Identificación y análisis funcional del lnc-Nr6a1 y del mRNA Serpine1 como reguladores tempranos de la transición epitelio-mesénquima

! ! ! ! ! ! Identificación!y!análisis!funcional!del!lnc-Nr6a1!y! del!mRNA!Serpine1!como!reguladores!tempranos! de!la!transición!epitelio-mesénquima! ! ! Memoria(presentada(por:( Salvador!Polo!Generelo! ! ! Tesis(doctoral(realizada(en(el(en(el(Centro(Andaluz(De(Biología( Molecular(y(Medicina(Regenerativa((CABIMER),(para(optar(al( grado(de( Doctor(en( Biología( Molecular,( Biomedicina( e( Investigación(Clínica(por(la(Universidad(de(Sevilla.( ( ( Director:( Dr.!José!Antonio!Pintor!Toro! ( Tutora:( Dra.!Rosa!María!Luna!Varo! ! ! ! ! ! ÍNDICE INTRODUCCIÓN 1 I.1. La transición epitelio-mesénquima (EMT) 1 I.1.1. Descripción del proceso de EMT 1 I.1.2. Tipos de EMT 5 I.1.3. EMT inducida por TGF- 7 1.1.3.1. Ruta canónica o dependiente de SMADs 8 1.1.3.2. Rutas no canónicas de señalización de TGF- 8 I.1.4. RNA y EMT 10 I.1.4.1. RNAs no codificantes (ncRNAs) 10 I.1.4.1.1. MiRNAs 11 I.1.4.1.2. LncRNAs 18 I.1.5. Splicing alternativo (AS) y EMT 26 I.1.5.1. Definición, tipos y descripción del proceso de splicing 26 I.1.5.2. Función de las proteínas SR en el AS 28 I.1.5.3. Implicaciones del AS en la EMT y el cáncer 29 I.1.6. Descripción de las estructuras de adhesión en las células epiteliales 30 I.1.7. Reprogramación metabólica, EMT y cáncer 33 I.1.8. SERPINE1 en EMT y cáncer 35 OBJETIVOS 41 RESULTADOS 43 CAPÍTULO 1: IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS FUNCIONAL DEL LNC-NR6A1 43 R.1.1. Identificación y caracterización molecular del lnc-Nr6a1 43 R.1.1.1. El lnc-Nr6a1 es un posible regulador temprano de la EMT 43 R.1.1.2. Secuencia de la isoforma lnc-Nr6a1-1 45 R.1.1.3. Las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 se localizan principalmente en la fracción nuclear insoluble 47 R.1.1.4. La isoforma lnc-Nr6a1-1 se transcribe como un precursor conteniendo los mir- 181a2/b2 48 R.1.1.5. El gen Lnc-Nr6a1 presenta un gen ortólogo en humano 52 R.1.2. Caracterización bioquímica de las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 53 R.1.2.1. El silenciamiento de la ruta MAPK ERK1 afecta a la inducción por TGF- de la isoforma lnc-Nr6a1-1 53 R.1.2.2. La inducción de la isoforma lnc-Nr6a1-1 es independiente de las rutas de señalización de las SMADs, p38, AKT y JNK kinasa 54 R.1.2.3. El silenciamiento de la ruta de AKT afecta a la inducción de la isoforma lnc-Nr6a1-2 56 R.1.3. Las células carentes del gen Lnc-Nr6a1 (Lnc-Nr6a1-/-) presentan defectos en la adhesión y un patrón de expresión génica alterado 57 R.1.3.1. Generación y caracterización de células Lnc-Nr6a1-/- 57 R.1.3.2. Las células Lnc-Nr6a1-/- presentan un patrón de expresión génica alterado 59 R.1.3.3. La ausencia del gen Lnc-Nr6a1 afecta a la adhesión célula-matriz 62 R.1.3.4. La ausencia del gen Lnc-Nr6a1 afecta a la adhesión célula-célula 64 R.1.3.5. El ciclo celular y la capacidad proliferativa no están afectados en las células Lnc-Nr6a1-/- 65 R.1.4. La sobreexpresión de las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 aumenta la capacidad de migración pero no afecta a la proliferación ni al ciclo celular 67 R.1.4.1. Clonación de las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 en vectores de expresión y lentivirales 67 R.1.4.2. La sobreexpresión de las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 produce un aumento de la capacidad migratoria 70 R.1.4.5. La sobreexpresión de las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 no produce alteraciones ni en la proliferación ni en el ciclo celular 72 R.1.5. La isoforma lnc-Nr6a1-1 no interacciona con la cromatina 73 R.1.6. Identificación del interactoma de la isoforma lnc-Nr6a1-1 74 R.1.6.1. La isoforma lnc-Nr6a1-1 interacciona con proteínas pertenecientes a complejos bien diferenciados 74 R.1.6.2. La ausencia del gen Lnc-Nr6a1 afecta a la interacción entre la lamina A/C y la cromatina 76 R.1.6.3. El metabolismo glicolítico se afecta en las células Lnc-Nr6a1-/- 78 R.1.7. La sobreexpresión del gen Lnc-Nr6a1, que incluye las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 y los miR-181a2/b2, afecta a la expresión de marcadores de EMT, aumenta la resistencia a anoikis y la capacidad de migratoria 79 R.1.7.1. Obtención de una línea celular estable NMuMG que sobreexpresa el gen Lnc-Nr6a1 80 R.1.7.2. La sobreexpresión del gen Lnc-Nr6a1 produce una disminución de E-cadherina y un aumento de N-cadherina 82 R.1.7.3. La sobreexpresión del gen Lnc-Nr6a1 aumenta la resistencia a anoikis 82 R.1.7.4. La sobreexpresión del gen Lnc-Nr6a1 no afecta a la proliferación celular 84 R.1.7.5. La sobreexpresión del gen Lnc-Nr6a1 no afecta a la adhesión célula-matriz 84 R.1.7.6. La sobreexpresión del gen Lnc-Nr6a1 aumenta la capacidad de migración de las células NMuMG 85 CAPÍTULO 2: ESTUDIO DE LA REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL DE LA EMT A TIEMPOS TEMPRANOS 87 R.2.1. Optimización y desarrollo de la técnica iCLIP de la proteína Argonauta2 (AGO2) en células NMuMG 87 R.2.1.1 Inmunoprecipitación de la proteína AGO2 87 R.2.1.2. Optimización de la concentración de proteína a utilizar por condición 88 R.2.1.3. Optimización de la concentración de RNasa 88 R.2.1.4. Estudio del tamaño del RNA unido a la proteína AGO2 89 R.2.1.5. Optimización del proceso de PCR 90 R.2.1.6. Desarrollo del experimento del iCLIP de AGO2 91 R.2.2. Análisis bioinformático de la genoteca del iCLIP de AGO2 92 R.2.2.1. Los triplicados de las muestras presentan un alto índice de similitud 92 R.2.2.2. AGO2 se une principalmente a exones y a regiones 3’ UTR del RNA 93 R.2.2.3. Estudio de los RNAs enriquecidos en el complejo RISC tras el tratamiento con TGF-. Selección del mRNA Serpine1 como posible esponja de miRNAs en la EMT 94 R.2.3. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 induce EMT 96 R.2.3.1. Los niveles de Serpine1 aumentan en células NMuMG tratadas con TGF- 96 R.2.3.2. Obtención de células que sobreexpresan el mRNA Serpine1 97 R.2.3.3. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 produce un aumento de la capacidad migratoria e invasiva de las células pero no afecta a la proliferación celular 99 R.2.3.4. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 confiere resistencia a anoikis 102 R.2.3.5. Las células que sobreexpesan el mRNA Serpine1 muestran cambios de expresión en marcadores característicos de la EMT 102 R.2.3.6. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 afecta a la adhesión célula-célula, pero no a la adhesión célula-matriz 103 R.2.3.7. Las células que sobreexpresan el mRNA Serpine1 presentan un perfil proteómico alterado 104 R.2.4. El factor de splicing TRA2B se regula mediante el mRNA Serpine1 y diferentes miRNAs 108 2.4.1. El factor de splicing TRA2B se regula postranscripcionalmente en las céulas NMuMG tratadas con TGF- 108 2.4.2. MiR130b-5p regula los niveles de la proteína TRA2B 110 R.2.5. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 y posterior inducción de TRA2B afecta al splicing alternativo (AS) y altera el patrón de expresión génica en las células NMuMG 119 2.5.1. Las células que sobrexpresan el mRNA Serpine1 presentan cambios a nivel del AS 119 2.5.2. Las células que sobreexpresan el mRNA Serpine1 tienen un patrón de expresión génica alterado 121 DISCUSIÓN 123 CAPÍTULO 1: IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS FUNCIONAL DEL LNC-NR6A1 123 D.1.1. Identificación y caracterización molecular del lnc-Nr6a1 123 D.1.2. La isoforma lnc-Nr6a1-1 es una diana directa de la ruta de señalización de la MAPK ERK1, mientras que la isoforma lnc-Nr6a1-2 lo es de la ruta de AKT 124 D.1.3. Identificación del interactoma de la isoforma lnc-Nr6a1-1 124 D.1.4. La sobreexpresión de las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 aumenta la capacidad de migración 129 D.1.5. La isoforma lnc-Nr6a1-1 no interacciona con la cromatina 129 D.1.6. La sobreexpresión del gen Lnc-Nr6a1, que incluye las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 y los miR- 181a2/b2, afecta a la expresión de marcadores de EMT, así como a la resistencia a anoikis y a la migración 130 CAPÍTULO 2: ESTUDIO DE LA REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL DE LA EMT A TIEMPOS TEMPRANOS 133 D.2.1. AGO2 se une principalmente a exones y a regiones 3’ UTR del RNA 133 D.2.2. Selección del mRNA Serpine1 como posible esponja de miRNAs en la EMT 133 D.2.3. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 induce la EMT 134 D.2.4. El factor de splicing TRA2B está regulado por el mRNA Serpine1 y miR-130b-5p 136 D.2.5. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 y posterior inducción de TRA2B afecta al splicing alternativo (AS) y altera el patrón de expresión génica en las células NMuMG 139 CONCLUSIONES 143 MATERIALES Y MÉTODOS 145 MM.1. MATERIAL BIOLÓGICO 145 MM.1.1. Bacterias 145 MM.1.1.1. Cepas bacterianas utilizadas 145 MM.1.1.2. Medios y condiciones de cultivo 145 MM.1.2. Líneas celulares 146 MM.1.2.1. Líneas celulares utilizadas 146 MM.1.2.2. Cultivo de líneas celulares 146 MM.1.2.3. Congelación y descongelación de células 147 MM.1.2.4. Ensayo de invasividad 148 MM.1.2.5. Ensayo de cierre de heridas 148 MM.1.2.6. Curva de proliferación celular 149 MM.1.2.7. Estudio del ciclo celular 149 MM.1.2.8. Ensayos de adhesión 150 MM.1.2.8.1. Adhesión célula-matriz 150 MM.1.2.8.2. Adhesión célula-célula 150 MM.1.2.9. Tinción con cristal violeta 150 MM.1.2.10. Establecimiento de líneas estables generadas con el sistema Alt-R CRISPR/Cas9 (IDT) para la deleción de fragmentos y CRISPR de activación (CRISPRa) para la inducción transcripcional 151 MM.1.2.10.1. Alt-R CRISPR/Cas9 151 MM.1.2.10.2. CRISPRa 153 MM.1.2.11. Estudio del metabolismo glicolítico mediante la tecnología de Seahorse® 156 MM.1.2.12. Estudio de la resistencia a anoikis 156 MM.1.2.13. Drogas y reactivos utilizados 157 MM.2. MANIPULACIÓN DEL DNA 159 MM.2.1. Plásmidos utilizados 159 MM.2.2. Cuantificación del DNA 161 MM.2.3. Purificación de plásmidos de bacterias 161 MM.2.4. Electroforesis de DNA 162 MM.2.5. Purificación de fragmentos de DNA de geles de agarosa 162 MM.2.6. Digestión de DNA con enzimas de restricción 162 MM.2.7. Defosforilación de extremos 162 MM.2.8. Ligación de fragmentos de DNA 162 MM.2.9. Reacciones de PCR 163 MM.2.10. Transformación 163 MM.2.11. Análisis de transformantes (PCR de colonias) 164 MM.2.12. Secuenciación 165 MM.2.13. Transfección de líneas celulares 165 MM.2.13.1. Transfección con Fosfato Cálcico 165 MM.2.13.2. Transfección con Viromer 166 MM.2.13.3. Lentivirus y retrovirus 166 MM.2.13.3.1. Producción 166 MM.2.13.3.2. Titulación de virus 167 MM.2.13.3.3. Infección con partículas virales 167 MM.2.14. Mutagénesis 167 MM.2.15. Extracción de DNA genómico 169 MM.3. MANIPULACIÓN DEL RNA 169 MM.3.1. Obtención de RNA total 169 MM.3.2. Cuantificación del RNA 169 MM.3.3. Tratamiento con DNasa 169 MM.3.4. Retrotranscripción 170 MM.3.5. PCR cuantitativa (qRT-PCR) 170 MM.3.6. Cuantificación de miRNAs 173 MM.3.7. Amplificación rápida de los extremos de cDNA (RACE) 174 MM.3.8. Aislamiento de RNA poli(A+) y poli(A-) 175 MM.3.9. Extracción de RNA de tejidos de ratón 175 MM.3.10. Fraccionamiento celular 175 MM.3.11. Obtención de RNA para RNAseq 176 MM.3.12. Aislamiento de cromatina mediante purificación de RNA (ChIRP) 176 MM.4. MANIPULACIÓN DE PROTEÍNAS 179 MM.4.1. Extracción de proteínas de cultivos celulares 179 MM.4.2. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford 180 MM.4.3. Cuantificación de proteínas en presencia de detergentes 180 MM.4.4. Electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida 180 MM.4.5. Detección de proteínas con rojo Ponceau 181 MM.5. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS 182 MM.5.1. Anticuerpos utilizados 182 MM.5.1.1. Anticuerpos primarios 182 MM.5.1.2. Anticuerpos secundarios 183 MM.5.2. Análisis de proteínas mediante western blot 183 MM.5.2.1. Transferencia de proteínas a membrana de nitrocelulosa 184 MM.5.2.2. Inmunodetección de proteínas 184 MM.5.3. Inmunofluorescencia indirecta 185 MM.5.4. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) 185 MM.5.5. Interacción proteína-RNA in vivo (RIP) 187 MM.5.6. Identificación de proteínas de interacción directa con RNA (iDRIP) 188 MM.5.7. Mapeo de los sitios de unión de la proteína AGO2 con RNAs (Individual Crosslinking ImmunoPrecipitation (iCLIP)) 191 MM.5.8. Coinmunopreciptación de proteínas 196 MM.5.9. Espectrometría de masas 197 MM.6. MICROSCOPIA 197 MM.6.1. Microscopía de contraste de fase 197 MM.6.2. Microscopía de fluorescencia 197 MM.7. HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS 198 MM.7.1. Procesamiento de los datos de RNAseq 198 MM.7.2. Procesamiento de los datos de ChIRPseq 199 MM.7.3. Procesamiento de los datos de ChIPseq 200 MM.7.4. Procesamiento de los datos de iCLIPseq 201 MM.7.5. Estudio del splicing alternativo (AS) 202 MM.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 203 BIBLIOGRAFÍA 205 Figura R.104. Ilustración esquemática de los eventos de AS comunes al sobreexpresar el mRNA Serpine1 y el factor de splicing TRA2B. 120 Figura R.105. Análisis de ontología génica de los genes desregulados significativamente al sobreexpresar el mRNA Serpine1. 121 Figura R.106. Diagrama de Venn que muestra los genes comunes desregulados al sobreexpresar el mRNA Serpine1 y el factor de splicing TRA2B. 122 Figura D.1. Modelo de interacción entre el lnc-Nr6a1-1 y las enzimas glicolíticas. 127 Figura D.2. Inmunohistoquímica (IHC) de la proteína SERPINE1 en distintos tipos de tumores. 135 Figura D.3. Niveles de proteína SERPINE1 en distintos tipos de tumores. 136 Figura D.4. Inmunohistoquímica (IHC) de la proteína TRA2B en distintos tipos de tumores. 138 Figura D.5. Niveles de proteína TRA2B en distintos tipos de tumores. 138 Figura D.6. Alteraciones genéticas detectadas en el gen TRA2B en distintos tumores humanos. 139 Figura MM.1. Ilustración esquemática de las diferentes etapas que constituyen la técnica ChIRP. 179 Figura MM.2. Ilustración esquemática de las diferentes etapas que constituyen la técnica iDRIP. 190 Figura MM.3. Ilustración esquemática de las diferentes etapas que constituyen la técnica iCLIP. 195 Figura MM.4. Análisis bioinformático AS. 202 ÍNDICE DE TABLAS Tabla I.1. miRNAs involucrados en EMT. 16 Tabla I.2. LncRNAs involucrados en EMT. 24 Tabla R.1. Potencial y probabilidad codificante de las isoformas del lnc-Nr6a1. 46 Tabla R.2. Inducción de las isoformas lnc-Nr6a1-1/2 y del miR-181a2-3p con las diferentes guías utilizadas en el CRISPRa. 81 Tabla R.3. Relación de algunos de los RNAs que más aumentaban en el complejo RISC tras el tratamiento con TGF-. 94 Tabla R.4. Número de sitios de crosslinking de los RNAs indicados en la tabla R.3 en células NMuMG control y tratadas con TGF- durante 4 horas. 95 Tabla R.5. Proteínas inducidas al sobreexpresar el mRNA Serpine1. 106 Tabla R.6. Relación de los MRES mutados en el mRNA Serpine1 y su localización. 112 Tabla R.7. Se indica el miRNA afectado, el MRE mutado, la mutación producida, el sitio de restricción creado y la enzima correspondiente. 112 Tabla R.8. Genes afectados por AS al sobreexpresar el mRNA Serpine1. Se indica la proporción de las distintas isoformas en cada condición y el tipo de evento de AS. 121 Tabla D.1. Sitios de reconocimiento del factor de splicing TRA2B en los exones alternativos de los genes Adar, Parp11 y Phf11d/Setdb2/Phf11c/Gm4593. H: A/C/T y V: G/A/C 140 Tabla MM.1. Estirpes de E.coli utilizadas en este trabajo. 145 Tabla MM.2. Líneas celulares utilizadas en este trabajo. 146 Tabla MM.3. Apareamiento entre el crRNA y el tracRNA. 152 Tabla MM.4. Mezcla de formación de los complejos RNPs. 152 Tabla MM.5. Mezcla para la transfección de los complejos RNPs. 152 Tabla MM.6. Secuencia de los crRNAs utilizados con el sistema Alt-R CRISPR-Cas9. 153 Tabla MM.7. Secuencias de los diferentes sgRNAs utilizados para la activación transcripcional. 154 Tabla MM.8. Mezcla de apareamiento de las dos cadenas de los sgRNAs. 154 Tabla MM.9. Reacción de digestión del plásmido lenti-sgRNA (MS2) con la enzima BsmB1. 155 Tabla MM.10. Reacción de ligación del plásmido lenti-sgRNA (MS2) con los diferentes guías apareados. 155 Tabla MM.11. Reactivos y drogas utilizados 159 Tabla MM.12. Relación de plásmidos utilizados. 161 Tabla MM.13. Oligonucleótidos utilizados para la comprobación de transformantes por PCR de colonias. 164 Tabla MM.14. DsiRNAs utilizados para silenciar SMAD4. 166 Tabla MM.15. Relación de oligonucleótidos utilizados en los diferentes ensayos de mutagéneses. Los dos primeros se utilizaron para mutar los 4 ATGs de Serpine1 y los restantes para mutar los MREs de los distintos miRNAs estudiados. 168 Tabla MM.16. Relación de oligonucleótidos utilizados para comprobar mediante secuenciación las mutaciones de los cuatro sitios ATGs mutados en Serpine1 y de los MREs de los miRNAs estudiados. 169 Tabla MM.17. Oligonucleótidos utilizados para comprobar las deleciones de los genes Lnc- Nr6a1 y Serpine1 en el ensayo de Alt-R CRISPR-Cas9. 169 Tabla MM.18. Relación de oligonucleótidos utilizados para PCR cuantitativa. 171 Tabla MM.19. Relación de oligonucleótidos utilizados para confirmar el AS mediante PCR cuantitativa 172 Tabla MM.20. Relación de oligonucleótidos para la cuantificación de las especies de miR-181. 173 Tabla MM.21. Secuencia del oligonucleótido del miR-425-5p, utilizado como normalizador en las cuantificaciones de otros miRNAs. 174 Tabla MM.22. Relación de oligonucleótidos utilizados para los experimentos de 5’ y 3’ RACE. 175 Tabla MM.23. Sondas utilizadas en el experimento de ChIRP de la isoforma lnc-Nr6a1-1. 177 Tabla MM.24. Reactivos para la preparación de geles SDS-poliacrilamida. 181 Tabla MM.25. Anticuerpos primarios utilizados. 183 Tabla MM.26. Anticuerpos secundarios. 183 Tabla MM.27. Relación de oligonucleótidos utilizados en la retrotranscripción de las muestras del iCLIP, indicando el código que permite distinguir las muestras en el proceso de secuenciación. 193 Tabla MM.28. Secuencia de los primers utilizados en la PCR del iCLIP. 195 Tabla MM.29. Criterios de filtrado para las distintas comparaciones de RNAseq. 198 Tabla MM.30. Número de lecturas de las distintas muestras utilizadas en los experimentos de RNAseq. 199 Tabla MM.31. Número de lecturas de las muestras utilizadas en el ChIRPseq. 200 Tabla MM.32. Número de lecturas de las muestras utilizadas en el ChIPseq. 200 Tabla MM.33. Número de lecturas de las distintas muestras utilizadas en el experimento de iCLIPseq. 202 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ABREVIATURAS! ! ! ! ! ! ABREVIATURAS ABREVIATURAS* * (p/v)* Peso/volumen* 2-DG* 2-Deoxy-D-glucosa* 3'*RACE* Amplificación*rápida*de*extremos*3'*de*cDNA*(del*inlglés,*3'#Rapid#amplification#of# cDNA#ends)* 3'*SS* Sitio*de*splicing*3'*(del*inglés,*splicing#site#3')* 3'*UTR* Región*3'*no*traducida*(del*ingés,*3'*Untranslated#region)* 5'*cap* Caperuza*5'* 5'*RACE* Amplificación*rápida*de*extremos*5'*de*cDNA*(del*inglés,*5'#Rapid#amplification#of# cDNA#ends)* 5'*SS* Sitio*de*splicing*5'*(del*inglés,*splicing#site#5')* 5'*UTR* Región*5'*no*traducida*(del*inglés,*5'*Untranslated#region)* A* Amperaje* ACC* Acetil*CoA*carboxilasa*(del*inglés,*Acetyl-CoA#carboxylase)* ADAR* Adenosina*deaminasa*específica*de*RNA*(del*inglés,*Adenosine#deaminase#acting#on# RNA)* AFE* Primer*exón*alternativo*(del*inglés,*Alternative#first#exon)* AGO* Argonauta* ALE* Último*exón*alternativo*(del*inglés,*Alternative#last#exon)* AMP* Adenosín*monofosfato*(del*inglés,*Adenosine#monophosphate)* AMPK* Proteína*quinasa*activada*por*AMP*(del*inglés,*AMP-activated#protein#kinase)* Apr* Resistencia*a*ampicilina* APS* Persulfato*de*amonio*(del*inglés,*Amonium#persulfate)* AS* Splicing*alternativo*(del*inglés,*Alternative#splicing)* ASO* Oligonucleótido*antisentido*(del*inglés,*antisense#oligonucleotide)* ATCC* Del*inglés,*American#Type#Culture#Collection# ATP* Adenosina*trifosfato* BMP* Molécula*morfogénica*ósea*(del*inglés,*Bone#morphogenetic#proteina)* BPAG1e* Antígeno*1*del*penfigoide*bulloso*(del*inglés,*Bullous#pemphigoid#antigen#1e)# BPAG2* Antígeno*2*del*penfigoide*bulloso*(del*inglés,*Bullous#pemphigoid#antigen#2)* BS* Sitio*de*ramificación*(del*inglés,*Branch#site)* BSA* Albúmina*de*suero*bovino*(del*inglés,*bovine#serum#albumin)* CBD* Dominio*de*unión*a*catenina*(del*inglés,*catenin#binding#domain)* cDNA* DNA*complementario* CDS* Región*de*codificación*(del*inglés,*Coding#sequence)* ceRNA* RNA*endógeno*competidor*(del*inglés,*Competing#endogenous#RNA)* ChIP* Del*inglés,*Chromatin#immunoprecipitation# ChIRP* Del*inglés,*Chromatin#isolation#by#RNA#purification# CHX* Cicloheximida* circRNA* RNA*circular*(del*inglés,*Circular#RNA)* cm* Centímetro* ABREVIATURAS* CPT-1* Carnitina*palmitoiltransferasa-1*(del*inglés,*Carnitine#palmitoyltransferase-1)* CRISPRa* CRISPR*de*activación*(del*inglés,*CRISPR#activation)* crRNA* CRISPR*RNA* Ct* Umbral*de*ciclos*(del*inglés,*Cycle#threshold)* CTT* CTP:fosfocolina*citidiltransferasa*(del*inglés,*CTP:#phosphocholine# cytidylyltransferase)* DAPI* Diaminofenilindol*(del*inglés,*4',6-diamidino-2-phenylindole)# dATP* Desoxiadenosina*trifosfato* dCas9* Del*inglés,*deficient#Cas9# dCTP* Desoxicitidina*trifosfato* ddC* Diseoxicitidina* DE* Desviación*estándar* dGTP* Desoxiguanosina*trifosfato* DLBC* Linfoma*difuso*de*células*B*(del*inglés,*Lymphoid#Neoplasm#Diffuse#Large#B-cell# Lymphoma)* DMEM* Del*inglés,*Dulbecco's#modified#Eagle#medium# DMSO* Dimetilsulfóxido* DNA* Ácido*desoxirribonucleico*(del*inglés,*Deoxyribonucleic#acid)* DNasa* Desoxirribonucleasa* dNTPS* Desoxirribonucleótidos*trifosforilados* DTT* Ditiotreitol* dTTP* Desoxitimidina*trifosfato* ECM* Matriz*Extracelular*(del*ingés,*Extracellular#matrix)* EDTA* Ácido*etilendiaminotetracético* EGF* Factor*de*crecimiento*epidérmico*(del*inglés,*Epidermal#growth#factor)* EGFR* Receptor*del*factor*de*crecimieto*epidérmico*(del*inglés,*Epidermal#growth#factor# receptor)* EGTA* Ácido*etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N'.N'-tetraacético* EMT* Transición*epitelio-mesénquima*(del#inglés,#Epithelial-mesenchymal#transition)# EMT-TF* Factor*de*transcripción*inductor*de*EMT*(del*inglés,*EMT#transcription#factor)* ERK* Del*inglés*Extracellular#regulated#kinases# eRNA* RNA*asociadoa*enhancer#(del*inglés,*Enhancer#associated#RNA)* ESCA* Carcinoma*esofágico*(del*inglés,*Esophageal#carcioma)* ESE* Secuencia*exónica*potenciadora*del*splicing*(del*inglés,*Exonic#splicing#enhancer)* ESRP* Proteína*epitelial*reguladora*de*splicing*(del*inglés,*Epithelial#splicing#regulatory# protein)* ESS* Secuencia*exónica*silenciadora*del*splicing*(del*inglés,*Exonic#splicing#silencer)* EST* Del*inglés,*Expression#sequence#tag* Ex/Em* Excitación/Emisión* FAK* Quinasa*de*adhesión*focal*(del*inglés*focal#adhesion#kinase)* FASN* Sintasa*de*ácidos*grasos*(del*inglés,*Fatty#Acid#Synthase)* FC* Del*inglés*Fold#change# FD* Factor*de*dilución* FDR* Del*inglés*False#discovery#rate# ABREVIATURAS FGF* Factor*de*crecimiento*fibroblásico*(del*inglés,*Fibroblast#growth#factor)* FGFR* Receptor*del*factor*de*crecimiento*fibroblástico*(del*inglés,*Fibroblast#growth# factor)* FSB* Suero*fetal*bovino*(del*inglés,*Fetal#bovine#serum)* g* gramos* g*(RCF)* Fuerza*centrífuga*relativa* GBM* Glioblastoma** GFP* Proteína*verde*fluorescente*(del*inglés,*Green#fluorescent#protein)* GLS1/2* Glutaminasa*1/2* glycoPER* Del*inglés,*Glycolysis#proton#efflux#rate# GSK3B* Glucógeno*sintasa*3*β*(del*inglés,*Glycogen#synthase#kinase#3#β)* GTP* Guanosín*trifosfato*(del*inglés,*guanosine#triphosphate)* h* horas* HBS* Tampón*HEPES*(del*inglés,*HEPES#buffer#saline)* HCC* Carcinoma*hepatocelular*(del*inglés,*hepatocellular#cancer)* HGF* Factor*de*crecimiento*hepático*(del*inglés,*Hepatic#growth#factor)* HK2* Hexoquinasa-2* HMGCR* *3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA-reductasa*(del*inglés,*3-hydroxy-3-methylglutaryl- coenzyme#A#reductase)* hnRNP* Ribononucleoproteína*nuclear*heterogénea*(del*inglés,*Heterogenous#nuclear# ribonucleoprotein)* HNSC* Carcinoma*de*células*escamosas*de*cabeza*y*cuello*(del*inglés,*Head#and#Neck# squamous#cell#carcinoma)* HS* Suero*de*caballo*(del*inglés,#horse#serum)* iCLIP* Del*inglés*individual#crosslinking#immunoprecipitation# iDRIP* Del*inglés,*Identification#of#direct#RNA#interacting#proteins# IgG* Inmunoglobulina*G* IgG* Inmunoglobulina*G* IHC* Inmunohistoquímica* IP* Inmunoprecipitación* ISE* Secuencia*intrónica*potenciadora*del*splicing*(del*inglés,*Intronic#splicing#enhancer)* ISS* Secuencia*intrónica*silenciadora*del*splicing*(del*inglés,*Intronic#splicing#silencer)* JAM* Molécula*de*adhesión*de*unión*(del*ingles,*Junctional#adhesion#molecule)* JMD* Dominio*de*yuxtamembrana*(del*inglés,*Juxtamembrane#domain)* JNK* Del*inglés,*c-Jun#N-terminal#kinase)* Kb* Kilobase* Kda* Kilodalton* KIRC* Carcinoma*renal*de*células*claras*(del*inglés,*Kidney#renal#clear#cell#carcinoma)* KO* Del*inglés*Knockout# LAD* Del*inglés,*Lamin#associated#domain# LGG* Glioma*cerebral*de*bajo*grado*(del*inglés,*Brain#Lower#Grade#Glioma)* LNA* Acido*nucleico*protegido*(del*inglés,*locked#nucleic#acid)* LncRNA* RNA*largo*no*codificante*(del*inglés,*long#non#coding#RNA)* M* Molar* ABREVIATURAS* MAPK* Proteína*quinasa*activada*por*mitógeno*(del*inglés,*Mitogen-activated#protein# kinase)# MET* Transición*mesénquima-epitelio*(del*inglés*mesenchymal-epithelial#transition)* mg* Miligramo* min* Minutos* MIRHG* Del*inglés,*microRNA#host#gene# miRNA* MicroRNA* mJ* Milijulios* ml* Mililitro* mm* Milímetro* mM* Milimolar* MMP* Metaloproteinasa*de*matriz*(del*inglés,*Matrix#metalloproteinase)* MOI* Multiplicidad*de*infección*(del*inglés,*Multiplicity#of#infection)* MOPS* Tampón*de*ácido*3-(N-morfolino)-propanosulfónica*(del*inglés,*3-(N-morpholino)# propanesulfonic#acid)# MRE* Sitio*de*reconocimiento*de*microRNA*(del*inglés,*MicroRNA#recognition#element)* mRNA* RNA*mensajero*(del*inglés,*Messenger#RNA)* NAD* Nicotinamida*adenina*dinucleótido*(del*inglés,*Nicotinamide#adenine#dinucleotide)* NAT* Transcrito*natural*antisentido*(del*inglés,*Natural#antisense#transcript)* NC1* Control*negativo*1*(del*inglés,*negative#control#1)* NCBI* Del*inglés,*National#Center#for#Biotecnology#Information* ncRNA* RNA*no*codificante*(del*inglés,*Non#coding#RNA)* ng* Nanogramo* NLS* Secuencia*de*localización*nuclear*(del*inglés,*nuclear#localization#sequence)* nm* Nanómetro* NMD* Desintegración*citosólica*mediada*por*secuencias*sin*sentido*(del*inglés,*Nonsense# meadited#decay)* NMuMG* Célula*normal*de*glándula*mamaria*de*ratón*(del*inglés,*Normal#murine#mammary# gland#cell)* NOTCHICD* Dominio*intracelular*de*Notche*(del*inglés*Notch#intracellular#domain)* ns* No*significativo* nt* Nucleótido* oncomiR* microRNA*oncogénico*(del*inglés,*oncogenic#microRNA)* ORF* Fase*abierta*de*lectura*(del*inglés,#open#reading#frame)* PAAD* Adenocarcinoma*pancreático*(del*inglés,*Pancreatic#adenocarcinoma)* PARN* Del*inglés,*Poly#(A)-specific#ribonuclease* PAT* RNA*asociado*a*promotores*(del*inglés,*Promoter#associated#RNA)* pb* Pares*de*bases* PBS* Tampón*fosfato*(del*inglés,*Phosphate#buffer#saline)* PCR* Reacción*en*cadena*de*la*polimerasa*(del*inglés,*Polimerase#Chain#Reaction)* PEG* Polietilenglicol* pg* Picogramos* pHEMA* polímero*poli(2-hidroxietil*metacrilato)* ABREVIATURAS PI* Youduro*de*propidio* PI3K* Del*inglés,*Phosphoinositide-3#kinase# PIP3* Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato*(del*inglés,*Phosphatidylinositol-3,4,5- trisphosphate)* piRNA* RNA*asociado*a*proteínas*PIWI* PKM2* Isoforma*2*de*la*isozima*M*de*piruvato*quinasa* pmoles* Picomoles* PMSF* Fluoruro*de*fenilmetilsulfonilo*(del*inglés,*Phenylmethyl#sulphonyl#fluoride)* PNK* Polinucleótido*quinasa*(del*inglés,#Polynucleotide#kinase)* PRC* Compejo*represivo*polycomb*(del*inglés,*Polycomb#repressive#complex)* pre-miRNA* Precursor*de*micro*RNA*(del*inglés,*Precursor#micro#RNA)* pri-miRNA* MicroRNA*primario*(del*inglés,*primary#micro#RNA)* PSA* Antígeno*prostático*específico,*del*inglés*Prostate-specific#antigen* pSD* pSIN-DUAL* PTT* Tracto*de*polipirimidinas*(del*inglés,*polypirimidine#tract)* rasiRNA* RNA*interferente*pequeño*asociado*a*repeticiones*(del*inglés,*Repeat-associated# small#interfering#RNA)* RAT* Del*inglés,*Rat#sarcoma#viral#oncogene#homolog# RCL* Bucle*del*centro*activo*(del*inglés,*Reactive#center#loop)* RIP* Del*inglés,*RNA#immunoprecipitation# RISC* Del*inglés*RNA#induced#silencing#complex# RNA* Ácido*ribonucleico*(del*inglés,*Ribonucleic#acid)* Rnasa* Ribonucleasa* RNP* Complejo*ribonucleoproteico* RPKM* Lecturas*por*kilobase*y*por*millón*de*lecturas*mapeadas*(del*inglés,*Reads#per# kilobase#per#million#mapped#reads)* rpm* Revoluciones*por*minuto* RRM* Motivo*de*reconocimiento*de*RNA*(del*inglés,*RNA#recgonition#motif)* rRNA* RNA*ribosómico* RT-qPCR* Transcripción*reversa*del*RNA*y*ampflificación*de*DNA*por*reacción*en*cadena*de* la*polimerasa*(del*ingles,*Reverse#transcriptase#quantitative#polimerase#chain# reaction)* SC* Sitio*de*crosslinking# SDS* Dodecilsulfato*sódico*(del*inglés,*Sodium#dodecyl#sulfate)* sgRNA* RNA*guía*(del*inglés*single#guide#RNA)* shRNA* Del*inglés*Short#hairpin#RNA# siRNA* RNA*pequeño*de*interferencia*(del*inglés,*small#interfering#RNA)* SLS* Sodio*lauroil*sacarosa*(del*inglés,*Sodium#lauryl#sarcosinate)# SMAD* Del*inglés,*Mothers#Against#Decantaplegic#homolog# snoRNA* RNA*pequeño*nucleolar*(del*inglés,*Small#nucleolar#RNA)* SNP* Polimorfismo*de*un*solo*nucleótido*(del*inglés,*Single#nucleotid#polymorfism)* snRNA* RNA*pequeño*nuclear*(del*inglés,*Small#nuclear#RNA)* snRNP* Ribonucleoproteí´na*nuclear*pequeña*(del*inglés,*Small#nuclear#ribonucleoprotein)* SR** Proteína*serina-arginina* INTRODUCCIÓN* * 1* INTRODUCCIÓN* * I.1.