Caracterización de la actividad anti-citomegalovirus de una colección de derivados de niclosamida.

TRABAJO DE FIN DE GRADO Caracterización de la actividad anti-citomegalovirus de una colección de derivados de Niclosamida Autora: Miranda Ramos Murillo Tutor Académico: Dr. Mohammed Rafii El Idrisi Benhnia Tutor del Proyecto: Dr. Javier Sánchez Céspedes Curso académico 2022/2023 Grado en Bioquímica por la Universidad de Sevilla y la Universidad de Málaga UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Biología 2 ÍNDICE 1. Introducción 1.1 Citomegalovirus Humano 1.1.1 Generalidades: Clasificación, estructura y genoma 1.1.2 Ciclo de infección de HCMV 1.2 Impacto clínico de la infección de HCMV 1.2.1 Infección de HCMV en la población 1.2.2 Tratamientos en pacientes inmunodeprimidos con infección HCMV 1.3 Alternativas: Derivados de Niclosamida 2. Justificación 3. Objetivos 4. Materiales y métodos 4.1 Compuestos derivados de Niclosamida 4.2 Línea celular y virus 4.3 Propagación y purificación viral 4.4 Titulación viral 4.5 Citotoxicidad de los compuestos 4.6 Cuantificación de HCMV en combinación con los derivados de Niclosamida, mediante PCR a tiempo real (rtPCR) 4.7 Cuantificación de HCMV-GFP en combinación con los derivados de mediante fluorescencia 4.8 Análisis estadístico 5. Resultados 5.1 Citotoxicidad de los compuestos 5.2 Obtención de Concentración Inhibitoria media de Infección mediante PCR (IC50) 3 5.3 Obtención de Concentración Inhibitoria media de Infección mediante fluorescencia (IC50) 5.4 Índice de selectividad 6. Discusión 7. Conclusiones 8. Bibliografía 4 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Citomegalovirus Humano 1.1.1 Generalidades: Clasificación, estructura y genoma El citomegalovirus humano (HCMV) o herpesvirus-5 (HHV-5) pertenece a la familia Herpesviridae, en concreto a la subfamilia Bethaherpesvirinae. Se encuentra entre los herpesvirus que pueden infectar a humanos (Gugliesi, 2020; Griffiths, 2021). El HCMV infecta entre un 40 a casi un 100% de la población humana (Jean Beltran, 2014), y entre la multitud de células que pueden ser infectadas por HCMV, encontramos células musculares lisas, fibroblastos, macrófagos, hepatocitos, células dendríticas y células endoteliales vasculares (Gugliesi, 2020). En cuanto a la estructura de la cápside del HCMV, está constituida por tres regiones principales: una nucleocápside icosaédrica que contiene el genoma de ADN lineal de doble cadena, un tegumento proteico que rodea a la cápside, la cual es una región compleja y con gran importancia en la infección, y una envoltura lipídica que rodea al virus. La capa lipídica deriva de la célula huésped, a la cual se le adicionan proteínas estructurales propias del virus. El genoma codifica numerosas de estas glicoproteínas estructurales: gB, gH, gL, gO, UL128, UL130, UL131. Según su disposición en pentámero (gH/gL/UL128/UL130/UL131) o trímero (gH/gL/gO) se determina el tropismo celular y son determinantes para la entrada del virus en la célula. La doble cadena de ADN viral clasifica a este tipo de virus en el grupo I dentro de la clasificación de Baltimore (Figura 1). Figura 1: Estructura de Citomegalovirus Humano (HCMV). gB y gH representan glucoproteínas virales de membrana. Tomada de http://synapticpg.com/cmv_fisiopatologia.html 5 El genoma está compuesto aproximadamente por unas 230 kb y está formado por dos regiones únicas (UL y US), cada una flanqueada por dos regiones repetidas (Cunningham, 2010; Gugliesi, 2020) (Figura 2). La expresión de los genes durante la infección de HCMV se lleva a cabo de manera temporal, en 3 fases: genes inmediatamente tempranos, en la que se transcriben los genes que controlan el entorno celular, regulan la expresión de otros genes virales y son responsables de la activación de los genes tempranos y tardíos (Isomura & Stinski, 2003). Se conocen dos mecanismos