Percepción y señalización de la radiación UV-B en plantas

PERCEPCIÓN Y SEÑALIZACIÓN DE LA RADIACIÓN UV-B EN PLANTAS Trabajo de Fin de Grado UNIVERSIDAD DE SEVILLA, CURSO 2021-2022 Alumno: JOAQUÍN MEDINA JIMÉNEZ PROFESOR: ALFONSO DE CIRES SEGURA DPTO: Biología Vegetal y Ecología. Área de Fisiología Vegetal 1 ÍNDICE -RESUMEN……………………………………………………………………………2 -INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………2 -EFECTOS DE LA LUZ UV-B……………………………………………………….7 -PERCEPCIÓN Y SEÑALIZACIÓN………………………………………………..12 -MECANISMOS DE DEFENSA……………………………………………………..20 -CONCLUSIONES……………………………………………………………………23 -BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..25 2 RESUMEN La radiación ultravioleta B es un factor ambiental fundamental en la vida de las plantas, ya que éstas se encuentran gran parte de su vida expuestas a ella, por lo que han desarrollado mecanismos de percepción y vías de señalización mediante los cuales han podido sobrevivir y funcionar adecuadamente durante generaciones, ya que les permiten mitigar los posibles daños que dicha radiación pueda causar en sus tejidos y células, conformando así unos mecanismos de defensa que cumplen el mismo fin, gracias a los cuales no solamente consiguen evitarlos sino también repararlos una vez se hayan producido. Todos estos mecanismos de percepción y señalización están mediados por la proteína fotorreceptora UVR8, la cual absorbe la radiación UV-B monomerizándose en el proceso e iniciando así un proceso de señalización. En esta revisión se trata de estudiar y analizar todos estos mecanismos moleculares, además de todos los posibles efectos bioquímicos y fotomorfológicos que la radiación UV-B provoca en ellas, ya sean beneficiosos o perjudiciales, con el fin de entenderlos adecuadamente y en profundidad, discerniendo sus funcionamientos. INTRODUCCIÓN La luz del sol alimenta la fotosíntesis y dota a las plantas de información vital sobre el medio que las rodea, pero también puede resultar ser un factor de estrés para las mismas, como es el caso de la radiación ultravioleta B (a partir de ahora, UV-B), la cual es un factor ambiental crucial para las plantas, dando lugar a diversas respuestas que afectan a su desarrollo y/o a su metabolismo, influyendo de manera directa en su viabilidad para sobrevivir y cumplir sus funciones como individuo (Podolec et al., 2021). La respuesta de la planta ante la radiación UV-B depende de la naturaleza del tratamiento que se le esté aplicando con dicha luz, además del tiempo de aplicación y la capacidad de la propia planta para aclimatarse al tratamiento, afectando también otros factores ambientales que interaccionan con ella y con la propia luz (Jenkins, 2009). 3 La energía proveniente del sol que incide sobre la superficie de la Tierra se compone de radiación infrarroja, visible y ultravioleta (Figura 1), siendo esta última la de más interés en esta revisión. La luz ultravioleta (a partir de ahora, UV) se encuentra entre frecuencias que van desde 8x1014 Hz hasta aproximadamente 3x1014 Hz, y sus fotones tienen una energía dentro del rango de 3,2 eV hasta 1,2x103 eV. (Bohórquez-Ballén y Pérez Mogollón, 2007). De esta manera, la luz ultravioleta se divide en tres regiones asignadas arbitrariamente (Ryer, 1997) (Figura 2): ● UV-A: Presenta longitudes de onda que van desde los 315 hasta los 400 nm. ● UV-B: Presenta longitudes de onda que van desde los 280 hasta los 315 nm. Gran parte de esta es bloqueada por la atmósfera, y va a ser el tipo de luz UV objetivo de este escrito, debido a sus diferentes capacidades y efectos sobre las plantas. ● UV-C: Presenta longitudes de onda que van desde los 100 a los 280 nm. Es absorbida en la capa atmosférica, ya que forma ozono al colisionar sus fotones con los átomos de oxígeno. Figura 1: Sección óptica del espectro electromagnético (Ryer, 1997) 4 De toda la radiación solar que incide sobre la Tierra solo el 7,2 % es luz ultravioleta, siendo solo un 1,3% correspondiente a la luz UV-B (Bohórquez-Ballén y Pérez Mogollón, 2007). La respuesta ante UV-B en plantas puede estar mediada por vías de señalización específicas, que incluyen moléculas de señalización de fenómenos como el daño en el ADN, las especies reactivas de oxígeno (ROS) o heridas en los