Empleo de nanopartículas metálicas para la detección de tensioactivos y biomoléculas

Lourdes Vergara O’Neale Facultad de Farmacia 2 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Trabajo de Fin de Grado Grado en Farmacia “EMPLEO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA LA DETECCIÓN DE TENSIOACTIVOS Y BIOMOLÉCULAS” Lourdes Vergara O’Neale Tutora: Elia María Grueso Molina Departamento de Química Física Tipología del trabajo: Bibliográfico Portada (Adaptada de Railsback et cols., 2012). 3 Agradecimientos Mi agradecimiento a la Dra. Elia Mª Grueso Molina, profesora contratada doctora de la Universidad de Sevilla, por guiarme en la elaboración de este trabajo. A mis padres, por su incondicional apoyo durante todos estos años. 4 INDICE RESUMEN ................................................................................................................... 6 INDICE DE ABREVIATURAS.................................................................................... 7 1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 11 1.1.- Nanopartículas ................................................................................................ 11 1.2.- Tensioactivos .................................................................................................. 17 1.3.- Biomoléculas .................................................................................................. 22 1.3.1.- Ácidos nucleicos: ADN y ARN ................................................................ 22 1.3.2.- Lisozima .................................................................................................. 23 2.- OBJETIVOS .......................................................................................................... 26 2.1 Objetivo principal .............................................................................................. 26 2.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 26 3.- METODOLOGÍA .................................................................................................. 27 4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 28 4.1.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Tensioactivos ......... 28 4.1.1.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Tensioactivos Catiónicos ........................................................................................................... 32 4.1.2.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Tensioactivos Aniónicos ............................................................................................................ 38 4.1.3.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Tensioactivos No Iónicos ................................................................................................................ 38 4.2.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Biomoléculas ......... 39 4.2.1. Tipos de Nanopartículas empleadas para la detección de Biomoléculas ..... 39 4.2.2. Modos de unión de las nanopartículas con los ácidos nucleicos y proteínas ... 42 4.2.3. Termodinámica de la Interacción de nanopartículas con los ácidos nucleicos y proteínas ................................................................................................................. 49 5 4.2.4. Aplicaciones de las nanopartículas como biosensores ................................ 50 4.3.- Empleo de sistemas tensioactivos/nanopartículas metálicas para la detección de biomoléculas ........................................................................................................... 53 5.- CONCLUSIONES ................................................................................................. 55 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 57 6 RESUMEN Actualmente, las nanopartículas juegan un papel muy importante en el campo de la investigación científica debido a la gran variedad de aplicaciones en distintas áreas tales como la farmacología, la medicina, la industria alimentaria, la tecnología, o la biología. Las nanopartículas más estudiadas con este fin son aquellas formadas por materiales metálicos. De entre todos los metales nobles, el oro destaca por sus interesantes propiedades ópticas, magnéticas, eléctricas, catalíticas, biocidas y antimicrobianas. Dentro del grupo de las nanopartículas metálicas pueden encontrarse nanopartículas de distinto tamaño, funcionalizadas con un amplio abanico de ligandos (anticuerpos, polímeros, sondas de diagnóstico, fármacos, material genético…). Por todo ello, las nanopartículas despiertan un gran interés y resultan especialmente prometedoras. En este trabajo de revisión bibliográfica, analizaremos en primer lugar las propiedades más interesantes de las nanopartículas, así como de los principales tensioactivos y biomoléculas. Por otro lado, estudiaremos la eficacia de los métodos colorimétricos basados en nanopartículas metálicas para la detección de tensioactivos y biomoléculas, en comparación con otras técnicas de análisis más tradicionales. Finalmente, se describe la eficacia de los sistemas que combinan nanopartículas y tensioactivos para la detección de biomoléculas. PALABRAS CLAVES: Nanopartículas, Tensioactivos, ADN, Análisis colorimétrico, Sensor. 7 INDICE DE ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico ARN: Ácido ribonucleico ARNm: ARN mensajero ARNr: ARN ribosómico ARNt: ARN transferente AgNO3: Nitrato de plata AgNPs: Nanopartículas de plata AuNPs: Nanopartículas de oro Au@AO-TEG: Nanopartícula de oro recubierta por naranja de acridina y trietilenglicol Au@AO-PEG: Nanopartícula de oro recubierta por naranja de acridina y polietilenglicol Au@citrato: Nanopartícula de oro recubierta por citrato Au@CALNN: Nanopartícula de oro recubierta por cisteína-alanina-leucina-asparaginaasparagina Au@malato: Nanopartícula de oro recubierta por malato Au@tartrato: Nanopartícula de oro recubierta por tartrato 8 Au@tiopronin: Nanopartícula de oro recubierta por tiopronina BMLs: Biomoléculas BZKB: Bromuro de benzalconio C10TAB: Bromuro de deciltrimetilamonio C18TAB: Bromuro de octadeciltrimetilamonio CE: Electroforesis capilar CMC: Concentración Micelar Crítica CPC: Cloruro de cetilpiridino CTAB: Bromuro de cetiltrimetilamonio DBA: Aptámero de unión a la dopamina DDAB: Bromuro de didodecildimetilamonio ds-poli-AT: ARN de doble cadena de pares de bases adenina-timina. DTAB: Bromuro de dodeciltrimetilamonio ELISA: Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura FeCl3: Cloruro de hierro 9 GC-MS: Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución HAuCl4: Ácido tetracloroáurico LAS: Sulfonato de dodecilbenceno de sodio NaBH4: Borohidruro sódico NAG: N-acetilglucosamina NAM: Ácido N-acetilmurámico NaOH: Hidróxido de sodio NIR: Espectroscopía de Infrarrojo cercano NMR: Resonancia Magnética Nuclear NPs: Nanopartículas OTA: Ochratoxin A PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PfLDH: Plamodium falciparum Lactato deshidrogenasa PvLDH: Plasmodium vivax Lactato deshidrogenasa 16 entre el haz de luz y los electrones en la superficie de la nanopartícula (Criado y cols., 2007). El hecho de tener estos sistemas un espacio reducido para el movimiento de los electrones, hace que las propiedades electrónicas cambien drásticamente, dando lugar a nuevas aplicaciones de gran interés (Astruc y Didier, 2004). Figura 