Caracterización fenólica de miel de mielada

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Caracterización fenólica de miel de mielada Marta López Villalobos 2 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO Curso 2017-2018 Caracterización fenólica de miel de mielada Marta López Villalobos Presentación: Junio 2018 Departamento de Química Analítica Tutora: María Dolores Hernanz Vila Tipología del trabajo: Experimental 3 RESUMEN La miel es la sustancia natural dulce producida por la abeja Apis mellifera a partir del néctar de plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores presentes en las partes vivas de plantas, que las abejas recolectan, transforman combinándolas con sustancias específicas propias, depositan, deshidratan, almacenan y dejan en colmenas para que madure. La miel de mielada es aquella que procede en su mayor parte de excreciones de insectos chupadores de plantas (hemípteros) presentes en las partes vivas de las plantas o de secreciones de las partes vivas de las plantas. Las principales diferencias entre la miel de néctar y de mielada son en la de conductividad eléctrica, el pH y la acidez. A lo largo del tiempo, la miel ha sido utilizada no solamente por sus propiedades nutritivas sino también por sus propiedades beneficiosas para la salud como son su acción antibacteriana, antifúngica, antiinflamatoria, antiséptica y cicatrizante Los compuestos fenólicos además de contribuir a las características sensoriales de la miel participan junto a otro grupo de constituyentes minoritarios en la actividad antioxidante. La determinación de los compuestos fenólicos se lleva a cabo mediante técnicas de separación, primero se realiza una extracción en fase sólida seguida de una extracción líquido-líquido y posteriormente el extracto se analiza en un cromatógrafo de líquidos. El proceso analítico puede entenderse como un proceso de tres etapas distintas que se construyen en relación con la etapa central de medida. Estas etapas son: toma y preparación de la muestra, medida de la señal analítica y toma de datos y el tratamiento de datos y la expresión de resultados. Mediante la calibración metodológica realizamos el tratamiento de datos estableciendo una relación entre la respuesta de un instrumento obtenida del cromatógrafo y la concentración analítica. En este estudio se han identificado distintos ácidos hidroxibenzoicos como son: el ácido gálico, protocatéquico, vainillico, siríngico y p-hidroxibenzoico y derivados del ácido siringico y p-hidroxibenzoico, ácidos hidroxicinámicos como ácidos p-cumárico y cafeico y por último galangina, naringenina, crisina y pinocembrina como flavonoides. Palabras claves: miel de mielada, compuestos fenólicos, tratamiento de datos. 4 ÍNDICE RESUMEN 1. INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………………………………………… 6 1.1 La miel…………………………………………………………………………………..…………….. 7 1.1.1 Miel de mielada ……………………….……………………………………………… 7 1.2 Compuestos fenólicos ………………………………………………………………..…….. 10 1.3 Proceso analítico general ………………………….………………………………………. 10 1.3. 1 Definición del problema ……………………………………………………..…. 11 1.3.2 Selección del método …………………….………………………………………. 11 1.3.3 Toma de muestra …………………………………………………………………… 11 1.3.4 Preparación de la muestra ……………………..……………………………… 11 1.3.5 Medida y tratamiento de los datos …………….…………………………. 12 1.3.6 Interpretación de los resultados ………………………………………….… 12 1.4 Etapa de medida, tratamiento y evaluación de datos …………..…………… 14 2. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………………………… 14 3. MATERIALES Y MÉTODOS ………………….………………………………………………………… 14 3.1 Determinación de los compuestos fenólicos ……………………………………… 14 3.1.1 Muestras………………………………………………………………………………... 14 3.1.2 Metodología ………………….………………………………………………………. 17 3.1.3 Calibración …………………………………………………………………………….. 20 3.2 Herramientas de exploración de datos……………………………..……………….. 20 3.2.1 Estadística descriptiva: Medidas de tendencia central y dispersión ………………………………………………………………………………………………..…… 20 3.2.2 Herramientas básicas de calidad ……………………………………….…… 22 3.3 Tratamiento de datos …………………………………………………………………….…. 22 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN …………………………………………………………………….……. 23 4.1 Ácidos fenólicos …………………………………………………………………………….….. 23 4.1.1 Ácidos hidoxibenzoicos ……………………………………………………….…. 25 4.1.2 Ácidos hidroxicinámicos ………………………………………………………… 26 4.2 Flavonoides ………………………………………………………………………….………….. 