de entrada en la célula por HCMV. Por un lado, el virus ingresa en las células por endocitosis, seguido de una fusión dependiente de pH bajo. Esta endocitosis requiere la unión de un complejo formado por las proteínas gH, gL y otras tres proteínas codificadas en la región en UL128, 130, 131A con la proteína neuropilina-2 (Nrp-2). En el caso de que las células infectadas sean fibroblastos, la entrada del virus no se produce por endocitosis sino que ésta es iniciada por la unión del trímero gH, gL y gO al receptor α del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) (Ryckman et al., 2006; Wang & Shenk, 2005). Esta unión desencadena una señalización que desemboca en un cambio de conformación en la glicoproteína viral gB. A medida que gB se repliega en su conformación de post-fusión, las membranas viral y celular se fusionan, creando un poro de fusión, a través del cual la cápside viral puede liberarse al interior celular (Connolly et al., 2021) (Figura 3). La cápside se dirige entonces al núcleo celular donde se libera el material genético mientras que las proteínas del tegumento controlan la respuesta de las células del huésped (Jean Beltran & Cristea, 2014) (Figura 4). Figura 2: Estructura del genoma de Citomegalovirus. TRL e IRL se refieren a las regiones repetidas del segmento largo único (UL). IRS y TRS son las regiones repetidas que flanquean al segmento corto único (US) (Sanbonmatsu Gámez et al., 2014) 6 Figura 3: A. Entrada de HCMV en células epiteliales: Se demuestra la interacción entre las proteínas virales de superficie (UL128, 130, 131ª, junto con gHGL) y la proteína neuropilina-2 (Nrp-2) de la superficie celular. B. Entrada en fibroblastos hunmanos. Se demuestra la interacción de gHGL y gO con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα). C. Fusión de membrana viral y membrana plasmática de las células (Connolly et al., 2021) • Figura 4: Ciclo de infección de HCMV. • A. Tras la interacción con los receptores el virus es introducido en la célula. B. A través de un transporte por microtúbulos la partícula viral desnuda llega hasta el núcleo. Aquí se circulariza la cadena de ADN. C. Se da la expresión de genes virales hasta formar nuevas partículas virales. Se transportan mediante un sistema de membranas adquiriendo las proteínas que formarán la envoltura. D. Se produce la liberación del virus completo (Jean Beltran & Cristea, 2014). Jean Beltran & Cristea, 2014) 7 A partir de aquí comienza la cascada de expresión de los diferentes clusters de genes: genes inmediatos tempranos, genes tempranos inmediatos, genes tempranos, genes tardíos y genes de evasión inmunológica. Son los genes tardíos los que hacen que comience el ensamblaje de la partícula viral (Figura 5). No obstante, después de la infección existen dos vías: vía lítica y vía lisogénica. En el caso de que el virus desarrolle latencia viral, por ejemplo en células progenitoras hematopoyéticas, no podrá realizar la infección por la vía lítica (S. J. Chen et al., 2022; Griffiths & Reeves, 2021). La latencia viral se puede deber a la ausencia de replicación lítica sumada a la capacidad que tiene el virus de reactivación en ciertas condiciones, como son la diferenciación y la señalización mediada por inflamación (Griffiths, 2021). Figura 5. Cascada de expresión genómica en CMV. (Sanbonmatsu Gámez et al., 2014) 1.2 Impacto clínico de la infección de HCMV 1.2.1 Infección de HCMV en la población Como se comentó anteriormente, tras la primera infección el HCMV puede volver a activarse en el huésped inmunosuprimido tras un periodo de latencia. Es por ello que, en la población sana e inmunocompetente, la mayoría de infecciones por HCMV evolucionan de manera asintomática y no llegan a producir enfermedad (Gugliesi et al., 2020; Yurochko, n.d.). Existe un equilibrio entre la infección viral y el sistema inmune mediando por inmunoglobulinas