Efecto inhibidor del hidroxitirosol y 3,4-dihidroxifenilglicol sobre la diabetes a través de su actividad sobre α-glucosidasa y α-amilasa

Ángela Dolores Molina González Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Efecto inhibidor del hidroxitirosol y 3,4-dihidroxifenilglicol sobre la diabetes a través de su actividad sobre α-glucosidasa y α-amilasa Trabajo Fin de Máster Máster en Especialización Profesional en Farmacia Especialidad Alimentación y Salud Efecto inhibidor del hidroxitirosol y 3,4-dihidroxifenilglicol sobre la diabetes a través de su actividad sobre α-glucosidasa y α-amilasa Ángela Dolores Molina González 19 de julio de 2024 Departamento de Fitoquímica de los Alimentos. Instituto de la Grasa (CSIC) – Departamento de Nutrición y Bromatología. Toxicología y Medicina Legal. Facultad de Farmacia Co-tutor: Juan Fernández-Bolaños Guzmán Tutora académica: Ana Belén Cerezo López Resumen: Este estudio se centró en la evaluación de los compuestos fenólicos hidroxitirosol (HT) y 3,4-dihidroxifenilglicol (DHFG) como posibles agentes inhibidores de las enzimas αglucosidasa y α-amilasa, esenciales en el control de la glucosa sanguínea en la diabetes tipo 2. Mientras que el hidroxitirosol ya ha sido estudiado por otros autores como inhibidor de estos enzimas, el 3,4-dihidroxifenilglicol nunca ha sido investigado previamente en este contexto. Se desarrollaron y optimizaron métodos precisos para medir la actividad enzimática mediante espectrofotometría, evaluando la inhibición de estas enzimas por HT y DHFG. Los resultados demostraron que tanto HT como DHFG poseen capacidad inhibitoria sobre α-glucosidasa y α-amilasa in vitro. DHFG mostró una mayor actividad inhibitoria sobre α-glucosidasa en comparación con HT, y similar a la acarbosa (control positivo), mientras que para α-amilasa, ninguno de los dos compuestos resultó más efectivo que la acarbosa. Sin embargo, se observó un efecto sinérgico significativo cuando HT y DHFG se combinaron en proporciones específicas (10:1 y 1:1), especialmente a concentraciones bajas en ambas enzimas. Este efecto es particularmente notable en α-amilasa, donde individualmente los compuestos fenólicos no mostraron actividad inhibitoria significativa. Estos hallazgos sugieren un potencial terapéutico para el control de la glucosa posprandial en la diabetes tipo 2. Los resultados respaldan el interés en los compuestos fenólicos derivados de la aceituna como alternativas prometedoras a los tratamientos convencionales para la diabetes tipo 2. No obstante, se subraya la necesidad de investigaciones adicionales para validar estos hallazgos en modelos animales y estudios clínicos. En conclusión, este estudio representa un primer paso en la identificación de nuevos agentes terapéuticos y proporciona evidencia inicial de su potencial efectividad en el manejo de la diabetes tipo 2. Palabras claves: α-glucosidasa, α-amilasa, hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol y acarbosa Abstract: This study focused on the evaluation of the phenolic compounds hydroxytyrosol (HT) and 3,4-dihydroxyphenylglycol (DHFG) as potential inhibitors of the α-glucosidase and α-amylase enzymes, which are essential in the control of blood glucose in type 2 diabetes. While hydroxytyrosol has already been studied by other authors as an inhibitor of these enzymes, 3,4-dihydroxyphenylglycol has never been previously investigated in this context. Accurate methods were developed and optimised to measure enzyme activity spectrophotometrically, assessing the inhibition of these enzymes by HT and DHFG. The results showed that both HT and DHFG possess inhibitory capacity on α-glucosidase and α-amylase in vitro. DHFG showed higher inhibitory activity on α-glucosidase compared to HT, and similar to acarbose (positive control), while for α-amylase, neither compound was more effective than acarbose. However, a significant synergistic effect was observed when HT and DHFG were combined in specific ratios (10:1 and 1:1), especially at low concentrations of both enzymes. This effect is particularly notable in αamylase, where individually the phenolic compounds did not show significant inhibitory activity. These findings suggest therapeutic potential for postprandial glucose control in type 2 diabetes. The results support the interest in olive-derived phenolic compounds as promising alternatives to conventional treatments for type 2 diabetes. However, the need for further research to validate these findings in animal models and clinical studies is highlighted. In conclusion, this study represents a first step in the identification of new therapeutic agents and provides initial evidence of their potential effectiveness in the management of type 2 diabetes. Keywords: α-glucosidase, α-amylase, hydroxytyrosol, 3,4-dihydroxyphenylglycol and acarbose. ÍNDICE 1. Introducción y antecedentes ...................................................................................... 