Impacto de la lecitina de unión a la manosa (MBL) y beta-defensina 2 en la susceptibilidad frente a infecciones en neonatos prematuros extremos

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA ! ! ! Título:! ! Impacto!de!la!Lectina!de!Unión!a!la!Manosa!(MBL)!y!β< Defensina!2!en!la!susceptibilidad!frente!a!infecciones!en! neonatos!prematuros!extremos! ! ! ! ! ! ! ! ! Trabajo!que!presenta!el!licenciado!Peter! Olbrich!para!optar!al!grado!de!Doctor!en! Medicina!y!Cirugía.! Sevilla,!2015! ! ! ! ! ! D.!JOSÉ!VILLAR!ORTIZ,!PROFESOR!DEL!DEPARTAMENTO!DE!MEDICINA!DE!LA! FACULTAD!DE!MEDICINA!DE!LA!UNIVERSIDAD!DE!SEVILLA.! ! ! CERTIFICA!:! Que!D.!Peter!Olbrich,!Licenciado!en!Medicina!y!Cirugía,!ha!realizado! bajo!nuestra!dirección!el!trabajo!titulado!“Impacto!de!la!Lectina!de!Unión!a!la! Manosa!(MBL)!y!βZDefensina!2!en!la!susceptibilidad!frente!a!infecciones!en! neonatos!prematuros!extremos”.! Revisado!el!presente!trabajo!por!creer!que!reúne!las!condiciones!necesarias,! estimamos!que!puede!ser!presentado!como!Tesis!Doctoral.! ! !! ! ! ! ! ! ! Sevilla,!!Mayo!2015! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ÍNDICE!DEL!CONTENIDO! I.#INTRODUCCIÓN#15! 1.1!PREMATURIDAD! 1! 1.2!SEPSIS!NEONATAL! 8! 1.3!EL!SISTEMA!INMUNE!EN!LA!EDAD!NEONATAL!11! 1.4!LAS!BETA!DEFENSINAS!HUMANAS!2! 16! 1.5!LA!LECTINA!DE!UNIÓN!A!LA!MANOSA!(MBL)!22! II.#HIPÓTESIS#Y#OBJETIVOS#26! III.#MÉTODOS#29! 3.1!ÁMBITO!DE!LOS!ESTUDIOS:! 30! 3.2!DISEÑO!DE!LOS!ESTUDIOS:! 31! 3.3!POBLACIÓN!DE!ESTUDIO:! 31! 3.4!CRITERIOS!DE!INCLUSIÓN!E!EXCLUSIÓN!EN!LOS!DOS!PROYECTOS!(P1,P2):!31! 3.5!RECOGIDA!DE!VARIABLES!EPIDEMIOLÓGICAS!Y!CLÍNICAS:! 33! 3.6!OBTENCIÓN,!PROCESAMIENTO!Y!ANÁLISIS!DE!MUESTRAS!DE!PLACENTA!35! 3.7!OBTENCIÓN!Y!PROCESAMIENTO!DE!LAS!MUESTRAS:! 35! 3.8!ANÁLISIS!DE!ESTABILIDAD!DEL!PÉPTIDO!HBD2!36! 3.9!CUANTIFICACIÓN!DE!NIVELES!DE!HBD2!36! 3.10!DETERMINACIÓN!DE!LOS!NIVELES!SÉRICOS!DE!MBL:!37! 3.11!ANÁLISIS!DE!DATOS!38! 3.12!ASPECTOS!ÉTICOS!39! IV.#RESULTADOS#41! ESTABILIDAD!Y!CACACTERÍSTICAS!DE!LAS!BETA!DEFENSINAS!HUMANA!EN!MUESTRA!DE!SUERO!41! PROYECTO#1!42! DESCRIPCIÓN!DE!LA!POBLACIÓN!42! NIVELES!DE!HBD2!EN!RELACIÓN!CON!LAS!VARIABLES!EN!ESTUDIO!43! DESCRIPCIÓN!DE!LA!POBLACIÓN!46! VARIABILIDAD!DE!LOS!NIVELES!DE!LA!BETA!DEFENSINA!HUMANA!Y!DE!LA!LECTINA!DE!LA!UNIÓN!A!LA! MANOSA!DURANTE!LA!SOSPECHA!DE!UN!EPISODIO!SÉPTICO!49! NIVELES!DE!LA!BETA!DEFENSINA!HUMANA!EN!RELACIÓN!CON!LAS!VARIABLES!EDAD!GESTACIONAL!Y! PESO!AL!NACER!50! HBD2!Y!LA!EDAD!GESTACIONAL!DICOTOMIZADA!51! HBD2!Y!EL!PESO!AL!NACER!COMO!VARIABLE!DICOTOMIZADA!53! NIVELES!DE!LA!MBL!EN!RELACIÓN!CON!LAS!VARIABLES!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!55! MBL!Y!LA!EDAD!GESTACIONAL!55! MBL!Y!EL!PESO!AL!NACER!DICOTOMIZADO!57! ANÁLISIS!DE!CORRELACIÓN!ENTRE!HBD2,!PROTEÍNA!C!REACTIVA!Y!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!58! ANÁLISIS!DE!CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!MBL,!PROTEÍNA!C!REACTIVA!Y!RECUENTO!DE! NEUTRÓFILOS!59! ESTRATIFICACIÓN#DE#LA#MUESTRA#EN#FUNCIÓN#DE#LA#VARIABLE#SEPSIS#NOSOCOMIAL#60! ANÁLISIS!DEL!ESTRATO!DE!"NEONATOS!SIN!DATOS!DE!SEPSIS"! 61! ASOCIACIÓN!ENTRE!NIVELES!DE!HBD2!Y!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!(DICOTOMIZADOS)! EN!NEONATOS!SIN!DATOS!DE!SEPSIS!61! ASOCIACIÓN!ENTRE!MBL,!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!64! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!MBL,!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!Y!VALOR!DE!PCR!EN! ESTRATO!DE!“NEONATOS!SIN!DATOS!DE!SEPSIS”! 65! ANÁLISIS!DEL!ESTRATO!DE!"NEONATOS!CON!SEPSIS!CLÍNICA"! 66! ! ! ! ASOCIACIÓN!ENTRE!HBD2,!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!66! CORRELACIÓN!ENTRE!HBD2,!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!Y!VALOR!DE!PCR!68! ASOCIACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!MBL,!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!69! CORRELACIÓN!ENTRE!MBL,!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!Y!VALOR!DE!PCR!70! ANÁLISIS!DEL!ESTRATO!DE!"NEONATOS!CON!SEPSIS!CONFIRMADA"! 71! ASOCIACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!HBD2,!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!71! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!HBD2,!NEUTRÓFILOS!Y!PROTEÍNA!C!REACTIVA!73! ASOCIACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!MBL,!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!74! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!MBL!Y!PROTEÍNA!C!REACTIVA!Y!NEUTRÓFILOS!EN!ESTRATO! DE!“NEONATOS!CON!SEPSIS!CONFIRMADA”! 75! ESTRATIFICACIÓN!DE!LA!MUESTRA!EN!FUNCIÓN!DE!LA!VARIABLE!HEMOCULTIVO!76! ANÁLISIS!DE!LAS!VARIABLES!HBD2!Y!MBL!EN!LOS!ESTRATOS!DE!LA!VARIABLE!HEMOCULTIVOS!76! V.#DISCUSIÓN#78! NIVELES!DE!HBD2!EN!FUNCIÓN!DE!SU!PROCESAMIENTO!Y!PROCEDENCIA!DE!LAS!MUESTRAS!79! PROYECTO#1:#80! VARIABLES!DEMOGRÁFICAS!Y!CLÍNICAS,!Y!SU!RELACIÓN!CON!LAS!HBD2!EN!LA!POBLACIÓN!80! NIVELES!DE!HBD2!EN!NEONATOS!A!TÉRMINO!Y!ADULTOS!SANOS!80! NIVELES!DE!HBD2!EN!NEONATOS!A!TÉRMINO!Y!PREMATUROS!81! HBD2!Y!SUSCEPTIBILIDAD!FRENTE!INFECCIONES!82! HBD2!Y!LA!PRESENCIA!DE!CORIOAMNIONITIS!83! PROYECTO#2:#84! DATOS!CLÍNICOS!Y!DEMOGRÁFICOS!84! REGULACIÓN!DE!HBD2!Y!MBL!DURANTE!LA!SOSPECHA!DE!SEPSIS!85! INFLUENCIA!DE!LA!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!EN!LOS!NIVELES!DE!HBD2!85! INFLUENCIA!DE!LA!EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER!EN!LOS!NIVELES!DE!MBL!87! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!HBD2!Y!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!EN!LA!POBLACIÓN! GENERAL!87! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!HBD2!Y!LOS!VALORES!DE!LA!PROTEÍNA!C!REACTIVA!88! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!MBL,!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!Y!LOS!VALORES!DE!LA! PROTEÍNA!C!REACTIVA!89! ESTRATIFICACIÓN!DE!LA!COHORTE!SEGÚN!LAS!VARIABLES:!SEPSIS!Y!HEMOCULTIVOS!89! NIVELES!DE!HBD2!EN!RELACIÓN!CON!LA!EDAD!GESTACIONAL!Y!EL!PESO!AL!NACER!EN!LOS!ESTRATOS! DE!LA!VARIABLE!SEPSIS!89! NIVELES!DE!MBL!EN!RELACIÓN!CON!LA!EDAD!GESTACIONAL!Y!EL!PESO!AL!NACER!EN!LOS!ESTRATOS! DE!LA!VARIABLE!SEPSIS!90! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!HBD2,!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!Y!LOS!VALORES!DE!LA! PROTEÍNA!C!REACTIVA!EN!LOS!ESTRATOS!DE!LA!VARIABLE!SEPSIS!Y!HEMOCULTIVOS!91! CORRELACIÓN!ENTRE!LOS!NIVELES!DE!MBL,!RECUENTO!DE!NEUTRÓFILOS!Y!LOS!VALORES!DE!LA! PROTEÍNA!C!REACTIVA!EN!LOS!ESTRATOS!DE!LA!VARIABLE!SEPSIS!Y!HEMOCULTIVOS!92! VI.#CONCLUSIONES#93! CONCLUSIONES#95! CONCLUSIONS#96! VII.#BIBLIOGRAFÍA#96! VIII.#ANEXOS#109! ! ! ! ÍNDICE!DE!TABLAS ! TABLA!1:!Mediadores!solubles!del!sistema!inmune!innato!con!efecto!regulador!en! las!edades!tempranas#12! TABLA!2:!Localización!y!función!de!las!defensinas!humanas.! 17! TABLA!3:!Comparación!de!datos!demográficos!y!clínicos!entre!los!grupos!según! edad!gestacional! 42! TABLA!4:!Comparación!de!niveles!de!HBD2!en!suero!en!relación!con!variables! demográficas!y!clínicas! 43! TABLA!5:!Características!generales!de!la!población! 46! TABLA!6:!Características!maternas!y!resultado!de!anatomía!patológica! 46! TABLA!7:!Características!del!parto!en!la!población!general! 47! TABLA!8:!Características!clínicas!y!analíticas!en!la!población!general!en!el!momento! del!ingreso!47! TABLA!9:!Variables!de!la!población!general!relacionadas!con!la!sospecha!de!sepsis!! 48! TABLA!10:!Niveles!de!HBD2!en!diferentes!momentos!de!extracción!en!la!población! general! 49! TABLA!11:!Niveles!de!MBL!en!diferentes!momentos!de!extracción!en!la!población! general! 49! TABLA!12:!Correlaciones!entre!la!edad!gestacional!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en! los!diferentes!momentos!de!extracción! 50! TABLA!13:!Asociación!entre!la!variable!edad!gestacional!y!niveles!de!HBD2!en!suero! en!los!diferentes!momentos!de!extracción! 51! TABLA!14:!Correlaciones!entre!el!peso!al!nacer!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los! diferentes!momentos!de!extracción! 52! TABLA!15:!Asociación!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en! los!diferentes!momentos!de!extracción! 54! TABLA!16:!Correlaciones!entre!la!edad!gestacional!y!niveles!de!MBL!en!suero!en!los! diferentes!momentos!de!extracción.! 55! TABLA!17:!Correlaciones!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!MBL!en!suero! en!los!diferentes!momentos!de!extracción! 55! TABLA!18:!Asociación!entre!la!variable!edad!gestacional!y!niveles!de!MBL!en!suero! en!los!diferentes!momentos!de!extracción! 57! TABLA!19:!Asociación!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!MBL!en!suero!en! los!diferentes!momentos!de!extracción! 57! TABLA!20:!Correlaciones!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!niveles!de!HBD2!en! suero!en!los!diferentes!momentos!de!extracción! 58! TABLA!21:!Distribución!de!frecuencias!de!la!presencia!de!las!diferentes!categorías! de!sepsis!en!la!población!general! 60! TABLA!22:!Edad!gestacional!(semanas)!para!las!categorías!de!la!variable!sepsis! 60! TABLA!23:!Peso!al!nacer!(gramos)!para!las!categorías!de!la!variable!sepsis.! 60! TABLA!24:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato! “no!sepsis”!61! TABLA!25:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato!“no! sepsis”!62! ! ! ! TABLA!26:!Correlaciones!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!niveles!de!HBD2!en! suero!en!los!diferentes!momentos!de!extracción!para!el!estrato!de!“No!sepsis”.!!! 62! TABLA!27:!Asociación!entre!los!niveles!de!MBL!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato! “no!sepsis”.!64! TABLA!28:!Asociación!entre!los!niveles!de!MBL!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato!“no! sepsis”!64! TABLA!29:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato! “sepsis!clínica”! 66! TABLA!30:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato! “sepsis!clínica”! 67! TABLA!31:!Correlación!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!los!niveles!de!HBD2!en! suero!en!los!diferentes!momentos!de!su!extracción!para!el!estrato!“Sepsis!clínica”! 68! TABLA!32:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato! “sepsis!clínica”! 70! TABLA!33:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato! “sepsis!clínica”! 70! TABLA!34:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato! “sepsis!confirmada”! 71! TABLA!35:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato! “sepsis!confirmada”! 72! TABLA!36:!Correlación!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!los!niveles!de!HBD2!en! suero!en!los!diferentes!momentos!de!su!extracción!para!el!estrato!“Sepsis! confirmada”! 73! TABLA!37:!Correlación!entre!el!valor!de!PCR!y!los!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los! diferentes!momentos!de!su!extracción!para!el!estrato!“Sepsis!confirmada”! 74! TABLA!38:!Asociación!entre!los!niveles!de!MBL!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato! “sepsis!confirmada”! 74! TABLA!39:!Asociación!entre!los!niveles!de!MBL!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato! “sepsis!confirmada”! 75! TABLA!40:!Distribución!de!frecuencias!de!la!presencia!de!las!diferentes!categorías! de!resultado!de!cultivos!en!la!población!general! 76! TABLA!41:!Correlación!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!los!niveles!de!HBD2!en! suero!en!los!diferentes!momentos!de!su!extracción!para!el!estrato!“Hemcultivo! negativo”! 76! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ÍNDICE!DE!FIGURAS! ! FIGURA!1:!!Las!localizaciones!de!la!infección!intrauterina!más!frecuentes! 3! ! FIGURA!2:!Posibles!mecanismos!de!la!relación!entre!la!colonización!bacteriana!de! las!estructuras!coriodeciduales!y!el!parto!prematuro! 4! ! FIGURA!3:!Causas!de!muerte!a!nivel!global!en!el!año!2010! 5! ! FIGURA!4:!Estimación!de!la!distribución!de!las!causas!directas!de!los!4!millones!de! fallecimientos!neonatales! 6! ! FIGURA!5:!Representación!gráfica!de!la!estructura!terciaria!de!las!defensinas! 16! ! FIGURA!6:!Papel!de!las!defensinas!como!péptido!antimicrobiano!y!otras!funciones! asociadas!a!la!defensa!del!huésped! 18! ! FIGURA!7:!Niveles!de!APPs!en!suero!en!neonatos!preterminos,!términos!en!relación! con!niveles!hallados!a!nivel!materno! 20! ! FIGURA!8:!Estudios!realizados!en!adultos!con!determinación!de!niveles!plasmáticos! 21! ! FIGURA!9:!Visión!simplificada!del!sistema!de!complemento!incluyendo!la!vía!de!las! lectinas!y!sus!interacciones!con!la!vía!alternativa!y!la!vía!clásica! 22! ! FIGURA!10:!La!estructura!del!gen!MBL2!y!de!la!Léctina!de!unión!a!la!manosa! 23! ! FIGURA!11:!Efecto!del!tiempo!de!procesamiento!e!inhibidores!de!proteinasa!sobre! los!niveles!de!HBD2!en!suero! 41! ! FIGURA!12:!Niveles!de!HBD2!a)!en!función!de!la!edad!y!b)!la!presencia!de!sepsis! tardía!en!el!grupo!de!los!prematuros! 44! ! FIGURA!13:!Correlación!entre!la!edad!gestacional!y!la!media!de!los!niveles!de!HBD2! en!suero!obtenido!los!días!0,!4!y!7!de!sospecha!de!sepsis!nosocomial! 50! ! FIGURA!14:!Asociación!entre!las!variables!edad!gestacional!y!niveles!de!HBD2!en! suero!en!los!diferentes!momentos!de!extracción! 52! ! FIGURA!15:!Correlación!entre!el!peso!al!nacer!y!la!media!de!los!niveles!de!HBD2!en! suero!obtenido!los!días!0,!4!y!7!de!sospecha!de!sepsis!nosocomial! 53! ! FIGURA!16:!Asociación!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!HBD2!en!suero! en!los!diferentes!momentos!de!extracción! 54! ! ! ! ! FIGURA!17:!Correlación!entre!las!medias!del!recuento!de!neutrófilos!con!los!niveles! de!HBD2!en!suero!de!sospecha!de!sepsis!nosocomial! 59! ! FIGURA!18:!Correlación!entre!las!medias!del!recuento!de!neutrófilos!con!las!medias! de!los!niveles!de!HBD2!en!suero!!para!el!estrato!de!“No!sepsis”! 63! ! FIGURA!19:!Asociación!entre!la!media!de!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional! en!el!estrato!“sepsis!clínica”! 67! ! FIGURA!20:!Asociación!entre!las!medias!de!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en! el!estrato!“sepsis!clínica”! 68! ! FIGURA!21:!Correlación!entre!la!medias!del!recuento!de!neutrófilos!con!los!niveles! de!HBD2!en!suero!!para!el!estrato!de!“Sepsis!clínica”! 69! ! FIGURA!22:!Asociación!entre!las!medias!de!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en! el!estrato!“sepsis!confirmada”! 72! ! FIGURA!23:!Asociación!entre!las!medias!de!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en! el!estrato!“sepsis!confirmada”! 73! ! FIGURA!24:!Gráfica!de!correlación!entre!las!medias!de!los!recuentos!de!neutrófilos! con!las!medias!de!los!niveles!de!HBD2!en!suero!!para!el!estrato!de!“Hemocultivo! negativo”! 77! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN! ! 1 Introducción! Esta!tesis!doctoral!trata!de!analizar!el!impacto!de!partes!solubles!del!sistema!inmune!innato! sobre! la! susceptibilidad! de! sufrir! infecciones! en! la! edad! neonatal.! Del! mismo! modo! es! objetivo!de!este!trabajo!generar!nuevas!hipótesis!y!aumentar!los! conocimientos!sobre!la! fisiología! y! fisiopatología! de! componentes! del! sistema! inmune! innato! en! recién! nacidos.! Para!lograr!estos!objetivos!se!han!realizado!dos!proyectos!relacionados!entre!si.!! !! ! ! ! 1.1!Prematuridad! ! Se!define!como!parto!pretérmino!o!prematuro!aquellos!partos!que!se!producen!antes!de!la! semana! 37! de! gestación.! Se! ha! introducido! la! siguiente! nomenclatura! para! diferenciar! subgrupos! de! prematuridad! según! la! edad! gestacional! (EG):! 32Z37! semanas! de! EG! “pretérmino!tardío”;!menor!de!32!semanas!de!EG!“recién!nacido!muy!pretérmino”!y!menor! de!28!semanas!EG!“recién!nacido!pretérmino!extremo”![1,2].!! Aunque! en! la! práctica! clínica! se! usa! de! forma! sinónima! el! término! de! recién! nácido! pretérmino,!esto!no!implica!información!sobre!su!estado!de!madurez.!Dadas!las!dificultades! de!establecer!con!exactitud!la!edad!gestacional!se!acepta!la!inclusión!del!peso!del!recién! nacido!como!valor!de!referencia.!Se!diferencian!los!siguientes!grupos:!(1)!menor!de!2500!g! “bajo!peso!al!nacimiento”;!(2)!menor!de!1500!g!“muy!bajo!peso!al!nacimiento”;!(3)!menor! de!1000!g!“extremado!bajo!peso”![1,2].!A!pesar!de!numerosos!estudios!e!intervenciones! realizados!con!el!fin!de!prevenir!el!parto!prematuro!este!evento!sigue!siendo!actualmente! uno!de!los!grandes!retos!de!los!sistemas!sanitarios![3Z5].!! ! La! tasa! de! partos! prematuros! (menor! de! 37! semanas! de! EG)! oscila! en! los! últimos! años! alrededor!de!12Z13%!en!Estados!Unidos!(EEUU)!y!5Z9%!en!países!europeos.!Mujeres!afroZ americanas! y! afroZcaribeñas! demuestran! una! tasa! elevada! (16Z18%)! de! presentar! partos! INTRODUCCIÓN! ! 2 prematuros! en! comparación! con! mujeres! de! raza! blanca! (6Z9%)! [6].! Una! parte! de! las! diferencias!encontradas!entre!las!tasas!de!partos!prematuros!en!EEUU!en!comparación!con! otros!países!con!similar!nivel!de!desarrollo!se!debe!posiblemente!a!esta!asociación![6].!! Otros!factores!de!riesgo!de!prematuridad!son!gestaciones!múltiples,!corto!intervalo!entre! diferentes! embarazos,! antecedentes! personales! o! familiares! de! partos! prematuros,! desnutrición,! estrés! social! o! psicológico,! tabaquismo,! uso! de! heroína! o! cocaína! y! enfermedades! maternas! como! depresión,! hipertensión! arterial,! diabetes! mellitus! u! otras! enfermedades! que! puedan! llevar! a! inducir! el! parto! de! forma! precoz! por! riesgo! materno! [3,7,8].! En! la! última! década! la! mayor! aplicación! de! técnicas! de! reproducción! asistida! ha! contribuido!posiblemente!a!que!las!cifras!de!prematuridad!no!se!hayan!reducido!a!pesar!de! intervenciones!preventivas!y!terapéuticas!importantes![3,8].!! Las!infecciones!intrauterinas!se!reconocen!como!una!causa!importante!del!parto!prematuro! [9,10].!En!los!últimos!años,!se!ha!observado!que!las!citoquinas!inflamatorias!sirven!de!señal! fetal!para!el!inicio!del!parto!en!el!contexto!de!infecciones![9Z13].!Un!alto!porcentaje!de!las! infecciones! tienen! una! presentación! subclínica! y! los! patógenos! más! frecuentemente! identificados! son! Trichomonas, sspp,! Chlamydia, sspp,, Neisseria!gonorrea!y! Treponema, pallidum,!mientras!el!papel!de!otros!patógenos!como!!Streptococcus,grupo,B,!Mycoplasma, hominis!y!Ureaplasma,ureolyticum!sigue!siendo!discutido![14Z16].!Las!vías!de!transmisión!de! los!agentes! infecciosos!!en!las!infecciones!intrauterinas!son!múltiples!y!pueden!afectar!a! diferentes!estructuras!fetales.!En!la!Figura!1!se!puede!observar!en!qué!áreas!anatómicas!y! funcionales!ocurren!la!mayoría!de!las!infecciones!intrauterianas![17].! ! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN! ! 3 Figura!1:!Lugares!de!infección!intrauterina!más!frecuentes![17].!! ! En!la!actualidad!no!se!dispone!de!herramientas!con!eficacia!comprobada!para!prevenir!el! parto!prematuro,!probablemente!por!desconocerse!todavía!los!mecanismos!fisiopatológicos! del!parto!prematuro!en!su!complejidad.!Se!postulan!como!datos!con!mayor!implicación,!los! procesos!inflamatorios!debidos!a!infecciones!y!la!insuficiencia!del!cervix![7Z9]!siendo!esta! última!el!mecanismo!común!final!que!explicaría!el!parto!pretérmino!con!independencia!de! la!posible!etiología!subyacente![10].!La!Figura!2!representa!un!esquema!de!mecanismos!que! se!inician!tras! un! estimulo! infeccioso!y!que!finalmente!pueden!llevar! al! parto!prematuro! [17].! ! ! ! INTRODUCCIÓN! ! 4 Figura! 2:,Posibles! mecanismos! de! la! relación! entre! la! colonización! bacteriana! de! las! estructuras!coriodeciduales!y!el!parto!prematuro![17].!! ! Sin! embargo,! no! existen! datos! concluyentes! sobre! la! cadena! de! mediadores! y! factores! iniciales!lo!que!impide!el!diseño!racional!de!estrategias!de!intervención!eficaces.!! Además,!existe!evidencia!creciente!que!el!síndrome!inflamatorio!fetal!(FIRS)!está!asociado! con!una!mayor!morbimortalidad!neonatal!siendo!la!Interleuquina!(IL)!Z6!la!citoquina!más! frecuentemente!relacionada!con!esta!complicación!clínica![18].!Es!un!dato!interesante!que! en!los!