Enfermedad de pompe: protocolo diagnóstico por el laboratorio clínico

de TESIS DOCTORAL JOAQUÍN BOBILLO LOBATO Sevilla 2012 FACULTAD DE MEDICINA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA JO A QU ÍN B O BILL O L O BAT O Sevilla 2012 FA CU LTAD DE MEDI C INA Y BI O L OG ÍA M O LE CU LAR DEPARTAMENT O DE BI OQU ÍMI C A MÉDI C A ENFERMEDAD DE POMPE P P ROTOCOLO ROTOCOLO D IAGNÓSTICO IAGNÓSTICO POR EL LABORATORIO CLÍNICO POR EL LABORATORIO CLÍNICO TESIS DOCTORAL FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR ENFERMEDAD DE POMPE PROTOCOLO DIAGNÓSTICO POR EL LABORATORIO CLÍNICO JOAQUÍN BOBILLO LOBATO SEVILLA 2012 1 Ciencia es el arte de crear ilusiones convenientes, que el necio acepta o disputa, pero de cuyo ingenio goza el estudioso, sin cegarse ante el hecho de que tales ilusiones son otros tantos velos para ocultar las profundas tinieblas de lo insondable. Carl Gustav Jung (1875-1961) Psicólogo y psiquiatra suizo. A mis padres, mis hermanos, sobrinos y todos mis seres queridos, quienes conforman mi familia y son parte de mi vida. 1 AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido posible gracias a la inestimable colaboración de muchas personas. En primer lugar quiero agradecer a mi director de tesis, el Dr. Luis M. Jiménez, la oportunidad que me brindó de incorporarme a este proyecto y poner a mi alcance todos los medios y recursos para la realización de esta Tesis. Gracias por transmitirme tu entusiasmo por la investigación, por tu rigor científico, por el constante estímulo que has supuesto para mí, por tu gran profesionalidad. Gracias por compartir tus conocimientos durante la residencia, por tus experiencias, plena dedicación y atención en todo momento durante la realización de este trabajo, pero principalmente por la confianza que mostraste en mí desde el primer día. Gracias por la total libertad de acción que me diste. Gracias por todo Luis. Quiero dar las gracias a Pilar Durán, por haber sido la primera en aguantarme y por enseñarme a trastear con las pipetas, los matraces, el peachímetro, los punchers, el sonicador… y todo el material de laboratorio. Gracias por no desesperar ante mi desorden y en tantas ocasiones en las que he llegado “arrasando”. Gracias por tus valiosos consejos, por escucharme y por el apoyo brindado durante la realización de la Tesis. Esto ha sido posible gracias a ti, tú lo sabes, y tengo que agradecértelo. Gracias a todo el personal facultativo y técnico del Servicio de Bioquímica Clínica del Virgen del Rocío. Tantas veces unos y otros me habéis aconsejado, os habéis preocupado y me habéis apoyado, dándome ánimos para seguir adelante. Especialmente a las Dras. Amelia Zaera y Adela Baños, ambas me disteis el impulso que necesitaba en los momentos en que más lo necesitaba, GRACIAS. AGRADECIMIENTOS Agradecimiento particular merecen todos mis compañeros residentes, a los que no puedo dejar de nombrar: mis co-R’s, Mª Carmen y Carmen(cita); mis R’s mayores, Carolina, José Diego, Hada, Said, Nando, Pablo, Mª José, José Luis y Ana; y mis R’s “chicos”, Ana, Pedro, Gema, Julia, Beatriz, Lola, Elena, Borja y Antonio. Muchísimas gracias por estar ahí SIEMPRE, por vuestra buena disposición SIEMPRE, por vuestra comprensión SIEMPRE y por vuestra paciencia conmigo SIEMPRE. GRACIAS. No puedo olvidarme de dar las gracias de forma especial a todos los que, desde fuera del hospital, habéis estado a mi lado y me habéis ayudado tantas veces a huir y a volver: a huir de las preocupaciones derivadas del trabajo que tantas veces me sobrepasaba y a volver a emprender la tarea con fuerzas renovadas. Siempre he tenido quién me ha escuchado cuando lo he necesitado, quién me ha sacado de casa en las tardes interminables escribiendo, quién me ha dado ideas, quién ha aguantado mis penas, quién me ha ayudado con los cálculos e incluso quién me ha ayudado con la portada… Muchísimas gracias a todos y cada uno. Y por último, mi agradecimiento, con todo mi cariño, a mi familia. Sin ellos no habría sido posible terminar este proyecto y por eso, además, les dedico esta Tesis. Han sido muchísimas las tardes que, encerrado frente al ordenador, escuchaba el jaleo de la vida que desarrollaba “abajo”; yo me sonreía, aunque no pudiera ir a disfrutar de esos ratitos con vosotros. Todo este trabajo es por vosotros y para vosotros. Con todo mi corazón: GRACIAS. Muchas gracias a todos. 1 ABREVIATURAS ABREVIATURAS MÁS UTILIZADAS DURANTE LA TESIS 4MU  4-Metilumbeliferona AαG  Actividad α-glucosidasa ácida total AαGIM  Actividad α-glucosidasa inhibida por acarbosa CDC  Centro de control y prevención de enfermedades de Atlanta (Centers for Disease Control and Prevention) CHO  Células ováricas de Hámster chino CK  Creatin-quinasa DBS  Sangre seca recogida sobre papel (Dried Blood Specimen/Spot) EDL  Enfermedad de depósito lisosomal EET  Terapia de mejora enzimática (Enzyme Enhancement Therapy ) EP  Enfermedad de Pompe ER  Enfermedad rara GAA  Enzima α-glucosidasa ácida Glc4  Glucosa tetrasacárido GSD  Glucogenosis/Enfermedad de depóstito de glucógeno (Glycogen Storage Disease) HPLC  Cromatografía líquida de alta resolución (High Performance Liquid Chromatography) IVS1-13T>G  Mutación más prevalente en la forma del adulto. Transversión de Timina por Guanina en la posición -13 del intrón 1 del gen GAA M6P  Manosa-6-fosfato ABREVIATURAS M6RP  Receptor de la manosa-6-fosfato MGA  Maltasa glucoamilasa NTE  Nutrición y Terapia del ejercicio NαG  Actividad α-glucosidasa ácida neutra PCR  Reacción en cadena de la polimerasa rhGAA  Enzima α-glucosidasa ácida humana recombinante TSE  Terapia de sustitución enzimática URV  Unidad relativa de valor INTRODUCCIÓN 19 INTRODUCCIÓN I. INTRODUCCIÓN 1. Enfermedades raras: Concepto y perspectiva general En la década de los años 60 aparecen en Europa las primeras referencias bibliográficas en torno al concepto de enfermedad rara (ER)1; pero no es hasta 1983 cuando se constituye en los Estados Unidos de Norteamérica la NORD (Nacional Organization for Rare Disorders), acuñándose de forma oficial el término de Enfermedad Rara, haciendo referencia a enfermedades con baja prevalencia. Posteriormente en los años 90 se constituye EURORDIS (European Organization for Rare Disorders), federación europea homóloga a la americana, y más recientemente FEDER (Federación Española de Enfermedades Raras) en nuestro país, con el fin de dar respuesta a las asociaciones de enfermos con estas patologías que poco a poco han ido proliferando a lo largo de estos años2. La Unión Europea define ER como aquella que tiene una prevalencia inferior a 5 casos por cada 10.000 habitantes, lo que equivale al 6-8% de la población europea3. Este umbral de prevalencia varía según los distintos países atendiendo a criterios epidemiológicos y económicos. En los EE. UU. se considera ER aquella que afecta a menos de 200.000 habitantes4, lo que se corresponde con un 8,4% de la población, en Japón las patologías que afectan a 4 de cada 10.000 habitantes5 y, en Australia, a las que afectan a 1 de cada 10.0006. Pero la realidad que se pretende abarcar con el término ER requiere una definición más amplia. De este modo, una definición más completa de ER sería “aquel conjunto amplio y variado de trastornos que se caracterizan por afectar, cada uno de ellos, a un número reducido de individuos en la población, ser crónicos y discapacitantes, contar con una elevada tasa de morbimortalidad, y para los que los recursos terapéuticos son, en general, escasos y poco eficaces”7. Algunas cuestiones importantes que reclaman aquellos que padecen estos trastornos, y quienes están relacionados con ellos, son: la falta de conocimiento científico sobre sus enfermedades; la dificultad para el acceso a un diagnóstico correcto y el retraso en dicho diagnóstico, así como la falta de información de calidad y de apoyo en ese momen- to; la falta de cuidados y atención multidisciplinaria; las consecuencias sociales adversas; la dificultad y la falta de equidad en el acceso al tratamiento, la rehabilitación y los cuidados; la pérdida de confianza en los servicios médicos y sociales; y cierto desinterés por parte de los profesionales de la salud. 20 INTRODUCCIÓN Como hemos referido, el diagnóstico suele ser complicado, no sólo por la sintomatología insidiosa e inespecífica que presentan de forma habitual y que puede llevar a retraso y errores, sino porque muchas veces, las técnicas que requieren son muy costosas y de difícil acceso y, sobre todo, por el gran desconocimiento que los clínicos tienen sobre este tipo de patologías. En España, la investigación en este campo es todavía escasa8-11, y por ello, se hacen necesarios esfuerzos importantes encaminados al desarrollo y potenciación de la investigación en este campo. En este sentido, se ha creado recientemente el Instituto de Investigaciones de Enfermedades Raras (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad y Consumo) que, entre otras actividades, ha publicado una Guía-Manual con un enfoque práctico de las ER12. El principal problema con el que nos encontramos es la repercusión sociosanitaria que suponen estas enfermedades13-14. La falta de inversiones y la escasa sensibilización de las distintas áreas implicadas, hacen sentir desamparados e impotentes a los pacientes afectos de ER. El escaso número de afectados por una misma ER es insuficiente para impulsar nuevas formas de detección, tratamiento y prevención, lo que agrava todavía más el problema para los pacientes. En los últimos años, la Unión Europea está impulsando la investigación, la formación de profesionales, el conocimiento y la divulgación de estas enfermedades. La solución es compleja, y precisa la colaboración conjunta de instituciones públicas, investigadores, facultativos, empresas farmacéuticas y asociaciones de pacientes15. Dentro de este amplio campo de las ER se encuentran enclavadas las enfermedades por depósito lisosomal, grupo muy heterogéneo donde destaca la enfermedad de Pompe, objeto de estudio del presente trabajo. La Decisión Nº 1295/1999/CE del Parlamento Europeo y del Consejo del 29 de abril de 1999 aprobó un programa de acción comunitaria sobre las enfermedades poco comunes en el marco de acción en el ámbito de la Salud Pública (1999-2003). Su propósi- to fue el de contribuir, en coordinación con otras medidas Comunitarias, a asegurar un alto nivel de protección sanitaria con relación a enfermedades raras. Se puso una atención específica en mejorar los conocimientos y en facilitar el acceso a la información sobre estas enfermedades, mediante cuatro acciones, siendo la segunda de ellas: Contribuir a la formación y la actualización de los conocimientos de los profesionales para mejorar, en el ámbito de las enfermedades poco comunes, la detección precoz, el reconocimiento, la intervención y la prevención. Por ello, el primer objetivo de esta tesis será contribuir a esta actualización de conocimientos sobre la enfermedad de Pompe a través de una extensa revisión bibliográfica que presente los principales puntos de conocimiento sobre el contexto, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad y que quedarán expuestos en el pun- to I. Introducción. 21 INTRODUCCIÓN 2. Enfermedades Lisosomales: Concepto y perspectiva general La OMS estima que existen actualmente unas 5.000 ER o de baja prevalencia en el mundo16. Entre ellas destaca un grupo cada vez más conocido y estudiado: las enfermedades de depósito lisosomal (EDL) o, simplemente, enfermedades lisosomales. De hecho, consideradas una por una, las EDL son poco frecuentes, pero su incidencia combinada puede suponer hasta 1 de cada 5.000-7.000 recién nacidos vivos17,18. Estas enfermedades tienen su origen en un trastorno, genéticamente determinado, de la síntesis o función de una hidrolasa ácida lisosomal o bien de una proteína necesaria para la correcta biogénesis y/o el normal funcionamiento de los lisosomas. En la actualidad suponen un heterogéneo grupo de alrededor de 50 entidades clínicas para las que hasta hace poco el diagnóstico preciso no era sencillo y requería de técnicas complejas e invasivas. La fisiopatología de la mayoría de estos trastornos se caracteriza por un curso progresivo, con importante morbimortalidad. En la actualidad, sólo se dispone de tratamiento específico para una pequeña parte de estas alteraciones19-22. La mayoría de las enfermedades que hoy se conocen como EDL se describieron por primera vez entre finales del siglo XIX y principios del siglo XX, mucho antes del descubrimiento de los lisosomas por De Duve en 195523. De hecho, la relación que existe entre los lisosomas y las EDL fue establecida por Hers cuando demostró que el déficit de la enzima maltasa ácida (α-glucosidasa) provocaba la acumulación de glucógeno en el interior de los lisosomas, en los pacientes que padecían la enfermedad de Pompe (Glucogenosis Tipo II) 24-26. Así, a medida que la estructura y función de este orgánulo celular se define y se identifican las diferentes enzimas en él incluidas, el concepto de EDL evoluciona. Desde este momento, cada enfermedad comienza a estar relacionada con una enzima lisosomal específica, el factor, el receptor o el sustrato acumulado (Figura I.1). Durante las dos últimas décadas, las técnicas de biología molecular han permitido identificar la mutación o mutaciones específicas que dan lugar a la enfermedad concreta de que se trate. La lista de EDL continúa creciendo a medida que se identifican nuevos trastornos o se descubre qué entidades clínicas de causa hasta ahora desconocida son el resultado de un defecto lisosomal (por ejemplo, recientemente, la enfermedad de Batten). 22 INTRODUCCIÓN Figura I.1. Línea del tiempo en el conocimiento de las EDL. Los lisosomas son orgánulos intracitoplasmáticos que forman parte de un complejo sistema de endocitosis celular mediada por receptores, utilizado por muchas células para internalizar diversas moléculas procedentes del medio extracelular, de células vecinas o secretadas por ellas mismas. Este sistema está formado por un grupo de estructuras especializadas en la separación de la molécula internalizada de su receptor, en su degradación enzimática y en el almacenamiento del material indigerible. Se trata de los endosomas “primarios”, los endosomas “tardíos”, los lisosomas propiamente dichos y las glicoproteínas asociadas a la membrana (LAMP’s o lgps) 27-29 (Figura I.2). 29 INTRODUCCIÓN Lo que encontró fue una importante cardiomegalia, signo característico de la forma infantil de la enfermedad. Tomando muestras del tejido cardiaco y realizando diferentes preparaciones microscópicas, pudo observar que las alteraciones de las células musculares podían deberse al acúmulo de una sustancia en el interior celular que parecía deformar las fibras cardiacas. Otros investigadores contemporáneos de Pompe, el Dr. Simon Van Creveld y el Dr. Edgar Von Gierke habían descrito entre 1928 y 1929 la GSD-I, o Enfermedad de Von Gierke, identificando como glucógeno el compuesto acumulado causante del trastorno. La influencia de estos autores llevó a Pompe a sospechar que la sustancia que ocasionaba la alteración cardiaca podía ser efectivamente glucógeno. Pompe se doctoró en 1936 con una tesis que precisamente titulaba como “Cardiomegalia glucogénica”. Después de una temporada en el Hospital San Canisio en Nimega, trabajó como patólogo en el Hospital de Nuestra Señora, en Amsterdam, donde permaneció desde junio de 1939 hasta su muerte45. Posteriormente se define la deficiencia enzimática causante de la enfermedad, la deficiencia de GAA, por el Dr. H. G. Hers en su artículo “Alpha-glucosidase deficiency in generalized glycogen storage disease (Pompe’s disease)” de 196324,25. Es en este momento cuando se sientan las bases para el desarrollo de toda una serie de estudios e investigaciones sobre un nuevo grupo de enfermedades, las enfermedades de depósito lisosomal 46-50. Figura I.5. J.C. Pompe 30 INTRODUCCIÓN 4.3. Formas de presentación de la enfermedad de Pompe La gran variabilidad fenotípica ha llevado a la creación de variedades basadas en la edad de aparición y el grado de afectación de los distintos órganos. Estos “subtipos” han recibido diferentes denominaciones en la literatura: “forma infantil no típica”, “forma juvenil”, “forma del adulto”, “formas de aparición tardía”… terminología que supone en muchas ocasiones controversias, incompatibilidades e incongruencias; de forma que, en la actualidad, tiende a considerarse a la EP como una enfermedad de progresión continua que varía según el momento en que debuta, el nivel de implicación de los órganos afectados y el grado de miopatía51,52. De este modo, en un intento de establecer una nomenclatura uniforme, podemos clasificar a la EP en dos principales formas de presentación: a) Una forma infantil, que incluye: - Pacientes que presentan enfermedad rápidamente progresiva caracterizada por una cardiomegalia importante, hepatomegalia, debilidad e hipotonía muscular, y muerte por insuficiencia cardiorrespiratoria durante el primer año de vida53, 54. Representa a la forma más extrema y grave de la enfermedad y es denominada a menudo como enfermedad de Pompe infantil clásica (precisamente la descrita por J.C.Pompe en 1932) 44. - Pacientes con variedad infantil (EP infantil no clásica), con una progresión más lenta y menor miocardiopatía severa, pero con presentación en el primer año de vida. Ésta también ha sido incluida por algunos autores en alguna de las “formas infantiles” 55. b) Una forma de aparición tardía, que incluye: - Pacientes en edad infantil o juvenil, con un espectro heterogéneo de patologías musculares, pero que de forma general no incluyen miocardiopatía severa56, 57. - Pacientes cuya sintomatología aparece más tarde, entre la segunda y sexta década de la vida (EP del adulto) y caracterizados por una miopatía lentamente progresiva sobre todo con participación del músculo esquelético58, 59. Sin embargo, es importante reconocer que la edad de inicio no siempre delimita bien los distintos subtipos, de modo que la presentación clínica debe ser considerada junto con la edad de inicio en la clasificación de los casos. 