tejidos, así como moléculas de señalización involucradas en la defensa general de la planta; aunque también existen vías de señalización específicas para la luz UV-B, que median las respuestas fotomorfogénicas ante niveles bajos de dicha luz. Estas vías específicas son muy importantes porque su señalización estimula la expresión de genes que se ven involucrados en tareas como la protección ante luz UV, lo cual fomenta la supervivencia de la planta ante los posibles efectos dañinos de la radiación UV-B. Figura 2: Designación común de la franja ultravioleta del espectro electromagnético. La franja delimitada como “Ozone-producing” es el rango de longitud de onda en el que se produce ozono a causa de la radiación UV, la delimitada como “Germicidal” es aquella en la que la radiación tiene acción germicida y la delimitada como “Erythemal” es en la que la radiación produce eritemas (inflamación, rojez) en la piel (Ryer, 1997). 5 Esta señalización fotomorfogénica está mediada por la proteína fotorreceptora UVR8 (del inglés UV-B resistance locus 8), que es un componente específico muy importante para la señalización de tal radiación. Este UVR8, junto con la proteína COP1 (del inglés constitutive photomorphogenic 1), es el responsable de la inducción la expresión del gen HY5 (del inglés elongated hypocotyl 5), que es un factor transcripcional que ocupa un papel crucial en la regulación de diversos genes involucrados en las respuestas fotomorfogénicas ante este tipo de radiación. El UVR8 es una proteína que utiliza triptófanos específicos como cromatóforos para la fotorrecepción de radiación UV-B en su estructura primaria, siendo el único fotorreceptor específico de esta radiación conocido hasta la fecha. La absorción de esta radiación hace que los fotorreceptores diméricos se disocien, ya que las uniones entre los monómeros se neutralizan, esto hace que se inicie la señalización por medio de la interacción con la proteína COP1, afectando transcripcionalmente a la expresión génica como ya se ha comentado anteriormente. Esto supone que el UVR8 sea responsable de la regulación de la transcripción de más de cien genes (Jenkins, 2014 A). El UVR8 se trata de una proteína fotorreceptora única no solo por su mecanismo de acción, sino también por su estructura (Figura 3), la cual se compone de 440 aminoácidos que presentan un núcleo propulsor β de 7 láminas con una extensión N-terminal corta y una región C-terminal aparentemente flexible de unos 60 aminoácidos (Jenkins, 2014 A). Al compararla con otras proteínas de su misma familia, la RCC1 (del inglés Regulator of chromosome condensation 1), se hacen evidentes ciertas singularidades en sus características; entre las que destaca la cantidad de vueltas que presentan sus propulsores β, siendo tres en lugar de las típicas cuatro que presentan el resto de las proteínas de su grupo. Esta proteína se encuentra en el citoplasma y su abundancia no depende de la luz Figura 3: Estructura cristalina de la proteína UVR8 (Di Wu et al., 2012) 6 UV-B, aunque su concentración sí que se encuentra redistribuida a causa de la presencia de dicha luz, generando que se acumule en el núcleo, siendo esto crucial para su funcionamiento. Esto es debido a que es en el núcleo donde se produce la interacción con la región promotora del HY5, siendo esta posiblemente una interacción con las histonas y no con el ADN de manera directa. Además, se cree que en el núcleo también se producen interacciones de la proteína UVR8 con cromatinas de genes que se activan en respuesta a la luz UV-B (Heijde y Ulm, 2012, A), aunque estas asociaciones todavía no se han dilucidado a ciencia cierta. La COP1 es un represor constitutivo de la fotomorfogénesis que interactúa con factores activan dicho proceso, como puede ser el ya mencionado HY5, cumpliendo una función degradativa de los mismos (Saijo et al., 2003). Su estructura (Figura 4) se compone de un dedo de zinc RING (del inglés "Really Interesting New Gene”), de una hélice superenrollada y dominios WD40, es decir, motivos estructurales cortos de aproximadamente 40 aminoácidos. Se trata de una proteína que está presente en plantas superiores y vertebrados, actuando en plantas como una E3 ubiquitin ligasa que se encarga