Estudio del efecto del aclaramiento de la colonización por pneumocystis jirovecii en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Medicina ESTUDIO DEL EFECTO DEL ACLARAMIENTO DE LA COLONIZACIÓN POR PNEUMOCYSTIS JIROVECII EN PACIENTES CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA Memoria presentada por Sonia Gutiérrez Rivero para optar al grado de Doctora en Medicina Sevilla, Septiembre de 2023 II III ESTUDIO DEL EFECTO DEL ACLARAMIENTO DE LA COLONIZACIÓN POR PNEUMOCYSTIS JIROVECII EN PACIENTES CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA Memoria presentada por Sonia Gutiérrez Rivero para optar al grado de Doctora en Medicina Directores Enrique Calderón Sandubete Carmen de la Horra Padilla Doctor en Medicina y Cirugía Doctora en Farmacia Profesor Titular Departamento de Medicina Investigadora Senior Instituto de Biomedicina de Sevilla Rubén Morilla Romero de la Osa Doctor en Biología Molecular y Biomedicina Profesor Contrato Doctor Departamento de Enfermería Departamento de Medicina FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE SEVILLA IV V AGRADECIMIENTOS Esta Tesis Doctoral es resultado del trabajo en equipo de las personas que integran el Grupo de Epidemiología Clínica y Riesgo Vascular, del que me siento afortunada de formar parte. Ha sido un largo camino, pero no podría haber llegado hasta aquí sin el apoyo y la colaboración de todos ellos. Quiero agradecer a mis directores de Tesis, al Doctor Enrique Calderón, a la Doctora Carmen de la Horra y al Doctor Rubén Morilla por su dedicación, paciencia y profesionalidad, mi más sincero agradecimiento a todos ellos por confiar en mí y transmitirme el interés y la ilusión por la investigación. Igualmente, quiero mostrar mi agradecimiento a todos los miembros del grupo de investigación y a mis compañeros de Medicina Interna por todos los momentos compartidos y por animarme a continuar adelante con mi trabajo de Tesis Doctoral. A mis padres por cuidar de su mayor legado, la familia, por ser un ejemplo a seguir en esta vida, por la educación y valores transmitidos, de los que mis hermanas y yo intentamos ser un reflejo en nuestro quehacer diario. Agradezco especialmente a mi marido Antonio y a mis hijos, Antonio e Inma, el apoyo incondicional que siempre mostráis, gracias por el esfuerzo, la compresión y por vuestra sonrisa infinita. Finalmente, quiero mostrar mi agradecimiento a mis pacientes y sus familias por permitirme acompañarlos en el transcurso de la enfermedad, de vuestra mano he crecido como profesional y persona. VI ESTUDIO DEL EFECTO DEL ACLARAMIENTO DE LA COLONIZACIÓN POR PNEUMOCYSTIS JIROVECII EN PACIENTES CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA VIII ÍNDICE XVI INTRODUCCIÓN 2 3 1. Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica 1.1. Definición, diagnóstico y evaluación La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) “es una enfermedad frecuente, prevenible y tratable que se caracteriza por la presencia de síntomas respiratorios persistentes y limitación del flujo aéreo debido a anomalías de las vías respiratorias y/o alveolares usualmente producidas por una exposición a partículas o gases nocivos e influenciada por factores del huésped”según la definición de la Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD). Los síntomas más frecuentes en los pacientes con EPOC son la sensación de disnea y la tos crónica con o sin expectoración asociada (Vogelmeier et al., 2022). Para establecer el diagnóstico de EPOC hay que realizar una espirometría, un valor VEF1/FVC (volumen espiratorio forzado en el primer segundo/capacidad vital forzada) inferior a 0,70 tras la prueba broncodilatadora confirma la existencia de una limitación persistente del flujo aéreo en sujetos con síntomas y factores de riesgo compatibles. Otras pruebas complementarias que forman parte del diagnóstico de la EPOC son la radiografía de tórax, el TAC de tórax en casos seleccionados, los volúmenes pulmonares y capacidad de difusión, el estudio del déficit de alfa-1-antitripsina, la oximetría, la medición de gases en sangre arterial si la saturación de oxígeno es < 92%, y el test de la marcha de 6 minutos. Es necesario realizar una evaluación del paciente con EPOC que nos permita conocer la gravedad de la limitación del flujo aéreo, el impacto en su salud y el riesgo de presentar exacerbaciones en el futuro. Para ello, utilizaremos el instrumento de evaluación “ABCD” de la GOLD (Vogelmeier et al., 2022) que precisa en primer lugar de la realización de una espirometría para determinar la gravedad de la EPOC, en segundo lugar deben evaluarse los síntomas mediante la utilización de escalas como el cuestionario del British Medical Research Council (mMRC) para la evaluación de la disnea (Anexo I), o el cuestionario CAT (COPD Assessment Test) (Anexo II) que permite analizar la calidad de vida de las personas con EPOC, siendo el umbral de corte en el mMRC ≥ 2 y en el CAT ≥ 10 para clasificar a los pacientes según la gravedad de los síntomas referidos (Nishimura et al., 2002; Jones et al., 2011). Por último, hay que 4 registrar el número de exacerbaciones previas y necesidad de hospitalización durante las mismas, así como la presencia de enfermedades concomitantes. El instrumento de evaluación “ABCD” de la GOLD combina estos parámetros y permite clasificar a los pacientes con EPOC según la gravedad de la limitación del flujo aéreo en grados espirométricos (de 1 a 4), y según la importancia de los síntomas y el riesgo de exacerbación (en grupos de A a D) cómo se puede observar en la Figura 1. Figura 1. Esquema de valoración “ABCD”de la EPOC propuesta por la GOLD (Modificado de Vogelmeier et al., 2022) 5 Por otro lado, la guía española de la EPOC, GesEPOC 2021 (Miravitlles et al., 2022), propone una nueva clasificación para estratificar el riesgo de los pacientes con EPOC en dos niveles: bajo y alto, utilizando para ello el grado de obstrucción del flujo aéreo medido por el VEF1postbroncodilatador, el nivel de disnea medido por la escala modificada de la mMRC y la historia de agudizaciones durante el año previo (Figura 2). En los pacientes de alto riesgo, GesEPOC 2021 reconoce una nueva distribución por fenotipos que guiará el esquema de tratamiento farmacológico. Estos nuevos fenotipos son el fenotipo no agudizador, el agudizador eosinofílico y el agudizador no eosinofílico. Figura 2. Estratificación del riesgo en pacientes con EPOC según la guía GesEPOC 2021 (tomado de Miravitlles et al., 2022) 6 1.2. Factores que influyen en el desarrollo y la progresión de la enfermedad La EPOC resulta de la combinación de la inhalación prolongada de gases y partículas nocivas y de una serie de factores relacionados con el huésped. Los principales factores asociados con el riesgo de presentar EPOC incluyen: Humo del tabaco El factor de riesgo más frecuente y mejor estudiado para desarrollar EPOC es el hábito de fumar cigarrillos, habiéndose establecido una relación causal entre ambos. Sin embargo, se ha observado una gran variabilidad en la respuesta individual al humo del tabaco. Aunque el número de cajetillas de cigarrillos consumidas anualmente es el factor más relevante para predecir el VEF1, solo explica el 15 % de la variabilidad de este parámetro. Esto sugiere que existen otros factores ambientales o genéticos que se suman al efecto nocivo del tabaquismo a nivel pulmonar, en este sentido, se ha descrito que incluso las personas no fumadoras pueden presentar una limitación crónica del flujo aéreo (Lamprecht et al., 2011). El estudio IBERPOC, un análisis epidemiológico transversal y multicéntrico realizado en nuestro país, reveló que el uso de tabaco por encima de 15 paquetes al año guardaba una estrecha asociación con la presencia de EPOC. Se ha observado que la razón de riesgo (Odd ratio) más elevada (5,4) se presenta cuando el uso del tabaco supera los 30 paquetes al año (Sobradillo et al., 1999). Varios trabajos han confirmado que la exposición al humo de tabaco de forma pasiva podría tener un impacto en la frecuencia de los síntomas respiratorios (Michel et al., 1990). Fumar durante el embarazo implica un riesgo para el feto, ya que puede interferir con el desarrollo pulmonar intraútero, y potencialmente, aumentar la sensibilidad del sistema inmunológico (Tager et al., 1995). El uso de otras formas de tabaco como la pipa, el puro y la pipa de agua, así como el consumo de marihuana, también favorecen el desarrollo de EPOC (Raad et al., 2011; Tan et al., 2009). Nutrición Varios trabajos han encontrado una asociación significativa entre la carencia de nutrientes y la EPOC. Se ha podido comprobar el efecto positivo de los antioxidantes, como el betacaroteno y las vitaminas C y E en este contexto (Britton et al., 1995). 7 Contaminación atmosférica y exposición laboral Se ha establecido una relación entre los gases generados por la cocción en ambientes cerrados, así como los contaminantes de origen ocupacional y químico, y el riesgo de padecer EPOC (Dennis et al., 1996). Varios análisis sistemáticos han reconocido a la biomasa y otros combustibles utilizados para calefacción o cocina en países en desarrollo como factores de riesgo para desarrollar EPOC (Hu G et al., 2010). Las exposiciones ocupacionales, como al polvo orgánico e inorgánico, productos químicos y humos, son factores de riesgo subestimados en la aparición de la EPOC (Eisner et al., 2010; Paulin et al., 2015). Infecciones Las infecciones de las vías respiratorias desempeñan un papel importante en las exacerbaciones de la EPOC, sin embargo, la influencia de estas infecciones en el deterioro de la función pulmonar en adultos es un tema controvertido. Se ha observado que ciertas infecciones, especialmente las de origen vírico (como el adenovirus y el virus respiratorio sincitial), en la infancia, pueden predisponer a la aparición de sintomatología respiratoria o a alteraciones en la función pulmonar, lo que puede favorecer el desarrollo de EPOC en el adulto (Sethi et al., 2008). Estado socioeconómico Se ha descrito una asociación inversa entre el riesgo de desarrollar EPOC y la posición económica (Gershon et al., 2011). Hiperreactividad bronquial y asma La teoría holandesa formulada por Orie y Van der Lende (Orie et al., 1961; Van der Lende R et al., 1970) sostiene que la hiperreactividad bronquial está relacionado con la obstrucción bronquial. Según Barter y Campbell, la exposición incluso a pequeñas cantidades de humo de tabaco puede tener un impacto significativo en la función respiratoria cuando existe hiperreactividad bronquial (Barter et al., 1976). El asma se considera un factor de riesgo para el desarrollo de limitación crónica del flujo aéreo y EPOC (Silva et al., 2004). En ausencia de un diagnóstico clínico de asma, la presencia de hiperreactividad bronquial es un factor de riesgo independiente para el desarrollo de EPOC y mortalidad de causa respiratoria (Rijcken et al., 1987; Hospers et al., 2000). 8 Edad y sexo El envejecimiento es un factor de riesgo para desarrollar EPOC. Debido a un mayor hábito tabáquico en la mujer recientemente, la prevalencia de la EPOC se está igualando en ambos sexos en países desarrollados (Landis et al, 2014). Algunos estudios sugieren una mayor susceptibilidad de la mujer al efecto del tabaco (Foreman et al., 2011). Factores genéticos El déficit de alfa-1-antitripsina es la única alteración genética claramente relacionada con el desarrollo de enfisema. Los pacientes diagnosticados de déficit de alfa-1- antitripsina con un fenotipo PiZZ (presentan niveles de enzima inferiores al 10%) experimentan precozmente enfisema pulmonar pudiendo contribuir a ello el consumo de tabaco, indicando la existencia de una predisposición genética para desarrollar EPOC. No obstante, solo el 1% de los sujetos con EPOC presentan déficit de alfa-1-antitripsina, motivando la búsqueda de asociaciones con polimorfismos de otros genes que podrían ser importantes en la patogenia de la EPOC (Barnes, 1999). Se ha descrito una relación entre el polimorfismo en el promotor del gen que codifica el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), el cual produce un incremento de esta citoquina y un riesgo diez veces más elevado de padecer EPOC en una población tailandesa (Huang et al., 1997). Además, se ha encontrado asociación entre el riesgo de desarrollar EPOC y los genes que codifican la metaloproteasa de matriz 12 (MMP-12) y la glutatión S tranferasa (Ding Z et al., 2019). Otros trabajos han encontrado relación entre una variante polimórfica de la hidrolasa epóxido microsomal, enzima implicada en el metabolismo de los epóxidos generados por el humo del tabaco, y un riesgo cinco veces más elevado de padecer EPOC (Smith et al., 1997). Procesos que se dan durante la gestación, el parto y las exposiciones durante la infancia y la adolescencia Las circunstancias que acontecen en estos procesos pueden tener un impacto en el desarrollo pulmonar (Barker et al 1991, Todisco et al 1993). Los factores presentes en la infancia, a los que se hace referencia como "limitantes", son tan importantes en la función pulmonar en el adulto como la exposición al tabaco (Lawlor et al., 2005). 