Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides

Tesis Doctoral IMPORTANCIA DE LA SUSTANCIA P Y SU RECEPTOR NK-1R EN EL CÁNCER DE TIROIDES Inmaculada Isorna Retamino Directores: Prof. Dr. Miguel Muñoz Sáez Prof. Dr. Francisco Esteban Ortega Prof Dr. Juan Solanella Soler Departamento de Cirugía. Universidad de Sevilla. A Miguel Muñoz, ojalá cumplas pronto tu sueño de curar el cáncer. A mi familia, A Fran, i AGRADECIMIENTOS Hacer esta tesis ha supuesto un reto profesional y personal en el que, como en muchas ocasiones importantes de la vida, los momentos de dificultad e incertidumbre dan lugar a la aparición de grandes satisfacciones y alegrías. Cuando echo la vista atrás no puedo si no llenarme de gratitud al recordar a todas las personas que me han brindado su ayuda de manera desinteresada, permitiendo que este trabajo haya podido salir adelante. Sé que es imposible resumir en unas pocas líneas lo que siento por cada una de ellas, pero no por ello voy a dejar de intentarlo. En primer lugar tengo que agradecer el apoyo recibido por mis directores de tesis. Paciencia, ilusión, entusiasmo, ánimo, empuje y apoyo incansable es lo que he recibido, con gran generosidad, durante muchos meses del doctor Miguel Muñoz. Él que es capaz como nadie de transmitir la ilusión por el conocimiento de lo desconocido y el amor y respeto por la ciencia. Y su sueño, cada día más cerca sin duda, de curar el cáncer ha resultado inspirador. Sin su inestimable guía no habría sido posible escribir esta tesis. Espero sinceramente ver dentro de poco el Premio Nacional de Investigación y el Nobel de Medicina en sus manos. Han sido fundamentales el apoyo y la ilusión puestos en todo momento por los doctores Francisco Esteban y Juan Solanellas, maestros en el campo de la Otorrinolaringología y modelos a seguir en el ámbito clínico y de la investigación. Me han demostrado una enorme generosidad, siempre con una sonrisa, estando siempre disponibles para esta doctorando. Cuando pienso en las personas que me han brindado su colaboración, me viene a la mente la ayuda totalmente desinteresada que he recibido del doctor Manuel Limón, jefe del Servicio de Anatomía Patológica del hospital de Mérida por el suministro y gestión de las muestras del biobanco que han hecho posible la realización de esta investigación. Al doctor Rafael Martínez, jefe del Servicio de Anatomía Patológica del hospital Virgen de Valme, con el que he pasado muchas horas frente al microscopio revisando muestras. Una persona muy generosa. Tendrá mi gratitud por su inestimable ayuda en esta tesis siempre. Es de justicia reconocer el apoyo que en todo momento he recibido de mis compañeros y amigos: Paco Sánchez, Juan Urbano, Vicente Guillén, María Martínez, Alicia González-Palomino, Rebeca González Hidalgo, Eva Pereira, Andrés Paulino y María Ángeles Herreros siempre me han transmitido la ilusión y el ejemplo por el trabajo bien hecho. Al doctor David Castro, por compartir sus conocimientos y sus experiencias. ii Mostrar mi agradecimiento a Esther Rosso, por su colaboración en el proceso de la inmunohistoquímica y valoración de las muestras. Gracias de la manera más profunda a mis padres, Rosario y Fernando, a los que debo casi todo lo bueno que me ha pasado en la vida. Son dos excelentes modelos a seguir, que han hecho posible que sea la persona que soy. A mis hijos, Marina y Elías, que me dan la alegría y las ganas de seguir mejorando en la vida, para ofrecerles lo mejor de mí. Pero aun teniendo los mejores directores de tesis y la colaboración de cuantos compañeros y amigos me han ayudado, la realización de esta tesis no hubiera sido posible sin el apoyo incondicional, la comprensión, la edición, los buenos consejos, el continuo ánimo de la persona con la que tengo la suerte de compartir mi vida. Gracias, Fran. iii ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico. ARN: Ácido ribonucleico. AVP: Arginina vasopresina. BSA: Albúmina de suero bovino. cAMP: Adenosin monofosfato cíclico. CGRP: Proteína relacionada con el gen de la calcitonina. DAB: 3,3-diaminobenzidina tetraclorhidrato. DAG: Diacilglicerol. DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol. DMSO: Dimetil sulfóxido. DTT: Ditiotreitol. EDTA: Ácido etilen-diamino-tetracético. EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico. EL: Bucle extracelular. ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. ERK: Cinasas reguladas por señales extracelulares. GABA: Ácido G-aminobutírico. GDP: Guanosín bifosfato. GPCRs: Receptores acoplados a proteínas G. GRB2: Proteína 2 de unión al receptor de factor de crecimiento. GRP: Gastrin-releasing peptide. GTP: Guanosín trifosfato. iv H202: Peróxido de hidrógeno. HK1: Hemocinina-1. Ig: Inmunoglobulina. IL: Bucle intracelular. IP3: Inositol trifosfato. MAPK: Proteín-cinasas activadas por mitógenos. NK-1R: Receptor de la Neurokinina 1. NK-2R: Receptor de la Neurokinina 2. NK-3R: Receptor de la Neurokinina 3. NKA: Neurokinina A. NKB: Neurokinina B. NPG: Neuropéptido G. NPK: Neuropéptido K. PBS: Solución tamponada de fosfato salino. PIP2: Fosfatidil inositol bifosfato. PLC: Fosfolipasa C. PPT: Preprotaquicinina. PVDF: Membranas de Polifluoruro de Vinilideno. RT-PCR: Reacción de la Cadena de Polimerasa en Transcripción Inversa. SBF: Suero bovino fetal. SDS: Dodecil sulfato de sodio. SHC: SH2-containing domain. SNC: Sistema nervioso central. SNP: Sistema nervioso periférico. v SP: Sustancia P. TGF: Factor de crecimiento transformante. TM: Región transmembrana. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 2 La frecuencia de los tumores de la glándula tiroidea es elevada, del 3 al 5% de todos los tumores, y aumenta proporcionalmente a la edad de la población. En realidad, esta frecuencia es mucho más elevada cuando se consideran los datos ecográficos y de autopsias, lo que subraya el carácter quiescente de muchos nódulos. Se trata de los tumores malignos más comunes de los órganos endocrinos (>92%)1. En las últimas 3-4 décadas, su incidencia en todo el mundo ha ido en aumento. Los cánceres de tiroides incluyen un amplio espectro de tumores con diferente epidemiología, actividad biológica y pronóstico2,3. El predominio femenino es unánimemente reconocido y es considerado cuatro veces superior a la incidencia en el hombre. Esto está en relación con la influencia de los esteroides sexuales3,4. Sin embargo, en los hombres los tumores son sustancialmente más agresivos2,3,5. Otros factores parecen ser importantes:  Influencias ambientales: Las diferencias étnicas y los factores dietéticos/ambientales también desempeñan un papel en el desarrollo de carcinoma de tiroides. El organismo humano está expuesto a diversas formas de radiación6 incluye la radiación interna de radioisótopos naturales, la radiación externa de La Tierra. La radiación espontánea y la de ambientes volcánicos (prevalencia de basalto), con aumento de las concentraciones de diversos elementos químicos (por ejemplo: B, Fe, Va y 222Rn) en el agua potable en zonas como Islandia, Hawái y Sicilia7. La contaminación del medio ambiente por bifenilos policlorados. El aumento de la ingesta de nitratos (de los vegetales verdes y jamón) conduce a un mayor riesgo de carcinoma de tiroides en hombres8.  Aporte de yodo insuficiente: Que favorece la aparición de tumores de la glándula tiroidea al provocar una hipersensibilidad a la tirotropina y limitar las posibilidades de síntesis de T3 (triyodotironina) y de T4 (tetrayodotironina), lo que causa una elevación de la tirotropina. Muchos países presentan situaciones de carencia yodada relativa9.  Efecto estimulante de la TSH y otras enfermedades del tiroides: Otro factor estimulante de cáncer de tiroides es el aumento de los niveles de TSH que conducen a la actividad tiroidea alterada y procesos inmunológicos que conducen a la producción de citoquinas. Algunas enfermedades tiroideas benignas están asociadas con carcinoma, como la tiroiditis de Hashimoto, que es un factor predisponente para la aparición de carcinomas de tiroides, especialmente a consecuencia de una terapia ineficaz y prolongada3,10,11. La Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 3 relación entre la enfermedad de Graves y el carcinoma de tiroides también se ha estudiado, pero sin encontrarse una clara correlación11,12.  Impacto genético: Se conoce la existencia de familias con bocios nodulares o multinodulares particularmente evidente en los gemelos monocigóticos, quienes presentan una concordancia del 70%. Esto está en relación con un trastorno de la hormonogénesis tiroidea, aunque el origen exacto de estas alteraciones no ha sido aún precisado. De la misma manera, se conoce la existencia de formas familiares de cáncer de tiroides, a veces asociadas a otras patologías3,12.  Radiaciones ionizantes: Que favorecen la aparición de tumores de la glándula tiroidea y especialmente de cánceres papilares. Esto ha sido demostrado después de las explosiones atómicas y después de la catástrofe de Chernóbil13. La irradiación en los niños y los adolescentes es especialmente peligrosa14. El tiempo de aparición de un cáncer es muy largo, variando entre 10 y 40 años15,16,17. El diagnóstico de tumor de la glándula tiroidea se basa principalmente en el examen clínico en una zona fácilmente accesible. En todos los casos, este examen debe ser seguido de exámenes complementarios y en particular de un análisis de laboratorio. No obstante, los exámenes complementarios generalmente no permiten afirmar la naturaleza benigna o maligna del tumor (nódulo aislado) o de uno de sus componentes (bocio multinodular). Sólo el examen histológico aporta una certeza. La determinación de tirotropina constituye el examen de base junto con las determinaciones de T3 y T4. La determinación de tirocalcitonina debe solicitarse cuando los elementos clínicos o los antecedentes familiares hacen sospechar un cáncer medular de tiroides. Dentro de las técnicas de examen morfológico la ecografía y la radiología simple representan los exámenes más simples y menos costosos. La gammagrafía, la tomografía computadorizada y resonancia magnética, no constituyen exámenes de rutina reservándose estas pruebas para casos concretos18. La punción-aspiración con aguja fina es sin duda el examen que crea más controversia entre los especialistas. Algunos lo consideran esencial para el diagnóstico y otros estiman que posee muchas desventajas por la dificultad en su interpretación19. El examen histológico intraoperatorio es de interés considerable, puesto que determina inmediatamente la decisión de proseguir o no la operación, ya que tiene un alto valor predictivo positivo de malignidad. Y, en caso de respuesta positiva, puede realizarse inmediatamente el Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 4 tratamiento quirúrgico necesario. La presencia de microcánceres constituye un elemento importante de riesgo de error en esta prueba. El diagnóstico se formula generalmente después de la exéresis quirúrgica durante el examen anatomopatológico, pero algunos elementos clínicos pueden sugerir malignidad desde un principio como: el crecimiento rápido del nódulo, la parálisis de una cuerda vocal, la fijación a las estructuras contiguas o la presencia de adenopatías cervicales. El tratamiento y el pronóstico varían según las formas histológicas, que son fundamentalmente los cánceres diferenciados, el cáncer medular y el carcinoma anaplásico. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 5 1.1. TIPOS DE CÁNCER DE TIROIDES. 1.1.1. CÁNCERES DIFERENCIADOS. Los cánceres diferenciados de la glándula tiroidea se desarrollan a partir de células foliculares. Son el carcinoma papilar y el folicular:  El carcinoma papilar representa aproximadamente el 65% de los cánceres tiroideos. Aparece principalmente en adultos jóvenes con una preponderancia femenina de tres a uno. Si bien la afección ganglionar es frecuente, las metástasis son más raras (aproximadamente el 10%). Es un tumor con un muy buen pronóstico y mayor tasa de supervivencia. Más del 85% de los pacientes sobreviven 40 años20.  El carcinoma folicular es mucho más raro que el carcinoma papilar. Su frecuencia es del 5 al 16%, según las series, y afecta sobre todo a mujeres entre 30 y 40 años. La punción-aspiración no es útil en este caso debido a la dificultad de diferenciar citológicamente los adenomas benignos de los cánceres. Tiene un peor pronóstico que el carcinoma papilar. El tratamiento es principalmente quirúrgico y requiere un control postoperatorio riguroso. Habitualmente, comporta los elementos siguientes: radioyodo, hormonoterapia sustitutiva e inhibidora y, de forma excepcional, una irradiación externa21,22,23,24. 1.1.2. CÁNCER MEDULAR. El cáncer medular de tiroides se desarrolla a partir de células C, secretoras de calcitonina, emigradas de la cresta neural. Representa del 5 al 10% de los cánceres tiroideos. Aparece generalmente en mujeres de mediana edad, ya sea de manera esporádica en el 60 al 70% de los casos o en el marco de formas familiares (30 al 40% de los casos). El diagnóstico de cáncer medular es generalmente considerado ante un bocio uni o bilateral, acompañado a veces de una diarrea motora y rubor facial. El diagnóstico puede establecerse a partir del examen histológico con inmunomarcadores tras la exéresis de un nódulo frío. Pero la confirmación se obtiene esencialmente gracias a las determinaciones de los marcadores tumorales:  La calcitonina es el más específico y el más sensible.  El antígeno carcinoembrionario no es específico, pero está elevado en el 80% de los casos. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 6  Otros marcadores tumorales como la catacalcina (PDN 21) o la CGRP (péptido relacionado con el gen de la calcitonina). El pronóstico del cáncer medular de la tiroides depende, esencialmente, de la extensión ganglionar y visceral. El tratamiento quirúrgico constituye el acto terapéutico esencial. La cobaltoterapia postoperatoria cervicomediastínica completa el tratamiento en algunos casos25. 1.1.3. CÁNCER INDIFERENCIADO O ANAPLÁSICO. Es uno de los cánceres más agresivos, cuyo pronóstico es extremadamente negativo a corto plazo. Estos tumores son generalmente de tamaño importante y ampliamente invasivos, con presencia de reestructuraciones necróticas y hemorrágicas. La incidencia es de alrededor del 3%. Aparece generalmente en mujeres de más de 50 años. La manifestación clínica más corriente es la aparición de una masa cervical de evolución rápida, acompañada de disfonía, disfagia e incluso de disnea. Una invasión locorregional y metastásica se encuentra en el 60% de los pacientes. La supervivencia media es inferior a 4 meses. Ninguna medida terapéutica tomada permite mejorar la supervivencia26. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 7 1.2. INCIDENCIA Y MORTALIDAD. El aumento de la incidencia de los cánceres de tiroides afecta a todas las razas y grupos étnicos globalmente1,11. La forma más común es el carcinoma papilar, que constituye aproximadamente el 85% de todos los casos1,3. Se asume que esto es debido al aumento de la detección de formas pequeñas iniciales de cáncer (<1 cm), microcarcinomas papilares1,2,11. Se ha objetivado un aumento en la incidencia de este tipo de cáncer en muchos países y sectores5 (figura 1). Figura 1. Incidencia del cáncer de tiroides en países europeos y vecinos. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 8 La incidencia del cáncer folicular y medular no ha cambiado3, mientras en el carcinoma anaplásico se ha encontrado una ligera disminución de incidencia del 1 al 2%4, durante el mismo período de tiempo. La tasa de mortalidad por cáncer en todo el mundo de tiroides varía de 0,2 a 1,2 en los hombres y de 0,4 a 2,8 en las mujeres por cada 100.000 personas. A pesar de que hay diferencias geográficas, la mortalidad por cáncer de tiroides no supera el 1%1,3. En general, la mortalidad es significativamente menor que la morbilidad3 (figura 2). Figura 2. Mortalidad por cáncer de tiroides en los países europeos. En España, Lope V et al. realizaron un estudio en el que concluyeron que donde existe mayor riesgo relativo de padecer cáncer de tiroides en nuestro país es en las Islas Canarias, Lugo, La Coruña y las zonas occidentales de Asturias y Orense. El patrón de mortalidad observada coincide con las zonas de España donde el bocio ha sido declarado endémico4 (figura 3). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 9 Figura 3. Distribución de la mortalidad por cáncer de tiroides en España. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 10 1.3. BIOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER. 1.3.1. EL CÁNCER COMO PROCESO MICROEVOLUTIVO. Según su definición, las células cancerosas crecen desafiando los controles normales y son capaces de colonizar e invadir los tejidos de su entorno. En estos tejidos pueden originar tumores secundarios o metástasis que ya resultan muy difíciles de erradicar quirúrgicamente. Parece que la mayoría de los cánceres se originan a partir de una sola célula que ha experimentado una mutación inicial. No obstante, la progenie de esta célula ha de sufrir otros cambios a posteriori. Para que algunas de estas células se conviertan en cancerosas será necesario un gran número de mutaciones adicionales. Este fenómeno de progresión tumoral, de mucho tiempo de duración, refleja numerosos cambios evolutivos por mutación y selección natural entre las células somáticas. El tratamiento del cáncer de forma racional requiere un conocimiento de las propiedades especiales que tienen las células cancerosas al progresar, multiplicarse y extenderse. Se encuentran entre estas propiedades las alteraciones en las vías de señalización celular, que capacitan a las células del tumor para ignorar las señales que proceden de su entorno y que normalmente mantiene la proliferación celular bajo un estricto control. De esta forma, las células pueden primero proliferar libremente en su tejido original y luego realizar metástasis sobreviviendo y proliferando en otros tejidos. Además, también como parte de su proceso de evolución, las células cancerosas ignoran las señales de suicidio y eluden las limitaciones programadas de proliferación. Puesto que son necesarias muchísimas mutaciones para proporcionar este gran conjunto de propiedades dañinas, quizás no sorprenda que casi todas las células cancerosas dispongan de propiedades adicionales que las transforman en muy mutables ya que han tenido que adquirir uno o varios defectos en distintos aspectos del metabolismo de su ADN. Esta inestabilidad genética les facilita la adquisición del complejo conjunto de alteraciones necesarias para la progresión tumoral27, 28, 29 30. 