27 4.3 Composición fenólica de las mieles de mielada ……………………….………… 29 5 5. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………………….… 29 6. BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………………………………………………... 32 7. ANEXO …………………………………………………………………………………………………………. 39 6 1. INTRODUCCIÓN 1.1 La miel La miel es la sustancia natural dulce producida por la abeja Apis mellifera a partir del néctar de plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores presentes en las partes vivas de plantas, que las abejas recolectan, transforman combinándolas con sustancias específicas propias, depositan, deshidratan, almacenan y dejan en colmenas para que madure (RD 1049/2003). Las propiedades y la composición química de la miel dependen de su origen geográfico, tiempo de recolección, factores ambientales, así como del tratamiento de los apicultores (El Sohaimy et al., 2015). Al ser producida por las abejas, algunos componentes de la miel son agregados por las mismas, otros provienen de las plantas, y otros se deben a reacciones bioquímicas que se dan durante la maduración de esta. El resultado es una mezcla compleja principalmente de carbohidratos (70- 80 % p/p), agua (10-20 % p/p) y una gran cantidad de componentes entre los que se incluyen, aminoácidos, proteínas, enzimas, hormonas, lípidos, compuestos fenólicos, vitaminas, aceites esenciales, pigmentos, esteroles, fosfolípidos y sales minerales. Debido a que la miel es alimento con una alta concentración de azúcares, si se almacena a temperaturas por debajo de 25 C puede llegar a perder su calidad (Krell, 1996). La miel es apreciada no sólo por su sabor sino también por su alto valor nutritivo y su contribución en la salud humana (Pita-Calvo y Vázquez, 2016). Esta es consumida mundialmente debido a que su composición química le aporta actividad antioxidante, antibacteriana y antiinflamatoria (Deng et al., 2018). Diversos estudios han demostrado que la principal actividad antimicrobiana se debe a la presencia de peróxido de hidrógeno producido por la enzima glucosa-oxidasa, por otro lado, la acidez debida a la presencia de ácidos orgánicos le da un pH de 3.5-4.5 lo que le confiere un importante factor antimicrobiano. Kassim et al. (2010) han estudiado el efecto de la miel sobre los mediadores de la inflamación, su actividad antioxidante está relacionada con la concentración de ácido ascórbico, compuestos fenólicos, carotenoides, ácidos orgánicos, aminoácidos y proteínas. Por otra parte, la baja tensión superficial de la miel permite que sea un excelente humectante 7 incorporándose a productos cosméticos (Krell, 1996; Estrada et al., 2005; Güal y Pehlivan, 2018). Los parámetros fisicoquímicos que pueden caracterizar la miel son el pH, la acidez, la actividad de la enzima diastasa (que indica el grado de frescura de la miel) y el contenido de hidroximetilfurfural (Terrab et al., 2002). Se pueden distinguir distintos tipos de miel atendiendo a diferentes parámetros (RD 1049/2003):  Según su origen: miel de flores o néctar y miel de mielada.  Según su elaboración o su presentación: miel en panal, con trozos de panal o panal cortado en miel, miel escurrida, miel centrifugada, miel prensada, miel filtrada y miel para uso industrial. 1.1.1 Miel de mielada La miel de mielada es aquella que procede en su mayor parte de excreciones de insectos chupadores de plantas (hemípteros) presentes en las partes vivas de las plantas o de secreciones de las partes vivas de las plantas como las encinas, alcornoques, robles, hayas, castaños, tilos, sauces, abetos, etc. Estos insectos tienen unas piezas en su aparato bucal con las que rompen la superficie de los vegetales. Cuando esto ocurre, la savia sale al exterior impulsada por la presión interna de la planta y por la succión del insecto. Sin embargo, el insecto succiona tal cantidad de savia que excede varias veces su propio peso, y el sobrante, después de sufrir transformaciones digestivas dentro del cuerpo, es depositado en el vegetal en forma de gotitas que se conocen como mielatos, ligamaza o mielada que recolectan otros insectos tales como las hormigas y las abejas. Los principales productores de mielato son aquellos insectos que chupan directamente de los haces vasculares (Sancho et al., 1991). Las principales diferencias entre la miel de néctar y de mielada son en la de conductividad eléctrica, el pH y la acidez presentando mayores valores en la miel de mielada. Además estas últimas tienen mayor contenido de cenizas y son más oscuras. Las mieles de mielada tienen un perfil glucídico diferente a las mieles de néctar y también presentan mayor contenido en disacáridos y trisacáridos, y menor en glucosa 8 y fructosa. Por otro lado, la miel de mielada tiene mayor concentración de compuestos fenólicos, principalmente flavonoides, así como una mayor actividad antioxidante (Shantal et al., 2015; Pita-Calvo y Vázquez, 2016). 