2. Imagen representativa de la orientación de los electrones de los átomos de la superficie de la nanopartícula como consecuencia de la incidencia de luz de una determinada frecuencia (Hammond y cols., 2014). La oscilación dipolar está entonces en resonancia con la radiación incidente a una frecuencia específica que depende tanto del tamaño, como de la forma de las nanopartículas. La región de longitudes de onda a la que se obtiene dicha resonancia se la conoce como banda de absorción o resonancia plasmónica (Cao, 2004). Para algunos metales como el cobre, oro o plata, la frecuencia de resonancia del plasmón aparece en el rango visible del espectro, y ésta es la razón por la que las disoluciones coloidales de estos metales muestran colores espectaculares e intensos. Por otro lado, las nanopartículas de metales de transición exhiben propiedades catalíticas frente a muchas reacciones orgánicas con alta actividad y selectividad, utilizándose en disolución (catálisis homogénea) o adsorbidas sobre un soporte sólido, como silica o alúmina (catálisis heterogénea). Su alta eficiencia catalítica se explica en función de su alta relación superficie/volumen en comparación con otros sistemas como mencionamos anteriormente (Li y cols, 2011) (Durand y cols, 2008). 17 1.2.- Tensioactivos Los tensioactivos llamados también surfactantes o agentes de superficie activa, se definen como sustancias que reducen la tensión superficial de un líquido, y que sirven como agente humectante o detergente. El término surfactante, es un anglicismo del termino anglosajón “Surface Active Agent” (Agente Activo de Superficie). Del mismo modo, se define tensión superficial como la acción de las fuerzas moleculares, en virtud de la cual, la capa exterior de los líquidos tiende a contener el volumen de estos dentro de la mínima superficie. En cuanto a su estructura la constitución química de un tensioactivo comprende grupos hidrofílicos y grupos hidrofóbicos (Myers, 1998), véase Figura 3. Figura 3. Esquema general de la estructura química de un tensioactivo. En disolución acuosa, la parte hidrofílica de la molécula interacciona más favorablemente con medios polares, mientras que la parte hidrofóbica lo hace con moléculas apolares. Atendiendo a la naturaleza de su grupo hidrófilo, los tensioactivos se pueden clasificar en no iónicos, catiónicos, aniónicos y anfóteros (Cantarero, 2010). Los tensioactivos aniónicos son aquellos que en disolución se ionizan, quedando cargados negativamente. Se emplean en la formulación de detergentes de uso doméstico e industrial. Son del tipo: sulfonato, sulfato, fosfato, sulfosuccinato, sulfoacetato, derivados de aminoácidos, etc. Los tensioactivos no iónicos en disolución acuosa no se ionizan, ya que poseen grupos hidrófilos del tipo alcohol, fenol, éter o amida. Algunos de estos surfactantes pueden 18 tornarse relativamente hidrofílicos por la presencia de una cadena poliéter del tipo polióxido de etileno. El grupo hidrófobo suele ser un radical alquilo o alquilbenceno y a veces una estructura de origen natural como un ácido graso, sobre todo cuando se requiere una baja toxicidad. Los tensioactivos no iónicos gracias sus características se pueden usar como materias primas, como base para la formulación de diversos productos para la industria de la agricultura, curtido, látex, textiles, procesos de metales, pinturas en emulsión, petróleo, pulpa y papel, limpiadores. Los tensioactivos catiónicos son aquellos que en disolución se ionizan, y el grupo hidrófobo queda cargado positivamente. Generalmente, están formados, al menos, por una cadena de 8 a 25 átomos de carbono, derivada de ácidos grasos o de un derivado petroquímico, un nitrógeno cargado positivamente. Además, suelen estar constituidos por una cadena larga de sales de amonio cuaternarias o sales de alquilaminas. Son muy relevantes en la industria por su eficiencia bactericida, germicida, algicida, etc. Algunos ejemplos son: metosulfato, derivados de imidazolina, óxidos de amina y sales de aminas. Los tensioactivos anfóteros resultan de la combinación dentro de una misma molécula de dos caracteres: aniónico y catiónico. Algunos de estos tensioactivos son insensibles al pH, otros son catiónicos a pH ácido, y otros de tipo aniónico a pH alto. Estos tensioactivos son en general bastante caros, por lo que su ámbito de aplicación es más reducido. Algunos ejemplos de ellos son aquellos que contienen aminoácidos, betaínas o los fosfolípidos en su estructura. Hace más de tres décadas surgieron los tensioactivos poliméricos que se sintetizan por asociación de estructuras polimerizadas de tipo hidrofílico o lipofílico, en forma de bloques o de injertos. Se suelen utilizar en procesos donde están involucradas macromoléculas naturales como en la deshidratación del petróleo (Salaguer, 2002). Respecto a las propiedades generales de los tensioactivos es importante destacar las siguientes (Cantarero, 2010): 1.- Compuestos anfifílicos Son aquellos que contienen en su molécula uno o varios grupos polares y uno o varios grupos no polares, que suelen ser cadenas hidrocarbonadas solubles en disolventes 19 orgánicos; y un grupo iónico soluble en agua. Debido a su estructura, cuando se pone en contacto una cantidad muy pequeña de tensioactivo con el agua aparecen dos tendencias opuestas; por una parte, el grupo hidrofílico del tensioactivo tiende a situarse en el interior del medio acuoso; y por otra, las moléculas de agua tienden a expulsar del medio acuoso las cadenas hidrófobas. 2.- Humectabilidad Constituye un mecanismo fundamental que interviene en la mayor parte de las aplicaciones que implican a los agentes tensioactivos. Es una característica que depende de las propiedades superficiales. 3.- Poder espumante La espuma se puede definir como un conjunto de celdas gaseosas separadas por láminas delgadas de líquido. La formación de espuma depende también de las propiedades superficiales de las disoluciones de los agentes tensioactivos. 4.- Formación de micelas Cuando un compuesto anfifílico se encuentra en disolución acuosa, para evitar la interacción desfavorable entre la parte hidrófoba y el disolvente, además de adsorberse en la interfaz, existe otra alternativa que es la de asociarse entre sí formando agregados moleculares, iónicos o mixtos llamados micelas, que se forman por encima de una cierta concentración, denominada concentración micelar crítica (C.M.C.) (Cantarero, 2010). Existen diferentes tipos de micelas, cuyas estructuras van a depender del balance entre la parte hidrófila y lipófila que prevalezca en la molécula del tensioactivo. Así, encontramos, micelas inversas, en las que las colas de hidrocarburos (región hidrofóbica) están orientadas hacia la fase oleosa, mientras que los grupos polares (región hidrofílica) se encuentran en el interior de la micela, disueltos en agua u otro disolvente polar confinado en su interior (véase figura 4a). O bien, podemos encontrar las micelas directas, en las que la parte hidrofílica está en contacto con la disolución, mientras que la parte hidrofóbica lo hace hacia el interior de la estructura micelar (Cruces, 1998) (véase figura 4b). 