1.3.2. ETIOLOGÍA DEL CÁNCER. Las tasas de progresión y de evolución de los tumores se ven aceleradas tanto por los agentes mutagénicos (iniciadores tumorales) como por agentes no mutagénicos (promotores tumorales) que afectan a la expresión génica, estimulan la proliferación y alteran el balance ecológico entre células mutantes y no mutantes. La mayoría de los agentes que producen cáncer son mutagénicos, como los carcinógenos químicos y ciertos virus, así como diversas formas de radiación. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 11 Dado que muchísimos factores de los que contribuyen al desarrollo de un cáncer son controlables, es posible prevenir muchos de ellos. Se desconocen todavía los principales factores ambientales que inciden sobre el cáncer. Algunos factores identificados son el humo del tabaco y algunas infecciones provocadas por virus. La epidemiología es una herramienta muy útil para identificar estas causas y revelar nuevas formas de prevenir la enfermedad. La aproximación epidemiológica no requiere conocer de qué forma actúan los agentes productores de cáncer. Puede relacionar factores que no son simplemente mutagénicos como la edad a la que se tiene el hijo primero o los virus. 1.3.3. PROTO-ONCOGENES Y GENES SUPRESORES TUMORALES. Los genes relacionados con el cáncer pueden se clasifican en dos grupos en función de si sus mutaciones provocan una pérdida o un incremento en la función del gen. Las mutaciones que inducen una pérdida de función de los genes supresores de tumores conllevan la pérdida de los mecanismos de inhibición de la proliferación que tratan mantener un número adecuado de células. Las mutaciones que implican un aumento de función permiten a las células proliferar de modo anormal. Estas últimas son mutaciones dominantes y los genes mutados son conocidos como oncogenes. Los oncogenes pueden ser identificados por su capacidad para transformar unas líneas celulares en células con proliferación cancerosa. Muchos de ellos fueron descubiertos porque producían cáncer en animales de experimentación cuando eran introducidos mediante infección por un vector vírico que había tomado material genético de una célula huésped anterior. Los oncogenes también se pueden localizar examinando su presencia en genes diana de células cancerosas humanas, de mutaciones de activación o de translocaciones cromosómicas que indiquen la presencia de un gen crítico del cáncer. Las mutaciones en genes supresores de tumores generalmente son recesivas, es decir, no se produce una pérdida del control hasta que han sido inactivadas las dos copias del gen. Los métodos utilizados actualmente para encontrar este tipo de genes se basan en busca en el genoma de las células cancerosas señales de pérdida de genes que, a menudo, se manifiestan en heterocigosis en una región cromosómica específica. Otra aproximación se centra en el estudio de los cánceres familiares. Estas formas hereditarias de tumores poco frecuentes han permitido el descubrimiento de genes supresores de tumores cuya pérdida es bastante común en muchos tipos de cánceres. Estos individuos son proclives a padecer cánceres y heredan habitualmente una copia defectuosa y una copia funcional de un gen supresor de tumores. Presentan una gran predisposición al desarrollo de cáncer puesto que una sola mutación en una célula somática es suficiente al haber heredado la otra mutación para Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 18 1.5. LAS TAQUICININAS. 1.5.1. INTRODUCCIÓN. La mayor familia peptídica descrita en el reino animal, es la familia de las taquicininas. Han sido aisladas más de 40 taquicininas entre animales invertebrados (insectos, gusanos y moluscos), procordados y vertebrados (piel, tracto gastrointestinal, sistema nervioso, etc.). Se han realizado diversas clasificaciones de los NP según diferentes criterios, como son su localización tisular o estructura y secuencia de aminoácidos; este hecho ha llevado a dividir a los neuropéptidos en familias a veces con funciones similares o incluso solapadas. En la tabla 2 se muestran los principales neuropéptidos de mamíferos y se incluyen algunos de los recientemente descubiertos. Tabla 2. Clasificación de los principales neuropéptidos de mamíferos (resaltado el grupo de las taquicininas, objeto de estudio de este trabajo). García-López, Martínez-Martos, Mayas, Carrera, & Ramírez-Expósito, 2002). Como ya se ha comentado, la primera taquicinina, la SP, fue identificada en 1931 y caracterizada 40 años después. Otros miembros de la familia son la NKA y NKB que fueron Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 19 identificados en mamíferos por diferentes grupos entre 1983 y 198459,60,61. Estos péptidos, en general, se encuentran ampliamente repartidos tanto por el sistema nervioso central (SNC) como periférico (SNP) y actúan principalmente como neurotransmisores. En el sistema nervioso autónomo (SNA) actúa esencialmente como un componente noradrenérgico nocolinérgico62,63,64,65,66,67,68,69,70,71. No obstante, recientes estudios han cambiado el concepto que se tenía sobre la distribución de las taquicininas, comprobando como tanto la SP, la NKA, la NKB y otro miembro de las taquicininas denominada hemocinina-1 (HK1) se producen también en células no neurales, sugiriendo una amplia distribución de las taquicininas por todo el organismo72,73,74,75,76,77,78,79. 1.5.2. PÉPTIDOS DE LA FAMILIA DE LAS TAQUICININAS. Se han descrito hasta la fecha, en mamíferos seis taquicininas: SP, NKA, NKB, neuropéptido K (NPK), neuropéptido Ɣ (NPƔ) y HK137,41,80 (figura 8). Figura 8. Estructuras de las principales taquicininas en mamíferos. Imagen tridimensional generada con el software SweetMollyGrace 1.3. NPK y NPƔ son formas extendidas del segmento N-terminal de la NKA75. Estos péptidos se caracterizan por compartir un C-terminal común determinado por la siguiente secuencia de aminoácidos: Phe-X-Gly-Leu-Met-NH281,82,83,84,85. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 20 Mientras que la secuencia de aminoácidos de la SP, NKA y NKB es idéntica en mamíferos, la secuencia de HK-1 parece variar entre el ratón, la rata y los humanos. En mamíferos, como ya se ha señalado, los péptidos de las taquicininas se expresan principalmente en los tejidos neurales86,87,88. La SP y la NKA están presentes tanto en el SNC como en el SNP, en este último aparecen en los tejidos inervados por neuronas primarias aferentes sensibles a la capsaicina40,58,89,90,91,92,93,94 siendo liberadas en las terminaciones nerviosas tanto en la médula espinal como en los tejidos periféricos realizando una actividad neurotransmisora excitatoria95,96,97,98. El sistema nervioso no es la única localización de la SP, como ya se comentó, así pues ésta se expresa en células endoteliales humanas, las células de Leydig de ratón, diversas células inflamatorias e inmunes de humanos, ratas y ratones99,100,101,102. Además se han encontrado precursores del NKB en placentas humanas y de ratas, en úteros así como en otras células reproductoras en ratón103,104,105,106. Por último, la HK1 se expresa principalmente en células no neurales y se piensa que tiene un papel importante en la señalización intercelular, específicamente, en las comunicaciones entre el sistema nervioso y otros sistemas biológicos. 1.5.3. ESTRUCTURA GENÉTICA. La sustancia P, la neurokinina A, el neuropéptido K y el neuropéptido Ɣ se encuentran codificados en el gen preprotaquicinina-A (PPT-A) o gen TAC-1 (tabla 3). Tabla 3. Secuencia de los diferentes neuropéptidos que integran la familia de las taquicininas de mamíferos. (a) Los aminoácidos subrayados son los que conforman la secuencia C-terminal común de las TK. En negrita se representa el residuo aromático o alifático correspondiente. (b) Péptido relacionado con las TK (tachykinin-like). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 21 Solamente se conoce la organización de este gen en unas cuantas especies de mamíferos107,108,109,110. En ratas y humanos, el gen está compuesto por siete exones, en ratones únicamente por seis. En humanos, a partir de la transcripción primaria del gen se obtienen cuatro isoformas de ARN mensajero (α, β, ɣ y δ) que difieren en sus combinaciones de los exones. El ARN mensajero β-PPT-A contiene los siete exones del gen mientras que el ARN mensajero α-PPT-A pierde el exón 6, el ɣ pierde el exón 4, por último, el ARN mensajero δ-PPT-A pierde los exones 4 y 6. La secuencia del exón 3 codifica la SP, mientras que la secuencia del 6 codifica la NKA. La secuencia que produce el NPƔ está presente en los exones 3, 5 y 6 mientras que la que produce la NPK se encuentra en los exones 3, 4, 5 y 6. La secuencia precursora de la SP está por tanto codificada por las 4 isoformas posibles, en cambio la secuencia de NKA está presente en el ARN mensajero β y ɣ-PPT-A, la secuencia de NPƔ en el ARN mensajero ɣ-PPT-A y por último, la secuencia de NPK es únicamente codificada por ARN mensajero β-PPT-A111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121. La translación de esos ARN mensajeros y su procesamiento postranslacional es lo que determina las distintas taquicininas. Es importante tener en cuenta diferentes circunstancias, por ejemplo la SP puede expresarse de manera aislada, mientras que la NKA siempre se expresa acompañada de SP. Hay ciertos estudios sobre las diferentes concentraciones de las distintas isoformas de ARN mensajero PPT-A en los distintos tejidos que muestran un incremento relativo en las concentraciones de las isoformas ɣ y β, en concreto las que expresan SP y NKA106. La NKB es la única secuencia conocida hasta el momento que se obtiene del gen PPT-B o gen TAC-3122,123. En humanos y ratas, el gen está compuesto por siete exones y la secuencia que codifica la NKB se encuentra en el exón 5. Se ha demostrado que la estructura primaria de la HK-1 es diferente en humanos de la hallada en ratones y ratas. La HK-1 está producida por el tercer gen PPT-C o TAC-472,73. El gen PPTC está compuesto por cuatro exones y la secuencia que codifica la HK-1 se encuentra en el exón 2. 1.5.4. ASPECTOS EVOLUTIVOS DE LAS TAQUICININAS. Tanto en los vertebrados superiores como en distintos grupos de invertebrados, se han aislado taquicininas81,124,125,126. La estructura primaria de las taquicininas son estructuras muy conservadas desde el punto de vista de la evolución, en especial la secuencia C-terminal compuesta por Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2 y que precisamente es donde reside la función biológica de estos péptidos85. Todas las especies a lo largo de la escala de la evolución expresan taquicininas o péptidos relacionados con ellas. La SP o sus péptidos relacionados, son los más abundantes de toda la familia y aparecen con estructura similar tanto en mamíferos como en otros vertebrados. Únicamente existen Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 22 pequeñas sustituciones como por ejemplo el cambio de un aminoácido por otro de similares propiedades127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143. La NKA de mamíferos, reptiles y aves tienen la misma estructura primaria diferenciándose únicamente en dos aminoácidos144,145,146. El NPƔ y péptidos relacionados se han encontrado también en otras especies de vertebrados como la serpiente pitón y el aligátor entre otros147,148. Los péptidos “pseudo” taquicinina se han aislado en invertebrados compartiendo con los vertebrados alrededor de un 30% de la secuencia; no obstante, la secuencia C-terminal relacionada con su actividad es diferente y por esta razón se le denominan péptidos “pseudo” taquicinina149,150,151,152,153,154,155,156. A pesar de ello, existen excepciones como la sustancia aislada en las glándulas salivares del mosquito Aedes aegypti, denominada sialokinina157 que conserva la secuencia C terminal de los vertebrados. Se plantea la posibilidad de que exista una relación entre este fenómeno y el hecho de que esta sustancia entre en contacto con un huésped vertebrado. La gran estabilidad estructural de estos péptidos a través de la evolución sugieren una fuerte presión selectiva, es decir que mutaciones que conllevan sustituciones conservativas en sus secuencias de aminoácidos, favorecen la supervivencia. Esta presión selectiva, junto al pequeño tamaño de las moléculas de las taquicininas hace difícil establecer relaciones filogenéticas. Así, el estudio de los genes completos, incluyendo intrones y otras regiones no codificantes podría ser útil para el estudio de la evolución de los neuropéptidos. No obstante todavía se desconocen la mayoría de los genes que codifican las taquicininas y sus péptidos relacionados. Con los conocimientos actuales no se puede asegurar que los genes PPTA, B, C y otros genes que codifican péptidos relacionados con las taquicininas procedan de un gen ancestral común, no obstante, hay varios hechos experimentales a tener en cuenta: A. La presencia de taquicininas o péptidos relacionados en todas las especies vivientes, incluidos invertebrados y las similitudes existentes en sus secuencias de aminoácidos. B. La similar distribución de las taquicininas en los tejidos de los organismos estudiados: sistema nervioso, glándulas salivares, intestino… C. El hecho por el cual en algunos casos la conformación activa de la SP y de los péptidos relacionados en insectos conforman sitios similares de unión al receptor. D. La observación de que el spantide (un antagonista selectivo de receptores de taquicininas) actúa tanto en receptores de taquicininas de mamíferos como de insectos. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 23 Todos estos hechos sugieren un origen común de las taquicininas y de los péptidos relacionados con ellas las cuales derivarían de un gen común ancestral127,158. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 24 1.6. NK-1R: RECEPTORES DE LAS TAQUICININAS. 1.6.1. TIPOS DE RECEPTORES. Los efectos biológicos de las taquicininas están mediados a través de 3 tipos de receptores denominados NK-1R (receptor de la neurokinina-1), NK-2R (receptor de la neurokinina-2) Y NK-3R (receptor de la neurokinina-3). Además, existe una variante del NK-3R denominado NK3BR o NK-4R. Estas moléculas pertenecen a la familia A (tipo rhodopsina) de los GPCRs, una gran superfamilia de proteínas que conforman aproximadamente el 1% de todo el genoma y juegan un papel clave en los mecanismos de señalización celular72,159,160,161,162. Los GPCRs, son unas proteínas transmembrana responsables de la transducción de señales mediadas por estímulos ambientales como luz, olor, sabor, así como hormonales, neurotransmisión y otros tipos de comunicación intercelulares. Los GPCRs comparten varias características estructurales, siendo la más importante la existencia de un paquete de siete hélices transmembrana conectadas por seis bucles de distinta longitud (figura 9). Figura 9. Receptor asociado a proteína G genérico: 7 hélices transmembrana y 6 bucles. Imagen tridimensional generada con el software SweetMollyGrace 1.3. Aunque los GPCRs comparten una topología común, cada uno tiene ciertas características diferenciadoras pudiendo variar especialmente en el tamaño del amino-terminal extracelular, los bucles citoplasmáticos y el grupo carboxilo terminal. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 25 Basándonos en esas diferencias, los GPCRs de mamíferos han sido clasificados en 3 tipos: A, B y C. La familia A (rhodopsin-like o adrenergicreceptor-like) es con diferencia la mayor de las tres y se caracteriza por una estructura amino-terminal corta y unos residuos ácidos constantes en cada hélice transmembrana. La proteína G acoplada es un heterotrímero constituido por una subunidad α con actividad GTPasa y dos subunidades β y γ que forman un dímero. El dímero β-γ se desacopla de la subunidad cuando se activa la proteína G. Existen varias isoformas de estas subunidades cuya combinación define los distintos tipos de proteínas G. Existen 16 isoformas de subunidad que se obtienen por ‘splicing’ alternativo, 5 isoformas de subunidad y 14 isoformas de γ (figura 10). Figura 10. Receptor acoplado a proteína una proteína G. A. Estructura del receptor con sus siete dominios transmembrana. B. Estructura de una proteína G inactiva con sus subunidades α, β y γ en una representación esquemática (1) y tridimensional (2). C. Activación de la proteína G tras la unión del receptor transmembrana a su ligando (Modificado de Alberts et al., 2008, pp. 904-906). En estado de reposo el trímero está asociado y la subunidad α está unida a GDP. Cuando el receptor se une al ligando se producen cambios conformacionales en las asas intracelulares del receptor que disocian el trímero activando la proteína G. La subunidad α se separa del dímero β-γ y se une al GTP. La subunidad α y el dímero β-γ por separado pueden actuar sobre una gran gama de efectores diferentes como la adenilato ciclasa, las fosfodiesterasas, la fosfolipasa C o canales iónicos. Todos ellos activan cascadas de señalización intracelular. La proteína G activada actuará sobre un efector u otro según el isotipo de sus subunidades α, β y γ (figura 11). Cada subtipo tiene un rango Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 26 de hidrólisis diferente. La duración del efecto de la proteína G activada depende de la actividad GTPasa de la subunidad α. Una vez hidrolizado el GTP el trímero se reasocia y se inhibe la activación de efectores. Figura 11. Mecanismos efectores de la proteína G. A. Vía de la adenilato ciclasa y proteincinasa A (PKA). B. Vía del fosfatidil inositol bifosfato (modificado de Alberts et al., 2008, p. 909 y 911). Igual que en otros miembros de esta superfamilia, los receptores de las taquicininas parecen tener 7 dominios hidrofóbicos transmembrana (TM I-VII) con 3 bucles extracelulares (EL 1, EL 2 y EL 3), 3 bucles intracelulares (IL 1, IL 2 e IL3), una formación aminoterminal extracelular así como otra formación carboxiterminal citoplasmática164. Cuando Nakanishi y col.165 clonaron el primer receptor relacionado con la SP, el conocimiento de la presencia de los receptores de neuropéptidos, hasta entonces se basaba en estudios de unión y análisis farmacológicos. Hoy en día se dispone de la estructura física de los receptores descritos hasta la fecha para los mamíferos (figuras 12 y 13). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 27 Figura 12. Receptor de la neurokinina-1. Imagen procedente de Almeida et al.166. Figura 13. Receptor de la Neurokinina-2 y 3. Imagen procedente de Almeida et al.166 Receptores de taquicinina de diferentes especies de mamíferos se han clonado. En todos ellos se ha podido demostrar que el NK-1R es una proteína compuesta por 407 aminoácidos165,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181. El NK-2R humano tiene 398 aminoácidos en cambio y es mayor que el de la rata con 390 aminoácidos; por otro lado, el NK-2R del cobaya tiene 402 aminoácidos. Por último, el NK-3R es el mayor de todos en todas las especies, siendo este tamaño a expensas de la región aminoterminal. Conteniendo 465, 452 y 440 aminoácidos en humanos, ratas y cobaya respectivamente. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 34 Figura 18. Translocación transmembrana de la β-arrestina 1-GFP. En la secuencia A, el medio no contiene SP. En la secuencia B, las células fueron incubadas con 10nM o 1 nM de SP durante 60 minutos a una temperatura de 4ºC. Tras la fijación de las células se procede a identificar los NK-1R mediante inmunofluorescencia. Así mismo, -ARR1 se procede a localizar la β-arrestina. En la secuencia A se observa que los NK-1R se sitúan en la membrana celular mientras que la βarrestina se distribuye por el citosol. La incubación con concentraciones nanomolares (10 y 1) de SP induce la translocación de β-arrestina 1-GFP desde el citosol hacia la membrana timpánica. Imagen procedente de Graddy et al.208. Figura 19. La SP estimula el tráfico de β-arrestina 1-GFP. Las células son incubadas con 10 nM (secuencia A) o con 1 nM (secuencia B) de SP durante 10 minutos a 37ºC. A continuación se lavan y se incuban de nuevo por un periodo entre 0 y 60 minutos a 37ºC. Posteriormente se fijan y se realiza la localización mediante inmunofluorescencia del NK-1R y de la β- -arrestina 1 y NK1R tanto en la membrana plasmática como en los endosomas perinucleares durante al menos 60 minutos. Tras este periodo se constata que la β-arrestina vuelve parcialmente hacia el citosol. Así mismo, la estimulación con 1 nM de SP induce una respuesta de menor intensidad a la anterior, así, se produjo la endocitosis de β-arrestina 1 y el NK-1R en las últimas fases del experimento. Se constató además una mínima depleción de β-arrestina 1 en el citosol. Tras 30 minutos el NK-1R se detectó en la membrana celular de nuevo. Imagen procedente de Graddy et al.208). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 35 Figura 20. Detección de la inmunorreactividad de cy3-SP (paneles de la izquierda) y NK-1R (paneles de la derecha). Las células se incubaron con 100 nM de cy3-SP durante 60 minutos a 4ºC, posteriormente fueron lavadas y vuelta a incubar con un medio sin SP durante 0 minutos (A y E), 10 minutos (B y F), 30 minutos (C y G) y 120 minutos (D y H). A continuación fueron fijadas y mediante inmunorreactividad se localizó a cy3-SP y NK-1R. Ambas moléculas se expresan en la misma localización excepto a los 120 minutos cuando se aprecia que la SP se queda internalizada en la célula mientras que el NK-1R va volviendo a la membrana celular. Imagen procedente de Graddy et al. 201. Se ha podido demostrar que el NK-1R y la SP, mediante un mecanismo dependiente de clathrina en los denominados endosomas tempranos son rápidamente internalizados. En estado basal, en ausencia de SP, el NK-1R se encuentra en la membrana plasmática. Tras la exposición de las células a la SP, el receptor y ésta se agrupan en dicha membrana desplazándose de manera conjunta hacia el interior de la célula por medio de endocitosis conformando los endosomas tempranos. Para demostrar que este mecanismo es dependiente de clathrina se modificó el medio añadiendo sustancias que bloquean la endocitosis por esta vía, como son la sucrosa hiperosmolar o deplecionando potasio. No obstante, es posible que éste no sea el único mecanismo de entrada como así aseguran los autores de dicho estudio. Varios minutos tras la administración de SP no se detecta ésta en la superficie celular, por el contrario, los estudios mediante anticuerpos dirigidos frente al NK-1R indican una parcial internalización de dicho receptor. La discrepancia entre la internalización casi completa del ligando frente a la parcial del receptor, podría estar relacionado con el estado de afinidad del receptor. Únicamente aquellos receptores con una alta afinidad para Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 36 su ligando serían internalizados quedando remanentes en la membrana plasmática aquellos con menor afinidad. Una vez que el complejo SP/NK-1R se internaliza, se dirige a la región perinuclear donde se va a producir una acidificación del endosoma hasta llegar a un pH inferior a 6,2 a partir del cual la SP se disocia del receptor. A las 4 horas tras la liberación de SP, se comprueba que los receptores NK-1R aparecen en la membrana plasmática de nuevo. Esto puede ser explicado mediante tres teorías: 1) La inserción de receptores preformados, 2) La síntesis de nuevos receptores, 3) El reciclaje de los receptores internalizados. La primera posibilidad no puede ser descartada del todo, aunque los estudios realizados en el estadio basal no mostraron NK-1R en el interior de la célula en tanta cantidad que nos hagan pensar en esta posibilidad. En contra de la segunda posibilidad aparece el hecho de que la ciclohexamida, un inhibidor de la síntesis proteica, no evita la aparición de los receptores en la membrana plasmática. Por último, la teoría del reciclaje se fundamenta en que el uso de agentes que previenen la acidificación de las organelas (bafilomicina A, monesina, cloroquina y NH4Cl) reduce de forma sensible la reaparición de los receptores en la membrana plasmática. El ligando por el contrario va a sufrir una degradación enzimática en el interior de los endosomas ya que no aparece de nuevo en la membrana plasmática junto con los receptores. Parece ser que es precisamente estos mecanismos de endocitosis y reciclaje de los receptores los que serían responsables de los fenómenos de desensibilización y resensibilización ante la respuesta de la SP; de este modo, tras la internalización de los mismos, la célula se hace insensible a la SP, volviendo a responder a ésta tras el reciclaje de los receptores en su vuelta a la membrana plasmática. De este modo, en la respuesta celular frente a la SP, se consigue la regulación. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 37 1.8. FUNCIONES DE LAS TAQUICININAS Y SU DISTRIBUCIÓN. 1.8.1. EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL. Tanto en los cuerpos celulares como en las fibras nerviosas, el SNC presenta una gran inmunorreactividad para la SP. La NKA tiene una distribución similar a la de la SP. Respecto a la NKB no se conoce la distribución exacta con el mismo grado de detalle que el resto. Las taquicininas están implicadas además de su papel como transmisor sensorial, en una variedad de funciones como el control de las actividades motoras, funciones autónomas y endocrinas, así como procesamiento de la memoria209,210,211,212,213. 1.8.1.A. NEOCORTEX. Si nos fijamos en el neocortex, la SP se encuentra a bajas concentraciones; no obstante, existen determinados estudios210 que otorgan a la SP papel más relevante del que se había asumido. En el neocortex de monos se ha determinado la existencia de dos tipos de células que presentan inmunorreactividad para la SP y NKA. El primer grupo de células, de menor cuantía pero mayor tamaño, tiñe intensamente tanto para las taquicininas como para somatostatina y NPƔ. El segundo grupo, más abundante que el anterior, pero de menor tamaño, tiñe débilmente para las taquicininas, presentando además inmunorreactividad para el GABA. El primer grupo está presente en las capas II, III y VI, así como en la sustancia blanca adyacente al córtex. El segundo grupo celular se encuentra en las capas IV y V. Respecto a las fibras nerviosas, se aprecia que se tiñen para las taquicininas en todas las capas del neocortex. El NKB está presente en grandes concentraciones en las capas IV y V de los cerebros de ratas. Mediante iontoforesis se ha podido comprobar que la SP induce una excitación prolongada de las neuronas corticales de ratas, en especial de las capas V y VI. Otros estudios215, muestran que la deprivación visual produce una disminución de la inmunorreactividad de taquicininas en las neuronas del córtex visual en monos. Esto sugiere que cambios en la percepción sensorial pueden inducir cambios en la síntesis de neurotransmisores como las taquicininas en la corteza cerebral216. 1.8.1.B. NÚCLEOS CAUDAL Y PUTAMEN. Los núcleos estriados muestran altos niveles de inmunorreactividad a SP. La tinción se lleva a cabo en los axones terminales y en los cuerpos neuronales. Existen dos tipos de neuronas en los núcleos estriados de ratas que tiñen para SP: por un lado, neuronas de mediano tamaño, espiculadas. El otro grupo de neuronas, de menor número y no espiculadas, conforman los circuitos neuronales locales del núcleo. Del total de las neuronas de los núcleos estriados de ratas, tres cuartas partes aproximadamente son catalogadas del primer tipo, espiculadas y proyectadas hacia la sustancia Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 38 negra, el área tegmental ventral y el globo pálido. Los núcleos estriados de los mamíferos están compuestos por dos compartimentos distintos, la matriz y el estriosoma. Estos compartimentos están dispuestos como un mosaico y presentan diferentes propiedades neuroquímicas. El estriosoma presenta menor nivel de acetilcolinesterasa que la matriz y altos niveles de SP, dinorfina y encefalina así como endopeptidasas las cuales degradan estos péptidos. Contiene altos niveles de dopamina y receptores muscarínicos, además. Diversos estudios indican la existencia en este núcleo de grandes concentraciones del NK1R presentando por el contrario muy bajos niveles para NK-2R Y NK-3R217,218,219. 1.8.1.C. GLOBO PÁLIDO. El principal origen de la SP en el globo pálido proviene de la proyección existente a través de las neuronas del núcleo estriado. En los primates, el segmento interno del globo pálido y el pálido ventral se encuentra ocupado por una estrecha red nerviosa muy inmunorreactiva a SP; por el contrario, el segmento externo presenta, para ésta, una tinción muy débil. Así como las fibras nerviosas tiñen para SP, los cuerpos celulares de primates no presentan inmunorreactividad para este neuropéptido. Los terminales nerviosos que presentan reactividad para la SP, dinorfina o encefalina en el globo pálido muestran una morfología característica en ovillo de lana donde los terminales nerviosos peptidérgicos envuelven a las dendritas receptoras por completo220,221. 1.8.1.D. SUSTANCIA NEGRA. La sustancia negra es de las zonas que mayor concentración de SP posee de todas las regiones cerebrales. Se ha podido observar esta distribución en cerebro de ratas donde se aprecia una intensa inmunorreactividad en las fibras nerviosas así como en dos diferentes tipos de botones sinápticos. La pars compacta de la sustancia negra es una de las principales fuentes productoras de dopamina; estas áreas se proyectan hacia el núcleo estriado y otras áreas del SNC. Se ha podido comprobar mediante microscopía electrónica que los terminales que presentan inmunorreactividad positiva para SP hacen sinapsis directamente con las células dopaminérgicas de la sustancia negra. El hecho de que la SP active las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales se ha visto reforzado por varios estudios222. La infusión de SP en la sustancia negra produce un incremento marcado de los comportamientos estereotipados de las ratas como son el olisqueo y el aseo, siendo éstos bloqueados con la infusión de 6-hidroxidopamina en el núcleo caudado. Una inyección intranigral de SP produce una elevación de los niveles de dopamina así como de ácido homovanílico en el ganglio estriado ipsilateral. El hecho de que una inyección intranigral de GABA y dinorfina A produzcan una disminución de la liberación de dopamina en el núcleo estriado sugiere que la SP Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 39 actúa como un neurotransmisor estimulador de las neuronas dopaminérgicas de la vía nigroestriatal, mientras que el GABA y la dinorfina A actúan como inhibidores. Existe un mecanismo de feedback opuesto de la dopamina sobre la SP. Los axones dopaminérgicos contactan directamente con las neuronas productoras de SP que se hallan en el núcleo estriado. La administración de un agonista indirecto de la dopamina o bien la administración de un inhibidor de su recaptación va a producir una elevación de la SP en la sustancia negra. Por otro lado, el bloqueo de las sinapsis dopaminérgicas mediante un antagonista de la dopamina va a producir una disminución de los niveles de SP en la sustancia negra. Se ha comprobado cómo en la enfermedad de Párkinson223, donde existe una menor concentración de dopamina en la sustancia negra, existe una disminución de la concentración de SP. Tanto la sustancia negra como el área tegmental ventral contienen también NKA. Aunque su distribución es similar a de la SP, la cantidad de esta taquicinina es levemente inferior a la SP. La NKA tiene una acción excitatoria sobre las neuronas dopaminérgicas y no dopaminérgicas de la sustancia negra. Lévesque et al afirman que el sistema de regulación de la vía dopaminérgica no es el mismo para la NKA que para la SP224. 1.8.1.E. HIPOCAMPO. Dentro del hipocampo, las fibras nerviosas que contienen SP se hayan principalmente en las capas piramidal y granular, en cambio, los cuerpos neuronales que expresan alrededor de su núcleo SP se hayan principalmente en la capa polimórfica. A pesar de que las concentraciones de SP en los mamíferos son bajas en esta región, son de 2 a 10 veces superiores que en otras áreas corticales de monos y humanos. Además se ha demostrado la existencia de receptores para las taquicininas. El hipocampo y la amígdala están implicados en diversas funciones relacionadas con la memoria; así, algunos estudios realizados con ratones sometidos a descargas eléctricas muestran una mayor retención de memoria tras la administración intracerebral de taquicininas225,226,227. Se piensa que el origen de las terminaciones nerviosas que contienen SP puede ser el núcleo supramamilar y el hipotálamo posterior. 1.8.1. F. NÚCLEOS DE LA ESTRÍA TERMINAL Y AMÍGDALA. La amígdala y los núcleos del lecho de la estría terminal están relacionados con la regulación del comportamiento sexual, habiéndose detectado así una concentración y distribución diferente de SP entre ambos sexos. Las ratas hembra presentan menor nivel de SP en estas áreas que los machos, además, las áreas que presentan una gran densidad de SP son dos veces mayores Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 40 en ratas macho que en hembras. La castración de machos adultos produce una disminución de la inmunorreactividad de la SP en la amígdala228,229. La concentración de SP en la amígdala cerebral es considerablemente alta en las ratas, no así en humanos donde su concentración es bastante baja. El área entre el núcleo amigdalar central y medial es donde se encuentra la mayor cantidad de células positivas para SP. Estas neuronas no solo conforman un denso plexo intrínseco en la amígdala sino que proyectan haces hacia el lecho de la estría terminal y el hipotálamo lateral. Se ha demostrado además la presencia de receptores de las taquicininas en estas áreas. 