Empleo de nanopartículas metálicas para la detección de tensioactivos y biomoléculas

Lou des Ve ga a O’Neale Facul ad de Fa macia 2 Uni e sidad de Se illa Facul ad de Fa macia T abajo de Fin de G ado G ado en Fa macia “EMPLEO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA LA DETECCIÓN DE TENSIOACTIVOS Y BIOMOLÉCULAS” Lou des Ve ga a O’Neale Tu o a: Elia Ma ía G ueso Molina Depa amen o de Química Física Tipología del abajo: Bibliog á ico Po ada (Adap ada de Railsback e cols., 2012). 3 Ag adecimien os Mi ag adecimien o a la D a. Elia Mª G ueso Molina, p o eso a con a ada doc o a de la Uni e sidad de Se illa, po guia me en la elabo ación de es e abajo. A mis pad es, po su incondicional apoyo du an e odos es os años. 4 INDICE RESUMEN ................................................................................................................... 6 INDICE DE ABREVIATURAS.................................................................................... 7 1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 11 1.1.- Nanopa ículas ................................................................................................ 11 1.2.- Tensioac i os .................................................................................................. 17 1.3.- Biomoléculas .................................................................................................. 22 1.3.1.- Ácidos nucleicos: ADN y ARN ................................................................ 22 1.3.2.- Lisozima .................................................................................................. 23 2.- OBJETIVOS .......................................................................................................... 26 2.1 Obje i o p incipal .............................................................................................. 26 2.2. Obje i os especí icos ........................................................................................ 26 3.- METODOLOGÍA .................................................................................................. 27 4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 28 4.1.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Tensioac i os ......... 28 4.1.1.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Tensioac i os Ca iónicos ........................................................................................................... 32 4.1.2.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Tensioac i os Aniónicos ............................................................................................................ 38 4.1.3.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Tensioac i os No Iónicos ................................................................................................................ 38 4.2.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Biomoléculas ......... 39 4.2.1. Tipos de Nanopa ículas empleadas pa a la de ección de Biomoléculas ..... 39 4.2.2. Modos de unión de las nanopa ículas con los ácidos nucleicos y p o eínas ... 42 4.2.3. Te modinámica de la In e acción de nanopa ículas con los ácidos nucleicos y p o eínas ................................................................................................................. 49 5 4.2.4. Aplicaciones de las nanopa ículas como biosenso es ................................ 50 4.3.- Empleo de sis emas ensioac i os/nanopa ículas me álicas pa a la de ección de biomoléculas ........................................................................................................... 53 5.- CONCLUSIONES ................................................................................................. 55 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 57 6 RESUMEN Ac ualmen e, las nanopa ículas juegan un papel muy impo an e en el campo de la in es igación cien í ica debido a la g an a iedad de aplicaciones en dis in as á eas ales como la a macología, la medicina, la indus ia alimen a ia, la ecnología, o la biología. Las nanopa ículas más es udiadas con es e in son aquellas o madas po ma e iales me álicos. De en e odos los me ales nobles, el o o des aca po sus in e esan es p opiedades óp icas, magné icas, eléc icas, ca alí icas, biocidas y an imic obianas. Den o del g upo de las nanopa ículas me álicas pueden encon a se nanopa ículas de dis in o amaño, uncionalizadas con un amplio abanico de ligandos (an icue pos, políme os, sondas de diagnós ico, á macos, ma e ial gené ico…). Po odo ello, las nanopa ículas despie an un g an in e és y esul an especialmen e p ome edo as. En es e abajo de e isión bibliog á ica, analiza emos en p ime luga las p opiedades más in e esan es de las nanopa ículas, así como de los p incipales ensioac i os y biomoléculas. Po o o lado, es udia emos la e icacia de los mé odos colo imé icos basados en nanopa ículas me álicas pa a la de ección de ensioac i os y biomoléculas, en compa ación con o as écnicas de análisis más adicionales. Finalmen e, se desc ibe la e icacia de los sis emas que combinan nanopa ículas y ensioac i os pa a la de ección de biomoléculas. PALABRAS CLAVES: Nanopa ículas, Tensioac i os, ADN, Análisis colo imé ico, Senso . 7 INDICE DE ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxi ibonucleico ARN: Ácido ibonucleico ARNm: ARN mensaje o ARN : ARN ibosómico ARN : ARN ans e en e AgNO3: Ni a o de pla a AgNPs: Nanopa ículas de pla a AuNPs: Nanopa ículas de o o Au@AO-TEG: Nanopa ícula de o o ecubie a po na anja de ac idina y ie ilenglicol Au@AO-PEG: Nanopa ícula de o o ecubie a po na anja de ac idina y polie ilenglicol Au@ci a o: Nanopa ícula de o o ecubie a po ci a o Au@CALNN: Nanopa ícula de o o ecubie a po cis eína-alanina-leucina-aspa agina- aspa agina Au@mala o: Nanopa ícula de o o ecubie a po mala o Au@ a a o: Nanopa ícula de o o ecubie a po a a o 8 Au@ iop onin: Nanopa ícula de o o ecubie a po iop onina BMLs: Biomoléculas BZKB: B omu o de benzalconio C10TAB: B omu o de decil ime ilamonio C18TAB: B omu o de oc adecil ime ilamonio CE: Elec o o esis capila CMC: Concen ación Micela C í ica CPC: Clo u o de ce ilpi idino CTAB: B omu o de ce il ime ilamonio DBA: Ap áme o de unión a la dopamina DDAB: B omu o de didodecildime ilamonio ds-poli-AT: ARN de doble cadena de pa es de bases adenina- imina. DTAB: B omu o de dodecil ime ilamonio ELISA: Ensayo po inmunoadso ción ligado a enzimas FAO: O ganización de las Naciones Unidas pa a la Alimen ación y la Ag icul u a FeCl3: Clo u o de hie o 9 GC-MS: C oma og a ía de gases acoplada a espec ome ía de masas HPLC: C oma og a ía líquida de al a esolución HAuCl4: Ácido e aclo oáu ico LAS: Sul ona o de dodecilbenceno de sodio NaBH4: Bo ohid u o sódico NAG: N-ace ilglucosamina NAM: Ácido N-ace ilmu ámico NaOH: Hid óxido de sodio NIR: Espec oscopía de In a ojo ce cano NMR: Resonancia Magné ica Nuclea NPs: Nanopa ículas OTA: Och a oxin A PCR: Reacción en cadena de la polime asa P LDH: Plamodium alcipa um Lac a o deshid ogenasa P LDH: Plasmodium i ax Lac a o deshid ogenasa 16 en e el haz de luz y los elec ones en la supe icie de la nanopa ícula (C iado y cols., 2007). El hecho de ene es os sis emas un espacio