20 (a) (b) Figura 4. (a) Micela inversa formada en un disolvente orgánico apolar. Los grupos polares del tensoactivo se orientan en el interior acuoso, mientras que sus cadenas hidrofóbicas están en contacto con el disolvente apolar (externo). (b) Micela directa formada en una disolución acuosa. Los grupos polares de las moléculas del tensoactivo están en la superficie en contacto con la fase acuosa y las regiones hidrocarbonadas, se encuentran en el interior de la micela. Existen múltiples usos y aplicaciones para los tensoactivos, entre los cuales destacan las siguientes recogidas en la Tabla 1: APLICACIONES Y USOS DE LOS TENSIOACTIVOS Emulsificantes Teñido Dispersantes Blanqueado Mojado Suavizantes Espumado o rompimiento de espuma Lubricantes Impermeabilizantes Humectante Germicidas Detergencia Insecticidas Engrase y desengrase Tabla 1. Algunos usos y aplicaciones de los tensioactivos (Solé, 2014). Por último, es interesante hacer una pequeña mención a los tensioactivos geminis. Los tensioactivos geminis constituyen un grupo de sustancias anfifílicas que poseen dos o más grupos polares, y dos o más cadenas hidrófobas. Mientras que las moléculas de los tensioactivos convencionales contienen una o dos cadenas hidrocarbonadas unidas a un 21 mismo grupo polar. Algunas características estructurales de los tensioactivos geminis son las siguientes (Antelo, 2008): 1.- Todos los tensioactivos geminis poseen al menos dos cadenas hidrófobas y dos grupos iónicos o polares. 2.- El puente entre dichas cadenas puede ser corto (dos grupos metileno) o largo (doce grupos metileno); rígido (benceno) o flexible (cadena de metilenos); polar (poliéter) o no polar (alifático, aromático), y puede servir para unir las cabezas polares o átomos de carbono de la cadena hidrocarbonada próximos a ellas. 3.- El grupo polar puede ser positivo (amonio), negativo (fosfato, sulfato, carboxilato), no iónico (poliéter, azúcar) o zwitteriónico. La mayor parte de los tensioactivos geminis poseen moléculas simétricas, es decir, con los grupos polares iguales, e idénticos grupos no polares. Sin embargo, también se han sintetizado tensioactivos geminis con distintos grupos polares y con cadenas hidrocarbonadas diferentes (véase Figura 5). Figura 5. Algunos ejemplos de surfactantes tipo gemini sintetizados hasta la actualidad: (a) tensioactivo gemini aniónico, (b) tensioactivo gemini zwitterionico, (c) tensioactivo gémini tetrámero catiónico, (d) tensioactivo gémini no iónico (Antelo, 2008). Finalmente, cabe mencionar algunas propiedades de este tipo particular de surfactantes: (i) la CMC de los tensioactivos geminis es menor que la de los tensioactivos ordinarios homólogos en uno o dos órdenes de magnitud. Una de las posibles razones de 22 esta disminución en el valor de la CMC es que se ha encontrado que hay un mayor empaquetamiento de los grupos hidrófobos de los gemini en la interfase aire-agua con respecto a los surfactantes convencionales; (ii) por otra parte, los tensioactivos geminis poseen una capacidad para disminuir la tensión superficial del agua que es de hasta tres órdenes de magnitud superior a la de los tensioactivos ordinarios. Cuando el grupo que actúa como puente es pequeño o hidrófilo, el acomodamiento de los grupos lipófilos en la interfase aire-agua es más compacto que en los tensioactivos convencionales y, por lo tanto, la concentración del tensioactivo en esa interfase es mayor, lo que causa una mayor disminución de la tensión superficial (Antelo, 2008). 1.3.- Biomoléculas 1.3.1.- Ácidos nucleicos: ADN y ARN Los ácidos nucleicos se pueden definir como biopolímeros de elevado peso molecular formados por otras subunidades estructurales o monómeros denominados nucleótidos. Son las biomoléculas portadoras de la información genética (Burriel, 2010). De acuerdo a la composición química, los ácidos nucleicos se clasifican en ácidos ribonucleicos (ARN) y en ácidos desoxirribonucleicos (ADN), que se encuentran en todos los tipos celulares. Los nucleótidos son las unidades básicas que forman los ácidos nucleicos como se mencionó anteriormente. Cada nucleótido está constituido por tres componentes: 1.- Una molécula de pentosa (polisacárido con 5 átomos de carbono). El ADN contiene en su estructura la desoxirribosa, mientras que el ARN está formado por ribosa. 2.- Una molécula de ácido fosfórico. 3.- Una base heterocíclica nitrogenada. Éstas últimas son las responsables a través de la secuencia y de los acoplamientos, de la conservación y transmisión de la información genética. Las bases nitrogenadas se clasifican en púricas y pirimidínicas. En el ADN, las bases púricas son la adenina y la guanina, mientras que las bases pirimidínicas son la citosina y la timina; en el ARN, el uracilo sustituye a la timina (Burriel, 2010). Los átomos de oxígeno y de nitrógeno de las bases pueden actuar como donadores o aceptores, y formar puentes de hidrógeno, interacción fundamental que mantiene unida la doble hélice. 23 Los ácidos nucléicos pueden formar diferentes estructuras en el ADN. La estructura primaria está definida por su estructura de enlaces covalentes y la secuencia de nucleótidos. Ésta determina la configuración de la macromolécula. Por otra parte, la estructura secundaria y terciaria establece la configuración de la macromolécula. La doble hélice se mantiene estable, principalmente, por dos tipos de fuerzas: (i) los enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarias de las dos cadenas; y (ii) las interacciones de apilamiento de las bases (interacciones “π-stacking”), a través de las cuales los pares de bases se encuentran parcialmente superpuestos, de forma que esta disposición favorece las interacciones de apilamiento de parejas de base situadas entre planos vecinos (Robertazzi y cols., 2006). En la actualidad, el ADN juega un papel muy importante en la tecnología, y se ha convertido en un mecanismo para estudiar y entender los procesos de la vida, en la medicina, biología y en otras ramas de la ciencia. Por otro lado, el ARN interviene junto al ADN en la síntesis de proteínas y del traslado de la información genética del ADN. El ARN copia la información de cada gen del ADN y luego esta pasa al citoplasma, donde se une al ribosoma para dirigir la síntesis proteica. Existen diferentes tipos de ARN: el ARN mensajero (ARNm), conocido como ARN codificante, posee el código genético que determina el esquema de los aminoácidos para formar una proteína; el ARN transferencia (ARNt) se encarga de llevar los aminoácidos a los ribosomas con el fin de incorporarlos al proceso de síntesis proteica, asimismo, se encarga de codificar la información que posee el ARN mensajero a una secuencia de proteínas; y por último, el ARN ribosómico (ARNr) que forma parte de los ribosomas y actúa en la actividad enzimática, encargándose de crear los enlaces peptídicos entre los aminoácidos del polipéptido en el proceso de síntesis de proteínas (Gómez-Jarabo, 2012). 1.3.2.- Lisozima La lisozima, también conocida como muramidasa (N-acetil muramidaglicano hidrolasa, E. C. 3. 2.1. 17), fue descubierta en 1922 por Alexander Fleming (Carrillo, 2013), véase figura 6. La lisozima de clara de huevo (HEW) fue la primera proteína que fue secuenciada y que tenía los veinte aminoácidos convencionales, además de ser también la primera de la 24 que se obtuvo un análisis cristalográfico completo, y de la que se proporcionó un mecanismo de reacción detallado. Desde su descubrimiento esta proteína ha jugado un papel muy importante en los modelos enzimáticos, y en muchos aspectos de la biología moderna, incluyendo la química de proteínas, cristalografía, resonancia magnética nuclear (NMR), inmunología y plegamiento de proteínas.