Fermentaciones lácticas en la industria alimentaria

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN GRADO EN FARMACIA CURSO 2022-2023 FERMENTACIONES LÁCTICAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA FRANCISCO JOSÉ TERNERO RAMÍREZ TRABAJO FIN DE GRADO DE CARÁCTER BIBLIOGRÁFICO FERMENTACIONES LÁCTICAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Francisco José Ternero Ramírez Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia- Grado en Farmacia Departamento de Microbiología y Parasitología Tutores: Dr. Antonio Ventosa Ucero y Dra. Ana Durán Viseras Sevilla, Julio de 2023 1 RESUMEN Fermentaciones lácticas en la industria alimentaria En el presente trabajo se ha realizado una revisión bibliográfica de los principales alimentos obtenidos por fermentación láctica. Concretamente, las concernientes a la producción de yogur, queso, kéfir, koumiss, mantequilla, aceitunas de mesa y kimchi. Para analizar estos alimentos se hace una recopilación introductoria de características generales y especies de los microorganismos responsables de estas fermentaciones, las bacterias ácido lácticas. Así mismo, se analizan las funciones que cumplen estas bacterias en la elaboración de estos alimentos, su historia y origen, condiciones óptimas de producción y las etapas para la producción de dichos alimentos. De igual manera se expone la idea de cómo la producción industrial y la elaboración artesana deben ir de la mano en el futuro de la producción. El uso de los cultivos iniciadores (starters) permiten la normalización del proceso industrial; sin embargo, la tradición y su no estandarización de la producción permite la innovación y el desarrollo por sus condiciones cambiantes. Palabras claves: Bacterias lácticas - Yogur - Leche - Fermentación láctica - Cultivo starter - Queso 2 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 3 1.1 DEFINICIÓN DE FERMENTACIÓN ..................................................................................... 3 1.2 TIPOS DE FERMENTACIONES ........................................................................................... 5 1.3 CONTEXTO HISTÓRICO DE LAS FERMENTACIONES .......................................................... 6 1.4 CARACTERÍSTICAS DE LA LECHE ...................................................................................... 9 2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 10 3. METODOLOGÍA ................................................................................................................... 11 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................................. 12 4.1 SITUACIÓN ACTUAL EN ESPAÑA DE LA INDUSTRIA LÁCTICA ......................................... 12 4.2 TAXONOMÍA Y HÁBITAT DE LAS BACTERIAS ACIDOLÁCTICAS ........................................ 13 4.3 BIOQUÍMICA DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS ................................................................... 15 4.4 CULTIVOS STARTERS ...................................................................................................... 16 4.4.1 sLAB ....................................................................................................................... 17 4.4.2 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LAS sLAB ................................................... 18 4.4.3 nsLAB ..................................................................................................................... 19 4.5 LECHES FERMENTADAS ................................................................................................. 20 4.5.1 YOGUR ................................................................................................................... 20 4.5.2 LECHES FERMENTADAS VARIANTES DEL YOGUR CLÁSICO ...................................... 24 4.5.3 KÉFIR ...................................................................................................................... 25 4.5.4 KOUMISS ................................................................................................................ 26 4.6 MANTEQUILLA .............................................................................................................. 27 4.7 QUESOS ........................................................................................................................ 28 4.8 ACEITUNAS DE MESA .................................................................................................... 30 4.9 KIMCHI .......................................................................................................................... 32 5. CONCLUSIONES................................................................................................................... 33 6. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 34 3 1. INTRODUCCIÓN Hoy en día vivimos en un mundo donde la humanidad se enfrenta a un gran desafío alimentario debido al incremento exponencial de la población. Según las previsiones de la ONU, para 2050 seremos 9700 millones de personas, es decir, un aumento de 1700 millones en menos de 30 años. Las previsiones para lo que queda de siglo tampoco reducirán este ritmo, para 2080 alcanzaremos la cifra de 10400 millones de seres humanos (Organización de las Naciones Unidas, 2023). Ante estas cifras, el sector alimentario tiene por delante el reto de aumentar la producción de alimentos, entre ellos unos tan básicos en todas las dietas del mundo como son los alimentos fermentados. Según Giorgio Giraffa, el consumo de alimentos fermentados ha experimentado un enorme aumento desde la década de los setenta del siglo pasado. En este grupo de alimentos se incluyen los productos lácteos, verduras, frutas y salchichas fermentadas; bebidas alcohólicas tales como la cerveza y el vino, salsas, etc. Uno de los grandes motivos que han auspiciado este aumento del consumo es la buena percepción y valoración que tienen los consumidores sobre este tipo de alimentos. Estos son percibidos como alimentos seguros, naturales, interesantes a nivel gastronómico y han sido avalados durante décadas por múltiples estudios científicos, dándoles el reconocimiento como alimentos beneficiosos para la salud humana (Giraffa, 2004). 