Sistemas de secreción tipo VI (T6SS) en Rhizobiales. Estudio in sílico del clúster de s. FREDII USDA257

FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA SISTEMAS DE SECRECIÓN TIPO VI (T6SS) EN RHIZOBIALES. ESTUDIO IN SÍLICO DEL CLÚSTER DE S. FREDII USDA257 Trabajo Fin de Grado Ana Sánchez Reina Tutor: Francisco Javier López Baena Directora: Patricia Bernal Guzmán Junio 2020 ÍNDICE 1. RESUMEN ........................................................................................................... 1 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1 2.1. Sistemas de secreción: clasificación y generalidades. ...................................... 1 2.2. Sistema de secreción tipo VI. .......................................................................... 4 2.2.1. Estructura y ensamblaje. .......................................................................... 4 2.2.2. Tipos de efectores. ................................................................................... 6 2.2.3. Componentes accesorios. ......................................................................... 7 2.3. Bacterias relacionadas con plantas. ................................................................. 8 2.3.1. Microbiota existente en los diferentes órganos de una planta. ................... 8 2.3.2. Interacción bacteria-bacteria. ................................................................... 9 2.3.3. Interacción planta-bacteria. ...................................................................... 9 2.3.3.1. Simbiosis Rhizobium-leguminosa.................................................... 10 3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 13 4. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 13 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 14 5.1. Estudio filogenético de los T6SS en el orden Rhizobiales. ............................. 15 5.2. Análisis bioinformático del T6SS de S. fredii USDA257. .............................. 18 6. CONCLUSIONES ............................................................................................. 27 7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 27 8. ANEXOS [1] 1. RESUMEN El sistema de secreción tipo VI (T6SS) es una maquinaria bacteriana a través de la cual se secretan toxinas/efectores al interior de células eucariotas y/o procariotas. Este sistema se ha visto involucrado en patogénesis, pero su papel fundamental es la competición entre bacterias. En este trabajo, se aborda el estudio de los T6SSs en el orden Rhizobiales, donde la función del T6SS es desconocida. En primer lugar, hemos llevado a cabo un análisis filogenético de los T6SSs en Rhizobiales para posteriormente centrarnos en la caracterización del clúster del T6SS de Sinorhizobium fredii USDA257, una cepa de especial interés en agricultura por su amplio rango de nodulación. Nuestro análisis filogenético muestra que los T6SS del orden Rhizobiales están distribuidos principalmente en dos grupos (grupo 3 y 5), de los cinco descritos en la literatura para los T6SSs. El análisis bioinformático del T6SS de nuestro organismo modelo S. fredii USDA257 muestra que el clúster génico contiene todos los genes necesarios para la biosíntesis de las proteínas estructurales necesarias para ensamblar un T6SS activo. Además, hemos encontrado genes accesorios que codifican proteínas reguladoras y estructurales que regulan el sistema y confieren nuevas características funcionales al mismo (TagF, TagM, TagL y TagY). El estudio in sílico también nos ha permitido identificar genes (USDA_c28430, USDA_c28470 y USDA_c28480) que codifican los posibles efectores Vgrge, Tre2 y Tre1, respectivamente. Las predicciones funcionales de estos efectores indican que podrían estar relacionados con la degradación de la pared celular vegetal. En este caso, serían los primeros efectores de tipo VI descrito, involucrado en el establecimiento de la simbiosis Rhizobium-leguminosa y que actuarían de manera conjunta con el sistema de secreción tipo III para llevar a cabo este proceso. 