Análisis de metabolitos de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo durante la acumulación de astaxantina

INSTITUTO DE BIOQUÍMICA VEGETAL Y FOTOSÍNTESIS Universidad de Sevilla Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Análisis de metabolitos de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo durante la acumulación de astaxantina Memoria presentada para optar al grado de Doctora en Biología por la licenciada CRISTINA HOYS HERNÁNDEZ Directora: Directora: Mercedes García González Esperanza del Río Sánchez Profesora Titular de la Universidad de Sevilla Doctora en Biología GARCIA GONZALEZ MERCEDES - 05251419J Firmado digitalmente por GARCIA GONZALEZ MERCEDES - 05251419J Nombre de reconocimiento (DN): c=ES, serialNumber=05251419J, sn=GARCIA GONZALEZ, givenName=MERCEDES, cn=GARCIA GONZALEZ MERCEDES - 05251419J Fecha: 2019.03.17 17:24:34 +01'00' DEL RIO SANCHEZ MARIA ESPERANZA - 77588248W Firmado digitalmente por DEL RIO SANCHEZ MARIA ESPERANZA - 77588248W Fecha: 2019.03.17 18:27:00 +01'00' HOYS HERNANDE Z CRISTINA - 14329606P Firmado digitalmente por HOYS HERNANDEZ CRISTINA - 14329606P Fecha: 2019.03.17 22:00:33 +01'00' AGRADECIMIENTOS Hay un proverbio hebreo que dice… “El que da, no debe volver a acordarse; pero el que recibe nunca debe olvidar” Por ello, quiero mostrar mi gratitud a todos aquellos que de una manera u otra han estado cercanos en el proceso de creación de esta tesis, leyendo el todo o las partes, alentando, aconsejando, corrigiendo, o simplemente, avanzando junto a mí en la marcha de los días. Ante todo, agradecer al Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis por ponerme a mi disposición sus instalaciones para el desarrollo de este trabajo, así como a las instituciones CSIC y Universidad de Sevilla por la financiación del proyecto. Al personal de microscopía electrónica del Centro de Investigación Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS) por su dedicación en el procesamiento de las muestras y en la toma de imágenes en el TEM. A Miguel y Mercedes muchísimas gracias por la confianza depositada en mí todos estos años, por apoyarme y valorarme siempre. A mis directoras Mercedes y Esperanza, os agradezco vuestra comprensión en los malos momentos, la paciencia ante los recurrentes errores, así como las palabras de ánimo y el esfuerzo conjunto….gracias Mercedes por hacerme ver que “había mucho” cuando yo creía que “no había nada”, por todas esas correcciones, tu implicación y aportarme todos los recursos necesarios, tanto materiales como intelectuales. Gracias Espe, por haber sentado una base sólida para esta tesis que no hubiera sido posible sin tu trabajo previo con Haematococcus. Tu confianza en mí me ha permitido trabajar en libertad y “a mi manera” pero siempre echándome “un alambre” cuando más lo necesitaba. A Pepe, por estar siempre siempre siempre dispuesto a ayudar en todas esas cosas que solo tú y nada más que tú sabes hacer, por montarme mi instalación “a mi altura”, desmontármela y volverla a montar, cambiar todos los cables y volverlos a cambiar, quitar y poner, poner y quitar, encender luces y entender por qué no se volvían a apagar, por arreglar los desastres en el microscopio, por ayudarme en con las determinaciones cuando ya “me cogió el toro”, por aportarme tranquilidad en los momentos de histeria, por alegrarte tanto como yo de los éxitos y por sufrir conmigo los obstáculos, por tantas y tantas cosas que podría seguir diciendo y no terminaría nunca, eso sí, siempre con una sonrisa e infinita paciencia. A “la Rebe”, por tu apoyo incondicional, por haber realizado tu trabajo aquí con esa pasión contagiosa que terminaste por contagiarme, por ser fuente constante de motivación e ideas innovadoras, por las innumerables conversaciones que se convertían en “miniclases” de bioquímica y que tanto me han ayudado, por los consejos que me regalaste y el apoyo que me brindaste a lo largo de esos años, por las llamadas de ánimo cuando no llegaba… A mis compañeros, a mi paisana alcalareña Alicia, por interesarte por mí en todo momento, por tu dedicación e implicación personal aquel día que lo empecé a ver todo distinto, por tomar mi trabajo como si fuera tuyo y estar siempre dispuesta a ayudarme. A Carlos, por tus innumerables pinchazos, por permitirme “trastear” el cromatógrafo, por aguantarme horas y horas cambiándolo todo en los equipos, por aportarme tranquilidad cuando surgían los problemas. A Irene, TE DEBO MUCHO. Gracias por hacerme fácil lo difícil. Por ayudarme en el día a día de mis últimos experimentos, por enseñarme las “cosas modernas” que tanto tiempo me han ahorrado, y sobre todo, por hacerte cargo del formato con ese manejo impecable del Word, por ordenar y “poner bonita “mi tesis como si fuera tuya, por recordarme en mis inicios, por recordarme también por qué elegí este camino. A Manuel y Mª José por poner a mi disposición vuestros conocimientos fotosintéticos y ayudarme con el PAM. A Esther, por avisarme a tiempo de “lo feas que eran mis gráficas” y enseñarme cómo se deben hacer (menos mal que lo hiciste), por avisarme a tiempo de por “dónde sí” y por “dónde no”, por avisarme a tiempo de lo que quedaba por venir. A PPL, por tu ayuda identificando los orgánulos de “mi niña”. A Inma, por poner tu avanzada experiencia por delante de mí, por hacerme saber en todo momento que podía contar contigo, por aportarme siempre tu visión acertada de las cosas, por apoyarme desde el primer momento. A mi vecina de mesa y sin embargo amiga Ani, por enseñarme el significado del “sentido común” y servirme como ejemplo de seguridad en un mismo, por ser “testigo” de muchos de mis avances y retrocesos al igual que yo fui “testigo” de mucho de los tuyos ;). A mi Martita, por esa llamada telefónica justo al final para alentarme y recordarme que estaba disponible para lo que necesitase. A mis amigas de siempre, a Espe, por estar ahí siempre disponible para lo que necesite, para que te ponga la cabeza “como un bombo”, por tu admiración continua por mi trabajo, por entenderme y ayudarme cuando “no me daba la vida”, por decirme una y otra vez….”¡porque es que la que vale, vale!”, por tantas y tantas cosas, gracias comadrita. A mi “coautora” Almudena, por ser mi “Pepito Grillo” siempre con tu frase “ya sabes cuál es tu objetivo”, por interesarte por mi trabajo constantemente y reflejar una ilusión que yo necesitaba recobrar, por aportar algunas ideas aunque no se llegaran a materializar (por ahora) y no dejar que desista por el camino...A mi Mari, por su ayuda para que no se me “enquistara”, por aportarme alegría siempre y quitarle hierro a todo, por ser mi confesora personal, y sobretodo, tranquilizarme con solo escucharte. A mi Cani, a mi Bartolita, porque simplemente eres una de mis personas favoritas, por arrancarme una sonrisa siempre, por entenderme, tranquilizarme y ayudarme, por todos esos desayunos, por esas conversaciones telefónicas, por dar sentido común a todo lo que no tiene sentido, por echarle “sirope” a los problemas, Elena, gracias por estar siempre ahí. A mi primo Paco, por poner la guinda final, por aplicar tu arte en la ilustración de la portada. A ti, a Rubén, por aparecer justo a tiempo y sobretodo, por quedarte, por todas las risas cuando las necesitaba, por tu seguridad ciega en mí, por priorizar y sufrir lo que no era tuyo como si lo fuera, por los “holis” que nunca faltan y que tranquilizan. A mi familia, que me habéis demostrado lo importante que soy para vosotros y me he dado cuenta de lo importante que sois para mí. A mi titi y mi abuela, por alimentar mis neuronas semanalmente y estar continuamente pendiente de que no me faltase nada. A mi padre y mis dos estrellas. Por estar aunque yo no esté. Por vuestro apoyo incondicional, consejos, comprensión con mis decisiones (a veces no acertadas), por respetar el camino que elegí y que me ha traído aquí, por hacer mi prioridad la vuestra, por la ayuda en los momentos difíciles, por llevarme los pies a tierra, por abrirme puertas que no sabía ni dónde estaban, por cerrarme otras que debía cerrar, por sostenerme para que no me caiga y levantarme cuando me caí. A mi hermana por servirme como ejemplo con su actitud, seriedad, tesón y su trabajo constante. Por decirme aquel día que me reiría de todo, por ayudarme a arrancar de nuevo, por recoger la toalla y volvérmela a dar. A mi madre, por recordarme que yo sí que puedo y ayudarme en “esas cosas que no se ven” A mi padre, por enseñarme a ver todo con los “ojos de la inteligencia”, por creer siempre en mí, porque todo empezó en Barbate con los cuadernos Santillana y “mira donde hemos acabao!!” Porque creía que no llegaba...porque nunca trabajé tanto y aprendí más…porque muchas han sido las veces que imaginaba como sería el momento en el que escribiría estas líneas y, una vez más, todo llega…porque cierro una etapa y doy comienzo una nueva… GRACIAS a quien siempre está, a quien ha querido estar y a quien acaba de llegar. a mis padres a ti Introducción 17 CAROTENOIDES Los carotenoides son pigmentos liposolubles del grupo de los isoprenoides, sintetizados de forma natural por plantas superiores, algas y microalgas, así como por organismos no fotosintéticos como bacterias y hongos (Goodwin 1980). Están presentes en todos los tejidos fotosintéticos, donde desempeñan un papel vital, ya sea participando en el proceso de transferencia de energía, absorbiendo la luz entre 400 y 500 nm o protegiendo el centro de reacción, gracias a su actividad antioxidante (Varela et al. 2015). Los colores amarillo, anaranjado y rojizo de las frutas y verduras se deben a la presencia de una secuencia lineal de al menos siete dobles enlaces (cromóforo) en estos compuestos. Desde el punto de vista químico, la estructura básica de un carotenoide es una molécula lineal de 40 átomos de carbono con dobles enlaces conjugados y una serie de ramificaciones con grupos metilo e hidroxilo. Se dividen en dos grupos: carotenos y xantofilas. Los primeros no presentan oxígeno en sus anillos terminales, es decir, sólo están compuestos por carbono e hidrógeno, mientras que las xantofilas son derivados oxigenados, donde el oxígeno puede estar presente en forma de grupos hidroxilo (luteína), grupos ceto (cantaxantina) o bien combinaciones de ambos (astaxantina) (Breithaupt 2007; Higuera-Ciapara et al. 2006). Se conocen alrededor de 700 compuestos de esta familia, derivados del licopeno (Figura 1). Figura 1. Estructura química de algunos carotenoides. Cristina Hoys Hernández 18 Los carotenoides también se pueden clasificar en primarios y secundarios. Los primarios como la luteína, α y β caroteno y violaxantina, actúan como componentes estructurales y funcionales del aparato fotosintético de las células y, por tanto, son esenciales para su supervivencia en condiciones de cultivo fotoautotrófico (Demmig- Adams et al. 1996). Los carotenoides secundarios como la astaxantina, cantaxantina y zeaxantina, se acumulan en cantidades considerables en cuerpos lipídicos dentro o fuera de los cloroplastos cuando las células se exponen a diferentes condiciones de estrés. Actualmente, se cree que pueden ejercer un papel como filtros fotoprotectores y como antioxidantes, previniendo la acumulación de radicales de oxígeno (Boussiba 2000; Demmig-Adams et al. 2002; Guerin et al. 2003; Jin et al. 2003). La presencia de gran número de dobles enlaces permite a los carotenoides interaccionar con el oxígeno singlete, amortiguar los estados triplete de la clorofila y secuestrar de las especies reactivas de oxígeno, disipando el exceso de energía (Demmig-Adams y Adams 2002). Una dieta rica en carotenoides puede retrasar el inicio de muchas enfermedades causadas por la acumulación de radicales libres así como ejercer un efecto protector frente a los rayos UV, mejorar el sistema inmune, prevenir el desarrollo del cáncer, diabetes, cataratas, degeneración macular y enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares (Gong y Bassi 2016; Varela et al. 2015). ASTAXANTINA: NATURALEZA QUÍMICA Y ESTRUCTURA La astaxantina, 3,3 '-dihidroxi-8-8-caroteno-4,4' –diona, es un carotenoide de la familia de las xantofilas formada por grupos hidroxilo y ceto en posiciones 3 y 4 de cada anillo terminal (Figura 1) que contribuyen a una mayor capacidad antioxidante y le confiere una naturaleza más polar respecto a otros carotenoides. Tiene un peso molecular de 596,8 Da y su fórmula es C40H52O4. Posee una cadena poliénica de once dobles enlaces conjugados, responsable del intenso color rojo brillante del cromóforo. Es uno de los principales pigmentos presentes en el medio acuático, contribuyendo a la coloración típica del caparazón de muchos crustáceos (camarón, quisquilla, gamba, Introducción 19 langosta, etc.), de la carne de salmónidos y de las plumas de algunas aves de estos ambientes (flamenco). Este pigmento tiene dos carbonos asimétricos (dos centros quirales) en la posición 3 y 3’, sobre los anillos bencénicos al final de la molécula. Cuando los grupos hidroxilo se unen sobre el plano de la molécula se dice que están en la configuración R y cuando los grupos hidroxilo se unen bajo el plano de la molécula se dice que están en la configuración S. Por tanto, presenta tres estereoisómeros dependiendo de la orientación espacial del grupo hidroxilo en el carbono quiral número 3: 3S, 3’S 3R, 3’S; y 3R, 3’R (Camacho Kurmen et al. 2013) (Figura 2). Además, los dobles enlaces de la parte lineal de la molécula dan lugar a los isómeros geométricos (cis, trans). La forma más estable, desde el punto de vista termodinámico, es la forma trans en todos sus carbonos, puesto que los grupos metilo de la parte lineal de la molécula no compiten por el espacio. De todos estos isómeros, el 3S, 3’S es el más abundante en la naturaleza, encontrándose en la microalga Haematococcus pluvialis o en el salmón salvaje (Higuera-Ciapara et al. 2006; Nguyen 2013). Figura 2. Esteroisómeros de la molécula de astaxantina. Cristina Hoys Hernández 20 Se considera uno de los antioxidantes más potente de la naturaleza ya que los electrones de la región descentralizada pueden ser donados para reducir moléculas oxidadas y convertirlas en productos más estables. En términos de capacidad antioxidante, la astaxantina es 65 veces más potente que la vitamina C, 54 veces más que el ß-caroteno y 100 veces más que el α-tocoferol (Cyanotech, 2015; Shah et al. 2016) La molécula de astaxantina puede presentarse libre (inestable y particularmente susceptible a la oxidación), conjugada con proteínas, como por ejemplo en el músculo del salmón o en el exoesqueleto de la langosta, o con los grupos hidroxilo de los anillos terminales esterificados con ácidos grasos, aumentando su hidrofobicidad y su actividad antioxidante. En la microalga Haematococcus pluvialis la forma esterificada monoéster es la predominante (Guerin et al. 2003; Hussein et al. 2006). APLICACIONES DE LA ASTAXANTINA La astaxantina comercial proviene tanto de fuentes naturales como sintéticas. La de síntesis química se genera a partir de derivados del petróleo, y es una mezcla 1:2:1 de isómeros (3S, 3´S), (3R, 3´S) y (3R, 3´R) respectivamente, en forma libre. La astaxantina natural tiene una orientación estereoquímica diferente formada sólo por el 3S, 3´S, produciendo una pigmentación más fuerte. Además, la de origen químico, al no estar esterificada con ácidos grasos, tiene menor capacidad antioxidante (Guerin et al. 2003; Higuera-Ciapara et al. 2006). Respecto a sus aplicaciones, la astaxantina se utiliza en la alimentación animal (en su forma sintética principalmente) y como producto nutracéutico (pigmento natural) con un mercado emergente en bebidas energéticas, como suplemento dietético (Capelli y Cysewski 2013; Shah et al.2016) y en acuicultura (Liu et al. 2014). Astaxantina en la alimentación animal: La coloración de salmónidos y crustáceos se percibe por los consumidores como indicativo de alta calidad y se debe principalmente a la presencia de astaxantina, que se acumula en la carne y la piel. Introducción 21 También es responsable del color anaranjado que poseen los peces ornamentales. La astaxantina no puede ser sintetizada por los animales, por lo que debe ser incluida en la dieta (Guerin et al. 2003; Lorenz R.T. y Cysewski 2000). Actualmente se incluye en piensos para la alimentación animal para incrementar la pigmentación de la yema de huevo en aves de corral, potenciar el valor nutritivo, mejorar los tejidos musculares, aumentar