1 1.1. Síndrome metabólico ............................................................................................. 1 1.2. Diabetes mellitus tipo 2 ......................................................................................... 1 1.3 Tratamiento farmacoterapéutico de la diabetes mellitus tipo 2 .............................. 2 1.4. Estudios sobre la inhibición de las enzimas α-glucosidasa y α-amilasa ................ 4 1.5. Dieta mediterránea y aceite de oliva ...................................................................... 5 1.6. El alperujo .............................................................................................................. 6 1.7. Compuestos fenólicos y sus propiedades ............................................................... 8 1.7.1. Hidroxitirosol .................................................................................................. 8 1.7.2. 3,4-dihidroxifenilglicol ................................................................................. 12 2.Objetivos ..................................................................................................................... 14 3. Materiales y métodos ................................................................................................ 15 3.1. Aislamiento del hidroxitirosol y del 3,4-dihidroxifenilglicol .............................. 15 3.2. Actividad inhibitoria de α-glucosidasa in vitro .................................................... 15 3.3. Actividad inhibitoria de α-amilasa in vitro .......................................................... 16 3.4. Análisis de los datos ............................................................................................. 17 4. Resultados y discusión .............................................................................................. 18 4.1. Actividad inhibitoria de HT y DHFG para α-glucosidasa in vitro ....................... 19 4.1.1. Actividad inhibitoria de α-glucosidasa por la mezcla HT: DHFG en las proporciones 10:1 y 1:1 ........................................................................................... 20 4.2. Actividad inhibitoria de HT y DHFG para α-amilasa in vitro ............................. 24 4.2.1. Actividad inhibitoria de α-amilasa por la mezcla HT: DHFG en las proporciones 10:1 y 1:1 ........................................................................................... 26 5. Conclusiones .............................................................................................................. 28 6. Bibliografía ................................................................................................................ 29 Introducción y antecedentes 1 1. Introducción y antecedentes 1.1. Síndrome metabólico El síndrome metabólico (SM) también conocido con el nombre de síndrome de resistencia a la insulina, síndrome de Reaven o síndrome metabólico X (Zimmet et al., 2005), es una enfermedad causada por la combinación de factores genéticos y ambientales vinculados al estilo de vida donde el componente patogénico principal sería la resistencia a la insulina. Esto aumenta la probabilidad de padecer diabetes, enfermedad arterial coronaria y enfermedad cerebrovascular (Carvajal Carvajal, 2017). Entre los factores de riesgo del SM encontramos (Huang, 2009; Rodríguez Porto et al., 2002): • Elevación de glucosa en sangre en ayunas nivel igual o superior a 110 mg/dL. • Niveles bajos de colesterol HDL, definido como menos de 40 mg/dL en los hombres y menos de 50 mg/dL en las mujeres. • Niveles altos de colesterol LDL, • Niveles elevados de triglicéridos: más de 150 mg/dL. • Presión arterial alta de 130/85 mm.Hg (milímetros de mercurio) • Obesidad central, es decir, un exceso de grasa en la zona abdominal, con un índice cintura-cadera mayor de 94 cm en hombres y mayor de 80 cm en mujeres, y o índice de masa corporal (IMC) mayor de 30 Kg/m2. En esta línea, el notable aumento de la obesidad se acompaña del aumento del SM. Este cuadro patológico se considera el factor de riesgo más relevante en el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (DM2), convirtiéndose en uno de los principales problemas de salud pública en la actualidad. En términos generales, la sospecha de SM se comienza al notar la presencia de obesidad abdominal y/o resistencia a la insulina. 