31 INTRODUCCIÓN 4.4. Prevalencia Resulta bastante complejo hablar de prevalencia de la EP y más complejo aún fijar un valor que la defina. La cuestión es que la prevalencia combinada de todas las formas de la enfermedad de Pompe es muy variable y depende enormemente de la etnia y la región geográfica de que se trate; así puede oscilar entre los 1:14.000 recién nacidos vivos en la población afroamericana60 a los 1:100.000 en individuos de origen europeo63. La única forma de aproximación posible a alcanzar una visión global resulta de analizar cada uno de los estudios individuales sobre prevalencia del trastorno en las distintas poblaciones y a partir de ellos sacar conclusiones. Sin embargo, este método también ha de hacerse con precaución si pretendemos extraer una información fidedigna, ya que el modo de acercamiento de cada estudio es muy diferente: desde trabajos basados en la cuantificación de casos tomando como base programas piloto de screening neonatal, hasta otros que calculan la prevalencia a partir de estudios poblacionales de frecuencia de las principales mutaciones de la enfermedad (Tabla I.1). Tabla I.1. Prevalencia de la enfermedad de Pompe en diferentes poblaciones POBLACIÓN INCIDENCIA REFERENCIA Afroamericano 1/14.000 Hirschhorn y Reuser60 Países Bajos 1/40.000 1/138.000 1/57.000 (combinada) (forma infantil) (forma del adulto) Ausems et al61 Poorthuis et al62 EE.UU. 1/40.000 (combinada) Martiniuk et al63 Sur de China / Taiwán 1/50.000 Lin et al64 Chien et al65 Descendientes de europeos 1/100.000 1/60.000 (forma infantil) (forma del adulto) Martiniuk et al63 Australia 1/145.000 Meikle et al66 Portugal 1/600.000 Pinto et al67 A pesar de estas dificultades para establecer un valor concreto de prevalencia, Orphanet (el portal de información europeo de referencia en enfermedades raras y medicamentos huérfanos) ha cuantificado en 1,1/100.000 la prevalencia de la enfermedad en sus informes periódicos de prevalencia de las enfermedades raras68 basados en los datos bibliográficos publicados recientemente. 32 INTRODUCCIÓN Además, y en relación a este tema, resulta muy interesante señalar que el estudio de prevalencia de las mutaciones han permitido detectar lo que en genética se conoce como efecto fundador en poblaciones de Taiwán y China (mutación p.Asp645Glu – 80% prevalencia en la población general) 69 y de ascendencia africana (mutación p.Arg854X – 60%)70, como consecuencia de la alta incidencia de mutaciones muy concretas de esta rara enfermedad en dichas poblaciones. 33 INTRODUCCIÓN 4.5 Bases moleculares, citológicas y fisiopatológicas de la enfermedad de Pompe 4.5.1 Genética de la enfermedad de Pompe La EP es una enfermedad hereditaria causada por una mutación en el gen de la GAA, localizado en el brazo largo del cromosoma 17 (locus 17q25.2-q25.3) 60,71. GAA es el único gen conocido asociado con GSD II y su modo de herencia es autosómico recesivo. El gen está completamente caracterizado (Tabla I.2). El ADNc tiene una longitud ≈ 3,6 kb, conteniendo 2.856 pb de secuencia codificante con una región 5' no traducida de 218 pb (exón 1) y una región 3' no traducida de 555 pb72, 73. El gen estructural completo (incluyendo las secuencias no codificantes/intrónicas) tiene una longitud de ≈28 kb y contiene 20 exones74, 75. EXON TAMAÑO DEL EXÓN POSICIÓN DEL EXON EN EL ADNc EXTREMO 5’ DONADOR EXTREMO 3’ ACEPTOR TAMAÑO DEL INTRÓN 1 >187 → 187 CGGgtagag tctcccgcagGCC 2800 2 578 188-765 ACGgtgggc tctcttctagATC 600 3 146 766-911 GCTgtgagt tgtcccgcagGCT 1850 4 166 912-1077 ACGgtacag gcatgtccagCCC 84 5 97 1078-1174 TGGgtaagc tcccttccagATG 350 6 120 1175-1294 TGGgaggg tggcctgcagGAT 80 7 119 1295-1413 CTGgtgagt tgtgctgcagGAC 88 8 132 1414-1545 GTGgtgtgt ctcttcccagGAT 1120 9 11 1546-1656 AAGgtaggg cgttgtccagGTA 670 10 114 1657-1770 ATTgtaagt tctcttgcagGAC 101 11 85 1771-1855 CTGgtcagc cctcttccagGGG 820 12 118 1856-1973 CAGgtgagg accaccccagGGC 600 13 134 1974-2107 CAGgtaagc gccctcccagAAA 139 14 152 2108-2259 CTGgtaggg tgccctgcagCCC 190 15 149 2260-2408 GGAgtgagt ccccttgcagGTT 3600 16 142 2409-2550 ACGgtgagt ctccctccagGTG 450 17 150 2551-2700 CAGgtacct ccctttccagGGC 650 18 165 2701-2865 AATgtgagt ctcggcccagAAC 350 19 153 2866-3018 AAGgcaaga ctctttccagGTC 550 20 606 3019-3624 Tabla I.2. Caracterización del gen GAA 74. En el ANEXO I se presenta la secuencia completa del gen GAA. 34 INTRODUCCIÓN La mayoría de los pacientes son “heterocigotos compuestos”, es decir, que han heredado dos mutaciones diferentes que al estar juntas dan lugar al desarrollo de la enfermedad. Hasta la fecha, se han identificado casi 300 mutaciones diferentes, aunque no todas se consideran patogénicas76, 77. Cada día se identifican nuevas mutaciones. El Pompe Center at the Erasmus University de Rotterdam, en los Países Bajos, mantiene un registro actualizado de todas mutaciones que dan lugar a la enfermedad78. La lista actualizada puede encontrarse en la web www.pompecenter.nl (ANEXO II). Aproximadamente el 63% de ellas conducen a la pérdida total de actividad GAA, el 12% a una deficiencia parcial, y el 25% son no patógenas 76, 79. La lista completa de mutaciones es larga, sin embargo no todas son igualmente prevalentes y, aunque algunas son más comunes, la mayoría son mutaciones privadas80-82. Entre las mutaciones más prevalentes podemos destacar:  -32-13T>G, IVS 1(-13 T→G) ó IVS1-13T>G Es la mutación más común en Europa y se encuentra en más de la mitad de los pacientes de raza blanca80. Es una mutación típica de la variedad del adulto, de hecho, el 71% de los pacientes heterocigotos compuestos con ésta variedad de la enfermedad, incluyendo todas las etnias, presentan esta mutación. Se trata de una transversión de Timina a Guanina en la posición -13 del sitio aceptor del intrón 1 del gen, originando splicing alternativos60: transcritos aberrantes en los que queda suprimido el primer exón codificante, el exón 2; y transcritos completos (≈10%) 83, 84 con la información adecuada para producir la enzima funcional85. Este mecanismo particular, es responsable de la escasa, pero significativa, actividad enzimática residual presente en estos pacientes, lo que explica la expresión fenotípicamente tardía de la enfermedad86, 87. A este respecto sería de gran interés seguir profundizando en el análisis cuantitativo de la abundancia del ARNm-GAA para obtener conclusiones sobre la expresión génica, la tasa de splicing eficiente y la correlación fenotípica de los pacientes IVS1.  1935C>A ó Asp645Glu Se encuentra en un gran porcentaje (hasta el 36%) de los recién nacidos con EP de Taiwán y parte de China88, 89 siendo ésta la enfermedad por almacenamiento de glucógeno más prevalente en estas poblaciones64, 69, 90. 35 INTRODUCCIÓN Esta mutación es una transversión de Citosina a Adenosina en la posición 1935 del exón 14 (C1935A), cercano al extremo 5’, que provoca la sustitución de ácido glutámico en la posición 645 por ácido aspártico (Asp645Glu), dando lugar a una reducción drástica de la actividad α-Gal en estos pacientes y, por lo tanto, a la forma infantil de la enfermedad91-93.  2560C>T ó Arg854X Se trata de la mutación más prevalente en las poblaciones de origen africano, con una frecuencia alélica de 0,43 entre los afroamericanos con GSD-II 70.Es una mutación sin sentido en el exón 18, una transición de Citosina a Timina que produce un codón de stop en la posición 854 de la proteína, donde debiera codificarse el aminoácido Arginina (Arg854X). La transición se produce en un dinucleótido CG, un punto susceptible a mutaciones recurrentes94. Se sintetiza una proteína truncada que se elimina y se pierde rápidamente, por lo que, si se encuentra en homocigosis, da lugar a la variedad infantil más grave de la enfermedad. Sin embargo, resulta mucho más frecuente encontrarla en heterocigosis en pacientes con las variantes juvenil-adulta de la EP, sobre todo en los de ascendencia africana.  Deleción del exón 18 (Δexon18) ó 2481+102_2646+31del ó Gly828_Asn882del El mecanismo de esta deleción consiste en la pérdida del exón debido a la existencia de dos secuencias idénticas que se repiten (AGGGGCCG) localizadas, la primera, a partir del nucleótido 102 tras el exón 17 (intrón 17), y la segunda, a partir del nucleótido 32 tras el exón 18 (intrón 18). Posiblemente durante los procesos de replicación del ADN se produce una recombinación desigual que trae consigo la pérdida del exón (Figura I.6) 96. Figura I.6. Mecanismo de deleción del exón 18. La pérdida del exón supone la ausencia de síntesis de la enzima, lo que deriva en la forma infantil grave de la enfermedad. EXON 17 EXON 18 AGGGGCCG AGGGGCCG 102 nt 31 nt 36 INTRODUCCIÓN  525delT (Δ525T) ó Glu176fsX45 Consiste en la deleción de un par de bases (T=A) en la posición 525, lo que conduce a una modificación del marco de lectura (frameshift - fs) ocasionando la terminación prematura de la síntesis de la proteína, de forma que no llega a producirse ninguna actividad enzimática. Su presencia en homocigosis es responsable del desarrollo de la variedad infantil95. Se ha especulado que el efecto fundador puede ser responsable de algunas de las mutaciones más frecuentes, siendo ésta una hipótesis ampliamente respaldada tanto por las pruebas que aporta la genética de poblaciones como por muchos autores en numerosos trabajos79, 89, 96, 97. Se ha tratado en muchas ocasiones de establecer una adecuada correlación genotipo-fenotipo global, pero aún no ha logrado conseguirse98. Desde el punto de vista molecular, muchos de los mecanismos genéticos no se conocen con exactitud, y desde el punto de vista clínico, se observa una gran heterogeneidad entre pacientes con un genotipo similar (a excepción de la presencia de dos mutaciones nulas, lo que resulta en una ausencia total de actividad enzimática y fenotipos similares). Así, la ausencia de correlación genotipo-fenotipo para la mayoría de las mutaciones sugiere una fisiopatología compleja de la enfermedad y unas bases moleculares aún complejas para nosotros. La única correlación posible que puede establecerse es la centrada no en propia mutación genética sino en la actividad enzimática residual, y aún así existen unos márgenes oscuros entre los límites que separarían a las diferentes variedades. En función de esto, sí es cierto que determinadas mutaciones son más o menos prevalentes para determinada variedad. Es el caso de las mutaciones que anteriormente hemos descrito y que están bastante bien caracterizadas, siendo muy características de variedades concretas y, aunque no de forma estricta, sí que presentan ciertos rasgos fenotípicos “típicos”, que podrían constituir un principio de correlación genotipo/fenotipo. Lo cierto es que los investigadores aún están aprendiendo acerca de la patología molecular de la enfermedad y, lo que también es de vital importancia, los factores tanto genéticos como ambientales que pueden influir en su progresión y sus resultados. 37 INTRODUCCIÓN 4.5.2 Síntesis y maduración de la α-Glucosidasa ácida (GAA) Puede resultar de interés hacer una breve referencia a la conformación de la GAA, pues es su alteración estructural y/o funcional desencadenará el proceso patológico en la EP. La enzima lisosomal α-glucosidasa ácida (GAA - EC 3.2.1.3), a pH ácido (≈5.4), hidroliza las uniones α-glucosídicas, tanto 1-4 como 1-6, de la molécula de glucógeno, presentando asimismo, una capacidad más o menos limitada de hidrolizar maltosa e isomaltosa99, 100. La secuencia de aminoácidos que componen la estructura primaria de la enzima se presenta en la Figura I.7: 10 20 30 40 50 60 70 80 MGVRHPPCSH RLLAVCALVS LATAALLGHI LLHDFLLVPR ELSGSSPVLE ETHPAHQQGA SRPGPRDAQA HPGRPRAVPT 90 100 110 120 130 140 150 160 QCDVPPNSRF DCAPDKAITQ EQCEARGCCY IPAKQGLQGA QMGQPWCFFP PSYPSYKLEN LSSSEMGYTA TLTRTTPTFF 170 180 190 200 210 220 230 240 PKDILTLRLD VMMETENRLH FTIKDPANRR YEVPLETPHV HSRAPSPLYS VEFSEEPFGV IVRRQLDGRV LLNTTVAPLF 250 260 270 280 290 300 310 320 FADQFLQLST SLPSQYITGL AEHLSPLMLS TSWTRITLWN RDLAPTPGAN LYGSHPFYLA LEDGGSAHGV FLLNSNAMDV 330 340 350 360 370 380 390 400 VLQPSPALSW RSTGGILDVY IFLGPEPKSV VQQYLDVVGY PFMPPYWGLG FHLCRWGYSS TAITRQVVEN MTRAHFPLDV 410 420 430 440 450 460 470 480 QWNDLDYMDS RRDFTFNKDG FRDFPAMVQE LHQGGRRYMM IVDPAISSSG PAGSYRPYDE GLRRGVFITN ETGQPLIGKV 490 500 510 520 530 540 550 560 WPGSTAFPDF TNPTALAWWE DMVAEFHDQV PFDGMWIDMN EPSNFIRGSE DGCPNNELEN PPYVPGVVGG TLQAATICAS 570 580 590 600 610 620 630 640 SHQFLSTHYN LHNLYGLTEA IASHRALVKA RGTRPFVISR STFAGHGRYA GHWTGDVWSS WEQLASSVPE ILQFNLLGVP 650 660 670 680 690 700 710 720 LVGADVCGFL GNTSEELCVR WTQLGAFYPF MRNHNSLLSL PQEPYSFSEP AQQAMRKALT LRYALLPHLY TLFHQAHVAG 730 740 750 760 770 780 790 800 ETVARPLFLE FPKDSSTWTV DHQLLWGEAL LITPVLQAGK AEVTGYFPLG TWYDLQTVPV EALGSLPPPP AAPREPAIHS 810 820 830 840 850 860 870 880 EGQWVTLPAP LDTINVHLRA GYIIPLQGPG LTTTESRQQP MALAVALTKG GEARGELFWD DGESLEVLER GAYTQVIFLA 890 900 910 920 930 940 950 RNNTIVNELV RVTSEGAGLQ LQKVTVLGVA TAPQQVLSNG VPVSNFTYSP DTKVLDICVS LLMGEQFLVS WC 38 INTRODUCCIÓN ESTRUCTURA DE LA α–GLUCOSIDASA ÁCIDA LISOSOMAL (GAA) Estructura primaria Estructura primaria 952 aminoácidos 110 kDa Procesamiento molecular Péptido señal 1 al 27 (27 aa) Propéptido 28 al 69 (42 aa) Cadena 70 al 952 (883 aa) Cadena 123 al 952 (830 aa) Forma activa madura silvestre, 76 kDa Cadena 204 al 952 (749 aa) Forma activa madura silvestre, 70 kDa Posiciones clave Centro activo Asn 518 Centro activo Glu 521 Modificaciones post-traduccionales Glicosilación Asn 140 N-acetil-Glucosamina Glicosilación Asn 233 N-acetil-Glucosamina Glicosilación Asn 390 N-acetil-Glucosamina Glicosilación Asn 470 N-acetil-Glucosamina Glicosilación Asn 652 N-acetil-Glucosamina Glicosilación Asn 882 N-acetil-Glucosamina Glicosilación Asn 925 N-acetil-Glucosamina Puente disulfuro Cys 82 ↔ Cys 109 Puente disulfuro Cys 92 ↔ Cys 108 Puente disulfuro Cys 103 ↔ Cys 127 Tabla I.3. Principales características estructurales de la GAA La estructura primaria de la GAA ha podido conocerse mediante clonación molecular y análisis de la secuencia de su ADNc101-104. Esta estructura primaria consiste en una proteína de 952 aminoácidos con un peso molecular aparente de 110 kDa que contiene, a su vez, siete puntos potenciales de glicosilación (Asn-X-Thr/Ser - donde X puede ser cualquier residuo 45 INTRODUCCIÓN CLASIFICACIÓN DE LAS FIBRAS MUSCULARES Tipo de Fibra Muscular Contractibilidad Color mATPasa Isoforma de Cadena pesada de Miosina Metabolismo Tipo I Lenta Rojo I MHCI Oxidativo Tipo IIA Rápida Rojo IIA MHCIIa Glucolítico- Oxidativo Tipo IIB Rápida Blanco IIB MHCIIb Glucolítico Además, análisis histoquímicos muestran diferente patrón enzimático en los distintos tipos de fibras musculares, lo cual refleja un metabolismo energético característico de cada tipo de fibra, poniendo de manifiesto vías metabólicas aeróbicas/oxidativo o anaerobicas/glicolíticas123. De este modo se establece una clasificación que converge con los tres tipos de fibras: de contracción rápida glucolítica (FG), de contracción rápida oxidativas (FOG), y de contracción lenta oxidativas (SO) (Tabla I.4). Es de vital importancia tener en cuenta esta clasificación de las fibras musculares, puesto que la deficiencia enzimática de la GAA, base de la EP, no afectará por igual a todos los tipos dependiendo del contexto metabólico y energético en que tenga lugar. Así, los dos principales tipos de metabolismo de estas células son127-129:  Metabolismo anaeróbico: basado principalmente en las vías catalíticas de la fosfocreatina a creatina y el glucógeno muscular a lactato.  Metabolismo aeróbico: basado principalmente en el metabolismo oxidativo de los ácidos grasos (procedentes de los triglicéridos almacenados en tejido muscular y adiposo) y la glucosa (procedente en primer lugar del glucógeno intracelular, pero la importancia de la glucosa extracelular aumenta con la duración del ejercicio). 