(Carrillo, 2013). La lisozima se encuentra en muchos organismos vivos. En los humanos, la lisozima juega un papel muy importante en la defensa frente a las infecciones. Por ejemplo, en las lágrimas se encuentra en cantidades comprendidas entre 3.000 y 5.000 μg/mL, y protege frente a bacterias y virus. En la saliva protege frente una gran variedad de microorganismos como bacterias, virus y hongos de diferentes especies de Candida. Además de la actividad antibacteriana, se han descrito muchas otras actividades biológicas de la lisozima como su actividad antiviral. La lisozima administrada por vía oral y cutánea previene enfermedades de la piel, como el herpes simple y la varicela, debido a su actividad antiinflamatoria (Carrillo, 2013). Organismos internacionales como la FAO/WHO y muchos países como Alemania, Austria, Australia, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Italia, Japón y Reino Unido tienen reconocida a la lisozima de clara de huevo como una proteína no tóxica, y por ello es utilizada para fines alimentarios, farmacológicos y terapéuticos. Así, se estima que más de 100 toneladas de lisozima se emplean anualmente para estos propósitos (Carrillo, 2013). En la industria farmacéutica, se emplea en el tratamiento de enfermedades bronco pulmonares, pastas dentales para prevención de caries, y en cremas de aplicación tópica. (Namba y cols, 1981). La lisozima es de la clase de enzimas que destruye las paredes celulares de ciertas bacterias Gram-positivas por ruptura del enlace β (1-4) entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y N-acetilglucosamina del peptidoglicano (NAG), debilitando así la pared celular (Carrillo, 2013). 25 Figura 6. Se muestra el sitio de corte de la lisozima en el peptidoglicano de la pared celular de las bacterias (Carrillo, 2013). El resultado es la penetración de agua en la célula que se hincha y acaba por estallar, teniendo lugar un fenómeno denominado lisis. En cambio, la lisozima es casi inactiva frente a microorganismos Gram-negativos, debidos a la dificultad para acceder al peptidoglicano, que se encuentra protegido por la membrana externa. Esta propiedad de hidrolizar el peptidoglicano se conoce como actividad neuraminidasa o muramidasa. De acuerdo con Jollés y Jollés (1984), las lisozimas se pueden clasificar en los siguientes tipos (Diez, 2014): 1.- Lisozima tipo C (“Chicken-type”): aunque las lisozimas más representativas de este tipo se encuentran en la clara de huevo de ciertas aves (pollo, pato) (véase Figura 7), en este grupo también pueden englobarse la lisozima procedente de la leche humana, de rata, etc. Todas ellas poseen alrededor de 130 aminoácidos, con cuatro puentes disulfuro. Poseen una cierta actividad de quitinasa, lo que posibilita la hidrólisis de polímeros compuestos únicamente de NAG. 2.- Lisozima tipo G (“goose-type”): esta clase de lisozimas tienen unos 185 aminoácidos y no dan reacción inmunológica cruzada con las de tipo C. También poseen cuatro puentes disulfuro. 3.- Lisozimas procedentes de bacteriofagos: el ejemplo más representativo lo constituye la lisozima codificada por el bacteriofago T4 (T4L). Esta lisozima tiene 164 aminoacidos y su secuencia no es homologa con las de las enzimas de tipo C. 32 En primer lugar, se muestran los resultados relativos a la detección de tensioactivos catiónicos empleando nanopartículas metálicas. 4.1.1.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Tensioactivos Catiónicos Como fue indicado anteriormente, el empleo de la técnica de espectroscopía de absorción UV-vis para la detección cuantitativa de diferentes analitos implica la determinación cuantitativa de la absorbancia de la muestra a una longitud de onda determinada a la que absorbe el analito, previo calibrado del sistema. Este es por tanto un método directo de cuantificación (véase la figura 9a). En cambio, cuando se extrapola este procedimiento a la detección de tensioactivos no coloreados, empleando nanopartículas metálicas, se procede mediante una determinación indirecta. Es decir, en lugar de seguir la banda del tensioactivo (en la mayoría no detectable por UV-visible, excepto en el caso de tensioactivos con grupos aromáticos en su estructura), es necesario seguir los cambios que se producen en banda SPR de la nanopartícula, así como en la longitud de onda del máximo, como consecuencia de la interacción de esta con el tensioactivo (véase figura 9b). Las características de la banda SPR de la nanopartícula depende del tipo de centro metálico, el tipo de ligando protector o estabilizante, del tamaño de las mismas y del medio (sales o codisolventes) que las rodean. Figura 9. (a) Gráfico representativo de la recta de calibrado de un analito coloreado cualesquiera para su determinación directa (Adaptada de Castellanos, 2013). (b) Espectros de absorción UV-vis del sistema Au@tartrato/CTAB, en función de la concentración de CTAB, empleados para la determinación indirecta del tensioactivo (Adaptada de Shrivas et cols., 2015). 33 Las nanopartículas empleadas para la detección de tensioactivos catiónicos son, por lo general, de carácter aniónico, es decir, su carga neta es negativa. En cuanto a su síntesis, desde un punto de vista químico, las nanopartículas en disolución (disolución coloidal) requieren del empleo de métodos que permitan obtener un control preciso sobre el tamaño y la forma de las nanopartículas para así obtener un conjunto de partículas monodispersas que presenten una propiedad determinada. En general, la síntesis de nanopartículas metálicas en disolución se lleva a cabo mediante el empleo de los siguientes componentes: a) Precursor metálico b) Agente reductor c) Agente estabilizante Destacan las de Au@citrato, cuya síntesis se basa en la reducción del ácido tetracloroáurico (HAuCl4) con el ligando protector, generalmente citrato trisódico, en medio acuoso. Las AuNPs obtenidas por este método tienen una cubierta de iones citrato en su superficie que puede ser fácilmente reemplazados o intercambiados por otro ligando. Otro método de síntesis habitual es la reducción de la mezcla Au/citrato, en las proporciones adecuadas, empleando NaBH4 como agente reductor, en presencia o no de un agente estabilizador como pueda ser el alcohol polivinílico. Además, son también frecuentes las nanopartículas de Au@malato y Au@tartrato cuya síntesis es equivalente (Shrivas et cols., 2015). Tanto la distribución de tamaño como el tamaño de la AuNPs pueden ser controlados por parámetros experimentales tales como el pH, la concentración de HAuCl4 y la relación de concentraciones Au/ligando. En el caso de las nanopartículas de plata existen dos métodos de síntesis característicos, que son: el método Lee-Meisel y el método Creighton. El primero consiste en una variación del método de obtención de nanopartículas de oro, en el que se emplea AgNO3 en lugar de HAuCl4 como precursor metálico, y citrato de sodio como agente reductor. Mediante este método se obtienen nanopartículas de plata con una distribución amplia de tamaño de partícula (polidispersas). El método Creighton consiste en la reducción de AgNO3 con el agente reductor