Estudio molecular de la cardioprotección inducida por Urocortina frente al síndrome de isquemia/repercusión.

2 A. INTRODUCCIÓN Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de morbimortalidad en los países desarrollados (Figura A1). Todo el arsenal farmacológico con que se cuenta en la actualidad sólo ha conseguido retrasar la edad de aparición de eventos cardiovasculares, pero en conjunto no se ha conseguido disminuir la prevalencia de dichos eventos (Fuster, 2005). Más bien al contrario, según los datos del último informe de la Organización Mundial para la Salud (OMS) las enfermedades cardiovasculares han aumentado en el periodo de los años 2000-2012 (Figura A1). Entre las enfermedades cardiovasculares más importantes la insuficiencia cardiaca es una enfermedad progresiva que incluso con el mejor tratamiento actual provoca una alta mortalidad y morbilidad. Alrededor del 50% de los pacientes diagnosticados de insuficiencia cardiaca han fallecido a los 5 años del diagnóstico (Sayago-Silva, 2013). La insuficiencia cardiaca supone el 2,5% del gasto total del Sistema Nacional de Salud, y es la primera causa de hospitalización en mayores de 65 años, lo que supone el 3% del total (Christopher, 2014). Por ello y debido sobre todo al envejecimiento de la población, actualmente el número de muertes por insuficiencia cardiaca está aumentando (Banegas, 2006). La causa principal de insuficiencia cardiaca es la cardiopatía isquémica, que ronda alrededor del 75% de todos los casos de insuficiencia cardiaca según el estudio Figura A1. Principales causas de muerte en el mundo en la actualidad y su evolución en los últimos 12 años. Fuente: Organización Mundial para la Salud (2012). 3 de Framingham, y particularmente el infarto agudo de miocardio (IAM), que representa la primera causa de muerte en el mundo occidental. Además es la primera causa de pérdida de vida ajustada por discapacidad debido precisamente a la consecuente aparición de insuficiencia cardiaca (Townsend, 2012). Según se recoge en el Plan Integral de Cardiopatías de Andalucía, en el año 2000, las afecciones coronarias fueron responsables del 35% del total de defunciones (40% en mujeres y 30% en hombres). El IAM ocurre por la obstrucción de una arteria coronaria que bloquea el flujo sanguíneo generando daño tisular en una parte del corazón. En los pacientes que sufren un IAM con elevación del segmento ST (STEMI), el principal objetivo terapéutico es restaurar el flujo coronario tan pronto como sea posible; la pronta y exitosa reperfusión miocárdica gracias al uso de tratamiento trombolítico o la intervención coronaria percutánea mediante angioplastia es la estrategia más eficaz para reducir el tamaño del infarto de miocardio y con ello mejorar el resultado clínico en su fase aguda (Patrick, 2013). Especialmente, la angioplastia primaria ha provocado un gran impacto en la historia natural de la cardiopatía isquémica, disminuyendo significativamente la mortalidad precoz y aumentando la supervivencia tras un STEMI. En la figura A2 puede verse una coronografía antes y después de realizarse una angioplastia primaria para restablecer el flujo sanguíneo coronario en un paciente con un infarto agudo con bloqueo total del flujo sanguíneo en la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Figura A2. Imágenes de una angiografía coronaria en la unidad de hemodinámica del Hospital Virgen del Rocío de Sevilla. A) Se muestra el bloqueo al flujo sanguíneo en la arteria descendente anterior izquierda y B) el restablecimiento de la circulación sanguínea tras la intervención percutánea. 4 Sin embargo, a pesar del éxito en las terapias de reperfusión y la mejora en la supervivencia a corto plazo, la cardiopatía isquémica sigue siendo la principal causa de remodelado ventricular adverso a largo plazo, lo que da lugar a la aparición de insuficiencia cardiaca. Incluso con la mejor terapia de reperfusión, entre un 20% y un 30% de los pacientes tratados exitosamente sufren un remodelado adverso del ventrículo. La consecuencia de este remodelado adverso es la aparición de insuficiencia cardiaca y el incremento en 10 veces de la mortalidad de estos pacientes (Bolognese, 2002). Por tanto los resultados a largo plazo de las nuevas terapias de reperfusión han sido mucho menos espectaculares de lo que se esperaba (Halkin, 2005). El elemento fisiopatológico clave en el desarrollo de la insuficiencia cardiaca tras un STEMI es el remodelado adverso del ventrículo, y aún a día de hoy las causas que explican la aparición de remodelado ventricular adverso tras un IAM, incluso siendo tratados exitosamente, siguen sin estar resueltas (Savoye, 2006). A.1. Isquemia-Reperfusión en la cardiopatía isquémica. El restablecimiento del flujo sanguíneo, o reperfusión, es la manera más eficaz de disminuir el daño miocárdico isquémico, limitando la extensión de la necrosis y mejorando la supervivencia de los cardiomiocitos. Sin embargo es bien conocido que existe un efecto desfavorable inducido por la propia reperfusión de las células isquémicas. De hecho una parte de la muerte celular se precipita, paradójicamente, por la propia restauración del flujo (Piper, 1998). Este fenómeno es conocido como síndrome de Isquemia/Reperfusión (I/R). Los daños por reperfusión se explican al restablecerse la circulación en un escenario previamente isquémico donde se han acumulado una serie de daños. La posterior llegada de sangre oxigenada a las células previamente isquémicas produce la reactivación del metabolismo celular en unas condiciones no óptimas de la mitocondria, lo que da lugar a la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). A esto hay que sumar la alteración de la homeostasis iónica de los cardiomiocitos cuyo principal problema es la acumulación de Ca2+ intracelular. Esto da lugar a nuevos daños estructurales a 3 niveles: i) activación de proteasas dependientes de Ca2+ que producen 5 una proteólisis generalizada de la maquinaria contráctil celular, ii) degradación de lípidos de membrana que conlleva una mayor fragilidad celular y iii) daño mitocondrial que conduce a la apertura del poro de transición mitocondrial (PTM) y muerte celular (Hori, 2009). El daño letal por reperfusión es capaz de producir la muerte de células que sólo fueron dañadas de forma reversible durante el periodo isquémico previo. Evidentemente las alteraciones celulares que tienen lugar durante la isquemia son el principio de un daño que después de la reperfusión van a llevar a la muerte celular, pero que por sí solos no serian causa definitiva. A.1.1. Daños agudos producidos en el miocardio por isquemia/reperfusión. A.1.1.1. Importancia de la homeostasis del calcio. La regulación de los niveles de Ca2+ intracelular es un proceso clave para los cardiomiocitos. El Ca2+ es un importante transductor de señales en cualquier tipo celular, pero en los cardiomiocitos es además el responsable directo de la contracción rítmica del músculo cardiaco. Los cardiomiocitos necesitan incrementar los niveles de Ca2+ citosólico durante un periodo breve de tiempo (sístole), y a continuación volver a recaptar todo ese Ca2+ rápidamente para volver a una situación de reposo (diástole) necesaria para que pueda producirse la siguiente contracción (Figura A3). Esta compleja regulación de los flujos de Ca2+ a través del retículo sarcoplásmico y de la membrana plasmática son procesos muy costosos energéticamente y se ven afectados durante una situación de isquemia donde los niveles de ATP bajan drásticamente al no funcionar la cadena respiratoria mitocondrial. Tras la reperfusión el problema se agrava considerablemente al perderse la capacidad de regular los niveles de Ca2+ citosólico (Siegmund 1992). El tejido miocárdico tiene una alta demanda metabólica, necesita una gran cantidad de energía para mantener su actividad contráctil y el funcionamiento de sus bombas iónicas. Es un tejido funcionalmente aeróbico que depende casi por completo de la oxidación de sustratos para la obtención de energía, por tanto en una situación de isquemia la ausencia de O2 disponible hace que la producción de fosfatos de alta 6 energía disminuya drásticamente. El balance energético se hace muy desfavorable, y el tejido en un corto periodo de tiempo va agotando las reservas de ATP, acumulando ADP y Pi. De modo compensatorio la célula inicia una glucolisis anaeróbica que sintetiza algo de ATP a costa de acumular lactato y protones, dando lugar a una acidificación del pH intracelular en pocos minutos (Neely, 1984). La consecuencia de esta acidificación es la activación de intercambiadores de Na+/H+ que van retirando protones a cambio de aumentar la concentración de Na+ citosólico, lo que entre otros efectos provoca la pérdida del gradiente de Na+ transmembrana resultando crítico para la actividad del intercambiador Na+/Ca2+ (NCX) (Pike, 1993). Por su parte, el intercambiador Na+/Ca2+ juega un papel fundamental en la homeostasis del Ca2+, ya que es la vía principal de extrusión del Ca2+ intracelular en condiciones fisiológicas normales. Sin embargo, durante una isquemia la despolarización progresiva de la membrana y la sobrecarga de Na+ citosólico provocan un funcionamiento continuo de la bomba en forma reversa, produciendo una entrada neta de Ca2+ al citoplasma. A esto hay que sumar la inhibición de las ATPasas de Ca2+ de la membrana plasmática y del retículo por falta de ATP, lo que lleva a un aumento prolongado de la concentración de Ca2+ intracelular (Steenbergen, 1987). Figura A3. Acoplamiento excitación-contracción en cardiomiocitos y mecanismos de manejo de Ca2+. Fuente: Min Luo, Circulation Research Image Gallery. 7 Posteriormente, cuando se produce la reperfusión sanguínea las células vuelven a disponer de oxígeno, volviendo a restablecerse la síntesis de ATP. Las concentraciones de ATP pueden tardar en volver a sus niveles normales, pero la disponibilidad energética se recupera a los pocos minutos de disponer de oxígeno. Sin embargo las mitocondrias que han sido dañadas tienen alterado el proceso oxidativo, dando lugar a más radicales libres de oxígeno (RLO) de lo normal (Siegmund, 1990). La acidosis producida en isquemia se revierte de forma rápida gracias al lavado extracelular de protones, y la vuelta a la actividad del intercambiador Na+/H+ y del transportador Na+/HCO3-. Si la isquemia ha sido breve la concentración de Na+ intracelular puede normalizarse con la actividad del la ATPasa Na+/K+. Sin embargo, en una isquemia prolongada la concentración de Na+ permanece alterada durante mucho tiempo debido también a la actividad del cotransportador Na+/HCO3y del intercambiador Na+/H+ que siguen introduciendo Na+ para poder restablecer el pH (Bersohn, 1995). Las células que sufren durante mucho tiempo la sobrecarga de Ca2+ citoplasmático mantienen de forma sostenida una alta actividad contráctil, lo que provoca daños en las estructuras sarcoméricas y el citoesqueleto, produciéndose un acortamiento irreversible de la célula que desembocará en la muerte celular (Piper, 1998). A.1.1.2. Alteraciones enzimáticas y fragilidad celular El proceso de I/R también produce alteraciones en la composición lipídica de la membrana plasmática, degradación de proteínas de membrana y pérdida de uniones entre la membrana y el citoesqueleto, lo que resulta en un aumento de la fragilidad celular (Ganote, 1988). Dicha fragilidad hace que las células soporten una menor sobrecarga mecánica. La alta concentración de Ca2+ intracelular, además de provocar la hipercontractura, activa fosfolipasas dependientes de Ca2+. La hidrólisis de fosfolípidos y la acción de los lisofosfolípidos producidos son los responsables en mayor medida de los cambios de composición en la membrana plasmática de las células sometidas a isquemia, y de la alteración de las propiedades físicas de la membrana como consecuencia de la alteración de proteínas estructurales, canales, etc (Cummings, 8 2000). Un ejemplo son las calpaínas, unas proteasas dependientes de Ca2+ que debido a la sobrecarga de Ca2+ citoplasmático sufren una alteración de su actividad. La actividad de las calpaínas es dependiente del pH, de manera que durante la reperfusión y el restablecimiento de un pH neutro contribuyen negativamente en la fragilidad celular, produciendo la proteolisis de proteínas que mantienen la integridad de la membrana, miofilamentos, y canales iónicos (Inserte, 2005). A.1.1.3. Alteraciones mitocondriales La reactivación de la respiración mitocondrial tras la reperfusión es fundamental para la recuperación celular. Sin embargo la propia actividad de la mitocondria además de producir gran cantidad de RLO, contribuye a la alteración de los niveles de Ca2+ intracelular y al desencadenamiento de procesos apoptóticos. Estos RLO tienen efectos directos sobre componentes de la cadena respiratoria, afectando a la síntesis de ATP y alterando también la permeabilidad de la membrana mitocondrial (Halestrap, 1998). En la reperfusión la restauración del potencial de membrana mitocondrial hace que la mitocondria capture Ca2+ citoplasmático contribuyendo a la normalización de su concentración intracelular. Sin embargo la sobrecarga de Ca2+ en la mitocondria puede llevar a la apertura del PTM (Griffiths, 1993). El PTM es un canal inespecífico de difusión de moléculas que en condiciones fisiológicas ayuda a modular los cambios de Ca2+ intracelular. Sin embargo una apertura descontrolada da lugar a la despolarización de la mitocondria, pérdida del gradiente de H+, cese de la síntesis de ATP, y liberación del Ca2+ mitocondrial al citosol. Cuando esto ocurre en buena parte de las mitocondrias se produce la muerte de la célula por necrosis. A.1.2. Mecanismos de muerte celular después de isquemia/reperfusión Hasta hace relativamente poco tiempo se pensaba que tras un proceso de I/R la necrosis era el único mecanismo de muerte celular de los cardiomiocitos. La necrosis es la muerte producida por una grave alteración de la homeostasis celular. Se caracteriza por una fragmentación descontrolada del DNA, desorganización de los 9 orgánulos celulares, rotura de la membrana plasmática y liberación al exterior del contenido intracelular, lo que desencadena una respuesta inflamatoria. Sin embargo actualmente está bastante bien establecido que si bien en los primeros minutos de isquemia se produce una muerte de cardiomiocitos por necrosis, la reperfusión desencadena posteriormente otro tipo de muerte celular que ocurre de una forma mucho más controlada; se produce muerte celular por apoptosis. La apoptosis es un proceso de muerte celular programado, que tiene lugar de una manera controlada, y que depende del balance entre la expresión de genes proy antiapoptóticos (Saraste, 2000). Se caracteriza por un encogimiento de la célula y su núcleo, una condensación de la cromatina y su posterior fragmentación, y la formación de cuerpos apoptóticos que van a dar lugar a una rápida fagocitosis por macrófagos o células del parénquima, de modo no se produce respuesta inflamatoria tan severa. El entrar o no en fase apoptótica se produce por la suma de factores tanto externos como internos, y dado que es un proceso programado puede llegar a ser un proceso reversible si se dan las señales adecuadas. El hecho que determina la entrada en apoptosis es la producción de determinadas proteínas, principalmente de la familia de las caspasas, que llevarán a cabo los procesos de degradación del DNA, y degradación proteolítica en cuerpos apoptóticos. Por otra parte aunque una isquemia severa provoca la muerte inevitable de los cardiomiocitos, parece que la muerte por necrosis ocurre relativamente tarde tras la isquemia. Los cardiomiocitos que mueren en los primeros minutos de la reperfusión muestran rotura de la membrana plasmática y liberación enzimática, y está asociada a la hipercontractura provocada por la alta concentración de Ca2+ intracelular, dando un patrón histológico característico llamado necrosis en bandas de contracción (Ganote, 1983). El resto de cardiomiocitos que mueren de forma tardía, incluso horas después de la reperfusión lo hacen por necrosis o por apoptosis (García-Dorado, 1992). Estos procesos apoptóticos pueden deberse a la toxicidad asociada a la respuesta inflamatoria tras la reperfusión, pero también pueden ser el resultado final de procesos iniciados en el periodo de isquemia (Bartling, 1998). 