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Sistemas de secreción: clasificación y generalidades. Los sistemas de secreción bacterianos son maquinarias de naturaleza proteica, que llevan a cabo muchos procesos biológicos como la conjugación, la competición interbacteriana o la interacción con células hospedadoras1. Estas maquinarias se encargan de translocar proteínas desde el interior celular hacia el espacio extracelular, inyectarlas en otras células diana o depositarlas en su propia superficie. Actualmente, se distinguen hasta nueve tipos distintos de sistemas de secreción1. Los tipos I, II, III, V, VI, VIII y IX son [2] propios de bacterias Gram-negativas, el tipo IV se encuentra tanto en bacterias Gramnegativas como en Gram-positivas, mientras que el tipo VII es exclusivo de bacterias Gram-positivas y se ha estudiado principalmente en bacterias del género Mycobacterium2 y Staphylococcus3. En bacterias Gram-negativas, estos sistemas se han dividido en dos grandes categorías atendiendo a si la maquinaria atraviesa la doble membrana celular, interna y externa, o si la maquinaria atraviesa únicamente la membrana externa (Fig. 1). La primera categoría engloba cinco sistemas donde se incluyen los tipos I, II, III, IV y VI (Fig. 1A), mientras que en la segunda se encuentran el tipo V y otras maquinarias que actúan de apéndices en la superficie celular, conocidas como pili y curli (también denominado tipo VIII)1 (Fig. 1B). Todos ellos desarrollan diversas funciones; así, el T1SS (Fig. 1A) se encarga fundamentalmente de la secreción de factores de virulencia al medio extracelular, como la hemolisina A (proteína formadora de poros)4. También secreta factores que ayudan a la bacteria en la adquisición de nutrientes, como el hemóforo HasA (proteína transportadora del cofactor hemo)5 o promueven la adhesión celular, LapA en Pseudomonas putida6. El T2SS (Fig. 1A) presente en patógenos, secreta gran cantidad de enzimas hidrolíticas como las pseudolisinas secretadas por P. aeruginosa, que son fundamentales para su crecimiento y supervivencia7. A través del T2SS, también se secretan otros tipos de toxinas como la toxina del cólera en Vibrio cholerae8. El sistema de secreción tipo III o T3SS (Fig. 1A), se encuentra fundamentalmente en bacterias patógenas y es fundamental en los procesos de virulencia. Los efectores de tipo III en bacterias patogénicas de los géneros Yersinia y Pseudomonas manipulan al hospedador, modulando funciones celulares y pudiendo llegar a causar la muerte celular9. El T3SS también está presente en algunas bacterias no patógenas, como las pertenecientes al orden Rhizobiales, en las que está implicado en la simbiosis con leguminosas10. El T3SS presente en algunas estirpes de rizobios, desempeña un papel fundamental en la determinación del rango de hospedador, la supresión de las respuestas de defensa, la eficiencia de la simbiosis o la formación de nódulos en ausencia de factores de nodulación10. En cuanto al sistema de secreción de tipo IV o T4SS (Fig. 1A), es de especial interés su capacidad para mediar el paso de ADN hacia células eucariotas y procariotas. Ésta es una habilidad que únicamente posee este sistema y es responsable, por ejemplo, de la transmisión de plásmidos que contienen genes de resistencia a antibióticos, entre muchos otros1. Este sistema está muy bien estudiado en Agrobacterium [3] tumefaciens, patógeno de planta donde el T4SS transfiere ADN a las células de la planta huésped como primer paso de su mecanismo de virulencia11. Figura 1. Organización estructural de los sistemas de secreción presentes tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas. A) Sistemas que atraviesan la doble membrana celular (T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T6SS). B) Sistemas que atraviesan únicamente la membrana externa (T5SS, Tipo I, Tipo Curli) o la membrana interna en el caso de Gram-positivas, como el T7SS presente en Mycobacterium y Staphylococcus. El sistema de secreción de tipo V (Fig. 1B) está involucrado en la adhesión celular y la formación de biopelículas. En el caso de Yersinia enterocolitica12, la secreción de adhesinas a través del T5SS, como YadA, permite la invasión de tejidos para causar infecciones. Además, el T5SS está implicado en la secreción de toxinas que actúan como factores de virulencia, como es el caso de VacA de Helicobacter pylori13 que promueve la apoptosis de la célula hospedadora mediante la formación de poros en la membrana plasmática de ésta. El tipo I o pili se caracteriza por poseer un apéndice (Fig. 1B), siendo su función principal el anclaje a células hospedadoras para la invasión de células eucariotas. El T8SS o curli (Fig. 1B), está implicado principalmente en la adhesión A) B) [4] celular14. Un ejemplo de ello es la cepa K-12 de Escherichia coli, la cual expresa este sistema de secreción para la formación de biopelículas14. El único sistema exclusivo de Gram-positivas, el T7SS (Fig. 1B) está implicado en procesos de virulencia en Mycobacterium2 y en competición entre bacterias en el caso de Staphylococcus3. 