46 INTRODUCCIÓN De forma esquemática podemos resumir las características metabólicas de los distintos tipos de fibras musculares en la siguiente Tabla130-135: Actividad ATPasa de Miosina Metabolitos Metabolismo del glucógeno Mioglobina Triglicéridos Glucógeno GAA GP Tipo I + +++ +++ ++ ++ +++ Tipo IIA ++ +++ + ++ ++ + Tipo IIB +++ + + ++ + +++ Metabolismo glucolítico Metabolismo oxidativo Metabolismo predominante PFK GP-DH SDH Cit. a y c 3-HADH Tipo I + + +++ +++ +++ Aerobio/ /Oxidativo Tipo IIA ++ ++ ++ ++ + Mixto Tipo IIB +++ ++ + + + Anaerobio/ /Glucolítico Tabla I.5. Propiedades metabólicas de los distintos tipos de fibras musculares. GP: Glucógeno fosforilasa; PFK: Fosfofructoquinasa; GP-DH: Glicerofosfato deshidrogenasa; SDH: Succinato deshidrogenasa; Cit a y c: Citocromos a y c; 3-HADH: 3-Hidroxiacil deshidrogenasa 47 INTRODUCCIÓN 4.5.3.2 Citopatología de la enfermedad de Pompe La enfermedad de Pompe se ha estudiado extensamente en las últimas décadas, pero todavía no está completamente claro cómo el defecto primario (la acumulación intralisosomal de glucógeno) lleva a la destrucción profunda del músculo esquelético. La idea predominante durante muchos años ha sido que las células musculares tienen poco espacio para soportar el aumento de volumen que sufren los lisosomas como consecuencia del acumulo de glucógeno no degradado; por lo que el daño muscular se produce cuando este aumento de volumen conduce a un aumento de tensión y el esfuerzo mecánico al que se somete la célula supera la capacidad de resistencia de las membranas, celular e intracelular, conduciendo a su ruptura136. Sin embargo, los últimos estudios tienden a pensar que esta visión resulta incompleta y que tiene mayor importancia el fracaso del proceso de autofagia observado más recientemente tanto en pacientes con EP como en ratones GAA-knock-out. Además, ha quedado demostrado que la deficiencia de una única enzima lisosomal (GAA) conduce a una disfunción vacuolar global y a un tráfico vesicular anormal tanto en la vía endocítica como en la autofagocítica. Figura I.11. Autofagia frente a fagocitosis 48 INTRODUCCIÓN Este defecto en la autofagia, conlleva una acumulación de autofagosomas que en último término llega a interrumpir el aparato contráctil de las fibras musculares, y además parece interferir con la terapia de reemplazo enzimático, actuando como sumidero para la enzima recombinante evitando su integración eficiente en el sistema lisosomal. Estas observaciones parten de los últimos ensayos clínicos dónde ha quedado registrado el éxito del tratamiento con rhGAA respecto a las anomalías cardiacas, pero no para el problema muscular137-139. La cuestión es que la situación en el músculo esquelético es más compleja y también se hará referencia a ella en el apartado 1.7. Tratamiento. Partiendo de ratones GAA-knock-out, se observa que tras un periodo de tratamien- to con rhGAA, las fibras musculares tipo II (de metabolismo glucolítico) habían eliminado el exceso de glucógeno de una forma significativamente menos eficiente que las fibras tipo I (de metabolismo oxidativo), especialmente las de tipo IIb139, 140. Ésta “resistencia al Figura I.12. Autofagosomas en las fibras musculares. Los autofagosomas retienen los materiales que no pueden degradarse y su acumulación interrumpe la estructura muscular, produciendo defectos en la contracción muscular normal. 49 INTRODUCCIÓN tratamiento”, manifestado en la escasa respuesta de las fibras musculares tipo II a la sustitución enzimática es sorprendente, ya que en los animales no tratados, el acúmulo de glucógeno en las fibras tipo II es significativamente menor que en las células cardíacas o las fibras Tipo I132, 133. La clave parece encontrarse en el hallazgo que pone de manifiesto la presencia de grandes áreas de autofagia en fibras musculares tipo II deficientes en GAA. La autofagia es un proceso de degradación lisosomal de proteínas de vida larga y orgánulos dañados. En la macroautofagia (en adelante denominada autofagia), vesículas de doble membrana, los autofagosomas, secuestran citoplasma y orgánulos dañados. El autofagosoma se fusiona con los endosomas, dando lugar a los anfisomas que posteriormente se fusionan con los lisosomas donde se completa la degradación del contenido del autofagosoma141, 142. La autofagia es un mecanismo de supervivencia crítica en condiciones de privación de nutrientes y parece jugar un papel importante en el recambio proteico basal143. En condiciones normales, autofagosomas y anfisomas son rápidamente degradados por los lisosomas, y su contenido se recicla. Por el contrario, en las fibras musculares tipo II obtenidas de ratones GAA-knock- out, se ha observado una acumulación significativa de autofagosomas. Grandes regiones no contráctiles que contienen abundantes autofagosomas de doble membrana son claramente visibles en este tipo de fibras por microscopía electrónica (Figura I.12) 144. En las fibras tipo I, por el contrario, sólo se observan un pequeño número de autofagosomas aislados. Estos resultados pueden ser confirmados al usar microscopía confocal marcando las fibras con anticuerpos contra diferentes proteínas propias de lisosomas, endosomas y autofagosomas, observándose anomalías en su número, volumen y distribución (Figura I.13)145. Otro dato de interés revelado en los últimos estudios hace referencia a la disposición que presentan los lisosomas en los distintos tipos de fibras musculares. Por un lado, en las fibras tipo I se disponen en largos tramos, quedando interconectados y en estrecha relación con el Golgi; no siendo así en las fibras tipo II donde existe un sistema independiente de vesículas individualizadas. Esta distribución responde al metabolismo principal de cada uno de los tipos de fibras, ya que la velocidad de reacción, la capacidad energética y las necesidades propias del tipo de contracción son diferentes. 50 INTRODUCCIÓN A B C WT KO Figura I.13. Imágenes de microscopía confocal de mioblastos teñidos para Lámp1 (proteína de membrana asociada a lisosomas). [A] o transfectadas con GFP-Lámp1 (Lamp 1 asociada a la proteína verde fluorescente). [B] que muestran el aumento en el número de endosomas tardíos y lisosomas en los animales knock-out (KO) respecto a los silvestres (WT). [C] El aumento de volumen de los endosomas tardíos en KO se confirma por el tamaño de las estructuras doble positivo Lámp1 (rojo)/receptor de manosa-6-fosfato-catión independiente (CI-MPR) (color verde). De este modo, en los animales KO los lisosomas de las fibras tipo I generan una estructura de forma tubular y, por el contrario, en las fibras tipo IIB KO, se distribuyen a lo largo de la fibras sin presentar conexión (Figura I.14) 146. Esta disposición lisosomal tiene su reflejo en el sistema autofagosómico de modo que existe una incapacidad de los autofagosomas para fusionarse y evolucionar hasta asociarse con los lisosomas que degraden y reciclen su contenido. Así, finalmente, los autofagosomas se acumulan y se convierten en un depósito de desperdicios y material celular inútil e incluso tóxico, que acaba afectando a la correcta estructura y función celular. 51 INTRODUCCIÓN WT KO Tipo I Tipo II Figura I.14. Disposición de los lisosomas en los diferentes tipos de fibras musculares tanto de animales WT como KO [A y B]. [C] Acumulación de autofagosomas en el interior de una fibra muscular Tipo II KO. Es bien sabido que la privación nutricional induce autofagia, presumiblemente para proveer de sustratos al metabolismo energético147. Así, un aumento de la autofagia en el músculo esquelético deficiente en GAA, plantea la intrigante posibilidad de que el fracaso al digerir el glucógeno lisosomal a glucosa podrá crear un círculo vicioso al privar a las células musculares de una fuente de energía que les resulta imprescindible. Sin embargo, sólo en las fibras KO tipo II se observan grandes acúmulos de autofagosomas, lo que sugiere que la patogénesis de la enfermedad en los dos tipos de fibras es muy diferente. El papel de la GAA en las fibras tipo II podría asemejarse al desarrollado por esta enzima en hígado y corazón durante el período postnatal inmediato cuando hay una demanda masiva de liberación de glucosa148. La autofagia de glucógeno en el período neonatal es un mecanismo accesorio de suministro de glucosa bajo condiciones de demanda masiva de producción de este azúcar. En estos casos, la degradación hidrolítica en las vacuolas de autofagia asiste a la degradación fosforolítica en el citoplasma para combatir la hipoglucemia149-151. Así, durante este período, aumenta dramáticamente la actividad GAA, y la degradación autofágica-lisosomal de glucógeno a glucosa proporciona la energía necesaria para satisfacer los requerimientos metabólicos. Figura 15. Degradación autofágica de glucógeno. 52 INTRODUCCIÓN De este modo, la sucesión de acontecimientos que desencadenan la citopatología basada en la alteración de la autofagia podría resumirse de la siguiente forma: La digestión deficiente de glucógeno produce, por un lado, una acumulación intralisosomal del polisacárido, y por otro, un “hambre celular”, estimulando una fuerte respuesta autofágica que, junto con la incapacidad de las vesículas para fusionarse y descargar su contenidos en los lisosomas, lleva a una acumulación continua de autofagosomas y de “basura biológica” dando lugar a una desorganización importante de la estructura de los microtúbulos, y por tanto a graves alteraciones del tráfico vesicular, produciendo la destrucción de la arquitectura celular así como un daño celular intenso y más o menos irreversible (Figura I.16). Figura I.16. Esquema del proceso autofágico en la enfermedad de Pompe 53 INTRODUCCIÓN Aunque el protagonismo del daño autofágico en la biología celular de la EP ha sido toda una revelación, las observaciones realizadas a lo largo de todos estos años, así como revisiones actuales de la citopatología de la enfermedad, no pueden otorgar exclusividad a este proceso como desencadenante de todas las alteraciones estructurales y funcionales que sufren las fibras musculares. Así, parece ser que la autofagia tiene una mayor importancia en los casos en los que la EP se presenta como una forma del adulto, siendo la acumulación autofágica mínima en las formas infantiles donde las alteraciones y roturas lisosomales parecen ser la principal causa de morbilidad celular. La antigua hipótesis presentada por Christian de Duve y aplicada a la enfermedad de Pompe por JL Griffin en 1984136 ha sido actualizada con posterioridad por B. Thurberg y sus colaboradores sobre una base de datos más recientes y con las nuevas técnicas de microscopía electrónica140, 152. Al caracterizar la progresión de la enfermedad en lactantes, estos autores propusieron cinco etapas: Las células con enfermedad en estadio temprano contienen lisosomas pequeños, cargados de glucógeno, situados entre las miofibrillas que se mantienen intactas (Etapa 1). El glucógeno se sigue acumulando, y los lisosomas cargados de glucógeno aumentan en tamaño y número. En algunas zonas, el glucógeno se filtra desde los lisosomas hacia el citoplasma y tiene lugar la fragmentación de las miofibrillas (Etapa 2). En la Etapa 3 las células contienen numerosos lisosomas llenos de glucógeno que ejerciendo presión sobre el resto de estructuras celulares. Algunas membranas lisosomales de estas células finalmente se rompen vertiendo más glucógeno en el citoplasma. En la Etapa 4, la mayoría del glucógeno es citoplasmático y los elementos contráctiles de la célula han quedado completamente desplazados. En la Etapa 5 las células aparecen hinchadas al parecer debido a la infiltración de agua que acompaña al acumulo intracelular de glucógeno (Figura I.17) 140. 54 INTRODUCCIÓN Etapa 1.  Glucógeno lisosomal  Mínima miopatía Etapa 2.  Incremento de glucógeno lisosomal  Glucógeno citoplasmático irregular Etapa 3.  Glucógeno lisosomal denso  Incremento citoplasmático de glucógeno  Severa miopatía y alteración del sistema fibrilar Etapa 4.  Disminución del glucógeno lisosomal  Incremento citoplasmático de glucógeno Etapa 5.  Mayor parte del glucógeno es citoplásmico  Edema celular // // infliltración de agua  Pérdida completa del sistema fibrilar y estructura sarcoplásmica Figura I.17. Modelo de las 5 etapas de Thurberg. La acumulación lisosomal de glucógeno y la ruptura de estos orgánulos serían la principal causa de la citopatología de la EP. El proceso se dividiría en 5 etapas consecutivas hasta originar el daño celular más grave que conduce a la destrucción de todas las estructuras contráctiles de la fibra muscular140. 61 INTRODUCCIÓN osteoporosis168. Las funciones motoras gruesa y fina pueden estar limitadas por la debilidad. En ciertas ocasiones y como última fase de la enfermedad, puede verse comprometida la comunicación como consecuencia de la debilidad oral-motora que puede desarrollarse, de modo que el paciente queda incapacitado para hablar y expresarse169. La miopatía es el resultado de la acumulación de glucógeno en el músculo, lo que compromete la función muscular y conduce a debilidad progresiva136, 140, 144. La distribución de la debilidad muscular refleja un patrón de cinturas escapular y pelviana, generalmente simétrica y de evolución descendente, donde los músculos pélvicos están más débiles que los de escápula165. De los pélvicos, los aductores del muslo y glúteos se ven más afectados que los psoas170. A nivel femoral se afectan más los músculos isquiotibiales. La afectación de la musculatura pelviana induce una marcha peculiar con desplazamiento hacia atrás del pun- to de gravedad, marcha de pato, balanceo de pelvis, hiperlordosis… Las extremidades superiores se ven menos afectadas que las inferiores, pero de nuevo reflejan una mayor participación proximal-distal. Todos los fijadores escapulares (subescapular, trapecio inferior y romboides) participan por igual. Hay menos participación de los músculos del brazo distal y una participación moderada de los músculos flexores del cuello con preservación de la extensión. Los músculos abdominales y los extensores del tronco se encuentran frecuentemente afectados, además, de forma marcadamente severa165, 170. A medida que la enfermedad progresa, los pacientes desarrollan las limitaciones relacionadas con la debilidad del anillo óseo. Éstas incluyen dificultad para levantar los brazos sobre la cabeza, incorporarse después de agacharse, sentarse o tumbarse, saltar, subir o bajar escaleras…167 El desequilibrio respecto a la afectación de los distintos músculos conduce a alteraciones en la postura y el movimiento, desarrollándose mecanismos compensatorios destinados a neutralizar las deficiencias y contrarrestar la debilidad171. A pesar de la eficacia inicial de las compensaciones, el uso persistente de estos mecanismos puede conducir, con el tiempo, a desventajas biomecánicas, contracturas, y deformidad que desencadenan debilidad e incapacidad crecientes167, 171.  DOLOR Y FATIGA El dolor y la fatiga, aunque no sean síntomas del todo específicos, son quejas muy comunes entre los pacientes adultos con EP. En un estudio reciente sobre la historia natural de los pacientes adultos con EP, el 76% de los pacientes reportaba fatiga y el 46% refirió dolores con frecuencia, normalmente acompañando a la fatiga172. Estos dos signos no parecen estar relacionados con la duración o evolución de la enfermedad, pudiendo ser tanto una manifestación inicial y desaparecer posteriormente, como aparecer más tarde y perdurar de forma crónica172. Los calambres musculares y las mialgias también son frecuentes172, 173. 62 INTRODUCCIÓN  INSUFICIENCIA RESPIRATORIA Conforme progresa la EP, la debilidad muscular conduce a bajos volúmenes pulmonares, tos frecuente e improductiva, alteración de gases en sangre y trastornos respiratorios del sueño. Estos cambios son similares a los observados en cualquier paciente con debilidad neuromuscular subyacente, como la distrofia muscular de Duchenne y la atrofia muscular espinal174. Los pacientes con EP también corren un mayor riesgo de neumonía por aspiración. Aproximadamente el 60% de los pacientes con EP de inicio tardío presenta una leve reducción de la capacidad vital (CV< 80% del teórico) y el 30-40% una reducción moderada (CV< 60% predicho)175, 176. Aunque el patrón de debilidad muscular es variable, se ha observado una correlación aproximada entre las medidas de función pulmonar y debilidad muscular proximal, en particular en la implicación diafragmática de las extremidades inferiores176. La implicación diafragmática puede ser un hallazgo precoz y la insuficiencia respiratoria es, a menudo, la primera manifestación clínica de la enfermedad177, 178. La retención crónica de CO2 (pCO2 arterial y concentración sérica de bicarbonato elevadas) y la hipoxemia (disminución de la pO2 arterial y la saturación de oxígeno) son signos de progreso de la debilidad muscular respiratoria, apareciendo por lo general mientras se duerme en primer lugar y posteriormente durante el día178. De forma prácticamente inevitable se acaban desarrollando trastornos respiratorios del sueño debido a la desventaja mecánica de la posición en decúbito supino y al efecto del sueño sobre los mecanismos de control respiratorio. Se produce así, una disminución en el tono de las vías respiratorias altas, especialmente durante el sueño REM, que puede comprometer la ventilación. La hipoventilación nocturna precede normalmente a la insuficiencia respiratoria durante el día175, 179. Si la insuficiencia respiratoria progresa, el paciente no tendrá más remedio que adoptar medidas de asistencia respiratoria. Entre el 11% y el 25% de los pacientes adultos requieren el uso de ventilación invasiva, precisando ventilación no invasiva el 29% 180.  PROBLEMAS CARDIACOS Y VASCULARES Los problemas cardíacos más comunes en los pacientes Pompe incluyen cardiomiopatía, insuficiencia cardíaca y arritmia. También hay un componente de disfunción cardíaca que contribuye a una insuficiencia respiratoria desde el punto de vista hemodinámico y del impacto del tamaño cardiaco en la capacidad pulmonar. 63 INTRODUCCIÓN En la forma infantil, los efectos de la acumulación de glucógeno son muy pronunciados en el corazón. El resultado de la acumulación del glucógeno es una hipertrofia cardiaca significativa (entre 2 y 10 z-score para la masa ventricular izquierda) que puede comenzar en el útero y que, incluso a las 4-8 semanas de edad, puede ser importante. La respuesta cardíaca a la acumulación de glucógeno puede tener como resultado una miocardiopatía hipertrófica o una cardiopatía hipertrófica y dilatada181. En las demás variantes de EP, la participación del corazón en la patología es variable, existiendo un espectro variable en los pacientes con actividad enzimática parcial que va desde la ausencia de patología cardiaca, pasando por la hipertrofia moderada, a la disfunción cardíaca181, 182. En los pacientes con EP de inicio tardío por lo general no aparece cardiopatía clínicamente identificable. Sin embargo, no hay datos publicados de la función sistólica y diastólica en este grupo de pacientes, siendo interesante realizar estudios en este campo. Los aneurismas cerebrales son una seria complicación de la EP, con mayor incidencia en la forma del adulto, siendo la segunda causa de muerte después de la insuficiencia respiratoria183, 184.  