de tipo G (Ig-G) (Gugliesi et al., 2020). En el momento en el que rompe este equilibrio, puede darse tal reactivación. (Griffiths & Reeves, 2021). En el caso de pacientes inmunodeprimidos la incidencia de la enfermedad por HCMV es más alta, sobre todo debido a la deficiencia de linfocitos CD4+ y CD8+ (Gugliesi et al., 2020). Esta falta de acción de la respuesta celular 8 específica puede ser debido tanto a patologías, como a trasplantes. La infección puede darse también de manera congénita. La infección por HCMV es una de las más frecuentes en pacientes recién trasplantados, tanto en receptores de trasplante de órgano sólido (TOS) como de progenitores hematopoyéticos TPH), además de ser una infección oportunista en individuos con VIH. Estas infecciones pueden llegar a la presencia del virus en sangre o viremia y una alta carga viral, y esta infección diseminada puede desembocar en afectación orgánica, con elevada morbilidad y mortalidad en esta población (Griffiths & Reeves, 2021). En referencia a los pacientes inmunosuprimidos, dependiendo de su afectación, podemos encontrar diferentes cuadros clínicos: desde fiebre con o sin hepatitis en pacientes receptores de TOS, neumonitis en receptores de TPH, o retinitis y encefalopatías en el caso de pacientes infectados por VIH (Sanbonmatsu Gámez et al., 2014). Los casos más graves se dan en aquellos pacientes con TOS que son seronegativos para el virus, a los que les ha sido trasplantado un órgano procedente de un individuo donador seropositivo para HCMV. En caso de que el receptor fuera seropositivo, podría darse una reactivación, no obstante, de menor gravedad que en la primera situación (Sanbonmatsu Gámez et al., 2014). 1.2.2 Tratamientos en pacientes inmunodeprimidos con infección HCMV Debido a la gravedad de la infección en pacientes inmunodeprimidos es necesario el suministro de fármacos antivirales para prevenir o tratar la potencial infección. Actualmente, el fármaco de elección, tanto para la profilaxis como para tratamiento de infecciones por HCMV es ganciclovir (S. J. Chen et al., 2022; S. Chen & Wang, 2019). Este antiviral es un análogo de aciclovir, un potente agente contra la familia de Herpesvirus (HSV) (Summary, n.d.-a). Ganciclovir es un inhibidor competitivo de las ADN polimerasas virales, tanto de herpes simple como de CMV. Se convierte en ganciclovir trifosfato, el cual impide la incorporación de desoxiguanosina trifosfato en la elongación de del ADN viral. Después de la liberación de pirofosfato, el ganciclovir monofosfato puede añadirse al final de la cadena de ADN viral ralentizando la replicación (Summary, 2020). En caso de generación de resistencia por parte del virus, existen otras alternativas como cidofovir o valganciclovir. Al igual que Ganciclovir, cidofovir es un inhibidor de la polimerasa viral de HCMV (Summary, n.d.-b). Debido a las dificultades asociadas con el uso prolongado de tratamientos intravenosos y su carácter invasivo se han desarrollado tratamientos orales como valganciclovir. Este compuesto es un profármaco del ganciclovir, por lo que mantiene el mismo mecanismo de acción, y muestra una 9 biodisponibilidad diez veces superior al fármaco de origen. Las enzimas esterasas presentes en el intestino y el hígado transforman rápidamente el compuesto en ganciclovir. Otro fármaco, de reciente desarrollo y muy utilizado en la actualidad, sobre todo como profilaxis, es letermovir, fármaco que actúa inhibiendo el complejo ADN terminasa de HCMV, en concreto la subunidad codificada por la región UL56 en el genoma (El Helou & Razonable, 2019). Este procedimiento resulta necesario para la escisión e introducción en la cápside del material genético y es empleado en situaciones de reactivación de HCMV o pacientes seropositivos los cuales son receptores de trasplantes (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios Comunidad et