Activación de Src quinasa: implicaciones predictivas y pronósticas en pacientes con cáncer de colon.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA ACTIVACIÓN DE SRC QUINASA: IMPLICACIONES PREDICTIVAS Y PRONÓSTICAS EN PACIENTES CON CÁNCER DE COLON MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Julia Martínez Pérez Directora: Rocío García Carbonero Sevilla 2018 2 3 AGRADECIMIENTOS 4 AGRADECIMIENTOS Esta tesis no hubiera sido posible sin la ayuda de muchas personas que me han acompañado y han hecho que este camino fuese más fácil. A todos ellos, mi más sincero agradecimiento. A la Dra. Rocío García Carbonero, directora de esta tesis, por su confianza infinita. Por creer en mí más que nadie, por su vocación médico-científica, inagotable capacidad de trabajo y dedicación que me demuestran que con constancia y organización todo es posible, por buscar las soluciones a mis problemas tanto dentro como fuera del hospital y por ser mi madre madrileña. Confío en que sigamos estando próximas en la distancia y este sea uno más de los muchos retos que nos quedan por compartir. Al Dr. Paz-Ares, jefe del Servicio de Oncología Médica del Hospital Virgen del Rocío durante la parte de mi residencia en la que inicié la tesis y jefe del Servicio de Oncología Médica del Hospital 12 de Octubre donde he tenido el placer de ejercer como adjunta, por su magnífico ejemplo profesional y liderazgo que suponen un gran estímulo para los que hemos podido trabajar a su lado. Al Dr. Salvador, jefe actual del Servicio de Oncología Médica del Hospital Virgen del Rocío, por permitirme volver a mi casa “profesional” y “personal” y por su apoyo en dicha andadura. Además quiero agradecer a todos los miembros del Servicio de Oncología Médica del Hospital Virgen del Rocío por su colaboración en el tratamiento y seguimiento de los pacientes incluidos en este estudio, y por enseñarme a ser mejor oncóloga cada día. Al Dr. Carnero, por guiarme en los primeros pasos del laboratorio y permitirme ser partícipe del apasionante mundo de Src, y al Dr. Iker López Calderero por su importante labor en la identificación de casos y elaboración de la base de datos clínica de parte de la cohorte incluida en este trabajo. A todos los miembros del Laboratorio de Oncología Traslacional y Nuevas Terapias del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) y del Instituto de Investigación i+12 del Hospital 12 de Octubre de Madrid, en especial a Carmen Sáez, Beatriz Soldevilla, Beatriz Gil y Daniel Rueda, por su inestimable contribución a este proyecto. A los responsables del Biobanco del H. Virgen del Rocío de Sevilla por su colaboración en la recopilación de muestras tumorales, y muy en especial a Carolina Castilla por su enorme dedicación y disponibilidad, su gran generosidad y su 5 excelente gestión del banco de tumores, herramienta indispensable para los que investigamos con muestras humanas. A todos los pacientes oncológicos y sus familias por enseñarme a diario una lección de vida. Por vosotros merece la pena seguir aprendiendo y trabajando todos los días con una sonrisa. A mi familia y amigos, pero en especial a mi madre, por ser mi apoyo incondicional y estar siempre disponible. Por escucharme y ayudarme en cada paso que doy, por inculcarme el valor de la honestidad, la responsabilidad y el trabajo bien hecho, y por animarme desde el primer minuto a conseguir este reto. Nunca podré agradecer lo suficiente todo ese amor. A Sito, por ser mi otra mitad. Por todo ese tiempo que nos he robado y por siempre apoyarme aunque suponga estar lejos de ti. Por intentar comprender Src aunque no te gusten los hospitales y por entender lo que supone mi trabajo dentro y fuera de él. No puedo soñar con mejor compañero de viaje, que dentro de poco será para toda la vida. A todos, ¡Gracias! 6 ABREVIATURAS 7 ABREVIATURAS 5-FU: 5-Fluorouracilo ADN: ácido desoxirribonucleico AJCC: American Joint Committee on Cancer ARNm: ARN mensajero C-terminal: carboxi-terminal CCR: cáncer colorrectal CCRm: cáncer colorrectal metastásico CEA: antígeno carcinoembrionario CIMP: fenotipo metilador de las islas CpG (del inglés “CpG island methylator phenotype”) CNA: alteraciones del número de copias (del inglés “copy number alterations”) CPNM: cáncer de pulmón no microcítico CPT11: irinotecán ECOG: Eastern Cooperative Oncology Group EE: enfermedad estable EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico (del inglés “epidermal growth factor receptor”) ESMO: Sociedad Europea de Oncología Médica (del inglés “European Society of Medical Oncology”) FAK: quinasas de adhesión focal (del inglés “focal adhesion kinases”) FOLFIRI: esquema de quimioterapia basado en irinotecán y 5- fluorouracilo FOLFOX: esquema de quimioterapia basado en oxaliplatino y 5- fluorouracilo FP: fluoropirimidinas G: grado histológico GPCRs: receptores acoplados a proteínas G (del inglés “G protein-coupled receptors”) HUVR: Hospital Universitario Virgen del Rocío IDEA: Evaluación Internacional de la Duración de la Quimioterapia adyuvante (del inglés “International Duration Evaluation of Adjuvant chemotherapy”) IGF2: factor de crecimiento insulínico tipo 2 (del inglés “insulin growth factor 2”) IHQ: inmunohistoquímica IL-8: interleuquina 8 LMC: leucemia mieloide crónica MAPK: protein-quinasas activadas por mitógenos (del inglés “ Mitogen-Activated Protein Kinases”) MMR: sistema de reparación de desapareamientos del ADN (del inglés “mismatch repair”) MSI: inestabilidad de microsatélites (del inglés “microsattelite instability”) 8 MSS: estabilidad de microsatélites (del inglés “microsattelite stability”) ND: no determinado PCR: reacción en cadena de la polimerasa (del inglés “polymerase chain reaction”) PDGFR: receptor del factor derivado de plaquetas (del inglés “platelet-derived growth factor receptor”) PDX: xenoinjertos derivados del paciente (del inglés “patient-derived xenografts”) PI3K: fosfatidilinositol 3 quinasa pSrc: Src fosforilado PTEN: fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa QT: quimioterapia RC: respuesta completa RM: resonancia magnética RP: respuesta parcial RTKs: receptores de membrana con actividad tirosin-quinasa (del inglés “tirosinquinase receptors”) SFK: familia de las Src quinasas (del inglés “ Src-family kinases”) SG: supervivencia global SLE: supervivencia libre de enfermedad SLP: supervivencia libre de progresión SLR: supervivencia libre de recaída STAT3: factor activador de la transcripción 3 (del inglés “signal transducer and activator of transcription 3”) TAC: tomografía axial computarizada TGFβ: factor de crecimiento transformante β (del inglés “trasnforming growth factor beta”) TMA: matrices de tejido (del inglés “ tissue microarrays”) TRO: tasa de respuesta objetiva VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular (del inglés “vascular endothelial growth factor”) VEGFR: receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (del inglés “VEGF receptor”) VS: versus XELOX: esquema de quimioterapia que combina Oxaliplatino y Capecitabina 9 16 INDICE 17 INDICE AGRADECIMIENTOS ................................................................................................. 4 ABREVIATURAS ......................................................................................................... 7 RESUMEN .................................................................................................................. 11 SUMMARY ................................................................................................................. 13 INDICE ........................................................................................................................ 17 INDICE DE TABLAS ................................................................................................. 19 INDICE DE FIGURAS................................................................................................ 20 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 23 1. Epidemiología del cáncer colorrectal y relevancia como problema de salud. .. 23 2. Bases biológicas del cáncer colorrectal. ........................................................... 24 2.1. Genómica y epigenómica del cáncer colorrectal ....................................... 24 2.2. Perfiles transcripcionales y clasificación molecular de consenso .............. 27 2.3. Proteogenómica del cáncer colorrectal ...................................................... 29 3. Presentación clínica y diagnóstico del cáncer colorrectal. ................................ 30 3.1. Presentación clínica ................................................................................... 30 3.2. Diagnóstico y estadificación ...................................................................... 