Mejora de la cognición (memoria) mediante el uso de ß-glucanos fúngicos: Papel del eje Eje Intestino-Cerebro.

TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN BIOQUÍMICA. FACULTAD DE BIOLOGÍA. UNIVERSIDAD DE SEVILLA Mejora de la cognición (memoria) mediante el uso de β-glucanos fúngicos: papel del eje intestino-cerebro Autora: Ana Marta Flores Alcaide Tutor: Dr. Juan Dionisio Bautista Palomas Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (Facultad de Farmacia) Sevilla, 2023 Índice 1. Resumen……………………………………………………………………………. 1 2. Introducción y antecedentes………………………………………………………... 1 2.1. β-glucanos: qué son y sus propiedades fisicoquímicas………………………... 1 2.2. Eje intestino-cerebro…………………………………………………………… 8 3. Objetivos……………………………………………………………………………10 4. Materiales y métodos……………………………………………………………… 11 5. Resultados y discusión…………………………………………………………….. 11 5.1. Generalidades fisiológicas de los β-glucanos………………………………… 11 5.2. Actividad inmunomoduladora…………………………………………………12 5.3. Actividad hipocolesterolémica………………………………………………...14 5.4. Actividad antialérgica………………………………………………………….14 5.5. Actividad hipoglucémica………………………………………………………15 5.6. Mejoras de las actividades fisiológicas de los β-glucanos…………………….15 5.7. Relación entre β-glucanos fúngicos y cognición………………………………16 5.8. Relación entre microbiota y salud cerebral……………………………………22 6. Perspectivas futuras………………………………………………………………...24 7. Conclusiones………………………………………………………………………..27 8. Bibliografía…………………………………………………………………………28 1 1. Resumen Los β-glucanos son polisacáridos de cadena larga cuya estructura principal se caracteriza por la unión de monómeros D-glucosa mediante enlaces glucosídicos β-(1,3) a la que se le unen ramificaciones mediante enlaces glucosídicos β-(1,6) o β-(1,4). Las estructuras de estos compuestos varían según sus fuentes de origen por lo que también presentan diferentes estructuras tridimensionales en solución acuosa las cuales influyen en las posibles actividades biológicas de estos compuestos. Los β-glucanos se utilizan ampliamente en la alimentación y han tenido y tienen una gran utilización en la medicina tradicional china debido a los numerosos efectos beneficiosos que poseen para la salud: hipocolesterolémico, inmunomodulador, hipoglucémico, antitumoral, antioxidante, antiinflamatorio, radioprotector y antialérgico. Además, los β-glucanos son capaces de mejorar la cognición tanto desde un estado fisiológico como desde uno disminuido a través de la microbiota y del eje intestino-cerebro. El microbioma intestinal maduro engloba entre 1013 y 1014 microorganismos, se establece entre los 1 y 3 años y está compuesto, principalmente, de bacterias anaeróbicas de más de 50 filos y 1000 especies diferentes. Un desequilibrio en este microbioma intestinal se conoce como disbiosis y puede ser el causante de varias enfermedades entre las que se incluye: el autismo, el estrés, la ansiedad, la obesidad, la esquizofrenia, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. La microbiota influye en la función cognitiva durante todas las etapas de la vida por lo que la utilización de β-glucanos puede ser una estrategia terapéutica o de prevención efectiva para muchas de estas enfermedades. Palabras clave: gut brain axis, β-glucan, mushroom, cognition, microbiota 2. Introducción y antecedentes 2.1. β-glucanos: qué son y sus propiedades fisicoquímicas Los β-glucanos son polisacáridos de cadena larga cuya estructura principal se caracteriza por la unión de monómeros D-glucosa mediante enlaces glucosídicos β-(1,3) a la que se le unen ramificaciones mediante enlaces glucosídicos β-(1,6) o β-(1,4) (Nakashima et al., 2018). Los β-glucanos están presentes en la capa de aleurona de algunos cereales y en las paredes celulares de hongos, liquen, levaduras, bacterias, algas, microalgas (Euglena gracilis) y cereales (ver Tabla 1) (Bashir & Choi, 2017). 2 Tabla 1.- Resumen de los β-glucanos más representativos presentes en la naturaleza y sus fuentes de origen. Tabla modificada de Bashir & Choi, 2017 y Nakashima et al., 2018. Tipo de β-glucano Nombre del β-glucano Fuente (especie) Nombre general β-glucano fúngico Schizophyllan (SPG) Schizophyllum commune Hongo suehirotake Lentinan (LNT) Lentinula edodes Hongo shiitake Grifolan (GRN) Grifola frondosa Hongo maitake Polisacáridoglucano (PSG) Ganoderma lucidum Hongo reishi (Japón) HEP3 Hericium erinaceus Hongo melena de león Pleuran (HA- glucan) Pleurotus ostreatus Gírgola o seta de ostras β-glucano de liquen Pustulan Gyrophera esculenta, Umbiliaria papulosa Liquen Lichenan Cetraria islandica Liquen β-glucano de levadura Zymosan, Yestimun y Cerevan Saccharomyces cerevisiae Levadura β-glucano bacteriano Curdlan Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter y Alcaligenes faecalis Bacteria β-glucano de alga Laminarin Laminaria digitata, Saccharina longicruris y Durvillaea antarctica Alga β-glucano de microalga Paramylon Euglena gracilis Euglena β-glucano de cereal - Avena sativa Avena - Hordeum vulgare Cebada - Triticum vulgare Trigo Las estructuras de los β-glucanos varían según sus fuentes de origen (ver Figura 