NaBH4. Este método es el más utilizado en la actualidad y da lugar a la obtención de 34 nanopartículas de plata de aproximadamente 10 nm y con una distribución estrecha de tamaños (monodispersas) (Monge, 2009). La detección colorimétrica usando AuNPs se basa en la distancia de la resonancia del plasmón de superficie de AuNPs. Es por eso, que las AuNPs dispersas poseen un color que tiende más al rojo (amarillo, rosa, rojo) y un máximo de absorción alrededor de 520 nm, mientras que las AuNPs agregadas tienen un color más próximo al azul (verde, azul o púrpura), y la intensidad de absorción de la muestra a longitudes de onda superiores se incrementa. Por tanto, es fundamental en la detección colorimétrica lograr una interacción selectiva entre el analito y las AuNPs que induzca la agregación/desagregación del sistema. Existen dos estrategias básicas que han sido empleadas en dicha detección: (a) la agregación y (b) la desagregación inducida por el analito. La figura 10 muestra un esquema representativo de ambas estrategias. (a) (b) Figura 10. (a) Esquema representativo de un sistema de nanopartículas en estado agregado (b) Esquema de un sistema de nanopartículas en estado desagregado. A continuación, en la Tabla 3 se expone una comparativa entre el tamaño de las nanopartículas, el incremento de la longitud de onda observado y las CMC teóricas y experimentales de los diferentes tipos de tensioactivos más utilizados en diferentes estudios realizados hasta la fecha. 35 Tipo de Nanopartícula /Referencia Diámetro NPs (nm) Tensioactivo (T) ∆λmáximo (nm) [T]∆λmáximo (mM) CMCexp (mM) CMCt (mM)/ Referencia Au@citrato (Kuong et cols., 2007) (23  3) C10TAB 255.5 5.0 50 - 100 65 (Lee, 2011) Au@citrato (Kuong et cols., 2007) (23  3) DTAB 253.7 0.5 10 - 50 14.6–16.0 (Aguiar et cols.,2003) Au@citrato (Kuong et cols., 2007) (23  3) TTAB 226.5 0.1 1.0 – 5.0 3.60–3.72 (Aguiar et cols.,2003) Au@citrato (Kuong et cols., 2007) (23  3) CTAB 201.3 0.01 0.5 – 1.0 0.92–1.00 (Aguiar et cols.,2003) Au@citrato (Kuong et cols., 2007) (23  3) C18TAB 201.3 0.01 0.1 - 0.5 0.21 (Islam et cols., 2015) Au@citrato (Zheng et cols.,2014) 17 DTAB - 0.01 ‹ 0.1 14.6–16.0 (Aguiar et cols.,2003) Au@citrato (Zheng et cols.,2014) 17 CTAB - 0.001 0.1 0.92–1.00 (Aguiar et cols.,2003) Au@citrato (Zheng et cols.,2014) 17 BZKB - 0.003 0.1 4.80 (Mahmood et cols., 2016) Au@tartrato (Shrivas et cols., 2015) (4.4  1.0) CTAB 194 0.00137 < 0.00137 0.92–1.00 (Aguiar et cols.,2003) Au@tartrato (Shrivas et cols., 2015) (4.4  1.0) CPC 210 0.00056 <0.00056 1.24 (Ontiveros et cols.,2011) Au@tartrato (Shrivas et cols., 2015) (4.4  1.0) DTAB 202 0.00097 <0.00097 14.6–16.0 (Aguiar et cols.,2003) Tabla 3. Análisis comparativo de distintos parámetros para la detección de algunos de los tensioactivos más comunes en diferentes estudios, donde CMCexp y CMCt corresponden a la concentración micelar crítica experimental y teórica. 36 Tras el análisis de la Tabla 3, pueden extraerse una serie de conclusiones interesantes. En primer lugar, la discusión se centrará en la detección del tensioactivo como monómero, y en segundo lugar en la detección de la CMC del tensioactivo, y por tanto, de la formación de estructuras micelares. Para caracterizar la detección del tensioactivo en forma monómero se han tenido en cuenta dos parámetros: (i) ∆λmáximo, es decir, el incremento entre la longitud de onda del máximo de absorción de la nanopartícula libre (en ausencia de tensioactivo), que proporciona disoluciones de color rojo) y el valor de la longitud de onda del máximo de absorción de la banda, que surge como consecuencia de la interacción del tensioactivo monómero con la nanopartícula en su estado más agregado (disoluciones color azul) (véase figura 11); y (ii) la concentración de tensioactivo a la cual se produce incremento de longitud de onda máximo, anteriormente descrito ([T]∆λ máxima). Figura 11. Representación gráfica del incremento de longitud de onda máximo (∆λmax) (Adaptada de Duymovich et cols., 2005). Estos dos parámetros dan cuenta de cuál es el sistema de nanopartícula, en cuanto a tamaño, naturaleza del centro metálico y del ligando protector más idóneos para lograr una determinación más sensible del tensioactivo en forma monómero. Teniendo en cuenta estas premisas, y atendiendo a los datos recogidos en la Tabla 3, se puede extraer la siguiente información: 37 1.-Se deduce que las nanopartículas de Au@citrato de menor tamaño son más sensibles para la detección de los tensioactivos de cadena alifática DTAB y CTAB. Así, las nanopartículas Au@citrato de diámetro (23  3) nm detectan al tensioactivo DTAB y CTAB a una concentración de 0.5 y 0.01 mM, respectivamente, en comparación con la mayor concentración de tensioactivo requerida en el caso de las nanopartículas de estructura equivalente y tamaño inferior (17 nm). Es importante destacar que no es posible extraer información en este caso del incremento de longitud de onda producido al no existir datos disponibles en la bibliografía en el caso de las nanopartículas de Au@citrato de 17 nm. 2.- Cuando se compara el sistema Au@tartrato con el sistema Au@citrato para la detección de DTAB y CTAB, se concluye que el sistema Au@tratrato es más sensible a la detección de estos tensioactivos en forma monómero. De esta forma para incrementos de longitud de onda máximo muy similares en ambos sistemas, se observa el máximo de agregación del sistema a una concentración de tensioactivo dos órdenes de magnitud más pequeña en el caso de las nanoparículas Au@tartrato respecto a la que presenta el sitema Au@citrato. Nótese en este caso que estos sistemas son diferentes en cuanto a las características del ligando protector que recubre el oro, y también en cuanto al tamaño del sistema. Por consiguiente, de nuevo, las nanopartículas de menor tamaño proporcionan límites de detección inferiores. 3.- Por otro lado, haciendo referencia únicamente a los tensioactivos pertenecientes al grupo de los bromuros alquiltrimetilamonio, se observa que para un mismo sistema de nanopartículas, se obtiene un nivel de detección más sensible en el caso de los tensioactivos que poseen una mayor longitud en su cadena carbonada. Así, a medida que aumenta el número de carbonos de la cadena carbonada, el ∆λmáxima es mayor, a la vez que [T]∆λ máxima disminuye. Esta secuenciación es equivalente independientemente del tamaño de la nanopartícula y de la naturaleza del ligando protector. 4.- Finalmente, en cuanto al cálculo de la CMC, vemos como la CMC experimental, obtenida mediante análisis colorimétrico, se encuentra dentro de los rangos establecidos por la CMC teórica, obtenida por otras técnicas más convencionales de análisis, como HPLC o medidas de conductividad o de tensión superficial, señaladas en las referencias adjuntas a la Tabla. Es importante destacar como los datos de la CMC experimental 38 obtenidos por el método colorimétrico para las nanopartículas Au@citrato de mayor diámetro son los más próximos al valor de la CMC teórica. 4.1.2.