educido pa a el mo imien o de los elec ones, hace que las p opiedades elec ónicas cambien d ás icamen e, dando luga a nue as aplicaciones de g an in e és (As uc y Didie , 2004). Figu a 2. Imagen ep esen a i a de la o ien ación de los elec ones de los á omos de la supe icie de la nanopa ícula como consecuencia de la incidencia de luz de una de e minada ecuencia (Hammond y cols., 2014). La oscilación dipola es á en onces en esonancia con la adiación inciden e a una ecuencia especí ica que depende an o del amaño, como de la o ma de las nanopa ículas. La egión de longi udes de onda a la que se ob iene dicha esonancia se la conoce como banda de abso ción o esonancia plasmónica (Cao, 2004). Pa a algunos me ales como el cob e, o o o pla a, la ecuencia de esonancia del plasmón apa ece en el ango isible del espec o, y és a es la azón po la que las disoluciones coloidales de es os me ales mues an colo es espec acula es e in ensos. Po o o lado, las nanopa ículas de me ales de ansición exhiben p opiedades ca alí icas en e a muchas eacciones o gánicas con al a ac i idad y selec i idad, u ilizándose en disolución (ca álisis homogénea) o adso bidas sob e un sopo e sólido, como silica o alúmina (ca álisis he e ogénea). Su al a e iciencia ca alí ica se explica en unción de su al a elación supe icie/ olumen en compa ación con o os sis emas como mencionamos an e io men e (Li y cols, 2011) (Du and y cols, 2008). 17 1.2.- Tensioac i os Los ensioac i os llamados ambién su ac an es o agen es de supe icie ac i a, se de inen como sus ancias que educen la ensión supe icial de un líquido, y que si en como agen e humec an e o de e gen e. El é mino su ac an e, es un anglicismo del e mino anglosajón “Su ace Ac i e Agen ” (Agen e Ac i o de Supe icie). Del mismo modo, se de ine ensión supe icial como la acción de las ue zas molecula es, en i ud de la cual, la capa ex e io de los líquidos iende a con ene el olumen de es os den o de la mínima supe icie. En cuan o a su es uc u a la cons i ución química de un ensioac i o comp ende g upos hid o ílicos y g upos hid o óbicos (Mye s, 1998), éase Figu a 3. Figu a 3. Esquema gene al de la es uc u a química de un ensioac i o. En disolución acuosa, la pa e hid o ílica de la molécula in e acciona más a o ablemen e con medios pola es, mien as que la pa e hid o óbica lo hace con moléculas apola es. A endiendo a la na u aleza de su g upo hid ó ilo, los ensioac i os se pueden clasi ica en no iónicos, ca iónicos, aniónicos y an ó e os (Can a e o, 2010). Los ensioac i os aniónicos son aquellos que en disolución se ionizan, quedando ca gados nega i amen e. Se emplean en la o mulación de de e gen es de uso domés ico e indus ial. Son del ipo: sul ona o, sul a o, os a o, sul osuccina o, sul oace a o, de i ados de aminoácidos, e c. Los ensioac i os no iónicos en disolución acuosa no se ionizan, ya que poseen g upos hid ó ilos del ipo alcohol, enol, é e o amida. Algunos de es os su ac an es pueden 18 o na se ela i amen e hid o ílicos po la p esencia de una cadena polié e del ipo polióxido de e ileno. El g upo hid ó obo suele se un adical alquilo o alquil- benceno y a eces una es uc u a de o igen na u al como un ácido g aso, sob e odo cuando se equie e una baja oxicidad. Los ensioac i os no iónicos g acias sus ca ac e ís icas se pueden usa como ma e ias p imas, como base pa a la o mulación de di e sos p oduc os pa a la indus ia de la ag icul u a, cu ido, lá ex, ex iles, p ocesos de me ales, pin u as en emulsión, pe óleo, pulpa y papel, limpiado es. Los ensioac i os ca iónicos son aquellos que en disolución se ionizan, y el g upo hid ó obo queda ca gado posi i amen e. Gene almen e, es án o mados, al menos, po una cadena de 8 a 25 á omos de ca bono, de i ada de ácidos g asos o de un de i ado pe oquímico, un ni ógeno ca gado posi i amen e. Además, suelen es a cons i uidos po una cadena la ga de sales de amonio cua e na ias o sales de alquilaminas. Son muy ele an es en la indus ia po su e iciencia bac e icida, ge micida, algicida, e c. Algunos ejemplos son: me osul a o, de i ados de imidazolina, óxidos de amina y sales de aminas. Los ensioac i os an ó e os esul an de la combinación den o de una misma molécula de dos ca ac e es: aniónico y ca iónico. Algunos de es os ensioac i os son insensibles al pH, o os son ca iónicos a pH ácido, y o os de ipo aniónico a pH al o. Es os ensioac i os son en gene al bas an e ca os, po lo que su ámbi o de aplicación es más educido. Algunos ejemplos de ellos son aquellos que con ienen aminoácidos, be aínas o los os olípidos en su es uc u a. Hace más de es décadas su gie on los ensioac i os polimé icos que se sin e izan po asociación de es uc u as polime izadas de ipo hid o ílico o lipo ílico, en o ma de bloques o de inje os. Se suelen u iliza en p ocesos donde es án in oluc adas mac omoléculas na u ales como en la deshid a ación del pe óleo (Salague , 2002). Respec o a las p opiedades gene ales de los ensioac i os es impo an e des aca las siguien es (Can a e o, 2010): 1.- Compues os an i ílicos Son aquellos que con ienen en su molécula uno o a ios g upos pola es y uno o a ios g upos no pola es, que suelen se cadenas hid oca bonadas solubles en disol en es 19 o gánicos; y un g upo iónico soluble en agua. Debido a su es uc u a, cuando se pone en con ac o una can idad muy pequeña de ensioac i o con el agua apa ecen dos endencias opues as; po una pa e, el g upo hid o ílico del ensioac i o iende a si ua se en el in e io del medio acuoso; y po o a, las moléculas de agua ienden a expulsa del medio acuoso las cadenas hid ó obas. 2.- Humec abilidad Cons i uye un mecanismo undamen al que in e iene en la mayo pa e de las aplicaciones que implican a los agen es ensioac i os. Es una ca ac e ís ica que depende de las p opiedades supe iciales. 3.- Pode espuman e La espuma se puede de ini como un conjun o de celdas gaseosas sepa adas po láminas delgadas de líquido. La o mación de espuma depende ambién de las p opiedades supe iciales de las disoluciones de los agen es ensioac i os. 4.- Fo mación de micelas Cuando un compues o an i ílico se encuen a en disolución acuosa, pa a e i a la in e acción des a o able en e la pa e hid ó oba y el disol en e, además de adso be se en la in e az, exis e o a al e na i a que es la de asocia se en e sí o mando ag egados molecula es, iónicos o mix os llamados micelas, que se o man po encima de una cie a concen ación, denominada concen ación micela c í ica (C.M.C.) (Can a e o, 2010). Exis en di e en es ipos de micelas, cuyas es uc u as an a depende del balance en e la pa e hid ó ila y lipó ila que p e alezca en la molécula del ensioac i o. Así, encon amos, micelas in e sas, en las que las colas de hid oca bu os ( egión hid o óbica) es án o ien adas hacia la ase oleosa, mien as que los g upos pola es ( egión hid o ílica) se encuen an en el in e io de la micela, disuel os en agua u o o disol en e pola con inado en su in e io ( éase igu a 4a). O bien, podemos encon a las micelas di ec as, en las que la pa e hid o ílica es á en con ac o con la disolución, mien as que la pa e hid o óbica lo hace hacia el in e io de la es uc u a micela (C uces, 1998) ( éase igu a 4b). 