2.2. Sistema de secreción tipo VI. El sistema de secreción tipo VI (T6SS, del inglés Type Six Secretion System), en el que nos vamos a centrar en este trabajo, fue descubierto por primera vez en Rhizobium leguminosarum15, aunque hasta 2006 no se le asignó el término de T6SS cuando fue identificado y descrito en V. cholerae16. El T6SS se encuentra en el 25% de las bacterias Gram-negativas, principalmente en el filo Proteobacterias donde se incluyen las clases α- , β-, γ-proteobacterias17. Este sistema de secreción secreta efectores/toxinas principalmente al interior de células procariotas, por lo que juega un papel esencial en la competición entre bacterias por el mismo nicho ecológico. Un ejemplo de este proceso es el de P. aeruginosa, capaz de producir la muerte de V. cholerae mediante la inyección del efector Tse1 en su periplasma18. Algunos efectores tienen como diana células eucariotas y en este caso el T6SS está implicado en patogénesis, como ocurre en la inflamación intestinal causada por V. cholerae gracias al dominio ACD de VgrG-119. 2.2.1. Estructura y ensamblaje. El T6SS es un complejo multiproteico formado por trece constituyentes principales. Los genes que codifican estas proteínas se encuentran agrupados en un mismo clúster génico20 denominado tss (de sus siglas en inglés, Type Six Secretion)21. En el mismo clúster se pueden encontrar genes que codifican proteínas con funciones complementarias, también conocidas como componentes accesorios y denominados Tag (del inglés, Type VI Accesory Genes). Estos componentes no se encuentran en todos los sistemas de tipo VI, pero en aquellos que aparecen, llevan a cabo diferentes funciones como controlar el ensamblaje del sistema o la regulación del mismo22. [5] En cuanto a la estructura del sistema, podemos diferenciar tres partes principales: el complejo de membrana, la placa base y la cola. El complejo de membrana está formado por tres proteínas principales, TssJ, TssL y TssM y se encarga de anclar el sistema de secreción a la membrana23 (Fig. 2, beige). Tras el ensamblaje de éste, se lleva a cabo el reclutamiento de TssA, que forma una estructura en forma de anillo que a su vez recluta a las proteínas que componen la placa base: TssK, TssE, TssF y TssG24 (Fig. 2, magenta). Una vez formada, ésta establece la unión entre el complejo de membrana y la cola24. En el centro de la placa base se localiza una estructura en forma de aguja, constituida por un trímero de proteínas VgrG y la proteína PAAR en la parte superior, terminando en forma de punta25 (Fig. 2, negro). A partir de la placa base y el anillo hexamérico formado por TssA situado en la parte distal del sistema, comienza la polimerización de la cola, hacia el citosol26. De esta manera, se sintetiza el tubo interno, formado por hexámeros en forma de anillo de la proteína Hcp (TssD) y rodeado por una vaina contráctil, compuesta por las proteínas TssB y TssC27 (Fig. 2). Ambas se unen formando dímeros estables repetidos en conformación helicoidal, siendo suficiente seis dímeros TssBC para cubrir un anillo de Hcp28. La formación del T6SS finaliza cuando la parte distal de éste conecta con la membrana que se encuentra en el lado opuesto de la bacteria26. Tras el ensamblaje del sistema completo, la secreción de los efectores tiene lugar una vez que se contrae la vaina. Después del estímulo necesario, como puede ser el contacto con la célula diana, se inicia en la placa base la reorganización de TssBC, produciéndose una rotación del complejo. Esto hace que la vaina se acerque hacia la placa base y por tanto disminuya su longitud. De esta forma, se promueve la expulsión del tubo interno de la cola a través de la placa base y el complejo de membrana ya que ambos forman un canal en la membrana celular para permitir este paso29. La expulsión del tubo interno se da hacia el interior de la célula diana junto con la aguja, y los efectores que pueden ir conectados a ella o Figura 2. Representación esquemática de la estructura del T6SS. Componentes de la placa base (TssEFGK) en color magenta, componentes del complejo de membrana (TssLMJ) en color beige y componentes de la vaina (TssBC) en color verde. [6] localizarse en el interior del tubo, serán liberados al medio intracelular30. A continuación, la vaina, que queda en el citosol, se desensambla gracias a una AAA+ ATPasa, conocida como ClpV (Fig. 2, rojo), la cual desempeña un papel crucial en el reciclaje del sistema para permitir su formación de nuevo31. 