Estudio multicéntrico de bacteriemias por escherichia coli productor de betalactamasas de espectro extendido: factores de riesgo, características microbiológicas de impacto clínico

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología TESIS DOCTORAL Estudio multicéntrico de bacteriemias por Escherichia coli productor de betalactamasas de espectro extendido: factores de riesgo, características microbiológicas e impacto clínico. Trabajo realizado para alcanzar el grado de Doctor por la Licenciada en Farmacia Dª. Encarnación Picón Toro Sevilla, diciembre de 2013 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología Dr. D. Álvaro Pascual Hernández, Catedrático de Microbiología de la Universidad de Sevilla y Dr. D. Jesús Rodríguez Baño, Profesor Asociado del Departamento de Medicina de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: Que la tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla que lleva por título “Estudio multicéntrico de bacteriemias por Escherichia coli productor de betalactamasas de espectro extendido: factores de riesgo, características microbiológicas e impacto clínico” ha sido realizada por Dña. Encarnación Picón Toro bajo nuestra supervisión, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación. Y para que conste donde proceda firmamos el presente certificado en Sevilla a 3 de diciembre 2013. Fdo. Dr. D. Álvaro Pascual Hernández Dr. D. Jesús Rodríguez Baño AGRADECIMIENTOS Una vez terminado este proyecto, quiero agradecer en primer lugar al Dr. Álvaro Pascual por haberme contratado y dado la oportunidad de trabajar en investigación, cosa que ya había descartado poder hacer, y por supuesto, agradecerle el poder plasmarlo después en esta tesis doctoral. Darle las gracias de nuevo al Dr. Álvaro junto al Dr. Jesús Rodríguez Baño por haber sido mis directores, y por haber tenido paciencia y tiempo para la tesis, y para mí. Agradezco al Dr. Javier Aznar que fuera mi tutor en el Programa de Doctorado y así poder finalizar todo el trabajo en forma de esta tesis. Al Dr. Evelio J. Perea le agradezco que me acogiera en el Departamento de Microbiología como doctorando. Le doy las gracias a la Red Española de Investigación en Patología Infecciosa (REIPI) por haber proyectado y financiado este trabajo. Tengo que agradecer a los compañeros del laboratorio. Al Dr. José Ramón el primero de ellos, por iniciarme en el trabajo experimental de esta tesis, y a todos los demás por haberme ayudado y colaborado de una u otra manera: Dr. José Manuel Rodríguez, Dra. Lorena López, Dra. Isabel Luque, Dra. Sofía Ballesta, Dra. Carmen Conejo, Dr. Felipe Fernández y D. Juan Alcalá. Gracias a Conce, por echarme una mano en el laboratorio cuando se lo pedí y ser amiga además de compañera de trabajo. A Paula y Lara, que repitieron unos ensayos de confirmación una vez que ya me había ido. A Pilar, por ayudarme con “el papeleo” y ser amiga y compartir los momentos de decaimiento y, por supuesto, agradecer a la Dra. Carmen Velasco que entre otras cosas me ayudó a diseñar los cebadores aportados a esta tesis. No quiero olvidarme de dar las gracias al Dr. Miguel Ángel Caviedes, profesor que en la carrera me acogió como alumna interna en su departamento y fue quien me inició en el mundo de la investigación e hizo que me entrara ese “gusanillo”. También tengo que agradecerle a mi familia, a mis amigos y a mis compañeros de trabajo el que me hayan estado apoyando y dando ánimos para que continuara con la tesis, a pesar de estar alejada ya del mundo de la universidad y de la investigación, incluso de la ciudad, hechos que a veces hacían que quisiera abandonar. A Ionel le agradezco que estuviera ahí para apoyarme, y por tener paciencia, soportar los momentos de estrés y nervios estoicamente aún cuando no he podido dedicarle mucho tiempo en los dos últimos años. A todos ellos les doy las gracias y les dedico esta tesis. Índice 16 4.3.4.5. Secuenciación de los genes codificantes de BLEE _________ 133 4.3.4.6. Sensibilidad a antimicrobianos en función del grupo de BLEE producida _________________________________________ 135 4.4. Análisis de potenciales diferencias clínico-epidemiológicas en función de la BLEE producida _______________________ 137 4.4.1. Adquisición __________________________________________ 138 4.4.2. Factores predisponentes ________________________________ 139 4.4.3. Origen de la bacteriemia ________________________________ 143 4.4.4. Tratamiento, gravedad y pronóstico _______________________ 143 