Papel de mTOR Y AMPK en la regulación del proceso de autofagia

TRABAJO FIN DE GRADO PAPEL DE mTOR Y AMPK EN LA REGULACIÓN DEL PROCESO DE AUTOFAGIA Paula Navarro de Salas Sevilla, Julio 2021 2 3 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Trabajo Fin de Grado Grado en Farmacia PAPEL DE mTOR Y AMPK EN LA REGULACIÓN DEL PROCESO DE AUTOFAGIA Paula Navarro de Salas Departamento de Bioquímica Facultad de Farmacia Tutor: Alberto García Quintanilla Revisión bibliográfica 4 ABREVIATURAS Aβ: β-amiloide ADP: Adenosin difosfato AMBRA-1: Regulador 1 de autofagia y Beclin1 AMPK: Proteína quinasa activada por AMP Akt (o PKB): Proteína kinasa B ATG: Proteína relacionada con la autofagia ATP: Adenosin trifosfato Bcl-2: Proteína de linfoma de célula B2 CAMKK2: Calcio calmodulina quinasa 2 DEPTOR: Dominio DEP que interacciona con mTOR FAK: Quinasa de adhesión local FIP200: Proteína de interacción con la fsmilia de las FAK de 200 kDa LAMP-2A: Proeína de membrana asociada al lisosoma 2ª LC3: Cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulo LKB1: Quinasa B1 del hígado mLST8: Subunidad letal de mamíferos con proteína SEC 13 8 mSIN1: Proteína quinasa activada por estrés de mamífero que interactúa con la proteína 1 mTOR: Diana de rapamicina de mamíferos mTORC1/2: Complejo 1/2 de mTOR PE: Fosfatidiletanolamina PIP2/3: Fosfatidil-Inositol- (2/3)- Fosfato PI3K: Fosfatidil-inositol-3 kinasa 5 PP2A: Proteína fosfatasa 2A PRAS40: Sustrato rico en prolina de Akt/PKB de 40 kDa RAPTOR: Proteína asociada a la regulación de mTORC1 Rictor: Componente rapamicina-insensible de mTOR ROS: Especies reactivas de oxígeno S6K1: Proteína ribosómica S6 quinasa ULK1: Quinasa activadora de autofagia unc-51 tipo 1 UPR: Respuesta a proteína mal plegegada 6 RESUMEN La autofagia juega un importante rol en el mantenimiento y la supervivencia celular, ya que es un proceso catabólico de degradación celular que permite el reciclaje de los componentes celulares para mantener la homeostasis celular. Amplios estudios han demostrado que hay una gran cantidad de genes y moléculas implicados en este proceso, y se ha visto el papel tan importante que juegan las moléculas mTOR y AMPK en la regulación de este proceso. Una desregularización en el proceso de la autofagia se relaciona con enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), entre otras. En la EA se ha demostrado que la actividad de la autofagia está disminuida, provocando la acumulación de vesículas autofágicas en neuronas. La proteína quinasa activada por AMP (AMPK) tiene funciones críticas en la regulación del crecimiento, y recientemente se ha relacionado con procesos celulares como la autofagia. La autofagia es promovida por la AMPK, un sensor de energía clave que regula el metabolismo celular para mantener la homeostasis energética en situaciones de deficiencia de ATP. Su activación produce un aumento de la autofagia en neuronas, por lo que se ha demostrado que mejora los síntomas de la demencia. Por el contrario, la autofagia es inhibida por la diana de la rapamicina en los mamíferos (mTOR), la cual está formada por un conjunto de proteínas que se encargan de controlar procesos anabólicos del organismo como la síntesis de proteínas. Un exceso de activación de mTOR puede llevar a enfermedades como EA. En esta revisión bibliográfica se resumen los términos generales que engloban al proceso de la autofagia, sus etapas, así como los métodos de detección más característicos y nos adentramos en la señalización y regulación que se lleva a cabo en este proceso a través de sus moléculas más destacables mTOR y AMPK. PALABRAS CLAVE: autofagia, mTOR, AMPK, metabolismo, enfermedad de Alzheimer. 7 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 8 2. OBJETIVOS DE LA REVISIÓN ......................................................................................... 10 OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................... 10 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 10 3. METODOLOGÍA ........................................................................................................... 11 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 12 4.1. AUTOFAGIA ......................................................................................................... 12 4.2. TIPOS DE AUTOFAGIA .......................................................................................... 12 4.3. TÉCNICAS DE MONITORIZACIÓN DE AUTOFAGIA ................................................. 14 4.3.1. MICROSCOPÍA DE TRANSMISIÓN ELECTRÓNICA ................................................................ 