31 4. Tratamiento del cáncer colorrectal localizado. ................................................. 33 4.1. Indicación de tratamiento adyuvante ......................................................... 33 4.2. Factores pronósticos y predictivos ............................................................. 35 5. Tratamiento del cáncer colorrectal metastásico. ............................................... 39 6. Proteína Src. ...................................................................................................... 43 6.1. Estructura, regulación y función ................................................................ 43 6.2. Activación de Src en cáncer: implicaciones predictivas y pronósticas ...... 45 6.3. Papel de Src en cáncer colorrectal ............................................................. 46 HIPÓTESIS.................................................................................................................. 51 OBJETIVOS ................................................................................................................ 54 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 57 1. Diseño del estudio. ............................................................................................ 57 2. Población de estudio y criterios de inclusión. ................................................... 57 3. Recogida de información clínica y consideraciones éticas. .............................. 58 4. Gestión de las muestras tumorales. ................................................................... 59 5. Estudio inmunohistoquímico de la expresión de pSrc. ..................................... 59 6. Extracción de ADN. .......................................................................................... 60 7. Análisis de inestabilidad de microsatélites. ...................................................... 61 8. Determinación del perfil mutacional RAS/BRAF. ........................................... 62 9. Análisis estadístico............................................................................................ 62 RESULTADOS............................................................................................................ 66 1. Cohorte 1: Pacientes con cáncer colorrectal estadío II-III. ............................... 66 1.1. Características clínicas de los pacientes .................................................... 66 1.2. Características histopatológicas y moleculares de los tumores ................. 68 1.3. Asociación entre la expresión de pSrc y las características clinicopatológicas ................................................................................................ 70 1.4. Supervivencia en función de las características clinicopatológicas ........... 72 1.5. Impacto de la expresión de pSrc en la supervivencia ................................ 74 18 1.6. Expresión de pSrc y sensibilidad a quimioterapia ..................................... 87 CONCLUSIONES ....................................................................................................... 91 ANEXO: PUBLICACIONES ...................................................................................... 94 BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................... 97 19 INDICE DE TABLAS  Tabla 1. Clasificación molecular de consenso del CCR.  Tabla 2. Estadificación del cáncer colorrectal TNM,AJCC/UICC, 8ª edición (2017).  Tabla 3. Representación esquemática de las estrategias de tratamiento en CCRm basada en la última guía de ESMO 2016.  Tabla 4. Representación esquemática de las estrategias de tratamiento en CCRm en primera línea teniendo en cuenta localización tumoral.  Tabla 5. Ensayos de citotoxicidad con oxaliplatino y PP2 (inhibidor de Src) en líneas celulares de CCR.  Tabla 6. Características clínicas de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Tabla 7. Características histopatológicas y moleculares de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Tabla 8. Características clínico-patológicas en función de la expresión tumoral de pSrc de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Tabla 9. Supervivencia libre de progresión y supervivencia global en función de las características clínico-patológicas de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Tabla 10. Análisis de supervivencia en función de la expresión tumoral de pSrc en la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Tabla 11. Análisis multivariante de factores pronósticos de SLE y SG en la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III. 20 INDICE DE FIGURAS  Figura 1. Vías moleculares implicadas en la carcinogénesis del CCR.  Figura 2. Clasificación molecular de consenso del CCR.  Figura 3. Representación esquemática de la estructura de Src.  Figura 4. Valores IC50 para oxaliplatino en líneas celulares de CCR.  Figura 5. Fotos ilustrativas de la expresión tumoral de pSrc valorada por IHQ.  Figura 6. Supervivencia libre de enfermedad en función de la expresión tumoral de pSrc agrupada (0-2 vs 3) en la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Figura 7. Supervivencia libre de enfermedad en función de la expresión tumoral de pSrc en la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Figura 8. Supervivencia global en función de la expresión tumoral de pSrc agrupada (0-2 vs 3) en la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Figura 9. Supervivencia global en función de la expresión tumoral de pSrc en la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III.  Figura 10. Impacto de la expresión de pSrc en la supervivencia libre de enfermedad en el subgrupo de pacientes con CCR estadío II.  Figura 11. Impacto de la expresión de pSrc en la supervivencia global en el subgrupo de pacientes con CCR estadío II.  Figura 12. Impacto de la expresión de pSrc en la supervivencia libre de enfermedad en función de la QT recibida. 21 22 INTRODUCCIÓN 23 INTRODUCCIÓN 1. Epidemiología del cáncer colorrectal y relevancia como problema de salud. El CCR constituye la tercera enfermedad neoplásica más frecuente a nivel mundial, con una incidencia global de 1,36 millones de casos nuevos diagnosticados en el año 2012 (Ferlay et al, 2012) y más de 135.000 casos nuevos estimados sólo en Estados Unidos en 2017 (Siegel et al, 2017). En cuanto a la distribución por sexos, el CCR es el segundo tumor más frecuente en las mujeres, por detrás del cáncer de mama, diagnosticándose 614.000 nuevos casos cada año, lo que supone un 9.2% del total de los cánceres diagnosticados mundialmente. En los hombres se diagnostican 746.000 casos nuevos anuales, representado la tercera neoplasia en frecuencia en los varones (10%), después del cáncer de pulmón y el de próstata. El CCR es la cuarta causa de mortalidad por cáncer en ambos sexos a nivel mundial, siendo responsable de 694.000 muertes anuales, lo que supone el 8.5 % del total de muertes por cáncer. Distinguiendo entre sexos, el 9% de las muertes por cáncer en las mujeres y el 8% en los varones se deben al cáncer de colon, suponiendo la tercera y cuarta enfermedad neoplásica más letal, respectivamente (Ferlay et al, 2012). Existe además una importante variabilidad geográfica, siendo su incidencia mayor en países desarrollados. No obstante, se ha observado una estabilización de la tasa de mortalidad por CCR en las últimas décadas en países desarrollados como consecuencia de la implantación de programas de cribado poblacional, y la optimización del diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. En España, el CCR es el tumor de mayor incidencia cuando se consideran ambos géneros de manera conjunta, con 32.240 nuevos casos diagnosticados en el año 2012, que comprenden el 15% del total de los tumores. Representa además la segunda causa de muerte por cáncer, con 14.700 defunciones anuales en 2012 (Ferlay et al, 2012). 24 2. Bases biológicas del cáncer colorrectal. 