1.2 Compuestos fenólicos El estudio de la fracción fenólica de la miel es importante, ya que estos están íntimamente relacionados con la actividad antioxidante. Por otra parte, el contenido en compuesto fenólicos y específicamente de flavonoides de la miel, podría ser no solamente un marcador del origen floral sino también un indicador potencial de su calidad biológica (Montenegro et al., 2008). Uno de los métodos usados comúnmente para determinar y cuantificar el contenido en fenoles totales en alimentos es el ensayo de Folin-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965). Se basa en que los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivos de Folin-Ciocalteu, a pH básico, dando lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada espectrofotométricamente a 765 nm (Gutiérrez et al., 2008). Los compuestos fenólicos son un grupo químicamente muy heterogéneo, con aproximadamente 10000 compuestos, que se agrupan en diferentes clases de acuerdo con su estructura química. Se pueden dividir en ácidos fenólicos y flavonoides. Los ácidos fenólicos a su vez se clasifican en ácidos hidroxibenzoicos e hidroxicinámicos, mientras que los flavonoides en flavanonas, flavonoles y flavonas (Harborne, 1989). Los ácidos hidroxibenzoicos poseen una estructura general derivada del ácido benzoico C1-C6 entre ellos se encuentran el ácido gálico, p-hidroxibenzóico, protocatetico y vainillico. Por otra parte, los ácidos hidroxicinámicos, como son los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinapíco, tienen una estructura general de C3-C6 y se diferencian en el tipo de sustituyente del anillo (Figura 1). 9 a) b) Figura 1.- a) ácidos hidroxibenzóicos y b) ácidos hidroxicinámicos. Los compuestos flavonoides tienen una estructura C6-C3-C6, que implica dos anillos de benceno conectados por un anillo de pirano (Figura 2). Estos representan el grupo mayoritario de compuestos fenólicos presentes en los vegetales. Están ampliamente distribuidos en las semillas, cortezas, hojas y flores de plantas y árboles. En las plantas son compuestos responsables de proporcionar protección frente a la radiación ultravioleta y los patógenos. Figura 2.- Estructura general flavonoides. Los principales componentes funcionales de la miel son los flavonoides (Figura 3), y contribuyen a la actividad antioxidante. Dicha actividad, en la mayoría de los casos depende del número y la posición de los grupos hidroxilo y de los otros sustituyentes. Da silva et al. (2005) estudian que la presencia de grupos hidroxilos en el anillo A y B, el doble enlace en la posición 2,3 y el grupo 4-oxo en el anillo C (Figura 2) aumentan la actividad antioxidante, mientras que la glicosilación la disminuye. 16 En la Figura 5 se muestra el mapa de muestreo, donde se incluyen las provincias de Ávila, Burgos, Cáceres, Ciudad Real, Granada, León, Oviedo, Ourense, Salamanca, Toledo, Zamora y Zaragoza. Figura 5.- Mapa de muestreo. 3.1.2 Metodología La extracción de fenoles de las distintas muestras de mieles se llevó a cabo según el método descrito por Gheldof et al., (2002) con ligeras modificaciones. En primer lugar, se llevó a cabo una extracción en fase sólida. Esta técnica se basa en la diferente afinidad de los compuestos con una resina polimérica Amberlite XAD-2 la cual permite la adsorción de los compuestos fenólicos presentes en la miel. La extracción en fase sólida consta de las siguientes etapas:  Etapa de acondicionamiento. Para la activación de la resina polimérica es necesario pasar 3 mL de metanol, agua mili-Q y agua acidulada (pH=2 con HCl).  Carga de la muestra. Se pesa 1 g de miel y se disuelve en 3 mL de agua (pH=2 con HCl). Esta disolución se hace pasar por el cartucho de manera que los compuestos fenólicos quedan retenidos en la resina. 17  Lavado. Esta etapa permite la eliminación de los azúcares de la miel y posibles interferentes. Para ello se hace pasar por la columna 3 mL de agua mili-Q y agua acidulada.  