9 1.3. Patogenia La limitación del flujo aéreo es la principal alteración funcional que tiene lugar en las personas que desarrollan EPOC, debido al enfisema y a la obstrucción de las vías respiratorias finas por la existencia de células, moco y fibrosis. Los mecanismos de la respuesta inflamatoria observada en el árbol respiratorio de sujetos con EPOC no son totalmente conocidos, de tal manera que en individuos genéticamente predispuestos la inhalación crónica del humo del tabaco produciría inflamación y atracción de células inflamatorias a los espacios aéreos terminales del pulmón, estas células liberarían proteinasas elastolíticas que dañarían la matriz extracelular de los pulmones produciendo la muerte de la estructura celular por el estrés oxidativo y pérdida de unión a la matriz celular, por último, la reparación ineficaz de la elastina y tal vez de otros componentes de la matriz extracelular produciría mayor tamaño de los espacios aéreos. La inflamación sistémica también juega un papel en la evolución de las enfermedades concomitantes presentes en los pacientes con EPOC (Barnes et al., 2016, Calderón et al., 2007). Las principales teorías que intentan explicar la respuesta inflamatoria en pacientes con EPOC son: 1.3.1. Desequilibrio proteasa-antiproteasa La matriz extracelular del pulmón se caracteriza principalmente por la presencia de colágeno tipo IV, proteoglicanos y elastina. La elastina desempeña un papel fundamental en la función pulmonar, ya que es el principal componente de las fibras elásticas y contribuye a mantener la integridad del parénquima pulmonar. Se ha propuesto que la degradación del tejido conectivo pulmonar está mediada por diversas proteasas, como la elastasa, la proteasa 3, algunas proteasas séricas derivadas de neutrófilos y las catepsinas. Se ha descrito que estas proteasas pueden provocar la aparición de enfisema en modelos animales. La hipótesis plantea que el desequilibrio entre las enzimas que degradan la elastina y sus inhibidores determinaría la predisposición del parénquima pulmonar a la destrucción característica del enfisema, de tal manera, que si las proteasas responsables de la degradación superan a los inhibidores, se produce una acumulación excesiva de elastasa y una degradación descontrolada de la elastina, lo que provocaría daño en el tejido pulmonar y desarrollo de enfisema. 16 Abandono del hábito tabáquico Abandonar el consumo de tabaco reduce la progresión de la enfermedad. Cuando los pacientes con EPOC leve-moderada dejan de fumar, experimentan una disminución menos pronunciada en la velocidad de deterioro del VEF1en comparación con aquellos que siguen fumando (Scanlon et al., 2000). Intervenciones como el apoyo conductual, las terapias de reemplazo de nicotina, así como el uso de vareniclina, bupropión o nortriptilina aumentan las tasas de abandono del hábito tabáquico (Cahill et al 2013, Stead et al 2016). Vacunación La vacunación antigripal disminuye la mortalidad y la cifra total de exacerbaciones. La vacunación antigripal, antineumocócica, así como la vacunación frente a la infección por SARS CoV2 están recomendadas en pacientes con enfermedades respiratorias crónicas (Wongsurakiat et al 2004, Poole et al 2006, Villar-Álvarez et al., 2021). Rehabilitación respiratoria y fomento de la actividad física La rehabilitación respiratoria está recomendada en pacientes con EPOC con síntomas significativos y/o que tengan un alto riesgo de exacerbaciones. Este enfoque terapéutico tiene como objetivo mejorar los síntomas respiratorios, la función pulmonar y contrarrestar o revertir las repercusiones a nivel sistémico (Nici et al., 2006). La actividad física juega un papel importante en esta rehabilitación, al mejorar la fuerza y resistencia muscular, reducir la sensación de falta de aire y, en general, mejorar la calidad de vida percibida (Gosselink et al., 2011). Adicionalmente, se ha observado que los pacientes con EPOC que mantienen un nivel de actividad física más alto presentan un menor riesgo de ser hospitalizados (Seidel et al., 2012). Soporte nutricional En pacientes que padecen EPOC y presentan malnutrición, se ha observado que los suplementos nutricionales tienen un efecto positivo. Estos suplementos han demostrado ser capaces de aumentar significativamente el peso corporal, mejorar la fuerza de los músculos respiratorios y, en consecuencia, mejorar la calidad de vida de los pacientes (Ferreira et al., 2012). 17 1.5.1 Tratamiento farmacológico de la EPOC estable Evaluar los síntomas específicos de cada individuo, así como su historial de exacerbaciones previas, ayudará a determinar la mejor estrategia terapéutica. Además, es importante considerar y abordar cualquier enfermedad concomitante o comorbilidad que pueda estar presente, ya que estas condiciones pueden influir en el curso y la respuesta al tratamiento de la EPOC. Broncodilatadores Los broncodilatadores son fundamentales en el tratamiento de la EPOC, se administran de manera continua para prevenir o aliviar los síntomas. Aumentan el VEF1y modifican otras variables espirométricas. Según el mecanismo de acción se clasifican en: a) agonistas beta-2-adrenérgicos: se administran por vía inhalada, pueden ser tanto de corta duración (SABA) como de larga duración (LABA), b) fármacos antimuscarínicos: se administran por vía inhalada, pueden ser de acción corta (SAMA) y larga duración (LAMA); y c) metilxantinas. se administran por vía oral y tienen un efecto broncodilatador moderado en la EPOC estable. El beneficio aparece con la administración de dosis que pueden resultar tóxicas, hay pocos datos y contradictorios sobre el efecto en dosis reducidas (Zhou et al., 2006, Cosío et al., 2016). Fármacos antiinflamatorios El mejor parámetro clínico para evaluar la eficacia de los fármacos antiinflamatorios es la presencia de exacerbaciones. Corticoides inhalados El tratamiento sólo con corticoides inhalados no modifica a largo plazo el VEF1ni la mortalidad en pacientes con EPOC (Calverley et al., 2018). En aquellos pacientes con EPOC moderada a muy grave y con exacerbaciones, la combinación de un corticoide inhalado y un LABA es más eficaz que los fármacos individuales para mejorar la función pulmonar y disminuir el número de exacerbaciones (Bafadhel et al., 2018, Siddiqui et al., 2015). Por otro lado, diferentes estudios han corroborado la capacidad predictiva de la eosinofilia periférica en la respuesta clínica a los corticoides inhalados en pacientes con EPOC (Pascoe et al., 2015, Golpe et al, 2020), de tal forma que en pacientes con EPOC con un recuento de eosinófilos < 100 células/µl los corticoides inhalados tienen poco o ningún efecto, sin embargo, aquellos con un recuento de 18 eosinófilos en sangre > 300 células/ µl tienen mayor probabilidad de beneficio con el tratamiento con corticoides inhalados. El tratamiento triple LABA/LAMA/corticoide inhalado mejora la función pulmonar y disminuye la frecuencia de exacerbaciones (Frith et al., 2015, Singh et al., 2016). Corticoides orales Los corticoides sistémicos son útiles en el tratamiento de las exacerbaciones con mejoría de la función pulmonar y la sensación de disnea, sin embargo, no tienen utilidad en el tratamiento crónico de la EPOC por las complicaciones sistémicas que presenta sin la obtención de beneficio. Inhibidores de la fosfodiesterasa-4 Roflumilast se administra por vía oral y actúa reduciendo la inflamación al inhibir la degradación del AMP cíclico intracelular. En pacientes con EPOC grave o muy grave y antecedentes de exacerbaciones mejora la función pulmonar, y disminuye las exacerbaciones moderadas y graves en pacientes tratados con dosis fijas de broncodilatadores (Calverley et al., 2009). Antibióticos En pacientes con antecedentes de exacerbaciones el tratamiento con azitromicina o eritromicina durante un año disminuyó el número de exacerbaciones (Seemungal et al., 2008, Uzun et al., 2014). Mucolíticos y antioxidantes El tratamiento con mucolíticos como la carbocisteína y la N-acetilcisteína disminuye las exacerbaciones en determinados grupos de pacientes (Poole et al., 2015). Otros tratamientos Varios estudios han evaluado la eficacia del anticuerpo monoclonal anti-IL-5 mepolizumab y el anticuerpo anti-receptor de IL-5-a beralizumab en pacientes con EPOC grave, exacerbaciones frecuentes y eosinofilia ( Pavord et al., 2017, Criner et al., 2019), aunque se requieren más estudios mepolizumab podría tener un papel en pacientes con EPOC con aumento del recuento de eosinófilos en sangre periférica y uso frecuente de corticoides orales. 19 El tratamiento para el déficit de alfa-1-antitripsina se recomienda en aquellos pacientes con enfisema pulmonar asociado a un déficit severo de alfa-1-antitripsina, ya que puede contribuir a reducir el deterioro de la función pulmonar y tener un impacto positivo en la preservación del tejido pulmonar (Chapman et al., 2015). El esquema de tratamiento de la GOLD 2022 para la EPOC estable según el esquema ABCD tras individualizar los síntomas y el riesgo de exacerbaciones, recomienda en los pacientes del grupo A tratamiento broncodilatador de corta o larga duración, en los pacientes del grupo B recomienda tratamiento broncodilatador de acción prolongada (LABA o LAMA), en los pacientes del grupo C recomienda tratamiento broncodilatador iniciando terapia con un LAMA, finalmente en los pacientes del grupo D estaría recomendado tratamiento broncodilatador con un LAMA y en aquellos con síntomas graves se aconsejaría LAMA + LABA o LABA + corticoides inhalados en aquellos con >300 eosinófilos/µl en sangre periférica (Vogelmeier et al.,2022 ). 1.5.2 EPOC, comorbilidad y rasgos tratables La EPOC suele coexistir con otras patologías que pueden ser trascendentes en el curso de la enfermedad. Estas enfermedades deben identificarse y tratarse. Las enfermedades cardiovasculares son comorbilidades frecuentes en los pacientes con EPOC. La última actualización de la guía GesEPOC aborda la importancia de identificar los rasgos tratables de los pacientes con SAE, definiendo rasgos tratables como “aquellas características clínicas, fisiológicas o biológicas presentes en cada individuo, que se pueden identificar mediante pruebas diagnósticas o biomarcadores y que tienen un tratamiento específico, como pueden ser la presencia de isquemia miocárdica, hipertensión pulmonar o la baja cumplimentación del tratamiento”(Miravitlles et al., 2022). 