la fertilidad y disminuir la mortalidad (Breithaupt 2007; Lorenz R.T. y Cysewski 2000; Shah et al. 2016). En un medio acuático natural, las microalgas sintetizan astaxantina que llega a los peces a través de la cadena trófica (Domínguez et al. 2005). Sin embargo, en las piscifactorías, los peces y los crustáceos no tienen acceso a fuentes naturales de astaxantina, por lo que se incluye en el pienso, normalmente en su forma sintética (Higuera-Ciapara et al. 2006; Yuan et al. 2011), aunque se ha demostrado que se obtienen mejores rendimientos utilizando astaxantina natural. Astaxantina como producto nutracéutico: Un metabolismo normal aerobio genera moléculas oxidativas, como hidroxilos, peróxidos, y especies reactivas del oxígeno (singlete). Cantidades excesivas de estos compuestos pueden resultar peligrosas debido a su elevada reactividad con los componentes intracelulares, oxidando proteínas, lípidos, carbohidratos e incluso ADN, provocando daños que pueden derivar en diferentes enfermedades como degeneración macular, retinopatía, carcinogénesis, aterosclerosis y Alzheimer (Di Mascio et al. 1991; Higuera-Ciapara et al. 2006). En los últimos años, se ha incrementado el interés por el consumo de los llamados “alimentos funcionales”, productos naturales que además de su aporte nutritivo puedan reducir riesgos para la salud. La astaxantina de origen natural (obtenida a partir de microalgas o extractos de levadura) se comercializa bajo este concepto. Se le reconocen importantes cualidades: actividad anticancerígena, prevención de enfermedades cardiovasculares, estimulación del sistema inmune, fotoprotección frente a rayos UV, efectos antiinflamatorios, antimicrobiano (Helicobacter pylori), en la salud ocular (evitando la progresión de cataratas y degeneración macular), efecto protector en enfermedades crónicas como la diabetes Cristina Hoys Hernández 22 mellitus, enfermedades hepáticas y neurodegenerativas (Guerin et al. 2003; Higuera- Ciapara et al. 2006; Hussein et al. 2006; López-Roldán 2012; Shah et al. 2016). La astaxantina de origen natural está aprobada desde 1987 como colorante en los piensos por la Agencia de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration, FDA). También lo está como suplemento dietético destinado al consumo humano en los Estados Unidos, Canadá, Japón y varios países europeos (Cysewski and Lorenz 2004; Yuan et al. 2011). Sin embargo, hasta el momento, no hay aprobación de EFSA (European Food Safety Authority) para la aplicación terapéutica. La Agencia de Normas Alimentarias del Reino Unido (Food Standards Agency, FSA) ha concedido la denominación de “nuevo alimento” a extractos de Haematococcus pluvialis obtenidos mediante CO2 supercrítico como disolvente, mientras que la FDA ha catalogado a la astaxantina de Haematococcus pluvialis como una sustancia “generalmente reconocida como segura” lo que se conoce como estado “GRAS” (Generally Recognized As Safe) (Capelli y Cysewski 2013; Shah et al. 2016). En 2014, se comercializaron las primeras bebidas energéticas conteniendo astaxantina natural. PRODUCCIÓN DE ASTAXANTINA PRODUCCIÓN DE ASTAXANTINA SINTÉTICA Aproximadamente el 95% de la astaxantina que se comercializa es sintética. En 1979, la empresa Hoffman – La Roche (cuya división “Vitamins and Fine Chemicals” fue absorbida por DSM) registró la patente (US4245109). En 1990, comenzó la producción de astaxantina sintética a gran escala cubriendo prácticamente la totalidad del mercado. Actualmente, las empresas más importantes que producen y comercializan astaxantina sintética son DSM (DSM Carophyll ® Pink 10% CWS) y BASF (BASF Lucantin® Pink) (Nguyen 2013). Introducción 23 PRODUCCIÓN DE ASTAXANTINA NATURAL La producción de astaxantina natural se puede realizar a partir de desechos de caparazones de crustáceos (camarones, krill o cangrejo), de levaduras, bacterias o microalgas. Antes de que la astaxantina procedente de Haematococcus pluvialis estuviera disponible comercialmente, las fuentes naturales de astaxantina eran el aceite y harina de krill, aceite de cangrejo o la levadura Phaffia rhodozyma. Sin embargo, estas fuentes tienen bajas concentraciones de astaxantina que van desde 0,15 % en el krill hasta 0,40 % en la levadura. Como consecuencia, se requieren grandes cantidades de estos compuestos para una pigmentación eficiente. En el caso de las harinas procedentes del krill, se utilizan métodos de secado a altas temperaturas que podrían desnaturalizar los pigmentos. Además, en este proceso se generan productos que contienen un alto porcentaje de ceniza y quitina, lo que disminuye significativamente la digestibilidad de los peces y limita la utilización de este producto en la elaboración de piensos. La levadura Phaffia rhodozyma fue el primer organimo explotado para la obtención de astaxantina natural. La producción por la levadura Phaffia rhodozyma es interesante desde el punto de vista de la productividad, porque es un microorganismo de crecimiento rápido capaz de utilizar distintas fuentes de carbono y nitrógeno alcanzando altas densidades celulares (Nguyen 2013) aunque el contenido en astaxantina sea bajo (Higuera-Ciapara et al. 2006; Lorenz y Cysewski 2000) y se presente en la forma no esterificada (Capelli y Cysewski 2013). Además, produce el isómero (3R, 3'R) que es menos eficiente como antioxidante que el producido por Haematococcus pluvialis (3S, 3’S). Se han podido obtener mutantes de Phaffia rhodozyma en las enzimas de la ruta de biosíntesis de astaxantina que han mejorado los rendimientos, llegando a alcanzar valores del 1 % de la biomasa (Schmidt et al. 2011). Actualmente, la compañía Naturxan comercializa el producto Aquasta® con astaxantina procedente de la levadura para la fabricación de piensos destinados a la acuicultura. Cristina Hoys Hernández 24 La astaxantina procedente de microalgas, constituye una interesante alternativa: Chlorella zofingiensis y Chlorococcum sp. acumulan un 0,7 % de pigmento en la biomasa seca, Scenedesmus sp. un 0,3 % (Liu et al. 2014; Nguyen 2013), destacando Haematococcus pluvialis que puede llegar a acumular hasta un 3-4 % del pigmento en la biomasa seca en el morfotipo de quiste (Boussiba 1999; 2000). A pesar de este elevado contenido, debido a las dificultades para su cultivo, se obtienen redimientos similares a los mutantes de Phaffia rhodozyma mencionados anteriormente (Domínguez-Bocanegra et al. 2007). Actualmente existe un creciente mercado de la astaxantina natural a pesar de su alto costo de producción, debido a la mayor capacidad antioxidante y a los beneficios que confiere a la salud. En enero del 2014, gracias a la iniciativa de Fuji Chemical Industry Co Ltd., Algatechnologies Ltd. y Cyanotech Corporation, se creó la asociación “NAXA” (Natural Algae Astaxanthin Association), para potenciar el consumo de la astaxantina natural frente a la sintética (Food News Latam® www.foodnewslatam.com). Otra fuente de astaxantina natural es el aceite de krill, que combina sinérgicamente las propiedades antioxidantes de la astaxantina con los omega-3 del aceite del pescado. Se comercializa por distintas empresas y a precios muy económicos. A partir de bacterias, concretamente de la cepa Methylobacterium extorquens, se prepara un extracto recientemente comercializado por KnipBio (www.salmonexpert.cl), para la elaboración de piensos. MERCADO DE ASTAXANTINA En el año 2017 se estimó el valor comercial de los carotenoides en cerca de 1.500 millones de dólares, con la oportunidad de crecer hasta 2.000 millones de dólares en 2022, con una tasa de crecimiento anual del 5,7 % (The Global Market for Carotenoids, 2018; http://bccresearch.com) siendo el ß-caroteno el carotenoide con mayor importancia económica, seguido de la luteína y la astaxantina (Figura 3). Introducción 25 Concretamente, el mercado mundial de astaxantina factura anualmente más de 288,7 millones de dólares estimándose que puede llegar a alcanzar un valor de 426,9 millones de dólares para 2022 con una tasa de crecimiento anual del 8,1 %. Actualmente, el precio de la astaxantina sintética es de 2000 dólares kg-1, mientras que la de origen natural generada mediante la fermentación de levaduras tiene un precio de 2500 dólares kg-1 y la que se obtiene a partir de microalgas de 7000 dólares kg-1 (Industry Experts, 2015; Nguyen 2013). Figura 3. Evolución del mercado de carotenoides (millones de dólares) en el periodo 2010 – 2018. Fuente: BBC Research. LA MICROALGA Haematococcus pluvialis MORFOLOGÍA Haematococcus pluvialis es una microalga unicelular biflagelada de agua dulce que pertenece a la clase Clorofíceas, orden Volvocales, familia Haematococcaceae. Fue descrita por primera vez en 1844 por J. Von Flotow y más tarde en 1899, Tracy Elliot Hazen presentó un amplio estudio sobre su biología y ciclo de vida (Hazen 1899). Cristina Hoys Hernández 32 está apoyada además por el hecho de que, con la adición del inhibidor de la síntesis de ácidos grasos cerulenina, o del inhibidor de la síntesis de carotenoides norflurazon, tanto la biosíntesis de astaxantina como la de ácidos grasos se suprimen (Han et al 2013; Zhekisheva et al. 2002). CONDICIONES QUE PROMUEVEN LA ACUMULACIÓN DE ASTAXANTINA El crecimiento y la carotenogénesis de Haematococcus pluvialis está regulada por factores ambientales (Han et al. 2013). La privación de algunos nutrientes como el sulfato, fosfato o el nitrato, alta irradiancia y alta temperatura promueven la acumulación masiva de este pigmento acompañada de cambios morfológicos desde un estado vegetativo verde hasta un estado rojo de alta acumulación de astaxantina (Borowitzka et al. 1991; Boussiba et al. 1992; 1999; Solovchenko 2015). Del mismo modo, la adición de NaCl, sulfato de hierro y acetato sódico al medio de cultivo (Cordero et al. 1996) o la presencia de iones metálicos Fe2+, Mn2+ y Cd2+ (Han et al. 2013) favorecen la carotenogénesis. El acetato constituye una importante fuente de carbono para esta microalga, promoviendo su crecimiento y la acumulación de astaxantina, debido a que se genera una situación de moderada limitación nitrogenada al aumentar la relación C/N (Kakizono et al. 1992; Kobayashi et al. 1991). Esta forma de inducir la acumulación de astaxantina genera problemas de contaminación. Tradicionalmente, se ha descrito a la alta irradiancia como un factor principal que desencadena la acumulación de astaxantina en Haematococcus pluvialis (Boussiba et al. 1992; Boussiba y Vonshak 1991; Borowitzka et al 1991; Kobayashi et al. 1992; Lv et al. 2016; Wang et al. 2003). Sin embargo, no está establecido si es un efecto directo o indirecto, relacionado con la acción positiva de la luz sobre el crecimiento del cultivo y el consiguiente consumo de nutrientes críticos como el nitrato, que podrían favorecer la entrada en limitación nutricional potenciando la acumulación de astaxantina (Fábregas et al. 2003; Guerrero et al. 1981). Introducción 33 El efecto conjunto de la disponibilidad de luz y de nitrógeno sería el responsable de la inducción de la biosíntesis de astaxantina en cultivos continuos de Haematococcus pluvialis (Del Río 2007). La disponibilidad real de nitrógeno para la célula está determinada por la concentracion de nitrato en el medio, la biomasa del cultivo y la geometría del reactor, definiéndose el término suministro específico de nitrato (SEN) como parámetro que engloba las tres variables, que podría ser el factor primario que desencadenaría la acumulación de astaxantina y no sólo la alta irradiancia (Boussiba et al. 1992), de forma que, cuando el valor del SEN se redujese por debajo de un valor umbral, se produciría la acumulación de astaxantina, condición en la que el incremento de la irradiancia potenciaría la acumulación del pigmento (Del Río et al. 2008). PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ASTAXANTINA La astaxantina se está produciendo comercialmente a partir de cultivos de Haematococcus pluvialis sometidos a diferentes condiciones de estrés, como alta irradiancia, privación de nutrientes o elevada temperatura (Olaizola 2003). Pero el cultivo masivo de Haematococcus pluvialis presenta importantes limitaciones (Cysewski and Lorenz 2004), relacionados con su sensibilidad a daños hidrodinámicos y susceptibilidad a la contaminación, en particular por hongos quítridos (Paraphysoderma sedebokerensis) (Carney and Lane 2014; Gutman et al. 2009; Han et al. 2013). A escala industrial, Haematococcus pluvialis se está cultivando en sistemas de dos fases (Figura 8). En la primera etapa o “etapa verde” se promueve el crecimiento del organismo en condiciones controladas (habitualmente en sistemas cerrados) para obtener una elevada productividad en biomasa. En una segunda etapa o “etapa roja” (en sistemas abiertos) el cultivo generado en la primera etapa se somete a un estrés nutricional y/o ambiental (deficiencia de nitrato y fosfato, incremento de luz y temperatura, adición de NaCl...) que desencadena la producción de quistes que contienen hasta el 4 % de su peso seco en astaxantina (Figura 9). Cristina Hoys Hernández 34 Posteriormente, los quistes se rompen para poder extraer el pigmento. Los costes derivados del proceso de cultivo de la microalga así como la extracción de astaxantina de los quistes, hace que el producto en el mercado no sea económicamente competitivo respecto a la que se obtiene mediante otros procesos alternativos, como la de síntesis química (Guerin et al. 2003; Fábregas et al. 2001; Lorenz and Cysewski 2000), justificándose esta industria por las cualidades del producto obtenido a partir de Haematococcus pluvialis. Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de producción de astaxantina natural a partir de Haematococcus pluvialis. Fuente: Cyanotech (www.cyanotech.com/astaxanthin/astaxanthin-process/). Introducción 35 Figura 9. Cultivo masivo de Haematococcus pluvialis para producir astaxantina mediante el sistema en dos etapas en un estanque abierto. Fuente: Cyanotech (www.cyanotech.com/astaxanthin/astaxanthinprocess/). Se han propuesto otra estrategia para producir astaxantina de Haematococcus pluvialis (Del Río et al. 2005; 2007; García-Malea et al. 2008; 2009) utilizando cultivos continuos en una fase donde se promueve la acumulación del pigmento simultáneamente con el crecimiento de la microalga ajustando la disponibilidad de nitrógeno. Una de las ventajas de este procedimiento es que en estos cultivos la biomasa está compuesta mayoritariamente por células palmeloides en vez de quistes, facilitando el proceso de extracción del pigmento. Además no se necesitan dos reactores diferentes ni el trasvase de grandes volúmenes de cultivo entre ellos, lo que podría disminuir costos de producción. Esta aproximación se ha realizado A escala de laboratorio y en régimen de iluminación continua, obteniéndose productuvidades de astaxantina de 20,8 mg l−1 d−1 (Del Río et al. 2008). La viabilidad técnica del cultivo en una fase se ha verificado a pequeña escala en el exterior, utilizando reactores tubulares cerrados de 50 litros, alcanzándose productividades de astaxantina de 8 mg l- 1 d-1 (García-Malea et al. 2009), comparables a las descritas en el sistema de dos fases (10 mg l-1 d-1) (Aflalo et al. 2007). Actualmente, la producción industrial de astaxantina a partir de Haematococcus pluvialis es una realidad y existen diversas compañías que la Cristina Hoys Hernández 36 comercializan: Cyanotech Corporation, Fuji Chemicals y Mera Phamaceuticals cultivan Haematococcus pluvialis a la intemperie utilizando el sistema en dos fases. Cyanotech, la mayor productora, en sus instalaciones en Hawai, utiliza tanto fotobiorreactores cerrados de doble canal (llamados Phytodome, de 28.000 litros de capacidad) como estanques abiertos para producir biomasa verde, que luego se utiliza para inocular otros estanques abiertos en los que se induce la síntesis de astaxantina. Actualmente comercializa su producto BioAstin® (https://www.nutrex-hawaii.com/pages/bioastin). Mera Pharmaceuticals, también localizada en Hawaii, utiliza fotobiorreactores tubulares de tipo serpentín de 25.000 litros de capacidad para producir la biomasa verde y estanques abiertos para la inducción, generando su producto comercial llamado AstaFactor® (http://nelha.hawaii.gov/our-clients/mera-pharmaceuticals- inc/). Algatech, una de las principales compañías de biotecnología y líder mundial en el cultivo de microalgas y producción de astaxantina, emplea fotobiorreactores tubulares para