1). Así, los β-glucanos de cereales también conocidos como glucanos de enlace mixto (Mixed Link Glucans: MLG) consisten en una cadena lineal cuyos monosacáridos de 3 glucosa se unen mediante enlaces glucosídicos β-(1,3) y β-(1,4) consecutivos sin ramificaciones. El lichenan también presenta esta estructura. Sin embargo, los βglucanos de hongos presentan una cadena lineal principal cuyos monosacáridos están unidos por enlaces glucosídicos β-(1,3) y las ramificaciones consisten en unidades de glucosa individuales o cadenas cortas unidas a la cadena principal mediante enlaces glucosídicos β-(1,6) a distancias relativamente cortas de dos a seis monómeros. Los βglucanos de levaduras y algas presentan una estructura base muy similar consistente en una cadena lineal principal donde los monosacáridos se unen mediante enlaces glucosídicos β-(1,3) a la cual están unidas ramificaciones mediante enlaces glucosídicos β-(1,6) consistentes en cadenas lineales, de longitud variable, unida por enlaces glucosídicos β-(1,3). En el caso de los β-glucanos de levaduras, las ramificaciones llegan a contener hasta 30 monosacáridos. En el caso de las algas, algunos β-glucanos se caracterizan por la presencia de manitol en el extremo de la cadena principal. Los βglucanos bacterianos y de organismos unicelulares como la Euglena consisten en una cadena principal lineal donde los monosacáridos se unen mediante enlaces glucosídicos β-(1,3) y no presentan ramificaciones. El pustulan también presenta esta estructura (Nakashima et al., 2018). Figura 1.- Estructuras representativas de β-glucanos extraídos de cereal (A), hongo (B), levadura (C), alga (D), bacteria y Euglena (E). Imagen modificada de Nakashima et al., 2018. 4 La conformación que presentan los β-glucanos en solución depende de varios factores, tales como: los impedimentos estéricos espaciales, el grado de libertad de giro de los enlaces y del peso molecular. Los β-glucanos pueden encontrarse formando diversas estructuras debido a las diferentes conformaciones que pueden adoptar en solución. Entre ellas cabe señalar: el ovillo aleatorio, la hélice simple, la doble hélice, la triple hélice, estructuras tipo gusano, tipo cilindro y agregado al azar (ver Figura 2). Los β- (1,3)-glucanos lineales sin ramificaciones presentan relativamente pocos impedimentos estéricos espaciales y un grado de libertad de giro grande por lo que, normalmente, adoptan la conformación de agregado al azar. Los β-(1,3)-glucanos con ramificaciones tienden a formar conformaciones de hélice debido a los numerosos enlaces de hidrógeno que se pueden formar entre sus cadenas laterales. Por ejemplo, el curdlan es un β-(1,3)- glucano lineal sin ramificaciones de bajo peso molecular por lo que, en solución, adopta una conformación de ovillo aleatorio. El lentinan es un β-(1,3)-glucano de alto peso molecular con ramificaciones por lo que presenta, en solución a temperatura ambiente, una conformación de triple hélice (Wang et al., 2017). El paramylon es un β-(1,3)- glucano lineal sin ramificaciones que se almacena como fuente de carbohidratos en forma de triple hélice dando lugar a estructuras cristalinas (Nakashima et al., 2018). Figura 2.- Representaciones bidimensionales de todas las posibles conformaciones tridimensionales que pueden adoptar los diferentes β-glucanos en solución acuosa. Imagen obtenida de Wang et al., 2017. Las propiedades fisicoquímicas (solubilidad, viscosidad y peso molecular) de los βglucanos difieren considerablemente dependiendo de la fuente o materia prima de partida, del método de extracción y del grado de purificación (Bashir & Choi, 2017). El peso molecular (PM) varía según el tipo de β-glucano consecuencia de la diversidad de fuente o materia prima de partida, del número de monosacáridos, así como del protocolo o procedimiento de extracción, purificación, e incluso de la metodología 5 empleada para su determinación, ya que depende de los solventes, tipo de columna de exclusión molecular (biogeles o Shephadex, etc), tipo de detección (absorbancia a 220 o índice de refracción) e incluso de los patrones (estándares) utilizados en la determinación. Los β-glucanos de mayor tamaño se han descrito en los cereales: entre 1.6 MDa en la avena y 49 MDa en la cebada. Los β-glucanos de hongos presentan tamaños muy variables, si bien bastante más bajos, por ejemplo, 30 kDa para el grifolan, 500 kDa para el lentinan, 450 kDa para el schizophyllan y 33 kDa para el pleuran, si bien estos valores varían significativamente según el método utilizado. El laminarin presenta un tamaño diferente según la fuente de extracción: 4 kDa el extraído de Laminaria digitata, entre 2.9 y 3.3 kDa el extraído de Saccharina longicrucis y 6.9 kDa el extraído de Durvillaea antárctica, si bien bastante más bajos que los descritos para cereales u hongos. Los β-glucanos de levadura tienen PM del orden de 240 kDa y los presentes en microalgas como Euglena tienen un tamaño de 500 kDa (Nakashima et al., 2018). En cuanto a los métodos de extracción utilizados para la obtención de β-glucanos puros o altamente purificados (> 80%) a partir