4.5. Estudio descriptivo de la cohorte de casos______________ 144 4.5.1. Variables demográficas _________________________________ 144 4.5.1.1. Enfermedades de base _____________________________ 151 4.5.1.2. Utilización de procedimientos invasivos_________________ 152 4.5.1.3. Utilización de antimicrobianos previos__________________ 152 4.5.2. Clínica ______________________________________________ 153 4.5.2.1. Origen de la bacteriemia ____________________________ 153 4.5.2.2. Gravedad en la presentación_________________________ 154 4.5.3. Terapia antimicrobiana _________________________________ 155 4.5.3.1. Tratamiento antimicrobiano empírico y dirigido __________ 155 4.6. Factores de riesgo ________________________________ 160 4.6.1. Bacteriemias de adquisición comunitaria____________________ 160 4.6.1.1. Análisis univariante ________________________________ 160 4.6.1.2. Análisis multivariante ______________________________ 160 4.6.2. Bacteriemias de adquisición nosocomial ____________________ 165 4.6.2.1. Análisis univariante ________________________________ 165 4.6.2.2. Análisis multivariante ______________________________ 166 4.7. Análisis pronóstico ________________________________ 170 4.7.1. Mortalidad global ______________________________________ 170 4.7.2. Análisis de mortalidad en bacteriemias de adquisición comunitaria173 4.7.3. Bacteriemias de adquisición nosocomial ____________________ 175 5. DISCUSIÓN ____________________________________________ 181 6. CONCLUSIONES_________________________________________ 197 7. BIBLIOGRAFÍA _________________________________________ 203 8. ANEXOS_______________________________________________ 235 Índice 17 8.1. Anexo I: Protocolo de datos generales de hospital ________237 8.2. Anexo II: Protocolo de recogida de datos _______________238 8.3. Anexo III: Documento de consentimiento informado.______239 8.4. Anexo IV: Índice APACHE II _________________________240 8.5. Anexo V: Índice de CHARLSON________________________242 8.6. Anexo VI: Score de Pitt de bacteriemia _________________243 8.7. Anexo VII: Relación de antibióticos con código en el estudio 244 9. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA _________________________________247 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS Índice de tablas y figuras 21 1.1. Tablas Tabla 1. Criterios de diagnóstico de SRIS, sepsis, sepsis grave y shock séptico (Pág. 31). Tabla 2. Condiciones subyacentes, origen y mortalidad cruda según la adquisición (Pág. 33). Tabla 3. Etiología y origen de las bacteriemias dependiendo de la adquisición (Pág. 35). Tabla 4. Bacteriemias de adquisición nosocomial en diferentes grupos de pacientes (Pág. 37). Tabla 5. Recomendaciones para el tratamiento empírico del paciente con sospecha de bacteriemia de origen desconocido (Pág. 39). Tabla 6. Principales grupos antibióticos betalactámicos (Pág. 48). Tabla 7. Clasificación y propiedades de las betalactamasas según Bush, Jacoby y Medeiros (Pág. 50). Tabla 8. Clasificación de las BLEE tipo CTX-M en función del grupo al que pertenecen en base a su secuencia aminoacídica (Pág. 57). Tabla 9. Nombre de los hospitales participantes, abreviaturas empleadas, ciudad y comunidad autónoma de ubicación de los mismos (Pág. 84). Tabla 10. Áreas de los servicios hospitalarios para los casos nosocomiales (Pág. 86). Tabla 11. Características de las fases de cada ciclo de PCR para cada tipo de familia de BLEE, tras desnaturalización previa de 95 ºC durante 3’ (Pág. 112). Tabla 12. Incidencias globales de las bacteriemias nosocomiales y comunitarias en el periodo estudiado e incidencia global poblacional (Pág. 120). Tabla 13. Características, datos globales, distribución de casos totales incluidos en el estudio y en función del tipo de adquisición, comunitaria y nosocomial, e incidencias por hospital. Los datos de bacteriemias E. coli BLEE se expresan como N (%) (Pág. 121). Tabla 14. Valores de CMI 50 , CMI 90 y categoría clínica de diferentes antimicrobianos (Pág. 132). Tabla 15. Distribución de enzimas BLEE producidas por los aislados del estudio según la familia y grupo de enzima al que pertenecen, Nº (%) (Pág. 134). Tabla 16. Sensiblidad de los aislados de E. coli BLEE a los antimicrobianos más relevantes, según los criterios del CLSI 2009, CLSI 2010 y EUCAST 2011, y por el grupo de BLEE producido. Datos expresados como número de aislados (%). Todos los aislados están incluidos en los totales, los 191. De los grupos CTX-M-9, CTX-M-1 y SHV se