20 (a) (b) Figu a 4. (a) Micela in e sa o mada en un disol en e o gánico apola . Los g upos pola es del ensoac i o se o ien an en el in e io acuoso, mien as que sus cadenas hid o óbicas es án en con ac o con el disol en e apola (ex e no). (b) Micela di ec a o mada en una disolución acuosa. Los g upos pola es de las moléculas del ensoac i o es án en la supe icie en con ac o con la ase acuosa y las egiones hid oca bonadas, se encuen an en el in e io de la micela. Exis en múl iples usos y aplicaciones pa a los ensoac i os, en e los cuales des acan las siguien es ecogidas en la Tabla 1: APLICACIONES Y USOS DE LOS TENSIOACTIVOS Emulsi ican es Teñido Dispe san es Blanqueado Mojado Sua izan es Espumado o ompimien o de espuma Lub ican es Impe meabilizan es Humec an e Ge micidas De e gencia Insec icidas Eng ase y deseng ase Tabla 1. Algunos usos y aplicaciones de los ensioac i os (Solé, 2014). Po úl imo, es in e esan e hace una pequeña mención a los ensioac i os geminis. Los ensioac i os geminis cons i uyen un g upo de sus ancias an i ílicas que poseen dos o más g upos pola es, y dos o más cadenas hid ó obas. Mien as que las moléculas de los ensioac i os con encionales con ienen una o dos cadenas hid oca bonadas unidas a un 21 mismo g upo pola . Algunas ca ac e ís icas es uc u ales de los ensioac i os geminis son las siguien es (An elo, 2008): 1.- Todos los ensioac i os geminis poseen al menos dos cadenas hid ó obas y dos g upos iónicos o pola es. 2.- El puen e en e dichas cadenas puede se co o (dos g upos me ileno) o la go (doce g upos me ileno); ígido (benceno) o lexible (cadena de me ilenos); pola (polié e ) o no pola (ali á ico, a omá ico), y puede se i pa a uni las cabezas pola es o á omos de ca bono de la cadena hid oca bonada p óximos a ellas. 3.- El g upo pola puede se posi i o (amonio), nega i o ( os a o, sul a o, ca boxila o), no iónico (polié e , azúca ) o zwi e iónico. La mayo pa e de los ensioac i os geminis poseen moléculas simé icas, es deci , con los g upos pola es iguales, e idén icos g upos no pola es. Sin emba go, ambién se han sin e izado ensioac i os geminis con dis in os g upos pola es y con cadenas hid oca bonadas di e en es ( éase Figu a 5). Figu a 5. Algunos ejemplos de su ac an es ipo gemini sin e izados has a la ac ualidad: (a) ensioac i o gemini aniónico, (b) ensioac i o gemini zwi e ionico, (c) ensioac i o gémini e áme o ca iónico, (d) ensioac i o gémini no iónico (An elo, 2008). Finalmen e, cabe menciona algunas p opiedades de es e ipo pa icula de su ac an es: (i) la CMC de los ensioac i os geminis es meno que la de los ensioac i os o dina ios homólogos en uno o dos ó denes de magni ud. Una de las posibles azones de 22 es a disminución en el alo de la CMC es que se ha encon ado que hay un mayo empaque amien o de los g upos hid ó obos de los gemini en la in e ase ai e-agua con espec o a los su ac an es con encionales; (ii) po o a pa e, los ensioac i os geminis poseen una capacidad pa a disminui la ensión supe icial del agua que es de has a es ó denes de magni ud supe io a la de los ensioac i os o dina ios. Cuando el g upo que ac úa como puen e es pequeño o hid ó ilo, el acomodamien o de los g upos lipó ilos en la in e ase ai e-agua es más compac o que en los ensioac i os con encionales y, po lo an o, la concen ación del ensioac i o en esa in e ase es mayo , lo que causa una mayo disminución de la ensión supe icial (An elo, 2008). 1.3.- Biomoléculas 1.3.1.- Ácidos nucleicos: ADN y ARN Los ácidos nucleicos se pueden de ini como biopolíme os de ele ado peso molecula o mados po o as subunidades es uc u ales o monóme os denominados nucleó idos. Son las biomoléculas po ado as de la in o mación gené ica (Bu iel, 2010). De acue do a la composición química, los ácidos nucleicos se clasi ican en ácidos ibonucleicos (ARN) y en ácidos desoxi ibonucleicos (ADN), que se encuen an en odos los ipos celula es. Los nucleó idos son las unidades básicas que o man los ácidos nucleicos como se mencionó an e io men e. Cada nucleó ido es á cons i uido po es componen es: 1.- Una molécula de pen osa (polisacá ido con 5 á omos de ca bono). El ADN con iene en su es uc u a la desoxi ibosa, mien as que el ARN es á o mado po ibosa. 2.- Una molécula de ácido os ó ico. 3.- Una base he e ocíclica ni ogenada. És as úl imas son las esponsables a a és de la secuencia y de los acoplamien os, de la conse ación y ansmisión de la in o mación gené ica. Las bases ni ogenadas se clasi ican en pú icas y pi imidínicas. En el ADN, las bases pú icas son la adenina y la guanina, mien as que las bases pi imidínicas son la ci osina y la imina; en el ARN, el u acilo sus i uye a la imina (Bu iel, 2010). Los á omos de oxígeno y de ni ógeno de las bases pueden ac ua como donado es o acep o es, y o ma puen es de hid ógeno, in e acción undamen al que man iene unida la doble hélice. 23 Los ácidos nucléicos pueden o ma di e en es es uc u as en el ADN. La es uc u a p ima ia es á de inida po su es uc u a de enlaces co alen es y la secuencia de nucleó idos. És a de e mina la con igu ación de la mac omolécula. Po o a pa e, la es uc u a secunda ia y e cia ia es ablece la con igu ación de la mac omolécula. La doble hélice se man iene es able, p incipalmen e, po dos ipos de ue zas: (i) los enlaces de hid ógeno en e pa es de bases complemen a ias de las dos cadenas; y (ii) las in e acciones de apilamien o de las bases (in e acciones “π-s acking”), a a és de las cuales los pa es de bases se encuen an pa cialmen e supe pues os, de o ma que es a disposición a o ece las in e acciones de apilamien o de pa ejas de base si uadas en e planos ecinos (Robe azzi y cols., 2006). En la ac ualidad, el ADN juega un papel muy impo an e en la ecnología, y se ha con e ido en un mecanismo pa a es udia y en ende los p ocesos de la ida, en la medicina, biología y en o as amas de la ciencia. Po o o lado, el ARN in e iene jun o al ADN en la sín esis de p o eínas y del aslado de la in o mación gené ica del ADN. El ARN copia la in o mación de cada gen del ADN y luego es a pasa al ci oplasma, donde se une al ibosoma pa a di igi la sín esis p o eica. Exis en di e en es ipos de ARN: el ARN mensaje o (ARNm), conocido como ARN codi ican e, posee el código gené ico que de e mina el esquema de los aminoácidos pa a o ma una p o eína; el ARN ans e encia (ARN ) se enca ga de lle a los aminoácidos a los ibosomas con el in de inco po a los al p oceso de sín esis p o eica, asimismo, se enca ga de codi ica la in o mación que posee el ARN mensaje o a una secuencia de p o eínas; y po úl imo, el ARN ibosómico (ARN ) que o ma pa e de los ibosomas y ac úa en la ac i idad enzimá ica, enca gándose de c ea los enlaces pep ídicos en e los aminoácidos del polipép ido en el p oceso de sín esis de p o eínas (Gómez-Ja abo, 2012). 1.3.2.- Lisozima La lisozima, ambién conocida como mu amidasa (N-ace il mu amidaglicano hid olasa, E. C. 3. 2.1. 17), ue descubie a en 1922 po Alexande Fleming (Ca illo, 2013), éase igu a 6. La lisozima de cla a de hue o (HEW) ue la p ime a p o eína que ue secuenciada y que enía los ein e aminoácidos con encionales, además de se ambién la p ime a de la 24 que se ob u o un análisis c is alog á ico comple o, y de la que se p opo cionó un mecanismo de eacción de allado. Desde su descub imien o es a p o eína ha jugado un papel muy impo an e en los modelos enzimá icos, y en muchos aspec os de la biología mode na, incluyendo la química de p o eínas, c is alog a ía, esonancia magné ica nuclea (NMR), inmunología y plegamien o de p o eínas.