de contener la señalización lumínica por medio de la focalización en los fotorreceptores y en la posterior ubiquitinación y degradación de los factores transcripcionales (Yi y Deng, 2005), en lo que resulta crucial su interacción con otro represor, el SPA1 (del inglés Protein Supressor of PHYA-105 1) (Hoecker et al., 1999), siendo dicha represión dependiente de la luz. El SPA1 es una proteína que actúa como represora del fitocromo A y regula las respuestas a la radiación infrarroja (Saijo et al., 2003). Esta proteína presenta un dominio proteín quinasa, una hélice superenrollada y un dominio WD40 C- terminal, que es muy similar estructuralmente al de la COP1; de hecho, es gracias a esta similaridad en su estructura lo que podría justificar su unión por medio de sus hélices Figura 4: Modelo de la estructura cristalina de la proteína COP1 (Dodonova et al., 2015) 7 superenrolladas y, por tanto, su función conjunta en la señalización. Es por esto por lo que la hélice superenrollada de SPA1 pueda tener la capacidad de aumentar la actividad E3 ligasa de la COP1 (Seo et al., 2003). La expresión del gen HY5 inhibe el crecimiento del hipocótilo y el desarrollo de las raíces laterales, y además se encarga de promover la acumulación de pigmentos de forma fotodependiente (Gangappa y Botto, 2016). Forma parte de diferentes procesos cumpliendo distintos papeles, funcionando como hormona, nutriente y factor de señalización de estrés abiótico o de especies reactivas de oxígeno, lo que hace que sea un gen muy importante en el centro de la red transcripcional de la planta debido a que regula la transcripción de un gran número de otros genes. Se ha observado que su expresión se activa bajo radiación UV-B (además de luz visible), por lo que se hace evidente su papel como señalizador de la misma fomentando el consumo de nitrato desde el brote hasta la raíz, así como el crecimiento de esta última. La percepción de la luz por parte de la planta tiene la capacidad de reprogramar transcripcionalmente su genoma hasta en un 35 % (Gangappa y Botto, 2016), lo cual hace más que evidente la importancia de su señalización y en consecuencia la de las proteínas y genes que acabamos de describir. EFECTOS DE LA LUZ UV-B Cuando hablamos de efectos de la luz ultravioleta la lista de elementos a tener en cuenta es bastante extensa, pero uno de los más destacables es el hecho de que las radiaciones ionizantes son absorbidas por los tejidos biológicos interactuando con, y por ende afectando a, moléculas y átomos de la célula, más particularmente con el agua, lo cual genera radicales libres que pueden dar lugar a diversos daños en diferentes tejidos de todos los seres vivos (Kovács y Keresztes, 2002). Esto es relevante con respecto a las plantas ya que generalmente el citoplasma de las células vegetales contiene un 80 % de agua. Es por esto que los cambios morfológicos en las plantas causados por la radiación UV-B son atribuidos generalmente a cambios químicos y biológicos en los distintos tejidos y células, causados evidentemente por la interacción con los ya mencionados radicales libres. Estos cambios morfológicos son numerosos, tal y como se observa en la Figura 5. 8 Figura 5: Representación de las diferentes alteraciones morfológicas en las plantas causadas por la radiación UV-B. Desetiolación de las plántulas que altera la longitud del hipocotilo, disminución del tamaño de las rosetas y las hojas, cierre estomático, alteración del desarrollo auxiliar y de la ramificación de las raíces (Yadav et al., 2020) La energía luminosa es absorbida por los pigmentos fotosintéticos, lo que hace que los electrones se exciten a un nivel superior. Estos pigmentos se encuentran asociados a proteínas en los complejos nucleares de ambos fotosistemas, I y II. Asimismo, los carotenoides protegen a la clorofila del daño cuando la actividad fotosintética es demasiado alta por saturación de la luz, haciendo que directamente se absorban los electrones excitados. Estos sistemas tanto de protección ante la saturación de la luz como de funcionamiento fotosintético se ven dañados por culpa de la radiación UV-B (Kovács y Keresztes, 2002). Teniendo esto en cuenta se hicieron pruebas en cloroplastos aislados de plántulas