*La*transición*epitelio-mesénquima*(EMT)* I.1.1.*Descripción*del*proceso*de*EMT* La*EMT*es*un*programa*celular*reversible*por*el*que*las*células*epiteliales*pierden*algunas*de*sus* características*y*adquieren*propiedades*típicas*de*las*células*mesenquimales.* Uno*de*los*principales*rasgos*de*las*células*epiteliales*es*su*capacidad*para*formar*capas*de*células* unidas* entre* ellas* debido* a* la* existencia* de* diferentes* tipos* de* uniones:* estrechas,* adherentes,* desmosomales*y*tipo* GAP.* La* distribución* de* este* tipo* de* uniones* determina* que* las* células* epiteliales*presenten*una*polaridad*ápico-basal.*Además,*también*interaccionan*con*la*membrana* basal* mediante* otro* tipo* de* estructuras* denominadas* hemidesmosomas* y* uniones* focales.*La* activación*de*la*EMT*provoca*la*pérdida*de*la*polaridad*celular,*el*desensamblaje*de*las*uniones* célula-célula* y* la* degradación* de* la* matriz* extracelular* (ECM).* Por* su* parte,* las* células* mesenquimales* resultantes*presentan* una* polaridad* delantero-trasera,* fibras* de* estrés* de* filamentos*de*actina*y*capacidad*de*migración*e*invasión*(Figura*I.1).* * Figura* I.1." La* transición* epitelio-mesénquima* (EMT).*El* diagrama* ilustra* algunos* de* los* cambios* más* importantes* ocurridos*en*el*programa*de*EMT,*así*como*los*marcadores*característicos*del*estado*epitelial*y*mesenquimal.*Adaptada*de* (Dongre*&*Weinberg,*2019)* " INTRODUCCIÓN* * 2* El*programa*de*EMT*se*inicia*con*la*activación*de*distintas*rutas*de*señalización*que*regulan*la* expresión*de*factores*de*transcripción*(EMT-TFs)*que*bloquean*la*expresión*de*genes*epiteliales*e* inducen*otros*mesenquimales.*Estos*cambios*transcripcionales*determinan*los*cambios*fenotípicos* de*las*células*epiteliales*que*permitirán*la*adquisición*de*las*nuevas*características*mesenquimales.* Las*rutas*de*señalización*implicadas*en*la*EMT*son*las*siguientes*(Figura*I.2):* • Vía*WNT:*se*inicia*con*la*unión*de*alguno*de*sus*19*ligandos*canónicos*a*un*receptor*de*la* familia*Frizzled,*conduciendo*a*la*liberación*de*b-catenina*del* complejo* que* forma* con* GSK3B*(glucógeno*quinasa*sintasa*3*b ), *XIN*(proteína*de*unión*a*actina)*y*APC*(proteína* de*la*poliposis*adenomatosa*de*colon),*y*su*translocación*al*núcleo,*donde*se*une*a*factores* de*transcripción*de*la*familia*TCF/LEF*para*activar*genes*que*inducen*la*EMT*(Dongre*&* Weinberg,*2019).*Por*su*parte,*la*proteína*E-cadherina,*fundamental*para*el*mantenimiento* de*la*adhesión*célula-célula*en*el*estado*epitelial,*es*un*regulador*negativo*de*esta*ruta,*ya* que*secuestra*b-catenina*en*la*uniones*adherentes*bloqueando*la*señalización*llevada*a* cabo*por*ésta*(Tian*et*al.,*2011).* • Vía*NOTCH:*se*inicia*con*la*unión*de*un*ligando*del*tipo*Delta*o*Jagged"a*alguna*de*las*cuatro* isoformas*de*receptores*tipo*NOTCH.*Tras*la*unión*ligando-receptor,*se*desencadena*una* serie*de*cortes*proteolíticos*que*terminan*con*la*liberación*del*dominio*intracelular*activo* del*receptor*NOTCH*(NOTCH-ICD),*el*cual,*una*vez*localizado*en*el*núcleo,*funciona*como* activador*transcripcional*(Osborne*&*Minter,*2007)." • Ruta* del* TGF- b : esta* cascada* de* señalización* se* activa* con* la* unión* de* alguno* de* sus* ligandos*a*dos*de*los*receptores*de*TGF-b (TbR1*y*TbR2),*que*conduce*a*la*fosforilación*de* las*proteínas*SMAD2*y*SMAD3;*éstas*se*unen*a*SMAD4*formando*un*complejo*que*se*trasloca* al* núcleo* e* interacciona* con* distintos* factores* de* transcripción* regulando*la* expresión* génica.*Además,*el*TGF-b también*activa*rutas*de*señalización*no*canónicas*como*p38,*AKT,* ERK1*y*la*vinculada*a*las*GTPasas*similares*a*RHO*(Xu*et*al.,*2009).*La*ruta*de*señalización* de*TGF-b se*estudiará*más*en*detalle*en*apartados*posteriores." • Factores* de* crecimiento* mitogénicos:* diferentes* factores* de* crecimiento* mitogénico* como*el*factor*de*crecimiento*epidérmico*(EGF),*el*factor*de*crecimiento*fibroblástico*(FGF)* o*el*factor*de*crecimiento*hepático*(HGF)*pueden*activar*el*programa*de*EMT.*La*unión*de* estos* ligandos* a* los* receptores* tirosina-quinasa* produce* la* dimerización* del* receptor* seguido* de* la* fosforilación* de* su* dominio* C-terminal,* activándose* distintas* cascadas* de* señalización* como* la* de* AKT,* ERK1,*p38* o*JNK,* que* regulan*la* expresión*génica,* proporcionando*características*funcionales*propias*de*las*células*mesenquimales*(Dongre* &*Weinberg,*2019).*Por*ejemplo,*la*unión*de*EGF*a*su*receptor*activa*la*ruta*ERK1*que* reprime*la*expresión*de*E-cadherina*(Tashiro*et*al.,*2016)." INTRODUCCIÓN* * 3* • Citoquinas:*la*unión*de*distintas*citoquinas*a*sus*receptores*desencadenan*la*fosforilación* y*la*activación*de*quinasas*Janus*(JAKs)*y*del*transductor*STAT,*que*forma*dímeros*y**activa* la*transcripción*de*genes*necesarios*para*la*ejecución*del*programa*de*EMT*(Dongre*&* Weinberg,*2019)." Los*factores*de*transcripción*activados*en*el*programa*de*EMT*se*engloban*en*tres*familias:*familia* SNAI,*familia*ZEB*y*familia*hélice-lazo-hélice*(bHLH):* • Familia*SNAI:*de*las*tres*proteínas*pertenecientes*a*esta*familia*que*existen*en*vertebrados,* sólo*dos*tienen*relevancia*en*la*EMT:*SNAI1*y*SNAI2/SLUG.*El*mecanismo*de*regulación* transcripcional*llevado*a*cabo*por*SNAI1/2*se*produce*mediante*la*unión*específica*a*DNA* en*los*motivos*E-box*a*través*de*sus*dominios*de*dedos*de*zinc.*Tras*la*unión,*estos*factores* de*transcripción*reclutan*al*complejo*PRC2*(Herranz*et*al.,*2008),*el*correpresor*SIN3A,*las* histonas*deacetilasas*1,2*y*3*(Peinado*et*al.,*2004)*y*la*demetilasa*específica*de*lisina-1* (LSD1)* (T.* Lin* et* al.,* 2010).* Estos* componentes* regulan* la* modificación* de* histonas* bloqueando*la*transripción.*En*contraposición*a*esta*actividad*represora,*las*proteínas*SNAI* también* pueden* activar,* de* forma* directa* o* indirecta,* la* expresión* de* proteínas* mesenquimales* como* fibronectina* y* N-cadherina,* relacionadas* con* la* migración* e* invasividad,*además*de*otros*componentes*de*la*matriz*extracelular*(Xu*et*al.,*2009).* • Familia*ZEB:**en*vertebrados*se*han*identificado*dos*proteínas*dentro*de*esta*familia:*ZEB1* y*ZEB2.**Al*igual*que*ocurre*con*la*familia*SNAI,*su*mecanismo*de*regulación*transcripcional* también*se*produce*mediante*la*unión*a*los*motivos*E-box,*activando*o*reprimiendo*genes.* La* represión* transcripcional* por* ZEB1* se* lleva* a* cabo* mediante*el* reclutamiento*del* correpresor*CTBP*(Postigo*&*Dean,*1999)*o*de*la*proteína*remodeladora*de*cromatina*BRG1* (Sánchez-Tilló* et* al.,* 2010).* La* activación*transcripcional* mediada*por* ZEB1* se* realiza* * Figura*I.2.*Rutas*de*señalización*implicadas*en*la*EMT."Se*incluye*las*vías*WNT,*NOTCH,*TGF-b,*factores*de*crecimiento* mitógeno*y*citoquinas.*Adaptada*de*(Dongre*&*Weinberg,*2019)" INTRODUCCIÓN* * 4* mediante*su*interacción*con*la*acetiltransferasa*PCAF*o*con*p300*(Postigo*et*al.,*2003).* Adicionalmente,*los*mRNAs*ZEB1/2*se*encuentran*regulados*postranscripcionalmente*por* los*miRNAs*de*las*familias*miR-200*y*miR-205*(Gregory*et*al.,*2008).* • Familia*hélice-lazo-hélice*(bHLH):*es*una*extensa*familia*de*factores*de*tanscripción*cuya* estructura*básica*consiste*en*dos*a-hélices*paralelas*unidas*por*un*lazo.*Los*factores*de*la* familia*bHLH*se*dividen*en*siete*categorías*entre*las*cuales,*las*de*clase*I,*E12*y*E47,*las*de* clase*II,*TWIST1/2,*y*las*proteínas*ID1-4*de*la*clase*V,*están*implicadas*en*el*proceso*de*EMT* (Massari*&*Murre,*2000).*TWIST1*reprime*la*expresión*de*E-cadherina*e*induce*N-cadherina" (Xu*et*al.,*2009)"(M.*H.*Yang*et*al.,*2010).* Estas*tres*familias*de*factores*de*transcripción*se*consideran*esenciales*en*el*desarrollo*de*la*EMT.* Actúan*de*forma*coordinada*y*temporal*y*su*contribución*dependerá*del*tipo*celular*o*del*tejido* implicado.* Otros*EMT-TFs*importantes*pertenecen*a*la*familia*FOX,*que*interaccionan*con*el*DNA*mediante* dominios* forkhead" (Eijkelenboom* &* Burgering,* 2013)"y* a* la* familia* GATA,*que*se*unen*al*DNA* mediante*dominios*de*dedos*de*zinc*y*regulan*la*expresión*de*genes*relacionados*con*la*uniones* célula-célula*y*con*los*complejos*necesarios*para*el*mantenimiento*de*la*polaridad*celular*(Campbell* et*al.,*2011).*Además,*la*cascada*de*señalización*iniciada*por*TGF-b activa*al*factor*de*transcripción* HMGA2,* que* se* une* al* DNA* mediante* secuencias* ricas* en* timina* a* través* de* un* mecanismo* dependiente* de* SMAD3/4.* Este* factor* de* transcripción* se* encuentra* desregulado*en* células* tumorales*y*su*expresión*ectópica*induce*transcripcionalmente*los*genes*Snai1/2*(Thuault*et*al.,* 2006).* La*activación*de*estos*factores*de*transcripción*produce*cambios*de*expresión*(algunos*de*los*cuales* ya*han*sido*mencionados)*que*determinan*la*aparición*del*fenotipo*mesenquimal.*Un*sello*distintivo* de*la*EMT*es*la*bajada*de*los*niveles*de*E-cadherina,*lo*cual*conlleva*una*desestabilización*de*las* uniones*adherentes*entre*las*células*epiteliales*y*la*liberación*de*la*b-catenina,*que*actúa*como* factor*de*transcripción*en*la*vía*WNT.*La*bajada*de*E-cadherina*va*acompañada*de*un*aumento*de* N-cadherina,*produciéndose* interacciones* célula-célula*que* son*más* débiles* y* favoreciendo* la* migración*y*la*invasión*celular*(Theveneau*&*Mayor,*2012).*También*ocurre*una*represión*de*los* genes* de* claudinas* y* ocludinas,* que* afectan* a* las* uniones* estrechas,* y* de* la* desmoplaquina* y* placofilina,*localizadas*en*los*desmosomas,*favoreciendo*la*desestabilización*de*estas*estructuras*de* adhesión*(Huang*et*al.,*2012).*Al*mismo*tiempo,*la*polaridad*ápico-basal,*debida*a*los*complejos*de* polaridad*PAR*(formado*por*las*proteínas*PAR3,*PAR6*y*aPKC)*y*Crumbs*(formado*por*las*proteínas* CRB1,*PALS1*y*PATJ),*y*que*están*integrados*física*y*funcionalmente*en*la*arquitectura*de*las*uniones* estrechas,*se*ve*afectada*por*los*cambios*ocurridos*en*los*distintos*tipos*de*unión*célula-célula,*lo* cual*conduce*a*una*desaparición*de*la*polaridad*ápico-basal*(St*Johnston*&*Ahringer,*2010).*A*su*vez,* algunos*componentes*de*estos*complejos*de*polaridad*se*regulan*transcripcionalmente*por*los*EMT- TF*(Aigner*et*al.,*2007).* INTRODUCCIÓN* * 5* El* aumento* de* los* niveles* de* vimentina* es* otra* característica* mesenquimal* que* afecta* a* la* composición*de*los*filamentos*intermedios*(Huang*et*al.,*2012)*y*que*es*necesario*para*la*movilidad* direccional* de* las* células* mesenquimales,* posiblemente* mediante* la* interacción* con* distintas* proteínas*motoras*(Mendez*et*al.,*2010).*Aparte,*las*células*que*inician*la*EMT*sufren*cambios*en*el* citoesqueleto* cortical* de* actina,*lo* que*permite* la* elongación* y* la* adquisición* de* la* capacidad* migratoria*mediante*la*formación*de*lamelipodios*y*filopodios*(Ridley,*2011).* A*medida*que*las*células*epiteliales*se*diferencian*a*células*mesenquimales,*se*producen*cambios*en* la*ECM,*así*como*en*la*interacción*de*las*células*con*ésta.*Por*ejemplo,*se*produce*un*aumento*de*la* integrina*a5b1, que*favorece*la*adhesión*celular*a*la*fibronectina,*que*también*es*inducida*durante* la* EMT,*promoviendo* la* migración* celular* (Mise*et*al.,*2012).*Adicionalmente,*el*aumento*de*la* expresión*de*las*integrinas*a1b1 y*a2b1 y*su*interacción*con*el*colágeno*tipo*I*facilita*la*separación* de*la*E-cadherina*de*las*uniones*estrechas*y*la*traslocación*al*núcleo*de*b-catenina*(Koenig*et*al.,* 2006).*Los*cambios*en*el*repertorio*de*integrinas*durante*la*EMT*se*correlacionan*con*el*aumento* de*expresión*de*proteasas,*como*las*metaloproteinasas*de*matriz*MMP2*y*MMP9,*lo*cual*permite*la* degradación*de*la*ECM,*la*migración*y*la*invasión*(Nisticò*et*al.,*2012).* En*la*EMT*también*se*producen*cambios*a*nivel*de*splicing*alternativo*(AS)"debido*a*la*acción*de* factores*de*splicing*como**las*proteínas*epiteliales*reguladoras*de*splicing*1*y*2*(ESRP1*y*ESRP2),*que* determinan*el*cambio*en*las*isoformas*del*receptor*2*del*factor*de*crecimiento*fibroblástico*(FGFR2)* (Warzecha*et*al.,*2009).* El*programa*de*EMT*también*está*regulado*por*la*actuación*de*distintos*miRNAs.*Algunos*de*ellos* interaccionan*con*los*EMT-TFs,*como*el*miR-29b*(Ru*et*al.,*2012),*el*miR-30c*(Jingcheng*Zhang*et*al.,* 2012)*y*el*miR-34*(Siemens*et*al.,*2011),*que*bloquean*la*traducción*de*Snai1;*o*el*miR-200,*que*tiene* como*mRNAs*dianas*Zeb1/2.*De*forma*inversa,*ZEB1/2*se*unen*directamente*al*promotor*de*mir- 200*(Korpal*et*al.,*2008)*y*SNAI1*al*del*mir-34,*reprimiendo*en*ambos*casos*su*expresión.*Otros* miRNAs*pueden*dirigirse*a*proteínas*que*son*necesarias*para*el*mantenimiento*del*fenotipo*epitelial,* como*el*miR-9*que*reprime*la*expresión*de*E-cadherina"(Ma*et*al.,*2010)." * I.1.2.*Tipos*de*EMT* En*función*del*contexto*biológico*en*el*que*se*produce,*la*EMT*puede*clasificarse*en*tres*tipos:* • EMT*tipo*1:*aquella*asociada*a*la*embriogénesis,*implantación*del*embrión*y*desarrollo*de* órganos.* Por*ejemplo,* durante* la* gastrulación,* la* formación* del* mesodermo* conlleva*un* proceso*de*EMT*en*el*que*las*células*del*ectodermo*cambian*de*fenotipo*y*se*invaginan* formando*el*surco*ventral*y*migrando*hacia*el*interior*del*epiblasto.* • EMT* tipo* 2:* vinculada* a* la* cicatrización* de* heridas,* regeneración* tisular* y* fibrosis* de* órganos.*Este*tipo*de*EMT*está*asociada*a*inflamación.*En*el*caso*de*la*fibrosis*de*órganos,* INTRODUCCIÓN* * 6* como*se*produce*una*inflamación*de*forma*indefinida,*el*proceso*de*EMT*persiste*pudiendo* causar*la*destrucción*del*órgano*afectado.* • EMT*tipo*3:*asociada*a*procesos*neoplásicos.*Ocurre*en*células*que*previamente*han*sufrido* cambios*genéticos*y/o*epigenéticos*que*afectan*a*oncogenes*o*genes*supresores*de*tumores* y*que,*de*alguna*forma,*alteran*moléculas*o*rutas*de*señalización*implicados*en*EMT.*Las* células* del* carcinoma* que* sufren*una* EMT* tipo* 3* pueden* migrar,* invadir* y* producir* metástasis.*Esto*es*lo*se*conoce*como*la*“cascada*invasión-metástasis”.* El*90%*de*las*muertes*asociadas*al*cáncer*se*caracteriza*por*la*capacidad*de*la*célula*cancerosa*para* invadir*tejido*circundante,* diseminarse* por* todo*el* cuerpo* y* establecer* tumores* secundarios* en* órganos*distantes*(Diepenbruck*&*Christofori,*2016).* La*denominada*“cascada*invasión-metástasis”*comienza*con*la*pérdida*de*adhesión*de*las*células* cancerosas,*su*migración*fuera*del*tumor*y*la*invasión*del*tejido*circundante.*A*continuación,*las* células*se*infiltran*en*la*circulación*sanguínea*o*linfática,*donde*tienen*que*resistir*a*la*anoikis,*un* tipo*de*muerte*celular*que*se*produce*por*la*falta*de*adhesión,*y*protegerse*del*sistema*inmunitario.* En*una*localización*secundaria,*las*células*extravasan*las*paredes*del*sistema*sanguíneo*o*linfático*y* migran* hacia* el* parénquima* del* nuevo* órgano,*donde* sufren*un* proceso* de* MET* (transición* mesénquima-epitelio)* para* constituir* la* colonia* metastásica* (Diepenbruck* &* Christofori,* 2016)* (Figura*I.3).* * Figura*I.3.*Representación*esquemática*de*la*“cascada*invasión-metástasis”.*Adaptada*de*(Diepenbruck*&*Christofori,* 2016)* INTRODUCCIÓN* * 7* I.1.3.*EMT*inducida*por*TGF- b * La*ruta*de*señalización*mediante*la*cual*se*ha*estudiado*el*proceso*EMT*en*el*presente*trabajo*es*la* inducida*por*TGF-b. Esta*ruta*tiene*un*papel*importante*en*diferentes*procesos*celulares*como*son* la* proliferación,* la* diferenciación,* la* morfogénesis,* la* homeostasis* tisular* y* la* regeneración.* No* obstante,*diversos*estudios*han*mostrado*que*el*TGF-b puede*realizar*funciones*muy*diferentes,* incluso*opuestas,*según*el*tipo*celular*y*las*condiciones.*Así,*por*ejemplo,*el*TGF-b*puede*inhibir*la* proliferación,*pero*promover*el*crecimiento*celular;*mejorar*la*pluripotencia*en*células*madre,*pero* inducir*también*la*diferenciación;*o*incluso*suprimir*el*crecimiento*en*células*premalignas,*mientras* que*en*otros*casos*potencia*la*formación*de*metástasis.*Esta*diversidad*funcional*ejercida*por*el*TGF- b está*determinada*por*el*contexto*celular.* Los*determinantes*contextuales*de*la*acción*del*TGF-b se*clasifican*en*tres*grupos*(Massagué,*2012):* • Sistema* de* transducción* de* señal:* teniendo* en* cuenta* un* entorno* epigenético* y* transcripcional*dado,*la*respuesta*a*la*señal*inducida*por*TGF-b depende*de*la*composición* intra*y*extracelular*del*sistema*de*transducción*de*la*señal;*por*ejemplo,*la*abundancia*y* actividad*de*los*ligandos*o*la*intervención*de*señales*coexistentes.* • Transcripción:*relacionada*con*los*factores*de*transcripción*que*cooperan*en*las*distintas* rutas*activadas*en*la*señalización*de*TGF-b. La*implicación*de*un*determinado*grupo*de* factores*de*transcripción*dará*lugar*a*perfiles*de*expresión*diferentes*y,*por*tanto,*a*efectos* funcionales*diversos.* • Estado*epigenético:*involucra*a*aquellos*elementos*que*interfieren*en*el*estado*epigenético* de*la*célula*como*la*metilación*del*DNA*y*accesibilidad*y*topología*de*la*cromatina,*entre* otros.* El*TGF-b es*el*prototipo*de*una*superfamilia*de*factores*polipeptídicos*que*incluye*33*miembros*en* humanos*entre*los*que*se*encuentran*activinas*e*inhibinas,*moléculas*morfogénicas*óseas*(BMPs)*o* factores*de*crecimiento*y*diferenciación,*entre*otros.*En*mamíferos*existen*tres*isoformas*de*TGF- b, que*forman*homodímeros*y*que*se*sintetizan*como*precursores*inactivos*que*son*procesados* proteolíticamente*para*dar*lugar*a*la*molécula*activa.*Por*otro*lado,*existen*tres*tipos*de*receptores* de*TGF-b, tipo*I,*II*y*III*(TbRI,*TbRII*y*TbRIII).**Los*dos*primeros,*los*más*vinculados*a*la*señalización* de*TGF-b, presentan*dominios*citoplásmicos*con*actividad*serina/treonina*quinasa.*La*cascada*de* señalización*comienza*con* la*unión*de*cualquiera*de*sus*ligandos*al*complejo*heterotetramérico* formado*por*dos*TbRI*y*dos*TbRII,*produciendo*la*transfosforilación*de*TbRI*por*parte*de*TbRII*e* iniciándose*una*ruta*de*señalización*que,*en*general,*engloba*dos*grupos*de*rutas:*1)*ruta*canónina* o*dependendiente*de*proteínas*SMADs*y*2)*ruta*independiente*de*proteínas*SMADs,*que*incluye*la* vía*de*las*MAPK,*la*ruta*de*las*GTPasas*similares*a*RHO*y*la*ruta*de*PI3*quinasa*(PI3K)/*AKT.*Tanto* la* ruta* canónica* como* aquellas* independientes* de* las* proteínas* SMADs* son* necesarias* para* el* progreso*de*la*EMT*(Tzavlaki*&*Moustakas,*2020).* INTRODUCCIÓN* * 8* 1.1.3.1.*Ruta*canónica*o*dependiente*de*SMADs* La*ruta*canónina*de*señalización*de*TGF-b *está*constituida*por*los*efectores*SMADs.*Esta*familia*está* formada*por*ocho*miembros*que* se* dividen*en*tres*grupos:*1)* proteínas*SMADs*reguladas*por* receptor*o*R-SMADs,*que*son*SMAD1,*SMAD2,*SMAD3*y*SMAD5;*2)*las*SMADs*inhibiorias*o*I-SMADs,* SMAD6*y*SMAD7;*y*3)*SMAD4,*que*constituye*el*efector*común*de*esta*ruta*(Feng*&*Derynck,*2005).* La*unión*de*alguno*de*los*tres*ligandos* de* TGF-b produce* la*fosforilación* de* TbRI*que*fosforila* SMAD2*y*SMAD3;*éstas*forman*un*trímero*con*SMAD4,*que*tras*ser*traslocado*al*núcleo,*interacciona* con* distintos* factores* de* transcripción* regulando* la* expresión*de* genes* necesarios* para* la* adquisición*del*fenotipo*mesenquimal*(Xu*et*al.,*2009)*(Figura*I.4).*Se*ha*demostrado*la*interacción* del*factor*de*transripción*HMGA2*con*el*complejo*SMAD2/3/4*para*regular*la*expresión*de*Snai1* durante*la*EMT*(Thuault*et*al.,*2008).*Además,*las*proteínas*SMADs*interaccionan*con*un*amplio* número*de*activadores*y*represores*para*llevar*a*cabo*los*cambios*de*expresión*génica*(Derynck*&* Zhang,*2003).** Por*su*parte,*las*I-SMADS,*SMAD6*y*SMAD7*regulan*negativamente*la*señalización*de*esta*ruta.*Por* ejemplo,*SMAD7*tras*interaccionar*con*el*receptor*de*TGF-b, recluta*a*la*ubiquitin*ligasa*SMURF2,* que*promueve*su*degradación*vía*proteosoma*(Kavsak*et*al.,*2000).* * 1.1.3.2.*Rutas*no*canónicas*de*señalización*de*TGF- b Dentro*de*las*rutas*no*canónicas*de*señalización*de*TGF-b se*encuentran*(Figura*I.5):* • Ruta*de*RAS*y*MAPK:*en*respuesta* a* TGF-b, TbRI* fosforila* a* SHCA,* lo* cual* provoca* el* reclutamiento*de*GRB2*y*SOS1,*que*forman*un*complejo*que*activa*a*RAS,*iniciándose*una* cascada*de*fosforilaciones*que*activa*de*forma*secuencial*a*RAF*y*MEK1/2*y*que*finaliza*en* ERK1/2,*que*una*vez*localizado*en*el*núcleo*regula*la*actividad*de*diferentes*factores*de* * Figura*I.4.*Representación*esquemática*de*la*ruta*canónina*de* señalización*por*TGF- b .**Adaptada*de*(Xu*et*al.,*2009).* INTRODUCCIÓN* * 9* transcripción* como* los* de* la* familia* de* AP-1,* mediante* fosforilación.* Por* otro* lado,* la* ubiquitin*ligasa* TRAF6* interacciona* con* el* complejo* receptor* de* TGF-b, produciendo* la* activación*de*TAK1*que*inicia*una*cascada*de*fosforilaciones*que*implica*a*MKK3,*MKK6*y* MKK4;*las*dos*primeras*fosforilan*a*la*MAPK*p38*y*la*última*a*JNK*(Xu*et*al.,*2009).* • Ruta*de*las*GTPasas*similares*a*RHO:*está*compuesta*por*las*subfamilias*de*proteínas* RHO,*RAC*y*CDC42,*que*regulan*la*organización*del*citoesqueleto*y*la*migración*celular.* RHOA*activa*a*la*quinasa*ROCK,*lo*cual*induce*la*formación*de*fibras*de*estrés*de*actina.*Del* mismo* modo,* ROCK* activa* a* la* quinasa* LIMK* que* posteriormente* inactiva* al* factor* despolimerizante* de* actina,* cofilina.* La* señalización* mediada* por* TGF-b provoca* la* degradación*de*RHOA*que*es*ubiquitinada*por*la*ubiquitin*ligasa*SMURF1,*desestabilizando* las*uniones*estrechas*(Xu*et*al.,*2009).* • Ruta*de*PI3K/AKT:*La*subunidad*p85*de*la*PI3K*interacciona*con*los*receptores*I*y*II*de* TGF-b*produciendo*la*activación*de*AKT;*a*continuación,*AKT*activa*a*mTOR*que*a*su*vez* produce* la* activación* de* la* quinasa* 1* S6* (S6K1),* la* cual* está* involucrada* en* diferentes* procesos*como*la*traducción*o*el*aumento*del*tamaño*celular*(Xu*et*al.,*2009).* * Figura*I.5.*Representación*esquemática*de*las*rutas*de*señalización*no*canónicas*iniciadas*por*TGF- b .*A.*Ruta*de* RAS/MAPK.*B.**Ruta*de*las*GTPasas*similares*a*RHO.*C.*Ruta*de*PI3K/AKT.* INTRODUCCIÓN* * 16* et*al.,*2010).*También*hay*miRNAs*que*afectan*a*rutas*de*señalización*que*favorecen*la*aparición*del* fenotipo* mesenquimal,*como* el*miR-155,* que* aumenta* la* capacidad* de* migración*e* invasión* de* células*NMuMG*al*actuar*sobre*el*mRNA*RhoA.* * miRNA* Efecto*sobre*la*EMT* Diana* Referencia* miR-9* Activar* CDH1" (Ma*et*al.,*2010)* miR-15b* Inhibir* BMI1" (Sun*et*al.,*2012)* miR-27* Activar* APC" (Z.