20 2. Pneumocystis jirovecii 2.1. Perspectiva histórica Pneumocystis jirovecii, anteriormente conocido como Pneumocystis carinii sp. f. hominis (Stringer et al., 2002), es un hongo atípico, ubicuo, extracelular, unicelular, con tropismo pulmonar y gran estenoxenismo que se transmite fundamentalmente por vía aérea. Se caracteriza por ser un microorganismo no cultivable del que, desde su descubrimiento a principios del siglo XX, se han logrado importantes avances en el conocimiento sobre su epidemiología, biología y genética (Calderón et al., 2002, Calderón et al., 2011). En 1909, Carlos Chagas (1879-1934) descubrió por primera vez un microorganismo al estudiar una nueva enfermedad que se producía en los trabajadores de las vías del ferrocarril en Minas Gerais. Al inocular sangre infectada con un nuevo tripanosoma humano en cobayas, estas morían después de cinco días. Chagas pudo observar la presencia de numerosas formas esquizogónicas en los pulmones, aunque interpretó erróneamente que formaban parte del ciclo vital del Trypanosoma cruzi, al que denominó Schizotrypanum cruzi (Chagas, 1909). Al año siguiente, Antonio Carini (1872-1950), quien en ese momento era el director del Instituto Pasteur de Sao Paulo, describió quistes similares en los pulmones de ratas infectadas con Trypanosoma lewisi (Carini, 1910). No obstante, al sospechar que estos quistes pertenecían a un organismo desconocido, envió muestras histológicas a Charles Louis Alphonse Laveran del Instituto Pasteur de París, quien había recibido el Premio Nobel en 1907 por sus estudios sobre el paludismo. El matrimonio Delanöe, discípulos de Laveran en el Instituto Pasteur, también observó quistes similares en el tejido pulmonar de ratas de las cloacas de París que no estaban infectadas por tripanosomas. En 1912, lograron aclarar que los quistes observados por Chagas y Carini pertenecían a un nuevo género y especie desconocidos, no relacionados con los tripanosomas. El matrimonio sugirió el nombre de Pneumocystis carinii para este nuevo microorganismo. El prefijo "Pneumo-" se utilizó por su afinidad por el pulmón, "-cystis" debido a su morfología característica y "carinii" en honor al Dr. Antonio Carini, quien les había proporcionado las muestras (Delanöe, 1912). El matrimonio Delanöe continuó sus investigaciones sobre el nuevo microorganismo y realizaron un experimento para estudiar las vías de transmisión. Aislando dos ratas que 21 habían sido previamente liberadas de ectoparásitos en un nuevo recinto, esperaron tres meses después de que las ratas dieran a luz a cuatro crías para comprobar que tanto las madres como las crías estaban infectadas por el nuevo microorganismo, concluyendo que éste debía transmitirse por vía aérea. Además, especularon sobre la afinidad del nuevo microorganismo con la familia de las Coccidia, que son organismos del orden de los esporozoos. De esta manera, en 1912, el matrimonio Delanöe señaló lo que hoy en día son nuestros conocimientos sobre este patógeno (Delanöe, 1912). Tras comunicar sus hallazgos, tanto Antonio Carini (Carini, 1914) como Carlos Chagas (Chagas, 1913) rectificaron sus hallazgos iniciales, respaldando los descubrimientos del matrimonio Delanöe. En 1913, Aragao sugirió que este nuevo organismo pertenecía al género Klosiella, aunque reconoció su similitud con otro protozoo del intestino de los ratones, el Cryptosporidium (Aragao, 1913). En los escasos estudios posteriores, se encontró Pneumocystis en una amplia gama de mamíferos sin que se evidenciara capacidad de causar enfermedad, lo que llevó a pensar que era solo un comensal. Como resultado, el interés científico por Pneumocystis disminuyó en las dos décadas siguientes. Pasaría una generación antes de que Pneumocystis se asociara con alguna enfermedad humana, si bien, quizás sin querer, Chagas ya había descrito la presencia de los quistes característicos del parásito en una autopsia en 1911 (Chagas, 1911). En 1938, Ammich (Ammich, 1938) y Benecke (Benecke, 1938) describieron una forma de neumonía de causa no aclarada llamada neumonía intersticial de células plasmáticas, que afectaba principalmente a niños prematuros y/o malnutridos y que se volvió epidémica en Europa Central durante la Segunda Guerra Mundial y en los años posteriores. Los científicos holandeses Van der Meer y Brug (Van der Meer et al., 1942) demostraron la primera asociación histológica entre la neumonía intersticial de células plasmáticas y Pneumocystis, si bien, este hecho pasó casi desapercibido, siendo considerados frecuentemente como sus primeros descubridores los investigadores checos, Vanêk, Jírovec y Lukes al describir la causa de esta neumonía una década después (Vanêk et al., 1953). 22 Cuando se reconoció que Pneumocystis era el agente causal de la neumonía intersticial de células plasmáticas, no se disponía de ningún tratamiento efectivo. En 1958, dos investigadores húngaros, Ivady y Paldy (Ivady et al., 1958), informaron por primera vez sobre la eficacia de un fármaco, la pentamidina, frente a Pneumocystis. Veinte años antes, este fármaco ya se había utilizado con éxito en el tratamiento de infecciones por protozoos (King et al., 1938). El uso de la pentamidina redujo drásticamente la mortalidad de esta forma de neumonía, la cual también estaba disminuyendo en Europa debido a la mejora de las condiciones de vida después de la guerra. Sin embargo, comenzaron a notificarse casos esporádicos cada vez más frecuentes de neumonía por Pneumocystis tanto en Europa como en EEUU en niños y adultos con diferentes causas de inmunodepresión (Rubin et al., 1960). El uso de la pentamidina reveló la alta incidencia de efectos adversos graves de este fármaco, lo que impulsó la necesidad de desarrollar nuevos tratamientos. En 1975, Hughes (Hughes et al., 1975), trabajando en Memphis, descubrió la eficacia de la combinación de trimetoprima/sulfametoxazol contra Pneumocystis, la cual se convirtió en la base del tratamiento y la quimioprofilaxis de esta infección. Posteriormente, en febrero de 1981, una auxiliar de farmacia de los Centros para la Prevención y Control de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos llamada Sandra Ford informó sobre el aumento en las solicitudes de pentamidina para el tratamiento de la neumonía por Pneumocystis en sujetos con inmunodepresión de causa desconocida en Nueva York. Esto constituyó la primera evidencia de la epidemia de SIDA (Centers for Disease Control, 1981, Armengol, 1995). En la actualidad, la infección por Pneumocystis jirovecii no se limita solo a pacientes con SIDA, sino que también es una causa común de infección oportunista en pacientes bajo tratamiento inmunosupresor y en pacientes con neoplasias (Cisneros et al., 1998, Ognibene et al., 1995, Varthalitis et al., 1993). Además, se han descrito casos de neumonía por Pneumocystis en pacientes sin evidencia de inmunodeficiencia (Jacobs et al., 1991, Cano et al., 1993). 23 2.2 Taxonomía La clasificación taxonómica de Pneumocystis ha cambiado desde su descubrimiento, considerado inicialmente un protozoo, en 1970, Vavra y Kucera sugieren que puede ser un hongo basándose en sus estudios ultraestructurales (Vavra et al., 1970), hecho que sería aclarado con la llegada de las técnicas de biología molecular. El primer indicio molecular de que Pneumocystis es un hongo fue publicado por Edman y colaboradores en 1988, al año siguiente, estos mismos resultados fueron confirmados por Stringer (Stringer et al., 1989). Las técnicas moleculares han permitido conocer la existencia de una gran divergencia a nivel genómico entre los aislamientos de Pneumocystis obtenidos de diferentes especies de mamíferos, lo que sugiere que existen diferentes tipos de Pneumocystis específicos de cada huésped (Dei-Cas et al., 1998). Hasta nombrar cada especie del género Pneumocystis, se propuso un sistema provisional de nominación trinomial en el que se usaba la denominación Pneumocystis carinii seguido de “forma specialis”y el nombre del mamífero al que infectaba, siendo Pneumocystis carinii f. sp. hominis (P. carinii f.s.p. hominis) el parásito específico que infecta a los humanos. En 1976, Frenkel renombró al microorganismo que infecta a los seres humanos y lo clasificó como una especie dentro del género Pneumocystis. Anteriormente, se le conocía como Pneumocystis carinii f.s.p. hominis. Frenkel propuso el nombre de Pneumocystis jirovecii (Frenkel, 1976; Frenkel, 1999) en reconocimiento al parasitólogo checo Otto Jirovec, quien fue uno de los primeros investigadores dedicado al estudio de Pneumocystis en humanos. Esta propuesta de nomenclatura fue aprobada posteriormente en una reunión sobre taxonomía y nomenclatura de Pneumocystis (Stringer et al., 2001). 24 2.3. Características biológicas, patogenia y respuesta inflamatoria El conocimiento del ciclo vital de Pneumocystis ha sido posible gracias al estudio mediante microscopía óptica y electrónica de las formas encontradas en el tejido pulmonar infectado. Se han descrito tres estadios en el ciclo vital del microorganismo: trofozoito, esporozoito y quiste, junto a formas intermedias adicionales como puede observarse en la Figura 3. El trofozoito o forma trófica es de tamaño pequeño (1-4 μm), presenta una forma variable y se agrupa en acúmulos. Se puede identificar en la tinción de Giemsa por su núcleo teñido de color rojo y su citoplasma de color azul. Durante la fase asexual del ciclo vital, las formas tróficas se multiplican por fisión binaria. Durante la fase sexual, las formas tróficas haploides se conjugan para formar un cigoto diploide que luego pasa a ser un prequiste o esporocito de aproximadamente 4-6 μm. Después de los procesos de meiosis y mitosis, se convierte en un quiste que contiene ocho cuerpos intraquísticos o esporas haploides. Este quiste, de tamaño entre 5 y 8 μm, tiene una pared celular gruesa y se tiñe bien con tinciones como la metenamina argéntica o el azul de toluidina O. Figura 3. Ciclo vital de Pneumocystis (tomado de Calderón et al., 2011) 25 La infección por Pneumocystis jirovecii en los seres humanos es una antropozoonosis, donde el único reservorio conocido es el ser humano (Wissmann et al., 2010). Los estudios realizados sugieren que P. jirovecii se transmite por vía horizontal, a través del aire, y también existe la posibilidad de transmisión vertical (transplacentaria), de la madre al hijo en el embarazo (Montes-Cano et al., 2009). Después de inhalar Pneumocystis, el microorganismo evita las defensas del tracto respiratorio superior y se deposita en los alvéolos. Las formas tróficas de Pneumocystis tienen una afinidad particular por los neumocitos tipo I en los alvéolos. La respuesta inmune frente a Pneumocystis involucra interacciones complejas entre linfocitos, macrófagos alveolares y neutrófilos, además de mediadores solubles que participan en la eliminación de la infección. Los macrófagos alveolares son las principales células fagocíticas en el árbol respiratorio inferior y tienen un papel importante en la captura y degradación de los microorganismos en los pulmones. Actúan reconociendo patrones moleculares asociados a patógenos a través de receptores de reconocimiento de patrones (RRP), de tal forma que en ausencia de opsoninas en el fluido epitelial, la unión de Pneumocystis a los macrófagos alveolares está mediada por los receptores de manosa de los macrófagos, que suponen un importante mecanismo de eliminación innata en un huésped inmunocompetente. Como podemos observar en la Figura 4, una vez que el patógeno es fagocitado por los macrófagos, se produce la activación del factor de transcripción nuclear potenciador kappabeta (NF-kB) y la liberación de citoquinas inflamatorias como IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, MMP y proteína inflamatoria de los macrófagos (PIM-2). Posteriormente, a través de la producción de radicales libres y productos reactivos del oxígeno, el patógeno es destruido (Kolls et al., 1993, Cañas et al., 2018). Las células dendríticas, que se encuentran en el tejido intersticial y peribronquial, también desempeñan un papel importante en la respuesta innata frente a Pneumocystis al presentar antígenos y activar la respuesta celular y humoral en los ganglios linfáticos. Los linfocitos CD4+ son esenciales en la defensa contra Pneumocystis al reclutar y activar otros mediadores celulares como monocitos y macrófagos. Tanto el TNF-α producido por los macrófagos como la IL-1 son requeridos para iniciar la respuesta pulmonar a la infección por Pneumocystis mediada por CD4+. Estos linfocitos CD4+ 32 por VIH, se ha observado que el lavado orofaríngeo puede tener una sensibilidad del 78% en la detección de Pneumocystis jirovecii utilizando un protocolo estándar de PCR (Durand-Joly et al., 2005). Otros estudios han comprobado la utilidad del lavado orofaríngeo para el diagnóstico de la PcP y para la identificación de sujetos colonizados no inmunodeprimidos (Respaldiza et al., 2006). La técnica de PCR anidada para amplificar el gen del ARN mitocondrial de la subunidad mayor del ribosoma (mtLSU rRNA) ha demostrado ser altamente sensible y específica en la detección de la presencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en pacientes no inmunodeprimidos utilizando muestras de lavado orofaríngeo, describiendo una sensibilidad superior al 95% y una especificidad cercana al 88% (Morris et al., 2008; de la Horra et al., 2006). La PCR se ha utilizado para amplificar diferentes genes de Pneumocystis jirovecii, como el gen que codifica la enzima dihidropteroato-sintasa (DHPS), el gen de la glicoproteína mayor de superficie (MSG), los genes ITS o el gen de la DHFR (Wakefield et al., 1990; Durand-Joly et al., 2005; Hugette et al., 2008). Uno de los genes más empleados para la identificación de la presencia de Pneumocystis es el gen mtLSU rRNA. Se trata de un gen multicopia, lo que facilita su detección y amplificación mediante la técnica de PCR incluso en situaciones de baja carga del microorganismo. Este gen está relacionado con funciones metabólicas básicas de la célula, como la síntesis de proteínas y la producción de energía. Debido a su importancia funcional y a su conservación genética, este gen presenta un alto grado de conservación genética. Varios estudios sugieren que este gen puede emplearse con fines diagnósticos, para estudios epidemiológicos y para seguimiento tras realizar tratamiento (Helweg-Larsen et al., 1997; Lu JJ et al., 1995). En el gen mtLSUrRNA se han identificado seis polimorfismos determinados por cambios en los nucleótidos 85 y 248 que han permitido definir diferentes genotipos: genotipo 1 (85C/248C), genotipo 2 (85T/248C), genotipo 3 (85T/248C), genotipo 4 (85C/248T), genotipo 5 (85A/248T) y genotipo 6 (85T/248T). La identificación de estos polimorfismos se puede determinar mediante secuenciación directa del fragmento de ADN obtenido mediante la PCR (Montes-Cano et al., 2004). 