de Vigna unguiculata en una situación de 0ºC, tanto con luz como en oscuridad, para probar los efectos bajo radiación UV-B. En los cloroplastos control se observó como toda la cadena de electrones y reacciones del fotosistema 2 se vieron mermadas considerablemente, cosa que también ocurrió con el fotosistema 1. Sin embargo, los 15 Tras la absorción de UV-B el homodímero de UVR8 se convierte de manera instantánea en monómeros. El mecanismo de monomerización del UVR8 puede que funcione de diferentes formas posibles. Una de ellas puede ser mediante la disrupción de las interacciones entre cationes 𝝅 entre residuos de Trp y Arg en la interfaz del dímero, lo cual puede generar cambios conformacionales en torno a R286 y R338, rompiendo así interacciones cruciales para mantener la estructura del propio dímero. Otra opción puede ser que la absorción de UV-B por parte del triptófano dé lugar a la neutralización de las interacciones de los puentes salinos por medio de los pares electrones que se transfieren a la pirámide de triptófano próxima a los residuos de arginina. También se teoriza que el residuo W233 puede actuar como sumidero para la energía de excitación y que una vez se haya producido la absorción de la radiación UV-B esta energía de excitación genere una separación de cargas entre los residuos W233 y W285 que desestabiliza los puentes salinos (Voityuk et al., 2014). Se han realizado cristalografías dinámicas comparando los cristales de UVR8 antes y después de la exposición a radiación UV-B, y se observa que la activación por UV-B también supone una reorientación de los cromóforos W285 y W233 debido a la separación de las cargas, dando lugar a la liberación de una molécula de agua, la cual debilita la red de puentes salinos al combinarse con ella (Zeng et al., 2015), dando lugar entonces a la monomerización. Los análisis espectroscópicos también respaldan esa reestructuración de los residuos de triptófano y arginina/ácido aspártico tras la absorción de la radiación UV-B (Heilmann et al., 2015). La interacción del UVR8 activado por UV-B con la COP1 es muy importante en la vía de señalización de dicho UVR8 (Figura 8). Esta interacción se produce por medio de dos dominios distintos de la COP1, pertenecientes al dominio de repeticiones WD40. El núcleo del dominio del propulsor β del UVR8 interactúa con dependencia de la luz UV- B con la COP1, siendo esta interacción desencadenada por la monomerización causada por la exposición a la luz UV-B. Esta interacción es compatible con las interacciones de los distintos mutantes del UVR8 con la COP1 en ausencia de radiación UV-B, aun así esta interacción por sí sola no tiene la capacidad para iniciar respuestas a UV-B in vivo (Heilmann et al., 2016). Por otra parte, el dominio C-terminal del UVR8 interactúa con la COP1 y resulta crucial para la señalización de la UVR8, de forma que la subregión C27 16 de este dominio contiene un motivo Val-Pro (a partir de ahora, VP), que se encuentra en varias proteínas que interactúan con la COP1. De esta manera las mutaciones presentes en los motivos VP que generan residuos de alanina, lo cual anula la interacción del terminal C del UVR8 con la COP1 y, por ende, disminuye las respuestas fisiológicas de la planta ante la radiación UV-B (Yin et al., 2015). El dominio C-terminal del UVR8 presenta una extensión flexible, lo cual contribuye a la posibilidad por parte del UVR8 de adoptar múltiples conformaciones de la proteína, lo cual incluso podría justificar el estado activo de la misma para la señalización (Camacho et al., 2019). Además, en este dominio C-terminal existe una subregión C17 que parece mostrar interacción con el dominio N- terminal del UVR8, lo cual posiblemente suponga una contribución a las diferentes conformaciones del dominio C-terminal, por lo que la eliminación de esta subregión C17 pueda dar lugar al aumento de la fotomorfogénesis provocada por radiación UV-B, posiblemente ajustando la afinidad de la interacción UVR8-COP1 (Lin et al., 2020). A pesar de que existen estudios que demuestran que existe actividad COP1 por sí misma (Seo et al., 2003), el complejo COP1/SPA funciona como sustrato de un complejo E3 ligasa mayor, el cual contiene un CUL4-DDB1 (del inglés