1.2. Diabetes mellitus tipo 2 En la actualidad la diabetes mellitus es una verdadera epidemia mundial. Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se estima que cerca de 200 millones de personas tienen diabetes y que esta cifra podría verse ampliada en los próximos 10 años (Rodríguez-Rada et al., 2021) La DM2 presenta una etapa inicial que puede ser asintomática, pasando inadvertida durante varios años antes de ser diagnosticada. Gran parte de los pacientes presenta 2 alteraciones en las vías metabólicas, y los órganos más afectados son el hígado, los islotes pancreáticos y los tejidos periféricos, tales como el tejido adiposo y el musculoesquelético. Los síntomas característicos son la poliuria (producción de orina mayor a 3 litros por día), la polifagia (excesivo deseo de comer), la pérdida de peso y la polidipsia (sed excesiva). La etiología de esta enfermedad radica en la resistencia a la insulina (Torrades, 2005). La insulina producida por el páncreas no es reconocida por las células y por tanto no se permite la entrada de glucosa para producir energía. Esto da lugar a una hiperglucemia, debido a que los valores de glucosa en sangre son altos. Para combatir esa resistencia a la insulina, el páncreas produce más. Las células reciben este torrente de insulina y se vuelven más resistentes, ocasionando un ciclo degenerado de niveles elevados de glucosa y continuos niveles elevados de insulina. Con el transcurso del tiempo, las altas concentraciones de glucosa en sangre deterioran los vasos sanguíneos y los nervios, lo que ocasiona que se desarrollen otras enfermedades como problemas en los nervios de las extremidades (neuropatía diabética), enfermedades cardíacas tales como insuficiencia cardíaca o cardiomiopatía, daño ocular como retinopatía que puede acabar en ceguera y enfermedades renales que incluso pueden llegar a requerir diálisis o trasplante de riñón, entre otras complicaciones (Brunton, 2016). El principal tratamiento para combatir esta enfermedad es la dieta y el ejercicio físico. Igualmente, se pueden administrar antidiabéticos orales o hipoglucemiantes y en determinados casos pueden necesitar insulinoterapia (Torrades, 2005). 1.3 Tratamiento farmacoterapéutico de la diabetes mellitus tipo 2 Existen múltiples agentes terapéuticos disponibles para la DM2, entre los que se encuentran las sulfonilureas, las biguanidas como metformina, las tiazolidinedionas, los inhibidores de las α-glucosidasas y α-amilasas como acarbosa y la insulina (Tabla 1). Una perspectiva lógica se basaría en empezar con los agentes más apropiados para la naturaleza y el estadío de la enfermedad, cambiando, si fuera necesario, a una terapia combinada. Los agentes farmacológicos que actúan por medio de distintos mecanismos de acción deben elegirse para mejorar los valores de glucosa minimizando los posibles efectos adversos (Brunton, 2016). 3 Tabla 1. Agentes orales empleados en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. CLASE MECANISMO DE ACCIÓN INDICIACIÓN (ES) Sulfonilureas Estimular la secreción de insulina por las células β del páncreas y aumentar la sensibilidad de los tejidos periféricos a esta hormona (Conteras et al.,2002). Insulinopenia (Conteras et al.,2002). Biguanidas Ejercen su función a nivel hepático, reduciendo la glucosa producida por el hígado. También presenta una acción a nivel muscular, aumentando la utilización y la captación de glucosa (González y Ortiz, 2012). Pacientes que presenten sobrepeso/obesidad (Brunton, 2016) Tiazolidinediona Inducen la entrada de ácidos grasos al tejido adiposo, lo que implica una disminución de la entrada estos ácidos a los tejidos diana de la insulina (hígado y músculo esquelético) mejorando así la resistencia a la insulina (Brunton, 2016) Resistencia a la insulina (Brunton, 2016) Inhibidores de la α-glucosidasa y α-amilasa Retrasan la