14 4.3.2. LC3/ATG8 ........................................................................................................................... 15 4.3.3. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA ................................................................................... 16 4.3.4. LC3-I/LC3-II MEDIANTE INMUNOTRANSFERENCIA ............................................................ 16 4.3.5. ENSAYO DE RENOVACIÓN DE LC3 ...................................................................................... 16 4.3.6. DEGRADACIÓN DE SUSTRATOS SELECTIVOS PARA LA AUTOFAGIA: LC3 Y P62 .................. 17 4.3.7. DETECCIÓN DE FRAGMENTOS GFP .................................................................................... 17 4.3.8. ENSAYO DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS DE LARGA DURACIÓN ................................... 17 4.4. MECANISMOS MOLECULARES DE AUTOFAGIA ..................................................... 18 4.5. REGULACIÓN DEL PROCESO DE AUTOFAGIA ........................................................ 20 4.5.1. MTOR ................................................................................................................................. 21 4.5.2. AMPK ................................................................................................................................. 27 4.6. DESREGULARIZACIÓN DE LA VÍA MTOR/AMPK Y SU IMPLICACIÓN EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA) .................................................................................. 29 5. CONCLUSIÓN ............................................................................................................... 33 6. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 34 8 1. INTRODUCCIÓN La palabra autofagia significa comer (fagia) propio (auto) y fue acuñada por primera vez en 1963 por Christian de Duve, cuando él y sus colaboradores observaron al microscopio electrónico fragmentos de orgánulos en el interior de lisosomas. Descubrieron este proceso después de que los componentes citoplasmáticos quedasen envueltos por el lisosoma, e identificaron una nueva vesícula que transporta la carga a éste: el autofagosoma (de Duve et al., 1966). La autofagia, es un proceso beneficioso ya que permiten que los orgánulos y las macromoléculas dañadas se degraden y reciclen dentro de la célula (Lapierre et al., 2015). Algunos hechos históricos relacionados con el descubrimiento y el proceso de la autofagia se resumen: En 1963, Christian de Duve describió por primera vez la autofagia describiéndolo como el proceso de degradación que se produce después de que los componentes citoplasmáticos queden envueltos por el lisosoma e identificó una nueva vesícula que transporta carga a éste, el autofagosoma. En la década de los 90, la investigación de la autofagia floreció después de que el equipo del Dr. Yoshinori Ohsumi identificara los genes importantes relacionados con las mutaciones defectuosas de la autofagia en levaduras, llamados genes relacionados con la autofagia (ATG) y su proteína relacionada. Poco después, se hicieron avances en la investigación que se centraron en los aspectos genéticos y varias proteínas ATG, lo que permitió comprender mejor la función y los mecanismos de la autofagia. Recientemente, la autofagia ha sido ampliamente estudiada no solo en levaduras y modelos animales, si no también en procesos fisiopatológicos humanos. En 2016, Yoshinori Ohsumi recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en reconocimiento a su trabajo para sentar las bases para una mejor comprensión de la capacidad de las células para controlar el hambre, el estrés y las enfermedades (Lin et al., 2019). La autofagia es un proceso intracelular catabólico conservado evolutivamente, y finamente regulado para el reciclaje de materiales citoplasmáticos (proteínas, lípidos, carbohidratos) y para la degradación de orgánulos dañados (mitocondrias, retículos endoplasmático y peroxisomas), cuya acumulación puede ser tóxica para las células. De esta forma, se garantiza la renovación y el buen funcionamiento de los orgánulos intracelulares. En los lisosomas, la autofagia determina: el reciclaje de las porciones celulares que aún se pueden utilizar, la reducción de los desechos celulares, la protección y el mantenimiento de la energía y la adaptación celular a los desafíos ambientales, en resumen, todos los procesos que contribuyen a la supervivencia 9 celular. Por tanto, la autofagia es principalmente un mecanismo citoprotector