2.1. Genómica y epigenómica del cáncer colorrectal El CCR fue uno de los primeros tumores sólidos caracterizados molecularmente. En el modelo clásico de carcinogénesis colorrectal, descrito por primera vez por Vogelstein en 1990 (Fearon and Vogelstein, 1990), el epitelio colónico normal se va progresivamente trasformando a epitelio displásico, adenoma temprano, adenoma tardío y carcinoma invasor a través de la adquisición secuencial de una serie de alteraciones genéticas (pérdida de genes supresores de tumores, activación de oncogenes) en un proceso más o menos predecible que puede durar muchos años. En este modelo clásico el CCR se origina en un pólipo adenomatoso, y el adenoma tubular sería la lesión precursora. Este modelo permitió identificar los principales genes supresores de tumores (APC, p53, SMAD4,..) y oncogenes (RAS, BRAF, PIK3CA,..) implicados en el desarrollo del CCR. La acumulación de mutaciones en estos genes confiere una ventaja selectiva que da lugar a la iniciación y progresión del CCR a través de la desregulación de vías que modulan la diferenciación y proliferación celular, y la apoptosis. Aunque el orden en el que suceden estas mutaciones no es invariable, presentan una asociación importante con determinadas etapas de la tumorogénesis (p.ej. la inactivación de APC está implicada en la iniciación tumoral, la activación de RAS es también un evento temprano en la transformación maligna, mientras que la pérdida de 18q o la inactivación de p53 sucede en fases avanzadas de la progresión tumoral). Posteriormente se describieron 2 vías alternativas de desarrollo del CCR que se caracterizaban por distintas manifestaciones clínicas, patológicas y moleculares (Colussi et al, 2013), la vía supresora y la vía mutadora. La vía supresora o vía de inestabilidad cromosómica o CIN (del inglés “Chromosomal instability”), es responsable del 85% de los CCR esporádicos y se caracteriza por alteraciones del cariotipo con pérdidas, ganancias o translocaciones de regiones cromosómicas que albergan genes esenciales en el proceso de carcinogénesis del CCR; el factor presumiblemente iniciador de esta vía sería la pérdida del gen supresor de tumores APC; su lesión precursora es el pólipo adenomatoso convencional. La vía mutadora o de inestabilidad de microsatélites (MSI, del inglés “Microsatellite instability”), es responsable del 15% del CCR y del 95% del cáncer de colon familiar no polipósico. causada por un funcionamiento deficiente del sistema de reparación de los desapareamientos del ácido desoxirribonucleico (ADN) (MMR, del inglés “mismatch repair”) durante la replicación. Esta deficiencia puede deberse a la existencia de mutaciones inactivadoras de los genes que conforman el sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH3, MSH6 o PMS2), lo cual generalmente sucede en pacientes portadores de mutaciones germinales en estos genes (Síndrome de Lynch), o al silenciamiento 25 epigenético mediante hipermetilación de la región promotora del gen MLH1, que es lo que generalmente sucede en tumores esporádicos con MSI. Estos últimos suelen originarse en adenomas serrados, en mujeres de edad avanzada, presentan con frecuencia hipermetilación de otros genes (fenotipo metilador) y mutaciones en BRAF, y se asocian a ciertos rasgos fenotípicos característicos como son la localización en colon derecho, histología mucinosa o con células en anillo de sello, y la presencia de un infiltrado linfocitario peritumoral. Son fácilmente identificables por técnicas de IHQ por la pérdida de expresión de las proteínas del sistema MMR, o mediante PCR por las longitudes alteradas de secuencias cortas y repetitivas de nucleótidos (microsatélites) en el ADN tumoral. Tanto los tumores con MSI familiares como esporádicos son tumores con una alta tasa de mutaciones, y la inactivación de genes que contienen microsatélites en su secuencia codificante (p.ej. TGFβR2 o BAX) contribuye a la progresión tumoral. Más recientemente, en 2012, se publicó el TCGA (“The Cancer Genome Atlas”) del CCR (Cancer Genome Atlas Network, 2012), una caracterización molecular exhaustiva e integrada en el que se analizaron 276 muestras de CCR mediante secuenciación del exoma (y del genoma completo en 97 casos), análisis del número de copias de ADN y alteraciones cromosómicas, análisis de los perfiles de metilación y análisis de la expresión de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y microARN. Los análisis de secuenciación detectaron que el 16% de los casos eran tumores hipermutados (tasa de mutaciones >12 por 106 pares de bases) y un 84% correspondía a tumores no hipermutados. Entre los hipermutados, un 77% presentaban inestabilidad de microsatélites por hipermetilación y silenciamiento de MLH1 y un 23% presentaban mutaciones somáticas del sistema MMR o mutaciones de la ADN polimerasa ɛ (POLE). Se identificaron 32 genes mutados recurrentemente en ambos grupos: 15 en tumores hipermutados (entre los que destaca TGFβR2 en el 51%, BRAF en el 46%, y MSH3 y MSH6 en el 40% de los casos, presentando mutaciones en APC sólo el 51%) y 17 en tumores no hipermutados (destacando mutaciones en APC en el 81%, TP53 en el 60% y KRAS en el 43% de los casos). Estas diferencias demuestran que los tumores hipermutados y no hipermutados progresan mediante diferentes secuencias de eventos genéticos. Evaluando el patrón de metilación, los tumores se clasificaron en 4 subgrupos: 2 de ellos con alta tasa de metilación de islas CpG (CIMP; del inglés “CpG island methylator phenotype”) que se subdivían a su vez en CIMP alto y bajo y que se presentaban de forma más frecuente en colon derecho; y otros 2 subgrupos con baja tasa de metilación que se correspondían fundamentalmente a tumores no hipermutados de diferentes localizaciones anatómicas. Según el perfil de expresión de ARNm se distinguían 3 subgrupos: 1 que correspondía a tumores con alta tasa de metilación e hipermutados, y otros dos que no se correspondían con ningún subgrupo de metilación. El análisis integrado de la información clínica y molecular mostró que los tumores hipermutados son tumores generalmente diploides que se localizan con más frecuencia en colon derecho, presentan mayores tasas de MSI, hipermetilación y mutaciones de BRAF (V600E), mientras que los tumores no hipermutados originados en distintas 32 Tabla 2. Estadificación del cáncer colorrectal TNM,AJCC/UICC, 8ª edición (2017). Tumor primario (T) Tx Tumor primario no puede ser evaluado T0 No hay evidencia de tumor primario Tis Carcinoma in situ: intraepitelial o invasión de la lámina propia T1 Tumor invade la submucosa T2 Tumor invade la muscular propia T3 Tumor invade a través de la muscular propia en los tejidos pericolorrectales T4a T4b Tumor penetra en la superficie del peritoneo visceral Tumor invade directamente o está adherido a otros órganos o estructuras Ganglios linfáticos regionales (N) Nx Los ganglios linfáticos regionales no pueden ser evaluados N0 No hay metástasis en los ganglios linfáticos regionales N1 N1a N1b N1c Existen metástasis en 1- 3 ganglios linfáticos regionales -Metástasis en un ganglio linfático regional -Metástasis en 2 o 3 ganglios linfáticos regionales -Depósitos de tumor satélites en la subserosa o en tejidos no peritonealizados N2 N2a N2b Metástasis en > 4 ganglios linfáticos regionales -Metástasis en 4-6 ganglios linfáticos regionales -Metástasis en > 7 ganglios linfáticos regionales Metástasis a distancia (M) M0 No existen metástasis a distancia M1 M1a M1b M1c Metástasis a distancia -Metástasis confinadas en un órgano -Metástasis en más de un órgano -Metástasis en el peritoneo con o sin metástasis en otras localizaciones 33 4. Tratamiento del cáncer colorrectal localizado. Aproximadamente dos tercios de los pacientes se diagnostican en estadíos precoces de la enfermedad (estadío I-III), potencialmente curables mediante resección quirúrgica, que constituye el tratamiento fundamental, seguido o no de QT adyuvante en función del riesgo de recaída. Globalmente se ha demostrado que los pacientes con estadío III y algunos subgrupos de pacientes con estadío II de CCR se benefician de un tratamiento adyuvante tras la cirugía. 4.1. Indicación de tratamiento adyuvante La QT adyuvante basada en 5-fluorouracilo (5-FU) en pacientes con CCR estadío III se estableció en los años ’90 como estándar de tratamiento tras demostrarse un beneficio en supervivencia en comparación con cirugía sola (Moertel et al, 1990; Haller et al, 2005). Un meta-análisis de 18 ensayos clínicos randomizados que incluyeron 20.800 pacientes con cáncer de colon estadío II-III, que fueron aleatorizados a recibir quimioterapia adyuvante basada en 5-FU frente a observación tras la cirugía, demostró un beneficio absoluto en SG del 5% para pacientes con estadío II y de un 10% para pacientes en estadío III (Sargent et al, 2009). Posteriormente, tres estudios randomizados (Andre et al, 2004; Kuebler et al, 2007; Haller et al, 2011) demostraron que añadir oxaliplatino a distintos esquemas de fluoropirimidinas aumentaba significativamente la SLE y la SG de los pacientes con cáncer de colon estadío III, constituyéndose por ello esta combinación en el esquema estándar de tratamiento adyuvante en estos pacientes (esquema FOLFOX o XELOX). No obstante, el tratamiento adyuvante con FP en monoterapia sigue considerándose Estadío T N M 0 Tis N0 M0 I T1-T2 N0 M0 IIA IIB IIC T3 T4a T4b N0 N0 N0 M0 M0 M0 IIIA IIIB IIIC T1-2 T1 T3-T4a T2-T3 T1-T2 T4a T3-T4a T4b N1 N2a N1 N2a N2b N2a N2b N1-N2 