1.8.1.G. EJE HIPOTÁLAMO-HIPOFISARIO. El hipotálamo de los mamíferos contiene altas concentraciones de SP, de hecho esta sustancia fue aislada por primera vez en extractos hipotálamo de bovino. La distribución de la SP en el hipotálamo varía mucho entre cada especie. En humanos, la región tuberal basal es la zona más rica en SP. El origen de las fibras nerviosas que contiene SP no se conoce del todo aunque se piensa que procede de la amígdala230. Mediante microscopía electrónica algunos estudios231 han demostrado la existencia de axones inmunorreactivos a SP contactando con la lámina basal de los capilares en el sistema portal hipotalámico en la eminencia mediana. El lóbulo hipofisario anterior contiene una gran cantidad de fibras portadoras de SP que se localizan alrededor de las células hipofisarias. Se ha demostrado, mediante inmunofluorescencia232 la existencia de receptores de la SP en estas células. La aplicación intraventricular de SP, en ratas, produce una inhibición de la liberación de la hormona de crecimiento, mientras que la aplicación de un antagonista produce el incremento de los niveles plasmáticos de esta hormona. La SP produce una elevación en plasma de prolactina233. En la rata, la inyección intracerebroventricular de SP produce una típica respuesta de defensa basada en aumento de la presión sanguínea, frecuencia cardiaca, actividad simpática eferente y vasoconstricción visceral. Aumento en el estado de conciencia, aumento de motricidad, arañazos, mordiscos y aseado. La parte anterior y ventromedial del hipotálamo es considerada la zona diana donde afecta la SP, se ha demostrado que la microinyección de SP en estas áreas evoca respuestas similares. La SP puede tener un papel muy importante en el control del comportamiento sexual. Existen gran cantidad de neuronas inmunorreactivas para SP que contienen receptores para estrógenos en los núcleos hipotalámicos ventromediales de ratas hembra. Se ha demostrado que Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 41 estos núcleos son diana de la acción de las hormonas que regulan el comportamiento sexual. En las ratas macho, la inyección de antagonistas de la SP en la región preóptica anterior del hipotálamo inhibe la respuesta sexual mientras que la aplicación de SP la estimula234,235. Respecto a los cuerpos neuronales, prácticamente el 100% de ellos expresan SP en su interior. Todas las regiones del tálamo presentan fibras nerviosas que contienen SP, a excepción de los núcleos centromediales y posterolaterales, pudiendo proceder estas fibras del hipotálamo, regiones pretalámicas y terrenos del cerebro medio236. 1.8.1.H. NÚCLEO ESPINAL DEL TRIGÉMINO. En la sustancia gelatinosa del núcleo espinal del trigémino en ratas, es similar la distribución de SP a la que se puede observar en la médula espinal. La distribución principal de estas fibras competen a la lámina I y II. En pacientes sometidos a una neurotomía trigeminal se objetiva una disminución de la captación de SP en dicho núcleo, lo que indica que las fibras positivas para SP se originan principalmente en neuronas primarias aferentes cuyos cuerpos ganglionares se hallan en el ganglio de Gasser. Tras una estimulación eléctrica de la pulpa dental en los conejos se objetiva un incremento de los niveles de SP en el núcleo trigeminal espinal; por el contrario, la aplicación local de morfina en dicha región produce el efecto contrario. Esto sugiere que el efecto analgésico de los opioides está modulado en parte por la SP al reducir la liberación de SP por las neuronas primarias aferentes. Determinados estudios indican que la liberación de SP tanto a nivel central como periférico por las terminaciones nerviosas produce también una autoactivación de dichas terminaciones inducidas por una actividad autorreceptora de la SP237,238,239. 1.8.1.I. NÚCLEO DORSAL DEL VAGO, GANGLIO VAGAL Y GANGLIO GLOSOFARÍNGEO. Tanto en gatos como en ratas, se ha detectado la presencia de varicosidades y cuerpos celulares positivos a SP en el núcleo dorsal del vago240. En conejos, los ganglios glosofaríngeo y vagal, poseen gran cantidad de cuerpos neuronales positivos a SP241. 1.8.1.J. GANGLIOS AUTÓNOMOS PREGANGLIONARES. En la médula torácica y lumbar la principal localización de las neuronas simpáticas preganglionares es el núcleo intermediolateral. Este núcleo se tiñe intensamente para SP en numerosas especies de mamíferos. Se han hallado además NK-1R en esta área. La aplicación de SP en este núcleo induce una actividad excitatoria. La administración intratecal de SP produce un Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 42 aumento de la tensión arterial y taquicardia. Esta reacción se ve acompañada de una elevación de los niveles de epinefrina y norepinefrina en plasma. Se piensa por tanto que estos dos neurotransmisores median la actividad de la SP a este nivel. Los núcleos parasimpáticos sacros, regulan las funciones del tracto urinario bajo, el intestino grueso y los órganos sexuales. Se han observado también tanto fibras que contienen SP como receptores242,243. 1.8.1.K. NÚCLEOS MOTORES CRANEALES Y NÚCLEOS DE ASTA ANTERIOR DE LA MÉDULA. Mediante microscopía electrónica, se ha comprobado que las fibras nerviosas que contienen SP hacen sinapsis con las dendritas de las motoneuronas de la médula espinal así como del núcleo del hipogloso. Se piensa que las taquicininas juegan un papel importante en la regulación de ciertos núcleos motores ya que la aplicación mediante iontoforesis de SP sobre las motoneuronas de gatos induce la despolarización de las mismas. El asta anterior de la médula contiene gran cantidad de SP y en esta región el origen de estas fibras procede del núcleo del rafe de la médula. Una hemitransección en C1 provoca una disminución de aproximadamente el 70% de la SP en C6-C7 ipsilateral. Otra fuente puede ser las neuronas aferentes primarias ya que la neurectomía a nivel dorsal provoca una disminución de los niveles de SP244,245. 1.8.1.L. GLÍA. Se piensa que la SP y la NKA podrían tener un papel en la regulación de la respuesta glial frente al daño del SNC. Recientes estudios indican la existencia de receptores de taquicininas en líneas celulares de glía, astrocitos y líneas celulares de astrocitomas246,247. 1.8.2. LAS TAQUICININAS EN TEJIDOS PERIFÉRICOS. La SP puede aparecer o bien en el interior de fibras nerviosas o bien sin relación con células neuronales, a lo largo de los tejidos periféricos. En el primer caso, las fibras suelen proceder de ramas periféricas de neuronas primarias aferentes cuyos cuerpos celulares se encuentran en los ganglios existentes en la raíz de la espina dorsal. Otras proceden de neuronas de los ganglios entéricos. Por último y en menor cuantía, están las que proceden de los ganglios autónomos. Las neuronas que se encuentra en la retina son un caso especial248. 1.8.2.A. OJO. POLO ANTERIOR. En diferentes regiones del polo anterior del ojo como la cornea, iris y cuerpo ciliar, se ha podido documentar la existencia de neuronas inmunorreactivas para SP en numerosas especies. El Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 43 hecho de que en conejos, ratas y ratones se produzca una disminución de la concentración de SP al inducir una denervación quirúrgica del trigémino, indica que las fibras nerviosas existentes tienen como origen este nervio. Las fibras existentes en el iris proceden de las neuronas parasimpáticas procedentes de los nervios ciliares y estas neuronas expresan igualmente SP en sus fibras. La irritación mecánica, química o bien por medio de la estimulación antidrómica del trigémino produce una reacción caracterizada por miosis, hiperemia conjuntival e iridial, ruptura de la barrera hematoacuosa y elevación de la presión intraocular. Existen muchas pruebas que inducen a pensar que esta reacción podría estar mediada por la SP. La inyección intraocular en el conejo de SP induce miosis, extravasación de proteínas hacia el humor acuoso y una elevación de la presión intraocular; así mismo, la inyección de un antagonista de la SP induce la respuesta contraria en aquellos casos de traumatismo ocular, estimulación antidrómica del nervio trigémino o tras la inyección de SP intraocular. Se ha visto como la SP induce una contracción del músculo esfínter del iris, y como con la aplicación de un antagonista de la SP es revertida esta acción249,250. RETINA. La retina de mamífero contiene SP, NKA, NKB y NPK. Zalustsky y Miller 251 demostraron que pequeñas cantidades de SP (<1 micromolar) excitaban al 78% de las células ganglionares de conejos, produciendo además una despolarización de algunas células amacrinas. La NKA produce la misma acción que la SP. Se ha demostrado que el uso de antagonista de la SP no produce una alteración en las propiedades receptivas de las células ganglionares, sino que se piensa más bien que pudiera tener una acción moduladora de la excitabilidad de estas neuronas actuando como cotransmisor principalmente del GABA. Pero también de otros neurotransmisores252,253. 1.8.2.B. VÍA AERO-DIGESTIVA SUPERIOR. CAVIDAD ORAL. Los niveles de SP en estos tejidos son de los más altos a nivel periférico. Se piensa que la SP podría tener un papel predominante en la transmisión del dolor a este nivel así como cierto papel en la respuesta vasodilatadora que acompaña a esta sensación. A estas conclusiones se han llegado mediante la estimulación antidrómica del trigémino y la aplicación de antagonistas de la SP59,254. LENGUA. Se ha detectado la existencia de fibras que contienen SP en la lengua de humanos, ratas y gatos. En los humanos, la región apical del epitelio lingual contiene fibras inmunorreceptoras para SP que median la sensación de quemazón que aparece con la capsaicina o la pimienta56,255. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 50 producen un aumento de la vascularización así como induce la contracción uterina. Algunos estudios287 en ratas mediante la aplicación de capsaicina intratecal indican que la SP podría tener un papel importante en la fertilidad, ya que esta acción produjo una marcada reducción de la fertilidad en ratas287,288,289. En humanos la SP tiene una respuesta bifásica respecto a la motilidad de los espermatozoides, a bajas concentraciones (4x10-7M) produce un leve incremento, a altas concentraciones (>10-6M) una marcada reducción de la motilidad291. La vesícula seminal, los testículos, el epidídimo y los vasos deferentes de ratas, gatos y cobaya contienen SP. Se ha encontrado también SP en las células de Leydig humanas. A este nivel, la SP estimula la contracción de los vasos deferentes y la vesícula seminal. 1.8.2.J. PLACENTA. La SP y el receptor NK-1R están distribuidos ampliamente por el cordón umbilical y la placenta en humanos (figura 22). La concentración es mayor en la decidua y en los trofoblastos de las membranas coriónicas. También existe gran concentración, en las células endoteliales y en los miocitos de los vasos placentarios, tanto en arterias como en venas, de las membranas placentarias y el cordón umbilical292,293. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 51 Figura 22. Inmunolocalización de NK-1R y SP en: Areceptores endoteliales de las células venosas placentarias; Bmiocitos arteriales del endotelio placentario; C y Ddecidua; E y Fen vellosidades coriónicas; Gcontrol; Hmiocitos. Parece que existe un efecto vasodilatador inducido por SP, NK-B y por producción endógena de prostaglandinas por las células endoteliales de las venas del cordón umbilical. Parece que el sistema SP/NK-1R está envuelto en la regulación de la circulación feto-placentaria sobre todo en los grandes vasos del cordón umbilical (tanto arteria como venas). La SP en el receptor NK-1R parecen tener también implicaciones en la regulación autocrina294,295,296,297, paracrina292,298 y endocrina de la placenta. Tiene la capacidad de producir proliferación celular299 y neoangiogénesis300. Por tanto, la disregulación de este sistema en la placenta puede estar implicado en la génesis de patologías durante el embarazo como la pre-eclampsia301, parto pretérmino y abortos302,303,304. Las células de Hofbauer son macrófagos placentarios que se encuentran en el estroma de la membrana coriónica en intima unión con los capilares fetales. Estas células modulan las vasculogénesis placentaria, induce proliferación celular y neoangiogénesis, expresando altos Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 52 niveles de factor de crecimiento placentario. En numerosas complicaciones durante el embarazo se ven alteraciones de la apariencia expresión y numero de las células de Hofbauer. Investigaciones recientes han demostrado la presencia de SP y receptor NK-1R en aproximadamente el 90% de todas las células de Hofbauer de la placenta. Tanto en el núcleo celular como en el citoplasma. Estos hallazgos sugieren que la SP esta involucrada en la regulación biológica de las funciones de las células de Hofbauer y por lo tanto en el normal desarrollo y crecimiento placentario305,306,307,308,309,310. 1.8.2.K. SISTEMA ADRENAL. Las glándulas adrenales de numerosas especies de mamíferos expresan SP. Los humanos son los que lo hacen a mayor concentración sobre todo en la médula adrenal. En la cortical, las células cromafines también expresan SP, pero en menor medida. Se ha comprobado que la SP tiene dos efectos en relación con la liberación de catecolaminas inducida por los agonistas nicotínicos. A altas concentraciones, la SP induce una inhibición en la liberación de catecolaminas. Mientras que a bajas concentraciones produce una protección contra la desensibilización de la respuesta nicotínica311,312. 1.8.2.L. SISTEMA MÚSCULO ESQUELÉTICO. MÚSCULO ESQUELÉTICO. A este nivel expresan SP las fibras nerviosas de las fibras musculares y de los vasos sanguíneos. El músculo sóleo contiene 3 veces más SP que el músculo extensor digital largo y se piensa que el porcentaje de SP está en relación con lo marcada que sea la vascularización muscular. La aplicación local de SP y NKA sobre la musculatura de conejos producen un aumento del flujo y la dilatación de las arteriolas transversas. Este mecanismo se encuentra bloqueado con la aplicación de antagonistas de las taquicininas. Lo que indica que la SP podría tener un papel importante en la regulación del flujo sanguíneo hacia los músculos esqueléticos313,314. HUESO Y ARTICULACIONES. La SP tiene un papel muy importante en la inflamación neurogénica así como la transmisión del dolor en procesos agudos como la artritis o degenerativos como la artrosis. En el hueso se pueden encontrar fibras inmunorreactivas para SP y CGRP tanto en la cortical como en la médula ósea, así como en los tejidos blandos alrededor del hueso. Estas fibras son especialmente abundantes cerca de las epífisis y periostio. También son muy abundantes en la membrana sinovial así como en la red perivascular existente a este nivel en humanos. Se piensa que Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 53 la SP podría tener un papel regulador de la mielopoyesis ya que induce la proliferación de los progenitores fagocitarios procedentes de la médula ósea315,316. 1.8.2.M. PIEL. La sustancia P esta presente en las fibras C de la piel, lo cual indica que también cumple un papel en la nocicepción. Diversos estudios en humanos, muestran inmunorreactividad para SP en los terminales nerviosos de las fibras existentes en la dermis papilar y epidermis. También se objetiva en los corpúsculos de Meissner así como en las inmediaciones de las glándulas sudoríparas y los vasos sanguíneos317,318. 1.8.3. TAQUICININAS EN LA INFLAMACIÓN Y EL SISTEMA INMUNITARIO. Se sabe que las fibras C aferentes primarias están relacionadas con la inflamación y la respuesta inmunitaria, teniendo además un papel relevante en la patogénesis de las enfermedades alérgicas319 e inflamatorias320, así mismo, pueden tener un papel relevante en la cicatrización de las heridas y el mantenimiento de la integridad tisular (figura 23 y 24). Figura 23. Esquema sobre los eventos que ocurren tras producirse un daño en la piel. Tras el daño (1) suele ocurrir una activación de los mastocitos y una liberación de histamina. Ésta activa los terminales de las neuronas sensitivas mediante el receptor de histamina 1 (2) de tal modo que produce una estimulación ortrodrómica de la médula espinal y antidrómica alrededor de la piel afectada. Esto último produce la liberación de neuropéptidos a este nivel. La SP puede actuar por medio de los NK-1R en las células endoteliales de las vénulas o posiblemente estimulando la liberación de aún más histamina por parte de los mastocitos produciendo una extravasación plasmática donde ha ocurrido el daño (3). La SP puede incluso incrementar el flujo sanguíneo, no obstante, es el CGRP, actuando a través de su receptor el que produce una respuesta más potente y duradera de vasodilatación cutánea (4) y enrojecimiento alrededor de la herida. Imagen procedente de Brain y Cox321. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 54 Figura 24. Factores que determinan la liberación de SP desde las terminaciones nerviosas sensitivas. La SP se libera a partir de la terminación nerviosa mediante la fragmentación del PAR-2 (receptor activado por proteasas-2) por medio de la triptasa. Además, la liberación es estimulada por otros factores como la unión de la bradiquinina con el receptor B2, la acción de las citoquinas o el óxido nítrico. La SP ya liberada se une al NK-1R que expresan las células endoteliales causando vasodilatación y formación de edema, ambos componentes característicos de la inflamación neurogénica. Además, la SP también reacciona con las células inmunitarias induciendo reacciones como la proliferación de los linfocitos T. Imagen procedente de Lundy et al322. 