incluyeron los aislados que sólo produjeron una BLEE (116, 38 y 29 aislados respectivamente) (Pág. 136). Tabla 17. Características clínicas y epidemiológicas de los pacientes cuyos aislados produjeron las enzimas mayoritarias de cada familia de enzimas y por grupo de familia de BLEE, N (%) (Pág. 140). Tabla 18. Características demográficas y factores predisponentes de los pacientes con bacteriemia por E. coli BLEE globales y en función de la adquisición de la infección. Los datos se expresan como Nº (%), excepto donde se especifica (Pág. 145). Tabla 19. Características clínicas y pronósticas de los pacientes con bacteriemia por E. coli BLEE globales y en función de la adquisición de la infección, datos expresados en Nº (%), excepto donde se indica (Pág. 147). Tabla 20. Número y porcentaje de pacientes que recibieron tratamiento antimicrobiano empírico, datos globales y en función de la adquisición de la infección, Nº (%) (Pág. 157). Tabla 21. Número y porcentaje de pacientes que recibieron tratamiento antimicrobiano dirigido, datos globales y en función de la adquisición de la infección, Nº (%) (Pág. 159). Índice de tablas y figuras 22 Tabla 22. Análisis univariante de factores de riesgo de pacientes caso con bacteriemias de adquisición comunitaria producidas por E. coli BLEE comparado con pacientes con sepsis de adquisición comunitaria (Control A) y con pacientes con bacteriemias de adquisición comunitaria producidas por E. coli no-BLEE (Control B), Nº (%) (Pág. 162). Tabla 23. Origen de las bacteriemias de adquisición comunitaria causadas por E. coli BLEE y E. coli no BLEE (Control B), Nº (%) (Pág. 164). Tabla 24. Análisis mulitivariante de los factores de riesgo para las bacteriemias comunitarias causadas por E. coli BLEE (Pág. 164). Tabla 25. Análisis univariante de factores de riesgo de pacientes caso con bacteriemias de adquisición nosocomial producidas por E. coli BLEE comparado con pacientes con sepsis de adquisición nosocomial (Control A) y con pacientes con bacteriemias de adquisición nosocomial producidas por E. coli no BLEE (Control B), Nº (%) (Pág. 167). Tabla 26. Origen de las bacteriemias nosocomiales causadas por E. coli BLEE comparado con pacientes con bacteriemias de adquisición nosocomial producidas por E. coli no BLEE (Control B), Nº (%) (Pág. 169). Tabla 27. Análisis multivariante de los factores de riesgo para bacteriemias de adquisición nosocomial producidas por E. coli BLEE (Pág. 169). Tabla 28. Mortalidad según CMI del antimicrobiano utilizado empíricamente (sólo o combinado). Los datos se muestran como el número de pacientes que fueron éxitus para cada CMI del antimicrobiano que recibieron de forma empírica/el número de tratados (Pág. 172). Tabla 29. Factores clínicos y pronóstico de pacientes con bacteriemias de adquisición comunitaria causadas por E. coli BLEE y E. coli no BLEE (Control B), Nº (%) (Pág. 173). Tabla 30. Análisis univariante y multivariante de las variables asociadas a la mortalidad entre los 282* pacientes (95 casos y 188 controles B) con bacteriemias de adquisición comunitaria por E. coli (Pág. 174). Tabla 31. Análisis univariante y mulitivariante de los factores de riesgo asociados a la mortalidad a día 14 (A) y día 30 (B) de pacientes con bacteriemias de adquisición nosocomial producidas por E. coli BLEE (Pág. 176). Índice de tablas y figuras 23 1.2. Figuras Figura 1. Representación gráfica de la población base de estudio (Pág. 86). Figura 2. Distribución de casos por centro hospitalario en función de la adquisición de la infección: comunitaria o nosocomial (Pág. 125). Figura 3. Distribución por hospital del número de casos de bacteriemia de adquisición comunitaria según los criterios de Friedman: estrictamente comunitarias y relacionadas con los cuidados sanitarios (Pág. 126). Figura 4. Patrones de PFGE de aislados relacionados clonalmente (Pág. 129). Figura 5. Patrones de PFGE de aislados relacionados clonalmente del HGU Gregorio Marañón (Pág. 130). Figura 6. Porcentaje de distribución de cada tipo de BLEE producida por cada uno de los centros hospitalarios participantes (Pág. 135). Figura 7. Distribución de cada tipo de enzima BLEE producida en el estudio en función de la adquisición de la bacteriemia (Pág. 138). Figura 8. Distribución del número de pacientes por edad en grupos de diez años en función de la adquisición de la bacteriemia (Pág. 144). Figura 9. Porcentaje de casos nosocomiales en función del servicio hospitalario donde se encontraba el paciente cuando