2.2.2. Tipos de efectores. Dentro o fuera del clúster de T6SS también podemos encontrar de forma habitual genes que codifican proteínas efectoras, que son moléculas secretadas por el mismo sistema de tipo VI y que por lo general inhiben el crecimiento o manipulan el funcionamiento de la célula diana32. Normalmente estos genes se encuentran aguas abajo de los genes que codifican las proteínas VgrG, Hcp y PAAR. Se diferencian dos grandes grupos de efectores basados en el modo de interacción con proteínas estructurales del sistema, los denominados “cargo” y los “especializados”32. Los efectores tipo cargo son aquellos que interaccionan con las proteínas Hcp, VgrG o PAAR. Esta interacción proteína-efector puede ocurrir de forma directa o mediante adaptadores (Tap, EagR), proteínas independientes capaces de reconocer el sistema y acoplarse para unir el efector posteriormente32. Por otro lado, encontramos los efectores especializados, codificados en el mismo gen que codifica las proteínas Hcp, VgrG o PAAR y, por tanto, se encuentran fusionados a ellas en forma de dominio C-terminal33. En este caso, las proteínas estructurales se denominan “Hcp, VgrG o PAAR evolucionadas” o Hcpe, VgrGe o PAARe, término que proviene del inglés “evolved” Hcp, VgrG o PAAR34. Los efectores de tipo 6 pueden tener como diana tanto células eucariotas como procariotas. Dentro de las toxinas anti-bacterianas encontramos amidasas, peptidasas hidrolasas de peptidoglicano, fosfolipasas y nucleasas, las cuales van dirigidas hacia el periplasma, la membrana o el citoplasma de la bacteria con la que compiten33. Además, es esencial que la bacteria que sintetiza el T6SS produzca, a su vez, proteínas inmunitarias que inactiven las propias toxinas o aquellas que proceden de células hermanas evitando ser su diana33. Por otro lado, los efectores que tienen como diana células eucariotas están implicados en procesos de manipulación del hospedador. Intervienen en mecanismos de reordenación de los componentes del citoesqueleto, fagocitosis, estrés oxidativo, inflamación, proliferación celular o apoptosis33,35. Recientemente, también se han identificado efectores antifúngicos36. Éstos están involucrados en la inhibición de la ingesta de nutrientes, detienen el crecimiento celular y causan la muerte en hongos36. [7] 2.2.3. Componentes accesorios. En la mayoría de los sistemas de secreción de tipo VI podemos encontrar componentes accesorios que varían entre clústeres y que codifican proteínas que regulan la articulación/desarticulación y/o la actividad de estos sistemas37. Algunos de estos componentes han sido ampliamente estudiados en P. aeruginosa, como es el caso de la serina/treonina kinasa PpkA38. PpkA es una proteína transmembrana que posee un dominio en el periplasma y otro en el citosol, siendo este último el que posee la actividad kinasa. Esta kinasa tras su dimerización y autofosforilación, es capaz de unir y fosforilar a la proteína citosólica Fha codificada en el mismo clúster38. Según otros autores, Fha fosforilada interacciona con algunos de los componentes estructurales del T6SS como TssL39. Esta interacción permite el reclutamiento de los demás componentes del sistema, promoviendo su ensamblaje y activación para llevar a cabo la secreción de toxinas/efectores. En cambio, se ha propuesto un modelo diferente para esta cascada regulatoria en el T6SS de A. tumefaciens39. En este caso, PpkA fosforila a TssL permitiendo su dimerización, para posteriormente reclutar a Fha. De igual forma, tras la unión de Fha a TssL se da el ensamblaje del sistema39. Por otro lado, encontramos la proteína con función inversa a PpkA, la fosfatasa PppA, la cual desfosforila a la proteína diana de PpkA, en el caso de P. aeruginosa, Fha, bloqueando el ensamblaje del sistema38. Esta inhibición también puede estar mediada por el represor TagF que se une directamente a Fha, bloqueando su interacción con TssL y por tanto inhibiendo el ensamblaje del T6SS; este proceso se ha estudiado en A. tumefaciens y P. aeruginosa39. Otras proteínas accesorias que se pueden encontrar en E. coli y P. putida son TagL y TagP, respectivamente40,41. Estas proteínas poseen un dominio de unión a TssL similar al de TssM (IcmF), y además un dominio de unión a peptidoglicano (OmpA). Estos dominios le permiten establecer una interacción entre el complejo de membrana y el peptidoglicano41. Diferentes estudios han mostrado que la estructura de los T6SS está muy conservada20 a pesar de que sus componentes estructurales no tienen una homología muy alta. Se ha observado que las proteínas estructurales del T6SS están presentes en todos los grupos filogenéticos y son esenciales para la función del mismo, mientras