33 Otro de los genes más estudiados de Pneumocystis jirovecii es el gen que codifica la síntesis de la DHPS, un gen unicopia, en el que mutaciones en los nucleótidos 55 y 57 han demostrado estar asociadas a resistencia a las sulfamidas, un grupo de medicamentos antimicrobianos que se utilizan en el tratamiento de la PcP (Thomas et al., 1997, Huang et al., 2004, de la Horra et al., 2021). En este gen se han descrito cuatro genotipos, el análisis de polimorfismos de restricción con enzimas específicas permite identificar las diferentes mutaciones puntuales descritas en la secuencia del gen de la DHPS (Calderón et al., 2004). La técnica de PCR anidada puede tener un mayor riesgo de contaminación en comparación con la PCR simple (Durand-Joly et al., 2005), debido a que implica múltiples rondas de amplificación, lo que aumenta la posibilidad de que se introduzcan contaminantes durante el proceso. La utilización de la PCR atiempo real permite obtener un resultado más rápido, reduce la posibilidad de contaminación y permite cuantificar la carga del microorganismo favoreciendo la detección del estado de colonización en los sujetos con baja carga de microorganismos (Flori et al., 2004). Un resultado positivo para P. jirovecii por PCR no garantiza la presencia de una infección activa o viable del microorganismo en la muestra estudiada. Para abordar esta limitación, se han desarrollado métodos basados en la amplificación del ARN mensajero del microorganismo, con una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 86 %, lo que ayuda a resolver esta dificultad y proporciona información más precisa sobre la presencia y viabilidad del microorganismo (de Oliveira et al., 2007). 2.6. Colonización por Pneumocystis jirovecii La presencia de portadores "sanos" o colonizados por Pneumocystis se define como la identificación del microorganismo o la detección de su ADN mediante PCR en muestras respiratorias en un paciente sin manifestaciones clínicas ni radiológicas de neumonía (Wissmann et al., 2010). En esta línea, la primera evidencia de la existencia de pacientes colonizados se llevó a cabo utilizando inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales como método de diagnóstico en una población de bronquíticos crónicos, que por ser expectoradores habituales no tenían que realizarse fibrobroncoscopia para la obtención de muestras. 34 Con este trabajo se pudo evidenciar en nuestro medio la presencia de P. jirovecii en un 10% de estos sujetos sin causas de inmunodepresión ni datos de neumonía (Calderón et al., 1996). Posteriormente, se llevaron a cabo estudios que utilizando técnicas más modernas para la detección de P. jirovecii, como la PCR anidada, situaron la prevalencia de pacientes colonizados por P. jirovecii con diferentes enfermedades respiratorias crónicas en nuestro medio entre un 21-55 % (Calderón et al., 2007, Respaldiza et al., 2005, Martín Juan et al., 2008). Otros estudios han descrito el estado de portador en mujeres embarazadas (Vargas et al., 2003) y en pacientes con alguna causa de inmunodepresión como infección por VIH, patología oncológica, bajo tratamiento inmunosupresor o con patologías del tejido conectivo (Morris et al, 2008; Krajicek et al, 2009). Se desconoce si la persistencia o no del microorganismo depende de la virulencia del mismo o de características del huésped, aunque es posible que diferencias en la respuesta inmunológica frente a la infección puedan condicionar la capacidad para eliminar el parásito, la situación de portador o el desarrollo de neumonías. En el estudio realizado por Board y colaboradores (Board et al., 2003), se investigó la respuesta inmune tras la inoculación de Pneumocystis en monos infectados con el virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), de forma que algunos monos desarrollaron neumonía aguda, y otros se mantuvieron colonizados. Tras la inoculación, se observó un incremento en la infiltración de linfocitos CD8+ y neutrófilos tanto en los monos con neumonía como en aquellos con colonización. Esta infiltración persistió a lo largo de la infección, incluso en los monos que no desarrollaron neumonía. Además, se encontraron niveles elevados de TNF-α, INF-γ e IL-8 en muestras de LBA durante el estado de colonización, lo que sugiere la posibilidad de que el daño pulmonar inducido por Pneumocystis se produzca incluso en situaciones de colonización. Otros estudios han revelado un aumento en la actividad proteolítica en las proteasas derivadas del huésped (MMP-2, MMP-9) y en las de Pneumocystis en pacientes con PcP (Qu et al., 2000). Esto sugiere que la colonización por Pneumocystis juega un papel en el desarrollo de enfisema pulmonar a través de la estimulación de proteasas. En modelos experimentales con Pneumocystis en ratas, se ha demostrado que el 35 microorganismo tiene actividad proteasa y elastasa contribuyendo a la degradación de la barrera alveolo-capilar (Atzori et al., 1999). Un estudio realizado por nuestro grupo demostró que pacientes con EPOC colonizados por P. jirovecii tenían niveles de linfocitos totales y CD4+ más elevados en sangre periférica que sujetos no colonizados, lo que podría dar a lugar a la progresión de la enfermedad y las exacerbaciones de la misma (Varela et al., 2003). También nuestro grupo demostró por primera vez que la colonización por P. jirovecii en pacientes con EPOC producía una elevación sistémica de los niveles de citoquinas proinflamatorias (IL-8, IL-6 y TNF-α) (Calderón et al., 2007). Colonización en la población infantil Los estudios serológicos han demostrado que los anticuerpos específicos frente al patógeno pueden ser detectados en niños desde temprana edad, lo que indica que la exposición a este patógeno es común a estas edades, describiéndose una seroprevalencia del 73% en nuestro medio con un aumento de ésta en relación con la edad (Vargas et al., 2001, Respaldiza et al., 2004). Este hecho, hizo pensar durante un tiempo que la enfermedad por P. jirovecii en personas inmunodeprimidas era el resultado de la reactivación de la infección latente adquirida en la infancia. Sin embargo, estudios en animales y humanos han demostrado que la eliminación de Pneumocystis ocurre después de la infección, lo que implica que la persistencia de organismos latentes es limitada (Morris et al., 2002). Los conocimientos actuales sobre la transmisión transplacentaria de P. jirovecii sugieren que la infección primaria es adquirida tempranamente y los bebés podrían ser un importante reservorio natural de P. jirovecii, que podrían permanecer colonizados hasta la madurez de su sistema inmunitario (Beard et al., 2000, Montes-Cano et al., 2009). En la población infantil, la colonización por P. jirovecii se ha relacionado con ciertas condiciones clínicas, como la bronquiolitis y la muerte súbita del lactante (Totet et al, 2003; Vargas et al, 1999). Algunos estudios en series de necropsias han informado de una prevalencia variable de colonización por Pneumocystis en casos de muerte súbita del lactante (Vargas et al., 1999; Morgan et al., 2001; Vargas et al., 2005). Sin embargo, no todas las observaciones publicadas han sido consistentes, lo que puede 36 atribuirse a diferencias en la sensibilidad de las técnicas de PCR utilizadas, variaciones geográficas en la colonización por Pneumocystis o diferencias en las características de los sujetos estudiados (Beard et al., 2005). Posteriormente, se ha sugerido que no hay una relación directa de causalidad entre el síndrome de muerte súbita del lactante y la colonización por P. jirovecii. Este estudio encontró una frecuencia similar de presencia del hongo, analizada mediante microscopía, tanto en los niños que murieron por muerte súbita como en aquellos que fallecieron por otras causas (Vargas et al., 2007). Colonización en adultos sanos La prevalencia de colonización por P. jirovecii descrita en adultos sanos difiere en los diferentes trabajos realizados. En este sentido, hay estudios que describen una ausencia de colonización en las muestras analizadas (Wakefield et al., 1990 Peters et al., 1992, Leigh et al., 1993 Vargas et al., 2003; Nevez et al., 2006) mientras que en otros trabajos sí han encontrado una prevalencia de colonización de hasta un 20 % en las muestras analizadas de sujetos sanos (Nevez et al., 1997, Medrano et al., 2005). Las diferencias encontradas entre los diferentes trabajos pueden ser atribuidas de nuevo a la variabilidad ocupacional y geográfica de los sujetos, y a la diferente sensibilidad de las técnicas diagnósticas empleadas. Colonización en pacientes con infección por VIH La prevalencia de colonización por P. jirovecii en adultos con infección por VIH está aceptada e igual que en las poblaciones anteriores es variable. En este sentido, se ha descrito una prevalencia de colonización por P. jirovecii en pacientes con infección por VIH que oscila entre el 46% (Morris et al., 2004a) y el 69% (Huang et al., 2003). En una población de adolescentes con infección por VIH nuestro grupo encontró una prevalencia de colonización por P. jirovecii del 40 % (Gutiérrez et al., 2011a). Según los estudios realizados haber padecido previamente PcP, el uso de tratamiento profiláctico frente a P. jirovecii o la toma de tratamiento antirretroviral no parecen estar relacionados con la colonización por este patógeno (Huang et al., 2003; Morris et al., 2004a). Sin embargo, el hábito tabáquico y el lugar de residencia si parecen estar relacionados (Morris et al., 2004a). Respecto al recuento de células CD4+ los hallazgos son controvertidos, de tal manera que hay estudios que han descrito un mayor riesgo de 37 colonización por Pneumocystis al descender los CD4+ (Leight et al.,1993), no encontrándose en estudios posteriores relación entre el número de células CD4+ y el riesgo de colonización por Pneumocystis (Huang et al., 2003). Colonización en pacientes inmunodeprimidos sin infección por VIH En pacientes inmunodeprimidos por una causa diferente a la infección por VIH se ha descrito una prevalencia de colonización por P. jirovecii del 16 % (Mekinian et al., 2011, Vidal et al., 2006). La toma de corticoides está asociado a un elevado riesgo de colonización por Pneumocystis, describiéndose una prevalencia de colonización del 44% en pacientes que estaban tomando metilprednisolona a dosis > 20mg/día (Maskell et al., 2003). Otro estudio corroboró estos resultados describiendo una prevalencia de colonización por P. jirovecii del 75% en pacientes bajo tratamiento corticoideo (Helweg-Larsen et al., 2002). Por otro lado, se ha observado que las alteraciones inmunitarias relacionadas con el embarazo pueden aumentar el riesgo de colonización por Pneumocystis jirovecii publicándose una prevalencia de colonización del 15% en mujeres embarazadas (Vargas et al., 2003). Colonización en pacientes con enfermedades respiratorias crónicas La colonización por P. jirovecii es relativamente frecuente en las distintas patologías crónicas pulmonares como han descrito varios estudios previamente (Probst et al., 2000; Gutiérrez et al., 2011b). Probst y colaboradores estudiaron 141 pacientes con enfermedades respiratorias crónicas detectando que más del 21% de los pacientes estaban colonizados. En el caso de las neumopatías intersticiales, se ha descrito una prevalencia de colonización por P. jirovecii en nuestro entorno del 34% (Vidal et al., 2006) siendo la prevalencia similar en los diferentes tipos de neumopatía intersticial encontrando una relación clara con el hábito tabáquico (OR 3,3; p=0,02). En este grupo de pacientes otros trabajos han publicado prevalencias que oscilan entre el 7,4% y el 22% (Sing et al., 2001; Respaldiza et al., 2005). Recientemente, una revisión sobre la prevalencia de colonización de P. jirovecii en pacientes con fibrosis quística ha puesto de manifiesto las diferencias significativas 38 existentes en los diferentes estudios realizados con prevalencias que oscilan entre el 2,5% y el 38% (Bonnet et al., 2020). Por otro lado, se ha descrito la relación entre pacientes con neoplasia de células pequeñas de pulmón y la presencia de colonización por P. jirovecii (de la Horra et al., 2004). 