SIGNOS BIOQUÍMICOS Existen pautas comunes en cuanto a la bioquímica sanguínea de estos pacientes. Se observan elevaciones de la creatin-quinasa (CK) en el suero de los recién nacidos con EP de hasta 2000 U/L185 y en los pacientes juveniles y adultos, puede alcanzar valores superiores a 15 veces el valor normal186. Sin embargo, no todos los pacientes experimentan esta elevación de CK, apareciendo hasta un 10 % con niveles normales de la enzima en suero. Aún así, es un marcador bastante sensible que conviene tener en cuenta a la hora de explorar al paciente con el fin de llegar al diagnóstico de la enfermedad. Las enzimas aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y lactato deshidrogenasa (LDH) también suelen encontrarse elevadas, pero los niveles normales no son excluyentes de la enfermedad. Estas enzimas tienden a aumentar a medida que progresa la enfermedad187. Es extremadamente infrecuente que el enfermo de EP no presente elevación de ninguna de estas enzimas160. Recientemente ha comenzado a tomar protagonismo un nuevo parámetro, un tetrasacárido de glucosa, excretado en orina (Glc4: Glc-α1→6-Glc-α1→4-Glc-α1→4-Glc), y que presenta una alta rentabilidad diagnóstica188. Algunos autores aseguran que la elevación de Glc4 en la orina presenta cerca del 100% de sensibilidad en la identificación de 64 INTRODUCCIÓN pacientes con la forma infantil de EP. Además, como marcador biológico, ha demostrado tener una buena correlación con la respuesta clínica a la terapia de sustitución enzimática (TSE) 188, 189. Las actuales guías clínicas recomiendan el análisis de Glc4 urinaria como prueba auxiliar no invasiva que apoye el diagnóstico de EP. Este método ha sido validado para la orina seca en papel, lo que facilita la recogida y traslado de las muestras desde lugares alejados de un centro de análisis. Cuando se combina con el ensayo de la GAA en DBS, la sensibilidad diagnóstica parece estar cercana al 100%189,190. Es igualmente importante tener en cuenta que los resultados negativos de ambas pruebas descartan de forma muy significativa el diagnóstico de la enfermedad y ahorran tiempo, eliminando también la necesidad de realizar procedimientos invasivos, tales como biopsias de piel o músculo. Estos ensayos se llevan a cabo en laboratorios especializados y aún no están muy extendidos.  PROGRESIÓN, EVOLUCION Y MORBILIDAD La tasa de progresión de la enfermedad en los pacientes con la forma adulta es variable, pero parece ser cierta la correlación entre la aparición más temprana y la progresión más rápida de los síntomas165. El porcentaje de pacientes que requieren el uso de silla de ruedas o respirador aumenta con la duración de la enfermedad, poniendo de relieve el carácter progresivo de ésta. Las probabilidades para el uso de silla de ruedas aumentan en un 13% por cada año adicional después del diagnóstico y para la asistencia respiratoria en un 8%180. Los signos y síntomas de la enfermedad son variados y suaves al principio, lo que a menudo supone una demora para el diagnóstico164-166. El retraso medio desde el inicio de los síntomas a la primera consulta médica con un diagnóstico más o menos definitivo, se ha calculado en un intervalo entre los 7 y 10 años y la comunidad médica aún no ha conseguido reducir este retraso diagnóstico en los últimos años.  MUERTE La muerte suele sobrevenir como consecuencia de fallo cardiorespiratorio a causa de la grave miopatía en la forma infantil y por la insuficiencia respiratoria a causa de la debilidad diafragmática en la forma adulta. Los pacientes que experimentan los primeros síntomas a edades más tempranas suelen morir antes165. 65 INTRODUCCIÓN 4.6 Diagnóstico de la enfermedad de Pompe El diagnóstico de la enfermedad de Pompe plantea a menudo una dificultad importante debido a la rareza de la condición y a la naturaleza relativamente poco específica de las características fenotípicas propias de la enfermedad. La presentación en su variedad infantil es más fácilmente reconocible por sus características de hipotonía, debilidad generalizada, y cardiomegalia. En el caso de los pacientes que padecen la forma del adulto la presentación conlleva signos más vagos y pueden ser más difíciles de enmarcar en el contexto de la enfermedad. El diagnóstico diferencial de la forma infantil incluye cualquiera de las casusas de hipotonía o cardiomiopatía (Tabla 9) 191. La hipotonía puede ser causada por afecciones de los músculos, los nervios, o la unión neuromuscular. También puede ser secundaria a enfermedades sistémicas con afectación de cualquiera de los nervios o los músculos. El diagnóstico diferencial en los casos de formas juveniles o del adulto es más amplio, dada la inespecificidad de las características que presentan (Tabla 10) 191, incluyendo también todas aquellas causas de debilidad crónica como miopatías, neuropatías y trastornos de la unión neuromuscular. El diagnóstico precoz es de vital importancia, principalmente para la forma infantil, y requiere, tanto de una mayor conciencia entre los clínicos respecto a las características de la enfermedad, como de pruebas diagnósticas rápidas y fiables que confirmen la deficiencia de GAA. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE LA FORMA INFANTIL DE ENFERMEDAD DE POMPE Hipotonía Etiología central (p.e. Hipoxia-isquemia) Miopatía congénita Distrofia muscular congénita Miopatía metabólica Otras enfermedades de depósito de glucógeno Enfermedad de Danon Miopatía ligada a X con exceso de autofagia Enfermedad de depósito de lípidos Miopatía mitocondrial Miopatía endocrina Atrofia muscular espinal Polineuropatía hereditaria Neuropatía axonal gigante Neuropatía hipomielinizante congénita Miastenia gravis neonatal transitoria Miastenia congénita Cardiomiopatía Fibroelastosis endocardiaca Miocarditis Cardiomiopatía hipertrófica idiopática Enfermedad de depósio Mucopolisacaridosis Mucolipidosis Gangliosidosis Enfermedad de Fabry Lipofuscinosis 66 INTRODUCCIÓN Al ser una enfermedad de acúmulo, y por lo tanto en la que el daño fisiopatológico es progresivo, un retraso en el diagnóstico supone un aumento del deterioro orgánico que puede llegar a ser importante e incluso irreversible165,180. Por ello es de vital transcendencia establecer un diagnóstico correcto en el menor tiempo posible e iniciar el tratamiento inmediatamente. Desgraciadamente la realidad es muy distinta, ya que hasta el 20% de los pacientes sufren un retraso diagnóstico de entre 1 y 5 años191, 192. Tras el diagnóstico, el seguimien- to clínico de los pacientes debe ser individualizado para cada enfermo, pero las guías recomiendan un seguimiento estrecho de los pacientes con la variante infantil de la enfermedad y una revisión general cada seis meses para la forma adulta/juvenil191-193. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE LA FORMA ADULTA/ /JUVENIL DE ENFERMEDAD DE POMPE Distrofia muscular Miopatía metabólica Otras enfermedades de depósito de glucógeno Enfermedad de Danon Miopatía ligada a X con exceso de autofagia Enfermedad de depósito de lípidos Miopatía mitocondrial Miopatía endocrina Miopatía inflamatoria Miopatía tóxica Trastornos celulares del asta anterior Esclerosis lateral amiotrófica Atrofia muscular espinal tipos 2 y 3 Enfermedad de Kennedy Neuropatía periférica Neuropatía hereditaria Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica Amiloidosis Trastornos de la unión neuromuscular Miastenia gravis Miastenia congénita Síndrome miasténico Lambert-Eaton 67 INTRODUCCIÓN 4.6.1 Evaluación clínica En la mayoría de los casos, los primeros signos de alarma son los síntomas propios de la enfermedad detectados por los padres (en el caso de la forma infantil) o el propio paciente (para la forma del adulto) como la hipotonía, la debilidad muscular o la fatiga. Son por tanto las primeras señales que pueden ayudarnos a llegar a un diagnóstico y en la mayoría de las ocasiones también el punto de partida de muchos algoritmos diagnósticos (Figuras I.19 y I.20) 192. La evaluación de estos síntomas debe valorarse a la luz de determinadas pruebas médicas que nos permitan cuantificar el grado y etiología de los mismos. La radiografía de tórax y el electrocardiograma (ECG) son pruebas de detección valiosas en el algoritmo diagnóstico para la enfermedad de Pompe infantil, siendo un ecocardiograma el siguiente paso192. La radiografía de tórax pondrá de manifiesto una cardiomegalia masiva de estos pacientes y el ECG suele mostrar un intervalo PR corto, así como un complejo QRS muy alto. En la forma adulta, rara vez aparece cardiomegalia en la radiografía de tórax y el ECG no resulta de mucha utilidad. Además, en la variedad infantil el ecocardiograma muestra, ya en las primeras etapas de la enfermedad, la miocardiopatía hipertrófica típica con o sin la obstrucción del tracto de salida ventricular. En las etapas tardías de la enfermedad infantil, los pacientes pueden presentar deterioro de la función cardiaca y miocardiopatía dilatada. Entre los pacientes con cardiomiopatía, una electromiografía (EMG) puede ser útil para documentar miopatía presintomática191, 192. La presentación clínica en los casos de adultos es típicamente la de una miopatía proximal; gran parte de la evaluación consiste en la realización de pruebas musculares (EMG, estudios de conducción nerviosa y/o biopsia muscular para histología, histoquímica y ensayo enzimático…). Las pruebas de función pulmonar son también de suma importancia pues la insuficiencia respiratoria aparece hasta en el 10% de los pacientes como el primer síntoma de debut clínico176. 68 INTRODUCCIÓN  ALGORITMO DIAGNÓSTICO ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE LA FORMA INFANTIL DE LA ENFERMEDAD DE POMPE SÍNTOMAS DE PRESENTACIÓN MÁS COMUNES CARDIOVASCULARES Caridomegalia; Fallo cardiaco congestivo; Taquicardia supraventricular; Paro cardiaco durante cirujía PULMONARES Infecciones frecuentes; Insuficiencia/distrés respiratorio NEUROLÓGICOS Hipotonía; Retraso mental; Retraso de la motricidad; Pérdida de las funciones motoras tempranas GASTROINTESTINALES Retraso del desarrollo y el crecimiento; Dificultades par a alimentarse HALLAZGOS DIAGNÓSTICOS DE INTERÉS CARDIOVASCULARES Soplo, arritmia, sudoración excesiva (de relación cardiaca); Cardiomegalia; Cardiomiopatía; Hipertrofia +/- LVOTO progresando a cardiomiopatía dilatada PULMONARES Afectación respiratoria progresiva; Aleteo nasal; Uso de músculos accesorios, retracción IC y SC, disminución del murmullo vesicular en LLL; Ruidos respiratorios toscos NEUROLÓGICOS Retraso motor; Hipotonía, control de la cabeza, habilidad del niño para “escurrirse”, posición de las piernas “en rana”, hipertrofia de los gemelos GASTROINTESTINALES Macroglosia; Boca abierta; Tono facial disminuído; Disminución del reflejo de succión y de deglución; Dificultad para manejar las secreciones orales; Hepatomegalia. ESTUDIOS CLÍNICOS Y DE LABORATORIO INICIALES ESTUDIOS CLÍNICOS Radiografía de tórax - Cardiomegalia; ECG - onda R aumentada, intervalo PR corto y complejo QRS alargado; Ecocardiografía – Cardiomiopatía; Electrofisiología (EMG/NCS) - Miopatía LABORATORIO (ORINA Y SANGRE) Elevación de CK, AST, ALT, LDH (en sangre) y Glc4 (en orina); Baja actividad GAA en DBS o Linfocitos; Mutación familiar conocida ESTUDIOS DE CONFIRMACIÓN ADN Descripción de la mutación de GAA ENZIMOLOGÍA Determinación de la actividad GAA en linfocitos, fibroblastos y/o músculo. Precaución con la biopsia muscular debido a la necesidad de anestesia. HISTOLOGÍA/ /HISTOQUÍMICA Incremento de glucógeno lisosomal, “células vacuoladas” LVOTO: Obstrucción intraventricular izquierda (de siglas en inglés). IC: infraclavicular. SC: supraclavicular. ECG: Electrocardiograma. EMG: Electromiograma. NCS: Estudio de conducción nerviosa - Si existe actividad GAA, continuar con resto de pruebas confirmatorias si hay sospecha clínica importante. - Sin actividad GAA, buscar estudios de confirmación de diagnóstico alternativo. 69 INTRODUCCIÓN ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE LA FORMA ADULTA DE LA ENFERMEDAD DE POMPE SÍNTOMAS DE PRESENTACIÓN MÁS COMUNES PULMONARES Infecciones frecuentes; Insuficiencia/distrés respiratorio; Apnea de sueño; Somnolencia; Dolores de cabeza matutinos MUSCULOESQUELÉTICOS Debilidad de cinturas y extremidades; Dolor de espalda; Intolerancia al ejercicio; Síndrome de columna rígida GASTROINTESTINALES Dificultades para alimentarse y tragar; Aumento de peso HALLAZGOS DIAGNÓSTICOS DE INTERÉS RESPIRATORIOS Insuficiencia respiratoria; Ortopnea; Apnea de sueño; Disnea de esfuerzo; Tos débil MUSCULOESQUELÉTICOS Debilidad muscular progresiva proximal de cinturas (extremidades inferiores> >extremidades superiores); Anomalías en la marcha; Intolerancia al ejercicio; Lordosis/Escoliosis; Hipotonía; Dolor de espalda bajo GASTROINTESTINALES Dificultad para mantener un peso normal; Dificultad para masticar y fatiga del músculo mandíbular; Disminución del reflejo de deglución; Hepatomegalia CARDIOVASCULARES Cardiomegalia infrecuente (formas juveniles) ESTUDIOS CLÍNICOS Y DE LABORATORIO INICIALES ESTUDIOS CLÍNICOS Pruebas de función pulmonar acostado y sentado; Evaluación de la fuerza muscular; Electrofisiología (EMG/NCS) - Miopatía; Biopsia muscular - Histología e histoquímica LABORATORIO (ORINA Y SANGRE) Elevación de CK, AST, ALT, LDH (en sangre) y Glc4 (en orina); Baja actividad GAA en DBS o Linfocitos; Mutación familiar conocida ESTUDIOS DE CONFIRMACIÓN ADN Descripción de la mutación de GAA ENZIMOLOGÍA Determinación de la actividad GAA en linfocitos, fibroblastos y/o músculo. Precaución con la biopsia muscular debido a la necesidad de anestesia. HISTOLOGÍA/ /HISTOQUÍMICA Incremento de glucógeno lisosomal, “células vacuoladas” - Si existe actividad GAA, continuar con resto de pruebas confirmatorias si hay sospecha clínica importante. - Sin actividad GAA, buscar estudios de confirmación de diagnóstico alternativo. 70 INTRODUCCIÓN 4.6.2 Evaluación por el laboratorio  PERFIL BIOQUÍMICO En la mayoría de los casos existe un perfil bioquímico característico de la enfermedad que pude suponer un apoyo importante al diagnóstico, e incluso el primero de los hallazgos. Se revela así, una elevación de creatin-quinasa sérica (CK), siendo éste un marcador sensible aunque muy inespecíficos de la enfermedad. La mayor elevación se encuentra generalmente en los pacientes infantiles (hasta 2000 U/L). Un elevado porcentaje de los pacientes de inicio tardío también manifiestan la elevación de CK186, sin embargo, hasta el 10% de estos enfermos pueden tener una CK normal186. Los niveles de aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y lactato deshidrogenasa (LDH) también suelen ser elevados, y niveles normales no excluyen la enfermedad. Además, estas enzimas tienden a aumentar a medida que la enfermedad progresa187.  DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO El diagnóstico de enfermedad de Pompe en un paciente que presenta síntomas clínicos requiere la demostración de una deficiencia de actividad GAA. En general, los niños con la forma infantil tienen actividades GAA por debajo del 1% de la actividad media de controles sanos156, mientras que los pacientes con la variedad del adulto/juvenil presentan una actividad GAA residual, aunque reducida, y mayor que la observada en niños y, en general, la gravedad de la enfermedad se correlaciona inversamente con ésta actividad enzimática196-198. La GAA hidroliza los enlaces α 1-4 y α 1-6 de los polímeros de glucosa y tiene una actividad óptima entre pH 3.7 y 4.5, dependiendo de la concentración de sustrato199. En un ensayo típico es necesario medir varias fracciones de la actividad GAA. Por un lado, la actividad GAA total (AαG) se mide a un pH ácido (3.8) e incluye toda la actividad glucosidasa (α-glucosidasa ácida y maltasa glucoamilasa). Se determina también la actividad α-glucosidasa neutra total (NαG) a pH neutro (pH 7.0) así como la actividad de la enzima inhibida por acarbosa (AαGIM) a pH ácido. La acarbosa inhibe específicamente a la maltasa glucoamilasa (MGA) 200, 201 y permite que la actividad α-glucosidasa sea reflejo únicamente de la GAA efectiva mediante el cociente NαG/AαGIM. El porcentaje de inhibición de la GAA, calculado como [(AαG - AαGIM)/ AαG], completa la información necesaria para establecer conclusiones diagnósticas basadas en la actividad enzimática. 77 INTRODUCCIÓN Los informes a corto plazo mostraron claramente que la enzima resultaba bien tolerada y que su acción sobre los sistemas motor y cardiaco mejoraba la morfología y función de esos tejidos. El efec- to sobre el corazón resultó ser el más importante, con una reducción del índice de masa ventricular izquierda (IMVI) en todos los recién nacidos. La mejora más impresionante se observó en los dos pacientes más jóvenes (Figura I.22). A largo plazo el informe de seguimiento de estos cuatro niños reveló la supervivencia de todos ellos más allá de la edad de cuatro años. La miocardiopatía hipertrófica disminuyó significativamente durante las 84 semanas de TSE. Se lograron progresos notables en la función motora sobre todo en los dos niños más jóvenes. Sin embargo, el paciente más joven se hizo dependiente del respirador a la edad de 2 años y murió repentinamente a la edad de 4 años y 3 meses después de un período de fiebre intratable, presión arterial inestable y coma. Los dos pacientes de más edad en este estudio (7 y 8 meses de edad al inicio) se hicieron dependientes del respirador poco después del inicio de la terapia y no volvieron a recuperar la función respiratoria perdida232. Tras este estudio se han sucedido muchos otros219, 222, 237, 238, 241-247. Todos ellos han demostrado que los pacientes experimentan una supervivencia más larga, una disminución de la hipertrofia cardíaca y una mejora de las funciones cardiaca y motora. Estos efectos resultan muy notables, teniendo en cuenta que sin tratamiento los pacientes infantiles suelen morir durante su primer año de vida, mientras que la esperanza de vida se prolonga de forma importante en los pacientes tratados. La edad media de supervivencia publicada para grandes cohortes históricas de pacientes no tratados va desde los 6 a los 8 meses53, 54. La hipertrofia cardíaca progresiva y la eventual insuficiencia cardíaca que conduce a la muerte de los pacientes son rasgos característicos. Pasos importantes en el desarrollo normal, tales como la capacidad de darse la vuelta, sentarse, incorporarse o mantenerse en pie, generalmente no se logran. Figura I.22. Análisis de regresión lineal del índice de masa ventricular izquierda230. r=-0,74, r= -0,93, r= 0,93 y r= 0,93 para los pacientes 1, 2, 3 y 4 respectivamente; p < 0,05 para cada uno de los pacientes. 