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Tensioactivos Aniónicos En este caso se encuentran muy escasas referencias en la bibliografía. Destaca sin embargo, un estudio en el que se demostró que la determinación de los tensioactivos aniónicos en agua, se basa en la formación de pares iónicos de dichos tensioactivos con el colorante azul de metileno (C16H18N3ClS). Se comprobó que las nanopartículas magnéticas recubiertas con poli (ácido acrílico) de magnetita (PPA@Fe3O4) podían adsorber el colorante azul en agua rápidamente y se producía un cambio obvio en la absorción óptica que varía de 662 hasta 590 nm, esto muestra la separación espectral entre el tinte y el par de iones. La detección se basa en que el color o la longitud de onda de absorción del azul de metileno cambian cuando se une al carboxilo de las nanopartículas (Wei y Mo, 2014). En conclusión, los tensioactivos aniónicos en agua pueden ser determinados directamente sin extracción y/o separación mediante el uso del colorante azul de metileno y las nanopartículas magnéticas modificadas. Las propiedades únicas de las nanopartículas magnéticas, incluyendo el superparamagnetismo y la alta capacidad de adsorción, son una alternativa eficaz a los materiales convencionales utilizados en la preparación de la muestra y la eliminación de contaminantes. Uno de los métodos de síntesis más común utiliza FeCl3 como fuente de los átomos de hierro y se descompone con dietilenglicol en presencia de PAA (ácido poliacrilacrílico) y NaOH que cataliza la reacción. La síntesis de las nanopartículas PAA@ Fe3O4 tiene una buena dispersabilidad y un tamaño promedio de 9 nm. El tensioactivo aniónico que se utilizó en este trabajo es el sulfonato de dodecilbenceno de sodio (LAS) (Wei y Mo, 2014). 4.1.3.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Tensioactivos No Iónicos En la actualidad, no consta bibliografía suficiente para desarrollar este apartado, pero si se mencionan algunos ejemplos de tensioactivos no iónicos en trabajos relacionados 39 con la detección de tensioactivos catiónicos y aniónicos como Tween 20, Brij-35, TritónX100 o Tritón-X114 (Kuong et cols., 2007), (Shrivas et cols., 2015). Los tensoactivos no iónicos están formados por una cadena alquílica larga y un grupo sin carga pero muy polar. Los grupos polares más utilizados son: polioles (a veces azúcares naturales), polioxietilenos (éteres de polialcohol), diaminas y aminas etoxiladas. Estos tensoactivos no producen iones en disolución acuosa y por este hecho son compatibles con cualquier otro tipo de tensioactivos. 4.2.- Empleo de Nanopartículas Metálicas para la detección de Biomoléculas El empleo de nanopartículas como marcadores o sensores para la detección de biomoléculas en lugar de moléculas o marcadores fluorescentes convencionales es un tema de interés reciente (Tansil y Gao, 2006). Estos avances han conducido a una mejora significativa tanto en selectividad, sensitividad como en la capacidad de formación de complejos biomolécula-receptor. En este apartado del trabajo de revisión se resumirán los últimos sistemas de nanopartículas empleados en la detección de biomoléculas, así como los diferentes modos de unión de las nanopartículas con biomoléculas como el ADN y el ARN, algunos parámetros termodinámicos de la interacción nanopartícula-biomolécula extraídos de los últimos estudios, y finalmente algunas de las aplicaciones más relevantes estudiadas hasta la fecha. 4.2.1. Tipos de Nanopartículas empleadas para la detección de Biomoléculas Como se ha mencionado anteriormente en este trabajo, las nanopartículas pueden encontrarse desnudas o sin funcionalizar (“naked nanoparticles”) o funcionalizadas con diferentes tipos de ligandos (“functionalized nanoparticles”). La funcionalización de las AuNPs con proteínas, péptidos y oligonucleótidos ha permitido el desarrollo de nuevos sensores para la detección altamente sensible de estas biomoléculas y las interacciones biomoleculares. Así en la bibliografía puede distinguirse entre: 1.- Funcionalización de las AuNPs con péptidos y proteínas (Zhang et cols., 2016). Se estudiaron las cuatro estrategias principales para el enlace de una proteína o un péptido a las AuNPs: 40 a) Absorción electrostática. b) Conjugación con un ligando en la superficie de la AuNP. c) Conjugación a una molécula cofactor pequeña que la proteína puede reconocer y unir. d) Conjugación directa a la superficie de la AuNP. 2.- Funcionalización de las AuNPs con ácidos nucleicos (Zhang et cols., 2016). El uso de ácidos nucleicos en combinación con AuNPs ha abierto nuevos horizontes para la detección de diferentes analitos. Esta metodología se basa normalmente en el estudio del objetivo con aptámeros específicos, es decir, secuencias de ADN individuales o cadenas de ARN, y el cambio de configuración o conformación resultante de los aptámeros. Cabe mencionar que los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla (ssDNA y RNA) capaces de reconocer de forma específica y con alta afinidad a varios tipos de moléculas diana mediante un plegamiento tridimensional de su cadena. Generalmente son obtenidos mediante su selección desde genotecas de oligonucleótidos combinatoriales, mediante el método SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), que permitirá seleccionar aquel oligonucleótido de la genoteca utilizada que se une con más afinidad a la molécula diana. Esta metodología ha sido ampliamente estudiada y ha demostrado ventajas especiales 3.- Funcionalización con otro tipo de ligandos. La incorporación de un ligando apropiado puede modificar las propiedades físicas del material que forma la nanopartícula y mejorar sus aplicaciones. Bajo este punto de vista los dendrímeros son adecuados para promover ordenamientos definidos de los materiales y mejorar las características físicas (ópticas, magnéticas, etc.) de estos sistemas, debido principalmente a la capacidad de control de su estructura y composición. Los calixarenos, viológenos dicatiónicos y las α,ωdiaminas alifáticas lineales también son otros ejemplos de ligandos para la funcionalización de las nanopartículas (Guerrini, 2008). 41 A continuación se muestran algunos ejemplos de pequeñas moléculas e iones que se han detectado mediante un método colorimétrico utilizando AuNPs funcionalizadas con proteínas o ácidos nucleicos (Tabla 4): Tamaño NPs (nm) Analito Detección de la sonda y/o método Límite de detección (nM) Referencia 13 Melanina AuNPs funcionalizdas con HS-oligonucleótido 41.7 (Huang et cols., 2011) 13 Dopamina (DBA)“Dopamine binding aptamer”, aptámero de unión de la dopamina como un elemento de reconocimiento. 3.6·10-4 (Zheng et cols.,2011) 20 Cisteína Nanopartículas de Cisteína combinada con Hg2+,y AuNPs funcionalizadas con oligonucleótidos dispersas 100 (Lee et cols., 2008) 13 Kanamicina Kanamicina unida al conjugado AuNPsaptámero 25 (Song et cols., 2011) 13 Ochratoxina A OTA induce un cambio conformacional en su aptámero 20 (Yang et cols., 2011) 42 Hg2+,Pb2+, Cu2+ AuNPs recubiertas con papaína. 200 (Guo et cols., 2011) Tabla 4. Ejemplos de diferentes analitos detectados haciendo uso del método colorimétrico basado en AuNPs funcionalizadas con proteínas o ácidos nucleicos. Teniendo en cuenta los datos recogidos en la tabla 4, se procede a comentar una serie de cuestiones, como por ejemplo, que sistema es mejor para detectar biomoléculas, cuál es el tamaño de nanopartícula más adecuado para dicha detección, o como influye el analito. El límite de detección se define como la cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un método analítico determinado, por tanto, un valor menor del mismo indica una mayor sensibilidad de la técnica de detección. 