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 IVA Cualquier T Cualquier N M1a IVB Cualquier T Cualquier N M1b IVC Cualquier T Cualquier N M1c 34 adecuado en pacientes frágiles y/o ancianos (>70 años), en los que se ha constatado que existe beneficio en supervivencia con la QT adyuvante (Sanoff et al, 2012), pero en los que existen dudas del beneficio aportado con el oxaliplatino (Tournigand et al, 2012: Haller et al, 2015). El tratamiento adyuvante con capecitabina en monoterapia es al menos igual de eficaz que el 5-FU intravenoso administrado en infusión rápida, y se asocia a menor toxicidad digestiva y hematológica, pero a mayor incidencia de síndrome de mano-pie y de hiperbilirrubinemia (Twelves et al, 2005). El beneficio de la QT adyuvante en los pacientes con estadío II es un aspecto particularmente controvertido. Estos pacientes pueden ser observados tras la cirugía o tratados con QT adyuvante dependiendo de factores de riesgo que abarcan características clínicas y biomoleculares del tumor. En cualquier caso, se estima que el beneficio global de la QT en este contexto supone un incremento absoluto del 5% en supervivencia (Sargent et al, 2009). Dada la pequeña magnitud del beneficio que la QT aporta en pacientes con CCR estadío II, y teniendo en cuenta que no es un tratamiento exento de riesgos, la indicación de QT adyuvante en estos pacientes debe individualizarse y generalmente se emplea en los subgrupos de alto riesgo de recurrencia (Dienstmann et al, 2015). Respecto a la duración del tratamiento adyuvante, el ensayo INT 0089 (Haller et al, 2005) estableció el estándar de administrar 6 meses de tratamiento adyuvante con fluoropirimidinas, en lugar de los 12 meses del esquema original de Moertel. En 2005, se llevó a cabo un estudio que comparaba 3 meses de 5-FU en infusión continua vs 6 meses del esquema estándar de 5-FU en infusión rápida de la clínica Mayo, observándose resultados similares en eficacia y menor toxicidad para el tratamiento con 5-FU en infusión continua, aunque el estudio había sido diseñado para demostrar superioridad (Chau et al, 2005). Más recientemente, basándose en el doblete de QT estándar (oxaliplatino + FP), se han comunicado los resultados de un grupo de estudios randomizados que han comparado 3 vs 6 meses de tratamiento adyuvante en pacientes intervenidos de CCR estadío III dentro del proyecto IDEA (del inglés “International Duration Evaluation of Adjuvant chemotherapy”). Este proyecto incluye 6 estudios randomizados (SCOT, TOSCA, SWOG80702, IDEA France, ACHIEVE, HORG) con un total de 12834 pacientes (Grothey et al, 2018). El objetivo principal fue la tasa de SLE a 3 años. Los estudios analizados de forma individual difieren en sus resultados y el primer análisis conjunto de todos ellos no alcanzó la significación estadística para demostrar la no inferioridad de 3 vs 6 meses de tratamiento en la población global del estudio (HR 1.07; IC 95% 1.00-1.15). Sin embargo, en el análisis preplanificado por esquemas de quimioterapia sí se demostró la no inferioridad del tratamiento con 3 vs 6 meses de XELOX (HR 0.95; IC 95% 0.85-1.06), pero no la de 3 vs 6 meses de FOLFOX (HR 1.16; IC 95% 1.06-1.26). En análisis exploratorios en función del estadiaje tumoral también se observó la no inferioridad de 3 vs 6 meses de quimioterapia en pacientes con tumores T1-3 N1 (HR 1.01; IC 95% 0.90-1.12) pero, por el contrario, el tratamiento con 6 meses de quimioterapia fue superior a 3 meses de tratamiento en pacientes con tumores T4 o 35 N2 (SLE a 3 años: 64.4% vs 62.7%, HR 1.12; IC 95% 1.03-1.23, P=0.01). Estos datos sugieren que en pacientes de menor riesgo (T1-3 N1) podría estar justificado un tratamiento de 3 meses, particularmente si se va a emplear XELOX, lo cual reduciría de manera significativa la neurotoxicidad inducida por el oxaliplatino, además de ser menos costoso para el paciente y para el sistema de salud. No obstante, hay que ser cautos a la hora de interpretar y aplicar estos datos preliminares, teniendo en cuenta que no existe randomización entre los esquemas de tratamiento, que no todos los estudios habían alcanzado los criterios de reclutamiento establecido y que el seguimiento es aún insuficiente para tener datos concluyentes en términos de SG. 4.2. Factores pronósticos y predictivos 4.2.1. Factores clínico-patológicos En la práctica clínica habitual los factores clínico-patológicos son los más frecuentemente empleados para la estratificación pronóstica de la enfermedad, en función de la cual se establece la estrategia terapéutica. En el contexto del cáncer colorrectal localizado la estadificación TNM juega un papel fundamental en este sentido. Así, los pacientes con estadío I o II de bajo riesgo se tratan únicamente con cirugía, mientras que los estadío II de alto riesgo y los estadío III tienen indicación de recibir quimioterapia adyuvante. Se definen como estadío II de alto riesgo aquellos pacientes que presentan alguno de los siguientes criterios: presentación clínica de urgencia en forma de oclusión o perforación intestinal, invasión de órganos vecinos (pT4), escaso número de ganglios analizados en la pieza quirúrgica (<12), presencia de invasión linfovascular y perineural, y pobre diferenciación histológica (grado histológico (G) 3) (Benson et al, 2004). No obstante, no todos los factores tienen el mismo peso, siendo el indicador histopatológico de mal pronóstico más robusto el estadiaje T4 (Roth et al, 2012; Snaebjornsson et al, 2014). Estudios retrospectivos identificaron también la invasión perineural y linfovascular como marcador de riesgo (Liebig et al, 2009), mientras que el grado histológico no se ha asociado de forma consistente con un incremento del riesgo de recurrencia en estadío II (Gray et al, 2011). De hecho, la pobre diferenciación tumoral se ha correlacionado con la presencia de MSI, sin tener impacto negativo establecido en estos pacientes, por lo que la agresividad de la pobre diferenciación histológica debería restringirse a los tumores con estabilidad de microsatélites (MSS). Respecto al número de ganglios analizados, una escasa extirpación ganglionar aumenta las posibilidades de infraestadificación y denota una cirugía o examen histopatológico subóptimos, todo lo cual se asocia a un peor pronóstico. Aunque no existe un número absoluto de ganglios analizados que defina un adecuado o inadecuado mapeo ganglionar, la Sociedad Europea de Oncología Médica (ESMO) y las guías americanas recomiendan el 36 estudio de al menos 12 ganglios para una adecuada estadificación. Otro factor clínico muy relevante es la localización del tumor primario (colon derecho vs izquierdo). Los resultados de recientes meta-análisis que incluyen múltiples estudios y un gran número de pacientes (Petrelli et al, 2016; Holch et al, 2017; ) confirman que los tumores de colon derecho se asocian de manera significativa con una menor supervivencia, independientemente del estadío o del tratamiento adyuvante recibido en estadíos localizados. Se han postulado múltiples factores que pueden justificar este diferente comportamiento clínico, incluidas diferencias embriológicas, ambientales (diferente microbiota y composición de contenido fecal), factores clínicos (diagnóstico más tardío en tumores derechos por presentación clínica más insidiosa) y moleculares (mayor incidencia de tumores MSI y mutaciones BRAF en colon derecho). No obstante, en relación a los tumores en estadío III, diversos estudios observan de manera consistente que los tumores de colon derecho presentan un peor pronóstico en términos de supervivencia independientemente del estado de MSI, mutaciones RAS o BRAF (Missiaglia et al, 2014; Schrag et al, 2016). Por el contrario, esta asociación también se observa en tumores en estadío II excepto para aquellos que presentan MSI, que constituye un conocido factor de buen pronóstico y está más frecuentemente asociado a tumores en colon derecho (Weiss et al, 2011). 