Tolerancia a la salinidad de plantas de mandioca (Manihot esculenta Cranz): influencia de la micorriza

INSTITUTO DE RECURSOS UNIVERSIDAD DE SEVILLA NATURALES Y AGROBIOLOGIA DEPARTAMENTO DE CRISTALOGRAFIA, DE SEVILLA MINERALOGIA Y QUIMICA AGRICOLA TESIS DOCTORAL CARLOS LUIS CARRETERO MONTERO TOLERANCIA A LA SALINIDAD DE PLANTAS DE MANDIOCA (Manihot esculenta Cranz): INFLUENCIA DE LA MICORRIZA. 2 TOLERANCIA A LA SALINIDAD DE PLANTAS DE MANDIOCA (Manihot esculenta Cranz): INFLUENCIA DE LA MICORRIZA. Memoria presentada por el licenciado D. Carlos Luis Carretero Montero para optar al grado de Doctor en Biología. Sevilla, Octubre de 2002 DIRECTORES DR. ANTONIO TRONCOSO DE ARCE DR. MANUEL CANTOS BARRAGAN Profesor de Investigación del CSIC Titulado Superior del CSIC TUTORA Dra. CELIA ESPINO GONZALO 3 ANTONIO TRONCOSO DE ARCE y MANUEL CANTOS BARRAGAN, como Directores de la Tesis Doctoral presentada por Carlos Luis Carretero Montero y titulada “Tolerancia a la salinidad de plantas de mandioca (Manihot esculenta Cranz): influencia de la micorriza”, para aspirar al Grado de Doctor, INFORMAN: que la citada Tesis Doctoral se ha realizado utilizando la metodología adecuada y haciendo uso de las técnicas idóneas para cumplir los objetivos previstos. Y para que conste a los efectos de tramitación para la obtención del citado Grado de Doctor, se firma el presente informe. Sevilla, Octubre de 2002 Fdo. A. Troncoso de Arce Fdo. M. Cantos Barragán 4 AGRADECIMIENTOS El presente trabajo ha sido realizado en el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (CSIC), por lo que agradezco en primer lugar a la Dirección del Instituto y a todo su personal, y en especial a D. Jesús Prieto por su confianza. En segundo lugar a los doctores D Antonio Troncoso de Arce y D. Manuel Cantos Barragán, directores de este trabajo por el tiempo que me han dedicado, colaboración y enorme paciencia demostrada durante su desarrollo. A los doctores D. José Aijón Noguera y D. Juan Manuel Lara Pradas y a Maite Sánchez, del Dep. de Biología Celular de la Universidad de Salamanca por su valiosa e inestimable colaboración en el estudio histológico llevado a cabo en este trabajo. A la Dra. Carmen Mazuelos así como a Carmen Grande y Asunción Castro por su colaboración en la realización de los análisis químicos llevados a acabo en este trabajo. A las Dras. Rosario Azcón y Concepción Azcón, de la Estación Experimental del Zaidín de Granada (CSIC) por su inestimable ayuda en los aspectos bibliográficos así como por sus críticas y consejos en todo lo relacionado con las micorrizas. A Juana Liñán, Beatriz Cubero, Carmen Villalón, Jose Luis García, Rafael Zárate, Rafael Sarmiento y a todos los compañeros del departamento por su amistad y colaboración. Muy especialmente a Isa, Rafa e Isabel por haberme animado y aguantado durante la realización de este trabajo y por el tiempo que no les pude dedicar. 5 A mi familia 1 INDICE Pag. INDICE DE FIGURAS......................................................................................................I INDICE DE TABLAS.....................................................................................................IV ABREVIATURAS EMPLEADAS..............................................................................VIII I. ANTECEDENTES .............................................................................................4 II. INTRODUCCIÓN GENERAL .........................................................................5 III. OBJETIVOS.....................................................................................25 IV. PROPAGACIÓN IN VITRO IV.1. INTRODUCCIÓN......................................................................................26 IV.2. MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................29 IV.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................31 IV.3.1. Influencia de la presencia de auxina (ANA) en el medio sobre la radicación y el desarrollo del explanto de mandioca in vitro................................................................................................................31 IV.3.1.1. Tanto por ciento de radicación......................................................31 IV.3.1.2. Número de raíces por planta..........................................................31 IV.3.1.3. Longitud media de raíces...............................................................32 IV.3.1.4 Longitud del tallo...........................................................................32 IV.3.1.5. Número de yemas..........................................................................32 IV.3.2. Influencia de la citoquinina en el desarrollo in vitro del explanto de mandioca....................................................................................33 IV.3.3. Prueba de adaptación a condiciones "in vivo".............................35 V. INFLUENCIA DE LA SALINIDAD (NaCl) EN EL DESARROLLO DE PLANTAS DE MANDIOCA (Manihot esculenta Cranz) IN VITRO. V.1. INTRODUCCIÓN.......................................................................................38 V.2. MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................41 V.2.1. Determinaciones analíticas............................................................42 V.3. RESULTADOS............................................................................................44 V.3.1. Influencia de la salinidad sobre la supervivencia del explanto....................................................................................................44 V.3.2. Desarrollo de los explantos supervivientes...................................46 V.3.3. Influencia de la concentración de NaCl sobre el contenido de nutrientes en plantas de mandioca cultivadas in vitro.........................54 V.3.3.1. Nitrógeno .................................................................................54 2 V.3.3.2. Fósforo ....................................................................................56 V.3.3.3. Potasio .....................................................................................56 V.3.3.4. Calcio ......................................................................................59 V.3.3.5. Magnesio .................................................................................59 V.3.3.6. Sodio .......................................................................................59 V.3.3.7. Cloro ........................................................................................61 V.3.3.8. Cobre........................................................................................61 V.3.3.9. Hierro ......................................................................................61 V.3.3.10. Manganeso ..............................................................................61 V.3.3.11. Cinc .........................................................................................63 V.4. DISCUSIÓN................................................................................................63 VI. TOLERANCIA A LA SALINIDAD EN CONDICIONES DE INVERNADERO. VI.1. INTRODUCCIÓN......................................................................................65 VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................67 VI.3. RESULTADOS...........................................................................................69 VI.3.1. Efectos sobre el sustrato..............................................................69 VI.3.1.1.Caracterísicas de las soluciones nutritivas empleadas en los tratamientos......................................................69 VI.3.1.2. Influencia de los tratamientos salinos sobre el sustrato....................................................................................70 VI.3. 2. Tolerancia de las plantas de mandioca a la salinidad del medio..................................................................................................72 VI.3.2.1. Supervivencia..........................................................72 VI.3.2.2. Desarrollo de plantas supervivientes.......................75 VI.3.2.3. Producción relativa.................................................79 VI.3.2.4. Influencia de la concentración de NaCl sobre el contenido de nutrientes en plantas de mandioca cultivadas ex vitro.............................................81 VI.3.2.4.1. Nitrógeno ......................................................81 VI.3.2.4.2. Fósforo ..........................................................81 VI.3.2.4.3. Potasio ...........................................................81 VI.3.2.4.4. Calcio ............................................................81 VI.3.2.4.5. Magnesio .......................................................84 3 VI.3.2.4.6. Sodio .............................................................84 VI.3.2.4.7. Cloro ..............................................................84 VI.3.2.4.8. Micronutrientes .............................................84 VI.4. DISCUSIÓN...............................................................................................88 VII. EFECTO DE LA MICORRIZA VII.1. INTRODUCCIÓN....................................................................................90 VII.2. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................91 VII.3. RESULTADOS.........................................................................................93 VII.3.1. Efecto de la micorriza en la adaptación y aclimatación de los tres clones de mandioca.................................................................93 VII.3.2. Influencia de la micorriza Glomus fasciculatum sobre la supervivencia de plantas de mandioca sometidas a tratamientos salinos..................................................................................95 VII.3.3. Influencia de la micorriza Glomus fasciculatum sobre el desarrollo de plantas de mandioca sometidas a tratamientos salinos.......................................................................................................97 VII.4 DISCUSIÓN...................................................................................99 VIII. DESARROLLO IN VITRO Y EX VITRO DE EXPLANTOS-PLANTAS DEL CLON SOM-1 DE MANDIOCA, PROCEDENTES DE PLANTAS MICORRIZADAS Y NO MICORRIZADAS. VIII.1. INTRODUCCIÓN......................................................................... .......107 VIII.2. MATERIALES Y MÉTODOS..............................................................108 VIII.3. RESULTADOS......................................................................................112 VIII.4. DISCUSIÓN..........................................................................................126 IX. DISCUSIÓN GENERAL…............................................................130 X.CONCLUSIONES.................................................................................135 XI. BIBLIOGRAFIA.............................................................................................137 I ÍNDICE DE FIGURAS Pag. fig. 1. Distribución mundial de los suelos afectados por sales .......................................6 fig. 2. Clasificación de las Glomales .............................................................................11 fig. 3. Planta de mandioca con tubérculos.......................................................................15 fig. 4. Tendencia de la producción de mandioca en el mundo........................................17 fig. 5. Distribución geográfica de la mandioca en el mundo...........................................17 fig. 6. Biomasa relativa (% control) en peso fresco y seco de plantas de mandioca tras 80 días de cultivo in vitro en medio salinizado .............................................51 fig 7. Ajuste de la biomasa relativa del peso fresco y seco mediante funciones exponenciales..........................................................................................................51 fig. 8. Longitud media del tallo tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl...............................................................................................................52 fig. 9. Número de raíces desarrolladas tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl...............................................................................................52 fig. 10. Número de yemas desarrolladas tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl.............................................................................................52 fig. 11. Número de hojas desarrolladas tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl.............................................................................................53 fig. 12. Temperaturas máximas, mínimas y medias registradas en el invernadero durante el desarrollo de la prueba.......................................................................73 fig 13. Longitud del tallo, número de hojas y número de yemas observadas en las plantas durante el desarrollo de la prueba...........................................................79 fig 14. Peso fresco relativo en % tomando como referencia el obtenido en el tratamiento control en plantas de los clones SOM, 05 y 50 (en el clon SOM-1 la medida fue tomada a los 45 días y en los clones 05 y 50 a los 35 días para el tratamiento de 8 gl -1 ..........................................................................80 fig 15. Peso seco relativo en % tomando como referencia el obtenido en el tratamiento control en plantas de los clones SOM, 05 y 50 (en el clon SOM-1 la medida fue tomada a los 45 días y en los clones 05 y 50 a los 35 días para el tratamiento de 8 gl -1 ..........................................................................80 VIII ABREVIATURAS EMPLEADAS EPS = exchangeable sodium percentage SAR = sodium adsorption ratio MVA = micorriza vesículo arbuscular cm = centímetro ºC = grados Celsius atm = atmósfera µ = micra l = litro ANA = Acido α-Naphtalen acético BA = 6- benzilaminopurina GA = ácido giberélico µM = microMolar GA 3 = ácido giberélico mgl -1 =miligramo por litro 2iP = 6-(γ,γ-dimethylallylamino) purina TDZ = (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea) M = Molar 2,4-D = ácido 2,4- diclorofenoxiacético AAB = ácido abcísico gl -1 = gramos por litro ml = mililitro µE m -2 s -1 = micro Einstein por metro cuadrado segundo w = vatio L.S.D = mínima diferencia significativa MS = medio de Murashige y Skoog. mm = milímetro dS m -1 =deciSiemens por metro nm = nanómetro χ 2 = Chi cuadrado ppm = partes por millón CE = Conductividad Eléctrica. g = gramo U.S.S.L. = United States Salinity Laboratory cm 3 = centímetro cúbico Kg -1 = kilogramo X = aumento en microscopía h = hora G.f. = Glomus fasciculatum ∅ = diámetro min = minuto s = segundo C 50 = Concentración 50% 4 I. ANTECEDENTES El presente estudio tiene su origen en el proyecto titulado “Amélioration des cultivars africains de manioc” financiado por la CEE con el número de contrato TS2A- 0239-M (CD). Este proyecto estuvo coordinado por Joseph Mabanza del Laboratoire d´Amélioration des plantes et de Culture in vitro (LAP-CV)/DGRST de Congo Brazzaville. En el proyecto participaron las siguientes instituciones: Gabón : Projet-FAO-CIAM Francia: ORSTON Génétique Montpellier. Université Paris Sud (Laboratoire de Morphogénèse Végétale Expérimentale). Italia: Istituto sulla Propagazione delle Specie Legnose di Firense (CNR). España: - Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (CSIC). - Estación Experimental del Zaidín de Granada (CSIC). 5 II. INTRODUCCIÓN GENERAL La necesidad de producir mayor cantidad de alimentos y de manera más constante, obliga a pensar en la utilización de tierras marginales que se caracterizan, a veces, por presentar suelos y aguas con alto grado de salinidad. La salinidad en el suelo o en el agua representa una de las situaciones de estrés para las plantas, cuya importancia en la agricultura va en aumento. Por ello, resulta muy interesante disponer de plantas cultivadas tolerantes a la salinidad y así mantener su potencial productivo. En general, un suelo salino se forma cuando la entrada de sales es mayor que su salida, lo que depende del clima, geomorfología, relieve e hidrología (Ponnamperuma, 1984). El exceso de sales en un suelo puede obedecer a la presencia de rocas salinas, como ocurre en las regiones semiáridas y áridas del mundo (Greenway y Munns, 1980; Tanji, 1990), o como se produce en áreas costeras tanto áridas como húmedas, por la intrusión en superficie o en el subsuelo del agua del mar. Otra fuente de salinización puede ser el propio riego. A este proceso se le denomina salinización secundaria y se produce al regar con agua salina en condiciones de drenaje deficiente. Un tercio de los regadíos en el mundo se ven afectados por sales. En general, las hectáreas afectadas por la salinidad en el mundo (fig. 1) se estiman en mil millones (Dudal y Purnell, 1986). El principal efecto de la salinidad sobre los cultivos es el descenso de su rendimiento y calidad, que se traduce en pérdidas económicas a la vez que convierte las tierras en improductivas, con su consiguiente abandono y posterior desertización (Royo y Aragües, 1989). Las acciones de la salinidad ejerce sobre las plantas pueden ser estudiadas desde tres aspectos fundamentales (Pasternak, 1987): - Acciones sobre las relaciones energéticas - Acciones sobre las relaciones hídricas. - Acciones sobre las relaciones nutricionales. La adaptación de las plantas a la salinidad puede dar origen a una disminución de las reservas energéticas necesarias para el crecimiento. Estas pérdidas energéticas pueden deberse a la desviación de los fotosintatos necesarios para el crecimiento hacia 6 funciones osmorreguladoras o a la energía consumida en el transporte iónico (Pasternak, 1987). fig. 1. Distribución mundial de los suelos afectados por sales (según Szabolcs 1985). El incremento de la salinidad en el terreno provoca un descenso del potencial hídrico de la solución del suelo. Este descenso puede inducir una reducción de potencial hídrico en la hoja, que a su vez origina una reducción de la turgencia y expansión celular y por tanto una disminución del crecimiento de la planta. Esta disminución del crecimiento puede minimizarse total o parcialmente por medio del denominado ajuste osmótico (Gale et al., 1967; Termaat et al., 1985) que permite compensar en mayor o menor medida la reducción del potencial osmótico de la solución del suelo. Tras este periodo de ajuste osmótico, la turgencia y expansión celular pueden retornar a valores iniciales siempre que las propiedades de transmisión de agua en la planta no hayan sido afectadas. Las acciones que la salinidad del medio ejerce sobre las relaciones nutricionales en las plantas, vienen determinadas por dos aspectos relacionados. Por un lado, la acumulación excesiva de iones dominantes en la solución del suelo, como Cl - o Na + , pudiendo alcanzar niveles tóxicos (Bernstein y Hayward, 1958; Iyengar et al.,1977; Greenway y Munns, 1980; Ashraf et al., 1986). Por otro, los desequilibrios nutricionales 7 que ocasiona la acumulación preferente de unos determinados iones frente al resto (Grattan y Grieve, 1992). Así, el descenso en la concentración de nitrógeno con la salinidad del suelo (Cram, 1973; Deane-Drummond y Glass, 1982) parece estar relacionado con el hecho de que el aumento de la captación y acumulación de Cl - en la planta reduce la concentración de NO 3 – (Aslam et al., 1984; Ward et al., 1986; Klobus et al., 1988). Si bien se ha descrito que el aumento de NO 3 – en el medio disminuye la captación y acumulación de Cl - (Berstein et al., 1974; Kafkafi et al., 1982; Feigin et al., 1987; Martínez y Cerdá, 1989). La disponibilidad de fósforo para la planta disminuye en un suelo salino, ya que la concentración de P en el suelo está estrechamente controlada por procesos de desorpción y por la solubilidad de los minerales de Ca-P (Grattan y Grieve 1992), la cual desciende conforme aumenta la salinidad (Sharpley et al., 1992). Si bien la salinidad puede aumentar las necesidades de P para ciertas plantas (Award et al., 1990), se ha podido comprobar que la adición de fósforo al suelo tiene efectos diversos sobre la planta que van desde el aumento, no afectación o incluso la disminución de la tolerancia a la salinidad (Champagnol, 1979). Los iones K + y Ca ++ están íntimamente relacionados con la tolerancia a la salinidad en las plantas y con la presencia de iones Na + en el medio. La concentración de K + en la solución del suelo suele ser baja debido a que este elemento es rápidamente adsorbido por la fracción mineral de éste. Sin embargo, la alta afinidad de las células de la raíz por el potasio frente al sodio, permiten a la planta satisfacer sus necesidades. Este grado de afinidad por el ión K + frente al ión Na + en suelos salinos varía con la especie y el cultivar. El estatus de potasio de la planta está relacionado con la relación Na + /K + en el extracto de pasta saturada disminuyendo cuando la EPS de la fase cambiable aumenta. Así, la relación K + /Na + en la planta ha sido utilizada en algunos cultivos como indicador de su tolerancia (Rathert, 1982; Kafkafi, 1984). Por otra parte, existen evidencias de que algunas especies pueden sustituir parte del potasio por sodio, como en algunas glicofitas, sin que se observe merma en su crecimiento. En este sentido, Marschner (1986), clasifica algunas especies cultivadas en varios grupos donde se incluyen desde especies como zanahoria (Daucus carota L.) o nabo (Brassica rapa L.), que pueden sustituir una alta proporción de potasio por sodio, hasta especies como lechuga (Lactuca sativa L.) o maíz (Zea mays L.) donde no se ha observado sustitución alguna sin que se vea afectado su crecimiento. 