de las diferentes fuentes de origen, éstos pueden ser de varios tipos y difieren según que el β-glucano sea soluble o insoluble. Además, de acuerdo con la distribución y localización celular de los polisacáridos fúngicos, éstos se dividen en polisacáridos intracelulares y extracelulares. En particular, los polisacáridos extracelulares crudos se pueden extraer directamente del medio de fermentación mediante métodos de precipitación con etanol, generalmente entre el 70 y el 80% de etanol. En cuanto a los polisacáridos fúngicos intracelulares, éstos se obtienen a partir de cuerpos fructíferos o micelios y se pueden extraer mediante diferentes métodos de extracción: sin pretratamiento, o con pretratamiento con ultrasonido, microondas o enzimático, seguido de una extracción en agua a diferentes temperaturas, generalmente > 90ºC o en autoclave (121ºC). Actualmente, la extracción con agua caliente (hot water extraction: HWE) se ha convertido en uno de los métodos de extracción más utilizados debido a su fácil implantación y equipos sencillos y baratos. Para la extracción de β-glucanos fúngicos intracelulares, el primer paso consiste en el secado y molienda del cuerpo fructífero del hongo, originando una harina del hongo donde se encuentran los β-glucanos solubles e insolubles junto con otros componentes celulares. El siguiente paso consiste en una extracción con agua caliente y una centrifugación, obteniendo una fracción soluble que contiene los β-glucanos 6 solubles, y un precipitado que contiene los β-glucanos insolubles. El procedimiento a seguir para obtener los β-glucanos puros solubles consta de una precipitación del sobrenadante con etanol al 70%, obtención del precipitado y redisolución (1:10) en agua desionizada, tratamiento con α-amilasa y proteasa para solubilizar α-glucanos y proteínas; seguido de una segunda precipitación con etanol al 70% (W. Wang et al., 2022) (Folgado-Dorado et al., 2023). Los β-glucanos se utilizan ampliamente en la alimentación ya que muchos de los productos que consumimos diariamente en nuestra dieta contienen estos compuestos. Sin embargo, estos productos han tenido y tienen una gran utilización en la medicina tradicional china debido a los numerosos efectos beneficiosos que poseen para la salud. Así, el uso medicinal del hongo shiitake, Lentinula edodes, se generalizó en la dinastía Ming (1368-1644) después del desarrollo de métodos para cultivar el hongo en troncos; fue adoptado como un tónico que podía contrarrestar la fatiga y los dolores cotidianos asociados con el envejecimiento. En esa época, se suponía que este hongo podía mejorar enfermedades del corazón y del pulmón, los gusanos intestinales y el tratamiento del cáncer. El hongo Ganoderma lucidum, llamado lingzhi (en China) y reishi (en Japón), es otro de los hongos medicinales más populares y tiene una historia de uso en China incluso más antigua que la del shiitake. Este hongo se menciona en un poema de 2000 años de antigüedad de la dinastía Han y las descripciones anteriores del "Hongo de la Inmortalidad" probablemente se refieren a esta especie. El hongo crece en madera podrida en la naturaleza y los agricultores modernos crían el hongo en bolitas de aserrín o paja empacadas en bolsas de plástico. Al igual que el shiitake, se cree que el lingzhi tiene una inmensa gama de beneficios y se usa para tratar el cáncer, las convulsiones, los problemas cardiovasculares y la diabetes (Money, 2016). Actualmente, los β-glucanos son reconocidos como ingredientes alimentarios funcionales y bioactivos gracias a la multitud de actividades biológicas que presentan, entre las que cabe señalar sus efectos: hipocolesterolémico, inmunomodulador, hipoglucémico, antitumoral, antioxidante, antiinflamatorio, radioprotector y antialérgico (Du et al., 2019). Debido a ello, la producción de hongos y trufas se ha incrementado de forma exponencial tanto en Asia oriental como en la Unión Europea, si bien en Asia de manera mucho más significativa. En 2020, Asia oriental ha producido en torno a 42 millones y la Unión Europea en torno a 1 millón (ver Figura 3). Se han registrado más 7 de 1000 tipos de hongos comestibles, los hongos son ricos en polisacáridos, proteínas, grasas, vitaminas y otros componentes activos. (W. Wang et al., 2022). Figura 3.- Representación gráfica de la evolución de la producción de hongos y trufas en la Unión Europea y Asia Oriental durante 1990 y 2020. Gráfica obtenida por la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura). Los β-glucanos también tienen un papel importante en la industria alimentaria ya que tiene la capacidad de formar gel y mejorar la consistencia de las soluciones acuosas. Se utiliza para dar mejor textura y aspecto a aderezos para ensaladas, salsas y helados. Además, el β-glucano se emplea como sustituto de la grasa en el desarrollo de productos alimentarios bajos en calorías. No obstante, el comportamiento del flujo y las propiedades gelificantes del β-glucano generan diversos problemas técnicos en las industrias alimentarias, como la filtración lenta de soluciones o lodos, bajos rendimientos y precipitación durante el almacenamiento de la cerveza. Por consiguiente, las aplicaciones del β-glucano en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica se han visto limitadas debido a su alto peso molecular y su viscosidad elevada (Du et al., 2019). Pero, actualmente, los β-glucanos han adquirido una gran importancia más que por su valor nutricional o sabor agradable, por su uso como nutracéuticos y/o prebióticos y por sus acciones beneficiosas para la salud, como describiremos más adelante en el apartado de Resultados y discusión. 