digestión de carbohidratos resultando en una disminución de la hiperglucemia postprandial (González y Ortiz, 2012). Hiperglucemia postprandial (González y Ortiz, 2012). De los agentes orales mencionados anteriormente, nos centraremos en la acarbosa, que actúa como inhibidor de la α-glucosidasa y la α-amilasa. La acarbosa es un fármaco oral antihiperglucemiante de origen microbiano obtenido a partir de Actinoplanes utahensis. Genera una mejoría del control metabólico de la DM2 reduciendo la respuesta glucémica postprandial. Las α-glucosidasas son una familia de enzimas intestinales (maltasa, isomaltasa, dextrinasa, glucoamilasa y sacarasa) encargadas de la hidrólisis de los hidratos de carbono en el aparato digestivo, es decir, actúan en la liberación de la maltosa, sacarosa y otros oligosacáridos en monosacáridos (glucosa, fructosa y galactosa). Se encuentran principalmente en el borde las vellosidades del intestino delgado, y su inhibición origina 10 observó una protección contra la toxicidad hepática y renal. Estos resultados evidencian que los polifenoles, en particular el HT, son eficaces para combatir la hiperglucemia y el EO causado por la diabetes, lo que sugiere que su uso podría ser beneficioso para prevenir las complicaciones diabéticas relacionadas con el EO (Hamden et al.,2009). Igualmente, los compuestos mayoritarios presentes en extracto de hoja de olivo, como la oleuropeína y el HT, lograron revertir la inflamación crónica y el EO causantes de los síntomas cardiovasculares, hepáticos y metabólicos en un modelo de ratas Wistar macho obesas con diabetes inducida por la dieta y otras inducidas por estreptozotocina (antibiótico producido por Streptomyces achromogenes, utilizado como un agente antineoplásico y para inducir diabetes en animales de experimentación) (Poudyal et al., 2010). Otras investigaciones que se centraron en un tratamiento prolongado mediante la administración de HT por vía oral a ratas con diabetes lograron potenciar el efecto de la aspirina en la prevención de una de las complicaciones de diabetes mellitus, como es la retinopatía diabética (De la Cruz et al., 2010). La EFSA (European Food Safety Authority) ha informado que los polifenoles presentes en el aceite de oliva proporcionan protección contra el daño oxidativo. Se ha demostrado que el daño oxidativo afecta negativamente a la salud cardiovascular, por lo que se recomienda un consumo mínimo de 5 mg/día de HT. Las propiedades in vitro e in vivo de este compuesto quedan agrupadas en la Tabla 2. 11 Tabla 2. Resumen propiedades in vitro e in vivo del HT. Propiedades In-vitro In-vivo Antimicrobiana Lesishmania spp. (Kyriazis et al.,2013) Propionibacterium Acnes (Eilami et al.,2017) Staphylococcus aureus/epidermis (Ghalandari et al., 2018) No se han descrito Cardioprotector Inhibición LDL en macrófagos, inhibiendo placa aterosclerótica (Granados-Principal et al., 2012) Protección endotelio vascular (Catalán et al.,2015) Protección sobre líneas celulares de miocardio (Wu et al.,2018) Pacientes con enfermedad coronaria, disminución de OL-G y proteína C (Fitó et al.,2008) Regulación positiva de los genes implicados en el flujo de salida del colesterol de las células a HDL en pacientes hipertensos (Farràs et al.,2013) Mejora el estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial en la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina (Granados-Principal et al.,2014) Disminución de LDL en pacientes hipertensos (Valls et al.,2015) Antiinflamatorio Inhibición citoquina proinflamatorias, generación óxido nítrico, secreción TNF-α, inhibición iNOS y COX-2 (Zhang et al.,2009) Inhibición de monocitos y granulocitos humanos (Bigagli et al.,2017) Inhibición COX-1 y COX-2 (Procopio et al., 2009) Inhibición COX-2 y TNF-α (Fuccelli et al.,2018) Anticanceroso Cáncer de tiroides (Toteda et al.,2017) Cáncer de colón (López de Las Hazas et al.,2017) Cáncer de próstata (Zubair 2017) Inhibición crecimiento tumores en ratas (Martínez-Martos et al.,2014; Ramírez- Expósito et al.,2018) 12 1.7.2. 