(Ca illo, 2013). La lisozima se encuen a en muchos o ganismos i os. En los humanos, la lisozima juega un papel muy impo an e en la de ensa en e a las in ecciones. Po ejemplo, en las lág imas se encuen a en can idades comp endidas en e 3.000 y 5.000 μg/mL, y p o ege en e a bac e ias y i us. En la sali a p o ege en e una g an a iedad de mic oo ganismos como bac e ias, i us y hongos de di e en es especies de Candida. Además de la ac i idad an ibac e iana, se han desc i o muchas o as ac i idades biológicas de la lisozima como su ac i idad an i i al. La lisozima adminis ada po ía o al y cu ánea p e iene en e medades de la piel, como el he pes simple y la a icela, debido a su ac i idad an iin lama o ia (Ca illo, 2013). O ganismos in e nacionales como la FAO/WHO y muchos países como Alemania, Aus ia, Aus alia, Bélgica, Dinama ca, España, Finlandia, F ancia, I alia, Japón y Reino Unido ienen econocida a la lisozima de cla a de hue o como una p o eína no óxica, y po ello es u ilizada pa a ines alimen a ios, a macológicos y e apéu icos. Así, se es ima que más de 100 oneladas de lisozima se emplean anualmen e pa a es os p opósi os (Ca illo, 2013). En la indus ia a macéu ica, se emplea en el a amien o de en e medades b onco pulmona es, pas as den ales pa a p e ención de ca ies, y en c emas de aplicación ópica. (Namba y cols, 1981). La lisozima es de la clase de enzimas que des uye las pa edes celula es de cie as bac e ias G am-posi i as po up u a del enlace β (1-4) en e el ácido N-ace ilmu ámico (NAM) y N-ace ilglucosamina del pep idoglicano (NAG), debili ando así la pa ed celula (Ca illo, 2013). 25 Figu a 6. Se mues a el si io de co e de la lisozima en el pep idoglicano de la pa ed celula de las bac e ias (Ca illo, 2013). El esul ado es la pene ación de agua en la célula que se hincha y acaba po es alla , eniendo luga un enómeno denominado lisis. En cambio, la lisozima es casi inac i a en e a mic oo ganismos G am-nega i os, debidos a la di icul ad pa a accede al pep idoglicano, que se encuen a p o egido po la memb ana ex e na. Es a p opiedad de hid oliza el pep idoglicano se conoce como ac i idad neu aminidasa o mu amidasa. De acue do con Jollés y Jollés (1984), las lisozimas se pueden clasi ica en los siguien es ipos (Diez, 2014): 1.- Lisozima ipo C (“Chicken- ype”): aunque las lisozimas más ep esen a i as de es e ipo se encuen an en la cla a de hue o de cie as a es (pollo, pa o) ( éase Figu a 7), en es e g upo ambién pueden engloba se la lisozima p oceden e de la leche humana, de a a, e c. Todas ellas poseen al ededo de 130 aminoácidos, con cua o puen es disul u o. Poseen una cie a ac i idad de qui inasa, lo que posibili a la hid ólisis de políme os compues os únicamen e de NAG. 2.- Lisozima ipo G (“goose- ype”): es a clase de lisozimas ienen unos 185 aminoácidos y no dan eacción inmunológica c uzada con las de ipo C. También poseen cua o puen es disul u o. 3.- Lisozimas p oceden es de bac e io agos: el ejemplo más ep esen a i o lo cons i uye la lisozima codi icada po el bac e io ago T4 (T4L). Es a lisozima iene 164 aminoacidos y su secuencia no es homologa con las de las enzimas de ipo C. 32 En p ime luga , se mues an los esul ados ela i os a la de ección de ensioac i os ca iónicos empleando nanopa ículas me álicas. 4.1.1.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Tensioac i os Ca iónicos Como ue indicado an e io men e, el empleo de la écnica de espec oscopía de abso ción UV- is pa a la de ección cuan i a i a de di e en es anali os implica la de e minación cuan i a i a de la abso bancia de la mues a a una longi ud de onda de e minada a la que abso be el anali o, p e io calib ado del sis ema. Es e es po an o un mé odo di ec o de cuan i icación ( éase la igu a 9a). En cambio, cuando se ex apola es e p ocedimien o a la de ección de ensioac i os no colo eados, empleando nanopa ículas me álicas, se p ocede median e una de e minación indi ec a. Es deci , en luga de segui la banda del ensioac i o (en la mayo ía no de ec able po UV- isible, excep o en el caso de ensioac i os con g upos a omá icos en su es uc u a), es necesa io segui los cambios que se p oducen en banda SPR de la nanopa ícula, así como en la longi ud de onda del máximo, como consecuencia de la in e acción de es a con el ensioac i o ( éase igu a 9b). Las ca ac e ís icas de la banda SPR de la nanopa ícula depende del ipo de cen o me álico, el ipo de ligando p o ec o o es abilizan e, del amaño de las mismas y del medio (sales o codisol en es) que las odean. Figu a 9. (a) G á ico ep esen a i o de la ec a de calib ado de un anali o colo eado cualesquie a pa a su de e minación di ec a (Adap ada de Cas ellanos, 2013). (b) Espec os de abso ción UV- is del sis ema Au@ a a o/CTAB, en unción de la concen ación de CTAB, empleados pa a la de e minación indi ec a del ensioac i o (Adap ada de Sh i as e cols., 2015). 33 Las nanopa ículas empleadas pa a la de ección de ensioac i os ca iónicos son, po lo gene al, de ca ác e aniónico, es deci , su ca ga ne a es nega i a. En cuan o a su sín esis, desde un pun o de is a químico, las nanopa ículas en disolución (disolución coloidal) equie en del empleo de mé odos que pe mi an ob ene un con ol p eciso sob e el amaño y la o ma de las nanopa ículas pa a así ob ene un conjun o de pa ículas monodispe sas que p esen en una p opiedad de e minada. En gene al, la sín esis de nanopa ículas me álicas en disolución se lle a a cabo median e el empleo de los siguien es componen es: a) P ecu so me álico b) Agen e educ o c) Agen e es abilizan e Des acan las de Au@ci a o, cuya sín esis se basa en la educción del ácido e aclo oáu ico (HAuCl4) con el ligando p o ec o , gene almen e ci a o isódico, en medio acuoso. Las AuNPs ob enidas po es e mé odo ienen una cubie a de iones ci a o en su supe icie que puede se ácilmen e eemplazados o in e cambiados po o o ligando. O o mé odo de sín esis habi ual es la educción de la mezcla Au/ci a o, en las p opo ciones adecuadas, empleando NaBH4 como agen e educ o , en p esencia o no de un agen e es abilizado como pueda se el alcohol poli inílico. Además, son ambién ecuen es las nanopa ículas de Au@mala o y Au@ a a o cuya sín esis es equi alen e (Sh i as e cols., 2015). Tan o la dis ibución de amaño como el amaño de la AuNPs pueden se con olados po pa áme os expe imen ales ales como el pH, la concen ación de HAuCl4 y la elación de concen aciones Au/ligando. En el caso de las nanopa ículas de pla a exis en dos mé odos de sín esis ca ac e ís icos, que son: el mé odo Lee-Meisel y el mé odo C eigh on. El p ime o consis e en una a iación del mé odo de ob ención de nanopa ículas de o o, en el que se emplea AgNO3 en luga de HAuCl4 como p ecu so me álico, y ci a o de sodio como agen e educ o . Median e es e mé odo se ob ienen nanopa ículas de pla a con una dis ibución amplia de amaño de pa ícula (polidispe sas). El mé odo C eigh on consis e en la educción de