2.7. Tratamiento y profilaxis El tratamiento de elección de la PcP en pacientes con infección por VIH o sin ella lo constituye la combinación de trimetoprim y sulfametoxazol (cotrimoxazol) intravenoso (Calderón et al., 2010), pudiendo realizar posteriormente terapia secuencial a vía oral en los casos de enfermedad leve-moderada o tras mejoría clínica. Como fármacos de segunda línea se incluyen clindamicina+primaquina, pentamidina intravenosa, dapsona y atovacuona, aunque estas dos últimas sólo están indicadas en casos de neumonías no graves. Los pacientes con infección por VIH que presenten una enfermedad moderada-grave (paO2 < 70 mmHg o gradiente alveolo-arterial <35 mmHg con aire ambiental) deben recibir además corticoides (Ewald et al., 2015). El papel de los corticoides no está claro en pacientes sin infección por VIH con PcP, de tal manera que los trabajos realizados no han demostrado que tengan un efecto importante sobre el curso de la enfermedad. No obstante, no disponemos de estudios controlados aleatorizados para confirmar este dato (Fujikura et al., 2017). En pacientes con infección por VIH la profilaxis primaria frente a la PcP está indicada cuando el recuento de linfocitos CD4+ es inferior a 200 cels/µl, en los casos de candidiasis orofaríngea previa o existencia de una enfermedad previa definitoria de SIDA. La profilaxis secundaria está indicada en pacientes que han tenido un episodio previo de PcP. El cotrimoxazol es el fármaco de elección para la profilaxis tanto primaria como secundaria debido a su eficacia en la prevención de la reactivación de la infección. Sin embargo, en casos de hipersensibilidad al cotrimoxazol, se pueden considerar alternativas como dapsona/pirimetamina o el uso de atovacuona con o sin pirimetamina. La desensibilización al cotrimoxazol también puede ser una opción en algunos casos para permitir su uso en pacientes con hipersensibilidad a dicho fármaco. La profilaxis con pentamidina inhalada no se considera efectiva para prevenir el 39 desarrollo de enfermedad extrapulmonar por Pneumocystis, estando su uso limitado a ciertos casos específicos, como pacientes con serología negativa para toxoplasma. La profilaxis puede suspenderse si tras el inicio del tratamiento antirretroviral la cifra de linfocitos CD4+ aumenta por encima de 200 cels/µl durante al menos 3 meses (Iribarren et al., 2015). La PcP es un problema emergente entre poblaciones de pacientes inmunodeprimidos por causa diferente a la infección por VIH, no existiendo directrices claras respecto al inicio de profilaxis en este grupo de pacientes. En este sentido, es necesario establecer estrategias sobre la profilaxis frente a la PcP en esta población (Fujikura et al., 2017, Pereira-Díaz et al., 2019). La presencia de mutaciones en el gen de la DHPS y su relación con la resistencia al tratamiento con sulfamidas sigue sin estar claro. Estas mutaciones se han asociado con el uso previo de sulfamidas, no obstante, las mutaciones también se han detectado en pacientes que no han tomado previamente sulfamidas, lo que sugiere la posibilidad de transmisión entre personas de cepas mutantes para DHPS. La ausencia de un sistema de cultivo para P. jirovecii hace que las conclusiones definitivas sobre la susceptibilidad a los tratamientos sea complicado (Helweg-Larsen 2004). Algunos estudios sugieren que las mutaciones en el gen de la DHPS se asocian con un peor resultado, definido como la necesidad de ventilación mecánica y mayor mortalidad. Un estudio llevado a cabo por nuestro grupo encontró que el 33 % de los pacientes estudiados con PcP presentaba alguna de las mutaciones vinculadas con la resistencia a sulfamidas en el gen de la DHPS (Calderón et al., 2004). Recientemente, otro trabajo pone de manifiesto que las mutaciones en el gen de la DHPS están ampliamente repartidas por todo el mundo, existiendo diferencias en cuanto a la prevalencia geográfica en relación con el uso de profilaxis con sulfamidas y con la transmisión de persona a persona (de la Horra et al., 2021). 40 3. Papel de Pneumocystis jirovecii en la EPOC La prevalencia de colonización por P. jirovecii descrita en pacientes con EPOC es elevada, oscilando entre el 10% y el 55% en los diferentes estudios realizados como como puede observarse en la Tabla 1. Estas diferentes prevalencias encontradas pueden explicarse por la existencia de disparidades geográficas en la epidemiología de P. jirovecii, la diferente sensibilidad de las técnicas utilizadas y el tipo de muestra utilizado en cada estudio. Tabla 1. Estudios sobre prevalencia de colonización por P. jirovecii en pacientes con EPOC Estudio Número de pacientes Muestra Método diagnóstico Pacientes colonizados (%) Calderón et al (1996) 50 Esputo Inmunofluorescencia 10% Sing et at (1999) 50 LBA Nested PCR 37,5% Probst et al (2000) 37 LBA Nested PCR 40,5% Helweg Larsen et al (2002) 23 LBA, esputo, aspirado bronquial Touch-down PCR 43,5% Maskell et al (2003) 23 LBA Nested PCR 17,4% Morris et al (2004b) 68 Tejido pulmonar* Nested PCR 19% Calderón et al (2004) 37 Esputo Nested PCR 40,5% Nevez et al (2006) 50 Esputo Nested PCR 16% Calderón et al (2007) 51 Esputo Nested PCR 55% Márquez-Martín et al (2014) 101 EI/ LOF Nested PCR 42,6% Cañas et al (2019) 71 EI Real time PCR 32,3% * (Resección pulmonar o trasplante); EI (esputo inducido); LBA (lavado broncoalveolar); LOF (Lavado orofaríngeo) 41 En trabajos realizados en animales, en personas sanas y en pacientes con fibrosis quística se ha observado como la colonización por Pneumocystis es un proceso dinámico existiendo ciclos transitorios de colonización y aclaramiento en estas poblaciones. En este sentido, Durand-Joly y colaboradores llevaron a cabo un estudio en profesionales sanitarios sanos encontrando una prevalencia de colonización del 8%, observando en el seguimiento posterior que el aclaramiento se producía entre las 3 y las 10 semanas (Durand-Joly et al., 2003). Otro estudio llevado a cabo en adultos sanos observó una prevalencia de colonización del 20%, en el seguimiento realizado a los 6 meses a 9 de los 12 pacientes colonizados, sólo dos de ellos permanecían colonizados por P. jirovecii (Medrano et al., 2005). Demanche y colaboradores, realizaron un estudio en una población de monos no inmunodeprimidos durante un período de dos años, demostrando una alta prevalencia de colonización por Pneumocystis mediante PCR (33.6 %), así como la existencia de una constante e intensa circulación del patógeno en la población con una duración media del estado de colonización de dos meses (Demanche et al., 2005). Por otro lado, nuestro grupo llevó a cabo un estudio en pacientes con fibrosis quística que demostraba por primera vez en este grupo de población, la presencia de una dinámica de colonización y aclaramiento por P. jirovecii tras un período de seguimiento de un año (Montes-Cano et al., 2007). El significado clínico de la colonización por P. jirovecii no está totalmente aclarado y se necesitan más estudios para profundizar en este área, siendo numerosos los trabajos realizados que sugieren que la colonización por P. jirovecii podría tener importantes implicaciones en pacientes con enfermedades respiratorias crónicas por varios motivos. En primer lugar, las personas colonizadas podrían actuar como reservorio y fuente de transmisión, de tal manera que no solo pueden estar en riesgo de desarrollar la enfermedad sino también convertirse en fuente de infección para otras personas vulnerables que pueden desarrollar PcP. En segundo lugar, los pacientes colonizados que han recibido profilaxis frente a P. jirovecii de manera prolongada podrían seleccionar cepas resistentes a los fármacos. Por último, la colonización por P. jirovecii, a través de cambios a nivel alveolar y de la respuesta inmune que desencadena, podría inducir o favorecer el desarrollo de daño pulmonar (Morris et al., 2008), llevándose a cabo varios estudios cuyos resultados sugieren que P. jirovecii podría desempeñar un papel en la progresión de la EPOC. 48 MATERIAL Y MÉTODOS 50 51 1. Diseño y ámbito de estudio 1.1 Diseño Con el fin de abordar los objetivos propuestos se diseñó un estudio de cohortes prospectivo observacional en el que se siguió la evolución de una cohorte de pacientes con EPOC para conocer la dinámica de la colonización por Pneumocystis jirovecii. 1.2 Ámbito de estudio El estudio fue realizado en el Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla dentro del Grupo de Epidemiología Clínica y Riesgo Vascular, equipo integrado por médicos pertenecientes a la Unidad Clínica de Atención Médica Integral (UCAMI) e investigadores pertenecientes al Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). Para llevar a cabo el estudio se incluyeron pacientes con diagnóstico de EPOC que cumplían los criterios de inclusión y ninguno de los criterios de exclusión descritos a continuación. Criterios de inclusión: Hombres o mujeres con edad superior o igual a 18 años. Diagnóstico confirmado previo de EPOC. Posibilidad de obtener una muestra de esputo espontáneo. Consentimiento informado del paciente. Criterios de exclusión: Pacientes con diagnóstico concomitante de otra enfermedad pulmonar diferente a la EPOC. Pacientes con diagnóstico confirmado o sospecha de neoplasia. Pacientes que presenten alguna causa de inmunodepresión: enfermedad autoinmune, infección por VIH, trasplante, uso crónico de esteroides sistémicos o de otros fármacos inmunomoduladores. Diagnóstico de infección respiratoria aguda y/o exacerbación de la EPOC en el mes previo a la inclusión en este estudio. 52 1.3 Tamaño muestral Se realizó una estimación del tamaño muestral necesaria para identificar diferencias en el seguimiento de los pacientes según los niveles de IL-8, al ser la interleuquina con mayor interés biológico. La estimación de los valores se basó en los niveles observados previamente en el trabajo realizado por nuestro grupo para analizar las diferencias en la respuesta inflamatoria sistémica entre pacientes EPOC colonizados y no colonizados por P. jirovecii (Calderón et al., 2007). Para el cálculo se utilizó el programa Epidat 3.1. Para una potencia del 80% y un nivel de confianza del 95% sería necesario incluir en el seguimiento una población de 49 sujetos. 2. Reclutamiento de pacientes y recogida de datos 2.1 Reclutamiento de pacientes Los pacientes fueron reclutados de forma consecutiva desde las consultas de la Unidad Médico-Quirúrgica de Enfermedades Respiratorias (UMQER) y la UCAMI del Hospital Universitario Virgen del Rocío entre el 1 de marzo de 2010 y el 31 de diciembre de 2012. 2.2 Información recogida y fuente Los datos recopilados en este estudio se obtuvieron mediante entrevista al paciente realizada por el personal médico de la Unidad Médico-Quirúrgica de Enfermedades Respiratorias (UMQER) y de la UCAMI pertenecientes al Hospital Universitario Virgen del Rocío. La información fue registrada en un formato estandarizado (Anexo III) e introducida en una base de datos específica construida para este proyecto. La encriptación bajo código es una medida de seguridad adicional que utilizamos para proteger los datos de carácter personal y cumplir con la normativa vigente sobre protección de datos, en este caso, la Ley Orgánica 3/2018. 