8 El Na + también interfiere con los iones Ca ++ de la solución del suelo, pudiendo impedir su entrada en la planta (Lynch y Laüchli, 1985), y desplazando al Ca ++ asociado a la membrana, dando lugar a un aumento de la permeabilidad y por tanto, disminuyendo la selectividad K + /Na + (Cramer et al., 1987). Las interacciones entre los iones Na + y Ca ++ desembocan en una serie de desórdenes fisiológicos que afectan al crecimiento y funcionamiento de la raíz y que guardan una estrecha relación con la proporción Na + /Ca ++ (Kent y Laüchli 1985; Mass y Grieve 1987; Cramer et al., 1987; Grieve y Mass, 1988). Estas variaciones descritas para el ión Ca ++ , afectan al ión Mg ++ dado su carácter antagonista. Por último, la solubilidad de los micronutrientes en el sustrato se ve favorecida por la salinidad (Sharpley et al., 1992). Sin embargo, su concentración en la planta va a depender del tipo de planta, tejido, salinidad, concentración de micronutrientes y de las condiciones ambientales en las que se desarrolle. Por ello, la capacidad de respuesta de las plantas a las acciones de la salinidad sobre los aspectos de energía, hidratación y nutrición conduce al concepto de tolerancia. La tolerancia a la salinidad fue definida por Bernstein (1963) como el grado con el que la planta ajusta su potencial osmótico, con un sacrificio mínimo de su crecimiento o, por Shannon (1979), como la capacidad de una planta para soportar los efectos de una solución salina concentrada en la zona radicular. Grado y capacidad son pues dos términos que implican una cuantificación o medida de la tolerancia, además del establecimiento de un criterio para realizarla. Mass (1986), considera tres criterios para analizar la tolerancia de las plantas a la salinidad: supervivencia, producción o biomasa absoluta y producción o biomasa relativa. Los criterios de supervivencia y de producción absoluta, si bien tienen interés agronómico y el de producción absoluta un interés económico añadido, limita la posibilidad de comparación de diferentes cultivos. El criterio de la producción relativa resulta más adecuado a la hora de realizar comparaciones tanto entre cultivos como entre cultivares (Nieman y Shannon, 1977). En este criterio, se relativizan las producciones obtenidas por los cultivos al comparar en diferentes tratamientos de salinidad con las producciones obtenidas por los mismos en ausencia de sal en el sustrato. La relación entre los valores relativos de producción así obtenidos y la conductividad eléctrica respectiva del sustrato queda representada por el ajuste de una función matemática (Mass y Hoffman, 1977; van Genuchten, 1983) cuyo estudio permite establecer el grado de tolerancia de los cultivos en consideración. 9 Los métodos que se siguen para estudiar la tolerancia se pueden clasificar en dos grupos: ensayos de campo y ensayos de laboratorio. Los ensayos de campo se realizan, bien en parcelas salinas naturales o en parcelas salinizadas artificialmente (Royo et al., 1987). En ambos casos, se presentan dificultades como son la persistencia de la variabilidad espacio-temporal de la salinidad, en el primer caso (Shannon, 1984) y el reducido número de niveles salinos e ensayar en el segundo, dado el coste que supondría aumentarlos. Los ensayos de laboratorio abarcan desde los practicados en invernadero en una gran diversidad de sustratos y contenedores, hasta técnicas más sofisticadas como el cultivo in vitro de órganos o tejidos en medio salinizado (Dudeck et al., 1986; Croughan et al., 1978). Las plantas se clasifican, según su comportamiento ante la sal en halófitas y glicófitas. La variación de comportamiento es muy amplia: desde las glicófitas más sensibles, que no crecen normalmente ni en contenidos muy bajos de cloruro sódico, hasta las halófitas más resistentes como Rhizophora mangle, que sólo sobrevive en salinidades próximas a la del agua del mar. Los mecanismos disponibles por las plantas mediante los cuales llegan a presentar diferentes grados de tolerancia persiguen dos objetivos fundamentales: la protección contra la pérdida de agua y la protección contra el efecto tóxico de los iones (Pasternak, 1987). Para disminuir la pérdida de agua, algunas plantas disminuyen el número de estomas por unidad de superficie, facilitan el cierre de los estomas, aumentan el espesor de la cutícula o disminuyen la relación parte aérea/raíz (Papadopoulus y Rendig, 1983). Otras plantas recurren al denominado ajuste osmótico, que en algunas halófitas consiste en acumular NaCl en hojas y el aislamiento en vacuolas. (Läuchli y Epstein, 1984) mientras que en glicófitas está mas relacionado con la sísntesis de sustancias orgánicas como prolina o glicinebetaina (Greenway y Muns, 1980). Este ajuste osmótico tiene como finalidad disminuir su potencial osmótico para poder mantener el flujo de agua del suelo a la raíz. Los mecanismos de protección contra la toxicidad iónica se basan en la absorción y transporte selectivo de iones, compartimentalización de electrolitos, traslocación y excreción (Cram, 1983). También, en la concentración de iones salinos en órganos no especializados como raíces, hojas viejas, traqueidas o peciólos con el fin de retrasar el daño a otras partes más sensibles en crecimiento.(Royo y Aragües, 1989). 10 Estas características son desarrolladas por diferentes tipos de plantas que presentan una cierta tolerancia a la salinidad del medio. Sin embargo, para paliar el efecto de la salinidad en los cultivos existen otros procedimientos. Dichos procedimientos siguen dos caminos: el manejo agronómico y la mejora genética. El manejo agronómico está dirigido principalmente al control de la salinidad en la zona radicular mediante la dosificación y espaciamiento de los riegos; a minimizar los daños en las plantas mediante el empleo de abonos (Mass y Hoffman, 1977) y al empleo de patrones tolerantes (Pasternak, 1987), muy relacionado con los procesos de mejora genética. La mejora genética de la tolerancia a la salinidad puede ser abordada por cualquiera de los procedimientos de selección empleados en mejora clásica, aunque persiste el problema de la escasez de conocimientos sobre marcadores fisiológicos o bioquímicos (Jana, 1987). A este problema hay que añadir la complejidad que entraña la búsqueda, debido a la ya mencionada variabilidad espacio-temporal de la salinidad y a la falta de conocimientos profundos de los mecanismos de tolerancia, además del coste que supone las operaciones de cribado a lo largo del ciclo de cultivo (Epstein y Rains, 1987). El hecho de que la tolerancia de un cultivar varíe con el ciclo de cultivo y con las condiciones ambientales impide además el desarrollo de un protocolo universalmente aceptado para este tipo de ensayos (Royo y Aragües, 1989). No obstante, la selección y mejora de plantas por su tolerancia a la sal es de máximo interés. Junto a las estrategias antes mencionadas y desarrolladas por el hombre para paliar el efecto de la salinidad en los cultivos, existe otra, más antigua y extendida entre los seres vivos y desarrollada por la propia naturaleza, que consiste en el establecimiento de asociaciones entre individuos para mejorar su adaptación al medio, es la denominada simbiosis. En el reino vegetal, además de las simbiosis alga-hongo (líquenes) o planta vascular-bacteria (Leguminosas-Rhizobium) existen otras asociaciones entre plantas vasculares y hongos denominadas micorrizas. Las micorrizas son simbiosis de tipo mutualista entre ciertos hongos del suelo y las raíces de algunas plantas superiores. En esta simbiosis la planta suministra al hongo los sustratos carbonados procedentes de la fotosíntesis, mientras que el hongo facilita la adquisición de los elementos minerales del suelo (Harley y Smith, 1983). El origen de las micorrizas parece tan antiguo como el de las propias plantas. La presencia de estructuras fúngicas en los primeros registros fósiles de vegetales 11 conocidos, que vivieron hace 370 millones de años (Nicolson, 1975; Stubblefield et al., 1987), apoyaría la hipótesis de que las plantas llegaron a colonizar la superficie terrestre, a partir de un medio acuoso, gracias a que sus antecesores se asociaron con ciertos hongos que les ayudaron a superar los problemas de desecación y captación de nutrientes que implicaban el paso de un ambiente acuático a uno terrestre (Pirozinsky y Malloch, 1975). Los hongos que forman las micorrizas, son los hongos inferiores pertenecientes a la clase Zigomicotina, orden Endogonales, familia Endogonaceae. Actualmente se distinguen siete tipos de micorrizas (Brundrett, 2002) de los cuales las micorrizas vesículo-arbusculares (MVA) son las más extendidas entre las plantas, mientras que las ectomicorrizas sólo se producen en ciertas familias de gimnospermas y dicotiledóneas. Los otros tipos son específicos de alguna familia de plantas. Las MVA están muy generalizadas encontrándose en alrededor del 80% de las especies vegetales. Todos los hongos MVA están clasificados en los Zigomicetes, orden Glomales y en los géneros: Glomus, Acaulospora, Scutellospora, Gigaspora, Paraglomus y Archaeospora. (Morton y Redecker, 2001). fig. 2. Clasificación de las Glomales (IVAM’s, 2002). 12 Estos hongos son considerados como los más primitivos debido a su esporas simples, ausencia de reproducción sexual y porque existen muy pocas especies asociadas a una gran diversidad de plantas (Morton, 1990). Este tipo de hongos son incapaces de crecer en ausencia de planta y tampoco ha sido posible cultivarlos en condiciones axénicas. La asociación micorrícica juega un papel esencial en los ciclos de materia y energía de ecosistemas con suelos generalmente pobres en agua y elementos minerales nutritivos, principalmente nitrógeno y fósforo (Read, 1991). La formación de micorrizas MVA, provoca normalmente una considerable estimulación del ritmo de crecimiento de la planta (Harley y Smith, 1983), que se traduce en un un incremento en la producción de biomasa. Este efecto es mas importante en suelos de baja fertilidad o desequilibrados nutritivamente, especialmente cuando el contenido en fósforo asimilable es bajo (Abbott y Robson, 1984). Una mayor relación parte aérea -raíz en términos de peso seco es característico en plantas micorrizadas (Berta et al., 1990). En general el crecimiento de las plantas micorrizadas va a depender del balance entre el efecto promotor debido al aporte de nutrientes y el efecto depresor ejercido por el drenaje de compuestos carbonados. Las plantas micorrizadas desvían entre un 10 y un 20 % de la fotosíntesis neta, que es requerida para la formación, mantenimiento y funcionamiento de las estructuras micorrícicas (Jakobsen y Rosendahl, 1990). El principal efecto de la infección de la raíz con micorriza está causado por el incremento en la absorción de fósforo (Bolan et al., 1987). Típicamente en plantas micorrizadas la concentración de P por unidad de peso seco es mayor que en las plantas no micorrizadas y por tanto una menor eficiencia en la utilización de P (Koide, 1991). Aunque puede decirse que las MVA mejoran las relaciones hídricas en plantas, induciendo un aumento de la conductividad hidráulica, no parece ser un efecto directo de la infección con estos hongos sino más bien una consecuencia de un mejor estado nutricional y especialmente en fósforo (Barea, 1991). En diversos experimentos se han puesto de manifiesto incrementos en la concentración de nitrógeno en plantas como consecuencia de la formación de MVA. Los hongos MVA son capaces de utilizar NH 4+ y NO 3- (Butler, 1987) y de metabolizar NH 4+ vía glutamino sintetasa (Smith et al., 1985). Con respecto a otros nutrientes, se ha podido constatar una menor concentración de K + , Ca ++ y Mg ++ . Con respecto a los micronutrientes, se ha puesto de manifiesto que en plantas micorrizadas la concentración de cinc y cobre son superiores a la de las plantas no micorrizadas (Lambert y Weidensaul, 1991). El descenso en la concentración 19 axilares. La técnica de cultivo tejidos vegetales “in vitro” consiste en el cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles y aisladas (dentro de un contenedor normalmente de vidrio) de parte o la totalidad de una planta. Se basa en los principios de autonomía y totipotencia celular de la célula vegetal. Se sabe que una de las rutas donde las células vegetales en cultivo pueden manifestar su totipotencia es la organogénesis, que conduce a la diferenciación de meristemos caulinares y/o radiculares (que originan tallos o raíces adventicias, respectivamente) a partir de órganos de la planta como las yemas apicales o axilares . La organogénesis implica la formación de estructuras monopolares que establecen conexión vascular con el tejido del que derivan. La primera condición para el éxito de un cultivo "in vitro" es la asepsia, ya que los medios en que se desarrolla el tejido vegetal son muy favorables para la proliferación de bacterias, hongos y otros contaminantes. Se crea, por consiguiente, la necesidad de la eliminación total de microorganismos, tanto en el instrumental de trabajo como en el material vegetal. Los principales métodos de eliminación de las fuentes de infección son: - Uso de productos químicos, como hipoclorito de sodio (lejía comercial), hipoclorito de calcio, mercurobutol, bicloruro de mercurio, productos bactericidas y fungicidas, etanol a 70-80°C y agua oxigenada, que destruyen microorganismos. - El calor, tanto producido por la llama de un mechero Bunsen como el calor húmedo a presión en autoclave (120°C y 1 atm.) durante determinados tiempos de esterilización que dependen del volumen de material a esterilizar. - Utilización de sistemas de filtración de aire forzado tales como filtros especiales que no dejan pasar partículas cuyo diámetro sea superior a 0.22 µ (cámara de flujo laminar). El flujo de este aire origina una presión que impide el acceso de aire contaminado desde el exterior al interior de la cabina. La esterilización del material vegetal debe realizarse de tal forma que los productos empleados no dañen los tejidos. Consecuentemente, hay que respetar todo lo posible los tiempos de esterilización. Las dificultades aparecen cuando hay presencia de heridas, ceras, tejido de naturaleza rugosa, presencia de pelos (tricomas), etc. 20 Los factores físicos ambientales determinantes en el cultivo de tejidos "in vitro" son las necesidades de luz, la temperatura y el medio de cultivo. Las primeras se pueden descomponer en tres parámetros: la intensidad, la duración de la iluminación y la calidad de la luz. La intensidad (potencia luminosa por unidad de superficie) viene expresada en W/m 2 , y habitualmente, en las salas de cultivo de tejido, varía de 23.25 a116.27 µE m -2 s -1 (1000 a 5000 lux) con una utilización muy corriente de 46.51 a 69.76 µE m -2 s -1 . Se sabe que una baja intensidad favorece la formación de callo, mientras que una intensidad alta fortifica y desarrolla los tallos. En cuanto a la duración de la iluminación, en la práctica la mayor parte de los cultivos "in vitro" se desarrollan con un fotoperíodo de 16 a 18 horas/día. Sin embargo, según algunos autores, parece que en la mayoría de los casos el factor más importante es la cantidad de energía luminosa recibida (intensidad por fotoperíodo). La calidad de la luz fue estudiada por Seibert et al., (1975) sobre tallo de tabaco; la luz azul (banda espectral centrada alrededor de 419 nm) induce la formación de yemas y la luz roja (660 nm) induce la rizogénesis. La temperatura de las cámaras de cultivo de tejidos vegetales está habitualmente regulada de forma constante a 24 –26 °C. La temperatura real del tejido en el interior de los recipientes puede ser superior de 2 a 3 °C a la de la cámara, debido a la radiación lumínica. Se emplea una temperatura baja para la formación de yemas florales, ruptura de dormancia y germinación de semillas, una temperatura muy baja para detener el crecimiento del cultivo (almacenamiento en frío), y una temperatura muy elevada, 37-38 °C, para tratamientos de termoterapia cuyo fin es la eliminación de virus en plantas afectadas. También se aplica en ocasiones una alternancia de temperatura, (26 °C/día y 15 °C/noche). Un medio de cultivo es una solución acuosa que contiene una parte mineral, que aporta a la misma N, P, K, Ca, S y Mg, Fe, Zn, B, Mn, Cu, I, Co, Ni, Al y Mo. Además, se incorpora una parte orgánica (azúcares, vitaminas, aminoácidos, fitohormonas o reguladores de crecimiento). Esta solución acuosa está solidificada en la mayor parte de los casos por agar-agar. Los minerales presentes en el medio de cultivo pueden usarse por los tejidos y células de las plantas como ladrillos para la síntesis de moléculas orgánicas o como 21 catalizadores en reacciones enzimáticas. Los iones de las sales disueltas juegan un importante papel en el transporte de moléculas por la planta, en la regulación osmótica y en el mantenimiento del potencial electroquímico de la planta. Las composiciones minerales más usadas se conocen con el nombre de sus autores, así, de las primeras empleadas fueron Knop (1865) y White (1943). Para el cultivo de callo las más usadas son Gamborg (1968), Gautheret (1959), Heller (1953). Para cultivo de raíces White (1963). Para cultivo de órganos Gamborg (1968) y Morel (1975). No obstante, el de uso más generalizado es el Murashige y Skoog (1962), rico en amonio, fósforo y azufre. Aunque las plántulas cultivadas "in vitro" son verdes y poseen clorofila, su función fotosintética está muy reducida, ya que aún no se han formado los enzimas necesarios. Por ello, como fuente de carbono se usa hidratos de carbono, generalmente sacarosa (1-3%). Trabajos realizados desde 1987 (Thompson and Thorpe, 1987) demuestran que la fuente hidrocarbonada del medio de cultivo no sólo desempeña una función nutritiva, sino que también ejerce un efecto importante sobre la morfogénesis a través de sus propiedades osmóticas. Los azúcares secundarios (mio-inositol) mejoran la división celular y participan en la formación de la pared celular. Aunque el nitrato da lugar a aminas en las células, en algunos casos se deben adicionar aminoacidos, glicina o cisteína, como nitrógeno reducido. Son fundamentales las vitaminas del grupo B. Así la B1 (tiamina), mantiene los ápices caulinares y la B6 o piridoxina, es importante en el metabolismo de los aminoácidos. La biotina es un cofactor de la actividad auxínica. El pantotenato de Ca es fundamental en la respiración. La vitamina C ó ácido ascórbico es un antioxidante. También se incluyen, a veces, el ácido nicotínico o vitamina PP y el ácido fólico. Los reguladores de crecimiento son los compuestos orgánicos que, en pequeñas cantidades, inhiben, promueven o modifican algún proceso fisiológico que a su vez origina la inhibición o estímulo del crecimiento y la organogénesis. Hasta el momento, la hipótesis mas aceptada para explicar el modo de acción de los reguladores del crecimiento en la organogénesis postula que dicho proceso está regulado por cambios en los niveles hormonales endógenos de auxinas y citoquininas, Esta hipótesis está basada en los trabajos de Skoog y Miller en 1957 que demuestran que la concentración relativa de auxinas y citoquininas exógenas regula la formación de órganos en cultivos de callo 22 de médula de tabaco. De acuerdo con este modelo, la diferenciación de yemas vegetativas (caulogénesis) es promovida por balances auxina/citoquinina favorables a las citoquininas, mientras que los balances favorables a las auxinas inducen la formación de raíces (rizogénesis). La manipulación de las concentraciones de auxinas y citoquininas en los medios de cultivo permite controlar la organogénesis in vitro de muchas especies vegetales, constituyendo además la base de gran parte de los protocolos de propagación vegetativa in vitro (micropropagación) existentes en la actualidad. La micropropagación es una de las aplicaciones de la técnica de cultivo de vegetales "in vitro" de mayor interés, vía organogénesis, ya que ofrece las siguientes posibilidades: - Proporciona un alto factor de multiplicación por lo que permite una gran rapidez de propagación de plantas idénticas a la de partida (madre). Este aspecto es muy válido, en particular, para la selección clonal. - Ayuda a la propagación de variedades con dificultades de adaptación o problemáticas para propagarse por otros sistemas mas tradicionales. -Facilita la constitución de colecciones de plantas madres, al permitir el almacenamiento de grandes cantidades de miniplantas (que se utilizarán como pies madres) sobre pequeñas superficies. Asimismo, facilita el intercambio de este germoplasma entre países. - Contribuye a salvar especies en vías de desaparición. -Permite la propagación durante todo el año, sin estar condicionado por la estación climatológica. La micropropagación consiste en tomar de la planta madre un órgano o un trozo de éste, lo que se denomina "explanto", y bajo condiciones asépticas, someterlo a sucesivos cultivos "in vitro" hasta obtener nuevas plantas semejantes a la inicial. Estos cultivos 23 sucesivos constituyen las diferentes fases de la micropropagacion que se pueden concretar como sigue: Fase 0.- Preparación del material madre. La planta original, que condiciona todo el cultivo ulterior, debe presentar las mejores características agronómicas y sanitarias, para contar con un material de partida en las mejores condiciones posibles. En general, se comportan mejor los explantos si proceden de plantas madres cultivadas en invernadero. Fase 1.- Establecimiento del cultivo aséptico. El objetivo de esta fase es obtener un cultivo libre de todo microorganismo (hongos, bacterias, etc.) procedente de la especie que se quiere multiplicar. Por ello, esta etapa se considera satisfactoria si un número adecuado de explantos sobrevive sin contaminación y se mantiene un crecimiento rápido. Fase 2.- Multiplicación propiamente dicha. El fin de esta etapa es llevar a cabo la multiplicación de órganos y estructuras que son capaces de dar lugar a nuevas plantas completas e intactas. Los brotes producidos en esta etapa pueden considerarse como propágulos en el sentido de su uso para propagar una nueva planta o cultivarse de nuevo con el fin de incrementar su número. La mayoría de las investigaciones realizadas en esta fase de la micropropagación, han centrado la atención en establecer el nivel óptimo de sales orgánicas, vitaminas, reguladores de crecimiento y de otros aspectos químicos para el desarrollo óptimo de una determinada especie o variedad en una fase específica del proceso. También, recientemente se ha demostrado que en cultivos en medios sólidos o semisólidos la concentración de agar en el medio influye en el nivel de proliferación ciertas especies. Otro parámetro físico que influye en la proliferación es el tamaño del contenedor del medio. Fase 3.- Preparación de los propágulos o plántulas para su transferencia a tierra. Un método de micropropagación eficaz debe mantener un alto porcentaje de plántulas vivas después de la salida del recipiente de cultivo. La fase 3 tiene por objeto preparar las plántulas para este fin, ya que concluida la fase 2, las plantas, por lo general, son pequeñas e incapaces de soportar las condiciones en suelo. Por ello, se puede subdivir esta tercera etapa en: 3.a) elongación de las plántulas formadas en la fase 2 y 3.b) enraizamiento "in 24 vitro" o "extra vitrum" de las plántulas crecidas en 3.a. En esta fase hay que tener en cuenta el balance auxinas-citoquininas. Fase 4.- Transferencia al ambiente natural. Si esta fase no se realiza cuidadosamente pueden producirse muchas pérdidas debido, por un lado, a que las jóvenes raíces formadas en tubo tienen una epidermis no suberificada, por otro a que las plantas cultivadas asépticamente, que crecen en alta humedad relativa (HR), a menudo sufren estrés hídrico cuando se exponen a baja HR. Este estrés hídrico es la causa más grave de pérdidas en el proceso de adaptación de plantas cultivadas "in vitro" a condiciones de invernadero. Las hojas de las plantas cultivadas en un medio controlado "in vitro" difieren anatómicamente de las de invernadero, ya que tienen menos ceras epicuticulares, células en empalizada más pequeñas y más aire intercelular en las células del mesófilo. Algunos autores sugieren que la baja respuesta del estoma también contribuye a este estrés. Por ello, en esta fase se deben situar las plantas en una atmósfera con una humedad relativa máxima durante un período de una a tres semanas a 15-25°C cuidando que en estas condiciones, no se desarrollen enfermedades de tipo fúngico. Un método poco costoso y práctico (Cantos et al., 1993) puede llevarse a cabo cuando las plantas hayan alcanzado el desarrollo adecuado, trasladarlas a vasos de plástico de 330 cc de capacidad con substrato de turba. El conjunto vaso-planta, se cubre con una bolsa de polietileno transparente y se pulveriza con agua para crear un ambiente de elevada humedad interna. A intervalos de dos días durante 10 días, se perfora paulatinamente la cubierta plástica y bajo frecuentes controles, a fin de comprobar que la planta no sufra deshidratación, se retira la bolsa para llegar al contacto total entre la planta y el ambiente externo. Una vez asegurada la supervivencia de la planta, se traslada ésta a maceta de mayor volumen (2 l.) y se lleva a invernadero aséptico. 