AgNO3 con el agen e educ o NaBH4. Es e mé odo es el más u ilizado en la ac ualidad y da luga a la ob ención de 34 nanopa ículas de pla a de ap oximadamen e 10 nm y con una dis ibución es echa de amaños (monodispe sas) (Monge, 2009). La de ección colo imé ica usando AuNPs se basa en la dis ancia de la esonancia del plasmón de supe icie de AuNPs. Es po eso, que las AuNPs dispe sas poseen un colo que iende más al ojo (ama illo, osa, ojo) y un máximo de abso ción al ededo de 520 nm, mien as que las AuNPs ag egadas ienen un colo más p óximo al azul ( e de, azul o pú pu a), y la in ensidad de abso ción de la mues a a longi udes de onda supe io es se inc emen a. Po an o, es undamen al en la de ección colo imé ica log a una in e acción selec i a en e el anali o y las AuNPs que induzca la ag egación/desag egación del sis ema. Exis en dos es a egias básicas que han sido empleadas en dicha de ección: (a) la ag egación y (b) la desag egación inducida po el anali o. La igu a 10 mues a un esquema ep esen a i o de ambas es a egias. (a) (b) Figu a 10. (a) Esquema ep esen a i o de un sis ema de nanopa ículas en es ado ag egado (b) Esquema de un sis ema de nanopa ículas en es ado desag egado. A con inuación, en la Tabla 3 se expone una compa a i a en e el amaño de las nanopa ículas, el inc emen o de la longi ud de onda obse ado y las CMC eó icas y expe imen ales de los di e en es ipos de ensioac i os más u ilizados en di e en es es udios ealizados has a la echa. 35 Tipo de Nanopa ícula /Re e encia Diáme o NPs (nm) Tensioac i o (T) ∆λmáximo (nm) [T]∆λmáximo (mM) CMCexp (mM) CMC (mM)/ Re e encia Au@ci a o (Kuong e cols., 2007) (23  3) C10TAB 255.5 5.0 50 - 100 65 (Lee, 2011) Au@ci a o (Kuong e cols., 2007) (23  3) DTAB 253.7 0.5 10 - 50 14.6–16.0 (Aguia e cols.,2003) Au@ci a o (Kuong e cols., 2007) (23  3) TTAB 226.5 0.1 1.0 – 5.0 3.60–3.72 (Aguia e cols.,2003) Au@ci a o (Kuong e cols., 2007) (23  3) CTAB 201.3 0.01 0.5 – 1.0 0.92–1.00 (Aguia e cols.,2003) Au@ci a o (Kuong e cols., 2007) (23  3) C18TAB 201.3 0.01 0.1 - 0.5 0.21 (Islam e cols., 2015) Au@ci a o (Zheng e cols.,2014) 17 DTAB - 0.01 ‹ 0.1 14.6–16.0 (Aguia e cols.,2003) Au@ci a o (Zheng e cols.,2014) 17 CTAB - 0.001 0.1 0.92–1.00 (Aguia e cols.,2003) Au@ci a o (Zheng e cols.,2014) 17 BZKB - 0.003 0.1 4.80 (Mahmood e cols., 2016) Au@ a a o (Sh i as e cols., 2015) (4.4  1.0) CTAB 194 0.00137 < 0.00137 0.92–1.00 (Aguia e cols.,2003) Au@ a a o (Sh i as e cols., 2015) (4.4  1.0) CPC 210 0.00056 <0.00056 1.24 (On i e os e cols.,2011) Au@ a a o (Sh i as e cols., 2015) (4.4  1.0) DTAB 202 0.00097 <0.00097 14.6–16.0 (Aguia e cols.,2003) Tabla 3. Análisis compa a i o de dis in os pa áme os pa a la de ección de algunos de los ensioac i os más comunes en di e en es es udios, donde CMCexp y CMC co esponden a la concen ación micela c í ica expe imen al y eó ica. 36 T as el análisis de la Tabla 3, pueden ex ae se una se ie de conclusiones in e esan es. En p ime luga , la discusión se cen a á en la de ección del ensioac i o como monóme o, y en segundo luga en la de ección de la CMC del ensioac i o, y po an o, de la o mación de es uc u as micela es. Pa a ca ac e iza la de ección del ensioac i o en o ma monóme o se han enido en cuen a dos pa áme os: (i) ∆λmáximo, es deci , el inc emen o en e la longi ud de onda del máximo de abso ción de la nanopa ícula lib e (en ausencia de ensioac i o), que p opo ciona disoluciones de colo ojo) y el alo de la longi ud de onda del máximo de abso ción de la banda, que su ge como consecuencia de la in e acción del ensioac i o monóme o con la nanopa ícula en su es ado más ag egado (disoluciones colo azul) ( éase igu a 11); y (ii) la concen ación de ensioac i o a la cual se p oduce inc emen o de longi ud de onda máximo, an e io men e desc i o ([T]∆λ máxima). Figu a 11. Rep esen ación g á ica del inc emen o de longi ud de onda máximo (∆λmax) (Adap ada de Duymo ich e cols., 2005). Es os dos pa áme os dan cuen a de cuál es el sis ema de nanopa ícula, en cuan o a amaño, na u aleza del cen o me álico y del ligando p o ec o más idóneos pa a log a una de e minación más sensible del ensioac i o en o ma monóme o. Teniendo en cuen a es as p emisas, y a endiendo a los da os ecogidos en la Tabla 3, se puede ex ae la siguien e in o mación: 37 1.-Se deduce que las nanopa ículas de Au@ci a o de meno amaño son más sensibles pa a la de ección de los ensioac i os de cadena ali á ica DTAB y CTAB. Así, las nanopa ículas Au@ci a o de diáme o (23  3) nm de ec an al ensioac i o DTAB y CTAB a una concen ación de 0.5 y 0.01 mM, espec i amen e, en compa ación con la mayo concen ación de ensioac i o eque ida en el caso de las nanopa ículas de es uc u a equi alen e y amaño in e io (17 nm). Es impo an e des aca que no es posible ex ae in o mación en es e caso del inc emen o de longi ud de onda p oducido al no exis i da os disponibles en la bibliog a ía en el caso de las nanopa ículas de Au@ci a o de 17 nm. 2.- Cuando se compa a el sis ema Au@ a a o con el sis ema Au@ci a o pa a la de ección de DTAB y CTAB, se concluye que el sis ema Au@ a a o es más sensible a la de ección de es os ensioac i os en o ma monóme o. De es a o ma pa a inc emen os de longi ud de onda máximo muy simila es en ambos sis emas, se obse a el máximo de ag egación del sis ema a una concen ación de ensioac i o dos ó denes de magni ud más pequeña en el caso de las nanopa ículas Au@ a a o espec o a la que p esen a el si ema Au@ci a o. Nó ese en es e caso que es os sis emas son di e en es en cuan o a las ca ac e ís icas del ligando p o ec o que ecub e el o o, y ambién en cuan o al amaño del sis ema. Po consiguien e, de nue o, las nanopa ículas de meno amaño p opo cionan lími es de de ección in e io es. 3.- Po o o lado, haciendo e e encia únicamen e a los ensioac i os pe enecien es al g upo de los b omu os alquil ime ilamonio, se obse a que pa a un mismo sis ema de nanopa ículas, se ob iene un ni el de de ección más sensible en el caso de los ensioac i os que poseen una mayo longi ud en su cadena ca bonada. Así, a medida que aumen a el núme o de ca bonos de la cadena ca bonada, el ∆λmáxima es mayo , a la ez que [T]∆λ máxima disminuye. Es a secuenciación es equi alen e independien emen e del amaño de la nanopa ícula y de la na u aleza del ligando p o ec o . 4.- Finalmen e, en cuan o al cálculo de la CMC, emos como la CMC expe imen al, ob enida median e análisis colo imé ico, se encuen a den o de los angos es ablecidos po la CMC eó ica, ob enida po o as écnicas más con encionales de análisis, como HPLC o medidas de conduc i idad o de ensión supe icial, señaladas en las e e encias adjun as a la Tabla. Es impo an e des aca como los da os de la CMC expe imen al 38 ob enidos po el mé odo colo imé ico pa a las nanopa ículas Au@ci a o de mayo diáme o son los más p óximos al alo de la CMC eó ica. 4.1.2.