*Zhang*et*al.,*2011)* miR-29a* Activar* Zfp36" (Gebeshuber*et*al.,*2009)* miR-30a* Inhibir* SNAI1" (Zhou*et*al.,*2013)* miR-103/107* Activar* DICER1" (Martello*et*al.,*2010)* miR-155* Activar* Rhoa" (Kong*et*al.,*2008)* miR-194* Inhibir* BMI1" (Dong*et*al.,*2011)* miR-200* Inhibir* Zeb1/2" (Korpal*et*al.,*2008)* miR-204* Inhibir* TGFBR2/SNAI2" (F.*E.*Wang*et*al.,*2010)* * Tabla*I.1.*miRNAs*involucrados*en*EMT.* * I.1.4.1.1.3.*Tecnologías*de*modulación*de*miRNAs* La*modulación*de*miRNAs*se*ha*desarrollado*principalmente*por*el*interés*en*regular*su*expresión* en*tumores.*Los*miRNAs*relacionados*con*tumorigénesis*se*dividen*en*dos*grupos:*a)*oncomiRs,*cuya* expresión*aumenta*en*distintos*tipos*de*tumores*y*b)*tsmiRs,*(miRNAs*supresores*tumorales),*que* incluye*aquéllos*que*se*encuentran*inhibidos,*favoreciendo*el*progreso*tumoral.** Las*principales*estrategias*de*modulación*van*encaminadas*bien*a*disminuir*o*a*aumentar*los*niveles* de*miRNAs*(Mollaei*et*al.,*2019).*Entre*a*las*estrategias*para*la*inhibición*miRNAs,*se*encuentran*la* utilización*de*inhibidores*sintéticos,*oligonucleótidos*antisentido,*miR-masks,*shRNAs*o*esponjas*de* microRNAs.*Los*inhibidores*sintéticos*están*constituidos*por*un*grupo*de*moléculas*capaces*de* inhibir*la*expresión*de*factores*de*transcripción*de*genes*de*miRNAs*mediante*el*control*de*rutas*de* señalización*(Garzon*et*al.,*2010)*(Gumireddy*et*al.,*2008).*Los*oligonucleótidos*antisentido*(ASO)* son*moléculas*que*se*unen*al*miRNA*induciendo*su*degradación*o*impidiendo*que*se*unan*al*mRNA* INTRODUCCIÓN* * 17* diana.*Pueden*estar*diseñadas*contra*el*pri-miRNA,*el*pre-miRNA*o*el*miRNA*maduro,*siendo*los* vinculados*a*este*último*los*que*han*demostrado*mayor*efectividad*(Esau,*2008).*La*eficiencia*de*las* moléculas*ASOs*se*ha*optimizado*mediante*diferentes*modificaciones*que*aumentan*su*estabilidad* y*especificidad,*como*es*el*caso*de*los*antagomiRs*(Krützfeldt*et*al.,*2005)*y*los*ASOs*de*ácido* nucleico*protegido*(LNA)*(Ørom*et*al.,*2006).*Por*otro*lado,*un*miR-masK*es*una*molécula*de*cadena* sencilla*de* unos*22* nucleótidos*de* longitud,* que*se*une* directamente*al*mRNA*diana* donde*se* encuentra*el* sitio* de* unión* del*miRNA*(también* denominado*“elementos* de* reconocimiento* de* miRNAs”*o*MREs),*impidiendo*la*acción*de*éste*sobre*el*mRNA*(Wei*Wu,*2018).*Cuando*se*requiere* la*inhibición*de*un*miRNA*durante*un*periodo*prolongado*se*utilizan*los*denominados*shRNAs* (System* Biosciences)* diseñados* contra* un* miRNA*específico;* los* shRNAs* pueden*clonarse*en* vectores*virales,*lo*que*permite*la*generación*de*líneas*celulares*estables.*Por*último,*las*esponjas* de* miRNAs*(también* denominadas* ceRNAs,* competing" endogenous*RNAs)*son* transcritos* muy* abundantes* que* contienen* MREs*para* un* miRNA* específico,* de* forma* que* los* miRNA* son* secuestrados*por*la*molécula*esponja*permitiendo*la*desrepresión*del*mRNA*diana*(Ebert*et*al.,* 2007).* En* general,* los* ceRNAs* constituyen* un* mecanismos* de* regulación* génica* a* nivel* postranscripcional*que*puede*ser*llevado*a*cabo*por*mRNAs,*pseudogenes,*lncRNAs*o*circRNAs*y*que* afecta*a*los*niveles*de*traducción*del*mRNA*diana*mediante*la*unión*competitiva*del*mismo*miRNA* (Y.*Zhong*et*al.,*2018)*(Thomson*&*Dinger,*2016)*(Figura*I.7).* Para*la*recuperación*de*la*actividad*o*la*sobreexpresión*de*un*miRNA*se*utilizan*las*denominadas* terapias*de*reemplazamiento,*dentro*de*las*cuales*se*encuentra*el*uso*de*moléculas*imitadoras*de* * Figura*I.7.*Mecanismo*de*acción*de*ceRNAs.*A.*El*mRNA*diana*es*transcrito*y*silenciado*por*el*miRNAs*localizado*en*el* complejo*RISC.*B.*Cuando*el*ceRNA*es*transcrito,*compite*con*el*mRNA*diana*por*la*unión*del*miRNA.*La*formación*de*los* complejos* miRNA-RISC* por* parte* del* ceRNA* da* como* resultado* un* incremento* en* la* expresión* del* gen* diana.* AGO2:* argonauta2;*Pol*II:*RNA*polimerasa*II.*Adaptada*de**(Thomson*&*Dinger,*2016)* INTRODUCCIÓN* * 18* miRNA*o*“miRNA*mimics”,*que*consisten*en*pequeños*oligonucleótidos*sintéticos*generalmente*de* cadena*doble,*modificados*químicamente*e*idénticos*al*miRNA*(Mollaei*et*al.,*2019).*Se*han*llevado* a*cabo*diversos*estudios*en*los*que*se*han*utilizado*moléculas*imitadoras*de*miR-7*en*diferentes* líneas*celulares*tumorales*y*que*han*dado*resultados*muy*prometedores*(Weizhong*Wu*et*al.,*2017).** Otra*estrategia*para*recuperar*la*expresión*de*un*miRNA*consiste*en*el*uso*de*vectores*virales,* derivados* de* adenovirus,* retrovirus* o* lentivirus,* que* expresan* los* miRNAs.* Los* vectores* virales* permiten*generar*partículas*víricas*con*una*eficiencia*de*infección*muy*alta*y*posibilitan*la*expresión* del*miRNA*a*largo*plazo*con*una*baja*toxicidad.* * I.1.4.1.2.*LncRNAs* Los* lncRNAs* se* definen* como* RNAs* de* un* tamaño* superior* a* 200* nucleótidos* y* sin* potencial* codificante.*En*los*últimos*años,*debido*al*avance,*tanto*de*la*secuenciación*masiva*como*de*una* tecnología*adaptada*a*las*características*celulares*de*los*lncRNAs,*se*han*identificado*y*caracterizado* un*importante*número*de*lncRNAs*con*funciones*claves*en*diferentes*procesos*celulares*así*como* en*el*desarrollo*de*enfermedades.** En*líneas*generales,*los*lncRNAs*se*encuentran*poco*conservados*a*nivel*de*secuencia,*son*poco* abundantes*y*muestran*una*expresión*específica*de*tejido.*Esta*especificidad*sugiere*la*existencia*de* complejos*mecanismos*de*regulación*de*los*lncRNAs*en*diferentes*procesos*celulares.* Una*de*las*dificultades*en*el*estudio*de*los*lncRNAs*es*la*diversidad*de*funciones*que*tienen,*así*como* sus*diferentes*mecanismos*de*acción.*En*la*investigación*de*lncRNAs*es*de*especial*relevancia*la* existencia*de*motivos*o*estructuras*secundarias*que*suelen*ser*claves* para*el*desarrollo*de*sus* funciones.*De*hecho,*aunque*la*secuencia**no*se*encuentre*muy*conservada*entre*especies,*sí*pueden* estarlo*determinadas*estructuras*a*través*de*las*cuales*el*lncRNA*desempeñaría*su*función*(Guttman* &*Rinn,*2012)*(Quinn*&*Chang,*2016).* * I.1.4.1.2.1.*Biogénesis,*clasificación*y*función*de*los*lncRNAs* La*mayor*parte*de*los*lncRNAs*se*transcriben*por*la*RNA*polimerasa*II,*incluyen*una*caperuza*en*su* extremo* 5’* (5’*cap),* están* poliadenilados* en* su* extremo* 3’*y* además,* suelen* estar* sometidos* a* cambios*de*AS*(Statello*et*al.,*2021).*A*pesar*de*estas*similitudes*con*la*biogénesis*y*procesamiento* de*los*mRNAs,*los*lncRNAs*presentan*características*diferenciales.*Por*ejemplo,*aunque*las*marcas* de*histonas*en*los*promotores*de*los*lncRNAs*activos*sean*similares*a*las*de*los*mRNAs,*en*levaduras* se*han*identificado*complejos*de*remodelación*de*la*cromatina*implicados*sólo*en*la*expresión*de*un* grupo*específico*de*lncRNAs*(Marquardt*et*al.,*2014).*Además,*también*hay*un*estudio*realizado*en* células*embrionarias*de*ratón*en*el*que*la*depleción*del*gen*Dicer1,*implicado*en*la*biogénesis*de* miRNAs,* produce* una* represión* de* cientos* de* lncRNAs,* un* mecanismo* en* el* que* también* está* INTRODUCCIÓN* * 19* implicado*el*oncogén*Myc,*lo*cual*sugiere*que*debe*haber*rutas*transcripcionales*especificas*de* lncRNAs* (Zheng* et* al.,* 2014).* Por* otro* lado,* algunos* lncRNAs* sufren* modificaciones* postranscripcionales*específicas*que*los*distinguen*de*los*mRNAs;*por*ejemplo,*una*de*las*isoformas* del*lncRNA*NEAT1*es*digerida*en*su*extremo*3’*por*la*RNasa*P,*formándose*así*el*lncRNA*maduro* que* es* esencial* para* su* función* estructural* en* los* paraspeckles*(estructuras* nucleares* ribonucleoproteicas*que*están*relacionadas*con*la*regulación*de*la*expresión*génica*mediante*la* retención*de*proteínas*y*RNAs)*(Wilusz*et*al.,*2012)(Quinn*&*Chang,*2016).** Los*lncRNAs*pueden*clasificarse*en*función*de*su*posición*en*el*genoma*en*los*siguientes*tipos* (Figura*I.8):* • LncRNAs*sentido:*son*aquellos*que*se*transcriben*en*la*misma*dirección*del*gen*codificante* con*el*que*solapan*unos*o*varios*de*sus*exones*o*intrones.* • LncRNAs* antisentido:* se* transcriben* desde* la*cadena*antisentido* del*gen* codificante;* pueden*aparecer*tres*subtipos:*1)*lncRNAs*en*los*que*alguno*de*sus*exones*solapa*con*otro* del*gen*codificante,*2)*lncRNAs*generados*completamente*a*partir*de*un*intrón*del*gen* codificante*y*3)*lncRNAs*en*el*que*uno*de*sus*intrones*cubre*completamente*la*región*donde* se*localiza*el*gen*codificante.* • LncRNAs*intrónicos:*se*transcriben*completamente*desde*un*intrón*de*un*gen*codificante.* • LncRNAs*intergénicos:*se*transcriben*desde*regiones*comprendidas*entre*dos*genes.* • LncRNAs*divergentes*o*bidireccionales:*son*aquellos*que*se*transcriben*en*el*sentido* opuesto*y*utilizando*e*el*promotor*del*gen*codificante.* • LncRNAs* asociados*a* enhancers:* se* transcriben* a* partir* de* regiones* del* genoma* que* corresponden*a*enhancers.* • LncRNAs*asociados*a*promotores:*se*encuentran*localizados*en*zonas*del*genoma*que* corresponden*a*promotores.* * * * * INTRODUCCIÓN* * 20* * Hasta*el*momento*se*han*identificado*lncRNAs*con*funciones*que*afectan*a*la*regulación*génica,*al* mantenimiento* de* estructuras* nucleares*como* son* los* paraspeckles* y* los* speckles*(estructuras* nucleares*ribonucleoporteicas*que*funcionan*como*reservorios*de*proteínas*relacionadas*con*el*AS)" a*la*traducción*y*estabilidad*de*los*mRNAs*o*a*la*actividad*de*diferentes*rutas*de*señalización.*Según* su*mecanismo*de*acción,*los*lncRNAs*pueden*clasificarse*en*cinco*arquetipos*(Figura*I.9):* • Arquetipo*I:*Señalizadores* Son*lncRNAs*que*responden*a*diferentes*estímulos*regulando*una*ruta*de*señalización*específica* en* cualquiera* de* sus* etapas,* de* forma* que* pueden* actuar* tanto* en* el* núcleo* como* en* el* citoplasma.*Por*ejemplo,*el*lncRNA*Air,*implicado*en*procesos*de*especificidad*alélica,*silencia* un*determinado*grupo*de*genes*de*origen*paterno*mediante*el*reclutamiento*de*modificadores* de*cromatina*como*la*metiltransferasa*G9a*(Nagano*et*al.,*2008).*Otro*ejemplo*de*este*arquetipo* de*lncRNAs*lo*constituye*el*lncRNA*PANDA,*que*es*inducido*directamente*por*p53,*tras*daño*al* DNA,* y* que* se* une* al* factor* de* transcripción* NF-YA* para* limitar* la* expresión* de* genes* proapoptóticos*y*permitir*la*parada*del*ciclo*celular*(Hung*et*al.,*2011).* • Arquetipo*II:*Señuelos* Este*tipo*de*lncRNAs*son*capaces*de*unirse*a*diferentes*tipos*de*moléculas,*secuestrarlas*y* bloquear*su*función.*El*lncRNA*GAS5*confiere*resistencia*a*glucocorticoides*mediante*la*unión*al* receptor*de*éstos,*impidiendo*que*el*receptor*pueda*interaccionar*con*los*promotores*de*genes* de*respuesta*a*glucocorticoides*(Kino*et*al.,*2010).*El*lncRNA*MALAT1,*por*su*parte,*secuestra* en*los*speckles*nucleares*factores*del*AS*ricos*en*serina/arginina,*de*forma*que*alteraciones*en* Figura*I.8.*Tipos*de*lncRNAs*según*su*localización*genómica.* * INTRODUCCIÓN* * 21* este*lncRNA*provocan*alteraciones*en*la*regulación*de*este*proceso*(Tripathi*et*al.,*2010).*Otro* tipo*de*mecanismo*de*señuelo*es*llevado*a*cabo*por*el*lncRNA*PVT1,*ya*que*su*promotor*y*el*del* oncogén*MYC*compiten*por*la*unión*de*un*potenciador*en*cis,"de*modo*que*la*expresión*del* lncRNA* PVT1*puede* suprimir* la* transcripción* de* MYC*(Cho*et*al.,* 2018);*el*lncRNA* NORAD,* localizado*en*el*citoplasma,*secuestra*a*las*proteínas*Pumilo1*y*Pumilo2,*impidiendo*que*éstas* se*unen*a*sus*mRNAs*dianas*para*estimular*su*deadenilación*y*decapitación,*lo*que*provoca*un* aumento*en*los*niveles*de*sus*mRNAs*dianas*(Lee*et*al.,*2016).* Dentro*de*este*subgrupo*funcional*de*lncRNAs*también*se*encuentran*aquellos*que*funcionan* como*esponjas*de*miRNAs*en*el*citoplasma.*Este*tipo*de*lncRNA*son*capaces*de*secuestrar*un* miRNA*específico*mediante*la*presencia*de*MREs*en*su*secuencia,*lo*que*impide*la*unión*miRNA- mRNA*diana,*y*en*última*instancia*permite*la*traducción*del*mRNA*diana.*Algunos*ejemplos*de* este*tipo*de*lncRNAs*son:*lncRNA*PVT1,*lncRNA*MALAT1*o*lncRNA*PNUTS,*de*los*que*se*ha* demostrado**capacidad*de*secuestrar*miR-152*(Ting*Li*et*al.,*2017),*miR-200c*(Pa*et*al.,*2017)*y* miR-205*(Grelet*et*al.,*2017),*respectivamente.* • Arquetipo*III:*Guías* Hay*lncRNAs*que*pueden*actuar*también*como*guías,*uniéndose*a*proteínas*y*dirigiéndolas*hacia* localizaciones* específicas.* Estas* proteínas* pueden* ser* factores* de* transcripción* o* complejos* activadores*o*represores.*Un*ejemplo*muy*bien*caracterizado*de*este*arquetipo*es*el*lncRNA*Xist,* capaz*de*guiar*al*complejo*de*represión*PRC2*para*el*silenciamiento*del*cromosoma*X*(Wutz*et* al.,*2002).*En*Arabidopsis"thaliana,*el*lncRNA*denominado*COLDAIR*ejemplifica*este*mecanismo* de*acción*guiando*también*al*complejo*PRC2*hasta*el*promotor*del*gen*FLC,*un*potente*represor* floral*(Kim*et*al.,*2017).** • Arquetipo*IV:*Andamios* Este*tipo*de*lncRNA*tiene*como*función*poner*en*contacto*dos*o*más*proteínas*de*un*complejo.* La* pérdida* de* función* de* un* lncRNA* que* funcione*como* andamio* puede* conducir* a* que* el* complejo*no*se*forme*o*lo*haga*de*forma*menos*eficiente,*afectando*a*la*actividad*realizada*por* éste.* El* lncRNA* HOTAIR*funciona* como* andamio* entre* el* complejo* PRC2* y* el* complejo* LSD1/CoREST/REST,* de* modo* que* puede* suprimir* la*expresión* génica* mediante* diferentes* mecanismos*(Tsai*et*al.,*2010).*El*lncRNA*ANRIL*funciona*como*un*andamio*entre*HDAC3*y* WDR5*(C.*Zhang*et*al.,*2020)*implicados*en*el*reclutamiento*de*complejos*remodeladores*de* cromatina*en*distintos*procesos.*Los*lncRNAs*NEAT1*(Y.*Lin*et*al.,*2018)*y*MALAT1"(Tripathi*et* al.,*2010)*funcionan*como*lncRNAs*andamio*en*la*formación*de*los*paraspeckles*y*speckles* nucleares,*respectivamente.* • Arquetipo*V:*Potenciadores( INTRODUCCIÓN* * 22* Aquellos*lncRNAs*que*funcionan*como*activadores*de*la*transcripción*de*genes*pertenecen*al* grupo*de*los*enhancers.*En*algunos*casos*la*transcripción*se*activa*al*promover*el*plegado*de*la* cromatina*desde*los*potenciadores*transcripcionales;*por*ejemplo,*el*lncRNA*CCAT1-L*funciona* como*un*superenhancer*del*oncogén*MYC*mediante*la*formación*de*un*lazo*que*potencia*la* expresión*de*este*gen*(Xiang*et*al.,*2014);*o*el*lncRNA*FALEC,*cuya*capacidad*tumorigénica*ha* sido*asociada*a*su*actividad*como*enhancer*sobre*el*gen*ECM1*(H.*Wu*et*al.,*2019)* Por*último,*es*importante*mencionar*que*un*lncRNA*puede*llevar*a*cabo*diferentes*funciones.*Por* ejemplo,*el*lncRNA*HOTAIR*es*capaz*de*funcionar*como*guía*y*como*andamio,*o*el*lncRNA*XIST,"que* puede*actuar*como*guía,*como*señalizador*y*como*andamio.* El*mecanismo*de*acción*de*un*lncRNA*depende*en*gran*medida*de*su*localización:*aquéllos*ubicados* en*el*núcleo*suelen*tener*funciones*de*regulación*de*la*cromatina,*control*transcripcional,*regulación* del*AS*o*con*el*mantenimiento*de*diferentes*estructuras*nucleares;*por*el*contrario,*las*funciones*de* los*lncRNAs*que*se*encuentran*en*el*citosol*suelen*estar*más*vinculadas*con*la*estabilidad*de*los* mRNAs,*regulación*de*la*traducción,*regulación*de*diferentes*rutas*de*señalización*o*con*el*secuestro* miRNAs.* * Figura*I.9.*Diferentes*mecanismos*de*acción*de*los*lncRNAs*según*su*localización*subcelular.**Adaptada*de*(Gomes*et* al.,*2017).* INTRODUCCIÓN* * 23* I.1.4.1.2.2.*Implicación*de*los*lncRNAs*en*la*EMT** Numerosos*estudios*han*mostrado*la*implicación*de*los*lncRNAs*en*la*regulación*de*la*EMT*a*nivel* transcripcional,*postranscripcional*y*postraduccional*(Cheng*et*al.,*2019).* Uno* de* los* mecanismos* de* regulación* transcripcional* consiste* en* la* interacción* con* diferentes* remodeladores*de*cromatina.*Así,*el*lncRNA*HOTAIR"silencia*epigenéticamente*el*mir-34a*al*unirse* al* componente* EZH2* del* complejo* PRC2* (Liu* et* al.,* 2015).* De* forma* similar,* el* lncRNA* MEG8* interacciona*con*PRC2*y*silencia*la*expresión*de*los*genes*mir-34a*y*mir-203,*lo*cual*resulta*en*una* inducción*de*los*factores*de*transcripción*SNAI1*y*SNAI2*(Terashima*et*al.,*2018).* Los*lncRNAs*también*pueden*funcionar*como*activadores*transcripcionales*de*genes*relacionados* con*la*EMT.*Por*ejemplo,*el*lncRNA*ELIT1"recluta*SMAD3*a*la*región*promotora*del*gen*SNAI1*para* potenciar* la* EMT* (Sakai* et* al.,* 2019).* El* lncRNA* SATB2-AS1"bloquea* la* progresión* del* cáncer* colorrectal*reclutando*la* proteína* p300,* que* acetila* el*promotor* del* gen* SATB2*para* inducir* su* transcripción;* a*continuación,* SATB2*recluta* HDAC1* al* promotor* de* SNAI1,* inhibiendo* su* transcripción*y*reprimiendo*EMT*(Y.*Q.*Wang*et*al.,*2019).*El*lncRNA*HOTTIP"une*la*proteína*WDR5* al*promotor*del*gen*HOXA13,*activando*los*factores*de*transcripción*ZEB1/2*(C.*Lin*et*al.,*2017).*** Trabajos*recientes*muestran*para*algunos*lncRNAs*una*función*represora*de*la*transcripción.*El* lncRNA*NEAT1"es*necesario*para*la*formación*de*un*complejo*entre*FOXN3*y*SIN3A*que*actúa*como* represor* transcripcional* del* gen* TJP1,* componente* de* las* uniones* estrechas,* y* cuya* depleción* favorece*la*aparición*de*un*fenotipo*mesenquimal*(W.*Li*et*al.,*2017).* Dentro*de*los*mecanismos*de*regulación*postranscripcional*llevados*a*cabo*por*lncRNAs,*destaca*su* función*como*ceRNA.*Diferentes*lncRNAs*ejercen*su*mecanismo*de*acción*secuestrando*miRNAs*y* permitiendo*la*expresión*de*genes*requeridos*para*el*progreso*de*la*EMT.*Por*ejemplo,*el*lncRNA* CAR10"induce*EMT*mediante*el*secuestro*de*miR-203*y*miR-30,*desbloqueando*la*traducción*del* mRNA*SNAI1/2,*y*la*consiguiente*bajada*de*niveles*de*E-cadherina*(Ge*et*al.,*2019).*Otro*ejemplo*lo* constituye*el*lncRNA*PNUTS,*que*actúa*como*ceRNA*del*miR-205,*que*tiene*como*mRNAs*dianas* ZEB1/2*(Grelet*et*al.,*2017).*El*lncRNA*ATB*también*actúa*como*ceRNA*secuestrando*miR-200*y* favoreciendo* el* progreso* de* la* EMT* mediante* el* aumento* de* los* niveles* de*los* factores* de* transcripción*ZEB1/2*(Yuan*et*al.,*2014).* Algunos*lncRNAs*ejercen*su*función*a*nivel*postranscripcional,*por*ejemplo,*regulando*el*AS;*este*es* el*caso*del*lncRNA*NAT"ZEB2,*que*favorece*que*se*mantenga*un*intrón*que*contiene*un*sitio*de* iniciación*interna*para*la*entrada*de*ribosomas*(IRE)*en*el*mRNA*ZEB2,*potenciando*su*traducción,* provocando*la*represión*del*gen*de*E-cadherina*y*promotiviendo*la*EMT*(Beltran*et*al.,*2008).* Los*lncRNAs*también*pueden*llevar*a*cabo*modificaciones*postraduccionales.*Por*ejemplo*el*lncRNA* MUF*activa*la*vía*WNT*regulando*la*fosforilación*de*b-catenina,*lo*cual*permite*la*activación*de*esta* vía*de*señalización*y*la*activación*del*programa*de*EMT*(X.*Yan*et*al.,*2017).* INTRODUCCIÓN* * 24* * LncRNA* Partner( Efecto*sobre*la*EMT* Referencia* MEG8" EZH2* Activar* (Terashima*et*al.,*2018)* MALAT1" EZH2* Activar* (Hirata*et*al.,*2015)* ELIT-1" SMAD3* Activar* (Sakai*et*al.,*2019)* NEAT1" FOXN3* Inhibir* (W.*Li*et*al.,*2017)* MUF" ANXA2* Activar* (X.*Yan*et*al.,*2017).* TBILA" S100A7* Activar* (Lu*et*al.,*2018)* NBR2" NOTCH1* Inhibir* (Cai*et*al.,*2019)* UCA1" miR-1/miR-203a* Activar* (G.*Y.*Li*et*al.,*2018)* CAR10" miR-30,*miR-203* Activar* (Ge*et*al.,*2019)* ATB" miR-200* Activar* (Yuan*et*al.,*2014)* ZFAS1" miR-150* Activar* (Tao*Li*et*al.,*2015)* MALAT1" miR-200c* Activar* (Pa*et*al.,*2017)* RP11" FBXO45,*SIAH1* Activar* (Y.*Wu*et*al.,*2019)* ATB" IL-11* Activar* (Yuan*et*al.,*2014)* * Tabla*I.2.*LncRNAs*involucrados*en*EMT.* * I.1.4.1.2.3.*Aplicaciones*terapéuticas*y*diagnósticas*basadas*en*lncRNAs* El*hecho*de*que*los*lncRNAs*presenten*una*expresión*específica*de*tejido*así*como*de*tipo*celular,* los* convierte* en* candidatos*idóneos*para* ser* usados* como* biomarcadores* de* diagnóstico* o* pronóstico*en*diferentes*tipos*de*tumores*e*incluso*como*dianas*terapéuticas.** Entre* las* principales* ventajas* de* los* lncRNAs* que* los*hacen* adecuados*como* biomarcadores* de* diagnóstico* y* pronóstico* del* cáncer,* se* encuentra* su* gran* estabilidad*en* los* fluidos* corporales,* especialmente*cuando*se*incluyen*en*exosomas*o*en*cuerpos*apoptóticos.* INTRODUCCIÓN* * 25* La*desregulación*de*lncRNAs*en*los* tejidos*tumorales*primarios*se*refleja*claramente*en*varios* fluidos* corporales,* incluidos* sangre,* plasma,* orina,* saliva* y* jugo* gástrico,* que* los* convierte* en* biomarcadores*efectivos*y*que*pueden*ser*analizados*mediante*procesos*mínimamente*invasivos* (Bolha*et*al.,*2017).* El*lncRNA*PCA3"se*está*utilizando*como*biomarcador*diagnóstico*del*cáncer*de*próstata*en*muestras* de*orina*con*una*sensiblidad*y*especificidad*superior*a*los*niveles*séricos*de*antígeno*prostático* específico*(PSA),*biomarcador*ampliamente*utilizando*para*el*diagnóstico*de*esta*patología*(Tinzl*et* al.,*2004).*También*se*ha*descrito*una*disminución*en*los*niveles*de*lncRNA*MALAT1"en*muestras*de* sangre*de*pacientes*con*cáncer*de*pulmón*(Guo*et*al.,*2015).*Otro*ejemplo*lo*constituye*el*lncRNA* HOTAIR,*que*es*muy*abundante*en*muestras*de*saliva*de*pacientes*con*carcinoma*oral*de*células* escamosas*(H.*Tang*et*al.,*2013).*Además,*se*ha*determinado*la*asociación*entre*el*aumento*de*los* niveles*sanguíneos*de*HOTAIR*y*un*peor*pronóstico*en*pacientes*con*cáncer*colorrectal*(Svoboda*et* al.,*2014).* De*la*misma*forma*que*ocurre*con*los*miRNAs,*los*lncRNAs*pueden*funcionar*como*oncogenes*o* como* genes* supresores* de* tumores,* por* lo* que* se* han* desarrollado* diferentes* estrategias*para* modular*la*expresión*de*lncRNAs*cuya*desregulación*puede*favorecer*el*desarrollo*de*enfermedades.* Algunas*de*estas*estrategias*son*similares*a*las*usadas*con*miRNAs,*como*son*los*ASOs*o*los*shRNAs,* pero* otras* suelen* utilizarse* más* específicamente* con* lncRNAs;* por* ejemplo,* siRNAs* (I.1.4.1),* ribozimas,* estrategias* de* modificación* genética* como* el* CRISPR,* las* denominadas* “moléculas* pequeñas”,*los*aptámeros*y*los*señuelos.*Las*ribozimas*median*la*degradación*catalítica*del*lncRNA* de*forma*sitio-específica*(Fathi* Dizaji,* 2020).*La*tecnología*CRISPR*permite*el*silenciamiento*de* lncRNAS* mediante* dos*mecanismos* distintos:* 1)* deleción* de* la* zona* promotora* del* lncRNA,* impidiendo*su*transcripción*(MM.1.2.10.1)*y*2)*utilización*de*complejos*represores*para*silenciar*la* transcripción*del*gen*del*lncRNA.*Las*denominadas*“moléculas*pequeñas”*(Fathi*Dizaji,*2020)*y*los* aptámeros*(Parasramka*et*al.,*2016)*actúan*de*la*misma*forma,*interaccionando*con*el*lncRNA*y* bloqueando* su* sitio* de* unión* con* la* proteína* con* la* que* interactúan.* Por* último,* los* señuelos* funcionan*como*imitadores*del*lncRNA,* de*forma* que*pueden*secuestrar* la*proteína*con* la*que* interaccionan,*interfiriendo*en*la*función*del*lncRNA*si*ésta*es*llevada*a*cabo*mediante*interacción* con*una*proteína*o*un*complejo*de*proteínas*(Fathi*Dizaji,*2020).* La*principal*estrategia*para*recuperar*la*función*de*un*lncRNA*que*actúa*como*supresor*de*tumores* consiste*en*la*utilización*de*vectores*virales*derivados*de*adenovirus,*retrovirus*o*lentivirus,*a*partir* de*los*cuales*se*restablece*la*expresión*del*lncRNA.*También*se*puede*utilizar*la*tecnología*del* CRISPR*de*activación*para*inducir*la*expresión*de*un*lncRNA*(MM.1.2.10.2).* Además,*también*se*pueden*utilizar*las*expresión*específica*de*un*lncRNA*para*la*expresión*de*una* molécula*antitumoral.*Por*ejemplo,*se*está*utilizando*un*plásmido*que*contiene*el*promotor*del* lncRNA*H19*con*el*gen*de*la*subunidad*A*de*la*toxina*diftérica,*de*modo*que*ésta*se*expresa*en*el* tumor*inhibiendo*su*crecimiento*(Mizrahi*et*al.,*2009).*En*otro*trabajo*se*ha*utilizado*el*lncRNA*XIST* INTRODUCCIÓN* * 32* Las* interacciones* entre* las* células* epiteliales* y* la* ECM* se* producen* mediante*dos*tipos* de* estructuras:*los*hemidesmosomas*y*las*adhesiones*focales.* • Los*hemidesmosomas*(Walko*et*al.,*2015)*son*complejos*multiproteicos*que*facilitan*la* adhesión*de*las*células*a*la*membrana*basal*subyacente.*El*núcleo*de*estas*estructuras*está* constituido*por*la*integrina*a6b4*y*plectina.*La*unión*de*las*células*con*la*membrana*basal* se* produce* entre* la* integrina* a6b4* y* la* laminina-332,* generándose* un* vínculo* entre* la* membrana*basal*y*los*filamentos*intermedios*de*queratina*a*través*de*la*plectina*(Figura* I.12).*Se*pueden*distinguir*dos*tipos*de*hemidesmosomas*según*sus*componentes:** • Los* hemidesmosomas* tipo* 1,* que* se* encuentran* principalmente* en* epitelios* estratificados* y* pseudoestratificados,* y* que* presentan* cinco*componentes:* las* integrina* a6b4,* el* antígeno* 2* del* penfigoide* ampolloso*(BPAG2),* la* tetraspina* CD151,*la*plectina*y*el*antígeno*1e*del*penfigoide*ampolloso*(BPAG1e).* • Los*hemidesmosomas*tipo*2,*que*se*encuentran*en*epitelios*simples*y*que*están* formados*por*las*a6b4*y*plectina.* El*ensamblaje*de*los*hemidesmosomas*comienza*con*la*interacción*entre*la*integrina*a6b4* y* la* laminina-332;* a* continuación,* la* subunidad* b4* de* la* integrina* interacciona* con* la* plectina,*que*a*su*vez*interactúa*con*los*filamentos*intermedios*de*queratina;*en*caso*de*los* * Figura*I.11.*Diferentes*tipos*de*estructuras*de*adhesión*célula-célula."Adaptada*de*(Knights*et*al.,*2012)* INTRODUCCIÓN* * 33* epitelios*estratificados* y*pseudoestratificados,* se* unirán,* a* continuación,* el* resto* de* los* componentes.** • Los*contactos*focales*establecen*un*nexo*de*unión*entre*la*ECM*(pueden*interaccionar*con** fibronectina,*lamininas,*colágeno,*vitronectina,*entre*otros)*y*los*filamentos*de*actina.*Entre* sus*componentes*principales*también*se*encuentran*las*integrinas,*que*pueden*interactuar* con* el* citoesqueleto* de* actina* directamente* o* mediante* otras* proteínas* (a-laminina,* vinculina* o* tensina,* entre* otros)* (Lo,* 2006).* La* interacción* de* las* integrinas* con* las* diferentes*proteínas*que*conforman*la*ECM,*inducirá*cambios*en*sus*dominios*citoplásmicos* que*permitirán,*a*su*vez,*la*interacción*con*otras*proteínas*o*con*señalizadores*como*pueden* ser*quinasas*o*fosfatasas.*En*conjunto,*esto*determinará*la*formación*de*estructuras*que* funcionan*como*transductores*de*señales*desde*la*ECM*para*regular*diferentes*procesos* como*la*adhesión,*la*proliferación*o*la*migración*(X.*Zhong*&*Rescorla,*2012).* * I.1.7.