a ampicilina en el tratamiento de las infecciones del SNC (meningitis) por L. monocytogenes . 2. El serotipo y/o la virulencia de los aislamientos de L. monocytogenes influyen en la actividad in vitro e in vivo de los antimicrobianos. ~ 33 ~ OBJETIVOS ~ 34 ~ 3 Objetivos La demostración de las hipótesis planteadas, intentaremos obtenerla a partir de la consecución de unos objetivos parciales y secuenciales. 1. Conocer la distribución modal de los valores de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de moxifloxacino y ampicilina frente a una colección de cepas aisladas de casos clínicos, agrupadas por serotipos, clones epidémicos y pulsotipos. 2. Determinar las dosis más adecuadas, mediante simulación de Monte Carlo, para la efectividad/eficacia de moxifloxacino y ampicilina en condiciones de infección del SNC. 3. Estudiar la capacidad bactericida de moxifloxacino y ampicilina mediante curvas de tiempo-muerte en condiciones de infección del SNC, en aislamientos representativos de cada serotipo y de los principales pulsotipos y/o clones epidémicos. 4. Comparar la actividad intracelular de moxifloxacino y ampicilina en condiciones de infección del SNC, con aislamientos representativos de cada serotipo y de los principales pulsotipos y/o clones epidémicos, en un modelo celular de células epiteliales. ~ 35 ~ MATERIAL Y MÉTODOS ~ 42 ~ − AUC 24h, libre : área bajo la curva de la concentración de moxifloxacino frente al tiempo de 0 a 24 horas (AUC 24h ) − D 24h : dosis diaria − Biodisponibilidad: fracción del antibiótico no unida a proteínas capaz de penetrar en LCR − CL: aclaramiento total − CMI: concentración mínima inhibitoria Los parámetros farmacocinéticos incluidos en el modelo, fueron obtenidos de la literatura usando el valor medio y su coeficiente de variación (54-56). Se asumió que todos los parámetros PK en la población se distribuían de forma log-normal y los valores CMI se fijaron a valores entre 0,094 y 2 mg/L según la distribución encontrada en el estudio microbiológico indicado en el apartado 4.4.1. Se consideró como objetivo terapéutico alcanzar un AUC24h, free/MIC = 35 (62 bis) en ≥90% de las simulaciones. El punto de corte PK/PD de sensibilidad/resistencia fue definido como la mayor CMI en la cual la probabilidad de obtener el objetivo terapéutico de AUC 24h, free /MIC = 35 fuera ≥90% (63). ~ 43 ~ 4.5.3 Evaluación PK/PD de la actividad de ampicilina en LCR mediante simulación de Monte Carlo Se realizó una simulación de Monte Carlo sobre 10.000 individuos con el fin de valorar el éxito de una dosis i.v. de 200 y otra de 400 mg/Kg/día de ampicilina respectivamente, mediante una aplicación construida en Microsoft Excel, para un paciente tipo de 70 Kg con función renal normal y considerando como objetivo terapéutico un cociente de C max libre /CMB ≥10 (63 bis). Se empleó como ecuación PK-PD: C CC C max libre max libremax libre max libre LCR (C LCR (CLCR (C LCR (C max maxmax max )/CMB = (Dosis x Biodisponibilidad/Vss)/CMB )/CMB = (Dosis x Biodisponibilidad/Vss)/CMB)/CMB = (Dosis x Biodisponibilidad/Vss)/CMB )/CMB = (Dosis x Biodisponibilidad/Vss)/CMB − C max : máxima concentración de antibiótico obtenida en LCR (mg/L) − Dosis: dosis de antibiótico (mg/Kg) − Biodisponibilidad: fracción del antibiótico no unida a proteínas capaz de penetrar en LCR − Vss: volumen de distribución en el estado estacionario (L/Kg) − CMB: concentración mínima bactericida Los parámetros farmacocinéticos incluidos en el modelo, fueron obtenidos de la literatura usando el valor medio y su coeficiente de variación (52, 53). ~ 44 ~ Se asumió que todos los parámetros PK en la población se distribuían de forma log-normal y los valores CMB se fijaron a valores entre 0,064 y 8 mg/L según la distribución encontrada en el estudio de microdilución indicado en el apartado 4.4.2. El punto de corte PK/PD de sensibilidad/resistencia fue definido como el valor de CMB para el cual la probabilidad de obtener el objetivo terapéutico de C max,libre /CMB = 35 fuera ≥90%. 4.6 Selección de los aislamientos para los estudios de actividad antimicrobiana intra y extracelular La actividad bactericida intra y extracelular de moxifloxacino y ampicilina fue evaluada frente a una cepa de L. monocytogenes de cada serotipo de los aislamientos de la serie incluida en el estudio, y una cepa de cada uno de los principales pulsotipos (agrupaciones clonales) y/o clones epidémicos que presentaban una CMI equivalente a la CMI 90 (peor escenario desde el punto de vista microbiológico). Un total de seis cepas fueron evaluadas (tabla 1). ~ 45 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 1 11 1. . . . Características de las cepas seleccionadas Características de las cepas seleccionadasCaracterísticas de las cepas seleccionadas Características de las cepas seleccionadas para los estudios de actividad antimicrobiana para los estudios de actividad antimicrobiana para los estudios de actividad antimicrobiana para los estudios de actividad antimicrobiana intra y extracelular intra y extracelularintra y extracelular intra y extracelular. .. . Nº de cepa Nº de cepaNº de cepa Nº de cepa serotipo serotiposerotipo serotipo PFGE PFGEPFGE PFGE EC ECEC EC CMI CMI CMI CMI ampicilina ampicilinaampicilina ampicilina CMI CMI CMI CMI moxifloxacino moxifloxacinomoxifloxacino moxifloxacino 28 1/2b 1/2b1/2b 1/2b P22 - 0,25 0,5 49 4b 4b4b 4b P19 ECI 0,5 0,5 57 1/2a 1/2a1/2a 1/2a P53 - 0,25 0,5 60 1/2a 1/2a1/2a 1/2a P53 ECIII 0,5 0,5 79 4b 4b4b 4b P44 ECII 0,25 0,5 118 1/2c 1/2c1/2c 1/2c P56 - 0,25 0,5 *EC: clones epidémicos *PFGE: electroforesis en campo pulsado 4.7 Actividad antimicrobiana extracelular. Curvas de tiempo-muerte Las curvas de tiempo-muerte se realizaron por triplicado según la metodología descrita por Grayo et al. y Carryn et al. (38, 43, 61). Se realizó una siembra en placa de agar sangre a partir de una alícuota congelada de L. monocytogenes y se incubó a 37ºC en atmósfera aerobia durante 24 horas. Tras las 24 horas de incubación se tomaron unas colonias de Listeria y se realizó una suspensión a 0,5 McFarland, equivalente a 1x10 8 UFC/mL. Usando la fórmula: C1 x V1 = C2 x V2, se calculó la cantidad de volumen de esa concentración inicial que habría que añadirle a 20 mL de caldo Müeller-Hinton para obtener una concentración ~ 46 ~ bacteriana final de 1 x 10 5 UFC/mL en 20 mL de caldo. En nuestro caso fue de 0,1 mL. En el caso de moxifloxacino, se inocularon 5 x 10 5 UFC/mL en 3 tubos con 20 mL de medio de cultivo Müeller-Hinton, en cada uno de los cuales se añadieron las siguientes concentraciones de antibiótico: 0,5 mg/L, 1,5 mg/L y 2,28 mg/L, correspondientes a los valores de la CMI así como de los valores de la C max media estimadas en LCR con las dosis de 400 mg/día y 800 mg/día, respectivamente. Como grupo control se inoculó un cuarto tubo sin antibiótico. En el caso de ampicilina, se inocularon 5 x 10 5 UFC/mL en 4 tubos con 20 mL de medio de cultivo Müeller-Hinton en cada uno de los cuales se añadieron las siguientes concentraciones de antibiótico: 0,5 mg/L, 1,5 mg/L, 24,5 mg/L y 49 mg/L, correspondientes a los valores de la CMI, 3 veces la CMI y las C max medias estimadas en LCR con dosis de 200 mg/Kg/día y 400 mg/Kg/día, respectivamente. Como grupo control se inoculó un quinto tubo sin antibiótico. En el caso del estudio de sinergia de ambos antibióticos, se inocularon 5 x 10 5 UFC/mL en 3 tubos con 20 mL de medio de cultivo Müeller-Hinton en cada uno de los cuales se añadieron las siguientes concentraciones de antibióticos: 0,5 mg/L de ampicilina + 0,5 mg/L de moxifloxacino, 1,5 mg/L de ampicilina + 1,5 mg/L de moxifloxacino, y 49 mg/L de ampicilina + 2,28 mg/L de moxifloxacino, correspondientes a los valores de la CMI, 3 veces la ~ 47 ~ CMI y las C max medias estimadas en LCR con dosis de 400 mg/Kg/día de ampicilina y 800 mg/día de moxifloxacino, respectivamente. Como grupo control se inoculó un cuarto tubo sin antibiótico. Todos los tubos fueron incubados a 37ºC en atmósfera aerobia. A las 0, 3, 6, 24 y 48 horas de la inoculación, se realizaron diluciones seriadas (10 -2 , 10 -4 y 10 -6 ) de cada uno de los tubos con las diferentes concentraciones de antibióticos y del tubo control, para posteriormente subcultivar 10µL de cada una de ellas en placas de agar sangre. Las placas fueron incubadas a 37ºC en atmósfera aerobia durante un período de 20 a 24 horas, pasado el cual se procedió al recuento de las colonias, expresándose los resultados en UFC/mL, correspondientes a la media +/- error estándar de los 3 experimentos. La actividad bactericida fue definida como la muerte de al menos el 99,9% del inóculo inicial después de 24 horas de incubación (reducción de al menos 3 log UFC/mL). La tasa de muerte fue definida como la disminución del inóculo inicial en las primeras 3 horas (61). Los resultados de la interacción de los antimicrobianos estudiados en combinación mediante curvas de muerte bacteriana, fueron interpretados de acuerdo a los criterios establecidos por Pillai et al. (61, 64). Se consideró efecto sinérgico a una reducción de al menos 2 log en el recuento de colonias ~ 48 ~ a las 24 horas de la combinación de ambos antibióticos, respecto al recuento obtenido con el antimicrobiano más activo en solitario. Adicionalmente se estudió la disminución del área bajo la curva de muerte bacteriana (AUKC) a las 6, 24 y 48 horas, en base a lo publicado por MacGowan et al. (64 bis, 65). Las curvas de muerte fueron modelizadas y estudiadas mediante el programa GraphPadPrism 5.0 (©2014 GraphPad Software, Inc). 4.8 Actividad antimicrobiana intracelular 4.8.1 Aislamientos bacterianos y condiciones de crecimiento Se utilizaron para los experimentos seis cepas de L. monocytogenes seleccionadas en base a lo indicado en el apartado 4.6. Las cepas se sembraron en caldo Müeller-Hinton y se incubaron a 37ºC durante 20-24 horas. Posteriormente, los cultivos fueron lavados con solución tampón fosfato salino (PBS) y resuspendidos en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) antes de su uso en los experimentos en células eucariotas. 