25 III. OBJETIVOS El objetivo principal de este trabajo es la evaluación de la tolerancia a la salinidad tanto in vitro como en condiciones de invernadero, de tres clones africanos de mandioca (Manihot esculenta Cranz), para en su caso poder ser cultivadas en áreas árido-salinas. Para la obtención de este objetivo principal se consideraran los siguientes objetivos parciales: a. Determinación de las condiciones óptimas para la propagación in vitro de explantos de mandioca y comportamiento de este material vegetal ante la presencia de concentraciones crecientes de NaCl en el medio de cultivo. Clasificación del material considerado por su tolerancia a la salinidad. b. Definición del comportamiento ante la sal de plantas de los tres clones de mandioca cultivadas en invernadero. Clasificación por su tolerancia y comparación con la clasificación obtenida in vitro. c. Determinación de la influencia del tratamiento con micorrizas vesículo arbusculares (MVA) sobre el desarrollo de plantas de los tres clones de mandioca al ser trasplantadas desde in vitro a condiciones externas y sobre su tolerancia a la presencia de sal en la solución nutritiva. d. Caracterización del comportamiento in vitro y tras el trasplante a condiciones externas, de material procedente de plantas de mandioca micorrizadas en invernadero. 26 IV. PROPAGACION IN VITRO IV.1. INTRODUCCION Como se ha indicado, la mandioca es una especie monoica y altamente heterocigótica. Debido a esta heterocigosis, cuando se pretenden conservar unos caracteres genéticos determinados, se propaga vegetativamente mediante estaquillado (Kamalam et al., 1977; Wholey y Cock, 1978). Como en otros tantos cultivos, las tasas de propagación alcanzadas mediante cultivo in vitro de yemas apicales son considerablemente mayores que las conseguidas por los métodos tradicionales (Stamp y Henshaw, 1986). Ello, unido a otras ventajas importantes del cultivo en medio controlado, como la independencia de la época estacional, de gran importancia en plantas tropicales, el almacenamiento en espacios reducidos, y en especial su uso como método de selección de variedades mas tolerantes a estrés, tanto de tipo abiótico como biótico, hace que el uso de la técnica de micropropagación para esta especie sea de gran interés. Además, el cultivo “in vitro” es un método apropiado para poder aplicar metodologías tanto biotecnológicas, como de ingeniería genética. Son bien conocidos los protocolos para el cultivo in vitro de meristemos y explantos nodales de mandioca, tanto para propagación (Protuguez y Mogilner, 1967; Konan et al., 1994, 1997; Li et al., 1998) como para obtener plantas sanas y libres de virus (Fereol, 1978; Kartha y Gamborg, 1978; Kaiser y Teemba, 1979; Roca y cols, 1980; Adapare y Coutts, 1981) en algunos casos asociando el cultivo de meristemos apicales a la termoterapia. En 1974, Kartha et al., optimizaron un medio para el cultivo de meristemos caulinares, empleando la solución mineral MS (Murashige y Skoog, 1962), con adición de las vitaminas del medio B5 (Gamborg et al., 1968) y suplementado además con ANA, BA y GA a 1,0, 0,.5 y 0,1 µM respectivamente. Más tarde, se estableció que la adición de BA (0,5 µM) en presencia de ANA y GA, mejoraba la regeneración y que el GA 3 tenía efectos estimulantes en el crecimiento de la mandioca (Nair y cols., 1979). Así pues, estos últimos autores prestaron atención especial a la influencia de los reguladores de crecimiento encontrando que la BA fue la mejor citoquinina frente a zeatina, kinetina ó 2iP, en conjunción con 0,18 ó 0,018 mgl -1 de ANA y 0,035 mgl -1 de GA3. Roca (1986), encontró 27 que niveles de 0,11 mgl -1 de BA promovieron iniciación de tallo y crecimiento y que concentraciones elevadas de BA (2 mgl -1 ) retardaron el crecimiento del tallo, inhibieron la formación de raíces y estimularon la formación de callo. La adición de ANA al mismo medio, indujo una formación excesiva de callo y raíces. Zok et al. (1992), propusieron como adecuado para el desarrollo vegetativo de mandioca in vitro, el medio MS con BA a 0,05 mgl -1 y ANA a 0,01 mgl -1 de concentración. Mas reciéntemente, Bhagwat et al. (1996), ensayaron el uso del TDZ (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea) compuesto relacionado con la fenilurea con efecto tanto auxínico como citoquinínico (Mok et al., 1982 ; Visser et al., 1992). El TDZ posee una poderosa capacidad de estimulación de organogénesis de brotes de algunas especies leñosas (van Nieuwkerk et al., 1986; Chalupa et al., 1988; Yusnita et al., 1990; Huetteman y Preece, 1993; Lu 1993). Bhagwat et al., (1996) indicaron que después de mantener explantos nodales en un medio MS líquido con 0,11 y 0,22 µM de TDZ durante 6 a 8 días, se trasplantaron a un medio sólido con 2,2 µM de BA y 1,6 µM de GA 3 , encontrando que el desarrollo iniciado en la fase de tratamiento inducido por TDZ se mantuvo en el medio sólido, obteniéndose una media de 31,5 brotes por explanto a las 10 semanas de cultivo. Estas respuestas positivas se generalizaron para ocho genotipos diferentes. Resultados obtenidos por el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en 1980, mostraron que el aumento en la concentración de sacarosa desde 0,03 a 0,06 M potenció el efecto de bajas concentraciones de BA sobre la elongación del tallo a partir de meristemos. En estas mismas condiciones, se observó un incremento del desarrollo radicular. Al aumentar la concentración de BA manteniendo la concentración de sacarosa en los niveles más altos citados, se incrementó también la formación de callo. Incrementos mayores de la concentración de sacarosa causaron oscurecimientos de la raíz y deterioro en los tejidos aéreos, probablemente como consecuencia del estrés osmótico. Noerhadi y Widiyanto (1982) demostraron que es posible la obtención de callos y raíces a partir de fragmentos de hojas y peciolos. Mabanza (1981) obtuvo la neoformación de plantas a partir de meristemos caulinares, e igualmente a partir de cotiledones extraídos de semilla (Mabanza y Jonard, 1984). Medard en 1985, hizo un estudio detallado sobre las etapas de la morfogénesis foliar de mandioca. A pesar de las dificultades impuestas inicialmente por el comportamiento irregular de las plantas de mandioca obtenidas con los diferentes sistemas de propagación in vitro, (Tilquin, 1979), en las dos últimas décadas se han desarrollado metodologías, como la embriogénesis (Liu y Chen, 1977) o el uso de brotes adventicios, con vistas a la 28 modificación genética. Ello ha tenido una amplia repercusión en la biotecnología de dicha especie. Los intentos mas recientes de desarrollar sistemas de regeneración in vitro para investigaciones desde el punto de vista molecular o celular se han centrado principalmente en la embriogénesis somática. Stamp y Henshaw (1982 y 1987) realizaron diversos trabajos sobre embriones somáticos primarios y secundarios y embriones cigóticos. Choi et al., (1987) estudiaron las características bioquímicas de embriones somáticos y Sofiari et al., (1997) compararon la acción de ANA y 2,4-D sobre la inducción de embriones somáticos a partir de discos de hoja de siete cultivares de mandioca, encontrando que el 2,4-D es el único que induce embriones primarios y que ambos reguladores inducen embriones secundarios. Ma, (1998) indicó que las citoquininas benciladenina y TDZ estimulan la organogénesis de brotes mas que la kinetina y N-isopentiladenina, mientras que las auxinas inducen de forma efectiva la embriogénesis somática. Aparte de su evidente aplicación para propagación, se han utilizado los callos de embriones somáticos para aislar protoplastos (Sofiari et al., 1998) o para estudiar efectos relacionados con la cianogénesis (Joseph et al., 1999) . En relación a la embriogénesis cigótica, Fregene et al., (1998), obtuvieron un alto porcentaje de plantas rescatadas precozmente de semillas usando embriones cigóticos inmaduros. A pesar de los últimos adelantos en este sistema, la aplicación eficiente de esta técnica para la transformación genética de la mandioca no es aun sencilla debido, entre otras causas a la dependencia del genotipo (Bhagwat et al., 1996) Dentro de las fases de la micropropagación definidas por Murashige (1974) una de las mas problemáticas es la transferencia al ambiente natural. Si esta fase no se realiza cuidadosamente pueden producirse muchas pérdidas debido, por un lado a que las jóvenes raíces formadas in vitro tienen una epidermis no suberificada y sufren daños en el proceso de trasplante (Gribaudo et al., 1995), y por otro, a que las plantas cultivadas asépticamente, crecen en alta humedad relativa (HR), en el interior del frasco de cultivo y al pasar al exterior con menor HR sufren a menudo pérdidas elevadas de agua. Las hojas de las plantas cultivadas "in vitro" difieren anatómicamente de las de invernadero, ya que tienen menos ceras epicuticulares (Zaid y Hughes, 1995), células en empalizada más pequeñas y más aire intercelular en las células del mesófilo. Por ello, el estrés hídrico que sufre la planta transferida de alta a baja HR se atribuye a estas particularidades anatómicas (Sutter y Langhans, 1979; Zacchini y Morini, 1998). Estos últimos autores sugirieron que la baja respuesta del estoma también contribuye a este estrés. Ziv et al., (1987) indicaron que los estomas en la epidermis de hojas cultivadas "in vitro" de clavel no se cierran como respuesta a la oscuridad, plasmolisis, AAB o Ca++, factores que motivan el cierre de los 35 IV.3.3. Prueba de adaptación a condiciones "in vivo". Se consideró de interés controlar si los distintos tipos de sistemas radicales provocados, en especial, por la presencia de ANA en el medio tuvieron alguna influencia sobre la supervivencia y el desarrollo de la planta de mandioca al ser trasplantada a condiciones externas. En la tabla 3 se indica la evolución, durante los primeros 100 días, del porcentaje de plantas de mandioca adaptadas a condiciones normales de crecimiento. En dicha tabla se especifica el comportamiento de los tres clones en estudio, dependiendo de que las plantas adaptadas hubiesen sido previamente obtenidas in vitro en presencia o ausencia de ANA. Tabla 3. Evolución del tanto por ciento de plantas supervivientes al trasplante en la fase de adaptación. Clon Días desde el trasplante con ANA 100 a 93,8 a 55,1 b 55,1 b 55,1 b sin ANA 100 a 87,5 ab 60,0 b 57,5 b 57,5 b con ANA 100 a 80,0 b 62,2 b 62,2 b 62,2 b sin ANA 100 a 78,2 b 65,2 b 65,2 b 65,2 b con ANA 100 a 78,2 b 65,2 b 65,2 b 65,2 b sin ANA 100 a 84,4 b 82,2 b 82,2 b 82,2 b 100 % plantas supervivientes SOM-1 05 50 0 25 50 75 Letras diferentes leídas en fila indican diferencias significativas (P< 0,05) respecto a tratamientos con ANA. Test LSD. En todos los casos, la mayor parte de las pérdidas se produjeron durante los primeros 50 días como sucede en la mayoría de las plantas, tanto de mandioca (Roca 1984; Guoha M. , 1998) como de otras especies como vid (Cantos et al., 1993), olivo (Pérez, 1997), Prunus (Zacchini y Morini, 1998) ó gardenia (Serret et al., 1997). Ese tiempo comprende un primer período de adaptación in vitro-ex vitro en el que ni el sistema radicular, ni la regulación estomática foliar (Choudhury y Monteith, 1986; Zacchini y Morini, 1998) están bien regulados con las necesidades de la planta, lo que puede producir pérdidas irreversibles de agua en los tejidos. También se produjeron nuevas pérdidas en los primeros días de haber pasado las plantas de la cámara de cultivo a invernadero. 36 No se observaron diferencias de adaptación entre las plantas con raíces formadas en medio sin ANA (largas aunque menos numerosas) o con ANA (menores y mas numerosas) como lo confirma los coeficientes de correlación entre plantas adaptadas y tiempo (r=-0,887 para plantas con raíz inducida y r=-0,876 para las de raíz espontánea), y la comparación entre las medias de plantas convenientemente aclimatadas procedentes de ambas situaciones . Tampoco se observaron diferencias significativas entre los porcentajes de plantas adaptadas al exterior de los clones en estudio. En la tabla 4 se indican los valores medios de longitud del tallo y del número de brotes de las plantas adaptadas en la prueba descrita, para cada uno de los tres clones en estudio, a los 50 días desde su trasplante al exterior. En dicha tabla, se observa que no existieron diferencias significativas entre la longitud del tallo de las plantas de los clones SOM-1 y 05, con raíz inducida o espontánea. Sólo las plantas del clon 50, que crecieron más que las de los otros dos clones, tuvieron tallos algo mayores cuando su sistema radicular se había formado en medio con ANA. Tampoco existieron diferencias entre el número de brotes de las plantas con raíces inducidas y espontáneas y que las plantas del clon 50 presentaron un mayor número de brotes que de los otros dos clones, entre los que no existieron diferencias significativas. Por otra parte, tampoco se encontraron diferencias en la supervivencia al trasplante in vitro-ex vitro (74%), ni entre el desarrollo durante la fase de aclimatación de las plantas de la prueba de adición de citoquininas (kinetina o BA) al medio de cultivo in vitro. Del conjunto de los resultados se puede destacar que con el método de cultivo in vitro utilizado se logró de un solo cultivo, el desarrollo contemporáneo de la parte aérea (tallo, hojas) y del sistema radicular, del explanto de mandioca cultivado in vitro. Tabla 4. Longitud media y número medio de brotes de plantas de mandioca adaptadas a condiciones “ex vitro” en relación al tipo de raíz. CLON SOM-1 50,0 b 48,6 c ns 4,0 b 4,0 a ns 05 60,2 a 66,2 b ns 3,7 b 3,9 a ns 50 72,6 a 94,7 a * 4,3 a 4,6 a ns sin ANA con ANA sin ANA con ANA Tallo Longitud (mm) Número de yemas Los asteriscos indican diferencias significativas (P< 0,05), respecto a tratamientos con y sin ANA. Letras diferentes leídas en columna indican diferencias significativas entre clones (P< 0,05). Test LSD. 37 Este hecho se considera de interés, ya que produce un notable ahorro de tiempo y dinero, puesto que el cultivo in vitro de material de mandioca, se realiza tradicionalmente en dos fases (un primer subcultivo para favorecer el crecimiento aéreo y un segundo para la radicación). No se encontró ningún efecto significativo positivo sobre el desarrollo in vitro del explanto de mandioca, por la adición al medio de cultivo de ANA a las concentraciones de 0,13 mgl -1 , o de BA o kinetina a las concentraciones 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mgl -1 . Solamente la presencia de ANA en el medio, provocó un mayor número de raíces por planta, pero estas fueron de menor tamaño que las menos numerosas obtenidas en el medio sin la auxina. No obstante, este mayor número de raíces no influyó en el desarrollo de la planta in vitro. Cuando se utilizó la técnica propuesta por Cantos et al., (1993), se alcanzó aproximadamente un 70% de plantas supervivientes tras el trasplante in vitro-ex vitro y un crecimiento normal de las mismas. Tampoco en este caso, las plantas que se habían cultivado in vitro en medio con reguladores de crecimiento (auxina o citoquinina), mostraron un comportamiento distinto a las que no tuvieron dichas substancias en el medio. Es decir, que para las condiciones de los experimentos que aquí se indican no fue aconsejable el uso de reguladores de crecimiento en la propagación in vitro de los explantos de mandioca. En consecuencia, a partir del escaso material inicial (1-2 explantos in vitro de cada clon) utilizando la técnica de propagación in vitro sobre medio de Murashige Skoog con 30 gl -1 de sacarosa y 100 mgl -1 de inositol, sin reguladores de crecimiento se logró un elevado coeficiente de multiplicación y plantas completas en un solo cultivo. Posteriormente, utilizando la técnica descrita por Cantos et al., (1993), se obtuvieron resultados excepcionales en el trasplante in vitro-ex vitro, lográndose plantas de gran calidad en condiciones de invernadero, que permitieron la realización de los experimentos que se discuten a continuación. 38 V. INFLUENCIA DE LA SALINIDAD (NaCl) EN EL DESARROLLO DE PLANTAS DE MANDIOCA (Manihot esculenta Cranz) IN VITRO. V.1. INTRODUCCIÓN El cultivo in vitro de tejidos y células vegetales es una herramienta útil para estudios relacionados con la salinidad, en especial para la caracterización de líneas tolerantes, ya sean mutantes espontáneos o inducidos (Sumaryati et al., 1992; Kuo et al., 1994; Morabito et al., 1994; Hafizur-Rahman et al., 1995; Zhang y Donnelly, 1997; Cano et al., 1998; Kirdmanee et al., 1998; Khrais et al., 1998; Liua y Baob, 1998; Ochatt et al., 1999). Sin embargo, a diferencia de los numerosos trabajos sobre la tolerancia de plantas a la salinidad realizados en condiciones de campo o de invernadero, hay muy pocos estudios en los que se aplica el cultivo de tejidos in vitro a la selección de plantas tolerantes a la sal. Debido a la importancia que presenta la salinización, junto a la dificultad de alcanzar resultados prácticos en la selección convencional, y a la facilidad de aplicación de estrés salino a cualquier sistema in vitro, es interesante potenciar estos estudios (Cano, 1991). No obstante, de acuerdo con Skene y Barlass (1988) y Troncoso et al., (1999a), los resultados obtenidos in vitro deben ser contrastados en experimentos realizados en condiciones externas. Una de las primeras investigaciones sobre el efecto de la sal en material vegetal cultivado in vitro, fue realizado por Babaeva et al., (1968) utilizando callos de raíz de zanahoria (Daucus carota L.), cultivados en concentraciones crecientes de NaCl. De este modo, se observaron diferentes niveles de tolerancia a la salinidad según el material obtenido. Melchers (1972), discutió las ventajas de la técnica de cultivo de tejidos in vitro para seleccionar mutantes resistentes a la sal. Esta aproximación, la aplicó posteriormente con éxito Zenk (1974), que seleccionó una línea celular aislada de haploides de Nicotiana sylvestris L., capaz de crecer sobre medio conteniendo 0,17 mM de NaCl, resistencia que se mantuvo estable después de varios subcultivos en medio salino. 39 Otro avance fué el conseguido por Dix y Street (1975), que seleccionaron un número de líneas celulares de Nicotiana sylvestris L. y Capsicum annuum L., capaces de desarrollarse en medio líquido con 0,34 M de NaCl. Algunas de estas líneas retuvieron la tolerancia a la sal después de varios subcultivos en medio sin NaCl. Nabors et al., (1980), describieron la heredabilidad de la tolerancia a la sal en plantas seleccionadas de Nicotiana tabacum L. regeneradas a partir de células de NaCltolerantes, encontrando que el nivel de resistencia de la progenie de las plantas regeneradas fue mayor que el de las plantas originales. Goldner et al., (1977), clasificaron las posibles mutaciones seleccionadas para la tolerancia a estrés salino mediante cultivo de tejidos in vitro, en tres grandes grupos : 1) mutaciones resistentes a estrés osmótico; 2) mutaciones resistentes a estrés causados por altas concentraciones de sales totales y 3) mutaciones resistentes a estrés causado por iones específicos. Además, recomendaron procedimientos específicos para cada uno de estos grupos y sugirieron que la técnica de selección usada por Zenk (1974), Dix y Street (1975) y Nabors et al., (1975) para cultivos de células en suspensión en NaCl, es aplicable a la selección de mutantes en el primer grupo. Así mismo, llegaron a emplear el cultivo de tejidos in vitro para estimar las contribuciones relativas de los diferentes efectos de los daños causados por la sal. Para ello, compararon los efectos del agua de mar, soluciones de diferentes sales inorgánicas y manitol sobre el crecimiento y la coloración de callos diploides, originados a partir de raíces de zanahoria (Daucus carota L). De los resultados obtenidos, concluyeron que la inhibición del crecimiento se debía fundamentalmente al incremento de presión osmótica, mientras que la decoloración y la necrosis eran atribuibles a la toxicidad de la sal. Chen et al., (1980), trabajando con callos de Nicotiana tabacum L. en medio conteniendo varias concentraciones de agua de mar o NaCl, encontraron que una solución de un solo tipo de sal (NaCl) resultó ser más tóxica para los tejidos que el agua de mar a la misma concentración. Strogonov (1973), estudió la respuesta a NaCl de callos obtenidos a partir de cuatro especies glicófitas y una halófita. Mientras la respuesta de callos originados a partir de especies glicófitas estuvo relacionada con la respuesta de la planta completa a la salinidad, esta correlación no existió en la halófita siendo el callo originado a partir de esta última mucho más sensible que los de la más sensible a la sal de las glicófitas. Estos resultados fueron confirmados en dos glicofitas (Phaseolus vulgaris L. y Beta vulgaris L.) por Smith y McComb (1981), no siguiendo este patrón las halofitas Atriplex undulata L. y Suaeda australis L. Por tanto, los investigadores citados 40 concluyeron que, en contraste con las glicófitas, la resistencia a la sal en las especies halófitas depende de la integridad anatómica y fisiológica de la planta completa y no de las propiedades celulares. En consecuencia, las células de estas plantas no son capaces de resistir la sal cuando se encuentran en forma de callo. Por el contrario, otros autores encontraron una correlación entre la respuesta de la planta completa y el callo derivado de la misma, tanto en glicofitas como en halofitas. Así, Von Edeströn y Breckle (1974), descubrieron esta correlación en Suaeda maritima L., incluso el callo creció mejor en medio con sal que en el carente de ella. Tal et al., (1978), establecieron que las células que se originaron de hojas, tallos y raíces de tomate cultivado y de dos especies salvajes tolerantes a la sal (Lycopersicon peruvianum L. y Solanum pennellii Corr.) mejoraban en proporción similar cuando la planta completa se cultivó en salinidad. Concluyeron que el mejor ajuste osmótico, que caracterizaba a las especies silvestres bajo alta salinidad, es operativo a nivel celular y no depende de la organización de esas células en la planta completa. Un comportamiento similar observó Orton (1980) para callos procedentes de plantas sensibles y resistentes de cebada (Hordeum vulgare L.). Un intento de uso de líneas celulares resistentes a NaCl de Nicotiana sylvestris L. para conocer la base de la resistencia