53 3. Parámetros evaluados En todos los pacientes incluidos en el estudio se realizó una evaluación clínicoepidemiológica, se obtuvieron muestras respiratorias y séricas, y se realizaron pruebas funcionales respiratorias en las visitas basal y a los 4 meses. Las pruebas de imagen se realizaron en la visita basal, y en las visitas posteriores se solicitaron a criterio médico. Adicionalmente, se obtuvieron muestras a los 8 meses en 22 pacientes y a los 12 meses en 14 pacientes. Estos datos se muestran en la Tabla 2. En el momento de la toma de muestras los pacientes no presentaban exacerbación de la EPOC. Tabla 2. Parámetros evaluados durante el seguimiento Visita basal Visita 2 ( 4 meses) Visita 3 ( 8 meses) Visita 4 ( 12 meses) -Evaluación clínicoepidemiológica -Muestras de esputo para evaluación microbiológica -Muestras séricas para evaluación inmunológica -Pruebas funcionales respiratorias -Pruebas de imagen -Evaluación clínica -Muestras de esputo para evaluación microbiológica -Muestras séricas para evaluación inmunológica -Pruebas funcionales respiratorias -*Pruebas de imagen -Evaluación clínica -Muestras de esputo para evaluación microbiológica -Muestras séricas para evaluación inmunológica -Pruebas funcionales respiratorias -*Pruebas de imagen -Evaluación clínica -Muestras de esputo para evaluación microbiológica -Muestras séricas para evaluación inmunológica -Pruebas funcionales respiratorias -*Pruebas de imagen *: a criterio médico 54 3.1. Evaluación clínico-epidemiológica En todos los pacientes incluidos en el trabajo se registraron los siguientes parámetros: Datos demográficos y clínicos: sexo, fecha de nacimiento, hábitos tóxicos incluyendo historia tabáquica, grado de disnea según la escala mMRC (Anexo I), comorbilidad asociada según el índice de Charlson (Anexo IV) y número de exacerbaciones. De cada uno de los pacientes incluidos en el estudio se obtuvieron muestras de esputo y suero que se mantuvieron criopreservadas a –20ºC hasta su procesamiento. Pruebas de imagen: radiografía de tórax, TACAR (tomografía axial computarizada de alta resolución) de tórax cuando estuviese indicado. Pruebas funcionales respiratorias: mediante la realización de espirometrías se analizó el VEF1. La clasificación de la gravedad de la EPOC se realizó mediante los criterios de la GOLD 2022, así como según la clasificación por fenotipos propuesta por GesEPOC 2021. a) Según la gravedad de la limitación del flujo aéreo (basada en el VEF1 postbroncodilatador según la GOLD (Vogelmeier et al, 2022) GOLD 1 (leve): VEF1≥ 80% del valor predicho. GOLD 2 (moderado): VEF180-50% del valor predicho. GOLD 3 (grave): VEF150-30% del valor predicho. GOLD 4 (muy grave): VEF1< 30% del valor predicho. b) Según GesEPOC (Miravitlles et al., 2021): Riesgo bajo: VEF1postbroncodilatación ≥ 50%, grado disnea 0-1 mMRC, 0-1 exacerbaciones sin ingresos. Riesgo alto: al menos uno de los siguientes VEF1 postbroncodilatación < 50%, grado disnea 2-4 de mMRC, 2 o más exacerbaciones o un ingreso. A su vez se clasifican en: -No agudizador -Agudizador no eosinofílico -Agudizador eosinofílico 55 3.2. Evaluación microbiológica La identificación de Pneumocystis jirovecii en los pacientes en estudio, se realizó conjuntamente mediante dos técnicas de PCR: PCR anidada y PCR a tiempo real para el gen mtLSUrRNA en muestras de esputo espontáneo. Para los fines de este estudio se ha considerado “colonización” la identificación positiva de ADN de Pneumocystis jirovecii en muestras de esputo, obteniendo resultados idénticos en las determinaciones por ambas técnicas de PCR en un paciente sin síntomas ni signos de neumonía (Wissmann et al., 2010). En todos los pacientes se estudió la presencia de infección respiratoria de otra etiología mediante la realización sistemática de cultivo para aerobios, tinción de Ziehl-Neelsen, cultivo de Löwenstein y tinciones para parásitos y hongos. Las muestras se analizaron de forma rutinaria en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen del Rocío. 3.3. Evaluación inmunológica El estudio de interleucinas proinflamatorias y de las proteínas del surfactante pulmonar se llevó a cabo en muestras séricas realizándose: Cuantificación de la respuesta inflamatoria sistémica midiendo las citoquinas IL-1β, IL-8, IL-6, TNF-α, IFN-γy la proteína humana MCP-1 (del inglés Monocyte Chemoattractant Protein-1), se usaron lotes de ELISA convencional para medir los niveles de MCP-1, IL-6 e IL-8 y las concentraciones séricas de las citoquinas TNF-α, IL-1β, e IFN-γ se midieron mediante kits ultrasensibles (Invitrogen, Londres, Gran Bretaña). Cuantificación de niveles séricos de las proteínas del surfactante pulmonar A (SP-A) y D (SP-D) mediante kits de ELISA (bioVendor, República Checa). 56 4. Variables de estudio 1. Prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii. 2. Respuesta inflamatoria sistémica 3. Niveles de proteínas del surfactante pulmonar SP-A y SP-D. 4. Evolución de parámetros clínicos: VEF1, número de eosinófilos, número de exacerbaciones. 5. Técnicas de laboratorio 5.1. Obtención y almacenamiento de las muestras - Esputo: las muestras de esputo espontáneo se obtuvieron en las consultas del Hospital Universitario Virgen del Rocío, remitiéndolas posteriormente al área de laboratorio. Estas muestras fueron divididas en dos alícuotas, remitiéndose una de ellas al Servicio de Microbiología donde fueron centrifugadas para separar el sobrenadante del botón celular. Se realizó un recuento celular total para ver la calidad y representatividad de la muestra, considerándose adecuadas aquellas muestras con un recuento de células escamosas epiteliales menor del 15%. La segunda alícuota fue enviada al laboratorio de investigación, tomándose una muestra de unos 2 ml de esputo que se disgregó en fresco utilizando una jeringa de 20g, separándose posteriormente en alícuotas de 500 μl que se mantuvieron a -20ºC hasta la extracción del ADN. - Muestras séricas: las muestras de sangre total obtenidas se mantuvieron en fresco hasta su centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos, descartándose el tapón coagulado, posteriormente el suero fue separado y dividido en dos alícuotas que fueron conservadas hasta su utilización a –20ºC. 5.2. Técnicas Moleculares 5.2.1 Digestión y extracción de ADN Las muestras de esputo se sometieron a una digestión enzimática con proteinasa K previa a la extracción del ADN para que el material genético fuera liberado, siguiendo un protocolo puesto a punto en el laboratorio de investigación. Para la extracción de ADN se siguió un método basado en la purificación en columnas de Nucleo-Spin Tissue kit suministrado por Machenery-Nagel siguiendo el protocolo 57 que se detalla en el Anexo V. El ADN extraído se eluyó con 55 µl de agua ultrapura y se conservó a -20º C hasta su examen. 5.2.2 Identificación de Pneumocystis jirovecii La identificación molecular de P. jirovecii se realizó utilizando como diana el gen mtLSUrRNA, que se caracteriza por estar ampliamente conservado interviniendo en funciones metabólicas básicas del patógeno. La detección de la región mtLSUrRNA se realizó mediante las técnicas de PCR anidada y PCR a tiempo Real. PCR anidada en esputo La identificación de ADN de P. jirovecii se realizó mediante una variante de la técnica de PCR, PCR-anidada, utilizando el ADN genómico aislado de las muestras de esputo. Para ello se amplificó un fragmento del gen de la región mitocondrial mtLSUrRNA de P. jirovecii, utilizando los cebadores externos paZ102-E y paZ102-H descritos por A.E. Wakefield (Wakefield et al., 1990) que amplifican una secuencia de 346 pares de bases. La mezcla de PCR se preparó en un volumen final de 25 µl, que incluía: 3µl del ADN molde, 2,5 µl de NH4reaction Buffer 10x (Bioline), 0,25 µl de Taq (BioTaq DNA pol. 5U/ µl suministrada por Bioline), 0,5 µl de una mezcla de nucleótidos trifosfato (1µM de cada dNTP), 0,5 µl de cada cebador (concentración de 20 µM cada uno) y 0,75 µl de MgCl250mM, siguiendo el protocolo de PCR que se detalla en la Tabla 3. Tabla 3. Programa para la primera ronda de PCR anidada 1ª ronda de PCR anidada (Programa PC40) Características ETAPA CICLOS T TIEMPO CEBADORES Activación 1 94ºC 5 min Cebadores: pAZ102-E: 5’-GATGGCTGTTTCCAAGCCCA-3’ pAZ102-H: 5’-TCACTTAATATTAATTGGGGAGC-3’ Fragmento de 346 pb Desnaturalización Alineamiento Elongación 40 92 ºC 55ºC 72 ºC 30 seg 30 seg 2 min Elongación final 1 72º ºC 5 min ºC, grados centígrados; min, minutos, seg, segundos; pb, pares de bases RESULTADOS 65 66 1. Características de la población estudiada En el estudio se incluyeron un total de 53 pacientes con EPOC estable, entre los pacientes incluidos en el estudio 50 eran hombres y 3 mujeres, con una edad media de 71,26 ± 9,6 años. El 13 % de los pacientes eran fumadores activos en el momento de la inclusión, mientras que el 87 % restante eran exfumadores. La media para el índice de comorbilidad de Charlson fue de 4,45±1,51. Respecto a la situación funcional respiratoria, el VEF1medio fue de 37,48 % ±9,90 y el 68% de los pacientes refería un grado de disnea ≥ 2 de la mMRC. El recuento medio de eosinófilos en sangre fue de 220 ± 291.2 células/mm3. En la visita basal, 22 de los 53 pacientes (41,5%) estaban colonizados por Pneumocystis jirovecii. En la Tabla 6 se muestra la comparación entre sujetos en la visita basal en función del estado de colonización por P. jirovecii, no encontrando diferencias en cuanto a edad, sexo, comorbilidad, hábito tabáquico y parámetros funcionales respiratorios. El recuento de eosinófilos mostró tendencia a ser más elevado en el grupo de pacientes colonizados sin llegar a alcanzar significación estadística. Al analizar la posible asociación entre la colonización por P. jirovecii y los diferentes estadios de la GOLD en la visita basal, observamos como la prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en los estadios 1 y 2 fue similar, siendo ligeramente superior en el estadio 4. Ningún paciente del estadio 3 estaba colonizado en la visita basal. El test de Chi cuadrado de Pearson no mostró asociación entre estas variables (p= 0,284). Por otro lado, al utilizar la clasificación para la EPOC por fenotipos recomendada por GesEPOC 2021, los pacientes agudizadores no eosinofílicos presentaron la prevalencia de colonización por P. jirovecii más elevada y los pacientes agudizadores eosinofílicos la menor prevalencia de colonización, el tamaño muestral no fue suficiente para poder evaluar la posible asociación entre estas variables. Estos datos se ilustran en las figuras 5 y 6. 67 Tabla 6. Diferencias a nivel basal en función del estado de colonización Variable Colonizados n=22 No colonizados n=31 OR/DM (IC95) p Edad (años), (m ± DE) 73,2 ± 8,3 69,9 ± 10,3 3,3(−1,7; 8,3) 0,196t Sexo (varón), n (%) 20 (90,9) 30 (96,8) 0,4 (0,01; 7,6) 0,563F Índice de Charlson (m ± DE) 4,5 ± 1,5 4,5 ± 1,6 0 (−0,8; 0,8) 0,977w Tabaquismo (exfumadores), n (%) 18 (81,8) 28 (90,3) 0,5 (0,1; 3,3) 0,431F Disnea (mMRC grado ≥ 2), n (%) 14 (63,6) 22 (71) 0,7 (0,2; 2,7) 0,573P VEF1(%), (m ± DE) 40,2 ± 11,5 35,7 ± 8,4 4,5 (-1,1; 1,1) 0,171 Estadio GOLD, n (%) 0,284P 1ª 7 (31,8) 5 (16,1) 2B 7 (31,8) 9 (29,0) 3C 0 (0) 3 (9,7) 4D 8 (36,4) 14 (45,2) Clasificación GesEPOC 2021, n (%) ND No agudizador 7 (31,8) 10 (68,2) Agudizador no eosinofílico 14 (59,1) 15 (40,9) Agudizador eosinofílico 2 (9,1) 5 (90,9) Eosinófilos (células/mm3), (m ± DE) 212,3 (334,4) 206,5 (104,9) 0,0641*W M: media, DE: desviación estándar, OR: Odd Ratio, Dm: diferencia de medias. IC95%: intervalo de confianza al 95%, ND: no disponible, F: test exacto de Fisher, P: Chi cuadrado de Pearson *No alcanza la significación estadística pero se observa una tendencia a la misma 68 Figura 5. Distribución de la presencia de P. jirovecii en la visita basal según la clasificación de EPOC de la GOLD Figura 6. Distribución de la presencia de P. jirovecii en la visita basal según la clasificación de EPOC de GesEPOC 69 Para evaluar la concordancia existente entre las clasificaciones de la GOLD y GesEPOC, los pacientes fueron agrupados en pacientes no agudizadores y pacientes agudizadores en ambas clasificaciones. De esta forma, los pacientes de los grupos A y B de la GOLD formaron el grupo de pacientes no agudizadores, y los pacientes de los grupos C y D el grupo de pacientes agudizadores. Según la clasificación utilizada por GesEPOC, los pacientes fueron divididos igualmente en pacientes no agudizadores y agudizadores, formando parte de este último grupo los pacientes agudizadores no eosinofílicos y los agudizadores eosinofílicos. El grupo de pacientes no agudizadores de la GOLD estaba integrado por 28 pacientes de los cuales 14 (50%) se encontraban colonizados por P. jirovecii. Por otro lado, según la clasificación GesEPOC los pacientes con fenotipo no agudizador eran 17, de los cuales 7 (41,2%) estaban colonizados por P. jirovecii. El análisis bivariante con la Chi cuadrado de Pearson no mostró asociación entre la presencia de colonización y la pertenencia a uno u otro grupo, de forma concordante con ambas clasificaciones (p= 0,565). De igual manera, se agruparon los pacientes pertenecientes a los grupos C y D de la GOLD, que incluía a pacientes agudizadores, formando parte de este grupo 25 pacientes, de los cuales 8 (32%) estaban colonizados por P. jirovecii. Los pacientes con fenotipo agudizador de la GesEPOC eran 36, de los que 16 (44,4%), estaban colonizados por P. jirovecii. El análisis bivariante con la Chi cuadrado de Pearson mostró que no había asociación entre la colonización y la pertenencia a uno u otro grupo (p= 0,328). Estos datos se ilustran en la figura 7. 