1.1 DEFINICIÓN DE FERMENTACIÓN Inicialmente, antes de los descubrimientos de Pasteur en el siglo XIX, el término “fermentación” servía para describir aquellos procesos de descomposición de materia orgánica en los cuales se observaba la producción de gas; de ahí el origen de su raíz etimológica latina: “fervere”, que en castellano se traduce como “hervir”. Gracias a las investigaciones de Louis Pasteur sobre microorganismos, este término cambió y pasó de percibirse como un proceso químico donde se creía que la masa bacteriana fermentadora no era más que otro producto químico de la fermentación, a percibirse como un proceso de transformación de un sustrato mediado por microorganismos. Hoy en día, podríamos definir la fermentación de una manera bioquímica como “una forma de catabolismo anaerobio en el que un compuesto orgánico es a la vez donador y aceptor de electrones” (Madigan et al., 2015). La fermentación es una de las dos principales estrategias para la conservación de energía de los microorganismos junto con la respiración. La fermentación se diferencia de la respiración por ser esta última un proceso catabólico aerobio o anaerobio en el que un donador de electrones es oxidado por O2 o un sustituto del O2 como aceptor terminal de electrones, es decir, la diferencia está en el aceptor terminal de los electrones (Madigan et al., 2015). 4 El resultado de esta cadena de reacciones que llamamos fermentación son productos tales como ácidos de cadena corta, alcoholes, agua, otros carbohidratos, hidrógeno, metano, etc. La fermentación requiere la presencia de ciertos microorganismos bajo unas condiciones favorables de pH y baja tensión de oxígeno (Solomons, 2002). Además, en 2008 Suárez-Lepe e Iñigo-Leal nos da las claves del proceso fermentativo que a su vez sirven para definirlo (Suárez-Lepe e Iñigo-Leal, 2008): 1. Las fermentaciones son reacciones catalizadas por enzimas de origen microbiano. 2. Las secreciones enzimáticas de las distintas especies microbianas presentan una notable diversidad cualitativa y cuantitativa, incluso en distintas cepas, variedades o razas de una misma especie. 3. Los agentes físicos-químicos influyen notablemente en la producción y funcionalidad de las enzimas microbianas. Como conclusión a estas afirmaciones podríamos decir que el curso y el resultado del proceso fermentativo dependerá de las características del microorganismo implicado y de las condiciones ambientales bajo las cuales se realice (Suárez-Lepe e Iñigo-Leal, 2008). La importancia de este proceso para el ser humano radica en su poder para (Giraffa, 2004; Montville y Matthews, 2009):  Enriquecer el contenido en nutrientes de los alimentos mediante la biosíntesis de vitaminas, aminoácidos esenciales, proteínas o el propio ácido láctico.  Mejorar la digestibilidad de proteínas y fibras mediante su catabolismo y transformación, este hecho lleva aparejado un aumento de las calorías del producto.  Aumentar la biodisponibilidad de micronutrientes y degradación de factores antinutricionales.  Producir cualidades organolépticas propias con diferentes aromas, sabores y texturas, lo cual genera variedad y versatilidad gastronómica para la industria y para el consumidor.  Mejorar la seguridad alimentaria, lo cual se traduce en un aumento de la vida útil del producto. Algunos mecanismos que contribuyen a esta mejora son: o Reducción de compuestos tóxicos como los cianógenos. o Creación de peróxido de hidrógeno en presencia de oxígeno. Este compuesto es tóxico para otras bacterias les da una ventaja selectiva para su crecimiento sobre todo en los primeros estadios de la fermentación. o Competencia por los nutrientes con otros microorganismos patógenos. o Reducción del pH. 5 o Producción de bacteriocinas*, como la nisina producida por Lactococcus lactis (Adams et al., 2016). *Bacteriocina: son péptidos antimicrobianos sintetizados por los ribosomas con una longitud de 20-60 aminoácidos, catiónicos e hidrofóbicos, con capacidad para inhibir el deterioro de los alimentos por su actividad frente a otras bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas (Rashmi et al., 2019). 1.2 TIPOS DE FERMENTACIONES Los mejores criterios para clasificar las fermentaciones es según el sustrato que se fermenta o bien por los productos que se forman en éstas. Los microorganismos que aparecen en la Tabla 1 metabolizan la hexosa por la vía glucolítica, la diferencia para obtener diferentes productos se basa en el destino del piruvato (Madigan et al., 2015). Tabla 1. Clasificación de las fermentaciones más comunes (Madigan et al., 2015). Tipo Reacción Microorganismo Alcohólica Hexosa 2 etanol + CO2 Levaduras, Zymomonas Homoláctica Hexosa 2 lactato- + 2 H+ Streptococcus, algunos Lactobacillus Heteroláctica Hexosa lactato- + etanol + CO2 + H2O Leuconostoc, algunos Lactobacillus Ácido mixta Hexosa etanol + 2,3- butanodiol + succinato2- + lactato- + acetato- + formiato- + H2O + CO2 Enterobacterias como Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter Del ácido propiónico 3 lactato 2 propionato + acetato + CO2 Propionibacterium, Clostridium propionicum Del ácido butírico Hexosa butirato- + 2 H2 + 4 H2O + H+ Clostridium butyricum 6 1.3 CONTEXTO HISTÓRICO DE LAS FERMENTACIONES A lo largo de la historia alimentos como el pan, el vino, el yogur o el queso han sido eje central en la dieta humana. El origen del consumo de este tipo de alimentos fermentados está ampliamente ligado a la evolución de la organización social de nuestra especie. El inicio de fabricación y consumo de estos alimentos se fecha en el período neolítico, sobre el 8500 a.C. en la zona del Creciente Fértil (Gasbarrini et al., 2016), junto a la revolución que supuso la sustitución de las sociedades cazadoras-recolectoras por pueblos sedentarios. Este sedentarismo propició la aparición de la agricultura y la ganadería, obteniendo como resultado una sobreproducción