a alta salinidad, fue publicado por Dix (1980), usando microanálisis con rayos X. Sugirió que la acumulación o secuestro de iones Na + y Cl - en un compartimento subcelular no puede ser el mecanismo responsable de la tolerancia a la sal en estos cultivos celulares. Por otro lado, uno de los principales problemas del uso del cultivo in vitro como herramienta de selección de plantas tolerantes a la sal es que la planta regenerada a partir de células vegetales no implica garantía absoluta de que sea una copia exacta de la línea parental utilizada, de modo que no siempre la tolerancia en el ámbito celular ha sido expresada en la planta regenerada. (Tal, 1985; Flowers et al., 1985). Esto es debido a la variación somaclonal (Scowcroft y Larkin, 1982) que es una manera de aumentar la variabilidad genética, dando lugar a un cambio genético (características cualitativas y cuantitativas) que se puede mantener en las plantas regeneradas (Cano, 1991). El valor de la variación somaclonal en agricultura ha sido descrito adecuadamente por Ahloowalia (1978) Larkin y Scowcroft (1981) y Evans et al., (1982). Por ello, durante las primeras etapas de selección in vitro para tolerancia a la salinidad, el interés se centra en comprobar si la variación está expresada fielmente en los cultivos de células y de tejidos. Esto se ha comprobado en callos de Hordeum jubatum L. (Orton, 1980); Lycopersicon peruvianum y L. pennellii Corr. (Tal et al., 1978). L. esculentum, L 41 pennellii y su híbrido interespecífico (Pérez-Alfocea, 1991), Beta vulgaris (Smith y Mc Comb, 1981a) y Medicago sativa (Smith y McComb, 1981b) y en suspensiones celulares de las plantas halófitas Salicornia y Suaeda maritima (Von Edeströn y Breckle, 1974), Distichlis spicala (Warren y Gould, 1982) y Spartina peclinala (Warren et al., 1985). Los estudios sobre cultivo in vitro de tejidos usando material más diferenciado y, en consecuencia menos susceptible a ser modificado genéticamente que las células o callos, para la selección de clones tolerantes a la sal son todavía más escasos. Uno de los primeros trabajos, efectuado con yemas, fue realizado por Barlass y Skene en 1981 con vid (Vitis vinifera L.), encontrando que la tolerancia in vitro al NaCl es dependiente de la variedad y está relacionada con la acumulación de Cl - en los tejidos del explanto. Aunque constataron que la metodología era aplicable a la selección, en trabajos posteriores Skene y Barlass, (1988) observaron que la selección in vitro de material de vid por su tolerancia a la salinidad necesitaba ser contrastada con ensayos realizados en condiciones externas. Posteriormente, (Troncoso et al., 1999a), estudiaron la respuesta de once portainjertos de vid a concentraciones crecientes de NaCl en el medio de cultivo, tanto in vitro usando yemas apicales y axilares como en cámara de crecimiento. Los resultados obtenidos permitieron clasificar las variedades estudiadas de acuerdo con su tolerancia a la salinidad en medio controlado y confirmar dicho comportamiento en condiciones externas. Alhagdow et al., (1999) consideraron las interaccioens de la sal con el estado nutritivo de plantas de patata obtenidas por micropropagación y Cano et al., (1998) evaluaron la tolerancia a sal de diferentes especies de tomate silvestre, resaltando que los parámetros de enraizamiento de las plántulas desarrolladas a partir de los ápices pueden ser buenos indicadores para una evaluación rápida de la tolerancia a la sal. El objetivo del presente capítulo es estudiar la tolerancia a la sal cultivando in vitro yemas subapicales en medio con concentraciones crecientes de NaCl de los tres clones de mandioca descritos. V.2. MATERIALES Y MÉTODOS En todos los casos, como material vegetal se emplearon explantos de aproximadamente un centímetro de longitud, con una yema axilar, obtenidos de plantas mantenidas in vitro, de los clones SOM-1, 05 y 50 usados en las pruebas anteriores. 42 Dado que los explantos provenían de plantas conservadas in vitro y en su preparación se trabajó en condiciones de asepsia, no fue necesario desinfectarlos. Como medio de cultivo se utilizó el de Murashige y Skoog (1962) con 30 g l -1 de sacarosa y 100 mg l -1 de mioinositol. El pH se ajustó a 5,7 con NaOH y HCl 1N y se añadió agar-agar (Cultimed) al 0,5%. Los distintos medios salinizados se prepararon por adición al medio anterior (control) de soluciones de NaCl respectivamente de 0, 2, 4, 6, 8 y 10 g l -1 que dieron una conductividad eléctrica de 4.6, 7.5, 10.63, 13.5, 16.4 y 19.2 dS m -1 en la primera prueba, y de 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y 3 g l -1 de NaCl en las que se midió una conductividad eléctrica de 4.6, 5.3, 6.1, 6.8, 7.5, 8.3 y 9.1 dS m -1 en la segunda prueba. La esterilización de estos medios y del material de laboratorio, se realizó en autoclave a 121 ºC y 1 atm de presión durante 20 minutos. En el primer y segundo experimento, se emplearon 48 explantos por clon (3 clones) y tratamiento salino (6 concentraciones salinas) lo que dio un total de 864 explantos en cada prueba. En todos los casos, los explantos se sembraron individualmente en tubos de ensayo de 150 x 25 mm, con 8 ml de medio. Cada tubo se tapó con un capuchón de polipropileno cuyo borde se selló con parafilm y se puso en una cámara de cultivo a 25±2 ºC, 16 horas de fotoperiodo y 30 µE m -2 s -1 de intensidad luminosa. Transcurridos 80 días se analizó la supervivencia de las plantas. En la segunda prueba se consideró además la producción de biomasa (peso fresco y peso seco), el grado de hidratación de los tejidos según la formula; {(Pf-Ps)/Pf}.100; la longitud del tallo, el número de yemas, el número de hojas y la superficie foliar, el número de raíces y la composición mineral de raíz, tallo y hojas de las plantas supervivientes. La producción de biomasa se determinó separando las plantas extraídas de cada tubo en raíz, tallo y hojas, y pesando cada una de estas partes. Para la determinación del peso seco se puso cada órgano en estufa de aire forzado a 70ºC hasta peso constante. La superficie foliar se determinó mediante digitalización de imagen (Leaf Area Meter Skye). V.2.1. Determinaciones analíticas. Cada muestra se lavó con agua y detergente y se enjuagó cuidadosamente con agua destilada. Para su desecación, se envolvió en un papel de filtro y se introdujo en 43 una estufa con circulación de aire a 60 ºC, durante 2 ó 3 días. Una vez seca se molió en un molinillo y el polvo se introdujo en un sobre de papel debidamente etiquetado. Para la determinación de los elementos sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro, cobre, manganeso y cinc se utilizaron técnicas de espectrofotometría de absorción atómica, por medio de un espectrómetro Perkin-Elmer mod. 300 (C.I.I.T.D.F., 1960). El procedimiento consistió en pesar 0.5 gramos (si no hubo suficiente muestra se pesaron 0.25 gramos) de cada muestra de polvo vegetal que se pusieron en cápsulas de platino, y se introdujeron en un horno frío, elevando la temperatura paulatinamente hasta 500 ºC, en 2 ó 3 horas. Una vez calcinadas, se humedecieron con 2-3 ml de agua desionizada más 1ml de HCl concentrado, añadidos lentamente. A continuación, se calentaron sobre unas placas hasta la aparición de los primeros vapores. Cada muestra resultante se filtró arrastrando el polvo de la cápsula con agua desionizada, recogiendo el filtrado sobre un matraz aforado de 50 ml (si se pesaron 0.5 g) o de 25 ml (si se pesaron 0.25 g), y se enrasó con agua desionizada. Luego, tras agitación, se midieron mediante absorción atómica. El procedimiento para la determinación de nitrógeno consistió en pesar 0.2 g de cada muestra vegetal e introducirlos en tubos de vidrio Kjeldahl. Se les añadieron 0.5 g de K 2 SO 4 desecado y selenio (catalizadores de digestión), y 5 ml de H 2 SO 4 . Los tubos se colocaron en un bloque digestor y se sometieron a una digestión elevando la temperatura hasta 380 ºC. Después del ataque se les añadió agua destilada y cuando se enfriaron se pasaron a matraces de 25 ml y se enrasaron. Así, las muestras quedaron preparadas para leerlas en el autoanalizador frente a una curva patrón. El fósforo se determinó por colorimetría, tras la formación del complejo fosfatovanadato-molíbdato. El análisis de cloro se realizó por medio de una calcinación en medio básico para evitar pérdidas de cloruros. La muestra de cenizas se extrajo con agua caliente y el cloro del extracto se determinó colorimétricamente con el método del tiocianato de mercurio en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda EZ210. El procedimiento consistió en pesar 1g de muestra de polvo vegetal en cápsula de porcelana. Se mezcló la muestra con la cuarta parte de su peso de óxido de calcio y suficiente agua sobre placa caliente. Se calcinó en horno a 500 ºC durante 90 minutos y se dejó enfriar. Se añadieron unos 10 ml de agua caliente y se colocó unos minutos sobre placa caliente. Se agitó cuidadosamente 44 con varilla de vidrio y se filtró sobre matraz de 100 ml. El residuo se lavó unas cinco veces con 10 ml de agua caliente, se enfrió y llevó a volumen. La colorimetría se realizó pipeteando una alícuota que contenía menos de 50 mg de cloruro a un matraz aforado de 25 ml. Se añadieron 2 ml de reactivo nitrato férrico y 2 ml de tiocianato de mercurio, se agitó y llevó a volumen. Se midió la absorbancia frente al punto 0 de la curva de calibrado a 460 nm, después de 5 minutos. Se preparó una curva de calibrado pipeteando en matraz de 25 ml que desarrolló el color como se describe anteriormente. Los datos estuvieron sometidos a un análisis de la varianza multifactorial (MANOVA) siendo los factores, clon y salinidad, y se empleó el test de rango multiple de Duncan para la separación de medias. En este análisis de datos se utilizó el programa SPSS bajo Windows 10.0. En el estudio de supervivencia se empleó el test-T para diferencias de proporciones mediante un programa realizado en BASIC por este departamento. La relación entre las variables peso fresco y peso seco de las plantas y la salinidad se realizó mediante el ajuste por mínimos cuadrados a la función de tipo exponencial propuesta por Van Genuchten (1983) siguiente: Y r = e C (α - βC) donde Y r es la biomasa relativa ( 1 / 1 ), C es la concentración salina y α y β son constantes. Con los resultados se realizó una prueba χ 2 de bondad de ajuste y determinación del coeficiente de correlación lineal (r) de Pearson. V.3. RESULTADOS V.3.1. Influencia de la salinidad sobre la supervivencia del explanto. En la tabla 5 se indica el número y el tanto por ciento de plantas obtenidas a partir de explantos en el ensayo donde se aplicaron al medio de cultivo concentraciones de sal, de 0, 2, 4, 6, 8 y 10 g l -1 . Se observa, que cuando no se añadió sal al medio, vivieron todos los explantos y llegaron a formar plantas. Este comportamiento indicó, de nuevo, la buena disposición del explanto de mandioca para ser propagado in vitro y dio garantías de que las bajas 51 fig. 6. Biomasa relativa (% control) en peso fresco y seco de plantas de mandioca tras 80 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. 0 25 50 75 100 125 150 175 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 gl -1 NaCl % Peso fresco Peso seco fig 7. Ajuste de la biomasa relativa del peso fresco y seco mediante funciones exponenciales. 0 0,5 1 1,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 gl -1 NaCl 1/1 Peso fresco Peso seco SOM-1 05 50 r (Peso fresco) 0,993 0,921 0,879 r (Peso seco) 0,981 0,954 0,869 En cuanto al crecimiento del tallo de la planta de mandioca, la longitud media del explanto en el momento de la siembra fue de 10 mm. Tras 60 días de cultivo en el medio control sin adición de NaCl, los clones 05 y 50 alcanzaron cerca de 100 mm de altura, mientras que el clon SOM-1 sólo llegó a los 60 mm. Es decir, los clones 05 y 50 52 fig. 8. Longitud media del tallo tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 Tiempo (días) Longitud (mm) 0 g/l 0,5 g/l 1 g/l 1,5 g/l 2 g/l 2,5 g/l SOM-1 05 50 fig. 9. Número de raíces desarrolladas tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 Tiempo (días) Nº de raíces 0 g/l 0,5 g/l 1 g/l 1,5 g/l 2 g/l 2,5 g/l SOM-1 05 50 fig. 10. Número de yemas desarrolladas tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 Tiempo (días) nº de yemas 0 g/l 0,5 g/l 1 g/l 2 g/l 2,5 g/l1,5 g/l SOM-1 05 50 53 fig. 11. Número de hojas desarrolladas tras 60 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 Tiempo (días) Nº de hojas 0 g/l 0,5 g/l 1 g/l 1,5 g/l 2 g/l 2,5 g/l SOM-1 05 50 Los asteríscos indican diferencias significativas entre clones (P<0,05) según el test de rango Multiple de Duncan Tabla 10. Longitud, número de hojas y superficie foliar a los 80 días de cultivo in vitro de cada clon, en los diferentes medios salinizados con NaCl. Organo Clon (mm) SOM 113,0 b A 80,8 c BC 86,4 b B 74,3 a C 49,9 c D 35,1 a E 05 123,3 b B 193,2 a A 119,5 a B 79,1 a C 67,9 b C 44,6 a D 50 184,9 a A 138,0 b BC 128,5 a B 88,4 a C 92,8 a C 43,5 a D Media 141,0 A 134,3 A 112,2 B 80,5 C 70,1 C 39,7 D SOM 6,3 a A 6,3 b A 4,9 a B 3,5 a C 2,1 b D 1,5 b E 05 5,5 b B 6,8 a A 4,3 b C 2,4 b D 2,4 b D 1,4 b E 50 5,7 b A 6,1 b A 4,3 b B 2,7 b C 2,9 a C 2,1 a D Media 5,8 B 6,4 A 4,5 C 2,9 D 2,5 E 1,7 F (mm 2 )SOM 1022 a AB 1042 b A 895 b B 627 a C 262 b D 148 ab D 05 1154 a AB 1088 b A 1147 a A 372 b B 353 b B 57 b C 50 1001 a B 1260 a A 1001 ab B 574 a C 468 a C 207 a D Media 1058 AB 1125 A 1014 B 526 C 361 D 155 E Area foliar Nº hojas Altura 2,5 Salinidad ( gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. test de rango múltiple de Duncan.Los valores medios se corresponden con el número de individuos que aparecen en la tabla 6 . crecieron más que el clon SOM-1, lo que se debe tener en cuenta a la hora de considerar la acción de la sal. Como en los casos anteriores, los tratamientos con bajas concentraciones de NaCl en el medio de cultivo (0.5 y 1 gl -1 ) mantuvieron o incluso mejoraron los crecimientos indicados para el medio control. Los aumentos en el grado 54 de salinidad del medio provocaron descensos en el crecimiento del tallo de los tres clones siendo estos descensos relativamente menores en el clon SOM-1. Del mismo modo las concentraciones bajas de NaCl (0.5 y 1 gl -1 ) no perjudicaron e incluso favorecieron el desarrollo de raíces, yemas y hojas, pero concentraciones mayores de sal actuaron negativamente. Aunque no existieron grandes diferencias en el comportamiento de los tres clones en consideración, el clon SOM-1 tuvo una ligera mayor tolerancia. V.3.3. Influencia de la concentración de NaCl sobre el contenido de nutrientes en plantas de mandioca cultivadas in vitro. En las tablas 11, 12, 13, 14, 15 y 16 se indican los contenidos de nutrientes, respectivamente de las raíces, tallos, hojas y planta completa en cada clon y la media de los tres clones para cada tratamiento salino hasta 2 g l -1 de NaCl. Las plantas tratadas con más cantidad de sal no pudieron ser analizadas ya que la elevada mortandad y el bajo desarrollo no permitió disponer de material suficiente. V.3.3.1. Nitrógeno. Los tratamientos salinos no parecieron influir sobre los contenidos de nitrógeno de los tres órganos en consideración y en consecuencia de la planta completa (tabla 11). No obstante, se observaron variaciones puntuales entre los clones y tratamientos salinos que no pudieron relacionarse con la presencia de sal en el medio al no existir una relación clara entre las variaciones de la concentración de nitrógeno en los órganos de la planta y los incrementos de salinidad del medio. Tallos y hojas mostraron niveles algo superiores a los de la raíz lo que puede relacionarse con la elevada movilidad de este elemento en la planta (Street y Öpik, 1984). Estos contenidos de nitrógeno, fueron superiores a los determinados por Troncoso et al., (1999a) para plantas de vid in vitro. En este trabajo también se indicó que la presencia de la sal (NaCl) en el medio de cultivo no alteró los contenidos de nitrógeno. Por el contrario, en trabajos realizados en otras especies vegetales en condiciones de invernadero (Cram, 1973; Deane-Drummond y Glass, 1982) se observó que la salinización reducía el contenido de nitrógeno de los tejidos de la planta. 55 Tabla 11. Concentración de nitrógeno y fósforo (%) en raíz, tallo, hojas y planta completa de los clones SOM-1, 05 y 50 tras 80 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. Nitrógeno Organo Clon Raíz SOM 4,82 a AB 5,25 a A 4,47 a BC 4,03 b C 5,28 a A 05 4,62 a AB 4,74 a AB 4,02 a B 4,57 ab AB 5,00 a A 50 4,94 a A 4,55 a A 4,06 a A 4,88 a A 4,90 a A Media 4,79 AB 4,85 AB 4,18 C 4,49 BC 5,06 A Tallo SOM 5,81 b A 4,70 b B 4,52 b B 4,66 b B 5,93 b A 05 6,51 ab A 6,37 a A 5,08 ab B 6,88 a A 6,98 a A 50 7,33 a A 5,59 ab B 5,62 a B 7,04 a A 7,15 a A Media 6,55 A 5,55 BC 5,07 C 6,19 AB 6,68 A Hojas SOM 6,31 a A 5,59 a A 5,89 a A 6,04 ab A 5,60 a A 05 6,01 a A 6,35 a A 5,54 a B 6,34 a A 4,98 a C 50 6,56 a A 5,98 a A 6,40 a A 5,83 b A 5,66 a A Media 6,29 A 5,97 A 5,94 A 6,07 A 5,41 B Planta SOM 5,64 a A 5,18 a AB 4,96 a AB 4,91 b B 5,60 a AB 05 5,71 a AB 5,82 a A 4,88 a B 5,93 a A 5,65 a AB 50 6,28 a A 5,37 a A 5,36 a A 5,92 a A 5,90 a A Media 5,88 A 5,46 AB 5,07 B 5,58 A 5,72 A Fósforo Organo Clon Raíz SOM 0,493 b AB 0,372 b B 0,412 b AB 0,427 b AB 0,567 b A 05 0,489 b B 0,667 a AB 0,555 ab B 0,834 a A 1,096 a A 50 0,780 a AB 0,535 a B 0,643 a B 0,902 a AB 1,097 a A Media 0,587 B 0,525 B 0,537 B 0,721 AB 0,920 A Tallo SOM 0,793 a A 0,638 a AB 0,672 a AB 0,532 a B 0,832 a A 05 0,265 c C 0,421 b B 0,290 b C 0,505 a AB 0,621 b A 50 0,502 b A 0,364 b B 0,374 b B 0,546 a A 0,549 b A Media 0,520 AB 0,474 B 0,445 B 0,528 AB 0,667 A Hojas SOM 0,498 a B 0,659 a AB 0,467 a B 0,448 a B 0,469 a B 05 0,349 b AB 0,525 b AB 0,320 c C 0,389 b B 0,391 a B 50 0,459 a AB 0,483 b A 0,405 b B 0,436 a AB 0,413 a A Media 0,435 B 0,556 A 0,397 B 0,425 B 0,424 B Planta SOM 0,594 a AB 0,556 a AB 0,517 a AB 0,469 a B 0,623 a A 05 0,368 b C 0,538 a AB 0,388 a BC 0,576 a AB 0,702 a A 50 0,580 a AB 0,461 a A 0,474 a AB 0,628 a AB 0,686 a B Media 0,514 B 0,518 B 0,460 BC 0,558 B 0,670 A Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. test de rango múltiple de Duncan. (n=6). 56 Este comportamiento diferente pudo estar relacionado con que en el medio de cultivo de condiciones in vitro existió bastante nitrógeno en forma amoniacal, mientras que en el otro, usaron N-nítrico y la disminución de nitrógeno en plantas se considera principalmente debida a que la presencia de Cl - en el medio inhibe la adsorción de NO 3- (Aslam et al. 1984; Gorham et al 1986). V.3.3.2. Fósforo. En los tres órganos se observaron contenidos de fósforo más elevados que los normalmente obtenidos en plantas in vitro de otras especies (tabla 11). Así Troncoso et al (1999a) determinaron niveles de P próximos al 0,4% para distintos portainjertos de vid in vitro y Troncoso et al (1999b) niveles de 0,1% en plantulas de olivo. Se observó también que los contenidos de P en raíz y en tallo fueron más elevados que los de hojas lo que pudo estar relacionado con la baja movilidad de este nutriente en la planta. En los dos primeros órganos existió una cierta acumulación de P en los tratamientos con mayor concentración salina, lo que concuerda con las indicaciones de Grattan y Grieve (1992) para plántulas cultivadas en condiciones externas. También este hecho pudo estar relacionado con la baja movilidad del nutriente indicada antes y con el menor ritmo de crecimiento de las plantas sometidas a salinidad. En plantas completas, el fósforo aumentó significativamente en el tratamiento de 2 gl -1 observándose diferencias entre clones sólo en el tratamiento control. V.3.3.3. Potasio. Como en el caso del fósforo, también los contenidos mayores de potasio se encontraron en la raíz, seguidos de los del tallo y siendo la hoja el órgano con menor nivel (tabla 12). Como se observa en dicha tabla, no hubo una relación clara entre el contenido de potasio en los tejidos de la planta y la salinidad del medio. Sólo en el caso del tallo se encontró una relación inversa entre estos parámetros. Esta falta de correlación a nivel general no coincide con lo indicado por Troncoso et al., (1999) para material de vid in vitro así como por otros autores (Li et al., 1989; Khan et al., 1999; Pardossi et al., 1999; Short y Colmer, 1999) para plantas en condiciones externas, quienes encuentran disminuciones de potasio muy claras al 57 Tabla 12. Concentración de potasio y calcio (%)en raíz, tallo, hojas y planta completa de los clones SOM-1, 05 y 50 tras 80 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. Potasio Organo Clon Raíz SOM 4,98 a A 4,31 b B 4,71 a AB 4,50 a AB 4,50 a AB 05 4,74 ab A 4,86 a A 4,58 ab AB 4,57 a AB 4,41 a AB 50 4,43 b AB 4,91 a A 4,23 b B 4,30 a B 4,30 a B Media 4,72 A 4,69 A 4,50 A 4,46 A 4,40 A Tallo SOM 3,85 a A 2,69 b B 2,56 a B 2,50 a B 2,75 a B 05 2,79 b B 3,42 a A 2,22 b BC 2,47 a BC 2,06 b C 50 3,47 a A 3,72 a A 2,78 a B 2,52 a B 2,32 b B Media 3,37 A 3,28 A 2,52 B 2,50 B 2,38 B Hojas SOM 1,98 a C 2,88 ab A 2,22 b BC 2,25 ab B 1,97 a C 05 1,76 b C 2,75 b A 1,93 c BC 2,10 b B 1,77 b C 50 1,86 ab C 2,96 a A 2,41 a B 2,35 a B 1,90 ab C Media 1,87 C 2,87 A 2,19 B 2,23 B 1,88 C Planta SOM 3,60 a A 3,29 a A 3,16 a A 3,08 a A 3,07 a A 05 3,09 a A 3,68 a A 2,91 a A 3,05 a A 2,75 a A 50 3,26 a AB 3,86 a A 3,14 a AB 3,06 a AB 2,84 a B Media 3,32 AB 3,61 A 3,07 AB 3,06 AB 2,89 B Calcio Organo Clon Raíz SOM 0,415 a A 0,267 b C 0,338 a B 0,397 a AB 0,356 a AB 05 0,317 b A 0,303 b A 0,311 a A 0,296 b A 0,257 b A 50 0,290 b AB 0,341 a A 0,261 b B 0,272 b AB 0,302 b AB Media 0,341 A 0,304 A 0,303 A 0,322 A 0,305 A Tallo SOM 0,943 a A 0,559 b C 0,678 a BC 0,631 a BC 0,761 a B 05 0,639 b A 0,605 ab A 0,393 b B 0,431 b B 0,441 b B 50 0,537 c B 0,650 a A 0,428 b C 0,399 b C 0,361 b C Media 0,706 A 0,605 AB 0,500 B 0,487 B 0,521 B Hojas SOM 0,589 a A 0,653 a A 0,484 a B 0,447 a B 0,292 b C 05 0,629 a A 0,582 b A 0,376 b B 0,389 a B 0,333 ab B 50 0,500 b A 0,553 b A 0,410 b B 0,390 a B 0,378 a B Media 0,573 A 0,596 A 0,423 B 0,409 B 0,335 C Planta SOM 0,649 a A 0,493 a A 0,500 a A 0,492 a A 0,470 a A 05 0,528 ab A 0,497 a A 0,360 b B 0,372 b B 0,344 a B 50 0,442 b AB 0,515 a A 0,366 b BC 0,354 b BC 0,347 a C Media 0,540 A 0,501 A 0,409 B 0,406 B 0,387 B Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. test de rango múltiple de Duncan. (n=6) 58 Tabla 13. Concentración de magnesio y sodio (%)en raíz, tallo, hojas y planta completa de los clones SOM-1, 05 y 50 tras 80 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. Magnesio Organo Clon Raíz SOM 0,168 b AB 0,155 b BC 0,137 b C 0,168 b AB 0,182 c A 05 0,200 ab A 0,238 a A 0,236 a A 0,251 a A 0,231 b A 50 0,233 a A 0,228 a A 0,217 a A 0,244 a A 0,288 a A Media 0,200 A 0,207 A 0,197 A 0,221 A 0,234 A Tallo SOM 0,113 b A 0,082 b B 0,093 ab B 0,091 b B 0,115 a A 05 0,132 a A 0,131 a A 0,088 b B 0,146 a A 0,132 a A 50 0,144 a A 0,122 a AB 0,112 a B 0,144 a A 0,133 a AB Media 0,130 A 0,112 AB 0,098 B 0,127 A 0,126 A Hojas SOM 0,223 a A 0,214 a A 0,174 a B 0,171 a B 0,135 b C 05 0,195 b A 0,185 b A 0,132 c B 0,127 c B 0,120 c B 50 0,202 b A 0,192 b A 0,164 b B 0,159 b BC 0,148 a C Media 0,207 A 0,197 A 0,157 B 0,152 B 0,134 C Planta SOM 0,168 a A 0,150 a A 0,135 a A 0,143 a A 0,144 a A 05 0,176 a A 0,185 a A 0,152 a A 0,174 a A 0,161 a A 50 0,193 a A 0,181 a A 0,164 a A 0,182 a A 0,190 a A Media 0,179 A 0,172 A 0,150 A 0,167 A 0,165 A Sodio Organo Clon Raíz SOM 0,202 a C 0,331 a B 0,387 a B 0,563 a A 0,629 a A 05 0,087 b D 0,198 b C 0,242 b C 0,303 b B 0,507 b A 50 0,179 a C 0,205 b C 0,262 b BC 0,324 b B 0,476 b A Media 0,156 D 0,245 C 0,297 C 0,396 B 0,537 A Tallo SOM 0,570 a C 1,827 b B 2,512 a A 2,582 a A 2,790 a A 05 0,470 b C 1,823 b B 2,098 b B 2,603 a A 2,837 a A 50 0,412 b C 2,257 a B 2,465 a AB 2,755 a A 2,707 a A Media 0,484 D 1,969 C 2,358 B 2,647 A 2,778 A Hojas SOM 0,025 b E 0,289 b D 0,358 a C 0,712 a B 0,946 a A 05 0,086 a C 0,475 a B 0,443 a B 0,827 a A 0,729 a A 50 0,079 a C 0,291 b B 0,450 a B 0,728 a A 0,836 a A Media 0,063 C 0,352 B 0,417 B 0,756 A 0,837 A Planta SOM 0,266 a B 0,816 a AB 1,086 a A 1,285 a A 1,455 a A 05 0,214 a B 0,832 a AB 0,928 a AB 1,245 a A 1,358 a A 50 0,223 a B 0,917 a AB 1,059 a AB 1,269 a A 1,339 a A Media 0,234 C 0,855 B 1,024 AB 1,266 AB 1,384 A Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. test de rango múltiple de Duncan. (n=6). 