16 y la modulación del Ca2+ intracelular. La activación de PKA se asoció a la apertura de canales de K+ y la hiperpolarización del potencial de membrana, induciendo un descenso de la [Ca2+]i y la consecuente relajación (LubomiRov, 2001; Huang, 2003). Recientemente, hemos demostrado en arteria coronaria humana que el efecto independiente de endotelio de la Ucn está relacionado con el cAMP y la activación de PKA (Smani, 2011), y con la inhibición tanto de la iPLA2 (fosfolipasa A2 independiente de Ca2+) como de la entrada de Ca2+ regulada por reservorios (SOCE) en arteria coronaria de rata (Smani, 2007). A.4.3. Efectos de urocortina sobre el miocardio. Existen varios tipos celulares en el corazón que expresan tanto Ucn como CRFR2. Dado que las isoformas de Ucn tienen una concentración plasmática alta, es razonable pensar que la Ucn actúa principalmente como las hormonas sintetizadas sistemáticamente que pueden influir sobre la función cardiaca. Sin embargo, la Ucn también tiene efectos cardiacos a través del sistema nervioso parasimpático como sugirió Rademaker (2006), en cuyo trabajo indicaron que Ucn ejerce sus efectos a través del eje hipotalámico-pituitario-adrenal directamente sobre la función cardiaca. De hecho la aplicación de Ucn3 directamente en el cerebro fue capaz de modular el gasto cardiaco a través de la médula adrenal (Chu, 2004). Pero por otro lado Ucn1 incrementó el gasto, la frecuencia y la contractilidad cardiaca sin acción del sistema nervioso en ovejas conscientes (Parkes, 1997). Diferentes trabajos también han demostrado potentes efectos de la Ucn en corazones perfundidos ex vivo en Langendorff y/o en cardiomiocitos ventriculares aislados (Yang, 2006; Calderón-Sánchez, 2009). Además, y sobre todo, hay datos que indican que la Ucn puede ser también producida directamente en el corazón por las células cardiacas ante un daño por I/R, lo que sugiere una acción autocrina de la Ucn sobre los cardiomiocitos (Knight, 2008). Está bien aceptado que Ucn tiene un potente efecto inotrópico y lusitrópico en el corazón. La Ucn actúa a través de CRF-R2 para estimular la actividad de PKA (Yang, 2006 y 2011). Sin embargo, a diferencia de los cardiomiocitos de conejos y ratones, esta mayor actividad de PKA no parece ser la base de los efectos inotrópicos y 17 lusitrópicos en cardiomiocitos de rata. Recientemente nuestro grupo ha publicado un mecanismo alternativo en cardiomiocitos ventriculares de rata donde se demuestra que los efectos agudos de Ucn implican un nuevo efector relacionado con cAMP llamado Epac (proteína de intercambio activada por cAMP). El incremento de la actividad de PKA por Ucn no desencadena efectos inotrópico y lusitrópico positivos, mientras que la inhibición de Epac previene los efectos de Ucn. Además de Epac, las vías de señalización de PKC (proteín kinasa C) y de las MAPK (proteín kinasa activada por mitógenos) también contribuyen a la acción inotrópica positiva de Ucn. Por otra parte, el efecto inotrópico provocado por Ucn se relaciona con una mejora importante en el manejo del Ca2+ intracelular (Calderón-Sánchez, 2009). La Ucn incrementa la amplitud de la corriente de Ca2+ tipo L (IcaL) tanto en cardiomiocitos de rata como de conejo, así como los transientes de [Ca2+]i de cardiomiocitos estimulados eléctricamente, y por último aumenta el contenido de Ca2+ del retículo sarcoplásmco (Smani, 2010). En conjunto, según se detalla en la figura A6, Ucn actúa mediante múltiples vías de señalización, incluyendo cAMP/PKA, Epac, PKC, MAPK y CaMKII, para promover los efectos inotrópicos y lusitrópicos en cardiomiocitos. Figura A6. Efectos inotrópicos de Ucn sobre los cardiomiocitos. Fuente: Díaz I, 2012 18 A.4.4. Urocortina en protección cardiaca. La aplicación de Ucn durante los primeros minutos después de un infarto reduce la muerte celular necrótica y apoptótica en corazones de rata aislados, previene parcialmente el vaciado de los reservorios de energía celular y mejora la función ventricular (Scarabelli , 2002). Ucn también promueve cardioprotección frente a I/R en corazones de rata perfundidos de forma aislada (Lawrence 2003). Recientemente, nuestro grupo ha demostrado que la aplicación de Ucn en el comienzo de la reperfusión recupera totalmente la contractilidad del corazón, además de mejorar rápidamente el manejo del Ca2+ intracelular. Ucn induce una completa recuperación de la amplitud de los transientes de Ca2+, y una recuperación a niveles normales de la concentración del Ca2+ diastólico, debido a la mejora de la actividad del intercambiador Na+/ Ca2+ (NCX) (Calderón-Sánchez, 2011). Varios estudios del grupo de Latchman han demostrado que Ucn previene la permeabilidad transitoria mitocondrial en respuesta al daño por reperfusión reduciendo el estrés oxidativo indirectamente (Lawrence, 2004; Townsend, 2007). Estos hallazgos sugieren que la acción a corto plazo de la Ucn es debida, al menos parcialmente, al mejor manejo intracelular de Ca2+ que evita la sobrecarga que se produce después de la reperfusión. Los mecanismos de señalización implicados en la cardioprotección por Ucn se deben principalmente a tres cascadas de kinasas tales como PKC, MAPK, y PI3K (fosfoinositol 3-kinasa). La familia PKC es una familia de serina/treonina kinasas que ha sido implicada en la fisiopatología de la insuficiencia cardiaca (Simonis, 2002). En corazones perfundidos en Langendorff, Ucn promueve la relocalización de PKC-epsilon desde el citosol a la mitocondria; y además la inhibición de PKC previene el efecto cardioprotector de Ucn (Lawrence, 2005). Por otro lado, miembros de la cascada MAPK tales como MEK1/2 y ERK1/2 han sido descritos como mediadores de la cardioprotección por Ucn (Yang, 2011). Las MAPK pueden estimular diferentes factores de transcripción produciendo respuestas celulares como la proliferación, diferenciación, supervivencia o apoptosis (Bonni, 1999; Wada, 2004). Del mismo modo, 19 la cardioprotección provocada por Ucn se perdió cuando la PI3K, capaz de activar a la proteína Akt, fue inhibida específicamente (Brar, 2002). Sin embargo mientras los efectos a corto plazo de Ucn son bien conocidos, estos cambios de señalización celular y cambios de expresión génica a más largo plazo han sido poco estudiados, si bien hay indicios de una fuerte modulación de la transcripción génica y la expresión de proteínas. De hecho, los efectos protectores de Ucn se relacionaron con la expresión de proteínas con propiedades cardioprotectoras bien conocidas y demostradas. Por ejemplo Ucn incrementa la expresión de la proteína de choque térmico 90 (Hsp 90) a través de la vía MEK1/2 en cardiomiocitos de rata (Brar, 2002), aumenta la expresión de cardiotrofina-1 (Janjua, 2003), o activa AKT que regula a la baja la expresión de diferentes genes que promueven la supervivencia celular (Brar, 2002). Además, en un análisis de expresión por microarray usando un modelo in vivo de daño por I/R, la administración de Ucn1 o Ucn2 revela una regulación diferencial de 66 y 141 genes respectivamente. Estos genes regulados por Ucn están implicados en procesos de metabolismo y muerte celular, estrés oxidativo, etc, y pueden ser útiles para proporcionar un mayor entendimiento de la complejidad del proceso de cardioprotección (Barry, 2010). Ucn modula la expresión de genes importantes como el canal de K+ sensible a ATP (KATP), iPLA2, y PKC-epsilon, que intervienen en la regulación del medio mitocondrial y parece evitar la apoptosis inducida por la mitocondria (Steer, 2001; Lawrence, 2002). De hecho nuestro grupo ha demostrado recientemente que en células de músculo liso de arteria coronaria Ucn disminuye la actividad y la expresión de la iPLA2 independiente de Ca2+, que se activa en el miocardio isquémico durante la isquemia y que, en parte, es responsable del daño por I/R al liberar ácido araquidónico de las membranas (Smani, 2007). 20 A.5. Cambios de expresión génica durante un IAM: Papel de los microRNAs. Trabajos recientes han mostrado cambios temporales en los perfiles de expresión génica en respuesta a un IAM, que además son específicos según las diferentes zonas del miocardio (Prat-Vidal, 2013). Se han encontrado cambios de expresión génica que ocurren específicamente por el daño isquémico en biopsias de miocardio humano y de modelos animales (Gabrielsen, 2007; Kittleson 2005). Dentro de los procesos de regulación génica que están ocurriendo en el remodelado adverso después de una I/R nuestro grupo se ha interesado recientemente por un mecanismo regulador de expresión génica que ha sido descrito hace relativamente poco tiempo, y con una gran relevancia dado el gran potencial como herramienta y/o diana terapéutica. Hablamos de los microRNAs, actualmente reconocidos como uno de los mecanismos más importantes de regulación de la expresión génica. Figura A7. Vías de señalización activadas por Ucn en los cardiomiocitos. Fuente: Díaz I, 2012 21 Los microRNAs constituyen a día de hoy un área en auge en la investigación cardiovascular. La propia descripción del perfil de microRNAs en diferentes situaciones fisiopatológicas ha generado gran interés en la comunidad científica (Mendell, 2012). Actualmente está bien descrito que el propio proceso de I/R es capaz de regular la expresión de microRNAs específicos (Shan, 2009), y estos han sido descritos como reguladores de procesos tan importantes para los cardiomiocitos como la señalización por Ca2+ intracelular (Pan, 2015), y la actividad de las mitocondrias (Wang, 2011). Concretamente en la cardiopatía isquémica se han descrito microRNAs como miR-24, que puede proteger a los cardiomiocitos del daño isquémico mejorando su supervivencia (Li, 2012) (Guo, 2015). Además los microRNAs juegan un papel importante en los procesos fisiológicos de remodelado ventricular, entre otros: i) en la adaptación del miocardio ante el propio daño por I/R (Karakikes, 2013; Duisters, 2009), ii) en la regulación del mecanismo de apoptosis en cardiomiocitos (Li, 2010), pero también en el proceso de muerte por necrosis (Piccoli, 2015); iii) así como en la regulación de genes pro-fibróticos (Van Rooij, 2008). A.5.1. Biología de los microRNAs. Los microRNAs son pequeñas moléculas de RNA de cadena simple formado por 22 nucleótidos sintetizadas de manera endógena por la propia célula, pero que no codifican para proteína. Los microRNAs regulan la expresión génica a nivel posttranscripcional mediante unión con la región no codificante del extremo 3´ (3´ UTR) del ARN mensajero de sus genes diana, lo que induce su degradación o inhibe la traducción a proteína (Parker, 2004). Se estima que una tercera parte de los genes del organismo están regulados por microRNAs. Un gen determinado puede ser diana de varios microRNAs, mientras que un mismo microRNA puede regular decenas de genes debido a la complementariedad solamente parcial en las secuencias de apareamiento, dando lugar a la formación de circuitos de regulación altamente complejos (Lim, 2005). Los microRNAs que modulan la transcripción de genes cardiacos pueden a su vez modular la propia transcripción de otros microRNAs, amplificando la señal. De hecho “los microRNAs trabajan juntos unos con otros” en la regulación de una solo diana, o bien regulando una ruta de señalización completa (Matkovich 2013). Como 22 consecuencia hay que tener en cuenta que la mayoría de microRNAs no tienen un efecto drástico sobre un gen diana, sino que más bien al contrario, suelen producir una pequeña atenuación en la expresión de sus genes diana, y que es, en conjunto trabajando de forma sinérgica, por lo que son piezas clave en la regulación de un proceso fisiológico. Por ejemplo miR-21 tiene un papel importante en el desarrollo de la fibrosis, donde está involucrado en la proliferación de fibroblastos cardiacos (Thum, 2009), en su diferenciación (Bronnum 2013), y en la secreción de proteínas de la matriz extracelular (Roy, 2009), pero también se ha descrito su papel en la muerte por apoptosis de los cardiomiocitos (Yang, 2014). Las regiones de ADN que codifican para los microRNAs están localizadas principalmente dentro de intrones de genes que codifican para proteínas, aunque también pueden aparecer en regiones intergénicas o exónicas (Rodríguez, 2004). Cuando el microRNA se encuentra una región intrónica del gen que codifica el mRNA que va a regular, la expresión del microRNA puede ir correlacionada con la regulación transcripcional de su gen diana y de esta manera se explicaría la especificidad tisular Figura A8. Biogénesis y procesamiento de los microRNAs. Fuente: Armanda Marie, Applied Biosystem 23 (Bartel, 2004). Sin embargo la expresión de los microRNAs puede ser regulada de forma independiente a través de sus propios elementos reguladores (Zeng, 2013). Como se observa de forma resumida en la figura A8 los microRNAs son transcritos por la RNA polimerasa II que produce una larga molécula de RNA, conocida como pri-microRNA (Lee, 2004). A lo largo de esta larga cadena de RNA se forma una estructura en horquilla (hairpin stem-loop) de unos 60-70 nucleótidos, la cual es cortada por una endonucleasa RNasa-III conocida con el nombre de Drosha dando lugar al pre-microRNA. (Lee, 2003; Denli, 2004). Luego es exportado al citoplasma de forma activa a través Exportina-5 (Lund, 2004). Una vez en el citoplasma este premicroRNA es cortado por una endonucleasa RNasa-III conocida como Dicer, dando lugar a una molécula de doble cadena microRNA duplex (Hutvagner 2001). De este microRNA duplex, se separan las dos cadenas y una de ellas da lugar al microRNA maduro, que es una cadena lineal de RNA de unos 22-24 nucleótidos. A.5.2. Mecanismos de acción de los microRNAs Para realizar su función la molécula microRNA madura se incorpora al complejo ribonucleoproteico conocido como RISC (RNA-induced silencing complex), que es la maquinaria catalítica responsable de la degradación del mRNA diana y/o de la inhibición de su traducción. El complejo RISC humano incluye a Dicer, a las proteínas Argonauta, a TRBP (HIV-1 transactivation responsive element) y a PACT (proteína de unión a RNA de doble cadena). Dicer está altamente conservada en eucariotas y siempre tiene un dominio DEAD-box RNA-helicase que hidroliza ATP para abrir RNA de doble cadena. De la familia Argonauta, AGO1 es necesaria para la producción del microRNA maduro, mientras que AGO2 es el enzima catalítico que corta el mRNA diana (Khvorova, 2003). Los dos pasos cruciales en el ensamblaje de RISC son: la selección de la cadena del microRNA sense o antisense, seguido de la potencial destrucción de la otra cadena. Una vez el RISC se ha ensamblado con la cadena (microRNA) que le hace de guía, este se une por complementariedad al mRNA diana en la región UTR 3’ para inducir su degradación o bloquear su traducción. 24 Los microRNAs regulan negativamente la expresión génica a través de dos mecanismos principales: la degradación del mRNA diana y la represión traduccional. Una vez el microRNA se incorpora en el complejo RISC, tendrá lugar un mecanismo u otro dependiendo del grado de complementariedad del microRNA con su mensajero diana. Si la complementariedad es elevada o total se producirá la degradación del mRNA (Bagga 2005), mientras que si la complementariedad es menor se producirá una inhibición de la traducción. Doench y Sharp (2004) demostraron que la capacidad de los microRNAs para inhibir la traducción dependía de la energía libre de unión entre los primeros 8 nucleótidos del extremos 5’ del microRNA con el mRNA diana, región que se conoce como seed-sequence. Según esto un microRNA puede actuar sobre muchas zonas UTR 3’ de un gran número de genes (Lim, 2005). A.5.3. Regulación de la expresión de los microRNAs Los microRNAs están muy conservados filogenéticamente y a menudo se organizan en tandem o en clusters (Laun, 2001). Estas organizaciones pueden tener una particular importancia en el control de la expresión génica y en la propia expresión de estos microRNAs, ya que cuando un grupo de microRNAs de secuencias similares se encuentra agrupado en un cluster, los productos de la expresión de estos microRNAs se pueden sincronizar para regular un conjunto de mRNA dianas. Sin embargo, estos clusters pueden contener también microRNAs con diferentes secuencias, que se dirigirán cada uno hacia sus dianas específicas. Muchos de los microRNAs están codificados en regiones intrónicas de sus propios genes diana (Kim, 2006). Se cree que estos microRNAs están corregulados con sus genes huésped (Ying, 2005), aunque es posible que estos microRNAs puedan tener a su vez sus propios promotores. Un claro ejemplo son los microRNAs musculoespecíficos miR-208, -208b y -499, los cuales están codificados en intrones de diferentes miosinas de cadena pesada (MHC). Los genes MHC se expresan específicamente en cardiomiocitos por lo que dichos microRNAs se expresan también casi exclusivamente en dicho tejido. Como se observa en el esquema de la figura A9 la expresión de alfa y beta MHC se regula recíprocamente durante el remodelado 25 cardiaco y se ha demostrado que miR-208 codificado en la isoforma alfa de MHC controla la expresión de la isoforma beta de MHC, gen que codifica a su vez a miR208b (Van Rooij, 2007). La expresión de genes específicos de tejido es controlada por redes transcripcionales complejas. Consistentemente, la transcripción de microRNAs específicos de tejido a menudo se modula por los mismos factores reguladores que regulan el mRNA. Por ejemplo, la diferenciación del músculo esquelético y cardíaco se caracteriza por la activación transcripcional de genes específicos musculares a través de la cooperación del factor de respuesta a suero (SRF) y el factor potenciador de miocitos 2 (MEF2) con factores de transcripción hélice-bucle-hélice específicos de músculo, incluyendo Myf-5, MyoD y miogenina (Black, 1998). Recientemente se ha descrito que SRF y MEF2 promueven la transcripción de varios microRNAs específicos de cardiomiocitos, incluyendo miR-1, -133, -206, y -208 (Schlesinger 2011). Aquí hay que señalar que además de cambios estables de expresión de microRNAs, estos pueden ser rápidamente inducidos por factores de crecimiento y en algunos casos estos cambios pueden ser muy transitorios. Sin embargo muy poco se conoce sobre la tasa de recambio de los microRNAs. De hecho aunque se conoce un sistema de degradación de microRNAs en A. thaliana (Ramachandran, 2008), no se conocepacticamente nada sobre el control de la degradación de microRNAs en mamíferos. No obstante parece que los microRNAs son bastante estables in vivo, incluso después de haber inhibido la maquinaria procesadora de microRNAs (Kuehbacher, Figura A9. Circuito de regulación intrónico de miR-208 y miR-208b sobre la expresión de los genes de la cadena pesada de miosina (MHC) alfa y beta. Fuente: Van Rooij, 2007 32 endocrina (Vickers, 2011). De hecho hay trabajos que sugieren que más allá de una mera liberación de los microRNAs citoplasmáticos como consecuencia del daño celular por I/R, esta liberación podría estar mediada y regulada, formando parte de un proceso activo mucho más complejo (Zhu, 2011). Además recientemente se ha demostrado que microRNAs circulantes son capaces de modificar la expresión de genes diana en las células receptoras (Viereck, 2014). Que los microRNAs liberados en un proceso de I/R tengan una función específica en el posterior remodelado del miocardio les hace ser unos potenciales biomarcadores tanto de daño como predictores de la aparición posteriormente de insuficiencia cardiaca. A.5.7. microRNAs marcadores de IAM. Se han publicado varios trabajos proponiendo microRNAs candidatos con potencial valor como biomarcadores de IAM y enfermedad coronaria. Sin embargo son series muy pequeñas de pacientes y en algunos casos con datos contradictorios. No obstante hay algunos resultados prometedores; miR-208 y miR-499, microRNAs específicamente expresados en corazón, parecen ser claros marcadores de IAM, ya que se encuentran niveles muy aumentados en las primeras horas tras el evento. Los niveles de miR-208 son indetectables en los pacientes sin IAM y se pueden detectar en el 100 % de los pacientes con IAM a las 4 horas del inicio del cuadro, con un área bajo la curva de 0,94. En otro estudio, los niveles de miR-499 estaban elevados a las 3 horas del dolor en el 93 % de los pacientes con IAM, con un área bajo la curva de 0,97 (Devaux, 2012). Por otro lado miR-1 y miR-133a que son microRNAs altamente expresados en células de músculo liso vascular parecen encontrarse elevados en sangre en pacientes con enfermedad cardiovascular de origen isquémico (Kuwabara, 2011). En un estudio prospectivo internacional y multicéntrico, se analizaron 6 microRNAs (miR-133a, miR-208b, miR-223, miR-320a, miR-451 y miR-499) en 1155 pacientes atendidos por dolor torácico en un servicio de urgencias. El 19 % fue diagnosticado de IAM. Los niveles de miR-208b, miR-499 y miR-320a fueron significativamente mayores en estos pacientes. El mejor rendimiento diagnóstico se 33 observó con miR-208b, si bien menor que el de la troponina T y troponina T ultrasensible. Asimismo, si bien los niveles de miR-208b fueron mayores en los pacientes que murieron en los primeros 30 días, el valor de predicción fue bajo, y ninguno de los microRNAs predijo la mortalidad a largo plazo (Devaux, 2015). En la tabla 2 puede verse un resumen de diferentes microRNAs estudiados como biomarcadores hasta la fecha. A pesar de todos los avances y de algunos resultados alentadores sobre el uso de microRNAs circulantes como futuros biomarcadores, todavía es necesario resolver algunas cuestiones. La extracción de microRNAs extracelulares no es una tarea fácil, ya que se encuentran en cantidades relativamente bajas en la sangre y la falta de normalizadores endógenos fiables dificulta la cuantificación específica de microRNAs circulantes. De momento, no existe un consenso en cuanto a la metodología a seguir, la obtención y preparación de las muestras y el método de cuantificación y normalización de los resultados. Por tanto, es necesaria la estandarización de protocolos para el desarrollo de microRNAs circulantes como nuevos biomarcadores. Tabla 2. Relación de microRNAs circulantes utilizados como marcadores de IAM e insuficiencia cardiaca en ensayos clínicos. Fuente: propia 35 B. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS La cardiopatía isquémica es un problema de salud de primer orden y las complicaciones asociadas a la terapia de revascularización derivan en la aparición de insuficiencia cardiaca a largo plazo en un gran número de pacientes. La investigación de nuevos tratamientos cardioprotectores debe tener como objetivo buscar la recuperación de la función cardiaca a corto plazo, y tratar de reducir la frecuencia de aparición de remodelado ventricular adverso a largo plazo. Nuestra hipótesis de trabajo se basa en la posibilidad de que Urocortina, como molécula cardioprotectora con efectos inotrópicos positivos a corto plazo, sea capaz de desencadenar procesos de regulación transcripcional que podrían estar generando una respuesta celular sobre procesos de supervivencia y muerte celular. Siendo la regulación post-transcripcional por microRNAs un factor de estudio clave para el entendimiento de este proceso. El objetivo principal de esta tesis ha sido profundizar en el conocimiento de la vía de señalización activada por Urocortina en el tratamiento cardioprotector frente a I/R, principalmente a través de los procesos de regulación génica y expresión de microRNAs que a más largo plazo están implicados en los procesos de supervivencia y muerte celular de los cardiomiocitos. Los objetivos específicos son los siguientes: i) Validar el efecto cardioprotector de Ucn en diferentes modelos experimentales de I/R. ii) Determinar el efecto de Urocortina sobre los procesos de supervivencia y muerte celular de cardiomiocitos adultos después de I/R. iii) Estudiar el efecto de Urocortina sobre la expresión de genes relacionados con los procesos de supervivencia y muerte celular por apoptosis. iv) Caracterizar los microRNAs implicados en la cardioprotección inducida por Urocortina después de I/R. 37 C. MATERIALES Y MÉTODOS C.1. Animales de experimentación. Todos los animales utilizados fueron tratados según las normas establecidas en la Convención Europea para la protección de animales empleados con fines experimentales (86/609/EEC) y conforme a la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio”, publicado por el US National Institute of Health (NIH Publication No. 85-23, revised 1996). Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité ético para la investigación animal de la Universidad de Sevilla. Las ratas utilizadas fueron sujetos machos de entre 250 y 300 g de peso de la raza Wistar que permanecían estabuladas en unas condiciones de luz/oscuridad con ciclos de 12h y con una temperatura y humedad controladas. C.2. Modelo animal de I/R in vivo. Realizamos un modelo animal de I/R en rata, mediante ligadura reversible de la arteria coronaria. La técnica quirúrgica se inicia con la anestesia mediante ketamina a 10 mg/kg e intubación con un catéter de 16g para la ventilación con respirador de 2,5 ml de volumen tidal y 60 ventilación/minuto. La temperatura se controla de forma precisa entre 35 y 37ºC mediante una manta eléctrica con sonda rectal acoplada (HB 101/2, Harvard Apparatus). Se practica toracotomía por el quinto espacio intercostal izquierdo tras la apertura del pericardio para exponer el corazón. Se localiza la coronaria descendente anterior izquierda que se encuentra junto a la orejuela izquierda hacia el ápex del ventrículo. La arteria se ocluye mediante un lazo reversible con sutura fina del nº 6 durante 30 minutos. El infarto es confirmado por la elevación del segmento ST del ECG y por la cianosis distal en la superficie pericárdica. Tras 40 minutos de isquemia se abre de nuevo la arteria para reperfundir el corazón y se resuelve la toracotomía (Circ Res 1996; 79:949-956). Para evitar la alta mortalidad los animales se medican con Lidocaína 10 mg/Kg. Para evitar la trombosis se administra por vía intraperitoneal heparina 200 UI/Kg. Después de la reperfusión se cierra rápidamente el tórax y se restaura la presión negativa intratorácica. 38 Grupos de experimentación en modelo animal de I/R. 1. Grupo I/R: grupo experimental de isquemia/reperfusión por oclusión transitoria de la arteria coronaria descendente anterior. A lo largo de la experiencia se evaluaron los diferentes parámetros de la función ventricular por ecografía a 1 y a 6 semanas. 2. Grupo I/R tratado con Ucn: ratas sometidas al mismo protocolo de I/R junto con la administración de Ucn a concentración de 150 µg/Kg por vía intravenosa. 3. Grupo Sham: ratas control que se someten al mismo estrés quirúrgico sin realizar la oclusión transitoria de la arteria coronaria, y en su caso se inyecta suero salino como control específico de la administración de Ucn. Cada grupo experimental se formó con 5 ratas y se replicó exactamente igual a diferencia del tiempo de estabulación post-quirúrgica para obtener otros 3 subgrupos temporales; sacrificio a las 24h, 7 días y 6 semanas. C.2.1. Evaluación de la función cardiaca en el modelo animal de isquemia/reperfusión. En todos los grupos se evaluó la función ventricular a lo largo de 1 y/o 6 semanas mediante ecocardiografía y al finalizar se realizó cardioectomia para la recogida de muestras. La función ventricular fue evaluada por ecocardiografía mediante una prueba pre-operatoria, y pruebas post-operatorias a las 24h, a los 7 días y a las 6 semanas. Se utiliza un sistema de imagen Vevo2100 con un transductor para animales de pequeño tamaño de 13-24 MHz (Visualsonics; Amsterdam, Netherlands). Las medidas convencionales (diámetros telediastólico y telesistólico del ventrículo izquierdo, grosor de pared anterior y posterior del ventrículo) se obtienen del registro en modo M por debajo del borde de los velos de la válvula mitral. De estas medidas se obtiene la fracción de acortamiento y la masa del ventrículo izquierdo. Los volúmenes telediastólico y telesistólico, así como la fracción de eyección del ventrículo izquierdo se obtienen mediante el método de Simpson a partir de las proyecciones de eje largo paraesternal y eje corto a nivel basal, medio y apical, como ha sido previamente 39 descrito (Thibault, 2007). El análisis se realiza off-line mediante el paquete EchoPAC (GE Medical Systems). C.3. Perfusión de corazones ex-vivo en el sistema Langendorff. Las ratas utilizadas fueron heparinizadas (4IU/g i.p.) y anestesiadas mediante administración intraperitoneal de Ketamina (1-2 ml/ 250g). Los corazones fueron extraídos lo más rápidamente posible y montados a través de una cánula aórtica al sistema Langendorff donde fueron perfundidos con una solución oxigenada (95 %O2 y 5%CO2) denominada Krebs-Henseleit (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 5 mM Glucosa) y calentada a 37ºC. Para poder evaluar la función isovolumétrica del ventrículo izquierdo se introdujo en dicho ventrículo un balón de latex inflado con agua destilada de manera que se consiguiera estabilizar la presión telediastólica en el ventrículo izquierdo (PVD) en 10 mm Hg. Todos los corazones fueron sometidos a un periodo de estabilización de 30 minutos en el que se instalan los electrodos, el balón ventricular y el sensor de temperatura en el ventrículo derecho. Se conecta un estimulador de marcapasos y se fija una frecuencia cardiaca de 160 latidos por minuto. A través de transductores de presión y mediante el software Power Lab (AD Instrument) se obtuvieron registros de la frecuencia cardiaca, la presión de perfusión coronaria (PPC) y la presión desarrollada por el ventrículo izquierdo (PVS). A continuación se explican los principales parámetros hemodinámicos. PVS: Valor máximo de la Presión Ventricular Sistólica o Presión Pico. Es el valor máximo de la curva de presión ejercida por el ventrículo izquierdo para un momento dado en el que se toma la medida. PVM: Presión Ventricular Media. Es el valor medio calculado entre el valor mínimo y máximo de la curva de presión ejercida por el ventrículo izquierdo sobre el balón intraventricular. PVD: Presión Ventricular Diastólica. Es el valor mínimo de la curva de presión ejercida por el ventrículo izquierdo en un momento dado. Esta variable fue fijada a 10 mmHg 40 mediante el llenado del balón intraventricular de manera que los cambios de presión registrados fuesen debidos al funcionamiento del ventrículo izquierdo. RV: Resistencias vasculares. Es un parámetro que informa de la resistencia que ejercen las coronarias a la perfusión. Se calcula a partir de la PPC y el flujo de perfusión en cada momento. dP/dt: Derivada de la curva de Presión del Ventrículo Izquierdo (PVI) respecto del tiempo. Es el Incremento de Presión respecto al tiempo de la curva de Presión del Ventrículo Izquierdo. Permite el análisis de la velocidad de acortamiento de la fibra cardiaca, y es un parámetro representativo de la función sistólica o Contractilidad. La contractilidad del corazón en los diferentes protocolos fue evaluada mediante el análisis de la +dP/dt, el cual corresponde al porcentaje de incremento del +dP/dt normalizado respecto al valor basal de +dP/dt tras el periodo de estabilización. C.3.1. Protocolos experimentales realizados. - Isquemia/reperfusión (I/R). El protocolo de isquemia/reperfusión en los corazones montados en este sistema Langendorff se realiza mediante el cierre de la perfusión externa, lo que provoca una isquemia global del corazón por la ausencia de flujo, durante 40 minutos. El periodo de reperfusión comienza con la apertura de la válvula de perfusión y la restauración del flujo con solución de perfusión y se mantiene durante 120 minutos. - Postcondicionamiento con Urocortina (Ucn). El protocolo realizado fue similar al anterior con la diferencia de que durante los 30 minutos primeros de reperfusión se aplicó 10nM de Urocortina en la solución de perfusión. C.4. Cultivo in vitro de cardiomiocitos. C.4.1. Dispersión y cultivo primario de cardiomiocitos adultos de rata. La ratas utilizadas fueron heparinizadas (4IU/g i.p.) y anestesiadas mediante administración intraperitoneal de Ketamina (1-2 ml/ 250g). Los corazones se extraen lo más rápidamente posible y son montados a través de una cánula aórtica al sistema Langendorff especialmente diseñado para la dispersión de células de miocardio. 41 Durante 2 minutos se perfunde el corazón con una solución “Tyrode” (130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 25 mM Hepes, 22 mM glucosa, 0,4 mM Na2H2PO4, 5 mM NaHCO3) libre de Ca2+ y con 0,2 mM de EGTA a 37ºC. Entonces se pasa a perfundir durante 10 minutos con solución Tyrode sin EGTA y que contiene colagenasa tipo II (Worthington) y 50µM de CaCl2. Después de esta digestión los corazones son extraídos del aparato Langendorff y tanto el ventrículo izquierdo como el derecho se cortan en pequeños trozos mediante bisturí estéril e incubados en agitación con solución Tyrode con 0,5 mM CaCl2 y 1 mg/ml de BSA (albumin from serum bovine, Sigma) para disociar las células del tejido muscular cardiaco. Finalmente las células aisladas son filtradas, centrifugadas y resuspendidas en solución Tyrode con 1 mM de CaCl2, de manera que los cardiomiocitos resistentes a Ca2+ se siembran en placas de cultivo previamente tratadas con laminina (Sigma Aldrich) y se mantienen en un incubador a 37ºC y atmósfera controlada con 95% de O2 y 5 % de CO2 durante 3-4 horas hasta la realización de los protocolos de isquemia-reperfusión. C.4.2. Dispersión y cultivo primario de cardiomiocitos neonatos de rata. Para la dispersión y cultivo de cardiomiocitos neonatales se utilizan las crías procedentes de dos madres gestantes entre el primer y tercer día desde su nacimiento. Tras el sacrificio de los animales mediante decapitación, se procede a la extracción y lavado con PBS de los corazones, manteniéndolos en todo momento a 4ºC. Posteriormente los corazones se limpian, eliminando las aurículas y el tejido vascular, hasta quedarnos con los ventrículos aislados. En condiciones de esterilidad, se procede a trocear los ventrículos con ayuda de una tijera curva hasta conseguir una buena homogenización. Posteriormente se lavan con PBS y los corazones se incuban en 5 ml de tripsina en un baño a 37ºC durante 20 minutos, agitando vigorosamente cada 10 minutos. Acto seguido se deja decantar y se elimina el sobrenadante. Se vuelve a incubar otros 20 minutos con tripsina. Se deja decantar y ahora recogemos el sobrenadante en el que se encuentran las células que van dispersándose. Se pasan a un falcon de 15 ml con PBS y suero para inactivar la tripsina, y se centrifugan a 1000rpm durante 5 minutos. Se elimina el sobrenadante, se 48 mix, 8 µl de agua y 1 µl de cDNA, para un total de 20 µl finales. El programa de amplificación fue el estándar para sondas Taqman consistente en 10 minutos a 95ºC y 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC seguidos de 60 segundos a 60ºC. En todos los casos el annealing y la síntesis de DNA se realizaron en el mismo paso a 60ºC. Todas las qRTPCRs y la toma de datos se realizaron en la máquina 7900HT de Applied Biosystem utilizando el software SDS 2.4 y el RQ Manager 1.2.1 para obtener los Cts. El análisis estadístico y la cuantificación relativa mediante el método del 2^ddCt se realizó en el DataAssist v2.0 tomando como referencia para normalizar la expresión de los genes endógenos U87 para los microRNAs y beta-actina y gapdh para la expresión génica de mRNA. C.7. PCR-array de apoptosis celular. Se utilizó el panel de PCR “Rat Apoptosis RT² Profiler PCR Array” (Cat. PAHS012) de SA Bioscience que permite el análisis de expresión de un panel de 84 genes involucrados en la muerte celular utilizando una PCR a tiempo real 7900HT de Applied. Obtuvimos el RNA de cardiomiocitos adultos de rata sometidos a I/R tratados y sin tratar con Ucn y fueron retrotranscritos utilizando el kit RT2 First Strand recomendado por SA Bioscience. El cDNA obtenido fue mezclado con la master mix RT2 SYBR Green qPCR de SA Bioscience y cargado por igual en todos los pocillos del array donde están pre-cargados los primers de cada ensayo. El experimento consistió en enfrentar los datos de amplificación de las muestras tratadas con Ucn contra el control sin tratar para poder realizar una cuantificación relativa de la expresión de los 84 genes de interés mediante el método 2^ddCt descrito anteriormente para la qRT-PCR convencional. Debido a la naturaleza del array, y para tratar de minimizar la variabilidad intrínseca de un experimento único, realizamos un pull de cDNAs mezclando equitativamente los cDNAs de cuatro experimentos independientes, lo que nos daba cierta garantía en los resultados obtenidos. No obstante los resultados obtenidos en el array fueron sometidos a validación mediante qRT-PCR para obtener datos estadísticamente significativos. 