1.8.3.A. INFLAMACIÓN. CONTRIBUCIÓN DE LAS FIBRAS AFERENTES SENSIBLES A CAPSAICINA. La triple respuesta cutánea desencadenada ante un daño mecánico, térmico o químico, descrita por Lewis323, consiste en la aparición de eritema local, tumefacción y la aparición de un halo alrededor del sitio del daño. El eritema se debe a un aumento del flujo sanguíneo debido a la vasodilatación, la tumefacción aparece por el incremento de la permeabilidad venular lo que conduce a una extravasación plasmática y por último, el enrojecimiento perilesional se debe a una vasodilatación arteriolar secundaria a un reflejo axonal. Al realizar una estimulación de los nervios sensitivos (pulpa dental, piel, ojo, mucosa respiratoria, gastrointestinal o urogenital), ya sea antidrómica u ortodrómica, se produce una respuesta similar a la triple respuesta, lo que se denomina la inflamación neurogénica. Tanto la inflamación neurogénica, como la respuesta inflamatoria inducida por daño químico o térmico se reducen o incluso anulan mediante el pre-tratamiento con capsaicina; estos hallazgos indican que las fibras C nociceptivas sensibles a capsaicina están relacionadas con esta respuesta324. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 55 EL PAPEL DE LAS TAQUICININAS EN LA INFLAMACIÓN. La estimulación eléctrica, mecánica o térmica en la piel, el ojo, la pulpa dental y el pulmón, conducen a una liberación de SP por parte de las fibras nerviosas de esos tejidos325. En la piel humana, al inyectar SP, se produce la clásica respuesta de eritema, tumefacción, dolor y picor. Por el contrario, la aplicación de NKA produce una respuesta mucho más débil que no incluye ni picor ni dolor. A nivel intravascular, la SP produce un aumento de la vasodilatación cutánea y de la extravasación plasmática326. Se han utilizado varios antagonistas de la SP, incluidos anticuerpos anti-SP, obteniéndose como resultados una disminución de la respuesta inflamatoria frente a los mismos estímulos antes mencionados327. Todos datos indican que las taquicininas tienen un papel relevante en la inflamación. TUMEFACCIÓN Y EXTRAVASACIÓN PLASMÁTICA. A diferencia del eritema perilesional que induce la SP, la tumefacción solamente se inhibe con la aplicación de anestésico local. El tratamiento con antihistamínico no previene esta repuesta. En la piel de las ratas se ha comprobado que tanto la estimulación nerviosa como la inyección de SP producen un aumento de la permeabilidad venular induciendo una extravasación plasmática. Este efecto se supone que es mediado a través de una acción directa a través de los NK-1R existentes alrededor de los capilares venosos en la piel. ERITEMA Y VASODILATACIÓN. La vasodilatación que ocurre alrededor del sitio del daño cutáneo se debe al reflejo axonal producido por las ramas terminales de las neuronas sensoriales sensibles a la capsaicina. Se ha visto que esta respuesta es inhibida mediante el tratamiento con anestésicos locales o con capsaicina. Por otro lado, se piensa que esta respuesta inducida por la SP está en relación con la liberación de histamina. Ciertos estudios han demostrado que el uso de antihistamínicos reduce así mismo esta respuesta328. En estudios realizados tanto in vivo como in vitro, se ha visto que la SP induce la liberación de histamina por parte de los mastocitos. El NKA tiene una acción similar pero mucho más débil. Esta actividad queda inhibida por el uso de antagonistas de la SP. El dolor que acompaña la inflamación es un indicador de que se produce una excitación de neuronas nociceptivas. La histamina liberada por los mastocitos tiene la capacidad de estimular los terminales nerviosos de las fibras sensibles a la capsaicina desencadenando con ello el reflejo axonal. En estudios69 in vitro se ha comprobado que estas neuronas excitadas por la histamina contienen en su interior SP y CGRP y que este efecto es llevado mediante los receptores de histamina H1. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 56 Tras la activación del relejo axonal por medio de la histamina, se produce una liberación de SP (y otros péptidos) en los terminales nerviosos sensitivos. La SP liberada al medio supone a su vez un incremento recíproco en la liberación de histamina por los mastocitos. Estas mutuas activaciones de las fibras aferentes y los mastocitos tienen la función de prolongar y expandir la respuesta inflamatoria en cascada. ACTIVACIÓN DE LEUCOCITOS. La respuesta vascular lleva consigo una migración de los leucocitos a través de las paredes de los vasos hacia los tejidos inflamados produciendo un infiltrado de granulocitos y macrófagos. Tanto la denervación quirúrgica como el pretratamiento con capsaicina en ratas producen una disminución de la migración leucocitaria. La aplicación de SP sobre músculo de conejo produce, además de la vasodilatación, una agregación plaquetaria y una migración de leucocitos a través de las paredes vasculares. Se piensa que la SP actuaría mediante dos mecanismos, por un lado, parece inducir cierta quimiotaxis leucocitaria y por otro el incremento de la permeabilidad vascular favorece la extravasación de leucocitos329. Otros efectos demostrados son el incremento en la actividad fagocitaria de los macrófagos de cobayas, así como aumento de la liberación de enzimas lisosomales, anión superóxido y metabolitos del ácido araquidónico330. La degranulación de mastocitos inducida por la SP también puede aumentar la migración leucocitaria331. 1.8.3.B. SISTEMA INMUNITARIO. La SP puede influir sobre los leucocitos a través de las citoquinas. No obstante, existen otros mecanismos como la estimulación directa sobre los linfocitos332 (figura 25). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 57 Figura 25. Resumen de las acciones hematopoyéticas de la SP y NKA. (I) La SP tiene un efecto estimulatorio sobre los progenitores primitivos de la m.o. (II) La SP estimula la proliferación de los progenitores eritroides precoces (BFUE) y tardíos (CFU-E). (III-VI) La SP tiene un efecto sinérgico con diversas citoquinas para inducir la proliferación de las colonias mixtas mieloide-eritroide. Las flechas indican estimulación hematopoyética por la SP. Estos efectos son contrarrestados por la acción de la NKA y SP1-4. Imagen tomada de H. S. Kang et al., 2004, p. 341. En la siguiente tabla se presenta el efecto de la SP sobre las distintas células del sistema inmunitario (tabla 5). Linfocitos Potente quimiotaxis. Cofactor en la diferenciación a linfocito T. Incrementa la secreción de inmunoglobulina. Estimula la liberación de citoquinas proinflamatorias de los linfocitos T. Estimula la actividad de los linfocitos Natural Killer. Estimula la proliferación de linfocitos T. Los linfocitos pueden producir SP. Monocitos/Macrófagos Potente quimiotaxis. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 58 Estimula la liberación de citoquinas proinflamatorias. Induce la "explosión oxidativa". Estimula la síntesis y liberación de metabolitos del ácido araquidónico. Los macrófagos expresan NK-1R y segregan SP. Neutrófilos Potente quimiotaxis. Estimula la degranulación. Incrementa la adherencia a células epiteliales (por medio de la regulación de la expresión de moléculas de adhesión). Estimula la liberación de citoquinas proinflamatorias. Mastocitos Media entre los mastocitos y las terminaciones nerviosas. Induce la degranulación. Induce la liberación de histamina y serotonina. Estimula la liberación de citoquinas proinflamatorias. Eosinófilos Potente quimiotaxis. Estimula la activación, degranulación, liberación de O2y tromboxano. Los eosinófilos pueden segregar SP. Tabla 5. Efectos de la SP sobre las células del sistema inmunitario. Tanto in vitro como in vivo, las concentraciones nanomolares de SP inducen la proliferación linfocitaria en humanos y ovejas. En ratones, la SP produce un incremento de la síntesis de IgA e IgM, pero no de IgG. Se ha demostrado en diversas especies la existencia de NK-1R tanto en linfocitos B, T como en las células natural killers (NK). Existen fibras inmunorreactivas para SP y CGRP en los ganglios linfáticos y el timo de numerosas especies. La infusión de SP a este nivel produce un incremento en el flujo de linfa y en la producción de linfocitos. El tratamiento neonatal con capsaicina en ratas produce que el número de linfocitos de los nódulos se reduzca en un 80%333. En este aspecto la NKA fue más potente que la SP. En este estudio se constató además que la aplicación de un antagonista de la SP produce en ratas una disminución de la producción de anticuerpos frente a un antígeno. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 59 Estudios recientes señalan el probable papel de la enzima conversora de angiotensina y un sistema renina-angiotensina propio de la medula ósea, a través del cual la angiotensina II actuaría de forma conjunta y coordinada con la SP y otros NP en la regulación de la hematopoyesis334. La génesis y progresión de los tumores están íntimamente relacionadas con el sistema inmune, de manera que las células inmunes pueden actuar tratando de detener la tumorogénesis o facilitando la progresión de la misma a distintos niveles. Este planteamiento unido a una serie de datos experimentales ha llevado a algunos autores a formular la hipótesis de que el SNC podría ser capaz de monitorizar y modular la formación de tumores a través de interacciones del eje neuroinmuno-endocrino en la fisiopatología de la tumorogénesis (figura 26). Figura 26. Modelo propuesto de interacción entre el sistema nervioso, endocrino, inmune y células tumorales. Las células tumorales liberan compuestos, como citoquinas o factores de crecimiento, que pueden influir en la función cerebral. No se tiene certeza de que el sistema nervioso libere sustancias que modulen el crecimiento del tumor de manera directa; en cambio la comunicación bidireccional del tumor con las células inmunes y las consiguientes interconexiones entre el sistema inmune con el nervioso constituirían la base de esta monitorización y modulación indirecta de la tumorogénesis por parte del cerebro (imagen tomada de Mravec et al., 2006, p. 112). 1.8.3.C. CICATRIZACIÓN DE HERIDAS Y FUNCIONES TRÓFICAS. Las neuronas sensoriales sensibles a capsaicina llevan a acabo una función trófica de los tejidos335. Al aplicar capsaicina sobre ciertos tejidos animales se inducen cambios como opacificaciones corneales, lesiones en piel, disminución de la viabilidad de injertos así como el incremento de la susceptibilidad para desarrollar una úlcera gastroduodenal. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 66 1.10. ANTAGONISTAS DEL NK-1R: APLICACIONES TERAPÉUTICAS. En el momento actual, la única aplicación terapéutica para los antagonistas del NK-1R es su uso como antiemético en los vómitos inducidos por quimioterapia siendo el Aprepitant el único fármaco antagonista de la SP aprobado por la Food and Drug Administration y la Agencia Europea del Medicamento347. Se ha relacionado la SP con varios actos fisiológicos como son la emesis inducida por quimioterapia, cambios en el tono cardiovascular, la regulación de la motilidad gastrointestinal, el desarrollo del sistema inmune, la estimulación de la secreción salival y pancreática, la contracción de la musculatura lisa vascular y extravascular, la vasodilatación, incluso se ha relacionado con la aparición de migraña, asma y bronquitis crónica, así como con el crecimiento tumoral y el desarrollo de metástasis. El estudio con antagonistas de la SP y con mutaciones genéticas en ratones ha ayudado a mejorar el conocimiento del papel de la SP en el dolor y en la respuesta al estrés348. Ahora haremos un breve repaso de los distintos campos médicos donde se están desarrollando novedades terapéuticas e investigando sobre los antagonistas de los NK-1R y la acción de la SP. 1.10.1. TRASTORNOS AFECTIVOS. La relación existente entre la SP y el desarrollo de enfermedades psiquiátricas como son la ansiedad y la depresión se ha objetivado. Hay numerosos estudios349,350,351 que apoyan esta afirmación y que investigan nuevos tratamientos para dichas enfermedades basándose en la fisiopatología de la SP. Ensayos clínicos a doble ciego realizados en ratones indican que tras la administración de antagonistas del NK-1R, se produce un incremento a largo plazo de la transmisión de serotonina en el hipocampo352. Esta propiedad es común a todos los antidepresivos conocidos y parece estar mediada por un incremento tiempo-dependiente en el índice de serotonina neuronal. Estas observaciones hacen pensar en la futura posibilidad del uso de los antagonistas del NK-1R como una nueva clase de agente antidepresivo y ansiolítico, e implican a la SP en la aparición de enfermedades psiquiátricas. Un artículo publicado en la revista Science353 comparó el antagonista del NK-1R Aprepitant con otros antidepresivos en un grupo de pacientes diagnosticados de depresión moderada-severa. Además de un gran efecto antidepresivo, se constató la ausencia de interacciones con el sistema monoamino lo que se traduce en un menor número de efectos secundarios y de interacciones medicamentosas. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 67 1.10.2. EL DOLOR. Electrofisiológicamente se ha comprobado que la aplicación iontoforética de SP en las astas dorsales de la médula causa una estimulación lenta, diferida y prolongada. Esta lentitud en la respuesta fue la primera prueba que la excluía como un transmisor primario de la vía aferente. Nuevas investigaciones mostraron que la SP modulaba la transmisión sináptica a dicho nivel, jugando un papel como potenciador de los inputs, ya fueran estimuladores o inhibidores. Comportándose como neurotransmisor del dolor, se ha demostrado que tiene una función facilitadora, de forma que la morfina, al impedir su liberación, bloquea el dolor354. La SP está presente en las fibras-C, que son las aferentes primarias relacionadas con la neurotransmisión del dolor. Se ha comprobado que está relacionada con los mecanismos dolorosos, ya que si se inyectan antagonistas de la SP en la médula espinal sobreviene una acción analgésica, además también reducen el tiempo de acción frente a los estímulos dolorosos y dan lugar a otras respuestas de comportamiento. Por otro lado, los analgésicos opiáceos, morfina y los morfinomiméticos inhiben la liberación de la SP en el núcleo trigeminal, que transmite la información dolorosa. Por lo tanto parece que existe alguna relación entre la SP y los neurotransmisores opioides endógenos implicados en los procesos de analgesia del SNC. Las denominadas encefalinas y endorfinas son compuestos naturales, de estructura química semejante a la morfina (morfinomiméticos). Se han relacionado con receptores opioides (lipoproteínas) presentes en el tálamo, la sustancia gris periacueductal, los núcleos del rafe, el sistema límbico, el locus ceruleus, la sustancia gelatinosa medular, etc. Se intentó determinar si la expresión diferenciada del CGRP o de la SP en una gama de tumores hipofisarios estaba relacionada con la presencia o ausencia del dolor de cabeza. Usando técnicas inmunohistoquímicas se concluyó que el mecanismo que provocaba dolor de cabeza asociado a tumores hipofisarios seguía siendo indeterminado y que el significado de la presencia de CGRP y de SP en estos tumores era desconocida, pero no parecía estar relacionada con el dolor de cabeza o la actividad endocrina del tumor355. Se investigaron los cambios neuroquímicos que ocurrían en el asta dorsal de la médula espinal en un modelo de dolor neuropático por cáncer en ratón. Para ello se inocularon células del sarcoma de Meth-A en la vecindad del nervio ciático, dando lugar al crecimiento de una masa tumoral que englobaba al propio nervio. Los niveles de SP y CGRP se elevaron, pero no de forma tan prolongada como el dynorphin A, que además lo hizo de forma paralela al aumento de células cFos-positivas en la medula. De forma que en este modelo el aumento de dynorphin A se podía asociar al dolor espontáneo, pero no así los niveles de SP y CGRP356. Otros estudios357 han investigado el papel de la capsaicina (presente en alimentos como las guindillas) como estímulo nociceptivo sobre ciertas células nerviosas, provocando la liberación de Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 68 SP, responsable de la transmisión de las señales dolorosas dentro de nuestro sistema nervioso. La capsaicina desencadena la liberación de este neurotransmisor e inhibe la producción de más cantidad del mismo en el organismo. Con el uso prolongado de capsaicina se gasta, en parte, la SP de las células nerviosas y así se alivia el dolor crónico (un estado que requiere la presencia de SP). En Cleveland, en la Case Western Reserve University, Deal et col.358 evaluaron los efectos de la capsaicina, tanto en pacientes con artritis reumatoide como con osteoartritis. Descubrieron un alivio significativo del dolor cuando se aplicaba tópicamente crema con capsaicina en las rodillas dolorosas, cuatro veces al día. En la artritis reumatoide, el tratamiento redujo el dolor a aproximadamente la mitad, mientras que en la osteoartritis disminuyó hasta alrededor de un tercio. Además de reducir la transmisión del dolor, la capsaicina también la producción del enzima colagenasa y de prostaglandinas, reduciendo tanto el dolor como la inflamación359. Uno de los resultados más sorprendentes de dicho estudio fue que los nervios sensoriales producen su propia respuesta antiinflamatoria. De esta forma la activación de las señales dolorosas que llevaba a cabo la capsaicina producía la liberación de un poderoso antiinflamatorio natural. 