se detectó la bacteriemia (Pág. 149). Figura 10. Número de casos ocurridos en cada mes del estudio en función del tipo de adquisición de la bacteriemia (Pág. 150). Figura 11. Número de casos según el origen de la bacteriemia en función de la adquisición de la infección (Pág. 153). Figura 12. Porcentaje de pacientes con bacteriemias por E. coli BLEE que padecieron características clínicas antes del tratamiento antimicrobiano y en las primeras 24 horas del mismo en función de la adquisición de la infección. (I.R.A.: Insuficiencia Renal Aguda, SDMO: Síndrome de Disfunción Multi Orgánico) (Pág. 155). Figura 13. Porcentaje de casos éxitus en función de la adquisición de la infección y el periodo de tiempo en el que se produjo desde la toma del hemocultivo: a los 14 días y entre 0-30 días (Pág. 170). Figura 14. Porcentaje de casos éxitus en función del origen de la infección y periodo de tiempo en el que se produjo desde la toma del hemocultivo: a los 14 días y entre 0-30 días (Pág. 171). Introducción 32 1.1.2. Epidemiología de la bacteriemia y la sepsis En las últimas décadas se ha observado un incremento en la incidencia de bacteriemia en la población general. La incidencia depende de la población estudiada y oscila entre 5 y 30 casos por cada 1.000 pacientes hospitalizados. En un hospital terciario de referencia de Madrid la incidencia incrementó de 16 episodios por 1.000 ingresos en 1985 a 31,2 en 2006 [210] , y en un estudio reciente realizado entre 2006- 2007 en hospitales terciarios y hospitales comunitarios de Andalucía la mínima incidencia de bacteriemia estimada en la población base fue 109,2 casos por 100.000 habitantes y año o 14,7 episodios por 1.000 ingresos [208] . Se presenta a cualquier edad y están especialmente predispuestos a padecerla los pacientes con enfermedades de base graves y los sometidos a maniobras médicas que causan alteraciones de los mecanismos generales y locales de defensa frente a la infección [34] . Así, el aumento en la incidencia de bacteriemia ha venido parejo a los cambios producidos en la práctica médica, influída por una parte por los avances tecnológicos y por otro por el envejecimiento de la población. Hay grupos de pacientes que reciben con más frecuencia tratamientos agresivos e inmunosupresores así como mayor número de maniobras diagnósticas y terapéuticas complejas (Tabla 2). Este aumento de la incidencia además se ha visto acompañado de cambios en el patrón de las bacteriemias en cuanto a microorganismos aislados, origen de la infección, adquisición comunitaria o nosocomial y resistencia a los antimicrobianos, entre otros factores [147] . La incidencia de bacteriemia por microorganismos Gram positivos y Gram negativos ha sufrido variaciones a lo largo de las últimas décadas. En la era preantibiótica existía un claro predominio de los cocos Gram positivos, pero a partir de los años 60 los bacilos Gram negativos se convirtieron en los principales agentes causantes de bacteriemia. A finales de los años 80 y principios de los 90 se produjo un resurgimiento de las bacteriemias por microorganismos Gram positivos a expensas principalmente de Staphylococcus aureus y Staphylococcus coagulasa negativo, hecho que se ha atribuido al incremento de las manipulaciones instrumentales (vasculares, genitourinarias, respiratorias), a la administración de perfusiones endovenosas, a las intervenciones quirúrgicas cada vez más agresivas (prótesis, injertos vasculares, transplantes), al uso de materiales bioprotésicos, a las enfermedades asociadas a la adicción a drogas por vía parenteral, al SIDA y a la Introducción 33 masiva utilización de antibióticos de amplio espectro activos frente a microorganismos Gram negativos. Las bacterias Gram negativas más frecuentemente causantes de bacteriemia son las enterobacterias (Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. y Serratia spp. sobre todo) y Neisseria meningitidis. En los pacientes hospitalizados se añade Pseudomonas aeruginosa y en determinados centros, Acinetobacter baumannii [210] . Tabla 2. Condiciones subyacentes, origen y mortalidad cruda según la adquisición [196] . CONDICIONES SUBYACENTES (%) PROCEDIMIENTOS PREDISPONENTES (%) ORIGEN (%) TASA BRUTA MORTALIDAD (%) ADQUISICIÓN ESTRICTAMENTE COMUNITARIA Enfermedad vascular (8-35) Diabetes mellitus (22-27) Cáncer (8-17) EPOC (11-17) Insuficiencia renal (11-22) Catéter urinario (5-13) Endoscopia (0-1) Cirugía (0-1) Tracto urinario (31-46) Tracto respiratorio (13-27) Intraabdominal (4-22) Desconocido (15) 10-19 ADQUISICIÓN COMUNITARIA ASOCIADA A CUIDADOS SANITARIOS Enfermedad vascular (12-43) Diabetes mellitus (30-31) Cáncer (10-39) EPOC (15) Insuficiencia renal (20-39) Catéter urinario (13-22) Endoscopia (18-28) Cirugía (5-6) Endoscopia (1-2) Tracto urinario (17-38) Tracto respiratorio (11-16) Intraabdominal (12-20) Catéter vascular (12-42) Desconocido (12-23) 14-27 ADQUISICIÓN NOSOCOMIAL Enfermedad vascular (11-43) Diabetes mellitus (20-27) Cáncer (9-35) EPOC (15-18) Insuficiencia renal (16-28) Catéter urinario (50-60) Catéter central (45-54) Cirugía (22-32) Endoscopia (6-12) Tracto urinario (15-19) Tracto respiratorio (7-16) Intraabdominal (13-14) Catéter vascular (24-52) Desconocido (15-27) 15-30 1.1.3. Origen y etiología de las bacteriemias en función de la adquisición Las bacteriemias se han clasificado tradicionalmente en función de su adquisición en comunitarias y nosocomiales [81] . En los últimos años se ha recomendado subdividir las bacteriemias comunitarias en dos grupos: las Introducción 34 bacteriemias relacionadas con los cuidados sanitarios y las bacteriemias estrictamente comunitarias [77] . Se consideran bacteriemias nosocomiales aquellas que aparecen tras 48 horas de ingreso en el hospital (siempre que la infección no estuviera incubándose al ingreso) y comunitarias aquellas detectadas en pacientes no ingresados y hasta las primeras 48 horas de hospitalización. Como decíamos, en los últimos años y en relación con los cambios en los modelos de atención sanitaria (particularmente, el desarrollo del sistema de atención ambulatoria de pacientes que anteriormente hubiesen precisado hospitalización) se ha recomendado subdividir las bacteriemias adquiridas en la comunidad en bacteriemias relacionadas con los cuidados sanitarios y bacteriemias estrictamente comunitarias [77] . Los criterios más aceptados para considerar una bacteriemia como relacionada con los cuidados sanitarios son [77, 223] : - ingreso en el último año en un centro hospitalario, - haber recibido tratamiento intravenoso domiciliario o algún tipo de diálisis en los últimos 3 meses, - haber recibido cuidados domiciliarios especializados en los últimos 3 meses y, - ser residente en centro sociosanitario. La importancia de esta nueva clasificación consiste en que las bacteriemias relacionadas con los cuidados sanitarios pueden asemejarse más a las nosocomiales que a las comunitarias en cuanto a la comorbilidad de los pacientes, etiología, orígenes y mortalidad [77, 223] . Debido a la reciente introducción de esta clasificación aún había escasa información diferenciada de las bacteriemias comunitarias, y en concreto sobre E. coli, cuando se inició este trabajo. En cuanto a la etiología y el origen de las bacteriemias hay importantes diferencias en función de la adquisición de las mismas (Tabla 3). Introducción 35 1.1.3.1. Bacteriemias de adquisición estrictamente comunitaria La frecuencia de las bacteriemias de adquisición estrictamente comunitaria en aquellos estudios que se ha tenido en cuenta esta diferenciación está entre el 28- 50% del total de bacteriemias [66, 208, 223, 240] . Tabla 3. Etiología y origen de las bacteriemias dependiendo de la adquisición [50] . ETIOLOGÍA (%) ADQUISICIÓN DE LA BACTERIEMIA GRAM + GRAM - MICROORGANIMOS PRINCIPALES ORIGEN (%) MORTALIDAD (%) COMUNITARIA 31 68 E. coli S. pneumoniae S. aureus Urinario (46-53) Respiratorio (12-27) Desconocido (9) 11-16 RELACIONADA CON CUIDADOS SANITARIOS 32 64 E. coli S. aureus K. pneumoniae Urinario (17-43) Catéter vascular (12-42) Desconocido (12) 20-34 NOSOCOMIAL 65 25 ECN S. aureus Enterococos Catéter vascular (26-52) Urinario (18-33) Desconocido (16) 27-37 ECN: Estafilococos coagulasa negativo La etiología de estas bacteriemias es debida principalmente a bacterias Gram negativas (alrededor de dos tercios de los casos). El microorganismo más frecuente en los estudios realizados es E. coli (49-53%), seguido de Streptococcus pneumoniae (9-11%) y Staphylococcus aureus (8%) [208, 223, 240] . La mortalidad cruda de este tipo de bacteriemia está entre el 11 y el 29% [77, 208, 223, 240] . La mortalidad está muy influenciada por la gravedad del SRIS que presenta el paciente, siendo el 78% en pacientes con shock séptico, el 32% con sepsis grave y el 4% en pacientes con sepsis [50] . El origen más frecuente de la bacteriemia estrictamente comunitaria es el tracto urinario (45-53%), en segundo lugar el tracto respiratorio (12-27%) y en tercer lugar las