70 Figura 7. Colonización por P. jirovecii en la visita basal según las clasificaciones GOLD y GesEPOC 71 2. Dinámica de la colonización por P. jirovecii en pacientes con EPOC De los 53 pacientes incluidos en el estudio se obtuvieron muestras respiratorias y séricas en dos visitas (basal y a los 4 meses), adicionalmente se obtuvieron muestras a los 8 meses en 22 pacientes y a los 12 meses en 14 pacientes. No encontramos diferencias en la prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en las diferentes visitas realizadas a lo largo del seguimiento de nuestros pacientes (figura 8). En este sentido, al comparar las visitas basales y la visita realizada a los 4 meses, no observamos diferencia en la prevalencia de colonización (41,5% vs 39,6%, diferencia de proporciones con IC 95% de -0,1 a 0,2; p=1). Respecto a las visitas realizadas a los 8 y 12 meses, tampoco encontramos diferencias significativas al comparar la prevalencia de colonización en dichas visitas frente a la visita basal. La prevalencia de colonización en la visita basal comparada con la prevalencia de colonización a los 8 meses resultó ser 41,5% vs 27,2% (diferencia de proporciones con IC95% -0,1 a 0,4; p= 0,369) y la prevalencia de colonización de la visita basal frente a la prevalencia de colonización a los 12 meses resultó ser 41,5% vs 14,2% (diferencia de proporciones con IC95% 0,1 a 0,5; p= 0,115). Figura 8. Prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en cada visita 72 Al evaluar el papel que pudiera tener la estación del año en la que se tomaba la muestra de esputo con la colonización por P. jirovecii, observamos que la mayor prevalencia de colonización correspondía a las muestras obtenidas en los meses de primavera, resultando colonizadas por P. jirovecii 19 de las 42 muestras obtenidas en este período de tiempo (38%). Por otro lado, la menor prevalencia de colonización fue encontrada en los meses de verano, donde de las 35 muestras obtenidas en este período, resultaron colonizadas 8 (16%), no encontrando diferencias estadísticamente significativas (p= 0,213). Durante el seguimiento de nuestra población, la dinámica de colonización y aclaramiento de Pneumocystis jirovecii observada pone de manifiesto la existencia de ciclos transitorios de colonización y aclaramiento de este hongo como puede observarse en la Tabla 7. Esta dinámica se ha clasificado para su estudio en los siguientes patrones: -Patrón A (pacientes colonizados que aclaran [+ →-]): sujetos que se encuentran colonizados en una visita y que negativizan en la siguiente visita. -Patrón B (pacientes que resultan colonizados [- → +]): pacientes que no estaban colonizados por Pneumocystis jirovecii en una visita y aparecen colonizados en la siguiente visita. -Patrón C [- →-]: pacientes que permanecen no colonizados en dos visitas consecutivas. -Patrón D [+ →+]: pacientes que permanecen colonizados por Pneumocystis jirovecii en dos visitas consecutivas. 73 Tabla 7. Dinámica de colonización y aclaramiento de P .jirovecii a lo largo del seguimiento Paciente Basal Visita 2 (4 meses) Visita 3 (8 meses) Visita 4 (12 meses) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 - + + + - + + - - - - - - + + + + - + - - + + + + - + - - + - + + - - - - - + - - + - + + - - - - - - - - - - - 15 16 17 18 19 20 21 22 - - + + - + + + - + - + - + - + - - - - - - - + 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 - - + - + - + + + - - - + - - + - - - - - - + - + - + - - - + + - + - + - - + + - - - + + - - - - - - - - - + - - - - - - - Total 53 53 22 14 + (colonizado) y –(no colonizado) 80 Tabla 13. Comparación de los patrones de aclaramiento y colonización por P. jirovecii frente a pacientes que se mantienen colonizados Variable Patrón A [+ → -] n= 25 Patrón B [- → +] n=14 Patrón D [+ → +] n=15 p Avs D p Bvs. D VEF1(ml) 42,2 ± 13,7 38,6 ± 11,9 40,6 ± 10,1 0,162w 0,691t Eosinófilos (cels/mm3) 157,2 ± 90,8 190,0 ± 90,7 238,2 ± 264 0,089*w 0,448w INF-γ (pg/ml) 7,2 ± 26,8 18,8 ± 47,6 0,6 ± 1,1 0,267w 0,466w IL1b (pg/ml) 0,96 ± 4,2 4 ± 9,8 0,07 ± 0,3 0,859w 0,112w IL6 (pg/ml) 10,0 ± 10,1 20,6 ± 23,9 15,3 ± 10,4 0,542w 0,776w IL8 (pg/ml) 22,9 ± 39,9 16,6 ± 7,9 18,9 ± 9,1 0,032w 0,486t MCP-1(pg/ml) 512,1 ± 302,6 1017,1 ± 424,2 992,3 ± 895,9 0,351w 0,331w TNF-α (pg/ml) 9,8 ± 21,2 30,9 ± 78,4 5,8 ± 5,3 0,132w 0,945w SPA (pg/ml) 107,3 ± 45,5 109,1 ± 46,7 94,3 ± 34,1 0,121w 0,541w SPD (pg/ml) 143,2 ± 61,3 206,7 ± 83,9 158,1 ± 79,3 0,821w 0,122t Media ± DE,pg/ml: picogramos por mililitro, cels/mm3: células por milímetro cúbico, W: test rangos de Wilconxon, t: t de Student *No alcanza la significación estadística pero se observa una tendencia a la misma 81 Al comparar la respuesta inflamatoria sistémica observada en todos los patrones mediante el test no paramétrico de Kruskal-Wallis, observamos la existencia de diferencias estadísticamente significativas para las interleuquinas IL-6, IL-8 y MCP-1, así como, tendencia a la significación con la proteína del surfactante pulmonar SP-D como puede observarse en la Tabla 14. Tabla 14.Comparación de todos los patrones de aclaramiento y colonización por P. jirovecii Variable Patrón A [+ → -] n= 25 Patrón B [- → +] n=14 Patrón C [- → -] n=35 Patrón D [+ → +] n=15 p-valor test KW VEF1(ml) 42,2 ± 13,7 38,6 ± 11,9 36,1 ± 9,9 40,6 ± 10,1 0,454 Eosinófilos (cels/mm3) 157,2 ± 90,8 190,0 ± 90,7 212 ± 120,4 238,2 ± 264 0,305 INF-γ (pg/ml) 7,2 ± 26,8 18,8 ± 47,6 0,9 ± 2,2 0,6 ± 1,1 0,597 IL1b (pg/ml) 0,96 ± 4,2 4 ± 9,8 0,7 ± 3,2 0,07 ± 0,3 0,316 IL6 (pg/ml) 10,0 ± 10,1 20,6 ± 23,9 8,1 ± 6,4 15,3 ± 10,4 0,029 IL8 (pg/ml) 22,9 ± 39,9 16,6 ± 7,9 10,8 ± 3,9 18,9 ± 9,1 0,002 MCP-1(pg/ml) 512,1 ± 302,6 1017,1 ± 424,2 485,5 ± 299,1 992,3 ± 895,9 <0,001 TNF-α (pg/ml) 9,8 ± 21,2 30,9 ± 78,4 4,7 ± 12,2 5,8 ± 5,3 0,488 SPA (pg/ml) 107,3 ± 45,5 109,1 ± 46,7 88,9 ± 37,1 94,3 ± 34,1 0,399 SPD (pg/ml) 143,2 ± 61,3 206,7 ± 83,9 135,5 ± 49,1 158,1 ± 79,3 0,063* Media ± DE,pg/ml: picogramos por mililitro, cels/mm3: células por milímetro cúbico Test KW: test de Kruskal-Wallis *No alcanza la significación estadística pero se observa una tendencia a la misma 82 A continuación, en la Tabla 15 se muestran los p-valores del test de comparaciones múltiples dos a dos para las interleuquinas IL-6, IL-8 y MCP-1 con la corrección de Bonferroni a fin de identificar que parejas muestran diferencias estadísticamente significativas. Al realizar el análisis no observamos diferencias significativas al comparar la respuesta inflamatoria sistémica observada entre los pacientes que aclararon aP. jirovecii frente a los que se mantuvieron no colonizados (A vs C), así como frente a los que permanecieron colonizados (A vs D). Por otro lado, al comparar la respuesta inflamatoria sistémica observada entre los pacientes que resultaron colonizados por P. jirovecii frente a los que permanecieron no colonizados (B vs C) se observaron niveles significativamente más elevados de MCP-1, una tendencia a presentar niveles más elevados de IL-8 sin alcanzar la significación, pero no se observaron diferencias significativas para los niveles de IL-6. La comparación del grupo de pacientes que se mantuvieron no colonizados frente a los que se mantuvieron colonizados (C vs D) mostró un aumento de IL-8, MCP-1 y una tendencia a mostrar niveles más elevados de IL-6 sin llegar a alcanzar la significación, en concordancia con los datos publicados previamente (Calderón et al., 2007). Finalmente, la comparación del grupo de pacientes que resultaron colonizados por P. jirovecii frente a los que aclararon (B vs C) mostró unos niveles de MCP-1 significativamente más elevados para los pacientes colonizados. Tabla 15.Comparación de los patrones por parejas *No alcanza la significación estadística, pero se observa una tendencia a la misma Parejas de patrones IL-6 IL-8 MCP-1 A [+ →-] vs C[- →-] <0,999 0,374 <0,999 B [- → +] vs C[- →-] 0,226 0,072* 0,001 D [+ →+] vs C[- →-] 0,089* 0,010 0,045 B[- → +] vs A[+ →-] 0,934 <0,999 0,010 B[- → +] vs D[+ →+] <0,999 <0,999 <0,999 A[+ →-] vs D[+ →+] 0,413 <0,999 0,314 83 4. Alteración en las proteínas del surfactante pulmonar inducidas por P. jirovecii Al analizar el comportamiento de las proteínas del surfactante pulmonar SP-A y SP-D, no observamos diferencias estadísticamente significativas en la visita basal ni para el conjunto de las muestras entre pacientes colonizados y no colonizados por Pneumocystis jirovecii como podemos observar en la tabla 16. Por otro lado, al comparar la respuesta inflamatoria sistémica observada entre los diferentes patrones de colonización y aclaramiento por P. jirovecii, observamos que los pacientes que resultaron colonizados respecto a los que se mantuvieron no colonizados (B vs C) presentaron niveles significativamente más elevados de la proteína del surfactante SP-D en suero como puede observarse en la tabla 12. Sin embargo, al aplicar el test de Kruskal-Wallis, la proteína SP-D no alcanzó la significación estadística para poder aplicar posteriormente el test de comparaciones múltiples de Bonferroni, probablemente en relación con el tamaño muestral. Tabla 16. Diferencias en los niveles de SP-A y SP-D en la visita basal y para el total de las muestras en función del estado de colonización Variable Colonizado No colonizado DM (IC95%) p Visita basal n=22 n=31 SP-A (pg/ml) 65,7 ± 36,1 77,0 ± 73,1 -11,3 (-15,2; -7,4) 0,982 SP-D (pg/ml) 133,1 ± 83,8 140,4 ± 88,6 -7,3 (-12,2; -2,4) 0,679 Total de muestras n=51 n=91 SP-A (pg/ml) 86,4 ± 42,3 90,7 ± 53,6 -4,3 (-6,6; -1,7) 0,613 SP-D (pg/ml) 161,2 ± 86,4 139,3 ± 67,0 21,9 (18,8; 25,0) 0,265 Media ± DE,pg/ml: picogramos por mililitro 84 5. Relación del aclaramiento de la colonización por P. jirovecii con la evolución de los parámetros clínicos en pacientes con EPOC Como se muestra previamente en las tablas 12 y 13, los pacientes que aclararon a P. jirovecii (Avs C) y (A vs D), presentaron una tendencia a la disminución del recuento de eosinófilos sin llegar a alcanzar significación estadística. Por otro lado, en los pacientes que aclararon a P. jirovecii respecto a los que se mantuvieron no colonizados (A vs C) se observó una tendencia a la mejoría del VEF1sin llegar a alcanzar significación estadística. También hemos podido observar como los pacientes colonizados por Pneumocystis jirovecii de manera persistente a lo largo del estudio presentaron tendencia al descenso del VEF1, mientras que en aquellos pacientes que se mantuvieron persistentemente negativos el VEF1se mantuvo estable o con ligera tendencia a mejorar como se muestra en la tabla 9. Durante el seguimiento, el número de exacerbaciones medio fue de 1,9 (±1,5), no existiendo diferencias estadísticamente significativas en el número de exacerbaciones durante el seguimiento entre pacientes colonizados y no colonizados (p=0,757) (Wilconxon). 