que las accesorias son específicas de cada clúster y regulan y articulan el ensamblaje del [14] Hoeflea, Agrobacterium, Methylobacterium, Microvirga, Methylocystis, Aminobacter, Methylosinus, Ensinfer y Phyllobacterium. Mediante el uso de la herramienta BLASTp57 se obtuvieron las secuencias correspondientes a la proteína TssB del T6SS, y se recopilaron en un archivo fasta (Anexo II). Para la construcción del árbol filogenético, se usó el programa MEGA758. En primer lugar, las 161 secuencias TssB obtenidas de las 153 cepas que componen el estudio, se alinearon con el algoritmo ClustalW. El archivo obtenido se exportó en formato .meg, para la posterior construcción del árbol filogenético. Usando el algoritmo “Maximum Likehood”59 y basado en el modelo “JTT matrix” con un valor de 500 bootstrap. De esta manera, se construyó el árbol filogenético de mayor probabilidad en base logarítmica (-13307,37). El árbol inicial para la búsqueda heurística se obtuvo automáticamente aplicando los algoritmos “Neighbor-Join and BioNJ”. Para estimar las distancias de la matriz por parejas se usó el modelo JTT y luego se seleccionó la topología con el valor estadístico más alto. Hubo un total de 237 posiciones en la base de datos final. El árbol filogenético se exportó en formato .nwk para ser analizado con la herramienta iTOL60. Este software se usó para personalizar el árbol, modificando el tamaño de fuente y el tamaño de las ramas, además de los colores asignados para los distintos grupos filogenéticos dentro del árbol. La segunda parte del estudio constó de un análisis bioinformático del clúster de T6SS en S. fredii USDA257. Para su desarrollo se utilizaron distintos softwares, bases de datos y herramientas informáticas. Para el análisis de proteínas se usaron las herramientas BLASTp, SMART61 y Pfam62. La herramienta “Protein Homology/analogy Recognition Engine” (Phyre2) fue usada para las predicciones estructurales basadas en homologías63. El peso molecular y punto isoeléctrico de cada proteína se calcularon con el software ExPaSy64. Mientras que PSORTb65 se usó para la predicción de la localización celular de las proteínas. La predicción del número de dominios transmembrana fue determinada por TMHMN66. Para el alineamiento de las secuencias proteicas se usó el software Clustal Omega67. Por último, se utilizó SignalP68 y PSORTb para la predicción de posibles péptidos señal. Para la creación de figuras se usaron los programas BioRender (https://biorender.com/) y Adobe Illustrator CC2019. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El T6SS es una nanomáquina bacteriana que secreta toxinas/efectores al interior de células eucariotas y/o procariotas. Este sistema se encuentra tanto en bacterias patógenas [15] como no patógenas, principalmente en el filo Proteobacterias (α-, β- y γ-proteobacterias). El último grupo es el mayoritario y mejor estudiado, en el que se encuentran las bacterias del orden Pseudomonadales, Enterobacteriales y Xhantomonadales. Sin embargo, los grupos α- y β-proteobacterias son minoritarios54. Concretamente el grupo de αproteobacterias es el de interés en este trabajo, ya que en él se hallan las bacterias del orden Rhizobiales. Hasta la fecha se conoce muy poco sobre la función y distribución de los T6SSs en este orden por lo que en este estudio vamos a realizar un análisis filogenético de los T6SSs en Rhizobiales, seguido del estudio in sílico de un clúster de T6SS, concretamente el presente en S. fredii USDA257, de interés por su potencial papel en el proceso de simbiosis. 5.1. Estudio filogenético de los T6SS en el orden Rhizobiales. Los T6SS presentes en el filo Proteobacteria están distribuidos en cinco grupos filogenéticos denominados Grupo 1, 2, 3, 4 y 517. En este trabajo nos centraremos en los T6SS presentes en el orden Rhizobiales para conocer su distribución. En el desarrollo de este estudio se han usado como cepas de referencias de cada grupo filogenético las pertenecientes al orden Pseudomonadales, con excepción del grupo 5 cuya cepa de referencia es A. tumefaciens. Como se ha explicado en el Apartado 2.2.1, la proteína TssB forma parte de la vaina contráctil del T6SS junto a TssC y está presente en todos los sistemas estudiados69. Al ser una de las proteínas más conservadas del sistema, se ha seleccionado para llevar a cabo nuestro estudio filogenético. En este análisis utilizamos 161 secuencias proteicas correspondientes a la proteína TssB del T6SS. Para ello se eligieron un número variable de cepas pertenecientes a distintos géneros del orden Rhizobiales (Tabla 