y su desregulación puede ser la causa de la aparición de patologías que pueden afectar al hígado, corazón, cerebro, miopatías, diabetes, obesidad y cáncer (Maiuolo et al., 2021). Entre estas enfermedades, se encuentra la enfermedad de Alzheimer (EA). La EA es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que se caracteriza por la deposición de placas neuríticas que contienen péptido beta amiloide y ovillos neurofibrilares compuestos de proteína tau hiperfosforilada. Sin embargo, los detalles moleculares de la patogénesis de la EA necesitan ser aclarados, aunque se asocian con varias anomalías neuronales en el metabolismo energético. Por tanto, teniendo en cuenta las propiedades de AMPK y mTOR, estas anomalías podrían estar relacionadas con posibles defectos funcionales en la señalización de ambos (Salminen at al., 2011). 16 Por tanto, teniendo en cuenta la importancia del procesamiento de LC3 para la formación y fusión del autofagosoma, éste es usado por distintas técnicas de monitorización, descritas a continuación, para detectar tanto el número de autofagosomas como el flujo autofágico: 4.3.3. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Después de la fusión con el lisosoma, LC3 de la membrana externa (LC3-ll) es escindida por ATG4 y LC3 de la membrana interna (LC3-l) es degradada por enzimas lisosomales, lo que da como resultado un contenido de LC3 muy bajo en el autolisosoma. Por lo tanto, LC3 endógena o GFPLC3 se visualiza mediante microscopía de fluorescencia como un grupo citoplasmático difuso o como estructuras puntiformes que representan principalmente autofagosomas. Aunque el número de estructuras puntiformes de LC3 o GFP-LC3 por célula suele ser una medida precisa del número de autofagosomas, este ensayo tiene algunas dificultades experimentales potenciales. El número de estructuras puntiformes puede contarse visualmente por un profesional experimentado o determinarse automáticamente utilizando programas de análisis de imágenes. Aunque el número de puntos aumenta notablemente después de la inducción de la autofagia, también se observan pequeñas cantidades de puntos incluso en condiciones normales. 4.3.4. LC3-I/LC3-II MEDIANTE INMUNOTRANSFERENCIA LC3-l y LC3-ll se pueden distinguir fácilmente en función de su distinta movilidad electroforética en geles de poliacrilamida con docecilsulfato sódico como el gel SDS-PAGE. A pesar del mayor peso molecular de LC3-l (PM aparente es 16 kD), LC3-ll (PM aparente es 14 kD) migra más rápidamente en SDS-PAGE en comparación con LC3-l, debido a una mayor hidrofobicidad asociada con el grupo PE (Barth et al., 2010). 4.3.5. ENSAYO DE RENOVACIÓN DE LC3 La degradación de LC3-II dentro del autolisosoma puede detectarse en ausencia o presencia de inhibidores de degradación lisosomal. Si las células se tratan con reactivos lisosomotrópicos como cloruro de amonio, cloroquina o bafilomicina A1, que inhiben la acidificación dentro del lisosoma o la fusión autofagosoma-lisosoma, o si se tratan con inhibidores de proteasas lisosomales como E64d y pepstatina A, la degradación de LC3-II se bloquea, lo que da como resultado una acumulación de LC3-II. 17 En consecuencia, las diferencias en la cantidad de LC3-II entre muestras en presencia y ausencia de inhibidores lisosomales representan la cantidad de LC3 que se entrega a los lisosomas para su degradación, es decir, flujo autofágico (Ju et al., 2010) (Zhang et al., 2013). Hay que tener en cuenta que los inhibidores de lisosomas tienen mayor afinidad por LC3-ll, por tanto, la relación LC3-l/LC3-ll no debe usarse como indicador del flujo autofágico. 4.3.6. DEGRADACIÓN DE SUSTRATOS SELECTIVOS PARA LA AUTOFAGIA: LC3 Y P62 Clásicamente, la autofagia se consideraba un sistema de degradación aleatorio, pero estudios recientes han revelado que varios sustratos específicos se degradan preferentemente mediante autofagia, de los cuales, el ejemplo mejor estudiado es p62 (también conocido como SQSTM1). p62 se incorpora selectivamente en los autofagosomas a través de la unión directa a LC3 y se degrada eficazmente por autofagia; por tanto, los niveles de expresión celular total de p62 se correlacionan inversamente con la actividad autofágica (Ramirez-Sagrado et al., 2016) 4.3.7. DETECCIÓN DE FRAGMENTOS GFP Aunque la fluorescencia de la proteína GFP se apaga por el entorno de pH ácido dentro del lisosoma, la GFP todavía es detectable por inmunotransferencia y es más estable que la proteína de fusión GFP-LC3. Por tanto, mediante este ensayo se produce la detección del fragmento de GFP libre que se genera por