las dos fases en sus instalaciones en el desierto de Negev (Israel). En mayo de 2017, se asoció con la empresa Lycored para distribuir su producto AstaPure® en forma de perlas (http://www.lycored.com/astaxanthin/). La compañía japonesa Fuji Chemicals con instalaciones en Suiza y en Hawaii, utiliza reactores en forma de cúpula llamados BioDomeTM de 140 litros de capacidad y transparentes para captar la luz solar. La biomasa verde producida en la primera fase se usa para inocular otros BioDomesTM donde se induce la carotenogénesis (Breithaupt 2007; Olaizola 2014). Esta empresa comercializa astaxantina natural con su producto AstaReal® en diferentes formatos: cápsulas de gelatina blanda con extracto de aceite para aplicaciones cosméticas, cápsulas con polvo de astaxantina como suplemento alimenticio en forma soluble para bebidas energéticas (http://www.astareal.com/). METABOLÓMICA La metabolómica es la técnica y estudio de los metabolitos o moléculas pequeñas que constituyen rutas bioquímicas. Permite establecer el perfil de los metabolitos de una muestra biológica. En la última década, se ha aplicado en diversos Introducción 37 estudios microbiológicos y se ha instaurado como una metodología clave para el análisis cualitativo y cuantitativo de metabolitos, debido a su extraordinaria sensibilidad, bajo consumo de muestras y alta selectividad constituyendo una herramienta valiosa para el análisis del metabolismo celular y de las respuestas a los factores ambientales (Su et al. 2014). Además, la metabolómica incluye en su objetivo el estudio de las variaciones dinámicas y las implicaciones bioquímicas de los metabolitos. Para el desarrollo de un estudio metabolómico es importante disponer de conjuntos de datos reproducibles, fiables y homogéneos. En este sentido, la aplicación del cultivo continuo a este tipo de estudios ofrece una buena alternativa a los sistemas en estanco, donde las diferencias metabólicas pueden quedar enmascaradas por cambios en el contenido y composición de la biomasa que acontecen al evolucionar el cultivo (Hoskisson and Hobbs 2005). El cultivo continuo permite a las células adaptar su velocidad de crecimiento a la velocidad de dilución impuesta, alcanzándose situaciones estabilizadas (estados estacionarios), en las que se mantienen constantes los parámetros de cultivo (incluida la disponibilidad de luz y nutrientes), así como la concentración y composición de la biomasa generada (Pirt 1980). Este régimen de operación permite estudiar la influencia de cada uno de los parámetros que afectan al cultivo de forma individualizada y analizar su influencia sobre el crecimiento o contenido en un compuesto de interés. Para el análisis simultáneo de multitud de metabolitos se aplican herramientas como la RMN y la MS, si bien la cromatografía de gases-masas (GS-MS) es el método más extendido. La combinación de altas resoluciones, sensibilidad y tiempos de análisis razonables de la cromatografía, junto con la capacidad de la espectrometría de masas de identificar de manera casi inequívoca cualquier sustancia pura, dan lugar a una combinación ideal para la determinación de metabolitos. Por ejemplo, esta técnica se ha utilizado en el estudio de los intermediarios del ciclo TCA en organismos modelo como Chlamydomonas reinhardti (Veyel et al. 2014) estableciendo la importancia de la toma de muestras y parada el metabolismo en el perfil metabólico obtenido, o en Arabidopsis, donde se ha aplicado al estudio de las Cristina Hoys Hernández 38 modificaciones en el perfil metabolómico como respuesta a la limitación de nitrato (Tschoep et al. 2009). En la actualidad, el enfoque metabolómico se está aplicando en microalgas para estudiar la respuesta a cambios en las condiciones ambientales, proporcionando una “instantánea” del estado metabólico de la microalga en una situación determinada. Por ejemplo, ha permitido estudiar los cambios de metabolitos de Chlamydomonas reinhardtii bajo privación de nutrientes en cultivos estancos (Lee et al. 2012; Wienkoop et al. 2010) y cultivos semicontinuos (Veyel et al. 2014; Willamme et al. 2015), o la caracterización metabolómica de dos Clorofíceas, Chlorella vulgaris y Scenedesmus obliquus, y dos cianobacterias, Aphanothece microscopica y Phormidium autumnale (Vendruscolo et al. 2018). En el caso de Haematococcus pluvialis, se ha aplicado al estudio del perfil metabolómico de cultivos en estanco, comparando células verdes con quistes (Recht et al. 2014). En condiciones de hambre de nitrógeno y alta luz, durante 48 horas, la microalga incrementaba la actividad del ciclo TCA aumentando los niveles de succinato, fumarato y malato, lo que podría estar relacionado con la biosíntesis de ácidos grasos, que ocurría simultáneamente con la síntesis de astaxantina. Este estudio ha permitido proponer un modelo integrador de la respuesta de Haematococcus pluvialis en estas condiciones de cultivo, relacionando la degradación de almidón con la síntesis de ácidos grasos en las últimas fases de la respuesta al estrés. Esta metodología también se ha aplicado para el estudio de la redistribución del carbono fijado por Haematococcus pluvialis destinado a la formación de distintos compuestos de reserva, en respuesta a cambios en las condiciones de cultivo generando una importante información de aplicación biotecnológica para la producción de metabolitos con interés comercial, como por ejemplo los carotenoides (Zhekisheva et al. 2002). La mayoría de los estudios metabolómicos con Haematococcus pluvialis en relación a la acumulación de astaxantina están realizados en régimen estanco y comparando quistes con células vegetativas (Lv et al. 2016; Recht et al. 2014; Su et al. Introducción 39 2014; Zhekisheva et al. 2002). En la operación en estanco, a medida que el cultivo evoluciona, se modifican parámetros clave como la disponibilidad de nutrientes o de luz, debido al propio crecimiento del cultivo que afectan a su perfil metabólico. Es decir, un cultivo estanco cambia con el tiempo, lo que repercute en cambios en la morfología celular, en la expresión de genes y en la acumulación o pérdida de metabolitos. Todas estas modificaciones dificultan relacionar un proceso concreto (como la biosíntesis de astaxantina) con cambios en algún metabolito específico. Por otro lado, al analizar el perfil metabólico en quistes, el número de metabolitos modificados es muy elevado porque múltiples procesos se ven alterados en este tipo de células. De ahí el interés de realizar el estudio de los metabolitos relacionados con la síntesis de astaxantina utilizando cultivos continuos y comparando células vegetativas sin acumulación de pigmento con células donde el proceso se esté iniciando, sin que hayan ocurrido cambios a nivel morfológico o fisiológico drásticos que dificulten su interpretación y que se mantengan estables durante el tiempo de experimentación, sin derivar en la formación de quistes. Cristina Hoys Hernández 40 OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo es conocer la situación bioquímica de células de Haematococcus pluvialis en las etapas iniciales de acumulación de astaxantina, para identificar los metabolitos que primariamente están afectados cuando se induce la síntesis del pigmento mediante una limitación moderada de nitrógeno. Para alcanzar este objetivo, es necesario disponer de cultivos morfológicamente homogéneos de células que acumulen astaxantina y crezcan activamente en cultivo continuo. Para su consecución se necesario abordan los siguientes objetivos específicos: • Obtener cultivos homogéneos y estables con distinto grado de acumulación de astaxantina. • Caracterizar metabólica y morfológicamente estos cultivos durante un ciclo solar simulado (en luz y en oscuridad). MATERIALES Y MÉTODOS Cristina Hoys Hernández 48 Figura 12. Esquema del reactor tipo columna de burbujeo. Los reactores y las sondas de pH se esterilizaron en autoclave, a 121ºC y 1 atmósfera durante 20 minutos. Para la operación en continuo se utilizaron bombas peristálticas (P-1 PHARMACIA) que permitían regular la entrada de medio fresco a distinta velocidad sólo durante el periodo de iluminación. Los reactores se iluminaron durante 12 horas con tubos fluorescentes de potencia regulable mediante reostatos, controlados por una aplicación informática desarrollada por el Dpto. de Ingeniería Química de la Universidad de Almería (DAQ Factory 5.0). Esta aplicación permitía modificar la irradiancia, simulando un ciclo circadiano, variando desde 0 hasta el nivel máximo establecido en cada experimento. Cada reactor se iluminaba con 6 tubos fluorescentes de luz blanca de 50 cm (Phillips Master TL5 HO 24 W/840 white-light lamp), que lo rodeaban completamente, agrupados de dos en dos, sobre tres paneles (Figura 13). Este sistema proporcionaba una iluminación con un valor máximo de 2500 µE m-2s-1. Materiales y Métodos 49 Figura 13. Vista frontal del sistema de iluminación (A y B) y vista superior (C) de la disposición de los fluorescentes sobre los paneles. Fuente: Del Río et al. 2017. Los reactores se inocularon en condiciones de esterilidad, en campana de flujo laminar, añadiendo 100 ml de inóculo, completando hasta 1,8 L con Medio Inorgánico estéril con la concentración de nitrato requerida en cada situación experimental. Se dejaron crecer en estanco durante 4-5 días, incrementando la irradiancia durante este tiempo de forma gradual hasta llegar al nivel seleccionado para cada experiencia. En ese momento se pasó a la operación en continuo. Las muestras se recogían cada 24 horas, en situaciones estabilizadas, denominadas “estados estacionarios dinámicos” (o de equilibrio fluido). Para la determinación de los distintos componentes celulares, se tomaron 2 muestras de días consecutivos y se analizaron por duplicado. MÉTODOS Y DETERMINACIONES ANALÍTICAS DETERMINACIÓN DE BIOMASA POR PESO SECO La valoración de la biomasa presente en el cultivo se realizó determinando peso seco. Se emplearon filtros de microfibra de vidrio Whatman GF/C de 1,2 µm de Ø de poro, secados previamente a 80°C durante al menos 24 h. Posteriormente, se pasaron a un desecador durante 60-120 minutos, para que adquiriesen la temperatura Cristina Hoys Hernández 50 ambiente, evitando la rehidratación, pesándose a continuación en una balanza de precisión. Se filtraron de 5 a 10 ml del cultivo (según su concentración) lavándose las células retenidas con un volumen igual de agua destilada. Los filtros conteniendo las células se secaron a 80°C durante 24 h, se pasaron por el desecador y se pesaron en una balanza de precisión. El peso seco se determinó por diferencia de pesada del filtro con y sin células y se refirió al volumen filtrado, en gramos de biomasa por litro de cultivo (Fontes et al. 1987). LIOFILIZACIÓN DE LA BIOMASA Para las determinaciones analíticas se utilizó biomasa liofilizada. Se recogieron las muestras siguiendo el método de parada del metabolismo celular “quenching” (Veyel et al. 2014). Para ello, se tomaron 100 ml de muestra, se centrifugaron rápidamente en frío (1 minuto, 3645 x g), y lavaron con el mismo volumen de agua destilada para eliminar las sales del medio. El sedimento resultante de la centrifugación se congeló en nitrógeno líquido y deshidrató mediante liofilización (Skadi-Europe® TFD 8503) durante al menos 2 días. Para su almacenamiento, las muestras se gasearon con corriente de nitrógeno, para prevenir la oxidación, y guardaron a -20º C. DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA 2.4.3.1 Determinación de carotenoides. La extracción de pigmentos y posterior saponificación se realizó según el método descrito por Del Campo et al. 2004. Todo el proceso se llevó a cabo en oscuridad para evitar la degradación de los pigmentos. Se partió de 4 mg de biomasa liofilizada sometida a rotura mecánica en MiniBead Beater (Biospec Products), con perlas de vidrio (2,7 mm Ø), utilizando Materiales y Métodos 51 acetona como solvente. Se realizaron los lavados necesarios hasta que el sobrenadante quedase sin color. Los sobrenadantes se unieron y se secaron con corriente de nitrógeno. Para cuantificar la astaxantina que se encontraba esterificada con ácidos grasos, se procedió a la hidrólisis de estos ésteres. Para ello, se resuspendió el extracto de carotenoides en 1 ml de éter, se añadió 1 ml de KOH al 2% en metanol y se dejó reposar 15 minutos a 0°C (en baño de hielo). Transcurrido este tiempo, se adicionaron 2 ml de una solución de NaCl al 10 % en agua, se agitó fuertemente y centrifugó (1 minuto, 3000 x g). Se retiró y guardó la capa superior (éter con pigmentos). Para asegurar la extracción total, a la fase acuosa restante se adicionó 1 ml de éter, se agitó fuertemente y se centrifugó, retirando la capa superior (éter con pigmentos) que se unió a la anterior. Se descartó la capa acuosa. La fracción de éter con pigmento se lavó tres veces para eliminar el KOH restante. Para ello, se le añadió 2 ml de NaCl al 10% en agua, agitando fuertemente, centrifugando y descartando la capa acuosa inferior. Se volvieron a añadir 2 ml de NaCl al 10% en agua, se agitó fuertemente y se centrifugó, descartando y guardando la capa superior (éter con pigmentos). Finalmente, se realizó un último lavado, añadiendo 1 ml de éter a la capa acuosa, agitando fuertemente y centrifugando, descartando la fase inferior acuosa y reuniendo todas las fracciones conteniendo éter con pigmentos, que se llevó a sequedad bajo nitrógeno. Para el análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución, se adicionó 1 ml de acetona, se agitó hasta resuspender completamente el secado, se centrifugó y recogió el sobrenadante. Alícuotas de 10 µl se inyectaron en HPLC (WatersTM LC Module I Plus), utilizando una columna “Nova-Pack” C-18 de fase reversa de 3,9 x 150 mm, con un tamaño de partícula de 4 µm y tamaño de poro de 60 Å, conteniendo dimetiloctadecilsilil unido a sílice amorfa. Como fase móvil se emplearon solvente A: metanol-agua-tampón (8:1:1, v/v); y solvente B: metanol-acetona (1:1, v/v). El tampón estaba formado por una solución de acetato de tetrabutilamonio (0,05 M) y acetato de amonio (1 M) en agua. Los pigmentos se eluyeron a un flujo de 1 ml min-1, utilizando el gradiente especificado en Cristina Hoys Hernández 52 Mínguez-Mosquera et al. 1992. El detector utilizado fue “Photodiode Array Waters 2996” que realizó un barrido de absorbancias entre 360 y 700 nm, seleccionando el cromatograma a una longitud de 440 nm. Para la cuantificación, se calibró el sistema con patrones de astaxantina, cantaxantina, ß-caroteno, -caroteno, luteína, violaxantina, zeaxantina y licopeno (DHI Water & Enviroment España). 