Cullin 4-Damaged DNA Binding Protein 1), de manera que la interacción con el UVR8 perturba dicho complejo y así se forma un complejo UVR8-COP1/SPA único, el cual interrumpe la ubiquitinización de la proteína objetivo. Cabe destacar que la proteína represora SPA no tiene capacidad de interaccionar con el UVR8 de forma directa a pesar de tener mucha similitud con la COP1 secuencialmente, por lo que sólo podrá interactuar con la UVR8 de forma indirecta por medio de la COP1 (Huang et al., 2013). RUP1 y RUP2 son proteína compuestas por repeticiones WD40 muy parecidas a la COP1 y a SPA1-SPA4, pero se diferencian de éstas en que contienen únicamente dichos dominios de repeticiones WD40 precedidos por una corta extensión N-terminal, y no presentan los dominios de hélices superenrolladas ni el dedo de zinc RING que presenta la COP1, ni tampoco los dominios quinasa de las proteínas SPA (Gruber et al., 2010). Estas proteínas RUP1 y RUP2 pueden ser inducidas por la radiación UV-B de forma dependiente de la UVR8 y de la COP1. A diferencia de la COP1, la cual muestra una alta afinidad por el monómero activo de UVR8, estas dos proteínas interactúan tanto con el 17 homodímero como con los monómeros de UVR8, aunque cabe destacar que presentan una afinidad algo más fuerte por estos últimos. También es diferente con respecto a la interacción UVR8-COP1, ya que al parecer solo interviene el motivo VP del C-terminal del UVR8 cuando interactúa con ellas, la RUP1 y RUP2 (Cloix et al., 2012). Es por esto que en el estado inactivo el motivo VP del UVR8 resulta accesible para RUP1 y RUP2, pero mucho menos para COP1; por lo que la fuerte interacción UVR8-COP1 dependiente de UV-B, la cual está posiblemente relacionada con la interacción adicional de la COP1 con el núcleo del UVR8, no se observa cuando actúan RUP1 y RUP2 (Yin et al., 2015). Como ya se ha comentado anteriormente, la RUP1 y RUP2 son responsables de facilitar la redimerización del UVR8 in vivo de manera eficiente, lo cual se hace evidente al comparar los tiempos de redimerización de esta proteína en Arabidopsis in vivo, cuyo proceso dura en torno a 2 horas (Heilmann y Jenkins, 2012), con el mismo proceso in vitro, el cual llega a las 30 horas (Heijde y Ulm, 2012, B). RUP1 y RUP2 cumplen funciones redundantes en cuanto a la redimerización del UVR8, ajustando la relación dímero/monómero con el fin de alcanzar un equilibrio fotoquímico (Findlay y Jenkins, 2016). Es por esto por lo que un cambio absoluto en dicho equilibrio que resulte relevante sólo puede ocurrir bajo condiciones experimentales con una dosis de radiación UV-B que resulte en estrés, ya que en condiciones naturales se tiende a mantener. La temperatura resulta ser un parámetro muy a tener en cuenta con respecto a la regulación de este equilibrio fotoquímico, ya que con temperaturas elevadas se observan unos índices de redimerización superiores. Además de la redimerización del UVR8 con respecto a la luz UV-B, se ha observado que la luz azul fomenta dicho proceso por medio de la activación transcripcional de RUP1 y RUP2 mediante criptocromos (Tissot y Ulm, 2020). RUP1 y RUP2 contienen motivos WD40 que están también presentes en las proteínas que interactúan con DDB1 (del inglés Damaged DNA Binding Protein 1), lo que sugiere que cumplen la función de ser sustratos del complejo receptor CUL4-DDB1-E3 ubiquitin ligasa. Es por esto que resulta destacable que, aunque los motivos WD40 no estén involucrados de forma directa con el DDB1 (Scrima et al., 2008), su interacción se ve mermada cuando dichos motivos mutan (Chen et al., 2010), de manera que estos motivos WD40 mutantes de RUP2 merman su función como represor de la fotomorfogénesis 18 causada por UV-B (Ren et al., 2019). Además de esto se ha observado que el adaptador DHU1 (del inglés DWD Hypersensitive To UV-B 1) del complejo CUL4-DDB1 regula de manera negativa las respuestas mediadas por UVR8 interactuando de forma directa con la COP1 y la RUP1, aunque el mecanismo mediante el cual realiza dicha función aún se desconoce (Kim et al., 2017). El HY5 es un factor de transcripción conformado por una cremallera de leucina que juega un papel fundamental en la señalización de la luz UV-B. Este gen, junto con su homólogo