últimos!años!diferentes!grupos!han!podido!demostrar!por!un!parte!la!inducción!de! esta!sustancia!por!neuropeptidos!tales!como!la!sustancia!P,!y!por!otra!la!presencia!de!este! neuropeptido!en!la!placenta![18Z20].!Además!en!un!modelo!animal!se!ha!observado!una! asociación!significativa!entre!el!síndrome!inflamatorio!fetal!y!la!parálisis!cerebral![21]!y!en! estudios! tipo! metanálisis! se! concluyó! que! la! corioamnionitis! estaba! relacionada! con! la! parálisis!cerebral!infantil![22].!! ! INTRODUCCIÓN! ! 5 No! obstante,! faltan! estudios! de! suficiente! tamaño! muestral! para! poder! conocer! las! complejas! interrelaciones! que! pudieran! existir! entre! corioamnionitis,! FIRS,! inducción! de! parto!prematuro,!sepsis!precoz!o!tardía!y!morbimortalidad!neonatal!asociada.!! Aunque!en!los!últimos!años!se!han!conseguido!bajar!las!cifras!de!mortalidad!neonatal,!el! fallecimiento! en! estas! edades! sigue! siendo! uno! de! los! mayores! retos! de! los! sistemas! sanitarios! a! nivel! global! [4,5].! La! Figura! 3! muestra! que! en! el! año! 2010! fallecieron! 7.6! millones!de!niños!menores!de!5!años,!de!los!cuales!3.1!millones!fallecieron!en!los!primeros! 28!días!de!vida!lo!que!constituye!un!40%!de!la!mortalidad!infantil!en!niños!menores!de!5! años![23].!! Figura!3:!Causas!de!muerte!a!nivel!global!en!el!año!2010![23].! ! De! manera! similar! se! identificó! al! parto! prematuro! y! sus! complicaciones! ! como! eventos! relacionados! con! un! 27%! de! la! mortalidad! neonatal,! tal! y! como! se! puede! apreciar! en! la! Figura!4![5].! INTRODUCCIÓN! ! 6 ! ! Figura!4:!Estimación!de!la!distribución!de!las!causas!directas!de!los!4!millones!de! fallecimientos!neonatales![5].! ! Además! de! contribuir! en! una! proporción! considerable! a! la! mortalidad! infantil,! el! parto! prematuro! se! asocia! con! complicaciones! importantes! que! implican! un! alto! riesgo! de! secuelas! a! largo! plazo.! Así,! neonatos! con! una! edad! gestacional! de! 23! y! 27! semanas! presentan! un! riesgo! relativo! (RR)! de! 80! de! padecer! parálisis! cerebral,! un! RR! de! 10! de! presentar! retraso! mental! y! un! RR! de! 7,5! de! recibir! una! pensión! de! discapacidad! en! comparación!con!niños!nacidos!a!término![24].!! ! Afortunadamente,!la!mejora!continua!en!los!campos!de!la!Obstetricia!y!Neonatología!han! permitido!aumentar!la!supervivencia!de!los!prematuros!y!su!pronóstico!a!largo!plazo![6,7]! aunque!sigue!siendo!una!realidad!reconocida!que!la!disponibilidad!y!el!consumo!de!estos! recursos!avanzados!se!transcribe!en!un!elevado!gasto!económico![6,24Z27].!Este!gasto!no!se! limita!solamente!a!la!estancia!hospitalaria,!sino!también!durante!el!seguimiento! extrahospitalario![24]!debido!a!su!elevado!riesgo!de!sufrir!secuelas!neurosensoriales!y! INTRODUCCIÓN! ! 7 comorbilidad!crónica![24,28Z32].!Los!datos!epidemiológicos!del!año!2009!en!España! recabados!en!el!grupo!de!niños!con!un!peso!menor!de!1500!g!permiten!estimar!la!magnitud! del!impacto!del!parto!prematuro.!En!este!registro!nacional!se!observa!una!mortalidad!del! 17,2%!de!!un!total!de!1968!individuos.!El!alta!hospitalaria!se!realizó!por!término!medio!a!los! 49!días!de!edad!y!en!este!momento!el!45,9%!de!los!supervivientes!presentaba!algún!tipo!de! morbilidad!asociada.!Además,!se!pudo!demostrar!que!muchas!de!estas!complicaciones! (29%)!estaban!directamente!relacionadas!con!patologías!infecciosas!con!especial! importancia!de!la!corioamnionitis!y!de!la!sepsis!neonatal![33].!!!!! ! ! !1.2!Sepsis!neonatal! ! Definición,,epidemiologia,y,datos,demográficos, La!sepsis!neonatal!se!define!como!la!bacteriemia!con!signos!de!infección!sistémicos!en!los! primeros!28!días!de!vida![34].! A!nivel!mundial!se!estima!que!las!infecciones!neonatales!invasivas!causan!un!36%!de!los!4! millones!de!fallecimientos!neonatales![35].,Del!mismo!modo,!la!sepsis!neonatal!representa! una! de! las! causas! más! frecuentes! de! muerte! en! las! unidades! de! cuidados! intensivos! neonatales! (UCIZNN)! que! puede! alcanzar,! dependiendo! del! patógeno! y! de! la! edad! gestacional!de!los!recién!nacidos,!cifras!de!mortalidad!entre!el!10Z40%![36Z38].!Además!de! estar! asociada! con! una! morbimortalidad! significativa,! la! septicemia! es! también! causa! de! aumento!de!la!estancia!hospitalaria!y!de!los!costes!hospitalarios![39,40].,Según!el!momento! de! aparición,! los! patógenos! implicados! y! la! patogénesis,! se! puede! diferenciar! la! sepsis! neonatal!en!dos!entidades:!la!sepsis!precoz!o!vertical!y!la!sepsis!tardía!o!nosocomial![34].! , Sepsis,precoz,o,Sepsis,vertical, La!incidencia!de!sepsis!precoz!o!vertical!es!de!0.98Z11/1000!neonatos!vivos!de!forma!global,! siendo!esta!tasa!superior!en!el!subgrupo!de!neonatos!prematuros![41].!Se!define!como!la! presentación!de!sintomatología!compatible!con!una!sepsis!en!las!primeras!72!horas!de!vida,! y!la!vía!de!transmisión!de!la!infección!suele!ser!ascendente![34,41]., , Sepsis,tardía,o,Sepsis,nosocomial, La!sepsis!tardía!o!nosocomial!es!la!infección!sistémica!a!partir!de!72!horas!de!vida!y!continúa! siendo!un!problema!de!extraordinaria!importancia,!debido!a!su!elevada!morbimortalidad,!a! pesar!de!los!avances!y!esfuerzos!realizados!en!el!campo!de!los!cuidados!neonatales![42Z44].! La!tasa!de!complicaciones!graves!y!mortalidad!es!más!frecuente!en!el!recién!nacido!con!muy! bajo! peso! al! nacer! (RNMBPN,! menor! de! 1.500! g)! [45].! Además! de! su! morbimortalidad! significativa,!un!estudio!realizado!en!EEUU!concluyó!que!cada!episodio!de!septicemia!en!la! edad! neonatal! se! traduce! en! una! prolongación! de! la! estancia! hospitalaria! de! INTRODUCCIÓN! ! ! 9 aproximadamente!dos!semanas!y!un!coste!adicional!de!25.000!$![46,47].! Los!neonatos!hospitalizados! en! una! UCIZNN,! en! particular! los! recién! nacidos! prematuros,! presentan!altas!tasas!de!sepsis!nosocomial!con!cifras!variando!entre!las!distintas!UCIZNNs! (de!un!7!a!un!24.5%),!en!función!de!factores!ambientales,!intrínsecos!y!debido!a!diferencias! en!la!práctica!clínica![48,49].! En!España!un!!21%!de!todos!los!RNMBPN!y!hasta!el!43%!de!los!recién!nacidos!de!extremo! bajo!peso!al!nacer!(RNEBPN,!menor!de!1000!g)!desarrollan!una!sepsis!demostrada![50].!! Esta! complicación! clínica! grave! se! presenta! habitualmente! entre! la! segunda! y! tercera! semana! de! vida.! De! los! gérmenes! aislados! en! un! 70%! son! Gram! positivos,! 25%! Gram! negativos!y!un!5%!hongos![51].!Aunque!los!staphylococcus!coagulasa!negativos!como!por! ejemplo!Staphylococcus,epidermidis!!son!los!gérmenes!que!se!aíslan!con!mayor!frecuencia! [52]! las! infecciones! causadas! por! gérmenes! Gram! negativos! o! cándida! presentan! una! mortalidad!de!2!a!3!veces!mayor![37,53].! ! Infecciones,invasivas,en,la,edad,neonatal,y,afectación,broncopulmonar,y,neurológica, Aunque!el!pronóstico!de!los!supervivientes!de!sepsis!en!la!edad!neonatal!ha!mejorado!de! forma! global,! con! menores! tasas! de! mortalidad! y! complicaciones! respiratorias! y! neurológicas,! las! secuelas! broncopulmonares! y! neurológicas! siguen! siendo! de! gran! importancia,!afectando!la!calidad!de!vida!de!los!pacientes!y!de!sus!familias![54Z57].! ! Se! ha! comprobado! daño! cerebral,! determinado! como! ! alteraciones! significativas! en! la! resonancia!magnética!a!nivel!de!la!sustancia!blanca,!en!un!36%!de!niños!con!antecedentes! de!más!de!un!episodio!de!sepsis!durante!el!periodo!neonatal,!comparados!con!un!5%!en! niños!con!no!más!de!un!episodio!(OR!10.9;!!IC!95%!2.5Z47.6)![57].! A! nivel! clínico! esto! se! traduce! en! mayores! tasas! de! parálisis! cerebral! infantil! y! ! menor! rendimiento!escolar!en!el!grupo!de!niños!con!sepsis![58,59].! ! Presentación,clínica,y,métodos,diagnósticos,de,sepsis,neonatal, La! presentación! clínica! de! una! sepsis! neonatal! puede! ser! indistinguible! de! otras! complicaciones!comunes!en!la!edad!neonatal!e!incluye:! 1. Signos!de!distrés!respiratorio!! 2. Inestabilidad!térmica! INTRODUCCIÓN! ! ! 10 3. Hipotensión!arterial! 4. Bradicardia!o!taquicardia! 5. Letargia!o!irritabilidad! 6. Distensión!abdominal! 7. Intolerancia!nutricional! ! Sin! embargo,! en! un! estudio! reciente! se! ha! comprobado! el! muy! bajo! valor! predictivo! de! estos! criterios,! 61%! (Intervalo! de! confianza! al! 95%:! 52Z70%)! [60].! En! general,! dado! por! hecho!que!una!vez! establecida! la! sintomatología!clínica!la!mortalidad!aumenta!de!forma! inaceptable,!muchos!clínicos!comienzan!de! forma! empírica! un!tratamiento!antibiótico!de! amplio!espectro![59].!Por!estos!motivos!muchos!estudios!buscan!herramientas!para!poder! establecer! el! diagnóstico! de! sepsis! de! forma! precoz,! y! con! la! mayor! precisión! posible! (idealmente! durante! la! fase! asintomática),! con! el! objetivo! de! evitar! tratamientos! innecesarios! e! identificar! a! aquellos! neonatos! que! se! beneficiarían! de! un! manejo! diagnóstico!y!terapéutico!más!agresivo![61,62].! En! este! escenario! es! probable! que! un! mayor! conocimiento! sobre! las! funciones! y! características!de!los!mediadores!solubles!de!sistema!inmune!innato!podrían!ser!de!utilidad.! Sin! embargo! en! la! actualidad! no! disponemos! de! datos! suficientes! para! conocer! la! importancia!del!sistema!inmune!innato!en!los!prematuros!extremos,!bien!en!el!momento!de! nacer!o!posteriormente!en!el!periodo!neonatal!en!situaciones!de!estrés.!! En! este! sentido,! la! presente! tesis! doctoral! busca! aumentar! los! conocimientos! sobre! esta! rama!del!sistema!inmunitario!en!esta!población!tan!vulnerable!para!infecciones!y/o!secuelas! inflamatorias.! ! ! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN! ! ! 17 Como! se! detalla! a! continuación! las! defensinas! humanas! se! hallan! en! muchos! tejidos! del! cuerpo! humano.! En! la! Tabla! 2!y! Figura! 6! se! recogen! las! localizaciones! y! mecanismos! de! actividad!más!frecuentes!de!estas!moléculas![101].! !! Defensinas!Humanas!en!la!edad!pediátrica! Defensina! Clasificación! Localización! Gen!asociado! Actividad! HNP!1<4! ! ! αZ!Defensina! ! ! Neutrófilos! DEFA1! DEFA3! DEFA4! Antimicrobiana! Antitoxina!(1Z3)! Quimiotaxis!(1Z2)! HD!5!y!6! αZ!Defensina! ! Epitelio!reproductivo! DEFA5! DEFA6! Antimicrobiana! Antitoxina!(5)! Homeostasis!de! microbiota! HBD1! ! βZ!Defensina! ! Tracto!urinario! respiratorio/digestivo! DEFB1! Antimicrobiana! Quimiotaxis! ! HBD2! ! βZ!Defensina! ! Piel,!tracto!digestivo/! respiratorio! DEFB4! Antimicrobiana! Quimiotaxis! HBD3! ! βZ!Defensina! ! Piel,!tracto! respiratorio/digestivo! DEFB103! Antimicrobiana! Quimiotaxis! HBD4! βZ!Defensina! Piel,!tracto!digestivo! DEFB104! Antimicrobiana! Quimiotaxis! HNP!(Human!neutrophil!peptides);!HD!(Human!defensins);!HBD!(human!β!defensin)! Tabla!2:!Localización!y!función!de!las!defensinas!humanas.!Modificado!de![101].! ! Las!αZDefensinas!se!encuentran!en!gránulos!en!el!interior!de!los!neutrófilos!y!en!las!células! de!Paneth!del!intestino!delgado![96,101,102],!mientras!las!βZdefensinas!humanas!(HBD)!se! producen! en! células! epiteliales,! incluyendo! los! queratinocitos! de! la! piel,! tracto! genitourinario,!enterocitos!colónicos!y!en!las!células!del!epitelio!respiratorio!tanto!a!nivel! pulmonar! como! de! senos! paranasales! y! oído! medio! [104].! Además,! se! encuentran! en! monocitos,! macrófagos! y! células! dendríticas! [101,102,105].! Aunque! solamente! están! presentes! en! los! primates,! las! θZDefensinas! constituyen! actualmente! una! clase! de! antimicrobianos!prometedoras!para!su!uso!farmacéutico![106].! ! INTRODUCCIÓN! ! ! 18 ! Figura!6:!Papel!de!las!defensinas!como!péptido!antimicrobiano!y!otras!funciones!asociadas!a! la!defensa!del!huésped.,ACTH:,hormona,adrenocorticotropa;,CCR6:,receptor,de,quimioquina, 6;, EGF, receptor:, receptor, del, factor, de, crecimiento, epidérmico;, HBD2:, beta, defensina, humana, 2;, DC:, células, dendríticas;, NP:, peptido, de, neutrofílico;, HPN1'3:, peptido, de, neutrofilos,humano,Modificado!de![107].! ! En! humanos! se! han! descrito! cuatro! clases! de! beta! defensinas,! cada! una! sintetizada! y! regulada! por! un! tipo! celular! diferente! [108Z109].! Mientras! la! HBD1! se! expresa! de! forma! constitutiva!y!constante,!las!HBD2!y!HBD3!pueden!ser!inducidos!por!estímulos!infecciosos!o! inflamatorios! [109Z111].! Del! mismo! modo,! los! niveles! de! HBD2! están! influenciados! genotípicamente!por!polimorfismos!y!por!el!número!de!copias!de!los!genes!implicados![112]! pudiendo!existir!una!variabilidad!interindividual!importante![113].! Al!igual!que!la!HBD3,!la!síntesis!de!HBD2!es!inducida!por!bacterias!o!por!sus!productos! (lipopolisacáridos)!y!por!citoquinas!proinflamatorias!como!TNF!(tumor,necrosis,factor),Zα!e! ILZ1β![114].!La!transcripción!de!los!genes!de!HBD!está!regulada!a!través!de!factores!de! transcripción!como!NFZ!κВ!(nuclear,factor,kappa'light'chain'enhancer,of,activated,B,cells)! [114,115]!Por!otra!parte,!varios!trabajos!usando!modelos!in,vitro!describen!la!inducción!y! actividad!de!HBD2!en!contexto!de!infecciones!bacterianas!como!p.ej.!Streptococcus, INTRODUCCIÓN! ! ! 19 pneumoniae,!Streptococcus,agalactiae,!Pseudomonas!aeruginosa!y!Klebsiella,pneumoniae,! gérmenes!todos!muy!relevantes!en!la!edad!neonatal![116Z118].!Además,!se!ha!demostrado! que!en!los!pacientes!sépticos,!tanto!en!la!edad!adulta![111]!como!en!la!edad!pediátrica! [119],!los!niveles!plasmáticos!de!HBD2!se!halla!significativamente!más!elevados,!y!también! que!existe!una!disminución!de!la!capacidad!de!inducción!in,vitro!de!mRNA!HBD2.!Esto!lleva! a!postular!que!un!déficit!de!HBD2!aumentaría!la!predisposición!individual!a!sufrir!de! infecciones!graves.! En!la!edad!neonatal,!los!péptidos!antimicrobianos!se!han!descrito!en!diferentes!tejidos!y!en! diversos! contextos! clínicos.! A! nivel! pulmonar,! en! aspirados! traqueales! de! neonatos! pretérminos,! se! han! encontrado! concentraciones! basales! bajas! de! HBD! 1Z3! y! LLZ37,! y! probablemente! esta! característica! aumenta! el! riesgo! de! una! infección! pulmonar! precoz! [120].!En!cambio!se!ha!descrito!una!regulación!positiva!de!la!concentración!de!HBD!y!LLZ37! en!caso!de!ventilación!mecánica,!neumonía!o!infección!sistémica![121,122].! ! En!el!tracto!gastrointestinal!el!papel!de!las!beta!defensinas!sigue!siendo!controvertido.!Por! un!lado!existen!datos!mostrando!niveles!menores!de!estos!péptidos!antimicrobianos!en!los! niños!prematuros!en!comparación!con!neonatos!a!término,!lo!que!en!parte!podría!explicar! el! elevado! riesgo! de! esta! población! de! sufrir! complicaciones! como! la! enterocolitis! necrotizante![123].!En!cambio,!un!trabajo!reciente!realizado!en!recién!nacidos!ha!analizado! los!niveles!de!HBD2!en!el!meconio!en!función!de!la!edad!gestacional!y!la!patología!intestinal,! incluyendo! la! enterocolitis! necrotizante! y! el! modo! de! alimentación,! sin! hallar! relación! significativa![124].! Determinando! los! niveles! de! LLZ37,! un! péptido! antimicrobiano,! en! muestras! de! sangre! obtenidas!del!cordón!umbilical,!se!han!detectado!correlaciones!con!los!niveles!hallados!en! sangre!materna!en!el!momento!del!parto![125].!Del!mismo!modo,!se!ha!demostrado!que!de! forma!general!aumentan!los!péptidos!antimicrobianos!con!la!edad!gestacional![68,69,85].!La! Figura!7!demuestra!como,!de!forma!progresiva,!los!niveles!de!los!péptidos!antimicrobianos! (BPI,!Calprotectina,!LLZ37,!sPLA2!y!HNP1Z3)!aumentan!según!la!edad!gestacional!aunque!sin! alcanzar!los!niveles!de!adultos.!Es!interesante!resaltar!la!evolución!de!los!niveles!de!BPI!y! Calprotectina,! puesto! que! no! siguen! estrictamente! este! patrón! progresivo! [69,85].! En! la! actualidad!no!se!dispone!de!datos!sobre!el!comportamiento!de!!los!HBD2!en!este!sentido.! ! INTRODUCCIÓN! ! ! 20 ! ! ! BPI Calprotectina LL-37 sPLA2 HNP 1-3 < 30 semanas 30-33 semanas 37-42 semanas Madre Porcentaje de los niveles maternos 0 25 100 50 75 ! Figura!7.!Niveles!de!APPs!en!suero!en!neonatos!preterminos,!términos!en!relación!con! niveles!hallados!a!nivel!materno.!BPI:,proteina'bactericida'incrementadora'de'la' permeabilidad;,LL'37:,catelicidina,LL'37;,sPLA2:,Fospholipasa,A2,soluble;,HNP:,,péptido, neutrofílico,humano![85].!! ! Hasta!la!fecha!se!desconocen!los!niveles!fisiológicos!y!patológicos!de!la!HBD2!en!suero!o! plasma!en!la!población!neonatal.!De!momento!todos!los!valores!!de!referencia!a!nivel! sanguíneo!provienen!de!estudios!realizados!en!adultos!![111,119].!En!la!Figura!8!A!se! pueden!observar!los!resultados!obtenidos!de!un!estudio!realizado!en!voluntarios!adultos! sanos,!pacientes!críticamente!enfermos!sin!sepsis,!y!pacientes!sépticos!en!una!unidad!de! cuidados!intensivos,!hallando!niveles!de!HBD2!en!plasma!de!339!pg/ml,!295!pg/ml!y!541! pg/ml,!!respectivamente![111].!Los!niveles!de!HBD2!en!plasma!encontrados!en!otro!trabajo! fueron!más!bajos!con!valores!de!47,6!pg/ml!en!adultos!sanos!y!167,6!pg/ml!en!adultos!con! una!patólogia!pulmonar!determinada![110].!Estos!datos!son!probablemente!un!reflejo!de!las! diferentes!metodologías!empleadas!pero!también!demuestran!el!posible!papel!de!este! péptido!antimicrobiano!en!los!estados!clínicos!de!inflamación!!e!infección.! INTRODUCCIÓN! ! ! 21 ! !" #" ! Figura!8:!Estudios!realizados!en!adultos!con!determinación!de!niveles!plasmáticos.!A)! Voluntarios!sanos!y!pacientes!precisando!cuidados!intensivos!con!y!sin!sepsis;!B)!Voluntarios! sanos!y!pacientes!con!broncodisplasia!pulmonar.!HBD2:,human,beta,defensin,2;,HV:, voluntarios,sanos;,DPB:,panbronquiolitis,diffusa,[110;111].! ! En!este!contexto,!ante!el!cada!vez!más!evidente!incremento!de!gérmenes!multiresistentes,! es!un!dato!prometedor!que!estos!péptidos!conserven!su!actividad!antimicrobiana,!incluso! frente!microorganismos!resistentes!a!múltiples!tratamientos!antibióticos!habituales! [118,126].!! En!esta!tesis!doctoral!se!evaluará!en!más!profundidad!a!la!beta!defensina!humana!2!(HBD2)! y!se!estudiarán!los!niveles!de!esta!molécula!en!el!periodo!neonatal!en!diferentes!ámbitos! clínicos,!analizando!sus!posibles!relaciones!con!determinadas!variables!demográficas,!! clínicas!y!analíticas.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN! ! ! 22 ! ! 1.5!LA!LECTINA!DE!UNIÓN!A!LA!MANOSA!(MBL)! ! Dentro!de!la!respuesta!inmune!innata,!la!lectina!de!unión!a!manosa!(MBL)!representa!un! factor!importante,!ya!que!varios!trabajos!han!relacionado!niveles!bajos!de!dicha!proteína! con!un!aumento!en!la!susceptibilidad!a!infecciones!en!neonatos!prematuros![87Z89].!! La!MBL!es!producida!en!el!hígado!y!forma!parte!de!la!vía!de!las!lectinas.!Esta!vía!se!activa!a! través! del! reconocimiento! de! carbohidratos,! manosa,! NZacetil! glucosamina! y! residuos! de! fucosa!y!glucosa!presentes!comúnmente!en!las!membranas!de!los!microorganismos![127Z 131].! La!MBL!reconoce!estas!moléculas!en!la!superficie!de!un!amplio!rango!de!microorganismos! clínicamente! relevantes! [128,129,131],! facilitando! así! la! fagocitosis! de! patógenos.! Otro! mecanismo!de!acción!de!la!MBL!es!la!iniciación!de!la!cascada!del!complemento!sin!precisar! la!presencia!de!anticuerpos![132].!Los!mecanismos!de!acción!mas!relavantes!se!muestran!en! la!Figura!9.!! !" #" ! Figura!9!modificado!de![134,135]:!(A)!Visión!simplificada!del!sistema!de!complemento.!Se! muestran!las!cascadas!de!las!tres!vía!de!complemento.!La!vía!clásica,!la!vía!de!las!lectinas!y! la!vía!alternativa.!La!vía!de!lectinas!incluye!la!MBL,!las!Ficolinas,!y!las!MASP!que!interactúan! con! las! la! vía! alternativa! y! la! vía! clásica.! (B)! Se! muestran! los! diferentes! mecanismos! de! acción! de! la! MBL,! especialmente! su! función! antimicrobiana! opsonizando! a! los! microorganismos! susceptibles,! induciendo! la! activación! e! interacción! con! componentes! INTRODUCCIÓN! ! ! 