de alimentos que necesitaban ser conservados. Los alimentos fermentados se obtuvieron de manera fortuita por la contaminación con bacterias o levaduras en condiciones favorables; este hecho permitió a nuestros antepasados la posibilidad de conservarlos, mejorando su seguridad y modificando sus propiedades organolépticas y su digeribilidad. El sedentarismo y el conocimiento de la fermentación de los alimentos fue expandiéndose por el Cáucaso, Egipto, Asia, Escandinavia y el Mediterráneo (Ferrari et al., 2020). Una de las primeras fermentaciones practicadas por la humanidad fue la de la leche, siendo adaptada a cada región geográfica según el origen de la leche (vaca, búfala, cabra, oveja, yak, camello, caballo, etc.), temperatura ambiental o utensilios usados (estómagos de animales, cuencos vegetales, etc.). Algunos ejemplos de leches fermentadas son el kéfir (Cáucaso), el koumiss, originaria de las estepas de Asia Central, el dahi de la India fabricado con leche de búfala o el labehn, leche fermentada árabe (Gasbarrini et al., 2016). Esta historia, sin embargo, es cierta para alimentos lácteos pero no para la fermentación alcohólica. Datos y objetos hallados en el yacimiento de “Raqefet Cave” (Israel) entre 2004 y 2011 sugieren que el primer producto fermentado que fabricaron nuestros antepasados fue la cerveza, por el pueblo natufiense que habitó la región de los actuales Israel, Líbano y Siria, hace unos 13000 años. El estudio de los gránulos de almidón encontrados en el interior de 3 morteros (Figura 1) ha permitido descubrir 3 tipos de daños en los gránulos: daño por enzimas y acciones mecánicas, daño por malteado y daño por fermentación. Figura 1. Morteros encontrados en “Raqefet Cave” (Liu et al., 2018). 7 Se encontraron hasta 6 tipos de almidones, entre ellos algunos pertenecen a plantas de la subfamilia Pooideae, tribu Triticeae, es decir, aquella a la que pertenecen plantas como el trigo (género Triticum) y la cebada (Hordeum sp.) (Liu et al., 2018). Según Ofer Bar-Yosef, arqueólogo y antropólogo israelí especialista en el Paleolítico, la cultura natufiense pudo ser la simiente del sedentarismo, motivado por la necesidad, entre otras cosas, de obtener trigo y cebada para fabricar la cerveza, puesto que tenía un carácter sacro en su cultura (Bar-Yosef, 1998). Varios milenios después, encontramos la primera evidencia pictórica de los alimentos fermentados en una tablilla de arcilla sumeria del 4000 a.C., donde un ganadero escribió sus ganancias por la fabricación y venta de leche, mantequilla y quesos. Actualmente se encuentra en el “Vorderasiatisches Museum” de Berlín (Gasbarrini et al., 2016). Existen representaciones de productos lácteos fermentados y del ensilaje del trigo en jeroglíficos egipcios (Woodford, 1985), evidencias del uso milenario de la leche de yak fermentada en el Tíbet para conservarla durante largas caminatas (Guo et al., 2014), textos ayurvédicos sobre el uso leches fermentadas y su efecto beneficioso en la salud o en la cultura helénica donde Homero narra en la Odisea como el cíclope Polifemo fabricaba queso en su cueva con la leche de ovejas (Ferrari et al., 2020). En el sudeste asiático fue donde tuvo comienzo la fermentación de los vegetales en el siglo III a.C., obteniéndose así el kimchi coreano (fabricado con repollo chino, Brassica rapa pekinensis) (Patra et al., 2016) o el zha cai (Brassica juncea, mostaza china) (Chao et al., 2009). Otro de los grandes protagonistas de los alimentos fermentados de la dieta de nuestros antepasados es el yogur. Su origen lo podemos encontrar en los pueblos de la Anatolia (actual Turquía) y los Balcanes donde los pastores transportaban la leche en bolsas hechas con el estómago de rumiantes (vacas, ovejas, cabras), camellos o caballos. Esta leche entraba en contacto con las bacterias lácticas, probablemente ancestros de Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Este nuevo producto, al contrario que la leche, era no perecedero y permitía su almacenamiento durante mayor tiempo (Gasbarrini et al., 2016). Figura 2. Imagen al microscopio electrónico de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (JGI Genome Portal, 2023). 14 *El género Bifidobacterium se ha considerado históricamente una bacteria acidoláctica debido a que originalmente fue clasificado dentro del género Lactobacillus pero no está relacionado filogenéticamente con éstas y bioquímicamente presenta diferencias sustanciales en el metabolismo de los carbohidratos (Giraffa, 2004). Las LABs son un grupo bastante heterogéneo donde las bases de la filogenia fueron establecidas en primer lugar por Felix Löhnis en 1907 y posteriormente por Orla-Jensen (1919) en su obra: “The lactic acid bacteria”. En esta obra las LABs se agruparon en 7 géneros diferentes: Streptococcus, Tetracoccus, Thermobacterium, Streptobacterium, Betabacterium, Microbacterium y Betacoccus (Orla-Jensen, 1919). Esta clasificación taxonómica se basa exclusivamente en características fenotípicas, y de hecho hoy día se sigue teniendo como punto de partida para la identificación de este tipo de bacterias (Stiles y Holzapfel, 1997). En relación con su hábitat las LABs presentan una distribución ubicua, las podemos encontrar en suelos, tractos gastrointestinales, vegetales y otros alimentos. Existe un amplio rango de condiciones medioambientales donde pueden desarrollarse tanto de temperatura, Leuconostoc sp. puede desarrollarse a temperaturas por debajo de 4 °C (Björkroth et al., 2014) mientras algunas especies de Lactobacillus sobreviven a 50 °C (Pot et al., 2014); como de pH, siendo en su mayoría acidófilas como Lactobacillus (rango de pH entre 3-8) (Axelsson, 2004), aunque existen especies mesófilas como Lactococcus (Kim, 2014). Esta adaptabilidad les proporciona gran interés industrial debido a que les permite habitar y fermentar diferentes materias primas. De igual manera existen algunas especies de LABs patógenas tanto de animales como humanas, de los géneros Streptococcus, Lactococcus, Carnobacterium o Enterococcus (Vinderola et al, 2019). La Tabla 3 resume algunas de las principales características que se usan para su identificación fenotípica. Tabla 3. Características de las principales familias y géneros de LABs (Vinderola et al., 2019). Familia Género Morfología Tipo de ácido láctico Crecimiento a pH 4,4 Crecimiento a pH 9,6 Aerococcaceae Aerococcus Cocos (tétradas) L - + Carnobacteriaceae Carnobacterium Bacilos L ND - 15 Enterococcaceae Enterococcus Cocos L + + Tetragenococcus Cocos L Variable + Vagococcus Cocos L ND - Lactobacillaceae Lactobacillus Bacilos D,L,DL Variable - Pediococcus Cocos L,DL + - Leuconostocaecae Leuconostoc Cocos D Variable - Fructobacillus Bacilos D ND ND Oenococcus Cocos D Variable - Weisella Cocos/bacilo s D,DL Variable - Streptococcaecae Lactococcus Cocos L Variable - Streptococcus Cocos L - - *ND: No determinado. 