1). El T6SS de Bacteroides fragilis, alejado evolutivamente de los T6SSs de Proteobacterias, se usó como raíz del árbol (Fig. 3, verde grisáceo). Tabla 1. Listado de los géneros bacterianos incluidos en el estudio filogenético, así como el número de cepas usadas de cada género. Género Número de cepas utilizadas Microvirga 2 Methylobacterium 29 Bacteroides 1 Methylocystis 1 [16] Methylosinus 4 Aminobacter 4 Mesorhizobium 16 Hoeflea 1 Phyllobacterium 8 Agrobacterium 34 Rhizobium 44 Sinorhizobium 6 Ensifer 3 En la Fig. 3, donde se muestra el árbol filogenético de los T6SSs de Rhizobiales, podemos observar que la mayoría de éstos pertenecen a los grupos 3 (representado en color azul) con 53 miembros (34.6 %) y 5 (representado en color naranja) con 86 miembros (56.2 %). Por lo que un total de 139 clústeres (91 %) se encuentran distribuidos entre los grupos 3 y 5. Cabe destacar que nuestro organismo modelo S. fredii USDA257 (Fig. 3, indicado con una estrella y en color rojo) se halla en el grupo 3. Por otro lado, solo se encuentra un miembro del orden Rhizobiales en el grupo 2 (Fig. 3, verde) y ninguno en el grupo 4 (Fig. 3, violeta); el grupo 1 contiene 11 clústeres, es decir un 7.2 % del total (Fig. 3, rojo). [17] Figura 3. Árbol filogenético de los T6SSs del orden Rhizobiales. Las ramas que poseen círculos en negro representan un nivel de confianza ≥ 0.75. Se distinguen 5 grandes grupos: grupo 1 (rojo), grupo 2 (verde), grupo 3 (azul), grupo 4 (violeta), grupo 5 (naranja). Bacteria del género Bacteroides (verde grisáceo) representa la raíz del árbol. La estrella en rojo corresponde a la cepa en estudio S. fredii USDA257. Para ampliar nuestro conocimiento sobre el papel del T6SS de rizobios y su posible papel en los procesos de simbiosis con leguminosas o la competición interbacteriana, en este trabajo vamos a realizar un estudio in sílico del T6SS en S. fredii USDA257. [18] 5.2. Análisis bioinformático del T6SS de S. fredii USDA257. La secuenciación del genoma de S. fredii USDA257 permitió identificar dos sistemas de secreción tipo III70. El T3SS está ampliamente estudiado en este organismo, jugando un papel esencial en la simbiosis con distintas leguminosas hospedadoras. Las proteínas secretadas a través de este sistema se conocen como Nop (del inglés, Nodulation Outer Protein)71. En cambio, el papel ejercido por el T6SS en este microorganismo es aún desconocido. En este trabajo fin de grado hemos identificado por primera vez un clúster que codifica un T6SS completo en este microorganismo (Fig. 4) y que pertenece al grupo filogenético 3 (Fig. 3). Figura 4. Organización del clúster del T6SS en S. fredii USDA257. En color beige se muestran los genes que codifican los componentes del complejo de membrana (tssM, L, J), y genes que codifican proteínas accesorias (tagL, tagY, tagM). Mientras que en color magenta se hallan los genes que codifican los componentes de la placa base (tssK, G, F, E) y tssA (violeta). En verde claro se identifican los genes tssB y tssC (vaina contráctil), en azul oscuro el gen hcp que codifica la proteína que forma el tubo interno y en azul claro los genes que codifican proteínas reguladoras (tagF, fha, ppkA y pppA). En rojo se indica el gen clpV que codifica para la ATPasa. Indicado en color gris se encuentran los genes que codifican posibles efectores del sistema (vgrGe, tre2 y tre1), mientras que el gen que codifica un posible adaptador (tar) se indica en gris oscuro. El gen de función desconocida usda_c28460 se indica en color verde mientras que el gen vgrG y un fragmento del mismo están coloreados en marrón y el paar en color rosa. A través de un detallado análisis bioinformático de este clúster se han identificado veintiséis genes, de los cuales catorce codifican proteínas estructurales que darán lugar al ensamblaje del sistema: complejo de membrana (TssJ, TssM, TssL) (Fig. 4, beige), TssA (Fig. 4, violeta), placa base (TssE, TssF, TssG, TssK) (Fig. 4, magenta), vaina contráctil (TssB, TssC) (Fig. 4, verde), tubo interno (Hcp) (Fig. 4, azul oscuro), aguja (VrgG (Fig. 4, marrón), PAAR (Fig. 4, rosa) y ATPasa (ClpV) (Fig. 4, rojo). Muchos de los T6SSs descritos hasta la fecha poseen proteínas reguladoras. Un ejemplo bien estudiado es la pareja kinasa-fosfatasa PpkA-PppA, que media la activación del sistema a través de una cascada de fosforilación que termina con el ensamblaje de los componentes estructurales38,39. En el clúster en estudio hemos identificado dos genes que codifican proteínas con actividad kinasa y fosfatasa (PpkA y PppA, respectivamente), y las proteínas