infecciones intraabdominales (4-9%). Entre el 7 y el 9% de estas bacteriemias son de origen desconocido [77, 208, 223, 240] . Introducción 36 1.1.3.2. Bacteriemias relacionadas con los cuidados sanitarios En el total del bacteriemias, el porcentaje que son relacionadas con los cuidados sanitarios oscila entre el 23 y el 37% [77, 208, 223, 240] . Los microorganismos más frecuentes productores de estas bacteriemias también son Gram negativos (67- 68%) [223, 240] . En concreto los agentes etiológicos predominantes son E. coli (25%), S. aureus (15%) y K. pneumoniae (9%) [208, 223] . Dependiendo de las definiciones usadas y de las diferencias en los sistemas sanitarios los orígenes más frecuentes varían. En general suelen estar implicados los catéteres vesicales e intravenosos de pacientes sometidos a hemodiálisis crónica, tratamientos intravenosos ambulatorios y diálisis peritoneal entre otros. En los pacientes que provienen de centros de larga estancia o residencia de ancianos es particularmente frecuente S. aureus resistente a meticilina (SARM) (19-32%) [77, 240] . Esto se debe a que en las residencias de larga estancia y residencia de ancianos puede haber un alto número de pacientes colonizados, con sonda urinaria y con úlcera de decúbito, siendo los orígenes más frecuentes de las bacteriemias en estos pacientes el tracto urinario y las infecciones de piel y partes blandas [223] . La mortalidad cruda de este tipo de bacteriemias está entre el 20 y 28% [77, 208, 240] . 1.1.3.3. Bacteriemias de origen nosocomial De manera global los microorganismos más frecuentes en este tipo de bacteriemias son los microorganismos Gram positivos (65%), fundamentalmente estafilococos coagulasa negativo (ECN) (31%), S. aureus (20%) y Enteroccocus spp. (9%). Entre las bacterias Gram negativas la más frecuente es E. coli (6%), seguida de Klebsiella spp. (5%) y P. aeruginosa (4%) [208, 252] . De forma más concreta la etiología de este tipo de bacteriemias varía entre centros y específicamente dentro de cada centro puede variar según el área o servicio donde se encuentre ingresado el paciente. Así, puede hacerse una clasificación más concreta atendiendo a determinados criterios (Tabla 4). Por tanto, Introducción 37 es muy importante conocer bien en cada caso la epidemiología local y del centro donde se encuentra hospitalizado el paciente para poder establecer un tratamiento antibiótico empírico adecuado. Tabla 4. Bacteriemias de adquisición nosocomial en diferentes grupos de pacientes [50] . ETIOLOGÍA (%) POBLACIÓN DE PACIENTES GRAM + GRAM - MICROORGANIMOS PRINCIPALES ORIGEN (%) MORTALIDAD (%) CON CATÉTER VASCULAR 45-60 20-40 ECN S. aureus Enterobacterias - 12-25 PACIENTES QUIRÚRGICOS 40-55 25-40 S. aureus E. coli Enterococcus spp. Catéter v. central (35) Lecho qco. (29) Desconocido 10-15 CON CÁNCER Y NEUTROPENIA FEBRIL 69-76 14-31 ECN S. aureus E. coli Catéter v. central (24) Respiratorio (7) Desconocido (56) 32 INGRESADOS EN CUIDADOS INTENSIVOS 60-70 20-35 ECN S. aureus A. baumannii Catéter v. central (57) Respiratorio (21) Desconocido (34) 25 GRANDES QUEMADOS 60 32 S. aureus P. aeruginosa ECN Quemadura (21-36) Respiratorio (14) Desconocido 3-6 En general, el origen más frecuente de las bacteriemias de origen nosocomial es el catéter vascular (14-52%), seguido de la infección del tracto urinario (18-39%), la neumonía (10-16%) y la infección intraabdominal (9-13%). En el 16% de los casos la bacteriemia es de origen desconocido [77] . La mortalidad global de estas bacteriemias es del 27-37% dependiendo de la etiología, teniendo las bacteriemias causadas por P. aeruginosa y Cándida spp. una mortalidad más alta (39%) y las causadas por ECN una mortalidad menor (21%) [77, 223, 252] . Introducción 38 1.1.4. Tratamiento de la bacteriemia El primer paso es realizar un diagnóstico precoz de sospecha para establecer la pauta de tratamiento empírico, que contribuirá a disminuir la morbilidad y mortalidad de esta patología [26, 28, 233] . En el tratamiento de la bacteriemia clínicamente significativa es importante iniciar un tratamiento sintomático y de soporte de las funciones vitales, y a la vez instaurar de forma precoz un tratamiento etiológico que puede tener varios objetivos: erradicar de la sangre al microorganismo responsable mediante el empleo de antimicrobianos y eliminar el foco de la sepsis [233] . La elección del tratamiento antimicrobiano empírico debe realizarse siempre de manera individualizada, teniendo en cuenta el foco de la