4.8.2 Cultivo e infección de las células humanas ~ 49 ~ Para el estudio de la actividad intracelular, se utilizó DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF) inactivado por calor, vancomicina (50 µg/mL), gentamicina (20 µg/mL), anfotericina B (0,25 µg/mL) y tampón N-2-(hydroxyethyl) piperazine-N’-2-ethane sulfonicacid (HEPES) al 1%, e incubado a 37ºC en estufa de CO 2 . Las células A549 (línea celular Type II pneumocyte derivada de carcinoma de pulmón humano) fueron subcultivadas de forma rutinaria cada 3-4 días. Se preparó una suspensión de 1 x 10 5 células/mL, inoculándose 1 mL del medio con las células en cada uno de los pocillos de las placas de cultivo celular antes de su infección con L. monocytogenes. Se incubaron 24 horas hasta formar una monocapa confluente uniforme. Inmediatamente antes de la infección con L. monocytogenes , las células A549 fueron lavadas tres veces con PBS precalentado y posteriormente incubadas en DMEM sin SBF ni antibióticos con 1 x 10 8 UFC/mL de L. monocytogenes , durante 1 hora en estufa a 37ºC. 4.8.3 Valoración de la actividad intracelular Tras ese período, las células A549 infectadas se lavaron tres veces con PBS precalentado y fueron tratadas con gentamicina a una concentración de 256 µg/mL durante una hora en estufa a 37ºC, a fin de eliminar las bacterias extracelulares. Posteriormente las células se lavaron tres veces con PBS ~ 50 ~ precalentado y fueron tratadas con 0,5 y 1 C max de moxifloxacino durante 1 y 24 horas y con 0,5 y 1 C max de ampicilina durante 1 y 24 horas. Tras los tiempos indicados, las células fueron lisadas con Triton X-100 al 0.5% y posteriormente sembradas en placas de agar sangre realizándose diluciones seriadas (10 -2 , 10 -4 y 10 -6 ). Se incubaron a 37ºC durante 24 horas para el recuento de colonias, y así determinar el número de bacterias intracelulares supervivientes. Las resultados fueron modelizados y estudiados mediante el programa GraphPadPrism 5.0 (©2014 GraphPad Software, Inc). ~ 51 ~ RESULTADOS ~ 58 ~ 75 1 1/2a P53 1/2a ECIII 0,25 8 0,25 0,5 76 1 1/2b P42 1/2b 0,25 8 0,25 0,5 77 1 1/2b P51 1/2b 0,25 8 0,25 0,5 78 4 4b P9 4b ECI 0,5 8 0,25 0,5 79 4 4b P44 4b ECII 0,25 8 0,5 0,5 80 1 1/2a P53 1/2a ECIII 0,125 8 0,25 0,25 81 1 1/2a P53 1/2a ECIII 0,125 8 0,25 0,5 82 1 1/2b P48 1/2b 0,25 8 0,25 0,5 83 1 1/2a P61 1/2a ECIII 0,125 8 0,25 0,5 84 1 1/2b P49 1/2b 0,125 8 0,25 0,5 85 1 1/2b P42 1/2b 0,125 8 0,25 0,25 86 1 1/2c P56 1/2c 0,25 8 0,25 0,25 87 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,25 0,25 88 1 1/2a P53 1/2a ECIII 0,125 8 0,25 0,5 89 4 4b P37 4b ECII 0,25 8 0,5 0,5 90 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,5 0,5 91 4 4b P61 4b ECI 0,125 8 0,25 0,5 92 1 1/2a P24 1/2a ECIII 0,125 8 0,5 0,5 93 4 4b P26 4b 0,5 1 0,5 0,5 ~ 59 ~ 94 1 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 95 1 1/2b P6 1/2b 0,25 8 0,25 0,25 96 4 4b P25 4b 0,25 8 0,25 0,5 97 4 4b P7 4b 0,25 8 0,25 0,25 98 4 4b P14 4b 0,25 8 0,25 0,5 99 1 1/2a P59 1/2a 0,25 8 0,25 0,5 100 4 4b P18 4b ECI 0,25 4 0,25 0,5 101 4 4b P28 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 102 1 1/2b P22 1/2b 0,25 8 0,25 0,25 103 4 4b P9 4b ECI 0,5 8 0,25 0,5 104 4 4b P9 4b ECI 0,5 8 0,5 0,5 105 1 1/2b P1 1/2b 0,25 8 0,5 0,5 106 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,5 0,5 107 4 4b P28 4b 0,25 8 0,25 0,5 108 4 4b P5 4b 0,125 8 0,5 0,5 109 1 1/2b P3 1/2b 0,125 8 0,25 0,25 110 4 4b P38 4b 0,25 4 0,25 0,5 111 4 4b P7 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 112 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 ~ 60 ~ 113 1 1/2c P56 1/2c 0,125 8 0,25 0,5 114 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 115 1 1/2b P13 1/2b 0,25 8 0,25 0,25 116 4 4b P7 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 117 1 1/2b P16 1/2b 0,5 8 0,25 0,25 118 1 1/2c P56 1/2c 0,25 4 0,5 0,5 119 4 4b P12 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 120 4 4b P30 4b 0,25 8 0,25 0,5 121 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 122 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,5 0,5 123 1 1/2b P48 1/2b 0,25 8 0,5 0,5 124 1 1/2a P53 1/2a 0,25 8 0,5 0,5 125 1 1/2b P1 1/2b 0,5 8 0,25 0,25 126 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,5 0,5 127 4 4b P9 4b 0,25 8 0,25 0,25 128 4 4b P8 4b 0,25 8 0,25 0,5 129 4 4b P9 4b 0,25 8 0,25 0,5 130 1 1/2b P6 1/2b 0,25 4 0,25 0,25 131 4 4b P19 4b ECI 0,5 8 0,25 0,25 ~ 61 ~ 132 4 4b P39 4b 0,25 8 0,25 0,5 133 1 1/2a P60 1/2a 0,125 4 0,25 0,5 134 4 4b P40 4b 0,25 8 0,5 0,5 135 1 1/2a P53 1/2a 0,25 8 0,5 0,5 136 4 4b P46 4b ECII 0,5 4 0,25 0,25 137 4 4b P4 4b 0,5 4 0,25 0,5 138 1 1/2b P50 1/2b 0,25 8 0,25 0,5 139 1 1/2c P56 1/2c 0,25 8 0,25 0,5 140 1 1/2b P42 1/2b 0,25 4 0,25 0,25 141 1 1/2b P42 1/2b 0,25 8 0,25 0,25 142 4 4b P9 4b 0,5 8 0,25 0,5 143 4 4b P25 4b 0,5 8 0,25 0,25 144 4 4b P19 4b 0,5 8 0,25 0,25 145 4 4b P7 4b ECI 0,5 8 0,25 0,5 146 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,25 0,5 147 4 4b P9 4b ECI 0,25 8 0,25 0,25 148 4 4b P9 4b 0,25 8 0,25 0,5 149 4 4b P9 4b 0,5 8 0,25 0,5 150 1 1/2a P62 1/2a 0,25 4 0,25 0,5 151 4 4b P9 *PFGE: electroforesis en campo pulsado. *EC: clon epidémico. En las figuras 1 CMI y CMB a moxifloxacino Figura Figura Figura Figura 1 11 1. Histograma . Histograma . Histograma . Histograma de la distribución de la distribuciónde la distribución de la distribución La mayor parte de las cepas ( moxifloxacino . De las cepas restantes, el 3,3% a 0,125 mg/L. ~ 62 ~ 4b 0,5 8 0,25 electroforesis en campo pulsado. a la 4 se representan gráficamente los resultados de CMI y CMB a moxifloxacino y ampicilina en todas las cepas estudiadas. de la distribución de la distribuciónde la distribución de la distribución de de de de valores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepas valores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepasvalores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepas valores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepas La mayor parte de las cepas ( 80%) eran sensibles a . De las cepas restantes, el 16,7% lo fueron a 0,5 a la 4 se representan gráficamente los resultados de en todas las cepas estudiadas. valores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepas valores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepasvalores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepas valores de CMI de moxifloxacino en las 150 cepas . .. . 0,25 mg/L de 0,5 mg/L y el Figura Figura Figura Figura 2 22 2. . . . Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. La mayoría de las cepas ( 32 % tuvo una CMB de 0,25 mg/L y el Figura Figura Figura Figura 3 33 3. . . . Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. ~ 63 ~ Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. La mayoría de las cepas ( 67,3 %) tuvieron una CMB de 0,5 mg/L. El % tuvo una CMB de 0,25 mg/L y el 0,7% de 0,125 mg/L. Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de moxifloxacino en las 150 cepas. %) tuvieron una CMB de 0,5 mg/L. El Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMI de ampicilina en las 150 cepas. Los porcentajes de sensibilidad a ampicilina fueron de 34,7 % para las CMIs de 0,125, 0,25 y 0,5 mg/L, respectivamente. Figura Figura Figura Figura 4 44 4. . . . Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. La mayor parte de las cepas las restantes (12,7 %), fue de 4mg/L. CM B de 1 mg/L o de 2 mg/L 5.1.2 Estudio de la CMI y CMB por serotipos 5.1.2.1 Moxifloxacino En la tabla 4 se exponen los resultados de relación a los serotipo ~ 64 ~ Los porcentajes de sensibilidad a ampicilina fueron de 10,7 % para las CMIs de 0,125, 0,25 y 0,5 mg/L, respectivamente. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. La mayor parte de las cepas (86%) presenta ron una CMB %), fue de 4mg/L. Sólo el 0,7% de las cepas tuvieron una B de 1 mg/L o de 2 mg/L . Estudio de la CMI y CMB por serotipos se exponen los resultados de CMI de moxifloxacino s. Todos los serotipos estudiados se comport 10,7 %, 54,7% y % para las CMIs de 0,125, 0,25 y 0,5 mg/L, respectivamente. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas.Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. Histograma de la distribución de valores de CMB de ampicilina en las 150 cepas. ron una CMB ≥8 mg/L, en Sólo el 0,7% de las cepas tuvieron una moxifloxacino en Todos los serotipos estudiados se comport an de ~ 65 ~ forma similar, no obstante, la CMI 90 del serotipo 1/2b fue de 0,25 mg/L, difiriendo en una dilución al cómputo global. Las 6 cepas con las CMI de moxifloxacino más bajas (0,125 mg/L) correspondían al serogrupo 1/2b. Tabla Tabla Tabla Tabla 4 44 4. . . . Distribución de los valores de CMI de moxi Distribución de los valores de CMI de moxiDistribución de los valores de CMI de moxi Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los serotipos. floxacino en relación con los serotipos.floxacino en relación con los serotipos. floxacino en relación con los serotipos. Moxifloxacino CMI Total 0,125 0,25 0,5 Serotipo 1/2a Recuento 0 16 9 25 % dentro de serotipo 0,0% 64,0% 36,0% 100,0% 1/2b Recuento 5 23 2 30 % dentro de serotipo 16,7% 76,7% 6,7% 100,0% 1/2c Recuento 0 3 0 3 % dentro de serotipo 0,0% 100,0% 0,0% 100,0% 4b Recuento 0 78 14 92 % dentro de serotipo 0,0% 84,8% 15,2% 100,0% Serotipo 1/2a, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,5 mg/L Serotipo 1/2b, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,25 mg/L Serotipo 4b, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,5 mg/L ~ 66 ~ En la tabla 5 se exponen los resultados de CMB a moxifloxacino en base al serotipo. La CMB 50 del serotipo 1/2b fue de 0,25 mg/L, difiriendo una dilución del cómputo global. Tabla Tabla Tabla Tabla 5 55 5. . . . Distribución de los Distribución de los Distribución de los Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los serotipos. valores de CMB de moxifloxacino en relación con los serotipos.valores de CMB de moxifloxacino en relación con los serotipos. valores de CMB de moxifloxacino en relación con los serotipos. Moxifloxacino CMB Total 0,125 0,25 0,5 Serotipo 1/2a Recuento 0 3 22 25 % dentro de serotipo 0,0% 12,0% 88,0% 100,0% 1/2b Recuento 1 21 8 30 % dentro de serotipo 3,3% 70,0% 26,7% 100,0% 1/2c Recuento 0 1 2 3 % dentro de serotipo 0,0% 33,3% 66,7% 100,0% 4b Recuento 0 23 69 92 % dentro de serotipo 0,0% 25,0% 75,0% 100,0% Serotipo 1/2a, CMB 50 = 0,5 mg/L; CMB 90 = 0,5 mg/L Serotipo 1/2b, CMB 50 = 0,25 mg/L; CMB 90 = 0,5 mg/L Serotipo 4b, CMB 50 = 0,5 mg/L; CMB 90 = 0,5 mg/L ~ 67 ~ 5.1.2.2 Ampicilina En la tabla 6 se exponen los resultados de CMI de ampicilina en relación al serotipo al que pertenecen las cepas. Como aspectos más destacables, los valores modales de CMI 50 y CMI 90 para los serotipos 1/2a y 1/2b fueron de 0,25 mg/L, mientras que en el serotipo 4b la CMI 90 aumentó en una dilución. Tabla Tabla Tabla Tabla 6 66 6. . . . Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los serotipos. Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los serotipos.Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los serotipos. Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los serotipos. Ampicilina CMI Total 0,125 0,25 0,5 Serotipo 1/2a Recuento 10 14 1 25 % dentro de serotipo 40,0% 56,0% 4,0% 100,0% 1/2b Recuento 3 22 5 30 % dentro de serotipo 10,0% 73,3% 16,7% 100,0% 1/2c Recuento 1 2 0 3 % dentro de serotipo 33,3% 66,7% 0,0% 100,0% 4b Recuento 2 44 46 92 % dentro de serotipo 2,2% 47,8% 50,0% 100,0% Serotipo 1/2a, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,25 mg/L Serotipo 1/2b, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,25 mg/L ~ 74 ~ 5.1.4 Estudio de la CMI y CMB de los pulsotipos (PFGE) más importantes 5.1.4.1 Moxifloxacino En la tabla 12 se exponen los resultados de CMI de moxifloxacino en relación con los dos pulsotipos más abundantes, P53 y P9, pertenecientes en su mayor parte a los clones ECIII y ECI, respectivamente. No existieron diferencias de CMI, salvo, la CMI 90 de P53 de 0,25 mg/L, una dilución menor que P9. Tabla Tabla Tabla Tabla 12 1212 12. Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y P9. . Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y P9.. Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y P9. . Distribución de los valores de CMI de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y P9. Moxifloxacino CMI Total 0,125 0,25 0,5 PFGE P53 0 10 5 15 0,0% 66,7% 33,3% 100,0% P9 0 17 6 23 0,0% 73,9% 26,1% 100,0% P53, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,25 mg/L P9, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,5 mg/L En la tabla 13 se exponen los resultados de CMB de moxifloxacino en relación con los dos pulsotipos más abundantes. No existieron diferencias. ~ 75 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 13 1313 13. Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y . Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y . Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y . Distribución de los valores de CMB de moxifloxacino en relación con los pulsotipos P53 y P9. P9.P9. P9. Moxifloxacino CMB Total 0,125 0,25 0,5 PFGE P53 0 2 13 15 0,0% 13,3% 86,7% 100,0% P9 0 3 20 23 0,0% 13,0% 87,0% 100,0% P53, CMB 50 = 0,5 mg/L; CMB 90 = 0,5 mg/L P9, CMB 50 = 0,5 mg/L; CMB 90 = 0,5 mg/L 5.1.4.2 Ampicilina En la tabla 14 se exponen los resultados de CMI de ampicilina en los dos pulsotipos más abundantes. La CMI 90 de P53 fue de 0,25 mg/L, una dilución menor que P9. Tabla Tabla Tabla Tabla 14 1414 14. Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. . Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9.. Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. . Distribución de los valores de CMI de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. Ampicilina CMI Total 0,125 0,25 0,5 PFGE P53 6 8 1 15 40,0% 53,3% 6,7% 100,0% ~ 76 ~ P9 0 16 7 23 0,0% 69,6% 30,4% 100,0% P53, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,25 mg/L P9, CMI 50 = 0,25 mg/L; CMI 90 = 0,5 mg/L En la tabla 15 se exponen los resultados de CMB de ampicilina en los dos clones más abundantes. No existieron diferencias. Tabla Tabla Tabla Tabla 15 1515 15. Distribución de los valores de CMB de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. . Distribución de los valores de CMB de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9.. Distribución de los valores de CMB de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. . Distribución de los valores de CMB de ampicilina en relación con los pulsotipos P53 y P9. Ampicilina CMB Total 1 2 4 ≥8 PFGE P53 0 0 1 14 15 0,0% 0,0% 6,7% 93,3% 100,0% P9 0 0 0 23 23 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 100,0% P53, CMB 50 = ≥8 mg/L; CMB 90 = ≥8 mg/L P9, CMB 50 = ≥8 mg/L; CMB 90 = ≥8 mg/L En base a los resultados obtenidos, podemos concluir que no existió diferencia significativa entre los pulsotipos más importantes de Listeria (P53 y P9) para ambos antibióticos. 5.2 Estudio PK/PD 5.2.1 Cálculo de la C Monte Carlo La C max media de moxifloxacino en LCR alcanzada en la s con dosis de 400 mg comprendido entre 0,69 mg /día fue de 2,28 mg/L; Figura Figura Figura Figura 5 55 5. D . D. D . Distribución de la istribución de la istribución de la istribución de la C CC C max max max max ~ 77 ~ Cálculo de la C max de moxifloxacino en LCR por simulación de media de moxifloxacino en LCR alcanzada en la s con dosis de 400 mg /día fue de 1,14 mg/L; variando en un rango 0,69 -1,71 mg/L (Figura 5 ), mientras que con /día fue de 2,28 mg/L; con un rango de 1,68- 3,59 mg/L (Figura 6 max max max max de moxifloxacino de moxifloxacinode moxifloxacino de moxifloxacino en LCR en LCRen LCR en LCR a dosis de a dosis de a dosis de a dosis de 400 mg 400 mg400 mg 400 mg/día /día/día /día i.v i.vi.v i.v de moxifloxacino en LCR por simulación de media de moxifloxacino en LCR alcanzada en la s imulación variando en un rango ), mientras que con dosis de 800 3,59 mg/L (Figura 6 ). i.v i.vi.v i.v . .. . Figura Figura Figura Figura 6 66 6. D . D. D . Distribución de la istribución de la istribución de la istribución de la C CC C max max max max 5.2.2 Cálculo de la C Monte Carlo La C max media de ampicilina en LCR alcanzada en la s dosis de 200 mg/Kg/ día fue de 24,5 mg/L; variando en un rango comprendid entre 22,4- 52,5 mg/L (Figura 7 fue de 49 mg/L; con un rango ~ 78 ~ max max max max de moxifloxacino de moxifloxacinode moxifloxacino de moxifloxacino en LCR en LCRen LCR en LCR a dosis de a dosis de a dosis de a dosis de 800 mg 800 mg800 mg 800 mg/día /día/día /día i ii i. .. . v vv v Cálculo de la C max de ampicilina en LCR por simulación de media de ampicilina en LCR alcanzada en la s día fue de 24,5 mg/L; variando en un rango comprendid 52,5 mg/L (Figura 7 ), mientr as que con la dosis de 400 mg fue de 49 mg/L; con un rango entre 45,3-101,1 mg/L (Figura 8 ). v vv v . .. . de ampicilina en LCR por simulación de media de ampicilina en LCR alcanzada en la s imulación con día fue de 24,5 mg/L; variando en un rango comprendid o as que con la dosis de 400 mg /Kg/día ). Figura Figura Figura Figura 7 77 7. Distribución de la . Distribución de la . Distribución de la . Distribución de la C CC C max max max max Figura Figura Figura Figura 8 88 8. Distribución de la . Distribución de la . Distribución de la . Distribución de la C CC C max max max max ~ 79 ~ max max max max de ampicilina de ampicilinade ampicilina de ampicilina en LCR en LCRen LCR en LCR a dosis de a dosis de a dosis de a dosis de 200 mg 200 mg200 mg 200 mg/Kg /Kg/Kg /Kg/día /día/día /día i.v i.vi.v i.v max max max max de ampicilina de ampicilinade ampicilina de ampicilina en LCR en LCRen LCR en LCR a dosis de a dosis de a dosis de a dosis de 400 mg 400 mg400 mg 400 mg/Kg /Kg/Kg /Kg/día /día/día /día i.v i.vi.v i.v i.v i.vi.v i.v . .. . i.v i.vi.v i.v . .. . 5.2.3 Análisis PK/PD de la actividad de moxifloxacino en SNC 5.2.3.1 Dosis de 400 mg La probabilidad (%) de alcanzar un AUC 400 mg /c24h i.v. en LCR por simulación M El modelo predice una buena actividad de moxif de CMI = 0,25 mg/L (99%; 9 actividad a valores de ≥ Figura Figura Figura Figura 9 99 9. . . . Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mgProbabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg ~ 80 ~ Análisis PK/PD de la actividad de moxifloxacino en SNC de 400 mg /día La probabilidad (%) de alcanzar un AUC libre,24h /CMI = 35 con dosis de /c24h i.v. en LCR por simulación M onte Carlo fue del 85% (Figura 9 predice una buena actividad de moxif loxacino hasta valores 0,25 mg/L (99%; 9 900/10000 de las simulaciones) y una caída de ≥ 0,5 mg/L (32,5%; 3249/10000 de las simulaciones). Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mgProbabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg /dí /dí/dí /dí a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino.a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino. Análisis PK/PD de la actividad de moxifloxacino en SNC = 35 con dosis de 85% (Figura 9 ). loxacino hasta valores 900/10000 de las simulaciones) y una caída de 0,5 mg/L (32,5%; 3249/10000 de las simulaciones). a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino.a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino. ~ 81 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 16 1616 16. . . . Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg/día i.v. de moxifloxacino en Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg/día i.v. de moxifloxacino en Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg/día i.v. de moxifloxacino en Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 400 mg/día i.v. de moxifloxacino en función de la CMI. función de la CMI.función de la CMI. función de la CMI. 5.2.3.2 Dosis de 800 mg/día La probabilidad (%) de alcanzar un AUC libre,24h /CMI = 35 con dosis de 800 mg/c24h i.v. en LCR por simulación Monte Carlo fue de 99,2% (Figura 10). El modelo predice una buena actividad de moxifloxacino hasta valores de CMI = 0,5 mg/L (95,7%; 9573/10000 de las simulaciones) y una caída de actividad a valores de ≥1 mg/L (40,8%; 4080/10000 de las simulaciones). D o s i s C M I 0 , 0 1 6 0 , 0 3 2 0 , 0 6 4 0 , 1 2 5 0 , 2 5 0 , 5 1 2 4 400 mg/Kg/dia %CMI 0% 0% 0% 6% 73% 21% 0% 0% 0% Target %Target 1 100% 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 5 100% 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 9640 1591 10 100% 10000 10000 10000 10000 10000 10000 9640 1591 3 15 100% 10000 10000 10000 10000 10000 9978 5653 40 0 20 99% 10000 10000 10000 10000 10000 9640 1591 3 0 25 96% 10000 10000 10000 10000 9995 8152 298 0 0 30 91% 10000 10000 10000 10000 9978 5653 40 0 0 35 85% 10000 10000 10000 10000 9900 3249 4 0 0 40 80% 10000 10000 10000 10000 9640 1591 3 0 0 45 74% 10000 10000 10000 9999 9079 730 0 0 0 Tabla Tabla Tabla Tabla 17 1717 17. . . . Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día i Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día iProbabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día i Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día i función de la CMI. función de la CMI.función de la CMI. función de la CMI. 5.2.4 Punto de corte PK/PD para moxifloxacino Los resultados previos nos permiten establecer como PK/PD para la dosis de 400 mg/día de moxif mg/L y para la dosis de D o s i s C M I 0 , 0 1 6 800 mg/Kg/dia %CMI 0% Target %Target 1 100% 10000 5 100% 10000 10 100% 10000 15 100% 10000 20 100% 10000 25 100% 10000 30 100% 10000 35 99% 10000 40 98% 10000 45 97% 10000 Figura Figura Figura Figura 10 1010 10. . . . Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mgProbabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg ~ 82 ~ Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día i Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día iProbabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día i Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg/día i .v. de moxifloxacino en .v. de moxifloxacino en .v. de moxifloxacino en .v. de moxifloxacino en Punto de corte PK/PD para moxifloxacino Los resultados previos nos permiten establecer como punto de corte dosis de 400 mg/día de moxif loxacino a nivel de SNC en mg/L y para la dosis de 800 mg/día de ≤0,5mg/L. 0 , 0 3 2 0 , 0 6 4 0 , 1 2 5 0 , 2 5 0 , 5 1 0% 0% 6% 73% 21% 0 % 10000 10000 10000 10000 10000 10 0 10000 10000 10000 10000 10000 10 0 10000 10000 10000 10000 10000 99 9 10000 10000 10000 10000 10000 98 3 10000 10000 10000 10000 9997 91 5 10000 10000 10000 10000 9961 77 2 10000 10000 10000 10000 9837 58 5 10000 10000 10000 9998 9573 40 8 10000 10000 10000 9997 9150 27 0 10000 10000 10000 9985 8541 17 1 Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mgProbabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg Probabilidad de alcanzar el objetivo AUC/MIC a dosis de 800 mg /dí /dí/dí /dí a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino.a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino. .v. de moxifloxacino en .v. de moxifloxacino en .v. de moxifloxacino en .v. de moxifloxacino en punto de corte loxacino a nivel de SNC en ≤0,25 1 2 4 % 0% 0% 0 00 10000 10000 0 00 9997 9150 9 7 9150 2704 3 7 5855 386 5 0 2704 52 2 6 1068 9 5 5 386 3 8 0 145 1 0 4 52 0 1 0 16 0 a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino.a i.v. de moxifloxacino. a i.v. de moxifloxacino. Considerando estos puntos de corte, las cepas serían sensibles y 5.2.5 Análisis PK/PD de la actividad de ampicilina en sistema nervioso central (SNC) 5.2.5.1 Dosis de 200 mg El análisis demuestra que con terapéutico de C max /CMB Figura Figura Figura Figura 11 1111 11. . . . Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino ~ 83 ~ estos puntos de corte, a dosis de 400 mg /día, las cepas serían sensibles y a dosis de 800 mg/día, el 10 0% de las cepas Análisis PK/PD de la actividad de ampicilina en sistema nervioso Dosis de 200 mg /Kg/día El análisis demuestra que con esta dosis y a nivel del SNC, el objetivo /CMB ≥ 10 sólo se conseguiría en el 4% de las Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino Cálculo del punto de corte PK/PD de moxifloxacino en LCR en función de la dosis. en LCR en función de la dosis.en LCR en función de la dosis. en LCR en función de la dosis. /día, el 73% de 0% de las cepas . Análisis PK/PD de la actividad de ampicilina en sistema nervioso esta dosis y a nivel del SNC, el objetivo 10 sólo se conseguiría en el 4% de las en LCR en función de la dosis. en LCR en función de la dosis.en LCR en función de la dosis. en LCR en función de la dosis. ~ 90 ~ En la tabla 23 se muestra la reducción logarítmica del crecimiento bacteriano con moxifloxacino. Éste se comportó, a las 6 horas de incubación, de forma bactericida para tres (ID79, ID28 e ID118) de las seis cepas analizadas (disminución ≥3 log), pertenecientes a los serogrupos 1/2a (ECIII), 1/2b y 1/2c, a concentraciones de 2,28 mg/L, 0,5 mg/L y 1,5 mg/L, respectivamente. En las 3 cepas restantes, ID57, ID49 e ID60, pertenecientes a los serogrupos 4b ECI, 4b ECII y 1/2a ECI, moxifloxacino se comportó de forma bactericida a las 24 horas, a concentraciones de 0,5 mg/L (ID57, ID49) y 1,5 mg/L (ID60). ~ 91 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 23 2323 23. . . . Reducción logarítmica de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Reducción logarítmica de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoReducción logarítmica de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Reducción logarítmica de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino. moxifloxacino.moxifloxacino. moxifloxacino. *nd: no determinado. Cepa ID 60 Cepa ID 60Cepa ID 60 Cepa ID 60 0h 0h0h 0h 5,6 nd 5,6 log reducc 5,6 log reducc 5,6 log reducc 1h 1h1h 1h 6,3 nd 6,1 0,5 6,1 0,5 5,8 0,2 3h 3h3h 3h 6,7 nd 5,8 0,1 5,0 -0,6 4,8 -0,9 6h 6h6h 6h 7,7 nd 4,9 -0,7 3,5 -2,1 3,1 -2,6 24h 24h24h 24h 8,5 nd 3,4 -2,2 1,7 -3,9 1,5 -4,1 48h 48h48h 48h 8,3 nd 1,8 -3,8 1,0 -4,6 0,0 -5,6 Cepa ID 28 Cepa ID 28Cepa ID 28 Cepa ID 28 0h 0h0h 0h 6,0 nd 6,0 log reducc 6,0 log reducc 6,0 log reducc 1h 1h1h 1h 6,1 nd 6,0 0,1 5,7 -0,2 5,5 -0,4 3h 3h3h 3h 7,2 nd 4,6 -1,3 3,3 -2,7 3,1 -2,8 6h 6h6h 6h 7,7 nd 2,8 -3,2 1,3 -4,6 2,0 -3,9 24h 24h24h 24h 8,3 nd 1,2 -4,7 0,0 -6,0 0,0 -6,0 48h 48h48h 48h 8,5 nd 0,5 -5,5 0,0 -6,0 0,0 -6,0 Cepa ID 79 Cepa ID 79Cepa ID 79 Cepa ID 79 0h 0h0h 0h 6,0 nd 6,0 log reducc 6,0 log reducc 6,0 log reducc 1h 1h1h 1h 6,1 nd 6,0 0,0 6,0 0,0 6,0 -0,1 3h 3h3h 3h 6,8 nd 5,7 -0,3 5,0 -1,0 4,8 -1,2 6h 6h6h 6h 7,6 nd 4,3 -1,7 3,2 -2,8 2,9 -3,1 24h 24h24h 24h 8,4 nd 2,0 -4,0 1,2 -4,9 0,5 -5,5 48h 48h48h 48h 8,4 nd 1,5 -4,5 0,7 -5,4 0,0 -6,0 Cepa ID 118 Cepa ID 118Cepa ID 118 Cepa ID 118 0h 0h0h 0h 5,6 nd 5,6 log reducc 5,6 log reducc 5,6 log reducc 1h 1h1h 1h 6,1 nd 6,0 0,5 5,8 0,2 5,7 0,1 3h 3h3h 3h 6,8 nd 5,3 -0,3 3,4 -2,2 3,1 -2,4 6h 6h6h 6h 8,0 nd 3,5 -2,1 2,3 -3,3 1,6 -4,0 24h 24h24h 24h 8,3 nd 2,0 -3,6 1,2 -4,4 0,0 -5,6 48h 48h48h 48h 8,4 nd 1,7 -3,9 0,5 -5,1 0,0 -5,6 Cepa ID 49 Cepa ID 49Cepa ID 49 Cepa ID 49 0h 0h0h 0h 6,3 nd 6,3 log reducc 6,3 log reducc 6,3 log reducc 1h 1h1h 1h 6,3 nd 6,2 -0,1 6,1 -0,2 6,0 -0,3 3h 3h3h 3h 6,6 nd 5,3 -1,1 4,6 -1,7 4,5 -1,8 6h 6h6h 6h 7,4 nd 4,1 -2,2 3,6 -2,8 3,5 -2,8 24h 24h24h 24h 8,7 nd 2,1 -4,2 1,8 -4,6 1,1 -5,2 48h 48h48h 48h 8,5 nd 1,5 -4,8 1,1 -5,2 0,0 -6,3 Cepa ID 57 Cepa ID 57Cepa ID 57 Cepa ID 57 0h 0h0h 0h 6,2 nd 6,2 log reducc 6,2 log reducc 6,2 log reducc 1h 1h1h 1h 6,2 nd 6,2 0,0 6,0 -0,1 6,2 0,0 3h 3h3h 3h 6,3 nd 5,9 -0,3 5,6 -0,6 5,2 -1,0 6h 6h6h 6h 6,8 nd 5,0 -1,2 4,2 -1,9 4,1 -2,1 24h 24h24h 24h 8,5 nd 3,2 -3,0 2,6 -3,6 1,9 -4,3 48h 48h48h 48h 8,5 nd 2,2 -4,0 1,3 -4,9 0,5 -5,7 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Control 0,5 mg/L ~ 92 ~ En la tabla 24 queda resumida la reducción logarítmica conjunta de las seis cepas. Tabla Tabla Tabla Tabla 24 2424 24. Reducción logarítmica media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino. . Reducción logarítmica media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino.. Reducción logarítmica media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino. . Reducción logarítmica media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino. Tiempo (h) 1CMI 3CMI Cmax 3 -0,5 -1,5 -1,7 6 -1,9 -2,9 -3,1 24 -3,6 -4,6 -5,1 48 -4,4 -5,2 -5,9 A concentraciones de 3CMI y C max, moxifloxacino se comporta de manera bactericida a las 6 horas de incubación. La tasa de muerte definida como la reducción del inóculo inicial a las tres horas de incubación, osciló entre 0,5 y 1,7 log en función de la concentración del antibiótico. El análisis en conjunto de las seis cepas estudiadas demuestra que moxifloxacino fue bactericida a las seis horas de incubación a concentraciones de 3 x CMI y C max , y a las 24 horas a todas las concentraciones. En las siguientes figuras (Figuras 14-19) se muestra de forma gráfica la evolución temporal del crecimiento bacteriano en presencia y ausencia del antibiótico. ~ 93 ~ Figura Figura Figura Figura 14 1414 14. . . . Recuento logarítmico Recuento logarítmicoRecuento logarítmico Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempode la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 60. moxifloxacino de la cepa 60.moxifloxacino de la cepa 60. moxifloxacino de la cepa 60. Figura Figura Figura Figura 15 1515 15. . . . Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempode la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 28. moxifloxacino de la cepa 28.moxifloxacino de la cepa 28. moxifloxacino de la cepa 28. Figura Figura Figura Figura 16 1616 16. . . . Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempode la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 79. moxifloxacino de la cepa 79.moxifloxacino de la cepa 79. moxifloxacino de la cepa 79. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Tiempo (h) L o g U F C ~ 94 ~ Figura Figura Figura Figura 17 1717 17. . . . Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempode la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 118. moxifloxacino de la cepa 118.moxifloxacino de la cepa 118. moxifloxacino de la cepa 118. Figura Figura Figura Figura 18 1818 18. . . . Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempode la actividad extracelular mediante curvas de tiempo de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 49. moxifloxacino de la cepa 49.moxifloxacino de la cepa 49. moxifloxacino de la cepa 49. Figura Figura Figura Figura 19 1919 19. . . . Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico Recuento logarítmico de la de lade la de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo actividad extracelular mediante curvas de tiempoactividad extracelular mediante curvas de tiempo actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 57. moxifloxacino de la cepa 57.moxifloxacino de la cepa 57. moxifloxacino de la cepa 57. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Tiempo (h) L o g U F C ~ 95 ~ En la tabla 25 se muestra el área bajo la curva (AUKC) de moxifloxacino dependiendo de la concentración del antibiótico y el tiempo de incubación. ~ 96 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 25 2525 25. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino. moxifloxacino.moxifloxacino. moxifloxacino. Cepa ID 60 Cepa ID 60Cepa ID 60 Cepa ID 60 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,0 5,8 0,0 5,9 0,0 5,7 0,0 3h 3h3h 3h 19,0 17,7 -0,1 17,0 -0,1 16,3 -0,1 6h 6h6h 6h 40,7 33,7 -0,2 29,7 -0,3 28,0 -0,3 24h 24h24h 24h 186,3 108,3 -0,4 76,5 -0,6 69,4 -0,6 48h 48h48h 48h 387,0 170,9 -0,6 109,2 -0,7 87,9 -0,8 Cepa ID 28 Cepa ID 28Cepa ID 28 Cepa ID 28 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,0 6,0 0,0 5,9 0,0 5,7 0,0 3h 3h3h 3h 19,3 16,7 -0,1 14,9 -0,2 14,4 -0,3 6h 6h6h 6h 41,6 27,8 -0,3 21,9 -0,5 22,1 -0,5 24h 24h24h 24h 185,3 64,0 -0,7 34,0 -0,8 40,4 -0,8 48h 48h48h 48h 386,5 84,9 -0,8 34,0 -0,9 40,4 -0,9 Cepa ID 79 Cepa ID 79Cepa ID 79 Cepa ID 79 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,1 6,0 0,0 6,0 0,0 6,0 0,0 3h 3h3h 3h 19,0 17,7 -0,1 17,0 -0,1 16,7 -0,1 6h 6h6h 6h 40,6 32,7 -0,2 29,3 -0,3 28,2 -0,3 24h 24h24h 24h 185,0 89,5 -0,5 68,4 -0,6 58,9 -0,7 48h 48h48h 48h 387,0 132,2 -0,7 90,0 -0,8 64,9 -0,8 Cepa ID 118 Cepa ID 118Cepa ID 118 Cepa ID 118 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 5,8 5,8 0,0 5,7 0,0 5,6 0,0 3h 3h3h 3h 18,7 17,2 -0,1 14,9 -0,2 14,5 -0,2 6h 6h6h 6h 40,8 30,4 -0,3 23,4 -0,4 21,6 -0,5 24h 24h24h 24h 187,6 79,8 -0,6 54,1 -0,7 36,0 -0,8 48h 48h48h 48h 387,8 123,4 -0,7 73,9 -0,8 36,0 -0,9 Cepa ID 49 Cepa ID 49Cepa ID 49 Cepa ID 49 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,3 6,3 0,0 6,2 0,0 6,2 0,0 3h 3h3h 3h 19,2 17,8 -0,1 17,0 -0,1 16,7 -0,1 6h 6h6h 6h 40,2 31,8 -0,2 29,3 -0,3 28,7 -0,3 24h 24h24h 24h 185,4 87,7 -0,5 77,5 -0,6 70,2 -0,6 48h 48h48h 48h 391,5 130,9 -0,7 112,4 -0,7 83,5 -0,8 Cepa ID 57 Cepa ID 57Cepa ID 57 Cepa ID 57 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,2 6,2 0,0 6,1 0,0 6,2 0,0 3h 3h3h 3h 18,7 18,3 0,0 17,7 -0,1 17,6 -0,1 6h 6h6h 6h 38,3 34,6 -0,1 32,4 -0,2 31,6 -0,2 24h 24h24h 24h 175,6 107,8 -0,4 93,8 -0,5 85,3 -0,5 48h 48h48h 48h 379,5 172,2 -0,5 140,5 -0,6 113,8 -0,7 ~ 97 ~ Se pueden observar reducciones desde el 42 al 65% con concentraciones de moxifloxacino de 0,5 mg/L, del 47 al 82% con concentraciones de 1,5 mg/L y del 51 al 81% con concentraciones de 2,28 mg/L a las 24 horas. En la tabla 26 queda resumida el área bajo la curva conjunta de las seis cepas. Tabla Tabla Tabla Tabla 26 2626 26. . . . Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a moxifloxacinoÁrea bajo la curva media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a moxifloxacino. .. . % de reducción del AU % de reducción del AU% de reducción del AU % de reducción del AUK KK KC CC C % reducc AU % reducc AU% reducc AU % reducc AUK KK KC CC C 1CMI 1CMI1CMI 1CMI (0,5 mg/L) (0,5 mg/L)(0,5 mg/L) (0,5 mg/L) 3CMI 3CMI3CMI 3CMI (1,5 mg/L) (1,5 mg/L)(1,5 mg/L) (1,5 mg/L) Cmax CmaxCmax Cmax (2,28 mg/L) (2,28 mg/L)(2,28 mg/L) (2,28 mg/L) 3h 3h3h 3h -8% -14% -16% 6h 6h6h 6h -21% -31% -34% 24h 24h24h 24h -51% -63% -67% 48h 48h48h 48h -65% -76% -82% La tasa de muerte bacteriana definida como la reducción del inóculo inicial a las tres horas de incubación, osciló entre 8% (-0,5 log) y 16% (-1,7 log), en función de la concentración del antibiótico. ~ 98 ~ En las siguientes figuras (20-26) se muestra de forma gráfica el área bajo la curva a las diferentes concentraciones y horas. Figura Figura Figura Figura 20 2020 20. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 60. moxifloxacino de la cepa 60.moxifloxacino de la cepa 60. moxifloxacino de la cepa 60. Figura Figura Figura Figura 21 2121 21. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -mue muemue muerte a rte a rte a rte a moxifloxacino de la cepa 28. moxifloxacino de la cepa 28.moxifloxacino de la cepa 28. moxifloxacino de la cepa 28. 