23 principales!de!las!vías!de!complemento!para!formar!finalmente!el!complejo!de!ataque!de! membranas.!! B:, Factor, B;, D:, Factor, D;, MAC:, complejo, ataque, membrana;, MASP:, serina'proteasas, asociadas, a, la, proteína, de, unión, a, la, manosa;, MBL:, Léctina, de, unión, a, la, manosa;, IgG:, Inmunoglobulina,G., ! Los!niveles!de!MBL!se!hallan!determinados!genéticamente,![134,136]!y!se!correlacionan!con! variaciones!genéticas!tanto! en!regiones!estructurales!como! del!promotor!del!gen! MBLZ2,! [137].!Tres!polimorfismos!de!un!solo!nucleótido!en!los!codones!52,!54!y!57!(variantes!D,!B!y! C,! respectivamente)! en! el! exón! 1! del! gen! MBLZ2,! dan! lugar! a! una! reducción! de! la! concentración!plasmática!de!esta!proteína.!Polimorfismos!en!el!promotor!del!gen!MBLZ2!en! las!regiones!221!(variantes!X/Y)!y!550!(variantes!H/L),!también!modulan!las!concentraciones! de!MBL!circulantes,![138,139].!En!la!Figura!10!se!representa!el!gen!MBL2,,su!polipeptido! resultante! y! también! el! producto! final! que! se! halla! en! plasma.! La! forma! de! MBL! que! se! encuentra! con! más! frecuencia! en! el! plasma! de! humanos! es! una! combinación! de! cuatro! subunidades!de!MBL!que!forman!una!unidad!tetramérica![135].!! !! ! ! INTRODUCCIÓN! ! ! 24 Figura!10!modificado!de![135]:!La!estructura! del!gen!MBL2!y!de!la!Lectina!de! unión!a!la! manosa.! De! arriba! hacia! abajo! se! hallan! la! estructura! del! gen! MBL2! con! su! polipéptido! correspondiente!que!consiste!de!cuatro!regiones.!En!la!parte!inferior!de!la!figura!se!muestra! la! forma! oligomérica! predominante! de! MBL! que! contiene! cuatro! subunidades! de! triple! hélices!de!polipéptidos!de!MBL.! MBL:,Lectina,de,unión,a,la,manosa;,CRD:,dominio,rico,en,cisteína;,Kd:,kilodalton., ! Variantes! genotípicas! del! gen! MBLZ2! asociadas! a! niveles! séricos! muy! reducidos! ! de! esta! proteína!(<!400!ng/ml)!se!pueden!encontrar!en!aproximadamente!el!12!%!de!la!población! europea! [136,138,139].! Los! niveles! de! MBL! muestran! una! notable! variabilidad! interindividual,! existiendo! una! fuerte! correlación! entre! el! genotipo! y! el! fenotipo.! Sin! embargo!existen!todavía!dudas!sobre!la!variabilidad!de!la!MBL!a!nivel!intraindividual.!Varios! trabajos!han!!asociado!las!deficiencias!de!MBL!con!una!mayor!susceptibilidad!a!infecciones,! especialmente! en! situaciones! de! inmunosupresión,! como! ocurre! en! los! ! pacientes! oncológicos!y!neonatos!prematuros![87Z89,140Z142].! Debe!destacarse!en!este!último!grupo,!que!los!niveles!reducidos!de!MBL!dependen!de!la! propia!prematuridad!además!del!genotipo![88].!A!este!respecto,!se!ha!demostrado!que!la! proporción! de! neonatos! con! niveles! de! MBL! menor! de! 400! ng/ml! es! el! doble! de! la! encontrada!en!otra!edades!de!la!vida,!y!que!esto!se!debe!a!que!pacientes!heterocigotos! pueden! presentar! cifras! inusualmente! bajas! de! forma! fisiológica! durante! el! periodo! neonatal![87,88].!Es!interesante!mencionar!que!un!trabajo!reciente!cuestiona!el!impacto!del! genotipo!sobre!los!niveles!séricos!de!MBL!en!una!cohorte!amplia!de!neonatos![143].,, Solamente!un!pequeño!número!de!estudios!han!analizado!muy!recientemente!el!papel!de!la! MBL! en! el! ámbito! neonatal,! y! estas! investigaciones! se! han! desarrollado! en! poblaciones! diferentes! a! las! que! en! esta! tesis! se! pretende! estudiar,! evaluando! sus! niveles! de! forma! puntual,! no! seriada! [87Z89,143].! Frakking, et, al.! Demostraron! en! un! grupo! de! neonatos! pretérminos!una!asociación!entre!niveles!bajos!de!MBL!y!la!presentación!durante!el!primer! mes! de! vida! de! sepsis! y! neumonía! [89].! Con! posterioridad! se! han! corroborado! estos! hallazgos! en! estudios! realizadas! en! Reino! Unido! y! Polonia,! estableciendo! que! un! peso! inferior! a! 1000! gramos! o! una! edad! gestacional! menor! de! 28! semanas! eran! factores! asociados!a!niveles!reducidos!de!MBL![87,88].! INTRODUCCIÓN! ! ! 25 La!importancia!de!conocer!posibles!asociaciones!entre!la!deficiencia!de!MBL,!el!riesgo!de! padecer!infecciones!y/o!una!respuesta!lenta!al!tratamiento!con!antibióticos!en!el!periodo! neonatal,!viene!dada!por!la!disponibilidad!de!una!terapia!de!reemplazo!con!MBL!(ensayo! clínico;! fase! II)! [144].! Esta! terapia! abre! nuevas! vías! para! el! tratamiento! de! los! procesos! infecciosos!en!esta!población!tan!desfavorecida,!de!tal!manera!que!permitirían!en!un!futuro! aumentar!la!supervivencia!y/o!disminuir!la!tasa!de!secuelas!en!esta!población.!! Además,!en!este!escenario!resultaría!muy!recomendable!conocer!la!capacidad!de!regulación! positiva! durante! los! procesos! infecciosos.! Este! último! aspecto! posibilitaría! no! solamente! conocer! con! mayor! profundidad! el! funcionamiento! de! la! MBL! durante! los! procesos! infecciosos!neonatales,!sino!valorar!el!posible!papel!de!las!determinaciones!de!MBL!como! marcador!de!infecciones,!el!momento!adecuado!para!una!posible!terapia!de!reemplazo!con! MBL,!la!necesidad!de!un!tratamiento!empírico!antimicrobiano,!así!como!su!duración.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! II.!HIPÓTESIS!Y!OBJETIVOS! MÉTODOS! 33 ! Neonatos!nacidos!en!el!periodo!de!estudio!con!una!edad!gestacional!menor!de!32!semanas! y/o! un! peso! al! nacer! menor! de! 1500! gramos! con! sospecha! de! sepsis! nosocomial! en! los! primeros!30!días!de!vida!y!cuyos!padres!hayan!otorgado!previamente!su!consentimiento.!! ! Proyecto!2<!Criterios!de!exclusión:! ! Presencia!de!malformaciones!mayores,!por!motivos!éticos!o!rechazo!de!participación!en!el! estudio!por!parte!de!los!tutores!legales.! ! ! 3.5!Recogida!de!variables!epidemiológicas!y!clínicas:! ! Proyecto!1:! Se! realizó! la! recogida! de! los! datos! epidemiológicos! y! clínicos! de! forma! retrospectiva! utilizando! el! sistema! informático! del! hospital! (SIDCA).! Se! recogieron! y! analizaron! las! siguientes!variables:!! 1 Edad!materna!(años)! 2 Tipo!de!finalización!del!parto!(natural,!instrumentado,!cesárea)! 3 Edad!gestacional!(semanas)! 4 Sexo! 5 Peso!al!nacimiento!(gramos)! 6 Peso!de!la!placenta!(gramos)! 7 Incidencia! de! patologías! de! embarazo! como! diabetes! mellitus! gestacional,! hipertensión! arterial,!amenaza!de!parto!prematuro! 8 Valoración!de!la!escala!Apgar!a!los!5!minutos!de!vida!y/o!intubación!orotraqueal!! 9 Administración!de!esteroides!y!antibióticos!antenatales! 10 Presencia!de!corioamnionitis!histopatológica! 11 Niveles!séricos!de!HBD2!(pg/ml)!en!suero!de!cordón!umbilical! 12 Valores!de!PCR!(mg/L)!y!recuento!de!neutrófilos!(células/mm³)!en!primeras!24!horas!de!vida! MÉTODOS! 34 (pretérminos)! 13 Presencia!de!sepsis!tardía!(pretérminos)! 14 Necesidad! de! ventilación! mecánica! convencional! mayor! de! 24! horas;! necesidad! de! ventilación!a!alta!frecuencia!(pretérminos).! 15 Mortalidad!neonatal!(pretérminos).! ! Proyecto!2:! Todos!los!pacientes!incluidos!en!el!estudio!fueron!seguidos!longitudinalmente!hasta!los!30! días! de! vida.! Aparte! de! las! variables! demográficas! detalladas! para! el! proyecto! 1! ! se! recogieron!las!siguientes!variables:! 16 Microorganismos!identificados!en!hemocultivo! 17 Incidencia!de!sepsis!(No/sepsis!confirmada/sepsis!clínica!o!presunción!de!sepsis)! 18 Valores!de!HBD2!y!MBL!determinados!en!los!días!1!(día!sospecha!de!sepsis),!4!y!7.! 19 Variables!analíticas!y!clínicas!necesarias!para!el!diagnóstico!de!sepsis! ! Definición!de!la!variable!sepsis!y!de!sus!categorías![36,37]:!! Sepsis!confirmada:!! Presencia! de! al! menos! dos! síntomas! clínicos! y/o! biológicos! sugestivos! de! infección! con! aislamiento!de!microorganismo(s)!en!hemocultivo.!! Sepsis!clínica!o!presunción!de!sepsis:!! Los! neonatos! con! evidencia! clínica! y/o! de! laboratorio! de! infección! con! resultados! microbiológicos!negativos.! ! Se!consideraron!los!siguientes!signos!clínicos!como!sugestivos!para!un!proceso!séptico:! (1)!Inestabilidad!térmica!(<37ºC!o!>38,5ºC)! (2)!Dificultad! respiratoria:! disnea,! taquipnea! mayor! de! 60! resp/min,! apnea,! necesidad! de! ventilación!asistida!y/o!aumento!en!los!requerimientos!de!oxígeno.! (3)!Disfunción!cardiovascular:!taquicardia!(>160!latidos/min),!bradicardia!(<100!latidos/min),! disminución!del!relleno!capilar,!hipotensión!(presión!arterial!sistólica!<40!mmHg),!necesidad! de!asistencia!vasopresora!o!medicación!inotrópica!! (4)!Irregularidades!neurológicas!como!hipotonía,!letargia,!irritabilidad.! MÉTODOS! 35 (5)!Problemas!gastrointestinales:!vómitos,!intolerancias!o!distensión!abdominal.!! Las! anormalidades! de! laboratorio! incluyen! leucopenia! (<5000! cél/mm3)! o! leucocitosis! (>20.000!cél/mm3),!recuento!plaquetario!bajo!(<100.000!cél/mm3),!niveles!de!proteínaZC! reactiva!!(>!10mg/L,!o!acidosis!metabólica.! ! 3.6!Obtención,!procesamiento!y!análisis!de!muestras!de!placenta! ! Las! placentas! se! fijaron! inmediatamente! después! del! parto! en! una! solución! neutra! de! formol.!Se!tomaron!muestras!para!el!estudio!histológico!del!borde!de!las!membranas!en!el! lugar!de!su!rotura,!de!los!extremos!fetal!y!maternal!y!de!la!inserción!del!cordón;!muestras! en!su!caso!representativas!del!punto!que!macroscópicamente!se!valore!como!patológico.! Para!la!evaluación!histológica,!se!prepararon!bloques!de!parafina!de!los!que!se!realizaron! cortes! de! 5µm! teñidos! con! hematoxilinaZeosina.! Se! procedió! a! realizar! una! lectura! histopatológica!sistematizada,!valorando!el!infiltrado!de!polimorfonucleares!como!indicativo! de! corioamnionitis! y! los! posibles! defectos! en! la! perfusión,! tales! como! villis! con! escasa! vascularización,! aumento! del! volumen! intervilloso! y! disminución! del! lecho! capilar! villoso! total! [145].! Todos! los! estudios! histológicos! se! realizaron! por! dos! investigadores! independientes!y!sin!conocimiento!previo!de!los!detalles!clínicos.! ! ! 3.7!Obtención!y!procesamiento!de!las!muestras:! ! Sangre!del!cordón!umbilical!! La! determinación! de! los! niveles! de! HBD2! se! realizó! a! partir! de! muestras! de! suero.! Las! muestras! de! sangre! de! cordón! se! extrajeron! inmediatamente! después! de! proceder! a! su! ligadura!y!depositándolas!en!vacutainers!para!bioquímica.!Las!muestras!se!centrifugaron!a! 4°C!a!3.200!r.p.m!durante!10!minutos!y!se!almacenaron!en!un!congelador!a!Z80°C.! ! Extracción!sanguínea!durante!la!sospecha!de!sepsis! MÉTODOS! 36 Aprovechando! las! extracciones! sanguíneas! realizadas! de! forma! rutinaria! en! la! práctica! clínica!el!día!de!la!sospecha!de!sepsis!(día!1)!y!a!ser!posible!en!dos!momentos!posteriores! (día!4!y!día!7),!se!obtuvieron!500!μl!de!sangre!para!determinación!de!niveles!de!MBL!y!βZ defensina!2.!!Las!muestras!se!almacenaron!hasta!su!procesamiento!a!4ºC.!Durante!el!mismo! día! o! el! día! posterior! a! su! extracción! se! centrifugaron! a! 4°C! a! 3.200! r.p.m! durante! 10! minutos!y!se!almacenaron!en!un!congelador!a!Z20°C!hasta!la!realización!de!la!determinación! de!MBL!y!HBD2.! ! 3.8!Análisis!de!estabilidad!del!péptido!HBD2! En!la!primera!fase!de!la!tesis!se!realizó!un!experimento!para!comprobar!la!estabilidad!del! péptido! HBD2! en! sangre! total! obtenido! del! cordón! umbilical.!Para! este! fin! se! recogieron! muestras!de!sangre!umbilical!de!un!recién!nacido!a!termino!y!se!procesaron!las!muestras!en! cinco!momentos!diferentes:!de!forma!inmediata,!a!las!dos!horas,!a!las!12!horas,!a!las!24! horas!y!a!las!48!horas.!Del!mismo!modo!se!comprobó!el!efecto!de!añadir!un!inhibidor!de! proteínasa! Aprotinina!(SigmaZAldrich,! St.! Louis,! MO,! USA,! 500KIU/ml;! dilución! 1:10)! a! las! muestras!extraídas.! Posteriormente! se! determinaron! las!concentraciones! de! HBD2! en! las! muestras!procesadas!con!y!sin!adición!del!inhibidor!de!proteinasa.! ! 3.9!Cuantificación!de!niveles!de!HBD2! La! cuantificación! de! los! niveles! de! HBD2! en! suero! se! realizó! mediante! técnica! de! ELISA! (Enzyme'Linked, ImmunoSorbent, Assay),!empleando! el!kit!comercial!βZdefensin!2,!Human,! ELISA!Kit,!EKZ072Z37!(Phoenix!Pharmaceuticals,!Inc,!Burlingame,!CA).!! Los! reactivos! se! atemperaron! antes! de! realizar! el! ensayo.! A! continuación,! los! pocillos! se! lavaron!con!300!µl!de!tampón!de!ensayo.!Se!añadieron!las!muestras!de!suero!diluidas!en! relación!1:10!en!tampón!de!ensayo!por!duplicado!en!los!pocillos!designados,!así!como!los! estándares!de!cuantificación.!La!placa!se!selló!y!se!incubó!durante!2!horas!a!temperatura! ambiente! con! agitación.! A! continuación,! los! pocillos! se! lavaron! 4! veces! con! 300! µl! de! tampón!de!ensayo!y!se!añadieron!a!cada!pocillo!100!µl!de!antiZβZdefensina!2!biotinilado!y!se! incubó!la!placa!durante!2!horas!a!temperatura!ambiente!con!agitación.!Seguidamente,!los! MÉTODOS! 37 pocillos!se!lavaron!4!veces!con!300!µl!de!tampón!de!ensayo!y!se!añadieron!a!cada!pocillo! 100! µl! de! estreptavidina! peroxidasa! (SAZHRP)! y! se! incubó! la! placa! durante! 30! minutos! a! temperatura!ambiente!con!agitación!continua.!Los!pocillos!se!lavaron!cuatro!veces!con!300! µl!de!tampón!de!ensayo!y!se!añadieron!a!cada!pocillo!100!µl!de!solución!de!sustrato!(TMB)! incubando! la! placa! durante! 20Z30! minutos! a! temperatura! ambiente! con! agitación.! Se! añadieron!a!cada!pocillo!100!µl!de!solución!de!parada!(ClH!2N)!y!se!leyó!la!absorbancia!en! un!lector!de!placas!a!450nm!(ThermoScientific,!Multiscan!Go,!Winooski,!VT).!Los!resultados! mostrados!corresponden!a!la!media!de!densidad!óptica!(OD)!por!duplicados.!El!cálculo!de! los! resultados! se! realizó! empleando! el! programa! informático! KaleidaGraph! (v.3.0.2,! Abelbeck!Software).!! ! 3.10!Determinación!de!los!niveles!séricos!de!MBL:! ! La! cuantificación! de! los! niveles! de! MBL! en! suero! se! realizó! mediante! técnica! de! ELISA! (Enzyme'Linked,ImmunoSorbent,Assay),!empleando!el!kit!comercial!MBL!oligomer!ELISA!kitZ 029!(BIOPORTO,!Gentofte,!Denmark).!! Los! reactivos! se! atemperaron! antes! de! realizar! el! ensayo.! Se! añadieron! 100! µl! de! las! muestras!de!suero! diluidas! en!relación!1:150!en!tampón!de!ensayo! por!duplicado!en!los! pocillos!designados,!así!como!los!estándares!de!cuantificación.!La!placa!se!selló!y!se!incubó! durante! 1! hora! a! temperatura! ambiente! con! agitación.! A! continuación,! los! pocillos! se! lavaron!3!veces!con!300!µl!de!solución!de!lavado!y!se!añadieron!a!cada!pocillo!100!µl!de! antiZMBL! biotinilado! y! se! incubó! la! placa! durante! 1! hora! a! temperatura! ambiente! con! agitación.!Seguidamente,!los!pocillos!se!lavaron!3!veces!con!300!µl!de!solución!de!lavado!de! ensayo! y! se! añadieron! a! cada! pocillo! 100! µl! de! estreptavidina! peroxidasa! (SAZHRP)! y! se! incubó!la!placa!durante!1!hora!a!temperatura!ambiente!con!agitación!continua.!Los!pocillos! se!lavaron!3!veces!con!300!µl!de!solución!de!lavado!y!se!añadieron!a!cada!pocillo!100!µl!de! solución!de!sustrato!(TMB)!incubando!la!placa!durante!15!minutos!a!temperatura!ambiente! con!agitación.!Se!añadieron!a!cada!pocillo!100!µl!de!solución!de!parada!(ClH!2N)!y!se!leyó!la! absorbancia! en! un! lector! de! placas! a! 450nm! (BioZTek! instruments,! Winooski,! VT).! Los! resultados!enseñados!corresponden!a!la!media!de!densidad!óptica!(OD)!por!duplicados.!El! MÉTODOS! 38 cálculo! de! los! resultados! se! realizó! empleando! el! programa! informático! KaleidaGraph! (v.3.0.2,!Abelbeck!Software).!! ! 3.11!Análisis!de!datos! En!el!grupo!de!los!recién!nácidos!prematuros!se!categorizaron!variables!cuantitativas!de!la! siguiente! manera:! Peso! al! nacimiento:! menor! de! 1000! gramos! y! mayor! o! igual! de! 1000! gramos!y!la!edad!gestacional!menor!de!28!semanas!o!!mayor!o!igual!de!28!semanas.!! Para!facilitar!el!análisis!de!los!datos,!se!ha!realizado!su!adecuada!tabulación!y!recogida!de! los!mismos!en!base!de!datos!informatizada.!Se!realizó!un!análisis!descriptivo!y!analítico.!Se! expresaron!los!resultados!de!las!variables!cuantitativas!de!los!diferentes!subgrupos!como! media! con! su! desviación! estándar! correspondiente! y! la! mediana! incluyendo! los! rangos! intercuartílicos!(percentil!25!y!percentil!75).!! En!el!proyecto!1!se!realizó!una!transformación!logarítmica!de!la!variable!HBD2!con!el!fin!de! controlar!la!variabilidad!interna!de!esta!variable.!Las!variables!con!asociación!significativa!o! con!relevancia!conocida! para! la!variable!resultado,!fueron!introducidas!en!un! modelo! de! regresión! logística.! Odds! ratio! (OR)! e! intervalo! de! confianza! de! 95%! fueron! calculados! usando! el! método! de! bootstrap! (para! 1000! muestras).! Para! comprobar! la! capacidad! predictiva! del! modelo! se! realizó! el! calculo! del! área! debajo! de! la! curva! (AUC),! con! sensibilidad,!especificidad,!valor!predictivo!positivo!y!negativo!y!el!índice!de!Youden.! Para!el!análisis!de!correlaciones!entre!las!variables!continuas!se!realizó!el!test!de!correlación! de!Pearson!o!el!Spearman!dependiendo!de!la!distribución!de!las!variables!analizadas!y!se! calcularon!los!coeficientes!de!correlación!correspondientes!(r:,Pearson,,Rho:,Spearman).,Se! utilizó! el! test! de! U'Mann'Whitney, para! las! variables! continuas,! y! el! χ2,para! las! variables! categóricas.!! Para!todos!los!cálculos!realizados!se!asumió!la!hipótesis!bilateral!y!se!consideró!un!error!alfa! de! menos! de! 0.05! como! estadísticamente! significativo.! Se! utilizaron! para! los! análisis! la! versión!19.0!del!programa!estadístico!SPSS!(SPSS!Inc,!Chicago,!IL,!USA)!y!el!programa!Graph! Pad!Prisms!(GraphPad!Software,!Inc.!San!Diego,!CA,!USA)!!en!la!versión!5.0! ! MÉTODOS! 39 3.12!Aspectos!éticos! ! Todos!los!trabajos!realizados!contaron!con!la!aprobación!del!comité!ético!del!H.U.!Virgen! del!Rocío!y!se!respetaron!las!normas!de!la!Declaración!de!Helsinki!para!seres!humanos.!De! los! individuos! incluidos! se! obtuvo! el! consentimiento! informado! firmado! por! los! tutores! legales.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! IV.!RESULTADOS! RESULTADOS! 41 IV.!RESULTADOS! ! ESTABILIDAD!Y!CARACTERÍSTICAS!DE!LAS!BETA!DEFENSINA!HUMANA!EN! MUESTRAS!DE!SUERO! ! Como!primer!objetivo!mardcado!se!recogieron!muestras!de!sangre!de!cordón!de!un!recién! nacido!a!término!con!el!fin!de!determinar!su!estabilidad!en!el!tiempo!antes!de!procesar!la! muestra!sanguínea,!y!de!un!modo!similar!evaluar!la!necesidad!de!añadir!un!inhibidor!de! proteinasa!(dilución!1:10).!En!la!Figura!11!se!observa!que!no!se!hallaron!diferencias!en!los! niveles! de! HBD2! en! suero! al! procesar! las! muestras! con! o! sin! el! inhibidor! de! proteinasa! Aprotinina.!! ! !" #!!" $!!!" $#!!" %!!!" %#!!" &!!!" !'" %'" $%'" %('" ()'" *+,"-./01,+,2" 30,"-./01,+,2" !"#$%#&'($)*#+,%+-./0+1234567+ 8)%52"+9(:&(+2'"$%:(5)%#&"+19"'(:7+ ! Figura!11:!Efecto!del!tiempo!de!procesamiento!e!inhibidores!de!proteinasa!sobre!los!niveles!de!HBD2!en!suero.!HBD2:! human,beta,defensin2,!h:!horas, ! ! De!un!modo!similar,!se!analizaron!muestras!de!suero!y!plasma!obtenidos!del!cordón!umbilical!de! cuadro!neonatos!diferentes!para!conocer!las!posibles!diferencias!entre!los!niveles!de!HBD2!en! suero!y!plasma.!Se!hallaron!valores!más!elevados!en!suero!en!comparación!con!el!plasma!(589!vs! 421!pg/ml)!aunque!sin!alcanzar!diferencias!estadísticamente!significativas!(p=0.068).! RESULTADOS! 42 PROYECTO!1! DESCRIPCIÓN!DE!LA!POBLACIÓN! En! la! primera! parte! de! la! tesis! se! presentan! los! datos! procedentes! del! estudio! retrospectivo! analizando! muestras! de! sangre! de! cordón! umbilical! en! recién! nacidos! prematuros! (n=31),! neonatos!nacidos!a!término!(n=42)!y!muestras!obtenidas!de!voluntarios!adultos!sanos!(n=7).!! ! ! RN! preterminos! (n=31)! RN! a! término! (n=42)! Valor!p! ! Edad!gestacional!(semanas)! 30!(RIQ!29Z31)! 39!(RIQ!38Z40)! <!0,001! Peso!al!nacer!(gramos)! 1298!(DS!338,4)! 3247!(DS!378,2)! <!0,001! Sexo!(n,!%)! Z Mujer! Z Varón! ! 11!(35,5%)! 20!(64,5%)! ! 28!(66,7%)! 14!(33,3%)! ! 0,008! Edad!materna!(años)! 32!(29Z34)! 30,5!(22,7Z35,2)! 0,151! Finalización!embarazo!(n,!%)! Z Eutócico! Z Instrumentado! Z Cesárea! ! 9!(29%)! 0!(0,0%)! 22!(71%)! ! 