49 C.8. Detección de apoptosis y necrosis. Ensayo de Annexin V/ Ioduro de Propidio. Para determinar el tipo de muerte celular involucrada en la protección por Ucn usamos el kit "Annexin VFITC kit” (Cat. 4830-01-K. Trevigen) para detectar células en apoptosis y necrosis en cultivo de cardiomiocitos adultos de rata. Durante la apoptosis ocurre una rápida y ubicua exposición de fosfatidil-serina en la superficie celular que es susceptible de unirse a Annexin-FITC y ser detectado por fluorescencia. A su vez el ioduro de propidio (IP) es usado para determinar la población celular que ha perdido la integridad celular, lo que indica necrosis o apoptosis tardía. Brevemente, cardiomiocitos adultos de rata fueron sembrados en una micro-placa de 6 canales “µ-Slide VI 0,4, de IBID”. Las células fueron incubadas normalmente, se les realizó los tratamientos oportunos y el protocolo de I/R descrito anteriormente. Posteriormente las células fueron tratadas in vivo; Se incubaron con 100 µl del binding buffer proporcionado por el kit, con 1 µl de Annexin-FITC durante 1 hora. Entonces se añadie 1 µl de IP y se incuba durante 15 minutos más. Después de los lavados se procede a la toma de imágenes de fluorescencia en el microscopio confocal “Leica TCS SP2”. Se tomaron 5 imágenes por condición y en 5 experimentos diferentes usando el objetivo HCX PI Apo CS 40x mediante proyección máxima en el eje z. Las imágenes fueron analizadas mediante el programa “Image J” para cuantificar el porcentaje respecto del total de células: i) sin marcaje (viables), ii) marcadas sólo con AnnexinFITC (apoptosis) y iii) marcadas con IP (necrosis). C.9. Actividad de las Caspasas 3/7, 8 y 9. Para determinar la actividad de las caspasas usamos el kit Caspase-Glo de Promega: i) TB323 para caspasas 3/7, ii) TB332 para caspasa 8, iii) TB333 para caspasa 9. El ensayo proporciona un sustrato sensible de cada caspasa con actividad luciferina al ser degradado, y una luciferasa termoestable. La actividad luciferasa es proporcional a la actividad de la caspasa de cada ensayo. Cultivos de cardiomiocitos tratados y sometidos al protocolo de I/R descrito fueron utilizados para extraer proteínas mediante lisado celular. Los extractos de proteínas fueron estabilizados en nitrógeno 50 líquido y conservados a -80 ºC hasta el momento del ensayo. En una placa de 384 pocillos se cargó 10 µl de proteínas a 1,5 µg/µl junto con 10µl del agente. Se cargaron 5 réplicas de cada condición, y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. La señal luminiscente fue detectada en el luminómetro “Luminoskan Ascent microplate Luminometer”(Thermo Scientific) cada 15 minutos. La cuantificación y análisis fue realizado con el programa Sigmaplot. C.10. Ensayo de citotoxicidad por detección de LDH. Como medida de la citotoxicidad o muerte celular de nuestros cultivos realizamos un ensayo de detección de los niveles de actividad de la enzima Lactato deshidrogenasa (LDH) presente en el medio extracelular. Esta enzima está presente normalmente en el citoplasma de las células vivas y se libera en el medio de cultivo celular al permeabilizarse la membrana de las células muertas. Para ello recogimos los medios de cultivo de cardiomiocitos sometidos al protocolo de I/R tratados y sin tratar con Ucn. Este medio fue centrifugado a 5000 rpm durante 5 minutos a 4ºC para eliminar posibles restos celulares, y el sobrenadante obtenido fue congelado en nitrógeno líquido y guardado a -80 ºC hasta la realización del ensayo. Para medir la actividad LDH utilizamos el kit “LDH cytotoxicity assay Kit (601170)” de Cayman según el protocolo: en una placa de 96 pocillos añadimos 50 µl de medio de cultivo y 50 µl de la mezcla de reacción del kit e incubamos durante 30 minutos. Posteriormente se procede a la lectura de la absorbancia a 490 nm. Después de sustraer los valores correspondientes al blanco cada valor fue referido al valor de máxima citotoxicidad y mostrado en porcentaje. C.11. Búsqueda bioinformática de genes dianas para los microRNAs. Para determinar las posibles dianas de los microRNAs que obtuvimos mediante el array de expresión realizamos un análisis bioinfomático mediante software libre: miRBASE, DIANA, TargetScan, PicTar, miRanda. Las predicciones se basan en los híbridos que se forman entre el microRNA y el mRNA. Estos híbridos se calculan mediante modelos termodinámicos “minimum free 51 energy algorithm” y donde se buscan algunas propiedades importantes como la energía libre, existencia de una región semilla (seed region), número de desemparejamientos, número de bucles, pero también la “accesibilidad” de la estructura secundaria y la interacción entre varias dianas en la misma 3’ UTR. La predicción de dianas de microRNAs se basa fuertemente en la presencia de un “seed” (emparejamiento perfecto de los 7 primeros nucleótidos entre el extremo 5’ del microRNA y la región 3’ UTR) aunque se estima que aproximadamente el 40% de todas las dianas no tienen “seed” sino regiones compensatorias, es decir muchos emparejamientos entre el extremo 3’ del microRNA y la UTR 3’ Cada software tiene un algoritmo determinado donde se prima una u otra propiedad, y debido a la gran cantidad de variables en juego es habitual encontrar grandes diferencias entre los resultados de uno u otro programa. En nuestra búsqueda bioinformática realizamos el análisis con 5 softwares diferentes y elegimos aquellos genes diana que cumplieran los siguientes requisitos: i) que estuvieran dentro de los 15 primeros resultados de cada programa bioinformático. ii) que estuvieran presentes en al menos 2 algoritmos diferentes. iii) que el gen tuviera una descripción en la bibliografía científica que lo relacionara con alguna patología cardiovascular, preferentemente las relacionadas con daños por IAM o remodelado ventricular. De esta manera obtuvimos una relación de genes candidatos a ser dianas de los microRNAs seleccionados. Para poder demostrar in-vivo que estos genes eran de verdad dianas de nuestros microRNAs analizamos la diferencia de expresión de dichos genes en cardiomiocitos neonatales de rata en los que sobre-expresábamos el microRNA de interés mediante un vector lentiviral. C.12. Producción de lentivirus de sobreexpresión de microRNAs. C.12.1. Construcción de los vectores pSD-lenti_125, pSD-lenti_139, pSD-lenti_324. El vector pSD fue cedido por el grupo del Dr. Pintor-Toro del instituto de investigación Cabimer bajo la autorización de su creadora la Dra. Collins. El vector pSD tiene una zona de multiclonning-site con las dianas de restricción BamHI-NotI que utilizamos para clonar la secuencia pre-miRNA de unas 500 pb de nuestros microRNAs. 52 La secuencia de cada pre-miRNA fue obtenida de la web miRBase. Diseñamos primers de PCR para las regiones flanqueantes añadiéndole la secuencia de restricción BamHI en la región 3´ y la secuencia NotI en la región 5´. Realizamos una PCR con dichos primers sobre DNA de rata extraído de la cola de rata mediante PCRTail (Viagen) para amplificar cada pre-miRNA clonado. El producto de PCR se utilizó directamente para ligar en el plásmido pGEM-T que está optimizado para clonar productos de PCR. Posteriormente procedimos a realizar las digestiones con las enzimas de restricción BamHI y NotI tanto en nuestras construcciones pGEM-T_lenti_(125, 324, 139) como en el vector pSD_GFP. En ambos casos el corte con BamHI-NotI fue analizado por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% donde confirmamos la presencia de un inserto de unas 500 pb y una banda superior de 3Kb en el caso del pGEM-T y de unas 10Kb en el caso del pSDGFP. Tanto la banda de 500pb de nuestros pre-miRNAs como la banda de 10kb del pSD fueron aisladas del gel de agarosa y purificadas por el kit “QIAquick gel extraction kit” de Qiagen. Realizamos una ligación de nuestros pre-miRNAs y el plásmido pSD con los extremos BamHI y NotI y obtuvimos una serie de clones positivos que fueron confirmados por la misma restricción en gel de agarosa y mediante secuenciación en “Secugen SL”. Figura C1. Esquema del plásmido de sobreexpresión de microRNAs pSIN-DUAL-microRNA-GFP2 para la producción de lentivirus. 53 C.12.2. Producción de los virus. Utilizamos un sistema lentiviral que consta de 3 plásmidos lentivirales: i) p8.91. Contiene los genes virales estructurales, de replicación, y regulación del virus. ii) pVSV-G. Expresa la envuelta glicoproteíca del virus VSV desde un promotor de CMV, reemplazando el gen “env” del lentivirus. iii) pSD-lenti_(125, 139, 324). Plásmido de sobreexpresión donde se clona el pre-miR de interés y que además expresa GFP. Estos tres plásmidos fueron cotransfectados en células HEK mediante CaCl2 usando el kit CalPhos de Cultek. Se prepara una mezcla de transfección con 3 µg del plásmido p8.91, 6 µg del pVSV, y 9 µg del pSD-lenti, y 85 µl de la solución de Ca2+ 2M en 700 µl totales. Luego se añade gota a gota 700 µl de HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, ph 7) y se incuban 10 minutos a temperatura ambiente. Acto seguido se añade poco a poco sobre 10 ml de medio de cultivo directamente en la placa de cultivo de 15 cm y se dejan en el incubador toda la noche. A la mañana siguiente se cambia el medio y se deja de nuevo 48 horas en cultivo. En este momento se recoge el medio de cultivo y se ultracentrífuga a 50000 g durante 2 horas. El precipitado se resuspende en 100 µl de PBS con 1% de BSA y se procede al título de los virus. Para titular los virus obtenidos se realizaron diluciones seriadas de partículas virales utilizadas para infectar un cultivo de cardiomiocitos neonatales de rata sembrados en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas se analizó la expresión de GFP por microscopía fluorescente invertida hasta detectar la menor dilución de virus que consigue infectar el 100% de células, y extrapolando el tamaño del pocillo de la placa de 24 al que usaremos en los experimentos, placas de 6 pocillos, obtuvimos la cantidad de virus que tenemos que usar para cada construcción lentiviral. 54 En la figura C2 se muestran imágenes de microscopia de fluorescencia de cultivos de cardiomiocitos infectados con diferentes dosis de lentivirus donde puede verse cómo la gran mayoría de células del cultivo están marcadas en verde, debido a la proteína GFP que actúa como “reporter” en el vector lentiviral usado. Además se presenta un gráfico con la cuantificación de los niveles de cada microRNAs en los cultivos infectados con cada lentivirus. En todos los casos se consigue un aumento en la tasa de cambio de cada microRNA al menos seis veces mayor. C.12.3. Infección de cardiomiocitos con lentivirus de sobreexpresión de microRNAs. Aislamos y sembramos 1,8 millones de cardiomiocitos neonatales de rata por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos. A las 48h de la dispersión añadimos la cantidad estimada en el título de partículas virales sobre 1 ml de medio de cultivo. Se incubó durante 16h en el incubador de cultivo hasta la mañana siguiente, donde comprobamos por microscopio de fluorescencia invertido la calidad de infección de Figura C2. Imágenes de cultivos de cardiomiocitos neonatos de rata infectados con dosis crecientes de lentivirus de sobreexpresión de miR-125a, miR-139-3p y miR-324. Y gráficos de cuantificación de la expresión de dichos microRNAs respecto a células infectadas con el vector control. Tasa de cambio miR-139-3p Tasa de cambio miR-324 Tasa de cambio miR-125a 55 nuestro cultivo. Y en el caso de haberse obtenido una alta eficiencia de infección se procede a la extracción de RNA. C.13. Estudio de los microRNAs circulantes en pacientes con IAM reperfundido: estudio miR-IAM. El estudio miRIAM es un estudio prospectivo longitudinal con seguimiento a un año, cuyo objetivo es determinar la cinética de liberación de los microRNAs en pacientes sometidos a angioplastia primaria (ACTP) tras infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST (STEMI) durante las primeras 48 h de ingreso. Y a largo plazo correlacionarlo con aparición de remodelado adverso e insuficiencia cardiaca, para lo cual se realiza un seguimiento clínico con técnicas de imagen de ecografía al alta, una prueba RMN a los 30 días del alta y una prueba ecocardiográfica un año después. Los criterios de inclusión son lo suficientemente estrictos para obtener una cohorte muy homogénea, y donde la liberación de microRNAs sea debida exclusivamente a un proceso de I/R. Los criterios de inclusión fueron: Edad <75 años, IAM de localización anterior con menos de 6 horas de evolución en el momento de empezar la coronariografía, y flujo TIMI 0-1 en la arteria responsable del infarto. Y los criterios de exclusión: historia previa de cardiopatía isquémica, negativa a participar en el estudio por el paciente o insuficiencia renal con filtrado glomerular menor de 30 ml/min. Como grupo control se incluyeron pacientes a los que se les realizó coronografía por dolor torácico que resultaron sin afectación de las arterias coronarias. En el momento de realizar estos experimentos contamos con una cohorte de 10 pacientes y 8 controles. De forma más específica el objetivo del estudio era comparar los microRNAs presentes en el momento justo antes de realizar la intervención de ACTP, frente a las muestras obtenidas tras la reperfusión, de modo que podamos describir qué microRNAs son liberados específicamente por el proceso de reperfusión. El protocolo para la obtención de las muestras de sangre fue el siguiente: a cada paciente se le 56 extrajeron 2 muestras de sangre periférica en los siguientes momentos: 0h justo antes de empezar el cateterismo, y 3h, 12h, 24h y 48h después de la ACTP. En cada punto temporal se extrajeron dos muestras de sangre: una dedicada a la obtención del suero (tubo “clot activator” con 9 ml de sangre) para el análisis de microRNAS en el laboratorio, y la otra (tubo “lithium heparin” con 4 ml de sangre) para las siguientes determinaciones bioquímicas realizadas en el laboratorio del hospital: CPK, Tn T ultrasensible, y NT-proBNP. En el estudio miRIAM la determinación del perfil de expresión de los microRNAs presentes en el suero de pacientes se realizó mediante arrays de expresión, sin embargo en lo que concierne a esta tesis hicimos una determinación directa de los microRNAs miR-125a, miR-139-3p y miR-324, mediante qRT-PCR tal como se describió en el apartado correspondiente. C.14. Análisis de datos. Cada experimento ha sido repetido al menos 5 veces independientes a no ser que se indique expresamente lo contrario. Los datos fueron normalizados respecto al resultado en los controles no tratados designados como 100% en la mayoría de los casos. Todos los resultados han sido presentados como la media ± desviación estándar. La comparación entre el grupo control y el grupo con tratamiento se llevó a cabo mediante el análisis por el test de t-Student si los datos se ajustan a una desviación normal o por el test de Mann-Whitney en caso contrario. Las medias entre diferentes grupos tratados se compararon mediante el análisis de la varianza (ANOVA). 64 D.2.3. Urocortina regula la vía MapK-Erk1/2 mediante la fosforilación de p42/p44. Para profundizar en las vías de señalización implicadas y siendo Erk1/2 un elemento clave de la señalización celular, realizamos experimentos de Western-blot (WB) para cuantificar la cantidad de proteína Erk1/2 que estaba siendo fosforilada por Ucn, activando por tanto la vía de señalización dependiente de Erk1/2. Como puede verse en la figura 5 la aplicación de 10nM de Ucn en cultivo de cardiomiocitos adultos sometidos a I/R aumenta la cantidad de proteína fosforilada tanto de la subunidad p44, como de la p42, de Erk. Como cabe esperar, la aplicación en paralelo de Ucn con 5µM del inhibidor específico PD, impide dicha fosforilación de Erk1/2. Por tanto Ucn es Figura 4. Registro de la contractilidad (+dp/dt)de corazones de rata montados en un sistema Langendorff a los que se les realizó un protocolo de I/R. A) La recuperación en la contractilidad con el tratamiento de Ucn se reduce significativamente con la administración de 20µM de BFA, inhibidor de EPAC, mientras que no se afecta por 1µM H89, inhibidor de PKA. B) El efecto protector de Ucn sobre la contractilidad se ve contrarrestado con 5µM de PD, inhibidor de Erk1/2. + Ucn + Ucn + BFA + Ucn + H89 20 60 100 140 180 30 50 70 90 110 130 Tiempo (min) + dP/dt * *** +Ucn +Ucn Isquemia Reperfusión B) A) Isquemia Reperfusión +Ucn +Ucn 10 50 90 130 170 30 50 70 90 110 130 +dP/dt + Ucn + PD + Ucn **** Tiempo (min) 65 capaz de activar mediante fosforilación a Erk1/2, lo que promoverá la activación de toda la cascada de señalización dependiente de Erk1/2. Por otra parte como habíamos visto indicios de que Ucn y EPAC estaban relacionados, quisimos determinar si la activación de EPAC era capaz de producir la fosforilación de Erk1/2. Para ello tratamos células sometidas a I/R con 10 µM de 8CPT, un activador directo de EPAC. Se puede observar como la activación directa de EPAC tiene una tendencia a promover la fosforilación de Erk1/2. Como control usamos 5 µM de PD para inhibir específicamente Erk1/2 en las células tratadas con 8CPT, y comprobamos como en estas condiciones no se producía dicha fosforilación de Erk1/2, I/R Phospho-Erk 1/2 P44 - P42 - Erk 1/2 total Tubulina P44 - P42 - 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Phospho p42/ p42 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Phospho p44/p44 ** Prot. Fosforilada / prot. total Figura 5. Arriba se muestran imágenes de western blot en cardiomiocitos adultos de rata sometidos a I/R en diferentes condiciones. Abajo la cuantificación de la fracción fosforilada (activa) de las proteínas Erk1/2; tanto p44 como p42, respecto a la cantidad total de erk1/2 (p44 y p42). * * * 66 por tanto estos resultados parecen indicar que Ucn podría activar Erk1/2 al menos en parte también a través de EPAC. D.3. Papel de Ucn sobre la supervivencia celular de los cardiomiocitos. D.3.1. Urocortina previene la muerte de cardiomiocitos adultos sometidos a isquemia/reperfusión. Como hemos visto hasta ahora la aplicación de Ucn tiene un efecto claro sobre la contractilidad del corazón sometido a I/R, y este se debe al menos en parte a la activación de una vía de señalización que incluye a EPAC y a Erk1/2. Pero además de los efectos en agudo sobre la contractilidad que tienen que ver principalmente con la mejora del manejo del Ca2+ intracelular (Calderón, 2011), nos interesaba profundizar en el efecto de Ucn sobre la supervivencia celular a más largo plazo, ya que la pérdida de contractilidad del corazón está asociada a la muerte celular de cardiomiocitos. Para ello realizamos un ensayo de supervivencia celular mediante trypan blue sobre cultivos de cardiomiocitos adultos sometidos a un protocolo de I/R in vitro. En nuestros cultivos celulares de cardiomiocitos la aplicación de 10nM de Ucn previene la muerte celular de dichos cardiomiocitos tras una I/R. En la figura 6 se pueden observar imágenes de cultivos de cardiomiocitos sometidos a I/R tras 18 horas de reperfusión. Respecto a la situación control, el cultivo sometido a I/R presenta un número significativamente mayor de células no viables o muertas. Células morfológicamente identificables por un aspecto hipercontraido y que además incorporan Trypan blue debido al daño en sus membranas. Sin embargo cuando el cultivo de cardiomiocitos sometido a I/R es tratado con 10nM de Ucn se obtiene una mayor proporción de células viables y significativamente menor marcaje de Trypan blue. Como puede observarse en la gráfica de la misma figura 6 los inhibidores de