14 5.3. Actividad hipocolesterolémica Los β-glucanos muestran viscosidad en una solución acuosa por lo que funcionan como fibra dietética al arrastrar materiales innecesarios en el intestino y ayudar a eliminarlos. La reducción de los niveles de colesterol por los β-glucanos puede ocurrir gracias a esta capacidad para actuar como fibra dietética atrapando las micelas de ácido biliar que contienen grasas interrumpiendo la interacción de las micelas con los transportadores de membrana luminal presentes en el epitelio intestinal, aumentando así la producción fecal de grasa, ácidos biliares y colesterol. Sin embargo, también puede ocurrir durante las fermentaciones de la microbiota ya que si aumenta el nivel de ácido propiónico y disminuye el nivel del ácido acético (sustrato principal para la biosíntesis del colesterol) resulta en la disminución de la biosíntesis del colesterol (Theuwissen & Mensink, 2008). Para compensar la disminución del nivel de ácidos biliares, la expresión de la 7a- hidroxilasa (enzima implicada en la síntesis de ácidos biliares) está sobreregulada. En consecuencia, el nivel de colesterol hepático también disminuye y se restaura por el colesterol transportado en la lipoproteína de baja densidad (low density lipoprotein: LDL) provocando un descenso de esta en el torrente sanguíneo. La LDL es un importante marcador de riesgo de enfermedades cardiovasculares y se ha visto que el pan formulado con β-glucano de avena reduce significativamente los niveles de esta. Por tanto, esto significa que el consumo de β-glucanos presentes en los cereales reduce el riesgo de enfermedades cardiovasculares (Nakashima et al., 2018). 5.4. Actividad antialérgica Las respuestas inmunológicas excesivas pueden derivar en enfermedades autoinmunes o alergias por lo que es muy importante mantener una homeostasis inmunológica equilibrada. En nuestro cuerpo, esta homeostasis inmunológica equilibrada se consigue mediante la supresión entre sí de las células Th1, encargadas de la inmunidad mediada por células, y las células Th2, responsables de la inmunidad humoral. Por un lado, si ocurre una alteración del equilibrio inmunológico en dirección a Th2 se pueden manifestar síntomas de dermatitis atópica y otras alergias. Por otro lado, la activación excesiva del sistema inmunológico mediado por células Th1 junto con las células Th17 causa enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide. La ingesta de β-glucanos, principalmente, estimula la actividad de las células Th1 y Th17 suprimiendo, así, la actividad de las células Th2. Por tanto, los β-glucanos son capaces de aliviar los 15 síntomas de enfermedades alérgicas. Esta acción esta, principalmente, desencadenada por el efecto inmunomodulador de los β-glucanos, lo que sugiere que los β-glucanos con efectos inmunomoduladores también tienen capacidad antialérgica (Nakashima et al., 2018). 5.5. Actividad hipoglucémica Los β-glucanos solubles disminuyen las concentraciones postprandiales de glucosa plasmática e insulina reduciendo la tasa de absorción de carbohidratos en el tracto gastrointestinal mediante varios mecanimos: aumentando la viscosidad del bolo alimenticio alargando los tiempos de vaciamiento gástrico y tránsito intestinal, impidiendo la digestión y absorción de parte de los carbohidratos ingeridos y liberando ácidos grasos de cadena corta (ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico) cuando son fermentados por la microbiota en el colon. Estos ácidos grasos de cadena corta serán absorbidos hasta la circulación sistémica y disminuyen la glucosa postprandial mediante la inhibición de la producción de glucosa endógena o mediante el aumento de las acciones de la insulina extrahepática (Battilana et al., 2001). 5.6. Mejoras de las actividades fisiológicas de los β-glucanos La conformación tridimensional del β-glucano es el factor clave que determina cuál es la actividad biológica que puede realizar con mayor eficiencia. Las modificaciones estructurales pueden cambiar la solubilidad en agua y la conformación espacial de los polisacáridos originales modificando, así, su actividad biológica. Por tanto, se pueden realizar modificaciones específicas para conseguir mejoras en las actividades biológicas de los β-glucanos (W. Wang et al., 2022). Estas modificaciones pueden ser físicas, químicas o biológicas. Las modificaciones físicas engloban: ondas ultrasónicas, irradiación con rayos X, γ y haz de electrones, microondas, alta temperatura y microfluidización a alta presión. Las modificaciones químicas engloban: sulfatación, carboximetilación y fosforilación. Las modificaciones biológicas se realizan mediante β-glucanasas, normalmente, para disminuir el peso molecular y aumentar la solubilidad en agua y la bioactividad del β-glucano (Q. Wang et al., 2017). En los últimos años se han realizado varios estudios para comprobar si realmente un cambio en la estructura del β-glucano provoca un cambio en su actividad fisiológica. El 16 lentinan tiene bioactividad antitumoral debido a su estructura tridimensional en forma de triple hélice. En un primer estudio se observó que la actividad antitumoral del lentinan desaparece cuando este presenta una estructura tridimensional en forma de hélice simple. Sin embargo, recupera, parcialmente, la actividad antitumoral con la unión de ácido sulfónico ya que este compuesto cargado podría aumentar la unión entre el lentinan y el receptor de células inmunes a través de la acción electrostática para activar la respuesta inmune y mejorar la actividad antitumoral (X. Wang & Zhang, 2009). En un segundo estudio se desnaturalizó la estructura tridimensional de triple hélice del lentinan en cadenas individuales utilizando dimetilsulfóxido o NaOH y observaron que, al agregar nanopartículas de Se (SeNPs), el lentinan desnaturalizado que posee una menor actividad antitumoral interacciona con ellas mediante una interacción Se-O-H, se reconstituye en un estado de triple hélice y envuelve las nanopartículas de Se formando un nanocompuesto estable (Se/s-LNT). Este Se/s- LNT puede promover la producción de ROS en las células tumorales HeLa y causar apoptosis de células tumorales, inhibiendo así la proliferación de células tumorales. También se observó que cuanto más pequeñas sean las nanopartículas de Se utilizadas, mejor será el efecto antitumoral ejercido por el nanocompuesto estable Se/s-LNT (Jia et al., 2015). En un tercer estudio, se comprobó qué pasaba con el curdlan, un β-glucano bacteriano con estructura tridimensional de ovillo aleatorio que no tiene actividad antitumoral cuando se modifica estructuralmente y se observó que una modificación sulfatante otorgaba al curdlan un poder antitumoral pudiendo inhibir la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en las células H9. Esta modificación sulfatante provocaba que la estructura tridimensional del curdlan sulfatado cambiara a triple hélice (Q. Wang et al., 2017). 5.7. Relación entre β-glucanos fúngicos y cognición El estudio de la relación existente entre el consumo de β-glucanos fúngicos y la mejora de la cognición ha ido en aumento durante los últimos años. Un estudio transversal reciente ha demostrado que el consumo de hongos había reducido la tasa de incidencia de deterioro cognitivo leve en individuos de edad avanzada en Singapur (Pan et al., 2021). En animales de laboratorio, la cognición o el aprendizaje y la memoria se evalúan mediante pruebas de conducta específicas dirigidas a la memoria espacial (de trabajo) y no espacial (de reconocimiento) (Gareau, 2014). 17 En un estudio realizado para comprobar la relación entre diferentes tipos de β-glucanos y la mejora de la cognición se han realizado pruebas de comportamiento a ratones con una dieta suplementada con lentinan (grupo M-BG), β-glucano de salvado de avena (grupo O-BG) y curdlan (grupo C-BG) durante 15 semanas. En la prueba de reconocimiento de nuevo objeto, se elevó el índice de discriminación en el grupo con suplementos de β-glucanos fúngicos en comparación con los ratones de los otros grupos experimentales. En la prueba del laberinto en Y, no hubo diferencia en la proporción de la alteración espontánea entre los grupos experimentales; esto sugiere que los βglucanos afectan a la memoria de reconocimiento, pero no a la memoria espacial a corto plazo. La plasticidad sináptica se considera uno de los principales mecanismos celulares para la cognición, incluido el rendimiento de la memoria. Las sinapsis deben experimentar algunos cambios para que la plasticidad sináptica pueda ocurrir. En la mejora de la cognición se busca una potenciación de la sinapsis por lo que se debe analizar si los β-glucanos son capaces de potenciar la sinapsis. Para ello, se ha estudiado cómo afectan estos compuestos a las proteínas que modulan la plasticidad y la ultraestructura sinápticas (factor neurotrófico derivado del cerebro [BDNF] y proteína postsináptica PSD95). Los resultados mostraron que los β-glucanos fúngicos son los que provocan un mayor aumento del nivel de BDNF en la corteza prefrontal. Además, las imágenes de microscopía electrónica de trasmisión (ver Figura 6) muestran que los β-glucanos fúngicos son los que indujeron un mayor grosor de la proteína postsináptica PSD95 lo que conlleva un reforzamiento de la sinapsis (Hu et al., 2022). Figura 6.- Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de la ultraestructura sináptica en la corteza prefrontal de los 4 grupos experimentales. Imagen modificada de Hu et al., 2022. La microglía, como célula inmune innata del sistema nervioso central, desempeña un papel importante en la regulación de la poda y remodelación sináptica por lo que afecta a los comportamientos cognitivos. En el hipocampo y corteza prefrontal, los β-glucanos 18 fúngicos provocan una reducción significativa de la microglía activa. El análisis de correlación de Pearson muestra que el número de células de microglía activa en el hipocampo y en la corteza prefrontal se correlacionaron negativamente con el índice de discriminación en la prueba de memoria de orden temporal. Por tanto, los β-glucanos fúngicos mejoran la memoria de reconocimiento inhibiendo la activación de la microglía. Esto se consigue mediante una disminución de los niveles de la proteína del complemento C3 y citoquinas proinflamatorias como IL-6 e IL-1β en el hipocampo (ver Figura 7). También se realizó varias tinciones inmunohistoquímicas del colon de los ratones tratados con los suplementos de β-glucanos utilizando el marcador CD206 para ver la cantidad de macrófagos M2 antinflamatorios los cuales son los encargados de liberar las citoquinas antiinflamatorias (IL-10) a la circulación sistémica. Los resultados mostraron un aumento de estos en el colon y una disminución de las citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α (ver Figura 8) lo que sugiere que este fenómeno puede estar asociado con el estado de la microglía en el hipocampo a través del eje intestinocerebro (Hu et al., 2022). Figura 7.- Representación gráfica del nivel de expresión del ARNm de la proteína C3 (G) y del nivel de expresión relativo del ARNm de IL-6, IL-1β, TNF-α e IL-10 (H). Imagen modificada de Hu et al., 2022. Figura 8.- A la izquierda se observan dos tinciones inmunohistoquímicas con el marcador CD206. A la derecha se observan tres gráficas que representan el nivel de expresión del ARNm de IL-10 (C), IL-6 (D) y TNF-α (E). Imagen modificada de Hu et al., 2022. 19 En el estudio anterior, se realizaron todos los experimentos con ratones sanos por lo que se puede confirmar que los β-glucanos fúngicos pueden mejorar la cognición desde un estado fisiológico. Para comprobar si estos son capaces de mejorar la cognición en ratones donde esta se ha visto disminuida, anteriormente, por factores externos, se han realizado otros estudios donde se han utilizado dietas altas en grasa y parásitos del sistema nervioso central. En un estudio se ha utilizado Toxoplasma gondii (T. gondii) el cual es un parásito protozoario invasivo del sistema nervioso central (SNC). Al infectar a su huésped, T. gondii se transforma en la etapa replicativa, se propaga por todo el cuerpo y luego se convierte rápidamente en la etapa quiescente que forma quistes en los tejidos del huésped, con una acumulación particularmente alta de quistes en las neuronas del SNC, estableciendo una infección crónica de por vida. Los ratones que sufren de toxoplasmosis muestran signos de enfermedad de Alzheimer (EA) debido a la alta densidad de quistes, neuroinflamación y degeneración neuronal en la corteza prefrontal. En el estudio se utilizan ratones infectados con la cepa Wh6 (una cepa de T. gondii de baja virulencia en China) para inducir un deterioro en la memoria no espacial y evaluar los efectos neuroprotectores del lentinan en este modelo. Los ratones se dividieron en cuatro grupos al azar: ratones que recibieron la solución salina tampón fosfato (PBS) por sonda oral, como grupo de control vehicular (grupo NC), ratones inyectados por vía intraperitoneal con solución de lentinan 2 semanas antes de la sonda nasogástrica de PBS (grupo NB), ratones infectados con la cepa Wh6 de T. gondii por sonda oral (grupo TG) y ratones inyectados con solución de lentinan intraperitonealmente 2 semanas antes de la infección por T. gondii (grupo TGB). Los efectos del lentinan en las funciones cognitivas relacionadas con la corteza prefrontal se evaluaron mediante pruebas de comportamiento incluido el laberinto en Y y el test de reconocimiento de nuevo objeto. Además, se utilizó microscopía electrónica de transmisión para caracterizar la ultraestructura sináptica, la tinción de Golgi-Cox para caracterizar las dendritas e inmunofluorescencia para observar neuroinflamación en la corteza prefrontal de los ratones. En los resultados se obtuvo que los déficits conductuales observados en la prueba de reconocimiento de nuevo objeto producidos por la infección con T. gondii Wh6 se pueden prevenir mediante el tratamiento con lentinan. También se observó una disminución significativa en la longitud total de neuritas por célula y en el número de ramas de neuritas después de la infección por T. gondii Wh6, mientras que la inyección de lentinan revirtió estos cambio; el lentinan fue capaz de prevenir la degeneración de neuritas y la disminución de la complejidad 20 neuronal en la corteza prefrontal inducida por la infección por T. gondii Wh6 (ver Figura 9) (Cui et al., 2023). Figura 9.