degradación de GFP-LC3 en el autolisosoma mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-GFP. 4.3.8. ENSAYO DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS DE LARGA DURACIÓN En este ensayo, las células se cultivan con aminoácidos marcados con isótopos (generalmente [ 14 C] – valina, [14C] – leucina o [ 35S] – metionina) durante un período prolongado (de varias horas a varios días) para marcar proteínas de larga duración, seguido de un período de incubación corto sin aminoácidos marcados con isótopos para eliminar las proteínas de vida corta, que son degradadas principalmente por el proteosoma. Después del tratamiento con un estímulo inductor de autofagia, la liberación celular de proteínas degradadas (medida como radiactividad soluble en ácido tricoloracético en el sobrenadante del cultivo) se cuantifica. Para 18 garantizar aún más la radioactividad medida, se recomienda realizar este ensayo con o sin un inhibidor de la autofagia. 4.4. MECANISMOS MOLECULARES DE AUTOFAGIA La macroautofagia es el tipo de autofagia mejor caracterizado y se lleva a cabo por cinco pasos principales: iniciación (1), nucleación (2), expansión (3), fusión (4) y reciclaje-degradación (5). Figura 4. Proceso de macroautofagia. (Frentzel et al., 2017) Se produce cuando las células son sometidas a estrés metabólico o terapéutico, tal como altas temperaturas, hipoxia, infección por patógenos, ayuno y estrés oxidativo. Tiene lugar en cinco pasos: 1. Iniciación: se produce la inducción de la autofagia debido a una respuesta de estrés metabólico o terapéutico, esto está mediado por el complejo ULK (compuesto por ULK1/2, ATG13, ATG101 y RB1CC1/FIP200). Así, cuando el complejo activo ULK1/2 recibe la señal, fosforila a ATG13 y RB1CC1, provocando su translocación a un dominio del RE (Ariosa et Klionsky., 2017). Una vez que entra en el RE, el complejo ULK inicia la nucleación. Este complejo es inactivado por fosforilación a través del complejo mTOR1 (mTORC1), por el contrario, durante la inducción de la autofagia mTORC1 es inhibido, produciéndose la interacción proteína-proteína, entre ULK y Beclin1 (Mejías, Y., 2015). 19 2. Nucleación: durante la nucleación se forma el fagoforo (o aislamiento de la membrana). Esta acción se desencadena principalmente por el complejo proteico VPS34, formado por ATG14, AMBRA1, VPS34 y Beclin1, con actividad quinasa 3- fosfatidil inositol fosfato (PI3K). Este complejo está activado cuando Beclin1 se une a AMBRA1 e inhibido cuando Beclin1 se une, a través de su propio dominio BH3, a Bcl-2 o Bcl-xL (García, J., 2016). 3. Expansión: la expansión de la membrana lipídica para posterior formación del autofagosoma se produce por la interacción del fagoforo con el complejo ATG12/ATG5/ATG16L, el cual se forma por la acción de ATG7 y ATG10, esto produce la multimerización y formación de un complejo que permite la inserción de la proteína LC3 (homóloga a ATG8) en la membrana del fagoforo, en su forma lipidada LC3- ll (para llegar a LC3 lipidada, LC3 es sintetizada como proLC3, que se escinde por ATG4, para formar LC3-l, ésta es activada por ATG7, transferida a ATG3 y finalmente conjugada con PE (fosfatidiletanolamina) para formar LC3-ll) (Tanida, I., 2011). Esta unión permite la captación de la carga citosólica y el posterior cierre de la vesícula, dando origen al autofagosoma. 4. Fusión: el autofagosoma se desprende del complejo ATG12/ATG5 y el ATG8 se libera de la membrana externa por acción de autofagina. Una vez desnudo el autofagosoma, se fusiona directamente con los lisosomas por acción de las proteínas Rab7, Lamp1 y Lamp2, o previamente se une con un endosa tardío formado un anfisoma. 5. Degradación: por último, una vez fusionados con el lisosoma, el contenido del interior del autofagosoma es degradado por las enzimas lisosomales (Ramirez – Sagredo et al., 2016). El pH ácido del lisosoma, mantenido por la bomba de protones ATPasa vacuolar (v-ATPasa), permite la actividad óptima de las captepsinas lisosomales. Los metabolimos generados tras la proteólisis son bombeados al citosol para su reutilización por la célula (Ariosa et Klionsky., 2017) (Rubinsztein et al., 2012). 