al., 2019). Otra alternativa es foscarnet, un antiviral que impide la replicación en la familia Herpesviridae (AEP, 2020). La estructura de estos antivirales se muestra en la Figura 6, y sus principales características se especifican en la Tabla 1. La actividad variable de todos ellos, en su lugar de acción, sumado a la toxicidad relacionada con la administración como por ejemplo de ganciclovir, que desaconseja su uso en pacientes inmunodeprimidos, y la creciente identificación de HCMV resistentes a todos ellos, tanto de este fármaco como de otros inhibidores de la ADN polimerasa viral como, hacen necesario el desarrollo de nuevos fármacos (S. Chen & Wang, 2019). Figura 6. Estructuras de fármacosn anti-HCMV. A. Aciclovir B. Ganciclovir C. Cidofovir D. Letermovir E. Ganciclovir. Tomado de https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ABC DE 16 Para cada fármaco se realizaron diluciones seriadas 1:2 partiendo de la concentración inhibitoria media obtenida previamente para HAdV5. Para cada fármaco se realizan dos réplicas. (Xu, 2020). Tras un período de incubación de 72 h a 37ºC y 5% de CO2, se recogieron las células con tripsina, se centrifugan a 4000 rpm a 4ºC durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. Para la extracción y purificación del material genético se utilizó el kit comercial E.Z.N.A.® Tissue DNA Kit, siguiendo las indicaciones del fabricante. Con el material genético extraído, se realizó una RT-PCR para cuantificar el ADN de HCMV, el número de genomas generadas en cada condición. Los primers TaqMan y las sondas se diseñaron para una región del gen US28 de HCMV, mediante el software GenSript. Las secuencias de los oligonucleótidos fueron: CMV-F, 5’-TCTACGTGGCTATGTTTGCC-3’ CMV-R, 5’-GGCCGATATCTCATGTAAACAA-3’ CMV-S, 5’-CACGGAGATTGCACTCGATCGC-3’ Las condiciones para llevar a cabo la RTPCR consistieron en 10 μL de ADN purificado, 0,25 μL del primer Forward (CMV-F) a 1/10, 0,75 μL del primer Reverse (CMV-R) a 1/10, 0,25 μL de la sonda (CMV-S) a 1/10 y 12,5 μL de la FastGene 2x PROBE Universal qPCR Master Mix (NIPPON Genetics), por reacción, hasta un volumen final de 15 μL. Se utilizan, como control interno, oligonucleótidos complementarios al gen de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humana (GAPDH), utilizando las mismas condiciones previamente mencionadas. El programa de PCR fue 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95ºC durante 30 segundos y 58ºC durante 60 segundos. Éste se lleva a cabo en el sistema LightCycler 96 (Roche Life Science, USA) (Mazzotta, 2020; Xu, 2020; Xu, 2021). Concentraciones conocidas de ambos genes se utilizaron para crear una curva patrón en paralelo para cada experimento. Con los resultados obtenidos en el ensayo se realiza una extrapolación a estas curvas. A continuación, se realiza una normalización entre ambos datos: se obtendrá la cantidad de copias de ADN del virus en relación con la cantidad de copias de ADN del gen GAPDH (Mazzotta, 2020; Xu, 2020; Xu, 2021). La ecuación que se utilizó fue la siguiente: % HCMV = copias de ADN de HCMV copias de ADN de GAPDH x 100 17 4.7 Cuantificación de HCMV-GFP en combinación con los derivados de niclosamida mediante fluorescencia La cuantificación de HCMV-GFP se realiza en placas de 96 pocillos, sembradas con 2·106 células HFF, a las que añadimos una MOI de 100 pv/célula de HCMV-GFP y se van añadiendo concentraciones decrecientes 1:2 de molécula, partiendo nuevamente de la IC50 para HAdV5. Además, para la cuantificación de HCMV-GFP, realizamos una curva en la que se infecta a concentraciones decrecientes, partiendo de la concentración del stock de virus que se utilice, para poder interpolar nuestros resultados en concentraciones virales conocidas. Tendremos también un control negativo, el cual no se infecta con virus, y un control positivo a la misma concentración que el experimento. Para