Erk1/2 (PD) y EPAC (BFA) reducen el efecto beneficioso de Ucn sobre la supervivencia, volviendo a encontrarse un mayor número de células no viables marcadas con Trypan blue. 67 De forma paralela recogimos los sobrenadantes de estos mismos cultivos, y analizamos mediante un ELISA los valores de LDH liberado al medio de cultivo. Una mayor presencia de LDH en el medio es indicativa de mayor citotoxicidad o muerte celular, principalmente por necrosis, ya que implica rotura de la membrana plasmática. Consistentemente con los resultados anteriores, la figura 7 muestra como los sobrenadantes de cultivos sometidos a I/R tenían niveles significativamente mayores de LDH respecto a la condición control. Es decir el proceso de I/R tiene un claro efecto citotóxico produciendo un aumento en la mortalidad de los cardiomiocitos. El tratamiento con 10nM de Ucn frente a I/R reduce significativamente el nivel de LDH liberado al medio de cultivo, lo que sugiere que Ucn es capaz de proteger frente a I/R disminuyendo la muerte celular o citotoxicidad. Además cuando inhibimos Erk1/2 con 5μM de PD durante el tratamiento con Ucn, se produce de nuevo una mayor liberación de LDH, reduciendo significativamente el efecto citoprotector de Ucn frente a I/R. Control I/R IR + Ucn Figura 6. Arriba se muestran imágenes de cardiomiocitos adultos en cultivo en situación control, sometidos a I/R, y tratados con 10nM de Ucn. El tratamiento con Ucn mejora la supervivencia celular disminuyendo significativamente el porcentaje de células no viables. Abajo se muestra un gráfico con la cuantificación del porcentaje de células no viables marcadas con trypan blue respecto del total en diferentes tratamientos. Trypan blue / total (%) 10 20 30 40 50 60 70 80 * * # # * # P < 0,05 frente a I/R P < 0,05 frente a Ucn 68 Sin embargo no hemos podido demostrar la implicación de EPAC en la mejora de la muerte celular mediante el análisis de la liberación de LDH. La activación de EPAC directamente con 8CPT no provocó ningún cambio en la liberación de LDH respecto a la situación inicial de I/R. La inhibición de EPAC con un inhibidor específico llamado ESI05 a 10 µM no consiguió afectar de forma significativa la mejora conseguida en el tratamiento con 10 nM de Ucn sobre la disminución de los niveles de LDH, aunque los datos muestran una tendencia hacia una mayor presencia de LDH en el medio cuando se aplica ESI-05 junto con Ucn. D.3.2. Urocortina provoca un cambio en el tipo de muerte celular disminuyendo la necrosis y aumentando la apoptosis. Para pro0fundizar en la acción de Ucn sobre el proceso de muerte celular tras I/R realizamos una serie de experimentos para evaluar el tipo de muerte celular que presentaban los cardiomiocitos después de I/R. Para ello sometimos a los cardiomiocitos al protocolo de I/R simulada con los diferentes tratamientos. A las 18h realizamos en vivo un marcaje con anexina-V para marcar los residuos de fosfatidilserina en la membrana plasmática de las células en apoptosis, y con IP para marcar las células que han muerto y por tanto ya no tienen integridad en sus membranas. Figura 7. Ensayo de citotoxicidad tipo ELISA por detección de LDH en el sobrenadante de cultivos de cardiomiocitos adultos de rata sometidos a I/R. El tratamiento con 10nM de Ucn disminuye los niveles de LDH en el medio celular tras I/R, lo que implica una menor muerte celular. 0 25 50 75 100 125 150 Liberación de LDH (%) * * # * # P < 0,05 frente a I/R P < 0,05 frente a Ucn 69 Como puede verse en la figura 8 los cultivos sometidos a I/R tienen el 40% de sus células marcadas exclusivamente con IP, lo que significa que tras una I/R la mayoría de las células mueren por necrosis. Así el porcentaje de células con marcaje de anexina-V es menor al 20%. Sin embargo cuando las células son tratadas con 10nM de Ucn, tal y como esperabamos aumenta considerablemente el número de células viables, disminuyendo a la vez el porcentaje de células marcadas con IP que mueren por necrosis. Pero además de forma paralela, el tratamiento con Ucn aumenta sorprendentemente la cantidad de células que expresan Annexina-V como marcador de apoptosis. De modo que Ucn no sólo aumenta la supervivencia celular, sino que I/R I/R + Ucn Figura 8. Ensayo de Anexina-V/IP en cultivos de cardiomiocitos adultos de rata sometidos a I/R. Las imágenes muestran dos cultivos de cardiomiocitos con marcaje de anexina-V en verde y ioduro de propidio (IP) en rojo, en situación de I/R, e I/R tratado con 10nM de Ucn. Abajo se muestra la cuantificación del número de células viables, apotóticas y necróticas en cada condición. 0 10 20 30 40 50 60 70 Apoptosis Necrosis Viables IR Ucn número de células (%) * * * I/R I/R + Ucn 70 además promueve que de ocurrir, la muerte celular ocurra mediante el proceso de apoptosis en lugar de necrosis, un mecanismo de muerte más fisiológico, y que genera menos daños secundarios al resto del tejido. Posteriormente evaluamos la implicación de Erk1/2 y EPAC sobre los mecanismos de muerte celular. La figura 9 muestra un gráfico con el análisis cuantitativo de estos mismos experimentos de IP/Anexina-V en cardiomiocitos adultos sometidos a I/R en diferentes condiciones. El tratamiento con 5 µM de PD para inhibir la actividad de Erk1/2 en células protegidas con 10nM de Ucn reduce significativamente la mejora en la viabilidad respecto al tratamiento normal con Ucn. Además el tratamiento con PD aumenta significativamente la cantidad de células que mueren por necrosis respecto al tratamiento con Ucn, mientras que no hay diferencias en el número de células marcadas con anexina-V. Estos resultados parecen indicar que Ucn necesita de la actividad de Erk1/2 para mejorar la supervivencia celular, pero no interviene en el cambio de muerte de necrosis por apoptosis. Por tanto el aumento de 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Control I/R Ucn Ucn + PD 8CPT Ucn + ESI Células apoptóticas Células necroticas Células viables * * * # # * * * # Figura 9. Cuantificación de los ensayos de Anexina-V/IP en cultivos de cardiomiocitos adultos de rata sometidos a I/R en diferentes tratamientos. La aplicación de 5µM PD o10µM de ESI, junto con 10nM de Ucn disminuye la mejora en la supervivencia celular amentando significativamente el número de células en necrosis. La aplicación de 10µM de 8CPT recapitula el efecto protector de Ucn. * # P < 0,05 frente a I/R P < 0,05 frente a Ucn # # número de células (%) 71 la supervivencia de los cardiomiocitos y el cambio en el tipo de muerte celular tras una I/R parecen ser dos mecanismos independientes. De igual manera evaluamos el papel de EPAC sobre el tipo de muerte celular en el proceso de I/R. En la figura 9 se muestra cómo al utilizar 10 µM de ESI-05 para inhibir EPAC durante el tratamiento con Ucn se produce una disminución de la viabilidad celular respecto al tratamiento normal con Ucn, que se acompaña además de un aumento del número de células necróticas. Sin embargo mientras que PD no parecía tener efecto sobre la apoptosis, ESI-05 sí reduce significativamente el número de células con marcaje de anexina-V. Según estos datos EPAC parece estar implicada en el efecto protector de Ucn sobre la supervivencia celular y la inducción de apoptosis. De hecho cuando realizamos un tratamiento con 8CPT en células sometidas a I/R, la activación directa de EPAC consigue una clara mejora de la supervivencia celular, además de disminuir el grado de necrosis, aumentando la apoptosis, realizando un efecto similar al observado durante el tratamiento con Ucn. D.3.3. Urocortina provoca un aumento en la actividad de las caspasas 3/7 y 9, pero no sobre la caspasa 8. Con el objetivo de profundizar en la posible función de Ucn sobre la inducción de la apoptosis realizamos una serie de experimentos para cuantificar la actividad de las caspasas como proteínas efectoras en el proceso de apoptosis. Realizamos un ensayo de actividad de las caspasas 3/7, 8 y 9 en cultivos de cardiomiocitos sometidos a I/R. Como puede verse en la figura 10 la aplicación de 10nM de Ucn resulta en un incremento estadísticamente significativo de la actividad tanto de las caspasas 3/7, como de la caspasa 9. Sin embargo no se observan cambios significativos en la actividad de la caspasa 8. Además el incremento en la actividad de las caspasas 3/7 y la caspasa 9 durante el tratamiento con Ucn se ve significativamente inhibido con la aplicación de 5 µM de PD, el inhibidor de Erk1/2. Por su parte no obtuvimos resultados significativos sobre el papel de EPAC en la actividad de las caspasas, ni al activar directamente EPAC con 8CPT, ni al inhibirlo con ESI-05 durante el tratamiento con Ucn. 72 En resumen Ucn estaría protegiendo el corazón tras un proceso de I/R mediante un incremento de la supervivencia celular a 2 niveles: por un lado Ucn evita que las células mueran, reduciendo el número de células que mueren por necrosis tras una I/R, y por otro lado en aquellas células con un daño irreparable que no pueden evitar la muerte, Ucn favorece la entrada en un proceso de muerte más fisiológico, como es la apoptosis. La protección miocárdica mediada por Ucn a través del aumento de la supervivencia de los cardiomiocitos tras I/R puede explicarse por ejemplo por el mejor manejo del Ca2+ intracelular después de I/R. Sin embargo el mecanismo por el que se favorece la inducción de otro tipo de muerte celular, en este caso programada, como es la apoptosis, implica necesariamente otro tipo de mecanismos celulares que tienen 0 50 100 150 200 250 Caspasa 3/7 0 50 100 150 200 Caspasa 9 * * Figura 10. Ensayo de actividad de caspasas en cultivo de cardiomiocitos adultos de rata sometidos a I/R. A) La aplicación de 10nM de Ucn sobre células sometidas a I/R aumenta la actividad de las caspasas 3/7, y B)caspasa 9. C) Ucn no modifica la actividad de caspasa 8. * * Actividad de caspasa (%) 0 50 100 150 200 Caspasa 8 Actividad de caspasa (%) A) B) C) Actividad de caspasa (%) 73 que ver con cambios de expresión génica, regulación postrancripcional, etc. Y sobre este proceso trataremos de profundizar de aquí en adelante en esta tesis. D.4. Urocortina desencadena una compleja regulación transcripcional. D.4.1. Urocortina actúa sobre la expresión de genes involucrados en el proceso de muerte por apoptosis. En base a los resultados anteriores realizamos una serie de experimentos para tratar de descubrir si la aplicación de Ucn estaba actuando a más largo plazo sobre la supervivencia celular mediante la regulación transcripcional de genes implicados en el proceso de muerte celular por apoptosis. Realizamos un semi-array de expresión génica mediante placas prediseñadas para cuantificar la expresión de una batería de genes relacionados con la apoptosis. Utilizamos un pool de RNAs procedentes de 4 cultivos diferentes de cardiomiocitos adultos de rata sometidos al protocolo de I/R y lo enfrentamos a otro pool equivalente de cultivos sometidos al mismo protocolo de I/R, pero tratados con 10nM de Ucn. Realizamos una cuantificación relativa de la expresión de dichos genes mediante qRTPCR y de este modo determinamos cuánto cambia la expresión de cada gen debido al tratamiento con Ucn. En la figura 11 se presenta la tasa de cambio positiva o negativa para cada gen en el tratamiento con Ucn frente a I/R. Los genes CD40-Lg, Bad, Dffb, Casp14 y Lta, con un cambio de expresión mayor al doble (0,3 en escala logarítmica) fueron considerados para una posterior validación por qRT-PCR. 80 Los resultados del array pueden verse en la figura 15 donde se muestra un gráfico con los microRNAs ordenados por el nivel de tasa de cambio relativa del tratamiento con “Ucn frente a I/R". La aplicación de 10nM de Ucn resultó en un cambio apreciable en el perfil de expresión de microRNAs frente a I/R, encontrándose en los corazones tratados con Ucn 159 microRNAs sobre-expresados (mostrados en B) A) C) +Ucn Ucn pre y post Ucn post I/R + dP/dt -20 -10 0 10 20 30 30 80 130 180 LVEDP (mmHg) ***** * RV (ml/min*mmHg) * * * * * * * 0 50 100 150 200 30 80 130 180 * **** * 0 20 40 60 80 100 120 140 30 80 130 180 Isquemia Reperfusión Figura 14. Registro hemodinámico de corazones de rata montados en un sistema Langendorff comparando el tratamiento con 10nM de Ucn antes de la isquemia (pre y post), y el tratamiento solamente durante la reperfusión (post). Se realizó un protocolo de I/R global por cierre de la perfusión durante 40 minutos y posterior reperfusión durante 2 horas. Ambos tratamientos con 10nM de Ucn, A) recuperan significativamente la contractilidad tras una I/R reflejada como +dp/dt (derivada de la presión en el tiempo), B) tienen una menor presión diastólica final del ventrículo izquierdo (LVEDP), y C) menor resistencia vascular (RV). Ucn pre y post Ucn post I/R Ucn pre y post Ucn post I/R Tiempo (min) +Ucn +Ucn Tiempo (min) Tiempo (min) 81 verde) y 122 sub-expresados (mostrados en rojo). En la figura 16 se muestra una tabla completa con los datos en crudo de cada muestra (4 muestras de I/R y 4 muestras de I/R tratadas con Ucn), el valor de tasa de cambio, y su correspondiente p-Value. Se muestran sombreados los microRNAs con una tasa de cambio mayor a 1,50 y cuyo pvalue es menor a 0,05. Estos fueron los microRNAs candidatos que analizamos posteriormente en el proceso de validación de los resultados del array. Reperfusión Isquemia Isquemia + Ucn 10nM 30´ 40´ 30´ 90´ I/R I/R + Ucn 30´ 40´ 120´ microRNAs - Log (Tasa de cambio) Figura 15. Array de expresión de microRNAs en corazones de rata sometidos a I/R en sistema Langendorff. Se presenta la tasa de cambio en escala logarítmica de la expresión de cada microRNA en cardiomiocitos tratados con 10nM de Ucn, frente a no tratados. En rojo se presentan los microRNAs con valores de tasa de cambio negativos cuya expresión disminuye con Ucn, y en verde aquellos cuyos valores de tasa de cambio son positivos y su expresión aumenta. 82 Figura 16. Array de expresión de microRNAs en corazones de rata sometidos a I/R en sistema Langendorff. microRNAs ordenados por mayor tasa de cambio en el tratamiento con Ucn frente a la I/R sin tratar. Se presentan marcados los microRNas con mayor tasa de cambio que además tíenen un pValue menor a 0,05 los cuales fueron elegidos para realizar la posterior validación meiante qRT-PCR. NOMBRES (gene ID) miRNA1_Ucn277 miRNA2_Ucn265 miRNA3_Ucn166 miRNA4_Ucn077 miRNA5_IR255 miRNA6_IR076 miRNA7_IR106 miRNA8_IR197 Fold Change P.Value rno-miR-139-3p 9,91 9,59 8,76 8,69 10,36 10,00 11,44 11,65 -3,09 0,003 rno-miR-10a-5p 12,32 11,14 8,50 11,40 12,37 11,49 12,24 12,03 -2,28 0,110 rno-miR-324-3p 10,74 10,77 11,80 9,96 10,17 9,58 9,64 9,99 1,96 0,016 rno-miR-145 8,34 8,02 11,06 8,40 8,08 7,94 8,03 8,15 1,88 0,144 rno-miR-125a-3p 8,53 9,18 10,40 8,61 8,47 8,16 8,48 8,40 1,75 0,050 rno-miR-494 10,19 10,87 11,40 8,81 9,95 8,52 10,82 9,05 1,66 0,256 rno-miR-30c-2* 10,47 10,40 10,73 9,86 10,14 10,12 8,89 9,44 1,64 0,035 rno-miR-322* 9,47 9,90 9,57 8,85 9,07 8,93 8,49 8,51 1,62 0,013 rno-miR-181b 10,59 10,12 10,67 9,54 9,96 9,59 9,65 9,06 1,58 0,036 rno-miR-320 10,15 9,60 9,91 9,47 9,05 9,59 9,26 8,83 1,51 0,014 rno-miR-221 10,47 10,28 10,92 10,27 10,62 9,85 10,12 9,12 1,47 0,085 rno-miR-126* 11,06 10,88 8,80 10,67 10,77 10,96 10,88 11,01 -1,47 0,224 rno-miR-500 10,56 10,36 10,70 10,14 10,46 9,85 9,79 9,58 1,44 0,027 rno-miR-140* 11,30 11,01 11,81 10,74 11,22 9,87 11,12 10,64 1,42 0,146 rno-miR-15b 12,21 11,76 10,90 11,89 12,34 11,77 12,40 12,23 -1,41 0,092 rno-miR-99b 10,55 10,09 10,86 9,77 10,30 10,22 9,53 9,30 1,40 0,127 rno-miR-466b 9,89 8,87 9,92 8,68 9,46 8,46 8,82 8,69 1,40 0,167 rno-miR-99a* 9,89 9,90 9,14 9,68 9,00 9,02 9,59 9,10 1,39 0,042 rno-miR-128 10,84 10,56 9,63 10,33 10,56 10,32 9,64 8,97 1,38 0,226 rno-miR-200c 8,10 8,68 8,77 8,64 8,02 8,35 7,93 8,11 1,36 0,023 rno-miR-872 9,09 9,63 8,06 9,00 8,65 8,48 8,44 8,43 1,36 0,138 rno-miR-450a 9,03 9,50 8,49 8,74 8,59 8,81 8,58 8,01 1,36 0,092 rno-miR-24-2* 8,38 8,85 8,80 9,46 8,47 8,64 8,11 8,53 1,35 0,076 rno-miR-30e 13,43 13,31 14,21 13,32 13,17 13,11 13,25 13,02 1,35 0,053 rno-miR-196c 8,46 9,18 8,16 8,77 8,37 7,99 8,35 8,14 1,35 0,067 rno-miR-152 10,46 9,89 8,55 9,87 10,10 10,54 10,00 9,85 -1,35 0,253 rno-miR-7a 9,06 9,00 8,71 8,53 8,44 8,38 8,38 8,41 1,34 0,010 rno-miR-29a 14,92 14,68 15,06 14,62 14,35 14,35 14,59 14,32 1,34 0,010 rno-miR-324-5p 10,58 10,39 9,83 10,02 10,26 9,92 9,63 9,37 1,33 0,097 rno-miR-598-3p 8,72 8,93 7,90 8,37 8,23 7,97 8,15 7,95 1,33 0,079 rno-miR-361 10,69 10,45 10,82 10,36 10,27 10,23 10,18 10,04 1,32 0,011 rno-let-7d* 9,64 10,07 8,23 9,81 9,10 10,08 10,13 10,02 -1,31 0,338 rno-miR-25 11,34 11,05 11,09 10,96 11,04 10,55 11,12 10,16 1,31 0,093 rno-miR-199a-5p 11,13 10,83 9,03 10,96 11,19 10,54 10,92 10,84 -1,30 0,378 rno-miR-342-3p 10,49 10,54 9,60 10,40 10,75 10,45 10,82 10,53 -1,30 0,097 rno-miR-539 8,24 8,19 8,00 8,11 8,75 7,96 8,74 8,58 -1,30 0,064 rno-miR-125a-5p 11,58 11,66 10,73 11,37 11,68 11,53 12,15 11,40 -1,28 0,155 rno-miR-20a 12,32 11,94 10,21 11,77 11,94 11,73 12,09 11,90 -1,28 0,380 rno-miR-532-5p 9,30 9,25 8,94 8,62 9,20 8,58 8,45 8,50 1,27 0,125 rno-miR-301a 11,02 10,97 9,80 10,85 10,79 11,17 10,97 11,07 -1,27 0,211 rno-miR-499 13,01 13,04 12,80 13,08 12,54 12,72 12,53 12,79 1,26 0,015 rno-miR-672 8,85 8,92 8,32 8,67 9,49 8,97 8,41 9,24 -1,26 0,175 rno-miR-30a 13,24 13,39 14,13 13,21 13,25 13,17 13,27 12,93 1,26 0,132 rno-miR-93 10,33 9,19 8,39 9,62 9,34 9,37 9,02 8,46 1,26 0,391 rno-miR-484 9,72 8,18 9,12 8,95 8,75 9,46 8,12 8,32 1,26 0,373 83 D.5.2. Urocortina modifica significativamente la expresión de miR-125a, miR-139-3p y miR-324. Para la validación de los resultados del array se cuantificó la expresión individual de cada microRNA mediante ensayos Taqman qRT-PCR. Se obtuvieron muestras de tejido miocárdico de 5 corazones de rata aislados y perfundidos en el sistema Langendorff a los que se sometió al protocolo de I/R y otros 5 con el tratamiento descrito previamente de 10 nM de Ucn en reperfusión. De cada corazón se obtuvieron 3 muestras diferentes de tejido y se realizó una extracción de RNA total, de modo que obtuvimos 15 replicas de RNA de cada condición. Se realizó una cuantificación relativa de la expresión de miR-30c, miR-29a, miR125a, miR139-3p, miR320 y miR-324 en el