Elución. Finalmente se produce la elución de los compuestos fenólicos con 3 mL de metanol, disolvente orgánico polar que va a permitir la desorción de dichos componentes. Para una correcta extracción es necesario controlar en todo momento el flujo de elución. Una vez obtenido el extracto, se concentró y se disolvió en 500 µL de agua mili-Q. A continuación se realizaron tres extracciones líquido-líquido con acetato de etilo (3 X 500 µL). Finalmente, las fases orgánicas se combinaron y se concentraron. El residuo seco se disolvió en 200 µL de fase móvil A (Ácido fórmico 0,01% v/v), se filtró (0,45 µm) y por último, 1 µL se inyectó en UHPLC (Palomar, 2015). La determinación de compuestos fenólicos se realiza mediante cromatografía líquida ultra-rápida resolución (UHPLC 1260 Agilent Technologies). Las fases móviles utilizadas son las siguientes:  Fase móvil A: agua: ácido fórmico 99,99:0,01 (v:v)  Fase móvil B: acetonitrilo Para conseguir la resolución de los compuestos fenólicos en las muestras de miel se utilizó el gradiente de elución que se muestra en la Tabla 2. El flujo de fase móvil se mantuvo a 1 mL/min y la temperatura de la columna fue 20 C. Tabla 2. Gradiente de elución La longitud de onda de detección fue de 280 nm. La determinación cuantitativa se efectuó por calibración simple, a partir de las áreas de los picos obtenidos en los cromatogramas. 3.1.3 Calibración simple Tiempo (min) %A %B 0100 0 595 5 20 50 50 21 100 0 22 100 0 18 Para realizar la calibración se prepararon disoluciones de patrones de concentración conocida a partir de los estándares puros. Los patrones utilizados se muestran en la Tabla 3 clasificados según su naturaleza química y el tiempo de retención como resultado del análisis cromatográfico. En la Figura 6 se muestra un cromatograma de una muestra de miel de mielada obtenida en las condiciones definidas anteriormente. Tabla 3. Clasificación de los patrones según su naturaleza química y tiempo de retención. Compuesto TR (min) ÁCIDOS FENÓLICOS O NO FLAVONOIDES ÁCIDOS HIDOXIBENZOICOS Ácido gálico 1.135 Ácido protocatequico 2.193 Ácido p-hidroxibenzoico 3.532 Ácido vainíllico 5.544 Ácido siríngico 6.776 ACIDOS HIDROXICINÁMICOS Ácido cafeico 6.030 Ácido p-cumárico 7.588 FLAVONOIDES FLAVANONAS Naringenina 12.807 Pinocembrina 16.106 FLAVONA Crisina 15.777 Galangina 15.281 19 Figura 6. Cromatograma de una muestra de miel de mielada registrado a 280 nm (1: ácido gálico; 2: ácido protocatequico; 3: ácido p-hidroxibenzoico; 4: ácido vainillico; 5: ácido cafeico, 6: ácido siríngico, 7: ácido p-cumárico ; 8: ácido cafeico D1 ; 9: ácido p-hidroxibenzoico D1; 10: galangina D1 ;11: ácido p-hidroxibenzoico D2; 12: ácido siríngico D1; 13: ácido siríngico D2; 14: naringenina D1; 15: naringenina ; 16: ácido siríngico D3; 17: ácido p-cumárico D; 18: galangina ; 19: crisina; 20: pinocembrina. A partir de las áreas de los picos obtenidas en los cromatogramas y las diferentes concentraciones conocidas de patrones se obtienen las rectas de calibrado individuales. Las rectas de calibrado obtenidas se recogen la Tabla 4. La linealidad se puede evaluar mediante la representación de datos e inspección visual del gráfico y mediante el coeficiente de correlación (r2). La linealidad se define como la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro del intervalo de trabajo. A partir de la curva de calibración, se puede obtener la ecuación de la recta de la que se obtiene un coeficiente de correlación r2. Para una buena garantía de linealidad, será conveniente medir en cinco niveles de concentración, que abarquen el intervalo de trabajo, y repetir este proceso tres veces. Se considera que un valor de r2 representa un buen ajuste lineal, cuanto más próximo a 1 se encuentre (Jurado, 2008). Tabla 4. Rectas de calibrado de los compuestos fenólicos. 20 ʎ(nm) Ecuación Coeficiente r2 Rango (Área) Rango (ng) Ácido gálico 280 y=0,73x-0,70 0.9991 1,50-8,30 3,12-12,48 Ácido protocatequico 280 y=1,61x-5,76 0.9991 1.6 - 102.9 3.33 - 66.6 Ácido p-hidroxibenzoico 280 y=1,22x-1,85 0.9916 1,50-11,50 2,80-11,20 Ácido vainíllico 280 y=1,71x-2,60 1.0000 2,70-18,50 3,08-12,32 Ácido cafeico 280 y=1,17x-1,05 0.9996 1,10-7,70 1,88-7,52 Ácido siríngico 280 y=2,27x-2,95 0.9997 2,30-18,20 2,23-9,28 Ácido p-cumárico 280 y=2,73x-3,60 0.9996 3,10-22,80 2,40-9,60 Naringenina 280 y=3,06x-21,50 0.9995 13,70-116,20 11,20-44,80 Crisina 280 y=3,63-19,05 1.0000 18,70-131,70 10,40-41,60 Pinocembrina 280 y=1,09x-5,75 1.0000 3,00-29,00 8,00-32,00 Galangina 280 y=2,15-5,65 0.9995 6,90-45,70 6,00-24,00 3.2 Herramientas de exploración de datos 