4.2.2. Factores moleculares  Inestabilidad de microsatélites. El porcentaje de tumores que presentan inestabilidad de microsatélites es distinta según los estadíos (22% en estadío II, 12% en estadío III, 2.5% en estadío IV). Su presencia constituye un factor pronóstico validado en cáncer de colon, aunque su impacto positivo en supervivencia se limita esencialmente a estadío iniciales de la enfermedad (Dienstmann et al, 2015). Se ha detectado, además, un menor beneficio derivado de la QT basada en 5-FU en pacientes con inestabilidad de microsatélites y estadío II (Hutchins et al, 2011), pudiendo incluso ser un tratamiento deletéreo para estos pacientes según concluyen algunos estudios (Sargent et al, 2010). Por ello, no se recomienda administrar QT adyuvante a los pacientes con CCR estadío II que presentan MSI, ya que presentan un mejor pronóstico y no parecen beneficiarse del tratamiento adyuvante con 5-FU. Como consecuencia de estos hallazgos, que son bastante consistentes en todos los estudios, la determinación de la expresión de los genes reparadores de ADN del sistema MMR se ha incorporado como una herramienta útil para la decisión terapéutica en estadío II principalmente, aunque las guías clínicas recomiendan su determinación en todos los pacientes con CCR independientemente del estadío, también por las implicaciones predictivas de respuesta a inmunoterapia en estadíos más avanzados. Por el contrario, en el estadío 37 III, el valor pronóstico y predictivo de la inestabilidad de microsatélites no está tan establecido. Se ha observado que los pacientes en estadío III se benefician del tratamiento adyuvante independientemente de la presencia o no de inestabilidad de microsatélites (Sinicrope et al, 2011).  Perfiles de expresión génica El análisis de la expresión génica ha permitido mejorar la precisión diagnóstica, pronóstica y predictiva en diversas enfermedades neoplásicas. En el contexto del CCR, se han publicado múltiples firmas genómicas capaces de detectar subgrupos de pacientes intervenidos de cáncer de colon estadío II-III con mayor riesgo de recidiva o metástasis (Wang et al, 2004; Sinicrope et al, 2015; D’Arrigo et al, 2005; Yamasaki et al, 2007). Las dos plataformas genéticas más desarrolladas son Oncotype Dx® (única comercializada) y ColoPrint®. En la plataforma de Oncotype Dx® se seleccionaron 7 genes con valor pronóstico y 6 genes con valor predictivo para ser validados como firma génica. La validación se llevó a cabo de forma prospectiva en 1436 pacientes participantes en el EC QUASAR, confirmándose su valor pronóstico y estableciéndose tres categorías de riesgo (bajo, intermedio y alto) en función de la tasa de recaída a los 3 años (12%, 18% y 22%, respectivamente, p:0.046) (Gray et al, 2011). Varios estudios posteriores han confirmado la utilidad pronóstica y predictiva de la firma en un número considerable de pacientes (Venook et al, 2013; Yothey et al, 2013). No obstante, la escasa capacidad discriminatoria entre los distintos grupos de riesgo con una diferencia de riesgos máxima del 10% entre los grupos de alto y bajo riesgo, junto con la baja probabilidad de recaída incluso en el grupo identificado como de alto riesgo han limitado su implantación en la práctica clínica. En la plataforma ColoPrint® se seleccionó un grupo de 18 genes que divide a los pacientes en dos grupos de riesgo de recaída (bajo y alto riesgo) independientemente de factores clínico-patológicos. Su valor pronóstico ha sido validado en una cohorte independiente para la SLR (HR=2.6; p=0,003) y especialmente en pacientes con estadío II (HR=3.3; p=0.02) (Salazar et al, 2011). Estos resultados han sido además reproducidos en análisis posteriores con resultados similares (Maak et al, 2013; Kopetz et al, 2015). Sin embargo, su falta de validación en estudios prospectivos controlados, su ausencia de valor predictivo y la mayor complejidad de su técnica que requiere tejido congelado compromete su utilidad clínica. Además, esta firma pronóstica no pudo ser validada en parafina por lo que no se llegó a comercializar. La clasificación molecular de consenso del CCR (Guinney et al, 2015; Dienstmann et al, 2017) también ha aportado información pronóstica basada en la expresión génica al identificar diferencias sustanciales en el pronóstico de los diversos 38 subtipos tumorales. Como hemos comentado previamente, globalmente el subgrupo CMS4 incluye los tumores con peor SLR y SG. No obstante, tras la recaída, los tumores CMS2 fueron los que presentaban una mayor supervivencia mientras que los CMS1 son los que se asociaron a un peor pronóstico.  Otros (CDX2, RAS, BRAF) CDX2 es un factor de transcripción específico esencial en el desarrollo intestinal, que se expresa tanto en la mucosa intestinal normal como en tumores de origen colónico. Este factor se ha identificado como un nuevo biomarcador pronóstico fácilmente evaluable mediante IHQ en CCR. En el estudio publicado en 2016 (Dalerba et al, 2016) se establece la pérdida de expresión de CDX2 (observada en torno al 5% de los pacientes) como un factor de mal pronóstico, que implica una peor evolución clínica en términos de SLE y SG en una cohorte retrospectiva de pacientes con CCR resecado estadíos II y III. Se observó además que la pérdida de expresión de CDX2 también se asociaba con mayor beneficio de la QT adyuvante en estos pacientes. Tal como concluyen los autores, estos hallazgos deben ser validados y confirmados en estudios prospectivos randomizados. Además del conocido impacto predictivo de respuesta a determinados fármacos en el cáncer colorrectal metastásico (CCRm), las mutaciones de RAS y BRAF tienen también un valor pronóstico, al menos en algunos subgrupos de CCR. En un estudio recientemente publicado (Smeby et al, 2018), que incluyó 1197 muestras tumorales de CCR estadios I-IV, se evaluó el impacto pronóstico de dichas mutaciones en función de los distintos subgrupos de la clasificación de consenso del CCR. En este estudio se concluye que las mutaciones KRAS y BRAF-V600E se asocian con una peor supervivencia exclusivamente en tumores con MSS, limitándose además a ciertos subgrupos CMS (la mutación de BRAF confería un peor pronóstico en CMS1 MSS pero no en CMS1 MSI, con independencia de la localización tumoral, y se asociaban a estadío metastásico, y las mutaciones KRAS conferían un peor pronóstico solo en CMS 2-3, con independencia de la localización del tumor). 39 5. Tratamiento del cáncer colorrectal metastásico. Aproximadamente un 25-30% de los casos debutan al diagnóstico con enfermedad metastásica (metástasis sincrónicas), y el 40% de los pacientes con estadíos precoces eventualmente desarrollan metástasis a distancia (metástasis metacrónicas) tras la cirugía, por lo que globalmente cerca del 50-60% de los pacientes diagnosticados con cáncer de colon presentarán enfermedad metastásica a lo largo de la evolución de la enfermedad. La SG de los pacientes con enfermedad avanzada ha ido aumentando progresivamente en las últimas décadas hasta alcanzar una mediana de 2-3 años. Ello se debe a las mejoras experimentadas en las técnicas diagnósticas, con una detección más temprana de la enfermedad metastásica y una mejor caracterización molecular de la enfermedad (perfil de mutaciones KRAS, NRAS y BRAF, e inestabilidad de microsatélites), así como mejoras terapéuticas significativas incluyendo el abordaje quirúrgico de la enfermedad oligometastásica, el tratamiento locorregional de las metástasis hepáticas (distintas técnicas ablativas, SBRT/radiocirugía o radioembolización) y la incorporación de nuevos fármacos desarrollados en base a un mayor conocimiento de la biología molecular del CCR (Van Cutsem et al, 2016). Existen actualmente múltiples fármacos aprobados para el tratamiento del CCRm que difieren tanto en mecanismo de acción como en su perfil de toxicidad. Estos fármacos incluyen quimioterápicos como 5-FU, capecitabina, raltitrexed, oxaliplatino, CPT11 o TAS102, antiangiogénicos como bevacizumab, aflibercept, ramucirumab o regorafenib, e inhibidores de EGFR como cetuximab o panitumumab. Estos antineoplásicos pueden ser empleados en distintas combinaciones y secuencias. Al margen de la secuencia empleada, que no está claramente establecida, de la exposición al mayor número de fármacos posible se deriva un mayor beneficio terapéutico (Grothey et al, 2005; Cremolini et al, 2015). Más recientemente se ha demostrado que el subgrupo de pacientes con CCRm y MSI tiene mal pronóstico cuando se trata con quimioterapia convencional, pero es particularmente sensible a la inmunoterapia ya que son tumores con una alta carga mutacional. De hecho, la FDA ha aprobado recientemente el Pembrolizumab (anticuerpo monoclonal anti-PD1, del inglés “Programmed Death-1”), y la combinación de Nivolumab (anticuerpo monoclonal anti-PD1) e Ipilimumab (anticuerpo monoclonal anti-CTLA4), inhibidores de los puntos de control del sistema inmunológico (del inglés “checkpoints inhibitors”), para el tratamiento de CCR MSI tras fracaso del tratamiento quimioterápico estándar (Le et al, 2015). 