3,4-dihidroxifenilglicol El 3,4-dihidroxifenilglicol (DHFG) es un fenol simple presente en la aceituna, el cual ha sido aislado y purificado de los subproductos de aceite de oliva (Rodríguez Gutiérrez et al., 2009) utilizando un procedimiento altamente adaptado y patentado (Rodríguez-Gutiérrez et al., 2011), del cual se obtiene el compuesto con una pureza superior al 90% en peso seco. El DHFG presenta la misma estructura orto-difenólica que el HT, pero en la posición β cuenta con un grupo hidroxilo adicional (Figura 3). Figura 3. Estructura de la molécula de 3,4-dihidroxifenilglicol La presencia de este grupo hidroxilo adicional en su estructura respecto al hidroxitirosol le podría conferir mejores propiedades biológicas, o mejorar las que éste último ya posee. En algunos grupos de investigación se han realizado los ensayos de la capacidad antioxidante del DHFG mediante cuatro ensayos in vitro: capacidad antirradical, poder reductor e inhibición de la oxidación primaria, secundaria en sistemas lipídicos (Rodríguez-Gutiérrez et al., 2007). Por primera vez se ha comprobado que el DHFG tiene, en fase acuosa, una capacidad antioxidante 2-3 veces mayor que la vitamina C y el hidroxitirosol. Además, posee una mayor capacidad antirradical y poder reductor que la vitamina C, la vitamina E y el hidroxitirosol. Se ha observado que, en fase lipídica, su capacidad para inhibir la oxidación es similar a la de la vitamina E, a pesar de su alta polaridad. Un estudio examinó los índices y mecanismos de estrés oxidativo y metabólico en ratas utilizando ratas deficientes en vitamina E y suplementando su dieta con α-tocoferol, un extracto fenólico, HT y DHFG. La biodisponibilidad de los compuestos fenólicos se confirmó mediante su detección en sangre y tejidos. Estudios proteómicos realizados en este trabajo revelan que el α-tocoferol y los compuestos fenólicos regulan la proteína hepática 13 mitocondrial aldehído deshidrogenasa (ALDH2) que representa un mecanismo antioxidante (Rodríguez–Guitérrez et al., 2012). Por tanto, se demuestra que los compuestos fenólicos de la aceituna o del aceite de oliva tienen un impacto beneficioso sobre la salud cardiovascular. Estudios de inhibición de la agregación plaquetaria demostraron un efecto sinérgico entre HT. Asimismo, otro estudio realizado con ratas deficientes en vitamina E ha demostrado el efecto sinérgico del HT y DHFG sobre la inhibición de la peroxidación de los microsomas hepáticos (Rubio-Senent et al.,2015). El DHFG es un compuesto con gran potencial en nutrición y farmacología debido a su fuerte capacidad antioxidante y por ser el principal producto derivado de la descomposición del neurotransmisor noradrenalina en el cuerpo humano (Venneri y Del Rio, 2004). Por lo tanto, incluir DHFG es una dieta equilibrada puede proteger contra el estrés oxidativo al neutralizar los radicales libres y detener la oxidación de los lípidos. La adición de DHFG a alimentos puede ser una estrategia para crear productos funcionales que beneficien la salud, la conservación de alimentos y su uso en cosmética como agente antienvejecimiento y antioxidante. Esto resalta el importante papel de los antioxidantes como herramienta terapéutica en la prevención y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Objetivos 14 2.Objetivos Los principales objetivos del proyecto llevado a cabo son: • Puesta a punto de los métodos de medida de la actividad de α-glucosidasa y α-amilasa. • Estudio de las propiedades inhibitorias del hidroxitirosol y 3,4-dihidroxifenilglicol, y el posible efecto sinérgico de ambos sobre la actividad enzimática de α-glucosidasa y α-amilasa. Materiales y métodos 15 3. Materiales y métodos 3.1. Aislamiento del hidroxitirosol y del 3,4-dihidroxifenilglicol HT y DHFG se extrajeron mediante un tratamiento hidrotérmico a temperatura de 60ºC durante 60 minutos, utilizando alperujo, un subproducto del proceso de extracción de aceite de oliva en el sistema de separación de dos fases. Este subproducto fue recogido de la Almazara Experimental del Instituto de la Grasa, Sevilla. Tras el tratamiento, se obtuvo una fase líquida rica en ambos compuestos. HT y DHFG se purificaron mediante fraccionamiento cromatográfico con columna de resina de intercambio iónica para el aislamiento parcial de HT y DHFG y posterior purificación con resina de adsorción XAD para su purificación completa (Fernández-Bolaños et al., 2014; nº patente WO2013/007850) Se parte de un stock de HT de 7.73 g/L con una pureza del 97% y un stock de DHFG de 3.88 g/L con una pureza del 96%. 