3.2.1 Estadística descriptiva: medidas de tendencia central y dispersión (Miller y Miller, 2002) - Medidas de Tendencia central: Media aritmética ( ): se define como la suma de una serie de datos dividida por el número de datos considerados. En el caso de una población, es decir, cuando realizásemos una serie infinita de medidas obtendríamos la media de la población (). La media aritmética se calcula aplicando la siguiente fórmula: Siendo, xi cada uno de los valores obtenidos y n el número de valores considerados. Mediana (M): Para un conjunto de n datos ordenados de menor a mayor, la mediana es el valor de la observación que ocupa el lugar (n+1)/2 si n es impar o bien la media de los valores que ocupan los lugares n/2 y (n/2+1) si n es par. 21 - Medidas de Dispersión: Desviación estándar (S): es un parámetro que nos informa de la dispersión de los datos obtenidos. En el caso de una población hablaremos de la desviación estándar de la población (  ). Se calcula aplicando la siguiente fórmula: Siendo, xi cada uno de los valores obtenidos, el valor medio y n el número de valores considerados. Varianza (V): se calcula como el cuadrado de la desviación estándar. Coeficiente de variación (CV): es otra medida de la variabilidad tambien conocido como desviacion estandar relativo y se puede calcular aplicando la siguiente ecuación: Rango: es el intervalo entre el valor máximo y el valor mínimo. Permite obtener una idea de la dispersión de los datos. 3.2.2 Herramientas básicas de calidad Según la norma de gestión de la calidad y elementos del sistema de la calidad, UNE 66 904-4:1995, un histograma es una herramienta que sirve para visualizar la dispersión de los datos, comunicar visualmente la información sobre el comportamiento del proceso, así como para la toma de decisiones sobres los puntos donde concentrar los esfuerzos de mejora. Un histograma se usa para:  Representar gráficamente los modelos de variación.  Comunicar visualmente información sobre el comportamiento de un proceso.  Tomar decisiones acerca de donde se deben concentrar los esfuerzos de mejora. 22 El procedimiento que se debe llevar a cabo para realizar un histograma es:  Recopilar los valores de los datos.  Determinar el recorrido de los datos restando del dato de mayor valor el dato de menor valor.  Determinar el número de intervalos en el histograma y dividir el recorrido por el número de intervalos para determinar la amplitud de cada intervalo.  Marcar la escala para el valor de los datos del eje horizontal.  Marcar la escala de frecuencias sobre el eje vertical.  Trazar la altura de cada intervalo igual al número de valores de los datos que se sitúan dentro de ese intervalo. 3.3 Tratamiento de los datos Para el análisis de los datos se ha empleado el programa Microsoft Excel (2013). 23 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A partir del estudio de los cromatogramas de las 58 muestras de miel de mielada se han obtenido las áreas de los veinte compuestos fenólicos identificados. Para cada compuesto identificado, se ha interpolado el valor del área en la recta de calibración correpondiente y se ha calculado su concentración en la muestra. Existen tres tipos de calibración metodologíca: calibración externa, patrón interno y adición estándar. En este Trabajo hemos aplicado la calibración externa en la cual la respuesta del instrumento o sistema de medida se expresa en forma de una magnitud distinta de la del patrón o patrones de calibración, esta calibración se realiza mediante patrones que contienen cantidades conocidas del analito, que generalmente consisten en disoluciones del mismo en un disolvente apropiado, que son sometidas a la etapa de medida instrumental. Tienen como ventaja la sencillez y rapidez, pero es necesario asegurar que no existe efecto de la matriz o que se haya corregido convenientemente. Por otra parte, la adición estándar se emplea cuando un efecto de la matriz es imposible de corregir, tiene como inconveniente que es un método laborioso. Por último, la calibración con patrón interno, cuyo objetivo es minimizar las fluctuaciones instrumentales, por lo tanto se emplea cuando existen problemas en la reproducibilidad de la técnica de medida. Las mieles de mielada estudiadas presentan un perfil fenólico común caracterizado por la presencia de ácidos fenólicos como los ácidos p-hidroxibenzoico, vainíllico, siríngico, cafeico y p-cumárico y de flavonoides como la galangina y naringenina. Todas las mieles tienen un perfil fenólico común pero existen diferencias cuantitativas con respecto a la composición fenólica de las misma (ANEXO 1). 