cada compuesto estudiado se realizaron tres réplicas. Tras el periodo de incubación de 72 h a 37ºC y 5% de CO2 se comprueban los resultados en el microscopio Olympus Invertido®, en el canal de FITC. Cada imagen tomada en el microscopio es procesada en el software ImageJ2 (Fiji). Para cada imagen se toman los puntos de fluorescencia y se convierten a porcentaje de HCMV-GFP y, por tanto, a porcentaje de infección viral. Cada imagen corresponde a una concentración diferente de compuesto. A C+ C- 10x IC50 en HAdV 1/2 IC50 en HAdV 1/4 IC50 en HAdV 1/8 IC50 en HAdV 1/16 IC50 en HAdV 1/32 IC50 en HAdV B C+ C- 10x IC50 en HAdV 1/2 IC50 en HAdV 18 1/4 IC50 en HAdV 1/8 IC50 en HAdV 1/16 IC50 en HAdV 1/32 IC50 en HAdV C C+ C- 10x IC50 en HAdV 1/2 IC50 en HAdV 1/4 IC50 en HAdV 1/8 IC50 en HAdV 1/16 IC50 en HAdV 1/32 IC50 en HAdV D C+ C- 10x IC50 en HAdV 1/2 IC50 en HAdV 1/4 IC50 en HAdV 1/8 IC50 en HAdV 1/16 IC50 en HAdV 1/32 IC50 en HAdV Figura Anexa. Imágenes de microscopía de fluorescencia tras infección con HCMV-GFP. A. JMX0940 B. JMX0895 C. JMX0312 D. JMX0285. 4.8 Análisis estadístico Para los experimentos anteriores, la normalización y extrapolación de datos se realizaron en GraphPad Prism 9 y Microsoft Excel. En el caso del cálculo de concentraciones medias se realizan en GraphPad Prism 9. Todos los experimentos se han realizado por triplicado. En las 19 gráficas se representan los valores de la media de las tres réplicas y las barras de error corresponden a la desviación típica de las réplicas. Para el análisis de los datos y la representación gráfica de los mismos se ha utilizado el software GraphPad Prism. 5. RESULTADOS 5.1 Citotoxicidad de los compuestos La Figura 7 muestra los estudios realizados para determinar la CC50 de los derivados evaluados, cuyos valores se muestran en la Tabla 3. Para el compuesto JMX0461 no se obtiene un resultado de CC50 al analizar informáticamente los datos de fluorescencia obtenidos en Typhoon FLA 9500, por lo que se establece como una concentración superior a la mayor utilizada en el estudio. Para todos los compuestos estudiados se ve un gradiente de citotoxicidad en las placas del ensayo. Los compuestos muestran un rango de citotoxicidad bastante amplio, ya que tratamos con concentraciones próximas a 10 μM en el caso de JMX0312 y de baja citotoxicidad (CC50 = 176,62 μM) para el derivado JMX0673. Los demás compuestos se encuentran en un rango intermedio entre 30 y 90 μM. Ninguno de los valores obtenidos interfiere en ensayos posteriormente realizados ya que se utilizan concentraciones de los diferentes derivados inferiores a las resultantes en CC50. 20 Tabla 3. Citotoxicidad de los compuestos. Compuestos CC50 (μM) (media y desviación) JMX0940 31,71 JMX0895 35,11 JMX0308 60,14 ± 3,7 JMX0312 9,8 ± 0,2 JMX0887 43,28 ± 2,41 JMX0281 60 ± 0,85 JMX0285 46,72 JMX0673 176,62 JMX0461 >80 JMX0493 90 ± 1,79 NY0611 95,36 ± 3,25 NY0624 67,96 ± 1,55 JMX0464 72,21 ± 9,9 Figura 7. Resultados de prueba de citotoxicidad media. De izquierda a derecha las concentraciones utilizadas de cada compuesto fueron 200 μM, 150 μM, 100 μM, 80 μM, 60 μM, 40 μM, 30 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM y 2,5 μM. La última columna corresponde al control negativo sin fármaco. Imagen obtenida a partir de Typhoon FLA 9500. 21 5.2 Obtención de Concentración Inhibitoria 50% mediante PCR (CI50) La actividad de los derivados de niclosamida se evaluó mediante la determinación de su concentración inhibitoria al 50%, que es aquella concentración que inhibe la infectividad viral en el 50% de las células. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8 y la Tabla 4. En el ensayo, la mayor concentración de la que se parte corresponde al valor de CI50 obtenido para cada compuesto en estudios con HAdV-5(Xu, Berastegui-Cabrera, Ye, et al., 2020). Para ocho de los compuestos evaluados se observa una disminución en las copias de HCMV (% HCMV) a medida que se aumenta la concentración de fármaco. Los cinco compuestos que presentaron mayor actividad a concentraciones micromolares fueron JMX0895, JMX0285, JMX0940, JMX0493 y JMX0312. Para este último compuesto se necesita seguir realizando diluciones para conseguir la concentración que inhiba al 50% de la progenie viral. En referencia a los compuestos restantes JMX0461, JMX0308, JMX0673, JMX0281 y JMX0887 no se obtienen resultados satisfactorios en los primeros ensayos que se realizan (Figura 8), por lo que se siguen estudiando aquellos que muestran la tendencia inhibitoria que se busca en este estudio. 5.3 Concentración Inhibitoria 50% mediante fluorescencia (CI50) La actividad inhibidora de los derivados de niclosamida, en este caso medido mediante HCMV-GFP, se muestra en la Tabla 5 y puede complementarse con Figura 9. Se prueba a obtener de otra forma el valor de CI50 con los compuestos que mostraban mayor tendencia inhibitoria en los ensayos con HCMV AD-169 y se intenta obtener un valor de CI50 para el compuesto JMX0312. Las concentraciones utilizadas se corresponden de nuevo a valores de CI50 para cada compuesto probado anteriormente con HAdV-5 (Xu, Berastegui-Cabrera, Ye, et al., 2020). Se comprueba como todos siguen mostrando un aumento del porcentaje viral a medida que se disminuye la concentración del compuesto (Figura 9) y siguen manteniéndose todos los valores a nivel micromolar. 5.4 Índice de selectividad (IS) A partir de los datos obtenidos de citotoxicidad (CC50) y concentración inhibitoria (CI50) se calculó el índice de selectividad (IS) de cada una de las moléculas evaluadas frente a HCMV AD-169 y HCMV-GFP, el cual nos da una idea de la especificidad de la molécula en cuestión 22 a la hora de inhibir la replicación del virus. Se define IS como el cociente entre la concentración citotóxica y la concentración inhibitoria (CC50/CI50). Los datos obtenidos se muestran en Tabla 6. Se observa que todas las concentraciones inhibitorias obtenidas son inferiores a las CC50 de dichos compuestos, lo cual apoya la especificidad de su actividad anti-HCMV, ya que, a mayor IS, mayor especificidad del compuesto. Los derivados con mayor IS fueron JMX0940, JMX0895 y JMX0285 para la infección con HCMV wild type (wt). En el caso del ensayo con HCMV-GFP el orden de mayor a menor índice de selectividad fue JMX0285, JMX0940 y JMX0895. JMX 464 Concentración (M) % CMV C+ C- 7.8 3.9 1.95 0.975 0 50 100 150 200 250 NY0624 Concentración (M) % CMV C+ C- 5 2.5 1.25 0.625 0 50 100 150 200 250 c+ c- 0.375 0.1875 0.09375 0.046875 0 50 100 150 200 250 JMX0285 Concentración (M) % CMV c+ c- 1.8 0.9 0.45 0.225 0 50 100 150 200 250 JMX0312 Concentración (M) % CMV c+ c- 0.03125 0.015625 0.0078125 0.00390625 0 50 100 150 200 250 JMX0940 Concentración (M) % CMV c+ c- 3.9 1.95 0.975 0.4875 0 50 100 150 200 250 JMX0493 Concentración (M) % CMV c+ c- 0.8 0.4 0.2 0.1 0 50 100 150 200 250 JMX0308 Concentración (M) % CMV c+ c- 1.6 0.8 0.4 0.2 0 50 100 150 200 250 JMX0673 Concentración (M) % CMV c+ c- 4.5 2.25 1.125 0.5625 0 50 100 150 200 250 JMX0281 Concentración (M) % CMV c+ c- 0.1375 0.06875 0.034375 0.0171875 0 100 200 JMX0895 Concentración (M) % CMV NY0611 Concentración (M) % CMV C+ C- 9 4.5 2.25 1.125 0 50 100 150 200 250 23 Tabla 4. Concentración de inhibición media medidos con PCR Tabla 5. Concentración de inhibición media medido con GFP Compuestos CI50 (μM) JMX0940 0,205±0,05 JMX0285 0,299±0,16 JMX0895 0,711±0,47 JMX0312 0,321±0,03 Compuestos CI50 (μM) JMX0940 0,005± 0,002 JMX0895 0,024 NY0611 2,086±0,089 JMX0312 <0,225 NY0624 0,627±0,005 JMX0464 0,932±0,004 JMX0285 0,05 JMX0493 0,21 JMX0461 nd JMX0308 nd JMX0673 nd JMX0281 nd JMX0887 nd Figura 8.Porcentaje de HCMV frente a concentraciones de compuestos. Tras el ensayo con los trece compuestos los que se muestran en la figura son los