2.4.3.2 Determinación de ácidos orgánicos mediante CG-MS. Los ácidos orgánicos se analizaron mediante cromatografía de gasesespectrometría de masas (CG-MS) (Veyel et al. 2014). Calibrado Se prepararon 11 patrones que contenían una mezcla de ácidos oxaloacético, pirúvico, succínico, fumárico, málico, α-cetoglutárico y cítrico (Sigma - Aldrich, St. Louis, USA) diluidos en piridina, a distintas concentraciones: 2, 8, 15, 25, 30, 40, 100, 200, 400, 600, 800 µM, usando ribitol (Sigma-Aldrich) 40 µM como patrón interno. Preparación de muestras Para la extracción de los ácidos orgánicos, 20 mg de biomasa liofilizada se sometieron a rotura mecánica en MiniBead Beater (Biospec Products), utilizando como solvente 3 ml de una mezcla de metanol:cloroformo:agua (MCW) en proporción 5:2:1 a la que se añadía 5 l de ribitol (4 mM preparado en metanol). Se realizaron los lavados necesarios hasta que el sobrenadante quedase sin color. Todos los sobrenadantes unidos se secaron bajo corriente de nitrógeno y guardados a -20ºC hasta su derivatización y posterior análisis (Figura 14). Materiales y Métodos 53 Figura 14. Esquema de la preparación de los extractos de Haematococcus pluvialis para el análisis de ácidos orgánicos mediante CG-MS. MCW: metanol-cloroformo-agua; MBB: Mini Bead Beater; SB: sobrenadante. Derivatización Los extractos se derivatizaron según la técnica de dos etapas (Roessner 2001) basada en una sililación de los compuestos con los agentes derivatizantes metoxamina (MTX) y N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA) (Sigma-Aldrich). Se resuspendió el extracto en 100 µl de piridina, se trató con 200 µl de MTX (20 mg/ml en piridina) incubando 90 minutos a 37º en agitación. Se añadió 200 µl del segundo agente derivatizante, MSTFA, y se incubó 30 minutos a 37º en agitación. El mismo protocolo se aplicó a cada una de las 11 mezclas de patrones que se habían preparado, tomando 100 µl de cada mezcla. El ribitol en este extracto derivatizado se encontraba a una concentración final de 40 µM. Se inyectó en el cromatógrafo 1 µl de cada muestra derivatizada. Biomasa liofilizada MCW (5:2:1) + Ribitol Perlitas de vidrio MBB Centrifugación en frío Lavados con MCW Recuperación SB y secado con corriente de N2 Derivatización Cristina Hoys Hernández 54 Cuantificación La detección de los compuestos se realizó mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas simple quadrupolo GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu, Kyoto, Japón), utilizando una columna capilar MetaX5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm; Teknokroma) acoplada a una pre-columna (Non Polar Guard Column 0,25 mm ID 1 x 10 m). Dependiendo de la concentración de los ácidos orgánicos, los análisis se llevaron a cabo en modo split 1:20 (1 de cada 20 partes de la muestra entraba en la columna) o en modo splitless (se inyectaba toda la muestra). Las condiciones establecidas para el análisis de las muestras fueron: temperatura del inyector, de la interfase y de la fuente de iones 300 °C, 250 °C y 200 °C, respectivamente y helio como gas portador (1,84 ml min-1). El programa de temperatura del inyector comenzaba a 80 °C subiendo 20 °C por minuto hasta alcanzar los 300 °C, manteniendo esta temperatura 2 minutos. La ionización de los compuestos se realizó por impacto electrónico con un voltaje de ionización de 70 eV, obteniendo un espectro de masas en el rango de 50–750 m/z para los ácidos oxaloacético, pirúvico, succínico, málico y cítrico (operando en modo full scan). Para la detección de los ácidos fumárico y α-cetoglutárico se operó en modo SIM y se seleccionó el ión 73 para ambos, monitorizándolos sólo en los intervalos de tiempo de retención correspondientes, 6,30 – 6,50 y 7,70 – 7,90 minutos, respectivamente. Para el ribitol, se seleccionó el ion 204 monitorizándolo en el intervalo de tiempo 8,58 – 8,80 minutos. El análisis cualitativo se realizó mediante el software CGMS Solution 2.30 Mass spectra comparando los tiempos de retención y los espectros de masas obtenidos con las librerías Wiley 229 y NIST11. El análisis cuantitativo (Ecuación 1) se realizó mediante las curvas de calibrado preparadas con los patrones, comparando las áreas de cada uno de los picos normalizadas frente al área del ribitol y refiriéndolo a la biomasa total analizada. Materiales y Métodos 55 Ecuación 1 𝐀𝐜. 𝐨𝐫𝐠á𝐧𝐢𝐜𝐨 (𝐧𝐚𝐧𝐨𝐦𝐨𝐥𝐞𝐬 · 𝐦𝐠−𝟏) = (á𝐜𝐢𝐝𝐨 𝐨𝐫𝐠á𝐧𝐢𝐜𝐨( µ𝐌 )· 𝐕𝐨𝐥 𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚 (µ𝐥) 𝐁𝐢𝐨𝐦𝐚𝐬𝐚 𝐥𝐢𝐨𝐟𝐢𝐥𝐢𝐳𝐚𝐝𝐚 (𝐦𝐠)·𝟏𝟎𝟎𝟎 2.4.3.3 Determinación de ácidos orgánicos mediante HPLC. Preparación de muestras La rotura mecánica de la muestra se realizó en MiniBead Beater, con 10 mg de biomasa liofilizada, perlas de vidrio (2,7 mm Ø) y ácido perclórico (0,4 M) en 5 pases de 1 minuto, alternando otro minuto en hielo para evitar el sobrecalentamiento de la muestra. Posteriormente se incubaron durante 1 hora a 4 °C. Se centrifugaron (1 minuto, 12100 x g) y se recuperó el sobrenadante. Tras realizar los lavados necesarios con ácido perclórico (0,4 M) hasta que el sobrenadante quedase sin color, el conjunto de todos los sobrenadantes se unieron y se contabilizó el volumen final obtenido. Detección Los ácidos orgánicos así extraídos se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, WatersTM LC Module I Plus con detector de fotodiodos Waters 2996) utilizando una columna de intercambio iónico (Aminex HPX-87H 300 mm x 7,8 mm y 9 µm de tamaño de partícula; Bio-Rad Laboratories, Inc.). El extracto en ácido perclórico se centrifugó (para eliminar restos celulares) y una alícuota de 20 µl del sobrenadante se inyectó en el cromatógrafo. Para la elución isocrática se utilizó H2SO4 (5 mM) a una velocidad constante de 0,6 ml/min y una temperatura de operación de 35 °C. La longitud de onda establecida en el fotodetector fue de 210 nm. El contenido en ácidos orgánicos (mM) se realizó mediante el software Millennium32 comparando con curvas de calibrado a partir de estándares comerciales Cristina Hoys Hernández 56 de los mismos ácidos orgánicos analizados por HPLC, tratados de la misma forma que las muestras. 2.4.3.4 Determinación de azúcares mediante CG-MS. El análisis del contenido en azúcares se realizó mediante cromatografía de gases-masas (CG-MS), siguiendo el método de Veyel et al. (2014). Las muestras se prepararon siguiendo el protocolo de extracción y derivatización utilizado para el análisis de ácidos orgánicos, utilizando una columna capilar VF – 1 ms (25 m; 0,20 mm; 0,33 µm; Agilent Technologies). Calibrado Se prepararon 8 patrones que contenían una mezcla de glucosa, fructosa, maltosa, trehalosa, galactosa, sacarosa, ribosa y ribulosa (Sigma – Aldrich; St. Louis, USA) en agua, a concentraciones de 5, 10, 20, 40, 80, 100, 300, 600 µM usando ribitol (Sigma-Aldrich) 40 µM, preparado en metanol, como patrón interno para cuantificar las posibles pérdidas durante el proceso. Los patrones así preparados se llevaron a sequedad con corriente de nitrógeno (Orata 2012b). Cuantificación Las condiciones para el análisis de las muestras fueron: temperatura del inyector 300 °C, comenzando a 105 °C, subiendo 8 °C por minuto hasta alcanzar 260 °C, y 20 °C por minuto hasta alcanzar 300 °C manteniéndose esta temperatura 15 minutos. La temperatura de la interfase y de la fuente de iones fue 280 °C y 200 °C respectivamente. Para la detección se trabajó en modo splitless/SIM, seleccionando el ión 73 en todos los casos, y adicionalmente un ion exclusivo de cada azúcar, para asegurar la Materiales y Métodos 57 identidad del mismo. Además del ión selectivo, se utilizó el tiempo de retención como criterio de identificación. Los iones selectivos se detallan en la Tabla 5. Tabla 5. Iones selectivos para operar en modo SIM. Compuesto Iones seleccionados Glucosa 319 Fructosa 103 Maltosa 204 Trehalosa 361 Ribitol 147 Sacarosa 361 Galactosa 319 Ribosa 103 Ribulosa 103 El análisis cualitativo se realizó con el software CGMS Solution 2.30 Mass spectra, comparando los tiempos de retención y los espectros de masas obtenidos con las librerías Wiley 229 y NIST11. El análisis cuantitativo se realizó mediante las curvas de calibrado preparadas con los patrones, comparando las áreas de cada uno de los picos normalizadas frente al área del ribitol y refiriéndolo a la biomasa total analizada (Ecuación 2). Ecuación 2 𝐀𝐳ú𝐜𝐚𝐫 (𝐧𝐚𝐧𝐨𝐦𝐨𝐥𝐞𝐬 · 𝐦𝐠−𝟏) = (𝐚𝐳ú𝐜𝐚𝐫( µ𝐌 )· 𝐕𝐨𝐥 𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚 (µ𝐥) 𝐁𝐢𝐨𝐦𝐚𝐬𝐚 𝐥𝐢𝐨𝐟𝐢𝐥𝐢𝐳𝐚𝐝𝐚 (𝐦𝐠)·𝟏𝟎𝟎𝟎 2.4.3.5 Determinación de ácidos grasos Para realizar esta determinación, fue necesaria la extracción previa de lípidos, su posterior metilación según el protocolo de Rodríguez-Ruiz et al. 1998 y análisis mediante cromatografía de gases. El contenido se calculó en referencia a un patrón Cristina Hoys Hernández 64 CÁLCULO DEL SUMINISTRO ESPECÍFICO DE NITRATO (SEN) El parámetro SEN, o “suministro específico de nitrato” indicaba el aporte de nitrato a la célula expresado como mmol NO3- g-1 de biomasa d-1. Se calculó según la Ecuación 8 (Del Río et al. 2005). Ecuación 8 𝐒𝐄𝐍 = 𝐍𝐎𝟑 − · 𝐃 𝐂𝐛 (NO3-=nitrato en medio de aporte (mM); D=velocidad de dilución (d-1); Cb=concentración de biomasa (g l-1)). TRATAMIENTO DE DATOS Los datos presentados correspondían a muestras tomadas en situaciones estabilizadas, siendo valores medios de 4 (cultivos control) o 16 determinaciones (cultivos en limitación) de cada estado estacionario. La estimación de la desviación se realizó mediante el error estándar. El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo mediante la prueba “t de Student” con un nivel de confianza del 95 % (p<0,05) utilizando Microsoft Excel 2010. RESULTADOS Resultados 67 GENERACIÓN DE CULTIVOS CON DISTINTO NIVEL DE ACUMULACIÓN DE ASTAXANTINA Para estudiar los cambios metabólicos que acontecen en la etapa inicial de acumulación de astaxantina, se compararon células en los primeros estadíos de acumulación de astaxantina (flageladas o palmeloides “rojizas”) con células que no acumularan el pigmento (flageladas o palmeloides verdes), descartando cultivos con quistes donde multitud de procesos estarían alterados, utilizando la limitación nitrogenada como herramienta para inducir la biosíntesis de astaxantina. Los cultivos se operaron en régimen continuo para mantener poblaciones estables asegurando la reproducibilidad de los datos. Las experiencias se desarrollaron bajo la influencia de un ciclo solar simulado, de manera que se trabajaba con estados estacionarios dinámicos, donde cada 24 horas se mantenían constantes las condiciones de disponibilidad de luz y nutrientes. Una vez alcanzado el estado estacionario, se tomaron muestras (al menos cuatro) durante una semana. En estudios anteriores con Haematococcus pluvialis operados en modo estanco (Del Río et al. 2005) se estableció el Medio Inorgánico como idóneo para el cultivo de esta microalga. Sin embargo, debido a su facilidad de preparación, se consideró interesante evaluar el medio Arnon (Arnon et al. 1974) en condiciones de cultivo continuo. Los resultados obtenidos (Figura 16) permitieron descartar el medio Arnon para la operación en continuo, debido a la formación de precipitados y al amarilleamiento del cultivo. Cristina Hoys Hernández 68 Figura 16. Cultivos de Haematococcus pluvialis crecidos en medio Arnon (izquierda) y Medio Inorgánico (derecha). Condiciones experimentales: velocidad de dilución 0,3 d-1, ciclo solar simulado I0 MAX 2500 µE m-2 s-1, nitrato en el medio de aporte 15 mM. Se seleccionó el Medio Inorgánico, pero al doble de concentración (x2) para que ningún nutriente resultase limitante cuando se utilizasen a velocidades de dilución bajas. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE DILUCIÓN Y CONCENTRACIÓN DE NITRATO EN EL MEDIO DE APORTE La acumulación de astaxantina en Haematococcus pluvialis está fuertemente influenciada por la disponibilidad de nitrato (Del Río et al. 2005). En un cultivo continuo, dicha disponibilidad depende del nitrato presente en el medio de aporte, de la velocidad a la que se suministra (velocidad de dilución) y de la biomasa del cultivo. Para establecer la combinación de velocidad de dilución y nitrato en el medio de aporte que permitiera disponer de dos cultivos morfológicamente homogéneos, uno de células verdes que no acumulasen astaxantina y otro de células rojizas que sí acumulasen el pigmento, se ensayaron velocidades de dilución de 0,3, 0,5, 0,7, 0,8 y 0,9 d-1 para concentraciones de nitrato en el medio de aporte de 1, 2, 3, 5 y 15 mM, analizando acumulación de astaxantina y morfología en cada estado estacionario, Resultados 69 completando su caracterización con crecimiento y composición elemental de la biomasa. Se establecieron como condiciones de cultivo: temperatura 25 °C, pH 7, irradiancia máxima durante el ciclo solar simulado de 2500 µE m-2s-1 y caudal de aire 16,7 l aire (l cultivo)-1 h-1. Las muestras se tomaron a las 6 horas desde el inicio del periodo de iluminación, cuando se alcanzaba la máxima irradiancia incidente. En general, el aumento en concentración de nitrato en el medio de aporte hasta 5 mM, suponía un incremento de la biomasa para todas las velocidades de dilución ensayadas. Para una concentración de nitrato determinada, la biomasa era mayor cuanto menor fuera la velocidad de dilución (Figura 17). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0,9 d-1 0,8 d-1 0,7 d-1 0,5 d-1 0,3 d-1 Biomasa (g l-1) Nitrato (mM) Figura 17. Influencia de la concentración de nitrato en el medio de aporte y velocidad de dilución sobre la biomasa de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo. Condiciones experimentales: temperatura 25 °C, pH 7, ciclo solar simulado I0 MAX 2500 µE m-2 s-1 y caudal de aire 16,7 l aire (l cultivo)-1 h-1. Muestras tomadas transcurridas 6 horas desde el inicio del periodo de iluminación. Se muestra el error estándar para n=4. Respecto a la acumulación de astaxantina, para todas las velocidades de dilución ensayadas, las concentraciones de nitrato de 15 y 5 mM se podían considerar Cristina Hoys Hernández 70 condiciones de suficiencia, ya que apenas se registraba acumulación (aproximadamente 0,016 % para todas las velocidades de dilución a 15 mM y 0,050 – 0,060 % para 5 mM). A partir de 3 mM se producía un notable incremento en la acumulación de astaxantina, salvo para la velocidad de dilución de 0,9 d-1. A concentraciones de nitrato inferiores a 3 mM, se registró acumulación para todas las velocidades de dilución ensayadas, aumentando el contenido en astaxantina a medida que disminuía la velocidad de dilución. La máxima acumulación del pigmento (0,734 % y 0,711 %) se obtuvo en cultivos a velocidad de dilución de 0,3 y 0,5 d-1 suplementados con nitrato 1 mM (Figura 18). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 0,9 d-1 0,8 d-1 0,7 d-1 0,5 d-1 0,3 d-1 Astaxantina (%) Nitrato (mM) Figura 18. Influencia de la concentración de nitrato en el medio de aporte y velocidad de dilución sobre el contenido de astaxantina de la biomasa de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo. Condiciones experimentales descritas en la Figura 17. Se muestra el error estándar para n=4. Teniendo en consideración estos resultados, se podría establecer la condición de 3 mM de nitrato como valor a partir del cual se desencadenaría situaciones de limitación de nitrógeno (manifestadas por la reducción de biomasa y aumento del contenido en astaxantina) para todas las velocidades de dilución ensayadas y a la Resultados 71 irradiancia establecida, excepto para el caso de la velocidad de 0,9 d-1 que ocurriría en la condición de nitrato de 2 mM. Las distintas combinaciones de velocidad de dilución, nitrato en el medio de aporte y concentración de biomasa en el cultivo, permiten definir la disponibilidad de nitrato para cada célula. Es lo que se denomina suministro específico de nitrato (SEN), que unifica en un solo valor las tres variables expresado en mmol NO3- g-1 d-1 (Del Río et al. 2005). La Figura 19 muestra la influencia del suministro específico de nitrato sobre la acumulación de astaxantina. Ésta se incrementaba a medida que el valor de SEN era menor, de manera que analizando el comportamiento global, se observaba acumulación para valores inferiores a 2 mmol g-1 d-1. Figura 19. Influencia del suministro específico de nitrato (SEN) sobre el contenido de astaxantina de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo. 0 5 10 15 20 25 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Astaxantina (%) SEN (mmol·g-1·d-1) Cristina Hoys Hernández 72 En la Tabla 6 se muestra el contenido en nitrógeno de la biomasa. Tabla 6. Contenido en nitrógeno de la biomasa (%) en función de la concentración de nitrato (mM) en el medio de aporte y velocidad de dilución impuesta (d-1) en cultivo continuo. Condiciones experimentales descritas en la Figura 17. D [NO3-] 0,9 0,8 0,7 0,5 0,3 15 mM 6,9 ± 0,2 8,0 ± 0,5 7,9 ± 0,1 7,7 ± 0,3 7,0 ± 0,2 5 mM 6,2 ± 0,4 6,7 ± 0,2 6,3 ± 0,8 6,1 ± 0,4 6,2 ± 0,6 3 mM 6,6 ± 0,0 N.D 4,8 ± 0,6 3,7 ± 0,1 3,4 ± 0,1 2 mM 6,1 ± 0,2 4,7 ± 0,2 4,6 ± 0,3 3,6 ± 0,1 2,2 ±0,1 1 mM 4,2 ± 0,1 3,0 ± 0,1 2,7 ± 0,1 2,8 ± 0,6 1,7 ± 0,1 *N.D: no determinado; En rojo se muestran las condiciones donde se observó acumulación de astaxantina según datos de la Figura 18. La acumulación de astaxantina se produjo, de manera general, para nivel celular de nitrógeno inferior a 5 % a excepción de la condición de 0.9 d-1 2 mM, que registró acumulación de astaxantina (0,2 %) con un contenido de nitrógeno en torno al 6 %. En la Figura 20 se relaciona el contenido intracelular de nitrógeno y la acumulación de astaxantina, observando que la acumulación de astaxantina incrementaba drásticamente cuando el contenido en nitrógeno de la biomasa era inferior al 5 %. Los valores máximos de astaxantina (0,6 – 0,7 %) se correspondían con contenido en nitrógeno del 2.8 %, velocidad de dilución de 0,5 d-1, 1 mM de nitrato en el medio y un SEN de 0,78 mmol NO3- g-1 d-1 y con la condición de velocidad de dilución de 0,3 d-1, contenido en nitrógeno en torno al 2 %, nitrato en el medio 2 y 1 mM y un SEN de 0,32 y 0,09 mmol NO3- g-1 d-1 respectivamente. Resultados 73 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Astaxantina (%) Nitrógeno (%) Figura 20. Correlación entre los contenidos en nitrógeno y astaxantina de la