HYH, forma homo y heterodímeros los cuales resultan ser reguladores positivos de la fotomorfogénesis causada por UV-B (Holm et al., 2002), teniendo la capacidad de adherir el ADN y de regular la expresión génica en diferentes loci (Lee et al., 2007). El HY5 y su homólogo HYH cumplen funciones que se solapan entre sí con respecto a las vías de señalización del fitocromo, criptocromo y los fotorreceptores UVR8, aunque cabe destacar que es el HY5 el que presenta una mayor relevancia a la hora de cumplir dicha función en las diferentes condiciones luminosas. El HY5 es sustrato del complejo COP1/SPA E3 ubiquitin ligasa y se estabiliza en presencia de luz, incluyendo la UV-B, lo cual se equilibra con el hecho de que la acumulación de RUP1 y RUP2 en presencia de UV-B funcionan de forma que su diana es el HY5 como parte del complejo CUL4-DDB1 ubiquitin ligasa (Ren et al., 2019). Además, la RUP2 interactúa de forma directa con la COP1, por lo que también inhibe la interacción COP1-HY5, de forma que podemos concluir que COP1 regula negativamente los niveles de RUP2. Es por esto que se cree que la suma de todos estos mecanismos se postula como crucial para la regulación de los niveles de HY5 bajo radiación UV-B. 19 La exposición a luz UV-B da lugar a una inducción de la expresión génica de HY5 y HYH de una manera transitoria y rápida, siendo esta expresión dependiente de UVR8 y COP1. Es por esto que se asume que HY5 y HYH regulan la mayoría de la inducción génica mediada por el UVR8 (Jenkins, 2014 B). El HY5 se asocia con regiones promotoras de varios genes que resultan diana del mismo en presencia de UV-B, en los que encontramos RUP1, RUP2 y COP1, entre otros, tal y como se observa en la figura 9 con la propia COP1; siendo estas asociaciones dependientes de UVR8 (Binkert et al., 2014). La manera exacta en la que el HY5 activa la expresión de sus genes diana en respuesta a UV-B aún no está esclarecida, pero existe un grupo de proteínas B-box, las cuales contienen reguladores transcripcionales que funcionan en consonancia con el HY5 en respuesta a la luz visible (Bursch et al., 2020), por lo que se cree que quizás tengan relación con dicho mecanismo desconocido. Estas proteínas B-Box son una gran familia de factores transcripcionales conformados por dedos de zinc. Muchos de ellos están involucrados en respuestas fotomorfogénicas a la luz visible, normalmente en consonancia con la COP1 y con HY5 (Vaishak et al., 2019), como ya hemos mencionado. Figura 9: Representación esquemática de la monomerización de la proteína UVR8 tras la percepción de UV-B y la rotura de la unión COP1-HY5 (Yadav et al., 2020) 20 MECANISMOS DE DEFENSA La radiación UV-B induce daños en el ADN, teniendo la capacidad de llegar a perjudicar e incluso imposibilitar procesos como la transcripción y/o la replicación del propio ADN. Es por esto por lo que las plantas han desarrollado evolutivamente diferentes mecanismos para poder soportar, o incluso evitar, este tipo de daños, ya que se encuentran en exposición constante a la luz solar. Los principales mecanismos de defensa ante la radiación UV presentes en plantas superiores se diferencian en dos tipos: la filtración óptica de la radiación por medio de los tejidos periféricos de la hoja y la reparación de los daños en el ADN (Hada et al, 2001). Estos mecanismos requieren de la acumulación de sustancias que sean capaces de absorber la radiación UV, que normalmente suelen ser flavonoides y compuestos fenólicos relacionados, como las antocianinas, los cuales se acumulan en las capas más externas de la epidermis de las hojas (Tevini et al., 1991); de hecho se ha observado en ejemplares de Phaseolus trilobus que como respuesta a la luz UV-B desarrollan hojas más gruesas, incrementando en ellas los niveles de flavonoides y antocianinas (Ravindran et al., 2010). Estas sustancias son efectivas a la hora de atenuar los efectos dañinos de forma directa de la radiación UV-B solar, pero sin embargo transmiten radiación fotosintéticamente activa a través de todas las capas de la epidermis foliar. Por otro lado, el mecanismo de defensa que se basa en la reparación de los daños causado por la radiación se centra en la reparación de la escisión de los nucleótidos, lo