que han proporcionado una mayor inhibición del número de copias del ADN del HCMV. Control positivo (C+) con mismo volumen de DMSO que en la prueba, y con un control negativo (C-) sin infectar. c+ c- 1.1 0.55 0.275 0.1375 0 50 100 150 200 250 JMX0887 Concentración (M) % CMV 24 Tabla 6. Índices de selectividad de compuestos obtenidos con HCMV wild type y HCMV-GFP Compuestos IS - PCR IS - GFP JMX0940 6342 154,7 JMX0895 1462,9 49,4 JMX0308 nd nd JMX0312 >43,6 30,5 JMX0887 nd nd JMX0281 nd nd JMX0285 934,4 156,3 JMX0673 nd nd JMX0461 nd nd JMX0493 428,6 nd NY0611 45,7 nd NY0624 108,4 nd Tabla 7. Recopilación de datos obtenidos (CC50, CI50 con PCR, CI50 con GFP y SI) Compuestos CC50 (μM) (media y desviación) CI50-PCR (μM) CI50-GFP (μM) SI - PCR SI - GFP JMX0940 31,71 0,005 ± 0,002 0,21±0,05 6342 154,68 JMX0895 35,11 0,024 0,71±0,47 1462,92 49,38 JMX0308 60,14 ± 3,7 nd nd nd nd JMX0312 9,8 ± 0,2 <0,23 0,32±0,03 >43,56 30,53 JMX0887 43,28 ± 2,41 nd nd nd nd Figura 9. Porcentaje de HCMV-GFP frente a concentraciones de compuestos. Tras el ensayo con los trece compuestos los que se muestran en la figura son los que han proporcionado una inhibición más eficaz contra HCMV-GFP. Se cuenta con un control positivo (C+) con mismo volumen de DMSO que en la prueba y con un control negativo (C-) sin infectar. c+ c- 1,8 0,9 0,45 0,225 0 50 100 150 JMX0312 Concentración (M) % CMV-GFP c+ c- 1,1 0,55 0,275 0,1375 0 50 100 150 JMX0895 Concentración (M) % CMV-GFP c+ c- 1,5 0,75 0,375 0,1875 0 50 100 150 JMX0285 Concentración (M) % CMV-GFP c+ c- 0,5 0,25 0,125 0,0625 0 50 100 150 JMX0940 Concentración (M) % CMV-GFP 25 JMX0281 60 ± 0,85 nd nd nd nd JMX0285 46,72 0,05 0,3±0,16 934,4 156,25 JMX0673 176,62 nd nd nd nd JMX0461 >80 nd nd nd nd JMX0493 90 ± 1,79 0,21 nd 428,57 nd NY0611 95,36 ± 3,25 2,086±0,09 nd 45,71 nd NY0624 67,96 ± 1,55 0,627±0,005 nd 108,39 nd JMX0464 72,21 ± 9,9 0,932±0,004 nd 77,48 nd 6. DISCUSIÓN Con este estudio se demuestra que los derivados de niclosamida evaluados representan una potencial alternativa para el desarrollo de fármacos anti-HCMV. Tras realizar ensayos de citotoxicidad y de actividad inhibitoria de una biblioteca de derivados, a partir de n-acetilación y n-alquilación de la niclosamida, se han obtenido unos valores de citotoxicidad menores y muestran mayor actividad que la propia niclosamida, algo que también se demuestra en estudios anteriores realizados con HAdV (Xu et al., 2021; Xu, Berastegui-Cabrera, Ye, et al., 2020). Estos muestran un índice de selectividad relativamente alto, lo que apoya el seguimiento de estudio de tales compuestos. En el caso de los estudios de citotoxicidad, se obtienen valores de CC50 superiores a las concentraciones más altas que se van a utilizar es los posteriores estudios por lo que no es necesario descartar ningún dato. Además, se obtienen concentraciones citotóxicas superiores a la obtenida con niclosamida (4,94 ± 0,65) en células HFF-1, concluyendo que son menos tóxicos. Al centrarnos en los resultados de CI50, los cuales se inician con valores de CI50 anteriormente probadas en Adenovirus humano (HAdV) (Xu, Berastegui-Cabrera, Ye, et al., 2020) vemos que varios compuestos analizados mediante PCR muestran datos inferiores a los obtenidos con HAdV. Los datos no disponibles corresponden a compuestos que no mostraron una actividad inhibitoria concentración dependiente, ya que el porcentaje de HCMV no iba aumentando a medida que se disminuye la concentración de la molécula en cuestión. No obstante, observando las figuras, se llega a nivel nanomolar para algunos compuestos aun no alcanzando los niveles de inhibición deseados. En tres de los compuestos (JMX0461, JMX0308, JMX0281) se llega a ver un resultado totalmente contrario al que se busca, en el que las copias de virus disminuyen a medida que se disminuye la concentración de fármaco, pudiendo implicar que los compuestos