48 La adenina tiene un grupo amino exocíclico situado en la sexta posición y un nitrógeno del anillo en la séptima posición, que permite una alta afinidad de absorción a través de fuerzas de absorción química. La unión tiene lugar a través de un mecanismo de coordinación que implica la interacción directa del nitrógeno del anillo de oro, con la contribución parcial del grupo amino exocíclico (Koo et cols., 2015). La afinidad de la adenina hacia el oro es tan alta que puede competir eficazmente con la unión estable de Watson-Crick para ds-poli-AT. Como resultado, en la proximidad de la superficie de oro, las secuencias de poli-A se absorben fuertemente como moléculas de hebra simple a pesar de la presencia de secuencias de poli-T complementarias. Las bases del ADN también interactúan con el oro a través del anillo aromático (Koo et cols., 2015). Varios estudios han confirmado que, excepto la adenina, todas las bases tienden a orientarse paralelamente a la superficie. Esta configuración permite la máxima superposición de las densidades electrónicas entre bases y oro para favorecer la transferencia de carga entre el anillo aromático y la superficie de oro (Demers et cols., 2002) (Piana y Bilic, 2006). 49 4.2.3. Termodinámica de la Interacción de nanopartículas con los ácidos nucleicos y proteínas Diámetro NPs (nm) Modo unión Tipo BMLs Kagua (M-1) ∆G (kJ) Método empleado en la cuantificación de K e ∆G Ref. Tipo de Nanopartículas Au@tiopronin 1.4 Intercalación o Enlaces de H. ADN 7.2 x105 -33.42 Cinético (PradoGotor y Grueso, 2011) 1.8 No electrostática ADN 6.40x105 -33.12 Espectroscopía (PradoGotor y Grueso, 2014) Au@AO-TEG 11.8±3.4 Intercalación o Unión externa ADN (K1) = 5.4x106 (K2) = 3.3x104 (K2’) =3.8x104 -38.40 -25.78 -26.13 K1 y K2: Espectrofotometría K2’:Espectrofluorometría (Biver et cols., 2011) Au@AO-PEG 3.9±1.0 Intercalación o Unión externa ADN (K1) = > 106 (K2) = < 105 (K2’) = 2x104 -24.54 K1 y K2: Espectrofotometría K2’:Espectrofluorometría (Biver et cols., 2011) Tabla 5. Parámetros termodinámicos de la interacción y características de diferentes nanopartículas de oro en su interacción con las biomoléculas. A continuación se exponen las conclusiones extraídas de la tabla 5. Se realiza una comparativa de los diferentes tipos de nanopartículas, los tamaños de estas, y el modo de unión al ADN. Por otra parte, se comenta cuál es el proceso mas favorecido en función de los valores de incremento de energía libre. En primer lugar, se observan tres tipos de nanopartículas de oro funcionalizadas con distintos ligandos (tiopronina, naranja de acridina y trietilenglicol o polietileglicol) que van a 50 unirse al ADN mediante diferentes modos de unión (intercalación, unión externa…). Las AuNPs presentan distintos tamaños, siendo Au@tiopronina la de menor valor. Por otro lado, en la tabla 5 se refleja tanto la constante de equilibrio (K) como el incremento de energía libre (∆G) obtenidos principalmente mediante métodos cinéticos y espectroscópicos. Así cuanto, más negativo es el valor de ∆G, y mayor en valor absoluto, más favorecido está el proceso de formación del complejo nanopartícula/ADN. De acuerdo con este razonamiento se concluye que las nanopartículas de Au@tiopronina son las que se unen más favorablemente al DNA. También podemos concluir, de forma general, que cuanto menor es el tamaño de la nanopartícula, más favorecida en la unión con el ADN. 4.2.4. Aplicaciones de las nanopartículas como biosensores Las nanopartículas de metales nobles (NPs) están teniendo un papel importante en el desarrollo de nuevos biosensores y / o en la mejora de las técnicas de biosensores existentes para satisfacer la demanda de los diagnósticos biomoleculares más específicos y altamente sensibles. Las propiedades fisicoquímicas únicas de estos metales en la nanoescala han llevado al desarrollo de una amplia variedad de biosensores, tales como: (i) nanobiosensores para el diagnóstico de una enfermedad , (ii) nanosondas para detección / formación de imágenes in vivo, el rastreo celular y el seguimiento de la patogénesis de las enfermedades o la monitorización de la terapia y (iii) otras herramientas basadas en la nanotecnología que benefician a la investigación científica sobre la biología básica (Doria et cols., 2012). Se han desarrollado numerosas técnicas para sintetizar NPs de metales nobles, con inclusión de métodos químicos (por ejemplo, reducción química, reducción fotoquímica, co-precipitación, descomposición térmica, hidrólisis, etc.) y métodos físicos (por ejemplo, deposición de vapor, ablación por láser, pulido, etc. .), cuyo objetivo final es la obtención de las NPs con un buen nivel de homogeneidad y proporcionar un control preciso sobre el tamaño, la forma y las propiedades superficiales, con el fin de aprovechar mejor sus propiedades físico-químicas únicas para los biosensores (Doria et cols., 2012). 51 Existen una variedad de métodos de biosensores de alta sensibilidad para los ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, enzimas y otras moléculas biológicas mediante la exploración de diferentes propiedades fisicoquímicas de las NPs de metales nobles, tales como Resonancia del plasmón de la superficie (SPR), Espectroscopía Raman Amplificada en Superficie (SERS), la actividad electroquímica, etc. Entre estos métodos biosensores, el enfoque colorimétrico han sido el más explorado y, debido a su simplicidad y portabilidad, es el más prometedor para futuros métodos de diagnóstico. Las NPs de plata y de oro son las más utilizadas en el desarrollo de técnicas de biosensores, ya que estas presentan propiedades ópticas únicas dentro de la gama de longitudes de onda visibles y son fáciles de sintetizar y funcionalizar. En menor medida las NPs de platino también se han utilizado por sus propiedades eléctricas únicas. En la tabla 6 se recogen algunos ejemplos de muestras biológicas reales detectadas empleando biosensores basados en nanopartículas de metales nobles de acuerdo con el tipo de NPs y el principio de metodología utilizado (Doria et cols., 2012). 52 Método Tipo NPs Muestra Referencia Colorimétrico Oro Mutaciones en el gen EGFR del ADN genómico (Lee et cols., 2010) Hepatitis C, virus RNA (Shawky et cols., 2010) Melanina en la leche entera (Wei et cols., 2010) Oro/ aleación Plata Gen TP53 (Doria et cols., 2010) Genes de fusión BCRABL (Baptista et cols., 2011) NIR Oro Células cancerígenas de próstata de ratón (Agarwal et cols., 2007) Ganglios linfáticos en ratones (Pan et cols., 2010) Vasos cerebrales en ratones (Wang et cols., 2004) SERS Oro Glucosa en rata (Stuart et cols.,2005) ADN del patógeno múltiple en muestras clínicas (líquido cefalorraquídeo, heces, pus y los esputos) (Kang et cols., 2010) Plata Glucosa en rata (Yuen et cols.,2010) Oro / Núcleo de Plata Biomarcador de proteína fosfolipasa Cγ1 en las células cancerosas (Lee et cols., 2007) Fluorescencia Oro Proteína de choque térmico en cultivos de sangre infectados por Plasmodium falciparum (Guirgis et cols., 2011) Plata Imágenes de la membrana celular en las líneas celulares (Zhang et cols., 2010) Eléctrico/ Electroquímico Oro Salmonella spp. en muestras de carne de cerdo (Yan et cols., 2009) IgG humano en suero humano (Tian et cols., 2009) Factor de necrosis tumoral α (TNF-a) en suero humano (Yin et cols., 2011) Plata α-1-fetoproteína (AFP) en suero humano (Che et cols., 2010) Tabla 6. Resumen de los diferentes tipos de muestras biológicas reales que han sido detectados empleando biosensores basados en NPs de metal noble, de acuerdo a su principio de metodología (Adaptada de Doria et cols., 2012). 