miocardio tratado con Ucn frente a I/R, utilizando el gen U87 como control endógeno. En la figura 17 se muestran los niveles de expresión de dichos microRNAs en el tratamiento con Ucn frente al valor basal de I/R. La aplicación de 10nM de Ucn aumenta significativamente la expresión de miR-125a y miR-324 frente a I/R, mientras Log (Tasa de cambio) -0,25 -0,15 -0,05 0,05 0,15 IR Ucn * * ** Figura 17. Nivel de expresión de lmicroRNAs cuantificados mediante qRT-PCR en corazones de rata sometidos a I/R en sistema Langendorff. Se presenta la tasa de cambio en escala logarítmica de la expresión de cada microRNA en los corazones tratados con 10nM de Ucn, frente a los no tratados. I/R I/R + Ucn 84 que inhibe la de miR-139-3p. Por su parte los microRNAs miR-30c, miR-29a, y miR-320 no muestran cambios significativos. Posteriormente realizamos una cuantificación de estos microRNAs sobre cultivos de cardiomiocitos adultos de rata tratados con dosis crecientes de Ucn para comprobar por una parte que dichos microRNAs son expresados especificamente por los cardiomiocitos, y por otra parte que de forma aislada Ucn era capaz de modificar su expresión. Se realizó una cuantificación relativa de cada dosis de Ucn frente a la situación basal o control sin Ucn mediante Taqman qRT-PCR. Como se observa en la figura 18A la aplicación de 10nM de Ucn consigue aumentar significativamente los niveles de miR-125a en los cardiomiocitos, produciéndose un mayor aumento con la aplicación de 50nM. Por su parte en la figura 18B se muestra cómo la expresión de miR-324 se ve aumentada significativamente desde concentraciones tan bajas como 2nM de Ucn, produciendo el mismo efecto las dosis de 10 y 50 nM. En cuanto a miR-139-3p, en la figura 18C se muestra cómo Ucn no provoca cambios significativos de expresión sobre los cardiomiocitos en situación control. D.5.3. Urocortina revierte los cambios en la expresión de miR-125a, miR-139-3p, y miR-324 tras I/R. Para profundizar en el conocimiento de estos microRNAs en el proceso de cardioprotección de Ucn frente a I/R realizamos cultivos de cardiomiocitos adultos que 0 0,25 0,5 miR-139-3p Log (Tasa de cambio) 0 0,25 0,5 miR-125a 0 nM Ucn 2 nM Ucn 10 nM Ucn 50 nM Ucn * * 0 0,5 1 miR-324 0 nM Ucn 2 nM Ucn 10 nM Ucn 50 nM Ucn * * * Figura 18. Nivel de expresión de mir125a, mir324 y miR-139-3p en cultivo de cardiomiocitos adultos de rata tratados con dosis crecientes de Ucn, cuantificados mediante qRT-PCR. A) B) C) 0 nM Ucn 2 nM Ucn 10 nM Ucn 50 nM Ucn 85 sometimos al protocolo de I/R. Y analizamos la expresión de miR-125a, miR-324, y miR139-3p mediante Taqman qRT-PCR durante el tratamiento con 10nM de Ucn, que es la dosis mínima cardioprotectora usada generalmente. Además utilizamos los inhibidores específicos de Erk1/2 y EPAC para evaluar si los cambios de expresión en los microRNAs producidos por Ucn necesitaban de dichas vías de señalización. -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 Control I/R Ucn Ucn + PD Ucn + ESI 8CPT Log (Tasa de cambio) * -0,4 -0,2 0,1 0,3 0,5 Control I/R Ucn Ucn + PD Ucn + ESI 8CPT -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 Control I/R Ucn Ucn + PD Ucn + ESI 8CPT * * * * * * * Log (Tasa de cambio) Log (Tasa de cambio) miR-139-3p miR-125a miR-324 Figura 19. Nivel de expresión de microRNAs cuantificados mediante qRT-PCR en cultivo de cardiomiocitos adultos de rata sometidos a I/R. A) El tratamiento con 10nM de Ucn disminuye significativamente los niveles de mir1393p, efecto inhibido con 10µM de ESI. B) yC) El tratamiento con Ucn aumenta los niveles de mir125a y mir324, efecto inhibido con 5µM de PD. C) B) A) 86 En la figura 19A se muestra cómo el proceso de I/R aumenta significativamente la expresión de miR-139-3p, situación que se revierte cuando aplicamos 10nM de Ucn, de modo que Ucn disminuye significativamente el nivel de expresión de miR-139-3p respecto a la situación de I/R. Además Ucn necesita de EPAC para modificar la expresión de miR-139-3p ya que el tratamiento con el inhibidor de EPAC, ESI-05, elimina el efecto de Ucn sobre miR-139-3p. Y aunque no resulte estadísticamente significativo el tratamiento con 8CPT, que activa EPAC directamente, parece que realiza el mismo efecto que el tratamiento con Ucn, ya que hay una tendencia a reducir el nivel de expresión de miR-139-3p. Sin embargo en estas condiciones el tratamiento con PD no afecta al resultado de Ucn sobre miR-139-3p. De modo que Ucn reduce los niveles de miR-139-3p, que habían sido elevados tras I/R, y lo hace de manera dependiente de EPAC. Por su parte los niveles de miR-125a (figura 19B) y miR-324 (figura 19C) se encuentran significativamente reducidos tras I/R, y la aplicación de 10nM de Ucn recupera la expresión tanto de miR-125a como de miR-324, contrarrestando el efecto de la I/R. En ambos casos la aplicación de PD para inhibir específicamente a Erk1/2 junto con la aplicación de Ucn impide la recuperación de los niveles de miR-125a y miR-324 tras I/R. Por tanto Ucn recupera los niveles de expresión de miR-125a y miR324 tras I/R de una manera dependiente de Erk1/2. Sin embargo no parece que EPAC esté implicado en la regulación de la expresión de miR-125a ni de miR-324, ya que no hay cambios significativos ni al activar EPAC con 8CPT en I/R, ni al inhibirlo con ESI-05 durante el tratamiento con Ucn. D.5.4. Urocortina modula in vivo los niveles de miR-139-3p después de I/R. A continuación se muestran una serie de resultados sobre el modelo animal de I/R in vivo que hemos visto en apartados anteriores. El objetivo de estos experimentos fue estudiar el comportamiento de los microRNAs miR-139-3p, miR-125a y miR-324 descritos anteriormente, en el modelo animal de I/R y evaluar si el tratamiento experimental con Ucn era capaz de regular la expresión de estos microRNAs en el miocardio in vivo. 87 Como vimos en la figura 2 del apartado 1.2 de los resultados, la I/R in vivo provoca una reducción de la contractilidad del corazón del 40% medida por la FE, la cual es recuperada significativamente con el tratamiento de 150 µg/kg de Ucn. En estos animales obtuvimos muestras de RNA total procedente de tejido miocárdico, tanto de la zona isquémica o zona en riesgo, situada por debajo de la ligadura usada para producir el infarto en el modelo, como de una zona remota o anterior a dicha ligadura. Mediante Taqman qRT-PCR cuantificamos la expresión de miR-125a, miR-1393p, y miR-324, en la zona infartada y la zona remota del miocardio de corazones sometidos al modelo de I/R, tratados y sin tratar con Ucn, de forma relativa respecto al grupo de ratas sham o control. -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 miR-139-3p * * Log (Tasa de cambio) -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 miR-125a miR-324 Log (Tasa de cambio) Figura 20. Estudio de microRNAs en un modelo in vivo de I/R en rata. A) Nivel de expresión de mir139-3p en muestras de miocardio del modelo de I/R en rata. mir139-3p se encuentra aumentado en la zona infartada a las 24hde I/R respecto a las sham. Mientras que la administración de 150 µg/Kg de Ucn produce su disminución significativa respecto a I/R. B y C) No hay diferencias significativas en los niveles de expresión de mirR-125a y miR-324 en las mismas muestras de miocardio del modelo de I/R. B) A) C) Log (Tasa de cambio) 88 En la figura 20A se muestra cómo el nivel de expresión de miR-139-3p está significativamente elevado en la zona isquémica de los corazones del modelo de I/R a las 24h de haber realizado el modelo, comparado con el miocardio de las ratas sham. En las ratas tratadas con Ucn el nivel de miR-139-3p en la zona isquémica del corazón descendía significativamente respecto a la zona isquémica de las ratas con I/R sin tratar. De hecho haciendo análisis pareado entre las diferentes zonas del mismo corazón, la expresión de miR-139-3p era significativamente menor en la zona isquémica comparado con la zona remota de los mismos corazones tratados con Ucn. Hay que destacar que esta situación reproduce exactamente lo que ocurre en el modelo ex vivo realizado en el sistema Langendorff (figura 17) y en el modelo in vitro realizado en cardiomiocitos adultos aislados en cultivo (figura 18). Por otra parte estos cambios de expresión de miR-139-3p descritos anteriormente se producen de forma aguda a las 24h de la I/R, sin embargo no hemos encontrado diferencias significativas en el modelo animal 1 semana después. Por otra parte, como se observa en las figuras 20B y 20C, no encontramos diferencias significativas en la expresión de miR-125a ni de miR-324 en ninguno de los puntos estudiados del modelo animal de I/R. D.5.5. Búsqueda de función de los microRNAs miR-125a, miR-139-3p y miR-324 Los microRNAs tienen una función moduladora de la expresión génica y actúan controlando a nivel post-transcripcional la expresión de sus genes diana. Con objeto de profundizar en la red transcripcional regulada en última instancia por Ucn, en adelante trataremos de describir los posibles genes diana de los microRNAs regulados por Ucn: miR-125a, miR-139-3p y miR-324. Como se ha descrito en el apartado de introducción los microRNAs son capaces de unirse a la región 3´ UTR del mRNA de sus genes diana para reprimir su trascripción a proteína. Las propiedades de unión entre microRNAs y su mRNA diana es un tema altamente complejo y cuando se trata de hacer una búsqueda bioinformática hay varios programas que utilizan diferentes algoritmos matemáticos para calcular probabilidades de unión entre ambas moléculas de RNA. Entre las muchas variables que se barajan podemos destacar: i) homología entre la secuencia “seed” del 89 microRNA y la región 5´UTR del mRNA, y ii) número de regiones dentro del mismo mRNA que tiene cierta homología con la secuencia “seed” del microRNA. Por otra parte debido a la propia naturaleza de los microRNAs cuya secuencia seed de unión a mRNA nunca es totalmente homóloga a dicho mRNA, sino que solamente 6 ó 7 residuos de los 8 son complementarios, hace que un mismo microRNA tenga múltiples dianas de mRNAs potenciales, y de hecho un mismo microRNA puede tener realmente varios mRNA diana, sobre los cuales está ejerciendo su función de regulación génica. De modo que el análisis de posibles genes diana para un determinado microRNA no es tarea fácil. Por lo general cada programa con su algoritmo suele dar unos resultados únicos, consistentes en un listado de cientos de posibles mRNA dianas ordenados según la probabilidad que su algoritmo da a la posible unión con la secuencia seed del microRNA concreto que estemos analizando. Figura 21. Lista de posibles genes dianas para mir125a, mir139-3p, y mir324 obtenida mediante análisis bioinformático en las plataformas de software online PicTar, TargetScan, y miRBase. Símbolo nombre completo Ref Seq miR-125a Mtfr1 mitochondrial fission regulator 1 NM_001100977.1 Igf2 insulin-like growth factor 2 NM_001190162.1 Map3k12 mitogen activated protein kinase kinase kinase 12 NM_013055.1 Brca1 breast cancer 1, early onset NM_012514.1 Xbp1 X-box binding protein 1 NM_001004210.2 Map2k7 mitogen activated protein kinase kinase 7 NM_001025425.1 Cpt2 carnitine palmitoyltransferase 2 NM_012930.1 Taz tafazzin NM_001025748.1 Rgs4 regulator of G-protein signaling 4 NM_017214.1 Smad4 SMAD family member 4 NM_019275.2 Nrg1 neuregulin 1 NM_001271130.1 miR-139-3p Igf1r insulin-like growth factor 1 receptor NM_052807.2 Foxo1 forkhead box O1 NM_001191846.2 CxcR4 chemokine (C-X-C motif) receptor 4 NM_022205.3 Pde4A phosphodiesterase 4A, cAMP-specific NM_013101.3 Gnb1 guanine nucleotide binding protein, beta polypeptide 1 NM_030987.2 Col5a2 collagen, type V, alpha 2 NM_053488.1 Camta2 calmodulin binding transcription activator 2 NM_001105801.2 miR-324 Crebbp CREB binding protein NM_133381.3 STAT2 signal transducer and activator of transcription 2 NM_001011905.1 Bcl2l11 (Bim) BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) NM_022612.1 Dnajb6 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6 NM_001013209.1 Nfat5 nuclear factor of activated T-cells 5, tonicity-responsive NM_001107425.1 Dag1 dystroglycan 1 (dystrophin-associated glycoprotein 1) NM_053697.1 Casq1 calsequestrin 1 (fast-twitch, skeletal muscle) NM_001159594.1 96 E. DISCUSIÓN E.1. Protección miocárdica en el IAM. Según el último informe del Sistema Nacional de Salud (2011) la enfermedad isquémica del corazón supuso en 2007 el 9,65% de todas las muertes en nuestro país. El infarto agudo de miocardio (IAM) produce en España aproximadamente 140.000 muertes al año y 5 millones de hospitalizaciones, lo que supone un coste sanitario del 15% del gasto total. A pesar del avance en el tratamiento del IAM, a día de hoy sigue siendo de primera importancia la búsqueda de nuevas estrategias de cardioprotección tanto para reducir el número de muertes directas, como para reducir la probabilidad de que los pacientes que sobreviven a un IAM sufran nuevos eventos cardiovasculares. Sirva como dato que el 20% de estos pacientes reingresan por nuevos eventos isquémicos durante el primer año y más del 50% en los siguientes 7 años. Además la carga de enfermedad de la patología cardiovascular supone un 12,5% del total, debido a la alta mortalidad y a la pérdida de calidad de vida por discapacidad, en gran medida consecuencia de la aparición de insuficiencia cardiaca (IC) después de un IAM (Eva Andrés, 2012). Durante las primeras 12 horas de un IAM el porcentaje de miocardio isquémico recuperable se reduce de forma progresiva. La implementación de estrategias de reperfusión ha hecho que se produzca una reducción marcada de la mortalidad intrahospitalaria en los países desarrollados, disminuyendo desde un 20% en los años 80 a aproximadamente un 5 % en la actualidad (Eapen, 2012). Paradójicamente, esta reducción de la mortalidad ha provocado un aumento de la incidencia de insuficiencia cardiaca posterior. De hecho, la disfunción ventricular post-infarto es una de las principales causas de insuficiencia cardiaca en la actualidad (Callender, 2014). Dado que la necrosis irreversible del miocardio dependiente de la arteria coronaria ocluida es un proceso que transcurre en horas, el manejo del síndrome coronario agudo con elevación del segmento ST se basa en un diagnóstico precoz, y en unas medidas que permitan restaurar lo antes posible el flujo coronario de la arteria ocluida, dentro de las primeras 12 horas del comienzo de los síntomas. La reperfusión, ya sea mediante angioplastia primaria o mediante fibrinolisis, es el tratamiento estándar del IAM con 97 elevación del segmento ST. La restauración rápida del flujo coronario reduce el tamaño del infarto y la mortalidad, sin embargo paradójicamente, esta restauración del flujo sobre células previamente isquémicas y la reactivación del metabolismo celular en unas condiciones no fisiológicas puede producir un daño adicional y complicaciones secundarias. Este fenómeno se conoce como daño por reperfusión, y es más frecuente cuanto más se demora la apertura del vaso. Antes de la muerte celular hay un período en el que los cardiomiocitos aunque viables, son muy vulnerables, de tal manera que la restauración del flujo produce un daño celular adicional, que puede desencadenar procesos celulares adversos e incluso ocasionar muerte celular en una segunda ventana temporal. Existe un continuo interés en encontrar nuevas dianas terapéuticas que puedan potencialmente proteger al corazón de los daños por I/R y cada vez más de las complicaciones posteriores (Chambers, 2010). Gracias a los programas de angioplastia primaria se ha reducido tanto el tiempo de infarto que el tamaño del infarto es por regla general lo suficientemente pequeño para no provocar la muerte del paciente. Sin embargo el hecho de haber sido sometido a una pronta y exitosa reperfusión no significa que el corazón no haya sido dañado. Aún con tiempos de infarto cortos, y por consiguiente tamaños de infarto pequeños, los daños producidos en el miocardio por la I/R acarrean una serie de problemas secundarios cuyo máximo exponente es la aparición de remodelado ventricular adverso e IC. Por tanto la puerta para investigar nuevas terapias cardioprotectoras sigue abierta (Ovice, 2010). E.2. Urocortina como péptido protector tras isquemia/reperfusión. Diferentes estrategias se han utilizado para tratar de mejorar la eficacia de las intervenciones coronarias mediante tratamientos cardioprotectores. Las clásicas estrategias de prey post-condicionamiento isquémico, las cuales han demostrado proteger de manera efectiva el corazón reduciendo el tamaño del infarto, fueron el inicio y la base sobre la que se apoyaron multitud de estudios que buscaban utilizar moléculas o potenciar mecanismos que sucedían en el condicionamiento isquémico (Heusch, 2015). Se ha intentado por ejemplo la inhibición de la MPTP mediante 98 ciclosporina intravenosa (Cung, 2015), o el uso de adenosina con resultados esperanzadores en modelos animales (García-Dorado, 2014), pero escaso éxito en la práctica clínica. Una de las moléculas presentes durante el condicionamiento isquémico con importantes propiedades cardioprotectoras, consideradas por tanto como un cardioprotector endógeno, es la Ucn. En un principio se propuso que la expresión de Ucn era producida por el sistema nervioso central, sin embargo actualmente hay consenso en que Ucn es expresada y liberada directamente por el corazón después de un daño isquémico (Knight, 2008). Nuestros resultados muestran como tanto en un modelo animal de IAM como de I/R los niveles de Ucn en sangre aumentan significativamente. Además analizamos la expresión de su receptor CRF-R2 en muestras de tejido miocárdico en el modelo de IAM e I/R, y mostramos como los niveles de CRF-R2 aumentan en el tejido miocárdico en ambos modelos respecto al grupo control. En ambos casos y consistentemente con los niveles elevados de Ucn en sangre, el aumento de expresión del receptor CRF-R2 ocurre 1 semana después de la lesión, y parece restablecerse tiempo después, volviendo a los valores basales a las 6 semanas de realizar el modelo. Un buen número de investigaciones han colocado a la Ucn como un agente con gran potencial terapéutico debido a sus propiedades cardioprotectoras, sobre todo en trabajos