4.3 BIOQUÍMICA DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS Las bacterias lácticas se clasifican metabólicamente en dos grandes grupos según su metabolismo de la glucosa: homofermentativas y heterofermentativas (Madigan et al., 2015). Las homofermentativas tienen como único producto de la glucólisis el ácido láctico (Figura 5), mientras que las heterofermentativas además de lactato generan otros productos, principalmente etanol y CO2 (Figura 6). Esta diferencia se debe a la presencia o deficiencia de la enzima aldolasa. Las bacterias que poseen aldolasa, las homofermentadoras, producen dos moléculas de lactato por molécula de glucosa; mientras las heterofermentadoras solo son capaces de producir una molécula de lactato ya que la deficiencia de aldolasa impide romper la fructosa-1,6-bifosfato en una molécula de dihidroxiacetona fosfato y una de gliceraldehído-3- fosfato. Por ello, el metabolismo de las heterofermentativas consiste en la oxidación de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconato, después lo descarboxilan a ribulosa-6-fosfato. La ribulosa- 6-fosfato es convertida a gliceraldehído-3-fosfato y fosfato de acetilo mediante la enzima fosfocetalasa (Figura 6). El gliceraldehído-3-fosfato prosigue la vía glucolítica normal, obteniendo como resultado una molécula de lactato. Por otro lado, a partir del fosfato de acetilo que funciona como aceptor de electrones en una reacción rédox con una molécula NADH, obtenemos una molécula de etanol (Madigan et al., 2015). 16 Figura 5. Vía glucolítica en bacterias homofermentativas (Madigan et al., 2015). Ruta de Entner-Doudoroff La ruta de Entner-Doudoroff (Figura 6) es una variante de la ruta glucolítica y está ampliamente extendida entre las bacterias, siendo su principal exponente el grupo de las pseudomónadas. En esta ruta obtenemos piruvato, gliceraldehído-3-fosfato que termina en lactato y una sola molécula de ATP por cada molécula de glucosa. Figura 6. Vía glucolítica en bacterias heterofermentativas (Madigan et al. 2015). 4.4 CULTIVOS STARTERS La fermentación láctica espontánea es un proceso microbiológico muy complejo en el que normalmente una población muy pequeña de bacterias del ácido láctico llega a convertirse en la microbiota predominante (Daeschel et al., 1987). El control industrial de los procesos de fermentación requiere un conocimiento actualizado de la fisiología, metabolismo y propiedades genéticas de estas LABs. Igualmente debemos conocer el impacto de éstas en la calidad, 17 seguridad y vida útil de los alimentos (Giraffa, 2004). Estas bacterias lácticas pueden clasificarse según su función dentro del proceso fermentativo en bacterias acidolácticas “starters” (sLAB) o bacterias acidolácticas “non-starter” (nsLAB). 4.4.1 sLAB Un cultivo iniciador (“starter”) no es más que un cultivo de microorganismos vivos que se utiliza al inicio del proceso fermentativo produciendo cambios en la composición química y en las propiedades sensoriales del producto alimenticio por fermentación de sus azúcares; principalmente son los encargados de la brusca bajada de pH. Los cultivos starters, si hablamos de la producción de lácteos, se añaden tras la pasteurización la cual mata la mayor parte de las LABs naturales presentes en la leche cruda. Gracias a la pasteurización los cultivos starters no tienen gran competencia permitiendo obtener rápidamente una alta cantidad de biomasa (Montville y Matthews, 2009). Entre las ventajas del uso de los cultivos starters encontramos (Montville y Matthews, 2009):  Rápida producción de ácido: la acidez afecta profundamente al control de humedad, pérdida de minerales, retención, hidratación e interacciones proteicas.  Disminución de las tasas de contaminación.  Producción de compuestos aromáticos.  Productos más consistentes.  Mayor predictibilidad del proceso.  Control de la velocidad y extensión de la producción de ácido en el alimento. Dentro de ese cultivo starter podemos diferenciar una especie que es la principal productora de ácido láctico y que representa el 80-90% del cultivo starter y una microbiota secundaria starter que representa el 10-20% de la proporción del starter. Esta microbiota secundaria, normalmente son bacterias con metabolismo heterofermentativo y hongos, que aporta sabores, aromas y texturas permitiendo obtener una gran diversidad de productos (Montville y Matthews, 2009). Tabla 4. Principales cultivos starters y microbiota secundaria usados en la fabricación de productos lácteos (Montville y Matthews, 2009). Producto Productor de ácido Microbiota secundaria Yogur Streptococcus thermophilus + Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ninguna 18 Suero de Mantequilla Lactococcus lactis subsp. cremoris o lactis Leuconostoc spp.* Kéfir Lactobacillus kefiri Saccharomyces cerevisae Candida kéfir Quesos Gouda, Edam, Havarti Lactococcus lactis subsp. cremoris o lactis Leuconostoc spp., Lactococcus lactis subsp. lactis Queso Camembert Lactococcus lactis subsp. cremoris o lactis Penicillium camemberti Queso Azul Lactococcus lactis subsp. cremoris o lactis L. lactis subsp. lactis Penicillium roqueforti *La acción de Leuconostoc tanto en el suero de mantequilla como en los quesos es la producción de compuestos aromáticos y CO2 debido al metabolismo del ácido cítrico. 