*Reprogramación*metabólica,*EMT*y*cáncer* Los* cambios* celulares,* fundamentalmente* determinados* por* alteraciones* transcripcionales,* ocurridos*durante*el*progreso*de*EMT,*también*conllevan*una*reprogramación*metabólica*acorde*a* las*nuevas*capacidades*invasivas*y*migratorias*de*las*células,*así*como*a*la*supervivencia*en*un* ambiente*hostil*que*permite*a*las*células*que*han*sufrido*EMT*invadir*tejidos*lejanos.*La*EMT*implica* una*reprogramación*metabólica*que*afecta*a*la*glicólisis,*a*la*respiración*oxidativa*y*al*metabolismo* de*los*lípidos*y*aminoácidos*(Sciacovelli*&*Frezza,*2017).* La*glicólisis*es*el*proceso*de*oxidación*parcial*de*la*glucosa*para*la*obtención*de*energía*y*piruvato.* El*piruvato*se*puede*reducir*a*lactato*generando*NAD+*o*entrar*en*la*mitocondria*donde,*mediante* * Figura* I.12.* Estructura* de* los* hemidesmosomas.* BPAG1e:* antígeno* 1e* del* penfigoide* ampolloso;"BPAG2:* antígeno* 2* del* penfigoide*ampolloso."Adaptada*de*(Jones*et*al.,*2017)* INTRODUCCIÓN* * 34* el*ciclo*de*los*ácidos*tricarboxílicos,*su*esqueleto*carbonado*se*oxida*completamente*hasta*CO2.*Los* electrones*obtenidos*en*la*oxidación*serán*utilizados*por*la*ATPsintasa*para*producir*energía.*La* glicólisis*es*un*proceso*mucho*menos*eficiente*que*la*respiración*mitocondrial,*ya*que*genera*menos* ATP* por* unidad* de* glucosa* metabolizada;* por* tanto,* se* requiere* más* glucosa* para* conseguir* la* energía*necesaria*para*el*crecimiento*y*progreso*tumoral.*No*obstante,*proporciona*intermediarios* metabólicos*que*son*necesarios*para*el*progreso*de*las*células*cancerosas*(Formentini*et*al.,*2010)* además* de* aumentar* la* tolerancia*a* la* fluctuaciones* de* oxígeno* (Hua* et* al.,* 2020).* La* elección* preferente*de*la*vía*glicolítica*en*detrimento*de*la*respiración*mitocondrial*aún*en*presencia*de* oxígeno*se*denomina*efecto*Warburg.*Uno*de*los*mecanismos*por*los*que*la*ruta*glicolítica*se*ve* potenciada*es*mediante*la*inducción*de*los*transportadores*de*glucosa.*Se*ha*demostrado*que*los* transportadores*de*glucosa*GLUT1*y*GLUT3*aumentan*el*metabolismo*glicolítico*favoreciendo*el* crecimiento*tumoral*(Macheda*et*al.,*2005).*Por*otro*lado,*diferentes*estudios*han*mostrado*que*la* sobreexpresión*de* la* hexoquinasa-2* (HK2),* que* cataliza* la* fosforilación* de* glucosa* para* su* transformación*en*glucosa-6-fosfato,*favorece*el*metabolismo*glicolítico*y*el*progreso*de*la*EMT* (Chen*et*al.,*2018)*(Patra*et*al.,*2013).*Otro*ejemplo*de*reprogramación*metabólica*glicolítica*en* células* tumorales*lo* consustituye* la* enzima* PKM2,* cuyo* aumento* de* expresión* favorece* la* supervivencia* celular* e* invasividad*mediante* un* incremento* de*la* captación* de* glucosa* y*de*la* producción*de*lactato*en*el*adenocarcinoma*ductal*pancreático*(C.*Li*et*al.,*2016).*Por*último,*un* estudio*realizado*en*células*tumorales*de*pulmón*ha*revelado*que*la*acidificación*por*el*aumento*de* lactato*debido*a*una*mayor*actividad*glicolítica*favorece*el*progreso*de*la*EMT*mediante*la*activación* de*factores*de*transcripción*como*SNAI1,*el*remodelado*de*la*matriz*extracelular*y*la*activación*de* TGF-b (X.*Li*et*al.,*2018).* La*disfunción*mitocondrial*es*una*característica*de*las*células*tumorales*asociada*a*una*mayor* agresividad*y*potencial*metastásico*(Sciacovelli*&*Frezza,*2017).*En*el*año*2014*un*estudio*llevado* a* cabo* por* Guha* y* colaboradores* demostró* que* la* disfunción* mitocondrial* generada* mediante* depleción*del*DNA*mitocondrial*conduce*a*cambios*morfológicos*y*moleculares*asociados*con*EMT,* incluida*una*mayor*expresión*de*EMT-TFs*y*metaloproteinasas,*o*la*supresión*de*la*expresión*de*E- cadherina* mediante* un* mecanismo* dependiente* de* calcineurina-A* (Guha* et* al.,* 2014).* Adicionalmente*a*estos*resultados,*se*ha*demostrado*que*la*represión*de*los*genes*mitocondriales* es*una*característica*común*de*los*cánceres*más*agresivos*y*se*ha*correlacionado*con*la*activación* de*EMT*en*20*tipos*de*cánceres*diferentes*(Gaude*&*Frezza,*2016).* Las* células* tumorales* muestran* un* metabolismo* lipidíco* desregulado,* incluyendo* una* alta* capacidad*lipogénica*y*lipolítica,*una*elevada*síntesis*de* lípidos* de*membrana*y*una*regulación* positiva*de*la*producción*de*lípidos*que*actúan*como*señalizadores*y*que*promueven*la*EMT*(Kang* et*al.,*2019).*Se*ha*demostrado*que*el*bloqueo*de*los*mRNAs*de*diferentes*enzimas*que*participan* en*la*síntesis*de*los*ácidos*grasos*como*son*la*sintasa*de*ácidos*grasos*(FASN),*la*reductasa*3-hidroxi- 3-metil-glutaril-CoA-reductoasa*(HMGCR)*y*la*acetil*CoA*carboxilasa*(ACC)*llevado*a*cabo*por*el*miR- INTRODUCCIÓN* * 35* 195*inhibe*el*proceso*de*EMT*en*líneas*celulares*de*cáncer*de*mama*(Singh*et*al.,*2015).*Los*ácidos* grasos*sintetizados*se*utilizan*para*la*obtención*de*energía*mediante*la*b-oxidación*que*tiene*lugar* en*la*mitocondria;*la*enzima*carnitina*palmitoiltransferasa-1*(CPT-1)*se*encarga*de*translocar*los* ácidos*grasos*desde*el*citosol*al*espacio*intermembrana*mitocondrial.*Se*ha*determinado*que*esta* enzima*está*sobreexpresada*en*diferentes*tipos*de*tumores*favoreciendo*la*obtención*de*energía*(Qu* et*al.,*2016).*El*principal*componente*de*los*lípidos*de*membrana*es*fosfatidilcolina;*una*de*las* enzimas* que* participa* en* su* síntesis* es* la* CTP:fosfocolina* citidiltransferasa* (CTT),* cuya* sobreexpresión*contribuye*al*crecimiento*del*tumor*y*a*la*transformación*de*células*epiteliales* (Arsenault*et*al.,*2013).*Los*lípidos*también*pueden*funcionar*como*moléculas*señalizadoras;*por* ejemplo,*el*fosfatidilinositol*se*fosforila*dando*lugar*a*un*sustrato*que*la*enzima*PI3K*convierte*a* fostatidilinositol-3,4,5-trifosfato*(PIP3),*que*media*la*progresión*del*tumor*activando*la*ruta*AKT- mTOR*dando*lugar*a*fenotipos*más*metastásicos*(Fruman*et*al.,*2017).** El*metabolismo*de*aminoácidos*también*supone*un*papel*importante*en*el*desarrollo*de*la*EMT.* A*expensas*de*la*realización*de*estudios*más*detallados,*es*probable*que*las*principales*enzimas* responsables* del* metabolismo* de* los* diferentes* aminoácidos* tengan* un* papel* importante* en* el* desarrollo*de*la*EMT*(Kang*et*al.,*2019).*De*todos*los*aminoácidos,*la*glutamina*es*el*aminoácido*más* consumido*y*se*considera*el*sustrato*más*importante*en*las*células*tumorales.*La*inhibición*de*la* glutaminasa*1*(GLS1)*bloquea*la*metástasis*in"vivo*mediante*un*mecanismo*que*implica*SNAI1*en* células*no*pequeñas*de*cáncer*de*pulmón*(Ulanet*et*al.,*2014).*En*contraposición,*la*glutaminasa*2* (GLS2),* la* isoforma* mitocondrial* de* la* glutaminasa,* funciona*como* supresor* de* tumores* correlacionando* inversamente* con* el* estadio* y* el* tamaño* del* tumor.* Asimismo,*GLS2* inhibe* la* invasión*y*la*migración*por*un*mecanismo*de*estabilización*de*Dicer,*lo*cual*permite*el*bloqueo*del* mRNA*SNAI1*por*parte*del*miR-34*en*células*de*carcinoma*hepatocelular*(HCC)*(Kuo*et*al.,*2016).* * I.1.8.*SERPINE1*en*EMT*y*cáncer* La*molécula*Serpine1*o*Serpin*E1,*también*denominada*PAI-1*(Plaminogen"activador"inhibitor,"type" I)"es*una*glicoproteína*que*pertenece*al*subgrupo*1*del*clado*E*de*la*superfamilia*SERPIN*(SERin* Proteasa*INhibitor),*y*constituye*uno*de*los*principales*elementos*reguladores*del*sistema*fibrolítico.* Este*sistema*tiene*un*papel*fundamental*en*el*mantenimiento*del*sistema*vascular*y*en*la*disolución* de*los*coágulos*sanguíneos.* Los*elementos*principales*que*forman*el*sistema*fibrolítico*son*el*plasminógeno,*una*proenzima* inactiva*que*se*convierte*en*plasmina,*y*sus*dos*activadores,*el*activador*tisular*del*plasminógeno* (tPA)*y*el*activador*de*plasminógeno*de*tipo*uroquinasa*(uPA).*La*conversión*de*plasminógeno*en* la*proteasa*activa*plasmina*la*realizan*sus*dos*activadores*tPA*y*uPA.* Varias* glicoproteínas* y* proteglicanos* de* la* matriz* extracelular,* como* laminina,* fibronectina,* vitronectina,*fibrina,*son*sustratos*de*la*plasmina.*Además,*la*plasmina*puede*activar*proteinasas* INTRODUCCIÓN* * 36* como*las*metaloproteinasas*MMP-1/3/9*(G.*E.*Davis*et*al.,* 2001)*(Hahn-Dantona*et*al.,*1999),*y* liberar*factores*de*señalización*presentes*en*la*matriz*extracelular*como*TGF-b*(Robertson*&*Rifkin,* 2016).*La*regulación*de*este*sistema*está*mediada*por*varios*inhibidores*que*actúan*a*nivel*de* activación*del*plasminógeno,*en*este*caso*mediante*el*inhibidor*del*activador*del*plasminógeno* (Serpine1)*(Figura*I.13),*o*mediante*el*inhibidor*de*la*fibrinólisis*activable*por*trombina,*o*a*nivel*de* plasmina*mediante*antiplasmina.* La*actividad*tPA*es*responsable*de*la*disolución*de*la*fibrina*presente*en*la*circulación,*mientras*que* la*actividad*de*uPA*depende*de*su*unión*a*un*receptor*específico*de*las*células*(uPAR),*y*su*función* es*la*inducción*de*la*proteólisis*pericelular,*necesaria*para*la*remodelación*y*reparación*tisular,*la* implantación*embrionaria*y*la*invasión*tisular.* SERPINE1* está* compuesta* por* 379* aminoácidos* y* presenta* un* peso* molecular* de* 52* KDa.*Su* estructura*consiste*en*tres*hojas*b*(A,*B*y*C)*y*nueve*hélices*a*(hA-hI).*A*nivel*funcional,*SERPINE1* inhibe* proteasas* mediante* un* mecanismo* irreversible* denominado* inactivación* suicida.* En* su* conformación* activa,* los* residuos*P1-P1’* (Arginina346*y* Metionina347)* del* centro* reactivo* de* SERPINE1* interaccionan* con* la* proteasa* diana*formando* un* complejo* no* covalente.* Durante* la* interacción,*la*serina*del*centro*activo*de*SERPINE1*es*atacada*por*la*proteasa*formándose*un*enlace* covalente*proteasa-SERPINE1*(en*el*grupo*carbonil*del*residuo*P1);*esto*resulta*en*la*escisión*del* enlace*P1-P1’*del*centro*reactivo*de*SERPINE1,*al*que*se*encuentra*unido*la*proteasa,*produciendo* su*traslocación*e*inactivación*(Figura*I.14).** * * Figura*I.13.*Mecanismo*de*acción*de*SERPINE1* en*el*sistema*fibrolítico.*SERPINE1* inhibe*a*las* proteasas*uPA*y*tPA,*bloqueando*la*conversión*de* plasminógeno* en* plasmina* y* la* consiguiente* degradación*de*fibrina.* INTRODUCCIÓN* * 37* La*molécula*Serpine1*se*expresa*en*una*gran*variedad*de*células,*como*las*células*musculares*lisas* vasculares,* las*células*endoteliales,* los* fibroblastos,* las* células*inflamatorias,*las*plaquetas*y*las* células*tumorales.*SERPINE1*es*sintetizada*por*las*células*y*secretada*al*exterior*en*su*conformación* activa,*adquiriendo*espontáneamente*la*conformación*latente*en*la*que*es*inactiva*la*proteína,*y*que* puede*reactivarse* mediante* agentes* desnaturalizantes*(Hekman* &* Loskutoff,* 1985).* Fisiológicamente,* SERPINE1* en* su* conformación* activa* se* encuentra* circulante* en* el* plasma* formando*un*complejo*con*la*proteína*vitronectina.* Respecto*a*la*regulación*de*la*expresión*de*SERPINE1,*numerosos*factores*de*transcripción*regulan* su*expresión*dependiendo*del*tipo*celular,*además*de*citoquinas,*factores*de*crecimiento*como*TGF- b*y*EGF,*insulina,*lipopolisacáridos*y*lipoproteínas.* Estudios*clínicos*y*epidemiológicos*han*demostrado*que*SERPINE1*está*implicada*en*diferentes* patologías*como*fibrinólisis,*trombosis,*restenosis,*ateroesclerosis,*fibrosis*y*cáncer.* En*relación*con*el*cáncer,*SERPINE1*se*ha*establecido*como*marcador*de*mal*pronóstico*en*cáncer* de* mama,* gástrico,* ovárico,* de* vejiga,* colorectal* y* oral.* Aunque* no* se* conocen*al* completo* los* mecanismos* por* los* que* SERPINE1* contribuye* a* la* progresión* tumoral* (Z.* Tang* et* al.,* 2017),** * Figura*I.14.*Conformaciones*SERPINE1.*A.*En*la*conformación*activa,*el*extremo*C-terminal*del*bucle*del*centro*reactivo* (RCL)*se*encuentra*en*una*posición*rígida.*B.*En*la*conversión*a*la*conformación*latente,*el*extremo*N-terminal*del*RCL*se* introduce*en*el*interior*del*core*de*la*proteína*dejando*el*enlace*P1-P1’*inaccesible.*C.*Cuando*SERPINE1*se*encuentra*en*la* conformación*activa,*puede*interaccionar*con*las*proteasas*uPA*y*tPA,*las*cuales*cortan*el*enlace*peptídio*entre*P1*(bola*roja- arginina346)-P1’* (bola* azul-metionina347).* El* extremo* N-terminal* del* RCL* cortado* se* introduce* en* la* hoja* b*A* (en* rojo),* formando*una*nueva*cadena*y*produciendo*la*traslocación*y*la*inactivación*de*la*proteasa*a*la*que*se*encontraba*unida.*D.* Secuencia*peptídica*del*bucle*del*centro*activo.*Se*indica*en*rojo*el*residuo*correspondiente*a*la*arginina*(R)*y*en*azul*el* correspondiente*a*la*metionina*(M).*P:*posición;*I:*inactivo.*Adaptada*de*(Simone*&*Higgins,*2015)* INTRODUCCIÓN* * 38* numerosos* estudios* in" vitro*demuestran* su* implicación*en*procesos* como* migración,* invasión,* adhesión* celular,* inhibición* de* apoptosis,* proliferación* y* angiogénesis.*Por* ejemplo,* SERPINE1* facilita* la* metástasis* de* pulmón* de* células* de* osteosarcoma* mediante* la* expresión* de* la* metaloproteinasa* de* matriz* MMP-13* (Hirahata* et* al.,* 2016)*y*su* sobreexpresión* aumenta* la* migración*en*células*de*carcinoma*escamoso*de*cuello*y*cabeza*mediante*la*activación*de*la*ruta* PI3K/AKT* (Pavón* et* al.,* 2015),* mientras* que* su* inhibición* reduce* la* movilidad* de* células* de* glioblastoma*y*afecta*a*la*progresión*del*tumor*in"vivo*(Seker*et*al.,*2019).* INTRODUCCIÓN* * 39* Analizando*la*base*de*datos*GEPIA*(http://gepia.cancer-pku.cn/)*se*observa*que*el*mRNA*SERPINE1* se*sobreexpresa*en*diferentes*tipos*de*cánceres*(Z.*Tang*et*al.,*2017)*(Figura*I.15).* De* hecho,* teniendo* en*cuenta* las* muestras* de* los* tumores* en* los* que* el* mRNA* SERPINE1*está* inducido,*se*puede*considerar*como*un*parámetro*de*mal*pronóstico*(http://gepia.cancer-pku.cn/)* (Z.*Tang*et*al.,*2017)*(Figura*I.16).* * Figura*I.15.*El*mRNA*SERPINE1*se*encuentra*sobreexpresado*en*diferentes*tipos*de*tumores.*A.*DLBC:*Linfoma*difuso* de*células*B;*B.*ESCA:*Carcinoma*esofágico;*C.*GBM:*Glioblastoma;*D.*HNSC:*Carcinoma*de*células*escamosas*de*cabeza*y* cuello;* E.*KIRC:* Carcinoma* renal* de* células* claras;* F.*LGG:* Glioma* cerebral* de* bajo* grado;* G.*PAAD:* Adenocarcinoma* pancreático;*H.*STAD:*Adenocarcinoma*de*estómago;*I.*THYM:*Timoma.*Se*indica*el*número*de*muestras*normales*(N)*y* tumorales*(T)*utilizado*para*cada*tipo*de*tumor.*(*)*P-valor*>*0,01.* INTRODUCCIÓN* * 40* A* pesar* de* los* numerosos* trabajos* que* muestran* y* confirman* una* función* tumorigénica* de* SERPINE1,*no*hay*una*evidencia*clara*de*que*la*inhibición*de*SERPINE1*pudiera*tener*un*efecto* terapéutico*en* pacientes* con* cáncer.* Se* han* desarrollado* moléculas* pequeñas* inhibidoras* de*la* proteína*SERPINE1*y*se*han*testado*en*modelos*animales*preclínicos.*Mientras*que*algunos*de*estos* inhibidores*son*eficaces*en*modelos*de*trombosis*aguda,*su*actividad*en*modelos*de*progresión* tumoral*y*metástasis*es*menos*clara,*teniendo*cierta*efectividad*en*la*inhibición*del*crecimiento* tumoral*y*metástasis*en*algunos*casos,*y*la*ausencia*de*efecto*en*muchos*otros.*Moléculas*inhibidoras* como*SK-116*y*SK-216*reducen*hasta*dos*veces*el*número*de*pólipos*intestinales*y*el*crecimiento*de* melanomas* primarios* subcutáneos* en* ratón*(Mutoh* et* al.,* 2008).* Otras* moléculas* como* PA1- 039/tiplaxtinin*(Hennan*et*al.,*2008),*efectivas*en*trombosis*agudas,*han*mostrado*cierta*actividad* antitumoral*en*ratón*(Gomes-Giacoia*et*al.,*2013).*Ninguno*de*estos*inhibidores*se*ha*testado*en* ensayos*clínicos*en*cáncer.*Su*efectividad*está*limitada*por*su*inactividad*frente*a*la*forma*estable* de* SERPINE1* unida* a* la* vitronectina,* su* corta* vida* media* y* la* alta* concentración* terapéutica* necesaria.*Se*puede*resumir*este*último*apartado*en*que,*hasta*la*fecha,*SERPINE1*se*ha*considerada* una* atractiva* diana* terapéutica* como* proteína,* con* resultados* beneficiosos* en* patologías*como* trombosis*aguda,*pero*no*en*tumorigénesis.*El*trabajo*que*se*presenta*desvela*al*mRNA*Serpine1* como*una*posible*diana*más*acertada*en*tumorigénesis.* * * * * * Figura* I.16.(Correlación* entre* la* expresión* del* mRNA* SERPINE1( y* supervivencia.* Niveles* más* altos* del* mRNA* SERPINE1* se*correlacionan*con* un* peor* pronóstico* para*los* tipos*de*cánceres*indicados*en*la*Figura*I.14.(( OBJETIVOS) ) ) ) RESULTADOS* * 44* La*cinética*de*expresión*de*las*dos*isoformas*en*células*NMuMG**tratadas*con*TGF-b*es*muy*parecida,* aumentando*su*expresión*en*torno*a*7*veces*a*las*2*horas*del*tratamiento*y*siendo*20*veces*superior* a*las*24*horas.*Por*otro*lado,* la* expresión* del*gen*Nr6a1*se*afecta* de* forma*muy*discreta* y*no* correlacionada*con*las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2*(Figura*R.2)* * * * * * Figura* R.1.Ilustración* esquemática* de* la* localización* cromosómica* del* gen* Lnc-Nr6a1.*Se* indica* la* dirección* de* transcripción*de*las*dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1*y*del*gen*Nr6a1.*En*la*parte*inferior*de*la*figura*aparece*el*procesamiento*de* las*isoformas..) Figura*R.2.)Expresión*relativa*de*las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2)y*del*gen*Nr6a1*en*células*NMuMG*tratadas*con*TGF- b .* Cuantificación*de*los*niveles*de*expresión*de*las*dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1*(A*y*B)*y*del*gen*Nr6a1)(C)*en*células*NMuMG* tras*el*tratamiento*con*TGF-b*a*los*tiempos*indicados.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la* desviación*estándar*(DE).*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.*(**)*P-valor*<*0.01;* (***)*P-valor*<*0.001;*h:*horas.) RESULTADOS* * 45* Tras*el*tratamiento*de*las*células*NMuMG*con*cicloheximida*(CHX),*un*inhibidor*de*la*síntesis*de* proteínas,*la*inducción*de*las*isoformas*del*lnc-Nr6a1*no*se*afectaba*tras*el*tratamiento*con*TGF-b,* concluyéndose*que*dicha*inducción*es*independiente*de*la*síntesis*de)novo)de*proteínas*y,*por*tanto,* las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2*son*dianas*directas*de*la*señalización*activada*por*TGF-b.*Como*control* positivo*del*efecto*de*CHX*se*utilizó)Zeb2,)que*se*regula*de*manera*indirecta*por*TGF-b,*siendo*por* tanto*dependiente*de*la*síntesis*de)novo*de*proteínas*(Figura*R.3).* * * R.1.1.2.*Secuencia*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1* Con*el*fin*de*determinar*el*inicio*y*terminación*del*lnc-Nr6a1-1,*se*llevaron*a*cabo*experimentos*de* amplificación*rápida*de*los*extremos*5’*(5’*RACE)*y*3’*(3’*RACE)*del*mismo*(Figura*R.4).*El*inicio*de* la* transcripción* se* localizó* 75* bases*antes* de* lo* anotado* en*la* base* de* datos* Ensemble) Genome) Browser)y*la*terminación*49*bases*después,*teniendo*un*tamaño*real*de*649*pb.* * * * * * * Figura*R.3.*La*inducción*de*las*dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1*no*requiere*la*síntesis*de)novo*de*proteínas.*Se*pretrataron* las*células*NMuMG*con*CHX*a*una*concentración*de*5*µM*durante*1*hora.*A*continuación,*se*estudiaron*las*inducciones*de*las* dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1*tras*2*horas*de*tratamiento*con*TGF-b*(A*y*B)*y*la*de*Zeb2*a*las*24*horas*(C).*Los*niveles*de* expresión*se*cuantificaron*mediante*PCR*cuantitativa.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la* DE.*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.*(***)*P-valor*<*0.001;*CHX:*cicloheximida;*h:* horas.* RESULTADOS* * 46* * La*capacidad*codificante*de*las*dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1*se*determinó*mediante*el*análisis*de*las* secuencias*con*varias*herramientas*bioinformática.*El*análisis*de*la*secuencia*mediante*ORF)Finder* (NCBI)*predijo*fases*de*lecturas*de*menos*de*43*aminóacidos.*Mediante*el*software*Coding)Potential) Calculator*y* la* herramienta* Coding-Potential) Assessment) Tool,* se* determinaron* potenciales* codificantes*muy*bajos*para*ambas*isoformas*(Figura*R.5).* * ** Lnc-Nr6a1-1* Lnc-Nr6a1-2* Potencial*Codificante* -0,83* -0,86* Probabilidad* 0,028* 0,028* * Tabla*R.1.*Potencial*y*probabilidad*codificante*de*las*isoformas*del*lnc-Nr6a1.* * Además,*se*analizó*la*expresión*de*ambas*isoformas*del*lnc-Nr6a1*y*del*gen*Nr6a1*en*distintos* órganos*de*ratón*(MM.3.9).*Se*observó*que*las*dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1*estaban*enriquecidas*en* músculo*esquelético,*mientras*que*el*gen*Nr6a1*se*expresa*fundamentalmente*en*testículos*(Figura* R.6).* * Figura* R.5.)Potencial* codificante*de*las* isoformas*lnc- Nr6a1-1/2.* Se* calculó* el* potencial* codificante* de* ambas* isoformas* del* lnc-Nr6a1,* observándose* valores* muy* bajos* comparables* al* de* otros* lncRNAs* como* HOTAIR,* Xist*o* Bravehart.*Como*control*positivo*se*utilizaron*las*secuencias* de* E-cadherina* y* N-cadherina,* que* muestran* potenciales* codificantes*superiores.* ) Figura*R.4.)5’*RACE*y*3’*RACE*del*lnc-Nr6a1-1.*A.*(izquierda)*Secuenciación*de*los*productos*de*PCR*obtenidos*mostrando* la*unión*de*los*adaptadores*del*5’*RACE*al*lnc-Nr6a1-1*mediante*una*flecha.*(Derecha)*Imagen*representativa*del*producto*de* PCR*obtenido.*B.*(izquierda)*Secuenciación*de*los*productos*de*PCR*obtenidos*mostrando*la*unión*de*los*adaptadores*del*3’* RACE*al*lnc-Nr6a1-1*mediante*una*flecha.*(Derecha)*Imagen*representativa*del*producto*de*PCR*obtenido.*Kb:*kilobases.) RESULTADOS* * 47* Se*encontraron*también*diferencias*significativas*en*el*patrón*de*expresión*de*ambas*isoformas;*así,* la*isoforma*1*se*expresa*abundantemente*en*ojos,*mientras*que*la*isoforma*2*en*médula*ósea*y*timo,* indicando* que* cada* una* de* ellas* podría* estar* implicada* en* procesos* diferentes,* a* pesar* de* sus* similitudes* tras*el* tratamiento* con* TGF-b*o* al* hecho* de* que* se* expresen* mayoritariamente* en* músculo*esquelético.** * R.1.1.3.* Las* isoformas* lnc-Nr6a1-1/2)se* localizan* principalmente* en* la* fracción* nuclear*insoluble* Con* el* objetivo* de* conocer* la* localización* subcelular* de* ambas* isoformas,* se* realizó* un* fraccionamiento*(MM.3.10)*separando*el*RNA*procedente*de*las*fracciones*citosólica,*nuclear*soluble* y*nuclear*insoluble.*Posteriormente,*se*cuantificó,*mediante*RT-qPCR,*la*abundancia*del*lnc-Nr6a1* en*cada*una*de*estas*fracciones,*observándose*un*enriquecimiento*del*RNA*de*las*dos*isoformas*en* la*fracción*nuclear*insoluble.*Como*controles*se*utilizaron*los*RNAs*Hprt,*U3*y*Xist,*localizados*en*el* citoplasma,*en*el*nucleólo*(fracción*nuclear*soluble)*y*en*la*cromatina*(fracción*nuclear*insoluble),* respectivamente.* La* determinación* de* la* localización* subcelular* del* lnc-Nr6a1*es* de* gran* importancia*para*el*análisis*funcional*del*mismo.* Aunque*las*dos*isoformas*se*localizan*fundamentalmente*en*la*fracción*nuclear*insoluble,*hay*que* subrayar*que*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*está*más*representada*en*el*citosol*que*la*isoforma*lnc-Nr6a1- 2*(Figura*R.7).* * Figura*R.6.*Expresión*relativa*de*las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2)y*del*mRNA*Nr6a1)en*diferentes*órganos*y*tejidos*de* ratón*adulto.*A.*Expresión*relativa*de*las*dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1.*Los*resultados*se*representan*como*expresión*relativa* a*hígado*como*órgano*de*referencia.*B.*Expresión*relativa*de*mRNA*Nr6a1.*Los*resultados*se*representan*como*expresión* relativa*a*timo*como*órgano*de*referencia.*A,*B.*Normalizados*frente*a*Hprt-1*como*gen*de*referencia.*Se*muestra*la*media*de* triplicados;*las*barras*de*error*corresponden*a*la*DE.* RESULTADOS* * 48* * R.1.1.4.*La*isoforma*lnc-Nr6a1-1*se*transcribe*como*un*precursor*conteniendo*los* mir-181a2/b2* Debido*a*la*proximidad*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*los*mir-181a2/b2,*se*estudió*la*transcripción* de*estos*miRNAs.*El*análisis*de*PCR*utilizando*sondas*específicas*del*exón*2*del*lnc-Nr6a1-1*y*del* miR-181a2*y*miR-181b2,*mostró*que*se*generaba*un*transcrito*que*contenía*los*exones*1,*2*y*3* procesados* y* un* fragmento* no* procesado* conteniendo* los* mir-181a2/b2,* indicando* que* estos* miRNAs*son*parte*del*transcrito*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1.*La*figura*R.8*muestra*los*fragmentos* generados*por*PCR.* La*existencia*de*un*precursor*conteniendo*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*los*mir-181a2/b2,*nos*llevó*a* estudiar*en*detalle*los*transcritos*generados.*Aislando*la*población*de*RNA*poliadenilado*(poli(A+))* y*no*poliadenilado*(poli(A-)),*y*llevando*a*cabo*RT-PCR,*se*demostró*que*el*transcrito*lnc-Nr6a1-1*se* encontraba*en*ambas*poblaciones*de*RNA,*en*contraste*con*lo*que*ocurría*con*la*isoforma*lnc-Nr6a1- 2*que*se*encontraba*sólo*en*la*población*de*RNA*poli(A+).*Como*controles*se*utilizaron*el*mRNA* poliadenilado* Gapdh*y* el*RNA* no* poliadenilado* U6,*que* se* encontraban* principalmente*en* las* poblaciones*de*RNA*poli(A+)*y*poli(A-),*respectivamente*(Figura*R.13.A).*** * Figura*R.7.*Localización*subcelular*del*lnc-Nr6a1.* Se* indica*el* nivel*de* expresión* del* lnc-Nr6a1-1,*lnc- Nr6a1-2,*Hprt,*U3*y*Xist*en*las*fracciones*citosólicas,* nuclear* soluble* y* nuclear* insoluble.* Se* muestra* la* media*de*triplicados;*las*barras*de*error*corresponden* a*la*DE.* * Figura* R.8.* Determinación* del* transcrito* formado* por* la* isoforma* lnc-Nr6a1-1*y*los* mir-181a2/b2.* A.*Ilustración* esquemática* de* las*dos*PCRs*realizadas*indicando*la*localización* de*los*primers*mediante*flechas*(1*y*2)*(1*y*3).*B.* Imagen*representativa*de*los*dos*productos*de* PCR*generados.*Kb:*kilobases;*M:*marcador.* RESULTADOS* * 49* Para* mapear* los* posibles* extremos* 3’*de* los* transcritos,* desarrollamos* la* técnica* 3’*RACE* dependiente* e* independiente* de* poli(A+).* En* el* primer* caso,* es* decir,* con* RNA* poli(A+),* se* identificaron*dos*sitios*de*poliadenilación*que*mapeaban*uno*tras*el*exón*2*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1- 2) y* el* otro*después* del* tercer* exón* del* lnc-Nr61-1,* éste* último* 49* nucleótidos* más* largo* que* el* transcrito*ENSMUST00000151229*anotado*en*las*base*de*datos*Ensemble)Genome)Browser*(R.1.1.2,* Figura*R.4.B)*(Figura*R.13.B).*Respecto*al*RNA*no*poliadenilado,*se*determinaron*cuatro*sitios*que* correspondían*a*los*sitios*de*corte*de*Drosha*en*los*extremos*5’*del*pre-miR-181a2*y*pre-miR-181b2,* respectivamente*(Figura*R.13.D/E)*y*a*los*sitios*de*corte*por*Drosha*en*los*extremos*3’*del*pre-miR- 181a2*y*pre-miR-181b2*respectivamente*(Figura*R.13.C/F).