sobre corazones montados ex vivo en sistema Langendorff, frente a los daños por IAM e I/R. Sin embargo no hay tantas evidencias en modelos animales in vivo. De hecho según nuestro conocimiento es la primera vez que se muestra un efecto cardioprotector de Ucn en un modelo animal de I/R in vivo. En la figura 2 hemos mostrado como en un modelo animal de I/R el tratamiento con 150 µg/Kg de Ucn durante los primeros minutos de la reperfusión mejora la recuperación de la contractilidad del corazón 1 semana después de haber realizado la intervención, estimada por la fracción de eyección mediante ecocardiografía. E.2.1. Urocortina mejora la función hemodinámica del corazón tras I/R Así como el papel de Ucn en la protección del miocardio después de un IAM está bastante bien estudiado, no ocurre lo mismo en un infarto reperfundido. Se 99 conoce mucho menos sobre el efecto protector que pueda tener Ucn sobre los daños por reperfusión. En este sentido hay que señalar que las propiedades cardioprotectoras de Ucn envuelven mecanismos de protección a diferentes niveles: i) Por inducción de la relajación a nivel vascular periférico lo que entre otras cosas disminuye la presión arterial media, ii) Por su efecto inotrópico positivo sobre el miocardio mejorando los parámetros hemodinámicos, y iii) y por la activación de mecanismos de supervivencia celular. i) Los efectos beneficiosos de Ucn sobre los vasos sanguíneos se deben principalmente al control de la entrada de Ca2+. Pero además de provocar una vasodilatación sistémica que conlleva una reducción de la presión arterial media, Ucn es capaz de inducir relajación de los vasos del propio corazón, favoreciendo la circulación, datos que han sido publicados anteriormente en nuestro grupo sobre un modelo ex vivo en arteria coronaria de rata (Smani, 2007), y humana (Smani, 2011). Nuestros resultados muestran cómo en corazón aislado y perfundido en sistema Langendorff la aplicación de 10 nM de Ucn disminuye la presión diastólica final y mantiene reducida las resistencias vasculares, disminuyendo la presión coronaria intracardiaca después de una I/R. Estos datos suponen en si mismo una menor carga de trabajo para el corazón, y podrían prevenir la llamada hipercontractura isquémica o rigor, ayudando a la recuperación hemodinámica del corazón, como veremos a continuación. ii) Nuestros datos sobre corazones de rata montados ex vivo en el sistema Langendorff y sometidos a un protocolo de I/R muestran cómo el tratamiento con 10 nM de Ucn produce una recuperación significativamente mejor de la contractilidad. De tal modo que Ucn es capaz de preservar la función hemodinámica del corazón y lo protege de los daños producidos por una I/R. De hecho hemos mostrado y comparado dos formas de aplicar Ucn: por una parte un pre condicionamiento clásico, aplicando Ucn durante todo el protocolo de I/R (Ucn pre y post), y por otra parte un post condicionamiento aplicando Ucn solamente durante los primeros minutos de la reperfusión (Ucn post). En ambos casos la aplicación de Ucn permite recuperar la contractilidad después de I/R de forma equivalente. El hecho de que los efectos beneficiosos de Ucn se mantengan aplicándose en la reperfusión aumenta la 100 relevancia del posible uso clínico de Ucn como agente terapéutico en el tratamiento del IAM, donde no hay posibilidad de aplicar el tratamiento antes de que ocurra. Generalmente la recuperación de la contractilidad en reperfusión se asocia a una disminución del tamaño del infarto y mejora del control del Ca2+ intracelular (Scarabelli, 2002). De hecho en este sentido nuestro grupo ha descrito recientemente un nuevo mecanismo de modulación de la Ucn sobre los canales voltaje dependientes tipo L en cardiomiocitos adultos. La Ucn provoca un aumento en la densidad de la corriente ICaL a través de su receptor CRF-R2 que implica a las proteínas PKC y ERK1/2 (Smani, 2010). iii) Y finalmente el grado de disfunción cardiaca después de un daño isquémico es un reflejo de la gravedad de la lesión a nivel celular, que en último término significa la muerte de los cardiomiocitos, y la formación de una escara o cicatriz en el tejido. Esto se relaciona posteriormente con la aparición de remodelado ventricular adverso, insuficiencia cardiaca y un peor pronóstico de esos corazones a largo plazo. Desde un principio aparecieron en la literatura artículos relacionando el uso de Ucn en I/R con un efecto citoprotector en los cardiomiocitos, tanto por prevención del daño mitocondrial (Lawrence, 2004), como por reducción de la muerte celular (Knight, 2008). Sin embargo Ucn no sólo mejora a corto plazo el manejo del Ca2+ intracelular y reduce el daño mitocondrial, como hemos determinado en nuestro grupo previamente, (Calderón-Sánchez, 2011), sino que activa vías de señalización complejas que promueven protección celular a más largo plazo mediante procesos de regulación de la expresión génica. Prueba de ello son los trabajos que describen como Ucn aumenta los niveles de expresión de proteínas con propiedades cardioprotectoras conocidas como son Hsp90 (Brar, 2002) y Cardiotrofina-1 (Janjua, 2003). A día de hoy no se ha profundizado mucho más en esta vía de estudio, siendo precisamente la complejidad de la regulación génica detrás de Ucn el aspecto en el que profundizaremos a continuación. Veremos la importancia que pueden tener estos mecanismos de regulación génica sobre la supervivencia celular a largo plazo, y el posible remodelado ventricular adverso posterior. 101 E.2.2. Urocortina mejora la supervivencia celular tras I/R Nuestros resultados muestran cómo Ucn proporciona diferentes efectos citoprotectores frente a los daños por I/R. Hemos mostrado como la aplicación de 10 nM de Ucn mejora la supervivencia celular de cardiomiocitos adultos aislados en cultivo después de una I/R, dando lugar a un mayor número de células viables, morfológicamente en buen estado, y con un menor porcentaje de células marcadas con Trypan Blue, indicativo de células muertas donde la membrana plasmática está dañada. Esto ha sido corroborado por una menor presencia de LDH en el medio extracelular en los cultivos de cardiomiocitos tratados con Ucn, reflejando una menor tasa de muerte celular por necrosis. Por otra parte hemos visto cómo la aplicación de Ucn no sólo disminuye el número de células que mueren tras una I/R, además las que mueren lo hacen en mayor medida mediante un proceso de muerte celular programada y que supone un menor impacto en el ambiente celular adyacente (Scarabelli, 2006). Nuestro resultados apoyan la idea de que en conjunto Ucn actúa modulando los mecanismos de muerte celular mediante un cambio en la forma en la que mueren los cardiomiocitos: disminuyendo el número de células que mueren por necrosis, y pasando a hacerlo de manera activa y controlada a través del proceso de apoptosis. Durante mucho tiempo se cuestionó la importancia de la muerte celular por apoptosis frente a la muerte por necrosis en el corazón isquémico. No fue hasta 1994 cuando se relacionó por primera vez la apoptosis con los daños por I/R (Gottlieb, 1994). Sin embargo más allá de ser dos formas de muerte excluyentes hay indicios de que ambos mecanismos pudieran estar conectados. En el inicio de la apoptosis la liberación del citocromo-c mitocondrial desencadena la activación de la cascada de caspasas, pero también produce la perdida de fosforilación oxidativa y reduce la síntesis de ATP, poniendo en peligro el desarrollo de la propia apoptosis (Krippner, 1996). También se ha visto relación entre las calpaínas que dan lugar a necrosis y la activación de las caspasas que van a producir apoptosis (Nakagawa, 2000). La producción de radicales libres, el aumento de la concentración de Ca2+ intracelular y el resto de alteraciones ocurridas durante un periodo de isquemia pueden promover el 102 inicio de apoptosis. No obstante el proceso de apoptosis es dependiente de energía, por lo que aun no está claro si la isquemia en si misma puede disparar la apoptosis, o es necesario que se produzca la reperfusión. Parece claro que si la isquemia que se produce es severa y reduce las reservas de ATP por debajo del 70% es imposible que tenga lugar un proceso apoptótico (Leist, 1997). Durante la isquemia se podrían iniciar las primeras etapas de la apoptosis, pero se necesita la recuperación energética tras la reperfusión para que se complete el proceso apoptótico (Freude, 2000). Por tanto cada vez está más aceptado que sobre todo el daño por reperfusión es capaz de provocar este tipo de muerte celular, y puede ser de gran importancia para la recuperación o el fitness de los corazones infartados a largo plazo (Scarabelli, 2006). El hecho de que un grupo grande de células en un evento lesivo más o menos agudo como es un infarto reperfundido mueran mayoritariamente por necrosis o apoptosis puede tener consecuencias muy diferentes fisiológicamente hablando para el resto del tejido sano. Una muerte masiva de células por necrosis provoca a nivel local una gran liberación de contenido celular que entre otras cosas va a provocar una fuerte respuesta inflamatoria y daños secundarios a las células que permanecen con vida. De hecho ya se ha propuesto anteriormente que conseguir cambiar la necrosis por apoptosis es en si mismo una potente acción cardioprotectora (Chen-Scarabelli, 2004). Nuestros datos confirman que dentro de la acción cardioprotectora de Ucn se encuentra el promover mecanismos celulares que favorecen el cambio del tipo de muerte celular de los cardiomiocitos depués de una I/R. A pesar de que en un principio se propuso que Ucn podía ejercer su función cardioprotectora mediante la disminución de la apoptosis de los cardiomiocitos (Scarabelli, 2002; Valentim, 2006) hay suficiente conocimiento que hace plausible el hecho de que Ucn favorezca el tipo de muerte celular por apoptosis frente a la necrosis: i) Ucn aumenta la supervivencia de los cardiomiocitos tras I/R, y aunque separar ambos tipos de muerte celular es difícil, la disminución de la apoptosis no es en si misma una acción cardioprotectora, que depende más bien del balance necrosis/apoptosis. 103 ii) Los trabajos que describen reducción de los niveles de apoptosis en cardiomiocitos se basan en infartos no reperfundidos, donde ya hay de por si bajos niveles de apoptosis. iii) La muerte por apoptosis necesita mecanismos activos y tiene un coste energético, por lo que es necesario que la célula tenga unas condiciones fisiológicas lo suficientemente mantenidas como para desencadenar los procesos celulares que conlleva la muerte por apoptosis. Y de hecho hay consenso en que Ucn favorece la mejora bionergética de la célula, y mejora el ratio ATP/ADP, en gran medida por la protección de la mitocondria (Lawerence, 2004), por lo tanto la aplicación de Ucn tras una I/R favorecería que se dieran las condiciones necesarias para que la célula pudiera activar los mecanismos de apoptosis. iv) Previamente ha sido descrito por Takatani-Nakase que la acción cardioprotectora ejercida por Ucn se debía a una disminución de la muerte celular independiente de las caspasas y que se debía en gran medida a una reducción en los niveles de la fosfolipasa iPLA2 (Takatani-Nakase, 2010). De hecho en nuestro grupo ya describimos como Ucn era capaz de reducir, no solo la actividad de dicha iPLA2, sino también disminuir su expresión (Smani, 2007). Es decir, tal como apoyan nuestros resultados, Ucn mejora la supervivencia celular de los cardiomiocitos tras I/R. La mejora en la homeostasis del Ca2+ intracelular, la protección de la mitocondria y la mejora de la bioenergética celular, crea unas condiciones citoprotectoras que logran rescatar un número elevado de células que de lo contrario morirían. Ucn reduce el número de células que mueren por necrosis, y por otra parte crea las condiciones necesarias para que un buen número de células con daño irreversible en vez de morir por necrosis, sean capaces de activar el programa de muerte celular controlada, la apoptosis. La activación del programa de muerte celular por apoptosis tiene dos formas de producirse, a través de receptores de muerte en la membrana celular, o a través de la mitocondria. Pero en ambos casos es necesaria la activación secuencial de una cascada de caspasas que en último término van a llevar a cabo los procesos proteolíticos que desencadenan el proceso de muerte propiamente dicha. Nuestros resultados 104 muestran cómo el tratamiento con Ucn es capaz de aumentar significativamente la actividad de las caspasas efectoras 3/7. Por otra parte hemos mostrado cómo Ucn produce un aumento de la actividad de la caspasa 9 perteneciente a la vía apoptótica mitocondrial, mientras que no encontramos cambios en la caspasa 8 perteneciente a la vía apoptótica de los receptores de muerte, resultado esperable dado el número de referencias donde Ucn se relaciona con la mitocondria. E.3. Urocortina desencadena cambios de expresión génica que inducen cardioprotección. E.3.1. Urocortina aumenta la expresión de la proteína proapotótica BAD. Dentro del cambio en el tipo de muerte celular, Ucn puede crear en agudo condiciones que favorecen la recuperación fisiológica celular. De hecho esta mejora en las condiciones celulares alarga la escala de tiempo en la que se desencadenan los siguientes mecanismos. Evidentemente tal cantidad de eventos celulares y metabólicos dan lugar al disparo de múltiples cascadas de señalización que desembocan en cambios de expresión génica, en un intento celular de adaptarse a las condiciones fisiológicas sufridas. De hecho en el proceso de apoptosis es muy importante la regulación de los procesos de expresión génica sobre una amplia batería de genes involucrados. Nuestros resultados del array de expresión génica y nuestros experimentos de qRT-PCR confirmaron que hay una importante regulación génica desencadenada por el tratamiento con Ucn. Hemos demostrado que Ucn es capaz de aumentar la expresión de BAD, una proteína de la familia Bcl-2 que promueve o favorece la entrada en apoptosis al liberar a la proteína Bax de la unión con Bcl-XL y Bcl-2 (Yang, 1995). Nuestros resultados confirman que Ucn aumenta no sólo los niveles de mRNA de BAD, sino también la cantidad de proteína total analizada mediante experimentos de WB. Estos resultados pueden explicar al menos parcialmente que Ucn aumente el nivel de apoptosis en los cardiomiocitos tras una I/R. La actividad de la proteína BAD es regulada mediante un sistema de fosforilación, de tal modo que cuando las serinas 112 y 136 están fosforiladas, la proteína se encuentra secuestrada en el citoplasma. Para poder realizar su función BAD tiene que estar en su forma defosforilada de modo que sea capaz de translocarse 105 al núcleo, donde como hemos visto anteriormente, es capaz de unirse a Bcl-2, liberando a Bax de la unión con la misma Bcl-2, de modo que pueda promover la entrada en apoptosis. Por el contrario la cascada de señalización inhibitoria conduce a una fosforilación en los residuos de serina 112 y 136 mediante la proteína AKT, inactivando a la proteína BAD, cuya fosforilación le impide entrar al núcleo y realizar su función (Datta, 1997). Nuestros resultados muestran cómo la mayor cantidad de proteína total obtenida en cardiomiocitos tratados con Ucn se corresponde con una mayor cantidad de la fracción libre de la proteína, es decir activa, lo que dispara la entrada en apoptosis a través de la proteína Bax. La liberación de Bax aumenta la permeabilidad de la membrana mitocondrial, produciéndose una mayor liberación del citocromo-c, que da lugar finalmente a la activación de la caspasa 9 y desencadena el proceso de apoptosis (Marzo, 1998). Estos datos concuerdan con los resultados mostrados anteriormente donde Ucn aumenta significativamente la actividad de caspasa 9. Es importante señalar que existe un trabajo anterior donde se describe un mecanismo proapoptótico inducido por Ucn a través del receptor CRF-R2 en macrófagos, lo que conlleva un efecto antiinflamatorio sobre el sistema inmune (Tsatsanis, 2005). Por tanto es plausible que Ucn ejerza protección miocárdica disminuyendo la respuesta inflamatoria tras una I/R en dos niveles diferentes a través del mismo mecanismo celular: i) Ucn podría aumentar la expresión de BAD y promover la apoptosis de los cardiomiocitos tras I/R, entonces los cuerpos apoptóticos serían fagocitados por los macrófagos sin estimular respuesta inflamatoria, ii) donde al mismo tiempo Ucn estaría promoviendo la aopotosis de dichos macrófagos a través de BAD. Esto daría lugar a una menor respuesta inflamatoria, más eficaz, y con una resolución más rápida del proceso. E.3.2. Urocortina aumenta la expresión de las proteínas antiapotóticas CD40-Lg y XIAP. Nuestros resultados de array de expresión y qRT-PCR muestran como Ucn regula la expresión de otros 2 genes con importante función en los mecanismos de apoptosis celular. Ucn sobre-expresa los genes CD40-Lg y XIAP después de I/R, lo que 112 sobre los genes XIAP y CD40-Lg con función anti-apoptótica, frente al gen proapoptótico BAD. Nuestros resultados del array de expresión de microRNAs en corazones completos sometidos a I/R muestran cómo el tratamiento con 10 nM de Ucn es capaz de producir una modificación de la expresión de una amplia bateria de microRNAs. Tras su validación por qRT-PCR, y después de la bateria de experimentos en diferentes modelos como son el cultivo de cardiomiocitos adultos, a nivel de corazón completo en el sistema Langendorff y el modelo animal de I/R, hemos demostrado que el tratamiento con Ucn frente a I/R regula la expresión de miR-139-3p, miR-125a y miR324. E.4.1. Urocortina disminuye la expresión de miR-139-3p. Nuestros resultados muestran cómo el tratamiento con 10nM de Ucn en corazones sometidos a I/R en el sistema Langendorff reduce el nivel de expresión de miR-139-3p. Hemos demostrado cómo el nivel de miR-139-3p aumenta significativamente en cardiomiocitos aislados cuando son sometidos a I/R. De hecho el nivel de miR-139-3p en situación control es ya tan reducido que en estas condiciones control la aplicación de diferentes dosis de Ucn no produce ninguna modificación en los niveles de expresión de miR-139-3p. Es en dicha situación de I/R cuando la aplicación de 10 nM de Ucn es capaz de reducir el nivel de miR-139-3p de forma significativa, volviendo a los niveles basales de la situación control. Por otra parte al igual que en cultivo de cardiomiocitos, en el modelo animal de I/R in vivo los niveles de miR-139-3p en la zona isquémica son significativamente mayores que en los animales control. En esta situación el tratamiento con Ucn también es capaz de reducir significativamente el nivel de miR-139-3p en la zona isquémica. Existe poca información sobre miR-139-3p, sin embargo recientemente se ha descrito que la cadena miR-139-5p reduce el estrés oxidativo en cardiomiocitos sometidos a hipoxia, reduce el nivel de caspasa 3 y el grado de apoptosis a través de una vía que implica a AKT y GSK-3β (Li, 2015). Nuestros resultados indican que Ucn reduce la expresión de miR-139-3p, que si asumimos que tuviera el mismo efecto que la cadena –5p, resultaría en un estímulo pro-apotótico. 