4.4.2 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LAS sLAB En la preparación y elección de un medio que cubra los requerimientos nutricionales para los cultivos starters no solo se tiene como objetivo la obtención de un alto rendimiento de biomasa sino también se tiene en cuenta la influencia del medio sobre la funcionalidad tecnológica (actividad acidificante, producción de aromas, supervivencia a los distintos pasos de producción) y los beneficios para la salud. Los requerimientos nutricionales generales y sus fuentes son (Vinderola et al., 2019): - Carbohidratos: glucosa o lactosa provenientes de la leche, trigo, mosto de la uva, vegetales, frutas, etc. - Aminoácidos y peptonas: generalmente son añadidos a través de peptonas, extractos de levaduras o proteínas lácticas. - Ácidos grasos: Tween y acetato. - Nucleósidos y nucleótidos: extractos de levaduras. - Minerales: añadidos en forma de sales (fosfatos, magnesio o manganeso). - Vitaminas: extractos de levaduras, extracto de carne o caldo peptona. - Citrato: bien purificado o de las propias materias primas a fermentar. Por ejemplo el crecimiento de Lactococcus en un medio rico en citrato produce un mayor contenido de diacetilo en leches fermentadas. 19 Un ejemplo del peso que puede tener la elección de estos medios iniciales los recoge Carvalho en un estudio en el cual analizó células liofilizadas de la especie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cultivadas en diferentes medios. Un medio se componía de glucosa al 2% y el otro medio contenía 1% glucosa + 1% sacarosa. El medio de 2% glucosa demostró tasas de supervivencia mayores tras 10 meses de almacenamiento (Carvalho et al., 2004). Otro ejemplo de la importancia de esta elección la encontramos en un estudio con Bifidobacterium longum. Esta bacteria en presencia de lactosa crea más SPE (Sustancias Poliméricas Extracelulares) en comparación al uso de glucosa o galactosa como fuente de energía principal (Audy et al., 2010). Estas SPE aumentan la viscosidad de las leches fermentadas, lo cual es deseable en este tipo de productos; por ello se intenta potenciar esta producción a través de la elección del starter (Ruas-Madiedo et al., 2006). 4.4.3 nsLAB Por otro lado, tenemos a las nsLAB que son “microorganismos vivos que se originan como microbiota espontánea/autóctona en los entornos de producción y procesamiento de los alimentos fermentados” (Blaya et al., 2018). La mayoría de las nsLAB son anaerobias facultativas tolerantes a la sal y al ácido y son capaces de equilibrar parte de la biodiversidad perdida por la pasteurización (Brizuela et al., 2019). Su fuente principal es la propia leche cruda, siendo algunos de ellos incluso resistentes a tratamientos térmicos (De Angelis y Gobetti, 2011); otro posible origen son los utensilios y maquinaria usados durante la elaboración industrial (Brizuela et al., 2019). Tradicionalmente en los alimentos fermentados no se controla este tipo de poblaciones, lo cual crea un reservorio de microorganismos que es fuente de aromas, texturas y propiedades diferentes del resultado esperado por el cultivo starter (Muruzović et al., 2018). Por tanto, la fabricación artesanal de estos productos provee de una buena fuente de nuevas nsLAB que permiten la modernización y optimización a la industria a gran escala. Las nsLAB son clave en la maduración de los quesos aportando versatilidad y variedad. Algunas de las especies ampliamente distribuidas en los quesos son Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei y Lactobacillus rhamnosus. En la elaboración de quesos la cinética de crecimiento de las nsLAB durante la fermentación difiere de la de las sLAB puesto que el número de sLAB va decayendo una vez terminado el proceso fermentativo principal de la leche, mientras que el número de nsLAB aumenta con el paso del tiempo durante el proceso de maduración (Gobetti et al., 2015). 20 También cabe destacar su papel en el sector sanitario por la capacidad de muchas de estas nsLAB de servir como probióticos y que hoy en día son objeto de nuevas investigaciones. 4.5 LECHES FERMENTADAS La leche fermentada según el Codex Alimentarius (Organización Mundial de la Salud y Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, 2011) es: “Un producto lácteo obtenido por medio de la fermentación de la leche, que puede haber sido elaborado a partir de productos obtenidos de la leche con o sin modificaciones en la composición según ciertas limitaciones, por medio de la acción de microorganismos adecuados y teniendo como resultado la reducción del pH con o sin coagulación. Estos cultivos de microorganismos serán viables, activos y abundantes en el producto hasta la fecha de duración mínima. Si el producto es tratado térmicamente después de la fermentación no se aplicará el requisito de la viabilidad”. Las principales leches fermentadas son el yogur, leches fermentadas obtenidas a base de cultivos alternativos, la leche acidófila, el kéfir y el koumiss. Además de estas leches fermentadas, en el Codex Alimentarius encontramos otras variaciones como: - Leche fermentada concentrada: leche fermentada en la cual las proteínas de la leche han sido aumentadas antes de la fermentación a un mínimo del 5,6%. Algunos de los productos son el stragisto, el labneh (origen árabe) o el ymer (origen escandinavo). - Leche fermentada aromatizada: son leches fermentadas que contienen un máximo de 50% (p/p) de ingredientes no lácteos como purés, cereales, miel, frutas, verduras, café, etc. Estos ingredientes se pueden añadir tanto antes como después de la fermentación. - Bebidas a base de leche fermentada: Constan de un mínimo de 40% (p/p) de leche fermentada a la que se le añade agua potable, puede además contener otros ingredientes como suero, ingredientes no lácteos y aromatizantes. 