sepsis, la presunción de los microorganismos probablemente implicados y la gravedad del cuadro. Aun así es posible hacer algunas recomendaciones generales, puesto que es sabido que el riesgo de que las bacterias implicadas sean resistentes a los antimicrobianos habituales es menor en la bacteriemia de origen estrictamente comunitario, en aquellos pacientes que no han recibido antimicrobianos recientemente y en aquellos que no tienen patología de base. Así como que los pacientes con bacteriemia nosocomial que han recibido tratamiento antimicrobiano previo durante varios días, en particular si padecen enfermedades debilitantes y han permanecido en el hospital durante más de cinco días, requieren en general un tratamiento antimicrobiano de mayor espectro. Una vez identificado el microorganismo y su patrón de sensibilidad a los diferentes antimicrobianos, el tratamiento empírico debe revisarse y modificarse en el caso de ser necesario para instaurar un tratamiento antimicrobiano dirigido. Debido a esto hay gran diversidad de guías sobre el tratamiento antimicrobiano, teniendo en cuenta la epidemiología de la zona y otros aspectos. La Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC) publicó unas recomendaciones para el tratamiento empírico de los pacientes con sospecha de bacteriemia de origen desconocido (Tabla 5) y para pacientes con características específicas [50] . La SEIMC en colaboración con otras sociedades ha elaborado un documento consenso para desarrollar e implantar Programas de Optimización del uso de Antimicrobianos (PROA) en hospitales españoles, debido a la compleja situación que se está produciendo por el aumento de resistencias a los antimicrobianos [209] . Adicionalmente, cada centro puede elaborar sus Introducción 39 recomendaciones en función de la epidemiología local. En el caso del Hospital Universitario Virgen Macarena estas recomendaciones están disponibles en www.hospital-macarena.com/comunicados/antibioterapia/. En concreto, antes de iniciarse este proyecto, la recomendación más frecuente para la sospecha de bacteriemia comunitaria por E. coli era el uso de cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima, ceftriaxona); para las bacteriemias nosocomiales, dado que frecuentemente hay que considerar P. aeruginosa en estos casos, solían incluirse ceftazidima, cefepima, piperacilina-tazobactam ó carbapenemas. Tabla 5. Recomendaciones para el tratamiento empírico del paciente con sospecha de bacteriemia de origen desconocido (Tomado de Guía para el diagnóstico y tratamiento del paciente con bacteriemia, SEIMC, 2006) [52] . SÍNDROME CLÍNICO TRATAMIENTO RECOMENDADO ADQUISICIÓN ESTRICTAMENTE COMUNITARIA Con sepsis Amoxicilina-clavulánico Con sepsis grave/shock séptico Ertapenem, ceftriaxona ADQUISICIÓN RELACIONADA CON CUIDADOS SANITARIOS Con sepsis Amoxicilina-clavulánico o; ceftriaxona Con sepsis grave/shock séptico Ertapenem; o imipenem, meropenem o piperacilinatazobactam + vancomicina ADQUISICIÓN NOSOCOMIAL Con sepsis Ceftriaxona, o cefepima, o imipenem, meropenem o piperacilina-tazobactam Con sospecha SARM ± Vancomicina Con sepsis grave/shock séptico Imipenem, meropenem o piperacilina-tazobactam + vancomicina ± antifúngico Introducción 40 1.2. Bacteriemias por bacilos gramnegativos 1.2.1. Epidemiología Como se ha explicado, los bacilos Gram negativos fueron los microorganismos predominantes causantes de las bacteriemias nosocomiales en EE.UU. hasta los años 80. En los años 90 aumentó la proporción de organismos Gram positivos pasando a ser los más frecuentes en la mayoría de centros. En América Latina y algunas áreas de Europa la proporción de bacteriemias causadas por bacilos Gram negativos es mayor que las identificadas en EE.UU. [21] como se aprecia en diversos estudios [82, 87, 129, 246] . En una revisión retrospectiva de 169 episodios de bacteriemias, el porcentaje de bacteriemias Gram negativas en pacientes de 65 años residentes en centros de larga estancia fue superior, del 59% [151] . En un estudio reciente en el sur de España el porcentaje de bacteriemias por Gram negativos fue 54%, de las cuales E. coli produjo el 27%. Clasificadas en función de la adquisición, los Gram negativos intervinieron mayoritariamente en las bacteriemias relacionadas con los cuidados sanitarios (64%), siendo el 58% producidas por E. coli. Asimismo los Gram negativos produjeron el 57% de las estrictamente comunitarias y el 50% de las nosocomiales, y fueron respectivamente por E. coli el 67 y el 41% [208] . En otro trabajo sobre bacteriemias realizado en Barcelona en pacientes hospitalizados con cáncer o transplantados con células hematopoyéticas el 25% se debieron a E. coli [88] . Javaloyas y cols. en un hospital pequeño de Barcelona obtuvieron datos algo superiores en cuanto a E. coli como responsable de las bacteriemias respecto a otros trabajos, explicando el hecho por el predominio de Gram positivos en grandes hospitales, donde hay mayor número de infecciones nosocomiales, pacientes en riesgo y unidades de cuidados intensivos [99] . 