59 aumentar la salinidad. Probablemente, el comportamiento tan especial del material de mandioca in vitro que soporta relativamente bien concentraciones de hasta 2 gl -1 de NaCl en el medio pero que cae rápidamente a niveles más altos de sal, pueda ser una explicacón a la falta de correlación negativa K-Na en algunos órganos. V.3.3.4. Calcio. En cuanto al calcio (tabla 12), al contrario de lo indicado para el potasio, los niveles del tallo y de la hoja fueron superiores a los de la raíz. Los contenidos de calcio en la raíz no fueron alterados por la presencia de sal en el medio, mientras que los de tallo y hojas mostraron un ligero descenso al aumentar la salinidad del medio. Descensos similares de calcio con la sal fueron indicados por Troncoso et al (1999) para plantas de vid in vitro. Así mismo, Somal y Yapa (1998), Esechie y Rodríguez (1998) y Yahya, (1998), encontraron un cierto antagonismo entre calcio y NaCl en plantas cultivadas en condiciones externas. V.3.3.5. Magnesio. Los niveles medios más altos de magnesio (tabla 13) se encontraron en las raíces donde no fueron alterados por la presencia de NaCl en el medio. El tallo mostró contenidos más bajos sin que tampoco la sal los modificara. Por el contrario, la hoja presentó cantidades de magnesio similares a los de la raíz en plantas control (0 gl -1 ) y tratadas con 0,5 gl -1 de sal, y más bajas (parecidas a las del tallo) en las sometidas a concentraciones salinas superiores. V.3.3.6. Sodio. Los contenidos de sodio (tabla 13) de todos los órganos y en consecuencia de la planta completa aumentaron al crecer la concentración de sal en el medio. No obstante, dicho aumento fue más significativo al pasar desde el tratamiento control, sin sal, a las primeras aplicaciones de NaCl. Después, los incrementos de Na + en los tejidos fueron 60 Tabla 14. Concentración de cloro (%) y cobre (ppm) en raíz, tallo, hojas y planta completa de los clones SOM-1, 05 y 50 tras 80 días de cultivo in vitro en medio salinizado con NaCl. Cloro Organo Clon Raíz SOM 1,172 a D 1,672 a C 2,123 b B 2,885 a A 2,950 a A 05 1,403 a C 1,848 a C 2,470 a B 3,068 a A 3,065 a A 50 1,352 a B 1,775 a B 2,300 ab A 2,497 b A 2,373 b A Media 1,309 D 1,765 C 2,298 B 2,817 A 2,796 A Tallo SOM 0,775 a C 1,920 a B 2,852 a A 2,957 b A 2,923 b A 05 0,658 a D 1,502 b C 2,738 a B 3,650 a A 3,302 ab A 50 0,700 a D 1,713 ab C 2,915 a B 3,638 a A 3,687 a A Media 0,711 D 1,712 C 2,835 B 3,415 A 3,304 A Hojas SOM 0,301 a CD 0,083 b D 0,446 a BC 0,805 a A 0,682 a AB 05 0,319 a CD 0,145 a D 0,509 a BC 0,967 a A 0,715 a B 50 0,139 b C 0,193 a C 0,568 a B 0,757 a B 1,265 a A Media 0,253 C 0,141 C 0,508 B 0,843 A 0,887 A Planta SOM 0,749 a B 1,225 a AB 1,807 a A 2,216 a A 2,185 a A 05 0,793 a B 1,165 a AB 1,906 a AB 2,562 a A 2,360 a A 50 0,730 a B 1,227 a AB 1,928 a AB 2,297 a A 2,442 a A Media 0,758 B 1,206 B 1,880 AB 2,358 A 2,329 A Cobre Organo Clon Raíz SOM 23 a A 14 a B 16 a B 17 a B 24 b A 05 21 a B 14 a B 17 a B 18 a B 31 a A 50 17 a A 15 a A 8 b B 12 a AB 13 c AB Media 20 A 14 B 14 B 15 B 23 A Tallo SOM 23 a A 8 b B 22 a A 12 a A 15 a A 05 10 b A 10 b A 11 b A 10 a A 16 a A 50 11 b B 14 a AB 8 b B 19 a A 19 a A Media 15 A 10 A 14 A 14 A 17 A Hojas SOM 16 b A 12 a A 11 b A 13 a A 15 a A 05 5 c B 12 a AB 6 c B 17 a A 19 a A 50 24 a A 8 a C 18 a AB 14 a BC 21 a AB Media 15 AB 11 B 11 B 15 AB 19 A Planta SOM 36 a A 11 a B 29 a A 24 a AB 31 a A 05 12 b B 12 a B 11 b B 15 b B 22 ab A 50 17 b AB 12 a BC 11 b C 15 b AB 18 b A Media 22 AB 12 C 17 BC 18 BC 24 A Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Salinidad (gl -1 NaCl) 0 0,5 1 1,5 2 Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. Test de rango múltiple de Duncan. (n=6). 67 de las plantas de acuerdo con su crecimiento y pueden usarse también para determinar si un suelo contiene suficientes sales solubles o sodio intercambiable, que afecte el desarrollo vegetal en forma adversa. (Royo y Aragües, 1989) VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS. Plantas de mandioca (Manihot esculenta Cranz) de los clones SOM-1, 05 y 50, procedentes de cultivo in vitro, se trasplantaron siguiendo la técnica de Cantos et al., (1993), a contenedores de plástico de 1,5 litros de capacidad usando como sustrato 900g del horizonte Ap de un suelo agrícola, cuyas características principales se indican en la tabla 18. Este suelo se esterilizó mediante autoclavado a 121 ºC y vapor fluyente en tres sesiones de 1 hora diaria. Cada contenedor se regó hasta saturación con solución Hoagland al 20 % y se cubrió con una bolsa de plástico transparente en cuyo interior se pulverizó agua destilada para dar mayor humedad. Los contenedores con las plántulas se colocaron en una cámara de cultivo a 22 ± 2ºC, con un fotoperiodo de 16 horas, e intensidad lumínosa de 111 µE m -2 s -1 , permaneciendo en estas condiciones durante 8 días. Finalizado este periodo de adaptación, las plantas se llevaron a un invernadero para su aclimatación, donde las bolsas de plástico se fueron abriendo gradualmente, cortando primero una de sus esquinas y más tarde la otra. Transcurridos 10 días, se comenzaron a eliminar totalmente las bolsas de plástico de aquellos contenedores en los que no se observaba la formación de gotas de agua. Durante los 15 días que duró este periodo de aclimatación, se regó con solución Hoagland al 20 % a intervalos de 5 días. A continuación, las plantas supervivientes de cada clon se repartieron aleatoriamente en tres grupos correspondientes a los tres tratamientos salinos en estudio: solución Hoagland al 20 % (tratamiento control), solución Hoagland al 20% a la que se añadieron 4 gl -1 de NaCl y solución Hoagland al 20 % a la que se añadieron 8 gl -1 de NaCl (tabla 17). La adición de NaCl fue progresiva, prolongándose este periodo de salinización durante 10 días con riegos cada 2 días, e incrementando la concentración salina en 2 gl -1 de NaCl por riego, hasta alcanzar la concentración prevista en cada grupo de plantas. En ese momento, se realizó un nuevo conteo de plantas de cada clon y se consideró como comienzo de la prueba. Después, las plantas pertenecientes a cada tratamiento salino 68 siguieron recibiendo las cantidades de NaCl que le correspondían hasta los 50 días de duración del ensayo. Al finalizar éste, se determinó el peso fresco y seco de un número significativo (ver tabla 20) de las plantas supervivientes. La determinación del peso seco se realizó secando el material en estufa de aire forzado a 70ºC hasta peso constante. El material vegetal seco, se molió en mortero para su análisis químico, en el que se emplearon los métodos en uso en el IRNAS-CSIC. La determinación de Na, Ca, Mg, K, Fe, Cu, Mn y Zn, se realizó mediante emisión de plasma. El contenido de nitrógeno se analizó mediante digestión Kjedhal, y el de fósforo por colorimetría, tras la formación del complejo fosfato-vanadato-molíbdato. La determinación de cloro se realizó por medio de una calcinación en medio básico para evitar pérdidas de cloruros. La muestra de cenizas se extrajo con agua caliente y el cloro del extracto se determinó colorimétricamente con el método del tiocianato de mercurio en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda EZ210. El sustrato a emplear en la prueba fue analizado previamente siguiendo los métodos de análisis de suelo en uso en el IRNAS-CSIC. Fue secado al aire, molido y tamizado por 2 mm y se le determinaron los siguientes parámetros: textura (método del densímetro de Bouyoucos), pH (en extracto de pasta saturada), carbonatos (calcímetro de Bernard), materia orgánica (método de Walkley y Black), nitrógeno (método Kjeldahl), fósforo disponible (método Olsen), potasio asimilable (fotometría de llama), calcio y magnesio asimilables (absorción atómica), manganeso, hierro, cobre y cinc (absorción atómica), densidad aparente (método del cilíndro), densidad real (picnómetro) y potencial capilar (método de Richards). Al finalizar el ensayo se tomaron tres muestras de sustrato de cada tratamiento salino para su análisis. El sustrato fue secado al aire durante 7 días y tamizado a 2 mm. Se tomaron 250 gramos y se realizó un extracto de pasta saturada en donde se determinó la conductividad eléctrica y el pH mediante conductímetro y pH-metro (Crison). En este extracto se determinaron los iones solubles: Na + , K + , Ca 2+ y Mg 2+ . Los cationes cambiables, así como la capacidad de intercambio catiónico, se determinaron mediante extracciones con acetato amónico 1N y pH 7. El porcentaje de saturación se calculó midiendo la cantidad de agua necesaria para llevar los 250 g de sustrato a saturación. La temperatura y humedad en el interior del invernadero fue registrada durante todo el ensayo mediante un termohidrógrafo. 69 El ensayo consistió en un diseño completamente al azar con dos factores; el factor clon, con tres niveles constituidos por los clones SOM-1, 05 y 50, y el factor salinidad también constituido por tres niveles; 0 gl -1 , 4 gl -1 y 8 gl -1 de NaCl en el agua de riego y 16 repeticiones por cada combinación de factores, con un total de 144 contenedores. Los datos estuvieron sometidos a un análisis de la varianza multifactorial (MANOVA) siendo los factores, clon y salinidad, y se empleó el test de rango multiple de Duncan para la separación de medias. En este análisis de datos se utilizó el programa SPSS bajo Windows 10.0. En el estudio de supervivencia se empleó el test-T para diferencias de proporciones mediante un programa realizado en BASIC por este departamento . VI. 3. RESULTADOS VI. 3. 1. Efectos sobre el sustrato. VI.3.1.1.Caracterísicas de las soluciones nutritivas empleadas en los tratamientos. Como disolvente de las sales nutritivas se usó agua de la red de Sevilla capital, con una conductividad eléctrica (CE) de 0,2 dS m -1 , lo que significa que es un agua de muy bajo contenido en sales, perfectamente utilizable para beber y para regar. Tabla 17. Composición de las distintas soluciones empleadas para riego . Tratamiento Control Solución Nº1 Solución Nº2 KNO 3 gl -1 20,2 20,2 20,2 NH 4 H 2 PO 4 gl -1 23 23 23 MgSO 4 . 7H 2 O gl -1 49,3 49,3 49,3 Ca(NO 3 ) 2 . 4H 2 O gl -1 34,8 34,8 34,8 Quelato de hierro % 0,5 0,5 0,5 H 3 BO 3 mg l -1 0,572 0,572 0,572 MnCl 2 . 4 H 2 O mg l -1 0,362 0,362 0,362 ZnSO 4 . 7 H 2 O mg l -1 0,044 0,044 0,044 CuSO 4 . 5 H 2 O mg l -1 0,016 0,016 0,016 H 3 MoO 4 H 2 O mg l -1 0,004 0,004 0,004 NaCl gl -1 0 4 8 mM 0,0 68,4 136,8 C.E. dS m -1 0,46 7,51 14,4 SAR 0 62 124 70 En la tabla 17 se indica la composición química de cada uno de los tratamientos . Dado que todas las plantas recibieron el mismo número y cantidad de riegos, se les aportó la misma cantidad de nutrientes excepto Na + y Cl - . El tratamiento control tuvo una conductividad eléctrica de 0,46 dS m -1 lo que significa un nivel pequeño de salinidad que no afecta al desarrollo normal de una planta. La U.S.S.L. (United States Salinity Laboratory, 1969) clasifica esta agua como C.2. S.1. y se le calculó una presión osmótica de –0,17 bares. En el primer tratamiento se añadieron a la solución control 4 gl -1 (68,4 mM) de NaCl, lo que elevó la conductividad eléctrica a 7,54 dS m -1 y el SAR a 62. En este caso, el agua se clasifica como C.4.S.4 . y se le calculó una presión osmótica de –2,75 bares. Según los datos indicados la solución se puede considerar como bastante salina no utilizable para riegos salvo en casos excepcionales. En el segundo tratamiento se añadieron a la solución base 8 gl -1 (136,8 mM) de NaCl, lo que provocó un incremento de la conductividad eléctrica a 14,4 dS m -1 y del SAR a 124,1, valores que se salen completamente de la tabla de clasificación del U.S.S.L. La presión osmótica calculada fue de –5, 25 bares. Una solución nutritiva de estas características no debe ser utilizada para el cultivo de plantas en condiciones normales y se usó en el presente trabajo para provocar una situación de exceso de sal. VI.3.1.2. Influencia de los tratamientos salinos sobre el sustrato. En la tabla 18 se indican las características físicas y químicas del suelo usado como sustrato. Se trata de un suelo franco arenoso, con una densidad aparente adecuada y una cantidad de agua útil de 0,05 cm 3 de agua por cm 3 . Ligeramente alcalino y con una conductividad eléctrica de 2,29 dS m -1 medidos en extracto de pasta saturada. Los contenidos de materia orgánica y de nitrógeno son bajos estableciéndose una relación C/N de 7,8. Este valor es muy bajo y propio de suelos erosionados, agotados y excesivamente labrados, donde el proceso de nitrificación ha sido muy intenso, observándose un contenido en nitrógeno en forma nítrica de 54 mg Kg -1 , que es considerado normal. Este suelo tiene un nivel alto en fósforo asimilable, normal en potasio y bajo en calcio y magnesio. Los contenidos de micronutrientes son adecuados. En términos de fertilidad actual, los contenidos encontrados en la solución del suelo son bajos para todos los elementos analizados, mientras que los observados en el 71 complejo de intercambio catiónico (fertilidad potencial) son adecuados para calcio y elevados para magnesio, sodio y potasio. Tabla 18. Características físicas y químicas del substrato. Arena % 75,8 Textura Limo " 8 Arcilla " 16,2 Densidad aparente. g/cc 1,37 Densidad real " 2,62 Potencial capilar 1/3 atm 13,8 15 " 10,1 Porosidad total % 47,9 pH 7,45 carbonatos % <1 Materia orgánica " 0,8 N(total) " 0,03 C/N 7,8 N-NO 3 mg Kg -1 de suelo 54 Fósforo " 16 Potasio " 199 Calcio " 161 Magnesio " 113 Manganeso " 23 Hierro " 20 Cobre " 9 Cinc " 50 La adición de las diferentes soluciones salinas a este substrato modificó la C.E. el SAR , PSI y presión osmótica de la solución del suelo (extracto de pasta saturada) (Tabla 19). La aplicación de riegos con las cantidades de NaCl antes mencionadas dio lugar a un aumento de la conductividad eléctrica del extracto de pasta saturada del suelo a 10,53 y 17,5 dS m -1 para los tratamientos de 4 y 8 g l -1 respectivamente. Este aumento de la salinidad produjo un aumento de las concentraciones de calcio, magnesio, sodio y potasio en la solución del suelo, aunque este aumento fue más importante en el ión sodio. Asímismo, la mayor proporción del ión sodio en la solución del suelo tuvo como consecuencia una mayor adsorción de éste en el complejo de intercambio catiónico y consiguiente salida de los cationes calcio y magnesio. 72 Tabla 19. Influencia de los tratamientos sobre la salinización del substrato. Tratamiento Extracto de pasta 0 gl -1 NaCl 4 gl -1 NaCl 8 gl -1 NaCl CE (extracto) dSm -1 2,3 10,5 17,5 SAR 1,3 12,1 16,4 PSI 0,68 14,2 18,6 P. Osmótica atm -0,83 -3,8 -6,4 Cambiables meq/100 g CIC " 7,5 7,3 7 (Ca + Mg) " 6,82 4,76 1,98 K " 0,49 0,42 0,43 Na " 0,19 2,12 4,6 Solubles meql -1 Ca " 16,5 35,6 54,3 Mg " 5,1 11,2 15,4 K " 0,98 1,3 1,6 Na " 4,4 58,8 96,9 Total " 26,98 106,9 168,2 Los riegos en el tratamiento de 4 gl -1 de NaCl produjeron un PSI de 14,3 y una conductividad eléctrica de 10,5 dS m -1 pudiendo clasificar este suelo de salino. En el tratamiento de 8 gl -1 de NaCl se alcanzó un PSI de 18,7 y una conductividad eléctrica de 17,5 dS m -1 siendo este suelo similar a un suelo salinosódico. VI. 3. 2. Tolerancia de las plantas de mandioca a la salinidad del medio. VI.3.2.1. Supervivencia. Una vez transcurrido el periodo de adaptación de 23 días tras el trasplante de in vitro a ex vitro, en el que se produjeron pérdidas del 23, 11 y 29 % respectivamente para los clones SOM-1, 05 y 50, los distintos grupos de plantas se sometieron a los tratamientos salinos correspondientes (tabla 20). Durante los 50 días de duración de la prueba, no se produjeron bajas (plantas muertas) en ninguno de los tres clones, con el tratamiento control sin NaCl (tabla 21). Este hecho es importante para valorar los resultados de la prueba, ya que indicó unas adecuadas condiciones de experimentación y buena aptitud de las plantas, lo que permitió relacionar las pérdidas producidas en los otros tratamientos con la acción de la sal. 73 fig. 12. Temperaturas máximas, mínimas y medias registradas en el invernadero durante el desarrollo de la prueba. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Días ºC Aclimatación Salinización Desarrollo de la prueba Tabla 20. Número de plantas vivas registradas en cada una de las etapas del proceso desde el trasplante a suelo hasta la finalización del proceso de salinización. Clon SOM 05 50 48 ( 100) aA 48 ( 100) aA 48 ( 100) aA 40 (83,3) aB 44 (91,6) aB 44 (91,6) aB 37 (77,0) aB 43 (89,6) aB 34 (71,0) aC 0 g/l 12 ( 100) 14 ( 100) 11 ( 100) 4 g/l 12 ( 100) 14 ( 100) 11 ( 100) 8 g/l 13 ( 100) 14 ( 100) 12 ( 100) Trasplante: (0 días) Adaptación: (8 días) Aclimatación: (15 días) Salinización: (10 días) Test T-student para diferencias de proporciones. Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) entre clones (minúsculas) y/o entre etapas (mayúsculas). Al ser la mandioca un cultivo de clima tropical, las bajas temperaturas influyen mucho sobre su desarrollo y supervivencia. Así, temperaturas por debajo de 20ºC frenan su crecimiento y 10ºC originan una elevada mortandad entre plantas de mandioca similares a las utilizadas en el experimento. Las temperaturas habidas en el invernadero durante esta prueba (fig. 12) indican que no pudo existir acción negativa importante por parte de este factor climático, lo que también avaló la relación directa entre las bajas producidas y la salinidad. La adición al medio control de 4 gl -1 de sal produjo pérdidas significativas de plantas en los clones SOM-1 y 50 a los 35 días del comienzo de la prueba y en el clon 05 a los 40, para después mantenerse con valores similares hasta el final del 74 experimento (tabla 21). En ningún caso, se encontraron diferencias significativas entre clones. Cuando a la solución nutritiva del agua de riego se añadieron 8 gl -1 de NaCl, la acción de la sal fue mucho más manifiesta. Como en el caso anterior, no se observaron bajas significativas durante los primeros 30 días de iniciado el experimento. A los 35 días se produjeron pérdidas en todos los clones que fueron pequeñas y no significativas en el clon SOM-1, e importantes y significativas en los otros dos clones. A partir de esa fecha, descendió significativamente el número de plantas vivas del clon SOM-1, aunque quedaron vivas algunas de ellas y murieron todas las plantas de los clones 05 y 50. Es decir, se pudo distinguir entre el comportamiento de 05 y de 50 con pérdidas mayores y más precoces y el clon SOM-1 que soportó mejor la sal. Tabla 21. Plantas vivas registradas a los 0, 30, 35, 40, 45 y 50 días después de alcanzado el nivel de sal en el agua de riego fijado para el ensayo. 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 SOM-1 12 ( 100) aA 12 ( 100) aA 13 ( 100) aA 0 días 05 14 ( 100) aA 14 ( 100) aA 14 ( 100) aA 50 11 ( 100) aA 11 ( 100) aA 12 ( 100) aA SOM-1 12 ( 100) aA 12 ( 100) aA 13 ( 100) aA 30 días 05 14 ( 100) aA 14 ( 100) aA 12 (85,7) aA 50 11 ( 100) aA 11 ( 100) aA 12 ( 100) aA SOM-1 12 ( 100) aA 8 (66,6) aB 10 (76,9) aA 35 días 05 14 ( 100) aA 12 (85,7) aA 3 (21,4) bB 50 11 ( 100) aA 7 (63,6) aB 3 (25,0) bB SOM-1 12 ( 100) aA 7 (58,3) bB 6 (46,1) bB 40 días 05 14 ( 100) aA 12 (85,7) bB 50 11 ( 100) aA 7 (63,6) bB SOM-1 12 ( 100) aA 7 (58,3) bB 4 (30,7) bB 45 días 05 14 ( 100) aA 10 (71,4) bB 50 11 ( 100) aA 7 (63,6) bB SOM-1 12 ( 100) aA 7 (58,3) bB 50 días 05 14 ( 100) aA 10 (71,4) bB 50 11 ( 100) aA 7 (63,6) bB Concentración de NaCl en el medio Test T-student para diferencias de proporciones. Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) entre clones (minúsculas) y/o entre etapas (mayúsculas). En consecuencia, bajo el punto de vista de la supervivencia de las plantas, los tres clones de mandioca utilizados, soportaron aceptablemente el tratamiento de 4 gl -1 75 de NaCl en el agua de riego, sin que se pudieran establecer diferencias significativas entre ellos. Este tratamiento, como se indicó antes, tuvo una CE de 7,5 dS/m en el agua de riego y SAR de 62, produciendo en el suelo una CE de 10,5 en extracto de pasta saturada, lo que indica una salinidad elevada. La solución de 8 gl -1 de sal con una CE de 14,4 dS/m en el agua de riego y de 17,5 dS/m en extracto de pasta saturada fue excesiva para el nivel de tolerancia de los tres clones de mandioca en consideración, sin embargo permitió distinguir entre ellos definiendo un mejor comportamiento ante la sal y mejor tolerancia del clon SOM.-1. VI. 3. 2. 2. Desarrollo de plantas supervivientes. Como medida del desarrollo de las plantas supervivientes de cada tratamiento y clon, se eligió el peso fresco y seco de ellas, representado por el de la media en cada caso. A partir de estas magnitudes se calculó además el tanto por ciento de agua en los tejidos. ({(Pf-Ps)/Pf}.100). Tabla 22. Influencia de la salinidad sobre el peso fresco (en mg) de raíz, tallo, hojas y planta completa en los tres clones de mandioca (en el clon SOM-1 la medida fue tomada a los 45 días y en los clones 05 y 50 a los 35 días para el tratamiento de 8 gl -1 ). Organo Clon Raíz SOM-1 100,0 a B 196,0 a B 380,0 A 05 84,5 a B 188,9 a A 176,0 AB 50 56,4 a B 195,6 a A 172,0 A Media 80,3 B193,5 A Tallo SOM-1 983,8 a A 738,0 a A 773,0 A 05 648,8 b A 425,0 b A 359,0 A 50 440,8 b A 485,6 b A 333,0 A Media 691,1 A549,5 A Hojas SOM-1 1229,2 a A 605,0 a B 438,0 B 05 987,6 a A 341,7 a B 166,0 B 50 726,9 a A 444,4 a AB 121,0 B Media 981,2 A463,7 B Planta SOM-1 2313,1 a A 1538,8 a A 1591,0 A 05 1720,9 ab A 955,6 a B 701,0 B 50 1204,0 b A 1125,6 a A 626,0 A Media 1746,0 A1206,6 B 048 Salinidad (gl -1 NaCl) Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,01) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. test de rango múltiple de Duncan. 