4.5.1 YOGUR El término yogur viene del turco “jugurt”, de donde es originario este producto. Es el principal producto lácteo, estando ampliamente distribuido a nivel mundial por su calidad nutricional, así como por sus propiedades beneficiosas para la salud y sensoriales (Adams et al, 2016). Según el Codex Alimentarius el yogur debe contener solo y exclusivamente dos especies de LABs específicas: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Figura 2) y Streptococcus thermophilus 21 (Figura 7), teniendo al menos una cantidad de 107 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por gramo vivas de cada una de las especies al final de su vida útil. Entre ambas especies se establece una relación simbiótica: por un lado, S. thermophilus tiene una rápida capacidad de acidificar el medio, produce CO2 y formiato, lo cual aumenta el crecimiento del lactobacilo; mientras Lactobacillus hidroliza las proteínas de la leche, liberando aminoácidos y péptidos que aumentan el crecimiento de S. thermophilus (Sieuwerts et al., 2008). El principal producto de la fermentación de la leche por parte de ambas bacterias es el ácido láctico, el cual se genera a partir de los azúcares de la leche, principalmente lactosa. La producción de este ácido provoca una disminución de pH (< 5), ocasionando el colapso de las micelas de caseína (principal proteína de la leche). Las caseínas constituyen un grupo heterogéneo de fosfoproteínas y cada tipo de caseína tiene unas propiedades fisicoquímicas diferentes. Son proteínas anfipáticas de tal manera que se disponen en la leche formando una estructura denominada micela. Su estructura es aún objeto de estudio, pero según el modelo de Walstra (1990), las micelas están formadas por submicelas unidas entre sí. La posición de las submicelas dentro de la micela depende del contenido de κ-caseína. La κ-caseína tiene residuos hidrofílicos por lo cual cuanto mayor proporción de κ-caseína más cercana a la interfase con el agua, y bajo contenido en κ-caseína implicará que forma parte del núcleo hidrófobo. Las micelas además contienen otros tipos de caseína como las caseínas αs1 y αs2 que se unen a otras caseínas mediante sus regiones hidrofóbicas e hidrofílicas o la β-caseína que se une a otras proteínas por sus grupos hidrofóbicos. En este modelo se propone que las moléculas de fosfato cálcico coloidal, formadas por los residuos de fosfoserina de las caseínas y el calcio de la leche, se encuentran en el interior de las submicelas y que las submicelas se mantienen unidas mediante interacciones hidrofóbicas (Padila-Doval y Zambrano-Arteaga, 2021). Sea como fuere, el descenso de pH tiene dos efectos sobre la micela: uno es la rotura de los enlaces entre los grupos fosfato y el calcio al reducirse la ionización de los fosfatos; y el otro efecto es la disminución de las repulsiones intramicelares por la protonación de residuos aminoacídicos debido a la bajada del pH hasta el punto isoeléctrico de la caseína. Esta rotura de las micelas produce una agregación de proteínas dándole al yogur textura semisólida (Vinderola et al., 2019). Figura 7. Imagen al microscopio electrónico de S. thermophilus (JGI Genome Portal, 2023). Figura 8. Modelo de Walstra (Padila- Doval y Zambrano-Arteaga, 2021). 22 A continuación se expone un esquema general de la producción de yogur: Figura 9. Esquema general de la producción de yogur. Modificado de Adams et al., 2016 y Vinderola et al., 2019. En el paso 1 de la Figura 9 el análisis y evaluación de la leche está justificado debido a que la leche es un excelente medio de cultivo por su moderado pH (6,4 - 6,6), su alta actividad del agua (aw) y su gran variedad de nutrientes. Aunque la ubre de la vaca tiene mecanismos para evitar la contaminación, es normal que la leche extraída de una vaca sana contenga 102 - 103 UFC/ml de microorganismos vivos, tales como micrococos, estreptococos o el dipteroide Corynebacterium bovis. Si la población de microorganismos supera estos límites puede causar mastitis. La mastitis es una enfermedad de las ubres causada por Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae o Corynebacterium pyogenes, entre muchas otras. Esta enfermedad no solo supone una pérdida económica sino también un riesgo para la salud pública, por ello en países desarrollados la leche es rápidamente enfriada al salir de la ubre 2. Preparación de la leche: estandarización y homogenización de la leche al contenido de grasa deseado. 3. Tratamiento con calor: 85 °C / 20-30’ o 90-95°C durante 5’. 4. Enfriamiento a la temperatura de cultivo: 44°C. 5. Inoculación del cultivo starter previamente preparado: L. delbrueckii subsp. bulgaricus y S. thermophilus a partes iguales. 6. Incubación: Durante 4-5 horas a 44°C hasta que el pH se encuentre en 4,6 – 4,7. 1. Recepción de la materia prima: Análisis y evaluación de la leche. 7. Enfriamiento y adicción de aromas o saborizantes. 8. Almacenaje a 4 °C. 23 y se almacena a 7 °C hasta su procesamiento, pasando posteriormente estrictos controles higiénicos sanitarios (Adams et al., 2016). La estandarización de la leche consiste en disolver todos los ingredientes: azúcar, saborizantes, estabilizantes, edulcorantes, etc., a una temperatura de 60 °C mientras se mezcla con la leche. Posteriormente, se procede a la homogenización cuyo objetivo es reducir el diámetro de los glóbulos de grasa de la leche evitando la separación en fases y el enranciamiento. La mezcla se calienta a unos 65-70 °C, a una presión controlada de unos 10-20 MPa y se usa un homogeneizador de dos etapas (la primera de alta presión y la segunda a baja presión). Lo siguiente es el tratamiento térmico el cual sirve para eliminar los microorganismos patógenos y desnaturalizar las proteínas del suero. Durante la etapa 4 se introduce la mezcla rápidamente en un baño de agua más fría a la temperatura de cultivo, 44 °C. Esta temperatura es una temperatura de equilibrio entre la temperatura óptima de crecimiento de S. thermophilus y L. delbrueckii. Para el paso 5 debemos previamente haber preparado el cultivo starter; para ello necesitaremos cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y S. thermophilus liofilizadas, medio SMY (Skim Milk Yeast Extract) que se compone de 10% de leche desnatada y 0,1% de extracto de levadura y medio SM (Skim Milk) con 10% de leche desnatada previamente pasteurizada. Los medios deben estar previamente esterilizados en autoclave a 121 °C durante 7 minutos. La preparación del starter comienza reconstituyendo el liofilizado y sembrando las bacterias de forma independiente en medio SMY, seguido de cultivo durante 16-20 horas a 37 °C, al menos 3 veces. Después, se inocula un 1% de cada cultivo a otro medio SMY y se cultiva de nuevo a 37 °C 16-20 horas, este es llamado “cultivo madre”. Un 1% de cada cultivo madre se inocula en un mismo medio SM. Se cultiva a 37 °C hasta que la acidez titulable sea del 0,8% (pH aprox. 