20 4.5. REGULACIÓN DEL PROCESO DE AUTOFAGIA Las vías primarias de la regulación de la autofagia que traducen la información sobre el estado energético de la célula y modulan el proceso son: la vía mTOR y la señalización por AMPK. Estas rutas integran señales metabólicas como disponibilidad de aminoácidos, factores tróficos (vía PIK3C1-ATk-mTORC1) o de oxígeno y glucosa (que definen los niveles energéticos vía AMP/ATPAMPK) (Benito I., 2017). Figura 5. Regulación de la autofagia. Por un lado, se produce la activación de la autofagia debido a una disminución del balance ATP/AMP que provoca una activación de AMPK, que induce la autofagia a través de la inactivación de TSC1/2 (complejo de proteínas de esclerosis tuberosa 1 y 2); UPR produce la activación de IRE1 (proteína transmembrana del RE), esta proteína presenta un dominio sensorial interno y un dominio endoribonucleótido externo. Un exceso de UPR provoca la activación de estos dominios; niveles moderados de estrés oxidativo inducen la mitofagia, el cual representa un gran mecanismo de protección frente a las ROS (especies reactivas de oxígeno), llevándose a cabo mediante PINK1, que recluta a Parkin y causa la ubiquitinación de algunas proteínas mitocondriales de membrana, por otro lado, las ROS pueden interrumpir directamente a ATG4, inhibiendo la escisión de LC3 (ATG8) de los lípidos de membrana del autofagosoma, lo que a su vez mejora la autofagia; los iones de Ca2+ se AUTOFAGIA ACTIVACIÓN INHIBICIÓN ATP/AMP UPR(respuesta proteína mal plegada) Nivel moderado de estrés oxidativo Ca2+ Aminoácidos intracelulares Factores de crecimiento cAMP ↑ AMPK à ↓ mTOR ↑ Sirtuina Activación del dominio endoribonucleasa de IRE 1 ↓ ATG4 PINK1 à Parkin à ubiquiti nación de la proteína de membrana externa à mitofagia ↑AMPK à ↓mTOR ↑mTOR ↓Raf-1 ↑PI3K à ↑Akt ↑PKA à ↑Ras à ↑PI3K à ↓ATG1 21 encuentran almacenados en el RE y pueden ser movilizados al citoplasma por canales voltajedependiente. Si el Ca2+ es liberado al citoplasma, estimula una calmodulina quinasa dependiente de calcio activado, la cual inhibe mTORC1 a través de la activación de la vía AMPK. Por otro lado, se da la inhibición de la autofagia mediada por el aumento de la concentración de aminoácidos que es detectada por las proteínas Rag, esto causa la unión de Rag a RAPTOR en mTORC1, mejorando la señal de mTOR e inhibiendo la autofagia; el aumento de los factores de crecimiento activan el receptor de membrana tirosin-quinasa, aumentando la actividad de PI3K (fosfoinositol-3-quinasa) de clase l encargado de activar a su vez la producción de PIP3 (fosfatidil inositol trifosfato) que conduce a la activación de la proteína Akt, activando el complejo mTORC1 e inhibiendo la autofagia; la acumulación de cAMP activa la PKA (proteina quinasa A) la cual causa la activación de Ras y éste causa la fosforilación y desactivación de ATG1 y la activación de PI3K desencadenando la inhibición de la autofagia. Figura modificada de (Moloudizargari et al., 2017). 4.5.1. MTOR La diana de rapamicina de mamífero (mTOR: mammalian target of rapamycin). mTOR es una proteína serina/treonina quinasa de gran tamaño (2549 aminoácidos, 250 kDa) y pertenece a la familia de proteínas quinasas relacionadas con fosfoinositido-3-quinasa (PI3K). Estructuralmente, el extremo N-terminal de la proteína mTOR contiene más de 20 repeticiones HEAT prototípicas en tándem (Huntingtin, EF3A, ATM, and TOR) que forman dos alfa-solenoides seguidas de un dominio FAT (FRAP, ATM y TRRAP) y un dominio FRB (unión de FKBP12/rapamicina), que está unido al dominio catalítico quinasa (KIN) y termina con el dominio FATC en el extremo C-terminal (Luo et al., 2018). Además, mTOR también contiene un dominio regular negativo (NRD) entre el dominio catalítico y el dominio FACT, que es esencial para la regulación de la actividad de mTOR (Wang et al., 2019) (Figura 6A). mTOR constituye la subunidad catalítica de dos complejos multiproteicos distintos: el complejo mTOR 1 (mTORC1) y el complejo mTOR 2 (mTORC2). Tanto mTORC1 como mTORC2 contienen algunas macromoléculas idénticas como la subunidad catalítica (mTOR) la subunidad letal de mamíferos con proteína SEC 13 8 (mLST8) y un componente regulador tanto de mTORC1 como de mTORC2 que contiene un dominio DEP (DEPTOR) proteína de interacción de mTOR. DEPTOR inhibe a mTORC1 y mTORC2, probablemente a través de la unión de su dominio PDZ a mTOR. Aparte, cada complejo presenta proteínas específicas. mTORC1 contiene PRAS40 (sustrato Akt 22 rico en prolina de 40 kDa) y la subunidad central, la proteína asociada a la regulación de mTOR (RAPTOR). Por el contrario, mTORC2 contiene la subunidad que contiene el sitio de unión al sustrato y determina la locación de mTORC2 (mSIN1), la subunidad insensible a la rapamicina (RICTOR) y las proteínas asociadas a RICTOR 1 (PROTOR1) y 2 (PROTOR2). Éstas últimas no parecen afectar la actividad intrínseca de mTORC2 (Hoeffer et al., 2010) (Tafur et al., 2020). El regulador mejor caracterizado de la autofagia es el