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Tensioac i os Aniónicos En es e caso se encuen an muy escasas e e encias en la bibliog a ía. Des aca sin emba go, un es udio en el que se demos ó que la de e minación de los ensioac i os aniónicos en agua, se basa en la o mación de pa es iónicos de dichos ensioac i os con el colo an e azul de me ileno (C16H18N3ClS). Se comp obó que las nanopa ículas magné icas ecubie as con poli (ácido ac ílico) de magne i a (PPA@Fe3O4) podían adso be el colo an e azul en agua ápidamen e y se p oducía un cambio ob io en la abso ción óp ica que a ía de 662 has a 590 nm, es o mues a la sepa ación espec al en e el in e y el pa de iones. La de ección se basa en que el colo o la longi ud de onda de abso ción del azul de me ileno cambian cuando se une al ca boxilo de las nanopa ículas (Wei y Mo, 2014). En conclusión, los ensioac i os aniónicos en agua pueden se de e minados di ec amen e sin ex acción y/o sepa ación median e el uso del colo an e azul de me ileno y las nanopa ículas magné icas modi icadas. Las p opiedades únicas de las nanopa ículas magné icas, incluyendo el supe pa amagne ismo y la al a capacidad de adso ción, son una al e na i a e icaz a los ma e iales con encionales u ilizados en la p epa ación de la mues a y la eliminación de con aminan es. Uno de los mé odos de sín esis más común u iliza FeCl3 como uen e de los á omos de hie o y se descompone con die ilenglicol en p esencia de PAA (ácido poliac ilac ílico) y NaOH que ca aliza la eacción. La sín esis de las nanopa ículas PAA@ Fe3O4 iene una buena dispe sabilidad y un amaño p omedio de 9 nm. El ensioac i o aniónico que se u ilizó en es e abajo es el sul ona o de dodecilbenceno de sodio (LAS) (Wei y Mo, 2014). 4.1.3.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Tensioac i os No Iónicos En la ac ualidad, no cons a bibliog a ía su icien e pa a desa olla es e apa ado, pe o si se mencionan algunos ejemplos de ensioac i os no iónicos en abajos elacionados 39 con la de ección de ensioac i os ca iónicos y aniónicos como Tween 20, B ij-35, T i ón- X100 o T i ón-X114 (Kuong e cols., 2007), (Sh i as e cols., 2015). Los ensoac i os no iónicos es án o mados po una cadena alquílica la ga y un g upo sin ca ga pe o muy pola . Los g upos pola es más u ilizados son: polioles (a eces azúca es na u ales), polioxie ilenos (é e es de polialcohol), diaminas y aminas e oxiladas. Es os ensoac i os no p oducen iones en disolución acuosa y po es e hecho son compa ibles con cualquie o o ipo de ensioac i os. 4.2.- Empleo de Nanopa ículas Me álicas pa a la de ección de Biomoléculas El empleo de nanopa ículas como ma cado es o senso es pa a la de ección de biomoléculas en luga de moléculas o ma cado es luo escen es con encionales es un ema de in e és ecien e (Tansil y Gao, 2006). Es os a ances han conducido a una mejo a signi ica i a an o en selec i idad, sensi i idad como en la capacidad de o mación de complejos biomolécula- ecep o . En es e apa ado del abajo de e isión se esumi án los úl imos sis emas de nanopa ículas empleados en la de ección de biomoléculas, así como los di e en es modos de unión de las nanopa ículas con biomoléculas como el ADN y el ARN, algunos pa áme os e modinámicos de la in e acción nanopa ícula-biomolécula ex aídos de los úl imos es udios, y inalmen e algunas de las aplicaciones más ele an es es udiadas has a la echa. 4.2.1. Tipos de Nanopa ículas empleadas pa a la de ección de Biomoléculas Como se ha mencionado an e io men e en es e abajo, las nanopa ículas pueden encon a se desnudas o sin uncionaliza (“naked nanopa icles”) o uncionalizadas con di e en es ipos de ligandos (“ unc ionalized nanopa icles”). La uncionalización de las AuNPs con p o eínas, pép idos y oligonucleó idos ha pe mi ido el desa ollo de nue os senso es pa a la de ección al amen e sensible de es as biomoléculas y las in e acciones biomolecula es. Así en la bibliog a ía puede dis ingui se en e: 1.- Funcionalización de las AuNPs con pép idos y p o eínas (Zhang e cols., 2016). Se es udia on las cua o es a egias p incipales pa a el enlace de una p o eína o un pép ido a las AuNPs: 40 a) Abso ción elec os á ica. b) Conjugación con un ligando en la supe icie de la AuNP. c) Conjugación a una molécula co ac o pequeña que la p o eína puede econoce y uni . d) Conjugación di ec a a la supe icie de la AuNP. 2.- Funcionalización de las AuNPs con ácidos nucleicos (Zhang e cols., 2016). El uso de ácidos nucleicos en combinación con AuNPs ha abie o nue os ho izon es pa a la de ección de di e en es anali os. Es a me odología se basa no malmen e en el es udio del obje i o con ap áme os especí icos, es deci , secuencias de ADN indi iduales o cadenas de ARN, y el cambio de con igu ación o con o mación esul an e de los ap áme os. Cabe menciona que los ap áme os son ácidos nucleicos de cadena sencilla (ssDNA y RNA) capaces de econoce de o ma especí ica y con al a a inidad a a ios ipos de moléculas diana median e un plegamien o idimensional de su cadena. Gene almen e son ob enidos median e su selección desde geno ecas de oligonucleó idos combina o iales, median e el mé odo SELEX (Sys ema ic E olu ion o Ligands by Exponen ial En ichmen ), que pe mi i á selecciona aquel oligonucleó ido de la geno eca u ilizada que se une con más a inidad a la molécula diana. Es a me odología ha sido ampliamen e es udiada y ha demos ado en ajas especiales 3.- Funcionalización con o o ipo de ligandos. La inco po ación de un ligando ap opiado puede modi ica las p opiedades ísicas del ma e ial que o ma la nanopa ícula y mejo a sus aplicaciones. Bajo es e pun o de is a los dend íme os son adecuados pa a p omo e o denamien os de inidos de los ma e iales y mejo a las ca ac e ís icas ísicas (óp icas, magné icas, e c.) de es os sis emas, debido p incipalmen e a la capacidad de con ol de su es uc u a y composición. Los calixa enos, iológenos dica iónicos y las α,ω- diaminas ali á icas lineales ambién son o os ejemplos de ligandos pa a la uncionalización de las nanopa ículas (Gue ini, 2008). 41 A con inuación se mues an algunos ejemplos de pequeñas moléculas e iones que se han de ec ado median e un mé odo colo imé ico u ilizando AuNPs uncionalizadas con p o eínas o ácidos nucleicos (Tabla 4): Tamaño NPs (nm) Anali o De ección de la sonda y/o mé odo Lími e de de ección (nM) Re e encia 13 Melanina AuNPs uncionalizdas con HS-oligonucleó ido 41.7 (Huang e cols., 2011) 13 Dopamina (DBA)“Dopamine binding ap ame ”, ap áme o de unión de la dopamina como un elemen o de econocimien o. 3.6·10-4 (Zheng e cols.,2011) 20 Cis eína Nanopa ículas de Cis eína combinada con Hg2+,y AuNPs uncionalizadas con oligonucleó idos dispe sas 100 (Lee e cols., 2008) 13 Kanamicina Kanamicina unida al conjugado AuNPs- ap áme o 25 (Song e cols., 2011) 13 Och a oxina A OTA induce un cambio con o macional en su ap áme o 20 (Yang e cols., 2011) 42 Hg2+,Pb2+, Cu2+ AuNPs ecubie as con papaína. 200 (Guo e cols., 2011) Tabla 4. Ejemplos de di e en es anali os de ec ados haciendo uso del mé odo colo imé ico basado en AuNPs uncionalizadas con p o eínas o ácidos nucleicos. Teniendo en cuen a los da os ecogidos en la abla 4, se p ocede a comen a una se ie de cues iones, como po ejemplo, que sis ema es mejo pa a de ec a biomoléculas, cuál es el amaño de nanopa ícula más adecuado pa a dicha de ección, o como in luye el anali o. El lími e de de ección se de ine como la can idad o concen ación mínima de sus ancia que puede se de ec ada con iabilidad po un mé odo analí ico de e minado, po an o, un alo meno del mismo indica una mayo sensibilidad de la écnica de de ección. 