1.10.3. INFLAMACIÓN NEUROGÉNICA. La inflamación neurogénica conlleva la liberación de SP, en respuesta al dolor o a la infección, desde los nervios sensitivos. La formación de edema, consecuencia de la permeabilidad vascular, es un proceso fuertemente mediado por la SP que se encuentra en las fibras-C. Esta acción, al igual que la del factor C5a, se produce tras la unión a la proteína G de sus respectivos receptores. Por otro lado la SP y la angiotensina II provocan una vasodilatación endotelial y en consecuencia están directamente relacionadas con la aparición de hipotensión y bradicardia, esta potente actividad hipotensora no es bloqueada por la atropina360. La SP también se ve implicada en ciertas reacciones por hipersensibilidad. En un estudio realizado en Japón, se evaluó el papel de la SP en las reacciones pulmonares adversas inducidas por Paclitaxel que causaba una extravasación de plasma y un edema marcados en pulmones con una disminución concomitante de la presión parcial arterial de oxígeno. Dichas reacciones fueron revertidos por LY303870, un antagonista del NK-1R, constatándose que los niveles de SP en el plasma y en el líquido del lavado broncoalveolar aumentaron después de la inyección del Paclitaxel. En 13 pacientes, aumentó el nivel en plasma de la SP pero no de la histamina durante la infusión del Paclitaxel, de forma significativa (p< 0.05). Por lo que se concluía que la SP, se podía implicar en la hipersensibilidad producida por el Paclitaxel335 más que la histamina. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 69 1.10.4. EMESIS POSTQUIMIOTERAPIA. Inducidos por la quimioterapia, las nauseas y vómitos desempeñan un papel importante en la calidad de vida de los pacientes, e influyen decisivamente en el mantenimiento de la quimioterapia. Por lo que, un control adecuado de las mismas salvaría vidas potencialmente, mejorando al menos los resultados del tratamiento quimioterápico362. Los fármacos antieméticos disponibles en la actualidad, no son completamente eficaces en la prevención de náuseas y vómitos. Durante el primer día se constata la incomodidad de los pacientes. Pero la mitad de ellos, al menos, siente náuseas y sufre vómitos también en su casa. Los antagonistas del NK-1R constituyen un nuevo grupo de fármacos dirigidos a otro tipo de receptores y con un mecanismo de acción diferente al de los antagonistas del receptor 5-HT3363, que actúan entre el segundo y el quinto día posteriores a la quimioterapia y que son efectivos en el 70% de los casos. Navari et col.364 investigaron la posibilidad de que un antagonista del NK-1R pudiera prevenir las náuseas y los vómitos agudos y retardados en los pacientes sometidos a tratamientos de quimioterapia, dado que se sabe que la SP está en las regiones del troncoencéfalo asociadas con los vómitos. El estudio se realizó con pacientes en tratamiento con Cisplatino. Todos recibieron Granisetrón y Dexametasona previo al tratamiento con Cisplatino y posteriormente se aleatorizaron en tres brazos, dos de los cuales contenían el antagonista de NK-1R a diferente dosis y pauta, y el tercero que contenía placebo. El 93% de los pacientes de los dos primeros grupos no tuvieron vómitos en la fase aguda, en comparación con el 67% del tercer grupo. También en la fase de vómitos retardados se encontró beneficio en los pacientes tratados con el antagonista del NK-1R. Este estudio demostró así, que el antagonista del NK-1R proporcionaba un beneficio adicional, más allá del tratamiento antiemético estándar en la prevención de náuseas y vómitos agudos y retardados. Se realizaron dos estudios, con al menos 520 pacientes en cada estudio, 365 controlados, aleatorios, doble ciegos, paralelos y multicéntricos. Uno llevado a cabo en centros de Europa, Estados Unidos, Sudáfrica y Taiwán, y el otro en Centroamérica y Sudamérica. Los pacientes recibieron Cisplatino (70 mg/m2) y fueron agrupados de forma aleatoria para recibir ya sea terapia estándar con receptor antagonista 5-HT3 (Ondansetrón) y Dexametasona prequimioterápica y Dexamentasona postquimioterapia (días 2-4) o terapia estándar más Aprepitant prequimioterapia y en los días 2 y 3 postquimioterapia. Los pacientes que participaron de estos estudios fueron registrando sus experiencias en diarios que ellos mismos completaban. La respuesta completa (no emesis, no rescate) en el grupo de Aprepitant en ambos estudios fue significativamente más alto, el período agudo (83%-89%) y el Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 70 período diferido (68%-75%), en comparación con la del grupo bajo terapia estándar, el período agudo (68%-78%) y el período diferido (47%-56%). Las náuseas mejoraron en el grupo bajo Aprepitant en mayor porcentaje, con una mejoría del 20 por ciento en esa protección. Manteniendo su eficacia antiemética en la prevención de las náuseas y vómitos inducidos por la quimioterapia hasta en seis ciclos de quimioterapia. Aprepitant fue generalmente bien tolerado, siendo las reacciones adversas más frecuentes la astenia o fatiga. Otros acontecimientos adversos experimentados fueron la diarrea, las náuseas (después del día 5 del estudio), el hipo (4,6%), la astenia (2,9%), el aumento de alaninotransferasa (2,8%), el estreñimiento (2,2%), las cefaleas (2,2%) y la anorexia (2,0%). Se ha demostrado que la SP es liberada desde las fibras nerviosas primarias y que existe una amplia distribución de la misma tanto en el SNC, como en el SNP. Debido a esta amplia distribución es importante tener un método adecuado para manejar y controlar las dosis terapéuticas de los fármacos antagonistas de los NK-1R, evitando en lo posible efectos tóxicos por sobredosis. En este sentido un estudio utilizó las imágenes obtenidas mediante tomografía por emisión de positrones con un trazador selectivo de NK-1R, el [(18)F]SPA-RQC, para determinar los niveles de ocupación de los NK-1R alcanzados a nivel central, tras la administración de dosis relevantes de Aprepitant (fármaco antagonista de los NK-1R) en individuos sanos. Para ello se desarrollaron dos estudios placebo-control, simple-ciego y aleatorizados, cuyos resultados mostraron que la ocupación de los NK-1R en el cerebro era predicha por las concentraciones plasmáticas del Aprepitant, por lo que éstas podían ser utilizadas para controlar las dosis administradas de forma terapéutica para patología del SNC366. Los estudios arriba mencionados, conforman la base sobre la que se apoyó la Food and Drug Administration, en marzo de 2003 para aprobar Aprepitant. También está aprobado en Canadá, Singapur, Malasia, América Central y del Sur, Inglaterra y Europa, convirtiéndose de esta forma en el primer fármaco antagonista del NK-1R comercializado. Como pauta se pueden seguir los regímenes utilizados en diferentes estudios clínicos: Aprepitant 125 mg el día 1 y 80 mg los días 2 y 3; Dexametasona 12 mg el día 1 y 8 mg los días 2, 3 y 4; Ondansetrón 32 mg sólo el día 1. Los estudios sobre los efectos del nuevo tratamiento indican que disminuyen los síntomas a partir del primer ciclo de quimioterapia y esto se mantiene hasta el sexto inclusive. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 71 En combinación con otros antieméticos, Aprepitant está indicado en la prevención de las náuseas y vómitos agudos o diferidos, relacionados con cursos iniciales y repetidos de quimioterapia altamente emetogénica, incluyendo altas dosis de cisplatino. 1.10.5. SEGURIDAD DE LOS ANTAGONISTAS DEL NK-1R. En los ensayos clínicos en humanos llevados a cabo con antagonistas del NK-1R, se ha demostrado que, en general, son seguros y no causan serios efectos secundarios. El único antagonista del receptor NK-1R que está comercializado actualmente es el Aprepitant. En ensayos clínicos controlados con placebo en pacientes con depresión mayor, el Aprepitant a dosis de 300mg al día fue bien tolerado. Y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a efectos secundarios respecto a placebo. La mayoría de los ensayos clínicos llevados a cabo son para el uso del Aprepitant como prevención de nauseas y vómitos en pacientes sometidos a tratamiento con quimioterapia altamente emetógena con cisplatino, o como antiemético postquirúrgico. Por ello en la mayoría de los estudios se coadministra Aprepitant (día 1: 125 mgs; días 2-3: 80 mgs) con dexametasona y un antagonista de los receptores de serotonina 5-HT3 (ondansetrón, granisetrón, palonosetrón). En estos estudios se objetiva la seguridad y la buena tolerancia del mismo y la reducción de las nauseas y los vómitos. Pero se encuentran también algunos efectos secundarios que pueden ser achacados a los otros fármacos o a la terapia quimioterápica en si. Como son, anorexia, astenia, estreñimiento, diarrea, dolor abdominal, mareos, cefaleas, hipo, infección y neutropenia. De hecho la reducción del 40% de la dosis de dexametasona en uno de los grupos del ensayo, demostró reducir la susceptibilidad a la neutropenia y a la infección367. En estudios de seguridad en sujetos sanos se ha demostrado que a dosis de Aprepitant: día 1: 125 mgs; días 2-5: 80 mgs, no produce ningún efecto la función propulsiva en estómago, en intestino delgado o colon. Es importante saber las interacciones medicamentosas que puedan suceder durante la administración de Aprepitant junto con otros fármacos. Por ejemplo no altera el metabolismo de ondansetrón, granisetrón, palonosetrón, hidrodolasetrón, vinorelbine, thiotepa, dinaciclib o digoxina. Pero las dosis de dexametasona o de metilprednisolona deben ser reducidas cuando se administra Aprepitant. Ya que se ha demostrado que el Aprepitant aumenta el nivel plasmático de los corticosteroides367,368,369,370. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 72 Aprepitant también reduce la eficacia de los anticonceptivos orales y no altera la farmacocinética de la ciclofosfamida367,371,372,373. Aprepitant debe ser usado con precaución ya que induce acumulación de metabolitos tóxicos de algunos fármacos como ifosfamida, midazolam y algunos quimioterápicos (docetaxel, paclitaxel, irinotecan, por ejemplo). En pacientes en tratamiento con warfarina también hay que tener más un control más exhaustivo. El Aprepitant es metabolizado principalmente por el citocromo P450 en el hígado. Por esto es bien tolerado en pacientes con insuficiencia renal severa y en enfermedad renal terminal374,375,376. Se llevó a cavo un estudio comparativo en el que se demostró que una dosis intravenosa de fosaprepitant de 150 mgs, es igual de segura y de efectiva que el tratamiento durante tres días con Aprepitant vía oral367,376,378. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 73 1.11. ACTIVIDAD ONCOGÉNICA DE LA SP Y DEL NK-1R. 1.11.1. ONCOGÉNESIS Y SP-NK-1R. La implicación de la SP en la oncogénesis está avalada por numerosas publicaciones377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400. Dentro de estas publicaciones podemos destacar las realizadas sobre líneas celulares in vitro y las realizadas sobre muestras de tejidos tumorales:  Líneas celulares de gliomas y astrocitomas humanos: U373 MG, U138 MG, UC11 MG y GAMG.  Líneas celulares de neuroblastomas humanos: SKN-BE.  Líneas celulares de retinoblastomas humanos: WEI-Rb-1 y Y-79.  Líneas celulares de melanomas humanos: COLO679, COLO858 y MEL-HO.  Líneas celulares de cáncer pancreático humano: CAPAN-1 y ASPC-1.  Líneas celulares de cáncer de pulmón humanos: de células pequeñas (NCIH69, H128, H417, COR-L88 y COR-L51), de células grandes (COR-L23), adenocarcinoma (MOR) y carcinoma escamoso (LUDLU-1).  Líneas celulares de cáncer de mama humanos: MDA-MB-231.  Líneas celulares de cáncer colorrectal humanos: HT-29.  Líneas celulares de adenocarcinoma gástrico.  Líneas celulares de cáncer de laringe: Hep-2 de carcinoma de células escamosas.  Líneas celulares de osteosarcomas humanos.  Líneas celulares de hepatoblastoma humano: HepT1, HepG2 y HuH6.  Líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda: T-ALL BE-13 y B-ALL SD-1.  Muestras de tejido de mucosa yugal con liquen plano oral.  Muestras de diferentes tipos de cáncer de laringe.  Muestras de diferentes tipos de cánceres orales. De manera detallada se presentan los estudios que existen hasta la actualidad sobre la actividad oncogénica de la SP y el NK-1R: 1.11.1.A. CÁNCER DE MAMA. En el año 2000 Singh y colaboradores realizaron un estudio383, en el que se investigó el papel de PPT-I y de sus receptores (NK-1R y NK-2R) en el cáncer de mama y sus metástasis, para ello se utilizó el análisis cuantitativo con RT-PCR, ELISA e hibridación in situ. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 74 Se demostró una expresión creciente de PPT-I y de NK-1R comparando las células epiteliales mamarias normales (n=2) y biopsias benignas de mama (n=21), con líneas celulares de cáncer de mama (n=7) y biopsias malignas de mama (n=25). Los niveles de NK-2R eran altos en células normales y malignas. Los antagonistas específicos del NK-1R y NK-2R inhibieron la proliferación celular, sugiriendo un estímulo autocrino o intercrino por los péptidos de PPT-I en el cáncer de mama. El antagonista del NK-2R no demostró ningún efecto sobre la proliferación de células normales pero medió en la proliferación de las células tumorales. Los extractos citosólicos de las células malignas de las células tumorales aumentaron la traducción de PPT-I mientras que los extractos de las células epiteliales mamarias normales no causaron ningún cambio. Los datos sugieren que los péptidos de PPT-I y sus receptores pueden ser importantes en el desarrollo del cáncer de mama. Considerando que los péptidos de PPT-I son moduladores hematopoyéticos, estos resultados se podían ampliar para entender la integración con la metástasis temprana de células tumorales en la médula ósea, su sitio predilecto de metástasis. La señal de transducción molecular para los péptidos PPT-I y el mecanismo que aumenta la traducción del mRNA de PPT-I podrían conducir a estrategias innovadoras para los tratamientos y la metástasis del cáncer de mama. La migración activa de células tumorales, requisito crucial para el desarrollo de la metástasis y la progresión del cáncer, es regulado por distintas sustancias incluyendo los neurotransmisores. La mayoría de los pacientes que sufren cáncer de mama no mueren debido al tumor primario sino al desarrollo de metástasis. En una investigación realizada por Lang y colaboradores391 se analizó la migración de las células tumorales del carcinoma de mama MDA-MB-468 y de próstata PC-3, dentro de una matriz tridimensional de colágeno utilizando videomicroscopía y análisis de la trayectoria de la migración asistido por ordenador para analizar la actividad migratoria de estas células en respuesta a diversos neurotransmisores. La migración de las células tumorales fue inducida por la norepinefrina, la dopamina y la SP, demostrándose que dicha migración puede ser inhibida utilizando un antagonista específico de los receptores γ2adrenales, el receptor D2 o el NK-1R, respectivamente. Todos los neurotransmisores investigados activaron perceptiblemente el ciclo de Krebs. Además se detectaron cambios en la expresión genética hacia un tipo de célula tumoral con mayor motilidad, incluyendo una alta regulación por parte de la integrina γ2, que es un receptor esencial para la adherencia del colágeno en la migración. Por el contrario el gen para la supresión del tumor, gelsolin, disminuyó su regulación. Estas dos importantes alteraciones fueron confirmadas por flujocitometría e immunoblotting, respectivamente. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 75 Los neurotransmisores inducen así un tipo de célula tumoral metastatogénica por la regulación directa de la expresión del gen y un incremento de la actividad migratoria, la cual se puede prevenir por los antagonistas de los neurotransmisores. En un estudio previo402 se había mostrado que la metencefalina, la SP, la bombesina, la dopamina y la norepinefrina tenían un efecto estimulante en la migración de las células del cáncer de mama MDA-MB-468. Todo ello evidencia que en la migración de células del cáncer de mama existe una fuerte implicación reguladora de estos neurotransmisores. 