*Estos*resultados*indican*que*la*isoforma* lnc-Nr6a1-1*se*transcribe*como*RNA*poliadenilado*y*también*como*RNA*no*poliadenilado,*en*este* caso*conteniendo*los*mir-181a2/b2,*que*serían*procesados*por*Drosha*(Figura*R.9*y*Figura*R.10).* Tras*el*procesamiento*por* Drosha* de* la*isoforma* no*poliadenilada,*el*lnc-Nr6a1-1*resultante*es* probable*que*se*degrade,*ya*que*analizando*los*ESTs*(Expression)Sequence)Tag)*de*la*base*de*datos* ENCODE,*no*se*detectan*lecturas*en*la*región*comprendida*entre*el*extremo*3’*de*la*forma*lnc-Nr6a1- 1*poliadenilada*y*el*extremo*5’*del*miR-181a2.* * * RESULTADOS* * 50* * * Figura*R.9.*Caracterización*de*los*transcritos*generados*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1.*A.*Distribución*de*las*isoformas* lnc-Nr6a1-1/2*entre*las*poblaciones*de*RNA*poli(A+)*y*poli(A-).*Se*incluyen*el*RNA*Hprt*y*U6)snRNA*como*controles*de*las* fracciones*poli(A+)*y*poli(A-),*respectivamente.*B-F.*(izquierda)*Secuenciación*de*los*productos*de*PCR*obtenidos*mostrando* la*unión*del*adaptador*del*3’*RACE*al*transcrito*mediante*una*flecha.*(Derecha)*Ilustración*esquemática*de*la*localización*del* extremo*3’*de*los*diferentes*transcritos*procesados*del*precursor*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*(flecha*verde)*y*de*los*primers* utilizados*para*cada*uno*de*ellos*(flechas*negras,*MM.3.6).*G.*Localización*de*los*sitios*de*corte*de*Drosha*detectados*en*los* pri-miR-181a2/b2.*H.*Secuencia*del*lnc-Nr6a1-1)poliadenilado*y*del*precursor*lnc-Nr6a1-1*no*poliadenilizado.*Se*indican*los* exones*en*los*colores*azul,*rojo*y*verde*y*las*regiones*correspondientes*al*mir-181*a2/b2*en*rosa.*Kb:*kilobases.* RESULTADOS* * 51* * Los*miRNAs*generados*a*partir*de*la*transcripción*del*gen*que*los*contiene,*están*generalmente* regulados*por*el*mismo*promotor*del*gen*hospedador.*Es*el*caso*de*miR-181a2/b2.*Resultados* previos* de* inmunoprecipitación* de* cromatina* muestran* una* región* enriquecida* en* H3K4me3* y* H3K27ac*en*la*región*que*contiene*el*sitio*de*inicio*de*la*transcripción*del*lnc-Nr6a1;*sin*embargo,* no*se*observa*este*enriquecimiento*en*la*región*promotora*putativa*de*los*genes*mir-181a2*/b2,* indicando*que*están*regulados*bajo*el*mismo*promotor*que*el*gen*Lnc-Nr6a1*(Guerrero-Martínez*et* al.,*2020)*(Figura*R.11).* * Figura*R.10.*Ilustración*esquemática*de*la*transcripción*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*los*mir-181a2/b2.*Se*indica*la* dirección*del*gen)Nr6a1)y*del*lnc-Nr6a1.*En*la*parte*inferior*de*la*figura*se*muestra*el*procesamiento*de*las*isoformas*del*lnc- Nr6a1*y*del*precursor*lnc-Nr6a1-1*conteniendo*los*mir-181*a2/b2.* * Figura*R.11.*Ilustración*de*las*marcas*K3K4me3,*H3k27Ac,*RNAseq*control*y*RNAseq*tras*el*tratamiento*de*TGF- b * durante*12*horas*en*la*región*genómica*correspondiente*al*gen*Lnc-Nr6a1.** * RESULTADOS* * 52* El*análisis*de*la*expresión*de*los*miRNAs*contenidos*en*el*transcrito*de*la*isoforma*lnc-)Nr6a1-1*no* poliadenilada*mostró*que*en*células*NMuMG*tratadas*con*TGF-b*se*inducían*aproximadamente*2* veces*tras*48*horas*de*tratamiento*(Figura*R.12).* Hay*que*señalar*que*miR-181a*y*miR-181b*maduros*muy*similares*son*codificados*por*los*genes* mir-181a1*y*mir-181b1*localizados*en*el*cromosoma*1;*y*en*el*caso*concreto*del*miR-181a1/b1-5p* son*indistinguibles*de*miR-181a2/b2-5p.* * R.1.1.5.*El*gen*Lnc-Nr6a1*presenta*un*gen*ortólogo*en*humano* Se*comprobó*la*existencia*de*un*gen*ortólogo*humano*del*gen*murino*Lnc-Nr6a1*(lnc-MIR181A2HG)* en*el*cromosoma*9.*Este*gen*mostró*un*60*%*de*homología*con*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*un*68*%* con*la*isoforma*lnc-Nr6a1-2.*Una*de*las*principales*diferencias*entre*el*gen*murino*y*su*ortólogo* humano*es*que*los*mir-181a2/b2*están*contenidos*en*el*único*intrón*que*posee*el*gen*humano.* * Figura*R.12.)Expresión*de*las*especies*de* miR-181*contenidos*en*el*gen*Lnc-Nr6a1** Se* cuantificaron* los* niveles* de* miR- 181a2/b2* (3p* y* 5p)* utilizando* el* kit* QuantiMir) RT) Kit*y* PCR* cuantitativa.* Los* resultados*están*normalizados*respecto*a*la* expresión* de* miR-425*en* células* NMuMG* control.*Se*muestra*las*media*de*triplicados;** las* barras* de* error* representan* la* DE.* Los* resultados* fueron* analizados* mediante* un* test*t)de*Student*de*dos*colas.*(*)*P-valor*<* 0,05;* (**)* P-valor*<* 0,01;* (***)* P-valor*<* 0.001;*h:horas.) RESULTADOS* * 53* De*forma*análoga*al*gen*murino,*el*lncRNA*ortólogo*humano*también*se*indujo*cuando*las*células* MCF10A*y*ATM*se*trataron*con*TGF-b*(Figura*R.13).* * R.1.2.*Caracterización*bioquímica*de*las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2* R.1.2.1.*El*silenciamiento*de*la*ruta*MAPK*ERK1*afecta*a*la*inducción*por*TGF- b *de*la* isoforma*lnc-Nr6a1-1* La* EMT* mediada* por* TGF-b*comienza*con* la* unión* de* alguno* de* sus* tres*ligandos*al* complejo* heterotetramérico* constituido* por* cuatro*receptores* transmembrana,* dos* TbRI* y* dos* TbRII,* activándose*diferentes*rutas*y*los*cambios*transcripcionales*consiguientes*necesarios*para*que*se* active*la*EMT.*Para*determinar*si*la*ruta*MAPK*ERK1*regula*la*inducción*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1* cuando*las*células*son*tratadas*con*TGF-b,*se*utilizó*el*inhibidor*específico*U0126*de*MEK1/2*(que* fosforila*ERK1).* Dicha* inhibición* se* comprobó* mediante* western)blot) de* la* proteína* ERK1/2* y* ERK1/2*fosforilada*(p-ERK1/2),*que*prácticamente*desaparecía.* * Figura*R.13.*Expresión*del*gen*ortólogo*lnc-MIR181A2HG*en*células*MCF-10A*y*ATM*tras*el*tratamiento*con*TGF- b .*Se* cuantificaron*los*niveles*de*expresión*del*lnc-MIR181A2HG)mediante*RT-qPCR.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras* de*error*representan*la*DE.*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.*(***)*P-valor*<*0.001;* h:*horas.* RESULTADOS* * 60* El*análisis* de* ontología* génica* de* dichos* genes,* generó*categorías* génicas* relacionadas* con* la* adhesión*y*la*glicólisis*(Figura*R.24).* * * Algunos*de*los*genes*que*cambiaban*más*significativamente* (Prune2,*Foxf1,*Dsg2,*Pkp1,*Adgrl3,* Fam111a*y*Mal2)*se*confirmaron*mediante*RT-qPCR.*Es*destacable*el*cambio*de*la*desmogleína*2* (Dsg2),*cuya*expresión*desaparecía*completamente*en*células*Lnc-Nr6a1-/-*(Figura*R.25).** Además,*se*estudiaron*posibles*cambios*transcripcionales*vinculados*al*Lnc-Nr6a1)y*la*EMT.*Para* ello,*se*llevó*a*cabo*un*RNAseq*comparando*los*cambios*ocurridos*en*células*control*y*células*KO* tratadas* con* TGF-b*durante* 2* horas.*En*el* análisis* se* seleccionaron* aquellos* genes* con* P-valor* ajustado* ≤" 0,05*y*cuya*expresión*diferencial*era*mayor*o*igual*a*1,5*veces.*900*genes*(54%)*se* sobreexpresaban*en*las*células*control*tras*el*tratamiento*de*TGF-b*durante*2*horas*y*758*(46%)* disminuían*su*expresión.*En*las*células*KO,*con*el*mismo*tratamiento,*se*inducían*643*(58%)*genes* y* se* reprimían* 461*(42%).* El* 61%* y* el* 44%* de* los* genes* sobreexpresados* y* reprimidos,* * Figura*R.24.*Análisis*de*ontología*génica*de*los*genes* desregulados*en*las*células*NMuMG*Lnc-Nr6a1-/-.*El* gráfico* muestra* el* análisis* de* ontología* génica* de* los* genes*con*cambios*significativos*en*las*células*NMuMG* Lnc-Nr6a1-/-*(5%*FDR).*El*número*de*genes*detectados* con* expresión* diferencial* correspondiente* a* cada* proceso*o*actividad*se*muestra*encima*de*la*barra.*FDR:* False)Discovery)Rate* Figura* R.25.* Expresión* relativa* de* algunos* de* los* genes* desregulados* en* las* células* Lnc-Nr6a1-/-.* Validación*mediante*RT-qPCR*de*los*genes*con*cambios* más*importantes*en*las*células*Lnc-Nr6a1-/-.*Se*muestra* la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan* la*DE.*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test* t) de* Student* de* dos*colas.* (**)* P-valor*<*0,01;*(***)*P- valor*<*0.001.* * * RESULTADOS* * 61* respectivamente,*eran*comunes*en*ambos*tipos*celulares,*por*lo*que*su*regulación*era*independiente* de*la*presencia*o*ausencia*del*gen*Lnc-Nr6a1.*Se*concluyó*que*había*una*coincidencia*significativa*en* los* genes* regulados* en*ambas* condiciones* (Figura* R.26)* (ANEXO* INFORMÁTICO* 1:* Perfil* transcriptomico*de*células*NMuMG*control*vs*NMuMG*control*+*2h*TGF-b*y*Perfil*transcriptomico*de* células*KO*vs*KO*+*2h*TGF-b).* El*análisis*ontológico*de*los*genes*coincidentes*al*tratar*ambos*tipos*de*células*con*TGF-b*durante*2* horas*mostró*un*enriquecimiento*en*genes*relacionados*con*la*fosforilación*de*las*proteínas*SMADs,* con*la*regulación*de*la*EMT*o*el*desarrollo*del*túbulo*distal*(Figura*R.26).* * * * * Figura* R.26.)Análisis*de* los* cambios* transcripcionales* en* células* Lnc-Nr6a1-/-* tras* el* tratamiento* con* TGF- b *durante* 2* horas.* Diagramas* de* Venn* que* muestan* la* intersección* de* genes* afectados* por* el* tratamiento* con* TGF-b*durante* 2* horas* en* células* NMuMG* control* y* Lnc-Nr6a1-/-.* A.* Genes* sobreexpresados* coincidentes* en* ambas* condiciones.* B.*Genes* reprimidos* coincidentes*en*ambas*condiciones.*C.*Todos* los*genes*desregulados*coincidentes*en*ambas* condiciones.*D.*Gráfico*que*muestra*el*análisis* de*ontología*génica*de*los*genes*coincidentes* en*ambas*condiciones*(5%*FDR).*El*número* de*genes*coincidentes*correspondiente*a*cada* proceso*o*actividad*se*muestra*encima*de*la* barra.*p:*probabilidad*hipergeométrica;*FDR:* False)Discovery)Rate.* ) RESULTADOS* * 62* Además,*el*estudio*global*de*los*cambios*de*expresión**tras*el*tratamiento*con*TGF-b*durante*2*horas* en*las*células*control*y*KO*mostró*que*el*comportamiento*de*los*genes*desregulados*era*muy*similar* Sin*embargo,*sí*se*observa*diferencia*en*cuanto*a*la*bajada**de*los*genes*reprimidos*en*el*KO*(Figura* R.27).* Los*principales*genes*asociados*a*EMT*como*son)E-cadherina,*N-cadherina)o*vimentina)respondían* de*forma*similar*en*células*NMuMG*control*y*Lnc-Nr6a1-/-.*El*análisis*de*los*niveles*de*expresión*de* estos*marcadores*mediante*western)blot*tras*8*horas*de*tratamiento*con*TGF-b*no*mostró*diferencias* significativas*(Figura*R.28).* * R.1.3.3.*La*ausencia*del*gen*Lnc-Nr6a1*afecta*a*la*adhesión*célula-matriz* Basándonos*en*el*análisis*de*ontología*génica*realizado*con*los*genes*diferencialmente*expresados* en*el*KO,*se*estudió*si*la*carencia*del*gen*Lnc-Nr6a1*podría* afectar*a*la*adhesión*célula-matriz,* causando*en*las*células*NMuMG*Lnc-Nr6a1-/-*una*adhesión*más*lenta*y/o*más*débil.* * * Figura*R.27.) Estudio* global* de* los* cambios* transcripcionales*tras*el*tratamiento*con*TGF- b *en*células* NMuMG* control* y* Lnc-Nr6a1-/-.* Diagramas* en* los* que* se* muestra*el*comportamiento*general*de*los*genes*inducidos*(A)* y*reprimidos*(B)*tras*el*tratamiento*con*TGF-b*durante*2*horas* en*células*NMuMG*control*y*Lnc-Nr6a1-/-*(KO).*FC:*Fold)Change.) Figura* R.28.* Análisis*de* los* marcadores*de* EMT* en* células* Lnc-Nr6a1-/-.*A.* Se* determinaron* mediante* western) blot) los* niveles* de* E-cadherina,* N-cadherina* y* vimentina* en* células* NMuMG* control* y* Lnc-Nr6a1-/-* tratadas*con*TGF-b*durante*8*horas.*B.*Cuantificación*de* las* bandas* del* wester) blot*normalizada* con* la* proteína* total*cargada*en*el*pocillo*y*con*los*niveles*de*expresión* en*células*NMuMG*control.* RESULTADOS* * 63* Se* observó*a* tiempo*cortos*(tiempos* insuficientes* para* que* las* células* proliferaran)* una*menor* capacidad* de* adhesión* de* las* células* KO.* El* experimento* se* realizó* en* placas* de* 12* pocillos,* sembrando*300000*células;*al*cabo*de*1,*4,*6*y*8*horas*las*placas*se*levaron*con*PBS*y*las*células* adheridas*se*fijaron,*se*tiñeron*con*cristal*violeta*y*la*intensidad*del*color*se*cuantificó*a*590*nm*con* el*analizador*varioskan*(MM.1.2.8.1)*(MM.1.2.9)*(Figura*R.29).* Además,*se*estudió*la*capacidad*de*adhesión*a*tiempos*más*largos;*para*ello,*se*añadieron*5000* células*a*placas*de*24*pocillos*y*se*procedió*de*la*misma*forma*que*para*determinar*la*adhesión*a* tiempos*cortos,*fijando*las*células*cada*24*horas*durante*4*días.*Aunque*se*observaron*cambios* significativos* comparando*KO* y*células*NMuMG*control,* es*importante* tener*en* cuenta*que* los* resultados*de*este*experimento*podrían*reflejar*otros*procesos*que*pudieran*estar*afectados*(Figura* R.30).* Adicionalmente,*se*llevó*a*cabo*un*ensayo*de*complementación*funcional*(reversión),*en*el*que*las* células* KO* se* infectaron* con* lentivirus* que* contenían* el* cDNA*lnc-Nr6a1-1) bajo* un* promotor* constitutivo.*Las*células*KO*sobreexpresando*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*recuperaban*su*capacidad*de* adhesión.*Para*estos*experimentos,*se*sembraron*inicialmente*5000/10000*células*y*se*fijaron*las* células*cada*24*horas*durante*4*días*(Figura*R.30).* * Figura*R.29.*Estudio*de*la*adhesión*célula-matriz*en*células*NMuMG*control*y*Lnc-Nr6a1-/-*a*tiempos*cortos.*A.*Tinción* con*cristal*violeta*de*las*células*NMuMG*control*y*KO*fijadas*a*los*tiempos*indicados.*B.*Cuantificación*de*la*intensidad*del* color*a*590*nm.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la*DE.* RESULTADOS* * 64* R.1.3.4.**La*ausencia*del*gen*Lnc-Nr6a1*afecta*a*la*adhesión*célula-célula** Para*estudiar*la*adhesión*célula-célula*(MM.1.2.8.2),*se*sembraron*50000*células*en*placas*de*96* pocillos*y*se*incubaron*durante*24*horas.*Al*día*siguiente,*se*marcaron*2,5*millones*de*células*con* acetoximetil-calceína.*Este*compuesto,*al*penetrar*en*la*célula,*es*digerido*por*esterasas*endógenas* dando*lugar*al*compuesto*fluorescente*(Ex/Em*=*504*nm/523nm).*Diferentes*estudios*han*mostrado* que*la*calceína*interfiere*mínimamente*con*el*proceso*de*adhesión*celular.*Tras*el*marcaje,*las*células* con*calceína*se*añadieron*a*las*pocillos*en*los*que*se*había*formado*una*monocapa*celular,*forzando* que*las*células*marcadas*sólo*pudieran*unirse*a*otra*célula*e*impidiendo*así*la*adhesión*al*sustrato.* Se*incubaron*durante*2*horas*a*37ºC*y*5%*CO2.*Tras*varios*lavados*exhaustivos*de*cada*pocillo,*las* células* adheridas* se* cuantificaron* mediante* citometría.* Las* células* KO* mostraron* una* menor* capacidad* de* adhesión* célula-célula*que* las* células* control.* Las* diferencias* observadas* eran* estadísticamente*significativas;*las*células*adheridas*fueron*del*16,6*%*y*4,28*%*en*células*control*y* KO,*respectivamente.*Adicionalmente,*se*estudió*el*proceso*de*adhesión*célula-célula*en*células*KO* que*habían*sido*infectadas*con*el*cDNA*lnc-Nr6a1-1,*observándose*una*reversión*parcial*del*proceso* con*un*13,8%*de*células*adheridas*(¡Error!*No*se*encuentra*el*origen*de*la*referencia.).* * Figura* R.30.* Estudio* de* la* adhesión* célula-matriz* en* células* NMuMG* control* y* Lnc-Nr6a1-/-) a* tiempos* largos.*A.* (izquierda)* Tinción* con* cristal* violeta* de* las* células* NMuMG* control* y* KO* fijadas* a* los* tiempos* indicados* (derecha)* Cuantificación*de*la*intensidad*del*color*a*590*nm.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la*DE.* B.*Experimento*de*reversión.*(izquierda)*Tinción*con*cristal*violeta*de*las*células*KO*y*KO*+*lnc-Nr6a1-1*fijadas*a*los*tiempos* indicados.*(derecha)*Cuantificación*de*la*intensidad*del*color*a*590*nm.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error* representan*la*DE.* RESULTADOS* * 65* R.1.3.5.*El*ciclo*celular*y*la*capacidad*proliferativa*no*están*afectados*en*las*células* Lnc-Nr6a1-/- Para*estudiar*la*capacidad*proliferativa*de*las*células*control*y*células*KO,*se*usó*el*analizador*celular* a*tiempo*real*xCELLigence*(Roche,*Iindianapolis,*IN).*Este*sistema*está*constituido*por*una*placa* multipocillo*con*electrodos*que*detectan*la*impedancia*provocada*por*las*células*adheridas*a*la*placa* (MM.1.2.6).*Aunque*se*observaron*cambios*en*los*valores*de*impedancia*entre*el*KO*y*las*células* control,* los* valores* de* las* pendientes*de* las* curvas*de* crecimiento* no* mostraron* diferencias* significativas,* indicando* que* no* había* diferencias* en* proliferación* y* que* las* diferencias* de* impedancia*observadas*podrían*ser*debidas*al*defecto*de*adhesión*de*las*células*KO*(Figura*R.32)* * Figura* R.31.* Las* células* NMuMG* Lnc-Nr6a1-/-*presentan* una* disminución* de* la* adhesión* célula-célula*se* recupera* con* la* expresión* del* cDNA* lnc-Nr6a1-1.* Se* indica* el* porcentaje* de* células* verdes*adheridas*a*la*monocapa*de*células*NMuMG*control,*células*Lnc- Nr6a1-/-)y)células*Lnc-Nr6a1-/-*+*lnc-Nr6a1-1..*Se*muestra*la*media* de*8* réplicas;* las* barras* de* error* representan* la* DE.* Los* resultados* fueron* analizados* mediante* un* test* t) de* Student* de* dos*colas.*(***)*P-valor*<* 0,001.* * RESULTADOS* * 66* * También*se*estudiaron*posibles*alteraciones*en*el*ciclo*celular*(MM.1.2.7);*sin*embargo,*las*células* Lnc-Nr6a1-/-*presentaban*un*ciclo*celular*normal*(Figura*R.33).* * Figura* R.33..*Las* células* NMuMG* Lnc-Nr6a1-/-*presentan* un* ciclo* celular*normal.*Se*estudió*el*ciclo*celular*de*las*células*NMuMG*control*y* Lnc-Nr6a1-/-*mediante*citometría*de*flujo.*Se*indica*el*porcentaje*de*células* en*cada*una*de*las*fases*del*ciclo*celular*SubG1,*G1,*S*y*G2/M.** Figura*R.*32.*La*proliferación*no*se*ve*afectada*en*las*células*NMuMG*Lnc-Nr6a1-/-.*A.*Monitorización*a*tiempo*real*de*la* proliferación*in)vitro*de*las*células*NMuMG*control*y*KO*mediante*el*sistema*xCELLigence.*Este*sistema*mide*la*impedancia* eléctrica*a*través*de*microelectrodos*integrados*en*el*fondo*de*los*pocillos*de*la*placa*de*cultivo.*B.*Valores*de*las*pendientes* de*las*curvas*de*impedancia.*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.*ns:*no*significativo* A*y*B.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la*DE.* RESULTADOS* * 67* R.1.4.*La*sobreexpresión*de*las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2*aumenta*la*capacidad* de*migración*pero*no*afecta*a*la*proliferación*ni*al*ciclo*celular* R.1.4.1.* Clonación* de* las* isoformas*lnc-Nr6a1-1/2*en* vectores* de* expresión* y* lentivirales* La*isoforma*lnc-Nr6a1-1*se*sintetizó*y*clonó*en*el*plásmido*pIDTBlue*(Figura*R.34)*flanqueada*por* sitios*de*restricción*para*las*enzimas*BamH1*y*Not1.** El*fragmento*correspondiente*a*la*isoforma*se*generó*digiriendo*la*construcción*con*las*enzimas* BamH1*y*Not1,*se*aisló*y*se*clonó*en*el*vector*lentiviral*pSINDUAL,*digerido*previamente*con*las* mismas*enzimas*de*restricción.*Las*colonias*resultantes*se*analizaron*mediante*PCR*de*colonias*con* primers**ubicados*en*el*promotor*SFFV*del*plásmido*pSINDUAL*y*en*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*(Figura* R.35).* * * * Figura*R.34.*Plásmido*iDTBlue.* Figura*R.35.*Imagen*representativa*de*los*productos* de* PCR* realizada* para* el* análisis*del* clonaje* de*la* isoforma*lnc-Nr6a1-1*en* el* vector* lentiviral* pSINDUAL.* Se* muestran* los* productos* de* PCR* de* los* plásmidos*de*distintas*colonias*y*un*control*negativo*de* PCR*realizado*sin*DNA.* RESULTADOS* * 68* La*secuencia*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-2*se*sintetizó*y*clonó*en*el*plásmido*pUCIDT*(Figura*R.36)* flanqueada*por*sitios*de*restricción*para*la*enzima*EcoR1.** Se*utilizaron*estos*sitios*de*restricción*para*aislar*el*fragmento*correspondiente*a*la*isoforma*y* clonarlo*en*el*vector*pCR*2.1*TOPO*(Figura*R.37Figura*R.36),*que*tiene*sitios*de*corte*para*la*enzima* EcoR1.* La*clonación*se*confirmó*mediante*PCR*de*colonias*(Figura*R.38).*** * Figura*R.36.*Plásmido*pUCIDT.* * Figura*R.37.*Plásmido*pCR*2.1*TOPO.* RESULTADOS* * 69* * Debido*a*la*forma*en*el*que*se*realizó*el*clonaje,*utilizando*sólo*una*enzima*de*restricción,*existía*la* posibilidad*de*que*el*inserto*se*integrara*en*el*sentido*correcto*o*inverso.*Para*seleccionar*aquellas* colonias*con*el*inserto*en*el*sentido*correcto*para*su*transcripción,*se*llevaron*a*cabo*dos*PCRs* utilizando*la*secuencia*para*el*primer*M13*forward*que*contiene*el*plásmido*pCR*2.1*TOPO.*De*esta* forma,*para*cada*colonia*se*realizaron*las*siguientes*PCRs:*1)*con*el*primer*M13*forward)y)con*un* primer*que*anillaba*en*la*cadena*negativa*del*lnc-Nr6a1-2*(lnc-Nr6a1-R,*el*mismo*que*se*utiliza*para* los*ensayos*PCR*cuantitativa),*identificando*los*fragmentos*en*posición*inversa,*y*2)*con*el*primer* M13* forward*y* con* un* primer* que*anillaba*en* la*cadena* positiva* del* lnc-Nr6a1-2*(lnc-Nra6a1-2* forward,)el*mismo*que*se*utiliza*para*los*ensayos*PCR*cuantitativa),*que*amplificaría*en*aquellas* colonias*en*el*que*el*inserto*esté*en*la*posición*correcta*(Figura*R.39).** Tras*la*selección*de*aquellas*colonias*con*el*inserto*en*el*sentido*correcto*(colonias*1,*4,*5*y*7),*éste* se*clonó*en*el*vector*lentiviral*pSINDUAL,*utilizando*los*sitios*de*corte*BamH1*y*Not1.*Las*colonias* se*analizaron*mediante*PCR*de*colonias*con*primers*en*el*promotor*SFFV*del*plásmido*lentiviral* pSINDUAL*y*otro*específico*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-2*(Figura*R.40).* * Figura* R.38.* Imagen*representativa*del* clonaje* de*la* isoforma*lnc-Nr6a1-2*en* el* plásmido* pCR* 2.1* TOPO.*Se* muestran* los* productos*de*PCR*de*los*plásmidos* de*distintas* colonias*y*un*control*negativo*de*PCR*realizado* sin*DNA.* * Figura*R.39.*Imagen*representativa* de*los*productos*de*PCR*obtenidos** para*la* comprobación* del* sentido* del*inserto*lnc-Nr6a1-2*en*el*vector* pCR*2.1*TOPO.*Se*muestra*para*cada* colonia*los*productos*de*las*dos*PCRs* realizadas.* RESULTADOS* * 76* De*esta*forma,*se*confirmaron*las*interacciones*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*con*las*proteínas*lamina* A/C,*JUP*(g-catenina/placoglobina)*,*ENO1*(enolasa*1),*ALDOA*(aldolasa*A)*y*GAPDH*(gliceraldehido- 3-fosfato*deshidrogenasa).*La*proteína*HPRT1*se*utilizó*como*control*negativo*(Figura*R.47).* R.1.6.2.*La*ausencia*del*gen*Lnc-Nr6a1*afecta*a*la*interacción*entre*la*lamina*A/C*y*la* cromatina* Teniendo*en*cuenta*la*interacción*entre*la*lamina*A/C*y*el*lnc-Nr6a1-1*y*con*el*objetivo*de*comprobar* si*la*ausencia*del*lnc-Nr6a1-1*tenía*algún*efecto*en*la*interacción*de*la*lamina*A/C*con*la*cromatina,* se*realizaron*ensayos*de*inmunoprecitación*de*cromatina*(ChIP)*(MM.5.4)*con*un*anticuerpo*contra* la*lamina*A/C*en*células*NMuMG*control*y*células*KO,*identificándose*los*dominios*asociados*a* lamina*(Lamin)Associated)Domains*(LADs))*en*cada*tipo*celular.* La* inmunoprecipitación*de* la* lamina* A/C* se* comprobó*mediante* RT-qPCR* con* primers*que* apareaban*en*regiones*descritas*como*zonas*de*interacción*directa*con*la*lamina*A/C*(Lund*et*al.,* 2015).*Estas*zonas*de*interacción*se*enriquecían*92*veces*más*con*el*anticuerpo*contra*la*lamina* A/C*que*con*la*IgG.** Los*resultados*mostraron*que*la*ausencia*del*gen*Lnc-Nr6a1*afectaba*a*los*sitios*de*unión*entre*la* cromatina*y*la*lamina*A/C*generándose*en*el*KO*45*nuevos*LADs*y*desapareciendo*148*(P-valor*<* 0,01).*En*general,*se*observó*que*esta*ganancia*o*pérdida*de*LADs*era*parcial,*no*produciéndose* cambios*drásticos*en*los*LADs*de*las*células*NMuMG*Lnc-Nr6a1-/-(Figura*R.48).* * Figura*R.47.*RIP*de*lamina*A/C,* g -catenina,*ENO1,*ALDOA,*GAPDH* y*HPRT.*Se*determinó*el*enriquecimiento*del*lnc-Nr6a1-1*relativos*a* IgG*para*cada*una*de*las*proteínas*indicadas.*Se*muestra*la*media*de* triplicados;*las*barras*de*error*representan*la*DE.* RESULTADOS* * 77* * Se*determinaron*los*genes*contenidos*en*los*LADs*diferenciales*y*se*llevó*a*cabo*un*análisis*de* ontología*génica.*No*se*obtuvo*ningún*grupo*de*genes*significativo*en*el*caso*de*los*genes*vinculados* a*los*nuevos*LADs,*pero*sí*con*los*asociados*a*los*LADs*desaparecidos,*que*se*encuadraban*en*las* categorías*de*quimiotaxis*celular*y*percepción*sensorial*del*olor*(Figura*R.49).* Además,*se*determinó*que*los*genes*asociados*a*los*LADs*no*mostraban*cambios*de*expresión*en*las* células*Lnc-Nr6a1-1-/-,*siendo*no*significativo*el*número*de*genes*coincidentes*(Figura*R.50).* * Figura*R.48.*Imagen*ilustrativa*de*pérdida*y*ganancia*de*LADs*en*las*células*Lnc-Nr6a1-/-.*Se*indican*la*distribución*de* LADs*detectados*en*el*cromosoma*2*de*células*NMuMG*control*(negro)*y*células*KO*(verde)*con*el*visualizador*IGV.*+:* Ganancia;*-:Pérdida.* * * Figura*R.50.*Diagrama*de* Venn* que*muestra*la*interacción*entre*los*genes* desregulados*en*el*KO*y*los*genes*asociados*a*LADs*diferenciales*en*el*KO.*p:* probabilidad*hipergeométrica.* Figura* R.49.)Análisis* de*ontología*de* los* genes* asociados* a* los* LADS*que*desaparecen*en*el*KO.*Gráfico*que*muestra*el*análisis*de* ontología*de*los*genes*asociados*a*los*LADs*desaparecidos*en*el*KO* (5%*FDR).*El*número*de*genes*detectados*en*los*LADs*desaparecidos* correspondiente*a*cada*proceso*o*actividad*se*muestra*encima*de*la* barra.*FDR:*False)Discovery)Rate.) RESULTADOS* * 78* R.1.6.3.*El*metabolismo*glicolítico*se*afecta*en*las*células*Lnc-Nr6a1-/-* Tomando*en*consideración*los*resultados*de*ontología*génica*del*RNAseq*de*las*células*NMuMG*Lnc- Nr6a1-/-*y*los*obtenidos*en*el*iDRIP*que*mostraban*una*interacción*directa*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1- 1*con*diferentes*enzimas*glicolíticas:*ALDOA,*ENO1,*PKM,*GAPDH*y*LDHA,*se*efectuó*un*análisis* metabólico*de*la*glicólisis*en*las*células*Lnc-Nr6a1-1-/-,*utilizando*para*ello*el*analizador*Seahorse*y* el*kit*glycolytic)rate)(MM.1.2.11).)En*líneas*generales,*con*este*kit*se*mide*la*actividad*glicolítica*tras* la*adición*de*inhibidores*en*dos*etapas,*en*una*primera*se*añade*una*mezcla*de*los*inhibidores* rotenona*y*antimicina*A,*que*inhiben*los*complejos*I*y*III,*respectivamente,*de*la*cadena*respiratoria,* y*en*una*segunda*etapa*se*añade*el*inhibidor*de*la*glucolisis*2-deoxy-D-glucosa*(2-DG),*que*inhibe* específicamente*la*enzima*hexoquinasa.* La*cuantificación*de*la*glicólisis*se*lleva*a*cabo*con*la*medida*de*los*protones*procedentes*de*este* proceso*metabólico,*denominado*glycoPER*(glycolysis*Proton*Efflux)Rate).*El*análisis*mostró*que*las* células*KO*presentaban*una*actividad*glicolítica*basal*y*compensatoria*menores*que*las*células* control.*Entiéndese* por* glicolisis* compensatoria* la* actividad* energética* que* la* célula* consigue* cuando*se*inhibe*la*fosforilación*oxidativa;*es*un*parámetro*indicativo*de*la*capacidad*celular*de* gestionar*la*demanda*de*energía*en*situaciones*de*estrés.