biomasa de Haematococcus pluvialis en cultivo continuo. El estudio se completó con la observación, mediante microscopía óptica, de los cultivos obtenidos en los experimentos anteriores para conocer la morfología que predominaba en cada una de las condiciones experimentales, y así definir la combinación de concentración de nitrato en el medio de aporte y velocidad de dilución que permitían obtener cultivos homogéneos de los dos tipos celulares (Figura 21). A concentraciones de 15 y 5 mM, los cultivos estaban formados por células verdes, flageladas o palmeloides, independientemente de la velocidad de dilución utilizada. A concentraciones de nitrato de 3 y 2 mM, se observaban células rojizas de todos los morfotipos, flageladas, palmeloides y quistes, compatible con la acumulación de astaxantina, siendo mayor la proporción de quistes al disminuir la velocidad de dilución. A 1 mM predominaban los quistes a todas las velocidades de dilución ensayadas. La acumulación de astaxantina se observaba cuando el nitrato en el medio de aporte era igual o inferior a 3 mM. Cristina Hoys Hernández 80 En la Figura 24 se muestra, como ejemplo, el cromatograma correspondiente a la mezcla de ácidos orgánicos a concentración de 200 µM operando en el modo de detección full scan. Figura 24. Perfil de la mezcla de estándares de ácidos orgánicos (200 µM). Patrón interno: ribitol (40 µM) *Oxima del ácido pirúvico. ** Oxima del G3P. ***Metil-oxima del G3P. Resto de picos no identificados correspondientes a residuos de la derivatización. La señal del detector (Intensity) dependía del grado de ionización de cada ácido de manera que, a igualdad de concentración, algunos ácidos podían no ser detectados si su ionización era baja. En el ejemplo presentado en la Figura 24, al ácido α-cetoglutárico 200 µm, le correspondía un pico pequeño, próximo al límite de detección. En los patrones de concentraciones inferiores a 200 µM, el α-cetoglutárico no se detectaba (Figura 25 A). El modo de detección full scan, por tanto, no permitía detectar compuestos presentes a una baja concentración en la muestra y/o que tuvieran un alto límite de detección (LOD). Como alternativa se utilizó el modo de detección SIM. Los criterios para elegir los iones que se monitorizaron en modo SIM fueron: los iones debían tener Resultados 81 la máxima abundancia relativa en cada compuesto, ser los más representativos en el patrón de ionización de ese compuesto y estar presentes a una abundancia relativa que no saturase. En caso de saturación, se elegiría el siguiente ión más representativo del compuesto y así sucesivamente. Siguiendo los criterios mencionados, para el caso del ácido α-cetoglutárico, se seleccionó el ión 73 (m/z) y se registró sólo en su intervalo de tiempo de retención correspondiente (RT, 7,70 - 7,90 min). Esto permitió aumentar hasta 50 veces la sensibilidad, detectando el ácido α-cetoglutárico a concentraciones tan bajas como 2 μM (Figura 25 B). Figura 25. A: GC–MS (full scan). Perfil de una mezcla de estándares de ácidos orgánicos (100 µM). B: GC–MS (SIM) cromatograma del ión 73 (m/z) monitorizado en el intervalo 7,70-7,90 min correspondiente al ácido α-cetoglutárico. Al aplicar la metodología habitual (Kombu et al. 2011), no se pudo diferenciar entre pirúvico y oxalacético. Cuando se sometieron a CG-MS, mezclas de oxalacético y pirúvico, a 200 y 400 M, ambos ácidos aparecieron con el mismo tiempo de retención, aunque la señal del oxalacético era el doble que la del pirúvico (Figura 26). B A Cristina Hoys Hernández 82 Es posible que la sililación, que tiene lugar durante el proceso de derivatización, se estuviera produciendo en los hidrógenos activos de los grupos carboxilos (dos en el caso del oxaloacético frente a uno en el caso del pirúvico) y que al romperse la molécula de oxaloacético se comportase como dos moléculas de pirúvico. A pesar de que se realizaron modificaciones en la temperatura del inyector y de la columna, no mejoró la separación de los picos. Figura 26. Captura de pantalla realizada en el CG-MS donde se muestra la superposición de los cuatro picos resultantes del análisis de ácido oxalacético/ácido pirúvico 200 - 400 µM. (Rosa: ácido oxalacético 400 µM; Marrón: ácido pirúvico 400 µM; Negro: ácido oxalacético 200 µM; Azul: ácido pirúvico 200 µM). El segundo pico mostrado a RT 3,87 minutos corresponde a un residuo de la derivatización. Eje de ordenadas, intensidad; Eje de abscisas, tiempo de retención. Resultados 83 La imposibilidad de separar ambos picos podría deberse a la descarboxilación en solución acuosa de oxaloacético en pirúvico y CO2, mediante una descomposición cetónica(Pedersen 1952) (Figura 27). Figura 27. Descomposición del OAA en ácido pirúvico. (1) Descarboxilación del OAA en CO2 y forma “enol” del ácido pirúvico. (2) Transformación de la forma enólica del ácido pirúvico en ácido pirúvico. Fuente: Pedersen 1952. La aplicación de otra técnica analítica, HPLC, tampoco permitió la separación de ambos ácidos. Cuando se analizaba un patrón de ácido oxalacético se observaban dos picos, uno coincidente con el tiempo de retención del pirúvico (RT 9,8 min) y otro anterior (RT 8,3 min) correspondiente al oxalacético (Figura 28 A). Sin embargo, el patrón de ácido pirúvico se detectaba como un único pico al tiempo de retención de 9,8 minutos (Figura 28 B), justificable por la descarboxilación espontánea del oxalacético en medio acuoso ya referida. Cristina Hoys Hernández 84 Figura 28. Perfiles de estándares de ácidos oxalacético (A) y pirúvico (B) (5 mM) monitorizada mediante HPLC. Por lo tanto, no fue posible separar y cuantificar ácido pirúvico de ácido oxalacético tratándolos en adelante de forma conjunta. Al aplicar la metodología optimizada de CG-MS a partir de los patrones a las muestras recogidas de cultivos continuos de Haematococcus pluvialis, se observaron problemas en la detección de algunos ácidos (fumarato y α-cetoglutarato) (Figura 29. A), bien por su límite de detección o bien porque estuvieran a baja concentración en la muestra, por lo que se analizaron en modo SIM (Figura 29. B y C) monitorizando sólo Resultados 85 los iones de interés y en los intervalos de tiempo de retención correspondiente a cada pico (Tabla 7). Tabla 7. Condiciones de detección en modo SIM para ácidos fumárico y α-cetoglutárico en muestras de Haematococcus pluvialis. Ácido orgánico Ión seleccionado Intervalo de RT (min) Fumárico 73 6,30 – 6,50 α-cetoglutárico 73 7,70 – 7,90 Figura 29. Perfiles de ácidos orgánicos de cultivos de Haematococcus pluvialis crecido a una velocidad de dilución de 0,8 d-1 en condiciones de suficiencia de nitrato (15 mM). A: GC–MS (full scan). B: GC–MS (SIM) cromatograma del ión 73 (m/z) del ácido fumárico. C: GC–MS (SIM) cromatograma del ión 73 (m/z) del ácido α-cetoglutárico. *Oxima del ácido pirúvico. Resto de picos no identificados corresponden a residuos de la derivatización. Cristina Hoys Hernández 86 Por tanto, la combinación de los dos métodos de detección permitió identificar los ácidos orgánicos del TCA aunque se encontrasen a baja concentración en la muestra, excepto la limitación comentada de separar los ácidos pirúvico y oxalacético. La cuantificación se realizó mediante comparación con rectas de calibrado para cada compuesto, tratadas de la misma forma que la muestra problema y con el método de detección adecuado (full scan o SIM), verificando previamente la existencia o no de interferencias con componentes celulares de los extractos de microalgas así como la eficiencia de la derivatización, mediante la adición de un patrón interno. Resultados 87 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y METABOLÓMICA DE CULTIVOS CON DISTINTO NIVEL DE ACUMULACIÓN DE ASTAXANTINA DURANTE EL CICLO SOLAR SIMULADO Se generaron cultivos verdes, en suficiencia de nitrato (15 mM NO3- y 0,8 d-1) sin astaxantina y cultivos rojizos, en limitación moderada (2 mM NO3- y 0,8 d-1) con acumulación del pigmento (0,23 % de la biomasa), analizándose el perfil y contenido de diversos metabolitos así como su morfología (Figura 30). Figura 30. Cultivo continuo de Haematococcus pluvialis sin acumulación de astaxantina (15 mM de nitrato) (A) y con acumulación de astaxantina (2 mM de nitrato) (B). Condiciones experimentales: velocidad de dilución 0,8 d-1, temperatura 25 °C, pH 7, ciclo solar simulado I0 MAX 2000 µE m-2 s-1 y caudal de aire 16,7 l aire (l cultivo)-1 h-1. Muestras tomadas transcurridas 6 horas desde el inicio del periodo de iluminación. MORFOLOGÍA Para analizar las diferencias morfológicas entre cultivos de Haematococcus pluvialis con y sin acumulación de astaxantina, se realizaron observaciones mediante microscopía óptica y electrónica. Los cultivos crecidos en suficiencia de nitrato estaban formados por células verdes, mayoritariamente palmeloides. Su tamaño oscilaba entre 10 y 15 µm en el caso de las flageladas y de 20 µm para las palmeloides (Figura 31. A). Los cultivos Cristina Hoys Hernández 88 crecidos en limitación de nitrato contenían células palmeloides que en el centro acumulaban astaxantina. Su tamaño medio era de 20 - 25 µm (Figura 31. B). Figura 31. Cultivos de Haematococcus pluvialis sin acumulación de astaxantina (15 mM de nitrato) (A) y con acumulación de astaxantina (2 mM de nitrato) (B). Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Figura 32) reflejaba cambios en la ultraestructura. En cultivos en suficiencia de nitrato (Figura 32 A), aparecían gotas redondeadas, electrodensas, de varios tamaños, correspondientes a vesículas lipídicas que aumentaban de tamaño al pasar a una situación de limitación nitrogenada (Figura 32 B). En esta situación, además se engrosaba la pared celular y se acumulaban gránulos de almidón distribuidos por toda la célula. Resultados 89 Figura 32. Ultraestructura de Haematococcus pluvialis sin acumulación de astaxantina (15 mM de nitrato) (A) y con acumulación de astaxantina (2 mM de nitrato) (B). N, núcleo; C, cloroplasto; P, pirenoide; PC, pared celular; GA, gránulo de almidón; VL, vesícula lipídica. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. En la Figura 33 se muestra una sección aumentada de ambas células observándose en detalle los gránulos de almidón y la estructura de las membranas fotosintéticas que en ambos casos permanecían ensambladas. Además, se observaba un engrosamiento de la pared celular con la consecuente desaparición de la envuelta cristalina tripartita y la disminución de la matriz extracelular en las células rojizas. Figura 33. Detalle de la ultraestructura de Haematococcus pluvialis sin acumulación de astaxantina (A) y con acumulación de astaxantina (B). C, cloroplasto; T, tilacoide; GA, gránulo de almidón; VL, vesícula lipídica; ECT, envuelta cristalina tripartita; PC, pared celular; ME, matriz extracelular. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Cristina Hoys Hernández 96 Figura 37. Análisis mediante citometría de flujo de la evolución de un cultivo de Haematococcus pluvialis con acumulación de astaxantina (2 mM de nitrato) a lo largo del ciclo solar simulado. FSC (eje X): Tamaño celular. Count (eje Y): número de eventos. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Resultados 97 Comparando esta distribución con la observación microscópica (Figura 38), el pico rojo podría relacionarse con células flageladas y palmeloides pequeñas, el pico verde a células palmeloides de tamaño medio y el pico azul con células grandes, (palmeloides en un grado avanzado de madurez o incluso sacos de células). Al comienzo del periodo de iluminación, la población estaba compuesta casi exclusivamente por sacos de células rojizas, posiblemente asociados a la aparición de la línea vertical azul, y algunas flageladas y palmeloides rojizas de pequeño tamaño libres que podrían corresponder con los picos rojo y verde respectivamente (Figura 38 A). Transcurridas 4 horas de iluminación, los sacos habían desaparecido y todas las células flageladas rojizas estaban libres (Figura 38 B) lo que se correspondía con la desaparición de la línea azul vertical y la aparición del pico rojo. A las 6 horas, la población era bastante heterogénea en cuanto a tamaño y siguió evolucionando hacia células palmeloides de mayor tamaño (Figura 38 C-F). Al finalizar el periodo de iluminación, había palmeloides de distintos tamaños, algunas hasta 40 µm. A medida que progresaba el periodo de oscuridad (a partir de 8 horas), estas células palmeloides de gran tamaño comenzaban a adoptar una forma ovoide de tamaño entre 45 – 50 µm (Figura 38 H-J) previa a la formación de sacos de células con al menos 12 células, constituyendo la población al final del periodo de oscuridad (línea vertical azul) (Figura 38 K y L). Cristina Hoys Hernández 98 Figura 38. Análisis mediante microscopía óptica de la evolución de la morfología celular de un cultivo Haematococcus pluvialis con acumulación de astaxantina (2 mM de nitrato) a lo largo del ciclo solar simulado. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Barra de tamaño 20 µm igual para todas las imágenes. Resultados 99 El porcentaje de células de cada tamaño en función del ciclo solar se representa en la Figura 39. Se contabilizaron 10.000 células (100 %) (eje Y). En cultivos en suficiencia de nitrato, la población era homogénea: las células de tamaño pequeño estaban presentes a lo largo del periodo de iluminación mientras que las de tamaño mediano se observaban en la oscuridad. Sin embargo, en cultivos en limitación de nitrato, se evidenciaba la presencia de tres poblaciones que cambiaban en porcentaje durante el ciclo solar. Las células de tamaño pequeño (marcadas en rojo) aumentaban su porcentaje, pasando de un 25% al inicio del periodo de iluminación, hasta alcanzar un 70 % transcurridas 4 horas. Esto podría corresponderse con la liberación de células del interior de los sacos. A partir de ese momento, la población estaba compuesta por células pequeñas y medianas en similar proporción, hasta el final del periodo de iluminación. Esto podría explicarse por el incremento de tamaño a medida que se registró acumulación de astaxantina. Las células pequeñas desaparecían en oscuridad con un incremento en el porcentaje de células de tamaño mediano (marcadas en verde), pasando de un 33 % a las 2 horas de oscuridad, hasta alcanzar un 85 % al final del periodo previo a la formación de sacos. La población de mayor tamaño (marcada en azul) estaba presente durante todo el ciclo y de forma más evidente al final de la oscuridad e inicio del periodo de iluminación (a las 2 horas). No se incluyeron en el análisis las células que estaban fuera de rango de detección (línea vertical azul de la Figura 37). Cristina Hoys Hernández 100 Figura 39. Distribución del tamaño (% FSC) de células de Haematococcus pluvialis sin acumulación (A) y con acumulación de astaxantina (B) en función del ciclo solar. Barra negra en el eje de abscisas indicativa del periodo de oscuridad. Pequeñas (<20 µm); Medianas (20 – 45 µm); Grandes (>45 µm). Resultados 101 METABOLÓMICA EN EL PERIODO DE ILUMINACIÓN Se determinaron el crecimiento y contenido en nitrógeno de la biomasa (ver Anexo Tabla A.3), además del contenido en carotenoides, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, azúcares y parámetros fotosintéticos. Las muestras se tomaron transcurridas 6 horas desde el comienzo del periodo de iluminación en cultivos que acumulaban astaxantina (2 mM de nitrato) y que no acumulaban (15 mM de nitrato). Los valores son promedio de cuatro experimentos diferentes, cada uno formado por 2 cultivos control (n=8) y 4 cultivos en limitación de nitrato (n=16). 3.3.2.1 Carotenoides El contenido en carotenoides de la biomasa obtenida de cultivos con distinto nivel de acumulación de astaxantina se muestra en la Tabla 8. En limitación nitrogenada (palmeloides rojizas), el contenido total de carotenoides aumentó en un 44 % (pasando de 0,25 % a 0,36 % en la biomasa) respecto al cultivo verde, debido al incremento en astaxantina, que se multiplicó x 15, y en menor medida a cantaxantina. Los demás pigmentos disminuyeron, especialmente β-caroteno y luteína. Cristina Hoys Hernández 102 Tabla 8. Contenido en carotenoides (expresado como % en la biomasa) y porcentaje de variación respecto a la condición de 15 mM de nitrato en cultivos continuos de Haematococcus pluvialis. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Se muestra el error estándar para n=8 en el caso de los cultivos en suficiencia (15 mM) y n=16 para los cultivos en limitación de nitrato (2 mM). Las diferencias son significativas para p<0,05. 