complejo mTOR 1 (mTORC1). Esta quinasa regula negativamente la autofagia inhibiendo directamente la actividad del complejo ULK1 por fosforilación. En células mamíferas, ULK1 es fosforilado directamente por AMPK en respuesta a falta de energía. Por lo tanto, AMPK desencadena la autofagia regulando positivamente el complejo ULK1 e inhibiendo a mTOR (Boya P et al., 2013). - mTORC1 Regulación “upstream” de mTORC1 La activación de mTORC1 está controlada por una serie de señales como factores de crecimiento, nutrientes, niveles de energía y estrés. La señal de factores de crecimiento es regulada por el complejo de esclerosis tuberosa (TSC). El complejo TSC lo comprenden: Hamartin (TSC1), tuberina (TSC2) y Tre2-Bub2-cdc16 (TBC). TSC inhibe a Rheb a través de su actividad de proteína activadora de GTPasa (GAP), convirtiendo GTP en GDP. Cuando TSC es inhibido, Rheb se une a GTP, esto permite la unión y activación alostérica de mTORC1 a través de un cambio conformacional. Existen muchas señales “upstream” que convergen en TSC para regular la actividad de mTORC1. Las vías de activación más importantes son la vía PI3K/Akt/mTORC1 y la vía Ras/Raf/MEK/ERK/mTORC1. Por ejemplo, Akt es capaz de fosforilar e inhibir TSC2, activando así a mTORC1. Esto se da cuando las señales de factores de crecimiento activan PI3K a través de la unión a las proteínas IRS. Luego, PI3K fosforila PIP2 a PIP3 que luego activan a PDK1/2. Akt se activa mediante la fosforilación de PDK1. Por tanto, promueve la actividad de mTORC1 a través de la fosforilación de TSC, activando posteriormente Rheb. mTORC2 también fosforila directamente a Akt. Niveles bajos en energía debido a la privación de glucosa activan la AMPK a través de la fosforilación de la quinasa hepática B1 (LKB1). AMPK es activa en respuesta a niveles bajos de energía celular (balance alto AMP/ATP). AMPK fosforila directamente a TSC2, incrementando la función GAP de TSC2. Además, AMPK fosforila el componente Raptor de mTORC1, aumentando la unión de Raptor 14-3-3 e inhibiendo a mTORC1. Durante la privación de glucosa, las vías de 23 respuesta al daño en el ADN conducen a la inhibición de mTORC1 mediante la inducción de la proteína supresora de tumores (p53). Las células responden a condiciones de estrés, como hipoxia, inhibiendo mTORC1 mediante el regulador en el desarrollo al daño al ADN (REDD1), independientemente al AMPK (Melick et al., 2020). En condiciones suficientes de aminoácidos, se ha demostrado que el complejo activo RAGA/B- GTP-RAGC/D-GDP se une directamente al componente RAPTOR de mTORC1 y redistribuye a mTORC1 al lisosoma. Por otro lado, en condiciones de privación de aminoácidos, especialmente la abstinencia de leucina, mTORC1 se dispara por toda la célula, pero se redistribuye en las vesículas que contienen proteínas de membrana asociada a lisosomas 2 (LAMP2) y RAB7 (que son marcadores de lisosomas y endosomas tardíos, respectivamente) en respuesta a la estimulación de aminoácidos. Esto sugiere que RAG GTPasa juega un papel en la transducción de señales de aminoácidos al mTORC1. La sobreexpresión de RAGA/B-GTP es suficiente para activar mTORC1, éste se une a RAG y se recluta en el lisosoma a través de un mecanismo desconocido. La leucil-ARNtasa sintetasa (LeuRS) puede actuar como un sensor directo del aminoácido Leu en el citoplasma y podría estar involucrado en la activación de mTORC1 (Jewell et al., 2013) (Figura 6B) La rapamicina y sus análogos inhiben la actividad de mTORC1 alostéricamente, mientras que mTORC2 demuestra insensibilidad a la rapamicina a corto plazo. El complejo rapamicina-FKBP12 se une al dominio que presenta mTOR reduciendo la disponibilidad de la hendidura catalítica, lo que hace que algunos sustratos no puedan acceder al sitio activo. Se ha estudiado que el tratamiento prolongado de rapamicina inhibe a mTORC2 a través del secuestro de mTOR en algunos tipos de células. Regulación “downstream” de mTORC1 mTORC1 interviene en la regulación de multitud de procesos celulares relacionados con el crecimiento, entre ellos, se encuentra la autofagia. La falta de nutrientes en las células provoca la degradación del contenido citoplasmático en su interior, incluido los orgánulos, y por tanto reciclan las macromoléculas para garantizar la supervivencia. Este proceso catabólico se denomina macroautofagia, definido anteriormente. mTORC1 regula la autofagia a través del control directo de ULK1/2 (ATG1 en levaduras), proteína quinasa encargada de la regulación del inicio de la formación del autofagosoma (Takahara et al., 2020). El principal complejo autofágico