*El*efecto*sobre*el*metabolismo*glicolítico* observado*en*células*carentes*del*gen*Lnc-Nr6a1*se*revertía*significativamente*en*células*KO*que* sobreexpresaban*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1)(Figura*R.51).* ** * * * Figura*R.51.*Las*células*Lnc-Nr6a1-1-/-*presentan*un*defecto*en*el*metabolismo* glicolítico*que*revierte*al*sobreexpresar*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1.*A*y*B.*Medida*del* flujo*de*protones*debido*a*la*glicólisis*(glycoPER).*Se*indica*el*momento*de*inyección*de* los*inhibidores*correspondientes*(Rotenona*+*Antimicina*A*y*2-DG).*C.*Medida*de*la* glicólisis* basal.* D.*Medida* de* la* glicólisis* compensatoria.* A,* B,* C* y* D.* Se* muestra* 1* experimento* representativo* con* 6* réplicas* por* condición.* Las* barras* de* error* representan*la*DE.*C*y*D.*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de*Student* de*dos*colas.*(*)*P-valor<*0,05;*(**)*P-valor<*0.01;*GlycoPER:*pmol/min/*µgramos*de* proteína.*2-DG:*2-Deoxi-D-Glucosa.*glycoPER:*glycolysis)Proton)Efflux)Rate.* RESULTADOS* * 79* Teniendo* en*cuenta* los* resultados* obtenidos* mediante* la* técnica* iDRIP*(R.1.6.1),* en* los* que* se* confirmó*la*interacción*directa*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*con*las*enzimas*glicolíticas*GAPDH,*PKM,* ALDOA,*ENO1*y*LDHA,*se*estudió*si*la*interacción*con*cada*una*de*estas*proteínas*ocurría*de*forma* independiente,*o,*por*el*contrario,*si*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*formaba*un*complejo*glicolítico*con* estas*enzimas;*para*ello,*se*llevaron*a*cabo*experimentos*de*coinmunoprecipitación*(MM.5.9)*de* extractos*crosslinkeados*con*radiación*UV*de*células*NMuMG*control*y*células*NMuMG*Lnc-Nr6a1-/-* en*los*que*utilizando*un*anticuerpo*frente*a*enolasa-1*se*observaba*un*enriquecimiento*del*resto*de* las*enzimas*glicolíticas:*GAPDH,*PKM,*ALDOA,*LDH,*PGK1,*HK1,*HK2,*PGAM1*y*TPI1.*Además,*este* experimento*reveló*que*en*las*células*Lnc-Nr6a1-/-*la*cantidad*inmunoprecitada*de*estas*enzimas*era* menor*comparado*con*células*NMuMG*control.*Los*resultados*obtenidos*sugieren*la*existencia*de*un* complejo* constituido* por* las* distintas* enzimas* glicolíticas,* cuya* formación* está* mediada* por*la* presencia*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1.)(Figura*R.52).* R.1.7.* La* sobreexpresión* del*gen*Lnc-Nr6a1,*que*incluye*las*isoformas*lnc- Nr6a1-1/2*y*los*miR-181a2/b2,*afecta*a*la*expresión*de*marcadores*de*EMT,* aumenta*la*resistencia*a*anoikis*y*la*capacidad*de*migratoria* Basándonos*en*que*las*células*NMuMG*tratadas*con*TGF-b*inducen*las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2*y*los* miR-181a2/b2*(R.1.1.1*y*R.1.1.4),*se*analizó*el*efecto*de*la*expresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*mediante* CRISPR*de*activación*(CRISPRa)* * * Figura* R.52.* Heatmap*que* muestra* los* cambios* en* la* abundancia*relativa*de*las*distintas*enzimas*glicolíticas* inmunoprecipitadas*con*un*anticuerpo*anti-enolasa-1.*Se* indica*el*porcentaje*de*cambio*con*respecto*a*la*media*de*las* cuentas*espectrales*del*grupo*control.*Los*resultados*fueron* analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.* RESULTADOS* * 80* R.1.7.1.*Obtención*de*una*línea*celular*estable*NMuMG*que*sobreexpresa*el*gen*Lnc- Nr6a1* Para*la*obtención*mediante*CRISPRa*de*una*línea*celular*estable*que*sobreexpresara*el*gen*Lnc- Nr6a1*se*utilizaron*tres*plámidos:*1)*lenti-sgRNA,*que*contienen*las*diferentes*guías*de*activación,* 2)*lenti-dCAS-VP64,*que*contiene*la*endonucleasa*CAS9*fusionada*al*activador*transcripcional*VP64* y* 3)* lenti-MPH-v2,* que*contiene*los* cofactores*P65* y* HSF1*potenciadores* de* la* inducción* (MM.1.2.10.2)*(¡Error!*No*se*encuentra*el*origen*de*la*referencia.).* En*primer*lugar,*tras*incubar*y*aparear*las*cadenas*de*DNA*correspondientes*a*los*guías,*se*clonaron* en* el* plásmido* correspondiente,* previamente* digerido* con* la* enzima* BsmB1.* Las* colonias* transformantes* fueron* analizadas*utilizando* un* primer*del* promotor* U6* y* otro* contenido*en*la* cadena*reversa*de*la*propia*molécula*guía*(Figura*R.54).** Tras*el*clonaje,*se*obtuvieron*partículas*lentivirales*con*las*que*se*infectaron*las*células*NMuMG,* previamente*infectadas*con*lentivirus*dCSD-VP64*y*lentiMPH*v2*y*seleccionadas*con*el*antibiótico* correspondiente.*Se*utilizaron*10*guías*diferentes*y*se*cuantificó*en*cada*caso*la*inducción*de*las* isoformas*lnc-Nr6a1-1,*lnc-Nr6a1-2*y*miR-181a2.*Se*escogió*el*miR-181a2-3p*por*contener*primers* específicos*y*diferenciales*del*miR-181a1-3p*(Tabla*R.2*y*Figura*R.55).* * ) * * * * * * Figura* R.53.) Ilustración* esquemática*del* CRISPR* de* activación* (CRISPRa).* Se* muestra* la* enzima*dCas9*(Cas9* deficiente*o*carente*de*actividad)*fusionada*al*factor*VP64.* Los*cofactores*P65*y*HSF1*potenciadores*de*la*transcripción* y*unidos*a*los*motivos*MS2*que*están*incluidos*en*la*molécula* de*RNA*guía*(sgRNA)* ) Figura*R.54.)Imagen*representativa*de*los*productos*de*PCR*obtenidos*en* la*comprobación*del*clonaje*de*las*distinas*guías.*Se*muestran*5*colonias* distintas,*siendo*positivas*la*2*y*la*3.) RESULTADOS* * 81* * Control* Guía* 1* Guía* 2* Guía* 3* Guía* 4* Guía* 5* Guía* 6* Guía* 7* Guía* 8* Guía* 9* Guía* 10* Lnc-Nr6a1-1* 1* 25* 50* 0,8* 4* 3* 0,9* 3* 47* 0,6* 1* Lnc-Nr6a1-2* 1* 6* 38* 0,6* 1* 0,8* 0,4* 3* 18* 0,4* 1* miR-181a2-3p* 1* 8* 24* 0,9* 0,8* 1* 0,5* 3* 8* 0,5* 0,6* ) Tabla*R.2.*Inducción*de*las*isoformas*lnc-Nr6a1-1/2*y*del*miR-181a2-3p*con*las*diferentes*guías*utilizadas*en*el* CRISPRa.)* * Para*los*siguientes*experimentos*se*seleccionaron*las*líneas*celulares*obtenidas*con*las*guías*2*y*8* ya*que*mostraban*los*mayores*niveles*de*expresión*de*las*dos*soformas*del*lnc-Nr6a1*y*del*miR- 181a2-3p.*Además,*en*las*líneas*celulares*obtenidas*con*las*guías*1,*2*y*8*se*cuantificaron*los*niveles* de*las*cadenas*miR-181a-5p,*miR-181b-5p*y*miR-181b2-3p,*confirmándose*que*también*estaban* inducidos*(Figura*R.56).* * * * Figura* R.55.*Inducción*de*las*isoformas*lnc- Nr6a1-1/2*y* del* miR-181a2-3p*con* las* diferentes*guías*utilizadas*en*el*CRISPRa.*Se* determinaron*mediante*RT-qPCR*los*niveles*de* las*dos*isoformas*del*lnc-Nr6a1*y*del*miR-181a2- 3p.* Las* inducciones* están* normalizadas* a* la* expresión*de*células*NMuMG*control.*Se*muestra* la*media*de*triplicados;*las*barras*corresponden* a*la*DE.) Figura*56.)Expresión*relativa*del*miR-181a-5p,*miR- 181b-5p* y* miR-181b2-3p*en* las* líneas* celulares* obtenidas*con*las*guías*1,*2*y*8.*Se*determinaron*los* niveles*de*estos*miRNAs*mediante*RT-qPCR.*Los*valores* de* expresión* se* presentan* normalizados* respecto* a* la* expresión* de* células* NMuMG* control.* Se* muestra* la* media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la* DE.) RESULTADOS* * 82* R.1.7.2.* La* sobreexpresión* del* gen* Lnc-Nr6a1*produce* una* disminución* de* E- cadherina*y*un*aumento*de*N-cadherina* Con*objeto*de*estudiar*el*efecto*sobre*la*EMT*de*la*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*se*analizaron* mediante*western)blot)los*niveles*de*los*marcadores*más*representativos*del*proceso,*apreciándose* una* disminución* significativa* de* los* niveles* de* E-cadherina*y*un*aumento*discreto*de* los* de* N- cadherina.*Dichos*cambios*fueron*confirmados*por*microscopía*de*fluorescencia.*Estos*resultados* indican*que*la*sobreexpresión*del*precursor*tiene*un*efecto*sobre*la*regulación*génica*de*algunos*de* los*marcadores*más*representativos*de*EMT*que*no*se*observa*con*la*sobreexpresión*de*la*isoforma* lnc-Nr6a1-1*(Figura*R.57).* * R.1.7.3.*La*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*aumenta*la*resistencia*a*anoikis* Las*células*no*tumorales,*a*excepción*de*las*células*hematopoyéticas,*no*son*capaces*de*crecer*en* suspensión,*fenómeno*conocido*como* dependencia*de* anclaje,*es*decir,*la* supervivencia* celular* depende*de*la*adhesión*de*la*célula*a*la*matriz.*Cuando*las*células*no*encuentran*la*posibilidad*de* adherirse* al* sustrato* activan* una*muerte* celular* denominada* anoikis.* Las* células* tumorales* desarrollan* mecanismos* para* poder* evitar* esta* muerte* celular* programada* y* sobrevivir* en* * Figura*R.57.*La*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1)afecta*a*los*marcadores*de*EMT*E-cadherina*y*N-cadherina.*A*y*B* Imágenes*de*microscopia*de*fluorescencia*de*células*NMuMG*control*y*células*infectadas*con*la*guía*2*que*sobreexpresan*el* gen*Lnc-Nr6a1.*Las*células*se*fijaron*y*se*marcaron*con*los*anticuerpos*contra*el*marcador*epitelial*E-cadherina*y*el*marcador* mesenquimal*N-cadherina.*Los*núcleos*se*marcaron*con*DAPI.*C.*Se*determinaron*mediante*western)blot*los*niveles*de*E- cadherina,*N-cadherina*y*vimentina*en*células*NMuMG*control,*células*que*sobreexpesan*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*células* que*sobreexpesan*el*gen*Lnc-Nr6a1*con*las*guías**2*y*8.*D.*Cuantificación*de*las*bandas*del*wester)blot*normalizada*con*la* proteína*total*cargada*en*el*pocillo*y*con*los*niveles*de*expresión*en*células*NMuMG*control.* RESULTADOS* * 83* condiciones*de*suspensión,*lo*que*está*directamente*vinculado*con*el*desarrollo*de*tumores*y*la* metástasis*de*los*mismos.* Estudios*previos*vinculan*la*sobreexpresión*del*miR-181*a*una*mayor*resistencia*a*anoikis,*de*forma* que*estudiamos*si*la*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*confería*resistencia*a*anoikis.*Para*ello,*las* células*se*sembraron*en*placas*de*6*pocillos*previamente*tratadas*con*el*polímero*poli(2-hidroxietil* metacrilato)* (pHEMA),* que* impide* la*adhesión* de* las*células* a* la* placa.* Además,* las* células* se* resuspendían*en*medio*de*cultivo*con*metilcelulosa,*para*impedir*la*adhesión*entre*ellas.*Las*células* se*mantuvieron*en*estas*condiciones*durante*24*horas*y,*a*continuación,*se*analizaron*mediante* citometría*de*flujo,*identificando*y*cuantificando*las*células*apoptóticas*(MM.1.2.12).* Se*observó*que*el*35%*de*las*células*que*sobreexpresaban*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*eran*apoptóticas* frente* al* 41%*de* las* células* control,* y* que* las* células* que* sobreexpresaban* el* gen* Lnc-Nr6a1* mostraban*un*porcentaje*de*células*apoptóticas*del*25%*(Figura*R.58).* * Figura*R.58.*Las*células*NMuMG*que*sobreexpresan*el*gen*Lnc-Nr6a1*con*las**guías* 2*y*8*muestran*una*reducción*en*los*niveles*de*apoptosis*tras*la*falta*de*adhesión.* Se*determinó*mediante*citometría*de*flujo*el*porcentaje*de*células*apoptóticas*en*las* líneas* celulares* indicadas.* Se* muestra* la* media* de* 6* réplicas;* las* barras* de* error* representan*la*DE.*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de* dos*colas.*(***)*P-valor*<*0.001;*ns:*no*significativo.* RESULTADOS* * 84* R.1.7.4.*La*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*no*afecta*a*la*proliferación*celular** Se*analizó*la*proliferación*celular*de*las*células*que*sobreexpresaban*el*gen*Lnc-Nr6a1*según*se*ha* descrito* previamente* en* el* apartado*R.1.3.5* (MM.1.2.6),* no* observándose* diferencias* entre* las* células*NMuMG*control*y*las*células*que*sobreexpresaban*el*gen*Lnc-Nr6a1*(guía*2*y*8)*(Figura*R.59).* * R.1.7.5.*La*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*no*afecta*a*la*adhesión*célula-matriz* Teniendo*en*cuenta*el*efecto*sobre*la*adhesión*célula-matriz*que*presentaban*las*células*lnc-Nr6a1- 1-/-,*se*analizó*el*efecto*sobre*la*de*adhesión*de*la*sobreexpresión*de*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*del* gen*Lnc-Nr6a1.* Se*sembraron*300000*células*en*placas*de*12*pocillos,*fijandóse*los*pocillos*a*los*tiempos*de*1,*4,*6* y*8*horas.*Antes*de*ser*fijadas,*los*pocillos*se*lavaron*exhaustivamente*con*PBS*para*eliminar*las* células*no*adheridas*al*sustrato.*Finalmente,*las*células*se*tiñeron*con*cristal*violeta*y*se*midió*la* absorbancia*a*550*nm*utilizando*el*analizador*varioskan)(Termo*Electron*Corporation)*(MM.1.2.8.1).* Figura* R.59.*La*proliferación*no* se*ve*afectada*por*la*sobreexpresión*del* gen* Lnc-Nr6a1*con*las* guías*2*y* 8.*A.* Monitorización*a*tiempo*real,*mediante*el*sistema*xCELLigence,*de*la*proliferación*in)vitro*de*las*células*NMuMG*control*y* sobreexpresando*el*gen*Lnc-Nr6a1)(guía*2*y*8).*B.*Valores*de*las*pendientes*de*las*curvas*de*impedancia.*Los*resultados*fueron* analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.*ns:*no*significativo*A*y*B.*Se*muestra*la*media*de*triplicados*y*las*barras* de*error*representan*la*DE.* * RESULTADOS* * 85* En*ninguna*de*las*dos*condiciones*se*observaron*diferencias*significativas*en*la*adhesión*célula- matriz*respecto*a*las*células*control*(Figura*R.60).* R.1.7.6.*La*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*aumenta*la*capacidad*de*migración*de* las*células*NMuMG* Se*determinó*si*la*sobreexpresión*del*gen*Lnc-Nr6a1*afectaba*a*la*capacidad*migratoria*de*las*células.* Para* ello,* se* procedió* de* la* misma* forma* que* la* indicada* en* el* apartado*R.1.4.4* (MM.1.2.5),* observándose*un* aumento* de* la*migración* en* aquellas* células* que* sobreexpresaban* el*gen*Lnc- Nr6a1,*comparado*con*las*células*que*sobreexpresaban*únicamente*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*que* ya*presentaban*un*aumento*en*la*migración*comparado*con*células*NMuMG*control.*Este*resultado* indica*que*la*sobreexpresión*del*miR-181a2/b2*afecta*también*a*la*capacidad*migratoria*de*las* células*(Figura*R.61).* * * * * Figura* R.60.*La* adhesión* célula-matriz* no* se*afecta*por* la* sobreexpresión* de* la* isoforma* lnc-Nr6a1-1*ni*por*la* sobreexpresión* del* gen* Lnc-Nr6a1.* A.* Tinción* con* cristal* violeta* de* las* células* NMuMG* control* y* las* células* que* sobreexpresan*la*isoforma*lnc-Nr6a1-1*y*el*gen*Lnc-Nr6a1*(guías*2*y*8)*fijadas*a*los*tiempos*indicados.*B.*Cuantificación*de*la* intensidad*del*color*a*590*nm.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la*DE.* * RESULTADOS* * 92* El*RNA*resultante*se*retrotranscribió*a*cDNA*y,*tras*ser*circularizado*y*linearizado,*se*amplificó*y* secuenció*(Figura*R.69).** R.2.2.*Análisis*bioinformático*de*la*genoteca*del*iCLIP*de*AGO2* R.2.2.1.*Los*triplicados*de*las*muestras*presentan*un*alto*índice*de*similitud* Se*determinó*que*las*réplicas*de*cada*una*de*las*condiciones*mostraban*un*alto*índice*de*semejanza* entre*ellas,*por*lo*que*se*decidió*unir*los*triplicados*con*el*fin*de*facilitar*la*detección*de*los*sitios*de* crosslinking)(Figura*R.70).* * * Figura*R.68.*Visualización* de* los*complejos*AGO2-RNA.* Imagen* representativa* de* los* complejos* AGO2-RNA*de*los* triplicados* de* cada* una* de* las* condiciones* marcados* radiactivamente,* resueltos* en* un* gel* de* acrilamida* y* transferidos* a* una* membrana* de* nitrocelulosa.* KDa:* kilodaltons* ) Figura* R.69.*Productos* de* amplificación* de* la* población* de* cDNAs* que* constituye* la* genoteca* iCLIP* de* cada* una* de* las* condiciones.* * RESULTADOS* * 93* R.2.2.2.*AGO2*se*une*principalmente*a*exones*y*a*regiones*3’*UTR*del*RNA* Se*analizó*la*localización*génica*de*los*RNAs*unidos*a*AGO2,*obteniéndose*resultados*muy*similares* en*las* tres*condiciones*de* estudio.* Los* resultados* indicaron* que* la* proteína* AGO2* se* une* principalmente*a*exones*y*regiones*3’*UTRs*(Figura*R.71).*Es*destacable*que*el*porcentaje*de*RNAs* que*interaccionan*con*AGO2*mediante*exones*y*mediante*la*región*3’*UTR*es*muy*parecido,*lo*cual* sugiere* que* el* mecanismo* de* regulación*llevado*a* cabo* por* RISC,* que* fundamentalmente*se* ha* asociado*a*regiones*3’*UTR,*también*está*asociado*a*exones.* Teniendo*en*cuenta*que*la*mayoría*de*las*lecturas*correspondían*a*regiones*3’UTR*y*exones,*se* trabajó*con*el*transcriptoma,*en*lugar*de*con*el*genoma.* * * Figura*R.71.*Distribución*génica*de*las*lecturas*de*iCLIPseq*en*las*distintas*condiciones.*Se*indica* el* porcentaje*de* lecturas*en*promotores,*regiones*“agua*abajo”*inmediatas,*5’*UTR,*3’*UTR,*exones,*intrones*y*regiones*intergénicas.*UTR:* untranslated)region* Figura*R.70.*Las*muestras*triplicadas*del*iCLIP*presentan*un** índice*de*similitud*alto.*Se*representa*la*distancia*euclidiana* de*las*comparaciones*entre*los*datos*de*iCLIPseq*de*3*réplicas* biológicas*independientes*de*las*tres*condiciones*de*estudio.*La* distancia*euclidiana*se*representa*en*un*diagrama*de*colores*en* un*intervalo*de*0*a*40.** RESULTADOS* * 94* R.2.2.3.*Estudio*de*los*RNAs*enriquecidos*en*el*complejo*RISC*tras*el*tratamiento*con* TGF- b .*Selección*del*mRNA*Serpine1*como*posible*esponja*de*miRNAs*en*la*EMT* Utilizando*el*software*PureCLIP)(Krakau*et*al.,*2017),*se*identificaron*los*sitios*de*crosslinking*de* cada* uno* de* los* RNAs* unidos* a* AGO2* en*cada* condición,* seleccionando*aquellos* RNAs* que* aumentaban*o*disminuían*en*el*complejo*RISC*cuando*las*células*se*trataban*con*TGF-b*durante*4* horas*y,*considerando*para*ello,*las*lecturas*asociadas*a*los*sitios*de*crosslinking.* Entre*los*RNAs*que*más*aumentaban*en*el*complejo*RISC*tras*el*tratamiento*con*TGF-b*durante*4* horas,*se*seleccionó*el*mRNA*Serpine1,*cuya*abundancia*en*el*complejo*RISC*era*11*veces*mayor*en* células* tratadas* con* TGF-b* (Tabla* R.3;* Figura* R.72)* (ANEXO* INFORMÁTICO* 2:* lecturas_bindingsites_genes).*Además,*se*observó*un*aumento*considerable*en*el*número*de*sitios* de*crosslinking)del*mRNA*Serpine1,*que*pasaba*de*2*sitios*de*crosslinking*en*condiciones*control*a*34* en*las* células*tratadas* con* TGF-b*durante* 4* horas*(Tabla* R.4)* (ANEXO* INFORMÁTICO* 2:* bindingsites_Serpine1)* * GEN* LECTURAS*CONTROL*(RPKM)* LECTURAS*4*h*TGF- b (RPKM)* ENRIQUIMECIMIENTO* Serpine1) 74,74* 863,58* 11,55* Ctgf-) 64.66* 328,14* 5,07* Bhlhe40) 41.60* 192,83* 4,63* Cdh6) 84,68* 307,37* 3,62* Pmepa1) 79,03* 273,24* 3,45* Bmf) 49,87* 153,48* 3,08* Tgfbr1) 92,17* 243,53* 2,62* * Tabla*R.3.*Relación*de*algunos*de*los*RNAs*que*más*aumentaban*en*el*complejo*RISC*tras*el*tratamiento*con*TGF- b .* Se*indica*el*símbolo*del*gen,*el*número*de*lecturas*en*las*células*NMuMG*control*y*en*las*tratadas*con*TGF-b*durante*4*horas* (normalizadas*por*kilobase*y*por*cada*millón*de*lecturas*mapeadas*(RPKM))*y*el*enriquecimiento.* * GEN* Nº*SITIOS*DE*CROSSLINKING* CONTROL* Nº*SITIOS*DE* CROSSLINKING)4*h*TGF- b * Serpine1) 2* 34* CTGF-) 2* 21* Bhlhe40) 0* 20* Cdh6) 3* 25* Pmepa1) 4* 20* Bmf) 0* 10* Tgfbr1) 2* 31* * RESULTADOS* * 95* Tabla*R.4.*Número*de*sitios*de*crosslinking)de*los*RNAs*indicados*en*la*tabla*R.3*en*células*NMuMG*control*y*tratadas* con*TGF- b *durante*4*horas.* Además,*para*confirmar*que*la*unión*a*AGO2*era*independiente*de*la*abundancia*del*RNA,*se*estudió* la*correlación*entre*RNAseq*y*iCLIPseq*de*algunos*mRNAs*que*más*se*inducían*tras*el*tratamiento* con*TGF-b*a*las*4*horas.*Para*ello,*se*seleccionaron*el*5%*de*los*genes*con*mayor*número*de*lecturas* (RPKM)* correspondientes* al* RNAseq* realizado* a* las* 4* horas* de* TGF-b,* se* ordenaron* de* forma* creciente,*y*se*determinó*para*cada*uno*de*ellos*el*número*de*lecturas*en*el*experimento*de*iCLIPseq* también*a*las*4*horas*de*TGF-b,*no*observándose*relación*entre*los*RNAs*más*abundantes*y*su* interacción*con*AGO2*(Figura*R.73)* ) * Figura*R.72.*Lecturas*del*iCLIPseq*correspondientes*al*mRNA*Serpine1*en*células*NMuMG*control*y*tratadas*con*TGF- b *durante*4*horas.* RESULTADOS* * 96* R.2.3.*La*sobreexpresión*del*mRNA*Serpine1*induce*EMT* R.2.3.1.*Los*niveles*de*Serpine1*aumentan*en*células*NMuMG*tratadas*con*TGF- b * Con*el*objetivo*de*caracterizar*los*cambios*expresión*del*gen*Serpine1*en*células*NMuMG*tratadas* con*TGF-b,*se*cuantificaron*los*niveles*de*mRNA*y* de*proteína*a* las* 0,* 2,* 4,*8,* 24* y* 48*horas* de* tratamiento,*confirmándose*un*aumento*tanto*de*los*niveles*de*RNA*como*de*proteína.*El*mRNA* aumentaba*unas*10*veces*a*las*2*horas*de*tratamiento*llegando*a*ser*16*veces*superior*a*las*24*horas.* En*cuanto*a*los*niveles*de*proteína,*aumentaron*unas*15*veces*a*las*2*horas*de*tratamiento.*Es* relevante*mencionar*que*a*tiempo*0,*aunque*los*niveles*de*mRNA*eran*altos*(Ct*aproximada*de*19* ciclos),*la*proteína*apenas*se*detectaba*(Figura*R.74).* El*hecho*paradójico*de*que*el*mRNA*Serpine1*se*induzca*de*forma*notable*con*el*tratamiento*de*TGF- b*y*simultáneamente*se*produzca*un*enriquecimiento*de*este*mismo*mRNA*en*el*complejo*RISC* (R.2.2.3),*indicaría*que*realiza*una*función*como*RNA*no*codificante,*concretamente*como*molécula* esponja*de*miRNAs;*ya*que,*¿por*qué*inducir*la*expresión*de*un*mRNA*para*a*continuación*silenciarlo* mediante*el*complejo*RISC?* * * * * * Figura*R..73.*Estudio*de*la*correlación*entre*iCLIPseq*y*RNAseq*a*las*4*horas*de*tratamiento*con*TGF- b .*Se*muestran*el* 5%*de*los*genes*con*mayor*número*de*lecturas*(RPKM)*en*el*experimento*de*RNAseq*ordenados*de*forma*creciente*y*el* número*de*lecturas*(RPKM)*determinadas*para*cada*uno*de*ellos*en*el*experimento*de*iCLIPseq.* RESULTADOS* * 97* R.2.3.2.*Obtención*de*células*que*sobreexpresan*el*mRNA*Serpine1) Con*el*propósito*de*estudiar*la*función*del*mRNA**Serpine1*en*la*EMT,*se*generó*una*línea*estable*de* células* NMuMG* que*sobreexpresaba* este* mRNA.* Para* ello,* se* mandó* a* sintetizar* la* secuencia* completa*del*gen*Serpine1*(incluyendo*las*regiones*completas*3’*UTR*y*5’*UTR,*fundamentales*en*la* regulación*mediada*por*miRNAs),*flanqueada*por*sitios*de*restricción*para*las*enzimas*BamH1*y* Not1*en*el*vector*pMA-T.** A*continuación,*se*mutaron*cuatro*sitios*ATGs*(los*dos*primeros*contiguos*y*correspondientes*al* sitio*de*inicio*de*la*traducción*y*otros*dos*localizados*a*800*pb*del*sitio*de*inicio*de*la*traducción)*de* la*secuencia*del*gen*Serpine1*(MM.2.14),*impidiendo*de*esta*forma*su*traducción,*y*permitiendo* estudiar*sólo*la*función*del*RNA;*la*mutagénesis*se*analizó*mediante*secuenciación.** * Figura*R.74.*El*gen*Serpine1*se*induce*cuando*las*células* NMuMG*son*tratadas*con*TGF- b .*A.*Expresión*relativa*del* mRNA*Serpine1)en*células*NMuMG*tratadas*con*TGF-b*a*los* tiempos* indicados.* Se* muestra* la* media* de* triplicados;* las* barras* de* error* representan* la* DE.* Los* resultados* fueron* analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.*(**)*P- valor* <* 0.01;(***)* P-valor* <* 0.001.*B.*Western) blot*de* la* proteína*SERPINE1*en*células*NMuMG*tratadas*con*TGF-b*a* los* tiempos* indicados.* C.*Cuantificación* de* las* bandas* del* wester) blot*de* SERPINE1* normalizada* con* la* proteína* total* cargada*en*el*pocillo*y*los*niveles*de*expresión*en*células*sin* tratar*(tiempo*0).* RESULTADOS* * 98* El*cDNA*mutado*de*Serpine1*se*clonó*en*el*vector*lentiviral*pSINDUAL*utilizando*para*ello*los*sitios* de*restricción*BamH1*y*Not1*introducidos*su*síntesis*y*presentes*en*el*vector*de*clonación*(Figura* R.75).* * Después*del*aislamiento*del*gel*de*los*fragmentos*correspondientes*al*vector*pSINDUAL*y*al*gen* Serpine1*mutado,*se*ligaron*y,*a*continuación,*se*transformaron*en*bacterias*DH5a.*Una*vez*obtenido* el*DNA*de*las*colonias*mediante*miniprep,*el*análisis*de*los*transformantes*se*llevó*a*cabo*mediante* restricción* con* las* enzimas* BamH1* y* Not1,* que* liberan* el* inserto*de* aproximadamente* 3* Kb* correspondiente*a*Serpine1*(Figura*R.76).** * Figura* R.75.* Imagen* representativa* de* los* fragmentos* obtenidos* tras* la* digestión* de* Serpine1*y* del* plásmido* pSINDUAL*con*las*enzimas*BamH1*y*Not1.*Kb:*kilobases.* * Figura* R.76.* Gel* representativo* de* la* comprobación*del*clonaje*de*Serpine1*en* pSINDUAL.*El*DNA*plasmídico*de*las*distintas* colonias* se* digirió* con* las* enzimas* de* restricción*BamH1*y*Not1.*Kb:*kilobases.* RESULTADOS* * 99* A*continuación,*se*obtuvieron*partículas*lentivirales*y*se*infectaron*células*NMuMG*a*MOI=2,*que* mostraron* niveles*de*mRNA* Serpine) 7* veces* superiores* a* los* de* las* células* control* y,* mediante* western)blot,)se*confirmó* que* los* niveles* de* proteína* no* se*afectaban* por* la* sobreexpresión* del* plásmido*mutado,*mientras*que*aumentaban*significativamente*con*la*expresión*del*plásmido*no* mutado*(Figura*R.77).** Los*niveles*de*mRNA*Serpine1)aumentaban*de*forma*similar*en*las*células*que*sobreexpesaban* cualquiera*de*los*dos*plásmidos.* Es* importante* subrayar*que* todos* los* experimentos* que* se* describen* a* continuación* fueron* realizados*con*el*plásmido*que*incluye*las*mutaciones*en*los*cuatro*ATGs*y*que*es*denominado*como* pSINDUAL-Serpine1ATG** * R.2.3.3.*La*sobreexpresión*del*mRNA*Serpine1*produce*un*aumento*de*la*capacidad* migratoria*e*invasiva*de*las*células*pero*no*afecta*a*la*proliferación*celular* La*mayor*capacidad*migratoria*e*invasiva*son*dos*de*las*principales*características*de*las*células* mesenquimales.*Así,*nos*propusimos*estudiar*si*la*sobreexpresión*del*mRNA*Serpine1*afectaba*a* alguna*de*estas*características.* La*migración*se*estudió*como*se*describe*en*el*apartado*R.1.4.4*(MM.1.2.5)*comparando,*en*este* caso,*células*que*sobreexpresaban*el*plásmido*pSINDUAL*religante*(células*control)*con*células*que* sobreexpresaban* el* mRNA* Serpine1.* El* resultado* del* experimento* reveló* que* las* células* que* sobreexpresaban*el*mRNA*Serpine1)migraban*más*rápido*que*las*células*control*es*decir,*el*cierre* completo*de*la*herida*se*realizaba*en*menos*tiempo*(Figura*R.78).* * * Figura* R.77.) Western) blot) de* células* NMuMG* que* sobreexpresan* Serpine1) silvestre* (wild) tipe,* wd)* y* mutada.* A.* Detección* de* la* proteína* SERPINE1* en* células* NMuMG* control* y* células* que* sobreexpresan* Serpine1*silvestre* y* mutada.*B.*Cuantificación*de*las*bandas*del* western) blot*normalizada* con*la*proteína* total*del*pocillo*y*a*los*niveles*de*proteína* en* células* NMuMG* control.* KDa:* kilodaltons.) RESULTADOS* * 100* * * El*análisis*de*la*capacidad*invasiva*de*las*células*se*llevó*a*cabo*utilizando*cámaras*de*invasividad* (Boyden*Chamber)*(MM.1.2.4).*En*el*compartimento*superior*se*añadieron*las*células*diluidas*y* cultivadas*en*medio*sin*suero*y*en*el*inferior*medio*completo.*A*las*24*horas*las*células*que*habían* alcanzado*el*compartimento*inferior*se*tiñeron*con*cristal*violeta*y*se*cuantificaron*(MM.1.2.4).