27!(64,3%)! 10!(23,8%)! 5!(11,9%)! <!0,001! Tabla!3:!Comparación!de!datos!demográficos!y!clínicos!entre!los!grupos!según!edad!gestacional.!RIQ:!rango,intercuartíl,! DS:!desviación,estándar,,RN:!recién,nacidos., ! En! la! Tabla! 3! se! presentan! características! seleccionadas! de! los! dos! grupos! en! estudio.! Se!! identificaron! diferencias! significativas! comparando! las! variables:! “Sexo”! y! “modo! de! finalización!del!parto”.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! RESULTADOS! 49 ! VARIABILIDAD!DE!LOS!NIVELES!DE!LA!BETA!DEFENSINA!HUMANA!2! (HBD2)!Y!DE!LA!LÉCTINA!DE!LA!UNIÓN!A!LA!MANOSA!(MBL)!DURANTE!LA! SOSPECHA!DE!UN!EPISODIO!SÉPTICO! ! Los! niveles! de! HBD2! y! MBL,! cuando! se! sospechó! el! proceso! infeccioso,! se! determinaron!los!días!0,!4!y!7!desde!el!inicio!(Tabla!10!y!11).!! ! Tabla!10:!Niveles!de!HBD2!en!diferentes!momentos!de!extracción!en!la!población!general.!HBD2:!human,beta, defensin,2;,DS:!desviación,estándar;,RIQ:,rango,intercuartíl., ! ! Tabla!11:!!Niveles!de!MBL!en!diferentes!momentos!de!extracción!en!la!población!general.!MBL:!mannose,binding, lectin;,DS:!desviación,estándar;,RIQ:!rango,intercuartil., , , No! se! hallaron! diferencias! significativas! entre! los! niveles! de! HBD2! y! MBL! en! los! diferentes!momentos!de!recogida.!! Niveles!de!HBD2!(pg/ml)!población!general! !! Día!0! Día!4! Día!7! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! 8562!(±!11263)! 7372!(±!6155)! 7202!(±!6256)! 5940!(2598Z9490)! 5839!(3094Z9787)! 5645!(3078Z9402)! Niveles!de!MBL!(ng/ml)!población!general! ! Día!0! Día!4!! Día!7! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! 1680!(±!1583)! 1904!(±!1623)! 1745!(±!1523)! 1512!(95Z2915)! 2041!(216Z3045)! 1441!(258Z3002)! RESULTADOS! 50 NIVELES!DE!LA!BETA!DEFENSINA!HUMANA!EN!RELACIÓN!CON!LAS!VARIABLES! EDAD!GESTACIONAL!Y!PESO!AL!NACER! ! Los!niveles!de!HBD2!mostraron!una!correlación!negativa!con!la!edad!gestacional!en!el! momento!de!sospecha!de!sepsis!(Tabla!12!y!Figura!13).!! COEFICIENTE DE CORRELACIÓN VALOR P DÍA 0 Rho: -0,417 p< 0,001 DÍA 4 Rho: -0,567 p< 0,001 DÍA 7 Rho: -0,395 p= 0,002 MEDIA Rho: -0,314 p= 0,004 !"#$%&'()*+,% -./.%(012/3456/+%&1,% ! Tabla!12:!Correlaciones!entre!la!edad!gestacional!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de! extracción.!HBD2:!human,beta,defensin,2;,s:!semanas.,Rho:!Rho,de,Spearman, , ! !"#$%&'()*+% ,$%'(''+% !"#$%&'()*%+,-.&/0% 1(*(%-'23*4)56*/%+2'&*6*20% ! Figura!13:!Correlación!entre!la!edad!gestacional!y!la!media!de!los!niveles!de!HBD2!en!suero!obtenido!los!días!0,!4! y!7!de!sospecha!de!sepsis!nosocomial.!HBD2:!human!beta!defensin!2;!Rho:!Rho,de,Spearman.!! ! RESULTADOS! 51 HBD2!Y!LA!EDAD!GESTACIONAL!DICOTOMIZADA:! ! En! este! análisis! se! calcularon! las! posibles! asociaciones! entre! la! variable! cuantitativa! continua!“niveles!de!HBD2!(pg/ml)”!y!la!variable!“edad!gestacional”!dicotomizada!(<!28! semanas!vs!≥!28!semanas).! En!la!muestra!estudiada!31!neonatos!(36,9%)!presentaron!una!edad!gestacional!menor! de!28!semanas!y!53!(63,1%)!una!edad!gestacional!mayor!o!igual!a!28!semanas.! Los!niveles!de!HBD2!en!suero!fueron!significativamente!más!elevados!en!neonatos!con! una!edad!gestacional!menor!de!28!semanas!(Tabla!13,!Figura!14).!! ! ! Niveles!de!HBD2!(pg/ml)!en!población!general! !! Día!0! <!28!semanas! ≥!28!semanas! Día!4! <!28!semanas! ≥!28!semanas! Día!7! <!28!semanas! ≥!28!semanas! Media!! <!28!semanas! ≥!28!semanas! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 11842!(±11844)! 6649!(±10569)! ! 11066!(±7662)! 5156!(±3626)! ! 8880!(±6368)! 6187!(±6046)! ! 10876!(±8877)! 6091(±5590)! ! 9422!(5302Z16944)! 3911!(1675Z7861)! ! 9397!(5274Z15298)! 5020!(1992Z7164)! ! 7899!(4169Z12986)! 4752!(2969Z8206)! ! !8894(5653Z13740! 5417!(1045Z6904)! ! 0,001! ! ! 0,001! ! ! 0,038! ! ! <0,001! Tabla!13:!Asociación!entre!la!variable!edad!gestacional!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos! de!extracción.!HBD2:!human,beta,defensin,2;,DS:!desviación,estándar;,RIQ:!rango,intercuartíl.,*Prueba!de!MannZ Whitney.! RESULTADOS! 52 !"#$%$$&# !"#$%&' !"#%(&' H B D 2 (p g /m l) < 2 8 > = 2 8 0 10000 20000 30000 40000 50000 )'*+',-./"/,' 0'*+',-./"/,' ! Figura!14:!Asociación!entre!las!variables!edad!gestacional!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos! de!extracción.!!HBD2:!human,beta,defensin,2.!! ! ! ! Se!observaron!resultados!similares!comparando!los!niveles!de!HBD2!en!suero!con!el! peso!al!nacer!en!esta!situación!clínica.!(Tabla!14,!Figura!14).!! COEFICIENTE DE CORRELACIÓN VALOR P DÍA 0 Rho: -0,165 p= 0,155 DÍA 4 Rho: -0,292 p= 0,019 DÍA 7 Rho: -0,243 p= 0,059 MEDIA Rho: -0,332 p= 0,002 !"#$%&'()*+,% -./0%1+%213.4%&(,% ! Tabla! 14:! Correlaciones! entre! el! peso! al! nacer! y!niveles! de! HBD2! en! suero! en! los! diferentes! momentos! de! extracción.!!HBD2:!human,beta,defensin,2;,g:!gramos;,Rho:!Rho,de,Spearman., ! RESULTADOS! 53 ! !"#$%$$&# !"#$%&'()*%+,-.&/0% 1'23%*/%4*5'6%+-6*&320% '()"#*$%++&# ! Figura!15:!!Correlación!entre!el!peso!al!nacer!y!la!media!de!los!niveles!de!HBD2!en!suero!obtenido!los!días!0,!4!y!7! de!sospecha!de!sepsis!nosocomial.!HBD2:!human!beta!defensin!2;!Rho:!Rho,de,Spearman., ! ! HBD2!Y!EL!PESO!AL!NACER!COMO!VARIABLE!DICOTOMIZADA:! ! En! este! análisis! se! calcularon! las! posibles! asociaciones! entre! la! variable! cuantitativa! continua!“niveles!de!HBD2!(pg/ml)”!y!la!variable!“Peso!al!nacer”!dicotomizada!(<!1000g! vs!≥!1000!g).! En!la!muestra!estudiada!44!neonatos!(52,4%)!presentaron!un!peso!al!nacer!menor!de!! 1000!g!y!40!(47,6%)!con!peso!mayor!o!igual!a!1000!g.! Los!neonatos!con!un!peso!al!nacer!menor!de!1000!g!presentaron!niveles!séricos!de! HBD2!significativamente! más! elevados! que! neonatos! con!un! peso! mayor! de! 1000! g! (Tabla!15,!Figura!16).! RESULTADOS! 54 ! Niveles!de!HBD2!(pg/ml)!población!general! !! Día!0! <!1000g! ≥!1000g! Día!4! <!1000g! ≥!1000g! Día!7! <!1000g! ≥!1000g! Media!! <!1000g! ≥!1000g! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 9487!(±10971)! 7587!(±11634)! ! 9096!(±7300)! 5156!(±3204)! ! 8264!(±6541)! 5951!(±5768)! ! 9397!(±8156)! 6164!(±5900)! ! 7335!(2564Z15100)! 5074!(2545Z8864)! ! 8067!(3651Z12353)! 5074!(2796Z6828)! ! 7540!(4217Z11530)! 4414!(2999Z8245)! ! 7991!(4649Z12717)! 5326!(3041Z6810)! ! 0,255! ! ! 0,028! ! ! 0,073! ! ! 0,005! Tabla!15:!Asociación!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de! extracción.!!HBD2:!human,beta,defensin,2;!DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango!intercuartíl;!g:!gramos.!*!Prueba!de! MannZWhitney.! !"#$%$$&# !"#$%&' !"#$$&' H B D 2 (p g /m l) <1000g >=1000g 0 10000 20000 30000 40000 50000 Figura!16:!Asociación!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de! extracción.!!HBD2:!human,beta,defensin,2.!! ! ! ! ! RESULTADOS! 55 NIVELES!DE!LA!MBL!EN!RELACIÓN!CON!LAS!VARIABLES!EDAD!GESTACIONAL!Y! PESO!AL!NACER! ! ! En!cambio!no!se!ha!encontrado!tal!comportamiento!al!analizar!las!correlaciones!de!la! variable!MBL!en!suero!con!la!edad!gestacional!y!el!peso!al!nacer!en!el!momento!de! sospecha!de!sepsis!(Tablas!16!y!17).! COEFICIENTE DE CORRELACIÓN VALOR P DÍA 0 Rho: -0,016 p= 0,889 DÍA 4 Rho: -0,157 p= 0,217 DÍA 7 Rho: 0,023 p= 0,860 MEDIA Rho: -0,069 p= 0,534 !"#$%&'()*+$ ,-.-$'/01.234&.*$%0/).&.0+$ ! Tabla! 16:! Correlaciones! entre! la! edad! gestacional! y! niveles! de! MBL! en! suero! en! los! diferentes! momentos! de! extracción.!MBL:!mannose,binding,lectin;!Rho:,Rho,de,Spearman.! ! ! COEFICIENTE DE CORRELACIÓN VALOR P DÍA 0 Rho: -0,030 p= 0,796 DÍA 4 Rho: -0,000 p= 0,998 DÍA 7 Rho: 0,013 p= 0,920 MEDIA Rho: -0,048 p= 0,661 !"#$%&'()*+$ ,-./$0*$&01-2$%'20)/.+$ ! Tabla!17:!Correlaciones!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!MBL!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de! extracción.!MBL:!mannose,binding,lectin;!Rho:!Rho,de,Spearman.! ! ! MBL!Y!LA!EDAD!GESTACIONAL:! ! En! este! análisis! se! calcularon! las! posibles! asociaciones! entre! la! variable! cuantitativa! continua!“niveles!de!MBL!(ng/ml)”!y!la!variable!“Edad!Gestacional”!dicotomizada!(<!28! semanas!vs!≥!28!semanas).! RESULTADOS! 56 En!la!muestra!estudiada!31!neonatos!(36,9%)!presentaron!una!edad!gestacional!menor! de!28!semanas!y!53!(63,1%)!una!edad!gestacional!≥!28!semanas.! Los!neonatos!con!una!edad!gestacional!menor!de!28!semanas!no!presentaron!niveles! de!MBL!en!suero!diferentes!del!grupo!de!neonatos!mayores!de!esta!edad!gestacional! (Tabla!18).!! ! Niveles!de!MBL!(ng/ml)!población!general! !! Día!0! <!28!semanas! ≥!28!semanas! Día!4! <!28!semanas! ≥!28!semanas! Día!7! <!28!semanas! ≥!28!semanas! Media!! <!28!semanas! ≥!28!semanas! ! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 1660!(±1867)! 1691!(±1414)! ! 2046(±1675)! 1819!(±1606)! ! 1692!(±1430)! 1777!(±1595)! ! 1676!(±1670)! 1676!(±1418)! ! ! 764!(65Z3245)! 1834!(114Z2880)! ! 2257!(409Z3285)! 1758!(204Z2828)! ! 1491!(327Z2829)! 1405!(191Z3095)! ! 1058!(97Z3002)! 1863!(141Z2768)! ! 0,636! ! ! 0,441! ! ! 0,911! ! ! 0,945! Tabla!18:!Asociación!entre!la!variable!edad!gestacional!y!niveles!de!MBL!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de! extracción.! ! MBL:! mannose, binding, lectin;, DS:! desviación, estándar;, RIQ:! rango, intercuartíl;, *! Prueba! de! MannZ Whitney.! ! ! RESULTADOS! 57 MBL!Y!EL!PESO!AL!NACER!DICOTOMIZADO:! ! En! este! análisis! se! calcularon! las! posibles! asociaciones! entre! la! variable! cuantitativa! continua!“niveles!de!MBL!(ng/ml)”!y!la!variable!“Peso!al!nacer”!dicotomizada!(<!1000g! vs!≥!1000g).! En!la!muestra!estudiada!44!neonatos!(52,4%)!presentaron!un!peso!al!nacer!menor!de! 1000!g!y!40!(47,6%)!un!peso!mayor!o!igual!a!1000!g.! Los!niveles!séricos!de!MBL!no!fueron!diferentes!en!el!grupo!de!los!neonatos!con!un! peso!inferior!a!1000!g!(Tabla!19).! ! Niveles!de!MBL!(ng/ml)!y!durante!la!sospecha!de!sepsis! !! Día!0! <!1000g! ≥!1000g! Día!4! <!1000g! ≥!1000g! Día!7! <!1000g! ≥!1000g! Media!! <!1000g! ≥!1000g! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 1596!(±1656)! 1768!(±1521)! ! 1755!(±1544)! 2096!(±1728)! ! 1617!(±1369)! 1895!(±1700)! ! 1619!(±1504)! 1739!(±1524)! ! 867!(100Z2867)! 1879!(92Z2995)! ! 1479!(373Z2986)! 2589!(182Z3113)! ! 1369!(462Z2604)! 1863!(136Z3275)! ! 1534!(162Z2851)! 1905!(103Z2979)! ! 0,681! ! ! 0,626! ! ! 0,745! ! ! 0,851! Tabla!19:!Asociación!entre!la!variable!peso!al!nacer!y!niveles!de!MBL!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de! extracción.! MBL:! mannose, binding, lectin;, DS:! desviación, estándar;, RIQ:! rango, intercuartíl;, *! Prueba! de! MannZ Whitney.! ! RESULTADOS! 58 ANÁLISIS!DE!CORRELACIÓN!ENTRE!HBD2!,!!PROTEÍNA!C!REACTIVA!Y!RECUENTO! DE!NEUTRÓFILOS! ! En!este!apartado!se!estudiaron!las!posibles!relaciones!entre!los!valores!de!variables! continuas! obtenidas! de! la! sangre! de! los! pacientes! en! diferentes! momentos! de! extracción.! ! Correlación!de!la!pareja!de!variables!HBD2!y!proteína!C!reactiva!(PCR):! No!se!han!observado!!correlaciones!entre!las!variables!de!PCR!(mg/L)!y!HBD2!(pg/ml)! en!los!días!0,!4,!y!7!(media!Rho!Z0.129;!p=0,250).!! ! Correlación!de!la!pareja!de!variables!HBD2!y!recuento!de!neutrófilos:! Se! han! observado! ! correlaciones! significativas! entre! las! variables! de! recuento! de! neutrófilos!(células/mm3)!y!HBD2!(pg/ml,!Tabla!20!y!Figura!17)! ! COEFICIENTE DE CORRELACIÓN VALOR P DÍA 0 Rho: 0,183 p= 0,118 DÍA 4 Rho: 0,307 p= 0,024 DÍA 7 Rho: 0,381 p= 0,014 MEDIA Rho: 0,375 p= 0,001 !"#$%&'()*+,% -./0123+45%&**6,% ! Tabla!20:!Correlaciones!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos! de!extracción.!!HBD2:!human,beta,defensin,2;,mm3:!células/mm3!;Rho:!Rho,de,Spearman., ! RESULTADOS! 65 Correlación!entre!los!niveles!de!MBL,!recuento!de!neutrófilos!y!valor!de!PCR! en!estrato!de!“neonatos!sin!datos!de!sepsis”!! ! Los!niveles!de!MBL!en!suero!no!mostraron!correlaciones!con!la!variable!“recuento!de! neutrófilos”!(media!Rho:!0,105,!p=0,619).!Tampoco!se!observaron!correlaciones! significativas!evaluando!la!pareja!de!variables!MBL!y!PCR!en!este!estrato!(media!Rho:!Z 0,083,!p=!0,688). RESULTADOS! 66 ANALISIS!DEL!ESTRATO!DE!“NEONATOS!CON!SEPSIS!CLÍNICA”! ! Asociación!entre!HBD2,!edad!gestacional!y!peso!al!nacer!! Los!neonatos!prematuros! extremos!(edad!gestacional!<28! semanas)!y!neonatos!con!muy! bajo!peso!al!nacer!(<1500g)!presentaron!niveles!de!HBD2!en!suero!significativamente!más! elevados!(Tablas!29,!30!y!Figuras!19,!20).! Tabla!29:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato!“sepsis!clínica”.!HBD2:,human,beta, defensin,2;,DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango,intercuartíl.*!MannZWhitney.! ! ! ! Niveles!de!HBD2!(pg/ml)!en!estrato!de!“sepsis!clínica”! !! Día!0! <!28!semanas!(n=8)! ≥!28!semanas!(n=6)! Día!4! <!28!semanas!(n=6)! ≥!28!semanas!(n=5)! Día!7! <!28!semanas!(n=7)! ≥!28!semanas!(n=6)! Media!(0,4,7)! <!28!semanas!(n=9)! ≥!28!semanas!(n=7)! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 9860!(±5570)! 3344!(±3944)! ! 12559!(±7195)! 4500!(±3989)! ! 11466!(±10013)! 5075!(±4281)! ! 11007!(±7500)! 4165!(±3602)! ! 9817!(5406Z15653)! 1445!(375Z7829)! ! 11051!(7138Z17465)! 5863!(251Z8068)! ! 11645!(2855Z15233)! 5696!(112Z9403)! ! 9381!(5424Z14919)! 6329!(468Z6964)! ! 0,020! ! ! 0,068! ! ! 0,153! ! ! 0,050! RESULTADOS! 67 !"#$%$&# !"#$%& !"#'%& H B D 2 (p g /m l) < 2 8 > = 2 8 0 10000 20000 30000 (&)*&+,-.".+& /&)*&+,-.".+& ! Figura!19:!Asociación!entre!la!media!de!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato!“sepsis!clínica”.!HBD2:, human,beta,defensin,2.!*!MannZWhitney.! ! ! Tabla! 30:! Asociación! entre! los! niveles! de! HBD2! y! el! peso! al! nacer! en! el! estrato! “sepsis! clínica”.! HBD2:,human, beta, defensin,2;,DS:!derivación,estándar;,RIQ:!rango,intercuartílico;,g:!gramos.*!MannZWhitney.! ! Niveles!de!HBD2!(pg/ml)!en!estrato!de!“sepsis!clínica”! !! Día!0! <!1000!g!(n=11)! ≥!1000!g!(n=3)! Día!4! <!1000!g!(n=9)! ≥!1000!g!(n=2)! Día!7! <!1000!g!(n=11)! ≥!1000!g!(n=2)! Media!(0,4,7)! <!1000!g!(n=13)! ≥!1000!g!(n=3)! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 7851!(±5905)! 4194!(±5490)! ! 10817!(±6293)! 251!(±284)! ! 9979!(±8197)! 469!(±479)! ! 9346!(±6901)! 2238!(±2959)! ! 7335!(2209Z10252)! 1598!(483ZNO)! ! 8326!(6829Z13670)! 251!(50ZNO)! ! 9370!(4427Z14200)! 469!(130ZNO)! ! 7766!(5762Z12358)! 593!(468ZNO)! ! 0,484! ! ! 0,034! ! ! 0,076! ! ! 0,051! RESULTADOS! 68 !"#$%$&'# !"#$%&!"#'$%& H B D 2 (p g /m l) <1000g >=1000g 0 10000 20000 30000 ! Figura!20:!Asociación!entre!las!medias!de!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato!“sepsis!clínica”.!HBD2:, human,beta,defensin,2,,DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango,intercuartíl;!g:!gramos.!*!MannZWhitney.! ! ! Correlación!entre!HBD2,!recuento!de!neutrófilos!y!valor!de!PCR!! En!pacientes!con!sepsis!clínica!(con!datos!disponibles!n=16)!se!ha!observado!una!correlación! positiva!y!significativa!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!recuento!de!los!neutrófilos!!(Tabla!31,! Figura!21).!! ! Tabla!31:!Correlación!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!los!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de!su! extracción!para!el!estrato!“Sepsis!clínica”.!HBD2:!,human,beta,defensin,2;,mm3:!células/mm3;!Rho:!Rho,de,Spearman., RESULTADOS! 69 ! !"#$%$$&# !"#$%#&'()'*+),"-"'./01-.%2' 3)4#$56/&"'7.8/4/%"9::;<' =>?@':)(-%'7,A9:/<' '()"#$%*+,# ! Figura!21:!Correlación!entre!la!medias!del!recuento!de!neutrófilos!con!los!niveles!de!HBD2!en!suero!!para!el!estrato!de! “Sepsis!clínica”.!HBD2:!human,beta,defensin,2;,Rho:!Rho,de,Spearman., ! En!cambio!no!se!detectó!una!correlación!analizando!los!niveles!de!HBD2!y!los!valores!de!la! proteína!C!reactiva!en!este!estrato!(media!Rho:!0,238,!p=!0,374).! ! Asociación!entre!los!niveles!de!MBL,!edad!gestacional!y!peso!al!nacer! Los! neonatos! prematuros! extremos! con! una! edad! gestacional! menor! de! 28! semanas! mostraron!niveles!de!MBL!más!bajos!que!aquellos!con!una!edad!gestacional!mayor!o!igual!a! ≥! 28! semanas.! Sin! embargo! estas! diferencias! no! fueron! estadísticamente! significativas.! Analizando!los!subgrupos!de!neonatos!(Peso!al!nacer!<1000g!versus!≥1000g)!no!se!mantuvo! esta!observación!(Tablas!32,33).! ! RESULTADOS! 70 Tabla!32:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato!“sepsis!clínica”.!MBL:,mannose,binding, lectin;,DS:!desviacón,estándar;,RIQ:!rango,intercuartíl;,*!MannZWhitney.! ! ! Niveles!de!MBL!(ng/ml)!en!estrato!de!“Sepsis!clínica”! !! Día!0! <!1000!g!(n=11)! ≥!1000!g!(n=3)! Día!4! <!1000!g!(n=9)! ≥!1000!g!(n=2)! Día!7! <!1000!g!(n=11)! ≥!1000!g!(n=2)! Media!(0,4,7)! <!1000!g!(n=13)! ≥!1000!g!(n=3)! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 1209!(±1296)! 1055!(±1740)! ! 1443!(±1122)! 1344!(±1891)! ! 1323!(±1220)! 1694!(±2253)! ! 1208!(±1100)! 1038!(±1709)! ! 663!(72Z2411)! 93!(8ZNO)! ! 1392!(322Z2429)! 1344!(7ZNO)! ! 1042!(327Z2049)! 1694!(101ZNO)! ! 1058!(152Z2077)! 97!(8ZNO)! ! 0,484! ! ! 0,637! ! ! 0,844! ! ! 0,459! Tabla!33:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato!“sepsis!clínica”.!MBL:,mannose,binding, lectin,,DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango,intercuartíl;!g:!gramos;,*!MannZWhitney! ! Correlación!entre!MBL,!recuento!de!neutrófilos!y!valor!de!PCR!! Los! niveles! de! MBL! en! suero! no! mostraron! correlaciones! significativas! con! las! variables! recuento! de! neutrófilos! (media! Rho:! 0,112,! p=0,880)! y! proteína! C! reactiva! (media! Rho:! 0,303,!p=!0,254)!en!el!estrato!de!sepsis!clínica.!! Niveles!de!MBL!(ng/ml)!en!estrato!de!“Sepsis!clínica”! !! Día!0! <!28!semanas!(n=8)! ≥!28!semanas!(n=6)! Día!4! <!28!semanas!(n=6)! ≥!28!semanas!(n=5)! Día!7! <!28!semanas!(n=7)! ≥!28!semanas!(n=6)! Media!(0,4,7)! <!28!semanas!(n=9)! ≥!28!semanas!(n=7)! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 484!(±652)! 2098!(±1483)! ! 1123!(±1214)! 1788!(±1127)! ! 792!(±760)! 2065!(±1516)! ! 705!(±870)! 1783!(±1279)! ! 108!(16Z4559)! 2738!(105Z2326)! ! 840!(102Z3120)! 2176!(84Z2860)! ! 490!(238Z3373)! 1855!(180Z2467)! ! 181!(17Z3715)! 1927!(117Z2063)! ! 0,093! ! ! 0,465! ! ! 0,086! ! ! 0,125! RESULTADOS! 71 ANALISIS!DEL!ESTRATO!DE!“NEONATOS!CON!SEPSIS!CONFIRMADA”! ! Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2,!edad!gestacional!y!peso!al!nacer! ! Los!neonatos!con!una!edad!gestacional!menor!de!28!semanas!o!un!peso!al!nacer!inferior!a! 1000!gramos!mostraron!niveles!de!HBD2!significativamente!más!elevados!en!comparación! con!neonatos!de!mayor!edad!gestacional!o!peso!al!nacer!(Tablas!34,!35!y!Figuras!22,23).! ! Niveles!de!HBD2!(pg/ml)!en!estrato!de!“sepsis!confirmada”! !! Día!0! <!28!semanas!(n=14)! ≥!28!semanas!(n=21)! Día!4! <!28!semanas!(n=14)! ≥!28!semanas!(n=19)! Día!7! <!28!semanas!(n=11)! ≥!28!semanas!(n=19)! Media!(0,4,7)! <!28!semanas!(n=16)! ≥!28!semanas!(n=24)! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 14842!(±15499)! 5464!(±1521)! ! 11260!(±8863)! 4734!(±3292)! ! 6653!(±3151)! 6106!(±5101)! ! 11629!(±11050)! 5690!(±3534)! ! 9287!(6249Z17443)! 4720!(3049Z6693)! ! 9410!(3856Z17928)! 4192!(2217Z6579)! ! 6577!(4169Z8205)! 4779!(3009Z7259)! ! 7503!(4824Z15769)! 5326!(3068Z6650)! ! 0,005! ! ! 0,029! ! ! 0,355! ! ! 0,009! Tabla!34:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato!“sepsis!confirmada”.!HBD2:,human, beta,defensin,2;,DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango,intercuartíl;,*!MannZWhitney.! ! RESULTADOS! 72 !"#$%$$&# !"#$%&'!"#()&' H B D 2 (p g /m l) < 2 8 > = 2 8 0 10000 20000 30000 40000 50000 *'$+',-./"/,' 0'$+',-./"/,' ! Figure!22:!Asociación!entre!las!medias!de!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato!“sepsis!confirmada”.!HBD2:, human,beta,defensin,2;,DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango,intercuartíl;!g:!gramos.!! ! Tabla!35:!Asociación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato!“sepsis!confirmada”.!HBD2:,human,beta, defensin,2;,DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango,intercuartílico;!g:!gramos;,*!MannZWhitney.! ! Niveles!de!HBD2!(pg/ml)!en!estrato!de!“sepsis!confirmada”! !! Día!0! <!1000!g!(n=15)! ≥!1000!g!(n=20)! Día!4! <!1000!g!(n=17)! ≥!1000!g!(n=16)! Día!7! <!1000!g!(n=12)! ≥!1000!g!(n=18)! Media!(0,4,7)! <!1000!g!(n=18)! ≥!1000!g!(n=22)! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 14087!(±15219)! 5562!(±3838)! ! 10231!(±8612)! 4604!(±2729)! ! 8280!(±5886)! 4991!(±2554)! ! 11792!(±10394)! 5017!(±2846)! ! 9074!(5626Z17029)! 4771!(2976Z6706)! ! 9244!(3695Z16638)! 4392!(2393Z6331)! ! 7201!(4380Z9176)! 4590!(3005Z7072)! ! 10117!(5538Z14416)! 5125!(2924Z5965)! ! 0,012! ! ! 0,098! ! ! 0,075! ! ! 0,001! RESULTADOS! 73 !"#$%$$&# !"#$$%&!"#'(%& H B D 2 (p g /m l) <1000g >=1000g 0 10000 20000 30000 40000 50000 ! Figure!23:!Asociación!entre!las!medias!de!los!niveles!de!HBD2!y!el!peso!al!nacer!en!el!estrato!“sepsis!confirmada”.!HBD2:, human,beta,defensin,2;,DS:!desviación,estándar;!RIQ:!rango,intercuartílico;!g:!gramos.!! ! ! Correlación!entre!los!niveles!de!HBD2,!neutrófilos!y!proteína!C!reactiva!! ! En!pacientes!con!sepsis!confirmada!(con!datos!disponibles!n=40)!no!se!ha!observado!una! correlación!entre!HBD2!y!neutrófilos!o!PCR!(Tablas!36,!37).! COEFICIENTE DE CORRELACIÓN VALOR P DÍA 0 r: 0,041 p= 0,814 DÍA 4 r: 0,153 p= 0,437 DÍA 7 r: 0,400 p= 0,090 MEDIA r: 0,125 p= 0,442 !"#$%&'()*+,% -./0123+45%&**6,% ! Tabla!36:!Correlación!entre!el!recuento!de!neutrófilos!y!los!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de!su! extracción! para! el! estrato! “Sepsis! confirmada”.! HBD2:! ,human, beta, defensin, 2;, mm3:! células/mm3;! r:! coeficiente, de, correlación,de,Pearson., RESULTADOS! 74 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN VALOR P DÍA 0 r: -0,294 p= 0,086 DÍA 4 r: -0,012 p= 0,952 DÍA 7 r: 0,465 p= 0,039 MEDIA r: -0,139 p= 0,392 !"#$%&'()*+,% -./%&*()0,% ! Tabla!37:!Correlación!entre!el!valor!de!PCR!y!los!niveles!de!HBD2!en!suero!en!los!diferentes!momentos!de!su!extracción! para!el!estrato!“Sepsis!confirmada”.!HBD2:!,human,beta,defensin,2;,PCR:!Proteína,C,reactiva;,r:!coeficiente,de,correlación, de,Pearson., ! ! Asociación!entre!los!niveles!de!MBL,!edad!gestacional!y!peso!al!nacer!! Los!neonatos!con!una!edad!gestacional!menor!de!28!semanas!o!un!peso!al!nacer!inferior!a! 1000!gramos!mostraron!niveles!de!MBL!similares!a!neonatos!de!mayor!edad!gestacional!o! mayor!peso!al!nacer!(Tablas!38,!39).! ! Tabla!38:!Asociación!entre!los!niveles!de!MBL!y!la!edad!gestacional!en!el!estrato!“sepsis!confirmada”.!MBL:,mannose, binding,lectin;,DS:!desviación,estándar;,RIQ:!rango,intercuartíl;,g:!gramos;,*!MannZWhitney.! ! ! ! Niveles!de!MBL!(ng/ml)!en!estrato!de!“sepsis!confirmada”! !! Día!0! <!28!semanas!(n=14)! ≥!28!semanas!(n=21)! Día!4! <!28!semanas!(n=14)! ≥!28!semanas!(n=19)! Día!7! <!28!semanas!(n=11)! ≥!28!semanas!(n=19)! Media!(0,4,7)! <!28!semanas!(n=16)! ≥!28!semanas!(n=24)! Media!(DS)! Mediana!(RIQ)! Valor!p*! ! 2139!(±1867)! 1830!(±1521)! ! 2558!(±1738)! 2152!(±1851)! ! 2187!(±1516)! 1888!(±1688)! ! 2209!(±1785)! 1876!(±1597)! ! 2148!(249Z3563)! 1993!(102Z3225)! ! 2804! (541Z3635)! 2572!(202Z3563)! ! 2599!(460Z2990)! 2285!(136Z3218)! ! 2450!(201Z3692)! 2229!(137Z3218)! ! 0,711! ! ! 0,512! ! ! 0,636! ! ! 0,544! DISCUSIÓN! 81 publicados!previamente!en!controles!de!adultos!sanos![110,111].!Con!el!fin!de!determinar!si! estas!diferencias!se!debían!a!haber!empleado!técnicas!diferentes,!se!analizaron!muestras!de! suero!obtenidas!de!adultos!jóvenes!sanos!en!paralelo!con!muestras!obtenidas!del!cordón! umbilical!de!recién!nacidos!a!término!normales.!Se!observó!que!efectivamente!los!neonatos! a!término!normales!presentan!valores!de!HDB2!más!altos!en!el!momento!de!nacer!que!los! adultos!sanos.!Si!se!comparan!los!valores!obtenidos!en!los!adultos!en!nuestro!estudio!con! los! de! Book et,al.! [111],! observamos! que! seguirán! mostrándose! niveles! de! HBD2! más! elevados! en! nuestra! cohorte! aún! después! de! considerar! las! diferencias! que! pudieran! deberse!a!la!distinta!medición!plasma,versus!suero.! El!hecho!de!haber!hallado!niveles!de!HBD2!más!elevados!en!neonatos!en!comparación!con! los!adultos!va!en!el!sentido!contrario!de!lo!encontrado!en!estudios!previos.!Estos!trabajos! comunicaron!niveles!de!péptidos!antimicrobianos!(p.ej.!Lactoferrina,!alfaZdefensinas,!LLZ37! etc)! inferiores! en! la! población! neonatal! en! comparación! con! los! hallados! en! adultos! [68,69,85].!No!se!conocen!los!motivos!que!pueden!explicar!estas!diferencias!encontradas!en! nuestra! cohorte,! aunque! pueden! sugerirse! un! posible! aumento! de! producción! de! HBD2! debido!al!estado!de!estrés!generado!en!el!periparto!o!una!mayor!dependencia!del!recién! nacido!en!las!primeras!semanas!de!vida!de!esta!parte!del!sistema!inmunitario.!! ! Niveles!de!HBD2!en!neonatos!a!término!y!prematuros! ! En! nuestra! muestra! de! recién! nacidos! se! han! observado! diferencias! significativas! de! los! valores!de!HBD2!con!respeto!a!la!edad!gestacional!y!al!peso!al!nacer.!Los!recién!nacidos!a! término!y!con!peso!mayor!de!1500!gramos!presentan!al!nacimiento!niveles!de!HBD2!más! altos!que!los!recién!nacidos!pretérminos![147].!Estas!diferencias!podrían!ser!explicadas!por! la!propia!inmadurez!del!sistema!inmune!innato!en!los!recién!nacidos!pretérminos.!Es!posible! que!en!parte!esta!inmadurez!o!deficiencia!de!la!respuesta!inmunitaria!y!especialmente!de! mediadores!solubles!tales!como!los!HBD2,!condicione!el!aumento!de!susceptibilidad!de!esta! población!frente!infecciones!invasivas!![85,87,122].! ! ! DISCUSIÓN! 82 HBD2!y!susceptibilidad!frente!infecciones!! ! En! este! trabajo! hemos! observado! que! prematuros! con! valores! más! bajos! de! HBD2! presentaban!un!mayor!riesgo!de!sufrir!una!sepsis!tardía![147].!! Dado!que!nuestro!estudio!es!el!primero!en!analizar!los!valores!séricos!de!HBD2!en!la!edad! neonatal!se!desconocen!los!valores!“normales”!de!HBD2!en!la!población!de!recién!nacidos.! No! obstante,! sería! útil! poder! establecer! puntos! de! corte! para! HBD2! a! fin! de! diferenciar! valores! normales! de! aquellos! patológicos! que! podrían! ser! utilizados! para! predecir! la! susceptibilidad!a!infecciones!en!la!edad!neonatal.!Hemos!realizado!estos!cálculos!en!nuestra! muestra!para!identificar!el!punto!de!corte!más!adecuado!que!predeciría!el!riesgo!de!sepsis! tardía,! hallándolo! este! valor! en! 880! pg/ml,! y! con! aceptables! valores! de! sensibilidad! y! especificidad,!e!incluso!teniendo!en!cuenta!otro!factor!de!riesgo!importante!como!la!edad! gestacional.! Aunque! los! resultados! de! este! modelo! fueron! significativos,! estos! deben! ser! comprobados!en!futuros!trabajos!ya!que!el!intervalo!de!confianza!fue!muy!amplio!debido!al! bajo!número!de!individuos!incluidos!en!el!estudio.! Para!la!interpretación!de!nuestros!resultados!es!importante!recordar!que!el!desarrollo!de! una!sepsis!tardía!es!un!proceso!multifactorial,!y!por!lo!tanto!incluye!una!serie!de!variables,! conocidas! y! no! conocidas,! que! no! han! podido! ser! controladas! por! las! características! de! nuestro!estudio,!ni!en!el!diseño!ni!en!el!análisis!estadístico.!! No!obstante!nuestros!resultados!concuerdan!con!la!literatura!en!el!sentido!que!el!déficit!de! componentes! del! sistema! inmune! innato! aumenta! el! riesgo! de! sufrir! infecciones! graves! [68,87Z89]!y!que!la!expresión!de!APPs!como!LLZ37!y!HBD1Z2!está!aumentado!en!diferentes! edades!en!un!proceso!infeccioso![111,122].!! Hasta!la!fecha!no!hay!datos!sobre!los!mecanismos!exactos!de!este!“efecto!protector”!de!la! HBD2! frente! infecciones! en! la! edad! neonatal.! A! nivel! genético! existe! ya! un! numero! considerable!de!estudios!que!relacionan!niveles!bajos!de!HBD2!con!ciertos!polimorfismos! genéticos![113,148,149].!Sin!embargo!sigue!siendo!incierto!si!estas!alteraciones!genéticas! finalmente! se! traducen! en! una! mayor! susceptibilidad! para! infecciones! invasivas! y/o! persistentes![149,150].!Hasta!la!fecha,!no!existen!estudios!que!hayan!analizado!el!posible! impacto!de!los!polimorfismos!genéticos!de!las!beta!defensinas!con!el!riesgo!de!infecciones! invasivas!en!la!edad!neonatal.! !! DISCUSIÓN! 83 HBD2!y!la!presencia!de!corioamnionitis!! ! En!nuestra!muestra!de!pacientes!hemos!observado!que!los!niveles!de!HBD2!en!suero!eran! más! altos! en! los! neonatos! prematuros! con! corioamnionitis! que! en! los! prematuros! sin! corioamnionitis![147].!Aunque!no!se!alcanzaron!diferencias!estadísticamente!significativas,! es! de! esperar! que! esta! tendencia! observada! sea! importante,! puesto! que! concuerda! con! trabajos! previos! que! han! estudiado! la! respuesta! inflamatoria! del! feto! (FIRS)! frente! a! un! estímulo!intenso!como!una!corioamnionitis![151Z153].!Del!mismo!modo!se!ha!demostrado! que! estímulos! inflamatorios! (p.ej.! corioamnionitis)! inducen! citoquinas! proZinflamatorias! como!TNFZα,!ILZ1β!e!ILZ6![18,114],!siendo!los!dos!primeros!inductores!de!la!producción!de! APPs!como!la!HBD2![154].! En!la!población!estudiada!en!este!proyecto,!la!elevación!de!los!niveles!de!HBD2!no!alcanza! significación! estadística,! probablemente! causado! por! el! reducido! número! de! individuos! incluidos!en!el!estudio.!Para!estudiar!en!un!futuro!con!mayor!profundidad!la!cadena!causal! de! la! presencia! de! corioamnionitis,! elevación! de! citoquinas! inflamatorias! y! finalmente! el! aumento! de! las! HBD2! en! los! recién! nacidos,! sería! recomendable! incluír! las! siguientes! variables:! estudio! histopatológico! de! la! placenta! y! de! las! membranas,! los! niveles! de! citoquinas! pro! y! antiZinflamatorias! y! la! determinación! de! los! niveles! de! HBD2! en! sangre! materna,!cordón!umbilical!y!en!el!mismo!recién!nacido.!! ! A!modo!de!resumen!de!este!proyecto!se!puede!concluir:! !! 1. El!péptido!HBD2!es!estable!al!menos!durante!48!horas!en!muestras!de!suero.!! 2. Los!niveles!de!HBD2!medidos!al!nacimiento!en!los!recién!nacidos!pretérminos!son! inferiores!a!los!hallados!en!los!nacidos!a!término.!! 3. Existe! una! asociación! entre! niveles! bajos! de! HBD2,! medidos! al! nacimiento! en! neonatos!prematuros,!y!un!mayor!riesgo!de!desarrollar!sepsis!tardía.! 4. Existe! una! probable! relación! entre! corioamnionitis! y! niveles! elevados! de! HBD2! medidos!en!el!momento!del!nacimiento.!! DISCUSIÓN! 84 Los!conocimientos!derivados!del!proyecto!1!resultaron!en!una!publicación!en!una!revista! prestigiosa!de!pediatría!en!el!año!2013![147]!con!dedicación!de!una!editorial![155].!Desde! entonces!este!articulo!ha!sido!citado!por!tres!diferentes!grupos![68,117,156].! Con! los! datos! obtenidos! de! este! estudio! retrospectivo! se! diseñó! un! segundo! proyecto! prospectivo!en!el!que!se!recogieron!muestras!en!recién!nacidos!pretérminos!extremos!en! situación!de!estrés!(sospecha!de!sepsis).!! ! Proyecto!2:!! Datos!clínicos!y!demográficos!! ! En!la!cohorte!analizada!destacan!una!elevada!incidencia!de!hipertensión!arterial!materna!y! un! alto! porcentaje! de! embarazos! múltiples.! Estos! datos! se! deben! posiblemente! a! la! asociación!de!estas!condiciones!clínicas!con!un!mayor!de!riesgo!de!parto!prematuro![7,8].! En!aproximadamente!un!15%!de!los!recién!nacidos!se!detectaron!signos!clínicos!y!analíticos! compatibles! con! una! infección! vertical.! De! estos! pacientes! solamente! dos! hemocultivos! fueron! positivos,! siendo! uno! de! ellos! posiblemente! contaminado! (S., anginosus).! Esta! discordancia! entre! sospecha! y! confirmación! biológica! en! estas! circunstancias! son! posiblemente!el!resultado!de!la!práctica!clínica!de!iniciar!el!tratamiento!antibiótico!empírico! materno! en! caso! de! presencia! de! amniorexis! precoz! [157]! o! necesidad! de! cesárea! ! no! electiva![158].! La!sepsis!nosocomial!es!una!de!las!variables!respuestas!de!este!proyecto.!La!presentación! clínica! de! esta! complicación! clínica! puede! ser! muy! variable,! siendo! las! manifestaciones! respiratorias!y!la! inestabilidad! hemodinámica! las! más!frecuentes!en!nuestra!cohorte.!Los! gérmenes!más!frecuentemente!aislados!son!los!Estafilococus!coagulasa!negativos,!seguidos! de!los!bacilos!gram!negativos.!Estos!datos!coinciden!con!la!literatura!reciente![51Z53].!No!se! ha!observado!ningún!episodio!de!sepsis!debido!a!hongos!tipo!Candida,albicans,en!nuestra! cohorte.! Una! de! las! causas! para! esta! observación,! es! la! instauración! en! nuestro! centro! desde! el! año! 2010! del! tratamiento! profiláctico! con! fluconazol! en! recién! nacidos! de! alto! riesgo!(<!1000!gramos),!que!ha!demostrado!disminuir!la!tasa!de!sepsis!causadas!por!estos! patógenos! no! solamente! en! nuestra! unidad! sino! también! en! otras! unidades! de! cuidados! neonatales![159].! DISCUSIÓN! 85 ! Regulación!de!HBD2!y!MBL!durante!la!sospecha!de!sepsis! ! En! la! situación! clínica! de! sospecha! de! sepsis! no! se! observaron! en! la! población! total! diferencias! significativas! entre! los! diferentes! momentos! de! recogida! de! muestras.! Tal! y! como!se!detallará!más!adelante!no!se!detectaron!tampoco!diferencias!en!los!subgrupos!de! la!variable!de!sepsis!(no!sepsis,!sepsis!clínica,!sepsis!confirmada).!Con!los!datos!obtenidos! podemos!intuir!una!leve!disminución!de!los!niveles!de!HBD2!mientras!los!niveles!de!MBL!se! mantienen!estable!durante!todo!el!proceso.!Esta!disminución!de!HBD2!podría!ser!debido!a! una!situación!de!alto!gasto!de!este!péptido!o!también!ser!reflejo!de!transfusiones!de!sangre! o!plaquetas!que!en!muchas!ocasiones!forman!parte!del!manejo!médico!en!las!situaciones!de! gravedad!en!la!UCIZNN.!No!se!han!observado!diferencias!entre!los!niveles!de!MBL!en!los! diferentes!días!de!recogida.!En!un!trabajo!realizado!por!Dzwonek,et,al.!en!recién!nacidos! prematuros! se! observó! un! aumento! de! MBL! a! lo! largo! del! primer! mes! de! vida.! Esta! elevación!fue!más!marcada!comparando!los!días!1Z3!con!las!determinaciones!posteriores!(7Z 10,!14Z18,!27Z30!días!de!vida).!Sin!embargo!una!vez!alcanzado!el!día!7Z10!no!se!modificaron! los! niveles! de! MBL! de! forma! significativa! [87].! El! motivo! de! no! haber! detectado! este! aumento! de! MBL! en! los! primeros! días! de! vida! en! nuestro! proyecto! es! posiblemente! atribuible! a! la! recogida! “tardía”! de! muestras,! generalmente! a! partir! del! día! 7Z9! de! vida! coincidiendo!con!el!pico!de!mayor!riesgo!de!sepsis!nosocomial.! ! Influencia!de!la!edad!gestacional!y!peso!al!nacer!en!los!niveles!de!HBD2! ! Analizando!las! variables!continuas!de!edad!gestacional!con!los!niveles!de!HBD2!hallamos! una! correlación! negativa! significativa.! A! menor! edad! gestacional! se! detectan! mayores! niveles!de!HBD2.! Como!es!de!esperar,!ya!que!la!edad!gestacional!y! el!peso!al!nacer!son! variables!que!se!condicionan!entre!ellos,!se!ha!observado!también!una!correlación!similar! (aunque!menos!pronunciada)!para!la!variable!peso!al!nacer.!Esto!refleja!que!los!niveles!de! HBD2!están!posiblemente!más!relacionados!con!la!inmadurez!de!los!individuos!que!con!el! peso.! Para! simplificar! el! análisis! se! realizó! una! transformación! de! las! variables! edad! gestacional! y! peso! al! nacer! en! variables! dicotómicas! (<28! semanas! versus! ≥28! semanas,! DISCUSIÓN! 86 <1000g!versus!≥1000g).!Con!este!procedimiento!se!confirmaron!los!resultados!anteriores,! detectando! unas! asociaciones! significativas! entre! las! variables! edad! gestacional,! peso! al! nacer! y! los! niveles! de! HBD2! en! suero.! Esta! observación! es! muy! interesante,! puesto! que! habitualmente!los!niveles!de!mediadores!solubles!del!sistema!inmune!innato!y!adaptativo! aumentan!con!la!edad!gestacional!y!maduración![68,69].!Un!trabajo!realizado!por!Strunk!et, al.!determinando!los!niveles!de!diferentes!péptidos!antimicrobianos!en!sangre!de!cordón! umbilical!en!diferentes!edades!gestacionales,!detectó!niveles!de!Calprotectina!más!elevados! en!los!neonatos!menores!de!30!semanas!en!comparación!con!los!de!una!edad!gestacional! entre!30!y!33!semanas!(116,9!versus!90,7!ng/ml).!Sin!embargo!en!este!artículo!los!autores! no!discutieron!este!resultado!posiblemente!debido!al!reducido!tamaño!muestral![69].!! Es!importante!recordar!que!encontramos!estas!diferencias!comparando!las!medidas!en!las! tres!determinaciones!de! HBD2!(día!0,!4! y! 7)!lo!cual!aumenta! la! consistencia!de!nuestros! resultados.!El!hecho!de!haber!detectado!niveles!más!elevados!de!HBD2!en!los!neonatos!más! inmaduros!nos!permite!formular!la!hipótesis!que!estos!péptidos!pueden!tener!una!mayor! importancia! en! estas! edades! extremas.! Si! su! función! es! solamente! antimicrobiana! o! relacionado! con! sus! actividades! inmunomoduladores! debería! ser! objetivo! de! futuros! estudios.!! En! cierto! modo! estos! resultados! del! proyecto! 2! pueden! parecer! contradictorios! con!los! datos! obtenidos! en! el! proyecto! 1,! donde! se! hallaron! valores! de! HBD2! más! bajos! en! los! recién!nacidos!pretérminos!en!comparación!con!neonatos!a!término.!En!este!sentido!parece! importante!destacar!dos!diferencias!en!el!diseño!de!ambos!proyectos.!Mientras!que!en!el! proyecto! 1! se! determinaron! los! niveles! de! HBD2! en! el! momento! de! nacimiento,! en! el! proyecto!2!estas!determinaciones!se!realizaron!habitualmente!a!partir!de!la!primera!semana! de!vida!y!en!el!contexto!de!sospecha!de!un!proceso!infeccioso.!Por!otra!parte!en!el!proyecto! 2!se!compararon!los!niveles!de!HBD2!dentro!del!propio!grupo!de!recién!nacidos!prematuros.! Estas!diferencias!entre!ambos!proyectos!pueden!ser!importantes!y!servir!al!menos!en!parte! como!explicación!de!los!resultados!comentados.! ! ! DISCUSIÓN! 87 Influencia!de!la!edad!gestacional!y!peso!al!nacer!en!los!niveles!de!MBL! ! En! cambio! no! se! observaron! correlaciones! significativas! entre! las! variables! de! edad! gestacional!y!peso!al!nacer!con!la!variable!MBL!en!suero.!La!relación!de!los!niveles!de!MBL! con!la!edad!gestacional!sigue!siendo!un!debate!continuo.!Varios!trabajos!han!mostrado!un! aumento!de!los!niveles!de!MBL!en!función!de!la!edad!gestacional!![160,161].! Sin! embargo! algunos! trabajos! recientes,! realizados! a! nivel! poblacional! en! Polonia,! mostraron! resultados! similares! a! las! obtenidas! en! nuestra! población! [143,162].! En! este! contexto!es!importante!recordar!que!en!nuestro!estudio!solamente!se!analizaron!muestras! obtenidas! de! recién! nacidos! prematuros! en! una! situación! clínica! muy! concreta! y! con! recogida!de!las!muestras!habitualmente!entre!los!días!7Z28!días!de!vida,!lo!cual!limita!su! extrapolación! a! otras! circunstancias.! Del! mismo! modo! se! han! demostrado! diferencias! geográficas! para! los! niveles! de! MBL! debido! a! la! distribución! genotípica! [163].! Nuestro! estudio!es!el!primero!realizado!en!la!edad!neonatal!en!España.!Por!lo!tanto,!para!evaluar!los! datos!obtenidos!en!nuestra!cohorte!en!el!contexto!adecuado!y!facilitar!así!su!interpretación,! serán! necesarios! estudios! poblacionales! en! la! península! ibérica! y! en! diferentes! circunstancias!clínicas.! ! Correlación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!recuento!de!neutrófilos!en!la!población! general! ! Se!detectó!una!correlación!positiva!entre!los!niveles!de!HBD2!y!el!recuento!de!neutrófilos.! Similar! a! lo! previamente! comentado,! estas! correlaciones! se! demostraron! analizando! las! medias!de!los!valores!obtenidos!en!los!días!0,!4!y!7,!aumentando!de!esta!manera!la!fortaleza! de! esta! correlación.! Las! HBD2! son! producidas! principalmente! en! células! epiteliales! y! su! impacto! en! patologías! dermatológicas,! respiratorias,! oftalmológicas! y! gastrointestinales! están! bien! descritos! [101,102].! Solamente! unos! pocos! trabajos! previos! han! analizado! los! valores!de!HBD2!en!muestras!de!sangre,!y!hasta!la!fecha!ninguno!ha!evaluado!las!posibles! relaciones! entre! los! niveles! de! HBD2! y! el! número! de! neutrófilos.! Para! interpretar! esta! correlación!positiva!se!ofrecen!varias! explicaciones.!Por!un!lado!es!posible!que!los!HBD2! sean!producidas!en!los!neutrófilos.!Algunos!trabajos!previos!han!demostrado!la!presencia! de! este! péptido! antimicrobiano! en! el! interior! de! células! como! monocitos,! macrófagos! y! DISCUSIÓN! 