ULK1, consta de ULK1, ULK2, ATG13 y RB1CC1 necesario para mediar la señal de la quinasa 24 mTORC1 sensible a nutrientes (Wong et al., 2013). Por otra parte, hay otra quinasa muy importante en la regulación y también sensible a la concentración de nutrientes, la proteína quinasa, AMPK, que fosforila directamente a ULK1/2 durante los momentos de inanición de glucosa. Esta proteína interviene en la regulación celular de muchos procesos del organismo. AMPK activa ULK1 fosforilando las serinas 317 y 777 de ULK1 mayoritariamente (Kim, J. et al., 2011). Aparte, una de las funciones clave de mTORC1 es la regulación de la traducción de proteínas, a través de la síntesis de proteínas mediante fosforilación directa de las proteínas relacionadas con la traducción, como la proteína ribosómica S6 quinasa 1 (S6K1) y la actividad de las fosfatasas como la proteína fosfatasa 2A (PP2A), que pueden regular los sustratos de mTOR, generando así bucles de retroalimentación dependientes de mTOR que controlan las tasas de iniciación (Hoeffer et al., 2010). Además, mTORC1 promueve la síntesis de lípidos al fosforilar la lipina 1, lo que aumenta la actividad de la proteína de unión al elemento regulador de esteroles 1 (SREBP1) (Peterson et al., 2010) y promueve la síntesis de purinas al estimular el ciclo del tetrahidrofolato mitocondrial (mTHF) mediante el incremento de la enzima metilentetrahidrofalato deshidrogenasa 2 (MTHFD2) (Ben-Sahra et al., 2016). - mTORC2 Regulación “upstream” de mTORC2 Hay menos información funcional y estructural disponible para la señalización de mTORC2. Se demostró por primera vez que mTORC2 regula la organización del citoesqueleto a través de la vía PKCa. mTORC2 también se encarga de inhibir la apoptosis y regular la homeostasis de la glucosa y el metabolismo anabólico. Los reguladores de mTORC2 no están muy bien definidos. La regulación por la vía PI3K es quizás la señal “upstream” mejor comprendida de mTORC2, con la unión de fosfatidilinositol (3, 4, 5) – trifosfato (PIP3), encargado de reclutar mTORC2 a la membrana y de estimular su actividad quinasa. Al igual que otras proteínas reguladoras PI3K, mTORC2 tiene una subunidad mSin1, proteína quinasa activada por estrés de mamíferos que interactúa con la proteína quinasa 1 (SGK1), que contiene un dominio homólogo de pleckstrina (PH). Este dominio es vital para la regulación de la actividad de mTORC2 insulina-dependiente o factores de crecimiento ya que inhibe la actividad catalítica de mTORC2 en ausencia de insulina. Por otro lado, AMPK activa mTORC2 directamente en respuesta al estrés energético. Los agonistas que activan la AMPK promueven la señalización de mTORC2 independientemente de la retroalimentación negativa mediada por mTORC1. AMPK fosforila mTOR y RICTOR, y esto es 25 suficiente para aumentar la actividad de la cinasa mTORC2. Los mecanismos por los que esta fosforilación regula la actividad de mTORC2, así como los sitios exactos de fosforilación, aún no se han definido completamente. La entrada directa de AMPK a mTORC2 sugiere una nueva estrategia para la supervivencia celular para hacer frente al estrés energético agudo (Fu and Hall, 2020) (Liu et al., 2015). mTORC1 regula negativamente a mTORC2 a través de S6K1, debido a la existencia de bucles de control de retroalimentación entre mTORC1 y mTORC2. mTORC1 fosforila y activa a Grb10, un regulador negativo de la señalización del receptor de insulina/IGF-1 de la vía “upstream” de Akt y mTORC2, mientras que la proteína ribosómica S6 quinasa (S6K1) participa en la regulación “downstream” de mTORC1, ésta suprime la activación de mTORC2 a través de la degradación dependiente de la fosforilación del sustrato 1 del receptor de insulina (IRS1). Esta regulación negativa de la señalización PI3K y mTORC2 por mTORC1 tiene numerosas implicaciones para la orientación farmacológica de mTOR en la enfermedad (Saxton and Sabatini, 2017). Al contrario que mTORC1, mTORC2 es insensible al tratamiento agudo con rapamicina. Sin embargo, estudios indican que la exposición prolongada a la rapamicina bloquea la función de mTORC2 en ciertas líneas celulares (Tsukumo et al., 2014). Regulación “downstream” de mTORC2 En comparación como mTORC1, las funciones de mTORC2 están mucho menos caracterizadas. mTORC2 fosforila miembros de la familia de quinasas AGC, como Akt, la proteína quinasa C (PKC) y la quinasa 1 (SGK1), regulando así la proliferación celular, la supervivencia y la organización del citoesqueleto de actina en respuesta a factores de crecimiento (Luo et al., 2018). mTORC2 fosforila y activa a