- Imágenes representativas de neuronas piramidales de la corteza prefrontal de los 4 grupos experimentales. Imagen modificada de Cui et al., 2023. La ultraestructura y la plasticidad sináptica están fuertemente asociadas con la memoria no espacial. La infección por T. gondii Wh6 redujo el grosor de la proteína de densidad postsináptica, acortó la longitud de la zona activa, disminuyó la curvatura sináptica y aumentó el ancho de la hendidura sináptica. Estos cambios patogénicos en la sinapsis se atenuaron después de la administración de lentinan; los ratones que habían recibido los suplementos de lentinan exhibieron una proteína de densidad postsináptica más gruesa, zonas activas más largas, mayor curvatura sináptica y una reducción de la hendidura sináptica. Estos resultados sugieren que el lentinan podría mejorar la ultraestructura y la plasticidad sinápticas de la corteza prefrontal previniendo, así, el deterioro cognitivo asociado a la corteza prefrontal causado por la infección por T. gondii Wh6. Además, se observó que el lentinan suprimió la activación de la microglía y de astrocitos y restringió la expresión de citoquinas proinflamatorias en la corteza prefrontal de los ratones infectados con T. gondii Wh6 (Cui et al., 2023). En los ratones alimentados con una dieta alta en grasas (High Fat: HF) a largo plazo se observa un aumento en la permeabilidad intestinal que permite la translocación de bacterias o lipopolisacáridos bacterianos a la circulación sanguínea induciendo inflamación sistémica. Además, la alteración de la microbiota intestinal induce la 21 síntesis de citoquinas que pueden infiltrarse en el cerebro a través de la barrera hematoencefálica y actuar sobre la microglía provocando su activación para inducir la producción local de citoquinas proinflamatorias, lo que desencadena neuroinflamación y pérdida sináptica causando deterioro cognitivo (Shi et al., 2020). En un estudio se diseñaron dos experimentos con suplementos de lentinan para examinar los efectos agudos a corto plazo sobre la microbiota intestinal y los efectos crónicos a largo plazo sobre la cognición y el eje intestino-cerebro que este podría ejercer en ratones alimentados con una dieta HF. Los grupos experimentales utilizados fueron: grupo control con dieta control (grupo LC), grupo experimental con dieta alta en grasas (grupo HF) y grupo experimental con dieta HF más suplementos de lentinan (grupo HFL). Para el experimento a corto plazo, los ratones recibieron las dietas durante siete días y para el experimento a largo plazo, recibieron las dietas durante quince semanas. Los resultados del experimento a corto plazo indican que la suplementación con el lentinan atenúa la disbiosis microbiana con respecto a la diversidad y composición que aparece en la etapa temprana de la alimentación con HF, antes de la aparición de un aumento de peso significativo y obesidad. Además, se observó una composición similar de la microbiota intestinal después de la suplementación a largo plazo del lentinan. En el experimento a largo plazo, se evaluaron los efectos de la suplementación dietética del lentinan mediante la realización de pruebas de comportamiento, midiendo neuroinflamación y observando la ultraestructura sináptica y la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en la corteza prefrontal y el hipocampo. Además, también se evaluaron los parámetros intestinales, incluido el grosor del moco producido en el colon y la expresión de proteínas que participan en las uniones estrechas del epitelio intestinal, así como el nivel de endotoxinas séricas. Los resultados mostraron que la suplementación a largo plazo del lentinan mejoró la cognición (ver Figura 10), mantuvo la integridad del epitelio intestinal del colon, alivió la inflamación, la microgliosis y la neuroinflamación en los ratones alimentados con la dieta HF. Demostrando, así, que la suplementación crónica del lentinan previno los déficits cognitivos inducidos por la dieta HF mediante el eje intestino-cerebro (Pan et al., 2021). Estos dos últimos estudios confirman que los βglucanos fúngicos también son capaces de mejorar la cognición que se ha visto disminuida, previamente, por factores externos en ratones. 22 Figura 10.- Representación gráfica del índice de discriminación en la prueba de memoria de orden temporal (a), índice de discriminación en la prueba de reconocimiento de nuevo objeto (b) y proporción de alternancias correctas en la prueba del laberinto en Y. Imagen obtenida de Pan et al., 2021. 5.8. Relación entre microbiota y salud cerebral Los resultados de los últimos estudios realizados sobre la relación entre la microbiota y el eje intestino-cerebro sugieren que, probablemente, la microbiota y sus metabolitos estén involucrados en la modulación de comportamientos y procesos cerebrales, incluida la capacidad de respuesta al estrés, el comportamiento emocional, la modulación del dolor y la bioquímica cerebral. Los diferentes enfoques experimentales utilizados para estudiar cómo modula la microbiota el eje intestino-cerebro son la manipulación de la microbiota intestinal con antibióticos, el trasplante microbiano fecal y los animales libres de gérmenes que no poseen microbiota intestinal fisiológica (Germ Free: GF). Sin embargo, el modelo GF tiene varias limitaciones ya que los animales GF nacen en condiciones asépticas debido a la extracción de la madre por cesárea y la transferencia inmediata del recién nacido a un