15 mM 2mM (% biomasa) % variación Violaxantina 0,045 ± 0,004 0,027 ± 0,002 -40 Astaxantina 0,014 ± 0,002 0,208 ± 0,036 1385,7 Luteína 0,129 ± 0,008 0,071 ± 0,003 -45 Cantaxantina 0,001 ± 0,000 0,009 ± 0,002 800 α-caroteno 0,003 ± 0,000 N.D.* - β-caroteno 0,050 ± 0,004 0,022 ± 0,001 -56 *N.D: no detectado 3.3.2.2 Ácidos grasos En los cultivos sin acumulación de astaxantina el contenido en ácidos grasos era del 4,92 % de la biomasa; mientras que, en los que se estaba acumulando astaxantina era significativamente superior, constituyendo un 6,53 % de la biomasa. La Tabla 9 muestra el perfil de ácidos grasos como porcentaje del total. Existían diferencias significativas en ambos tipos celulares para el ácido palmitoleico (C16:1), oleico (C18:1), linoleico (C18:2) y linolénico (C18:3n4). El ácido palmitoleico bajaba casi un 50 % en células rojizas y el linolénico un 30 %. Sin embargo, el ácido oleico y y el linoleico experimentaron una subida del 38 % y del 28 %, respectivamente. El resto de ácidos grasos detectados no mostraron diferencias significativas entre los dos cultivos. Resultados 103 Tabla 9. Perfil de ácidos grasos (expresado como % del total de AG) y porcentaje de variación respecto a la condición de 15 mM de nitrato en cultivos continuos de Haematococcus pluvialis. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Se muestra el error estándar para n=8 en el caso de los cultivos en suficiencia (15 mM) y n=16 para los cultivos en limitación de nitrato (2 mM). Los ácidos grasos destacados en negrita mostraron diferencias significativas (p<0,05). 15 mM 2mM (% total AG) % variación Mirístico (C14:0) 0,08 ± 0,01 0,07 ± 0,01 - 12,5 Palmítico (C16:0) 17,52 ± 0,39 15,89 ± 1,27 - 9,3 Palmitoleico (C16:1) 2,25 ± 0,14 1,17 ± 0,04 - 48 Esteárico (C18:0) 5,49 ± 0,35 4,94 ± 0,32 - 10 Oleico (C18:1) 15,81 ± 0,36 21,89 ± 2,33 38,5 Linoleico (C18:2) 13,03 ± 0,44 16,66 ± 0,68 27,8 Linolénico (C18:3n4) 20,60 ± 0,55 14,47 ± 0,44 - 29,8 Araquidónico (C20:6n4) 1,53 ± 0,12 1,37 ± 0,15 -10,5 3.3.2.3 Aminoácidos libres En la Tabla 10 se muestra el contenido en aminoácidos para los dos tipos celulares estudiados. En ambos casos, el ácido glutámico era el aminoácido más abundante seguido de la alanina. Sólo se observaron diferencias significativas en el contenido en ácido glutámico y aspártico, asparragina, glutamina y alanina que eran menores en cultivos que acumulaban astaxantina. La histidina aparece al mismo tiempo de retención que el GABA. Se ha descrito (Recht et al. 2014) que en limitación nitrogenada el contenido en GABA se incrementaba respecto a la situación control. Por tanto, no es posible afirmar que el aumento en el pico correspondiente a histidina se deba a un aumento de este aminoácido, de GABA o a la suma de ambos. Cristina Hoys Hernández 104 Tabla 10. Contenido en aminoácidos libres (expresado como nanomoles/mg biomasa) y porcentaje de variación respecto a la condición de 15 mM de nitrato en cultivos continuos de Haematococcus pluvialis. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Se muestra el error estándar para n=8 en el caso de los cultivos en suficiencia (15 mM) y n=16 para los cultivos en limitación de nitrato (2 mM). Los aminoácidos destacados en negrita mostraron diferencias significativas (p<0,05). *Problema en la integración del pico de histidina por solapamiento con GABA. ** Problema en la integración del pico de treonina por solapamiento con residuos de la derivatización. 15 mM 2 mM (nanomoles/mg biomasa) % variación Ac. aspártico 2,24 ± 0,24 0,77 ± 0,17 -65,6 Ac. glutámico 12,11 ± 0,48 8,04 ± 0,54 -33,6 Serina 1,19 ± 0,15 1,34 ± 0,13 12,6 Asparagina 0,66 ± 0,07 0,46 ± 0,05 -30 Glicina 0,79 ± 0,13 0,62 ± 0,09 -21,5 Glutamina 1,44 ± 0,17 0,81 ± 0,16 -43,7 Histidina* 0,10 ± 0,05 0,40 ± 0,20 300 Treonina** 1,99 ± 0,56 1,59 ± 0,17 -20,1 Alanina 4,81 ± 0,97 2,30 ± 0,31 -52,2 Arginina 1,39 ± 0,23 1,76 ± 0,40 26,6 Prolina 0,71 ± 0,09 0,60 ± 0,08 -15,5 Tirosina 0,03 ± 0,02 0,09 ± 0,02 200 Valina 0,70 ± 0,22 0,59 ± 0,11 -15,7 Metionina 0,10 ± 0,03 0,11 ± 0,05 10 Cisteína 0,49 ± 0,15 0,35 ± 0,05 -28,5 Isoleucina 0,30 ± 0,11 0,21 ± 0,05 -30 Leucina 0,27 ± 0,07 0,21 ± 0,05 -22,2 Fenilalanina 0,13 ± 0,03 0,14 ± 0,03 7,7 Triptófano 0,36 ± 0,10 0,23 ± 0,05 -36 Lisina 0,38 ± 0,07 0,33 ± 0,05 - 13,2 Resultados 105 3.3.2.4 Ácidos orgánicos El contenido en intermediarios del Ciclo del Ácido Cítrico en cultivos con y sin acumulación de astaxantina se muestra en la Tabla 11. Tabla 11. Contenido en ácidos orgánicos (expresado como nanomoles por mg de biomasa) y porcentaje de variación respecto a la condición de 15 mM de nitrato en cultivos continuos de Haematococcus pluvialis. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Se muestra el error estándar para n=8 en el caso de los cultivos en suficiencia (15 mM) y n=16 para los cultivos en limitación de nitrato (2 mM). Las diferencias son significativas para p<0,05. 15 mM 2 mM (nanomol/mg biomasa) % variación Piruvato & Oxaloacetato 0,96 ± 0,10 0,55 ± 0,06 - 42,7 Succinato 1,53 ± 0,07 1,21 ± 0,07 - 20,9 Fumarato 0,62 ± 0,21 0,28 ± 0,05 - 54,8 Malato 5,78 ± 0,20 2,88 ± 0,11 - 50,1 α-cetoglutarato 0,45 ± 0,13 0,17 ± 0,03 - 62,2 Citrato 1,59 ± 0,10 1,98 ± 0,14 24,5 Las células rojizas tenían un menor contenido de ácidos orgánicos excepto citrato, que subía un 25 %. Los cambios más significativos afectaban al α-cetoglutarato, fumarato y malato que disminuían un 62, 55 y 50 % respectivamente en relación al control sin astaxantina. 3.3.2.5 Azúcares El análisis de azúcares (Tabla 12) evidenció un incremento en más de tres veces en el contenido en sacarosa y de 1,5 veces en el de glucosa y fructosa en células rojizas. El resto de azúcares no mostraban diferencias significativas entre los dos tipos celulares (p<0,05). Cristina Hoys Hernández 112 3.3.3.4 Ácidos orgánicos En oscuridad no se detectaron piruvato, oxalacetato, succinato y fumarato (Tabla 17). Sin embargo, el contenido en citrato y α-cetoglutarato en los cultivos con astaxantina era un 74 % y 18 % mayor respectivamente, mientras que el malato no cambiaba (Tabla 11). Tabla 17. Contenido en ácidos orgánicos (expresado como nmol por mg de biomasa) y porcentaje de variación respecto a la condición de 15 mM de nitrato en cultivos continuos de Haematococcus pluvialis. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Muestras tomadas transcurridas 6 horas desde el inicio del periodo de oscuridad. Se muestran valores de error estándar para n=4. Los ácidos orgánicos destacados en negrita mostraron diferencias significativas (p<0,05). 15 mM 2 mM (nanomol/mg biomasa) % variación Piruvato & Oxaloacetato N.D. N.D. -- Succinato N.D. N.D. -- Fumarato N.D. N.D. -- Malato 4,44 ± 0,37 3,97 ± 0,24 - 10,6 α-cetoglutarato 0,62 ± 0,02 0,73 ± 0,03 17,8 Citrato 1,73 ± 0,08 3,01 ± 0,50 74 N.D: no detectado 3.3.3.5 Azúcares El perfil de azúcares se muestra en la Tabla 18, con un menor contenido en fructosa y glucosa (3 y 2 veces respectivamente) y mayor en sacarosa (1,5 veces) en los cultivos que acumulaban astaxantina. Este comportamiento difería de lo observado durante el periodo de iluminación (Tabla 12). Resultados 113 Tabla 18. Contenido en azúcares (expresado como nmol/mg de biomasa) y porcentaje de variación respecto a la condición de 15 mM de nitrato en cultivos continuos de Haematococcus pluvialis. Condiciones experimentales descritas en la Figura 30. Muestras tomadas transcurridas 6 horas desde el inicio del periodo de oscuridad. Se muestran valores de error estándar para n=4. Los azúcares destacados en negrita mostraron diferencias significativas (p<0,05). 15 mM 2 mM (nanomol/mg biomasa) % variación Fructosa 0,98 ± 0,27 0,31 ± 0,09 - 68,3 Galactosa 2,58 ± 0,44 2,79 ± 0,30 8,1 Glucosa 0,91 ± 0,24 0,43 ± 0,06 - 52,7 Sacarosa 47,40 ± 5,21 71,19 ± 7,18 50,2 Trehalosa 0,15 ± 0,04 0,17 ± 0,03 13,3 DISCUSIÓN Discusión 117 La astaxantina es un pigmento ampliamente utilizado en acuicultura, en cosmética y en la industria alimentaria, con actividad antioxidante notablemente superior a la de otros carotenoides. El mercado mundial de astaxantina actualmente está dominado por la astaxantina sintética con precios de mercado de 2.000 dólares por kg (Nguyen 2013) y aplicación preferencial como pigmento acuícola. Se estima que en 2022 el mercado de la astaxantina superará los 426,9 millones de dólares (Industry Experts, 2015). La astaxantina sintética contiene una mezcla de isómeros 3S, 3'S; 3R, 3'S; y 3R, 3'R en proporción 1: 2: 1, a diferencia de la natural, donde predomina el isómero 3S, 3'S. Precisamente este isómero es el que confiere mayor grado de pigmentación (Han et al. 2013) y mayor capacidad antioxidante, de ahí su interés. Otra razón para utilizar astaxantina natural es la creciente preocupación por la seguridad alimentaria y sanitaria. En las últimas décadas, el mercado nutracéutico y de alimentos funcionales ha experimentado un acelerado crecimiento, lo que supone una excelente oportunidad para la astaxantina natural, en general y para la obtenida a partir de Haematococcus pluvialis, en particular. Esta microalga desarrolla quistes de resistencia en respuesta a condiciones de estrés, tales como alta irradiancia y ausencia de nitrógeno, que pueden acumular más del 4% de este pigmento en su biomasa (Boussiba and Vonshak 1991; Boussiba 2000; Margalith 1999; Tjahjono et al. 1994). La producción comercial de astaxantina por Haematococcus pluvialis se ha visto limitada por razones fisiológicas y técnicas: tasa de crecimiento lenta, susceptibilidad a la contaminación por otras microalgas, amebas, hongos y protozoos, altos costos derivados del empleo de complejas infraestructuras para los sistemas producción en dos fases aplicados a escala industrial, etc. A pesar de estas limitaciones, la producción de astaxantina a partir de Haematococcus pluvialis es una realidad, con elevado precio de mercado de 7.000 dólares por kg (Nguyen 2013) justificados por la demanda como potente agente antioxidante natural (Lorenz and Cysewski 2000; Guerin et al. 2003). Para disminuir estos costos es necesario, entre otros aspectos, optimizar la Cristina Hoys Hernández 118 producción, determinando los factores que favorecen la acumulación del pigmento. Existen multitud de estudios a este respecto, todos ellos realizado en sistemas de cultivo en estanco. La utilización del cultivo continuo como aproximación experimental supone una valiosa herramienta al permitir el estudio de cada factor de forma individualizada, eliminando o reduciendo las interferencias a la hora de interpretar los resultados que se producen en los sistemas en estanco. Este tipo de cultivos permite el mantenimiento de estados de equilibrio donde todas las variables están controladas y las características de la población permanecen constantes. Cuando la velocidad específica de crecimiento iguala a la velocidad de dilución, se genera un estado estacionario a un determinado valor de densidad celular, compensándose la generación de células por crecimiento con la dilución producida por el aporte de medio fresco (Fernandes et al. 2015; Pirt 1980). Los cultivos continuos son especialmente adecuados para los estudios metabolómicos que requieren un conjunto de datos reproducibles, fiables y biológicamente homogéneos (Hoskisson and Hobbs 2005). La aplicación de estos cultivos donde destaca la constancia de parámetros (incluida la disponibilidad nutrientes) que ocurre durante el estado estacionario, es muy productiva en este sentido y ofrece ventajas para la adquisición de estos datos, prevaleciendo sobre sistemas en batch donde las diferencias, podrían estar enmascaradas por la cantidad de variables que se encuentran afectadas en estas circunstancias. El cultivo continuo se ha aplicado con éxito a la producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis, utilizando la limitación moderada de nitrato como factor de estrés, ya que permite mantener poblaciones celulares en crecimiento activo a la vez que sintetizan astaxantina, alcanzándose elevadas productividades (20 mg l-1d-1) de este pigmento (Del Río et al. 2008). Esta metodología se ha probado a escala piloto (García-Malea et al. 2009). En estudios recientes con Haematococcus pluvialis se han analizado los metabolitos alterados durante la síntesis de astaxantina (Recht et al. 2014; Su et al. Discusión 119 2014; Wang et al. 2004). En todos los casos se opera en régimen estanco y bajo la influencia de fuertes condiciones de estrés, como limitación severa de nitrógeno y/o alta irradiancia que han sido ampliamente descritas como generadoras de quistes (Boussiba et al. 1999; Grünewald et al. 2000; Orosa et al. 2005; Zhekisheva et al. 2002). En estas condiciones, se producen importantes cambios en la microalga tanto estructurales como metabólicos que impiden determinar cuáles son los que están directamente relacionados con la biosíntesis de astaxantina. En este trabajo se han abordado estudios metabólicos pero utilizando cultivos continuos que permiten someter a las células a una limitación moderada de nitrógeno, mediante el balance adecuado entre velocidad de adición de medio y concentración de nitrato en este medio de aporte. De esta forma, se pueden obtener células palmeloides donde se está iniciando la biosíntesis de astaxantina y sin cambios drásticos en la morfología celular y en otros procesos metabólicos (sin la formación de quistes), disponiendo así de un modelo experimental idóneo para analizar los cambios en metabolitos que se producen en los estadios iniciales de la acumulación de astaxantina. Atendiendo a esta premisa, la primera parte de este trabajo ha consistido en definir la adecuada combinación de velocidad de dilución y contenido en nitrógeno en el medio de aporte que generen células palmeloides con ligera acumulación de astaxantina. El estudio conjunto de ambos factores refleja que la acumulación de astaxantina se empieza a registrar para concentraciones de nitrato iguales o inferiores a 3 mM, a todas las velocidades de dilución ensayadas pero especialmente a las más bajas, lo que implica un contenido de nitrógeno en la biomasa inferior al 5 %. El valor máximo de acumulación de pigmento (0,7 %) se obtiene para una concentración de nitrato de 1 mM y una velocidad de dilución de 0,3 d-1. Este valor es superior al referenciado por García Malea (2006) (0,51 %), e inferior al obtenido por Del Río (2007) (1,1 %), pero en este último trabajo, los cultivos estaban sometidos a luz continua, no a ciclo solar. Cristina Hoys Hernández 120 La disponibilidad real de nitrato no depende únicamente de su concentración en el medio de aporte y de la velocidad a la que se suministra, sino también de la biomasa del cultivo. Estas tres variables se resumen en el concepto “suministro específico de nitrato, SEN” (Del Río et al. 2005). Cualquier modificación en alguna de estas variables tendrá influencia sobre el suministro específico de nitrato y por tanto en la acumulación de astaxantina. En las condiciones de este estudio, valores de SEN inferiores a 2 mmoles NO3- por gramo de biomasa y día inducen la acumulación de astaxantina, de forma similar a lo descrito por Del Río (2007) y García Malea (2006) (por debajo de 2,7 y 3 mmoles NO3- g-1 d-1 respectivamente) alcanzándose valores máximos de acumulación de astaxantina (0,7 %) para SEN de 0,78 mmoles NO3- g-1 d-1. En definitiva, es necesario operar a un valor de velocidad de dilución relativamente elevado (0,7-0,9 d-1) a la vez que a una concentración de nitrato en el medio de aporte inferior a 3 mM para que se den las condiciones de SEN y % de nitrógeno en la biomasa que induzcan una ligera acumulación de astaxantina en células donde la síntesis de astaxantina se esté iniciando. Haematoccocus pluvialis cambia su morfología a lo largo del ciclo de vida (Gu et al. 2013b) y se ha descrito que la acumulación de astaxantina está ligada a estos cambios morfológicos (Boussiba 2000; Castro et al. 2016). Los distintos tipos celulares van desde células pequeñas flageladas, que en general no acumulan pigmento, a células palmeloides que han perdido los flagelos pero mantienen la capacidad de dividirse y que puede acumular o no el pigmento, hasta quistes grandes esféricos que no se dividen y con alto contenido en astaxantina. Los estudios de microscopía presentados, indican que los cultivos en suficiencia de nitrato (15 y 5 mM) están