Akt/PKC. El papel de Akt incluye la regulación de la proliferación celular, supervivencia, metabolismo, y transcripción. A través de su dominio PH, Akt se une a PIP3 y genera PI3K tras la estimulación por insulina o factores de crecimiento. De manera similar a otras AGC quinasas, la Akt unida a la membrana se activa mediante fosforilación en dos sitios, un sitio en el bucle de activación de la quinasa (Thr308) y un sitio en la zona hidrófoba (Ser473). Por tanto, mTORC2 es la responsable de la fosforilación en el sitio hidrófobo, jugando un papel positivo en la activación de Akt. Por lo tanto, mTORC2 quizás pueda inhibir la autofagia indirectamente activando mTORC1 a través de la fosforilación en el dominio hidrófobo de Akt (Figura 6B). 32 AMPK. Curiosamente, la EA está asociada con varias anomalías en el metabolismo energético neuronal, por ejemplo, disminución de la captación de glucosa, disfunciones mitocondriales y defectos en el metabolismo del colesterol y, además, con problemas para mantener la homeostasis del Ca2+. Una de las quinasas “upstream” que activan AMPK, la Ca2+/Proteína quinasa β dependiente de calmodulina (CAMKKβ) se expresa abundantemente en las neuronas y es activada por un aumento de concentración de Ca2+ intracelular. Por tanto, disfunciones en el equilibrio de Ca2+ puede desencadenar la señalización de AMPK, sobretodo en neuronas (Salminen et al., 2011). Resumiendo, la homeostasis del Ca2+ neuronal se encuentra desregulada en la EA, siendo el Ca2+ un potente activador de AMPK a través de la activación de CAMKKβ. La activación crónica de AMPK puede desencadenar la muerte de células neuronales, ya sea a través de vías apoptóticas o autofágicas. Por otro lado, se sabe que durante la EA se produce una hiperfosforilación de tau y depósitos de Aβ. La AMPK, no solo puede afectar a la deposición de Aβ, sino también reducir la hiperfosforilación de tau, mejorando así los síntomas de la demencia. En primer lugar, la AMPK actúa regulando la expresión de secretasa β y γ, para reducir el depósito de Aβ. En segundo lugar, la AMPK mejora la desacetilación y reduce la hiperfosforilación de tau a través de la activación de SIRT1 y PP2A. En general, la AMPK no solo desempeña un papel útil en la producción y eliminación de Aβ, sino que también mejora en gran medida las características patológicas de la EA (Chen et al., 2021). 33 5. CONCLUSIÓN La autofagia es el proceso por el cual nuestras células descomponen y destruyen orgánulos viejos, anormales o dañados. Los productos de descomposición se reciclan para funciones celulares importantes como el ayuno o estrés. Este proceso evita la acumulación de proteínas mal plegadas u orgánulos defectuosos y también ayuda a destruir virus y bacterias, impidiendo quizás que las células normales se vuelvan cancerosas. La macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas son los tres principales tipos de autofagia. Hay muchas técnicas de monitorización del proceso de la autofagia, tanto cualitativas, como la TEM, como cuantitativas para determinar el flujo autofágico. Las rutas metabólicas mTOR y AMPK son de suma importancia para comprender el control del metabolismo mediante sus dos fases, el anabolismo y el catabolismo, pero también para el desarrollo de patologías. mTOR regula negativamente la autofagia mediante la fosforilación de ULK1. ULK1 es fosforilado directamente por AMPK en respuesta a falta de energía. Por lo tanto, AMPK desencadena la autofagia regulando positivamente el complejo ULK1 e inhibiendo a mTOR. Conocer estas dos vías de señalización puede darnos armas terapéuticas para luchar contra enfermedades como el cáncer o las enfermedades neurodegenerativas, en concreto, en la EA: - Una activación constante de la vía mTOR, provoca una inhibición permanente de la autofagia, disminuyendo su actividad y aumentando la acumulación de vesículas autofágicas, que en neuronas provocan una hiperfosforilación de tau y la acumulación de Aβ. - La actividad de AMPK puede mejorar los síntomas de demencia en la EA, ya que disminuye las concentraciones de tau hiperfosforilada y reduce las deposiciones de Aβ. 34 6. BIBLIOGRAFÍA Ariosa AR, Klionsky DJ. Autophagy core machinery: overcoming spatial barriers in neurons. J Mol Med (Berl). 2016;94(11):1217-1227 Barth S, Glick D, Macleod KF. Autophagy: assays and artifacts. J Pathol. 2010;221(2): 117- 124. Ben-Sahra I, Hoxhaj G, Ricoult SJH, Asara JM, Manning BD. mTORC1 induces purine synthesis through control of the mitochondrial tetrahydrofolate cycle. 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