* Estos*ensayos*mostraron*que*la*sobreexpresión*del*mRNA*Serpine1*per) se*confiere*a*las*células* mayor*capacidad*invasiva*(Figura*R.79).** * * Figura*R.79.)La*sobreexpresión*del*mRNA*Serpine1*aumenta*la*capacidad*invasiva*de*las*células*NMuMG.*A.*Imágenes* de*microscopía*del*compartimento*inferior*de*la*cámara*de*invasividad*con*células*sobreexpresando*el*plásmido*pSINDUAL* religante*(control)*y*el* mRNA* Serpine1.* B.*Cuantificación* de*la*intensidad* del*color*a* 590* nm.* Se* muestra* la* media* de* triplicados;*las*barras*de*error*representan*la*DE*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.* (*)*P-valor*<*0.05.) Figura*R.78.*La*sobreexpresión*del*mRNA*Serpine1*produce*un*aumento*de*la*capacidad*migratoria*de*las*células* NMuMG.* La* capacidad* migratoria* de* las* células* que* sobreexpresan* mRNA* Serpine1*y* el* plásmido* pSINDUAL*religante* (control)*se*comprobó*mediante*ensayos*de*cierre* de* herida;*las*imágenes*de*las*células*se*capturaron*cada*10*minutos* durante*24*horas.*A.*Se*muestran*las*imágenes*capturadas*a*las*0,*9*y*15*horas.*B.*Las*imágenes*capturadas*a*9*y*12*horas*se* utilizaron* para* estimar* el* porcentaje* de* la* superficie* de* la* herida* cerrada*por* las* células.* Se* muestra* la* media* de* dos* experimentos*independientes;*las*barras*de*error*representar*la*DE.*Los*resultados*fueron*analizados*mediante*un*test*t)de* Student*de*dos*colas.*(***)*P-valor*<*0.001.*h:horas.* RESULTADOS* * 101* Además,*para*descartar*que*el*aumento*de*la*capacidad*migratoria*e*invasiva*estuvieran*ligados*a*un* aumento*de*la*proliferación*celular,*se*analizó*este*parámetro*como*se*describe*en*el*apartado*R.1.3.5* (MM.1.2.6).*No*se*observaron*diferencias*significativas*en*el*índice*de*proliferación*entre*las*células* control*y*las*células*que*sobreexpresan*el*mRNA*Serpine1*(Figura*R.80).* * Figura*R.80.)La*proliferación*no*se*afectada*por*la*sobreexpresión*del*mRNA*Serpine1.*A.*Monitorización*a*tiempo*real* de*la*proliferación*in)vitro*de*las*células*NMuMG*que*sobreexpresan*el*plásmido*pSINDUAL*religante*(control)*y*el*mRNA* Serpine1*mediante*el*sistema*xCELLigence.*B.*Valores*de*las*pendientes*de*las*curvas*de*impedancia*.*Los*resultados*fueron* analizados*mediante*un*test*t)de*Student*de*dos*colas.*ns:*no*significativo*A*y*B.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras* de*error*representan*la*DE.* RESULTADOS* * 108* R.2.4.* El* factor* de* splicing*TRA2B* se* regula* mediante* el* mRNA* Serpine1*y* diferentes*miRNAs* 2.4.1.*El*factor*de*splicing*TRA2B*se*regula*postranscripcionalmente*en*las*céulas* NMuMG*tratadas*con*TGF- b * Con*la*finalidad*de*analizar*los*cambios*de*expresión*del*gen*Tra2b*en*células*NMuMG*tratadas*con* TGF-b,*se*realizó*una*cinética*de*este*factor*de*splicing,*a*nivel*de*RNA*y*proteína,*tras*0,*2,*4,*8,*24*y* 48*horas*de*tratamiento,*observándose*que,*mientras*los*niveles*de*RNA*se*mantenían*estables* durante* el* tratamiento,* los* niveles*de* proteína* aumentaban* drásticamente* a* las* 2* horas,* manteniéndose*esta*inducción*hasta*las*24*horas*(Figura*R:86).* Con*el*fin*de*confirmar*que*el*aumento*del*nivel*de*la*proteína*TRA2B*era*un*efecto*debido*al*mRNA* Serpine1,* se* generaron* células* NMuMG* Serpine1-/-) mediante* la* técnica* de* CRISPR/Cas9* (MM.1.2.10.2).*Se*utilizaron*para*ello*guías*de*RNA*distanciadas*entre*sí*aproximadamente*3*kb,*y* ubicadas*en*la*región*promotora*y*en*el*exón*2*del*gen*(Figura*R:87).* * Figura*R.86.*Niveles*de*expresión*de*Tra2b*en*células*NMuMG* tratadas* con* TGF- b .* A.*Expresión* relativa* del* mRNA* Tra2b)en* células* NMuMG* tratadas* con* TGF-b*a* los* tiempos* indicados.* Se* muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la* DE.*B.*Western)blot*de*la*proteína*TRA2B*en*células*NMuMG*tratadas* con*TGF-b*a*los*tiempos*indicados.*C.*Cuantificación*de*las*bandas* del*wester)blot*de*TRA2B*normalizada*con*la*proteína*total*cargada* en*el*pocillo*y*con*los*niveles*de*expresión*en*células*NMuMG*control* (tiempo*0).*KDa:*kilodaltons.* * RESULTADOS* * 109* La*deleción*se*comprobó*mediante*PCR*semicuantitativa*utilizando*primers)externos*al*a*deleción,*y* la*ausencia*del*mRNA*Serpine1*mediante*RT-qPCR*(Figura*R.88)* Los*niveles*de*proteína*TRA2B*no*se*inducían*en*células*deplecionadas*en*Serpine1)tratadas*con*TGF- b,*confirmando*que*la*regulación*postranscripcional*de*este*factor*de*splicing*está*mediada*por*el* mRNA*Serpine1*(Figura*R.89).* * * * Figura*R.87.*Ilustración*esquemática*del*sistema*de* CRISPR* utilizado* para* la* generación* de* células* NMuMG* Serpine1-/-.* Se* utilizaron* dos* guías* que* generaron* una* deleción* de* aproximadamente* 3* kb* entre*la*región*promotora*y*el*segundo*exón*del*gen* impidiendo*su*transcripción.*Kb:*kilobases.** Figura*R.88.*Análisis*clones*CRISPR*Serpine-/-.)A.)Se*muestra*una*imagen*representativa*de*los*productos*de*PCR*obtenidos.* Los*clones*2*y*6*son*homocigotos*para*la*deleción.*B.*Cuantificación*de*la*expresión*relativa*del*mRNA*Serpine1*en*los*clones* 2*y*6*mediante*RT-qPCR.*Se*muestra*la*media*de*triplicados;*las*barras*de*error*representan*la*DE.** RESULTADOS* * 110* 2.4.2.*MiR130b-5p*regula*los*niveles*de*la*proteína*TRA2B* Para*determinar*los*miRNAs*que*pudieran*interaccionar*con*el*mRNA*Serpine1*y*regular*la*expresión* postranscripcional*del*mRNA*Tra2b,*se*analizaron*los*resultados*obtenidos*del*experimento*de*iCLIP* de*AGO2,*referentes*a*los*sitios*de*crosslinking*detectados*en*el*mRNA*Serpine1,*tanto*en*condición* control*como*tras*el*tratamiento*con*TGF-b*durante*4*horas.* Se* obtuvieron* las* secuencias* correspondientes* a* cada* sitio* de* crosslinking,* extendiendo* 20* pb* upstream*y*20*pb*downstream*a*partir*del*sitio*de*crosslinking*(Figura*R.90).*Una*vez*determinadas* estas* secuencias,* se* seleccionaron* sólo* las*que* eran* específicas* tras* el* tratamiento* con* TGF-b;* considerando*como*tales*las*que*no*solapaban*con*las*de*la*condición*control*(el*solapamiento*de* sólo* 1* pb* se* consideró* secuencia* inespecífica),* obteniendo* un* total* de* 31* regiones* específicas* (ANEXO*INFORMÁTICO*2:*regiones_específicas_Serpine1_TGF-b4h).* Posteriormente,*se*determinaron*los*cores*o*seed)sequence)de*miRNAs*contenidos*en*las*secuencias* de*los*sitios*de*crosslinking.*Para*esta*búsqueda,*a*partir*de*las*secuencias*recogidas*en*la*base*de* datos* miRBase* (https://www.mirbase.org/),* se* determinaron* las* secuencias* reverso* complementarias* de* las* secuencias* core)de*todos* los*miRNAs*de* la* base* de* datos,* permutando* previamente*las*bases*de*uracilo*por*timina.* * Figura* R.90.* Generación* de* las* secuencias* de* los* sitios* de* crosslinking)de*Serpine1)para*buscar*los*cores*de*miRNAs.*SC:* sitio*de*crosslinking)* * Figura*R.89.*Los*niveles*de*proteína*TRA2B*no*se*afectan*en*células*NMuMG*Serpine1-/-*tratadas*con*TGF- b .*Western) blot) de* la* proteína* TRA2B* en* células* NMuMG* control* y* KO* tras* el* tratamiento* con* TGF-b*a* los* tiempos* indicados.* B.* Cuantificación*de*las*bandas*del*western) blot*normalizada*con*la* proteína*total*cargada*en*el*pocillo*y*con*los*niveles*de** expresión*de*células*NMuMG*control*y*KO*a*tiempo*0.*KDa:*kilodaltons.* RESULTADOS* * 111* Tras* el* análisis,* 189* cores*de* miRNAs* estaban* presentes,* al* menos* una* vez,* en* las* secuencias* correspondientes* a* los* sitios* de* crosslinking* (ANEXO* INFORMÁTICO* 2:* miRNAs_Serpine1).* A* continuación,* filtramos* estos* miRNAs*teniendo* en* cuenta* resultados* publicados* previamente* (Diepenbruck*et*al.,*2017),*que**identificaban,*mediante*RNAseq,*los*miRNAs*presentes*en*las*células* NMuMG.*Se*utilizó*un*criterio*de*abundancia*entendiendo*que*el*miRNA*fuera*lo*suficientemente* abundante*para*tener*un*efecto*funcional.*Para*ello,*tomamos*como*referencia*la*abundancia*de* miRNAs*para*los*que*se*había*demostrado*una*funcionalidad*en*células*NMuMG*y*en*EMT,*como*es* miR-1199-5p*(Diepenbruck*et*al.,*2017),*cuya*abundancia*era*de*aproximadamente*900*lecturas,*el* miR-200*(Korpal*et*al.,*2008),*que*según*la*familia*y*la*cadena,*oscilaba*entre*100*y*8000*lecturas,*o* el*miR-99b-3p*(Turcatel*et*al.,*2012)*,*que*presentaba*1845*lecturas.*Adicionalmente,*se*tuvo*en* cuenta*que*el*nivel* de*expresión*del* miRNA* fuera*adecuado*para*ser* secuestrado* por* el* mRNA* Serpine1)y*que*se*afectara*su*funcionalidad,*,*para*ello,*eliminamos*aquellos*miRNAs*que*presentaban* una*abundancia*por*encima*de*10000*lecturas,*ya*que*superarían*la*capacidad*máxima*de*secuestro* del*mRNA*Serpine1*y*reduciría*el*efecto*funcional*posterior*(Denzler*et*al.,*2014).*17*de*los*189* miRNAs*tenían*una*abundancia*entre*100*y*10000*lecturas:*miR-350-3p,*miR-7a-5p,*miR-149-5p,* miR-128-3p,*miR-30d-3p,*miR-185-5p,*miR-30a-3p,*miR-1943-5p,*miR-210-5p,*miR-30e-3p,*miR- 296-3p,* -miR-532-5p,* miR-130b-5p,* miR-30b-3p,* miR-331-3p,* miR-93-3p*y* miR-6539.* De* esta* manera,*con*el*riesgo*de*eliminar*algún*candidato*interesante,*descartamos*los*miRNAs*ausentes*o* mínimamente*repesentados*(<*100*lecturas)*y*los*muy*representados*(>10000*lecturas).* Mediante*la*base*de*datos*miRWalk*(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/),*se*determinó*cuáles* de* estos* 17*miRNAs* tenían*al*menos*un*MRE*en* las* regiones* 3’*UTR* y/o*CDS*de* Tra2b;*los*17* cumplían*esta*condición.* Finalmente,* teniendo* en* cuenta* el* criterio* de* abundancia,* el* número* de* MREs*(elemento* de* reconocimiento*de*miRNA)*presentes*en*el*mRNA*Serpine1*y*distintas*referencias*bibliográficas*que* acreditaban*una*posible*función*de*estos*miRNAs*en*EMT*(Bao*et*al.,*2020)*(He*et*al.,*2017)*(Li*et*al.,* 2020)*(Gao*et* al.,* 2019)*(Zhou* et* al.,* 2013)*(Liu* et* al.,* 2017)*(Song* et* al.,* 2020),* optamos* por* seleccionar*7*de*los*17*miRNAs:*miR-93-3p,*miR-130b-5p,*miR-296-3p,*miR-210-5p,*miR-30b-3p,* miR-128-3p,*miR-30/a/e/d-3p)*y*estudiar*si*afectaban*a*la*regulación*postranscripcional*de*Tra2b.* La* estrategia* consistió* en* mutar* los* MREs*de*estos* miRNAs* en* el* mRNA* Serpine1*(en* el* que* previamente*habían*sido*mutados*los*4*ATGs,*imposibilitando*su*traducción),*impidiendo*la*unión* miRNA-mRNA,*y,*posteriormente,*analizar*el*efecto*sobre*los*niveles*de*proteína*TRA2B.** * miRNA* Localización*en*el*mRNA* Serpine1* miR-93-3p* Exón*2* miR-130b-5p*(1)* Exón*3* miR-296-3p* Exón*6* RESULTADOS* * 112* miRNA* Localización*en*el*mRNA* Serpine1* miR-210-5p* Exón*7* miR-130b-5p*(2)* Región*3’*UTR* miR-30b-3p* Región*3’*UTR* miR-128-3p* Región*3’*UTR* miR-130b-5p*(3)* Región*3’*UTR* miR-30/a/e/d-3p* Región*3’*UTR*(comparten*el* mismo*core)* * Tabla*R.6.*Relación*de*los*MRES*mutados*en*el*mRNA*Serpine1*y*su*localización.*Se*indica*el*nombre*del*miRNA*y*su* localización*en*el*mRNA*Serpine1.*UTR:*Untranslated)region.)* * Para*llevar*a*cabo*la*mutagénesis*se*utilizó*el*kit*QuikChange) Multi) Site-Directed)Mutagenesis)Kit) (MM.2.14),)y*se*generaron*tres*plásmidos*diferentes:*1)*plásmido*que*contenía*el*gen*Serpine1*con* los*MREs*localizados*en*los*exones*mutados*(miR-93-3p,*miR-130b-5p*(2),*miR-296-3p,*y*miR-210- 5p)*(pSINDUAL-Serpine1ATG*Ex*),*2)*plásmido*que*contenía*el*gen*Serpine1*con*los*MRE*localizados* en*la*región*3’UTR*mutados*(miR-130b-5p*(2),*miR-30b-3p,*miR-128-3p,*miR-130b-5p*(3)*y*miR- 30/a/e/d-3p)*(pSINDUAL-Serpine1ATG*3’UTR*)*y* 3)* plásmido* que*contenía*el* gen*Serpine1*con* todos*los*MREs*mutados*(pSINDUAL-Serpine1ATG*Total*).*Estas*mutaciones*se*hicieron*sobre*el* plásmido*pMA-T.*Las*mutaciones*se*diseñaron*de*forma*que,*al*modificar*el*MRE*del*miRNA*de* estudio,* se* introducía*un* sitio* de*corte*para* una* enzima* de* restricción* que* permitía,* mediante* digestión*enzimática,*comprobar*la*mutagénesis.* * miRNA* MRE* Mutación* Enzima*de*restricción*a*utilizar* miR-93-3p* tcagcag* tcTAGag* Xba1* miR-130b-5p*(1)* gaaagag* gaaTTcg* EcoR1* miR-296-3p* caaccct* cATcGAt* Cla1* miR-210-5p* cagtggc* cTCGAgc* Xho1* miR-130b-5p*(2)* gaaagag* gaaTTCg* EcoR1* mir-30b-3p* catccca* GatATca* Kpn1* miR-128-3p* cactgtg* cTcGAGg* Xho1* mir-130b-5p*(3)* gaaagag* gaaTTCg* EcoR1* miR-30a/e/d-3p* actgaaa* TctAGaa* Xba1* * Tabla*R.7.*Se*indica*el*miRNA*afectado,*el*MRE*mutado,*la*mutación*producida,*el*sitio*de*restricción*creado*y*la* enzima*correspondiente.* RESULTADOS* * 113* De* esta* forma,* tras* el* proceso* de*mutagénesis,* los* plásmidos* de* las* colonias* transformantes* correspondientes*se*analizaron*con*las*diferentes*enzimas*para*verificar*si*incluían*o*no*la*mutación* correspondiente.* Los*plásmidos*que*contenían*las*mutaciones*de*los*MREs*localizados*en*exones*se*digirieron*con*las* enzimas*Xba1,*EcoR1,*Cla1*y*Xho1*(Figura*R.91).* Según*los*patrones*obtenidos,*el*plásmido*de*la*colonia*1,*presentaría*sitios*de*corte*para*las*enzimas* Xba1*y*Cla1,*es*decir,*se*habría*mutado*los*MREs*de*los*miR-93-3p*y*miR-296-3p.*Los*plásmidos*de* las*colonias*2*y*4*para*las*enzimas*EcoR1*y*Xba1,*es*decir,*se*habrían*mutado*los*MREs*de*los*miR- 130b-5p*(1)*y*miR-93-3p,*y*el*plásmido*de*la*colonia*3*presentaría*sitios*de*corte*para*Xho1*y*Xba1,* y,*por*tanto,*se*habrían*mutado*los*MREs*de*miR-210-5p*y*miR-93-3p*(Figura*R.92).** * * * Figura*R.92.*Ilustración*esquemática*del*patrón*de* restricción*obtenido*al*digerir*con*las*enzimas*de* restricción*indicadas.* * Figura*R.91.*Gel*representativo*del*patrón*de*restricción* de*los*plásmidos*con*mutaciones*en*los*MREs*localizados* en*los*exones*tras*digerir*con*las*enzimas*Xba1,*EcoR1,* Cla1*y*Xho1.*Kb:kilobases.* RESULTADOS* * 114* Los* plásmidos* se* secuenciaron*con* primers) específicos* para* confirmar* inequívocamente* las* mutaciones*generadas.*Las*secuencias*de*los*plásmidos*de*las*colonias*1*y*3*confirmaban*el*patrón* de*restricción*obtenido;*sin*embargo,*los*plásmidos*de*las*colonias*2*y*4*además*incluían*la*mutación* en*el*MRE*del*miR-210-5p,*que*introduce*el*sitio*de*corte*para*la*enzim*Xho1*(Figura*R.93).** Debido* a* que* ninguno* de* los* plásmidos* analizados* contenía* las* mutaciones* de* los* 4* MREs,* se* seleccionó*la*colonia*2*(ya*que,*junto*con*la*4,*era*la*que*presentaba*un*número*mayor*de*mutaciones)* y*se*repitió*el*proceso*de*mutagénesis*para*el*MRE*del*miR-296-3p.* Algunos*de*los*transformantes*obtenidos*fueron*analizados*mediante*digestión*con*la*enzima*Cla1,* que*tendría*que*linealizar*el*plásmido*(Figura*R.94).* Para*la*generación*del*plásmido*que*contenía*las*mutaciones*en*los*MREs*localizados*en*la*región*3’* UTR,*se*procedió*de*la*misma*forma.*Tras*la*mutagénesis,*los*plásmidos*se*analizaron*con*las*enzimas* de*restricción*correspondientes*y*se*confirmaron*mediante*secuenciación.*Primero,*se*digirió*con*las* enzimas*EcoR1*y*Xho1*(Figura*R.95).* * Figura*R.93.*Ilustración*esquemática*del*patrón*de*restricción*obtenido*al*digerir* con*las*enzimas*indicadas.** * Figura*R.94.*Gel*representativo*del*patrón*de*restricción*obtenido* tras*digerir*con*la*enzima*Cla1.*Kb:*kilobases.* RESULTADOS* * 115* Según*el*patrón*obtenido,*las*colonias*que*contendrían*plásmidos*con*los*MREs*de*los*miRNAs*130b- 5p* (2),* 130b-5p* (3)* y* 128-3p*mutados*y,* por* tanto,* habría* incorporado* los* tres*sitios*de* corte* correspondientes*para*estas*enzimas*(2*para*la*enzima*EcoR1*y*1*para*la*enzima*Xho1)*generarían* un*patrón*de*4*bandas*de*0,3*Kb,*0,6*Kb,*1*Kb*y*3,5*Kb*(Figura*R.96).* ) * * * Por*lo*tanto,*los*plásmidos*de*las*colonias*5,6,*7,*9*y*15*contendrían*las*mutaciones*deseadas.*Estos* plásmidos*se*digirieron*con*la*enzima*Xba1*para*confirmar*la*mutación*en*el*MRE*del*miR-30a/e/d- 3p,*que*linealizaría*el*plásmido.*Los*plásmidos*de*las*colonias*5,*7,*9*y*15*contendrían*también*esta* mutación*(Figura*R:97).* * Figura*R.95.)Gel*representativo*del*patrón*de*restricción*de*los*plásmidos*con*mutaciones*en*los*MREs*localizados* en*la*región*3’*UTR*tras*digerir*con*las*enzimas*EcoR1*y*Xho1.*Kb:*kilobases.) * Figura*R.96.*Ilustración*esquemática*del*patrón*de*restricción*obtenido*al* digerir*con*las*enzimas*indicadas.) RESULTADOS* * 116* Por*último,*la*mutación*para*el*miRNA-30b-3p*se*confirmó*mediante*la*digestión*con*la*enzima*Kpn1.* Al*menos*los*plásmidos*de*la*colonia*9*contendrían*esta*mutación,*dando*lugar*su*digestión*con*Kpn1* 2*fragmentos*de*4*Kb*y*1,4*kb*aproximadamente*(Figura*R.98).* Para*la*obtención*del*plásmido*que*contenía*todas*las*mutaciones,*tanto*en*exones*como*en*la*región* 3’*UTR,*se*utilizó*como*plásmido*de*partida*el*que*incluía*las*mutaciones*en*la*región*3’*UTR*y*sobre* ése* se* realizaron* las* mutaciones* correspondientes* a*los* miRNAs* localizados* en* los* exones.*Los* transformantes* fueron* comprobados* con* las* enzimas* de* restricción* correspondientes* y* por* secuenciación.* Una*vez*obtenidas*las*tres*construcciones*y*confirmadas*las*mutaciones,*se*clonaron*los*insertos*de* Serpine1*en*el*plásmido*lentiviral*pSINDUAL*utilizando*para*ello*los*sitios*de*restricción*BamH1*y* Not1*presentes*desde*el*inicio.*Tras*el*aislamiento*del*plásmido*y*los*tres*insertos*con*las*distintas* mutaciones,*se*ligó,*se*transformó*y*las*colonias*resultantes*fueron*analizadas*mediante*restricción* de*las*enzimas*BamH1*y*Not1.* * * Figura*R.97.*Gel*representativo*del*patrón*de*restricción*de* los*plásmidos*con*mutaciones*en*los*MREs*localizados*en*la* región*3’*UTR*tras*digerir*con*la*enzima*XbaI.*Kb:*kilobases* * Figura*R.98.*Patrón*de*restricción*de*la*digestión*con* Kpn1*de*los*plásmidos*con*mutaciones*en*los*MREs* localizados*en*la*región*3’*UTR.*A.*Gel*representativo*del* patrón*de*restricción*obtenido.*B.*Ilustración*esquemática* del*patrón*de*restricción.* RESULTADOS* * 117* Posteriormente,* se* obtuvieron* partículas* lentivirales* con* cada* una* de* las* construcciones* y* se* infectaron*las*células*NMuMG*a*MOI=2,*consiguiéndose*una*sobreexpresión*de*7*veces*del*mRNA* Serpine1*de*cada*una*de*las*construcciones.* La*sobreexpresión*de*cada*una*de*las*tres*construcciones*con*las*diferentes*mutaciones*afectaba*los* niveles*de*proteína*TRA2B,*indicando*que*uno*o*más*miRNAs*correspondientes*a*los*MREs*mutados,* estaban*implicados*en*la*regulación*del*factor*de*splicing*TRA2B.)(Figura*R.99).* A*continuación,*se*analizó*si*el*miR130b-5p*tenía*un*efecto*sobre*la*regulación*postranscripcional*de* Tra2b.*Este*miRNA,*según*los*datos*obtenidos*en*el*iCLIP*de*AGO2,*presenta*tres*sitios*de*unión*en* el*mRNA*Serpine1)(uno*en*el*exón*3*y*dos*en*la*región*3’*UTR)*(Figura*R.100).* * Figura*R.99.*Niveles*de*proteína*TRA2B*en*células*NMuMG*sobreexpresando*el*mRNA*Serpine1*silvestre*(mutado*en* los*ATGs)*o*mutado*(además)*en*los*distintos*MREs.*A.*Western)blot*de*la*proteína*TRA2B*sobreexpresando*el*plásmido* pSINDUAL*religante*(control),*el*mRNA*Serpine1*silvestre*o*el*mRNA*Serpine1*mutado*en*los*MREs*de*los*distintos*miRNAs.* KDa:*kilodaltons.*B.*Cuantificación*de*las*bandas*del*western)blot*normalizada*con*la*proteína*total*cargada*en*el*pocillo*y*con* los*niveles*de*TRA2B*en*células*NMuMG*control.* * Figura* R.100.)Alineamiento* de*los* MREs* del* miR-130b-5p*en*el*mRNA*Serpine1)con*el*core* del*miRNA.*UTR:*Untranslated)region.) BIBLIOGRAFÍA* * 212* Hahn-Dantona,*E.,*Ramos-DeSimone,*N.,*Sipley,*J.,*Nagase,*H.,*French,*D.*L.,*&*Quigley,*J.*P.*(1999).* Activation*of*ProMMP-9*by*a*plasmin/MMP3*cascade*in*a*tumor*cell*model.*Regulation*by* tissue*inhibitors*of*metalloproteinases.*Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences,*878,*372– 387.*https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1999.tb07696.x* Halbleib,*J.*M.,*&*Nelson,*W.*J.*(2006).*Cadherins*in*development:*Cell*adhesion,*sorting,*and*tissue* morphogenesis.* Genes+ and+ Development,* 20(23),* 3199–3214.* https://doi.org/10.1101/gad.1486806* Hartsock,* A.,* &* Nelson,* W.* J.* (2008).* Adherens* and* tight* junctions:* Structure,* function* and* connections*to*the*actin*cytoskeleton.*Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes,*1778(3),* 660–669.*https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2007.07.012* Hayes,*J.,*Peruzzi,*P.*P.,*&*Lawler,*S.*(2014).*MicroRNAs*in*cancer:*Biomarkers,*functions*and*therapy.* Trends+in+Molecular+Medicine,*20(8),*460–469.*https://doi.org/10.1016/j.molmed.2014.06.005* He,*L.,*He,*X.,*Lim,*L.*P.,*De*Stanchina,*E.,*Xuan,*Z.,*Liang,*Y.,*Xue,*W.,*Zender,*L.,*Magnus,*J.,*Ridzon,*D.,* Jackson,*A.*L.,*Linsley,*P.* S.,* Chen,*C.,*Lowe,*S.*W.,*Cleary,*M.*A.,* &*Hannon,*G.* J.* (2007).*A* microRNA*component*of*the*p53*tumour*suppressor*network.*Nature,*447(7148),*1130–1134.* https://doi.org/10.1038/nature05939* He,*Z.,*Yu,*L.,*Luo,*S.,*Li,*M.,*Li,*J.,*Li,*Q.,*Sun,*Y.,*&*Wang,*C.*(2017).*miR-296*inhibits*the*metastasis*and* epithelial-mesenchymal*transition*of*colorectal*cancer*by*targeting*S100A4.*BMC+Cancer,*17(1),* 1–10.*https://doi.org/10.1186/s12885-017-3121-z* Hekman,*C.*M.,*&*Loskutoff,*D.*J.*(1985).*Endothelial*cells*produce*a*latent*inhibitor*of*plasminogen* activators* that* can* be* activated* by* denaturants.* Journal+ of+ Biological+ Chemistry,* 260(21),* 11581–11587.*https://doi.org/10.1016/s0021-9258(17)39071-3* Hennan,*J.*K.,*Morgan,*G.*A.,*Swillo,*R.*E.,*Antrilli,*T.*M.,*Mugford,*C.,*Vlasuk,*G.*P.,*Gardell,*S.*J.,*&* Crandall,*D.*L.*(2008).*Effect*of*tiplaxtinin*(PAI-039),*an*orally*bioavailable*PAI-1*antagonist,*in* a* rat* model* of* thrombosis.* Journal+ of+ Thrombosis+ and+ Haemostasis,* 6(9),* 1558–1564.* https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2008.03063.x* Herbert,*K.*M.,*Pimienta,*G.,*DeGregorio,*S.*J.,*Alexandrov,*A.,*&*Steitz,*J.*A.*(2013).*Phosphorylation*of* DGCR8* Increases* Its* Intracellular* Stability* and* Induces* a* Progrowth* miRNA* Profile.* Cell+ Reports,*5(4),*1070–1081.*https://doi.org/10.1016/j.celrep.2013.10.017* Herranz,*N.,*Pasini,*D.,*Díaz,*V.*M.,*Francí,*C.,*Gutierrez,*A.,*Dave,*N.,*Escrivà,*M.,*Hernandez-Muñoz,*I.,* Di*Croce,*L.,* Helin,* K.,* García* de* Herreros,* A.,* &* Peiró,*S.* (2008).* * Polycomb* Complex* 2*Is* Required*for*E-cadherin*Repression*by*the*Snail1*Transcription*Factor*.*Molecular+and+Cellular+ Biology,*28(15),*4772–4781.*https://doi.org/10.1128/mcb.00323-08* Hirahata,*M.,*Osaki,*M.,*Kanda,*Y.,*Sugimoto,*Y.,*Yoshioka,*Y.,*Kosaka,*N.,*Takeshita,*F.,*Fujiwara,*T.,* Kawai,*A.,*Ito,*H.,*Ochiya,*T.,*&*Okada,*F.*(2016).*PAI-1,*a*target*gene*of*miR-143,*regulates* invasion*and*metastasis*by*upregulating*MMP-13*expression*of*human*osteosarcoma.*Cancer+ BIBLIOGRAFÍA* * 213* Medicine,*5(5),*892–902.*https://doi.org/10.1002/cam4.651* Hirata,*H.,*Hinoda,*Y.,*Shahryari,*V.,*Deng,*G.,*Nakajima,*K.,*Tabatabai,*Z.*L.,*Ishii,*N.,*&*Dahiya,*R.* (2015).*Long*noncoding*RNA*MALAT1*promotes*aggressive*renal*cell*carcinoma*through*Ezh2* and* interacts* with* miR-205.* Cancer+ Research,* 75(7),* 1322–1331.* https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-2931* Hua,* W.,* ten* Dijke,* P.,* Kostidis,* S.,* Giera,* M.,* &* Hornsveld,* M.* (2020).* TGFβ-induced* metabolic* reprogramming*during*epithelial-to-mesenchymal*transition*in*cancer.*Cellular+and+Molecular+ Life+Sciences,*77(11),*2103–2123.*https://doi.org/10.1007/s00018-019-03398-6* Huang,*R.*Y.*J.,*Guilford,*P.,*&*Thiery,*J.*P.*(2012).*Early*events*in*cell*adhesion*and*polarity*during* epithelialmesenchymal* transition.* Journal+ of+ Cell+ Science,* 125(19),* 4417–4422.* https://doi.org/10.1242/jcs.099697* Hung,*T.,*Wang,*Y.,*Lin,*M.*F.,*Koegel,*A.*K.,*Kotake,*Y.,*Grant,*G.*D.,*Horlings,*H.*M.,*Shah,*N.,*Umbricht,* C.,*Wang,*P.,*Wang,*Y.,*Kong,*B.,*Langerød,*A.,*Kim,*S.*K.,*Vijver,*M.*Van*De,*&*Sukumar,*S.*(2011).* Articles* Extensive* and* coordinated* transcription* of* noncoding* RNAs* within* cell-cycle* promoters.*Nature+Publishing+Group,*43(7).*https://doi.org/10.1038/ng.848* Huppertz,*I.,*Attig,*J.,*D’Ambrogio,*A.,*Easton,*L.*E.,*Sibley,*C.*R.,*Sugimoto,*Y.,*Tajnik,*M.,*König,*J.,*&*Ule,* J.*(2014).*iCLIP:*Protein-RNA*interactions*at*nucleotide*resolution.*Methods,*65(3),*274–287.* https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2013.10.011* Jang,*S.*R.,*Nelson,*J.*C.,*Bend,*E.*G.,*Rodríguez-Laureano,*L.,*Tueros,*F.*G.,*Cartagenova,*L.,*Underwood,* K.,*Jorgensen,*E.*M.,*&*Colón-Ramos,*D.*A.*(2016).*Glycolytic*Enzymes*Localize*to*Synapses* under* Energy* Stress* to* Support* Synaptic* Function.* Neuron,* 90(2),* 278–291.* https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.03.011* Jones,*J.*C.*R.,*Kam,*C.*Y.,*Harmon,*R.*M.,*Woychek,*A.*V.,*Hopkinson,*S.*B.,*&*Green,*K.*J.*(2017).* Intermediate*filaments*and*the*plasma*membrane.*Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology,* 9(1).*https://doi.org/10.1101/cshperspect.a025866* Kang,*H.,*Kim,*H.,*Lee,*S.,*Youn,*H.,*&*Youn,*B.*(2019).*Role*of*metabolic*reprogramming*in*epithelial– mesenchymal* transition* (EMT).* International+ Journal+ of+ Molecular+ Sciences,* 20(8).* https://doi.org/10.3390/ijms20082042* Kavsak,*P.,*Rasmussen,*R.*K.,*Causing,*C.*G.,*Bonni,*S.,*Zhu,*H.,*Thomsen,*G.*H.,*&*Wrana,*J.*L.*(2000).* Smad7*Binds*to*Smurf2*to*Form*an*E3*Ubiquitin*Ligase*that*Targets*the*TGFβ*Receptor* for* Degradation.* Molecular+ Cell,* 6(6),* 1365–1375.* https://doi.org/10.1016/S1097- 2765(00)00134-9* Kim,* D.* H.,* Xi,* Y.,* &* Sung,* S.* (2017).* Modular* function* of* long* noncoding* RNA,* COLDAIR,* in* the* vernalization* response.* PLoS+ Genetics,* 13(7),* 1–18.* https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006939* Kino,*M.,*Hur,*D.*E.,*Ichijo,*T.,*Nader,*N.,*&*Chrousos,*G.*P.*(2010).*Kino*T,*Hurt*D*E,*Ichijo*T,*et*al.* BIBLIOGRAFÍA* * 214* Noncoding* RNA* gas5* is* a* growth* arrest-* and* starvation-associated* repressor* of* the* glucocorticoid*receptor.[J].*Science*Signaling,*2010,*3(107):ra8.*Science+Signalling,*3(107),*1– 16.*https://doi.org/10.1126/scisignal.2000568.Noncoding* Knights,*A.*J.,*Funnell,*A.*P.*W.,*Crossley,*M.,*&*Pearson,*R.*C.*M.*(2012).*Holding*Tight:*Cell*Junctions* and* Cancer* Spread.* Trends+ in+ Cancer+ Research,* 8(February* 2015),* 61–69.* http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23450077%0Ahttp://www.pubmedcentral.nih.gov/a rticlerender.fcgi?artid=PMC3582402* Kochanowski,*K.,*Gerosa,*L.,*Brunner,*S.*F.,*Christodoulou,*D.,*Nikolaev,*Y.