40 La estrategia terapéutica y los objetivos del tratamiento deben ser establecidos en base a diversos factores clínicos y moleculares, como la localización y extensión tumoral, la resecabilidad del tumor primario y de las metástasis, las características biológicas del tumor, las características clínicas del paciente, los síntomas derivados de la enfermedad y el perfil de toxicidad de los fármacos. En base a todos estos factores, ESMO recomienda clasificar a los pacientes esencialmente en 3 grupos: aquellos que presentan enfermedad metastásica resecable de inicio, aquellos que presentan enfermedad potencialmente resecable, en los que el objetivo terapéutico es alcanzar la máxima reducción del tamaño tumoral para conseguir la resecabilidad con intención curativa, y los pacientes con enfermedad diseminada irresecable, en los que los objetivos del tratamiento son el control de los síntomas y de la evolución de la enfermedad. En pacientes con enfermedad resecable, la cirugía es la estrategia fundamental con el objetivo de conseguir una resección completa R0, e irá acompañada de QT perioperatoria o adyuvante según los casos. En contraposición, el CCRm irresecable se considera incurable y el tratamiento de elección es la QT sistémica, ya que ha demostrado prolongar de forma significativa la supervivencia y mejorar la calidad de vida de los pacientes en comparación con el mejor tratamiento de soporte (Best et al, 2000). En los pacientes con enfermedad irresecable en los que se consigue controlar la enfermedad tras un tratamiento de inducción, deben plantearse estrategias para disminuir la toxicidad acumulativa, como es la administración de tratamiento de mantenimiento, la posibilidad de intervalos libres del mismo o incluso el uso de técnicas ablativas si existe enfermedad oligometastásica. Antes de iniciar cualquier tipo de tratamiento las guías clínicas recomiendan determinar el estado mutacional de RAS/BRAF y determinar la estabilidad de microsatélites en todos los pacientes para identificar a aquellos candidatos a tratamiento con anti-EGFR (si RAS/BRAF es nativo) o inmunoterapia (tumores con MSI) (Van Cutsem et al, 2016, García-Alfonso et al, 2015). De forma general y en ausencia de contraindicaciones médicas, el tratamiento estándar de primera línea consiste en esquemas de poliQT basados en FP y oxaliplatino o CPT11 (FOLFOX, XELOX, FOLFIRI), que han demostrado un incremento en la tasa de respuesta y supervivencia respecto a esquemas en monoterapia. Estos dobletes de oxaliplatino e CPT11 han resultado ser equivalentes en términos de eficacia terapéutica si se combinan con regímenes semejantes de FP, por lo que la diferencia fundamental entre ambos esquemas es el perfil de toxicidad: mayor diarrea y alopecia con CPT11, y mayor neurotoxicidad con oxaliplatino. A su vez, los dobletes de QT pueden combinarse con anticuerpos monoclonales dirigidos frente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o frente a EGFR en tumores sin mutaciones de RAS/BRAF para mejorar los resultados clínicos, reservándose el uso de tripletes de citotóxicos (FP con oxaliplatino e CPT11; FOLFOXIRI) con o sin bevacizumab para pacientes seleccionados y con tumores de colon derecho fundamentalmente (Cremolini et al, 2015). En contraposición, el tratamiento en monoterapia debe reservarse para pacientes frágiles con riesgo de mala 41 tolerancia a tratamiento intensivo por situación funcional o comorbilidades, pero que sean candidatos a QT activa. Todos estos fármacos han demostrado eficacia en CCRm en primera y sucesivas líneas de tratamiento, por lo que la estrategia de segunda línea viene determinada por los fármacos previamente utilizados. De esta forma, en pacientes que han comenzado con bevacizumab en combinación con un doblete de quimioterapia en primera línea, las alternativas son cambiar el doblete de quimioterapia y añadir bevacizumab, aflibercept (sólo en combinación con FOLFIRI) o un anti-EGFR en pacientes sin mutaciones de RAS/BRAF, o bien reservar el anti-EGFR para tercera línea en este último caso tras una segunda línea que incluya un antiangiogénico. Por el contrario, en pacientes que han iniciado tratamiento con anti-EGFR y son bevacizumab-naive, se debe plantear el uso de antiangiogénicos en segunda línea si no existe contraindicación para ello. Por tanto, en la elección de segunda línea hay que tener en cuenta otros factores añadidos como la toxicidad presentada previamente, y el tipo y duración de la respuesta al tratamiento inicial. No obstante, a pesar de que todos estos esquemas consiguen tasas de respuesta objetiva tumoral del 40-60%, incluso los pacientes respondedores eventualmente desarrollan resistencia y fallecen por progresión tumoral, con medianas de SG que generalmente no superan los 2.5-3 años de vida en la mejor de las series. En la Tabla 3 se resumen las distintas estrategias de tratamiento a lo largo de la evolución de la enfermedad en función del objetivo terapéutico y del perfil molecular, en base a las recomendaciones de la última guía de ESMO 2016 (Van Cutsem et al, 2016). 48 Tabla 5. Ensayos de citotoxicidad con oxaliplatino y PP2 (inhibidor de Src) en líneas celulares de CCR. Resultados similares fueron observados en modelos PDX (del inglés “patientderived xenografts” o xenoinjertos derivados del paciente) generados en nuestro laboratorio a partir de metástasis hepáticas de pacientes con CCRm sometidos a resección quirúrgica de sus metástasis, y que fueron implantadas ortotópicamente en el hígado de ratones desnudos. Se seleccionaron 4 modelos PDX, 2 con alta expresión de pSrc (ambos KRAS mutado y, BRAF nativo, y uno de ellos con MSI) y 2 con baja expresión (uno RAS/BRAF nativo, y el otro KRAS mutado; ambos con MSS). En estos modelos observamos que el dasatinib, un inhibidor de Src, en combinación con oxaliplatino, prolongaba significativamente la supervivencia de los PDX con alta expresión de Src, frente al tratamiento con cualquiera de los dos fármacos en monoterapia o frente al tratamiento con solución sin fármaco (control). Sin embargo, este sinergismo no se observó en modelos con baja expresión de pSrc, ni con la combinación de dasatinib con 5-FU. 49 50 HIPÓTESIS 51 HIPÓTESIS El cáncer colorrectal es una enfermedad neoplásica molecularmente heterogénea y compleja, que comprende un espectro de tumores con una gran variabilidad en cuanto a su comportamiento biológico y su susceptibilidad a distintos fármacos. La identificación de nuevos biomarcadores pronósticos y/o predictivos resulta de trascendental importancia para una estratificación pronóstica más precisa y una selección más personalizada de las terapias más eficaces para cada paciente. Src pertenece a una familia de receptores tirosina quinasa citoplasmáticos que juega un papel central en la regulación de diversas vías de señalización implicadas en la regulación de múltiples procesos celulares relavantes en la carcinogénesis, como son la proliferación, invasión, migración, angiogénesis y apoptosis. Además se ha demostrado que la activación de Src se asocia a un fenotipo tumoral más agresivo y puede mediar la resistencia a determinados agentes quimioterápicos, resistencia que puede ser farmacológicamente revertida con inhibidores específicos de Src. En base a todo ello, la hipótesis de nuestro trabajo es que la sobreexpresión tumoral de Src activado o pSrc se correlaciona con un peor pronóstico y con una mayor resistencia a esquemas de QT basados en oxaliplatino en pacientes con CCR. Src podría ser, por lo tanto, un biomarcador de potencial utilidad clínica para mejorar la estratificación pronóstica de los pacientes y para la identificación de subgrupos de pacientes tributarios de nuevas estrategias terapéuticas. 52 53 OBJETIVOS 54 OBJETIVOS El objetivo global del proyecto es evaluar la expresión tumoral de pSrc y su utilidad clínica como biomarcador en cáncer de colon, y analizar su papel como factor pronóstico de la evolución natural de la enfermedad y como factor predictivo de resistencia al tratamiento con QT basada en oxaliplatino. Para ello se llevarán a cabo los siguientes objetivos específicos: o Evaluación mediante técnicas de IHQ de la expresión tumoral de pSrc en matrices de tejido tumoral parafinado (“tissue microarrays”, TMA) de 487 pacientes con cáncer de colon estadío II-III y 154 pacientes con cáncer de colon estadío IV diagnosticados y tratados en el Hospital Universitario Virgen del Rocío (HUVR) de Sevilla. o Evaluación de la correlación entre la expresión tumoral de pSrc y la SLE y SG en pacientes con cáncer de colon estadío II-III tratados mediante resección quirúrgica, con o sin tratamiento quimioterápico adyuvante (FP +/- oxaliplatino). o Evaluación de la correlación entre la expresión tumoral de pSrc y la tasa de respuesta objetiva, la SLP y la SG de pacientes con cáncer de colon estadío IV con diferentes perfiles moleculares (RAS y BRAF nativos o mutados, y tumores con o sin inestabilidad de microsatélites), tratados con esquemas de QT basados en oxaliplatino. 55 56 MATERIALES Y MÉTODOS 57 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Diseño del estudio. Observacional, de cohorte y retrospectivo. 