76 La presencia de NaCl en el sustrato influyó negativamente sobre el peso fresco de los órganos aéreos y en el total de las plantas, aunque con diferencias entre clones. El clon 05 fue el más claramente afectado ya que fue el de más biomasa en el tratamiento control y el de menos en cada uno de los tratamientos salinos. Después el clon 50 el de menor peso fresco en el tratamiento control, resistió bien el tratamiento con la concentración menor de NaCl pero se afectó fuertemente cuando se añadieron al medio nutritivo 8 gl -1 de la sal (tabla 22). Tabla 23. Influencia de la salinidad sobre el peso seco (en mg) de raíz, tallo, hojas y planta completa en los tres clones de mandioca (en el clon SOM-1 la medida fue tomada a los 45 días y en los clones 05 y 50 a los 35 días para el tratamiento de 8 gl -1 ). Organo Clon Raíz SOM-1 50,3 a A 42,1 a A 69,4 A 05 33,3 a A 44,4 a A 20,8 B 50 24,0 a B 36,5 a A 28,5 AB Media 35,8 A41,0 A Tallo SOM-1 208,7 a A 126,1 a A 150,6 A 05 103,1 b A 79,0 a A 58,7 A 50 59,5 b A 77,1 a A 61,2 A Media 123,8 A94,1 A Hojas SOM-1 205,0 a A 132,2 a A 229,9 A 05 164,6 ab A 85,4 a B 107,5 B 50 107,5 b A 94,6 a A 85,7 A Media 159,0 A104,1 B Planta SOM-1 464,0 a A 314,2 a A 436,3 A 05 301,0 ab A 208,9 a A 152,6 A 50 181,3 b A 208,1 a A 191,0 A Media 315,4 A243,7 A 048 Salinidad (gl -1 NaCl) Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,01) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. test de rango múltiple de Duncan Al igual que ocurrió con la supervivencia de las plantas, el clon de mandioca SOM-1 fue el menos afectado en su desarrollo por la presencia de sal en el medio. El peso fresco de las plantas sometidas a la salinidad, en especial las que recibieron mayores concentraciones de NaCl fue netamente superior al de los otros clones. Por el contrario, las raíces de las plantas tratadas con NaCl tuvieron mayor peso fresco que las del control. 83 Tabla 27. Concentración de potasio y calcio (%) en raíz, tallo, hojas y planta completa de los tres clones, creciendo en invernadero y sometidos a distintos tratamientos salinos con NaCl (en el tratamiento de 8 gl - 1 los datos corresponden a plantas creciendo durante 45 días, para el clon SOM-1 y 35 dias en los clones 05 y 50). Potasio Organo Clon Raíz SOM 0,494 a B 0,385 a B 1,304 A 05 0,270 a A 0,355 a A 0,931 A 50 0,457 a A 1,234 a A 1,505 A Media 0,407 A0,658 A Tallo SOM 1,672 b A 1,104 a A 1,876 A 05 2,297 ab A 1,208 a B 1,420 B 50 2,414 a A 1,143 a B 1,320 B Media 2,128 A1,152 B Hojas SOM 2,058 a A 2,100 a A 2,230 A 05 1,792 a B 1,888 a AB 2,293 A 50 1,820 a A 1,967 a A 2,140 A Media 1,890 A1,985 A Planta SOM 1,408 a A 1,196 a A 1,803 A 05 1,453 a A 1,150 a A 1,548 A 50 1,564 a A 1,448 a A 1,655 A Media 1,475 A1,265 A Calcio Organo Clon Raíz SOM 2,350 a AB 2,522 a A 1,625 B 05 2,043 a A 2,088 a A 1,858 A 50 2,277 a A 2,318 a A 1,485 B Media 2,223 A2,309 A Tallo SOM 1,175 b B 2,483 a A 2,698 A 05 1,712 a A 2,265 ab A 2,355 A 50 1,443 ab A 1,404 b A 1,903 A Media 1,443 B2,051 A Hojas SOM 2,048 a B 2,750 a A 3,112 A 05 2,347 a C 2,945 a B 3,512 A 50 1,808 a C 3,285 a B 3,667 A Media 2,068 B2,993 A Planta SOM 1,858 a B 2,585 a A 2,478 A 05 2,034 a A 2,433 a A 2,575 A 50 1,843 a A 2,336 a A 2,352 A Media 1,911 B2,451 A 0 4 8 Salinidad (gl -1 NaCl) Salinidad (gl -1 NaCl) 0 4 8 Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,01) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. Test de rango múltiple de Duncan. 84 bastante parecidos. En la media de ellos, se produjo una acumulación en el tallo, hoja y por ello en el total de la planta ante la presencia de sal, mientras que en la raíz descendió (tabla 27). VI.3.2.4.5. Magnesio. Los niveles de este nutriente fueron también similares entre clones y experimentaron un aumento con la salinidad del medio (tabla 28). VI.3.2.4.6. Sodio. La concentración de sodio en las plantas de mandioca aumentó en el tratamiento de 4 gl -1 y se mantuvo en valores similares en el tratamiento de 8 gl -1 , siendo el tallo el principal acumulador de este elemento. La concentración de sodio en la raíz aumentó progresivamente con el aumento de la salinidad (tabla 28) sin que se observaran diferencias entre los clones. VI.3.2.4.7. Cloro. La concentración de cloro en la planta aumentó con la salinidad en los tres órganos analizados y principalmente en tallo y hojas. En la raíz la concentración de cloro aumentó bastante entre el testigo y el tratamiento de 4 gl -1 y algo menos entre este y el tratamiento de 8 gl -1 (tabla 29). VI.3.2.4.8. Micronutrientes . En los micronutrientes considerados tampoco se encontraron diferencias entre los clones, ni modificaciones ante la presencia de sal (NaCl) en el sustrato que permitieran definir algún tipo claro de influencia de la concentración situación de ésta sobre el nivel de los oligoelementos (tablas 29, 30 y 31). En consecuencia, como en otras situaciones tratadas antes, la mayor influencia sobre el contenido de nutrientes de la planta de mandioca alimentada con solución nutritiva con NaCl, fue la fuerte acumulación de estos elementos (Na + y Cl - ). Se observó por ello una alteración importante del equilibrio nutritivo de la planta. 85 Tabla 28. Concentración de magnesio y sodio (%) en raíz, tallo, hojas y planta completa de los tres clones, creciendo en invernadero y sometidos a distintos tratamientos salinos con NaCl (en el tratamiento de 8 gl - 1 los datos corresponden a plantas creciendo durante 45 días, para el clon SOM-1 y 35 dias en los clones 05 y 50). Magnesio Organo Clon Raíz SOM 0,431 a B 0,504 a B 0,685 A 05 0,345 a A 0,453 a A 0,623 A 50 0,411 a B 0,525 a A 0,530 A Media 0,396 A0,494 A Tallo SOM 0,127 b B 0,520 a A 0,500 A 05 0,185 ab B 0,407 ab A 0,401 A 50 0,220 a A 0,223 b A 0,297 A Media 0,177 B0,383 A0,399 Hojas SOM 0,403 a B 0,464 ab A 0,519 A 05 0,400 a B 0,517 a A 0,526 A 50 0,327 a B 0,442 b AB 0,482 A Media 0,377 B0,474 A Planta SOM 0,320 a B 0,496 a A 0,568 A 05 0,310 a B 0,459 a A 0,517 A 50 0,319 a A 0,396 a A 0,436 A Media 0,317 B0,450 A Sodio Organo Clon Raíz SOM 0,300 a C 1,420 a B 2,536 A 05 0,254 a B 1,346 a A 1,668 A 50 0,478 a B 1,559 a A 1,688 A Media 0,344 B1,442 A Tallo SOM 0,129 a B 5,650 a A 5,752 A 05 0,292 a C 2,878 ab B 4,085 A 50 0,314 a B 2,375 b A 3,097 A Media 0,245 B3,634 A Hojas SOM 0,226 a B 0,403 a A 1,112 A 05 0,274 a B 0,435 a A 1,370 A 50 0,187 a B 0,683 a A 1,407 A Media 0,229 B0,507 A Planta SOM 0,218 a B 2,491 a A 3,133 A 05 0,273 a B 1,553 a A 2,374 A 50 0,326 a B 1,539 a A 2,064 A Media 0,272 B1,861 A 0 4 8 0 4 8 Salinidad (gl -1 NaCl) Salinidad (gl -1 NaCl) Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,01) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. Test de rango múltiple de Duncan. 86 Tabla 29. Concentración de cloro (%) y cobre (ppm) en raíz, tallo, hojas y planta completa de los tres clones, creciendo en invernadero y sometidos a distintos tratamientos salinos con NaCl (en el tratamiento de 8 gl - 1 los datos corresponden a plantas creciendo durante 45 días, para el clon SOM-1 y 35 dias en los clones 05 y 50). Cloro Organo Clon Raíz SOM 0,297 b C 1,718 b B 4,052 A 05 0,353 b B 2,353 ab A 1,598 AB 50 0,768 a B 3,438 a A 2,945 A Media 0,473 B2,503 A Tallo SOM 0,402 b C 3,355 a B 6,153 A 05 0,686 a C 4,237 a B 5,887 A 50 0,789 a B 3,897 a A 4,713 A Media 0,626 B3,829 A Hojas SOM 0,363 a C 3,040 a B 4,945 A 05 0,202 a C 3,118 a B 4,293 A 50 0,317 a C 3,246 a B 4,463 A Media 0,294 B3,135 A Planta SOM 0,354 b C 2,704 a B 5,050 A 05 0,414 b B 3,236 a A 3,926 A 50 0,625 a B 3,527 a A 4,041 A Media 0,464 B3,156 A Cobre Organo Clon Raíz SOM 33 b B 60 a A 74 A 05 36 b B 52 a AB 67 A 50 67 a A 55 a A 62 A Media 45 B55 A Tallo SOM 18 a A 22 a A 24 A 05 13 a A 14 a A 13 A 50 16 a A 18 a A 14 A Media 16 A18 A Hojas SOM 18 a A 14 a B 16 AB 05 16 a A 13 a A 14 A 50 13 a A 16 a A 15 A Media 16 A14 A Planta SOM 23 a A 32 a A 25 A 05 22 a A 26 a A 31 A 50 32 a A 30 a A 30 A Media 26 A29 A 0 4 8 0 4 8 Salinidad (gl -1 NaCl) Salinidad (gl -1 NaCl) Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,01) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. Test de rango múltiple de Duncan. 87 Tabla 30. Concentración de hierro y manganeso (ppm) en raíz, tallo, hojas y planta completa de los tres clones, creciendo en invernadero y sometidos a distintos tratamientos salinos con NaCl (en el tratamiento de 8 gl - 1 los datos corresponden a plantas creciendo durante 45 días, para el clon SOM-1 y 35 dias en los clones 05 y 50). Hierro Organo Clon Raíz SOM 4132 b AB 5338 a A 3860 B 05 4315 ab A 5233 a A 5368 A 50 6221 a A 4494 a AB 4001 B Media 4889 A5022 A Tallo SOM 86 b B 194 a AB 277 A 05 185 a B 215 a B 330 A 50 166 a A 181 a A 419 A Media 146 A197 A Hojas SOM 303 a A 289 a A 349 A 05 257 a B 276 a B 347 A 50 234 a A 321 a A 344 A Media 265 A295 A Planta SOM 1507 a A 1940 a A 1495 A 05 1586 a A 1908 a A 2015 A 50 2207 a A 1666 a A 1588 A Media 1766 A1838 A Manganeso Organo Clon Raíz SOM 436 a A 708 a A 901 A 05 526 a A 563 a A 668 A 50 544 a A 545 a A 654 A Media 502 A605 A Tallo SOM 73 a B 121 a AB 181 A 05 81 a B 101 a AB 129 A 50 89 a A 74 a A 104 A Media 81 A99 A Hojas SOM 143 a A 187 a A 247 A 05 145 a B 239 a A 284 A 50 174 a B 248 a AB 289 A Media 154 B225 A Planta SOM 218 a A 339 a A 443 A 05 251 a A 301 a A 360 A 50 269 a A 289 a A 349 A Media 246 A310 A 0 4 8 0 4 8 Salinidad (gl -1 NaCl) Salinidad (gl -1 NaCl) Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,01) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. Test de rango múltiple de Duncan. 88 Tabla 31. Concentración de cinc (ppm) en raíz, tallo, hojas y planta completa de los tres clones, creciendo en invernadero y sometidos a distintos tratamientos salinos con NaCl (en el tratamiento de 8 gl - 1 los datos corresponden a plantas creciendo durante 45 días, para el clon SOM-1 y 35 dias en los clones 05 y 50). Cinc Organo Clon Raíz SOM 141 a A 213 a A 225 A 05 133 a B 157 a AB 275 A 50 252 a A 240 a A 163 A Media 176 A203 A Tallo SOM 99 a A 102 a A 193 A 05 48 a A 101 a A 98 A 50 92 a A 122 a A 181 A Media 80 A108 A Hojas SOM 77 a A 82 b A 88 A 05 80 a AB 63 b B 127 A 50 55 a B 137 a A 143 A Media 71 A94 A Planta SOM 106 a A 132 a A 168 A 05 87 a B 107 a AB 166 A 50 133 a A 166 a A 162 A Media 109 A135 A 0 4 8 Salinidad (gl -1 NaCl) Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,01) en mayúscula y en fila para los tratamientos salinos y en minúscula y en columna para los clones. Test de rango múltiple de Duncan. VI.4. DISCUSIÓN Se debe destacar la tolerancia tan distinta ante la sal de la planta de mandioca en condiciones de cultivo in vitro o de invernadero. Como se indicó antes, las plantas cultivadas in vitro sólo soportaron concentraciones salinas inferiores a 2,5 gl -1 de NaCl, lo que demostró cierta sensibilidad a la sal, mayor que la definida para material similar de vid (Troncoso et al, 1999a) o de olivo (Troncoso et al., 1999b). Por el contrario, las plantas de mandioca, mayores, más desarrolladas, en condiciones de invernadero llegaron a soportar durante un cierto tiempo concentraciones de 8 gl -1 de NaCl. No obstante las diferencias indicadas, existió una correspondencia entre el comportamiento relativo de cada clon in vitro y ex vitro. Así, SOM-1 fue el que demostró mayor tolerancia a la sal en ambas situaciones como corresponde a una especie recogida en el desierto árido-salino de Somalia. Por el contrario, 05 fue el clon que demostró mayor sensibilidad de acuerdo también con su origen de la zona tropical 89 lluviosa de las antiguas colonias francesas de Africa Occidental. Además, tanto in vitro como en el invernadero, cada uno en su nivel, la sal ejerció los mismos efectos sobre la planta de mandioca. Cuando la concentración fue suficientemente elevada provocó la muerte de algunas plantas y disminuyó el desarrollo (peso fresco, peso seco, crecimiento, formación de yemas y de hojas) de las supervivientes. También en ambos casos (in vitro y ex vitro), la presencia de sal en el medio disminuyó el contenido de agua de las hojas en aquellos clones tolerantes, y provocó una fuerte acumulación de Na + y Cl - en los tejidos de la planta. El primer efecto, concuerda con lo indicado en la bibliografía sobre la acción de la sal sobre la presión osmótica medio-planta, que se considera como la acción más inmediata de la sal sobre la planta (Munns, 1993). El hecho de que la falta de agua aparezca primero en la hoja coincide con lo indicado por Newman (1997) sobre que la acumulación de sal se manifiesta con un proceso de senescencia foliar que impide nuevos crecimientos de la planta. Munns et al., (1995), también indicaron que la afectación foliar fué determinante para medir la tolerancia de la planta a la salinidad y Franco et al., (1997), relacionaron la variación del área foliar con la tolerancia a la sal. El otro rasgo característico de la presencia de NaCl en el medio, es la modificación de la composición mineral de la planta, en especial la acumulación de Na + y Cl - . Este proceso que, como se ha indicado antes, es otra manifestación del efecto tóxico de la sal, que se acepta actúa a más largo plazo que la deshidratación (He y Cramer, 1993), se produjo tanto en las plantas cultivadas in vitro, como en las mantenidas en invernadero. Existió, en consecuencia, un paralelismo entre el comportamiento ante la sal de la planta de mandioca in vitro y ex vitro, aunque a los niveles respectivos de tolerancia indicados antes. Esta relación in vitro-ex vitro de comportamiento ante la sal de la planta de mandioca, ha sido demostrada por primera vez en este trabajo y se considera de gran importancia. En efecto, el uso del cultivo in vitro para la selección de plantas de mandioca tolerantes a la salinidad representa una gran ventaja debido al ahorro de trabajo y tiempo de estos estudios. 90 VII. EFECTO DE LA MICORRIZA. VII.1. INTRODUCCIÓN. Los hongos micorrícicos arbusculares benefician a las plantas, permitiéndoles crecer y producir mejor en suelos de baja fertilidad química. La asociación micorrícica, juega un papel esencial en los ciclos de materia y energía de ecosistemas con suelos generalmente pobres en agua y nutrientes, en especial nitrógeno y fósforo (Read, 1991). Existen varias razones que justifican este comportamiento entre las que destaca el aumento del volumen de terreno colonizado por la planta, con mayor cantidad de nutrientes disponibles (Clark y Zeto, 2000). También, la mayor captación de nutrientes depende del incremento de la superficie absorbente de la raíz, movilización de fuentes de nutrientes y excreción de compuestos quelantes o ectoenzimas. Autores como Gilmore (1971), Rhodes y Gerdemann (1975), Tinker (1978) y Tinner y Leyder (1978) confirman que la micorriza aumenta el crecimiento de la planta por el aumento de la absorción de nutrientes en especial P, Cu y Zn. Por regla general, las micorrizas vesículo-arbusculares (MVA) no sólo provocan un incremento en la formación de biomasa, sino que afectan igualmente a la distribución de ésta entre parte aérea y raíz con beneficio relativo del componente autotrófico (Smith 1980). La competencia entre el hongo y la raíz por los fotosintatos parece ser la principal causa de la mayor relación en peso seco de la parte aérea sobre la raíz que se da en plantas micorrizadas.(Berta et al., 1990; Marschner y Dell, 1994). La formación mantenimiento y función de las micorrizas requiere en torno al 20% de los fotosintatos producidos por la planta (Jacobsen y Rosendahl, 1990). Algunos investigadores (Allen y Allen, 1986) consideran que la respuesta micorrícica sólo tiene lugar durante periodos de estrés. Varios trabajos llevados a cabo en campo (Davies et al., 1992) demuestran un efecto protector de las micorrizas frente situaciones de estrés tanto biótico como abiótico, que se argumenta en gran parte mediante la estimulación del crecimiento provocado por la micorriza. Existen estudios que consideran la importancia de la simbiosis MVA en el crecimiento y nutrición de plantas desarrolladas en hábitats salinizados. (Hirrel and Gerdemann, 1980; Pond et al., 1984). 91 El mecanismo por el que se consigue esta reducción del estrés puede estar relacionado con la mejora en la nutrición fosforada (Hirrel y Gerdemann, 1980; Ojala et al., 1983). También se ha encontrado un descenso en la concentración de cloro en plantas de Parthenicum argentatum micorrizadas cuando crecen en ambientes salinos en comparación con plantas no micorrizadas (Pfeiffer y Bloss, 1988) El incremento de prolina como consecuencia de la salinidad en lechuga (Lactuca sativa L.) fue considerablemente menor en plantas colonizadas por Glomus fasciculatum y Glomus deserticola que en plantas no inoculadas o inoculadas con Glomus mosseae, lo que indicó que las plantas micorrizadas con estos dos hongos estuvieron menos afectadas por la salinidad (Ruíz-Lozano et al., 1996). Estos autores no encontraron diferencias en el contenido de fósforo entre plantas micorrizadas y plantas no micorrizadas con aportes de este nutriente, por lo que sugieren que los mecanismos por los cuales estos hongos alivian el estrés salino pueden estar basados en procesos fisiológicos con un incremento en la tasa de intercambio de CO 2 , transpiración, conductancia estómatica y eficiencia en la utilización de agua. Por otra parte, se observó un descenso en la concentración de calcio y magnesio en plantas de alfalfa (Medicago sativa L) micorrizadas. Sin embargo, no todas las MVA aumentan el crecimiento en suelos salinos. (Azcón et al., 1976; Hirrel and Gerdemann, 1980; Rosendahl and Rosendahl, 1991). La mandioca, como muchas especies tropicales que se cultivan sobre suelos pobres, presenta hábitos micotróficos y un considerable grado de dependencia de la simbiosis planta-micorriza para un desarrollo adecuado (Sieverding, 1991). Por otra parte, las micorrizas arbusculares juegan un papel decisivo en la aclimatación de plantas micropropagadas (Hooker et al., 1994) entre ellas la mandioca (Azcón-Aguilar et al., 1997). VII.2. MATERIALES Y METODOS. En un primer ensayo se estudió el comportamiento de los tres clones de mandioca frente a la micorriza durante el proceso de adaptación y aclimatación desde in vitro a condiciones externas o ex vitro. Para ello, se trasplantaron 12 plantas de mandioca (Manihot esculenta Cranz) de cada uno de los clones SOM-1, 05 y 50 procedentes de cultivo in vitro a contenedores con un sustrato esterilizado en autoclave a 92 121ºC y vapor fluyente durante tres días en sesiones de una hora diaria. La mitad de los contenedores fueron infectados con 5 g de inóculo de Glomus deserticola (II Ag 8903), facilitado por la E.E. el Zaidín del CSIC. Después del trasplante, las plántulas se cubrieron con una bolsa de plástico transparente en cuyo interior se pulverizó agua destilada mientras que el sustrato de los contenedores se humedeció con solución Hoagland al 20%. Seguidamente, las plantas se llevaron a una cámara de ambiente controlado para su adaptación a 22±2 ºC de temperatura, fotoperíodo de 16 horas por dia e intensidad luminosa de 111 µEm -2 s -1 , permaneciendo en estas condiciones durante 8 días. Finalizado este periodo de adaptación, las plantas se llevaron a un invernadero para su aclimatación, donde las bolsas de plástico se fueron abriendo gradualmente, cortando primero una de las esquinas y más tarde la otra. Las plantas se regaron cada 3 días con 100 cc de agua de la red. Cada 7 días se midió la longitud del tallo, el número de yemas y el número de hojas de cada planta. A los 42 días, las plantas fueron retiradas de los contenedores y separadas en raíz, tallo y hojas, pesadas para determinar su peso fresco. La determinación del peso seco se realizó secando el material en estufa de aire forzado a 70ºC hasta peso constante. En un segundo ensayo, se estudió el efecto de la micorriza sobre la tolerancia a la salinidad en plantas de mandioca. Como plantas control, sin micorrizar, se utilizaron las mismas estudiadas en el capítulo anterior dado que ambos experimentos fueron contemporáneos y hechos en el mismo lugar. Para la micorrización de las plantas se siguió el mismo procedimiento de trasplante y adaptación indicado antes, pero inoculando los contenedores respectivos con Glomus fasciculatum. La aplicación de la sal se hizo del modo indicado en el capítulo anterior. Una vez finalizado el ensayo, se tomó una muestra de raíces de cada clon y tratamiento salino, que fueron teñidas con azul trypan para observar su estado de micorrización. Para ello, las raíces se depositaron en tubos de ensayo con agua destilada durante 24 horas para su hidratación. A continuación, se lavaron en agua destilada para eliminar los restos de suelo que habían quedado adheridos a ellas. Las raíces lavadas se colocaron de nuevo en tubos de ensayo a los que se les añadió KOH al 10% permaneciendo durante 24 horas en esta solución. Seguidamente, los tubos con las raíces se autoclavaron durante 20 minutos a 121 ºC y 1 atm de presión. Después, se eliminó el KOH y se realizaron 3 lavados con agua destilada dejando finalmente las raíces inmersas en HCl al 5 % durante cinco minutos. A continuación, se eliminó el ácido y se llenaron los tubos con azul trypan al 0,05% en ácido láctico, glicerina y agua (1:1:1) autoclavando nuevamente las muestras 99 Con el peso seco ocurrió algo parecido, aunque en este caso, no existieron modificaciones importantes en la biomasa radical y los descensos de la parte aérea fueron relativamente más pequeños (tabla 36) que en el peso fresco. Como con las plantas no micorrizadas, la salinidad del medio hizo disminuir el grado de hidratación de los tejidos de la hoja (tabla 36) de las plantas micorrizadas. No obstante en estas últimas, el descenso fue menor, en especial en el tratamiento de 4 gl -1 de NaCl y en el clon SOM-1. En consecuencia, la micorriza mejoró la tolerancia a la sal en los tres clones lo que se reflejó en una mayor producción de biomasa y en una mejor conservación de la humedad de los tejidos de la hoja ante una misma concentración de NaCl en el medio. En lo referente al estado nutritivo, el comportamiento de las plantas micorrizadas ante la sal (tablas 37, 38, 39 y 40) fue muy parecido al indicado antes para las plantas no micorrizadas (tablas 26 a 31), salvo en un mayor nivel de nitrógeno en la raíz de las primeras. Es decir, que también en este caso se produjo una fuerte acumulación de Na + y Cl - en todos los tejidos de la planta por la presencia de sal en el medio. En consecuencia, el mejor comportamiento ante la salinidad de las plantas colonizadas por el hongo no pudo relacionarse con una menor absorción de los iones salinos. La no existencia de diferencias importantes entre el estado de nutrición de las plantas micorrizadas pudo deberse a la aplicación de la solución nutritiva Hoagland (20%) en ambas situaciones que procuró un medio nutritivo suficiente. Las observaciones realizadas sobre las preparaciones de raíces teñidas con azul trypan revelaron la presencia de formas características de este tipo de micorrización en aquellas plantas micorrizadas con Glomus fasciculatum mientras que en las plantas no micorrizadas no se apreciaron estructuras teñidas con dicho colorante. Por ello los efectos diferenciadores descritos se han atribuido a la presencia de hongos MVA en las raíces de las plantas de mandioca micorrizadas (fig.16). VII.4. DISCUSION De acuerdo con los resultados indicados antes, la micorriza mandioca-Glomus produjo unos efectos interesantes tanto en el periodo de aclimatación desde el cultivo in vitro al de condiciones de invernadero, como en la respuesta a la salinidad del medio en el último tipo de cultivo. 