53 Una cuestión clave a tener en cuenta en la integración de la plataforma de biosensores es la creciente demanda de una mayor sensibilidad y selectividad a un costo mínimo, y la posibilidad de controlar los biosensores en tiempo real, sobre todo para las plataformas de cuidado, para lo cual también hay que tener en cuenta la simplicidad. Teniendo en cuenta esto, los enfoques colorimétricos y electroquímicos son los más prometedores debido a su simplicidad, alta sensibilidad y especificidad, además del hecho de que en la mayoría de los casos simplemente no requieren instrumentación costosa y compleja para lograr una respuesta adecuada. 4.3.- Empleo de sistemas tensioactivos/nanopartículas metálicas para la detección de biomoléculas En este último apartado, se proporcionan algunos datos sobre los avances más recientes en el desarrollo de biosensores basados en el empleo de sistemas combinados tensioactivos/nanopartículas para la detección de biomoléculas. Esta técnica está actualmente en desarrollo y se dispone de una escasa bibliografía para su análisis. Entre ellos destacan dos artículos recientes en los que se pretende desarrollar un biomarcador para la malaria. La malaria se diagnostica generalmente mediante técnicas convencionales como la microscopía, ELISA, PCR o mediante pruebas de diagnóstico rápido. Sin embargo, cada uno de estos métodos presentan algunas limitaciones. El método de microscopía por ejemplo, requiere de un personal altamente cualificado, con experiencia y el procedimiento para la preparación de las muestras es complicado. Por otra parte, las pruebas de diagnóstico rápido disponibles en el mercado son poco sensibles y resultan inespecíficas a bajas concentraciones de parásitos (Jain et cols.,2016). Además tienen un bajo rendimiento debido a la humedad y a las altas temperaturas empleadas, ya que utilizan anticuerpos como biomarcadores (Lee et cols., 2014). Debido a estas limitaciones, se propone un nuevo método rápido y eficaz para la detección de la malaria. Los anticuerpos utilizados como biomarcadores serán sustituidos por aptámeros, éstos tienen muchas ventajas como su fácil análisis, una alta especificidad, estabilidad térmica y una sencilla síntesis química. 54 Los aptámeros como se mencionó anteriormente son oligonucleótidos de cadena simple que se unen de forma específica a la molécula diana y que se seleccionan a partir de una “biblioteca” de secuencias (SELEX) (Jain et cols., 2016). Se desarrollaron dos tipos de biomarcadores (proteínas recombinantes) para la detección de la malaria: Plasmodium vivax LDH (PvLDH) y Plasmodium falciparum LDH (PfLDH) mediante el uso de SELEX (Lee et cols., 2014). En relación con ello, existen varios estudios en los que se desarrolla un aptámero para detectar la presencia de malaria (biomarcador) a través de un ensayo basado en tensioactivos catiónicos, utilizando AuNPs como sondas de detección óptica (Cheung et cols., 2013) (Lee et cols., 2012). Por un lado, se estudiará el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB). Este tensioactivo catiónico posee dos características muy útiles, una carga positiva que le permite agregar las AuNPs y la capacidad de ensamblar el ADN para formar supramoléculas con ciertas nanoestructuras (si se trata de ADN de cadena simple formarán nanoestructuras cúbicas, mientras que si se trata de ADN de doble cadena serán hexagonales) (Zhou et cols., 2004). Por otro lado, se encuentra el cloruro de benzalconio (BCK) que posee un anillo aromático que proporciona una ventaja significativa en la agregación de las nanopartículas. Y finalmente, el bromuro de dodecildimetilamonio (DDAB) que contiene dos cadenas de alquilo largas. De los tres tensioactivos estudiados, el DDAB es el que provoca la agregación completa de las AuNPs libres a una concentración muy baja, seguido de BCK y CTAB. Los cambios de color se experimentaron entre 650 nm y 520 nm (Jain et cols., 2016). En cuanto a los aptámeros, se utilizaron tres candidatos con una mayor afinidad por PfLDH. Estos fueron P38, P9 y P45, siendo P38 el de mayor afinidad (Jain et cols.,2016). En otros estudios se utilizó el pL1 como elemento de reconocimiento (Lee et cols., 2014). Los resultados de estos estudios confirman que el cambio de color corresponde con el grado de agregación de las AuNPs causada por la interacción de las AuNPs y el tensioactivo, dependiendo de la concentración del biomarcador. 55 5.- CONCLUSIONES Finalmente, de este trabajo de revisión bibliográfica se pueden extraer las siguientes conclusiones generales y más específicas. De forma general puede apuntarse que: 1.- Las nanopartículas metálicas pueden ser producidas con distintos tamaños y presentarse no funcionalizadas o “desnudas”, y funcionalizadas con diferentes tipos de ligandos. Su carga global puede variar en función del pH del medio o las características estructurales. 2.- Las nanopartículas de oro son las más empleadas como sensores, gracias a sus excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas, intrínsecas a su tamaño nanométrico. 3.- Hasta la fecha, los sistemas de nanopartículas metálicas para la detección de ADN son los más estudiados. 4.- El método colorimétrico, basado en los cambios de la SPR de las nanopartículas, es un método alternativo, simple, rápido y de bajo coste que se puede aplicar en muestras para la determinación de tensioactivos y biomoléculas empleando nanopartículas metálicas. De forma más específica y en relación a los sistemas estudiados puede concluirse: 1.- Las nanopartículas de Au@citrato de menor tamaño son más sensibles para la detección de los tensioactivos de cadena alifática DTAB y CTAB. 2.- El sistema Au@tratrato es más sensible a la detección de los tensioactivos DTAB y CTAB cuando se compara con el sistema Au@citrato. 3.-Para los tensioactivos pertenecientes al grupo de los bromuros alquiltrimetilamonio, se observa que para un mismo sistema de nanopartículas, a medida que aumenta el número de carbonos de la cadena carbonada, el ∆λmáxima es mayor, a la vez que [T]∆λmáxima disminuye. Por tanto, estos sistemas son más sensibles a la determinación de tensioactivos de mayor tamaño de cadena. 3.- Atendiendo a los valores de energía libre, las nanopartículas de oro de menor tamaño son las que presentan mayor afinidad por el ADN, presentado valores mayores de K y ∆G más negativos. 4.- Los sistemas compuestos nanopartículas/tensioactivos para la determinación de biomoléculas están en continua investigación, y presentan características muy prometedoras, como una mayor capacidad de agregación/ desagregación en comparación con los sistemas simples. Es necesario por tanto, seguir investigando en esta línea para 56 mejorar tanto la sensibilidad de la técnica colorimétrica, basada en los cambios en la SPR de las nanopartículas, como el grado de especificidad por las diferentes biomoléculas. 57 BIBLIOGRAFÍA [1] Agarwal A, Huang SW, O’Donnell M, Day KC, Day M, Kotov N, Ashkenazi S. 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