2. Población de estudio y criterios de inclusión. Para la realización del estudio se establecieron 2 cohortes de pacientes: o Cohorte de pacientes diagnosticados de CCR estadío II-III. En esta cohorte de estudio se incluyeron un total de 487 pacientes consecutivos diagnosticados de CCR estadío II y III entre el año 2000 y 2010 en el HUVR de Sevilla. Estos pacientes fueron tratados mediante resección quirúrgica del tumor primario, con o sin QT adyuvante. Globalmente, salvo contraindicación médica (p.ej. complicaciones postquirúrgicas o comorbilidades importantes), recibieron QT adyuvante los pacientes con cáncer de colon estadío III o estadío II de alto riesgo. Se consideraron estadío II de alto riesgo los casos que cumplían alguna de las siguientes condiciones: T4, G3, <12 ganglios analizados, obstrucción o perforación intestinal como debut de la enfermedad o presencia de invasión vascular. La QT estándar en ese periodo de estudio consistía en FP en monoterapia (5-FU o capecitabina) y, desde 2005, FP en combinación con oxaliplatino (esquemas FOLFOX o XELOX) en pacientes con estadío III y < 70 años, salvo contraindicación médica para ello. o Cohorte de pacientes diagnosticados de CCRm o estadío IV. En esta cohorte de estudio se incluyeron 154 pacientes diagnosticados de CCR avanzado y tratados en el HUVR en el periodo 2007-2014. Estos pacientes recibieron QT para enfermedad metastásica que podía consistir en un doblete de QT con FP y oxaliplatino o irinotecán +/- antiangiogénicos o anti-EGFR (si RAS nativo). 64 65 RESULTADOS 66 RESULTADOS 1. Cohorte 1: Pacientes con cáncer colorrectal estadío II-III. 1.1. Características clínicas de los pacientes La primera cohorte de nuestro estudio está constituida por 487 pacientes diagnosticados de CCR estadío II-III. Las principales características clínicas y demográficas de esta cohorte se muestran en la Tabla 6. Aproximadamente la mitad de los pacientes fueron varones (56.9%), con una mediana de edad al diagnóstico de 67.8 años (rango 28-90) y la mayoría de ellos presentaban un buen estado funcional (ECOG 0-1: 74%). El 17.7% de los casos debutaron al diagnóstico con cuadro de obstrucción intestinal y el 7.4% con cuadro de perforación intestinal, requiriendo en ambos casos intervención quirúrgica urgente. La localización más frecuente del tumor primario fue colon izquierdo o recto (66.3%), mientras que el 33.7% de los tumores se localizaron en colon derecho. Desde el punto de vista terapéutico, el 61.2% recibió tratamiento QT adyuvante; un 38% de ellos con FP en monoterapia y un 22.2% FP en combinación con oxaliplatino. Todas las características clínicas están bien balanceadas entre los dos subgrupos de pacientes (estadío II y III) excepto, como es esperable, el tratamiento adyuvante: mientras que el 78.9% de los pacientes diagnosticados en estadío III recibieron tratamiento adyuvante, más de la mitad de los pacientes con estadío II no lo recibieron, empleándose la combinación de fluoropirimidinas y oxaliplatino con más frecuencia en el estadío III (38.1% vs 7.9 % en estadío III vs II, respectivamente). 67 Tabla 6. Características clínicas de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III. Población total 487 (100%) Población estadío II 240 (49.3%) Población estadío III 247 (50.7%) Edad (años)  Mediana (rango) 67.8 (28-90) 66.8 (28-90) 68.0 (35-88) Sexo  Hombre  Mujer 277 (56.9%) 210 (43.1%) 156 (65.0%) 84 (35.0%) 121 (49.0%) 126 (51.0%) ECOG  0  1  2  3  Desconocido 278 (57.1%) 83 (17.0%) 25 (5.1%) 7 (1.4%) 94 (19.3%) 159 (66.3%) 26 (10.8%) 8 (3.3%) 1 (0.4%) 46 (19.2%) 119 (48.2%) 57 (23.1%) 17 (6.9%) 6 (2.4%) 48 (19.4%) CEA prequirúrgico  Normal  Elevado  ND 118 (24.2%) 150 (30.8%) 219 (45.0%) 69 (28.7%) 74 (30.8%) 97 (40.4%) 49 (19.8%) 76 (30.8%) 122 (49.4%) Obstrucción intestinal  Sí  No 86 (17.7%) 401 (82.3%) 40 (16.7%) 200 (83.3%) 46 (18.6%) 201 (81.4%) Perforación intestinal  Si  No 36 (7.4%) 451 (92.6%) 19 (7.9%) 221 (92.1%) 17 (6.9%) 230 (93.1%) Localización tumoral  Ciego y colon ascendente  Colon transverso  Colon descendente  Sigma  Recto 105 (21.6%) 59 (12.1%) 125 (25.6%) 183 (37.6%) 15 (3.1%) 50 (20.8%) 28 (11.7%) 63 (26.2%) 94 (39.2%) 5 (2.1%) 55 (22.2%) 31 (12.6%) 62 (25.2%) 89 (36.0%) 10 (4.0%) QT adyuvante  No  Sí o FP o FP +OX 189 (38.8%) 298 (61.2%) 185 (38.0%) 113 (22.2%) 137 (57.1%) 103 (42.9%) 84 (35.0%) 19 (7.9%) 52 (21.2%) 195 (78.9%) 101 (40.9%) 94 (38.1%) Seguimiento de pacientes (meses)  Mediana (rango) 65.7 (0-169) 80.7 (0.3-169) 58.0 (0.0-149) Recidiva  Sí  No 137 (28.1%) 350 (71.9%) 54 (22.5%) 186 (77.5%) 83 (33.6%) 164 (66.4%) Éxitus  Sí  No 176 (36.1%) 311 (63.9%) 83 (34.6%) 157 (65.4%) 93 (37.7%) 154 (62.3%) CEA: Antígeno carcinoembrionario. ND: No determinado. QT Quimioterapia. FP: Fluoropirimidinas. OX: Oxaliplatino. 68 1.2. Características histopatológicas y moleculares de los tumores En la Tabla 7 se resumen las características histopatológicas y moleculares de los tumores de esta cohorte. El subtipo histológico más frecuente fue el adenocarcinoma (95.1%), y la mayor parte de los casos fueron tumores bien o moderadamente diferenciados (35.1% y 57.5%, respectivamente), sin invasión vascular (95.9%) ni perineural (99.8%). Siguiendo la clasificación TNM, el 49.3% de los pacientes presentaban estadío II al diagnóstico y el 50.7% correspondían a estadío III. En relación a la expresión de pSrc, ésta fue evaluable en 409 muestras (84%). La intensidad de la expresión de pSrc se distribuyó de la siguiente manera: 144 pacientes (29.6%) presentaron una expresión nula (0), 118 pacientes (24.2%) expresión débil (+1), 103 (21.1%) expresión moderada (+2) y 44 pacientes (9.0%) expresión alta (+3). 69 Tabla 7. Características histopatológicas y moleculares de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III. Población total 487 (100%) Población estadío II 240 (49.3%) Población estadío III 247 (50.7%) Subtipo histológico  Adenocarcinoma  Carcinoma mucinoso  Carcinoma anillo sello  Medular  Coloide 463 (95.1%) 10 (2.1%) 7 (1.4%) 2 (0.4%) 5 (1.0%) 229 (95.4%) 4 (1.7%) 2 (0.8%) 1 (0.4%) 4 (1.7%) 234 (94.7%) 6 (2.4%) 5 (2.0%) 1 (0.4%) 1 (0.4%) Estadío T patológico  pT1  pT2  pT3  pT4 2 (0.4%) 16 (3.3%) 366 (75.2%) 102 (20.9%) 1 (0.4%) 1 (0.4%) 83 (76.3%) 54 (22.5%) 1 (0.4%) 15 (6.1%) 183 (74.1%) 48 (19.4%) Estadío N patológico  pN0  pN1  pN2 240 (49.3%) 162 (33.3%) 85 (17.5%) 240 (100.0%) - - - 162 (65.6%) 85 (34.4.%) Estadío TNM  II o IIA o IIB  III o IIIA o IIIB o IIIC 240 (49.3%) 185 (38.0%) 55 (11.3%) 247 (50.7%) 17 (3.5%) 146 (30.0%) 84 (17.2%) Grado histológico  G1  G2  G3  ND 171 (35.1%) 280 (57.5%) 35 (7.2%) 1 (0.2%) 111 (46.3%) 114 (47.5%) 15 (6.3%) - 60 (24.3%) 166 (67.2%) 20 (8.1%) 1 (0.4%) Invasión vascular  Si  No 20 (4.1%) 467 (95.9%) - 240 (100%) 20 (8.1%) 227 (91.9%) Invasión perineural  Sí  No 1 (0.2%) 486 (99.8%) - 240 (100%) 1 (0.4%) 246 (99.6%) Inestabilidad de microsatélites  Sí  No  ND 14 (2.9%) 23 (4.7%) 450 (93.8%) 11 (4.6%) 5 (2.1%) 224 (93.3%) 3 (1.2%) 18 (7.3%) 226 (91.5%) Src máximo  0  1  2  3  ND 144 (29.6%) 118 (24.2%) 103 (21.1%) 44 (9.0%) 78 (16.0%) 88 (36.7%) 54 (22.5%) 34 (14.2%) 17 (7.1%) 47 (19.6%) 56 (22.7%) 64 (25.9%) 69 (27.9%) 27 (10.9%) 31 (12.6%) G; Grado histológico. ND: No determinado. 70 1.3. Asociación entre la expresión de pSrc y las características clinicopatológicas La asociación entre la expresión de pSrc y las diversas características clinicopatológicas de interés se recoge en la Tabla 8. Se observó una tendencia a una mayor expresión de pSrc en pacientes de mayor edad (8.8% vs 12.6% en < 65 vs > de 65 años, respectivamente), en pacientes que debutaron con obstrucción intestinal (15.1% vs 10.1% en sí vs no, respectivamente), en tumores localizados en colon derecho (14.4% vs 8.9% en colon derecho vs colon izquierdo, respectivamente), en tumores con invasión vascular (16.7% vs 10.7% en sí vs no, respectivamente) y en estadios más avanzados de la enfermedad (12.5% vs 8.8% en estadío III vs II, respectivamente). Todos estos factores se asocian, en general, a un peor pronóstico. No obstante, las diferencias observadas no fueron estadísticamente significativas. Por último, también se observó una mayor expresión de pSrc en pacientes recidivados o fallecidos. 