TagF, y Fha que interaccionan con el sistema y regulan su actividad (Fig. 4, azul). Según los resultados obtenidos, todas ellas son homólogas a proteínas reguladoras [19] de tipo VI en otros microrganismos (Tabla 2, Fig. 4), por lo que cabe esperar que desempeñen la misma función en este sistema y regulen el mismo a nivel posttraduccional. Dentro de los componentes que forman el complejo de membrana, la proteína estructural TssL posee un dominio citosólico (DotU), un dominio transmembrana, y otro periplásmico que en ocasiones puede tener un dominio de unión a peptidoglicano (OmpA) denominándose en este caso TssL especializada72. El dominio DotU de TssL (PF09850) es un dominio C-terminal (Ct) que establece una unión fuerte con el dominio citosólico IcmF de TssM y mantiene unidas estas dos proteínas del complejo de membrana72. Según el análisis realizado en nuestro estudio, observamos que la proteína del complejo de membrana TssL del T6SS de USDA257 (TssLU), posee un dominio DotU de unión a IcmF [intervalo 43-246 aminoácidos (aas)] (Fig. 5), por donde interacciona con TssMU. TssLU posee un dominio transmembrana y en el extremo Ct un dominio de unión a peptidoglicano OmpA (Fig. 5) por lo que es una TssL especializada. La predicción de localización celular indica que esta proteína está situada en la membrana interna (Fig. 5, Tabla 2). La otra proteína del complejo de membrana, TssMU, consta de tres dominios transmembrana (Fig. 5) y tres dominios conservados IcmF (COG3523) de unión a DotU (Fig. 5). Dos de ellos se encuentran en el dominio amino terminal (Nt) y el tercero en torno al intervalo 400-500 aas de un total de 1176 aas que componen la proteína. Según la predicción de localización, esta proteína se halla en la membrana interna (Fig. 5, Tabla 2). En algunos T6SS también encontramos proteínas accesorias como TagL en E. coli40. TagL es una proteína estructural con homología a TssM y que al igual que ésta posee un dominio de unión a TssL (IcmF); TagL también contiene un dominio de unión a peptidoglicano (OmpA) que no se encuentra en TssM pero que se encuentra en las TssL especializadas72. Tras analizar la proteína TagL de USDA257 (TagLU), se observa cierta similitud con la proteína estructural TssL, ya que posee en el extremo Ct terminal el dominio OmpA pero al contrario que TagL de E. coli, no tiene dominio IcmF (Fig. 5). TagLU posee un péptido señal en el extremo Nt, que sitúa a la proteína en el periplasma, y que no se encuentra en la proteína de membrana interna TssL. Según las predicciones realizadas en este estudio, TagLU se sitúa en el periplasma (Fig. 5, Tabla 2). En el clúster de USDA257, los dominios IcmF de unión a DotU (TssL) aparecen en la proteína TssM como se indicó anteriormente y también en una proteína específica [20] de este clúster, que hemos denominado TagM (Fig. 4, Tabla 2). La proteína TagM posee dos dominios IcmF (Ct) y un único dominio transmembrana a la altura del aminoácido 150 de la secuencia proteica según las predicciones de los programas TMHMM y Smart (Fig. 5). El dominio Nt de TagM es un dominio DotU (intervalo 5-125 aas, SMART), el cual se encuentra en las proteínas TssL del T6SS (Fig. 5). TagM presenta la misma probabilidad de localización en todos los compartimentos subcelulares según la herramienta PSORTb (Tabla 2), pero dada su topología podríamos esperar que esta proteína se situara en la membrana interna ya que posee un dominio transmembrana, un dominio DotU citosólico y no posee péptido señal para situarla en la membrana externa o en el periplasma (Fig. 5). Por tanto, TagM y TagL son proteínas nuevas del T6SS, las cuales poseen dominios comunes a otras proteínas estructurales que forman parte del complejo de membrana, como es el caso del dominio IcmF, de la proteína TssM y el dominio DotU de TssL para TagM y el dominio OmpA de TssL para TagL (Fig. 5). TagL y TagM parecen formar parte del complejo de membrana en USDA257 y podrían llevar a cabo funciones de anclaje a la membrana y al peptidoglicano como es el caso de TagL y TagP en E. coli y P. putida, respectivamente. Para apoyar los resultados obtenidos, también se realizó un alineamiento de estas proteínas basado en el programa Clustal Omega. Tras realizar el alineamiento entre TssM y TagM (Fig. 6A), se observó que gran parte de la secuencia proteica de ambas proteínas presentaba homología (dominio IcmF), a excepción del dominio Nt de TagM, el cual correspondía al dominio DotU. En su lugar, en TssM encontramos dos dominios transmembrana y un dominio IcmF adicional. También se realizó un alineamiento entre