*V,*&*Sauer,*U.*(2017).**Few* regulatory*metabolites*coordinate*expression*of*central*metabolic*genes*in*Escherichia*coli*.* Molecular+Systems+Biology,*13(1),*903.*https://doi.org/10.15252/msb.20167402* Koenig,*A.,*Mueller,*C.,*Hasel,*C.,*Adler,*G.,*&*Menke,*A.*(2006).*Collagen*type*I*induces*disruption*of* E-cadherin-mediated* cell-cell* contacts* and* promotes* proliferation* of* pancreatic* carcinoma* cells.*Cancer+Research,*66(9),*4662–4671.*https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-05-2804* Kolligs,*F.*T.,*Kolligs,*B.,*Hajra,*K.*M.,*Gang,*H.,*Tani,*M.,*Kathleen*R,*C.,*&*Fearon,*E.*R.*(2000).*γ-Catenin* is*regulated*by*the*APC*tumor*suppressor*and*its*oncogenic*activity*is*distinct*from*that*of*β- catenin.*Genes+and+Development,*14(11),*1319–1331.*https://doi.org/10.1101/gad.14.11.1319* Konermann,*S.,*Brigham,*M.*D.,*Trevino,*A.*E.,*Joung,*J.,*Abudayyeh,*O.*O.,*Barcena,*C.,*Hsu,*P.*D.,*Habib,* N.,*Gootenberg,*J.*S.,*Nishimasu,*H.,*Nureki,*O.,*&*Zhang,*F.*(2015).*Genome-scale*transcriptional* activation* by* an* engineered* CRISPR-Cas9* complex.* Nature,* 517(7536),* 583–588.* https://doi.org/10.1038/nature14136* Kong,*W.,*Yang,*H.,*He,*L.,*Zhao,*J.,*Coppola,*D.,*Dalton,*W.*S.,*&*Cheng,*J.*Q.*(2008).*MicroRNA-155*Is* Regulated*by*the*Transforming*Growth*Factor*β/Smad*Pathway*and*Contributes*to*Epithelial* Cell* Plasticity* by* Targeting* RhoA.* Molecular+ and+ Cellular+ Biology,* 28(22),* 6773–6784.* https://doi.org/10.1128/mcb.00941-08* Korpal,*M.,*Lee,*E.*S.,*Hu,*G.,*&*Kang,*Y.*(2008).*The*miR-200*family*inhibits*epithelial-mesenchymal* transition*and*cancer*cell*migration*by*direct*targeting*of*E-cadherin*transcriptional*repressors* ZEB1* and* ZEB2.* Journal+ of+ Biological+ Chemistry,* 283(22),* 14910–14914.* https://doi.org/10.1074/jbc.C800074200* Krakau,* S.,* Richard,* H.,* &* Marsico,* A.* (2017).* PureCLIP:* Capturing* target-specific* protein-RNA* interaction* footprints* from* single-nucleotide* CLIP-seq* data.* Genome+ Biology,* 18(1),* 1–17.* https://doi.org/10.1186/s13059-017-1364-2* Krol,*J.,*Loedige,*I.,*&*Filipowicz,*W.*(2010).*The*widespread*regulation*of*microRNA*biogenesis,* function* and* decay.* Nature+ Reviews+ Genetics,* 11(9),* 597–610.* https://doi.org/10.1038/nrg2843* Krützfeldt,*J.,*Rajewsky,*N.,*Braich,*R.,*Rajeev,*K.*G.,*Tuschl,*T.,*Manoharan,*M.,*&*Stoffel,*M.*(2005).* Silencing* of* microRNAs* in* vivo* with* “antagomirs.”* Nature,* 438(7068),* 685–689.* BIBLIOGRAFÍA* * 215* https://doi.org/10.1038/nature04303* Kuo,*T.*C.,*Chen,*C.*K.,*Hua,*K.*T.,*Yu,*P.,*Lee,*W.*J.,*Chen,*M.*W.,*Jeng,*Y.*M.,*Chien,*M.*H.,*Kuo,*K.*T.,*Hsiao,* M.,* &* Kuo,* M.* L.*(2016).*Glutaminase*2*stabilizes*Dicer*to* repress*Snail*and*metastasis*in* hepatocellular* carcinoma* cells.* Cancer+ Letters,* 383(2),* 282–294.* https://doi.org/10.1016/j.canlet.2016.10.012* Lamers,* M.* M.,* van* den* Hoogen,* B.* G.,* &* Haagmans,* B.* L.* (2019).* ADAR1:* “Editor-in-Chief”* of* Cytoplasmic* Innate* Immunity.* Frontiers+ in+ Immunology,* 10(July),* 1763.* https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01763* Landry,* J.* R.,* Mager,* D.* L.,* &* Wilhelm,* B.* T.* (2003).* Complex* controls:* The* role* of* alternative* promoters* in* mammalian* genomes.* Trends+ in+ Genetics,* 19(11),* 640–648.* https://doi.org/10.1016/j.tig.2003.09.014* Lao,*T.*D.,*&*Le,*T.*A.*(2020).*MicroRNAs:*Biogenesis,*Functions*and*Potential*Biomarkers*for*Early* Screening,*Prognosis*and*Therapeutic*Molecular*Monitoring*of*Nasopharyngeal*Carcinoma.*In* Processes+*(Vol.*8,*Issue*8).*https://doi.org/10.3390/pr8080966* Lee,*S.,*Kopp,*F.,*Chang,*T.*C.,*Sataluri,*A.,*Chen,*B.,*Sivakumar,*S.,*Yu,*H.,*Xie,*Y.,*&*Mendell,*J.*T.*(2016).* Noncoding*RNA*NORAD*Regulates*Genomic*Stability*by*Sequestering*PUMILIO*Proteins.*Cell,* 164(1–2),*69–80.*https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.12.017* Li,*C.,*Zhao,*Z.,*Zhou,*Z.,*&*Liu,*R.*(2016).*PKM2*Promotes*Cell*Survival*and*Invasion*Under*Metabolic* Stress*by*Enhancing*Warburg*Effect*in*Pancreatic*Ductal*Adenocarcinoma.*Digestive+Diseases+ and+Sciences,*61(3),*767–773.*https://doi.org/10.1007/s10620-015-3931-2* Li,*G.*Y.,*Wang,*W.,*Sun,*J.*Y.,*Xin,*B.,*Zhang,*X.,*Wang,*T.,*Zhang,*Q.*F.,*Yao,*L.*B.,*Han,*H.,*Fan,*D.*M.,*Yang,* A.*G.,*Jia,*L.*T.,*&*Wang,*L.*(2018).*Long*non-coding*RNAs*AC026904.1*and*UCA1:*A*“one-two* punch”*for*TGF-β-induced*SNAI2*activation*and*epithelial-mesenchymal*transition*in*breast* cancer.*Theranostics,*8(10),*2846–2861.*https://doi.org/10.7150/thno.23463* Li,*Tao,*Xie,*J.,*Shen,*C.,*Cheng,*D.,*Shi,*Y.,*Wu,*Z.,*Deng,*X.,*Chen,*H.,*Shen,*B.,*Peng,*C.,*Li,*H.,*Zhan,*Q.,*&* Zhu,* Z.* (2015).* Amplification* of* long* noncoding* RNA* ZFAS1* promotes* metastasis* in* hepatocellular* carcinoma.* Cancer+ Research,* 75(15),* 3181–3191.* https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-3721* Li,*Ting,*Meng,*X.*ling,*&*Yang,*W.*qi.*(2017).*Long*Noncoding*RNA*PVT1*Acts*as*a*“Sponge”*to*Inhibit* microRNA-152* in*Gastric* Cancer*Cells.* Digestive+ Diseases+ and+ Sciences,*62(11),* 3021–3028.* https://doi.org/10.1007/s10620-017-4508-z* Li,*W.,*Zhang,*Z.,*Liu,*X.,*Cheng,*X.,*Zhang,*Y.,*Han,*X.,*Zhang,*Y.,*Liu,*S.,*Yang,*J.,*Xu,*B.,*He,*L.,*Sun,*L.,* Liang,* J.,* &* Shang,* Y.* (2017).* The* FOXN3-NEAT1-SIN3A* repressor* complex* promotes* progression*of*hormonally*responsive*breast*cancer.*Journal+of+Clinical+Investigation,*127(9),* 3421–3440.*https://doi.org/10.1172/JCI94233* Li,*X.,*Zhang,*Z.,*Zhang,*Y.,*Cao,*Y.,*Wei,*H.,*&*Wu,*Z.*(2018).*Upregulation*of*lactate-inducible*snail* BIBLIOGRAFÍA* * 216* protein*suppresses*oncogene-mediated*senescence*through*p16*INK4a*inactivation.*Journal+of+ Experimental+and+Clinical+Cancer+Research,*37(1),*1–13.*https://doi.org/10.1186/s13046-018- 0701-y* Li,*Y.,*Zhou,*J.,*Wang,*J.,*Chen,*X.,*Zhu,*Y.,*&*Chen,*Y.*(2020).*Mir-30b-3p*affects*the*migration*and* invasion*function*of*ovarian*cancer*cells*by*targeting*the*CTHRC1*gene.*Biological+Research,* 53(1),*1–8.*https://doi.org/10.1186/s40659-020-00277-4* Liddicoat,*B.*J.,*Chalk,*A.*M.,*&*Walkley,*C.*R.*(2016).*ADAR1,*inosine*and*the*immune*sensing*system:* Distinguishing* self* from* non-self.* Wiley+ Interdisciplinary+ Reviews:+ RNA,* 7(2),* 157–172.* https://doi.org/10.1002/wrna.1322* Lin,* C.,* Wang,* Y.,* Wang,* Y.,* Zhang,* S.,* Yu,* L.,* Guo,* C.,* &* Xu,* H.* (2017).* Transcriptional* and* posttranscriptional* regulation* of* HOXA13* by* lncRNA* HOTTIP*facilitates* tumorigenesis*and* metastasis* in* esophageal* squamous* carcinoma* cells.* Oncogene,* 36(38),* 5392–5406.* https://doi.org/10.1038/onc.2017.133* Lin,*T.,*Ponn,*A.,*Hu,*X.,*Law,*B.*K.,*&*Lu,*J.*(2010).*Requirement*of*the*histone*demethylase*LSD1*in* Snai1-mediated* transcriptional* repression* during* epithelial-mesenchymal* transition.* Oncogene,*29(35),*4896–4904.*https://doi.org/10.1038/onc.2010.234* Lin,*Y.,*Schmidt,*B.*F.,*Bruchez,*M.*P.,*&*McManus,*C.*J.*(2018).*Structural*analyses*of*NEAT1*lncRNAs* suggest*long-range*RNA*interactions*that*may*contribute*to*paraspeckle*architecture.*Nucleic+ Acids+Research,*46(7),*3742–3752.*https://doi.org/10.1093/nar/gky046* Liu,*M.*M.,*Li,*Z.,*Han,*X.*D.,*Shi,*J.*H.,*Tu,*D.*Y.,*Song,*W.,*Zhang,*J.,*Qiu,*X.*L.,*Ren,*Y.,*&*Zhen,*L.*L.*(2017).* MiR-30e* inhibits* tumor* growth* and* chemoresistance* via* targeting* IRS1* in* Breast* Cancer.* Scientific+Reports,*7(1),*1–10.*https://doi.org/10.1038/s41598-017-16175-x* Liu,*Y.*W.,*Sun,*M.,*Xia,*R.,*Zhang,*E.*B.,*Liu,*X.*H.,*Zhang,*Z.*H.,*Xu,*T.*P.,*De,*W.,*Liu,*B.*R.,*&*Wang,*Z.*X.* (2015).* LincHOTAIR* epigenetically* silences* miR34a* by* binding* to* PRC2* to* promote* the* epithelial-to-mesenchymal*transition*in*human*gastric*cancer.*Cell+Death+and+Disease,*6,*1–9.* https://doi.org/10.1038/cddis.2015.150* Lo,* S.* H.* (2006).* Focal* adhesions:* What’s*new* inside.* Developmental+ Biology,* 294(2),* 280–291.* https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2006.03.029* Lodish,*H.*F.,*Zhou,*B.,*Liu,*G.,*&*Chen,*C.*Z.*(2008).*Micromanagement*of*the*immune*system*by* microRNAs*(Nature*Reviews*Immunology*(2008)*8,*(120-130)).*Nature+Reviews+Immunology,* 8(3),*238.*https://doi.org/10.1038/nri2280* Lu,*Z.,*Li,*Y.,*Che,*Y.,*Huang,*J.,*Sun,*S.,*Mao,*S.,*Lei,*Y.,*Li,*N.,*Sun,*N.,*&*He,*J.*(2018).*The*TGFβ-induced* lncRNA*TBILA*promotes*non-small*cell*lung*cancer*progression*in*vitro*and*in*vivo*via*cis- regulating* HGAL* and* activating* S100A7/JAB1* signaling.* Cancer+ Letters,* 432(17),* 156–168.* https://doi.org/10.1016/j.canlet.2018.06.013* Lund,*E.*G.,*Duband-goulet,*I.,*Oldenburg,*A.,*Buendia,*B.,*Lund,*E.*G.,*Duband-goulet,*I.,*Oldenburg,*A.,* BIBLIOGRAFÍA* * 217* Buendia,*B.,*&*Collas,*P.*(2015).*Distinct+ features+ of+ lamin+ A-interacting+ chromatin+ domains+ mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin+Distinct+ features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+ or+micrococc.*1034.*https://doi.org/10.4161/19491034.2014.990855* Ma,*L.,*Young,*J.,*Prabhala,*H.,*Pan,*E.,*Mestdagh,*P.,*Muth,*D.,*Teruya-Feldstein,*J.,*Reinhardt,*F.,*Onder,* T.*T.,*Valastyan,*S.,*Westermann,*F.,*Speleman,*F.,*Vandesompele,*J.,*&*Weinberg,*R.*A.*(2010).* MiR-9,*a*MYC/MYCN-activated*microRNA,*regulates*E-cadherin*and*cancer*metastasis.*Nature+ Cell+Biology,*12(3),*247–256.*https://doi.org/10.1038/ncb2024* Macheda,* M.* L.,* Rogers,* S.,* &* Best,* J.* D.* (2005).* Molecular* and* cellular* regulation* of* glucose* transporter* (GLUT)* proteins* in* cancer.* Journal+ of+ Cellular+ Physiology,* 202(3),* 654–662.* https://doi.org/10.1002/jcp.20166* Maeda,*M.,*Johnson,*E.,*Mandal,*S.*H.,*Lawson,*K.*R.,*Keim,*S.*A.,*Svoboda,*R.*A.,*Caplan,*S.,*Wahl,*J.*K.,* Wheelock,*M.*J.,*&*Johnson,*K.*R.*(2006).*Expression*of*inappropriate*cadherins*by*epithelial* tumor*cells*promotes*endocytosis*and*degradation*of*E-cadherin*via*competition*for*p120ctn.* Oncogene,*25(33),*4595–4604.*https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209396* Malone,*C.*D.,*&*Hannon,*G.*J.*(2009).*Small*RNAs*as*Guardians*of*the*Genome.*Cell,*136(4),*656–668.* https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.045* Mannion,*N.*M.,*Greenwood,*S.*M.,*Young,*R.,*Cox,*S.,*Brindle,*J.,*Read,*D.,*Nellåker,*C.,*Vesely,*C.,* Ponting,*C.*P.,*McLaughlin,*P.*J.,*Jantsch,*M.*F.,*Dorin,*J.,*Adams,*I.*R.,*Scadden,*A.*D.*J.,*Öhman,*M.,* Keegan,* L.* P.,* &* O’Connell,* M.* A.* (2014).* The* RNA-Editing* Enzyme* ADAR1* Controls* Innate* Immune* Responses* to* RNA.* Cell+ Reports,* 9(4),* 1482–1494.* https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.10.041* Marquardt,*S.,*Escalante-Chong,*R.,*Pho,*N.,*Wang,*J.,*Churchman,*L.*S.,*Springer,*M.,*&*Buratowski,*S.* (2014).*A*chromatin-based* mechanism*for*limiting* divergent*noncoding*transcription.*Cell,* 157(7),*1712–1723.*https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.04.036* Martello,*G.,*Rosato,*A.,*Ferrari,*F.,*Manfrin,*A.,*Cordenonsi,*M.,*Dupont,*S.,*Enzo,*E.,*Guzzardo,*V.,* Rondina,* M.,* Spruce,* T.,* Parenti,* A.* R.,* Daidone,* M.* G.,*Bicciato,* S.,* &* Piccolo,* S.* (2010).* A* microRNA* targeting* dicer* for* metastasis* control.* Cell,* 141(7),* 1195–1207.* https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.05.017* Massagué,*J.*(2012).*TGFβ*signalling*in*context.*Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology,*13(10),*616– 630.*https://doi.org/10.1038/nrm3434* Massari,* M.* E.,* &* Murre,* C.* (2000).* Helix-Loop-Helix* Proteins:* Regulators* of* Transcription* in* Eucaryotic* Organisms.* Molecular+ and+ Cellular+ Biology,* 20(2),* 429–440.* https://doi.org/10.1128/mcb.20.2.429-440.2000* Melo,*S.*A.,*Moutinho,*C.,*Ropero,*S.,*Calin,*G.*A.,*Rossi,*S.,*Spizzo,*R.,*Fernandez,*A.*F.,*Davalos,*V.,* Villanueva,*A.,*Montoya,*G.,*Yamamoto,*H.,*Schwartz,*S.,*&*Esteller,*M.*(2010).*A*genetic*defect* BIBLIOGRAFÍA* * 218* in*exportin-5*traps*precursor*MicroRNAs*in*the*nucleus*of*cancer*cells.*Cancer+Cell,*18(4),*303– 315.*https://doi.org/10.1016/j.ccr.2010.09.007* Mendez,*M.*G.,*Kojima,*S.,*&*Goldman,*R.*D.*(2010).*Vimentin*induces*changes*in*cell*shape,*motility,* and*adhesion*during*the*epithelial*to*mesenchymal*transition.*The+FASEB+Journal,*24(6),*1838– 1851.*https://doi.org/10.1096/fj.09-151639* Merriam,*J.*M.,*Rubenstein,*A.*B.,*&*Klymkowsky,*M.*W.*(1997).*Cytoplasmically*anchored*plakoglobin* induces* a* WNT-like* phenotype* in* Xenopus.* Developmental+ Biology,* 185(1),* 67–81.* https://doi.org/10.1006/dbio.1997.8550* Mise,*N.,*Savai,*R.,*Yu,*H.,*Schwarz,*J.,*Kaminski,*N.,*&*Eickelberg,*O.*(2012).*Zyxin*is*a*transforming* growth*factor-β*(TGF-β)/Smad3*target*gene*that*regulates*lung*cancer*cell*motility*via*integrin* α5β1.* Journal+ of+ Biological+ Chemistry,* 287(37),* 31393–31405.* https://doi.org/10.1074/jbc.M112.357624* Mizrahi,*A.,*Czerniak,*A.,*Levy,*T.,*Amiur,*S.,*Gallula,*J.,*Matouk,*I.,*Abu-lail,*R.,*Sorin,*V.,*Birman,*T.,*de* Groot,*N.,*Hochberg,*A.,*&*Ohana,*P.*(2009).*Development*of*targeted*therapy*for*ovarian*cancer* mediated* by* a* plasmid* expressing* diphtheria* toxin* under* the* control* of* H19* regulatory* sequences.*Journal+of+Translational+Medicine,*7,*1–11.*https://doi.org/10.1186/1479-5876-7- 69* Mollaei,*H.,*Safaralizadeh,*R.,*&*Rostami,*Z.*(2019).*MicroRNA*replacement*therapy*in*cancer.*Journal+ of+Cellular+Physiology,*234(8),*12369–12384.*https://doi.org/10.1002/jcp.28058* Mutoh,*M.,*Niho,*N.,*Komiya,*M.,*Takahashi,*M.,*Ohtsubo,*R.,*Nakatogawa,*K.,*Ueda,*K.,*Sugimura,*T.,*&* Wakabayashi,*K.*(2008).*Plasminogen*activator*inhibitor-1*(Pai-1)*blockers*suppress*intestinal* polyp* formation* in* Min* mice.* Carcinogenesis,* 29(4),* 824–829.* https://doi.org/10.1093/carcin/bgn028* Naetar,*N.,*Ferraioli,*S.,*&*Foisner,*R.*(2017).*Lamins*in*the*nuclear*interior*-*Life*outside*the*lamina.* Journal+of+Cell+Science,*130(13),*2087–2096.*https://doi.org/10.1242/jcs.203430* Nagano,*T.,*Mitchell,*J.*A.,*Sanz,*L.*A.,*Pauler,*F.*M.,*Ferguson-smith,*A.*C.,*&*Feil,*R.*(2008).*The+Air+ Noncoding+ RNA+ Epigenetically+ Silences+ Transcription+ by+ Targeting+ G9a+ to+ Chromatin.* 5(November).* Nisticò,* P.,* Bissell,* M.* J.,* &* Radisky,* D.* C.* (2012).* Epithelial-mesenchymal* transition:* General* principles* and* pathological* relevance* with* special* emphasis* on* the* role* of* matrix* metalloproteinases.* Cold+ Spring+ Harbor+ Perspectives+ in+ Biology,* 4(2).* https://doi.org/10.1101/cshperspect.a011908* O’Donnell,* K.* A.,* Wentzel,* E.* A.,* Zeller,* K.*I.,*Dang,* C.* V.,* &* Mendell,* J.* T.* (2005).*c-Myc-regulated* microRNAs* modulate* E2F1* expression.* Nature,* 435(7043),* 839–843.* https://doi.org/10.1038/nature03677* Omori,*K.,*Hattori,*N.,*Senoo,*T.,*Takayama,*Y.,*Masuda,*T.,*Nakashima,*T.,*Iwamoto,*H.,*Fujitaka,*K.,* BIBLIOGRAFÍA* * 219* Hamada,*H.,*&*Kohno,*N.*(2016).*Inhibition*of*plasminogen*activator*inhibitor-*1*attenuates* transforming* growth* factor-* β-dependent* epithelial* mesenchymal* transition* and* differentiation* of* fibroblasts* to* myofibroblasts.* PLoS+ ONE,* 11(2),* 1–18.* https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148969* Ørom,*U.*A.,*Kauppinen,*S.,*&*Lund,*A.*H.*(2006).*LNA-modified*oligonucleotides*mediate*specific* inhibition* of* microRNA* function.* Gene,* 372(1–2),* 137–141.* https://doi.org/10.1016/j.gene.2005.12.031* Osborne,* B.* A.,* &* Minter,* L.* M.* (2007).* Notch* signalling* during* peripheral* T-cell* activation* and* differentiation.*Nature+Reviews+Immunology,*7(1),*64–75.*https://doi.org/10.1038/nri1998* Pa,*M.,*Naizaer,*G.,*Seyiti,*A.,*&*Kuerbang,*G.*(2017).*Long*Noncoding*RNA*MALAT1*Functions*as*a* Sponge*of*MiR-200c*in*Ovarian*Cancer.*Oncology+ Research+ Featuring+ Preclinical+ and+ Clinical+ Cancer+Therapeutics.*https://doi.org/10.3727/096504017x15049198963076* Paoli,*P.,* Giannoni,*E.,* &* Chiarugi,*P.* (2013).*Anoikis*molecular*pathways*and*its* role*in*cancer* progression.*Biochimica+ et+ Biophysica+ Acta+ -+Molecular+Cell+ Research,*1833(12),*3481–3498.* https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2013.06.026* Parasramka,*M.*A.,*Maji,*S.,*Matsuda,*A.,*Yan,*I.*K.,*&*Patel,*T.*(2016).*Long*non-coding*RNAs*as*novel* targets*for*therapy*in*hepatocellular*carcinoma.*Pharmacology+and+Therapeutics,*161,*67–78.* https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2016.03.004* Parikh,*A.,*Lee,*C.,*Joseph,*P.,*Marchini,*S.,*Baccarini,*A.,*Kolev,*V.,*Romualdi,*C.,*Fruscio,*R.,*Shah,*H.,* Wang,*F.,*Mullokandov,*G.,*Fishman,*D.,*D’Incalci,*M.,*Rahaman,*J.,*Kalir,*T.,*Redline,*R.*W.,*Brown,* B.* D.,* Narla,* G.,* &* Difeo,* A.* (2014).* MicroRNA-181a* has* a* critical* role* in* ovarian* cancer* progression* through* the* regulation* of* the* epithelial-mesenchymal* transition.* Nature+ Communications,*5.*https://doi.org/10.1038/ncomms3977* Park,*M.*K.,*Zhang,*L.,*Min,*K.*W.,*Cho,*J.*H.,*Yeh,*C.*C.,*Moon,*H.,*Hormaechea-Agulla,*D.,*Mun,*H.,*Ko,*S.,* Lee,*J.*W.,*Jathar,*S.,*Smith,*A.*S.,*Yao,*Y.,*Giang,*N.*T.,*Vu,*H.*H.,*Yan,*V.*C.,*Bridges,*M.*C.,*Kourtidis,* A.,*Muller,*F.,*…*Song,*M.*S.*(2021).*NEAT1*is*essential*for*metabolic*changes*that*promote* breast* cancer* growth* and* metastasis.* Cell+ Metabolism,* 33(12),* 2380-2397.e9.* https://doi.org/10.1016/j.cmet.2021.11.011* Park,*S.*H.,*Brugiolo,*M.,*Akerman,*M.,*Das,*S.,*Urbanski,*L.,*Geier,*A.,*Kesarwani,*A.*K.,*Fan,*M.,*Leclair,* N.,*Lin,*K.*T.,*Hu,*L.,*Hua,*I.,*George,*J.,*Muthuswamy,*S.*K.,*Krainer,*A.*R.,*&*Anczuków,*O.*(2019).* Differential* Functions* of* Splicing* Factors* in* Mammary* Transformation* and* Breast* Cancer* Metastasis.*Cell+Reports,*29(9),*2672-2688.e7.*https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.110* Paroo,*Z.,*Ye,*X.,*Chen,*S.,*&*Liu,*Q.*(2009).*Phosphorylation*of*the*Human*MicroRNA-Generating* Complex* Mediates* MAPK/Erk* Signaling.* Cell,* 139(1),* 112–122.* https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.06.044* Patra,*K.*C.,*Wang,*Q.,*Bhaskar,*P.*T.,*Miller,*L.,*Wang,*Z.,*Wheaton,*W.,*Chandel,*N.,*Laakso,*M.,*Muller,* BIBLIOGRAFÍA* * 220* W.* J.,* Allen,* E.* L.,* Jha,* A.* K.,*Smolen,*G.* A.,*Clasquin,* M.* F.,* Robey,* R.*B.,* &* Hay,*N.* (2013).* Hexokinase*2*is*required*for*tumor*initiation*and*maintenance*and*its*systemic*deletion*is* therapeutic* in* mouse* models* of* cancer.* Cancer+ Cell,* 24(2),* 213–228.* https://doi.org/10.1016/j.ccr.2013.06.014* Pavón,*M.*A.,*Arroyo-Solera,*I.,*Téllez-Gabriel,*M.,*León,*X.,*Virós,*D.,*López,*M.,*Gallardo,*A.,*Céspedes,* M.*V.,*Casanova,*I.,*López-Pousa,*A.,*Mangues,*M.*A.,*Quer,*M.,*Barnadas,*A.,*&*Mangues,*R.*(2015).* Enhanced*cell*migration*and*apoptosis*resistance*may*underlie*the*association*between*high* SERPINE1*expression*and*poor*outcome*in*head*and*neck*carcinoma*patients.*Oncotarget,* 6(30),*29016–29033.*https://doi.org/10.18632/oncotarget.5032* Paz,*I.,*Akerman,*M.,*Dror,*I.,*Kosti,*I.,*&*Mandel-Gutfreund,*Y.*(2010).*SFmap:*A*web*server*for*motif* analysis*and*prediction*of*splicing*factor*binding*sites.*Nucleic+Acids+Research,*38(SUPPL.*2),*1– 5.*https://doi.org/10.1093/nar/gkq444* Peinado,*H.,*Ballestar,*E.,*Esteller,*M.,*&*Cano,*A.*(2004).*Snail*Mediates*E-Cadherin*Repression*by*the* Recruitment* of*the* Sin3A/Histone*Deacetylase* 1* (HDAC1)/HDAC2*Complex.* Molecular+ and+ Cellular+Biology,*24(1),*306–319.*https://doi.org/10.1128/mcb.24.1.306-319.2004* Perez-Moreno,*M.,*&*Fuchs,*E.*(2006).*Catenins:*Keeping*Cells*from*Getting*Their*Signals*Crossed.* Developmental+Cell,*11(5),*601–612.*https://doi.org/10.1016/j.devcel.2006.10.010* Pestal,*K.,*Funk,*C.*C.,*Snyder,*J.*M.,*Price,*N.*D.,*Treuting,*P.*M.,*&*Stetson,*D.*B.*(2015).*Isoforms*of* RNA-Editing* Enzyme* ADAR1* Independently* Control* Nucleic* Acid* Sensor* MDA5-Driven* Autoimmunity* and* Multi-organ* Development.* Immunity,* 43(5),* 933–944.* https://doi.org/10.1016/j.immuni.2015.11.001* Pora,* A.,* Yoon,* S.,* Windoffer,* R.,* &* Leube,* R.* E.* (2019).* Hemidesmosomes* and* Focal* Adhesions* Treadmill* as* Separate* but* Linked* Entities* during* Keratinocyte* Migration.* Journal+ of+ Investigative+Dermatology,*139(9),*1876-1888.e4.*https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.03.1139* Postigo,* A.* A.,* &* Dean,* D.* C.* (1999).* ZEB* represses* transcription* through* interaction* with* the* corepressor* CtBP.* Proceedings+ of+ the+ National+ Academy+ of+ Sciences+ of+ the+ United+ States+ of+ America,*96(12),*6683–6688.*https://doi.org/10.1073/pnas.96.12.6683* Postigo,*A.*A.,*Depp,*J.*L.,*Taylor,*J.*J.,*&*Kroll,*K.*L.*(2003).*Regulation*of*Smad*signaling*through*a* differential* recruitment* of* coactivators* and* corepressors* by* ZEB* proteins.* EMBO+ Journal,* 22(10),*2453–2462.*https://doi.org/10.1093/emboj/cdg226* Pradella,*D.,*Naro,*C.,*Sette,*C.,*&*Ghigna,*C.*(2017).*EMT*and*stemness:*Flexible*processes*tuned*by* alternative*splicing*in*development*and*cancer*progression.*Molecular+ Cancer,*16(1),*1–19.* https://doi.org/10.1186/s12943-016-0579-2* Qu,* Q.,* Zeng,* F.,* Liu,* X.,* Wang,* Q.* J.,* &* Deng,* F.* (2016).* Fatty* acid* oxidation* and* carnitine* palmitoyltransferase*I:*Emerging*therapeutic*targets*in*cancer.*Cell+Death+and+Disease,*7(5),*1– 9.*https://doi.org/10.1038/cddis.2016.132* BIBLIOGRAFÍA* * 221* Quinn,*J.*J.,*&*Chang,*H.*Y.*(2016).*Unique*features*of*long*non-coding*RNA*biogenesis*and*function.* Nature+Reviews+Genetics,*17(1),*47–62.*https://doi.org/10.1038/nrg.2015.10* Ridley,* A.* J.* (2011).* Life* at* the* leading* edge.* Cell,* 145(7),* 1012–1022.* https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.06.010* Robertson,*I.*B.,*&*Rifkin,*D.*B.*(2016).*and+TGF-+b+-Related+Proteins.*1–25.* Roscigno,*R.*F.*&*M.*(1995).*SR*proteins*escort*the*tri-snRNP.pdf.*In*Rna*(Vol.*1,*pp.*692–706).* Ru,*P.,*Steele,*R.,*Newhall,*P.,*Phillips,*N.*J.,*Toth,*K.,*&*Ray,*R.*B.*(2012).*miRNA-29b*suppresses* prostate* cancer* metastasis* by* regulating* epithelial-mesenchymal* transition* signaling.* Molecular+Cancer+Therapeutics,*11(5),*1166–1173.*https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT- 12-0100* Sabour,*D.,*Xu,*X.,*Chung,*A.*C.*K.,*Le*Menuet,*D.,*Ko,*K.,*Tapia,*N.,*Araúzo-Bravo,*M.*J.,*Gentile,*L.,*Greber,* B.,*Hübner,*K.,*Sebastiano,*V.,*Wu,*G.,*Schöler,*H.*R.,*&*Cooney,*A.*J.*(2014).*Germ*cell*nuclear* factor* regulates* gametogenesis* in* developing* gonads.* PLoS+ ONE,* 9(8),* 1–14.* https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103985* Saito,*K.,*Nishida,*K.*M.,*Mori,*T.,*Kawamura,*Y.,*Miyoshi,*K.,*Nagami,*T.,*Siomi,*H.,*&*Siomi,*M.*C.*(2006).* Specific+association+of+Piwi+with+rasiRNAs+derived+from+retrotransposon+and+heterochromatic+ regions+in+the+Drosophila+genome.*2214–2222.*https://doi.org/10.1101/gad.1454806.In* Sakai,*S.,*Ohhata,*T.,*Kitagawa,*K.,*Uchida,*C.,*Aoshima,*T.,*Niida,*H.,*Suzuki,*T.,*Inoue,*Y.,*Miyazawa,*K.,* &*Kitagawa,*M.* (2019).*Long*noncoding*RNA*ELIT-1* acts* as*a* Smad3* cofactor* to* facilitate* TGFb/Smad* signaling* and* promote* epithelial–mesenchymal* transition.* Cancer+ Research,* 79(11),*2821–2838.*https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-3210* Sánchez-Tilló,* E.,* Lázaro,*A.,* Torrent,* R.,*Cuatrecasas,* M.,*Vaquero,* E.* C.,*Castells,*A.,*Engel,* P.,*&* Postigo,*A.*(2010).*ZEB1*represses*E-cadherin*and*induces*an*EMT*by*recruiting*the*SWI/SNF* chromatin-remodeling* protein* BRG1.* Oncogene,* 29(24),* 3490–3500.* https://doi.org/10.1038/onc.2010.102* Santoro,*R.*(2021).*Looking*for*a*job*in*a*dynamic*and*collaborative*working*place?*LncRNAs*are* recruiting!*Cell,*184(25),*6019–6021.*https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.10.020* Sciacovelli,* M.,* &* Frezza,* C.* (2017).* Metabolic* reprogramming* and* epithelial-to-mesenchymal* transition*in*cancer.*FEBS+Journal,*284(19),*3132–3144.*https://doi.org/10.1111/febs.14090* Seker,*F.,*Cingoz,*A.,*Sur-Erdem,*İ.,*Erguder,*N.,*Erkent,*A.,*Uyulur,*F.,*Selvan,*M.*E.,*Gümüş,*Z.*H.,*Gönen,* M.,*Bayraktar,* H.,*Wakimoto,*H.,* &*Bagci-Onder,* T.* (2019).* Identification* of* SERPINE1*as*a* regulator*of*glioblastoma*cell*dispersal*with*transcriptome*profiling.*Cancers,*11(11),*1–21.* https://doi.org/10.3390/cancers11111651* Shen,*J.,*Xia,*W.,*Khotskaya,*Y.*B.,*Huo,*L.,*Nakanishi,*K.,*Lim,*S.*O.,*Du,*Y.,*Wang,*Y.,*Chang,*W.*C.,*Chen,* C.*H.,*Hsu,*J.*L.,*Wu,*Y.,*Lam,*Y.*C.,*James,*B.*P.,*Liu,*X.,*Liu,*C.*G.,*Patel,*D.*J.,*&*Hung,*M.*C.*(2013).* EGFR*modulates*microRNA*maturation*in*response*to*hypoxia*through*phosphorylation*of* BIBLIOGRAFÍA* * 228* inducing* epithelial-to-mesenchymal* transition.* Cancer+ Genetics,* 204(9),* 486–491.* https://doi.org/10.1016/j.cancergen.2011.07.004* Zheng,*G.*X.*Y.,*Do,*B.*T.,*Webster,*D.*E.,*Khavari,*P.*A.,*&*Chang,*H.*Y.*(2014).*Dicer-microRNA-Myc* circuit*promotes*transcription*of*hundreds*of*long*noncoding*RNAs.*Nature+ Structural+ and+ Molecular+Biology,*21(7),*585–590.*https://doi.org/10.1038/nsmb.2842* Zhong,*X.,*&*Rescorla,*F.*J.*(2012).*Cell*surface*adhesion*molecules*and*adhesion-initiated*signaling:* Understanding* of* anoikis* resistance* mechanisms* and* therapeutic* opportunities.* Cellular+ Signalling,*24(2),*393–401.*https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2011.10.005* Zhong,*Y.,*Du,*Y.,*Yang,*X.,*Mo,*Y.,*Fan,*C.,*Xiong,*F.,*Ren,*D.,*Ye,*X.,*Li,*C.,*Wang,*Y.,*Wei,*F.,*Guo,*C.,*Wu,* X.,*Li,*X.,*Li,*Y.,*Li,*G.,*Zeng,*Z.,*&*Xiong,*W.*(2018).*Circular*RNAs*function*as*ceRNAs*to*regulate* and* control* human* cancer* progression.* Molecular+ Cancer,* 17(1),* 1–11.* https://doi.org/10.1186/s12943-018-0827-8* Zhou,*B.*X.,*&*Li,*Y.*(2020).*Significance*of*desmoglein-2*on*cell*malignant*behaviors*via*mediating* MAPK* signaling* in* cervical* cancer.* Kaohsiung+ Journal+ of+ Medical+ Sciences,* 36(5),* 336–343.* https://doi.org/10.1002/kjm2.12182* Zhou,*Q.,*Yang,*M.,*Lan,*H.,*&*Yu,*X.*(2013).*MiR-30a*negatively*regulates*TGF-β1-induced*epithelial- mesenchymal* transition* and* peritoneal* fibrosis* by* targeting* snai1.* American+ Journal+ of+ Pathology,*183(3),*808–819.*https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2013.05.019* * *