aislador, donde se esteriliza todo el aire, los alimentos y el agua entrantes. No obstante, el ambiente intrauterino no es estéril y los metabolitos microbianos liberados por el microbioma intestinal materno pueden tener una influencia en el desarrollo del cerebro fetal. Además, los ratones GF son más delgados que los animales control, a pesar de consumir más calorías. Esto se debe a que los ratones GF no cuentan con los AGCC generados por la microbiota intestinal. Los cambios metabólicos consecuentes de la pérdida de una fuente importante de calorías para el organismo en desarrollo pueden afectar al desarrollo del cerebro y alterar la actividad de los circuitos cerebrales involucrados en el comportamiento alimentario y el metabolismo. Esto hace que exista una amplia gama de diferencias entre animales GF y animales control en la bioquímica del cerebro y del intestino, en las respuestas del eje hipotalámico-hipofisario-suprarrenal (HPA), en al ámbito afectivo-social, en el comportamiento alimentario y en el metabolismo (Mayer et al., 2015). 23 La falta de microbiota intestinal fisiológica en ratones GF conduce a una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE). Esta anomalía se debe a la reducción de la expresión de las proteínas de las uniones estrechas (ocludina y claudina- 5) que son las responsables de mantener la integridad de la BHE. Los ratones GF adultos, cuando se exponen a la microbiota de ratones libres de patógenos (Pathogen Free: PF), presentan un aumento del nivel de las proteínas de las uniones estrechas y una disminución de la permeabilidad de la BHE. La transferencia de AGCC o la transferencia fecal de ratones PF a ratones GF también ayudan a preservar la integridad de la BHE (Socała et al., 2021). Estos hallazgos indican que los cambios observados en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en ratones GF provocan una entrada significantemente alterada de los metabolitos microbianos intestinales al cerebro. Por lo tanto, hay que tener en cuenta que los cambios cerebrales y de comportamiento observados en los animales GF podrían estar mediados directamente por la falta de microbiota intestinal o indirectamente a través de una o varias alteraciones no relacionadas con el cerebro (Mayer et al., 2015). El eje intestino-cerebro es una comunicación bidireccional entre el sistema nervioso central (SNC) y la microbiota. Por un lado, el sistema nervioso central (SNC) modula el tracto gastrointestinal y el sistema nervioso entérico (SNE) a través de las ramas simpática y parasimpática del sistema nervioso autónomo (SNA) y el eje hipotalámicohipofisario-suprarrenal (HPA). Las influencias del SNC pueden afectar a la microbiota intestinal, indirectamente, alterando su entorno y, directamente, a través de un gran número de moléculas de señalización. El SNA se encarga de regular la motilidad regional, la secreción de ácido, la producción de bicarbonatos y moco, el mantenimiento del líquido epitelial, la permeabilidad del intestino y la respuesta inmune de la mucosa. La modulación mediada por el SNA de la secreción de moco tiene efectos importantes sobre el tamaño y la calidad de la capa mucosa intestinal, un hábitat importante para la mayor parte de la microbiota intestinal. Además de los cambios inducidos por el SNC en el entorno intestinal, las moléculas de señalización utilizadas por el huésped para la señalización neuronal y neuroendocrina, incluidas, entre otras, catecolaminas, serotonina, dinorfina, GABA y citocinas, también pueden ser liberadas en la luz intestinal por neuronas, células inmunes y células enterocromafines lo cual está modulado por el SNC (Mayer et al., 2015). 30 Pan, W., Jiang, P., Zhao, J., Shi, H., Zhang, P., Yang, X., Biazik, J., Hu, M., Hua, H., Ge, X., Huang, X. F., & Yu, Y. (2021). β-Glucan from Lentinula edodes prevents cognitive impairments in high-fat diet-induced obese mice: involvement of colonbrain axis. Journal of Translational Medicine, 19(1). https://doi.org/10.1186/S12967-021-02724-6 Shi, H., Yu, Y., Lin, D., Zheng, P., Zhang, P., Hu, M., Wang, Q., Pan, W., Yang, X., Hu, T., Li, Q., Tang, R., Zhou, F., Zheng, K., & Huang, X. F. (2020). β-glucan attenuates cognitive impairment via the gut-brain axis in diet-induced obese mice. Microbiome, 8(1). https://doi.org/10.1186/S40168-020-00920-Y Sidhu, M., & Van Der Poorten, D. (2017). The gut microbiome. FOCUS 206 AFP, 46(4). Socała, K., Doboszewska, U., Szopa, A., Serefko, A., Włodarczyk, M., Zielińska, A., Poleszak, E., Fichna, J., & Wlaź, P. (2021). The role of microbiota-gut-brain axis in neuropsychiatric and neurological disorders. Pharmacological Research, 172, 105840. https://doi.org/10.1016/J.PHRS.2021.105840 Theuwissen, E., & Mensink, R. P. (2008). Water-soluble dietary fibers and cardiovascular disease. Physiology & Behavior, 94(2), 285–292. https://doi.org/10.1016/J.PHYSBEH.2008.01.001 Wang, Q., Sheng, X., Shi, A., Hu, H., Yang, Y., Liu, L., Fei, L., & Liu, H. (2017). β- Glucans: Relationships between Modification, Conformation and Functional Activities. 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