78 INTRODUCCIÓN El denominador común de los pacientes que respondieron mejor al tratamiento fue el comienzo precoz de la TSE (antes de los 5 meses de edad), circunstancia que suele coincidir con situaciones en las que aún no se han producido daños irreversibles216, 253-255. Se concluyó pues, que la condición clínica del paciente al inicio del tratamiento resulta más importante para el resultado final que la propia edad al inicio de la terapia. Los pacientes con parálisis completa no se recuperan. Los estudios sobre patología y morfometría muscular corroboran estas observaciones clínicas. La preservación de las miofibrillas y la arquitectura muscular original es esencial para un buen resultado del tratamiento140, 222, 223, 231. Thurberg y sus colaboradores realizaron una clasificación fisiopatológica de las fibras musculares en la EP, estableciendo 5 etapas o fases de pérdida de la estructura muscular140 (ver sección Citopatología de la enfermedad de Pompe). Thurberg sugiere que sólo las dos primeras etapas, en las que las miofibrillas aún se mantienen intactas son susceptibles de tratamiento140. Sin duda alguna, el tratamiento con rhGAA cambia la historia natural de la enfermedad, pero también debe tenerse en cuenta que muchos pacientes con la forma infantil clásica muestran algún tipo de enfermedad residual a pesar de la terapia enzimática. Debe prestarse una atención especial a la fisioterapia como ayuda al sistema motor, al tratamiento inmediato de las infecciones respiratorias y la hipoventilación, a la audición y el habla, a la osteoporosis y a los riesgos durante la anestesia256-258. A pesar de que no todos los pacientes responden con igual eficiencia, hay que concluir que la terapia enzimática ofrece inestimables perspectivas para los pacientes con enfermedad de Pompe. También debe tenerse en cuenta, que los pacientes con la forma infantil clásica tienen una mayor deficiencia enzimática y por supuesto con efectos más “devastadores”.  TRATAMIENTO EN ADULTOS Existe una considerable experiencia internacional y numerosas publicaciones respecto al tratamiento con rhGAA en todas las etapas de la enfermedad. Esto incluye los resultados de pacientes con las formas del adulto tratados en grandes cohortes para acreditar la verdadera eficacia del fármaco. Además, existe un número creciente de informes de casos individuales o pequeñas series de pacientes a través de la continua aparición de trabajos publicados en la literatura que confirman el efecto positivo de la rhGAA259-266. Los principales criterios de valoración para estudiar los efectos positivos de la TSE en pacientes con la forma del adulto incluyen, en primer lugar, la mejora de las fun- 79 INTRODUCCIÓN ciones motora y pulmonar, y en segundo plano, la reducción de los acúmulos de glucógeno, así como la bioquímica sanguínea favorable (Tabla 12) 164. CRITERIOS DE VALORACIÓN DE LA EFICACIA DE LA RHGAA Criterios de valoración principales Función motora  Pruebas de marcha y deambulación  Pruebas de fuerza muscular Función cardiaca  Pruebas de resistencia cardiovascular Función pulmonar  Porcentaje del valor estimado de la capacidad vital forzada (CVF) Criterios de valoración segundarios Pruebas funcionales  Fuerza del músculo esquelético evaluada mediante puntuación del examen muscular cuantitativo (quantitative muscle testing, QMT) de brazos y piernas  Fuerza de los músculos respiratorios evaluada mediante el porcentaje del valor estimado de la presión inspiratoria máxima y de la presión espiratoria máxima. Pruebas bioquímicas  Reducción de los acúmulos de glucógeno  Disminución de la creatin-quinasa, transaminasas hepáticas y lactato deshidrogenasa En torno a los 18 meses de tratamiento ya comienzan a superarse los primeros criterios de valoración, observándose cómo los pacientes consiguen aumentar su función motora al demostrar mejoras significativas en las pruebas de marcha y deambulación. Tras 78 semanas de tratamiento se consigue un incremento en el porcentaje del valor estimado de la CVF, mientras que los estudios informan que este valor, no sólo no se mantiene, sino que incluso disminuye en los pacientes no tratados. El resto de criterios secundarios también se van consiguiendo progresivamente a lo largo del tiempo en el que se sigue administrando la enzima recombinante245, 267. Se han reportado efectos beneficiosos de la rhGAA en todas las etapas de la enfermedad incluyendo la reducción de la dependencia del ventilador, las mejoras en la movilidad y la calidad de vida, y en muchos casos, la prevención o retraso de la progresión de la enfermedad259-267. Como la enfermedad de Pompe es progresiva, tanto la mejoría clínica como la estabilización pueden ser consideradas como efectos terapéuticos. Además, la disponibilidad de una terapia eficaz aumenta la necesidad de un mejor diagnóstico y reconocimiento de la enfermedad, para que el tratamiento pueda comenzar antes de que existan daños musculares irreversibles253-255. El tratamiento óptimo de la enfermedad de Pompe no puede centrarse exclusivamente en la TSE, sino que requiere de una combinación de terapias específicas y de apoyo para las diferentes complicaciones que se derivan de la deficiencia enzimática y que siem- 80 INTRODUCCIÓN pre están presentes. Dado que los pacientes con EP pueden tener una gama tan amplia de manifestaciones clínicas y alteraciones funcionales, el tratamiento y seguimiento de éstos requiere su atención por un equipo multidisciplinario.  LIMITACIONES DE LA TSE A pesar de los excelentes resultados alcanzados en los estudios clínicos y preclínicos de la TSE en relación a la mejoría de la patología cardiaca y la reducción significativa de la mortalidad en recién nacidos, los efectos en el músculo esquelético son menos importantes de lo previsto139, 225. Cierto que existe una mejoría global de las funciones motoras, pero se ha observado una resistencia al tratamiento por parte de algunas fibras musculares, las fibras musculares de tipo II B225 (ver secciones Tipos de Fibras musculares y Citopatología en la enfermedad de Pompe). Además, la necesidad de infusiones intravenosas de por vida, el alto costo de la enzima recombinante, y las dosis extremadamente altas de la droga (hasta ~ 80 veces superiores a los de otros EDL) constituyen una serie de limitaciones que hacen que la rhGAA ya no sea la panacea que en un principio parecía ser. Una última limitación y la más importante, derivada de la propia utilización de la rhGAA, es la aparición de anticuerpos frente a la enzima recombinante268-271. La respuesta inmune a la TSE se observa en la mayoría de los pacientes con EP en tratamiento. Los pacientes que nunca han estado en contacto con la proteína GAA por fallos de la síntesis de forma constitutiva (lo que se conoce como cross-reactive immunological material negative o CRIM-negativos) desarrollan un título de anticuerpos antirhGAA especialmente alto. Ha podido establecerse una ligera correlación entre la evolución de estos anticuerpos y la disminución en la respuesta a la TSE268-270, de hecho se ha observado una mejor respuesta al tratamiento en los pacientes CRIM positivos272 (cross-reactive immunological material positive o con expresión de la proteína GAA, sea cual sea el nivel de actividad residual que ésta presente). Además de la aparente inactivación de la enzima, estos anticuerpos pueden actuar a diferentes niveles, desde interfiriendo en la correcta incorporación de la enzima a las células, hasta desencadenar otra serie de efectos adversos acompañando a las infusiones del tratamiento. 81 INTRODUCCIÓN 4.7.2 Nutrición y Terapia de ejercicio (NTE) La NTE consiste en una combinación de dieta baja en carbohidratos y con un alto contenido en proteínas así como un plan de ejercicio aeróbico submáximo diario. Esta terapia está dirigida a reducir al mínimo la acumulación de glucógeno, aumentando la síntesis de proteínas musculares y aumentar la proporción de fibras tipo I frente a las tipo II. Así, los pacientes que cumplen plenamente con NTE muestran mejor pronóstico y una tasa de deterioro muscular significativamente mucho más lenta273-275. Por un lado, el plan de ejercicio está orientado a alcanzar el 60%-65% del consumo máximo de oxígeno, o una frecuencia cardíaca máxima para la edad correspondiente. Se establece un programa de una hora de duración de ejercicio aeróbico dónde se instruye a los pacientes para realizar un primer periodo de carrera en cinta durante 45-50 minutos, seguido de ejercicios aeróbicos de parte la superior del cuerpo durante 10-15 minutos. Los pacientes no ambulatorios, o con dificultades para hacer ejercicio en la cinta, se ejercitan en bicicleta estática durante un período similar de tiempo o se les pide que caminen con un andador si es posible276, 277. Por otro lado, la dieta ha de ser baja en carbohidratos y de alto valor proteico, debiendo estar estrictamente controlada. Consta de una distribución calórica de: 25% -30% de proteínas, 30% -35% de hidratos de carbono, y el 35%-40% de grasas. Además, los pacientes deben ingerir por vía oral comprimidos de 1,5 g de L-alanina, 4 veces/día278-282. La combinación de una dieta rica en proteínas y pobre en carbohidratos, junto al programa de ejercicio aeróbico, fue ideada para contrarrestar el efecto patógeno de aumento de la deposición de glucógeno muscular y disminuir la síntesis de proteínas musculares283. La baja ingesta de hidratos de carbono está orientada a minimizar la acumulación de glucógeno tanto intra como extralisosomal, mientras que el complemento de proteínas y alanina trata de aumentar la síntesis de proteínas musculares reduciendo al mínimo la degradación neta del músculo, los dos procesos patogénicos que concurren en la EP284, 285. Además, el ejercicio aeróbico submáximo diario está orientado a disminuir la demanda de glucogenolisis muscular y aumentar la utilización de ácidos grasos por el músculo286. Una disminución en la demanda de glucogenolisis muscular también hace disminuir la demanda de aminoácidos como fuente alternativa de combustible y así se disminuye aún más la proteolisis muscular. Como último aporte de este tipo de terapia, cabe destacar un beneficio más. Desde hace tiempo se reconoce que el músculo esquelético de los mamíferos tiene el potencial de alterar su fenotipo, y que el ejercicio aeróbico submáximo regular es el medio más 82 INTRODUCCIÓN eficaz para desarrollar las fibras musculares tipo I y disminuir las fibras tipo II286. Al mismo tiempo, el mayor estado de nutrición y la suplementación frecuente con alanina proporcionada por NTE reducirá al mínimo los períodos de privación nutricional muscular282. Ambos acontecimientos tendrán como resultado la reducción al mínimo el desarrollo de los procesos autofágicos patológicos y por lo tanto se minimizará la destrucción del músculo287, 288. Así pues, la nutrición y el ejercicio (NTE) puede ralentizar de forma manifiesta el inexorable deterioro de la función muscular y mejorar significativamente la historia natural de esta enfermedad, pudiendo resultar un apoyo realmente importante para la TSE. 83 INTRODUCCIÓN 4.7.3 Tratamiento por Terapia génica A pesar de las decepciones sufridas en los primeros estudios clínicos, hay un interés continuo en el desarrollo de la terapia génica para la EP ya que, de tener éxito, supondría la primera estrategia verdaderamente curativa de cuantas existen hasta el momen- to. Las principales ventajas que presenta la EP para abordar este tipo de estrategia son:  La EP resulta de alteraciones monogénicas y normalmente están bien caracterizadas74, 78, 290.  El sistema de recaptación enzimática a través del receptor M-6-P catión independiente, permite que la transducción génica pueda realizarse a nivel de un órgano de depósito (p.e. el hígado) lo que podría permitir una secreción de enzima a la circulación a niveles terapéuticos248, 249, 291.  La cantidad de enzima necesaria para un nivel suficiente de corrección de la enfermedad no requiere la recuperación completa de la actividad enzimática; en este sentido, la potencia de los vectores de transferencia de genes necesarios para facilitar la producción de niveles terapéuticos de la enzima no tiene porqué ser muy alta292, 293.  Aunque no está claro si la sobreexpresión sostenida de esta hidrolasa tendrá consecuencias adversas, es poco probable que se requiera una regulación estricta de los niveles de producción de la enzima, en parte debido a que el pH óptimo para su actividad la hacen inactiva en la circulación sistémica dónde el pH es más básico que el lisosomal99, 100.  Por otra parte, existe un gran número de modelos animales de esta enfermedad, lo que facilita la realización de todos estos estudios37, 237-240. Uno de los enfoques consiste, como se ha indicado, en conseguir una expresión de alto nivel de la enzima en un órgano de depósito, como puede ser el hígado294. Esto puede conseguirse tras la administración intravenosa de vectores de generación de adenovirus (Ad), de forma que aparecen niveles terapéuticos de enzima circulante y se consigue la reducción de los depósitos de glucógeno. Éste enfoque ya ha tenido éxito en los modelos murinos de EP295, 296. El problema es que la expresión de la enzima es transitoria debido a la intensa respuesta inmune que el organismo desencadena contra el vector adenovirus297. 84 INTRODUCCIÓN Figura I.23. Tráfico de enzimas lisosomales y corrección cruzada. La GAA es glicosilada (círculos verdes) en el retículo endoplasmático (RE) de las células genéticamente modificadas. Luego se le adhiere la M-6-P (círculos rojos) en el aparato de Golgi. La mayoría (flechas gruesas) seguirán la vía de maduración normal de los lisosomas (Lys). Una minoría (flechas finas) son secretadas. La enzima extracelular puede unirse a los receptores de manosa (ManR) o al receptor de M-6-P (M6PR) de la membrana plasmática. Ambos receptores median endocitosis interiorizan las enzimas exógenas. Una posible solución al problema consiste en combinar al Ad con la expresión de CTLA-4298. Ésta es una proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas; su nombre deriva de sus iniciales Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 (Antígeno 4 del linfocito T citotóxico) y se expresa en los linfocitos T Helper transmitiendo una señal inhibitoria a las células T. Sin embargo, los resultados en este sentido muestran una reducción de la respuesta inmune sólo durante cortos periodos de tiempo298, 299. Los últimos avances realizados apuntan a la utilización de los vectores de 3ª generación, también llamados Ad gutless o Ad helper dependientes300. Para producir estos vectores se necesitan tres elementos fundamentales: un Ad gutless con el gen terapéutico; un Ad helper que aporte las proteínas virales necesarias in trans y; una línea celular permisiva para la producción de adenovirus (es decir, un tipo de células aptas para que los Ad se reproduzcan en ellas). Los Ad gutless, también son denominados “dependientes de 85 INTRODUCCIÓN ayudante” (ó Ad helper-dependent), ya que sin la presencia de los Ad helper carecen de la maquinaria viral necesaria para reproducirse. Es decir, para producir las cantidades necesarias de Ad gutless útiles en la terapia, se necesita la presencia de los Ad helper, que son quienes suministran toda la “infraestructura de producción” del virus. Los Ad gutless, al no contener ninguna región viral codificante, no generan respuesta inmune celular y tienen una capacidad de hasta 36 Kpb. Se ha demostrado que la expresión de los genes que incorporan puede durar toda la vida del organismo301, 302. Otro enfoque en el uso de vectores ha llevado a la utilización de retrovirus (Retroviridae) como agentes de transfección para el gen GAA deficiente303. Éstos son virus de ARN que retrotranscriben su genoma a una cadena simple de ADN para luego formar la doble cadena, pudiendo ésta a continuación, integrarse en los cromosomas. Los virus se unen a los receptores de la célula huésped a través de proteínas de la envoltura glicoproteica que se incorporan en la superficie del virión. Para usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica inicialmente se eliminan los genes responsables de su replicación y se reemplazan estas regiones por el gen GAA seguido de un gen marcador. Del genoma vírico quedaban las secuencias LTR; y los elementos necesarios para producir los vectores a gran escala y para transformar las células son aportados desde otros vectores304. Los retrovirus como vectores en terapia génica presentan un inconveniente considerable, y es que la enzima integrasa puede insertar el material genético en cualquier zona del genoma del huésped, pudiendo causar efectos deletéreos como la modificación en el patrón de la expresión (efecto posicional) o la mutagénesis de un gen silvestre por inserción305. Los lentivirus son una familia de retrovirus compleja que inducen una enfermedad crónica y progresiva, por lo general asociada con la infección de