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Horas A U C ~ 99 ~ Figura Figura Figura Figura 22 2222 22. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 79. moxifloxacino de la cepa 79.moxifloxacino de la cepa 79. moxifloxacino de la cepa 79. Figura Figura Figura Figura 23 2323 23. . . . Área bajo la curva de la activida Área bajo la curva de la actividaÁrea bajo la curva de la activida Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo d extracelular mediante curvas de tiempod extracelular mediante curvas de tiempo d extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 118. moxifloxacino de la cepa 118.moxifloxacino de la cepa 118. moxifloxacino de la cepa 118. Figura Figura Figura Figura 24 2424 24. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a moxifloxacino de la cepa 49. moxifloxacino de la cepa 49.moxifloxacino de la cepa 49. moxifloxacino de la cepa 49. 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 2,28 mg/L Horas A U C ~ 106 ~ Figura Figura Figura Figura 26 2626 26. . . . Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoRecuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 60. ampicilina de la cepa 60.ampicilina de la cepa 60. ampicilina de la cepa 60. Figura Figura Figura Figura 27 2727 27. . . . Recuento logarítmico de la Recuento logarítmico de la Recuento logarítmico de la Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo actividad extracelular mediante curvas de tiempoactividad extracelular mediante curvas de tiempo actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 28. ampicilina de la cepa 28.ampicilina de la cepa 28. ampicilina de la cepa 28. Figura Figura Figura Figura 28 2828 28. . . . Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoRecuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 79. ampicilina de la cepa 79.ampicilina de la cepa 79. ampicilina de la cepa 79. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Tiempo (h) L o g U F C ~ 107 ~ Figura Figura Figura Figura 29 2929 29. . . . Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoRecuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 118. ampicilina de la cepa 118.ampicilina de la cepa 118. ampicilina de la cepa 118. Figura Figura Figura Figura 30 3030 30. . . . Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoRecuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampici ampiciampici ampicilina de la cepa 49. lina de la cepa 49.lina de la cepa 49. lina de la cepa 49. Figura Figura Figura Figura 31 3131 31. . . . Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoRecuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Recuento logarítmico de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 57. ampicilina de la cepa 57.ampicilina de la cepa 57. ampicilina de la cepa 57. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Tiempo (h) L o g U F C 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 2 4 6 8 10 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Tiempo (h) L o g U F C ~ 108 ~ En la tabla 31 se muestra el área bajo la curva (AUKC) de ampicilina según la concentración del antibiótico y el tiempo de incubación. Tabla Tabla Tabla Tabla 31 3131 31. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina. ampicilina.ampicilina. ampicilina. Cepa ID 60 Cepa ID 60Cepa ID 60 Cepa ID 60 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,0 5,8 0,0 5,9 0,0 5,7 0,0 3h 3h3h 3h 19,0 17,7 -0,1 17,0 -0,1 16,3 -0,1 6h 6h6h 6h 40,7 33,7 -0,2 29,7 -0,3 28,0 -0,3 24h 24h24h 24h 186,3 108,3 -0,4 76,5 -0,6 69,4 -0,6 48h 48h48h 48h 387,0 170,9 -0,6 109,2 -0,7 87,9 -0,8 Cepa ID 28 Cepa ID 28Cepa ID 28 Cepa ID 28 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,0 6,0 0,0 5,9 0,0 5,7 0,0 3h 3h3h 3h 19,3 16,7 -0,1 14,9 -0,2 14,4 -0,3 6h 6h6h 6h 41,6 27,8 -0,3 21,9 -0,5 22,1 -0,5 24h 24h24h 24h 185,3 64,0 -0,7 34,0 -0,8 40,4 -0,8 48h 48h48h 48h 386,5 84,9 -0,8 34,0 -0,9 40,4 -0,9 Cepa ID 79 Cepa ID 79Cepa ID 79 Cepa ID 79 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,1 6,0 0,0 6,0 0,0 6,0 0,0 3h 3h3h 3h 19,0 17,7 -0,1 17,0 -0,1 16,7 -0,1 6h 6h6h 6h 40,6 32,7 -0,2 29,3 -0,3 28,2 -0,3 24h 24h24h 24h 185,0 89,5 -0,5 68,4 -0,6 58,9 -0,7 48h 48h48h 48h 387,0 132,2 -0,7 90,0 -0,8 64,9 -0,8 Cepa ID 118 Cepa ID 118Cepa ID 118 Cepa ID 118 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 5,8 5,8 0,0 5,7 0,0 5,6 0,0 3h 3h3h 3h 18,7 17,2 -0,1 14,9 -0,2 14,5 -0,2 6h 6h6h 6h 40,8 30,4 -0,3 23,4 -0,4 21,6 -0,5 24h 24h24h 24h 187,6 79,8 -0,6 54,1 -0,7 36,0 -0,8 48h 48h48h 48h 387,8 123,4 -0,7 73,9 -0,8 36,0 -0,9 Cepa ID 49 Cepa ID 49Cepa ID 49 Cepa ID 49 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,3 6,3 0,0 6,2 0,0 6,2 0,0 3h 3h3h 3h 19,2 17,8 -0,1 17,0 -0,1 16,7 -0,1 6h 6h6h 6h 40,2 31,8 -0,2 29,3 -0,3 28,7 -0,3 24h 24h24h 24h 185,4 87,7 -0,5 77,5 -0,6 70,2 -0,6 48h 48h48h 48h 391,5 130,9 -0,7 112,4 -0,7 83,5 -0,8 Cepa ID 57 Cepa ID 57Cepa ID 57 Cepa ID 57 Control ControlControl Control 0,5 mg/L 0,5 mg/L0,5 mg/L 0,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1,5 mg/L 1,5 mg/L1,5 mg/L 1,5 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 2,28 mg/L 2,28 mg/L2,28 mg/L 2,28 mg/L % reducc % reducc% reducc % reducc 1h 1h1h 1h 6,2 6,2 0,0 6,1 0,0 6,2 0,0 3h 3h3h 3h 18,7 18,3 0,0 17,7 -0,1 17,6 -0,1 6h 6h6h 6h 38,3 34,6 -0,1 32,4 -0,2 31,6 -0,2 24h 24h24h 24h 175,6 107,8 -0,4 93,8 -0,5 85,3 -0,5 48h 48h48h 48h 379,5 172,2 -0,5 140,5 -0,6 113,8 -0,7 ~ 109 ~ Se puede observar la reducción del inóculo bacteriano a las 24 horas en un rango del 16 al 28% a concentraciones de ampicilina de 0,5 mg/L, del 27 al 38% a concentraciones de 1,5 mg/L, y en torno al 27-42% a altas concentraciones del antibiótico (24-49 mg/L). En la siguiente tabla queda resumida el área bajo la curva conjunta de las seis cepas. Tabla Tabla Tabla Tabla 32 3232 32. . . . Á ÁÁ Área bajo la curva rea bajo la curva rea bajo la curva rea bajo la curva de las 6 cepas representativas a ampicilina. de las 6 cepas representativas a ampicilina.de las 6 cepas representativas a ampicilina. de las 6 cepas representativas a ampicilina. % reducc AUKC 1xCMI (0,5 mg/L) 3xCMI (1,5 mg/L) Cmax1 (24,5 mg/L) Cmax2 (49 mg/L) 3h -4% -5% -6%- -6% 6h -10% -13% -13% -13% 24h -21% -32% -33% -33% 48h -26% -46% -49% -51% La tasa de muerte definida como la reducción del inóculo inicial a las tres horas de incubación, osciló entre 4-6% en función de la concentración del antibiótico. En las siguientes figuras se muestra el área bajo la curva de las seis cepas a diferentes concentraciones y horas. ~ 110 ~ Figura Figura Figura Figura 32 3232 32. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 60. ampicilina de la cepa 60.ampicilina de la cepa 60. ampicilina de la cepa 60. Figura Figura Figura Figura 33 3333 33. .. . Área Área Área Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempobajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 28. ampicilina de la cepa 28.ampicilina de la cepa 28. ampicilina de la cepa 28. Figura Figura Figura Figura 34 3434 34. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 79. ampicilina de la cepa 79.ampicilina de la cepa 79. ampicilina de la cepa 79. 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Horas A U C ~ 111 ~ Fi FiFi Figura gura gura gura 35 3535 35. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 118. ampicilina de la cepa 118.ampicilina de la cepa 118. ampicilina de la cepa 118. Figura Figura Figura Figura 36 3636 36. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 49. ampicilina de la cepa 49.ampicilina de la cepa 49. ampicilina de la cepa 49. Figura Figura Figura Figura 37 3737 37. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempoÁrea bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo Área bajo la curva de la actividad extracelular mediante curvas de tiempo- -- -muerte a muerte a muerte a muerte a ampicilina de la cepa 57. ampicilina de la cepa 57.ampicilina de la cepa 57. ampicilina de la cepa 57. 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control 0,5 mg/L 1,5 mg/L 24,5 mg/L 49 mg/L Horas A U C ~ 112 ~ 5.3.4 Actividad extracelular de ampicilina más moxifloxacino En las tablas siguientes se incluye el recuento bacteriano (tabla 33) y logarítmico (tabla 34) inicial y a las diferentes horas de incubación de las seis cepas, tanto en el grupo control como a las diferentes concentraciones de la combinación de ambos antibióticos. ~ 113 ~ Tabl TablTabl Tabla a a a 33 3333 33. . . . Recuento bacteriano de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Recuento bacteriano de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Recuento bacteriano de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Recuento bacteriano de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo tiempotiempo tiempo- -- -muerte. muerte.muerte. muerte. Cepa ID 60 Cepa ID 60Cepa ID 60 Cepa ID 60 0h 0h0h 0h 1000000 860000 1000000 860000 1000000 860000 1000000 860000 1h 1h1h 1h 1100000 884000 1152000 744000 700000 624000 800000 712000 3h 3h3h 3h 4700000 5900000 972000 592000 500000 436000 528000 520000 6h 6h6h 6h 51600000 56800000 512000 340000 328000 216000 428000 288000 24h 24h24h 24h 118400000 101200000 19000 5160 14000 5480 800 400 48h 48h48h 48h 144000000 100000000 100 250 90 80 0 0 Cepa ID 28 Cepa ID 28Cepa ID 28 Cepa ID 28 0h 0h0h 0h 680000 616000 616000 680000 616000 680000 616000 680000 1h 1h1h 1h 696000 708000 596000 744000 544000 500000 476000 376000 3h 3h3h 3h 2800000 5000000 344000 428000 117000 110000 122000 156000 6h 6h6h 6h 43200000 33600000 73000 77000 27000 40000 17000 10920 24h 24h24h 24h 96400000 109600000 70 120 20 30 0 10 48h 48h48h 48h 84400000 113600000 0 0 0 0 0 0 Cepa ID 79 Cepa ID 79Cepa ID 79 Cepa ID 79 0h 0h0h 0h 1184000 440000 440000 1184000 440000 1184000 440000 1184000 1h 1h1h 1h 1496000 692000 540000 1232000 576000 964000 540000 864000 3h 3h3h 3h 5400000 4200000 512000 808000 364000 852000 328000 768000 6h 6h6h 6h 60800000 47600000 268000 412000 168000 400000 144000 41200 24h 24h24h 24h 112000000 94800000 2030 2520 1220 5400 950 300 48h 48h48h 48h 101600000 84000000 20 40 0 0 0 0 Cepa ID 118 Cepa ID 118Cepa ID 118 Cepa ID 118 0h 0h0h 0h 724000 520000 520000 724000 520000 724000 520000 724000 1h 1h1h 1h 632000 644000 528000 696000 572000 484000 520000 744000 3h 3h3h 3h 2500000 2100000 256000 448000 212000 336000 352000 572000 6h 6h6h 6h 47600000 44000000 49000 252000 108000 276000 156000 300000 24h 24h24h 24h 142400000 100800000 970 2110 90 240 70 10 48h 48h48h 48h 82400000 105600000 10 50 0 20 0 0 Cepa ID 49 Cepa ID 49Cepa ID 49 Cepa ID 49 0h 0h0h 0h 816000 752000 752000 816000 752000 816000 752000 816000 1h 1h1h 1h 844000 852000 800000 712000 484000 680000 480000 544000 3h 3h3h 3h 4500000 4300000 432000 424000 176000 280000 256000 304000 6h 6h6h 6h 35200000 13500000 115000 240000 37000 88000 87000 176000 24h 24h24h 24h 131200000 147200000 110 110 40 60 30 20 48h 48h48h 48h 99200000 109600000 30 50 10 20 10 0 Cepa ID 57 Cepa ID 57Cepa ID 57 Cepa ID 57 0h 0h0h 0h 500000 752000 752000 500000 752000 500000 752000 500000 1h 1h1h 1h 676000 756000 668000 664000 632000 644000 792000 620000 3h 3h3h 3h 2300000 3200000 652000 524000 360000 296000 448000 390000 6h 6h6h 6h 