4.1 Ácidos fenólicos 4.1.1 Ácidos hidroxibenzoicos En la Tabla 3 se muestran los valores de los ácidos hidroxbenzoicos identificados en las mieles de mielada. Se han determinado diez ácidos hidroxibenzoicos que corresponden a los ácidos gálico, protocatéquico, vainillico, siríngico y p-hidroxibenzoico y derivados del ácido siringico y p-hidroxibenzoico. Cabe destacar que el compuesto mayoritario es el ácido siríngico y sus derivados, seguido 24 del ácido p-hidroxibenzoico. En la Figura 7 se ha representado gráficamente en histograma la concentración de ácidos hidroxibenzoicos en las mieles de mielada. Tabla 3. Valores medios (mg/100 g) y de dispersión de la concetración de ácidos hidroxibenzoicos en las muestras de mielada (n = 58). M S V Max Min Rango CV Ác. gálico 0,021 0 0,033 0,001 0,136 0,000 0,136 >100 Ác. protocatequico 0,195 0,19 0,094 0,009 0,435 0,000 0,435 48 Ác. vainillico 0,031 0,037 0,031 0,001 0,095 0,000 0,095 >100 Ác. siríngico 0,059 0,053 0,051 0,003 0,205 0,000 0,205 86 Ác. siríngico D 1 0,091 0,079 0,057 0,003 0,291 0,000 0,291 42 Ác. siríngico D 2 0,494 0,359 0,358 0,358 3,746 0,000 3,746 72 Ác. siríngico D 3 0,096 0,069 0,127 0,016 0,704 0,000 0,704 >100 Ác. p-hidroxibenzoico 0,122 0,122 0,04 0,002 0,245 0,058 0,186 33 Ác. p-hidroxibenzoico D 1 0,114 0,08 0,133 0,018 0,791 0,000 0,791 >100 Ác. p-hidroxibenzoico D 2 0,189 0,105 0,299 0,090 1,944 0,000 1,944 >100 =media, M = mediana, S = desviación estándar, V = Varianza, Max = valor máximo, Min = valor mínimo, CV = coeficiente de variación. Las muestras de miel de mielada presentaron un intervalo de concentración de ácido gálico entre 0,034 y 0,136 mg/100 g, con un valor medio de 0,021 ± 0,033 mg/100 g. En la Figura 7 se ha representado gráficamente en histograma los resultados obtenidos de ácido gálico en las mieles, y se observa que la mayoría de las muestras presentan valores comprendidos entre los 0,059 y 0, 110 mg/100 g. En cuanto a la concentración de ácido protocatequico, las mieles presentaron un rango más amplio entre 0,099 y 0,435 mg/100 g. El ácido siríngico y sus derivados presentaron una concentración entre 0,658 y 1,229 mg/ 100 g. La variabilidad del ácido vainillico es mucho menor ya que la mayoría de las muestras presentan valores entre 0,055 y 0,069 mg/100 g. Por último el ácido hidroxibenzoico presente en las muestras de mielada es el ácido p-hidroxibenzoico junto a sus tres derivados, la gran parte de las muestras presentaron una concentración entre 0,374 y 0,682 mg/100 g. 25 Figura 7.- Histogramas de los ácidos hidroxibenzoicos. 4.1.2 Ácidos hidroxicinámicos En la Tabla 4 se muestran los valores de los ácidos hidroxicinámicos identificados en las mieles de mielada. Se han determinado cuatro ácidos que corresponden a los ácidos p-cumárico y un derivado del mismo, cafeico y su derivado. En la Figura 8 se ha representado gráficamente en histograma los ácidos hidroxicinámicos y sus derivados. 0 2 4 6 8 10 12 14 0.034 0.059 0.085 0.110 0.136 Frecuencia Ácido gálico (mg/100g) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0.099 0.147 0.195 0.243 0.291 0.339 0.387 0.435 Ácido protocatéquico (mg/100 g) 0 5 10 15 20 25 30 35 0.086 0.658 1.229 1.801 2.372 2.943 3.515 4.086 Ácido siríngico y derivados (mg/100mg) 0 10 20 30 40 0.065 0.374 0.682 0.991 1.300 1.609 1.917 2.226 Frecuencia Ácido p-hidroxibenzoico y derivados (mg/100 g) 0 5 10 15 20 0.029 0.042 0.055 0.069 0.082 0.095 Frecuencia Ácido vainillico (mg/100 g) 32  Terrab A., Diez MJ, Heredia FJ. Characterisation of Moroccan unifloral honeys by their physicochemical characteristics.Food Chemistry. 2002;79(3): 373–379.  Sancho M.T., Muniategui S., Huibodro J.F. y J. Simal. Mieles del País Vasco. VI: Elementos de mielada .Anales de Bromatología 1991;43: 165-. 172.  Valcárcel M. Principios de Química Analítica. 1ª ed. 