macrófagos. Se han desarrollado vectores de transferencia génica para la EP que se derivan de los lentivirus para complementar los aspectos positivos de los vectores retrovirales (integración eficiente, ausencia de genes virales con información genética transferida al receptor, y falta de inmunidad pre-existente en el receptor) con la capacidad de infectar a células bien diferenciadas y que no se dividen, lo que aporta seguridad a este tipo de tratamiento306, 307. Otra ventaja que presentan los lentivirus es que su tasa de expresión se mantiene durante largos periodos de tiempo (de ahí que originen enfermedades crónicas) 308; la razón no se conoce, aunque puede residir en las características intrínsecas de las regiones LTR virales y/o en la disposición en diferentes sitios de la cromatina durante la integración. Por estos motivos, muchos laboratorios han optado por la utilización de vectores derivados de lentivirus para utilizarlos en el tratamiento de la EP. 86 INTRODUCCIÓN 4.7.4 Terapia de mejora enzimática: Chaperonas La terapia de mejora de la enzima (Enzyme enhancement therapy - EET) es un enfoque reciente que está despertando gran interés. La EET se basa en el concepto de que la pérdida de función de la enzima se debe a menudo a mutaciones sin sentido que causan un mal plegamiento y una rápida degradación de la enzima309, 310. Así, puede obtenerse un rescate parcial de la actividad enzimática utilizando inhibidores competitivos dirigidos al sitio activo, de modo que su unión al centro catalítico mejore la estabilidad y el plegamiento de la proteína mutada con conformaciones alteradas actuando del mismo modo que las chaperonas celulares311. La principal desventaja de este tipo de enfoque es que su eficacia depende de una actividad enzimática residual y puede no resultar útil en ciertas mutaciones en el gen GAA311. Varios inhibidores y derivados de desoxinojirimicina (DNJ) han sido probados en diferentes enfermedades de depósito lisosomal. Se han determinado una serie de mutaciones sin sentido (Y455F, P545L, G549R, L552P…) presentes en los pacientes Pompe que dan como resultado una GAA de estructura anómala susceptibles de ser tratadas con este tipo de terapia y frente a las que ya existen resultados muy prometedores310, 312, 313. Los estudios recientes, las bases de datos de pacientes, y el conocimiento actual que en general se tiene de la EP, dan una cifra aproximada de la fracción de pacientes susceptibles de ser tratados por éste sistema en torno al 10-15% debido a presentar mutaciones de este tipo76, 78-82, 313. Esto limita el uso de la terapia farmacológica a una población restringida de pacientes. Sin embargo, ha quedado demostrado que las chaperonas farmacológicas representan una herramienta eficaz además en la mejora de la eficacia de la TSE, con consecuencias beneficiosas para muchos pacientes con EP314, 315. Es sabido que no sólo la GAA de los pacientes puede presentar deficiencias, sino también la actividad rhGAA, una vez incorporada la enzima a la célula, puede ser subóptima. Se ha demostrado in vitro, en fibroblastos de enfermos316, e in vivo, en células musculares de un modelo de ratón EP317, que una fracción de rhGAA no presenta actividad intracelular, siendo por lo tanto ineficaz. Es posible que la incorporación de la enzima recombinante en los compartimentos celulares la exponga a procesos de degradación y la interacción con chaperonas farmacológicas mejora, al menos en parte y en este sentido, la estabilidad de la enzima. Por lo tanto, la EET no solo tendría como objetivo tratar deficiencias estructurales de la GAA sino que también sería importante como terapia coadyuvante de la TSE315. Otra ventaja importante, radica en el mejor perfil de biodistribución que presentan las chaperonas, y lo que es más, que parece aportar al TSE clásico315. En los modelos 93 OBJETIVOS II. OBJETIVOS El diagnóstico de la enfermedad de Pompe plantea a menudo una dificultad importante debido a la rareza de la condición y a la naturaleza relativamente poco específica de las características fenotípicas propias de la enfermedad. Por ello, el laboratorio clínico desempeña un papel esencial en el diagnóstico de esta patología. La hipótesis de partida para esta Tesis se basa en la capacidad que presenta el Laboratorio Clínico para poder llegar a un diagnóstico definitivo de esta patología, aportando pruebas y evidencias que confirman la reducción de la actividad α-glucosidasa ácida, fundamento de la enfermedad. Para ello, en el desarrollo de esta Tesis intentaremos alcanzar los siguientes objetivos: - Contribuir a la actualización de información sobre la enfermedad de Pompe, a través de una extensa revisión bibliográfica que presente los principales puntos de conocimiento sobre el contexto, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. - Implantación de la determinación de α-glucosidasa ácida en DBS como método de screening diagnóstico para la enfermedad de Pompe, y estudio de la veracidad de esta determinación mediante la participación en programas de evaluación externa de la calidad. - Consenso de la determinación de α-glucosidasa ácida intralinfocitaria como método goldstandard para el diagnóstico de la enfermedad de Pompe (pros/contras vs uso de biopsia muscular y/o fibroblastos). - Valoración de la glucosa tetrasacárido como biomarcador diagnóstico de la enfermedad de Pompe. - Contribución del estudio molecular de la mutación IVS1-13T>G al diagnóstico definitivo de la enfermedad de Pompe. - Proposición de un algoritmo diagnóstico de la enfermedad de Pompe para el Laboratorio Clínico. MATERIALES Y MÉTODOS 97 MATERIALES Y MÉTODOS III. MATERIALES Y MÉTODOS La parte experimental de esta Tesis se apoya en protocolos ya utilizados y contrastados por otros grupos de investigación. En muchos de los experimentos hemos realizado modificaciones, adaptaciones y/o mejoras, para optimizar los resultados obtenidos según nuestro sistema de trabajo. La cartera de pruebas analíticas realizadas para llegar al diagnóstico de la enfermedad de Pompe incluye:  Determinación de actividad GAA en sangre seca recogida sobre papel (DBS).  Determinación de actividad GAA intralinfocitaria.  Determinación de los niveles de Glucosatetrasacárido en orina de 24 horas.  Estudio molecular de la mutación IVS1-13T>G. 1. Pacientes Las muestras incluidas en cada uno de los experimentos realizados durante el desarrollo de la Tesis y cuyos resultados nos permitieron obtener conclusiones, proceden de una serie de pacientes distribuidos prácticamente por toda la geografía española y enviados a nuestro laboratorio. Éste se encuentra ubicado en el Servicio de Bioquímica Clínica del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla, constituye un centro de referencia para la enfermedad de Pompe y en él se reciben muestras de pacientes de todo el país con alta sospecha de padecer esta dolencia. Los principales síntomas de los pacientes sometidos a nuestras pruebas diagnósticas fueron: la existencia de miopatía, mialgias, debilidad muscular, intolerancia al ejercicio, distrofia de cinturas, miocardiopatía (en casos infantiles), insuficiencia respiratoria y la hiperCKemia. También se realizaron los estudios correspondientes a familiares de pacientes ya diagnosticados, normalmente al manifestar algún signo de la enfermedad. 98 MATERIALES Y MÉTODOS 2. Determinación de actividad α-Glucosidasa ácida en sangre seca recogida sobre papel La determinación se llevó a cabo según la técnica descrita por Chamoles et al (2004)214 basada en la acción de la enzima α-Glucosidasa ácida lisosomal presente en la muestra del paciente, sobre el sustrato 4-metilumbeliferil-α-D-glucopiranósido, liberando 4-metilumbeliferona que a pH alcalino produce fluorescencia proporcional a la actividad de la enzima. SUSTRATO-4MU + MUESTRA   ENZIMÁTICAACTIVIDAD PRODUCTO + 4MU La muestra de partida fue sangre seca recogida sobre papel (DBS, del inglés Dried Blood Specimen). 2.1. Toma de muestras Como en todas las determinaciones analíticas, la correcta obtención de la muestra fue vital para poder realizar un buen estudio y obtener resultados fiables. Las tarjetas de papel utilizadas por nuestro laboratorio son cartulinas de papel cromatográfico S&S903 en las que quedan indicadas por círculos las zonas donde debe aplicarse la sangre. Además, contienen información a completar por el clínico sobre los datos demográficos del paciente y la determinación que se desea realizar. Para una adecuada obtención de la muestra de DBS, ya sea para la determinación de actividad GAA como para cualquier otra enzima, deben seguirse los siguientes pasos:  Sumergir la mano de la punción en agua a 37-40ºC.  Desinfectar la zona de la punción con alcohol (No usar desinfectantes que contengan yodo).  Realizar la punción con una lanceta estéril.  Despreciar la primera gota de sangre que suele estar contaminada con el desinfectante u otras impurezas.  Esperar hasta que se haya formado una gota lo suficientemente grande. 99 MATERIALES Y MÉTODOS  Tocar la tarjeta de papel con la gota de sangre de forma constante sin presionar sobre el papel.  No presione el dedo con excesiva fuerza para evitar la expulsión de líquido intersticial.  Espere hasta que la sangre haya calado hasta el reverso del papel teniendo cuidado de no sobrepasar los límites del círculo indicado. ESTE PUNTO TIENE ESPECIAL IMPORTANCIA.  No vuelva a aplicar sangre sobre el mismo círculo.  Deje secar la sangre sobre una superficie limpia, lisa y no absorbente.  Rellene la tarjeta correctamente con los datos correspondientes. Introduzca la tarjeta en una bolsa de plástico, ciérrela adecuadamente y envíela al Laboratorio. Initials and Family Name Date of Birth Sex Date of collection M F Patient Identification Number Requesting Physician Hospital Name  Adress Country  Telephone  E-mail Test Requested: Fabry Pompe Gaucher MPSI Disease Disease Disease Figura III.1. Modelo de tarjeta de recogida de muestras DBS 100 MATERIALES Y MÉTODOS 2.2. Reactivos Todos los reactivos utilizados fueron de calidad analítica, proporcionados por Sigma, Merck, Mallinckrodt o similares, salvo que se indique lo contrario. En la especificación de cada uno de los materiales y métodos, queda indicada la procedencia de cada reactivo. 2.2.1. Tampón acetato de sodio 0.4M, ácido y neutro Merck 1.06267.1000. PM: 136.08 Se prepararon sendos tampones acetato 1M ácido y neutro respectivamente, para luego preparar a partir del ellos las soluciones tampón 0.4M a los mismos pH’s. La conservación se realizó en alícuotas a -20ºC. 2.2.2. Sustrato: 4-metil-umbeliferil-α-D-glucopiranósido 2.8mM SIGMA, M-9766. PM:338.3 El sustrato era un preparado que fue necesario diluir en los tampones de acetato de sodio que preparamos anteriormente. Así, para elaborar la solución ácida del sustrato, se disolvió la 4-MU-α-D-glucopiranósido en el tampón acetato ácido, y para la solución neutra de sustrato se disolvió en el tampón acetato neutro. La conservación se realizó en alícuotas a -20ºC. 2.2.3. Inhibidor: Acarbosa 40µM SIGMA A-8980. PM: 645.61 La solución de acarbosa destinada a inhibir específicamente la actividad enzimática maltasa glucoamilasa (MGA) 200, 201, permitió que la actividad α-glucosidasa fuera reflejo únicamente de la GAA efectiva. Su preparación consistió únicamente en disolver la solución madre de acarbosa, hasta una concentración de 40µM con agua destilada. La conservación se realizó en alícuotas a -20ºC. 101 MATERIALES Y MÉTODOS 2.2.4. Solución Testigo: 4-Metilumbeliferona SIGMA, ref. M-1381. P.M. 176.17 Se construyó una curva de calibración que nos permita establecer la relación entre la intensidad de la fluorescencia y la actividad enzimática presente en las muestras. Para ello se partió de distintas concentraciones de una solución testigo de 4-Metilumbeliferona (4-MU), que en las reacciones era el producto fluorescente que debía formarse. La curva testigo se requiere para calcular los resultados del ensayo por extrapolación, siendo necesario asegurarse que la fluorescencia medida en el ensayo se encuentra dentro del rango lineal de medición. La preparación de la solución testigo a distintas concentraciones requirió la disolución de la solución madre de 4-MU en un tampón TCG (Carbonato-Glicina) a pH básico. Además, con objeto de conservar la fluorescencia del compuesto, debe evitarse disolver en agua caliente y se procuró proteger de la luz todo lo posible. Como siempre, la conservación fue en alícuotas a -20ºC. Partiendo de una solución de 1140 nmol/µL de 4-MU se realizaron diluciones seriadas al 1/2 con TCG, llegando hasta una concentración de 8.9 nmol/µL. Ver Tabla III.1 Concentracion (nmol/µL) Fluorescencia Solución 1 1140.0 239692 Solución 2 570.0 121551 Solución 3 285.0 58924 Solución 4 142.5 31141 Solución 5 71.3 15160 Solución 6 35.6 7596 Solución 7 17.8 3876 Solución 8 8.9 2085 Tabla III.1. Curva de calibración de 4-MU con las concentraciones expresadas en nmol/µL y la fluorescencia emitida. 102 MATERIALES Y MÉTODOS 2.2.5. Solución Stop: Etilendiamina 0.13M, pH básico SIGMA, 195804. P.M. 133.02 Con objeto de parar la reacción enzimática una vez transcurrido el tiempo de reacción estipulado, se añadió una solución de stop de etilendiamina diclorhidrato 0.13M a pH básico que, debido a sus propiedades bioquímicas y a su alto pH, conseguía detener la actividad enzimática, y por tanto, el proceso de formación del producto fluorescente. Tras su preparación, y antes de su uso, se conservó a 4ºC en frasco de color topacio. 2.3. Reacción Disponíamos de placas de 96 pocillos de 400µL de capacidad (Microplaca GREINER BIO-ONE FIA-PLATE, BLACK, Ref. 655076), en los que tenían lugar la reacción de determinación. En cada uno de ellos colocamos, gracias a un puncher manual, un disco DBS de 1,5 mm. Posteriormente añadimos en cada pocillo lo que se indica en la figura III.3: Columnas 1-11 Muestra Columna. 12 Curva 4MU Acarbosa Buffer Ácido Buffer Neutro Sustrato ácido Sustrato neutro I N C U B A C I Ó N 24 hrs 37ºC Sol Stop Sustr. Ácido Sustr. neutro L E C T U R A Actividad Total (AαG) A B Actividad Inhibida (AαGIM) C D Act. Neutra Total (NαG) E F Blanco Ácido G Blanco Neutro H . Figura III.3. Esquema de la preparación de la reacción enzimática en microplaca para determinación en DBS. Figura III.2. Microplaca. 109 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.3. Inhibidor: Acarbosa 40µM SIGMA A-8980. PM: 645.61 La solución de acarbosa tiene como fin inhibir específicamente la actividad enzimática maltasa glucoamilasa (MGA) 200, 201 que pudiese existir en la muestra debido a la existencia de algún polimorfonuclear que hubiese escapado durante el proceso de aislamiento de linfocitos, permitiendo que la actividad α-glucosidasa fuera reflejo únicamente de la GAA efectiva. Su preparación consistió únicamente en disolver la solución madre de acarbosa, hasta una concentración de 40µM. La conservación se realizó en alícuotas a -20ºC. 3.2.4. Solución Testigo: 4-Metilumbeliferona SIGMA, M-1381. P.M. 176.17 Se construyó una curva de calibración que nos permita establecer la relación entre la intensidad de la fluorescencia y la actividad enzimática presente en las muestras. Para ello se partió de distintas concentraciones de una solución testigo de 4-Metilumbeliferona (4-MU), que en las reacciones era el producto fluorescente que debía formarse. La curva patrón de 4-MU construida es de preparación y resultados similares a la presentada en el apartado 2.6. Solución Testigo: 4-Metilumbeliferona para DBS. 3.2.5. Solución Stop: Tampón Carbonato-Glicina 0.17M, pH básico SIGMA, 195804. P.M. 133.02 Con objeto de parar la reacción enzimática transcurrido el tiempo de reacción estipulado, se añadió una solución de stop consistente en un tampón Carbonato-Glicina 0.17M a pH básico que, debido a sus propiedades bioquímicas y a su alto pH, conseguía detener la actividad enzimática, y por tanto, el proceso de formación del producto fluorescente. Tras su preparación, y antes de su uso, se conservó a 4ºC en frasco de color topacio. 110 MATERIALES Y MÉTODOS 3.3. Reacción Se realiza en las mismas placas que para el caso de las muestras DBS. Disponíamos de placas de 96 pocillos de 400 µL de capacidad (Microplaca GREINER BIOONE FIA-PLATE, BLACK, Ref. 655076), en los que tenían lugar la reacción de determinación. En cada uno de éstos colocamos, 10 µL de la solución sonicada y centrifugada. Posteriormente se procede según se indica en la Figura III. 7: Columnas 1-11 Muestra Columna. 12 Curva 4MU Acarbosa Buffer Ácido Buffer Neutro Sustrato ácido Sustrato neutro I N C U B A C I Ó N 1 hr 37ºC Sol Stop Sustr. Ácido Sustr. neutro L E C T U R A Actividad Total (AαG) A B Actividad Inhibida (AαGIM) C D Act. Neutra Total (NαG) E F Blanco Ácido G Blanco Neutro H . Figura III.7. Esquema de la preparación de la reacción enzimática en microplaca para la determinación de actividad intralinfocitaria. La reacción finalizó tras la adición a cada uno de los pocillo de la solución de stop de tampón Carbonato-Glicina. Se agregó a continuación a la fila G, solución de sustrato en tampón ácido y a la fila H solución de sustrato en tampón neutro. Las distintas fracciones de actividad enzimática se calcularon a partir de las filas correspondientes tal y como queda indicado en la Figura III.7. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado en pocillos contiguos, excepto la curva de solución testigo de 4-MU que se realizó por determinación simple. 111 MATERIALES Y MÉTODOS 3.4. Proceso de lectura en microplacas La lectura de la microplaca se realizó en un espectrofluorímetro de microplaca de longitud de onda variable Beckman Coulter, modelo DTX880. La longitud de onda de excitación fue de 355 nm y de emisión de 460 nm. El tiempo de lectura fue de 800 milisegundos. 