71 Tabla 8. Características clínico-patológicas en función de la expresión tumoral de pSrc de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III. Src P N 0-2 3 χ2 Sexo  Varón  Mujer 230 179 207 (90.0%) 158 (88.3%) 23 (10.0%) 21 (11.7%) NS Edad  < 65  > 65 171 238 156 (91.2%) 209 (87.8%) 15 (8.8%) 29 (12.2%) NS ECOG  0-1  > 2 297 28 267 (89.9%) 25 (89.3%) 30 (10.1%) 3 (10.7%) NS CEA  Normal  Elevado 100 125 93 (93.0%) 116 (92.8%) 7 (7.0%) 9 (7.2%) NS Localización tumoral  Colon derecho  Colon izquierdo 139 270 119 (85.6%) 246 (91.1%) 20 (14.4%) 24 (8.9%) NS Obstrucción intestinal  Sí  No 73 336 62 (84.9%) 302 (89.9%) 11 (15.1%) 34 (10.1%) NS Perforación intestinal  Sí  No 30 379 27 (90.0%) 337 (88.9%) 3 (10.0%) 42 (11.1%) NS Histología  Adenocarcinoma  Mucinoso/células en Anillo de sello/medular 392 17 351 (89.5%) 14 (82.4%) 41 (10.5%) 3 (17.6%) NS Invasión vascular  Sí  No 18 391 15 (83.3%) 350 (89.5%) 3 (16.7%) 41 (10.5%) NS T  pT1-2  pT3-4 15 393 14 (93.3%) 350 (89.1%) 1 (6.7%) 43 (10.9%) NS N  pN0  pN1/2 193 216 176 (91.2%) 189 (87.5%) 17 (8.8%) 27 (12.5%) NS Grado histológico  G1  G2  G3 140 237 31 102 (72.9%) 137 (57.8%) 29 (93.5%) 38 (27.1%) 100 (42.2%) 2 (6.5%) NS Estadío tumoral  II  III 193 216 176 (91.2%) 189 (87.5%) 17 (8.8%) 27 (12.5%) NS QT adyuvante  Sí  No 255 154 233 (91.4%) 132 (85.7%) 22 (8.6%) 22 (14.3%) NS Recaída  Sí  No 117 292 100 (85.5%) 264 (90.4%) 17 (14.5%) 28 (9.6%) NS Éxitus  Sí  No 141 268 119 (84.4%) 245 (91.4%) 22 (15.6%) 23 (8.6%) NS CEA: Antígeno carcinoembrionario. G: Grado histológico. QT: Quimioterapia. NS: No significativo. 72 1.4. Supervivencia en funcin de las caractersticas clinicopatolgicas Con una mediana de seguimiento de 66 meses (rango 0-169), el 28% de los pacientes habían recidivado y el 36% habían fallecido en el momento del análisis (Tabla 9). La SLE a los 5 años para la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III fue del 60.6% (95% IC 56-65.2). Se detectaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) en la tasa de SLE a 5 años en función del sexo (55.7% en varones, 67.2% en mujeres), edad (66.1% en <65, 56.5% en >65 años), estadío TNM (67.5% en estadío II, 54.2% en estadío III), valor prequirúrgico de CEA (71.9% si normal, 59.1% si elevado, 55.2% si ND), ECOG (65.8% ECOG 0-1, 27.3% ECOG > 2), presencia de perforación intestinal (62.3% si tumor no perforado, 36.4% si perforado) y afectación ganglionar (67.1% si N0, 58.4% si N1 y 47.3% si N2). La SG a los 5 años para la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III fue del 71.6% (95% IC 67.2-76). En este caso, las variables que demostraron tener un impacto significativo fueron: sexo (66.4% en varones, 78.7% en mujeres), edad (79.0% en pacientes < 65, 66.0% en > 65 años), estadío TNM (77.0% en estadío II, 66.6% en estadío III), valor prequirúrgico de CEA (82.5% si normal, 70.7% si elevado, 66.0% si ND), ECOG (77.5% ECOG 0-1, 41.6% ECOG > 2), presencia de perforación intestinal (71.9% si no perforado, 52.9% si perforado) y de obstrucción intestinal (73.9% si no obstrucción, 60.6% si obstrucción). 73 Tabla 9. Supervivencia libre de progresión y supervivencia global en función de las características clínico-patológicas de la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III. SLE: Supervivencia libre de enfermedad. SG: Supervivencia global. dx: diagnóstico. CEA: Antígeno carcinoembrionario. G: Grado histológico. ND: No determinado. FP: Fluoropirimidinas. Ox: Oxaliplatino. NS: No significativo. N (%) SLE P SG P (% a 5a) (% a 5a) Total Población 487 60.6% 71.6% Sexo Varón Mujer 277 210 55.7% 67.2% 0.01 66.4% 78.7% 0.01 Edad < 65 años > 65 años 201 286 66.1% 56.5% 0.01 79.0% 66.0% 0.05 ECOG al dx 0-1 > 2 361 32 65.8% 27.3% 0.00 77.5% 41.6% <0.01 CEA pre-cirugía Normal Elevado ND 118 150 219 71.9% 59.1% 55.2% 0.02 82.5% 70.7% 66.0% 0.01 Localización tumoral Colon derecho Otros 164 323 55.6% 63.1% NS 66.4% 74.3% 0.12 Obstrucción intestinal Sí No 86 401 51.1% 62.5% 0.10 60.6% 73.9% <0.01 Perforación intestinal Sí No 36 451 36.4% 62.3% 0.04 52.9% 71.9% <0.01 Invasión vascular Sí No 20 467 52.9% 61.0% NS 59.5% 72.1% NS T pT1 pT2 pT3 pT4 2 16 366 102 50.0% 65.6% 63.2% 51.0% NS 50.0% 81.3% 73.8% 63.2% NS N pN0 pN1 pN2 240 162 85 67.1% 58.4% 47.3% 0.05 77.0% 68.0% 63.8% NS Grado histológico G1 G2 G3 171 280 35 69.7% 55.3% 61.6% 0.10 79.3% 59.0% 73.5% NS Estadío II III 240 247 67.5% 54.2% 0.05 77.0% 66.6% 0.02 QT adyuvante No Sí - FP - FP + Ox 189 298 185 113 59.5% 63.2% 63.2% 58.5% NS NS 66.4% 74.5% 75.4% 72.9% NS NS 80 Figura 11. Impacto de la expresión de pSrc en la supervivencia global en el subgrupo de pacientes con CCR estadío II. Para valorar el papel pronóstico de la expresión de pSrc en la supervivencia con independencia de otras características clínico-patológicas, se realizó el análisis de regresión multivariante de Cox incluyendo las variables previamente descritas en la sección “Material y Métodos” (edad, sexo, ECOG, valor de CEA prequirúrgico, cuadro obstructivo como debut de la enfermedad, perforación intestinal al diagnóstico, administración de QT adyuvante y grado de intensidad de la expresión de pSrc). Los resultados de dicho análisis confirmaron que una alta expresión de pSrc se asocia de forma independiente con un peor pronóstico, tanto en términos de SLE (HR=0.56, p = 0.02) como de SG (HR=0.58, p =0.06). El ECOG y la perforación intestinal también resultaron ser factores pronósticos significativos para la SLE en el análisis multivariante. Además, el sexo, el ECOG, la obstrucción y perforación intestinal fueron factores pronósticos significativos para SG (Tabla 11). 86 Tabla 11. Análisis multivariante de factores pronósticos de SLE y SG en la cohorte de pacientes con CCR estadío II-III. SLE SG Factores HR P HR P Edad (<65 vs >65 años) 0.94 0.75 0.74 0.17 Sexo (V vs M) 1.66 0.08 1.57 0.04 ECOG 0.04 0.04  ECOG 0 vs 1 1.08 0.72 0.88 0.64  ECOG 0 vs 2 2.32 0.00 2.46 0.01  ECOG 0 vs 3 1.21 0.74 1.31 0.63 CEA 0.10 0.10  CEA elevado vs normal 1.54 0.12 1.56 0.17  CEA ND vs normal 1.75 0.03 1.94 0.03 Obstrucción (no vs sí) 0.73 0.17 0.51 0.01 Perforación (no vs sí) 0.43 0.01 0.37 0.01 Estadío TNM (II vs III) 0.68 0.07 0.63 0.06 QT adyuvante (no vs sí) 1.09 0.71 1.51 0.08 pSrc (bajo vs alto) 0.56 0.02 0.58 0.06 SLE: Supervivencia libre de enfermedad. SG: Supervivencia global. V: Varón. M: Mujer. CEA: Antígeno carcinoembrionario. ND: No determinado. 87 1.6. Expresión de pSrc y sensibilidad a quimioterapia Finalmente, para valorar el posible papel de pSrc como factor predictivo de resistencia a oxaliplatino, se analizó el impacto de la expresión de pSrc en función del tratamiento adyuvante recibido (no QT, fluoropirimidinas en monoterapia, o fluoropirimidinas en combinación con oxaliplatino). Así, se observó que pSrc tenía un impacto negativo en la SLE que fue estadísticamente significativo tanto en pacientes que no recibieron QT (63.7% vs 35.4% en pacientes con baja vs alta expresión de pSrc, HR=0.49, p=0.02) como en aquellos que recibieron QT adyuvante con FP (66.1% vs 35.7% en pacientes con baja vs alta expresión de pSrc, HR=0.50, p=0.05). Por tanto, pSrc tiene un impacto negativo en la evolución de la enfermedad con independencia del tratamiento recibido (Figura 12). Tanto para SLE como para SG, no se observó una interacción significativa entre el biomarcador y el tratamiento con quimioterapia (test de interacción P = 0.78 para SLE y 0.86 para SG). 88 Figura 12. Impacto de la expresión de pSrc en la supervivencia libre de enfermedad en función de la QT recibida. A: pacientes que no recibieron QT adyuvante. B: pacientes que recibieron QT adyuvante (FP + oxaliplatino). 89 90 CONCLUSIONES 91 CONCLUSIONES  Src es un receptor tirosina quinasa citoplasmático que actúa como regulador de diversos procesos relacionados con la carcinogénesis. La activación de Src se asocia a un fenotipo tumoral más agresivo. En modelos preclínicos la activación de Src induce quimiorresistencia que puede revertirse farmacológicamente con inhibidores específicos de Src.  pSrc se expresa en aproximadamente un 54% de los pacientes con CCR estadío II y III (en un 9% de los casos la expresión es alta (+3)) y en un 53% de los pacientes con CCR estadío IV (en un 5% de los casos la expresión es alta (+3)).  La alta expresión de Src activado o pSrc (+3) confiere un peor pronóstico a los pacientes con CCR localizado en términos de SLE y SG, independientemente del tratamiento adyuvante recibido y de otros factores clínico-patológicos de conocida relevancia pronóstica para este tumor.  La expresión de pSrc (1-3) se asocia en CCRm con una tendencia a una menor TRO y peor pronóstico tanto en términos de SLP como de SG.  En nuestro estudio hemos identificado pSrc como un nuevo biomarcador pronóstico en CCR, que permite identificar un subgrupo de pacientes con peor supervivencia potencialmente tributarios de nuevas estrategias terapéuticas, ya que Src es una tirosina quinasa susceptible de inhibición farmacológica.  En nuestro estudio no se ha confirmado la sobre-expresión de pSrc como factor predictivo de resistencia a QT basada en oxaliplatino en CCR estadíos II-IV. 92 93 ANEXO: PUBLICACIONES 94 ANEXO: PUBLICACIONES 1. 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