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ANEXOS ANEXO A: concentraciones de ácidos hidroxibenzoicos en las mieles de mielada. ác.gálico ác. protocatequico ác. vainillico ác. siríngico ác. siríngico D1 ác. siríngico D2 ác. siríngico D3 ác. p-hidroxibenzoico ác. p-hidroxibenzoico D1 ác. phidroxibenzoico D2 Muestra 1 0,000 0,109 0,030 0,000 0,000 0,068 0,000 0,065 0,059 0,000 Muestra 2 0,000 0,111 0,000 0,052 0,000 0,071 0,000 0,065 0,000 0,000 Muestra 3 0,000 0,220 0,052 0,058 0,087 0,576 0,059 0,184 0,071 0,095 Muestra 4 0,000 0,138 0,029 0,000 0,083 0,303 0,048 0,077 0,056 0,131 Muestra 5 0,058 0,184 0,046 0,000 0,130 1,681 0,704 0,134 0,269 0,617 Muestra 6 0,068 0,145 0,000 0,051 0,153 0,246 0,024 0,085 0,054 0,067 Muestra 7 0,000 0,104 0,000 0,000 0,080 0,118 0,168 0,069 0,073 0,078 Muestra 8 0,000 0,172 0,051 0,054 0,075 0,161 0,053 0,102 0,043 0,063 Muestra 9 0,037 0,201 0,000 0,056 0,087 0,259 0,000 0,147 0,066 0,075 Muestra 10 0,000 0,203 0,000 0,037 0,074 0,178 0,062 0,097 0,053 0,068 Muestra 11 0,041 0,256 0,000 0,000 0,061 0,729 0,071 0,110 0,085 0,198 Muestra 12 0,000 0,244 0,000 0,065 0,073 0,644 0,067 0,103 0,057 0,324 Muestra 13 0,000 0,395 0,046 0,038 0,133 0,317 0,061 0,146 0,059 0,089 Muestra 14 0,000 0,435 0,045 0,000 0,057 0,352 0,057 0,118 0,109 0,091 Muestra 15 0,000 0,126 0,000 0,000 0,109 0,321 0,070 0,094 0,065 0,113 Muestra 16 0,000 0,000 0,000 0,057 0,069 0,080 0,082 0,067 0,107 0,000 Muestra 17 0,000 0,239 0,000 0,080 0,061 0,167 0,165 0,110 0,065 0,073 Muestra 18 0,000 0,227 0,000 0,072 0,105 0,473 0,085 0,153 0,153 0,074 Muestra 19 0,000 0,143 0,066 0,000 0,062 0,133 0,000 0,102 0,179 0,122 Muestra 20 0,000 0,245 0,000 0,059 0,056 0,130 0,068 0,129 0,103 0,076 Muestra 21 0,000 0,129 0,069 0,000 0,000 0,000 0,086 0,069 0,071 0,000 Muestra 22 0,000 0,099 0,057 0,000 0,055 0,094 0,123 0,092 0,081 0,085 Muestra 23 0,000 0,266 0,068 0,087 0,056 0,378 0,290 0,239 0,791 0,164 Muestra 24 0,000 0,152 0,000 0,061 0,070 0,676 0,085 0,085 0,061 0,175 34 Muestra 25 0,000 0,127 0,000 0,046 0,057 0,213 0,047 0,081 0,063 0,086 Muestra 26 0,000 0,152 0,000 0,043 0,081 0,635 0,149 0,099 0,083 0,182 Muestra 27 0,000 0,195 0,000 0,060 0,055 0,516 0,000 0,137 0,070 0,125 Muestra 28 0,000 0,114 0,000 0,057 0,061 0,150 0,000 0,066 0,070 0,056 Muestra 29 0,000 0,000 0,000 0,029 0,000 0,399 0,000 0,100 0,104 0,084 Muestra 30 0,051 0,174 0,065 0,033 0,085 0,558 0,129 0,127 0,124 0,164 Muestra 31 0,055 0,189 0,000 0,085 0,291 0,125 0,133 0,132 0,100 0,176 Muestra 32 0,000 0,242 0,059 0,000 0,153 0,513 0,000 0,138 0,097 0,224 Muestra 33 0,000 0,329 0,054 0,034 0,145 0,473 0,000 0,144 0,098 0,199 Muestra 34 0,039 0,320 0,050 0,000 0,043 0,202 0,071 0,149 0,056 0,060 Muestra 35 0,000 0,270 0,000 0,088 0,058 0,222 0,000 0,151 0,047 0,087 Muestra 36 0,000 0,319 0,068 0,079 0,157 0,518 0,000 0,245 0,427 0,114 Muestra 37 0,000 0,189 0,000 0,069 0,156 1,120 0,545 0,217 0,641 0,587 Muestra 38 0,000 0,241 0,055 0,137 0,199 0,354 0,000 0,149 0,093 0,132 Muestra 39 0,000 0,256 0,056 0,151 0,127 0,391 0,087 0,157 0,096 0,128 Muestra 40 0,000 0,250 0,058 0,035 0,116 0,367 0,095 0,152 0,099 0,099 Muestra 41 0,068 0,160 0,094 0,031 0,097 2,475 0,116 0,147 0,260 1,220 Muestra 42 0,086 0,223 0,054 0,093 0,139 0,048 0,114 0,151 0,122 0,070 Muestra 43 0,042 0,201 0,053 0,051 0,052 0,347 0,138 0,116 0,086 0,110 Muestra 44 0,000 0,258 0,053 0,092 0,062 0,245 0,024 0,143 0,061 0,079 Muestra 45 0,000 0,125 0,095 0,044 0,000 3,746 0,154 0,058 0,224 1,944 Muestra 46 0,000 0,113 0,000 0,000 0,000 0,364 0,321 0,088 0,029 0,148 Muestra 47 0,106 0,400 0,000 0,075 0,083 0,460 0,347 0,142 0,087 0,077 Muestra 48 0,000 0,190 0,000 0,040 0,193 0,932 0,000 0,133 0,085 0,422 Muestra 49 0,136 0,353 0,000 0,059 0,126 0,245 0,000 0,181 0,061 0,062 Muestra 50 0,057 0,175 0,054 0,076 0,176 1,177 0,070 0,143 0,080 0,341 Muestra 51 0,034 0,155 0,000 0,195 0,089 0,477 0,065 0,096 0,053 0,092 Muestra 52 0,083 0,168 0,053 0,037 0,060 0,939 0,054 0,094 0,068 0,337 Muestra 53 0,055 0,000 0,090 0,164 0,078 0,409 0,084 0,133 0,054 0,129 Muestra 54 0,064 0,172 0,051 0,042 0,067 0,433 0,000 0,120 0,071 0,090 35 Muestra 55 0,000 0,214 0,000 0,205 0,069 0,228 0,110 0,095 0,000 0,051 Muestra 56 0,057 0,317 0,058 0,116 0,196 0,587 0,127 0,116 0,107 0,182 Muestra 57 0,039 0,000 0,055 0,125 0,157 0,051 0,109 0,125 0,095 0,191 Muestra 58 0,042 0,196 0,052 0,186 0,134 0,555 0,069 0,136 0,091 0,118 Concentraciones de ácidos hidroxicinámicos en las mieles de mielada. ác. p-cumárico ác p-cumárico D1 ác. Cafeico ác. cafeico D1 Muestra 1 0,063 0,000 0,057 0,035 Muestra 2 0,079 0,000 0,000 0,035 Muestra 3 0,241 0,000 0,104 0,079 Muestra 4 0,089 0,000 0,058 0,034 Muestra 5 0,804 0,094 0,191 0,113 Muestra 6 0,202 0,000 0,138 0,146 Muestra 7 0,109 0,000 0,072 0,090 Muestra 8 0,159 0,000 0,076 0,047 Muestra 9 0,196 0,000 0,142 0,083 Muestra 10 0,100 1,052 0,069 0,053 Muestra 11 0,110 1,142 0,054 0,042 Muestra 12 0,124 1,091 0,076 0,058 