48 La adenina iene un g upo amino exocíclico si uado en la sex a posición y un ni ógeno del anillo en la sép ima posición, que pe mi e una al a a inidad de abso ción a a és de ue zas de abso ción química. La unión iene luga a a és de un mecanismo de coo dinación que implica la in e acción di ec a del ni ógeno del anillo de o o, con la con ibución pa cial del g upo amino exocíclico (Koo e cols., 2015). La a inidad de la adenina hacia el o o es an al a que puede compe i e icazmen e con la unión es able de Wa son-C ick pa a ds-poli-AT. Como esul ado, en la p oximidad de la supe icie de o o, las secuencias de poli-A se abso ben ue emen e como moléculas de heb a simple a pesa de la p esencia de secuencias de poli-T complemen a ias. Las bases del ADN ambién in e ac úan con el o o a a és del anillo a omá ico (Koo e cols., 2015). Va ios es udios han con i mado que, excep o la adenina, odas las bases ienden a o ien a se pa alelamen e a la supe icie. Es a con igu ación pe mi e la máxima supe posición de las densidades elec ónicas en e bases y o o pa a a o ece la ans e encia de ca ga en e el anillo a omá ico y la supe icie de o o (Deme s e cols., 2002) (Piana y Bilic, 2006). 49 4.2.3. Te modinámica de la In e acción de nanopa ículas con los ácidos nucleicos y p o eínas Diáme o NPs (nm) Modo unión Tipo BMLs Kagua (M-1) ∆G (kJ) Mé odo empleado en la cuan i icación de K e ∆G Re . Tipo de Nanopa ículas Au@ iop onin 1.4 In e calación o Enlaces de H. ADN 7.2 x105 -33.42 Ciné ico (P ado- Go o y G ueso, 2011) 1.8 No elec os á ica ADN 6.40x105 -33.12 Espec oscopía (P ado- Go o y G ueso, 2014) Au@AO-TEG 11.8±3.4 In e calación o Unión ex e na ADN (K1) = 5.4x106 (K2) = 3.3x104 (K2’) =3.8x104 -38.40 -25.78 -26.13 K1 y K2: Espec o o ome ía K2’:Espec o luo ome ía (Bi e e cols., 2011) Au@AO-PEG 3.9±1.0 In e calación o Unión ex e na ADN (K1) = > 106 (K2) = < 105 (K2’) = 2x104 -24.54 K1 y K2: Espec o o ome ía K2’:Espec o luo ome ía (Bi e e cols., 2011) Tabla 5. Pa áme os e modinámicos de la in e acción y ca ac e ís icas de di e en es nanopa ículas de o o en su in e acción con las biomoléculas. A con inuación se exponen las conclusiones ex aídas de la abla 5. Se ealiza una compa a i a de los di e en es ipos de nanopa ículas, los amaños de es as, y el modo de unión al ADN. Po o a pa e, se comen a cuál es el p oceso mas a o ecido en unción de los alo es de inc emen o de ene gía lib e. En p ime luga , se obse an es ipos de nanopa ículas de o o uncionalizadas con dis in os ligandos ( iop onina, na anja de ac idina y ie ilenglicol o polie ileglicol) que an a 50 uni se al ADN median e di e en es modos de unión (in e calación, unión ex e na…). Las AuNPs p esen an dis in os amaños, siendo Au@ iop onina la de meno alo . Po o o lado, en la abla 5 se e leja an o la cons an e de equilib io (K) como el inc emen o de ene gía lib e (∆G) ob enidos p incipalmen e median e mé odos ciné icos y espec oscópicos. Así cuan o, más nega i o es el alo de ∆G, y mayo en alo absolu o, más a o ecido es á el p oceso de o mación del complejo nanopa ícula/ADN. De acue do con es e azonamien o se concluye que las nanopa ículas de Au@ iop onina son las que se unen más a o ablemen e al DNA. También podemos conclui , de o ma gene al, que cuan o meno es el amaño de la nanopa ícula, más a o ecida en la unión con el ADN. 4.2.4. Aplicaciones de las nanopa ículas como biosenso es Las nanopa ículas de me ales nobles (NPs) es án eniendo un papel impo an e en el desa ollo de nue os biosenso es y / o en la mejo a de las écnicas de biosenso es exis en es pa a sa is ace la demanda de los diagnós icos biomolecula es más especí icos y al amen e sensibles. Las p opiedades isicoquímicas únicas de es os me ales en la nanoescala han lle ado al desa ollo de una amplia a iedad de biosenso es, ales como: (i) nanobiosenso es pa a el diagnós ico de una en e medad , (ii) nanosondas pa a de ección / o mación de imágenes in i o, el as eo celula y el seguimien o de la pa ogénesis de las en e medades o la moni o ización de la e apia y (iii) o as he amien as basadas en la nano ecnología que bene ician a la in es igación cien í ica sob e la biología básica (Do ia e cols., 2012). Se han desa ollado nume osas écnicas pa a sin e iza NPs de me ales nobles, con inclusión de mé odos químicos (po ejemplo, educción química, educción o oquímica, co-p ecipi ación, descomposición é mica, hid ólisis, e c.) y mé odos ísicos (po ejemplo, deposición de apo , ablación po láse , pulido, e c. .), cuyo obje i o inal es la ob ención de las NPs con un buen ni el de homogeneidad y p opo ciona un con ol p eciso sob e el amaño, la o ma y las p opiedades supe iciales, con el in de ap o echa mejo sus p opiedades ísico-químicas únicas pa a los biosenso es (Do ia e cols., 2012). 51 Exis en una a iedad de mé odos de biosenso es de al a sensibilidad pa a los ácidos nucleicos, p o eínas, an icue pos, enzimas y o as moléculas biológicas median e la explo ación de di e en es p opiedades isicoquímicas de las NPs de me ales nobles, ales como Resonancia del plasmón de la supe icie (SPR), Espec oscopía Raman Ampli icada en Supe icie (SERS), la ac i idad elec oquímica, e c. En e es os mé odos biosenso es, el en oque colo imé ico han sido el más explo ado y, debido a su simplicidad y po abilidad, es el más p ome edo pa a u u os mé odos de diagnós ico. Las NPs de pla a y de o o son las más u ilizadas en el desa ollo de écnicas de biosenso es, ya que es as p esen an p opiedades óp icas únicas den o de la gama de longi udes de onda isibles y son áciles de sin e iza y uncionaliza . En meno medida las NPs de pla ino ambién se han u ilizado po sus p opiedades eléc icas únicas. En la abla 6 se ecogen algunos ejemplos de mues as biológicas eales de ec adas empleando biosenso es basados en nanopa ículas de me ales nobles de acue do con el ipo de NPs y el p incipio de me odología u ilizado (Do ia e cols., 2012). 52 Mé odo Tipo NPs Mues a Re e encia Colo imé ico O o Mu aciones en el gen EGFR del ADN genómico (Lee e cols., 2010) Hepa i is C, i us RNA (Shawky e cols., 2010) Melanina en la leche en e a (Wei e cols., 2010) O o/ aleación Pla a Gen TP53 (Do ia e cols., 2010) Genes de usión BCR- ABL (Bap is a e cols., 2011) NIR O o Células cance ígenas de p ós a a de a ón (Aga wal e cols., 2007) Ganglios lin á icos en a ones (Pan e cols., 2010) Vasos ce eb ales en a ones (Wang e cols., 2004) SERS O o Glucosa en a a (S ua e cols.,2005) ADN del pa ógeno múl iple en mues as clínicas (líquido ce alo aquídeo, heces, pus y los espu os) (Kang e cols., 2010) Pla a Glucosa en a a (Yuen e cols.,2010) O o / Núcleo de Pla a Bioma cado de p o eína os olipasa Cγ1 en las células cance osas (Lee e cols., 2007) Fluo escencia O o P o eína de choque é mico en cul i os de sang e in ec ados po Plasmodium alcipa um (Gui gis e cols., 2011) Pla a Imágenes de la memb ana celula en las líneas celula es (Zhang e cols., 2010) Eléc ico/ Elec oquímico O o Salmonella spp. en mues as de ca ne de ce do (Yan e cols., 2009) IgG humano en sue o humano (Tian e cols., 2009) Fac o de nec osis umo al α (TNF-a) en sue o humano (Yin e cols., 2011) Pla a α-1- e op o eína (AFP) en sue o humano (Che e cols., 2010) Tabla 6. Resumen de los di e en es ipos de mues as biológicas eales que han sido de ec ados empleando biosenso es basados en NPs de me al noble, de acue do a su p incipio de me odología (Adap ada de Do ia e cols., 2012). 