1.11.1.B. CÁNCER PANCREÁTICO. La expresión del NK-1R ha sido analizada cuantitativamente por RT-PCR, hibridación in situ, inmunohistoquímica y Western-Blot, en muestras tumorales pancreáticas, en tejidos pancreáticos humanos normales y en líneas celulares de cáncer pancreático. El NK-1R y su ligando la SP están implicados en la patogénesis de ciertos tumores neuronales. Además, se ha analizado mediante sulforhodamine B la influencia de los análogos de la SP y de los antagonistas del NK-1R (MEN 11467) en el crecimiento celular del cáncer pancreático. Por RT-PCR, se ha comprobado que el mRNA del NK-1R estaba incrementado un 36.7 % (p<0.001) en muestras de cáncer pancreático humano comparado con controles normales. Los niveles incrementados de la expresión del NK-1R no estaban relacionados con el grado del tumor sino con un estadio avanzado del cáncer. Por hibridación in situ e inmunohistoquímica, la inmunorreactividad y el mRNA del NK-1R fueron escasas y débilmente presentes en células acinares y ductales de páncreas sano. En contraste, se detectaron intensas señales del mRNA del NK-1R y de inmunorreactividad en la mayoría de las células de cáncer. Mediante análisis de Western-Blot, se comprobó que el NK-1R estaba incrementado un 26 % (p<0.01) en muestras pancreáticas del cáncer en comparación a los controles sanos. El mRNA del NK-1R fue detectado en cinco líneas celulares de cáncer pancreático por RTPCR, encontrándose los niveles más altos en células CAPAN-1 y el más bajo en células ASPC-1. Los análogos del SP estimularon el crecimiento celular del cáncer pancreático, dependiendo del nivel de la expresión del NK-1R, constatándose que este efecto se podría bloquear por un antagonista selectivo del NK-1R. Estos resultados ilustran que el NK-1R está activo en la patogenia del cáncer pancreático humano y tiene el potencial de contribuir al crecimiento de células cancerígenas381. Al examinar el [D-Arg(1),D-Trp(5,7,9),Leu(11)]SP (SP-A) en los cánceres pancreáticos ductales, en otro estudio403. El SP-A actúa mediante su unión a la proteína G del receptor acoplado a Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 82 Figura 32. Porcentaje de inhibición del crecimiento de COLO 858, MEL HO y COLO 679 de melanoma humano en cultivo in vitro en relación con la adición de concentraciones crecientes (de 10 a 100) de L-732,138. Nivel de significación p ≤ 0.05. Estos resultados indicaban que el L-733,060 actuaba como agente antitumoral. Esta acción se demostró por primera vez en este estudio y sugería que el L-733,060 podría ser un fármaco prometedor en el tratamiento del melanoma humano. En el ultimo estudio de 2014 de Muñoz et al, en líneas celulares de melanoma, se demostró además que el NK-1R es muy importante para la viabilidad de las células tumorales. Ya que tras la Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 83 eliminación de NK-1R en las células mediante el método de sileciamiento génico(siRNA) o “knockdown gene silencing method”, las células afectadas que no expresan NK-1R demostraron una gran disminución de proliferación y metástasis en comparación con los controles. El método siRNA, se llevó a cabo en líneas celulares de melanoma COLO 858. Después de 72 h, encontramos 7,2×105 siRNA-negativas COLO 858 de control y 2.2×105 siRNA TAC1R COLO 858. Este experimento se repitió tres veces por duplicado. El número de células de control negativo siRNA se comparó con el número de las células siRNA TAC1R. A la hora 0, se sembraron 20.000 células COLO 858. A las 72 h, la disminución en el número de células siRNA TAC1R era bastante significativa en comparación con el número de células de control negativo siRNA. Estos datos muestran que los receptores NK-1 desempeñan un papel importante en la viabilidad de las líneas celulares de melanoma 380. 1.11.1.G. RETINOBLASTOMA. En julio de 2005 se publicó otro estudio de Muñoz et al419 donde se plantea si la activación del NK-1R induce la proliferación de células tumorales del retinoblastoma. Este estudio in vitro valora la capacidad inhibitoria del L-733,060 sobre el crecimiento de la línea humana WERI-Rb-1 del retinoblastoma y contra el retinoblastoma humano línea Y-79, en concentraciones que se extienden desde 7.5 a 20 µM y de 10 a 25 µM respectivamente. Este estudio también ha tratado de determinar la capacidad de la SP para activar el crecimiento de celular de estas líneas celulares de retinoblastoma. Las concentraciones nanomolares de SP aumentaron el crecimiento de las líneas celulares y las concentraciones micromolares de L-733,060 inhibieron el crecimiento de las dos líneas estudiadas, con y sin la administración previa de la SP. El L-733,060 inhibió el crecimiento de las líneas WERI-Rb-1 e Y-79 de forma dosis-dependiente. El IC50 fue 12.15 µM a las 49 horas para WERI-Rb1 y 17.38 µM a las 40 horas para Y-79. Los resultados demuestran que la SP es mitogénica y también indica que el L-733,060 (antagonista del NK-1R) actúa en ambas líneas celulares humanas del retinoblastoma como un agente antitumoral. 1.11.1.H. OSTEOSARCOMA. El osteosarcoma es un tumor óseo de alto grado que se origina en el epitelio mesangial. Es el tercer tumor óseo maligno más frecuente en niños y adolescentes. Si hay metástasis presentes la supervivencia a largo plazo es menor del 20%. En un estudio del Dr. Muñoz et al400 publicado en 2013 se analizó la expresión de NK-1R en una línea celular humana de osteosarcoma (MG-63) mediante RT-PCR y Western-Blot. Se demostró Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 84 entonces la presencia de una cantidad significativa de proteínas y ARNm de NK-1R. Más tarde se demostró la capacidad inhibitoria sobre el crecimiento celular de Aprepitant y de otros antagonistas del NK-1R como el L-733,060 and L-732,138. Todos ellos inducen inhibición del crecimiento del tumor y apoptosis. Se observó la existencia de sinergia en la combinación de L-733,060 y fármacos citostáticos usados comúnmente en las líneas celulares de MG-63. Concentraciones nanomolares de SP han demostrado producir un aumento del ratio de crecimiento de las células de MG-63 y concentraciones nanomolares de Aprepitant inhiben el crecimiento inducido por la SP de una manera dosis dependiente (figura 33). Figura 33. Expresión del receptor NK-1R e inhibición del crecimiento celular en línea celular de osteosarcoma MG63 con concentraciones ascendentes de antagonistas del NK-1R. In vivo, líneas celulares de MG-63 fueron xenoinjertadas en ratones, y estos separados en grupo control y grupo de tratamiento de forma aleatorizada. Una vez que el tumor resultó visible, estos fueron tratados con inyecciones subcutáneas peritumorales de fosaprepitant semanalmente Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 85 (los días 0, 7, 14, 21 y 28) con resultado de reducción del volumen del tumor de forma significativa (figura 34). Figura 34. Tratamiento in vivo con fosaprepitant de ratones xenoinjertados con líneas celulares de osteosarcoma. Los ratones fueron observados a diario, el tamaño tumoral medido en mm3. *p<0.05, **p< 0.01. Se demostró por tanto por primera vez que el NK-1R es expresado en líneas celulares de osteosarcoma MG-63 y que este receptor puede se inhibido tanto in vivo como in vitro por antagonistas del NK-1R. 1.11.1.I. HEPATOBLASTOMA. El hepatoblastoma es el tumor maligno hepático más frecuente durante la niñez. El pronóstico de este tumor es bueno si se puede producir una resección quirúrgica completa, pero si esto no es posible el pronóstico es bastante sombrío al tratarse de un tumor multirresistente a los tratamientos quimioterápicos que se conocen actualmente. Por este motivo se realizó un estudio in vitro en tres líneas celulares de hepatoblastoma de 17 niños: HepT1, HepG2 y HuH6 e in vivo mediante xenoinjerto en ratones de la línea celular HuH6420, para intentar demostrar la utilidad del complejo SP-NK-1R como un potencial objetivo para el tratamiento de este tumor. Las células del hepatoblastoma expresan predominantemente una variedad truncada de NK-1R. Los fibroblastos tienen una expresión muy pobre de NK-1R y por ello tienen una gran resistencia al tratamiento. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 86 La estimulación de las células de hepatoblastoma con SP causa un aumento en la tasa del crecimiento del tumor y la administración de sustancias antagonistas del NK-1R producen una inhibición de este crecimiento (figura 35). Figura 35. (A), expresión de ARNm para el NK-1R en fibroblastos humanos (FB) y tipo de expresión genética (fl, completa; tr, truncada). Niveles de expresión obtenidos por RT-PCR y Western blot. (B) supervivencia celular después del tratamiento con Aprepitant durante 48 h para las líneas celulares HuH6, HepT1, HepG2. (C–E) supervivencia celular comparando L-733,060 y L-732,138 con Aprepitant en HepT1 (C), HuH6 (D) y HepG2 (E). Más importante aún es la observación en vivo en los ratones estudiados tras xenoinjerto de líneas celulares de hepatoblastoma HuH6. Los ratones fueron xenoinjertados de forma subcutánea con células de HuH6 humanas y posteriormente aleatorizados en dos grupos: grupo control y grupo tratamiento. Aprepitant fue administrado de manera oral todos los días cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 75 mm3 hasta el día 24. El calibre del tumor se midió con un calibrador en mm3. Se demuestra una reducción significativa del tumor tras la administración oral de 80 mg/kg de Aprepitant durante 24 días (figura 36). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 87 Figura 36. Tratamiento in vivo de ratones xenoinjertados con HuH6 con Aprepitant. (A). Diferencia entre grupo placebo y grupo tratamiento. En (B) y (C), se muestra el peso del tumor y los niveles de AFP respectivamente. La histología de los ratones tratados y no tratados se muestra en (D). La inmunohistoquímica del NK-1R se muestra en los paneles superiores de (E). En (F), se muestra la inmunohistoquímica de Ki-67. En (G), se presenta la variante de NK-1R. También podemos ver en (H) la angiogénesis en vivo por medio de inmunohistoquímica de CD31 y en (H) se muestra la densidad y la vascularización. *p <0.05; **p <0.01. Resultó una reducción de la tasa de crecimiento del tumor, una disminución del peso y del volumen del mismo, y disminución de los marcadores tumorales específicos alfa-fetoproteína en suero. También se observo como efecto del tratamiento in vivo, la inhibición de la angiogénesis. 1.11.2. IMPLICACIÓN DEL COMPLEJO SP/NK-1R EN LA PROGRESIÓN TUMORAL. En términos generales, cuando el complejo SP/NK-1R se activa, se produce una serie de respuestas intracelulares que conllevan la activación de la cascada de las MAPK (protein-quinasas activadas por mitógenos). El mecanismo por el que se transmite esta señal es confuso. En última instancia se va a producir una inducción de la proliferación celular protegiendo a la célula de la apoptosis421,422. Se ha demostrado ampliamente que las células tumorales sobreexpresan los receptores NK-1R y que tras unirse a SP se induce la proliferación celular. Los receptores NK-1R usualmente están localizados en la membrana citoplasmática y en la membrana plasmática de las células Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 88 tumorales, pero en ocasiones también se puede encontrar en el núcleo de las mismas (figura 37). Las células normales expresan un número menor receptores de NK-1R y las muestras de estadios avanzados de tumores exhiben niveles mucho más altos de receptores. Dentro del mismo tumor los fenotipos más malignos, muestran un ratio mayor de NK-1R y está asociado a situaciones tumorales avanzadas y a un peor pronóstico. Figura 37. Cascada de señales desencadenadas por el receptor NK-1R. Al activarse mediante la SP comienza la proliferación celular, los efectos antiapoptóticos y la migración celular. Además de inducir el crecimiento tumoral, se ha comprobado que la SP posee otras características oncológicas ya que tiene la capacidad de estimular la angiogénesis necesaria para el crecimiento tumoral. Así, la SP por medio del NK-1R va a inducir la proliferación de las células endoteliales en primera instancia y posteriormente la formación de nuevos vasos que aseguren el aporte sanguíneo al tumor. Otro fenómeno estudiado es la facultad de la SP para inducir la producción de metástasis. Por un mecanismo no del todo conocido, la SP va a favorecer la migración tumoral y con ello la diseminación metastásica. Se ha visto con anterioridad que existe un claro vínculo entre la SP e inflamación, así se piensa que la SP podría favorecer el desarrollo de tumores en tejidos con inflamación crónica. Se ha demostrado que este neuropéptido se encuentra ampliamente en estos tejidos, esto, unido a la capacidad mitogénica de la SP es la base sobre la que asienta esta teoría. Otro aspecto interesante respecto a la SP es su implicación con los desordenes afectivos, siendo especialmente importante el incremento que existe de SP en ciertas áreas cerebrales en pacientes diagnosticados de ansiedad, depresión y estrés. Esta teoría supone que existe un vínculo entre el estado emocional del paciente y la evolución del cáncer llegando incluso a Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 89 sugerir que en pacientes diagnosticado de cáncer, el hecho de tratar la depresión con fármacos o medidas psicosociales podría aumentar el tiempo de supervivencia. En resumen, la SP es un ubicuo mediador de la inflamación que, presente a concentraciones picomolar en tejidos humanos, a concentraciones nanomolares es un mediador de la inflamación que regula la inflamación y cáncer. Aquellos tejidos sometidos a inflamación crónica y a una exposición continua a SP pueden desarrollar células tumorales. Aquellas células cancerígenas que expresen una mayor cantidad de NK-1R y por tanto presenten un fenotipo más agresivo, serán seleccionadas produciéndose un aumento de la masa tumoral dependiente de la SP. Además, tanto la inhibición como la muerte celular que aparecen en las líneas celulares tumorales al administrar los antagonistas del NK-1R, podrían ser debidos a la pérdida de esas señales mitogénicas inducidas por el NK-1R que en este caso estaría inhibido. La pérdida del balance mitogénesis/apoptosis se inclinaría hacia este último produciendo la muerte celular. No se debe olvidar que la SP es abundante en el SNC donde actúa como neurotransmisor, aunque también como una hormona la cual se disemina por todo el torrente sanguíneo. Este punto podría ser clave para entender un hecho que se comprueba en la clínica diaria que es la importancia del SNC en el control y la progresión del cáncer. Tras unirse a su receptor NK-1R la SP regula muchas funciones fisiopatológicas en el sistema nervioso central como el comportamiento emocional, el estrés, la depresión, la émesis, las nauseas, la migraña, la adicción al alcohol y la neurodegeneración. La sustancia P ha sido también implicada en el dolor, la inflamación, la hepatitis, la hepatotoxicidad, colestasis, prurito, miocarditis, bronquiolitis, abortos, infecciones bacterianas y virales (VIH, por ejemplo). La SP juega un papel muy importante en el cáncer, en la proliferación celular, efecto antiapoptótico, angiogénesis, migración de las células tumorales, infiltración y metástasis. Todo esto significa que el complejo SP/NK-1R está envuelto en la base molecular de muchas patologías humanas. Por lo tanto el conocer a fondo de esta fisiopatología es la clave para entender el funcionamiento de muchas enfermedades. Todos estos datos hacen que los antagonistas del NK-1R deban ser considerados como una alternativa para el tratamiento de la émesis, el prurito, la depresión, la degeneración neuronal, la enfermedad inflamatoria intestinal, infecciones virales y el cáncer, ya que son regulados por el completo SP/NK-1R423,424,425,426,427,428. Se ha demostrado la presencia de SP y de NK-1R en numerosos tipos de canceres humanos (tabla 6). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 90 Tabla 6. Presencia de SP y NK-1R en muestras y líneas celulares tumorales humanas. Pero todavía quedan muchos otros campos por investigar tanto en tejidos cancerígenos como en tejidos sanos, actualmente el grupo de investigación del Dr. Muñoz et al, tiene varias líneas de investigación abiertas en este sentido. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 91 II. OBJETIVOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 98 3.5. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS E INMUNOHISTOQUÍMICA INDIRECTA. 3.5.1. REALIZACIÓN DE CORTES Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS. Las muestras fueron fijadas en formaldehido al 4% e incluidas en bloques de parafina según el protocolo habitual del servicio de Anatomía Patológica del Hospital de Mérida. Se realizaron cortes de los tejidos entre 3-5 μm con un microtomo y se montaron en portaobjetos destinados específicamente para inmunohistoquímica con el ancho adecuado para los instrumentos Autostainer, identificándolas mediante serie numerada. Estas muestras de tejido parafinado se incubaron durante 24 horas en la estufa a 37ºC y 30 minutos antes de la realización de la inmunohistoquímica a 60ºC. 3.5.2. RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA INDUCIDA POR CALOR. Se colocan los portaobjetos en unos peines que se introducen en el sistema PT-link específico para la recuperación del epítopo inducida por calor. Con esta técnica, se llevan a cabo la desparafinación y la rehidratación en el mismo paso de la recuperación antigénica. Se llenan los tanques del sistema PT-link con la solución de recuperación antigénica de pH ácido citrato low diluída en agua destilada (1:10), durante 20 minutos a 96ºC. 3.5.3. INHIBICIÓN DE LA PEROXIDASA ENDÓGENA. Tras este proceso, se introduce la gradilla con los portaobjetos en un tanque con una solución buffer de lavado (Tris) diluida (1:20) y a temperatura ambiente, durante 5 minutos. Con este procedimiento se evita la reacción de las peroxidasas endógenas con la diaminobencidina. 3.5.4. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS. Se preparan los reactivos en los botes para rellenar con reactivos que se introducirán posteriormente en el dispositivo RACK del sistema Autostainer Link. De todas las soluciones necesarias para la realización de la inmunohistoquímica, unas se pueden incorporar directamente al RACK pues ya vienen preparadas en el kit de inmunohistoquímica (peroxidasa, hematoxilina, EnVisionTM FLEX / HRP y Linker de conejo). Sin embargo, será necesario preparar en los botes, las siguientes soluciones:  Sustrato buffer y cromógeno DAB+ (diaminobenzidina) en una proporción de 1 gota de cromógeno por cada 20 ml de sustrato. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 99  Anticuerpos policlonales primarios de conejo y diluyente: se prepararán tres botellas para las distintas soluciones: una solución de diluyente comercial Dako, una solución de anticuerpo anti SP y diluyente en proporción 1:2000, y una solución de anti-NK-1R y diluyente en proporción 1:1000. La preparación de la cantidad de solución a introducir en los botes para rellenar, ha de ser calculada según protocolo del sistema Autostainer Link. 3.5.5. PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO DE TINCIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA EN INSTRUMENTO AUTOSTAINER LINK. Se introducen los peines con los portaobjetos en el sistema Autostainer Link, tras identificación de los portaobjetos con etiquetas en las que constan el número de bloque, el anticuerpo empleado (anti SP o anti NK-1R), la concentración utilizada, la fecha de realización de la inmunohistoquímica y la fecha de caducidad del reactivo. Se producirán de forma automática los procesos de incubación de los cortes en antisuero primario específico para cada anticuerpo, la incubación en anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y la incubación con diaminobencidina. Los pasos de tinción y los tiempos de incubación óptimos recomendados son preprogramados en el software del sistema. En el caso del número de portaobjetos de nuestro estudio, se requirió un tiempo de tres horas de procesamiento. 3.5.6. DESHIDRATACIÓN DEL TEJIDO. Una vez completado el procedimiento de tinción, se han de montar las muestras. Se llevan las muestras a agua destilada, se realizará la deshidratación de las muestras mediante el paso de los portaobjetos por la batería de alcoholes en el siguiente orden: 60% (30 segundos), 70% (30 segundos), 80% (30 segundos), 90% (5 minutos), 96% (5 minutos), 100% (5 minutos). Finalmente se pasan las tres muestras por las tres cubetas de xiloles, para eliminar el alcohol: de forma rápida en las dos primeras (hasta que los cristales dejen de “lagrimear”) y en la tercera, el tiempo necesario hasta el montaje con el pegamento. 3.5.7. MONTAJE. A cada cristal recién sacado y escurrido del xilol se le pone un cubreobjetos al que previamente se han añadido unas gotas de pegamento Pertex. La reacción del xilol y el pegamento Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 100 hace que se unan ambos materiales. Se eliminan las burbujas que se forman durante el montaje. Una vez secado, las muestras están preparadas para la visualización del resultado con el microscopio óptico. 3.5.8. CONTROL DE CALIDAD. Los controles de la especificidad anticuerpo policlonal del reactivo mediante un suero preabsorbido, no se realizan como control de calidad, dado que los anticuerpos han sido validados para su uso por el laboratorio que los comercializa. Cada sesión de tinción incluyó una muestra de control positivo conocido con el fin de asegurar un rendimiento correcto de todos los reactivos aplicados. Se ha utilizado un reactivo de control negativo con cada muestra para identificar cualquier tinción no específica. La solución que contiene diaminobencidina proporciona un color marrón en el lugar del antígeno diana reconocido por el anticuerpo primario. El color marrón está presente en la muestra de control positivo en la ubicación esperada del antígeno diana. No hubo tinción inespecífica, que se reconocería como una tinción bastante difusa de color marrón en los portaobjetos tratados con el reactivo de control negativo. Los núcleos se tiñen de color azul gracias a la contratinción con hematoxilina. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 101 3.6. VALORACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. Las muestras fueron valoradas e interpretadas una a una en colaboración con un especialista en Anatomía Patológica especializado en patología tiroidea. Para ello se siguió un sistema ciego de identificación de las muestras en el que no se conoce ningún dato del paciente (edad, diagnóstico, comorbilidad...) en el momento de valorar cada muestra. Se obtuvieron fotografías de las muestras más representativas mediante un microscopio Olympus BX61, dotado con objetivos de diferentes aumentos (4X, 10X, 20X, 40X, 60X) y acoplado a una cámara fotográfica digital Olympus modelo DP72. Para el procesamiento de las imágenes se empleó el software CellSens Dimension (versión 1.4, 2010, Olympus Corporation). Algunas imágenes, denominadas como “reconstruidas” en el apartado de Resultados, se obtuvieron mediante la opción que ofrece este programa de edición fotográfica de superponer diferentes imágenes obtenidas varios planos del eje Z (separados entre sí por 0.1 µm), integrando los diferentes puntos enfocados de cada plano en una sola imagen final, en la que se consigue una profundidad de campo notablemente mayor. Los resultados del estudio inmunohistoquímico se presentan utilizando un sistema de puntuación semicuantitavo, el Allred Unit Scoring system. Se trata de un sistema de puntuación de 8 unidades. Este sistema evalúa la proporción y la intensidad de la tinción de 0 a 8.429 3.6.1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS. La descripción de la muestra y su análisis estadístico se llevó a cabo utilizando Microsoft Excel 2014 y el paquete estadístico SPSS v.14. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 102 Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 103 IV. RESULTADOS. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 104 4.1. DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA DE ESTUDIO. Se dispone de 135 muestras histológicas pertenecientes a pacientes diagnosticados de cáncer de tiroides de diferentes estirpes. El 63% son mujeres y el 37% hombres, con edades comprendidas entre los 11 y 76 años (media 47 años). Figura 38. Distribución de edades. Figura 39. Distribución por sexo. Mujeres 63% Hombres 37% Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 105 De los pacientes el 30,07% no presentaban antecedentes personales de interés clínico. El 19,2% tenían antecedentes de hipertensión arterial; el 19.2% dislipemia y el 3,8% hipotiroidismo. Respecto a hábitos tóxicos el 11,5% tenían hábito tabáquico y ningún paciente era bebedor ni consumidor de otras sustancias tóxicas. Respecto al tipo de tumor tiroideo el 34,6% de las muestras corresponden a carcinoma papilar de tiroides; el 30,8% a carcinoma folicular; el 11,5 % a carcinoma medular; el 7,7% a carcinoma anaplásico y el 15,4% a metástasis. Figura 40. Distribución por tipos de tumor. 0 5 10 15 20 25 30 35 Papilar Folicular Medular Anaplásico Metástasis 34,6 30,8 11,5 7,7 15,4 Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 106 4.2. RESULTADOS DEL ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO DE LA SP Y EL NK-1R. Los resultados del estudio inmunohistoquímico se presentan utilizando un sistema de puntuación semicuantitavo, el Allred Unit Scoring system. Se trata de un sistema de puntuación de 0 a 8 unidades. Este sistema evalúa la proporción y la intensidad de la tinción. La puntuación representa la proporción estimada de fracción de células de tinción positiva (0 = ninguna; 1 = menos de una centésima; 2 = centésima a décima; 3 = un décimo a un tercio; 4 = un tercio a dos tercios; 5 = mayor que dos tercios). Y la intensidad estimada de 0 a 3 (0 = ninguno; 1 =débil; 2 = intermedio; 3 = fuerte). La puntuación total se expresa como la suma de la proporción y la intensidad de puntuaciones (por lo que oscila entre 0 y 8)429 (figura 41). Figura 41. Sistema Allred Unit Scoring. Si el marcador es ≥1, el tejido fue aceptado como positivo. Las tasas de positividad y los resultados se compararon entre los tejidos sanos y patológicos, y entre diferentes diagnósticos patológicos (figura 42). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 107 Figura 42. Expresión NK-1R en carcinoma folicular de tiroides (x40). Tinción citoplasmática: Proporción = 5 y la intensidad = 3 ( Allred = 8). Tinción coloide: Proporción=3, intensidad=2 ( Allred=5). Tinción nuclear: Proporción=0, intensidad=0 (Allred=0). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 114 Figura 51. Expresión SP en carcinoma papilar variante oncocítica (Cls. de Hürthle). Observamos tinción nuclear, más intensa en la periferia de los núcleos de las células oxifílicas (Allred:5), escasa tinción del estroma (Allred:2) y nula en células endoteliales (Allred:0). EXPRESIÓN SP EN CARCINOMA FOLICULAR. En las muestras de carcinoma folicular observamos un tinción muy intensa de los núcleos de las células principales (Allred:8). Tanto el material coloide como el estroma y el citoplasma presentan una tinción escasa y las células endoteliales no captan. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 115 Figura 52. Expresión de SP en carcinoma folicular (x20). Núcleos de células principales con captación intensa (Allred:7), células endoteliales sin tinción (Allred:0). Coloide con expresión moderada (Allred:5). Figura 53. Expresión de SP en carcinoma folicular (detalle x40) Núcleos de células principales con captación intensa (Allred:7), células endoteliales sin tinción (Allred:0). Coloide con expresión moderada (Allred:5). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 116 El riesgo de desarrollar un carcinoma papilar de tiroides es mayor en los pacientes con tiroiditis de Hashimoto. Este tipo de cáncer es claramente más agresivo que otros carcinomas papilares de tiroides 430. Figura 54. Expresión SP en carcinoma folicular en paciente con tiroiditis de Hashimoto previa.(x10). Podemos observar una clara tinción nuclear muy intensa (Allred: 7), y del material coloide y tejido estromal (Allred:5). En la siguiente imagen de cáncer folicular sobre tiroiditis de Hashimoto previa, llama la atención la infiltración linfocítica y el nódulo linfoide que observamos en el centro de la imagen, propia de la tiroiditis linfocitaria crónica. Cómo la inflamación crónica produce un aumento de SP en las células afectadas y como consecuencia la aparición de cáncer. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 117 Figura 55. Expresión SP en carcinoma folicular en paciente con tiroiditis de Hashimoto previa.(x20). Infiltración linfocítica y el nódulo linfoide propia de la tiroiditis linfocitaria crónica que tiene un captación de SP de intensidad 3 y proporción 3 (Allred:6). Podemos observar una tinción nuclear intensa (Allred: 7), y del material coloide y tejido estromal (Allred: 5). Figura 56. Expresión SP en carcinoma folicular en paciente con tiroiditis de Hashimoto previa (detalle x40). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 118 EXPRESIÓN SP EN CARCINOMA MEDULAR. El cáncer medular de tiroides se desarrolla a partir de las células parafoliculares o células C, secretoras de calcitonina, las cuales se encuentran en un bajo porcentaje dentro del folículo tiroideo. En la siguiente imagen podemos observar como se tiñen estos grupos celulares de forma muy intensa, en contraste con el resto del tejido que no capta SP (figuras 57, 58 y 59). Figura 57. Expresión SP en carcinoma medular (x20). Observamos tinción marcada de los núcleos de las células parafoliculares (intensidad 3), y de forma difusa del tejido estromal, en claro contraste con la falta de captación del resto del tejido tiroideo. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 119 Figura 58. Expresión SP en carcinoma medular, detalle (x20). Figura 59. Expresión SP en carcinoma medular, detalle (x40). EXPRESIÓN SP EN CARCINOMA ANAPLASICO. El carcinoma anaplásico es uno de los cánceres más agresivos, de evolución rápida y cuyo pronóstico es extremadamente negativo a corto plazo. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 120 En el siguiente corte histológico podemos observar la transición entre tejido sano y carcinoma anaplásico. Como vemos en el tejido sano la captación de SP es muy escasa y en contraposición en el carcinoma es muy intensa y de proporción variable. Esto se debe al rápido crecimiento de este tumor. Vemos como se produce una desestructuración completa de la arquitectura folicular tiroidea y como en el límite se acumula SP con mayor intensidad (figuras 60, 61 y 62). Figura 60. Transición de tejido sano a carcinoma anaplásico (x4). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 121 Figura 61. Expresión SP en carcinoma anaplásico (x10). Figura 62. Expresión SP carcinoma anaplásico (x20). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 122 EXPRESIÓN SP EN GANGLIOS METASTÁSICOS. Podemos observar en las muestras histológicas de ganglios metastásicos una expresión de SP intensa en los núcleos de las células principales en claro contraste con el tejido linfoide sano (figuras 63, 64 y 65). Figura 63. Expresión SP en metástasis de carcinoma papilar en ganglio cervical (x10) podemos observar la transición del tejido sano linfoide a carcinoma. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 123 Figura 64. Expresión SP en metástasis de carcinoma papilar x20. Tinción nuclear intensa (Allred:7) y del material coloide (Allred:5). Figura 65. Metástasis (x40) detalle. En el que se objetiva como la tinción para SP además de nuclear es más intensa en la membrana células cuboidales del folículo que son las que tienen actividad glandular. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 130 Figura 72. Expresión NK-1R en carcinoma papilar (x20). Observamos una tinción muy intensa citoplasmática (Allred:8) con núcleos que no captan NK-1R.El coloide presenta captación moderada (Allred:4). Figura 73. Expresión NK-1R en carcinoma papilar (x40). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 131 Estudiamos también la expresión NK-1R en el carcinoma papilar variante oncocítica o de células de Hürthle. Las células oxifílicas o de Hürthle muestran un citoplasma granular abundante debido a la acumulación de mitocondrias y podemos observar los núcleos con nucleolo aparente. En la siguiente imagen podemos observar una tinción citoplasmática moderada en la que se objetiva un aumento de intensidad de expresión de NK-1R en la membrana de las células principales cuboidales del folículo que son las que tienen actividad glandular. Los núcleos no expresan NK-1R. Figura 74. Expresión NK-1R en carcinoma papilar variante oncocítico (x40). Se objetiva un aumento de intensidad de expresión de NK-1R en la membrana de las células principales cuboidales del folículo que son las que tienen actividad glandular. Los núcleos no expresan NK-1R. EXPRESIÓN NK-1R EN CARCINOMA FOLICULAR. En las muestras de cáncer folicular podemos observar una expresión muy intensa de NK-1R citoplasmática de las células principales y nula captación nuclear. El coloide tiene una tinción muy leve al igual que las fibras reticulares del tejido estromal (figura 75). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 132 Figura 75. Expresión de NK-1R en carcinoma folicular (x20) Vemos una tinción intensa de NK-1R citoplasmatica de las células principales (Allred: 8) y ninguna captación nuclear (Allred:0). El coloide tiene tinción debil (Allred: 3). Figura 76. Expresión de NK-1R en carcinoma folicular, detalle (x40) Tinción intensa de NK-1R citoplasmatica (Allred: 8) y ninguna captación nuclear (Allred:0). El coloide tiene una tinción leve (Allred: 3). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 133 EXPRESIÓN NK-1R EN CARCINOMA MEDULAR. El cáncer medular de tiroides se desarrolla a partir de las células parafoliculares o células C, secretoras de calcitonina, las cuales se encuentran en un bajo porcentaje dentro del folículo tiroideo. En la siguiente imagen podemos observar como se tiñen los citoplasmas estos grupos celulares de forma muy intensa, en contraste con el resto del tejido que no capta NK-1R (figura 77). Figura 77. Expresión NK-1R en carcinoma medular (x20) Objetivamos tinción citoplasmática intensa en los grupos celulares de células parafoliculares (Allred: 8), y tinción leve de las fibras reticulares del tejido estromal (Allred:2). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 134 Figura 78. Expresión NK-1R en carcinoma medular, detalle (x40). EXPRESIÓN NK-1R EN CARCINOMA ANAPLÁSICO. El carcinoma anaplásico es uno de los cánceres más agresivos. En el siguiente corte histológico podemos observar la transición entre tejido sano y carcinoma anaplásico. Vemos que en tejido sano existe una captación moderada de NK-1R y en la zona tumoral existe tinción escasa de algunos núcleos y del tejido reticular y desestructurado que compone el tumor. Esto se debe al rápido crecimiento de este tumor que es de muy rápida evolución. Vemos como se produce una desestructuración completa de la arquitectura folicular tiroidea y como al contrario de las tinciones para SP en las que la expresión es muy intensa, en el carcinoma anaplásico, el tumor expresa de forma escasa NK-1R (figura 79). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 135 Figura 79. Expresión de NK-1R transición de tejido sano a carcinoma anaplásico (x4). Vemos que en tejido sano existe una captación moderada de NK-1R y en la zona tumoral existe tinción escasa de algunos núcleos y del tejido reticular y desestructurado que compone el tumor. Figura 80. Expresión NK-1R en carcinoma anaplásico, detalle (x40). Observamos leve captación de algunos núcleos, en las membranas celulares, material coloide y en el tejido reticular desestructurado. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 136 EXPRESIÓN NK-1R EN GANGLIOS METASTÁSICOS. Podemos observar en las muestras histológicas de ganglios metastásicos una expresión de NK-1R intensa en el citoplasma de las células principales en claro contraste con el tejido linfoide sano (figuras 81, 82 y 83). Figura 81. Expresión NK-1R en metástasis carcinoma papilar x20. Observamos tinción citoplasmática de las células principales (Allred: 6), no se tiñen los núcleos celulares (Allred:0) y de forma leve el estroma y el material coloide. Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 137 Figura 82. Expresión NK-1R en metástasis carcinoma papilar, detalle (x40). Figura 83. Expresión NK-1R en metástasis carcinoma papilar, detalle (x40). Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 138 Importancia de la sustancia P y su receptor NK-1R en el cáncer de tiroides 139 V. DISCUSIÓN.