85 DISCUSIÓN 87 88 Los trabajos realizados previamente han analizado la prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en pacientes con EPOC, así como la respuesta inflamatoria sistémica que desencadena este microorganismo. Sin embargo, no tenemos conocimiento que hasta la fecha, se hayan realizado estudios sobre la dinámica de colonización y aclaramiento por Pneumocystis jirovecii en pacientes con EPOC a lo largo del tiempo, así como la repercusión en la respuesta inflamatoria sistémica que ello supondría. El presente estudio permite confirmar por primera vez en pacientes con EPOC la existencia de una dinámica de colonización consistente en ciclos transitorios de colonización, aclaramiento y re-exposición a P. jirovecii. Igualmente, hemos podido corroborar como la colonización por este hongo se asocia con un aumento en la actividad inflamatoria sistémica, objetivando por primera vez como este aumento de actividad inflamatoria sistémica revierte tras el aclaramiento de Pneumocystis jirovecii. Por otra parte, desde el punto de vista clínico, hemos podido observar como los pacientes que eliminan a P. jirovecii, presentan una tendencia a la mejoría del VEF1y a la disminución del número de eosinófilos, no observando diferencias en el número de exacerbaciones durante el seguimiento entre pacientes colonizados y no colonizados por P. jirovecii. Por primera vez, se ha evaluado la prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii según la clasificación por fenotipos para la EPOC propuesta por GesEPOC 2021, siendo concordante con la clasificación para la EPOC de la GOLD. 89 1. Dinámica de colonización de Pneumocystis jirovecii en pacientes con EPOC Estudios previos realizados en modelos animales, en sujetos sanos y en pacientes con fibrosis quística han demostrado la existencia de ciclos transitorios de colonización y aclaramiento de Pneumocystis jirovecii. Este trabajo ha permitido confirmar por primera vez la existencia de esta dinámica de colonización y aclaramiento en pacientes con EPOC en nuestro medio. En este sentido, Durand-Joly y colaboradores, en un estudio con lavados orofaríngeos en 164 profesionales sanitarios sanos que desarrollaban su trabajo en diferentes áreas de un hospital universitario, mostraron que 10 trabajadores estaban colonizados por P. jirovecii, lo que suponía una prevalencia de colonización del 8%.En 4 de los 10 trabajadores colonizados se realizó seguimiento, objetivando que el aclaramiento se producía entre las semanas 3 y la 10, este trabajo permitió conocer la existencia de colonización y aclaramiento de P. jirovecii en trabajadores sanos y sugería que podían actuar como fuentes de infección a sujetos susceptibles (Durand-Joly et al., 2003). Nuestro grupo realizó un estudio en lavados orofaríngeos de adultos sanos encontrando una prevalencia del 20% utilizando técnicas moleculares. En el seguimiento a los seis meses, realizado en nueve de los 12 sujetos colonizados, dos de ellos permanecían colonizados por Pneumocystis jirovecii; este hecho sugería que los adultos sanos colonizados podrían constituir un reservorio transitorio y una potencial fuente de infección (Medrano et al., 2005), además de poner de manifiesto que la colonización por P. jirovecii es un proceso dinámico en esta población. Demanche y colaboradores, realizaron un estudio prospectivo en una población de monos inmunocompetentes seguidos durante un período de dos años, obtuvieron muestras mediante hisopos nasales mensualmente y analizaron un total de 500 muestras mediante PCR, objetivando una constante e intensa circulación de Pneumocystis. Las prevalencias de colonización fueron variables y oscilaban desde la más alta en los meses de Marzo (83,3%) y Septiembre (100%), a la más baja en el mes de Febrero donde solo un macaco estaba colonizado. La duración media del estado de portador fueron 2 meses, oscilando desde menos de 1 mes hasta 6 meses (Demanche et al., 2005). 96 visita basal en función del estado de colonización, si bien, al tratarse la colonización de un proceso dinámico, es posible que los grupos establecidos al inicio del estudio no fueran coincidentes en las sucesivas visitas (Cañas et al., 2019). En el presente estudio, no hemos encontrando diferencias significativas en los valores basales del VEF1entre pacientes colonizados y no colonizados por P. jirovecii, tampoco hemos encontrado relación a nivel basal entre la colonización por P. jirovecii y los estadios más avanzados de la EPOC a diferencia de los hallazgos publicados por Morris y colaboradores (Morris et al., 2004b). Sin embargo, estos datos estarían en consonancia con los publicados previamente en pacientes con EPOC de nuestro entorno donde tampoco se encontró asociación entre la colonización por P. jirovecii y los estadios más avanzados de la enfermedad (Márquez-Martín et al., 2014). La existencia de diferencias geográficas en la prevalencia de colonización, la diferente sensibilidad de las técnicas utilizadas, el tipo de muestra utilizado en cada estudio junto con el conocimiento de la existencia de ciclos transitorios de colonización y aclaramiento, podrían explicar las diferentes prevalencias observadas en los estudios realizados (Calderón, 2009). Por otro lado, también podría ser explicado por un problema de potencia estadística, siendo necesario aumentar el tamaño muestral para obtener resultados que nos permitan aclarar la relación entre el grado de obstrucción espirométrica y la colonización por P. jirovecii. Los patrones de comportamiento mostrados en la dinámica de colonización y aclaramiento de P. jirovecii, nos han permitido observar en los pacientes que eliminan al microorganismo una tendencia a la disminución del número de eosinófilos sin llegar a alcanzar significación estadística, así como una tendencia a la mejoría del VEF1en los pacientes que aclaran respecto a los que se mantienen no colonizados. Por otro lado, hemos podido observar como en aquellos pacientes que se mantienen persistentemente colonizados existe tendencia al descenso del VEF1, mientras que en aquellos que se mantuvieron persistentemente no colonizados el VEF1se mantuvo estable o con ligera tendencia a la mejoría. Todo ello podría estar en relación con las diferencias observadas en los perfiles de citoquinas que modulan la respuesta inflamatoria responsable del daño pulmonar (Love et al., 2022) 97 Aunque en nuestro estudio no se han observado diferencias en el número de exacerbaciones durante el seguimiento entre pacientes colonizados y no colonizados por Pneumocystis jirovecii, estos datos no serían concluyentes debido al escaso número de sujetos que completaron un año de seguimiento. 98 4. Limitaciones La principal limitación del presente trabajo se centra en el número de pacientes que completaron un año de seguimiento. En este sentido, para el análisis realizado en la primera y segunda visita el número de sujetos evaluados fue de 53, superior al tamaño muestral de 49 estimado como necesario para tener suficiente potencia estadística para identificar diferencias en los niveles de citoquinas. Sin embargo, este número se vio reducido durante el seguimiento, lo que supone una limitación para poder establecer comparaciones directas entre los valores obtenidos en la primera visita y en las últimas revisiones. Para la realización de este trabajo de tesis doctoral nos hemos basado en la actualización 2022 de la guía GOLD para EPOC (Vogelmeier et al., 2022). Sin embargo, recientemente ha sido publicada una nueva actualización de esta guía, GOLD 2023 (Vogelmeier et al., 2023), donde destacan como principales novedades: una nueva definición de EPOC, así como una nueva clasificación (taxonomía) de la EPOC atendiendo a las diferentes causas que la pudieron originar. GOLD 2023 modifica la herramienta de evaluación inicial «ABCD» y propone la clasificación en tres grupos A, B y E, desapareciendo los grupos C y D que se agruparían en el grupo E, formado por los pacientes exacerbadores. Los umbrales propuestos para los síntomas y los antecedentes de agudizaciones son similares a las guías previas. Si bien, este trabajo ha utilizado como referencia la guía GOLD 2022, en uno de los análisis realizados agrupamos a los pacientes en “no exacerbadores” (gruposA+B) y en “exacerbadores” (grupos C+D, o actual grupo E) para evaluar la concordancia con los fenotipos propuestos por GesEPOC. Respecto al tratamiento farmacológico de la EPOC, GOLD 2023 propone en pacientes del grupo A el mismo tratamiento que en ediciones anteriores, sin embargo, para pacientes del grupo B recomienda tratamiento con dos broncodilatadores de acción prolongada, ya que es más eficaz que la monoterapia, finalmente, para los pacientes del grupo E también se recomienda como tratamiento inicial la doble broncodilatación de acción prolongada, excepto en aquellos enfermos que tengan ≥300 eosinófilos/µl en sangre, en los que puede valorarse la terapia triple añadiendo corticoides inhalados. 99 Por otro lado, la sensibilidad de la técnica de identificación de la colonización empleada para evitar sesgos de diagnóstico podría presentar sus limitaciones. Nuestro estudio ha utilizado PCR anidada, para identificar el gen mtLSU-rRNA como diana, y simultáneamente PCR a tiempo real, para detectar ADN de P. jirovecii procedente de muestras respiratorias obtenidas de manera no invasiva del tracto respiratorio, como el esputo. En trabajos publicados previamente se han utilizado con éxito técnicas de PCR para estudiar el estado de colonización en lavados orofaríngeos, esputo y exudados nasofaríngeos (Helweg-Larsen et al., 1997, Helweg-Larsen et al, 2004, Flori et al., 2004, Calderón et al., 2004, Durand-Joly et al., 2005), mostrando en estudios comparativos tener la mayor sensibilidad para la detección de P. jirovecii (Robberts et al, 2007). Esta técnica es útil incluso en muestras con baja carga de patógenos (Calderón et al., 2009), dato a tener cuenta al analizar la colonización por Pneumocystis en sujetos inmunocompetentes, ya que éstas muestras tienen una baja carga de microorganismos, como es el caso de los pacientes con EPOC. Otra potencial problema relacionado con estas de técnicas es la aparición de falsos positivos por problemas de contaminación. Con el fin de evitar la presencia de ADN externo, como los amplicones de determinaciones anteriores, se tomaron medidas durante el procesamiento de las muestras, para ello, la extracción de ADN y las fases de pre- y post-amplificación se llevaron a cabo en áreas de trabajo separadas espacialmente. La utilización de espacios separados para cada área de trabajo contribuye a evitar la transferencia de ADN entre muestras. Además, se llevaron a cabo procedimientos de limpieza en las superficies de trabajo utilizando soluciones descontaminantes antes y después de cada uso, las cuales son específicas para destruir el ADN. Por otro lado, se llevó a cabo el uso de puntas con filtros y la inclusión de controles negativos (agua estéril) y positivos (muestras de pacientes con PcP diluidas 1:10) para evaluar la presencia de contaminación durante el proceso y confirmar la especificidad de la técnica. 100 CONCLUSIONES 102 103 1.El presente estudio confirma por primera vez en pacientes con EPOC, la existencia de una dinámica de colonización por Pneumocystis jirovecii consistente en ciclos transitorios de colonización, aclaramiento y re-exposición al patógeno. Este hecho junto a otros factores como las diferencias climatológicas traduce una prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii variable. 2. La prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii observada durante este trabajo ha sido más elevada en los meses coincidentes con la primavera, no observando relación entre la colonización por este patógeno y la gravedad de la EPOC. 3. Hemos podido corroborar como la colonización por este patógeno se asocia a un aumento de la actividad inflamatoria sistémica, objetivando por primera vez, como este aumento de actividad inflamatoria sistémica revierte tras el aclaramiento de Pneumocystis jirovecii. 4. Los pacientes que eliminan al patógeno presentan una tendencia a la mejoría del VEF1y a la disminución del número de eosinófilos, no observando diferencias en el número de exacerbaciones durante el seguimiento. 5. Por tanto, nuestros resultados muestran que la colonización por Pneumocystis jirovecii en sujetos con EPOC es un proceso dinámico que provocaría alteraciones en la respuesta inflamatoria a nivel sistémico del huésped colonizado que revertirían tras el aclaramiento. Estos datos sugieren fuertemente que Pneumocystis jirovecii puede contribuir a la patogenia de la EPOC. 104 BIBLIOGRAFÍA 112 Criner, G. J., Celli, B. R., Brightling, C. E., Agusti, A., Papi, A., Singh, D., Sin, D. D., Vogelmeier, C. F., Sciurba, F. 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