34400000 36000000 284000 180000 108000 99000 192000 262000 24h 24h24h 24h 100800000 145600000 310 160 170 50 110 30 48h 48h48h 48h 122000000 100800000 60 30 30 20 10 0 CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX ~ 114 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 34 3434 34. . . . Recuento logarítmico de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante cur Recuento logarítmico de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curRecuento logarítmico de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante cur Recuento logarítmico de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de vas de vas de vas de tiempo tiempotiempo tiempo- -- -muerte. muerte.muerte. muerte. Cepa ID 60 Cepa ID 60Cepa ID 60 Cepa ID 60 0h 0h0h 0h 6 5,9 6,0 5,9 6,0 5,9 6,0 5,9 1h 1h1h 1h 6,0 5,9 6,1 5,9 5,8 5,8 5,9 5,9 3h 3h3h 3h 6,7 6,8 6,0 5,8 5,7 5,6 5,7 5,7 6h 6h6h 6h 7,7 7,8 5,7 5,5 5,5 5,3 5,6 5,5 24h 24h24h 24h 8,1 8,0 4,3 3,7 4,1 3,7 2,9 2,6 48h 48h48h 48h 8,2 8,0 2,0 2,4 2,0 1,9 0,0 0,0 Cepa ID 28 Cepa ID 28Cepa ID 28 Cepa ID 28 0h 0h0h 0h 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 1h 1h1h 1h 5,8 5,9 5,8 5,9 5,7 5,7 5,7 5,6 3h 3h3h 3h 6,4 6,7 5,5 5,6 5,1 5,0 5,1 5,2 6h 6h6h 6h 7,6 7,5 4,9 4,9 4,4 4,6 4,2 4,0 24h 24h24h 24h 8,0 8,0 1,8 2,1 1,3 1,5 0,0 1,0 48h 48h48h 48h 7,9 8,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Cepa ID 79 Cepa ID 79Cepa ID 79 Cepa ID 79 0h 0h0h 0h 6,1 5,6 5,6 6,1 5,6 6,1 5,6 6,1 1h 1h1h 1h 6,2 5,8 5,7 6,1 5,8 6,0 5,7 5,9 3h 3h3h 3h 6,7 6,6 5,7 5,9 5,6 5,9 5,5 5,9 6h 6h6h 6h 7,8 7,7 5,4 5,6 5,2 5,6 5,2 4,6 24h 24h24h 24h 8,0 8,0 3,3 3,4 3,1 3,7 3,0 2,5 48h 48h48h 48h 8,0 7,9 1,3 1,6 0,0 0,0 0,0 0,0 Cepa ID 118 Cepa ID 118Cepa ID 118 Cepa ID 118 0h 0h0h 0h 5,9 5,7 5,7 5,9 5,7 5,9 5,7 5,9 1h 1h1h 1h 5,8 5,8 5,7 5,8 5,8 5,7 5,7 5,9 3h 3h3h 3h 6,4 6,3 5,4 5,7 5,3 5,5 5,5 5,8 6h 6h6h 6h 7,7 7,6 4,7 5,4 5,0 5,4 5,2 5,5 24h 24h24h 24h 8,2 8,0 3,0 3,3 2,0 2,4 1,8 1,0 48h 48h48h 48h 7,9 8,0 1,0 1,7 0,0 1,3 0,0 0,0 Cepa ID 49 Cepa ID 49Cepa ID 49 Cepa ID 49 0h 0h0h 0h 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 1h 1h1h 1h 5,9 5,9 5,9 5,9 5,7 5,8 5,7 5,7 3h 3h3h 3h 6,7 6,6 5,6 5,6 5,2 5,4 5,4 5,5 6h 6h6h 6h 7,5 7,1 5,1 5,4 4,6 4,9 4,9 5,2 24h 24h24h 24h 8,1 8,2 2,0 2,0 1,6 1,8 1,5 1,3 48h 48h48h 48h 8,0 8,0 1,5 1,7 1,0 1,3 1,0 0,0 Cepa ID 57 Cepa ID 57Cepa ID 57 Cepa ID 57 0h 0h0h 0h 5,7 5,9 5,9 5,7 5,9 5,7 5,9 5,7 1h 1h1h 1h 5,8 5,9 5,8 5,8 5,8 5,8 5,9 5,8 3h 3h3h 3h 6,4 6,5 5,8 5,7 5,6 5,5 5,7 5,6 6h 6h6h 6h 7,5 7,6 5,5 5,3 5,0 5,0 5,3 5,4 24h 24h24h 24h 8,0 8,2 2,5 2,2 2,2 1,7 2,0 1,5 48h 48h48h 48h 8,1 8,0 1,8 1,5 1,5 1,3 1,0 0,0 CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL CMI CMICMI CMI 3CMI 3CMI3CMI 3CMI C MAX C MAXC MAX C MAX ~ 115 ~ En la tabla 35 se muestra la reducción logarítmica. La combinación de ambos antibióticos no produjo efecto sinérgico, definido como la reducción del inóculo inicial de al menos 2 log comparándolo con el antibiótico más activo, en este caso, moxifloxacino. ~ 122 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 38 3838 38. . . . Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a ambos antibióticos. Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a ambos antibióticos.Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a ambos antibióticos. Área bajo la curva media de las 6 cepas representativas a ambos antibióticos. % reducc % reducc % reducc % reducc AU AUAU AUK KK KC CC C 1CMI 3CMI Cmax 3h -5% -7% -7% 6h -14% -17% -17% 24h -40% -45% -48% 48h -57% -63% -69% La tasa de muerte definida como la reducción del inóculo inicial a las tres horas de incubación, osciló entre 5-7% en función de la concentración del antibiótico, más parecida a la obtenida con ampicilina que con moxifloxacino. Al igual que los datos obtenidos con el cálculo de la reducción logarítmica, moxifloxacino por separado produce reducciones, en este caso de la AUKC, mucho mayores que la combinación de ambos antibióticos. En las siguientes figuras se muestra de forma gráfica el área bajo la curva a las diferentes concentraciones y horas. ~ 123 ~ Figura Figura Figura Figura 44 4444 44. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de ti titi tiempo empoempo empo- -- -muerte de la cepa 60. muerte de la cepa 60.muerte de la cepa 60. muerte de la cepa 60. Figura Figura Figura Figura 45 4545 45. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo tiempotiempo tiempo- -- -muerte de la cepa 28. muerte de la cepa 28.muerte de la cepa 28. muerte de la cepa 28. Figura Figura Figura Figura 46 4646 46. . . . Área bajo la curva de la actividad Área bajo la curva de la actividadÁrea bajo la curva de la actividad Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo tiempotiempo tiempo- -- -muerte de la cepa 79. muerte de la cepa 79.muerte de la cepa 79. muerte de la cepa 79. 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control CMI 3CMI CMAX Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control CMI 3CMI CMAX Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control CMI 3CMI CMAX Horas A U C ~ 124 ~ Figura Figura Figura Figura 47 4747 47. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo tiempotiempo tiempo- -- -muerte de la cepa 118. muerte de la cepa 118.muerte de la cepa 118. muerte de la cepa 118. Figura Figura Figura Figura 48 4848 48. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de tiempo tiempotiempo tiempo- -- -muerte de la cepa 49. muerte de la cepa 49.muerte de la cepa 49. muerte de la cepa 49. Figura Figura Figura Figura 49 4949 49. . . . Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos Área bajo la curva de la actividad extracelular de ambos antibióticos mediante curvas de mediante curvas de mediante curvas de mediante curvas de tiempo tiempotiempo tiempo- -- -muerte de la cepa 57. muerte de la cepa 57.muerte de la cepa 57. muerte de la cepa 57. 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control CMI 3CMI CMAX Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control CMI 3CMI CMAX Horas A U C 0 3 6 9 12151821242730333639424548 0 100 200 300 400 Control CMI 3CMI CMAX Horas A U C ~ 125 ~ 5.4 Actividad antimicrobiana intracelular 5.4.1 Moxifloxacino En la tabla 39 se muestra el crecimiento intracelular de L. monocytogenes en el grupo control (sin antibiótico) y en células tratadas con dos concentraciones, 0,5 y 1 C max , de moxifloxacino, mientras que la tabla 40 se recoge el porcentaje de reducción del inóculo inicial a 1 hora en las mismas condiciones experimentales. ~ 126 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 39 3939 39. . . . Recuento bacteriano Recuento bacterianoRecuento bacteriano Recuento bacteriano inicial inicialinicial inicial y porcentaje de reducción de la actividad intracelular de y porcentaje de reducción de la actividad intracelular de y porcentaje de reducción de la actividad intracelular de y porcentaje de reducción de la actividad intracelular de moxifloxacino. moxifloxacino.moxifloxacino. moxifloxacino. Tabla Tabla Tabla Tabla 40 4040 40. . . . Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad intracelular de moxifloxacino a dos concentraciones distint intracelular de moxifloxacino a dos concentraciones distintintracelular de moxifloxacino a dos concentraciones distint intracelular de moxifloxacino a dos concentraciones distintas. as.as. as. C E P A 7 9 M O X I F L O X A C I N O 1 H C E P A 1 1 8 M O X I F L O X A C I N O 1 H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 9000 2200 1440 1 4000 1200 1080 2 5000 1960 1240 2 5200 2720 490 3 6000 2400 1160 3 2440 1440 470 mediana 6666,666667 2186,66667 1280 mediana 3880 1786,66667 680 % 100% 33% 19% % 100% 46% 18% CEPA 79 MOXIFLOXACINO 24H CEPA 118 MOXIFLOXACINO 24H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 32400000 6320 4240 1 85200000 4000 2000 2 26000000 3720 2960 2 140000000 7000 1440 3 15200000 3100 2280 3 150000000 6000 2000 mediana 24533333,33 4380 3160 mediana 125066666,7 5666,66667 1813,333333 % 100% 0,02% 0,01% % 100% 0,005% 0,001% CEPA 57 MOXIFLOXACINO 1H CEPA 60 MOXIFLOXACINO 1H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 3400000 1600000 564000 1 224000 156000 72000 2 3400000 2200000 612000 2 412000 156000 65000 3 2900000 900000 604000 3 224000 160000 65000 mediana 3233333,333 1566666,67 593333,333 mediana 286666,6667 157333,333 67333,33333 % 100% 48% 18% % 100% 55% 23% CEPA 57 MOXIFLOXACINO 24H CEPA 60 MOXIFLOXACINO 24H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 140000000 52000 42000 1 48800000 10000 8000 2 180000000 29000 9000 2 81200000 55000 10000 3 150000000 58000 23000 3 48800000 20000 5000 mediana 156666666,7 46333,3333 24666,6667 mediana 59600000 28333,3333 7666,666667 % 100% 0,03% 0,02% % 100% 0,05% 0,01% CEPA 28 MOXIFLOXACINO 1H CEPA 49 MOXIFLOXACINO 1H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 14000 4000 1280 1 7000 3000 1000 2 19000 8000 6000 2 9000 4000 1500 3 5000 3000 1200 3 6000 3000 1000 mediana 12666,66667 5000 2826,66667 mediana 7333,333333 3333,33333 1166,666667 % 100% 39% 22% % 100% 45% 16% CEPA 28 MOXIFLOXACINO 24H CEPA 49 MOXIFLOXACINO 24H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 15600000 14000 7000 1 10800000 22000 5600 2 14000000 22000 8000 2 11200000 23000 1320 3 14400000 11000 6000 3 7200000 2000 1120 mediana 14666666,67 15666,67 7000 mediana 9733333,333 15666,6667 2680 % 100% 0,11% 0,05% % 100% 0,16% 0,03% Cepas CepasCepas Cepas % de reducción del inóculo % de reducción del inóculo% de reducción del inóculo % de reducción del inóculo 0.5 C 0.5 C0.5 C 0.5 C max maxmax max 1 C 1 C1 C 1 C max maxmax max Cepa 79 67 81 Cepa 57 52 82 ~ 127 ~ Moxifloxacino a concentración de 0,5 C max , logró reducciones del inóculo bacteriano de las distintas cepas a la hora de incubación que variaron del 45% al 67%, y que aumentaron a valores que variaron del 77 al 84% con la concentración 1 C max . Mientras que las 24 horas, se obtuvo una reducción cercana al 100% en todas las cepas estudiadas con las dos concentraciones. En las siguientes figuras (50-55) se puede ver de forma gráfica la reducción en el crecimiento bacteriano de las diferentes cepas a la hora y a las 24 horas en las células tratadas con moxifloxacino. Figura Figura Figura Figura 50 5050 50. Re . Re. Re . Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la cuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a lacuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la cuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas hora y a las 24 horas hora y a las 24 horas hora y a las 24 horas a diferentes concentraciones de la cepa 79. a diferentes concentraciones de la cepa 79.a diferentes concentraciones de la cepa 79. a diferentes concentraciones de la cepa 79. Moxifloxacin, strain 79 (1h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 2000 4000 6000 8000 i n t r a c e l l u l a r C F U Moxifloxacin, strain 79 (24h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 1.0×10 07 2.0×10 07 3.0×10 07 i n t r a c e l l u l a r C F U Cepa 28 61 78 Cepa 118 54 82 Cepa 60 45 77 Cepa 49 55 84 ~ 128 ~ Figura Figura Figura Figura 51 5151 51. . . . Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a lasRecuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas 24 horas 24 horas 24 horas a diferentes concentraciones de la cepa 118. a diferentes concentraciones de la cepa 118.a diferentes concentraciones de la cepa 118. a diferentes concentraciones de la cepa 118. Figura Figura Figura Figura 52 5252 52. . . . Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas a diferentes concentraciones de la cepa 57. a diferentes concentraciones de la cepa 57.a diferentes concentraciones de la cepa 57. a diferentes concentraciones de la cepa 57. Figura Figura Figura Figura 53 5353 53. . . . Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas a diferentes concentraciones de la cepa 60. a diferentes concentraciones de la cepa 60.a diferentes concentraciones de la cepa 60. a diferentes concentraciones de la cepa 60. Moxifloxacin, strain 118 (1h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 1000 2000 3000 4000 5000 intracellular CFU Moxifloxacin, strain 118 (24h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 5.0×10 07 1.0×10 08 1.5×10 08 i n t r a c e l l u l a r C F U Moxifloxacin, strain 57 (1h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 1000000 2000000 3000000 i n t r a c e l l u l a r C F U Moxifloxacin, strain 57 (24h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 5.0×10 07 1.0×10 08 1.5×10 08 i n t r a c e l l u l a r C F U Moxifloxacin, strain 60 (1h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 100000 200000 300000 400000 i n t r a c e l l u l a r C F U Moxifloxacin, strain 60 (24h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 2.0×10 07 4.0×10 07 6.0×10 07 8.0×10 07 intracellular CFU ~ 129 ~ Figura Figura Figura Figura 54 5454 54. . . . Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas la hora y a las 24 horas la hora y a las 24 horas la hora y a las 24 horas a diferentes concentraciones de la cepa 28. a diferentes concentraciones de la cepa 28.a diferentes concentraciones de la cepa 28. a diferentes concentraciones de la cepa 28. Figura Figura Figura Figura 55 5555 55. . . . Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas Recuento bacteriano de la actividad intracelular de moxifloxacino a la hora y a las 24 horas a diferentes concentraciones de la cepa 49. a diferentes concentraciones de la cepa 49.a diferentes concentraciones de la cepa 49. a diferentes concentraciones de la cepa 49. En la siguiente tabla queda recogida la media de reducción en el crecimiento de las seis cepas a la hora y a las 24 horas sobre el inóculo inicial. Moxifloxacin, strain 28 (1h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 2000 4000 6000 8000 i n t r a c e l l u l a r C F U Moxifloxacin, strain 28 (24h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 5000000 1.0×10 07 1.5×10 07 i n t r a c e l l u l a r C F U Moxifloxacin, strain 49 (24h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 5000000 1.0×10 07 intracellular CFU Moxifloxacin, strain 49 (1h) 0 Cmax 0,5 Cmax 1 Cmax 0 2000 4000 6000 8000 i n t r a c e l l u l a r C F U ~ 130 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 41 4141 41. . . . Media de reducción en el crecimiento de las seis cepas tratadas con moxifloxac Media de reducción en el crecimiento de las seis cepas tratadas con moxifloxacMedia de reducción en el crecimiento de las seis cepas tratadas con moxifloxac Media de reducción en el crecimiento de las seis cepas tratadas con moxifloxacino. ino.ino. ino. 0.5 CMAX 0.5 CMAX0.5 CMAX 0.5 CMAX 1 CMAX 1 CMAX1 CMAX 1 CMAX Tiempo TiempoTiempo Tiempo % sobre inóculo inicial % sobre inóculo inicial% sobre inóculo inicial % sobre inóculo inicial 1h 44% 19% 24h 0,06% 0,02% 5.4.2 Ampicilina En la tabla 42 se muestra el crecimiento intracelular de L. monocytogenes en el grupo control (sin antibiótico) y en células tratadas con dos concentraciones, 0,5 y 1 C max , de ampicilina, mientras que la tabla 43 se recoge el porcentaje de reducción del inóculo inicial a 1 hora en las mismas condiciones experimentales. ~ 131 ~ Tabla Tabla Tabla Tabla 42 4242 42. . . . Recuento bacteriano y porcentaje de reducc Recuento bacteriano y porcentaje de reduccRecuento bacteriano y porcentaje de reducc Recuento bacteriano y porcentaje de reducción de la actividad intracelular de ampicilina. ión de la actividad intracelular de ampicilina.ión de la actividad intracelular de ampicilina. ión de la actividad intracelular de ampicilina. Tabla Tabla Tabla Tabla 43 4343 43. . . . Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad Porcentaje de reducción del recuento bacteriano inicial y tras 1 hora de actividad intracelular de ampicilina a dos concentraciones distintas. intracelular de ampicilina a dos concentraciones distintas.intracelular de ampicilina a dos concentraciones distintas. intracelular de ampicilina a dos concentraciones distintas. C E P A 7 9 A M P I C I L I N A 1 H C E P A 1 1 8 A M P I C I L I N A 1 H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 9000 2640 5000 1 62000 32000 17000 2 5000 1920 1800 2 63000 11000 6000 3 6000 2600 2880 3 48000 16000 14000 mediana 6666,666667 2386,666667 3226,666667 mediana 57666,66667 19666,66667 12333,33333 % 100% 36% 48% % 100% 34% 21% CEPA 79 AMPICILINA 24H CEPA 118 AMPICILINA 24H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 32400000 46000 13000 1 85200000 88000 580000 2 26000000 32000 15000 2 140000000 96000 8000 3 15200000 14000 12000 3 150000000 6720 12000 mediana 24533333,33 30666,66667 13333,3333 mediana 125066666,7 63573,33333 200000 % 100% 0,13% 0,05% % 100% 0,05% 0,16% CEPA 57 AMPICILINA 1H CEPA 60 AMPICILINA 1H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 6000 5000 3200 1 18000 26000 2440 2 13000 22000 12000 2 4840 40000 32000 3 6000 1640 11000 3 2280 12000 3600 mediana 8333,333333 9546,666667 8733,333333 mediana 8373,333333 26000 12680 % 100% 115% 105% % 100% 311% 151% CEPA 57 AMPICILINA 24H CEPA 60 AMPICILINA 24H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 88000000 96000 54000 1 11600000 29000 236000 2 80000000 9000 240000 2 9200000 1400000 8000 3 100000000 3000 20000 3 11200000 6000 10000 mediana 89333333,33 36000 104666,6667 mediana 10666666,67 478333,3333 84666,66667 % 100% 0,04% 0,12% % 100% 4,48% 0,79% CEPA 28 AMPICILINA 1H CEPA 49 AMPICILINA 1H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 14000 3000 6000 1 7000 5000 3000 2 19000 10000 17000 2 9000 9000 4000 3 5000 5000 12000 3 5000 1160 1240 mediana 12666,66667 6000 11666,66667 mediana 7000 5053,333333 2746,666667 % 100% 47% 92% % 100% 72% 39% CEPA 28 AMPICILINA 24H CEPA 49 AMPICILINA 24H Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX Experimento SIN ANTIBIOTICO 0.5 CMAX 1 CMAX 1 15600000 184000 47000 1 10800000 100000 15000 2 14000000 144000 20000 2 11200000 200000 4000 3 14400000 5000 4000 3 7200000 3400 1780 mediana 14666666,67 111000 23666,66667 mediana 9733333,333 101133,3333 6926,666667 % 100% 0,76% 0,16% % 100% 1,04% 0,07% Cepas CepasCepas Cepas % de reducción del % de reducción del % de reducción del % de reducción del inóculo inóculoinóculo inóculo 0.5 C 0.5 C0.5 C 0.5 C max maxmax max 1 C 1 C1 C 1 C max maxmax max Cepa 79 64 52 Cepa 57 -15 -5 Cepa 28 53 8 Cepa 118 66 79 Cepa 60 -211 -51 Cepa 49 28 61 ~ 138 ~ como de CLSI (≤2 mg/L), resultados que coinciden con lo publicado por otros trabajos en Europa en los últimos años (20, 68, 69, 70), donde se constata que todos los aislamientos de L. monocytogenes presentan valores de CMI 90 por debajo del ECOFF ≤2 mg/L propuesto por EUCAST para diferenciar aquellas poblaciones de L. monocytogenes que poseen algún mecanismo de resistencia a ampicilina. Sin embargo, en 2014, en un estudio realizado en Suiza (71), con un gran número de aislados de L. monocytogenes de distinta procedencia tanto humanos como veterinarios y ambientales, se comprueba la existencia de cepas con CMI a ampicilina de 2 mg/L en muestras procedentes de peces, aunque en el estudio molecular no se evidenció la existencia de los genes que confieren resistencia a betalactámicos (bla1, bla2, blaZ). Esta circunstancia también la pone en evidencia Morvan et al. (20), en un gran estudio realizado en Francia que incluía aislamientos clínicos desde 1926 a 2007, donde se observaba, a partir de 1989, la existencia de cepas con valores de CMI de 2 mg/L. Este fenómeno, ya observado anteriormente en aislados ambientales y procedentes de alimentos (72, 73), y carentes de genes que codifiquen betalactamasas, se podría explicar mediante un fenómeno de "MIC creeping" o el aumento progresivo de los valores de CMI a lo largo del tiempo (74), debido al incremento en el uso de betalactámicos desde la segunda mitad del siglo XX, fenómeno ya descrito en S. pneumoniae (75). Aunque no se han publicado fallos clínicos asociados a casos de resistencia a betalactámicos, estudios recientes demuestran que la mutación ~ 139 ~ de los genes lmo0441 y lmo2229 que codifican la proteína PBP4 en L. monocytogenes podrían contribuir al aumento de la CMI a betalactámicos (76). Moxifloxacino mostró una gran actividad bactericida con valores modales de CMB 50/90 de 0,5 mg/L para ambos valores, y un cociente CMB/CMI ≤4, por lo que se puede considerar bactericida al presentar un cociente CMB/CMI bajo. En nuestro estudio, la capacidad bactericida de ampicilina es escasa, con cociente CMB/CMI ≥16 y valores de CMB 50/90 ≥8 mg/L, que coinciden con el trabajo clásico de Moellering et al. de los años 70 del siglo pasado (77), donde ya describían valores de CMB ≥16 en una larga serie de aislamientos invasivos de L. monocytogenes . Otros trabajos de esa época (70, 78), comunicaban resultados similares, informando cocientes CMB/CMI inferiores a valores de 32, por lo que en principio descartaban fenómenos de tolerancia a ampicilina. Si la CMB fuera considerablemente mayor que la CMI (cociente mayor de 32), la cepa podría ser considerada como tolerante al antibiótico. En la actualidad no existen datos recientes sobre la actividad bactericida de ampicilina sobre L. monocytogenes . En vista de lo anterior, vemos que nuestros aislamientos se comportan de manera similar, desde el punto de vista de la sensibilidad a ampicilina, a las series publicadas en otros trabajos, aunque no se detectan aislamientos con valores ≥1 mg/L como los descritos en algunas series, hecho que podría ser debido a aspectos metodológicos, ya que en algunas de las ~ 140 ~ series publicadas emplean tiras de gradiente de CMI en vez de la microdilución (técnica de referencia) como metodología de estudio. En relación a la existencia o no de diferencias significativas entre los distintos serotipos, pulsotipos y clones epidémicos, en nuestro estudio llegamos a la conclusión que todas las cepas se comportan de la misma forma con leves diferencias, ante los dos antimicrobianos estudiados. Debido a la limitada experiencia y a la dificultad de realizar estudios clínicos con moxifloxacino a nivel del SNC en humanos, se realizó una simulación de Monte Carlo para evaluar su actividad a nivel de SNC. Esta simulación, nos ha permitido estimar las concentraciones de moxifloxacino y ampicilina que se pueden alcanzar en LCR con las dosis propuestas para el tratamiento de la infección por L. monocytogenes . En nuestro estudio, la simulación predice concentraciones máximas