100 Tabla 37. Estado de nutrición de la raíz en plantas de mandioca micorrizadas y no micorrizadas de cada clon creciendo en tres concentraciones salinas tras 50 días de cultvo en invernadero. Clon Sal Tipo N P K Ca Mg Na Cl Cu Fe Mn Zn Control 0,902 0,156 0,494 2,350 0,431 0,300 0,297 33 4132 436 141 micorriza 2,688 0,176 0,332 2,437 0,444 0,174 0,088 42 1645 356 64 ** ** * ** ** ** Control 1,191 0,136 0,385 2,522 0,504 1,420 1,718 60 5338 708 213 micorriza 2,788 0,154 0,341 2,328 0,376 1,360 1,285 47 2626 330 98 ** * ** ** ** Control 2,145 0,335 1,304 1,625 0,685 2,536 4,052 37 3860 901 225 micorriza 4,595 0,117 1,493 1,353 0,852 2,240 2,888 28 1639 567 98 ** * * ** ** Control 0,838 0,174 0,270 2,043 0,345 0,254 0,353 36 4315 526 133 micorriza 1,283 0,157 0,339 2,028 0,377 0,198 0,343 43 1544 241 56 ** ** ** Control 1,418 0,189 0,355 2,088 0,453 1,346 2,353 52 5233 563 157 micorriza 2,898 0,175 0,699 2,308 0,496 1,823 1,790 49 2667 363 118 ** ** ** Control 0,911 0,182 0,931 1,858 0,623 1,668 1,598 67 5368 668 275 micorriza 3,722 0,179 1,373 1,883 0,736 3,326 3,930 36 2299 709 103 * ** ** ** Control 1,034 0,202 0,457 2,277 0,411 0,478 0,768 67 6221 544 252 micorriza 1,875 0,147 0,292 1,920 0,422 0,263 0,388 73 1797 357 100 * ** ** ** Control 1,960 0,174 1,234 2,318 0,525 1,559 3,438 55 4494 545 240 micorriza 2,443 0,195 0,791 2,217 0,537 1,910 2,343 39 2677 240 97 ** ** ** ** Control 2,117 0,192 1,505 1,485 0,530 1,688 2,945 62 4001 654 163 micorriza 2,331 0,184 1,921 1,895 0,355 4,556 6,105 40 2354 425 131 ** * * * Control 0,925 0,177 0,407 2,223 0,396 0,344 0,473 45 4889 502 176 micorriza 2,054 0,162 0,322 2,172 0,419 0,206 0,246 51 1660 323 72 ** ** ** ** ** ** Control 1,523 0,166 0,658 2,309 0,494 1,442 2,503 55 5022 605 203 micorriza 2,700 0,177 0,644 2,279 0,481 1,740 1,871 45 2661 308 105 ** * ** ** ** Control 1,724 0,236 1,246 1,656 0,612 1,964 2,865 55 4410 741 221 micorriza 3,793 0,155 1,531 1,674 0,706 3,138 3,948 34 2046 595 106 ** ** ** ** ** 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 0 gl -1 4 gl -1 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 8 gl -1 SOM 05 50 Media % ppm La presencia del símbolo * indica diferencias significativas P<0.05 y el símbolo ** indica diferencias significativas a P<0,01. Test–T para muestras independientes. 101 Tabla 38. Estado de nutrición del tallo en plantas de mandioca micorrizadas y no micorrizadas de cada clon creciendo en tres concentraciones salinas tras 50 días de cultivo en invernadero. Clon Sal Tipo N P K Ca Mg Na Cl Cu Fe Mn Zn Control 1,960 0,073 1,672 1,175 0,127 0,129 0,402 18 86 73 99 micorriza 1,125 0,082 1,712 1,463 0,150 0,121 0,407 19 107 43 23 ** * Control 2,428 0,174 1,104 2,483 0,520 5,650 3,355 22 194 121 102 micorriza 1,680 0,099 1,015 1,873 0,241 2,675 3,947 16 84 45 23 * ** ** * ** Control 2,175 0,192 1,876 2,698 0,500 5,752 6,153 24 277 181 193 micorriza 4,080 0,136 1,278 2,193 0,341 4,265 5,187 17 177 53 59 * ** Control 1,788 0,082 2,297 1,712 0,185 0,292 0,686 13 185 81 48 micorriza 1,723 0,072 1,840 1,324 0,195 0,208 0,627 10 96 59 35 * ** ** Control 2,718 0,111 1,208 2,265 0,407 2,878 4,237 14 215 101 101 micorriza 1,735 0,097 1,320 1,747 0,238 2,235 4,052 12 124 73 39 ** * * * * Control 2,495 0,134 1,420 2,355 0,401 4,085 5,887 13 330 129 98 micorriza 3,097 0,146 1,642 2,333 0,777 3,802 5,698 14 289 87 47 ** ** Control 1,844 0,092 2,414 1,443 0,220 0,314 0,789 16 166 89 92 micorriza 2,425 0,101 2,158 1,468 0,284 0,315 0,963 13 192 74 58 Control 1,663 0,095 1,143 1,404 0,223 2,375 3,897 18 181 74 122 micorriza 2,870 0,128 1,708 1,947 0,294 2,892 4,270 18 179 79 54 * * Control 2,173 0,145 1,320 1,903 0,297 3,097 4,713 14 419 104 181 micorriza 2,740 0,138 1,380 3,700 0,456 5,560 8,667 11 169 86 70 ** * ** ** * Control 1,864 0,082 2,128 1,443 0,177 0,245 0,626 16 146 81 80 micorriza 1,758 0,085 1,903 1,419 0,210 0,215 0,666 14 131 59 39 ** ** Control 2,270 0,127 1,152 2,051 0,383 3,634 3,829 18 197 99 108 micorriza 2,095 0,108 1,348 1,856 0,257 2,601 4,089 15 129 66 39 ** ** ** ** Control 2,281 0,157 1,539 2,319 0,399 4,311 5,584 17 342 138 157 micorriza 3,419 0,140 1,444 2,551 0,538 4,339 6,087 15 220 73 56 ** ** SOM 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 05 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 50 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 Media 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 % ppm La presencia del símbolo * indica diferencias significativas P<0.05 y el símbolo ** indica diferencias significativas a P<0,01. Test–T para muestras independientes. 102 Tabla 39. Estado de nutrición de las hojas en plantas de mandioca micorrizadas y no micorrizadas de cada clon creciendo en tres concentraciones salinas tras 50 días de cultivo en invernadero. Clon Sal Tipo N P K Ca Mg Na Cl Cu Fe Mn Zn Control 4,433 0,135 2,058 2,048 0,403 0,226 0,363 18 303 143 77 micorriza 3,492 0,226 2,480 2,845 0,423 0,247 0,265 35 290 111 61 * ** ** ** Control 5,003 0,118 2,100 2,750 0,464 0,403 3,040 14 289 187 82 micorriza 3,210 0,172 2,152 3,258 0,492 0,566 3,505 24 253 217 70 ** ** Control 5,032 0,138 2,230 3,112 0,519 1,112 4,945 16 349 247 88 micorriza 2,693 0,153 2,963 3,413 0,485 1,196 4,465 29 274 218 98 ** ** * Control 4,123 0,149 1,792 2,347 0,400 0,274 0,202 16 257 145 80 micorriza 3,462 0,184 1,850 2,825 0,390 0,218 0,130 21 260 130 59 * * Control 3,897 0,160 1,888 2,945 0,517 0,435 3,118 13 276 239 63 micorriza 3,440 0,169 1,850 3,145 0,445 0,420 2,770 24 271 186 67 * Control 3,875 0,142 2,293 3,512 0,526 1,370 4,293 14 347 284 127 micorriza 3,498 0,165 2,667 3,737 0,496 1,358 5,083 30 273 240 80 * * * ** Control 4,097 0,146 1,820 1,808 0,327 0,187 0,317 13 234 174 55 micorriza 3,458 0,180 1,852 2,810 0,386 0,188 0,245 19 237 164 70 * * Control 3,720 0,155 1,967 3,285 0,442 0,683 3,246 16 321 248 137 micorriza 4,398 0,173 1,893 3,627 0,485 0,643 3,858 18 268 203 69 ** Control 3,803 0,205 2,140 3,667 0,482 1,407 4,463 15 344 289 143 micorriza 5,213 0,174 2,507 3,943 0,505 1,487 6,000 15 255 215 69 * Control 4,218 0,143 1,890 2,068 0,377 0,229 0,294 16 265 154 71 micorriza 3,471 0,197 2,061 2,827 0,400 0,218 0,213 25 262 135 63 ** ** ** * Control 4,207 0,144 1,985 2,993 0,474 0,507 3,135 14 295 225 94 micorriza 3,683 0,171 1,965 3,343 0,474 0,543 3,378 22 264 202 69 * * ** * Control 4,237 0,162 2,221 3,430 0,509 1,296 4,567 15 346 273 119 micorriza 3,519 0,162 2,753 3,649 0,493 1,319 5,019 26 270 226 85 * ** ** ** ** ** SOM 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 05 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 50 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 Media 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 % ppm La presencia del símbolo * indica diferencias significativas P<0.05 y el símbolo ** indica diferencias significativas a P<0,01. Test–T para muestras independientes. 103 Tabla 40. Estado de nutrición de plantas de mandioca micorrizadas y no micorrizadas de cada clon creciendo en tres concentraciones salinas tras 50 días de cultivo en invernadero. Clon Sal Tipo N P K Ca Mg Na Cl Cu Fe Mn Zn Control 2,432 0,122 1,408 1,858 0,320 0,218 0,354 23 1507 218 106 micorriza 2,435 0,161 1,508 2,248 0,339 0,181 0,253 32 681 170 49 ** Control 2,874 0,143 1,196 2,585 0,496 2,491 2,704 32 1940 339 132 micorriza 2,531 0,140 1,273 2,506 0,369 1,556 3,116 27 783 181 59 ** ** Control 3,117 0,222 1,803 2,478 0,568 3,133 5,050 25 1495 443 168 micorriza 3,789 0,135 1,912 2,320 0,559 2,567 4,180 25 696 279 85 ** Control 2,250 0,135 1,453 2,034 0,310 0,273 0,414 22 1586 251 87 micorriza 2,265 0,135 1,469 2,063 0,314 0,209 0,369 22 520 131 49 ** Control 2,678 0,153 1,150 2,433 0,459 1,553 3,236 26 1908 301 107 micorriza 2,691 0,147 1,290 2,400 0,393 1,493 2,871 28 1021 207 75 Control 2,427 0,153 1,548 2,575 0,517 2,374 3,926 31 2015 360 166 micorriza 3,439 0,163 1,894 2,651 0,669 2,829 4,904 27 954 345 77 * ** Control 2,325 0,147 1,564 1,843 0,319 0,326 0,625 32 2207 269 133 micorriza 2,675 0,142 1,577 2,084 0,357 0,255 0,550 30 610 178 73 * * Control 2,448 0,141 1,448 2,336 0,396 1,539 3,527 30 1666 289 166 micorriza 3,237 0,165 1,464 2,597 0,439 1,815 3,491 25 1041 174 73 ** Control 2,698 0,181 1,655 2,352 0,436 2,064 4,041 30 1588 349 162 micorriza 3,428 0,165 1,936 3,180 0,439 3,867 6,924 22 926 242 90 ** ** ** Control 2,336 0,134 1,475 1,911 0,317 0,272 0,464 26 1766 246 109 micorriza 2,457 0,147 1,517 2,137 0,337 0,214 0,385 28 606 160 57 ** ** ** ** Control 2,667 0,146 1,265 2,451 0,450 1,861 3,156 29 1838 310 135 micorriza 2,831 0,151 1,345 2,501 0,401 1,623 3,161 27 955 188 70 ** ** ** Control 2,747 0,185 1,669 2,468 0,507 2,524 4,339 29 1699 384 166 micorriza 3,577 0,152 1,909 2,624 0,579 2,932 5,018 25 845 298 83 * ** ** SOM 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 05 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 50 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 Media 0 gl -1 4 gl -1 8 gl -1 % ppm La presencia del símbolo * indica diferencias significativas P<0.05 y el símbolo ** indica diferencias significativas a P<0,01. Test–T para muestras independientes. 104 fig. 16. Raíz de mandioca sin micorriza (a) (x40) y micorriza (b) con Glomus fasciculatum (x100). a b Como se indicó en el capítulo anterior, no se encontró una influencia de la micorriza sobre el número de plantas supervivientes de los tres clones de mandioca tras el trasplante desde cultivo in vitro a condiciones externas (invernadero), lo que se debió al bajo número de pérdidas habido en ambos grupos de plantas (con o sin micorriza). No obstante, existen en la bibliografía trabajos que demuestran que cuando el nivel global de supervivencia es más bajo, la micorriza disminuye el número de pérdidas (Hooker et al., 1994). Por el contrario, la simbiosis mandioca-MVA produjo un incremento muy elevado del peso fresco (13 veces) y seco (10 veces) de la planta de mandioca, durante el periodo de adaptación a condiciones externas, como corresponde a una especie definida como micorriza obligada. Incrementos similares de biomasa de mandioca como consecuencia de la micorriza fueron encontrados por nosotros en experimentos previos (Carretero et al., 1996; Aguilar-Azcón et al., 1997;). En otras plantas también se ha visto un efecto beneficioso de la micorriza sobre el desarrollo (Gianinazzi et al., 1990; Lovato et al., 1996; Azcón-Aguilar y Barea, 1997; Troncoso et al., 2001). 105 Al contrario de lo indicado a veces en la bibliografía (Berta et al., 1990; Marschner y Dell, 1994) en las plantas de mandioca consideradas no se observó un mayor desarrollo relativo de la parte aérea sobre la raíz. Este hecho pudo estar relacionado con las buenas condiciones de nutrición a las que las plantas estuvieron sometidas y al mayor grado de hidratación, en especial en la raíz, que origina la micorriza. Las plantas colonizadas por MVA soportaron mejor la salinidad del medio que las no colonizadas, tanto en la supervivencia como en el mayor desarrollo de las supervivientes. Esta mayor tolerancia a la sal se relaciona con el hecho de que la micorriza produce plantas más fuertes y con un mayor grado de hidratación en especial en las raices. Por el contrario, no se encontraron diferencias importantes en el estado de nutrición de estos dos tipos de plantas, salvo una mayor acumulación de nitrógeno en la raíz y de fósforo en las hojas raíz de las micorrizadas. Es decir, tanto la mandioca colonizada como la no colonizada por MVA mostraron en sus tejidos cantidades similares de Na y Cl, lo que indicó que el hongo no fue un filtro para la absorción de dichos nutrientes y que las plantas micorrizadas soportaron mejor los excesos de estos elementos. Ruíz-Lozano y Azcón (2000), encuentran que el efecto protector realizado por de Glomus sp., aislado en ambientes salinos, sobre plantas de lechuga sometidas a estrés salino está basado en la estimulación del desarrollo radicular, mientras que el efecto protector de G. deserticola estuvo basado en un mejor estado nutricional de la planta. Numerosos autores han estudiado los beneficios de la micorriza en plantas en situación de estrés abiótico (Howeler et al., 1982; Barea y Jeffries, 1995). Así, Duin et al., (1991) estudiaron las relaciones entre micorrizas, tanto ectomicorrizas como MVA, y diferentes plantas bajo diferentes tipos de estrés como el exceso de metales pesados en el suelo o suelos salinos. Copeman et al., (1996) encontraron que plantas de tomate creciendo bajo condiciones de estrés salino y micorrizadas con MVA presentaron mejor desarrollo que las no micorrizadas. En los capítulos anteriores, se destacó la mayor tolerancia a la sal del clon SOM- 1 de mandioca frente a los otros dos clones estudiados (05 y 50), tanto en condiciones de cultivo in vitro como de invernadero. En este capítulo se ha indicado la influencia positiva de la micorriza al aumentar la tolerancia a la sal de los tres clones. En consecuencia, la combinación SOM-1-hongo MVA resultó muy interesante en este trabajo ya que permite disponer de un material de mandioca de un nivel de tolerancia a 106 la sal bastante elevado. Este hecho puede ser de gran utilidad para el cultivo de mandioca en zonas árido-salinas donde habitan poblaciones de extrema pobreza y hambruna. 10 7 VIII. DESARROLLO IN VITRO Y EX VITRO DE EXPLANTOSPLANTAS DEL CLON SOM-1 DE MANDIOCA, PROCEDENTES DE PLANTAS MICORRIZADAS Y NO MICORRIZADAS. VIII.1. INTRODUCCIÓN La respuesta del material vegetal al cultivo in vitro, depende en gran medida de las condiciones de la cámara (luz, tanto en intensidad como fotoperiodo, y temperatura) y de las características del medio nutritivo. La insuficiencia de mecanismos reguladores, presentes en la planta completa, hace a los tejidos cultivados in vitro muy sensibles a las condiciones nutritivas del medio (Margara, 1988). Además de estos factores externos, también son importantes en el cultivo in vitro las condiciones fisiológicas del material vegetal de partida para la propagación (Margara, 1988; Pierik, 1990). La diversidad de medios nutritivos existentes para el cultivo in vitro de plantas se explica por la prioridad de atender las necesidades específicas de diferentes tejidos y especies a cultivar y propiciar así su mejor desarrollo. Por ello, junto al uso del medio de cultivo adecuado, es de gran interés la mejora del estado fisiológico del material inicial a propagar. En este sentido Debergh (1986) propone pulverizaciones, baños o inyecciones con reguladores de crecimiento o inmersiones de la planta madre de la que se van a obtener los explantos en soluciones con azucares, sales minerales o, reguladores. Dado que la micorriza modifica el estado nutritivo (Bolan et al., 1987; Barea, 1991), hídrico (Allen y Cunningham, 1983) y produce cambios en los niveles de reguladores de crecimiento (Crafts y Miller, 1974; Allen et al, 1980; Barea y Azcón- Aguilar, 1982; Bass y Kuiper, 1989; Danneberg et al, 1992) de los tejidos de la planta huésped, se considera de interés estudiar el comportamiento de plantas ya micorrizadas y vueltas a establecer in vitro. Para ello se eligió el clon SOM-1 debido a su comportamiento ante el estrés salino, buena respuesta a la micorrización y al cultivo in vitro que viene presentando a lo largo del presente trabajo. 108 VII.2. MATERIALES Y METODOS Los pasos sucesivos del proceso seguido en los ensayos realizados, se indican en el esquema de la fig. 17. En primer lugar se prepararon 24 explantos nodales de 1 cm de longitud, de plantas del clon SOM-1 no micorrizadas y micorrizadas con Glomus deserticola (II Ag 8903), procedentes de la prueba de adaptación referida en el capítulo VII. Estos explantos fueron desinfectados mediante inmersión en etanol 70% durante 15 segundos y en hipoclorito sódico al 12% (50 gl -1 de cloro activo) durante 15 o 16 segundos, seguido de tres lavados con agua estéril. A continuación se sembraron individualmente en tubos de 2l x 150 mm con 8 cc de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) con 100 mgl -1 de inositol, sin reguladores de crecimiento, en agar 0.6% a pH 5.7. Los tubos, una vez tapados con tapones de polipropileno y sellados con parafilm, se colocaron en una cámara de cultivo a 25 ºC, 30 µEm -2 s -1 de iluminación y 16h. de fotoperíodo, distinguiendo entre aquéllos procedentes de plantas no micorrizadas que se señalaron con la letra A y aquellos procedentes de plantas micorrizadas con Glomus deserticola (II Ag 8903) que se marcaron con la letra B . Tras 5 ciclos de repicado de 56 dias cada uno, se obtuvieron suficientes plantas A y B in vitro para realizar los experimentos que se indican a continuación. A partir de estas plantas se tomaron 24 yemas al azar de cada grupo (A y B) y se sembraron en medio MS igual al indicado anteriormente. Transcurridos 80 días, se extrajeron las plantas de los tubos y se determinó su peso fresco, peso seco, grado de hidratación de los tejidos según la formula; {(Pf-Ps)/Pf}.100 y la composición mineral de sus raíces, tallos y hojas como se indicó en el capítulo V (pag. 42). Otras 32 plantas de cada grupo se trasplantaron a contenedores de 1,5 l de capacidad con suelo, esterilizado como se describe en el capítulo VI (pag. 67). La mitad de los contenedores de las plantas A y B se micorrizaron con Glomus fasciculatum formándose en consecuencia cuatro grupos de plantas del clon SOM-1: A (sin micorriza y de origen no micorrizado), A+G.f. (con micorriza y de origen no micorrizado), B (sin micorriza y de origen micorrizado) y B+G.f. (con micorriza y de origen micorrizado). Todos los contenedores se colocaron en un invernadero para su aclimatación como se describió en el capítulo VI (pag. 67) regándose con solución Hoagland al 20% cada 3 días. 115 Tabla 41. Biomasa expresada como peso fresco, peso seco e hidratación de plantas de los tipos “A”(no micorrizadas previamente) y “B”(micorrizadas previamente con G. deserticola (II Ag 8903) del clon SOM-1 de mandioca tras 56 días de cultivo in vtro. Clon Organo Tipo Peso fresco Peso seco Hidratación mg mg % A138,3 13,7 90,2 B117,8 12,2 89,4 A91,0 9,3 89,2 B123,0 13,2 89,3 ** ** A129,7 23,0 82,2 B161,3 26,8 83,6 ** ** A358,9 46,0 87,2 B402,2 52,2 87,1 SOM-1 Raíz Tallo Hoja Planta Test T para muestras independientes. Los asteríscos indican diferencias significativas: * (P<0,05); ** (P<0,01) Tabla 42. Estado nutritivo de la raiz, tallo hojas y planta completa de los tipos “A”(no micorrizadas previamente) y “B”(micorrizadas previamente con G. deserticola (II Ag 8903) del clon SOM-1 de mandioca tras 56 días de cultivo in vtro. Clon Organo Tipo N P K Ca Mg Na Cl Cu Fe Mn Zn A5,227 1,137 4,213 0,437 0,145 0,231 0,951 32 1364 372 320 B4,757 0,879 5,197 0,418 0,138 0,190 1,200 33 1370 376 144 * A6,567 1,103 3,730 0,903 0,110 0,899 0,983 28 138 93 174 B6,900 1,012 3,437 0,739 0,093 0,596 0,900 23 234 109 97 * * * A5,337 0,870 2,810 0,818 0,161 0,142 0,147 11 202 292 130 B6,097 0,780 2,890 0,725 0,165 0,080 0,206 23 182 288 126 ** A5,710 1,037 3,584 0,719 0,139 0,424 0,694 24 568 252 208 B5,918 0,890 3,841 0,627 0,132 0,289 0,769 27 595 258 123 * * SOM Raíz Tallo Hoja Planta Composición mineral % ppm Test-T. Los asteriscos indican diferencias significativas ; * (P<0,05) y ** (P<0,01) entre plantas de tipo A y B. En consecuencia, existió una distribución de biomasa distinta entre las plantas A y B con una proporción de peso fresco parte aérea/peso fresco raíz de 1,59 en las A y de 2,41 en las B, y de 2,35 y 3,28 respectivamente para la misma correlación de peso seco. No obstante, no hubo diferencias significativas en la biomasa total de ambas plantas, aunque las B pesaron algo más. En consecuencia, no se pudo asegurar que las plantas previamente micorrizadas (B) tuviesen un mejor comportamiento in vitro ya que la 116 similitud en el desarrollo y la composición mineral de los grupos de plantas, pudo deberse a la gran influencia del medio nutritivo sobre las características del material cultivado. Como se indicó en el apartado de materiales y métodos, las plantas A y B obtenidas in vitro se trasplantaron a condiciones externas sobre suelo estéril y sobre el mismo suelo con Glomus fasciculatum. Se establecieron en consecuencia cuatro grupos de plantas: A, A+G.f., B y B+G.f. En la figura 21 se presenta un aspecto de un grupo de plantas de cada uno de estos grupos tras 80 días de cultivo en invernadero. En la tabla 43 se indica, así mismo, el peso fresco, peso seco y grado de hidratación de las raíces, tallos, hojas y total de las plantas de cada grupo. El peso fresco y seco de las raíces, tallos, hojas y en consecuencia del total de las plantas A (sin micorriza y de origen no micorrizado) fueron significativamente menores que los respectivos de las plantas A+G.f.. Es decir, que al igual que se había indicado ante en este capítulo y en el capítulo IV, la micorriza produjo un efecto altamente positivo en el desarrollo de la planta del clon SOM-1. fig. 21. Plantas de los tipos “A” (no micorrizadas préviamente) y “B” (micorrizadas préviamente con G. deserticola (II Ag 8903)) del clon SOM-1 de mandioca, creciendo durante de 80 días en suelo sin micorrizar (A y B) y micorrizado con Glomus fasciculatum (A+G.f. y B + G.f.). 117 En las plantas del grupo B (sin micorriza y de origen micorrizado) se produjo una situación similar al comparar su peso fresco y seco con las del grupo B+G.f. Sólo que en estos casos en un nivel de biomasa superior. Es decir, el peso fresco y seco de las raíces, tallos y hojas de las plantas B fueron superiores a los de plantas A, y los de las plantas B+G.f. también superiores a las de A+G.f. En consecuencia, los explantos obtenidos de plantas micorrizadas del clon SOM-1, tras ser cultivados in vitro y formar nuevas plantas (con una parte aérea más desarrollada que las de origen no micorrizado) y ser trasplantadas a condiciones de invernadero, produjeron mayor cantidad de biomasa, que cuando las plantas trasplantadas procedían de explantos tomados de plantas no micorrizadas del mismo clon SOM-1. Tabla 43. Peso fresco, peso seco y grado de hidratación de plantas del tipo “A” (no micorrizadas préviamente) y “B” (micorrizadas préviamente con G. deserticola (II Ag 8903)) del clon SOM-1 de mandioca, creciendo en invernadero durante 80 días en suelo no micorrizado (sin G.f.) y micorrizado con Glomus fasciculatum (con G.f.). Clon Organo Tipo Micorriza Peso fresco Peso seco Hidratación mg mg % sin G.f. 69 c 25 c 61 a con G.f. 95 b 45 bc 53 ab sin G.f. 113 b 54 b 52 ab con G.f. 166 a 83 a 50 b ** ** * sin G.f. 638 c 96 b 85 a con G.f. 1133 ab 206 ab 83 ab sin G.f. 951 b 202 ab 80 b con G.f. 1688 a 317 a 82 ab ** ** * sin G.f. 833 c 131 c 81 a con G.f. 1964 ab 322 ab 83 a sin G.f. 1293 bc 221 bc 82 a con G.f. 2746 a 426 a 85 a ** ** sin G.f. 1540 c 252 c 83 a con G.f. 3192 ab 572 ab 82 a sin G.f. 2357 bc 477 bc 80 a con G.f. 4599 a 826 a 82 a ** ** SOM-1 Raíz Tallo Hojas Planta A B A B A B A B Los asteríscos indican diferencias significativas (* P<0,05 y ** P<0,01) entre plantas de los tipos A y B sin inocular con G. fasciculatum según el test-T para muestras independientes. Letras diferentes en columna indican diferencias significativas (P<0,01) según el test de Rango múltiple de Duncan. Existió, por consiguiente un mayor desarrollo de la planta obtenida in vitro y trasplantada a condiciones externas cuando provenían de material micorrizado, que se demostró tanto cuando el trasplante se hizo a un sustrato inerte, y , más aún, cuando el sustrato estuvo micorrizado por Glomus fasciculatum. 