TssL y TagM, donde se constató la alta homología existente a nivel del dominio DotU presente en ambas proteínas en sus extremos Nt (Fig. 6C). Además, el alineamiento de las proteínas TssL y TagL mostró la similitud entre ambas secuencias ya que poseen en común el dominio OmpA de unión a peptidoglicano (Ct). Este dominio se halla en el intervalo de aminoácidos de 327-429 en la proteína TssL, mientras que en TagL se encuentra en el intervalo 146-242 (Fig. 6B). [21] Figura 5. Representación esquemática de las proteínas estructurales TssMU, TssLU, y la accesorias TagL y TagM y sus correspondientes dominios. Dominio citosólico DotU (verde azulado), dominio transmembrana (gris), dominio estructural IcmF (rojo), dominio de unión a peptidoglicano OmpA (magenta) y péptido señal (azul). ME: membrana externa, MI: membrana interna, PG: peptidoglicano. Como podemos observar, estas cuatro proteínas están interconectadas, ya que poseen dominios en común, e incluso algunas de ellas establecen uniones entre sí en la estructura del sistema. En el caso de TssLU y TagM, ambas poseen dominios DotU que interaccionan en el citosol con el dominio IcmF de TssMU. Mientras que TagLU no se conoce con qué proteína establece interacción, pero al poseer un dominio OmpA al igual que TssLU, se espera que ancle el sistema al peptidoglicano. [22] Figura 6. Alineamiento múltiple de las secuencias de las proteínas TssMU, TagM, TagLU y TssLU. Representación del alineamiento de las secuencias proteicas de TssMU y TagM (A), de las secuencias de TssLU y TagLU (B) y de las secuencias de TssLU y TagM (C). TssM1 corresponde a TssMU y TssM2 corresponde a TagM. A) B) C) [23] A continuación, entre los genes que codifican las proteínas TagL y TagM observamos un gen que codifica una proteína con función desconocida y que hemos denominado TagY (Fig. 4, Tabla 2). Nuestro estudio indica que esta proteína posee dos dominios, el primero situado en el Nt, perteneciente a la superfamilia SlyX (Pfam04102), mientras que en el Ct encontramos un dominio conocido como peptidasa M15_4 (Pfam13539). El primero de ellos es de función desconocida y no hemos encontrado ninguna predicción funcional con las distintas herramientas utilizadas en este estudio. Según la base de datos Pfam, el dominio Pfam13539 corresponde a una D-alanil D- alanina carboxipeptidasa73. A pesar de que su localización celular no se conoce, las predicciones indican que posee un dominio transmembrana en el extremo Nt y un péptido señal, por lo que esta proteína parece encontrarse anclada a la membrana de la bacteria, con el extremo Ct hacia el periplasma o hacia el exterior celular. Hasta la fecha sólo se ha descrito un clúster de T6SS que codifica una peptidasa74, hallada en Acinetobacter baumannii. Esta enzima es una endopeptidasa que digiere el peptidoglicano de la pared bacteriana, concretamente ejerce su actividad sobre los enlaces L-ala-D-glu y se denomina TagX74. Esta enzima forma un poro en la membrana bacteriana que permite la correcta formación y actuación del T6SS74. De manera similar a TagX, TagY podría estar involucrada en la rotura local del peptidoglicano a través de sus enlaces D-alanina-D- alanina para la correcta formación del T6SS en S. fredii USDA257. En los clústeres de los T6SS se pueden encontrar genes que codifican proteínas efectoras32. En el T6SS de USDA257, encontramos un gen que codifica una proteína VgrG evolucionada (VgrGe) (Fig. 7A, marrón). Una proteína VgrGe es la que posee en su dominio Ct un efector codificado en el propio gen34. El dominio Ct de VgrGe de USDA257 tiene homología con un dominio que se encuentra en proteínas pertenecientes a la superfamilia FhaB y que están implicadas en adhesión y en la utilización del grupo hemo, así como en el transporte y la secreción vesicular. En nuestro caso, la extensión de VgrGe es de 746 aas mientras que el dominio FhaB tiene una longitud de 225 aas. Los datos obtenidos nos indican que este dominio sólo corresponde con un fragmento de la proteína FhaB completa, la cual es precursora de filamentos de hemaglutinina (FHA), uno de los factores de virulencia de Bordetella pertussis75. FhaB ejerce de chaperona previniendo el plegamiento prematuro de FHA75. Este dominio Ct presenta además homología estructural con la proteína Cthe_2159 procedente de Hungateiclostridium [30] 40. Santin, Y. G. et al. Role and recruitment of the TAGL peptidoglycan-binding protein during type VI secretion system biogenesis. J. Bacteriol. 201, 1–12 (2019). 41. Aschtgen, M. S., Thomas, M. 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