3.5. Determinación de proteínas intralinfocitarias Para calcular la concentración de proteínas existente en las muestras y así expresar la actividad enzimática en función de ésta, utilizamos un método espectrofotométrico derivado del empleado por Lowry et al322. Partimos de linfocitos aislados de sangre total, sonicados y conservados a -80ºC. Una vez descongelados, centrifugamos a 3500 rpm durante 5 minutos en centrifuga refrigerada a 4ºC y usamos el sobrenadante. Se requieren como reactivos de base: Reactivo A: CO3Na2 al 2% en NaOH 0.1 M; Reactivo B: SO4Cu.5H2O al 1%; y Reactivo C: Tartrato sódico potásico al 2%. Mezclando estos 3 reactivos en el momento de realizar la determinación obtenemos el primer reactivo (Reactivo-1) de la reacción de Lowry. Como segundo reactivo de la reacción usamos el denominado Reactivo de Folin en su formato comercial (Sigma ref. F9252). Concentracion (mg/dL) D.O. Etandar 1 10 0.008 Standar 2 25 0.030 Standar 3 50 0.065 Standar 4 100 0.135 Standar 5 200 0.255 Tabla III.2. Curva de calibración para la determinación de concentración de proteínas de muestras de linfocitos aislados. 112 MATERIALES Y MÉTODOS Fue preciso preparar una curva a partir de una solución stock de albúmina de concentración 1000 mg/dL (Albumin human Sigma-Aldrich ref. A9731) para extrapolar los valores obtenidos en nuestras muestras. Los puntos de la curva se expresan en la Tabla III.2. El procedimiento, tanto para las muestras como para la construcción de la curva consistió en colocar en tubos de al menos 4 mL de capacidad: Muestra/Calibrador/Control: 50 μl Agua destilada: 450 μl Reactivo-1: 2500 μl Mezclar bien durante 10 minutos en oscuridad Reactivo-2: 250 μl El resultado es una solución con distinta intensidad de azul según la concentración de proteínas existente en la muestra. Se procede a continuación a la lectura en el espectrofotómetro (ThermoSpectronic Genesys 10uv) a 580 nm y extrapolamos los resultados de las muestras en la curva de calibración de proteínas. Para asegurar que el proceso se llevó a cabo de forma correcta, procesábamos simultáneamente dos Controles de Bio-Rad, UCC-1 y UCC-2(LiquichekTM 397 y 398, respectivamente). 3.6. Cálculos En este caso al no existir actividad MGA en los linfocitos, la actividad enzimática estará en función de la actividad GAA ácida total presente en los linfocitos. Ésta se calcula por extrapolación de la fluorescencia obtenida a partir de la curva de 4MU. Como hemos indicado, la actividad enzimática intralinfocitaria depende de la concentración de linfocitos en la muestra y la expresión de la enzima en estas células, por lo que el resultado final ha de quedar expresado en función de la concentración de proteínas de la muestra, también por extrapolación en su curva de calibración. De esta forma, el resultado final quedó expresado en nmol/min/mg proteína siendo los valores normales los resultados entre 0.2 y 1.0 nmol/min/mg proteína. 113 MATERIALES Y MÉTODOS 3.7. Informe de los resultados El informe completo de los resultados obtenidos queda representado en la Figura III.8. Servicio de Bioquímica Clínica Unidad de Metabolopatías Paciente: Centro: Consulta: Doctor/a: Población: Diagnóstico de Enfermedad de Pompe en Linfocitos. Los análisis realizados en la muestra de sangre total con nº de referencia _______, recibida en nuestro Laboratorio el día --/--/-- tuvieron los siguientes resultados: Paciente Enzima Actividad α-Glucosidasa ácida total en linfocitos X α-Glucosidasa Y nmol/min/mg proteína Valores de referencia 0.2 – 1.0 nmol/min/mg proteína COMENTARIO DE LOS RESULTADOS: Sevilla, __ de ______________ de 20__. Fdo: Figura III.8. Informe de resultados de la actividad GAA intralinfocitaria 114 MATERIALES Y MÉTODOS 4. Determinación de los niveles de Glucosa tetrasacárido en orina Se han desarrollado diferentes metodologías para la determinación de la Glc4 incluyendo inmunoensayos, cromatografía de afinidad con anticuerpos frente a Glc4, cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta o electroquímica (HPLC/UV-ED) o bien cromatografía gaseosa/líquida con detección mediante espectrometría de masas188, 323, 324, 327-330. Nosotros hemos llevado a cabo una modificación en la metodología de HPLC/UV descrita por An Y et al188 que presenta la ventaja de precisar un menor tiempo de desarrollo cromatográfico para la cuantificación de la Glc4 urinaria. 4.1. Materiales e instrumentación Glucosa tetrasacárido (Glc4), Lactosa, Maltosa, Glucosa, Manosa y Cellopentaosa (estandard interno), componentes del calibrador, procedentes de Sigma-Aldrich. N-butil-4-aminobenzoato, Cianoborohidruro sódico, Ácido acético glacial y Metanol LiChrosolv, como productos usados en el proceso de derivatización, suministrados por Merck KGaA. Tetrabutilamonio cloruro y Acetonitrilo LiChrosolv, constituyentes de los solventes de la fase móvil suministrados igualmente por Merck KGaA. Los cartuchos LiChrolut RP-18 (40-63 µm) 100 mg usados en la preparación de las muestras, procedían de la casa VWR y la columna Synergi 4µm Hydro-RT 80 (Phenomenex®) 250x4.6 mm utilizada como fase estacionaria en el procedimiento analítico, de la casa Jasco. El procedimiento cromatográfico de HPLC/UV se llevó a cabo en un equipo modular Agilent 1100 dotado de inyector automático de las muestras. 115 MATERIALES Y MÉTODOS 4.2. Toma y preparación de muestras Las muestras de orina se recogieron durante un periodo de 24 horas, y se conservaron a -20ºC hasta la determinación analítica. La determinación de los oligosacáridos de glucosa mediante cromatografía líquida requiere un proceso previo de derivatización de las muestras, en nuestro caso realizado según el método de Poulter y Burlingame modificado331. Este proceso, que se realiza mediante el uso de N-butil-4-aminobenzoato (BAB), presenta las ventajas de su especificidad, sensibilidad, reproductibilidad y alta resolución. Además, su simpleza y bajo coste posibilitan su utilización en los laboratorios clínicos. La derivatización de muestras y calibradores se realiza del siguiente modo:  50 µL de orina/calibrador.  10 µL de Solución del Estándar Interno (1.2 mmol).  140 µL de Reactivo de derivatización (preparado diariamente a base de N-bil- 4aminobenzoato, cianoborohidruro sódico, ácido acético y metanol).  Se procede a continuación a incubar en vial tapado en un termobloque a 80ºC durante 45 minutos.  Después de enfriar en baño de agua, las muestras/calibradores se diluyen mediante la adición de 900 µL de una mezcla de acetonitrilo/agua (15/85 v/v). La fase de extracción de muestras/calibradores se lleva a cabo mediante cartuchos LiChrolut® RP-18 (40-63 µm) 100 mg previamente acondicionados por la adición de Metanol seguido de agua destilada. Los oligosacáridos derivatizados, procedentes de las muestras/calibradores añadidos a los cartuchos, son lavados con la mezcla acetonitrilo/agua (15/85 v/v) y eluidos finalmente mediante la adición de una mezcla acetonitrilo/agua (30/70). El eluido está ya preparado para inyectar directamente en el sistema de HPLC. 116 MATERIALES Y MÉTODOS 4.3. Análisis y cuantificación mediante HPLC Los oligosacáridos derivatizados son separados en una columna Synergi 4µm Hydro-RT 80 250x4.6mm con un flujo de 0.9 ml/min. y detección UV a 304 nm durante un tiempo de 40 minutos. La fase móvil estuvo formada por: o Sol. A. Tetrabutilamonio cloruro 10 mM en Acetonitrilo/Agua 20/80 v/v. o Sol. B. Acetonitrilo puro. Se utilizó un procedimiento de separación en gradiente durante 40 minutos. Las áreas de los picos de Glc4 y estándar interno (Cellopentaosa) se calculan automáticamente con corrección de la línea base, usando la ratio de ambas áreas para la cuantificación de la Glc4. Figura III.9. Ejemplo de cromatograma con altas concentraciones de Glc4. 117 MATERIALES Y MÉTODOS 4.4. Informe de los resultados Servicio de Bioquímica Clínica Unidad de Metabolopatías Paciente: Centro: Consulta: Doctor/a: Población: Determinación de Glucosa tetrasacárido para el diagnóstico de la Enfermedad de Pompe. En la muestra de Orina con nº de referencia _______ recibida en nuestro laboratorio el día --/--/---- se obtuvieron los siguientes resultados: Paciente Fecha de nacimiento Glc4 mmol/mol creat. Valores normales X --/--/---- Y 0.30 – 1.0 COMENTARIO DE LOS RESULTADOS: Sevilla, __ de ______________ de 20__. Fdo: Figura III.10. Informe de resultados de la concentración de Glc4 en orina de 24 horas. 118 MATERIALES Y MÉTODOS 5. Estudio molecular para la mutación IVS1-13T>G La mutación IVS1-13T>G es la más común en Europa encontrándose en más de la mitad de los pacientes de raza blanca80. Es una mutación típica de la variedad del adulto, de hecho, el 71% de los pacientes heterocigotos compuestos con ésta variedad de la enfermedad la presentan. Se trata de una transversión de Timina a Guanina en la posición -13 del sitio aceptor del intrón 1 del gen, originando splicings alternativos60, que dan lugar a transcritos aberrantes en los que queda suprimido el primer exón codificante, el exón 2; y transcritos completos (≈10%) 83, 84 con la información adecuada para producir la enzima funcional85. En consecuencia, nos planteamos que sería de gran interés desarrollar un sistema de análisis molecular para detectar la presencia de la mutación a través de una reacción de PCR a tiempo real que nos permitiera identificar de forma rápida y sencilla a los pacientes que portan esta mutación. Asimismo pensamos, que desarrollando un sistema de extracción del ADN a partir de las muestras de DBS contribuiríamos de forma muy importante a la mejora del proceso diagnóstico, proporcionando un sistema eficiente, de calidad, y sobre todo, de mayor comodidad para clínicos y pacientes, que proporcionara un diagnóstico completo (hasta el nivel molecular) de la enfermedad de Pompe. 5.1. Aislamiento del ADN El aislamiento de ADN se realizó tanto a partir de las muestras de sangre total (con EDTA como anticoagulante) como de muestras DBS, recibidas para realizar el análisis de actividad enzimática. De esta forma pusimos a punto la técnica de detección de la mutación para ambos tipos de muestras. En lo referente a la sangre seca, el primer paso fue cortar seis discos DBS de 3 mm de diámetro y colocarlos en tubos de ensayo de 5 mL junto con 400 µL de agua destilada, y dejarlos en agitación en un baño termostatizado a 56ºC durante 2 horas. Tras este paso, centrifugamos y extraemos el sobrenadante del cual haremos la extracción propiamente dicha. A partir de este paso el proceso es común tanto para DBS como para sangre total, de forma que se procede a la extracción utilizando MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I ®, Roche Applied Science, Indianápolis, USA; eluyendo en un volumen final de 200 µL de tampón de elución. RESULTADOS 127 RESULTADOS IV. RESULTADOS Con el fin de alcanzar los objetivos planteados, y utilizando la población, las muestras y la metodología experimental detallada en el capítulo anterior, se realizaron una serie de experimentos para evaluar la importancia que representa el papel del laboratorio clínico en el diagnóstico de la enfermedad de Pompe cuyos resultados se detallan a continuación. 1. Resultados de la revisión bibliográfica que presenta los principales puntos de conocimiento sobre el contexto, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad de Pompe El primer objetivo que nos marcamos en el desarrollo de esta Tesis consistía en contribuir a la actualización de información sobre la enfermedad de Pompe a través de una extensa revisión bibliográfica que presente los principales puntos de conocimiento sobre el contexto, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. Este objetivo responde, entre otras consideraciones, a los planteamientos expuestos por el Plan Andaluz de Atención a Personas Afectadas por Enfermedades Raras en el cual se detallan varias acciones de carácter prioritario para alcanzar los fines propios del Plan, entre las que destaca: Mejorar la gestión de conocimientos sobre las enfermedades raras, la formación de los profesionales y la investigación. Los esfuerzos para alcanzar el objetivo marcado (primer punto de la sección II. OBJETIVOS, citado en el párrafo anterior) en relación a lo expuesto en el Plan Andaluz de Atención a Personas Afectadas por Enfermedades Raras (también expuesto en el párrafo precedente), quedan reflejados en la amplia introducción que precede al resto del trabajo de Tesis que se presenta (sección I. INTRODUCCIÓN). Por ello creemos que resulta interesante hacer esta consideración en el primer punto tratado en la sección de RESULTADOS de la presente Tesis. 128 RESULTADOS 2. Determinación de actividad α-glucosidasa ácida en DBS para el diagnóstico de la enfermedad de Pompe En el diagnóstico bioquímico de la enfermedad de Pompe el primer paso consiste en la determinación de la actividad GAA en sangre seca recogida sobre papel (DBS). Analizaremos en este apartado los resultados obtenidos en nuestro laboratorio para este tipo de muestras a lo largo del año 2011, examinando los valores obtenidos en todos los pacientes estudiados durante este periodo, así como las conclusiones que podemos extraer gracias a nuestra participación en el programa externo de la calidad para este tipo de muestras dirigido por el CDC de Atlanta y en el que participa nuestro laboratorio. 2.1. Resultados de la actividad GAA en DBS de la población estudiada. Desde el 1/1/2011 hasta el 31/12/2011 llegaron a nuestro laboratorio 530 muestras de DBS de pacientes con sospecha de padecer enfermedad de Pompe, a los que se le realizaron las determinaciones de actividad enzimática GAA en DBS en sus distintas formas (AαG - Actividad ácida total, NαG - Actividad neutra total, AαGIM - Actividad ácida inhibida o Actividad efectiva) y con sus diferentes cocientes (Cociente NαG/AαGIM y Porcentaje de inhibición de AαG). A raíz del análisis de éstos resultados, podemos extraer conclusiones interesantes que arrojen luz sobre la idoneidad de la metodología empleada en nuestro laboratorio. La descripción estadística de los resultados de individuos sin la patología (488 pacientes) se muestran en las Tablas IV.1-IV.5, acompañadas de los histogramas que demuestran, junto con la realización del test estadístico de normalidad de Kolmogorov- Smirnov, que la colección de valores obtenidos sigue en todos ellos una distribución normal con la típica campana de Gauss. 129 RESULTADOS Actividad AαG (Ácida total) MEDIA 4,35 D.S. 2,16 P5 2,10 P95 8,05 MIN 1,50 MAX 19,40 Tabla IV.1. Descripción estadística de los resultados obtenidos para la actividad ácida total (AαG) en la población de muestras DBS que se encontraban en los rangos de normalidad. Las actividades enzimáticas están expresadas en µmol/L/h. El histograma refleja el resultado del test estadístico de normalidad de Kolmogorov-Smirnov que confirma que los resultados siguen una distribución normal (p<0,05). Actividad NαG (Neutra total) MEDIA 12,79 D.S. 5,54 P5 6,35 95 22,10 MIN 3,40 MAX 52,20 Tabla IV.2. Descripción estadística de los resultados obtenidos para la actividad neutra total (NαG) en la población de muestras DBS que se encontraban en los rangos de normalidad. Las actividades enzimáticas están expresadas en µmol/L/h. El histograma refleja el resultado del test estadístico de normalidad de Kolmogorov-Smirnov que confirma que los resultados siguen una distribución normal (p<0,05). AαGIM (Ácida inhib. ó Ácida efectiva) MEDIA 1,35 D.S. 0,69 P5 0,71 P95 2,48 MIN 0,53 MAX 8,70 Tabla IV.3. Descripción estadística de los resultados obtenidos para la actividad ácida inhibida (AαGIM) en la población de muestras DBS que se encontraban en los rangos de normalidad. Las actividades enzimáticas están expresadas en µmol/L/h. El histograma refleja el resultado del test estadístico de normalidad de Kolmogorov-Smirnov que confirma que los resultados siguen una distribución normal (p<0,05). 130 RESULTADOS Cociente NαG/AαGIM MEDIA 10,12 D.S. 3,15 P5 5,60 P95 15,70 MIN 2,50 MAX 22,30 Tabla IV.4. Descripción estadística de los resultados obtenidos para el cociente de actividades neutra total e inhibida (NαG/ AαGIM) en la población de muestras DBS que se encontraban en los rangos de normalidad. El histograma refleja el resultado del test estadístico de normalidad de Kolmogorov- Smirnov que confirma que los resultados siguen una distribución normal (p<0,05). % de inhibición de AαG MEDIA 67,95 D.S. 8,62 P5 51,66 P95 79,50 MIN 31,30 MAX 86,70 Tabla IV.5. Descripción estadística de los resultados obtenidos para el porcentaje de inhibición de la actividad ácida total en la población de muestras DBS que se encontraban en los rangos de normalidad. Los resultados están expresados en tanto por ciento. El histograma refleja el resultado del test estadístico de normalidad de Kolmogorov-Smirnov que confirma que los resultados siguen una distribución normal (p<0,05). En el caso de los valores fuera de los rangos de la normalidad (42 pacientes), mostramos en la Tabla IV.6 la descripción estadística, no representando en este caso histograma por no tratarse ésta de una colección de valores que siga una distribución normal. 