3.2. Actividad inhibitoria de α-glucosidasa in vitro La actividad inhibitoria de α-glucosidasa (levadura de panadería tipo I, Sigma Aldrich) se determinó por espectrofotometría utilizando el método descrito previamente en el estudio de Kim et al. (2005) con ligeras modificaciones. Por triplicado, se añadieron 20 µL de la muestra a diferentes concentraciones en microplaca de 96 pocillos. Posteriormente, se añadieron 120 µL de tampón fosfato 100 mM a pH 6,8 y 60 µL de 4-Nitrofenil β-D-glucopiranósido (pNPG) 5 mM en tampón fosfato (A3). Además, para cada ensayo se preparó un control negativo o 100%, compuesto por 140 µL de tampón fosfato y 60 µL de pNPG (A1). A continuación, las mezclas se incubaron a 37ºC durante 5 minutos. Después, se añadieron 30 µL de 0,1 U/mL de enzima en tampón fosfato. Se preparó un blanco de reacción para cada muestra (A4) y del 100% (A2) sin la enzima. La absorbancia (espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan FC) se midió a 400 nm (t=0), y la microplaca se incubó de nuevo a 37ºC durante 30 minutos. La absorbancia se midió de nuevo a 400 nm (t=30). Los porcentajes de inhibición se calcularon mediante la fórmula (%): I (%) = [ 1 - (𝐴1−𝐴2) (𝐴3−𝐴4) ] × 100 Donde → A1: Absorbancia del 100% A2: Absorbancia del blanco del 100% 16 A3: Absorbancia de la muestra A4: Absorbancia del blanco de la muestra Tabla 3. Resumen de las mezclas de reacción en la actividad inhibitoria de α-glucosidasa. Volumen (µl) µL tampón µL muestra µL pNPG µL Enzima 100% A1 140 0 60 30 Blanco 100% A2 170 0 60 0 Muestra A3 120 20 60 30 Blanco muestra A4 150 20 60 0 3.3. Actividad inhibitoria de α-amilasa in vitro La actividad inhibitoria de α-amilasa (Bacilus Subtilis, MP Biomedical) se determinó por espectofotometría utilizando el método anteriormente descrito en el estudio de Mendoza y Medina (2015) con leves modificaciones. Por triplicado, se añadieron 25 µL de la muestra a diferentes concentraciones y 25 µL de la enzima (A3) en microplaca de 96 pocillos. Para cada ensayo se preparó un control negativo o 100% (A1), compuesto por 25 µL de tampón fosfato y 25 µL de enzima. Seguidamente, las mezclas se incubaron a una temperatura ambiente de 25ºC durante 10 minutos. Asimismo, se preparó un blanco de reacción para cada muestra (A4) y el 100% (A2) sin la enzima. Después, se añadieron 25 µL de almidón al 0.5 % (p/v) en tampón PBS 1M pH 6,9 y se volvió a incubar durante 10 minutos a 25ºC. A continuación, se agregaron 50 µL dinitrosalicílico (DNS) y se depositó la placa en un baño con una temperatura de 100ºC durante 5 minutos. Posteriormente, se dejó enfriar y se midió la absorbancia (espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan FC) a 540 nm. Los porcentajes de inhibición se calcularon mediante la fórmula (%): I (%) = [ 1- (𝐴1−𝐴2) (𝐴3−𝐴4) ] × 100 Donde → A1: Absorbancia del 100% A2: Absorbancia del blanco del 100% A3: Absorbancia de la muestra A4: Absorbancia del blanco de la muestra 17 Tabla 4. Resumen de las mezclas de reacción de la inhibición de α-amilasa. Volumen (µl) Tampón Muestra Almidón Enzima 100% A1 25 0 25 25 Blanco 100% A2 50 0 25 0 Muestra A3 0 25 25 25 Blanco muestra A4 25 25 25 0 3.4. Análisis de los datos Los resultados se expresaron como valores medios ± desviación estándar. 23 Tabla 5. Porcentaje de inhibición teórico de los compuestos por separados y sus mezclas en proporción 10:1 y porcentaje de inhibición experimental de las mismas mezclas para α-glucosidasa. μg/mL % Inhibición teórico % Inh exp HT DHFG HT+DHFG HT DHFG HT+DHFG HT+DHFG 10:1 10:1 10:1 7 0.7 7.7 0.00 0.00 0.00 0 10 1 11 0.00 0.00 0.00 3.14 14 1.4 15.4 1.34 0.00 1.34 9.39 20 2 22 7.97 0.00 7.97 16.02 35 3.5 38.5 18.38 2.15 20.53 26.42 50 5 55 25.01 8.64 33.65 33.04 70 7 77 31.27 14.76 46.02 39.30 140 14 154 44.16 27.36 71.52 52.17 350 35 385 61.20 44.01 105.22 69.20 700 70 770 74.10 56.61 130.71 82.08 En este caso las concentraciones van desde 0.8 µg/mL HT + 0.8 µg/mL DHFG a 500 µg/mL HT + 500 µg/mL DHFG. Los datos obtenidos quedan reflejados en la Tabla 6, donde observamos que en la concentración 2.5 µg/mL de manera teórica no se obtiene ninguna inhibición de α-glucosidasa, mientras que de manera experimental da un 14.97%. Para la siguiente concentración (4 µg/mL), el dato de la inhibición experimental es 4.89 veces mayor que la inhibición teórica. Lo mismo sucede para las concentraciones de 5 y 8 µg/mL, donde los resultados para la inhibición experimental son 3.01 y 1,95 veces mayores que la inhibición teórica respectivamente. Por consiguiente, el rango observado de efecto sinérgico abarca desde 2.5 hasta 20 µg/mL. Estos hechos demuestran que la combinación de HT y DHFG en proporción 1:1 ejerce un efecto sinérgico importante a concentraciones bajas. Para la mezcla 1:1 se alcanza un EC50 de 45 ± 4 µg/mL, la cual es mucho menor a la EC50 del control positivo (170 ± 60 µg/mL). Este resultado indica que la combinación de HT y DHFG en proporción 1:1 funciona mejor que el fármaco. 