formados por células verdes, tanto flageladas como palmeloides. Las primeras prevalecen a velocidades de dilución altas (0,9 y 0,8 d-1), mientras que las segundas van apareciendo a medida que disminuye la velocidad de dilución (0,7, 0,5 y 0,3 d-1). Para la concentración de nitrato en el medio de 3 mM, se observa una mezcla de células flageladas y palmeloides tanto verdes como rojizas, siendo estas últimas mayoritarias a medida que disminuye la velocidad de dilución. Para las concentraciones de 2 y 1 mM, el cultivo está compuesto por palmeloides Discusión 121 rojizas y algunos quistes. Concretamente, la aparición de quistes se observa a velocidades de dilución bajas (0,5 y 0,3 d-1) para concentraciones de nitrato de 3 y 2 mM, y a 1 mM, a todas las velocidades de dilución ensayadas. Estas observaciones morfológicas coinciden con las de García-Malea (2006) quien describe que para velocidad de dilución de 0,9 d-1 y concentración de nitrato en el medio inferior a 2,5 mM, el cultivo está compuesto por células palmeloides rojizas. Considerando en conjunto los valores de contenido en astaxantina y las observaciones microscópicas, se puede concluir que la concentración de nitrato en el medio de aporte de 2 mM y velocidades de dilución de 0,7 y 0,8 d-1 generan cultivos compuestos por células palmeloides con acumulación de astaxantina. Aunque los valores constantes en el tiempo de concentración de biomasa indican que estos cultivos han alcanzado el estado estacionario, su color cambia (desde verde-marrón hasta marrón-rojizo) durante el tiempo de operación. La observación al microscopio revela que estos cambios están relacionados con la modificación del tamaño de las células palmeloides rojizas, lo que hace necesario refinar más las condiciones de cultivo para conseguir la homogeneidad en el tiempo de estos cultivos. La luz afecta a procesos tan importantes como la diferenciación celular y la carotenogénesis (Imamoglu 2007; Mauricio y Landínez 2013; Kobayashi et al. 1997). También se le ha atribuido un papel sincronizador de los cultivos, cuando se someten a ciclos de luz-oscuridad (Mocquet et al. 2010; Poliner et al. 2015). Esto justifica los ensayos a distintas irradiancias y regímenes de iluminación buscando esta homogeneidad. En este sentido, condiciones de ciclos luz-oscuridad (12:12) con una irradiancia constante en el periodo de iluminación de 1300 µE m-2s-1 (valor medio de la irradiancia recibida bajo condiciones de ciclo solar con irradiancia máxima de 2500 µE m-2s-1), no mejoran la homogeneidad del cultivo, observándose una mezcla de flageladas rojizas, palmeloides rojizas de distintos tamaños, bolsas de división celular y, en baja proporción quistes, descartándose por tanto este régimen de iluminación. Sin embargo, cuando se someten los cultivos a un ciclo solar simulado, con menor irradiancia máxima que la utilizada inicialmente (2000 µE m-2s-1) y velocidad de dilución Cristina Hoys Hernández 128 metabólicas estudiadas en este trabajo, los aminoácidos mayoritarios son glutámico, aspártico y alanina, aunque con diferencias entre células que acumulan astaxantina y las que no lo hacen, ya que en células rojizas hay un 34 % menos de glutámico y un 66 % y 52 % menos de aspártico y alanina respectivamente. En condiciones de limitación de nutrientes, los aminoácidos pueden utilizarse como fuente de energía ingresando alguno de ellos en el ciclo del ácido cítrico (TCA) a través de las reacciones anapleróticas (Nelson y Cox 2008). Esto podría justificar la disminución del contenido en aminoácidos libres en células rojizas respecto de las verdes. Otra posible explicación a este descenso sería su desaminación y acumulación en forma de GABA, descrita para cultivo de Haematococcus pluvialis en ausencia de nitrógeno y alta luz (Recht et al. 2014). En un trabajo reciente (Vendruscolo et al. 2018), se ha demostrado que la alanina es uno de los aminoácidos más abundantes en condiciones de crecimiento estándar en Haematococcus pluvialis y otras microalgas como Chlorella vulgaris y Scenedesmus obliquus, confirmando los resultados obtenidos en este trabajo, donde la alanina es el segundo aminoácido más abundante tanto en células verdes como rojizas. La señal para treonina puede considerarse un artefacto ya que aparece asociada a una señal no aminoacídica debida al proceso de derivatización (Derrien et al. 1998). De forma similar, la señal para histidina está solapada con la de GABA, por lo que no es posible discriminar si el aumento de este pico en situaciones de acumulación de astaxantina se debe a un mayor contenido en histidina o una subida en GABA que está favorecida en condiciones de estrés (Bouché y Fromm 2004; Recht et al. 2014). El ciclo del ácido cítrico (TCA) es la vía central del metabolismo celular. Es la puerta de entrada al metabolismo aeróbico de la mayoría de las biomoléculas para generar energía, así como fuente importante de precursores para la biosíntesis de macromoléculas. Se ha descrito que su actividad cambia en respuesta a las señales ambientales, tanto en plantas (Sweetlove et al. 2010), como en animales (Atherton et al. 2006). Un comportamiento similar se ha descrito en microalgas, con un incremento de la actividad del ciclo en respuesta a alta irradiancia y restricción de nutrientes (Kim et al. 2011). Discusión 129 Estudios previos en Haematococcus pluvialis y otras microalgas (Lee et al. 2012; Recht et al. 2014; Wienkoop et al. 2010; Xiong et al. 2010) han evidenciado dificultades para la identificación de ácidos orgánicos, derivadas de las bajas concentraciones en las que éstos se encontraban en las células de microalgas y/o los límites de detección de las técnicas utilizadas. Por ejemplo, algunos intermediarios del ciclo de TCA, como oxaloacetato y α-cetoglutarato, no pueden ser detectados en cultivos en hambre de nitrógeno de Haematococcus pluvialis (Recht et al. 2014). Estos problemas metodológicos también están descritos por Wang et al. (2008) para ácidos orgánicos con diferente grado de volatilidad (lo que afecta a su concentración) en plantas de tabaco. Para abordar el estudio de los intermediarios del ciclo TCA y realizar su cuantificación, en este trabajo se ha optimizado la metodología GC-MS descrita en la bibliografía, que también ha permitido a la determinación de azúcares. En un primer análisis del perfil metabólico de Haematococcus pluvialis en condiciones de suficiencia y limitación de nitrógeno, no se registra señal para fumarato y α-cetoglutarato, bien por baja concentración en la muestra y/o por encontrarse por debajo del límite de detección del método. En concreto, se han revisado los procedimientos de muestreo (con parada del metabolismo) y extracción de metabolitos, se ha analizado la interferencia de la matriz celular en la derivatización, se han normalizado los datos mediante un patrón interno, mejorando con ello la detección de todos los metabolitos de forma simultánea. La toma de muestras se ha realizado mediante la técnica de “quenching”, y debe ser lo más rápida posible para “detener” el metabolismo en el momento deseado, proporcionando una “instantánea” de la situación metabólica de la célula. De los distintos métodos ensayados (Bölling y Fiehn 2005; Veyel et al. 2014), la centrifugación en frío y posterior liofilización es el más idóneo para Haematococcus pluvialis. Respecto a la derivatización (Kombu, et al. 2011; Orata 2012; Roessner 2001; Ruiz-Matute et al. 2011;), se ha seleccionado el método en dos etapas (Roessner 2001), una de oximación y otra de sililación seguida de GC-MS en modo SCAN de adquisición de datos. Por otra parte, se ha verificado mediante la adición de un patrón Cristina Hoys Hernández 130 externo, que la recuperación del método es del 100 %, sin interferencia de la matriz celular durante la derivatización (Fernandez Segovia y Martínez García 2005). El protocolo optimizado permite detectar todas las sales de ácidos orgánicos presentes en la muestra con la excepción de oxaloacetato y piruvato, que comparten tiempo de retención y tienen patrones de fragmentación idénticos, detectándose como un único compuesto. Cambios en la temperatura del inyector o en la rampa de temperatura no mejoran la separación. El análisis mediante HPLC corrobora la descomposición espontánea del ácido oxaloacético en ácido pirúvico detectando dos picos distintos con patrones de ácido oxaloacético. La detección de un compuesto depende de la cantidad presente en la muestra biológica (influenciada por las condiciones de cultivo) y de la intensidad de la señal, que está relacionada a su vez, con su patrón de fragmentación. Así, por ejemplo, es posible la detección de α-cetoglutarato en muestras de Chlamydomonas (Veyel et al. 2014), mientras que en Haematococcus pluvialis, a veces sí se detecta (Su et al. 2014) y otras no (Recht et al. 2014). Los problemas de detección encontrados en este trabajo para α-cetoglutarato podrían estar relacionados con su baja concentración, menor a la del resto de los ácidos orgánicos, y a la baja señal que ofrece el detector cuando se opera en condiciones estándar (full scan, Split 1:20), que sólo permite detectar patrones de este compuesto cuando su concentración es superior a 200 µM. De forma similar, el fumarato no se puede detectar utilizando el modo estándar y los patrones sólo son visibles a partir de 100 M. Cuando un metabolito particular está presente a niveles muy bajos en la muestra y/o tiene un límite de detección alto, el modo de adquisición de exploración completa full scan aplicado comúnmente, no alcanza la resolución requerida, por lo que es necesario aplicar una metodología más sensible, el modo selected ion monitoring o modo SIM. Operar en modo SIM permite aumentar la relación señal/ruido y mejorar la detección de los compuestos enmascarados en la línea base del cromatograma, como el α-cetoglutarato y fumarato. Discusión 131 Mediante una combinación de modos de adquisición, exploración completa (full scan) y monitoreo selectivo de iones (SIM), se han podido cuantificar los niveles de succinato, fumarato, malato, α-cetoglutarato y citrato en los extractos de Haematococcus pluvialis independientemente de su concentración. De forma general, los intermediarios del TCA, además de la producción de energía, participan directa o indirectamente en rutas importantes para la formación de compuestos como lípidos, proteínas y pigmentos (Vendruscolo et al. 2018). Recht et al. (2014) han relacionado la carotenogénesis con el aumento de la actividad del TCA en cultivos de Haematococcus pluvialis. La acumulación de astaxantina en esta microalga también se ha asociado a un aumento de la expresión de genes relacionados con glucolisis, TCA y fosforilación oxidativa (Kim et al. 2011). Su et al. (2014) han identificado cambios en diversos metabolitos (D-ribosa 5 fosfato, glutamato y αcetoglutarato) acoplados a la acumulación de astaxantina en Haematococcus pluvialis en respuesta a estrés por alta luz, ion ferroso o acetato. Tanto en células verdes como en células rojizas, los ácidos orgánicos más abundantes son succinato, malato y citrato, de forma similar a lo descrito para Chlorella vulgaris y Scenedesmus obliquus (Vendruscolo et al. 2018). Los cultivos que están sintetizando astaxantina tienen menor contenido de malato, fumarato, succinato, piruvato, oxaloacetato y α-cetoglutarato y un 25 % más de citrato que los cultivos sin astaxantina. Este comportamiento es similar al publicado para Chlamydomonas reinhardtii en condiciones de hambre de nitrógeno (Bölling and Fiehn 2005) o para Arabidopsis como respuesta a la limitación de nitrato (Tschoep et al. 2009). Sin embargo, otros estudios en régimen estanco con Chlamydomonas reinhardtii en hambre de nitrógeno y luz continua, evidencian un incremento de los niveles de citrato, oxoglutarato, succinato y malato (Wase et al. 2014), o un aumento de los niveles de malato y succinato (Wienkoop et al. 2010). Por otro lado, en la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 se ha descrito una subida sustancial de los niveles de succinato, malato y fumarato sin cambios en los de citrato, en respuesta a la privación de nitrógeno (Osanai et al. 2014). Cristina Hoys Hernández 132 Recht y colaboradores (2014) en su estudio con cultivos de Haematococcus pluvialis sometidos a hambre de nitrógeno durante 48 horas, muestran un aumento gradual del contenido de piruvato, malato, fumarato y succinato a lo largo del tiempo de experimentación y una disminución de citrato, que se corresponde con un incremento de la actividad de las enzimas involucradas en estas reacciones, la fosfoenolpiruvato carboxilasa, enzima málica, malato deshidrogenasa, citrato sintasa y aconitasa. Los patrones de cambio tanto en la actividad enzimática como en la abundancia de metabolitos indican una mejora general del ciclo de TCA y de los procesos metabólicos estrechamente asociados con éste. La discrepancia con los resultados presentados en este trabajo puede estar relacionada con la diferente situación experimental: el trabajo de Recht et al. (2014) está realizado con cultivos en estanco y ausencia total de nitrógeno, comparando células vegetativas con quistes. El α-cetoglutarato es un metabolito clave implicado en la asimilación primaria de amonio que conecta el metabolismo del carbono y del nitrógeno. En este estudio se detecta una bajada sustancial de su contenido (del 62 %) en las células rojizas respecto a las verdes, relacionado con la bajada previamente comentada de glutámico en las células rojizas, ya que α-cetoglutarato es el sustrato para la formación de ácido glutámico, necesario para la síntesis del resto de aminoácidos y por tanto, de proteínas. El α-cetoglutarato es el metabolito directamente afectado por la limitación nitrogenada. En este estudio no se ha observado su acumulación en condiciones de acumulación de astaxantina sino de un metabolito anterior en la ruta, el citrato, posiblemente debido a una actuación de las enzimas isocitrato deshidrogenasa y aconitasa en sentido inverso. Sin embargo, en estudios preliminares desarrollados en nuestro grupo utilizando cultivo continuo, con limitación moderada de nitrógeno y luz continua (Del Río 2007) se observó un incremento de los niveles intracelulares de αcetoglutarato. Este resultado coincide con el de Su et al (2014), utilizando sales de hierro, acetato o una combinación de ambos bajo luz continua como factor de estrés para desencadenar la síntesis de astaxantina. La señal registrada como sumatorio de piruvato y oxaloacetato es menor en células rojizas que en la verdes posiblemente por su utilización en condiciones de Discusión 133 síntesis de astaxantina. Ambos compuestos son intermediarios en múltiples rutas metabólicas: TCA, gluconeogénesis, síntesis de aminoácidos y ácidos grasos o ciclo de la urea para el caso del oxaloactetato y TCA, síntesis de aminoácidos y ácidos grasos para el piruvato (Nelson y Cox 2008). Este piruvato está descrito como precursor del IPP en Chorella zofingiensis y en Haematoccocus pluvialis (Grünewald et al. 2001) y de la síntesis de ácidos grasos necesarios para la esterificación de la astaxantina (Recht et al. 2014). En situación de acumulación de astaxantina el malato experimenta una bajada del 50 %, que podría explicarse por la mayor actividad del TCA o por su descarboxilación oxidativa a piruvato mediante la enzima málica (Xue et al. 2016). Se ha sugerido que el malato desempeña un papel clave, pero de forma indirecta, en la biosíntesis de ácidos grasos bajo condiciones de estrés que favorecen la carotenogénesis (Recht et al. 2014), proponiendo un flujo significativo de malato desde la mitocondria al cloroplasto, donde se convierte en piruvato (Figura 43). Esta hipótesis se ha confirmado utilizando sésamol, un inhibidor de la enzima málica. Tras 24 horas de exposición a este compuesto, la síntesis de los ácidos grasos principales en Haematococcus pluvialis se ve inhibida, sugiriendo que la mayoría de los ácidos grasos proceden de esa vía (Recht et al. 2012). Además, en la descarboxilación del malato se genera NADPH necesario para la síntesis y desaturación de los ácidos grasos (Kendrick y Ratledge 1992). Figura 43: Mecanismo propuesto de la redistribución del carbono del TCA en la biosíntesis de ácidos grasos mediante la migración del malato desde la mitocondria al cloroplasto. (Fuente: modificada de Recht et al. 2014). Cristina Hoys Hernández 134 El Acetil CoA se une a oxalacetato