131 RESULTADOS MEDIA D.S. P5 P95 MIN MAX AαG (Ácida total) 3,12 1,08 1,31 4,90 0,84 5,90 NαG (Neutra total) 12,68 3,80 8,31 0,75 7,40 21,50 AαGIM (Ácida inhibida) 0,42 0,20 0,17 0,75 0,14 0,87 Cociente NαG/AαGIM 38,59 24,64 15,90 89,51 15,10 100,20 % de inhibición de AαG 85,12 7,38 75,99 94,98 58,20 95,30 Tabla IV.6. Descripción estadística de los resultados obtenidos en la población de muestras DBS que se encontraban fuera de los rangos de normalidad. Las actividades enzimáticas están expresadas en µmol/L/h 132 RESULTADOS 2.2. Estudio de la veracidad de la determinación de actividad GAA en DBS mediante la participación en programas de evaluación externa de la calidad. El control externo de la calidad abarca diferentes actividades orientadas a la evaluación de la exactitud de los resultados mediante la intervención de una organización ajena al laboratorio. La forma más común de control externo de la calidad son las comparaciones entre laboratorios o programas de evaluación externa de la calidad. Estos programas son organizados por asociaciones profesionales, organismos oficiales (como el CDC de Atlanta) o por fabricantes de materiales de control. Aunque existen diferencias operativas, todos los programas tienen un fundamento similar. Los laboratorios participantes miden alguna magnitud de un material de control, de valor desconocido, la organización del programa recopila los resultados de los laboratorios y realiza un estudio de los datos que remite luego a cada laboratorio participante, informándole sobre el error de su resultado. En los programas externos se compara el resultado obtenido en el laboratorio con un valor asignado para estimar el error cometido. El valor asignado es un valor convencionalmente verdadero y puede obtenerse de varias formas, aunque la más frecuente es calculando el valor de consenso, que es la media de resultados de todos los laboratorios participantes que utilizan el mismo método de medida. En nuestro caso, nuestro laboratorio forma parte de un programa piloto de evaluación externa de la calidad dirigido por el CDC de Atlanta, y mediante la participación en él pretendemos verificar la buena praxis respecto a la determinación de la actividad GAA para muestras DBS. Realizaremos esta comprobación mediante la comparación de los resultados obtenidos en nuestras determinaciones, partiendo del material aportado por este programa, y el cálculo de los errores que nos permitan estudiar la veracidad de nuestros resultados. Las determinaciones se llevaron a cabo a partir de las muestras aportadas por el CDC de Atlanta, correspondiendo estas muestras DBS a los niveles bajo, medio y alto de la actividad enzimática estudiada. Se realizaron dos envíos anuales con sus correspondientes resultados. Los valores obtenidos por nuestro laboratorio durante su participación en el programa del 2011, en comparación con los resultados aportados por la organización responsable del mismo, se expresan en la Tabla IV.7. 133 RESULTADOS RESULTADOS DE NUESTRO LABORATORIO MEDIA DE VALORES OBTENIDOS* D.S. CV1 CV2 1er SET Nivel Bajo 1,02 1,02 1,01 0,99 1,07 1,01 0,05 0,04 0,05 Nivel Medio 4,96 4,77 4,67 4,81 4,94 4,83 0,16 0,03 0,03 Nivel Alto 7,49 7,41 7,47 7,80 7,79 7,59 0,24 0,02 0,03 2º SET Nivel Bajo 0,65 0,59 0,60 0,58 0,57 0,60 0,03 0,01 0,05 Nivel Medio 5,22 5,30 5,33 5,18 5,25 5,26 0,12 0,02 0,02 Nivel Alto 10,13 9,52 10,31 9,71 9,94 9,92 0,31 0,01 0,03 Tabla IV.7. Las mediciones de cada set se realizaron por duplicado durante 5 días consecutivos. *En la Tabla se muestra la media de los valores obtenidos cada día. Los resultados enviados al CDC fueron la Media, Desviación típica y Coeficientes de variación (CV1 – C.V. intraensayo, CV2 – C.V. interensayo) calculados a partir de las determinaciones. La Tabla IV.8. muestra el resultado de la comparación entre nuestros valores y los aportados por el programa como verdaderos. MEDIA DE VALORES OBTENIDOS POR NUESTRO LABORATORIO RESULTADOS CONVENCIONALMENTE VERDADEROS CÁLCULO DE ERRORES Media asignada Intervalo de error permitido Error cometido Error permitido 1ER SET Nivel Bajo 1,02 1.13 0.90 – 1.36 -0,10 ± 0,23 Nivel Medio 4,83 5.29 3.91 – 6.67 -0,08 ± 1,38 Nivel Alto 7,59 10.23 6.60 – 13.86 -0,26 ± 3,63 2º SET Nivel Bajo 0,60 0.75 0.47 – 1.02 -0,20 ± 0,27 Nivel Medio 5,26 5.42 4.22 – 6.62 -0,03 ± 1,20 Nivel Alto 9,92 10.14 7.39 – 12.89 -0,02 ± 2,75 Tabla IV.8. Comparativa entre los valores obtenidos por nuestro laboratorio y los convencionalmente verdaderos aportados por el CDC para cada uno de los envíos. Se muestran también los índices de error siendo éstos positivos o negativos según queden por encima o por debajo de la media. En estos programas, la organización aporta un resultado único y un intervalo correspondiente a los valores que se encuentran dentro de los límites del error permitido (el error permitido en cada caso queda reflejado en la Tabla IV.8). El valor proporcionado por cada laboratorio participante debe tener un error inferior al permitido y por tanto encontrarse dentro del intervalo de valores acreditado. x 134 RESULTADOS El error relativo de nuestras determinaciones respecto al valor convencionalmente verdadero aportado por la organización se calcula como: Como hemos indicado, este error relativo no puede superar al error permitido, condición que se cumple para nuestros resultados (Tabla IV.8). Podemos concluir por tanto, que los resultados obtenidos certifican que cumplimos los criterios de calidad estipulados para esta metodología, y que dicha calidad se mantiene a lo largo del año. consensoValor consensoValorsultadoRe cometidoelativorError   141 RESULTADOS 4.2. Construcción de una curva ROC para evaluar la importancia de la glucosa tetrasacárido como biomarcador diagnóstico de enfermedad de Pompe La curva ROC es un gráfico en el que se representan todos los pares sensibilidad/especificidad resultantes de la variación continua de los puntos de corte en todo el rango de resultados observados. En el eje y de coordenadas se sitúa la sensibilidad (S) o fracción de verdaderos positivos. En el eje x se sitúa la fracción de falsos positivos o 1- especificidad (1-E). Cada punto de la curva representa un par S/1-E correspondiente a un nivel de decisión determinado. Una prueba con discriminación perfecta, sin solapamiento de resultados en las dos poblaciones, tiene una curva ROC que pasa por la esquina superior izquierda, donde S y E toman valores máximos (S y E = 1). Una prueba sin discriminación, con igual distribución de resultados en los dos subgrupos, da lugar a una línea diagonal de 45º, desde la esquina inferior izquierda hasta la superior derecha. La mayoría de las curvas ROC caen entre estos dos extremos. Cualitativamente, cuanto más próxima es una curva ROC a la esquina superior izquierda, más alta es la exactitud global de la prueba. Las curvas ROC son índices de la exactitud diagnostica y proporcionan un criterio unificador en el proceso de evaluación de una prueba334, 335, debido a sus diversas aplicaciones. Nosotros hemos construido una curva ROC a partir de los resultados de Glc4 obtenidos en los dos grupos de pacientes utilizando el software estadístico IBM SPSS Statistics 17.0. La curva se representa en la Figura IV.3 y las coordenadas de cada uno de los puntos acompañadas de sus respectivos valores de Sensibilidad/1-Especificidad se representan en la Tabla IV.13. 142 RESULTADOS COORDENADAS DE LA CURVA Positivo si mayor o igual quea S 1-E -,4420 1,000 1,000 0,6235 1,000 0,938 0,6925 1,000 0,875 0,7300 1,000 0,813 0,7755 1,000 0,750 0,8170 1,000 0,688 0,8790 1,000 0,625 0,9265 1,000 0,563 0,9465 1,000 0,500 0,9575 1,000 0,438 0,9855 1,000 0,375 1,0245 1,000 0,313 1,0455 1,000 0,250 1,0495 1,000 0,188 1,0525 0,938 0,188 1,0630 0,938 0,125 1,0775 0,938 0,063 1,1370 0,938 0,000 1,4000 0,875 0,000 1,9000 0,813 0,000 3,8000 0,750 0,000 5,6150 0,688 0,000 6,6900 0,625 0,000 8,8950 0,563 0,000 11,1700 0,500 0,000 13,6600 0,438 0,000 19,0600 0,375 0,000 26,7500 0,313 0,000 31,1900 0,250 0,000 34,4650 0,188 0,000 41,8150 0,125 0,000 56,0600 0,063 0,000 66,6300 0,000 0,000 a. El menor valor de corte es el mínimo valor de contraste observado menos 1, mientras que el mayor valor de corte es el máximo valor de contraste observado más 1. Todos los demás valores de corte son la media de dos valores de contraste observados ordenados y consecutivos. 143 RESULTADOS La evaluación cuantitativa de la exactitud se obtiene específicamente mediante el cálculo del área bajo la curva ROC (Tabla IV.14). ÁREA BAJO LA CURVA Area Error típico Significacióna Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0.988 0.014 0,000 0,000 1,000 Tabla IV.14. a. Hipótesis nula: área verdadera=0,5 El área bajo la curva nos permite cuantificar cuán buena es la capacidad de discriminación de un biomarcador entre individuos sanos/enfermos. Nuestro valor, superior a 0,9 indica que la Glc4 es un biomarcador muy apto para clasificar a un individuo como sano/enfermo según sus niveles. Las coordenadas de cada uno de los puntos que componen la curva y sus correspondientes valores de Sensibilidad/1-Especificidad, nos permiten establecer el nivel de decisión o punto de corte más apropiado para la clasificación de los enfermos. En nuestro caso, el valor de Glc4 de 1,0495 mmol/mol creatinina con una Sensibilidad del 100% y una Especificidad del 81,2% nos parece el más apropiado como punto de corte para discriminar entre individuos; considerándose sanos aquellos con niveles de Glc4 inferiores a este valor y enfermos a aquellos con niveles superiores. 144 RESULTADOS 5. Contribución del estudio molecular al diagnóstico definitivo de la enfermedad de Pompe El empleo de técnicas de biología molecular para el estudio de mutaciones puntuales permite realizar una detección precoz, segura y rápida de estas alteraciones. Para poder evaluar de forma ideal la efectividad de nuestra técnica de detección por PCR a tiempo real, debemos tener en cuenta tres grupos de pacientes: controles sanos, pacientes heterocigotos para IVS1-13T>G y pacientes homocigotos para la mutación. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que esta es una enfermedad poco frecuente y, dentro del grupo de pacientes, la homocigosis de la mutación IVS1-13T>G es extremadamente rara. Para el desarrollo de ésta técnica, la población de partida consistió en los pacientes estudiados por nuestro laboratorio de los que recibimos posterior confirmación diagnóstica a través de los clínicos que siguen a dichos pacientes. El diagnóstico molecular que describe las mutaciones que padecen, se realizó por secuenciación en distintos centros de referencia y dicha información nos fue remitida por los clínicos correspondientes. Así, contamos para nuestro estudio con 3 pacientes heterocigotos para la mutación IVS1-13T>G (posteriormente recibimos nuevos pacientes en los que se identificó ésta mutación por nuestro propio método, apartado 7. Población de pacientes diagnosticados de enfermedad de Pompe según nuestro protocolo diagnóstico) y 3 controles sanos, no teniendo a nuestra disposición ningún paciente con la mutación IVS1-13T>G en homocigosis. De forma que, para nuestro estudio, únicamente contaremos con un grupo control y otro de pacientes heterocigotos. Ésta deficiencia no es sustancial, pues la técnica de PCR a tiempo real mantiene la capacidad de detección de la mutación presente de forma inherente en los individuos heterocigotos. Por otra parte, realizamos una comparación de los resultados obtenidos con dos sondas SimpleProbe correspondientes a las formas silvestre y mutante del gen (T y G respectivamente). Tras las experiencias realizadas, se concluyó que la sonda silvestre-T no era informativa mientras que la sonda mutante-G tipifica correctamente a los genotipos tanto silvestre como mutante y, en consecuencia, la sonda SimpleProbe-G fue la elegida para formar parte de la técnica definitiva. El resultado final de las PCR’s a tiempo real, fueron dos curvas de melting diferentes para los dos tipos de pacientes: sanos (WT) y heterocigotos para IVS1-13T>G (Mut). El análisis de las curvas reveló una temperatura de melting media de 59,2ºC para los controles sanos, mientras que los controles heterocigotos mostraron además una segunda curva de melting a una temperatura de 66,4ºC (Figura IV.4). 145 RESULTADOS Estos resultados concuerdan con las bases genéticas, ya que los controles sanos presentan en la posición -13 del intrón 1 un par de nucleótidos T=A y su temperatura de melting es inferior a la de los pacientes heterocigotos que presentan en la misma posición un par G≡C. Por lo tanto las dos poblaciones pueden quedar bien definidas por este método, de forma que mediante esta técnica queda perfectamente identificada la mutación IVS1-13T>G. Figura IV.4. Curvas y picos de melting resultado de la PCR a tiempo real de un individuo sano (WT) y otro heterocigoto para la mutación IVS1-13 T>G. Como puede observarse, ésta técnica permite una diferenciación perfecta entre los dos tipos de pacientes. Estos resultados favorables son aplicables tanto para sangre total como para las muestras DBS, requiriendo éstas últimas un proceso de elución previo y un mayor número de ciclos de amplificación, pero aportando un alto valor clínico al ser muestras mucho más cómodas de manejar tanto para los pacientes como para el laboratorio. WT Mut 146 RESULTADOS 6. Estudio coste/efectividad El último objetivo que planteado en esta Tesis consistía en: Proposición de un algoritmo diagnóstico de la enfermedad de Pompe para el Laboratorio Clínico. Para poder alcanzarlo nos parece imprescindible, además de establecer un organigrama de pruebas que responda a un plan de actuación lógico para el laboratorio, realizar un pequeño estudio coste/efectividad que nos permita construir dicho algoritmo diagnóstico con bases más sólidas y completas. En función de lo dicho, procederemos a indicar el cálculo del coste que suponen cada una de las determinaciones que componen la batería de pruebas disponibles por nuestro laboratorio y que participan, con la información que aportan, en la consecución del diagnóstico de la enfermedad. Teniendo en cuenta que para los Laboratorios Clínicos la Unidad Relativa de Valor (URV) se define en función de la Determinación de Glucosa en Suero/Plasma (Determinación de Glucosa = 1 URV), se expresan en las Tablas IV.15 los costes de todas las técnicas realizadas durante el desarrollo de ésta Tesis para llegar al diagnóstico de la enfermedad de Pompe. Teniendo en cuenta que la URV hace referencia, no sólo al coste económico de una determinación bioquímica, sino también a la complejidad que comporta dicho análisis, se ha optado por expresar en la Tabla VI.15 las URV’s de cada técnica, comparativamente, con los valores de URV’s que suponen técnicas equivalentes en metodología y complejidad, de forma que pueda evaluarse de forma más cómoda y objetiva el verdadero valor que estas unidades de costo expresan para cada determinación. Podría resultar revelador un estudio comparativo, más o menos detallado, entre el coste que supone el desarrollo de éstas técnicas por nuestro laboratorio en contraposición a lo requerido por otros centros de referencia. Sin embargo, preferimos simplemente mostrar que el diagnóstico de esta enfermedad por el Laboratorio Clínico no tiene por qué suponer un alto gasto económico, y que, la elección de la metodología empleada a lo largo de este estudio, también presenta la venta- ja de resultar asequible. 147 RESULTADOS VALOR RELATIVO DE LAS DETERMINACIONES PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE POMPE Técnica analítica URV URV de técnica equivalente* Determinación de α-glucosidasa ácida en sangre seca recogida sobre papel (DBS) 9,20 URV  10,30 URV I Determinación de α-glucosidasa ácida intralinfocitaria 180,75 URV  277,80 URV II Cuantificación de los niveles de glucosa tetrasacárido en orina de 24 horas 24,80 URV  27,77 III Identificación molecular de la mutación IVS1-13T>G 69,45 URV  277,77 URV IV Tabla VI.15. El resultado en URV es una estimación aproximada. Estas pruebas no se encuentran en cartera de servicios y por tanto no poseen URV’s asignadas de forma oficial. * Se han establecido equivalencias entre las URV’s de las técnicas estudiadas y otras técnicas de las mismas características para poder disponer de una valoración relativa que permita evaluar de forma más objetiva la diferencia económica existente: I Screening de Tirotropina en DBS II Estudio de la función linfocitaria in vitro III Cuantificación de catecolaminas en orina de 24 hrs IV Identificación genética de una mutación conocida 148 RESULTADOS 7. Población de pacientes diagnosticados de enfermedad de Pompe según nuestro protocolo diagnóstico Gracias a los experimentos realizados durante el desarrollo de esta Tesis, pudimos diagnosticar a un total de 16 pacientes con enfermedad de Pompe de los 505 individuos recibidos por nuestro laboratorio para estudio de esta patología. Estos 505 pacientes aportaron un total de 530 muestras de DBS, entre las cuales 42 mostraron valores de actividad GAA alterados en alguna de sus formas. A partir de éstos resultados, se realizaron 35 determinaciones de actividad GAA intralinfocitaria, de las cuales 16 mostraron resultados de actividad enzimática reducida, correspondientes a los 16 pacientes posteriormente diagnosticados de enfermedad de Pompe (Figura IV.5). RESULTADOS DEL PROCESO DIAGNÓSTICO A LO LARGO DEL AÑO 2011 (1) Figura IV.5. Resultados las muestras analizadas por nuestro laboratorio a lo largo del año 2011. RESULTADOS DEL PROCESO DIAGNÓSTICO A LO LARGO DEL AÑO 2011 (2) Figura IV.6. Resultados del diagnóstico de enfermedad de Pompe por nuestro laboratorio a lo largo del año 2011. 149 RESULTADOS Así, la incidencia de la enfermedad en la población de pacientes con clínica compatible, remitidos a nuestro laboratorio, es aproximadamente del 3% (Figura IV.6). Y en lo referente a las formas de la enfermedad, de estos 16 pacientes, 2 presentaban la forma infantil y 14 la forma del adulto, encontrándose entre éstos 2 pacientes con la variante infanto-juvenil. Además, se ha realizado una recopilación de los principales signos y síntomas clínicos que presentaban estos 16 pacientes a través de una encuesta enviada a los clínicos responsables del diagnóstico/seguimiento/tratamiento de cada uno de ellos (encuesta en ANEXO III). Los resultados obtenidos de esta recopilación de datos se muestran en las Figuras IV.7-11. 150 RESULTADOS