24 Figura 6. Concentraciones de las mezclas de HT y DHFG (µg/mL) en proporción 1:1 frente a su porcentaje de inhibición de α-glucosidasa. Los resultados se expresan como valores medios (n=3) y las barras indican la desviación estándar. Tabla 6. Porcentaje de inhibición teórico de los compuestos por separados y sus mezclas en proporción 1:1 y porcentaje de inhibición experimental de las mismas mezclas para α-glucosidasa. μg/mL % Inhibición teórico % Inh exp HT DHFG HT+DHFG 1:1 HT DHFG HT+DHFG 1:1 HT+DHFG 1:1 0.8 0.8 1.6 0.00 0.00 0.00 0.00 2.5 2.5 5 0.00 0.00 0.00 14.97 4 4 8 0.00 4.59 4.59 22.49 5 5 10 0.00 8.65 8.65 26.07 8 8 16 0.00 17.19 17.19 33.59 10 10 20 0.00 21.25 21.25 37.17 20 20 40 7.97 33.85 41.81 48.27 40 40 80 20.86 46.44 67.30 59.37 50 50 100 25.01 50.50 75.51 62.94 100 100 200 37.90 63.10 101.00 74.04 250 250 500 54.95 79.75 134.70 88.71 500 500 1000 67.84 92.35 160.19 99.81 4.2. Actividad inhibitoria de HT y DHFG para α-amilasa in vitro Si la primera enzima digestiva probada fue la α-glucosidasa, ahora nos centraremos en la αamilasa para la cual también se estudió el efecto inhibitorio que podría ejercer los compuestos fenólicos (HT y DHFG) mencionados anteriormente y en sus mezclas. Para ello, se estudiaron concentraciones desde 2 µg/mL a 40 µg/mL tanto en el ensayo con HT como con DHFG. y = 16,013ln(x) - 10,805 R² = 0,9245 -20 0 20 40 60 80 100 120 0200 400 600 800 1000 1200 % Inhibición μg/mL HT:DHFG (1:1) 25 En la Figura 7 se presentan las gráficas obtenidas para HT (a) y para DHFG (b), así como el porcentaje de inhibición para α-amilasa alcanzado con cada concentración probada. Los valores de EC50, expresados en µg/mL fueron 171.70 ± 39.48 µg/mL para HT y 70.13 ± 2.59 µg/mL para DHFG. Comparando estos datos con la EC50 de la acarbosa, que es de 3.77 ± 0.70 µg/mL, se deduce que los compuestos fenólicos probados individualmente no funcionan mejor que el fármaco, puesto que se requieren concentraciones mayores para alcanzar el 50% de la inhibición de la enzima. La misma conclusión se obtiene al comparar la EC50 expresada en µM, con valores de 1113.77 ± 256.09 µM para HT y 412.53 ± 15.24 µM para DHFG. Estos son muy superiores al del control positivo, con un valor de 5.83 ± 1.08 µM. En un estudio sobre el efecto del hidroxitirosol y la oleuropeína en la inhibición de la αamilasa, los resultados mostraron que a la concentración más alta empleada (600 µM), el hidroxitirosol y la oleuropeína no fueron efectivos, ya que se observó una inhibición de la actividad inferior al 25% y al 10% respectivamente. Estos datos revelaron que estos compuestos fenólicos ejercen una tasa de inhibición inferior a la de la acarbosa (Hadrich et al., 2015). y = 0,2298x + 0,063 R² = 0,8354 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 010 20 30 40 50 % Inhibición μg/mL HT a) 26 Figura 7. Concentraciones de HT (µg/mL) (a) y concentraciones de DHFG (µg/mL) (b) frente a su porcentaje de inhibición de α-amilasa. Los resultados se expresan como valores medios (n=3) y las barras indican la desviación estándar. 4.2.1. Actividad inhibitoria de α-amilasa por la mezcla HT: DHFG en las proporciones 10:1 y 1:1 Una vez analizados el HT y el DHFG por separados se procedió a estudiar la posible inhibición de la enzima α-amilasa por dichos compuestos en proporción 10:1 y 1:1 respectivamente. Para poder calcular los valores teóricos de inhibición se utilizaron las rectas obtenidas en las Figuras 7a y 7b para el HT y el DHFG. HT y= 0.2298x + 0.063 DHFG y= 0.7291x – 2.4804 HT:DHFG (10:1) y= 0.4615x – 5.2804 HT:DHFG (1:1) y= 2.1893x + 6.4794 En el caso de la proporción 10:1, las concentraciones varían desde 3 µg/mL HT + 0.3 µg/mL DHFG hasta 60 µg/mL HT + 6 µg/mL DHFG, como se ilustra en la Tabla 7, donde también se refleja como los porcentajes de inhibición teórica difieren de los porcentajes de inhibición experimental. Además, se puede apreciar como todas las concentraciones empleadas presentan un efecto sinérgico. Por otro lado, al analizar desde la mezcla