cual se lleva a cabo mediante etapas endonucleolíticas, la liberación de los oligonucleótidos dañados y la resíntesis del propio ADN. Uno de los mecanismos para reparar estos daños que se ha encontrado en diversas especies de plantas y que es reconocido como la principal vía de reparación de los dímeros de pirimidina causados por la radiación UV-B es la fotorreactivación (Friedberg, 2015). Este proceso es una reparación del ADN de forma directa y en él se produce la monomerización de los ya mencionados dímeros de pirimidina, que se encuentran unidos de forma covalente a causa de la exposición a UV- B, gracias a ser expuesto a luz visible. La fotorreactivación está catalizada por las fotoliasas, las cuales utilizan energía electromagnética de longitudes de onda cuyo rango 21 puede oscilar desde luz azul hasta UV-A (Sancar, 1994). Las fotoliasas reconocen de manera específica a los dímeros de pirimidina y se anclan a ellos formando un complejo molecular que es estable en ausencia de luz, y una vez que se absorbe un fotón de luz dentro del rango antes descrito estos dímeros de pirimidina pasan a ser monómeros (Prado et al., 2011). Este proceso de reparación requiere aproximadamente una hora para completarse (Takeuchi et al., 2007). En plántulas de espinaca (Spinacia oleracea) se observó que los dos mecanismos de defensa a los daños por UV-B funcionan en diferentes proporciones con respecto a la etapa del crecimiento en la que se encuentre el individuo, tal y como se observa en la Figura 10 (Hada et al., 2001). La actividad de las fotoliasas resulta muy elevada en las etapas tempranas del crecimiento, lo que sugiere una alta actividad fotorreactivadora, pero una vez se alcanzan etapas posteriores del crecimiento esta actividad decrece de forma considerable hasta niveles bastante bajos; en contraste con esto, las cantidades de flavonoides y compuestos fenólicos aumentan considerablemente en etapas posteriores del crecimiento, lo que evidentemente sugiere un funcionamiento más cuantioso de la actividad del mecanismo de filtración óptica. Esta disparidad en el crecimiento de ambos tipos de mecanismos sugiere que en aquellas células que no hay replicación activa del ADN la actividad fotorreactivadora no es muy elevada, siendo así su principal mecanismo de defensa ante la radiación UV-B la Figura 10: Cambios en el contenido de sustancias que absorben UV (A) y en la actividad de la fotoliasa (B) en los cotiledones (Círculos huecos) y en las primeras hojas (Círculos cerrados) en plántulas de espinaca durante el crecimiento (Hada et al., 2001). 22 acumulación de estas sustancias acumuladoras, y por el contrario, la actividad de las fotoliasas es mucho más pronunciada en aquellas células que sí replican activamente el ADN (Hada et al., 2001). Al estudiar la actividad de las fotoliasas en la fotorreactivación del ADN en Arabidopsis se observa que los niveles de esta enzima son regulados por la radiación UV-B y que presenta un funcionamiento muy consistente en diferentes especies que están constantemente expuestas a la luz solar y, por tanto, a luz UV-B (Waterworth, 2002), incluso fuera del reino Plantae. Un ejemplo de esto es el pez dorado (Carassius auratus), el cual al permanecer gran parte de su vida en aguas poco profundas está en constante exposición a radiación solar, y por lo tanto UV-B, presentando una regulación de las fotoliasas muy similar a la de las plantas (Yasuhira y Yasui, 1992). Figura 12: Plantas de Arabidopsis desarrolladas a la luz fueron expuesta a oscuridad durante e irradiadas con UV-B (0,36 W m-2) durante diferentes periodos de tiempo ( ◆ 24 horas ▇ 48 horas ▲72 horas) antes de ser irradiadas con luz blanca fotorreactivadora (Waterworth, 2002). Figura 11: Inducción del gen de la fotoliasa de Carassius auratus por medio de luz visible. Expresión relativa del gen de la fotoliasa al ser irradiadas con luz visible (Círculos huecos) o sin ella (Círculos cerrados) (Yasuhira y Yasui, 1992) 23 Otro factor a destacar con respecto a las fotoliasas en Arabidopsis es el hecho de que éstas se mantienen en los tejidos aéreos de la planta hasta 3 días, lo que significa que su vida útil es bastante larga, tal y como se observa en la Figura 12, y que por lo