113 El proceso por el cual se regula la expresión de microRNAs es un tema aún no resuelto del todo, sin embargo hemos demostrado que Ucn necesita de la vía de señalización de EPAC para regular la expresión de miR-139-3p, ya que si inhibimos EPAC con el inihibidor ESI-05, se impide el efecto de Ucn sobre la expresión de miR139-3p. De hecho la activación directa de EPAC mediante 8CPT consigue reducir el nivel de expresión de miR-139-3p en cardiomiocitos sometidos a I/R, reproduciendo el efecto de Ucn. La importancia del cAMP en la regulación de los microRNAs ha sido descrita anteriormente. EPAC es capaz de regular la transcripción de miR-124 en cerebro (Yang, 2012). El cAMP y Epac2 incrementan la expresión de la conexina Cx43 y de miR-451 (Mostafavi, 2014). Recientemente se ha visto como la proteína PGE2, situada aguas abajo en la cascada de señalización de EPAC es capaz de regular a miR-21 en macrófagos, donde estaría regulando la polarización e inflamación a través su diana Stat3 (Wang, 2015). Para tratar de encontrar sentido fisiológico o funcional, realizamos un estudio bioinformático en busca de posibles genes diana de miR-139-3p. Después de testear la batería de genes obtenida por el análisis bioinformático, mostramos cómo la sobreexpresión de miR-139-3p reduce significativamente los niveles de PDE4A, una fosfodiesterasa específica de cAMP. De hecho hay algunos trabajos apuntando a qué PDE4A pueda tener algún papel en procesos patológicos del corazón, como son arritmias o hipertrofia (Kostic, 1997; Abi-Gerges, 2009). La función de PDE4A es potenciar a través de PKA las vías de señalización del cAMP por lo que no se puede descartar su relación con EPAC (Moon, 2012). Estos datos van en consonancia con nuestros resultados que muestran como la regulación de Ucn sobre miR-139-3p depende de EPAC, lo que indicaría la presencia de una red de regulación génica que implicaría al cAMP, EPAC, miR-139-3p, y PDE4A entre otros posibles genes diana. Hay que tener en cuenta que nuestros resultados muestran cómo Ucn reduce el nivel de expresión de miR-139-3p, de tal manera que se estaría perdiendo parte de la inhibición de miR-139-3p sobe PDE4A. Por tanto la aplicación de Ucn resultaría en un estímulo que favorece la expresión de PDE4A. 114 E.4.2. Urocortina aumenta la expresión de miR-125a. Nuestros resultados muestran cómo el tratamiento con 10nM de Ucn en corazones sometidos a I/R en el sistema Langendorff aumenta significativamente la expresión de miR-125a. La aplicación de dosis crecientes de Ucn en cultivo de cardiomiocitos adultos resulta en un incremento de la expresión de miR-125a. Hemos mostrado cómo el proceso de I/R en cultivo de cardiomiocitos disminuye significativamente el nivel de expresión de miR-125a. En esta situación la aplicación de 10 nM de Ucn aumenta y recupera el nivel de miR-125a. En el proceso de regulación de la transcripción de miR-125a por Ucn hemos demostrado que necesita de la vía de Erk1/2. El inhibidor de Erk1/2 PD impide que Ucn recupere la expresión de miR-125a tras I/R. En consonancia con nuestros resultados hay varios trabajos donde se describe la importancia de Erk1/2 como regulador de la expresión de microRNAs. Por ejemplo Erk1/2 es capaz de transactivar a miR-133 regulando en cardiomiocitos la expresión de las caspasa-3 y -9 (Wang, 2014). Y de hecho recientemente se ha descrito una relación entre miR-125a y Erk1/2, aunque en este caso es miR-125a quien estaría promoviendo adipogénesis a través de la inhibición de la ruta RhoA/Rock1/Erk1/2 (Chen, 2015). En cuanto a la función de miR-125a realizamos una búsqueda bioinformática de posibles genes diana que fueron testeados posteriormente mediante análisis de su expresión por qRT-PCR. En la figura 23A se muestra como la sobreexpresión de miR125a reduce significativamente los niveles de BrcA1, Cpt2 y Taz: i) BrcA1 es un gen supresor de tumores con función muy bien conocida en cáncer a través de p53. Sin embargo su papel reparador del daño en el ADN no está bien explorado en otros tejidos. Se ha demostrado que BrcA1 juega un papel importante como regulador de la función cardiaca después de un IAM. De tal modo que la pérdida de función de BrcA1 resulta en remodelado ventricular adverso, peor función ventricular, y mayor tasa de mortalidad de los cardiomiocitos tras una lesión isquémica (Shukla, 2011). BrcA1 es por tanto una proteína importante para la respuesta adaptativa de los cardiomiocitos al daño en el ADN, y está relacionada con el metabolismo energético celular, la apoptosis y una peor función cardiaca (Singh, 115 2013). Recientemente se ha descrito que BrcA1 puede estar regulado posttranscripcionalmente por microRNAs (Quann, 2015). En relación con lo anterior se ha propuesto que miR-125a junto a miR125b pueda estar inhibiendo la apoptosis precisamente a través de p53 (Chen, 2015), lo que iría en línea el papel de BrcA1 sobre p53. De hecho en corazón miR-125b podría estar protegiendo de la misma manera el miocardio de los daños por I/R (Wang, 2014). Sin embargo existen varios trabajos donde miR-125a se describe en sentido contrario como promotor de apoptosis junto a otros miembros de la familia let-7, a través de posibles genes diana como la proteína HuR (Guo, 2009), Bcl2, Bcl2L12 y Mcl1 (Tong, 2015), y reprimiendo la expresión de Stat3 (Wang, 2015). No hay duda de que hay que seguir investigando al respecto, pero hay datos que apoyan la importante relación de miR-125a con la supervivencia celular y la apoptosis, lo que apoya nuestros resultados sobre la regulación génica de Ucn sobre los procesos celulares de protección frente a I/R. ii) Hemos mostrado que miR-125a inhibe la expresión del gen Taz (Tafazzin), relacionado con el síndrome de Barth, una miocardiopatía genética dilatada ligada al cromosoma X. Este gen no ha sido descrito nunca en un proceso isquémico, sin embargo sí que se ha relacionado la inhibición de la expresión de Taz con una pérdida del correcto metabolismo energético y la señalización mitocondrial de la apoptosis (Ikon, 2015). iii) Por último miR-125a atenúa la expresión de Cpt2 (carnitina palmitoil-transferasa), una proteína de la membrana mitocondrial encargada de la oxidación de ácidos grasos de cadena larga, y cuya pérdida se ha visto asociada a una peor recuperación del corazón tras un IAM (Sena, 2009). No se han descrito microRNAs que regulen Cpt2, sin embargo la isoforma Cpt1-α sí que es regulada por microRNAs (Iliopoulos, 2010). E.4.3. Urocortina aumenta la expresión de miR-324. Nuestros resultados muestran cómo el tratamiento con 10 nM de Ucn aumenta significativamente la expresión de miR-324 en corazones sometidos a I/R en el sistema Langendorff. La aplicación de dosis crecientes de Ucn en cultivo de cardiomiocitos 116 adultos resulta en un incremento de la expresión de miR-324. Hemos descrito cómo el proceso de I/R en cultivo de cardiomiocitos, al igual que con miR-125a, disminuye significativamente el nivel de expresión de miR-324. En estas condiciones el uso de 10 nM de Ucn recupera el nivel de miR-324, aumentando su expresión. Este efecto se ve contrarrestado al inhibir Erk1/2 mediante PD, de modo que Ucn necesita de la vía Erk 1/2 para regular la expresión de miR-324. En la búsqueda de función de miR-324 a través de sus posibles genes diana mostramos como la sobreexpresión de miR-324 aumenta significativamente los niveles de Stat2 y Bcl2L11. Aunque la función principal de los microRNAs es reprimir la transcripción, y en ocasiones se asume que esa es exclusivamente su función fisiológica, algunos microRNAs pueden actuar en sentido contrario favoreciendo la expresión de sus genes diana (Plaze, 2008; Valinezhad, 2014). Incluso un mismo microRNA puede inhibir o favorecer la expresión de un determinado gen según las condiciones fisiológicas del momento (Saraiya, 2013). De hecho en consonancia con nuestros resultados se ha descrito que miR-324 induce la expresión del gen ReIA a través de su promotor aumentando el nivel de mRNA y proteína de ReIA, lo que aumenta el nivel de caspasa 3 activa (Dharap, 2013). Stat2 es un miembro un tanto minoritario dentro de la familia de proteínas STAT. Las proteínas STAT responden a estímulos externos de diferentes citoquinas y factores de crecimiento actuando como transductores de señal, y activando otros genes a nivel nuclear. La importancia de la vía JAK/STAT sobre el proceso de cardioprotección en el precondicionamiento isquémico se conoce desde hace tiempo (Xuan, 2001). Posteriormente la vía se amplió a JAK/ERK/STAT y se describieron varias propiedades cardioprotectoras, entre ellas la reducción de la inflamación local tras una I/R, y un menor tamaño del infarto (Ottani, 2013). En cualquier caso Stat3 es el miembro más estudiado de la familia, y de hecho se ha descrito recientemente que varias de las propiedades cardioprotectoras de Ucn están mediadas por la vía SRC/STAT3 (Chen-Scarabelli, 2013). Nuestros resultados sobre el aumento de expresión de miR-324 por Ucn indicarían que tal vez parte del efecto cardioprotector estaría potenciándose a través de la mayor expresión de Stat2, otro miembro de la familia STAT. 117 Por último hemos mostrado como miR-324 favorece la expresión de Bcl2L11 (Bcl2-like-11), gen perteneciente a la familia de Bcl2, con propiedades pro-apoptóticas o facilitadoras del proceso de apoptosis. De hecho se ha descrito que Bcl2L11 es diana de miR-24 en cardiomiocitos, y tiene un importante papel protector frente a un IAM (Li, 2013). Nuestros datos indican que Ucn podría favorecer el proceso de apoptosis frente a necrosis tras una I/R, y según lo que acabamos de ver la mayor expresión de miR-324 podría estar apoyando este estímulo a través de Bcl2L11. E.5. miR125a y miR324 como microRNAs circulantes en IAM. El uso potencial de microRNAs como biomarcadores de enfermedad, en este caso de daño miocárdico, está siendo ampliamente estudiado. La importancia de encontrar microRNAs específicos de forma circulante en la sangre de pacientes que han sufrido un IAM, y la posibilidad de que estos predigan la evolución a largo plazo, aparición de complicaciones, insuficiencia cardiaca, etc., ha hecho que se realicen múltiples estudios de investigación. En este sentido hay que destacar los prometedores resultados sobre miR-1, miR-133a, miR-133b y miR-208 , los cuales se han encontrado elevados en pacientes que han sufrido un IAM consistentemente en diferentes estudios (D´Alessandra, 2010; Widera, 2011; Wang, 2014; Li, 2014). Especial relevancia tiene miR-499, el cual parece estar correlacionado con la aparición y gravedad de insuficencia cardiaca posterior (Corsten, 2010). Sin embargo a pesar de todos los avances y de algunos resultados alentadores sobre el uso de microRNAs circulantes como futuros biomarcadores, todavía es necesario resolver algunas cuestiones. La extracción de microRNAs extracelulares no es una tarea fácil, ya que se encuentran en cantidades relativamente bajas en la sangre y la falta de normalizadores endógenos fiables dificulta la cuantificación específica de microRNAs circulantes. De momento, no existe un consenso en cuanto a la metodología a seguir, la obtención y preparación de las muestras y el método de cuantificación y normalización de los resultados. Por tanto, es necesaria la estandarización de protocolos para el desarrollo de microRNAs circulantes como nuevos biomarcadores. 118 Nuestros resultados sobre el nivel circulante de microRNAs presente en la sangre de pacientes que han sufrido un IAM tratado mediante angioplastia primaria; es decir, una I/R, muestran datos relevantes para miR-125a y miR-324: i) En la figura 20B se puede observar como el nivel de miR-125a en sangre es significativamente mayor 12h después de la intervención coronaria respecto al tiempo 0h, momento antes de realizar la intervención de reperfusión, analizando la expresión de forma pareada entre las muestras del mismo paciente. Comparando el nivel de miR125a antes y después de abrir el vaso, comprobamos como hay una liberación de miR125a al torrente sanguíneo debido a la propia reperfusión, ya que el nivel de miR-125a no varía entre el grupo de pacientes control y las muestras de pacientes en isquemia (tiempo 0h). En relación a nuestros resultados recientemente se ha publicado un estudio donde han encontrado niveles elevados de miR-125a-5p en pacientes que sufrían insuficiencia cardiaca con reducción de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (Wong, 2015), hecho que apoya el papel de miR-125a, no sólo como biomarcador, sino en relación a la propia patología isquémica. ii) En la figura 20C se muestra como el nivel de miR-324 es significativamente mayor en todas las muestras de los pacientes con IAM, desde el tiempo 0h en situación de isquemia, hasta las 3h, 12h y 24h después de abrir el vaso, comparado con el grupo de pacientes control. Estos resultados indican que es la isquemia producida durante el IAM lo que provoca la liberación de miR-324, cuyo nivel de expresión se mantiene significativamente elevado al menos 24h después de la intervención. Esto es una buena característica para su potencial uso como biomarcador de daño miocárdico pues sería un marcador más estable, con una ventana amplia para su detección. Esto es relevante porque la mayoría de microRNAs suelen tener curvas temporales muy marcadas con picos de liberación entre 1-3 horas desde la lesión, cayendo rápidamente su nivel en sangre (D'Alessandra, 2010; Wang, 2010). Actualmente no podemos concluir nada definitivo sobre el papel de miR125a y miR-324 en la sangre de pacientes con IAM, y es necesario ampliar el estudio para poder determinar su usabilidad como biomarcadores. Sin embargo estos resultados demuestran que ambos microRNAs son relevantes a nivel cardiaco y deben estar 119 ejerciendo algún papel en el proceso de I/R, apoyando los experimentos mostrados en otros modelos experimentales. A pesar de que todo nuestro trabajo de investigación básica está realizado en un modelo animal en rata, hay indicios suficientes para pensar que los resultados puedan ser extrapolables al ser humano. De hecho los microRNAs están muy conservados y la mayoría de secuencias de microRNAs son similares entre humanos y roedores. De hecho las secuencias de 22 nucleótidos de miR125a, miR-1393p y miR-324 son idénticas en rata y humano. Nuestros resultados en conjunto apoyan la idea de que Ucn es una molécula de carácter cardioprotector cuyos efectos van más allá del inotropismo positivo en el corazón sometido a I/R. Ucn es un potente regulador de la expresión génica que desencadena una respuesta celular de supervivencia y muerte celular por apoptosis bajo la que subyacen mecanismos moleculares que forman un complicado circuito de regulación génica. Hemos descrito como Ucn regula la expresión de los genes CD40-Lg, XIAP, y BAD, además de 3 nuevos microRNAs como miR-139-3p, miR-125a y miR-324. Estos cambios de expresión génica y regulación pos-transcripcional por microRNAs resultan en diferentes estímulos proy anti-apoptóticos que en suma están aumentado la supervivencia de los cardiomiocitos tras una I/R y favoreciendo la apoptosis frente a la necrosis como un mecanismo de muerte celular más fisiológico. 121 F. CONCLUSIONES i. La aplicación terapéutica de Urocortina al inicio de la reperfusión mejora la contractilidad del corazón en un modelo animal de I/R. ii. Urocortina mejora los parámetros hemodinámicos de contractilidad, presión diastólica final, y resistencia vascular en un modelo de I/R en corazón perfundido en sistema Langendorff, cuando es aplicada tanto en precomo en postcondicionamiento. Este efecto cardioprotector necesita de la actividad de Erk1/2 y EPAC. iii. La aplicación de Urocortina mejora la supervivencia celular de los cardiomiocitos sometidos a isquemia/reperfusión in vitro y favorece la muerte celular por apoptosis frente a la necrosis. iv. Urocortina produce sobre-expresión de la proteína BAD con efecto pro-apotótico a nivel de mRNA y proteína, para lo cual necesita de la activación de EPAC. v. Urocortina promueve la sobre-expresión de los genes anti-apoptóticos CD40-Lg y XIAP a nivel de mRNA y proteína, para lo cual necesita de la vía de Erk1/2. vi. La aplicación de Ucn produce un cambio en el perfil de microRNAs del miocardio después del proceso de revascularización. vii. Urocortina reduce el nivel de expresión de miR-139-3p que se ve incrementado después de I/R en diferentes modelos experimentales. Urocortina necesita de EPAC para regular el nivel de expresión de miR-139-3p. viii. La sobreexpresión de miR139-3p inhibe la expresión de la fosfodiesterasa específica de cAMP, PDE4A, como posible gen diana involucrado en procesos patológicos del corazón. ix. Urocortina modula la expresión de los microRNAs miR-125a, y miR-324, aumentando y revertiendo su nivel de expresión después de I/R. Urocortina necesita de Erk1/2 para regular el nivel de expresión de miR-125a y miR-324. 128 Doench JG & Sharp PA. Specificity of microRNA target selection in translational repression. Genes & Development 2004; 18, 504-511. Donaldson CJ, Sutton SW, Perrin MH, Corrigan AZ, Lewis KA, Rivier JE, Vaughan JM, Vale WW. Cloning and characterization of human urocortin. Endocrinology 1996; 137:2167-70. 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