menos concentrada hasta la más concentrada, se observa que los porcentajes de inhibición experimental son 9.06, 5.78, 3.77, 2.94 y 2.27 veces mayores que los porcentajes de inhibición teórica respectivamente, observándose como este efecto sinérgico aumenta a bajas concentraciones. y = 0,7291x - 2,4804 R² = 0,9746 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 010 20 30 40 50 % Inhibición μg/mL DHFG b) 27 No obstante, si nos centramos en el valor de la EC50, el cual se corresponde con 85.47 ± 9.77 µg/mL, seguimos teniendo que el fármaco funciona mejor que la mezcla en proporción 10:1 de HT y DHFG porque su EC50 es bastante menor (3.77 ± 0.70 µg/mL). Tabla 7. Porcentaje de inhibición teórico de los compuestos por separados y sus mezclas en proporción 10:1 y porcentaje de inhibición experimental de las mismas mezclas para α-amilasa. μg/mL % Inhibición teórica % Inh exp HT DHFG HT:DHFG (10:1) HT DHFG HT:DHFG (10:1) HT+DHFG 3 0.3 3.3 0.75 0.00 0.75 6.80 6 0.6 6.6 1.44 0.00 1.44 8.33 14 1.4 15.4 3.28 0.00 3.28 12.39 30 3 33 6.96 0.00 6.96 20.51 60 6 66 13.85 1.89 15.75 35.74 Para la proporción 1:1 se utilizaron concentraciones que van desde 2 µg/mL HT + 2 µg/mL DHFG hasta 10 µg/mL HT + 10 µg/mL DHFG como se muestran en la Tabla 8. Al igual que ocurrió en la proporción 10:1, todas las concentraciones presentaron un efecto sinérgico. Desde la mezcla menos concentrada hasta la más concentrada, se observó que los porcentajes de inhibición experimental eran 29.3, 16.89 y 7.01 veces mayores que los porcentajes de inhibición teórica respectivamente. Las dos primeras concentraciones (2 y 4 µg/mL) mostraron el mayor efecto sinérgico. De nuevo, llegamos a la conclusión de que las bajas concentraciones en las mezclas son las que mejor funcionan. Si hablamos ahora de su EC50, se ha obtenido un valor de 20.36 ± 4.25 µg/mL, el cual sigue siendo mayor que la EC50 del control positivo (3.77 ± 0.70 µg/mL). A pesar de ello, si comparamos entre las distintas proporciones, vemos como la proporción 1:1 funciona mejor que la proporción 10:1, habiendo una diferencia de 65.11 µg/mL. Tabla 8. Porcentaje de inhibición teórico de los compuestos por separados y sus mezclas en proporción 1:1 y porcentaje de inhibición experimental de las mismas mezclas para α-amilasa. μg/mL % Inhibición teórica % Inh exp HT DHFG HT:DHFG (1:1) HT DHFG HT:DHFG (1:1) HT:DHFG (1:1) 2 2 4 0.52 0.00 0.52 15.24 4 4 8 0.98 0.44 1.42 23.99 10 10 20 2.36 4.81 7.17 50.27 Conclusiones 28 5. Conclusiones El trabajo ha cumplido satisfactoriamente con los objetivos propuestos, que incluía el desarrollo y la optimización de métodos para medir la actividad de las enzimas α-glucosidasa y α-amilasa, así como la evaluación de las propiedades inhibitorias del hidroxitirosol y 3,4- dihidroxifenilglicol, efectuándose las siguientes conclusiones: 1) Se han establecido protocolos reproducibles y precisos para medir la actividad enzimática de α-glucosidasa y α-amilasa. 2) Tanto el HT como el DHFG han demostrado capacidad inhibitoria sobre las enzimas α-glucosidasa y α-amilasa. La acarbosa (control positivo) mostró ser más efectiva para α-amilasa, aunque similar al DHFG para α-glucosidasa. La combinación HT y DHFG en proporciones específicas (10:1 y 1:1) reveló un efecto sinérgico significativo a bajas concentraciones, lo que podría ser terapéuticamente interesante. Por lo tanto, se puede decir que dos de los compuestos fenólicos más importantes presentes en la aceituna, HT y DHFG, muestran potencial como agentes antidiabéticos alternativos. La sinergia observada sugiere que la combinación de estos compuestos podría mejorar la efectividad inhibitoria sobre enzimas claves implicadas en la diabetes tipo 2. A pesar de los resultados prometedores, se subraya la necesidad de realizar estudios adicionales para validar estos hallazgos en modelos in vivo y en estudios clínicos. Bibliografía 29 6. Bibliografía A Adisakwattana S, Ruengsamran T, Kampa P, Sompong W. In vitro inhibitory effects of plantbased foods and their combinations on intestinal α-glucosidase and pancreatic α-amylase. BMC Complementary Alternative Medicine. 2012;12(1). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1186/1472-6882-12-110 Allouche N, Fki I, Sayadi S. Toward a high yield recovery of antioxidants and purified hydroxytyrosol from Olive mill wastewaters. 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