medias de moxifloxacino en LCR de 1,14 mg/L y de 2,28 mg/L con dosis de 400 y 800 mg/día, respectivamente y de ampicilina de 24,5 y 49 mg/L a dosis de 200 y 400 mg/Kg/día. Estos últimos valores, coinciden con los obtenidos en estudios experimentales, donde los niveles oscilan entre 0,3-38 mg/L, con un porcentaje de penetración que varía entre el 4-65% en función de la dosis utilizada (79). Al aplicar dichas concentraciones, el modelo predijo una probabilidad del 85% de éxito terapéutico con dosis de 400 mg/día y del 99,2% con dosis de 800 mg/día de moxifloxacino, resultados ampliamente superiores a los que se obtienen comparativamente con ampicilina, 4% de éxito con dosis de ~ 141 ~ 200 mg/Kg/día, y que al aumentar la dosis a 400 mg/Kg/día se incrementa hasta un 25%, muy lejos del objetivo terapéutico, C max,libre /CMB ≥10 (≥90%). Asimismo, con dosis de 400 mg/día de moxifloxacino y teniendo en cuenta los puntos de corte PK/PD derivados del modelo, serían sensibles el 73% de las cepas y el 100% si empleáramos dosis de 800 mg/día. Estos resultados concuerdan con lo publicado por Kanellakopoulou et al., donde demuestran que moxifloxacino es altamente bactericida a nivel del SNC (41). En base a estos resultados in vitro , moxifloxacino podría estar cualificado para reemplazar a ampicilina como tratamiento de primera elección de la listeriosis. Además, distintos trabajos (44, 46, 80) en modelos animales demuestran que es capaz de reducir la carga bacteriana de la infección, incluyendo animales inmunodeprimidos. Puesto que no existe experiencia clínica, no se puede hacer una recomendación generalizada para el uso de moxifloxacino en el tratamiento en humanos, pero un caso clínico publicado de tratamiento con levofloxacino en un paciente con meningitis también avala estos resultados, a pesar de que las características farmacocinéticas de este antibiótico son inferiores a las de moxifloxacino (81). Respecto al punto de corte PK/PD de moxifloxacino en LCR: ≤0,25 mg/L con dosis de 400 mg/día y 0,5 mg/L con dosis de 800 mg/día, a pesar de no existir punto de corte propuesto por EUCAST ni CLSI, si justificaría el empleo de dosis máxima en el tratamiento de la infección en SNC. ~ 142 ~ En nuestro estudio, la simulación predice concentraciones máximas medias de ampicilina en LCR de 24,5 y 49 mg/L con dosis de 200 y 400 mg/Kg/día, y aunque en general, los betalactámicos penetran mal a través de la barrera hematoencefálica, sin embargo, las formas ionizadas, caso de ampicilina, penetran relativamente bien en LCR. Estos valores están en línea con estudios experimentales publicados, donde los niveles oscilan entre 0,3-38 mg/L, con un porcentaje de penetración que varía entre el 4-65% en función de la dosis utilizada (79). La actividad de los betalactámicos en LCR es concentración dependiente, a diferencia de lo que ocurre con las infecciones que se producen en otras partes del cuerpo (82). Esta conclusión deriva de estudios experimentales, donde se demuestra que la muerte bacteriana aumenta a medida que se incrementa la concentración máxima en LCR, obteniéndose la máxima actividad cuando la concentración supera la CMB en al menos 10 veces (62). Sin embargo, la concentración máxima y el T>CMB de los antibióticos están correlacionados y cuando la concentración del antibiótico supera en al menos 10 veces la CMB, el T>CMB en LCR se consigue durante todo el período entre dosis (63), haciéndose los dos conceptos equivalentes a nivel del SNC. En la simulación realizada, el objetivo terapéutico de C max,libre /CMB ≥10, solo se consiguió con ampicilina en el 4% y 25% de los casos, y por tanto sólo sería eficaz la dosis de 200 mg/Kg/día en el 2% de nuestras cepas, aquellas con valores de CMB ≤2 mg/L, y con dosis de 400 mg/Kg/día en el ~ 143 ~ 15%, aquellas con valores de CMB de 4 mg/L. Los resultados anteriores, demuestran que concentraciones bacteriostáticas de ampicilina en LCR (concentraciones máximas entre la CMI y la CMB) producen una disminución lenta de los recuentos bacterianos y esto afecta a la respuesta al tratamiento. El clásico parámetro PK/PD C max /CMI>10, produce una supresión persistente del crecimiento bacteriano, efecto insuficiente en una infección del SNC, donde los mecanismos de defensa del hospedador están disminuidos y justificaría el empleo de parámetros PK/PD que incluyan la CMB (C max /CMB). Estos resultados, podrían explicar posibles fallos en el tratamiento de la infección por L. monocytogenes a nivel del SNC y justificaría las recaídas y fracasos en el tratamiento publicados en personas con meningitis (83), de hecho, el tratamiento antibiótico óptimo para la listeriosis no se ha establecido en ensayos clínicos controlados. Aun así, ampicilina, aunque se considera bacteriostático frente a L. monocytogenes , puede producir actividad bactericida retardada in vitro (48 horas) a niveles que se pueden obtener en el LCR (84). Lo anterior se puede atribuir al hecho de que es un microorganismo de crecimiento lento (85). Nuestro estudio predice dicha actividad bactericida, aunque leve a las 24 horas, que puede llegar al 25% de los casos con dosis de 400 mg/Kg/día y podría añadir una actividad adicional que justificaría la inclusión de este antibiótico en el tratamiento de la infección del SNC (33). Respecto a la comparación del punto de corte de moxifloxacino proporcionado por la simulación: CMB ≤2 mg/L con dosis de 400 mg/día y ~ 144 ~ CMB ≤4 mg/L con dosis de 800 mg/día, respecto a los propuestos por CLSI y EUCAST: CMI ≤2 mg/L y ≤1 mg/L respectivamente, es de difícil valoración, ya que nosotros proponemos un punto de corte basado en CMB, para adecuarlo al objetivo PK/PD propuesto para infección del SNC, mientras que CLSI y EUCAST proponen puntos de corte a nivel general basados en la CMI y de difícil extrapolación al SNC. Sin embargo, pensamos que son similares si utilizamos la dosis de 400 mg/día, e incluso por las propiedades bactericidas y farmacocinéticas del fármaco, con la dosis de 800 mg/día este valor podría ascender a 4 mg/L. Existen pocos estudios que evalúen la actividad de moxifloxacino mediante curvas de tiempo-muerte en L. monocytogenes . Grayo et al. (43), demuestran empleando una cepa serotipo 1/2a virulenta y productora de hemolisina, que el inoculo inicial se reduce en más de 3 log UFC/mL después de 6 horas de incubación, con una tasa de muerte bacteriana alta a concentraciones de 4xCMI y de C max , aspecto que coincide con nuestros resultados, donde con concentraciones 3xCMI y C max la reducción media del inoculo osciló entre 2,9 y 3,1 log. En otro trabajo de Carryn et al. (42), también demuestran una alta actividad bactericida de moxifloxacino a las 24 horas de incubación a concentraciones clínicamente relevantes (4 mg/L). Seral et al. (45), también encuentran resultados similares, con reducciones del orden de 2 log a las 5 horas de incubación a concentraciones de moxifloxacino de 3,4 mg/L. ~ 145 ~ Por tanto, todos los estudios realizados con esta metodología, incluido el nuestro, demuestran la actividad bactericida de moxifloxacino. En el caso de ampicilina, los valores de CMI y CMB encontrados en el estudio extracelular revelan una actividad bacteriostática, con cocientes CMB 90 /CMI 90 ≥32. Sin embargo, estos datos contradicen la experiencia clínica donde la ampicilina y penicilina son efectivas en el tratamiento de la meningitis por L. monocytogenes (86,87). Esta posible contradicción, fue evaluada por Appleman et al. (85), demostrando que la prolongación de la incubación genera un efecto bactericida de ampicilina sobre L. monocytogenes , similar a lo que estaba descrito anteriormente en S. aureus (88). Es decir, el efecto bactericida de los antibióticos betalactámicos en L. monocytogenes , demostrado por curvas tiempo-muerte ocurre entre las 24 y las 48 horas de incubación (85). Por lo tanto, se puede afirmar que la eficacia clínica en meningitis de los betalactámicos es gracias a la actividad bactericida a las 24-48 horas tras un tratamiento prolongado. La explicación de este fenómeno se debe a la baja tasa de crecimiento de este microorganismo, que requiere 48 horas para alcanzar un contaje de 10 8 -10 10 UFC/mL, a diferencia de otras bacterias como Staphylococcus spp. que consiguen estos contajes en 24 horas (89, 90). Por esta razón, en el tiempo de exposición al antibiótico, la tasa de muerte bacteriana superaría a la tasa de crecimiento de las bacterias. ~ 146 ~ Por todo ello, nuestros resultados demuestran la actividad bactericida que predice el modelo clínico de simulación de Monte Carlo y están en consonancia con los resultados clínicos publicados. Aunque ambos antibióticos ejercen un efecto bactericida sobre las formas extracelulares de L. monocytogenes , moxifloxacino actúa más rápidamente que ampicilina (42, 43). Esta rápida actividad bactericida podría afectar de forma favorable a la adecuada evolución clínica de los pacientes, especialmente en aquellos con déficit de la inmunidad celular (91). A lo anterior, habría que añadir, que dado que la barrera hematoencefálica limita la entrada de antibióticos en el SNC (82) y moxifloxacino alcanza altas concentraciones en LCR en comparación con ampicilina, incrementándose su coeficiente terapéutico, esto podría ser una ventaja adicional a la hora del tratamiento de la infección por L. monocytogenes a dicho nivel (41). Existen muy pocas publicaciones que valoren la sinergia entre betalactámicos y quinolonas frente a L. monocytogenes , pero en dos trabajos publicados demuestran la existencia de antagonismo de las combinaciones tanto in vitro como en un modelo de ratón neutropénico (92, 93), aunque ninguno de los trabajos incluye moxifloxacino en el estudio. En nuestro estudio, con la combinación de tres concentraciones fijas de ambos antibióticos, no se detectó efecto sinérgico (reducción del inóculo inicial de al ~ 147 ~ menos 2 log comparándolo con el antibiótico más activo) con ninguna de las combinaciones estudiadas, pero sí indiferencia, ya que en ninguna de ellas se produjo tal disminución del inóculo inicial y la actividad fue similar a la del antibiótico más activo, en este caso, moxifloxacino. La entrada de las quinolonas en células eucariotas tiene lugar por difusión pasiva, dada la naturaleza anfifílica de estos antibióticos. En ciprofloxacino, no obstante, se han descrito mecanismos de expulsión celular activa mediante bombas de flujo, fenómeno que no ocurre con moxifloxacino (94). El análisis conjunto de los resultados demuestra la gran actividad intracelular de moxifloxacino que logró reducciones del inóculo bacteriano a la hora de incubación entre el 56-81% dependiendo de la concentración de antibiótico empleada, llegando a la esterilización del nicho intracelular a las 24 horas, con reducciones del 99,97-99,99% a concentraciones de 0,5xCMI y C max . Estos resultados, están en consonancia con otros trabajos que demuestran que moxifloxacino presenta una rápida acción bactericida concentración dependiente frente a las formas intracelulares de L. monocytogenes (42, 43, 80). Ampicilina, aunque produce reducciones del inóculo intracelular muy modestas a 1 hora de incubación (0-25%) a concentraciones de 0,5xCMI y