4,6). Por último, se procede al enfriamiento del cultivo en un baño de agua fría y se mantiene refrigerado hasta su uso. Para su uso en la producción de yogur agregaríamos un 2-4% de cultivo starter previamente calentado a la temperatura de fermentación y se mezcla el conjunto (Nagaoka, 2019). La etapa 6 es la fermentación, la temperatura es de 44 °C aunque puede variar entre los 40-44 °C según el autor. La fermentación dura hasta que la acidez titulable alcance el 0,8%, que corresponde a un pH aproximado de 4,6. Esta titulación se mide de acuerdo a los estándares de la IDF (“International Dairy Federation”). El principal método usado en la titulación es la valoración con una disolución de hidróxido de sodio 0,1 mol/L y una disolución de fenolftaleína en etanol como indicador. Alcanzada la acidez deseada, la leche ya fermentada es rápidamente llevada a un refrigerador a una temperatura menor de 15 °C. En ese momento se añaden 30 * El cuajo puede ser de origen vegetal, animal o microbiano. El cuajo animal procede del cuarto estómago o abomaso de los animales rumiantes. Su enzima principal es la renina que escinde la κ-caseína, rompiendo las micelas de la leche. Existen cuajos procedentes de hongos como Mucor miehei, Mucor pusillus o Endothia parasítica, aunque actualmente se tiende al uso de renina obtenida mediante biotecnología recombinante en Escherichia coli (Adams et al., 2016). Los cultivos starters de los quesos incluyen bacterias lácticas mesófilas, termófilas y mohos; en muchos casos se distingue entre starter principal y microbiota secundaria (Tabla 4). Algunas de las bacterias más importantes en esta industria son: Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus o Streptococcus thermophilus. Todas estas son usadas en la fabricación del cheddar, parmesano o queso emmental (Adams et al., 2016) y en quesos como la mozzarella, provolone o romano (Montville y Matthews, 2009). En algunos quesos se requiere la producción de diacetilo; para ello se usa como starter a Leuconostoc cremoris o al propio Lactococcus lactis. Otro de los compuestos a tener en cuenta es el CO2; por ejemplo, en el queso gouda es una característica deseable, proporcionando huecos al queso denominados “ojos del queso”. Además de bacterias lácticas, participan bacterias del ácido propiónico como Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii en quesos como el Masdaam holandés o el suizo, siendo el responsable de los ojos del queso también. Otros microorganismos encontrados son los mohos donde destacan el Penicillium camembertii y Penicillium roquefortii produciendo la maduración exterior de quesos blandos como el camembert, el brie o el roquefort (Adams et al., 2016). 4.8 ACEITUNAS DE MESA Una de las grandes protagonistas de la gastronomía española es la aceituna de mesa. Las aceitunas son el fruto del olivo (Olea europea sativa) (Ruiz-Barba y Jiménez-Díaz, 2005). Según la Norma de Calidad del Consejo Oleícola Internacional (1980) la aceituna de mesa es: “El fruto de determinadas variedades de olivo cultivado, sano, cogido en el estado de madurez adecuado y de calidad tal que, sometido a las preparaciones apropiadas, dé un producto de consumo y de buena conservación como mercancía comercial”. Según esta norma existen 4 tipos de aceitunas: verdes, negras naturales, negras oxidadas o de color cambiante. Ya en tiempos de los griegos y romanos este alimento era elaborado en nuestro territorio. En aquellos tiempos se usaban vasijas de barros, que posteriormente fueron sustituidas por toneles de madera, y estos a partir de 1970 fueron reemplazados por fermentadores modernos de plástico y fibra de vidrio (Ruiz-Barba y Jiménez-Díaz, 2005). 31 En la elaboración de las aceitunas verdes de mesa al estilo sevillano o español el objetivo es llevar a cabo un procesamiento del fruto, de tal manera que, la microbiota que contiene de manera natural comience a desarrollarse en la salmuera de fermentación, consuma los azúcares produciendo ácido láctico y se reduzca el pH. La bajada del pH, el ácido láctico y otros compuestos generados evitan la degradación de la aceituna por otros microorganismos (Ruiz- Barba y Jiménez-Díaz, 2005). El primer paso consiste en la recogida, traslado, acondicionamiento, lavado y clasificación de las aceitunas. En esta etapa se quitan las ramas, hojas e impurezas que traiga consigo el fruto del campo. Después se inicia el “cocido” que consiste en introducir las aceitunas en una solución de sosa caustica (NaOH) durante horas o días según la variedad y las condiciones medioambientales, hasta que la sosa haya ingresado 2/3 en la pulpa. Esta sosa hidroliza la oleuropeína. Posteriormente se lava (1 lavado de 10-12 horas) y se colocan en salmuera 10-12%. Esta fase permite la eliminación de la oleuropeína y otros polifenoles que proporcionan el sabor amargo a los frutos y que además, son inhibidores de las LABs. Su eliminación permite una mejor fermentación y un producto final sin alteraciones, más homogéneo y con mejores características organolépticas (Durán-Quintana et al., 1997; Ruiz-Barba y Jiménez-Díaz, 2005). Las LABs se encuentran en muy baja proporción en las aceitunas de manera natural, 0,1-1%. Sin embargo, tras la colocación de las aceitunas en salmuera, se produce un incremento sustancial de la biomasa de estas gracias a que la salmuera inhibe a gran parte de la microbiota (Ruiz-Barba y Jiménez-Díaz, 2005). La