88 células! dendríticas! [101,102,105].! Otra! hipótesis! sería! que! el! número! de! neutrófilos! en! sangre!periférica!y!los!niveles!de!HBD2!en!suero!son!el!resultado!de!estímulos!inflamatorios! comunes.! En! este! sentido! varios! trabajos! han! demostrado! que! la! síntesis! de! HBD2! es! inducida! por! bacterias! o! por! sus! productos! (lipopolisacáridos)! y! por! citoquinas! proZ inflamatorias! como! TNFZα! e! ILZ1β! [114,115].! Estas! mismas! sustancias! a! nivel! sistémico! inducen! también! una! respuesta! inflamatoria! general! con! un! aumento! de! los! niveles! de! neutrófilos! en! sangre! [164,165].! La! HBD2! y! HBD3! han! demostrado! interaccionar! con! el! CCR2,! un! receptor! de! quimioquinas! con! expresión! en! macrófagos,! monocitos! y! también! neutrófilos,!resultando!en!un!efecto!de!atracción!química!(chemoattractant)![166,167]!para! estas!células.! También!es!interesante!mencionar!que!la!HBD3,!que!comparte!características!funcionales! con!la!HBD2,!ha!demostrado!inducir!la!expresión!de!la!quimioquina!CXCR2!que!es!una!de!las! moléculas!claves!para!el!paso!de!los!neutrófilos!de!la!medula!ósea!a!la!periferia.!Aunque!en! este!mismo!trabajo!se!analizaron!también!los!efectos!de!otros!péptidos!antimicrobianos,!no! se!analizó!el!papel!de!las!HBD2![168].! ! ! Correlación!entre!los!niveles!de!HBD2!y!los!valores!de!la!proteína!C!reactiva! ! No! se! hallaron! asociaciones! significativas! entre! el! péptido! HBD2! y! PCR! en! las! muestras! extraídas.!Este!dato!es!importante!ya!que!indica!que!la!HBD2!responde!a!estímulos!de!una! manera! diferente! a! como! lo! hace! este! reactante! de! fase! aguda.! Muchos! trabajos! han! estudiado! el! valor! de! la! proteína! C! reactiva! para! el! diagnóstico! de! complicaciones! infecciosas!en!la!edad!neonatal![169Z171].!Para!analizar!si!este!comportamiento!se!debe!a!la! presencia! de! patógenos! o! situaciones! clínicas! compatibles! con! sepsis! se! analizaron! los! diferentes! estratos! de! la! variables! “sepsis”! tal! y! como! se! describe! en! el! apartado! correspondiente!más!adelante.!! ! ! ! DISCUSIÓN! 89 Correlación!entre!los!niveles!de!MBL,!recuento!de!neutrófilos!y!los!valores!de!la! proteína!C!reactiva! ! En!nuestra!cohorte!no!se!observaron!relaciones!entre!estas!variables.!Las!explicaciones!para! esta! ausencia! de! asociación! pueden! ser! diferencias! a! nivel! de! los! genotipos! que! pueden! facilitar! o! inhibir! la! regulación! de! la! producción! de! MBL! durante! procesos! inflamatorios! [134,136].!El!hecho!de!no!disponer!de!datos!sobre!la!presencia!de!los!genotipos!ni!de!su! distribución!en!nuestra!cohorte,!representa!una!debilidad!de!nuestro!estudio!e!imposibilita! evaluar! la! influencia! del! genotipo! sobre! los! resultados! o! la! estratificación! según! los! genotipos.!! ! Estratificación!de!la!cohorte!según!las!variables:!sepsis!y!hemocultivos! ! Para!evaluar!el!efecto!de!la!edad!gestacional!y!el!peso!al!nacer!sobre!el!riesgo!de!presentar! una!sepsis!nosocomial!se!analizaron!los!tres!subgrupos!sin!hallar!diferencias!significativas.!La! inmadurez! y! el! bajo! peso! son! factores! de! riesgo! conocidos! para! sufrir! complicaciones! infecciosas! graves! en! la! edad! neonatal! [39].! El! hecho! de! no! haber! encontrado! estas! diferencias!en!nuestra!cohorte,!se!debe!posiblemente!a!las!características!de!la!misma!con! una!muy!baja!variabilidad!de!la!variable!edad!gestacional,!distribuyéndose!la!mayoría!de!los! recién!nacidos!en!el!rango!de!28Z32!semanas.!Para!la!homogeneidad!de!la!cohorte!en!esta! variable!el!número!de!pacientes!no!era!suficiente!para!detectar!diferencias!significativas.!! ! Niveles!de!HBD2!en!relación!con!la!edad!gestacional!y!el!peso!al!nacer!en!los! estratos!de!la!variable!sepsis! ! Para! profundizar! en! el! análisis! de! las! variables! HBD2! en! función! de! las! variables! edad! gestacional,!peso!al!nacer!y!los!datos!provenientes!de!las!analíticas!(neutrófilos!y!proteína!C! reactiva)!se!realizó!la!estratificación!de!la!cohorte!en!función!de!la!clasificación!de!la!variable! sepsis!en!las!tres!categorías:!no!signos!de!sepsis,!sepsis!clínica!y!sepsis!confirmada.! A!diferencia!de! la!cohorte!general!no! se!encontraron!asociaciones!significativas! entre!las! variables!analizadas!en!estrato!de!“neonatos!sin!signos!de!sepsis”.! DISCUSIÓN! 90 Sin! embargo! para! los! estratos! de! “sepsis! clínica”! y! “sepsis! confirmada”! se! observaron! asociaciones! significativas! para! las! parejas! de! variables! HBD2! versus! edad! gestacional! y! HBD2!versus!peso!al!nacer,!siendo!esta!asociación!más!significativa!en!el!estrato!de!“sepsis! confirmada”.! Una! posible! lectura! de! esta! observación! es! que! el! péptido! HBD2! es! el! mecanismo! de! defensa! fundamental! en! los! neonatos! más! inmaduros! ante! un! proceso! infeccioso,! mientras! que! en! neonatos! con! mayor! edad! gestacional! y! peso! al! nacer! otras! partes!del!sistema!inmunitario!innato,!sean!mediadores!solubles!o!de!predominio!célular! como! por! ejemplo! receptores! de! reconocimiento! de! patrones! (pattern, recognition, receptors),! ganan! en! importancia! y! potencialmente! sustituyen! a! la! HBD2.! Tal! y! como! previamente!ha!sido! comentado,! no! se! han! descrito!niveles!solubles! del! sistema! inmune! innato!más!elevados!en!los!recién!nacidos!más!inmaduros!durante!procesos!infecciosos!lo! cual!aumenta!el!impacto!de!esta!observación![68].!Naturalmente!son!necesarios!estudios! con!mayor! tamaño! muestral! y! con! el! objetivo!concreto! de! describir! esta! asociación! para! confirmar!nuestros!resultados.!! ! Niveles!de!MBL!en!relación!con!la!edad!gestacional!y!el!peso!al!nacer!en!los! estratos!de!la!variable!sepsis! ! Al! igual! que! en! el! análisis! de! la! cohorte! completa,! no! se! encontraron! correlaciones! o! asociaciones!significativas!para!la!variable!MBL!con!la!edad!gestacional!y!el!peso!al!nacer! para!los!tres!diferentes!estratos!de!la!sepsis.!Tal!y!como!ha!sido!comentado!previamente,! sigue!siendo!objeto!de!debate!si!existen!asociaciones!entre!los!niveles!de!MBL!y!estas!dos! variables! demográficas! [161,162].! Los! datos! de! esta! tesis! no! apoyan! la! hipótesis! de! que! exista! tal! relación,! teniendo! en! cuenta! las! características! especificas! de! nuestra! cohorte! (prematuridad!extrema,!recogida!de!muestras!en!entre!el!7Z14!días!de!vida,!estado!crítico! del! paciente! en! el! momento! de! la! extracción! de! la! muestra,! población! española)! y! las! limitaciones!del!análisis!al!no!disponer!de!genotipaje![137].!El!análisis!por!estratos!de!sepsis! nos!permite!postular!que!la!presencia!de!sepsis!clínica!o!sepsis!confirmada!no!modifica!de! manera! significativa! los! resultados! observados! en! la! cohorte! general,! lo! cual! reduce! la! posibilidad!que!la!ausencia!de!asociación!entre!niveles!de!MBL!y!edad!gestacional!y!peso!al! nacer!este!relacionada!con!los!diferentes!estratos!de!la!variable!sepsis.!!! BIBLIOGRAFÍA! 97 aa ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! VII.!BIBLIOGRAFÍA! BIBLIOGRAFÍA! 98 1. WHO.!WHO:! recommended! definitions,! terminology! and! format! for! statistical! tables! related! to! the! perinatal!period!and!use!of!a!new!certificate!for!cause!of!perinatal!deaths.!Acta!Obstet!Gynecol!Scand! 1977;!56:!247–53.!! 2. Goldenberg!RL,!Gravett!MG,!Iams!J,!et!al.!The!preterm!birth!syndrome:!issues!to!consider!in!creating!a! classification!system.!Am!J!Obstet!Gynecol!2012;!206:!113–18.!!! 3. Lawn!JE,!Blencowe!H,!Pattinson!R,!et!al.!Stillbirths:!Where?!When?!Why?!How!to!make!the!data!count?! Lancet!2011;!377:!1448–63.! 4. Rajaratnam!JK,!Marcus!JR,!Flaxman!AD,!et!al:!Neonatal,!postneonatal,!childhood,!and!underZ5!mortality! for!187!countries,!1970Z2010:!a!systematic!analysis!of!progress!towards!millennium!development!goal!4.! Lancet.!2010;!375:1988Z2008.! 5. Lawn!JE,!Blencowe!H,!Oza!S,!You!D,!Lee!AC,!Waiswa!P,!Lalli!M,!Bhutta!Z,!Barros!AJ,!Christian!P,!Mathers!C,! Cousens! SN;! Lancet! Every! Newborn! Study! Group.! Every! Newborn:! progress,! priorities,! and! potential! beyond!survival.!Lancet.!2014;!384:189Z205.!! 6. Blencowe!H,!Cousens!S,!Oestergaard!MZ,!Chou!D,!Moller!AB,!Narwal!R,!Adler!A,!Vera!Garcia!C,!Rohde!S,! Say!L,!Lawn!JE.!National,!regional,!and!worldwide!estimates!of!preterm!birth!rates!in!the!year!2010!with! time! trends! since! 1990! for! selected! countries:! a! systematic! analysis! and! implications.! Lancet.! 2012;! 379:2162Z72.! 7. Goldenberg! RL,!Culhane! JF,! Lams! JD,! et! al:! Epidemiology! and! causes! of! preterm! birth.! Lancet! 2008;! 371:75Z84.!! 8. Henderson! JJ,!McWilliam! OA,! Newnham! JP,! Pennell! CE.! Preterm! birth! aetiology! 2004Z2008.! Maternal! factors! associated!with! three!phenotypes:!spontaneous! preterm! labour,!preterm! preZlabour! rupture!of! membranes!and!medically!indicated!preterm!birth.!J!Matern!Fetal!Neonatal!Med.!2012;!25:642Z7.!! 9. Agarwal!V,!Hirsch!E.!Intrauterine!infection!and!preterm!labor.!Semin,Fetal,Neonatal,Med.!2012;!17:12Z9.! 10. McElrath!TF,!Hecht!JL,!Dammann!O,!et,al.,Pregnancy!disorders!that!lead!to!delivery!before!the!28th!week! of!gestation:!an!epidemiologic!approach!to!classification.!Am,J,Epidemiol.!2008;!168:980Z9.! 11. Mendz! GL,!Kaakoush! NO,! Quinlivan! JA.! Bacterial! aetiological! agents! of! intraZamniotic! infections! and! preterm!birth!in!pregnant!women.!Front,Cell,Infect,Microbiol.!2013;!3(58):1Z7.! 12. Cunnington!M,!Kortsalioudaki!C,!Heath!P.!Genitourinary!pathogens!and!preterm!birth.!Curr,Opin,Infect, Dis.!2013;!26:219Z30.!! 13. Martinez<Lopez!DG,!Funderburg!NT,!Cerissi!A,!et!al.!Lipopolysaccharide!and!soluble!CD14!in!cord!blood! plasma!are!associated!with!prematurity!and!chorioamnionitis.!Pediatr,Res.!2014;!75:67Z74.! 14. Goldenberg!RL,!Culhane!JF,!Johnson!DC.!Maternal!infection!and!adverse!fetal!and!neonatal!outcomes.!Clin! Perinatol!2005;!32:!523–59.! 15. Cotch!MF,!Pastorek!JG!2nd,!Nugent!RP,!et!al.!Trichomonas!vaginalis!associated!with!low!birth!weight!and! preterm!delivery.!Sex!Transm!Dis!1997;!24:!353–60.! 16. Sweet!RL,!Landers!DL,! Walker!C,!et!al.!Chlamydia!trachomatis!infection!and!pregnancy!outcome.!Am! J! Obstet!Gynecol!1987;!156:!824–33.!! 17. Goldenberg!RL,!Hauth!JC,!Andrews!WW.!Intrauterine!infection!and!preterm!delivery.!N!Engl!J!Med!2000.! BIBLIOGRAFÍA! 99 342:!1500–07.!! 18. Gotsch!F,!Romero!R,!Kusanovic!JP,!et!al.!The!fetal!inflammatory!response!syndrome.!Clin!Obstet!Gynecol.! 2007;!50:652Z83.! 19. Delgado!AV,!McManus!AT,!Chambers!JP.!Production!of!tumor!necrosis!factorZalpha,!interleukin!1Zbeta,! interleukin! 2,! and! interleukin! 6! by! rat! leukocyte! subpopulations! after! exposure! to! substance! P.! Neuropeptides.!2003;!37:355Z61.! 20. Muñoz!M,!Pavón!A,!Rosso!M,!Salinas!MV,!Pérez!A,!Carranza!A,!GonzálezZOrtega!A.!Immunolocalization!of! NKZ1!Receptor!and!Substance!P!in!Human!Normal!Placenta.!Placenta!2010;!31:649Z651.! 21. Burd!I,!Balakrishnan!B,!Kannan!S.!Models!of!fetal!brain!injury,!intrauterine!inflammation,!and!preterm! birth.!Am!J!Reprod!Immunol.!2012;!67:287Z94.! 22. Wu!YW,!Escobar!GJ,!Grether!JK,!et!al.!Chorioamnionitis!and!cerebral!palsy!in!term!and!nearZterm!infants.! JAMA.!2003;!290:2677Z84.! 23. Liu! L,!Johnson! H,! Cousens! S,! et! al,! for! the! Child! Health! Epidemiology! Reference! Group! of! WHO! and! UNICEF.!Global,!regional,!and!national!causes!of!child!mortality:!an!updated!systematic!analysis!for!2010! with!time!trends!since!2000.!Lancet!2012;!379:!2151–61.!! 24. Moster!D,!Lie!RT,!Markestad!T.!LongZterm!medical!and!social!consequences!of!preterm!birth.!N,Engl,J,Med, 2008;!359:!262–73! 25. Peters!KL,!Rosychuk!RJ,!Hendson!L,!et!al.!Improvement!of!shortZ!and!longZterm!outcomes!for!very!low! birth!weight!infants:!Edmonton!NIDCAP!trial.!Pediatrics.!2009;!124:1009Z20.!! 26. Tommiska!V,!Tuominen!R,!Fellman!V,!et!al.!Economic!costs!of!care!in!extremely!low!birthweight!infants! during!the!first!2!years!of!life.!Pediatr!Crit!Care!Med.!2003;!4:157Z63.! 27. Clements!KM,!Barfield!WD,!Ayadi!MF,!et!al.!Preterm!birthZassociated!cost!of!early!intervention!services:! an!analysis!by!gestational!age.!Pediatrics.!2007;!119:e866Z74.!! 28. Leviton!A,!Fichorova!RN,!O'Shea!TM,!et!al.!TwoZhit!model!of!brain!damage!in!the!very!preterm!newborn:! small!for!gestational!age!and!postnatal!systemic!inflammation.!Pediatr!Res.!2013;!73:362Z70.! 29. Parikh!NA,!Lasky!RE,!Kennedy!KA,!et!al.!Perinatal!factors!and!regional!brain!volume!abnormalities!at!term! in!a!cohort!of!extremely!low!birth!weight!infants.!PLoS!One.!2013;!8:e62804.!! 30. Potharst!ES,!van!Wassenaer!AG,!Houtzager!BA,!et!al.!High!incidence!of!multiZdomain!disabilities!in!very! preterm!children!at!five!years!of!age.!J!Pediatr.!2011;!159:79Z85.! 31. de!Jong!M,!Verhoeven!M,!van!Baar!AL.!School!outcome,!cognitive!functioning,!and!behaviour!problems!in! moderate!and!late!preterm!children!and!adults:!a!review.!Semin!Fetal!Neonatal!Med.!2012;!17:163Z9.! 32. Farooqi!A,!Hägglöf!B,!Sedin!G,!et!al.!Impact!at!age!11!years!of!major!neonatal!morbidities!in!children!born! extremely!preterm.!Pediatrics.!2011;!127:e1247Z57.!! 33. Moro!M,!PérezZRodriguez!J,!FiguerasZAloy!J,!et,al.,Predischarge!morbidities!in!extremely!and!very!lowZ birthZweight!infants!in!Spanish!neonatal!units.!Am,J,Perinatol.!2009;!26:335Z43.! 34. Wynn!JL,!Wong!HR,!Shanley!TP,!Bizzarro!MJ,!Saiman!L,!Polin!RA.!Time!for!a!neonatalZspecific!consensus! definition!for!sepsis.!Pediatr!Crit!Care!Med.!2014;15:523Z8.! 35. Qazi!SA,!Stoll!BJ.!Neonatal!sepsis:!a!major!global!public!health!challenge.!Pediatr!Infect!Dis!J.!2009;!28:S1Z BIBLIOGRAFÍA! 100 2.! 36. Shane!AL,!Stoll!BJ.!Neonatal!sepsis:!progress!towards!improved!outcomes.!Journal!of!Infection!2014;!68,! S24ZS32.! 37. Hornik!CP,!Fort!P,!Clark!RH,!et!al.!Early!and!late!onset!sepsis!in!veryZlowZbirthZweight!infants!from!a!large! group!of!neonatal!intensive!care!units.!Early!Hum!Dev,!2012;88!S2:S69Z74.! 38. Makhoul!IR,!Sujov!P,!Smolkin!T,!Lusky!A,!Reichman!B,!PathogenZspecific!early!mortality!in!very!low!birth! weight!infants!with!lateZonset!sepsis:!a!national!survey.!Clin!Infect!Dis.!2005;!40:218Z24.! 39. Weston!EJ,!Pondo!T,!Lewis!MM,!MartellZCleary!P,!Morin!C,!Jewell!B,!Daily!P,!Apostol!M,!Petit!S,!Farley!M,! Lynfield!R,!Reingold!A,!Hansen!NI,!Stoll!BJ,!Shane!AL,!Zell!E,!Schrag!SJ.!The!burden!of!invasive!earlyZonset! neonatal!sepsis!in!the!United!States,!2005–2008.!Pediatr!Infect!Dis!J.!2011;30:937Z41.! 40. Smith!PB,!Morgan!J,!Benjamin!JD,!Fridkin!SK,!Sanza!LT,!Harrison!LH,!Sofair!AN,!HuieZWhite!S,!Benjamin!DK! J.!Excess!costs!of!hospital!care!associated!with!neonatal!candidemia.!Pediatr!Infect!Dis!J!2007;!26:197–200.!!! 41. Stoll!BJ,!Hansen!NI,!Sanchez!PJ,!et!al.!Early!onset!neonatal!sepsis:!the!burden!of!group!B!Streptococcal!and! E.!coli!disease!continues.!Pediatrics!2011;127:817–26.! 42. Bartels!DB,!Schwab!F,!Geffers!C,!Poets!CF,!Gastmeier!P.!Nosocomial!infection!in!small!for!gestational!age! newborns!with!birth!weight!<1500!g:!a!multicentre!analysis.!Arch!Dis!Child!Fetal!Neonatal!Ed.!2007;! 92:449–453.! 43. Bizzarro!MJ,!Gallagher!PG.!AntibioticZresistant!organisms!in!the!neonatal!intensive!care!unit.Semin! Perinatol.!2007;!31:26–32.! 44. Ligi!I,!Arnaud!F,!Jouve!E,!Tardieu!S,!Sambuc!R,!Simeoni!U.!Iatrogenic!events!in!admitted!neonates:!a! prospective!cohort!study.!Lancet.!2008;!371:404Z410.! 45. Clark!R,!Powers!R,!White!R,!Bloom!B,!Sanchez!P,!Benjamin!DK!Jr.!Nosocomial!infection!in!the!NICU:!a! medical!complication!or!unavoidable!problem?!J!Perinatol.!2004;!24:382–3887.! 46. Payne!NR,!Carpenter!JH,!Badger!GJ,!Horbar!JD,!Rogowski!J.!Marginal!increase!in!cost!and!excess!length!of! stay!associated!with!nosocomial!bloodstream!infections!in!surviving!very!low!birth!weight!infants.! Pediatrics.!2004;!114:348Z55.! 47. Mireya!UA,!Martí!PO,!Xavier!KV,!Cristina!LO,!Miguel!MM,!Magda!CM.!Nosocomial!infections!in!paediatric! and!neonatal!intensive!care!units.!J!Infect.!2007;!54:212–2208.!! 48. Aziz!K,!McMillan!DD,!Andrews!W,!Pendray!M,!Qiu!Z,!Karuri!S,!Lee!SK;!Canadian!Neonatal!Network.! Variations!in!rates!of!nosocomial!infection!among!Canadian!neonatal!intensive!care!units!may!be!practiceZ related.!BMC!Pediatr.!2005;!5:22.! 49. Wirtschafter!DD,!Powers!RJ,!Pettit!JS,!Lee!HC,!Boscardin!WJ,!Ahmad!Subeh!M,!Gould!JB.!Nosocomial! infection!reduction!in!VLBW!infants!with!a!statewide!qualityZimprovement!model.!Pediatrics.!2011;! 127:419Z26.! 50. López!Sastre!JB,!Pérez!Solís!D.![Definitions!of!neonatal!sepsis:!a!long!way!to!go].!An!Pediatr.!2006;!65:525Z 8.! 51. Stoll!BJ,!Hansen!N,!Fanaroff!AA,!Wright!LL,!Carlo!WA,!Ehrenkranz!RA,!Lemons!JA,!Donovan!EF,!Stark!AR,! Tyson!JE,!Oh!W,!Bauer!CR,!Korones!SB,!Shankaran!S,!Laptook!AR,!Stevenson!DK,!Papile!LA,!Poole!WK.! BIBLIOGRAFÍA! 101 Changes!in!pathogens!causing!earlyZonset!sepsis!in!veryZlowZbirthZweight!infants.!N!Engl!J!Med.!2002;! 347:240Z7.!! 52. Marchant!EA,!Boyce!GK,!Sadarangani!M,!Lavoie!PM.!Neonatal!sepsis!due!to!coagulaseZnegative! staphylococci.!Clin!Dev!Immunol.!2013;2013:586076.! 53. Dong!Y,!Speer!CP.!LateZonset!neonatal!sepsis:!recent!developments.!Arch!Dis!Child!Fetal!Neonatal!Ed.! 2014!Nov!25.!pii:!fetalneonatalZ2014Z306213.! 54. Adams<Chapman!I.!LongZterm!impact!of!infection!on!the!preterm!neonate.!Semin!Perinatol.!2012;36:462Z 70.!! 55. Strunk!T,!Inder!T,!Wang!X,!Burgner!D,!Mallard!C,!Levy!O.!InfectionZinduced!inflammation!and!cerebral! injury!in!preterm!infants.!Lancet!Infect!Dis.!2014;!14:751Z62.! 56. Glass!HC,!Bonifacio!SL,!Chau!V,!Glidden!D,!Poskitt!K,!Barkovich!AJ,!Ferriero!DM,!Miller!SP.!Recurrent! postnatal!infections!are!associated!with!progressive!white!matter!injury!in!premature!infants.!Pediatrics.! 2008;!122:299Z305.! 57. Schlapbach!LJ,!Aebischer!M,!Adams!M,!Natalucci!G,!Bonhoeffer!J,!Latzin!P,!Nelle!M,!Bucher!HU,!Latal!B;! Swiss!Neonatal!Network!and!FollowZUp!Group.!Impact!of!sepsis!on!neurodevelopmental!outcome!in!a! Swiss!National!Cohort!of!extremely!premature!infants.!Pediatrics.!2011;!128:e348Z57.! 58. van!der!Ree!M,!Tanis!JC,!Van!Braeckel!KN,!Bos!AF,!Roze!E.!Functional!impairments!at!school!age!of! preterm!born!children!with!lateZonset!sepsis.!Early!Hum!Dev.!2011;!87:821Z6.! 59. Lutsar!I,!Chazallon!C,!Carducci!FI,!Trafojer!U,!Abdelkader!B,!de!Cabre!VM,!Esposito!S,!Giaquinto!C,!Heath! PT,!Ilmoja!ML,!Katragkou!A,!Lascoux!C,!Metsvaht!T,!Mitsiakos!G,!Netzer!E,!Pugni!L,!Roilides!E,!Saidi!Y,! Sarafidis!K,!Sharland!M,!Usonis!V,!Aboulker!JP;!NeoMero!Consortium.!Current!management!of!late!onset! neonatal!bacterial!sepsis!in!five!European!countries.!Eur!J!Pediatr.!2014;!173:997Z1004.! 60. Camacho<Gonzalez!A,!Spearman!PW,!Stoll!BJ.!Neonatal!infectious!diseases:!evaluation!of!neonatal!sepsis.! Pediatr!Clin!North!Am.!2013;!60:367Z89.! 61. Srinivasan!L,!Harris!MC.!New!technologies!for!the!rapid!diagnosis!of!neonatal!sepsis.!Curr!Opin!Pediatr.! 2012;!24:165Z71.! 62. Buhimschi!CS,!Bhandari!V,!Han!YW,!Dulay!AT,!Baumbusch!MA,!Madri!JA,!Buhimschi!IA.!Using!proteomics! in!perinatal!and!neonatal!sepsis:!hopes!and!challenges!for!the!future.!Curr!Opin!Infect!Dis.!2009;!22:235Z 43.! 63. Medzhitov!R,!Janeway!CA!Jr.!Decoding!the!patterns!of!self!and!nonself!by!the!innate!immune!system.! Science.!2002;!296(5566):298Z300.! 64. Dowling!DJ,!Levy!O.!Ontogeny!of!early!life!immunity.!Trends!Immunol.!2014;!35:299Z310.! 65. Adkins!B.!Heterogeneity!in!the!CD4!T!Cell!Compartment!and!the!Variability!of!Neonatal!Immune! Responsiveness.!Curr!Immunol!Rev.!2007;!3:151Z159.! 