tanto su tasa de reciclaje resulta considerablemente lenta, lo cual implica que cuando una planta ha sido expuesta previamente a luz solar con ciclos día/noche normales siempre tendrá unos niveles basales de fotoliasas presentes en los tejidos, lo que implica que estas plantas siempre van a tener la capacidad de tener actividad fotorreactivadora de forma inmediata cuando son expuestas a luz solar, y por ende a luz UV-B. Esto fue comprobado al colocar en total oscuridad plantas de Arabidopsis, las cuales crecieron en campo abierto, durante 24-48 horas; ya que retuvieron una cantidad considerable, aunque algo reducida, de estas proteínas fotoliasas, mostrando además una reparación casi instantánea de los daños cuando fueron expuesta a radiación UV-B (Figura 12). Por el contrario, aquellas plantas que crecieron en total oscuridad mostraron cantidades ínfimas, incluso indetectables, de las fotoliasas, mostrando un retraso de hasta 2 horas antes de actuar fotorreactivamente cuando fueron expuestas a luz blanca (400-500 nm) (Waterworth, 2002). Esta comparación permite concluir que no es posible que la enzima fotoliasa se mantenga en los tejidos por un periodo superior a 3 días, además de que resulta imposible que se reparen los dímeros de pirimidina causados por la luz UV-B en dichos tejidos hasta que no ocurra de nuevo la síntesis de las fotoliasas, inducida por un cambio en la exposición lumínica. CONCLUSIONES La radiación ultravioleta B resulta ser un factor ambiental crucial para la vida de las plantas, debido a que éstas se encuentran expuestas constantemente a dicha radiación, por lo que es fundamental que presenten mecanismos de defensa que le permitan evitar los daños que pueda causar en la mayor medida de lo posible, así como mitigar los mismos una vez hayan ocurrido. Estos mecanismos de defensa y reparación ante los daños causados por la radiación UV-B en las plantas resultan efectivos y su correcto funcionamiento es posible gracias a que presentan unos mecanismos de percepción y unas vías de señalización que los permiten, estando sus mecanismos fuertemente conectados. 24 Los daños que puede causar la radiación UV-B en las plantas son más que considerables, ya que no solo generan radicales libres que causan cambios morfológicos en sus estructuras causados por cambios químicos y biológicos, instigados por los propios radicales libres, que se producen en los diferente tejidos y células de la misma, sino que también generan lesiones de manera completamente directa en el material genético de sus células, es decir, en el ADN, afectando así a todos los procesos en los que éste está involucrado, con todo lo que eso conlleva. A pesar de todo lo negativo recientemente mencionado, también cabe destacar que la radiación UV-B puede tener cierto efecto positivo en las plantas, ya que puede provocar un efecto positivo a la hora de activar ciertos mecanismos de defensa ante patógenos, así como por el efecto perjudicial que supone de forma directa sobre ciertos posible patógenos del vegetal, debido a que evidentemente esta radiación puede resultar dañina no solo para plantas sino también para todo tipo de animales, hongos, bacterias o virus que puedan ser perjudiciales para la planta. Cabe destacar que este efecto positivo es muy relativo, ya que la capacidad que tiene cada especie para soportar esta radiación es variable, como por ejemplo puede ser el contraste entre dos de las especies mencionadas anteriormente: el brócoli (Brassica oleravea var. Itálica) el cual tiene una tolerancia muy baja a UV-B y presenta daños y síntomas de fototoxicidad con dosis considerablemente bajas de la misma, y el girasol (Helianthus annuus) el cual puede soportar dosis de radiación UV-B hasta 13 veces mayor por día de lo que puede soportar el brócoli. De forma definitiva podemos concluir que a pesar de que la capacidad para soportar la radiación UV-B sea relativa a la especie, los efectos positivos con respecto a la defensa ante patógenos se hacen evidentes aún con dosis pequeñas de dicha radiación, sin necesidad de llegar a causar estrés por la misma, lo cual es inherentemente gracias a los mecanismos de defensa y de percepción y señalización anteriormente mencionados y explicados.