118 Este hecho positivo y del que no tenemos constancia de haber sido indicado previamente en la bibliografía, pudo estar relacionado con características del material inicial micorrizado con Glomus deserticola (II Ag 8903). Tabla 44. Estado nutritivo de raíz, tallo, hoja y planta de los tipos “A” (no micorrizadas préviamente) y “B” (micorrizadas préviamente con G. deserticola (II Ag 8903)) del clon SOM-1 de mandioca, creciendo en invernadero durante 80 días, no micorrizadas (sin G.f.) y micorrizadas con Glomus fasciculatum (con G.f.) Clon Organo Tipo Micorriza sin G.f. 0,623 b 0,193 a 0,437 a 1,968 a 0,352 a 0,317 a 0,497 a con G.f. 3,330 a 0,140 a 0,322 a 2,184 a 0,439 a 0,275 ab 0,080 b sin G.f. 1,118 b 0,137 a 0,327 a 2,425 a 0,424 a 0,236 ab 0,153 b con G.f. 1,365 b 0,177 a 0,359 a 2,220 a 0,406 a 0,159 b 0,263 ab ** * * * ** sin G.f. 1,965 a 0,091 a 2,028 a 1,485 a 0,157 a 0,148 a 0,505 a con G.f. 1,635 a 0,083 a 1,977 a 1,565 a 0,198 a 0,191 a 0,583 a sin G.f. 1,783 a 0,065 a 1,940 a 1,402 a 0,155 a 0,273 a 0,583 a con G.f. 1,213 a 0,071 a 1,575 a 1,223 a 0,147 a 0,139 a 0,450 a sin G.f. 3,898 b 0,163 ab 1,987 a 2,285 ab 0,413 a 0,262 a 0,318 a con G.f. 3,607 b 0,208 a 2,260 a 3,082 a 0,426 a 0,239 a 0,227 a sin G.f. 4,658 a 0,121 b 1,863 a 2,110 c 0,390 a 0,237 a 0,248 a con G.f. 3,347 b 0,203 a 2,070 a 2,588 b 0,387 a 0,226 a 0,168 a * sin G.f. 2,162 a 0,149 a 1,484 a 1,913 a 0,307 a 0,242 a 0,440 a con G.f. 2,829 a 0,144 a 1,590 a 2,282 a 0,349 a 0,232 a 0,309 a sin G.f. 2,520 a 0,108 a 1,377 a 1,979 a 0,323 a 0,249 a 0,328 a con G.f. 1,975 a 0,150 a 1,335 a 2,010 a 0,313 a 0,175 a 0,294 a * Clon Organo Tipo Micorriza sin G.f. 36 a 3870 a 364 b 158 a con G.f. 62 a 2195 b 404 b 71 b sin G.f. 33 a 4577 a 598 a 116 ab con G.f. 41 a 1440 b 257 b 54 b * sin G.f. 17 ab 118 a 77 a 87 a con G.f. 22 a 115 a 60 ab 36 a sin G.f. 14 ab 153 a 78 a 60 a con G.f. 8 b 87 a 42 b 22 a sin G.f. 18 a 282 a 160 a 90 a con G.f. 28 a 260 a 130 a 60 a sin G.f. 16 a 278 a 129 a 68 a con G.f. 29 a 290 a 112 a 61 a sin G.f. 24 a 1423 a 200 a 112 a con G.f. 36 a 778 a 186 a 54 b sin G.f. 21 a 1669 a 268 a 81 ab con G.f. 26 a 606 a 137 a 45 b Planta A B SOM-1 Raíz A B Tallo A B Hojas A B Tallo A B Hojas SOM-1 Raíz A B A B Planta A B Mn Zn ppm % N P K Ca Mg Na Cl Cu Fe Los asteríscos indican diferencias significativas (* P<0,05 y ** P<0,01) entre plantas de los tipos A y B sin inocular con G. fasciculatum según el test-T para muestras independientes. Letras diferentes en columna indican diferencias significativas (P<0,01) según el test de Rango múltiple de Duncan. 119 Anteriormente se indicó (tabla 42) que ambos grupos de plantas (A y B) tras 65 días de cultivo in vitro no fueron muy diferentes en sus respectivos estados nutritivos. Algo parecido ocurrió tras el trasplante y ser cultivadas durante días en condiciones de invernadero. En efecto, como se observa en la tabla 44, en general, fueron escasas las diferencias estadísticamente significativas observadas en los contenidos de nutrientes respectivos con respecto al origen o al tratamiento fúngico de las plantas. Las variaciones puntuales existentes no pudieron ser relacionadas con ninguno de los dos factores anteriores y pudieron deberse a circunstancias no conocidas de la propia planta o del experimento. En consecuencia, el mayor peso de las plantas del grupo B sobre A y las respectivas micorrizadas B+G.f sobre A+G.f. no pudo relacionarse con diferencias relacionadas con un mejor estado en la nutrición mineral de las plantas. En la figura 22 se muestran las raices correspondientes de las plantas SOM-1 de los grupos A, A+G.f., B y B+G.f. teñidas con azul trypán. En las raíces de las plantas A no se observan estructuras de tipo fúngico teñidas como cabría esperar al haber sido trasplantadas a un sustrato previamente desinfectado. Por el contrario, en las raíces de las plantas A+G.f. se aprecian claramente estructuras fúngicas teñidas, que se corresponden con esporas de Glomus fasciculatum emitiendo hifas que progresan por el interior del cortex de la raíz. Esta situación es acorde con la presencia en el sustrato de trasplante de dichos hongos MVA, como ya se había observado en el capítulo VII. En las plantas B, en las que se esperaba una situación idéntica a la de A, se observaron estructuras de tipo fúngico teñidas por el azul trypán, que diferían de las observadas en las plantas del grupo A+G.f. Por último, en las plantas B+G.f. se observan esporas e hifas como en plantas A+G.f. y otras estructuras similares a las de las plantas B. Las estructuras fúngicas que aparecen en las plantas B y B+G.f. y que no se corresponden con Glomus fasciculatum y que no se observan en plantas A, deben estar relacionadas con las plantas madres originales y haberse transmitido via explanto, ya que no pudieron originarse ni durante el proceso aséptico de cultivo in vitro, ni en el trasplante a suelo esterilizado micorrizando o no con Glomus fasciculatum, como lo prueban las plantas del grupo A y A+G.f. en las que no aparecen dichas estructuras. En consecuencia, los factores que diferencian las plantas A y B y que pueden estar relacionados con la mayor producción de biomasa de las segundas son: - Mayor desarrollo de las plantas madres B micorrizadas con Glomus deserticola (II Ag 8903) frente a las A no micorrizadas. Es decir un material 120 Fig. 22. Imágenes obtenidas en el microscopio de raíces de plantas A (no micorrizada y de origen no micorrizado), A+G.f. (micorrizada y de origen no micorrizado) donde se observan estructuras fúngicas características, B (no micorrizada y de origen micorrizado) donde se aprecian estructuras fúngicas y B+G.f. (micorrizada y de origen micorrizado) teñidas con azul trypan (100x) en donde, junto a las esporas propias de esta micorriza, se observa una mayor cantidad de hifas. 121 de partida diferente, que no obstante, no tiene un claro reflejo en la propagación in vitro salvo por un mayor desarrollo de la parte aérea. Presencia en las raíces de las plantas B y B+ G.f. de estructuras fúngicas transmitida desde las plantas madres micorrizadas. Para comprobar estos resultados, como se indicó en el apartado de Material y Métodos, se realizó un segundo experimento con plantas del grupo A y B del clon SOM-1 obtenidas in vitro, y en este caso trasplantadas a un sustrato estéril de arena lavada. Como se observa en las figuras 23 y 24 las plantas del grupo B alcanzaron un mayor tamaño y número de hojas que las del grupo A, lo que concuerda con lo indicado en el experimento anterior. Además, cuando estas plantas se sometieron a riegos deficitarios, las del grupo A mostraron más clara y rápidamente signos de estrés hídrico. Así, apareció flacidez en el tallo por lo que en las fotos las plantas del grupo A aparecen apoyadas en el fondo, mientras que las del grupo B permanecieron erguidas. Se observó clorosis severas en las hojas terminales de las plantas A y un menor o nulo desarrollo de éstas. Las raíces de las plantas A teñidas con azul trypán, al igual que se indicó en la prueba anterior no mostraron estructuras fúngicas (fig. 25a) mientras que las B presentaron de nuevo estructuras coloreadas como hifas, esporas y estructuras globosas asociadas (fig. 25 b, c, d, e y f). También se observaron diferencias en la estructura anatómica de la raíz, tallo y hojas de las plantas A y B, tanto in vitro (fig. 26) como ex vitro (fig. 27). La raíz de plantas del grupo A in vitro (fig. 26 a) presenta una epidermis, exodermis, parenquima cortical laxo y con grandes espacios intercelulares y un cilíndro vascular tetrámero donde se alterna xilema y floema. En esta imagen no se aprecia endodermis ni periciclo como ocurre en la sección transversal de la raiz de la planta del grupo B (fig. 26 d) donde aparece claramente una endodermis con engrosamiento de la pared (bandas de Caspary) y un periciclo monoestratificado indicando un mayor desarrollo de esta raíz. En el tallo del grupo A (fig. 26 b) se aprecian la epidermis, parénquima cortical seguido por el anillo vascular constituido por haces de floema, cambium vascular y xilema, a continuación se presenta el parénquima medular. En plantas del grupo B (fig. 26 e), tras la epidermis se aprecia una capa de colénquima que le confiere mayor rigidez, y en el parénquima cortical se observan unas estructuras inmersas en él. 122 fig. 23. Plantas de los tipos “A” (no micorrizadas previamente) y “B” (micorrizadas préviamente con G. deserticola (II Ag 8903)) del clon SOM-1 de mandioca creciendo en cámara de cultivo durante 56 días. fig. 24. Plantas de los tipos “A” (no micorrizadas previamente) y “B” (micorrizadas préviamente con G. deserticola (II Ag 8903)) del clon SOM-1 de mandioca creciendo en cámara de cultivo durante 70 días. 123 fig.25. Imágenes obtenidas en el microscopio de raíces de plantas A (no micorrizadas préviamente) (a) donde no se observaron estructuras teñidas con azul trypan (40x) y B (micorrizadas préviamente con G. deserticola (II Ag 8903)) (b) 40x, (c) 100x, (d) 100x, (e) 100x y (f) 400x, teñidas con azul trypan (100x) donde se pueden apreciar hifas y estructuras globosas que presentan afinidad por este colorante. a. b. c. d. e. f. Por lo tanto también el tallo de las plantas del grupo B presentan un grado de desarrollo mayor que las plantas A. Con respecto a las hojas, la principal diferencia entre ambos tipo de plantas radica en la organización de la misma apreciándose en las hojas de plantas B (fig. 26 f) un parénquima en empalizada y otro esponjoso junto con amplios espacios celulares, mientras que en plantas A (fig. 26 c) se aprecia en organización del mesófilo la presencia de amplios espacios intercelulares propios de plantas cultivadas in vitro. 124 fig. 26. Secciones transversales de raíz, tallo y hoja de planta de tipo A (no micorrizadas préviamente (a, b y c respectivamente) y de tipo B (micorrizadas previamente con G. deserticola (II Ag 8903)) (d, e y f respectivamente), procedentes de cultivo in vitro y teñidas con fucsinaverde luz (200x). En la imagen d se aprecian hoquedades inmersas en el parénquima que no se apreian en la imagen a. Con respecto al tallo, en la imagen e se observan también unas estructuras próximas a la exodermis que no aparecen en la imagen b. Por último, en la imagen f se puede obserar una organización la hoja ligéramente distinta a la observada en la imagen c. a d b e c f 131 En cualquier caso, los explantos uninodales de los tres clones de mandioca considerados, fue un material bien diferenciado que se multiplicó perfectamente en un solo cultivo y en ausencia de reguladores de crecimiento en el medio nutritivo. Esto proporcionó material suficiente para las distintas pruebas a realizar, con una alta garantía de estabilidad genética al evitase la variación somaclonal. El cultivo in vitro de células vegetales en medio nutritivo salinizado con NaCl, ha sido utilizado con relativa frecuencia para la obtención de plantas tolerantes (Gangopadhyay et al., 1997; Basu et al., 1997). No obstante, este método presenta el problema de que muchas veces existe una falta de correspondencia entre los mecanismos de tolerancia a la sal de la célula y los de la planta completa (Tal, 1994). Por ello, en el presente trabajo se eligió un material vegetal como el explanto nodal, mucho más diferenciado y en consecuencia con mayores posibilidades de correlación entre la tolerancia in vitro y en condiciones externas. El cultivo in vitro en medio salino de segmentos nodales de los tres clones en consideración, indicó que este tipo de material no soportó concentraciones superiores a 2,5 gl -1 de NaCl en el medio. Es decir, salinidades inferiores s las toleradas por otro explantos in vitro como la vid (Troncoso et al., 1999 a), u olivo (Troncoso et al., 1999 b), cuando en condiciones de campo, la mandioca puede ser considerada como tolerante. En consecuencia, el material in vitro demostró una fuerte sensibilidad a la presencia de sal (NaCl) en el medio. No obstante, existió una gradación de comportamiento entre los tres clones usados de forma que se pudo establecer una clasificación de tolerancia relativa entre ellos (SOM-1> 50> 05). El comportamiento de los tres clones de mandioca cultivados en condiciones de invernadero y sometidos a concentraciones crecientes de NaCl disuelto en la solución nutritiva, determinó una clasificación por tolerancia igual a la indicada para el cultivo in vitro, es decir SOM> 50 y 05. Existió en consecuencia una correlación entre la respuesta relativa de cada clon in vitro y ex vitro, aunque a distintos niveles de salinidad. Como se ha indicado, el material in vitro presentó problemas ante concentraciones de NaCl superiores a 2 gl -1 , mientras que en las condiciones de invernadero en general las plantas soportaron bien concentraciones de NaCl de 4 gl -1 , y el clon SOM-1 hasta 8 gl -1 . Junto a provocar la muerte de algunas plantas y el descenso en el desarrollo y producción de biomasa en las plantas supervivientes, el efecto de la sal (NaCl) se 132 caracterizó por originar disminuciones importantes del grado de hidratación de los tejidos de la hoja, en especial en los clones menos tolerantes, y acumulación de Na + y Cl - . Es decir, se produjeron los efectos (osmótico y tóxico) indicados en la bibliografía como características de la acción salina (Munns, 1993). La correlación entre los niveles de Na + y Cl - en el medio y en la planta, permiten pensar que los contenidos de estos iones en los tejidos del vegetal son buenos indicadores para conocer la salinidad que en un momento dado soporta la mandioca. Indira y Ramanujam (1982), trabajando con plantas jóvenes de 15 cultivares de mandioca en condiciones de invernadero también observaron que concentraciones de 1500 ppm (1,5 gl -1 ) de NaCl no afectaron el crecimiento de dichas plantas. Por el contrario, Hawker y Smith, (1982), aplicando soluciones de 50 mM (3 gl –1 ) de NaCl observaron reducciones del 50% en el peso fresco de los tubérculos de las plantas de mandioca. De estos resultados se deduce que en especial, el comportamiento del clon SOM-1 ante la sal definido en este trabajo, denota un grado interesante de tolerancia como corresponde a una variedad cultivada desde hace muchos años en una zona áridosalina del desierto de Somalia. La correlación entre el comportamiento in vitro y ex vitro de los clones de mandioca en consideración, puesta de manifiesto en este trabajo por primera vez, representa en principio un hallazgo de gran interés, ya que tras nuevas comprobaciones, el cultivo in vitro puede representar una ventaja importante de tiempo, espacio y economía en los estudios de salinidad con la mandioca. La presencia de micorriza Glomus deserticola (II Ag 8903) o Glomus fasciculatum incrementó muy significativamente el desarrollo de los tres clones de mandioca al ser trasplantados desde in vitro a condiciones de invernadero, lo que demostró el carácter de micorriza-dependiente que se atribuye a la mandioca (Janos, 1980; Habte y Byappanahalli, 1994). Existen otros precedentes en los que la micorriza afectó positivamente a la planta de mandioca (Carretero et al., 1997 Fagbola, 1998). Junto a ser más desarrolladas y posiblemente influenciadas por ello, las plantas de mandioca micorrizadas toleraron mejor la sal que las no micorrizadas, lo que es de gran interés para la posible adaptación de esta especie a nuevas zonas de cultivo con carácter salino. En este sentido, se debe destacar que con el binomio clon SOM-1-micorriza se logró una tolerancia muy elevada, y lo hace especialmente interesante. 133 Trabajos en los que se relaciona la tolerancia a la sal con la micorriza fueron realizados por Azcón y El-Atrash (1996) en alfafa, Carretero et al., 1997) en mandioca o Copeman et al., (1996) y Al-Karaki y Hammad, (2001) en tomate. Las causas de esta mejor tolerancia parecen estar relacionadas con un maor crecimiento y adquisición de nutrientes (Al-Karaki,2000l) y a unas mejores relaciones hídricas (Gu, 1998) en plantas micorrizadas frente a no micorrizadas en ambientes salinos. Otro aspecto muy interesante de la simbiosis hongo micorrícico-mandioca, considerado por primera vez en este trabajo, fue el comportamiento in vitro in vitro y ex vitro de material de mandioca previamente micorrizado. En efecto, como se indicó antes, los segmentos nodales procedentes de tallos de plantas micorrizadas, produjeron in vitro plantas con una biomasa similar a la de aquellos procedentes de mandioca no micorrizada, aunque con una relación parte aérea-raíz muy superior. No obstante, cuando se trasplantaron a condiciones de invernadero el desarrollo de las plantas de origen micorrizado fue muy superior. Junto con este mayor desarrollo, las plantas de origen micorrizado mostraron una serie de distinciones anatómicas tanto in vitro como ex vitro, basadas fundamentalmente en un mayor grado de diferenciación de tejidos, en la observación estructuras no identificadas por nosotros en plantas de origen micorrizado y localizadas en el parénquima cortical de tallo y raíz, y la presencia de estructuras fúngicas en su raíces. Dado el proceso totalmente aséptico seguido en el cultivo in vitro, la presencia de estos hongos sólo pudo ser debida a una transmisión por el explanto inicial. Aunque no se ha podido clasificar dichos hongos, sólo existen dos posibilidades; o se trata de hongos que acompañan al inóculo de Glomus deserticola (Ag 8903) capaces de alcanzar el sistema vascular de la planta para instalarse en la parte aérea de la misma, o bien se trata del propio G. deserticola cuyas hifas podrían progresar por el córtex hacia la parte aérea de la planta dadas las características histológicas que presentan las plantas procedentes de cultivo in vitro e el momento del trasplante. Por otra parte micorrización de plantas cultivadas in vitro en la fase de enraizamiento ya ha sido experimentada en varias especies (Pons et al., 1983; Chavez y Ferrera-Cerrato, 1990; Mathur y Vyas, 1995). En cualquier caso, es importante de destacar que las plantas obtenidas in vitro a partir de explantos procedentes de tallos de plantas micorrizadas se desarrollaron más cuando se trasplantaron a condiciones externas que las equivalentes provenientes de plantas no micorrizadas y que ello pudo estar relacionado o con las mejores condiciones 134 de las plantas de origen, o con la presencia de hongos en las primeras, o con ambas a la vez. 135 X. CONCLUSIONES 1. Por el método utilizado en este trabajo, los tres clones de mandioca considerados, SOM-1, 05 y 50, respondieron muy bien a la propagación in vitro por medio de sagmentos nodales, incluso sin adición de reguladores de crecimiento, formando plantas completas (desarrollo de la parte aérea y del sistema radical) en una sóla fase de cultivo. Esto representa un ahorro de tiempo, trabajo y costes sobre el sistema tradicional de micropropagación de la mandioca, que se hace en dos fases; una para el desarrollo de la parte aérea y otra de enraizamiento. 2. Contenidos superiores a 2 gl -1 de NaCl en el medio de cultivo, afectaron negativamente la supervivencia y el desarrollo del material in vitro de los tres clones de mandioca, aunque se pudieron establecer diferencias entre ellos. El clon SOM-1 fue el que soportó mejor el estrés salino y el clon 05 fue el más sensible. Por el contrario, concentraciones más bajas de NaCl en el medio favorecieron el desarrollo de la planta de mandioca in vitro. 3. Junto a la incidencia sobre la supervivencia y el desarrollo del material de mandioca in vitro, la presencia de sal en el medio afectó negativamente el grado de hidratación de los tejidos de la hoja (más en los clones menos tolerantes) y originó una fuerte acumulación de sodio y cloro en la planta. Es decir, se produjeron los dos efectos indicados en la bibliografía como responsables de la acción negativa de la sal. 4. La presencia de sal (NaCl) en la solución nutritiva, dada a plantas de los tres clones de mandioca cultivados en contenedores en cámara de cultivo, también afectó su supervivencia, desarrollo, grado de hidratación foliar y acumulación de sodio y cloro, y con el mismo orden de tolerancia entre clones (SOM-1> 50> 05) que el indicado in vitro. 5. Con independencia del nivel de tolerancia en cada caso (in vitro y ex vitro), el comportamiento equivalente ante la sal de los tres clones de mandioca en ambas condiciones de cultivo avalan la posibilidad de uso de la técnica de cultivo in vitro para evaluar el comportamiento ante la sal (NaCl) del material de mandioca. Este 136 hecho, puesto de manifiesto por primera vez en la bibliografía de esta especie, se considera de gran interés en los estudios sobre salinidad y mandioca. 6. La micorriza mandioca-Glomus ssp. favoreció muy significativamente el desarrollo de las plantas de los tres clones de mandioca tras el trasplante in vitro-ex vitro, lo que demostró además el carácter micorrizo-dependiente de este género. 7. En concordancia con el mejor desarrollo de las plantas, la presencia de micorriza también aumentó claramente la tolerancia a la sal (NaCl) de los tres clones de mandioca. 8. Segmentos nodales procedentes del tallo de plantas micorrizadas y no micorrizadas, del clon SOM-1, formaron in vitro plantas semejantes aunque con una mayor relación parte aérea-raíz en las primeras. Una vez estas plantas fueron trasplantadas a condiciones externas, las de origen micorrizado tuvieron un mayor desarrollo que las de origen no micorrizado. 9. Junto al mayor desarrollo, las plantas de origen micorrizado mostraron en sus raíces la presencia de formaciones fúngicas y modificaciones anatómicas que difieren de lo observado en las plantas de origen no micorrizado. Las formaciones fúngicas, aún no identificadas se transmiten desde las plantas originales a través del tallo en el cultivo in vitro y se relacionan con el mayor desarrollo de las plantas obtenidas. 10. La combinación de tolerancia a la sal del clon SOM-1 de mandioca, como corresponde a una planta adaptada a las condiciones árido-salinas del desierto de Somalia, su cultivo in vitro en medio salino, y la acción positiva de la micorriza con Glomus deserticola (II Ag 8903), ha dado lugar a un material bastante tolerante al estrés salino, disponible para ser ensayado en campo en aquellos paises donde la salinidad afecta claramente al cultivo de la mandioca. 137 XI. BIBLIOGRAFIA Abbott L.K. y Robson A.D. 1984. The effect of mycorrhizas on plant growth. En VA Mycorrhiza. Powell, C.Ll.,Bagyaraj, D.J. (eds), CRC Pres, Boca Raton, Florida, pp113- 130. Adams P., Thomas J.C., Vernon D.M., Bohnert H.J. y Jensen R.G. 1992. Distinct cellular and organismic responses to salt stress. 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