66. Adkins!B,!Leclerc!C,!MarshallZClarke!S.!Neonatal!adaptive!immunity!comes!of!age.!Nat!Rev!Immunol.!2004;! 4:553Z64! 67. Baker!CJ,!Carey!VJ,!Rench!MA,!Edwards!MS,!Hillier!SL,!Kasper!DL,!Platt!R.!Maternal!antibody!at!delivery! protects!neonates!from!early!onset!group!B!streptococcal!disease.!J!Infect!Dis.!2014;!209:781Z8.! BIBLIOGRAFÍA! 102 68. Pettengill!MA,!van!Haren!SD,!Levy!O.!Soluble!mediators!regulating!immunity!in!early!life.!Front!Immunol.! 2014;!5:457.! 69. Strunk!T,!Doherty!D,!Richmond!P,!Simmer!K,!Charles!A,!Levy!O,!Liyanage!K,!Smith!T,!Currie!A,!Burgner!D.! Reduced!levels!of!antimicrobial!proteins!and!peptides!in!human!cord!blood!plasma.!Arch!Dis!Child!Fetal! Neonatal!Ed.!2009;!94:F230Z1.! 70. Levy!O.!!Innate!immunity!of!the!newborn:!basic!mechanisms!and!clinical!correlates!Nat!Rev!Immunol.! 2007;!7:379Z90! 71. Janeway!CA!Jr,!Medzhitov!R.!Innate!immune!recognition.!Annu!Rev!Immunol.!2002;!20:197Z216.! 72. Akira!S,!Uematsu!S,!Takeuchi!O.!Pathogen!recognition!and!innate!immunity.!Cell.!2006;!124:783Z801.! 73. Cuenca!AG,!Wynn!JL,!Moldawer!LL,!Levy!O.!Role!of!innate!immunity!in!neonatal!infection.!Am!J!Perinatol.! 2013;!30:105Z12.! 74. Gasteiger!G,!Rudensky!AY.!Interactions!between!innate!and!adaptive!lymphocytes.!Nat!Rev!Immunol.! 2014;!14:631Z9.! 75. Levy!O,!Wynn!JL.!A!prime!time!for!trained!immunity:!innate!immune!memory!in!newborns!and!infants.! Neonatology.!2014;!105:136Z41.! 76. Kenzel!S,!Henneke!P.!The!innate!immune!system!and!its!relevance!to!neonatal!sepsis.!Curr!Opin!Infect!Dis.! 2006;!19:264Z70.! 77. Maheshwari!A.!Neutropenia!in!the!newborn.!Curr!Opin!Hematol.!2014;21:43Z9.! 78. Cuenca!AG,!Cuenca!AL,!Gentile!LF,!Efron!PA,!Islam!S,!Moldawer!LL,!Kays!DW,!Larson!SD.!Delayed! emergency!myelopoiesis!following!polymicrobial!sepsis!in!neonates.!Innate!Immun.!2014.!pii:! 1753425914542445.! 79. Björkqvist!M,!Jurstrand!M,!Bodin!L,!Fredlund!H,!Schollin!J.Defective!neutrophil!oxidative!burst!in!preterm! newborns!on!exposure!to!coagulaseZnegative!staphylococci.!Pediatr!Res.!2004;!55:966Z71! 80. Prosser!A,!Hibbert!J,!Strunk!T,!Kok!CH,!Simmer!K,!Richmond!P,!Burgner!D,!Currie!A.!Phagocytosis!of! neonatal!pathogens!by!peripheral!blood!neutrophils!and!monocytes!from!newborn!preterm!and!term! infants.!Pediatr!Res.!2013;!74:503Z10.! 81. Jones!CA,!Holloway!JA,!Warner!JO.!Phenotype!of!fetal!monocytes!and!B!lymphocytes!during!the!third! trimester!of!pregnancy.!J!Reprod!Immunol.!2002;!56:45Z60! 82. Belnoue!E,!Fontannaz!P,!Rochat!AF,!Tougne!C,!Bergthaler!A,!Lambert!PH,!Pinschewer!DD,!Siegrist!CA.! Functional!limitations!of!plasmacytoid!dendritic!cells!limit!type!I!interferon,!T!cell!responses!and!virus! control!in!early!life.!PLoS!One.!2013;!8:e85302.! 83. Förster<Waldl!E,!Sadeghi!K,!Tamandl!D,!Gerhold!B,!Hallwirth!U,!Rohrmeister!K,!Hayde!M,!Prusa!AR,! Herkner!K,!BoltzZNitulescu!G,!Pollak!A,!Spittler!A.!Monocyte!tollZlike!receptor!4!expression!and!LPSZ induced!cytokine!production!increase!during!gestational!aging.!Pediatr!Res.!2005;!58:121Z4.! 84. Glaser!K,!Speer!CP.!TollZlike!receptor!signaling!in!neonatal!sepsis!and!inflammation:!a!matter!of! orchestration!and!conditioning.!Expert!Rev!Clin!Immunol.!2013;!9:1239Z52! 85. Wynn!JL,!Levy!O.!Role!of!innate!host!defenses!in!susceptibility!to!earlyZonset!neonatal!sepsis.!Clin! Perinatol.!2010;!37:307Z37.! BIBLIOGRAFÍA! 103 86. McGreal!EP,!Hearne!K,!Spiller!OB.!Off!to!a!slow!start:!underZdevelopment!of!the!complement!system!in! term!newborns!is!more!substantial!following!premature!birth.!Immunobiology.!2012;!217:176Z86.!! 87. Dzwonek!AB,!Neth!OW,!Thiébaut!R,!Gulczynska!E,!Chilton!M,!Hellwig!T,!BajajZElliott!M,!Hawdon!J,!Klein!NJ.! The!role!of!mannoseZbinding!lectin!in!susceptibility!to!infection!in!preterm!neonates.!Pediatr!Res.!2008;! 63:680Z5.! 88. Israëls!J,!Frakking!FN,!Kremer!LC,!Offringa!M,!Kuijpers!TW,!van!de!Wetering!MD.!MannoseZbinding!lectin! and!infection!risk!in!newborns:!a!systematic!review.!Arch!Dis!Child!Fetal!Neonatal!Ed.!2010;!95:F452Z61.! 89. Frakking!FN,!Brouwer!N,!Zweers!D,!Merkus!MP,!Kuijpers!TW,!Offringa!M,!Dolman!KM.!High!prevalence!of! mannoseZbinding!lectin!(MBL)!deficiency!in!premature!neonates.!Clin!Exp!Immunol.!2006;!145:5Z12.!! 90. Tissières!P,!Ochoda!A,!DunnZSiegrist!I,!Drifte!G,!Morales!M,!Pfister!R,!Berner!M,!Pugin!J.!Innate!immune! deficiency!of!extremely!premature!neonates!can!be!reversed!by!interferonZγ.!PLoS!One.!2012;!7:e32863.! 91. Saito!S,!Kato!Y,!Maruyama!M,!Ichijo!M.!A!study!of!interferonZgamma!and!interleukinZ2!production!in! premature!neonates!and!neonates!with!intra!uterine!growth!retardation.!Am!J!Reprod!Immunol.!1992;! 27:63Z8.! 92. Kollmann!TR,!Levy!O,!Montgomery!RR,!Goriely!S.!Innate!immune!function!by!TollZlike!receptors:!distinct! responses!in!newborns!and!the!elderly.!Immunity.!2012;!37:771Z83.! 93. Kai<Larsen!Y,!Gudmundsson!GH,!Agerberth!B.!A!review!of!the!innate!immune!defence!of!the!human! foetus!and!newborn,!with!the!emphasis!on!antimicrobial!peptides.!Acta!Paediatr.!2014;!103:1000Z8! 94. Iliodromiti!Z,!Anastasiadis!A,!Varras!M,!Pappa!KI,!Siristatidis!C,!Bakoulas!V,!Mastorakos!G,!Vrachnis!N.! Monocyte!function!in!the!fetus!and!the!preterm!neonate:!immaturity!combined!with!functional! impairment.!Mediators!Inflamm.!2013;!2013:753752.! 95. Hostetter!MK.!What!we!don't!see.!N!Engl!J!Med.!2012;366:1328Z34!.! 96. Lehrer!RI,!Ganz!T.!Antimicrobial!peptides!in!mammalian!and!insect!host!defence.!Curr!Opin!Immunol.! 1999;!11:23Z7.! 97. Choi!KY,!Chow!LN,!Mookherjee!N!J!Cationic!host!defence!peptides:!multifaceted!role!in!immune! modulation!and!inflammation.!Innate!Immun.!2012;!4:361Z70.!! 98. Legrand!D.!Lactoferrin,!a!key!molecule!in!immune!and!inflammatory!processes.!Biochem!Cell!Biol.!2012;! 90:252Z68.! 99. Balakrishnan!A,!Marathe!SA,!Joglekar!M,!Chakravortty!D.!Bactericidal/permeability!increasing!protein:!a! multifaceted!protein!with!functions!beyond!LPS!neutralization.!Innate!Immun.!2013;!19:339Z47.! 100. Wong!JH,!Ye!XJ,!Ng!TB.!Cathelicidins:!peptides!with!antimicrobial,!immunomodulatory,!antiZinflammatory,! angiogenic,!anticancer!and!procancer!activities.!Curr!Protein!Pept!Sci.!2013;!14:504Z14.! 101. Underwood!MA,!Bevins!CL.!DefensinZbarbed!innate!immunity:!clinical!associations!in!the!pediatric! population.!Pediatrics.!2010;!125:1237Z47.! 102. Ganz!T.!Defensins:!antimicrobial!peptides!of!innate!immunity.!Nat!Rev!Immunol.!2003;!3:710Z20.! 103. Krishnakumari!V,!Rangaraj!N,!Nagaraj!R.!Antifungal!activities!of!human!betaZdefensins!HBDZ1!to!HBDZ3! and!their!CZterminal!analogs!Phd1!to!Phd3.!Antimicrob!Agents!Chemother.!2009;!53:256Z60.! 104. Doss!M,!White!MR,!Tecle!T,!Hartshorn!KL.!Human!defensins!and!LLZ37!in!mucosal!immunity.!J!Leukoc!Biol.! BIBLIOGRAFÍA! 104 2010;!87:79Z92.! 105. Duits!LA,!Ravensbergen!B,!Rademaker!M,!Hiemstra!PS,!Nibbering!PH.!Expression!of!betaZdefensin!1!and!2! mRNA!by!human!monocytes,!macrophages!and!dendritic!cells.!Immunology.!2002;!106:517Z25.! 106. Lehrer!RI,!Cole!AM,!Selsted!ME.!θZDefensins:!cyclic!peptides!with!endless!potential.!J!Biol!Chem.!2012;! 287:27014Z9.! 107. Lehrer!RI.!Primate!defensins.!Nat!Rev!Microbiol.!2004;!2:727Z38.! 108. Yang!D,!Chertov!O,!Bykovskaia!SN,!Chen!Q,!Buffo!MJ,!Shogan!J,!Anderson!M,!Schröder!JM,!Wang!JM,! Howard!OM,!Oppenheim!JJ.!BetaZdefensins:!linking!innate!and!adaptive!immunity!through!dendritic!and!T! cell!CCR6.!Science.!1999;286:525Z8.! 109. Hazlett!L,!Wu!M.!Defensins!in!innate!immunity.!Cell!Tissue!Res.!2011;!343:175Z88.! 110. Hiratsuka!T,!Mukae!H,!Iiboshi!H,!Ashitani!J,!Nabeshima!K,!Minematsu!T,!Chino!N,!Ihi!T,!Kohno!S,!Nakazato! M.!Increased!concentrations!of!human!betaZdefensins!in!plasma!and!bronchoalveolar!lavage!fluid!of! patients!with!diffuse!panbronchiolitis.!Thorax.!2003;!58:425Z30.! 111. Book!M,!Chen!Q,!Lehmann!LE,!Klaschik!S,!Weber!S,!Schewe!JC,!Luepertz!M,!Hoeft!A,!Stuber!F.!Inducibility! of!the!endogenous!antibiotic!peptide!betaZdefensin!2!is!impaired!in!patients!with!severe!sepsis.!Crit!Care.! 2007;!11:R19.! 112. Hollox!EJ,!Barber!JC,!Brookes!AJ,!Armour!JA.!Defensins!and!the!dynamic!genome:!what!we!can!learn!from! structural!variation!at!human!chromosome!band!8p23.1.!Genome!Res.!2008;!18:1686Z97.! 113. Abu!Bakar!S,!Hollox!EJ,!Armour!JA.!Allelic!recombination!between!distinct!genomic!locations!generates! copy!number!diversity!in!human!betaZdefensins.!Proc!Natl!Acad!Sci!U!S!A.!2009;!106:853Z8.! 114. Harder!J,!MeyerZHoffert!U,!Teran!LM,!Schwichtenberg!L,!Bartels!J,!Maune!S,!Schröder!JM.!Mucoid! Pseudomonas!aeruginosa,!TNFZalpha,!and!ILZ1beta,!but!not!ILZ6,!induce!human!betaZdefensinZ2!in! respiratory!epithelia.!Am!J!Respir!Cell!Mol!Biol.!2000;!22:714Z21.! 115. Joly!S,!Organ!CC,!Johnson!GK,!McCray!PB!Jr,!Guthmiller!JM.!Correlation!between!betaZdefensin!expression! and!induction!profiles!in!gingival!keratinocytes.!Mol!Immunol.!2005;!42:1073Z84.! 116. Scharf!S,!Zahlten!J,!Szymanski!K,!Hippenstiel!S,!Suttorp!N,!N'Guessan!PD.!Streptococcus!pneumoniae! induces!human!βZdefensinZ2!and!Z3!in!human!lung!epithelium.!Exp!Lung!Res.!2012;!38:100Z10.! 117. Boldenow!E,!Hogan!KA,!Chames!MC,!Aronoff!DM,!Xi!C,!LochZCaruso!R.!Role!of!cytokine!signaling!in!group! B!streptococcusZstimulated!expression!of!human!Beta!defensinZ2!in!human!extraplacental!membranes.! Am!J!Reprod!Immunol.!2015;!73:263Z72.! 118. Routsias!JG,!Karagounis!P,!Parvulesku!G,!Legakis!NJ,!Tsakris!A.!In!vitro!bactericidal!activity!of!human!betaZ defensin!2!against!nosocomial!strains.!Peptides.!2010;!31:1654Z60.! 119. Thomas!NJ,!Carcillo!JA,!Doughty!LA,!Sasser!H,!Heine!RP.!Plasma!concentrations!of!defensins!and! lactoferrin!in!children!with!severe!sepsis.!Pediatr!Infect!Dis!J.!2002;!21:34Z8.! 120. Starner!TD,!Agerberth!B,!Gudmundsson!GH,!McCray!PB!Jr.!Expression!and!activity!of!betaZdefensins!and! LLZ37!in!the!developing!human!lung.!J!Immunol.!2005;!174:1608Z15.! 121. Nathe!KE,!Parad!R,!Van!Marter!LJ,!Lund!CA,!Suter!EE,!HernandezZdiaz!S,!Boush!EB,!Ikonomu!E,!Gallington!L,! Morey!JA,!Zeman!AM,!Mcnamara!M,!Levy!O.!EndotoxinZdirected!innate!immunity!in!tracheal!aspirates!of! BIBLIOGRAFÍA! 105 mechanically!ventilated!human!neonates.!Pediatr!Res.!2009;!66:191Z6.! 122. Schaller<Bals!S,!Schulze!A,!Bals!R.!Increased!levels!of!antimicrobial!peptides!in!tracheal!aspirates!of! newborn!infants!during!infection.!Am!J!Respir!Crit!Care!Med.!2002;!165:992Z5.! 123. Jenke!AC,!Zilbauer!M,!Postberg!J,!Wirth!S.!Human!βZdefensin!2!expression!in!ELBW!infants!with!severe! necrotizing!enterocolitis.!Pediatr!Res.!2012;!72:513Z20.! 124. Campeotto!F,!Baldassarre!M,!Laforgia!N,!Viallon!V,!Kalach!N,!Amati!L,!Butel!MJ,!Dupont!C,!Kapel!N.!Fecal! expression!of!human!βZdefensinZ2!following!birth.!Neonatology.!2010;!98:365Z9.!! 125. Mandic!Havelka!A,!YektaeiZKarin!E,!Hultenby!K,!Sørensen!OE,!Lundahl!J,!Berggren!V,!Marchini!G.!Maternal! plasma!level!of!antimicrobial!peptide!LL37!is!a!major!determinant!factor!of!neonatal!plasma!LL37!level.! Acta!Paediatr.!2010;!99:836Z41.! 126. Vila<Farres!X,!Garcia!de!la!Maria!C,!LópezZRojas!R,!Pachón!J,!Giralt!E,!Vila!J.!In!vitro!activity!of!several! antimicrobial!peptides!against!colistinZsusceptible!and!colistinZresistant!Acinetobacter!baumannii.!Clin! Microbiol!Infect.!2012;!18:383Z7.! 127. Turner!MW.!The!role!of!mannoseZbinding!lectin!in!health!and!disease.!Mol!Immunol.!2003;!40:423Z9.! 128. Jack!DL,!Turner!MW.!AntiZmicrobial!activities!of!mannoseZbinding!lectin.!Biochem!Soc!Trans.!2003;!31:753Z 7.!! 129. Gadjeva!M,!Takahashi!K,!Thiel!S.!MannanZbinding!lectinZZa!soluble!pattern!recognition!molecule.!Mol! Immunol.!2004;!41:113Z21.!! 130. Ezekowitz!RA,!Shi!L,!Fraser!I,!Takahashi!K.!The!mannoseZbinding!lectin:!an!infection!susceptibility!gene.! Adv!Exp!Med!Biol.!2005;!560:99Z103.! 131. Neth!O,!Jack!DL,!Dodds!AW,!Holzel!H,!Klein!NJ,!Turner!MW.!MannoseZbinding!lectin!binds!to!a!range!of! clinically!relevant!microorganisms!and!promotes!complement!deposition.!Infect!Immun.!2000;!68:688Z93.! 132. Petersen!SV,!Thiel!S,!Jensenius!JC.!The!mannanZbinding!lectin!pathway!of!complement!activation:!biology! and!disease!association.!Mol!Immunol.!2001;!38:133Z49.! 133. Takahashi!K.!MannoseZbinding!lectin!and!the!balance!between!immune!protection!and!complication.! Expert!Rev!Anti!Infect!Ther.!2011;!9:1179Z90! 134. Garred! P,!Larsen! F,! Seyfarth! J,! Fujita! R,! Madsen! HO.! MannoseZbinding! lectin! and! its! genetic! variants.! Genes!Immun.!2006;!7:85Z9432.!! 135. Brouwer! N,!Dolman! KM,! van! Zwieten! R,! Nieuwenhuys! E,! Hart! M,! Aarden! LA,! Roos! D,! Kuijpers! TW.! MannanZbinding!lectin!(MBL)Zmediated!opsonization!is!enhanced!by!the!alternative!pathway!amplification! loop.!Mol!Immunol.!2006;!2051Z60.!! 136. Turner! MW,!Lipscombe! RJ,! Levinsky! RJ,! Lau! YL,! Hill! AV,! Summerfield! JA,! Sumiya! M.! Mutations! in! the! human!mannose!binding!protein!gene:!their!frequencies!in!three!distinct!populations!and!relationship!to! serum!levels!of!the!protein.!Immunodeficiency.!1993;!4:285Z7.! 137. Madsen!HO,!Garred!P,!Thiel!S,!Kurtzhals!JA,!Lamm!LU,!Ryder!LP,!Svejgaard!A.!Interplay!between!promoter! and! structural! gene! variants! control! basal! serum! level! of! mannanZbinding! protein.! J! Immunol.! 1995;! 155:3013Z20.! 138. Madsen!HO,!Satz!ML,!Hogh! B,!Svejgaard!A,! Garred!P.! Different!molecular!events!result!in!low! protein! BIBLIOGRAFÍA! 106 levels!of!mannanZbinding!lectin!in!populations!from!southeast!Africa!and!South!America.!J!Immunol.!1998;! 161:3169Z75.! 139. Crosdale!DJ,!Ollier!WE,!Thomson!W,!Dyer!PA,!Jensenious!J,!Johnson!RW,!Poulton!KV.!Mannose!binding! lectin!(MBL)!genotype!distributions!with!relation!to!serum!levels!in!UK!Caucasoids.!Eur!J!Immunogenet.! 2000;!27:111Z7.! 140. Frakking!FN,!Israëls!J,!Kremer!LC,!Kuijpers!TW,!Caron!HN,!van!de!Wetering!MD.!MannoseZbinding!lectin! (MBL)!and!the!risk!for!febrile!neutropenia!and!infection!in!pediatric!oncology!patients!with!chemotherapy.! Pediatr!Blood!Cancer.!2011;!57:89Z96.!! 141. Neth!O,!Hann!I,!Turner!MW,!Klein!NJ.!Deficiency!of!mannoseZbinding!lectin!and!burden!of!infection!in! children!with!malignancy:!a!prospective!study.!Lancet.!2001;!25;358:614Z8.! 142. Schlapbach! LJ,!Mattmann! M,! Thiel! S,! Boillat! C,! Otth! M,! Nelle! M,! Wagner! B,! Jensenius! JC,! Aebi! C.! Differential!role!of!the!lectin!pathway!of!complement!activation!in!susceptibility!to!neonatal!sepsis.!Clin! Infect!Dis.!2010;!51:153Z62.! 143. Swierzko!AS,!Szala!A,!Cedzynski!M,!DomzalskaZPopadiuk!I,!BorkowskaZKlos!M,!Jopek!A,!Szczapa!J,!Szemraj! J,!Atkinson!AP,!MacDonald!SL,!Turner!ML,!Kilpatrick!DC.!MannanZbinding!lectin!genotypes!and!genotypeZ phenotype!relationships!in!a!large!cohort!of!Polish!neonates.!Hum!Immunol.!2009;!70:68Z72.! 144. Frakking!FN,!Brouwer!N,!van!de!Wetering!MD,!Budde!IK,!Strengers!PF,!Huitema!AD,!Laursen!I,!Houen!G,! Caron!HN,!Dolman!KM,!Kuijpers!TW.!Safety!and!pharmacokinetics!of!plasmaZderived!mannoseZbinding! lectin!(MBL)!substitution!in!children!with!chemotherapyZinduced!neutropaenia.!Eur!J!Cancer.!2009;! 45:505Z12.! 145. Redline!RW,!FayeZPetersen!O,!Heller!D,!Qureshi!F,!Savell!V,!Vogler!C;!Society!for!Pediatric!Pathology,! Perinatal!Section,!Amniotic!Fluid!Infection!Nosology!Committee.!Amniotic!infection!syndrome:!nosology! and!reproducibility!of!placental!reaction!patterns.!Pediatr!Dev!Pathol.!2003;6:435Z48.! 146. Hedstrom!L.!Serine!protease!mechanism!and!specificity.!Chem!Rev.!2002;!102:4501Z24.! 147. Olbrich!P,!Pavón!A,!Rosso!ML,!Molinos!A,!de!Felipe!B,!Sanchez!B,!PraenaZFernández!JM,!Jimenez!F,! Obando!I,!Neth!O.!Association!of!human!betaZdefensinZ2!serum!levels!and!sepsis!in!preterm!neonates*.! Pediatr!Crit!Care!Med.!2013;!14:796Z800.! 148. Linzmeier!RM,!Ganz!T.!Human!defensin!gene!copy!number!polymorphisms:!comprehensive!analysis!of! independent!variation!in!alphaZ!and!betaZdefensin!regions!at!8p22Zp23.!Genomics.!2005;!86:423Z30.! 149. Fode!P,!Larsen!AR,!Feenstra!B,!Jespersgaard!C,!Skov!RL,!Stegger!M,!Fowler!VG!Jr;!Danish!SAB!Study!Group! Consortium,!Andersen!PS.Genetic!variability!in!betaZdefensins!is!not!associated!with!susceptibility!to! Staphylococcus!aureus!bacteremia.!PLoS!One.!2012;!7:e32315.! 150. Hardwick!RJ,!Amogne!W,!Mugusi!S,!Yimer!G,!Ngaimisi!E,!Habtewold!A,!Minzi!O,!Makonnen!E,!Janabi!M,! Machado!LR,!Viskaduraki!M,!Mugusi!F,!Aderaye!G,!Lindquist!L,!Hollox!EJ,!Aklillu!E.!βZdefensin!genomic! copy!number!is!associated!with!HIV!load!and!immune!reconstitution!in!subZsaharan!Africans.!J!Infect!Dis.! 2012;!206:1012Z9.! 151. Chaiworapongsa!T,!Romero!R,!Berry!SM,!Hassan!SS,!Yoon!BH,!Edwin!S,!Mazor!M.!The!role!of!granulocyte! colonyZstimulating!factor!in!the!neutrophilia!observed!in!the!fetal!inflammatory!response!syndrome.!J! Copyright © 2013 by the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies. Unauthorized reproduction of this article is prohibited Olbrich et al 4 www.pccmjournal.org October 2013 • Volume 14 • Number 8 DISCUSSION In this study, HBD2 serum levels were significantly higher in term neonates compared with preterm neonates and healthy adult controls. This is in contrast to previous published data in which AMPs were found to be lower in newborns than in adult controls (2, 5). Although AMP could be important to protect newborns from infections during the first weeks of life, upregulation of HBD2 might be reduced in preterm infants due to the immaturity of the immune system (2, 6, 7). Chorioamnionitis was more common within preterm neonates. Interestingly, no significant difference in HBD2 levels was observed, suggesting that chorioamnionitis alone might not increase HBD2 levels substantially. As described previously, low GA was an independent risk factor in preterm neonates to develop LOS (6). In addition, low HBD2 serum levels at birth were observed to be independently associated with LOS. Although HBD2 levels in the preterm group were significantly lower than that in term neonates, preterm HBD2 levels did not seem to differ from adult controls, implying that a “relative deficiency” of HBD2 in the perinatal period of this subgroup is associated with an increased susceptibility to suffer from infections. This is an important observation and is supported by previous studies suggesting an association of “physiological” low levels of components of the innate immune system (e.g., complement proteins including mannose-binding lectin) with the susceptibility to infections in preterm neonates (2, 5–7). Up-regulation of HBD2 has been associated with severe sepsis in adult patients, further supporting a role of HBD2 in infection (8). Although two preterm neonates with very low HBD2 levels suffered from LOS (one being fatal), another patient with extremely high HBD2 levels suffered from fatal EOS. It remains to be clarified whether very low and very high HBD2 levels may be detrimental for the clinical outcome. All studies were performed in blood serum and HBD2 levels were found to be higher compared to those in published data (8) where plasma was used. Indeed, when HBD2 levels from control blood samples were analyzed using both plasma and serum, HBD2 levels were found to be higher in serum samples. This observation might be explained by the fact that HBD2 is a highly positively charged peptide, which binds to negatively charged proteins in plasma and serum, resulting in a reduction of free circulating HBD2. Furthermore, numerous coagulation factors in plasma are serine proteases, which may affect HBD2 levels. Finally, differences of published HBD2 levels might be due to the use of different laboratory techniques. Neither the addition of a protease inhibitor to serum samples nor its analysis at different time points did influence HBD2 levels. This is important as it may facilitate clinical studies in the future. In summary, in this study, HBD2 serum levels were lower in preterm neonates than in term infants but were not different from the levels in adult controls, suggesting a relative deficiency at birth. Low HBD2 levels might be an independent risk factor for the susceptibility to infections in this risk group. The value of HBD2 measurements at birth and the impact of HBD2 on clinical outcome remain to be determined. REFERENCES 1. Vergnano S, Menson E, Kennea N, et al: Neonatal infections in England: The NeonIN surveillance network. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2011; 96:F9–F14 2. Wynn JL, Levy O: Role of innate host defenses in susceptibility to early-onset neonatal sepsis. Clin Perinatol 2010; 37:307–337 Figure 1. A, Human beta-defensin-2 (HBD2) serum levels in term newborns, preterm newborns, and healthy adults. Filled triangle = term newborns, filled circles = preterm newborns, open diamond = adults. b, HBD2 serum levels in preterm neonates with and without late-onset sepsis. Two patients with early-onset sepsis have been excluded from this analysis. Filled triangle = late-onset sepsis, filled circles = no late-onset sepsis. Copyright © 2013 by the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies. Unauthorized reproduction of this article is prohibited Neonatal Intensive Care Pediatric Critical Care Medicine www.pccmjournal.org 5 3. Underwood MA, Bevins CL: Defensin-barbed innate immunity: Clinical associations in the pediatric population. Pediatrics 2010; 125:1237–1247 4. Stoll BJ, Hansen N, Fanaroff AA, et al: Late-onset sepsis in very low birth weight neonates: The experience of the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics 2002; 110(2 Part 1):285–291 5. Strunk T, Doherty D, Richmond P, et al: Reduced levels of antimicrobial proteins and peptides in human cord blood plasma. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2009; 94:F230–F231 6. Dzwonek AB, Neth OW, Thiébaut R, et al: The role of mannose-bind- ing lectin in susceptibility to infection in preterm neonates. Pediatr Res 2008; 63:680–685 7. Starner TD, Agerberth B, Gudmundsson GH, et al: Expression and activity of beta-defensins and LL-37 in the developing human lung. J Immunol 2005; 174:1608–1615 8. Book M, Chen Q, Lehmann LE, et al: Inducibility of the endogenous antibiotic peptide beta-defensin 2 is impaired in patients with severe sepsis. Crit Care 2007; 11:R19 Editorials 824 www.pccmjournal.org October 2013 • Volume 14 • Number 8 in more detail. In one of their previous studies, the authors showed that therapeutic hypothermia resulted in altered IL-6, IL-8, IL-10, and monocyte chemotactic protein-1 serum levels, with worse outcomes being associated with an increase in IL-8 and IL-10 (14). This may correlate with the low leukocyte counts noted in patients with poor outcomes in this study. In the same study, they also report that poor outcomes were associated with increased IL-12 and increased macrophage inhibitory protein-1α, cytokines that can promote a Th1 response, at the time of rewarming and persisting up to 72 hours (14). Hence, it appears that suppression of WBC counts as seen in the hypothermia group may be beneficial, but too much suppression or persistent suppression leading to immune dysregulation would be harmful. As with all thought-provoking and interesting studies, this study by Jenkins et al leaves us with several more questions that will need to be addressed in future studies. A better understanding of the temporal progression of the innate and adaptive immune response over a prolonged period following neonatal HIE, and the role of other factors that may influence the immune system such as neonatal sepsis and exposure to maternal infection/inflammation, would be crucial for optimally manipulating the immune response to achieve the desired effects of neuroprotection with therapeutic hypothermia. REFERENCES 1. Kamel H, Iadecola C: Brain-immune interactions and ischemic stroke: Clinical implications. Arch Neurol 2012; 69:576–581 2. Hurn PD, Subramanian S, Parker SM, et al: T- and B-cell-deficient mice with experimental stroke have reduced lesion size and inflammation. J Cereb Blood Flow Metab 2007; 27:1798–1805 3. Iadecola C, Anrather J: The immunology of stroke: From mechanisms to translation. Nat Med 2011; 17:796–808 4. Gelderblom M, Weymar A, Bernreuther C, et al: Neutralization of the IL-17 axis diminishes neutrophil invasion and protects from ischemic stroke. Blood 2012; 120:3793–3802 5. Huang Z, Meola D, Petitto JM: Dissecting the effects of endogenous brain IL-2 and normal versus autoreactive T lymphocytes on microglial responsiveness and T cell trafficking in response to axonal injury. Neurosci Lett 2012; 526:138–143 6. Mena H, Cadavid D, Rushing EJ: Human cerebral infarct: A proposed histopathologic classification based on 137 cases. Acta Neuropathol 2004; 108:524–530 7. Levy O: Innate immunity of the newborn: Basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol 2007; 7:379–390 8. Sharma AA, Jen R, Butler A, et al: The developing human preterm neonatal immune system: A case for more research in this area. Clin Immunol 2012; 145:61–68 9. Johnston MV, Fatemi A, Wilson MA, et al: Treatment advances in neonatal neuroprotection and neurointensive care. Lancet Neurol 2011; 10:372–382 10. Chakkarapani E, Thoresen M: Use of hypothermia in the asphyxiated infant. Perinatology 2010; 3:20–29 11. Shankaran S, Pappas A, McDonald SA, et al; Eunice Kennedy Shriver NICHD Neonatal Research Network: Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy. N Engl J Med 2012; 366:2085–2092 12. Jenkins DD, Lee T, Chiuzan C, et al: Altered Circulating Leukocytes and Their Chemokines in a Clinical Trial of Therapeutic Hypothermia for Neonatal Hypoxic Ischemic Encephalopathy. Pediatr Crit Care Med 2013; 14:786–795 13. Offner H, Vandenbark AA, Hurn PD: Effect of experimental stroke on peripheral immunity: CNS ischemia induces profound immunosuppression. Neuroscience 2009; 158:1098–1111 14. Jenkins DD, Rollins LG, Perkel JK, et al: Serum cytokines in a clinical trial of hypothermia for neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. J Cereb Blood Flow Metab 2012; 32:1888–1896 Human Beta 2 Defensin—Is It About Prediction or Is It About the Science? A Tale of Innate Immunity* Copyright © 2013 by the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies DOI: 10.1097/PCC.0b013e31829b2236 *See also p. 796. Key Words: antimicrobial peptides and proteins; human beta 2 defensin; lactoferrin; premature neonates; sepsis Supported, in part, by institutional funds. The author has disclosed that she does not have any potential conflicts of interest. In this issue of Pediatric Critical Care Medicine, Olbrich et al (1) examine yet another biomarker in preterm infants, to determine an association between human beta defensin 2 serum levels and sepsis. After a dizzying array of cytokines, chemokines, soluble adhesion proteins, growth factors (and so on), which have been measured in the serum or plasma of humans, few, if any, have subsequently been demonstrated to be particularly helpful when caring for patients with prematurity, sepsis, meconium aspiration syndrome, chronic lung disease, etc. (2–5). Some of the frustration occurs because all “biomarkers” are measured in isolation, in small groups of patients which subsequently do not appear to be useful when applied to larger populations, or our bias to publish positive results only. In a study of 927 births (116 very preterm, 372 moderately preterm), the relationship between 27 cord blood immune biomarkers and preterm birth was examined (2). Some immune markers were increased with preterm birth M. Michele Mariscalco, MD Department of Pediatrics University of Kansas School of Medicine-Wichita Wichita, KS Editorials Pediatric Critical Care Medicine www.pccmjournal.org 825 (interleukin [IL]-2–4, -5, -8, tumor necrosis factor α), others were decreased (IL-1β), and others were not associated (IL-6). Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells (sTREM)-1 is one case in point. Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 is a member of immunoglobulin gene superfamily, is found on the surface of phagocytes, and is upregulated and released on exposure to pathogens. sTREM-1 has been suggested to be a “marker of inflammation.” Matoba et al (2) found it to be increased in the cord blood of preterm infants, suggesting “increased inflammation.” Wu et al (6) performed a systematic review and meta-analysis of studies examining plasma sTREM-1 to differentiate sepsis patients from those with systemic inflammation. Eleven studies were identified that met prespecified criteria for inclusion (total of 1,795 patients), and sTREM-1 had moderate diagnostic performance, with patient sample size and assay methods the main sources of heterogeneity. There was also publication bias. Another potential biomarker put into biomarker “limbo.” Why would human beta 2 defensin be more specific or sensitive than other biomarkers? It may not be. The study by Olbrich et al (1) examined a small cohort of infants (42 term and 31 preterm), which is highly problematic. We are uninformed of how many families of neonates who met inclusion refused to participate (1). Study strengths are that the authors specifically define the preterm population (< 32 wk) versus term population (37–42 wk) (with enough “age” between the two groups for biological plausibility), histologically identified chorioamnionitis, and defined late onset sepsis. The authors “deal” with tissue processing issues. Serum levels are higher than plasma values, though not statistically significant, this is more likely due to small sample size, and must be dealt with more rigorously if this biomarker is to be studied further. Nonetheless all the samples are processed and analyzed in the same manner. In univariate analysis, birth weight and gestational age are correlated with human beta 2 defensin levels. Interestingly, chorioamnionitis was not associated with a difference in human beta 2 defensin level. Of those preterm infants who went on to develop late onset sepsis, cord blood human beta 2 defensin was significantly lower than those who did not develop late onset sepsis (513 pg/mL vs 1,411 pg/mL; p = 0.006). In multivariable analysis for the development of late onset of sepsis, human beta 2 defensin and gestational age were independent risk factors, while birth weight, chorioamnionitis, gender, and mode of delivery were not. Note that human beta 2 defensin did not correlate with other markers of inflammation or innate immunity (neutrophil count or C-reactive protein). Although this initial study is intriguing, it is very preliminary, and much more work must be done for human beta 2 defensin to be a suitable biomarker in premature infants as a predictor for late onset sepsis. However, information that has recently been lacking in neonatal studies was included here. The authors compare term and preterm serum levels to that of healthy adults. Both term and neonatal infants have highly elevated serum human beta 2 defensin levels compared with adults (approximately 5× and 2×, respectively, Fig. 1B in [1]). It is important to highlight that there are few biomarkers that have been identified that are increased in neonatal serum or plasma (premature or term) compared with adults, and for this reason alone, this study bears closer examination. Human beta defensins are a subgroup of antimicrobial peptides and proteins (APPs) that are an integral part of the innate immune system (5). They are present at mucosal lining and in the skin and are part of the initial antimicrobial response. Many are present in human milk and are hypothesized to be the primary reason for the immunity boost seen with ingesting breast milk (7). Human beta 2 defensin is found in neonatal dermis epithelial cells and appears equal to that found in adults, but the APP, cathelicidin, is many times up-regulated in neonate compared with adult. The combination of cathelicidin with human beta 2 defensin has strong antimicrobial activity against group B Streptococcus (8). Another APP lactoferrin is also dramatically up-regulated in neonatal skin, compared with adult; however, serum lactoferrin levels are increased in newborn compared with adults (unlike cathelicidin which is not increased) (9). Like human beta 2 defensins, premature infants have diminished lactoferrin plasma levels, and diminished levels were associated with clinical signs of infection (10). Thus, the present study is an important next step in understanding innate immunity of the neonate and as critically identifying opportunities for intervention in the premature neonate. The authors demonstrate that in the premature neonate lower levels of human beta 2 defensin at birth are associated with increased prevalence of late onset of sepsis. This begs the question, would supplementation with human beta 2 defensin decrease the prevalence of late onset sepsis in prematures? Treatment with synthetic APP has been explored for several decades. Bacterial permeability increasing factor was found to neutralize endotoxin and improve survival in animal models of endotoxemia and bacteremia; however, it failed to improve survival in children with severe meningococcemia (11). However, bovine lactoferrin given orally to very low birth weight infants decreases the prevalence of late onset sepsis and invasive Candida infections, in Italian neonatal ICUs (12, 13). This present study supports the biologic plausibility of human beta 2 defensin as prophylactic treatment to decrease the prevalence of late onset infections in premature infants. Thus, human beta 2 defensin may be more important in its function in the innate immune system than its role as a “predictor” of sepsis. REFERENCES 1. Olbrich P, Pavón A, Rosso ML, et al: Association of Human Beta- Defensin-2 Serum Levels and Sepsis in Preterm Neonates. Pediatr Crit Care Med 2013; 14:796–800 2. Matoba N, Yu Y, Mestan K, et al: Differential patterns of 27 cord blood immune biomarkers across gestational age. Pediatrics 2009; 123:1320–1328 3. Schaller-Bals S, Schulze A, Bals R: Increased levels of antimicrobial peptides in tracheal aspirates of newborn infants during infection. Am J Respir Crit Care Med 2002; 165:992–995 4. Okazaki K, Kondo M, Kato M, et al: Serum cytokine and chemokine profiles in neonates with meconium aspiration syndrome. Pediatrics 2008; 121:e748–e753 Editorials 826 www.pccmjournal.org October 2013 • Volume 14 • Number 8 5. Wynn JL, Levy O: Role of innate host defenses in susceptibility to early-onset neonatal sepsis. Clin Perinatol 2010; 37:307–337 6. Wu Y, Wang F, Fan X, et al: Accuracy of plasma sTREM-1 for sepsis diagnosis in systemic inflammatory patients: A systematic review and meta-analysis. Crit Care 2012; 16:R229 7. Levy FH, Brilli RJ, First LR, et al: A new framework for quality partnerships in Children’s Hospitals. Pediatrics 2011; 127:1147–1156 8. Dorschner RA, Lin KH, Murakami M, et al: Neonatal skin in mice and humans expresses increased levels of antimicrobial peptides: Innate immunity during development of the adaptive response. Pediatr Res 2003; 53:566–572 9. Scott PH: Enzyme immunoassay of lactoferrin in newborn term infants: Reference values and influence of diet. Ann Clin Biochem 1989; 26(Part 5):407–411 10. Scott PH: Plasma lactoferrin levels in newborn preterm infants: Effect of infection. Ann Clin Biochem 1989; 26(Part 5):412–415 11. Levin M, Quint PA, Goldstein B, et al: Recombinant bactericidal/permeability-increasing protein (rBPI21) as adjunctive treatment for children with severe meningococcal sepsis: A randomised trial. rBPI21 Meningococcal Sepsis Study Group. Lancet 2000; 356:961–967 12. Manzoni P, Stolfi I, Messner H, et al; Italian Task Force for the Study and Prevention of Neonatal Fungal Infections—The Italian Society of Neonatology: Bovine lactoferrin prevents invasive fungal infections in very low birth weight infants: A randomized controlled trial. Pediatrics 2012; 129:116–123 13. Manzoni P, Rinaldi M, Cattani S, et al; Italian Task Force for the Study and Prevention of Neonatal Fungal Infections, Italian Society of Neonatology: Bovine lactoferrin supplementation for prevention of late-onset sepsis in very low-birth-weight neonates: A randomized trial. JAMA 2009; 302:1421–1428 Validity of Family Satisfaction Measures: An Ongoing Process* In today’s critical care practice, increasing emphasis is placed on patient- and family-centered care (PFCC). PFCC is care that is respectful of and responsive to patient and family preferences, needs, and values (1). In pediatrics, PFCC acknowledges the family as the child’s primary source of strength and support (2). To advance PFCC, tools to assess patient and family needs and priorities are necessary. Tools are also needed to evaluate patient and family outcomes in response to practice changes intended to address these needs and priorities. Family satisfaction in intensive care is the extent to which family members perceive their needs and expectations as fulfilled by healthcare providers (3). Family satisfaction is an outcome relevant to PFCC because satisfaction is expected to increase as patient and family needs are met. Several tools to assess family satisfaction have been developed for use in intensive care settings. However, few tools have been specifically developed or adequately tested with parents of critically ill children. In this issue of Pediatric Critical Care Medicine, Epstein et al (4) evaluate the internal consistency reliability and construct validity of the Family Satisfaction in the ICU (FS-ICU) survey in 50 parents of critically ill children admitted to a single cardiothoracic ICU (CTICU). The FS-ICU is a 24-item survey originally developed for use with family members of critically ill adults to assess two domains of family satisfaction, including satisfaction with care and satisfaction with medical decision making (5). FS-ICU items were generated based on the conceptual frameworks of patient satisfaction and quality end-of-life care, prior research on family needs and satisfaction with medical decision making, other validated satisfaction surveys, and a pilot study. Validation of the FS-ICU was conducted among 1,038 relatives of patients (46% spouses) of age 61 ± 18 years (6). For this study, Epstein et al (4) modified the FS-ICU slightly to reflect that parents of young children are the intended respondents (pFS-ICU) rather than relatives of critically ill adults. Scores were converted to a 1–100 scale (0 = lowest satisfaction and 100 = highest satisfaction). Findings from the study demonstrate a total pFS-ICU score of 92.6 ± 8.3 suggesting high overall satisfaction with care and decision-making processes in the pediatric CTICU. The pFS- ICU was found to have high internal consistency reliability as reflected by Cronbach’s alpha of 0.95. Construct validity was evaluated by correlation of the pFS-ICU scores with those of a 23-item satisfaction survey developed by McPherson et al (7). The McPherson survey was designed for use with parents of critically ill children and covers satisfaction with the hospital environment, patient care, and communication. Correlation between the pFS-ICU and the McPherson survey was strong (r = 0.73; p < 0.01). Correlation between the pFS-ICU Copyright © 2013 by the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies DOI: 10.1097/PCC.0b013e3182975e4d Drs. Meert and Templin have received grants from NICHD R03HD048487 Spiritual Needs of Bereaved Parents and have received funding from the National Institutes of Health. *See also p. e350. Key Words: psychometrics; satisfaction; survey; validity Kathleen L. Meert, MD, FCCM Children’s Hospital of Michigan Detroit, MI Thomas N. Templin, PhD Wayne State University Detroit, MI