53 Una cues ión cla e a ene en cuen a en la in eg ación de la pla a o ma de biosenso es es la c ecien e demanda de una mayo sensibilidad y selec i idad a un cos o mínimo, y la posibilidad de con ola los biosenso es en iempo eal, sob e odo pa a las pla a o mas de cuidado, pa a lo cual ambién hay que ene en cuen a la simplicidad. Teniendo en cuen a es o, los en oques colo imé icos y elec oquímicos son los más p ome edo es debido a su simplicidad, al a sensibilidad y especi icidad, además del hecho de que en la mayo ía de los casos simplemen e no equie en ins umen ación cos osa y compleja pa a log a una espues a adecuada. 4.3.- Empleo de sis emas ensioac i os/nanopa ículas me álicas pa a la de ección de biomoléculas En es e úl imo apa ado, se p opo cionan algunos da os sob e los a ances más ecien es en el desa ollo de biosenso es basados en el empleo de sis emas combinados ensioac i os/nanopa ículas pa a la de ección de biomoléculas. Es a écnica es á ac ualmen e en desa ollo y se dispone de una escasa bibliog a ía pa a su análisis. En e ellos des acan dos a ículos ecien es en los que se p e ende desa olla un bioma cado pa a la mala ia. La mala ia se diagnos ica gene almen e median e écnicas con encionales como la mic oscopía, ELISA, PCR o median e p uebas de diagnós ico ápido. Sin emba go, cada uno de es os mé odos p esen an algunas limi aciones. El mé odo de mic oscopía po ejemplo, equie e de un pe sonal al amen e cuali icado, con expe iencia y el p ocedimien o pa a la p epa ación de las mues as es complicado. Po o a pa e, las p uebas de diagnós ico ápido disponibles en el me cado son poco sensibles y esul an inespecí icas a bajas concen aciones de pa ási os (Jain e cols.,2016). Además ienen un bajo endimien o debido a la humedad y a las al as empe a u as empleadas, ya que u ilizan an icue pos como bioma cado es (Lee e cols., 2014). Debido a es as limi aciones, se p opone un nue o mé odo ápido y e icaz pa a la de ección de la mala ia. Los an icue pos u ilizados como bioma cado es se án sus i uidos po ap áme os, és os ienen muchas en ajas como su ácil análisis, una al a especi icidad, es abilidad é mica y una sencilla sín esis química. 54 Los ap áme os como se mencionó an e io men e son oligonucleó idos de cadena simple que se unen de o ma especí ica a la molécula diana y que se seleccionan a pa i de una “biblio eca” de secuencias (SELEX) (Jain e cols., 2016). Se desa olla on dos ipos de bioma cado es (p o eínas ecombinan es) pa a la de ección de la mala ia: Plasmodium i ax LDH (P LDH) y Plasmodium alcipa um LDH (P LDH) median e el uso de SELEX (Lee e cols., 2014). En elación con ello, exis en a ios es udios en los que se desa olla un ap áme o pa a de ec a la p esencia de mala ia (bioma cado ) a a és de un ensayo basado en ensioac i os ca iónicos, u ilizando AuNPs como sondas de de ección óp ica (Cheung e cols., 2013) (Lee e cols., 2012). Po un lado, se es udia á el b omu o de hexadecil ime ilamonio (CTAB). Es e ensioac i o ca iónico posee dos ca ac e ís icas muy ú iles, una ca ga posi i a que le pe mi e ag ega las AuNPs y la capacidad de ensambla el ADN pa a o ma sup amoléculas con cie as nanoes uc u as (si se a a de ADN de cadena simple o ma án nanoes uc u as cúbicas, mien as que si se a a de ADN de doble cadena se án hexagonales) (Zhou e cols., 2004). Po o o lado, se encuen a el clo u o de benzalconio (BCK) que posee un anillo a omá ico que p opo ciona una en aja signi ica i a en la ag egación de las nanopa ículas. Y inalmen e, el b omu o de dodecildime ilamonio (DDAB) que con iene dos cadenas de alquilo la gas. De los es ensioac i os es udiados, el DDAB es el que p o oca la ag egación comple a de las AuNPs lib es a una concen ación muy baja, seguido de BCK y CTAB. Los cambios de colo se expe imen a on en e 650 nm y 520 nm (Jain e cols., 2016). En cuan o a los ap áme os, se u iliza on es candida os con una mayo a inidad po P LDH. Es os ue on P38, P9 y P45, siendo P38 el de mayo a inidad (Jain e cols.,2016). En o os es udios se u ilizó el pL1 como elemen o de econocimien o (Lee e cols., 2014). Los esul ados de es os es udios con i man que el cambio de colo co esponde con el g ado de ag egación de las AuNPs causada po la in e acción de las AuNPs y el ensioac i o, dependiendo de la concen ación del bioma cado . 55 5.- CONCLUSIONES Finalmen e, de es e abajo de e isión bibliog á ica se pueden ex ae las siguien es conclusiones gene ales y más especí icas. De o ma gene al puede apun a se que: 1.- Las nanopa ículas me álicas pueden se p oducidas con dis in os amaños y p esen a se no uncionalizadas o “desnudas”, y uncionalizadas con di e en es ipos de ligandos. Su ca ga global puede a ia en unción del pH del medio o las ca ac e ís icas es uc u ales. 2.- Las nanopa ículas de o o son las más empleadas como senso es, g acias a sus excelen es p opiedades ísicas, químicas y biológicas, in ínsecas a su amaño nanomé ico. 3.- Has a la echa, los sis emas de nanopa ículas me álicas pa a la de ección de ADN son los más es udiados. 4.- El mé odo colo imé ico, basado en los cambios de la SPR de las nanopa ículas, es un mé odo al e na i o, simple, ápido y de bajo cos e que se puede aplica en mues as pa a la de e minación de ensioac i os y biomoléculas empleando nanopa ículas me álicas. De o ma más especí ica y en elación a los sis emas es udiados puede conclui se: 1.- Las nanopa ículas de Au@ci a o de meno amaño son más sensibles pa a la de ección de los ensioac i os de cadena ali á ica DTAB y CTAB. 2.- El sis ema Au@ a a o es más sensible a la de ección de los ensioac i os DTAB y CTAB cuando se compa a con el sis ema Au@ci a o. 3.-Pa a los ensioac i os pe enecien es al g upo de los b omu os alquil ime ilamonio, se obse a que pa a un mismo sis ema de nanopa ículas, a medida que aumen a el núme o de ca bonos de la cadena ca bonada, el ∆λmáxima es mayo , a la ez que [T]∆λmáxima disminuye. Po an o, es os sis emas son más sensibles a la de e minación de ensioac i os de mayo amaño de cadena. 3.- A endiendo a los alo es de ene gía lib e, las nanopa ículas de o o de meno amaño son las que p esen an mayo a inidad po el ADN, p esen ado alo es mayo es de K y ∆G más nega i os. 4.- Los sis emas compues os nanopa ículas/ ensioac i os pa a la de e minación de biomoléculas es án en con inua in es igación, y p esen an ca ac e ís icas muy p ome edo as, como una mayo capacidad de ag egación/ desag egación en compa ación con los sis emas simples. Es necesa io po an o, segui in es igando en es a línea pa a 56 mejo a an o la sensibilidad de la écnica colo imé ica, basada en los cambios en la SPR de las nanopa ículas, como el g ado de especi icidad po las di e en es biomoléculas. 57 BIBLIOGRAFÍA [1] Aga wal A, Huang SW, O’Donnell M, Day KC, Day M, Ko o N, Ashkenazi S. Ta ge ed gold nano od con as agen o p os a e cance de ec ion by pho oacous ic imaging.J.Appl.Phys. 2007,102. 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