para generar citrato en el primer paso del ciclo TCA. El citrato no utilizado en el TCA, se puede exportar al citoplasma (Figura 44). De esa forma se evita la acumulación de Acetil CoA en la mitocondria, donde podría actuar como inhibidor del TCA y de la biosíntesis de ácidos grasos (regulador negativo de la Acetil CoA carboxilasa). El citrato transportado al cloroplasto puede descomponerse en Acetil CoA y oxalacetato mediante la citrato liasa. Este Acetil CoA participaría en la síntesis de Malonil CoA (precursor de los ácidos grasos) que actuaría como modulador positivo de esta ruta. A su vez, el oxaloacetato, por acción de la malato deshidrogenasa formaría malato, que por la enzima málica sintetizaría piruvato. Además, el citrato citoplasmático activa la Acetil CoA carboxilasa que cataliza la reacción de síntesis de ácidos grasos a partir de Acetil CoA (Nelson y Cox 2008). Figura 44: Lanzadera de grupos acetilo en forma de citrato desde la mitocontria al citosol (Fuente: Nelson and Cox 2008). El citrato también se ha relacionado con activación de la ruta de síntesis de astaxantina. En Chlorella zofingiensis se ha demostrado que actúa como molécula Discusión 135 señal promoviendo la expresión de BKT (  -caroteno transcetolasa), implicada directamente en la síntesis de astaxantina (Li et al. 2008). Por otra parte, se ha observado en algunas microalgas, un incremento de los niveles de citrato en condiciones de hambre de nitrógeno, concretamente en diatomeas (Bromke et al. 2015) y en Chlamydomonas reinhardtii (Shtaida et al. 2015; Wase et al. 2014). La eliminación del nitrógeno del medio de cultivo repercute en un incremento de la síntesis de dos de las subunidades que componen el complejo enzimático de la piruvato deshidrogenasa, por lo que en estas condiciones nutricionales la conversión de piruvato hacia Acetil-CoA estaría favorecida. Los datos mostrados del estudio metabólico y enzimático en Chlamydomonas reinhardtii en hambre de nitrógeno indican que los niveles de citrato aumentan coordinadamente con un aumento de la expresión de las enzimas piruvato carboxilasa, citrato sintasa y ATP citrato liasa. A su vez, también se correlaciona con el aumento de lípidos durante transcurridas 144 h en ausencia de nitrógeno (Wase et al. 2014). Los resultados obtenidos en este trabajo sitúan al citrato como molécula relacionada con la activación de la ruta síntesis de astaxantina y ácidos grasos, que explicaría el aumento de sus niveles celulares (del 25 %) en situaciones de síntesis de astaxantina. Precisamente, estos ácidos orgánicos que están alterados en las células con acumulación de astaxantina (malato, citrato y piruvato), se han utilizado para el crecimiento heterotrófico de Chorella zofingiensis, observándose una produción incrementada de astaxantina (Chen et al. 2009). Además, se ha propuesto la adición de citrato (Lemoine y Schoefs 2010), y piruvato (Kobayashi et al. 1991) exógena al medio de cultivo de Haematococcus pluvialis para promover la acumulación de astaxantina. En este sentido se han realizado pruebas preliminares adicionando distintas concentraciones (5, 10, 50 y 100 mM) de citrato, α-cetoglutarato, piruvato y succinato sódico a cultivos de Haematococcus pluvialis en condiciones de suficiencia nitrogenada y observándose acumulación de astaxantina a las 48 horas a partir de la concentración Cristina Hoys Hernández 136 de 50 mM para el α-cetoglutarato sódico y el citrato sódico, y de 100 mM para el piruvato sódico y succinato sódico (datos no mostrados). En las células que acumulan astaxantina, se observa un incremento del contenido de todos los azúcares estudiados respecto al de células verdes, con excepción de la trehalosa. Este aumento es especialmente significativo para glucosa, fructosa, y sacarosa. Resultados similares se han obtenido en cultivos de Haematococcus pluvialis sometidos a alta luz para inducir la síntesis de astaxantina (Lv et al. 2016) registrándose un aumento de los niveles de fructosa, galactosa, glucosa, sacarosa y trehalosa en células palmeloides rojizas relacionando el contenido de sacarosa con un efecto protector en la célula. Recht y colaboradores (2014) describen un incremento considerable de los niveles de sacarosa, fructosa, glucosa y maltosa en Haematococcus pluvialis en ausencia de nitrógeno. En otras microalgas como Chlamydomonas reinhardtii, la limitación de nitrógeno también aumenta los niveles de glucosa y fructosa ya que el flujo de carbono en la célula está siendo dirigido hacia la síntesis de almidón, en el que la trehalosa juega un papel importante como regulador positivo (Valledor et al. 2014; Wienkoop et al. 2010). En trabajos recientes con la microalga Chlorella zofingiensis (Huang et al. 2016; Zhang et al. 2019), describen a la glucosa como metabolito involucrado en la síntesis de astaxantina, promoviendo la expresión de genes de la ruta biosintética (PSY, LCYb, CHYb y BKT) y potenciando además la síntesis de ácidos grasos. En la Figura 45 se recogen los cambios en metabolitos detectados en células con acumulación de astaxantina en respuesta a la limitación moderada de nitrógeno respecto a células sin acumulación. Discusión 137 Figura 45. Esquema del metabolismo central en Haematococcus pluvialis. En rojo se muestran los metabolitos que disminuyen sus niveles intracelulares, en azul los que aumentan y en verde los que no muestran diferencias significativas en situación de acumulación de astaxantina en relación a situaciones sin acumulación del pigmento. Los compuestos en negro no se han determinado. Conclusiones 145 A continuación se resumen las principales conclusiones obtenidas en este trabajo: 1. El sistema de cultivo continuo es adecuado para estudios metabólicos en Haematococcus pluvialis ya que permite mantener células en crecimiento activo pero con acumulación de astaxantina. Los factores que gobiernan el cultivo se mantienen constantes y por tanto aseguran la reproducibidad de los datos. 2. La optimización de la metodología de CG-MS para ácidos orgánicos y azúcares combinando los métodos de detección full scan y SIM, permite su determinación con un alto nivel de sensibilidad. 3. Las condiciones que permiten disponer de cultivos en estado estacionario formado por células palmeloides que acumulan astaxantina son: velocidad de dilución de 0,8 d-1, concentración de nitrato en el medio de aporte de 2 mM e irradiancia máxima de 2000 µE m-2s-1 durante el periodo de iluminación del ciclo solar simulado. 4. El estudio metabólico comparativo entre células que acumulan y que no acumulan astaxantina en respuesta a la limitación moderada de nitrógeno muestra que en condiciones de acumulación de astaxantina durante el periodo de iluminación se incrementa el contenido en cantaxantina, astaxantina, ácido linoleico y oleico, citrato, glucosa, fructosa y sacarosa, y disminuye el contenido en violaxantina, luteína, β-caroteno, ácido palmitoleico y linolénico, piruvato, oxaloacetato, succinato, malato, fumarato, α-cetoglutarato y trehalosa así como los aminoácidos asparagina, glutamina, alanina, ácido glutámico y aspártico. 5. Durante el periodo de oscuridad en condiciones de acumulación de astaxantina, se produce un incremento del contenido en cantaxantina, astaxantina, ácido palmítico, esteárico y oleico, α-cetoglutarato, citrato y sacarosa. En estas condiciones se produce una disminución del contenido en violaxantina, luteína, α y β- Cristina Hoys Hernández 146 caroteno, ácido mirístico, palmitoleico, linolénico y araquidónico, fructosa, glucosa, serina, glutamina, glicina y alanina. En conjunto, estas modificaciones estarían relacionadas con la acumulación del pigmento que requiere ácido oleico para su esterificación, azúcares como fuente de energía y/o poder reductor para la síntesis y citrato como precursor de Acetil CoA y molécula reguladora. 6. Las células rojizas tienen una tasa de transporte de electrones (ETR (II)) y un rendimiento del fotosistema II (PSII (Y (II)) menor que las células verdes, y una mayor disipación de energía no fotoquímica en forma de calor (NPQ). Sin embargo, la maquinaria fotosintética es activa, con FV/FM sólo ligeramente inferior al de células verdes. 7. Haematococcus pluvialis acumula almidón en condiciones de limitación moderada de nitrógeno, acompañado de un engrosamiento de la pared celular y aumento de tamaño de las vesículas lipídicas, posiblemente debido a la acumulación de astaxantina en esas estructuras. Asimismo, las membranas tilacoidales permanecen ensambladas y se disponen rodeando los gránulos de almidón. 8. La limitación moderada de nitrógeno ha permitido obtener células con ligera acumulación de astaxantina, sin cambios acusados en la envuelta celular ni en el aparato fotosintético pero con cambios importantes en el contenido de algunos metabolitos que prepararían a la célula para la síntesis del pigmento. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 149 Acién F.G., García, F., Sánchez, J.A., Fernández, J.M., Molina-Grima E., 1998. “Modelling of biomass productivity in tubular photobioreactors for microalgal cultures: effects of dilution rate, tube diameter and solar irradiance” Biotechnology & Bioengineering 58 (6): 605–616. Aflalo C., Meshulam Y., Zarka A., Boussiba S. 2007. “On the relative efficiency of two-vs one-stage production of astaxanthin by the green alga Haematococcus pluvialis” Biotechnology and Bioengineering 98: 300–305. Algatech: www.algatech.com American Type Culture Collection, (ATCC): www.atcc.org Arnon D.I., McSwain B.D., Tsujimoto H.Y., Wada K. 1974. “Photochemical activity and components of membrane preparations from blue-green algae. I. Coexistence of two photosystems in relation to chlorophyll a and removal of phycocyanin” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 357 (2): 231–45. Atherton H. J., Bailey N. J., Zhang W., Taylor J., Major H., Shockcor J., Clarke K., Griffin J. L. 2006. “A combined 1H-NMR spectroscopy- and mass spectrometry-based metabolomic study of the PPAR- Null mutant mouse defines profound systemic changes in metabolism linked to the metabolic syndrome” Physiological Genomics 27 (2): 178–86. Baker N. R., 2008. “Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo” Annual Review of Plant Biology 59 (1): 89–113. Betancort Rodríguez J.R., García Reina G., Santana Rodríguez J.J. 1997. “Determination of free amino acids in microalgae by high-performance liquid Cristina Hoys Hernández 150 chromatography using pre-column fluorescence derivatization” Biomedical Chromatography 11 (6): 335–36. Bölling C., Fiehn O. 2005. “Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation” Plant Physiology 139: 1995–2005. Borowitzka M.A., Huisman J.M., Osborn A. 1991. “Culture of the astaxanthinproducing green alga Haematococcus pluvialis. Effects of nutrients on growth and cell type” Journal of Applied Phycology 3 (4): 295–304. Boussiba S. 2000. “Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: cellular physiology and stress response” Physiologia Plantarum 108: 111–17. Boussiba S., Bing W., Yuan J.P., Zarka A., Chen F. 1999. “Changes in pigments profile in the green alga Haeamtococcus pluvialis exposed to environmental stresses” Biotechnology Letters 21: 601–4. Boussiba S., Fan L., Vonshak A. 1991. “Astaxanthin accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis” Plant and Cell Physiology 32 (7): 1077–82. Boussiba S., Fan L., Vonshak A. 1992. “Enhancement and determination of astaxanthin accumulation in green alga Haematococcus pluvialis” Methods in Enzymology 213: 386–91. Breithaupt D.E. 2007. “Modern application of xanthophylls in animal feeding - a review” Trends in Food Science and Technology 18 (10): 501–6. Bromke M.A., Sabir J.S., Alfassi F.A., Hajarah N.H., Kabli S.A., Al-Malki A.L., Ashworth M.P., Méret M., Jasen R.K., Willmitzer L. 2015. “Metabolomic profiling of 13 Bibliografía 151 diatom cultures and their adaptation to nitrate-limited growth conditions” PLoS ONE 10 (10): 1–17. Bubrick P. 1991. “Production of astaxanthin from Haematococcus” Bioresource Technology 38 (2–3): 237–39. Business Communications Company, Inc.: www.bccresearch.com Camacho Kurmen J.E., González G., Klotz B. 2013. “Producción de astaxantina en Haematococcus pluvialis bajo diferentes condiciones de estrés” Nova 11 (19): 91– 102. Capelli B., Cysewski G.R. 2013. "The world’s best kept health secret natural astaxanthin" Journal of Chemical Information and Modeling. Vol. 53: 132; 133-135. Carney L.T., Lane T.W. 2014. “Parasites in algae mass culture” Frontiers in Microbiology 5: 278. Córdoba-Castro N.M., Acero-Reyes N.L., Duque-Buitrago L.F., Jiménez-Aguilar L.J., Serna-Jiménez J.A. 2015. "Obtención y caracterización de astaxantina de la microalga Haematococcus pluvialis" UGCiencia 21: 73-82. Cerón M.C, García-Malea M.C, Rivas J., Acién F.G, Fernández J.M., Del Río E., Guerrero M.G., Molina E. 2007. “Antioxidant activity of Haematococcus pluvialis cells grown in continuous culture as a function of their carotenoid and fatty acid content.” Applied Microbiology and Biotechnology 74 (5): 1112–19. Chaumont D., Thépenier C. 1995. “Carotenoid content in growing cells of Haematococcus pluvialis during a sunlight cycle” Journal of Applied Phycology 7: 529– 37. Cristina Hoys Hernández 152 Chen, G. 2007. "Lipid and fatty acid composition and their biosyntheses in relation to carotenoid accumulation inthe microalgae Nitzschia laevis (Bacillariophyceae) and Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae)" Ph.D. dissertation, The University of Hong Kong, Hong Kong, 150 pp. Chen G., Wang B., Han D., Sommerfeld M., Lu Y., Chen F., Hu Q. 2015. “Molecular mechanisms of the coordination between astaxanthin and fatty acid biosynthesis in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae)” Plant Journal 81 (1): 95–107. Chen T., Dong W., Chen G., Wang Y., Chen F. 2009. “Employment og organic acids to enhance astaxanthin formation in heterotrophic Chlorella zofinfiensis" Journal of Food Processing and Preservation 33: 271–84. Chen Z., Guangce W., Jianfeng N. 2012. “Variation in Rubisco and other photosynthetic parameters in the life cycle of Haematococcus pluvialis” Chinese Journal of Oceanology and Limnology 30 (1): 136–45. Cordero B., Otero A., Patiño M., Arredondo B.O., Fábregas J. 1996. “Astaxanthin production from the green alga Haematococcus pluvialis with different stress conditions” Biotechnology Letters 18 (2): 213–18. Cysewski G.R., Todd Lorenz R. 2004. “Industrial production of microalgal cellmass and secondary products – species of high potential: Haematococcus” In Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology, 281–88. Danxiang H., Li Y., Hu Q. 2013. “Astaxanthin in microalgae: pathways, functions and biotechnological implications.” Algae 28 (2): 131–47. Bibliografía 153 Danxiang H., Wang J., Sommerfeld M., Hu Q. 2012. “Susceptibility and protective mechanisms of motile and non motile cells of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) to photooxidative stress.” Journal of Phycology 48 (3): 693–705. Del Campo J.A., Moreno J., Rodríguez H., Vargas M.A., Rivas J., Guerrero M.G. 2000. “Carotenoid content of Chlorophycean microalgae: factors determining lutein accumulation in Muriellopsis sp. (Chlorophyta)” Journal of Biotechnology 76 (1): 51–59. Del Campo J.A., Rodríguez H., Moreno J., Vargas M.A., Rivas J., Guerrero M.G. 2004. “Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta)” Applied Microbiology and Biotechnology 64 (6): 848–54. Del Campo J.A., García-González M., Guerrero M.G. 2007. “Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives” Appl. Microbiol. Biotechnol. 74: 1163-1174 Del Río E. 2007. "Producción de astaxantina por la microalga Haematococcus pluvialis en cultivo continuo. Tesis doctoral. Universidad de Sevilla. Del Río E., Acién F.G., García-Malea M.C., Rivas J., Molina-Grima E., Guerrero M.G. 2005. “Efficient one-step production of astaxanthin by the microalga Haematococcus pluvialis in continuous culture” Biotechnology and Bioengineering 91 (7): 808–15. Del Río E., Acién F.G., García-Malea M.C., Rivas J., Molina-Grima E., Guerrero M.G. 2008. “Efficiency assessment of the one-step production of astaxanthin by the microalga Haematococcus pluvialis” Biotechnology and Bioengineering 100 (2): 397– 402. Del Río E., García-Gómez E., Moreno J., Guerrero M.G, García-González M. 2017. “Microalgae for oil. Assessment of fatty acid productivity in continuous culture