fermentación tiene lugar en 4 fases. La primera dura entre 5 y 15 días donde crecen bacterias Gram negativas y cocos lácticos (Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis y Pediococcus urinaeequi, actual Aerococcus urinaeequi), estos producen una rápida caída del pH. La segunda fase dura entre 10-15 días, se inicia con la aparición de los primeros lactobacilos Lactibacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum y la dominante que es Lactobacillus pentosus. En la tercera fase la población de lactobacilos emerge como las más numerosa. Estas bacterias son las causantes de producir los cambios fisicoquímicos más importantes y dotan al fruto de las características organolépticas típicas. Se ha descrito la coexistencia de levaduras que crecen de forma sinérgica con los lactobacilos. La tercera fase acaba con la ausencia de azúcares fermentables y un pH ≤ 4. La última fase comprende toda la etapa de conservación del fruto fermentado y es cuando se producen variaciones como el aumento de la acidez volátil y una elevación del pH. La elevación del pH debe estar controlada, ya que un aumento de 0,4 unidades en la escala de pH supone un riesgo para la producción por la aparición de efectos indeseables debido al crecimiento de bacterias anaeróbicas del género Propionobacterium y Clostridium. Estos cambios son conocidos como “zapatería” de la aceituna. Otra de las alteraciones más 32 comunes es el “alambrado” que consiste en la formación de hendiduras en el exterior de la aceituna por la producción de gas; la solución en este caso es el ajuste de pH inicial (Durán- Quintana et al., 1997). Terminada la fermentación se requieren operaciones complementarias relativas a la clasificación por tamaño, homogenización y ajuste de las salmueras y envasado de las aceitunas. 4.9 KIMCHI El término “kimchi” hace referencia a un conjunto de alimentos vegetales fermentados por bacterias acidolácticas. Es originario de Corea y existen más de 200 variaciones de este alimento, La variedad más comercializada y consumida y en la que se centrará este apartado es el kimchi baechu. La materia prima del kimchi baechu es el repollo chino (Brassica rapa subsp. pekinensis). Existen otras variedades elaboradas con rábano coreano (Raphanus raphanistrum subsp. sativus), pepino, hoja de mostaza o cebolla verde. Tradicionalmente el kimchi se ha fabricado durante la festividad del Kimjang, donde los coreanos preparaban kimchi que les permitía conservar verduras durante todo el invierno (Surya y Nugroho, 2023). El perfil microbiológico del kimchi es bastante amplio habiéndose hallado cepas de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc y Weissella (Choi et al., 2002). Uno de los pasos de la elaboración del es colocar el repollo en salmuera antes de la fermentación, causando la inhibición de otros microorganismos patógenos y permite el desarrollo de las cepas acidolácticas. La microbiota del kimchi es variable según el pH, la temperatura, acidez y la época de producción (Vinderola et al., 2019). Incluso dentro de la propia fermentación de un mismo lote encontramos fluctuaciones de la cepa mayoritaria. En etapas tempranas de la fermentación, cuando el pH se encuentra entre 5,64-4,27 y la acidez inferior a 0,9%, el microorganismo dominante es Leuconostoc mesentoroides. En etapas tardías cuando el pH es inferior a 4,15 y la acidez es superior a 0,9% reinan los lactobacilos como Lactobacillus sakei; además, encontramos cepas del género Weissella, por ejemplo Weissella koreensis (Cho et al., 2009). Toda esta microbiota la portan de manera natural los propios vegetales. El uso de cultivos starters es limitado en este producto, puesto que en muchos casos no superan las características conferidas por la microbiota autóctona (Vinderola et al., 2019). Las etapas de elaboración del kimchi son las siguientes (Vinderola et al., 2019): 1. Pretratamiento: recogida, clasificación, lavado y corte del repollo chino. 2. Salmuera: el repollo cortado es depositado en tanques en salmuera al 10% durante una noche. 3. Enjuague y filtración del exceso de agua. 33 4. Premezclado de los condimentos: La fórmula estandarizada del kimchi contiene los siguientes condimentos: 13% de rábano en rodajas, 2% de cebolla verde, 3,5 % de chile rojo en polvo (gochugaru), 1,4% de ajo, 0,6% de jengibre y 2,2% de anchoas fermentadas. 5. Mezcla de los condimentos con el repollo y ajuste de la sal a un 2,5%. 6. Envasado. 7. Fermentación: se mantiene entre 5-10 °C durante 4-7 días, aunque puede estar semanas/meses. Una temperatura baja mejora el sabor de este alimento. 5. CONCLUSIONES Tras esta revisión bibliográfica podemos concluir que los alimentos fermentados a pesar de haber sido elaborados desde hace milenios, continúan siendo unos grandes desconocidos. Sin duda, la elección del cultivo starter es la clave para un producto seguro, de calidad y estandarizado, pero es un campo que aún está en desarrollo en todos los alimentos tratados en esta revisión. De igual manera, el conocimiento de la genética y la bioquímica de estas bacterias constituye la base sobre la que trabajar para mejorar el rendimiento y la producción, puesto que las fermentaciones tienen diversas fases con predominancia de diferentes géneros de bacterias según las condiciones cambiantes del medio. Por otro lado, el perfil nutricional de los alimentos obtenidos por fermentación láctica los hace ser alimentos funcionales con numerosos estudios que demuestran el carácter beneficioso de su consumo. Algunos como el labenh, el koumiss o el kimchi son alimentos cuyo mercado en España se preveé que aumentará en los próximos años como ya lo hizo el kéfir, gracias a los estudios que avalan su potencial probiótico; mientras que otros como el queso, el yogur o las aceitunas seguirán constituyendo una parte fundamental de la dieta mediterránea. 34 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Adams MR, Moss MO, McClure PJ. Food Microbiology. 4ª ed. Cambridge: The Royal Society of Chemistry; 2016. 2. 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