Muestra 13 0,207 1,116 0,000 0,116 Muestra 14 0,106 1,216 0,000 0,033 Muestra 15 0,166 1,276 0,070 0,088 Muestra 16 0,082 1,152 0,000 0,041 Muestra 17 0,103 1,319 0,000 0,051 Muestra 18 0,095 0,000 0,000 0,047 Muestra 19 0,098 0,301 0,000 0,058 Muestra 20 0,181 0,333 0,000 0,074 36 Muestra 21 0,106 0,336 0,000 0,000 Muestra 22 0,210 0,055 0,000 0,096 Muestra 23 0,100 0,104 0,070 0,040 Muestra 24 0,245 0,185 0,137 0,041 Muestra 25 0,131 0,000 0,057 0,037 Muestra 26 0,267 0,000 0,137 0,050 Muestra 27 0,127 0,144 0,117 0,045 Muestra 28 0,101 0,346 0,057 0,049 Muestra 29 0,082 0,150 0,000 0,046 Muestra 30 0,162 0,140 0,131 0,072 Muestra 31 0,470 0,026 0,211 0,086 Muestra 32 0,686 0,575 0,056 0,142 Muestra 33 0,641 0,330 0,000 0,145 Muestra 34 0,026 0,000 0,093 0,051 Muestra 35 0,252 0,327 0,000 0,041 Muestra 36 0,604 0,245 0,334 0,143 Muestra 37 1,175 0,114 0,238 0,145 Muestra 38 0,447 0,360 0,000 0,203 Muestra 39 0,277 0,183 0,225 0,112 Muestra 40 0,265 0,000 0,235 0,114 Muestra 41 1,224 0,210 0,000 0,122 Muestra 42 0,307 0,120 0,289 0,135 Muestra 43 0,155 0,000 0,078 0,043 Muestra 44 0,206 0,325 0,000 0,049 Muestra 45 2,368 0,355 0,000 0,171 Muestra 46 0,213 0,000 0,000 0,000 Muestra 47 0,332 0,000 0,000 0,087 Muestra 48 0,783 0,392 0,000 0,130 Muestra 49 0,190 0,099 0,266 0,086 Muestra 50 0,831 0,110 0,263 0,156 37 Concentraciones de los flavonoides en las mieles de mielada. Galangina Galangina D1 Naringenina Naringenina D1 Crisina Pinocembrina Muestra 1 0,112 0,084 0,198 0,000 0,000 0,000 Muestra 2 0,113 0,000 0,199 0,000 0,152 0,000 Muestra 3 0,111 0,101 0,200 0,168 0,000 0,000 Muestra 4 0,091 0,050 0,169 0,156 0,000 0,000 Muestra 5 0,094 0,119 0,313 0,222 0,144 0,124 Muestra 6 0,097 0,071 0,228 0,213 0,000 0,000 Muestra 7 0,102 0,000 0,180 0,172 0,000 0,000 Muestra 8 0,107 0,246 0,222 0,193 0,000 0,000 Muestra 9 0,105 0,111 0,212 0,182 0,000 0,000 Muestra 10 0,000 0,102 0,164 0,151 0,117 0,000 Muestra 11 0,000 0,248 0,135 0,000 0,223 0,000 Muestra 12 0,000 0,071 0,197 0,153 0,116 0,000 Muestra 51 0,320 0,055 0,143 0,070 Muestra 52 0,509 0,073 0,093 0,049 Muestra 53 0,204 0,099 0,134 0,060 Muestra 54 0,130 0,077 0,143 0,053 Muestra 55 0,000 0,000 0,112 0,052 Muestra 56 0,305 0,000 0,269 0,215 Muestra 57 0,693 0,093 0,255 0,164 Muestra 58 0,211 0,079 0,228 0,108 38 Muestra 13 0,000 0,163 0,216 0,264 0,000 0,000 Muestra 14 0,000 0,218 0,154 0,170 0,121 0,000 Muestra 15 0,000 0,096 0,195 0,160 0,135 0,000 Muestra 16 0,000 0,372 0,170 0,206 0,128 0,000 Muestra 17 0,000 0,376 0,156 0,158 0,000 0,000 Muestra 18 0,000 0,161 0,000 0,000 0,136 0,000 Muestra 19 0,000 0,134 0,000 0,215 0,150 0,000 Muestra 20 0,000 0,106 0,000 0,000 0,135 0,000 Muestra 21 0,000 0,083 0,000 0,000 0,146 0,000 Muestra 22 0,000 0,140 0,204 0,000 0,000 0,000 Muestra 23 0,000 0,163 0,197 0,000 0,137 0,000 Muestra 24 0,000 0,096 0,177 0,000 0,000 0,000 Muestra 25 0,108 0,079 0,159 0,000 0,000 0,000 Muestra 26 0,000 0,095 0,182 0,164 0,000 0,000 Muestra 27 0,000 0,296 0,167 0,000 0,000 0,000 Muestra 28 0,000 0,052 0,184 0,167 0,129 0,000 Muestra 29 0,000 0,164 0,000 0,176 0,136 0,000 Muestra 30 0,000 0,159 0,198 0,164 0,130 0,000 Muestra 31 0,106 0,114 0,248 0,345 0,134 0,187 Muestra 32 0,000 0,111 0,245 0,315 0,133 0,000 Muestra 33 0,000 0,115 0,212 0,183 0,000 0,000 Muestra 34 0,000 0,080 0,167 0,000 0,000 0,000 Muestra 35 0,000 0,095 0,158 0,000 0,134 0,000 Muestra 36 0,000 0,138 0,312 0,235 0,134 0,000 Muestra 37 0,000 0,104 0,339 0,200 0,134 0,000 Muestra 38 0,000 0,126 0,254 0,221 0,138 0,000 Muestra 39 0,000 0,196 0,320 0,203 0,130 0,000 Muestra 40 0,000 0,172 0,243 0,210 0,135 0,000 Muestra 41 0,000 0,125 0,212 0,178 0,000 0,000 Muestra 42 0,000 0,093 0,226 0,224 0,134 0,000 39 Muestra 43 0,000 0,107 0,165 0,150 0,122 0,000 Muestra 44 0,000 0,136 0,178 0,164 0,000 0,000 Muestra 45 0,000 0,133 0,272 0,211 0,000 0,000 Muestra 46 0,000 0,186 0,192 0,179 0,000 0,000 Muestra 47 0,000 0,000 0,231 0,249 0,000 0,000 Muestra 48 0,000 0,103 0,286 0,220 0,000 0,000 Muestra 49 0,000 0,097 0,433 0,300 0,151 0,131 Muestra 50 0,000 0,112 0,399 0,186 0,164 0,189 Muestra 51 0,000 0,136 0,264 0,190 0,145 0,151 Muestra 52 0,000 0,103 0,193 0,000 0,000 0,000 Muestra 53 0,000 0,113 0,325 0,193 0,249 0,214 Muestra 54 0,000 0,095 0,220 0,193 0,000 0,000 Muestra 55 0,000 0,000 0,221 0,188 0,171 0,152 Muestra 56 0,000 0,128 0,324 0,204 0,000 0,000 Muestra 57 0,000 0,125 0,312 0,251 0,000 0,000 Muestra 58 0,000 0,095 0,347 0,248 0,000 0,000