1.2.2. Factores de riesgo Los principales factores de riesgo identificados en pacientes con bacteriemia por Gram negativos han sido: insuficiencia hepática, hipoalbuminemia, transplante de Introducción 41 órgano sólido y de progenitores hematopoyéticos, diabetes mellitus, enfermedad pulmonar crónica, hemodiálisis, insuficiencia renal, enfermedad hematológica, tratamiento con corticosteroides, tratamiento previo con antimicrobianos, presencia de catéteres vasculares, catéteres urinarios, estancia larga de hospitalización y mayor de edad [86, 103, 123, 151, 173] . 1.2.3. Origen de la infección Hay trabajos sobre bacteriemias que investigan de forma global todos los microorganismos causantes de las mismas, siendo siempre predominante E. coli en el caso de los Gram negativos [49, 127, 210, 223, 240] . Entre estos estudios no hay grandes diferencias en los resultados en el origen de la infección por bacterias Gram negativas. En general los orígenes más frecuentes son urinario, desconocido e intraabdominal [58, 120] . En un estudio realizado por Ortega y cols. a lo largo de 18 años sobre bacteriemias por E. coli [160] , el 55% tuvieron su origen en el tracto urinario, de las cuales el 84% eran de adquisición comunitaria. Los siguientes orígenes en frecuencia fueron el desconocido y la infección biliar, 14 y 13% respectivamente. En las residencias de larga estancia, el origen más frecuente es el tracto urinario, seguido del tracto gastrointestinal y en tercer lugar el respiratorio; en las unidades de cuidados intensivos (UCI), los orígenes son por orden de mayor a menor frecuencia: tracto respiratorio, catéter venoso central e infección quirúrgica [227] . 1.2.4. Patogenia La principal manifestación clínica de las bacteriemias por Gram negativos es el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, que puede ser tan intenso como para causar sepsis grave ó shock [56] . El factor de virulencia clave en las bacterias Gram negativas influyente en el desarrollo del SRIS es el lipopolisacárido (LPS) de la pared bacteriana. Este es capaz de poner en marcha la liberación en cascada de los mediadores inflamatorios, Introducción 48 Tabla 6. Principales grupos antibióticos betalactámicos. Modificado de “Manual of clinical microbiology (9 th Edition) [150] . GRUPO BETALACTÁMICO RESISTENCIA SUBGRUPO BETALACTÁMICO ANTIBIÓTICOS PENICILINAS NATURALES Bencilpenicilina (penicilina G) Fenoximetilpenicilina (penicilina V) RESISTENTES A PENICILINASAS Meticilina Nafcilina Cloxacilina Dicloxacilina Oxacilina AMINOPENICILINAS Ampicilina Amoxicilina Bacampicilina Pivampicilina CARBOXIPENICILINAS Carbenicilina Ticarcilina UREIDOPENICILINAS Azlocilina Mezlocilina Piperacilina SEMISINTÉTICAS DE ESPECTRO EXTENDIDO COMBINACIÓN PENICILINA+INHIBIDOR BETALACTAMASAS Ampicilina-sulbactam Ticarcilina-clavulánico Amoxicilina-clavulánico Piperacilina-tazobactam CARBAPENEMAS Imipenem Meropenem Ertapenem Doripenem Faropenem Panipenem MONOBACTAMAS Aztreonam Introducción 49 CEFALOSPORINAS PRIMERA GENERACIÓN Cefalotina Cefapirina Cefradina Cefazolina Cefalexina Cefaloridina Cefadroxilo Cefroxadina SEGUNDA GENERACIÓN Cefaclor Cefamandol Cefonicida Ceforanida Cefuroxima Cefprozil Loracarbef Cefmetazol Cefminox Cefotetan Cefoxitina TERCERA GENERACIÓN Cefdinir Cefditoren Cefixime Cefoperazona Cefotaxima Cefpodoxima Ceftazidima Ceftibuten Ceftizoxima Ceftriaxona CUARTA GENERACIÓN Cefepima Cefpiroma Cefelidina Cefaclidina Introducción 50 Tabla 7. Clasificación y propiedades de las betalactamasas según Bush, Jacoby y Medeiros (modificado). INHIBIDAS POR GRUPO BUSH, JACOBY y MEDEIROS CLASE AMBLER CENTRO ACTIVO TIPO DE ENZIMA SUSTRATO PREFERIDO CLAV EDTA ENZIMAS REPRESENTATIVAS 1 C Serina Cefalosporinasas de espectro ampliado Penicilinas, Cefalosporinas de espectro restringido y extendido, cefamicinas y monobactamas - - CMY-2 a 13, LAT-1, MOX-1 y 2, FOX 1 a 6, ACT-1, MIR-1, DHA-1 y 2, ACC-1, CFE-1, algunas enzimas cromosómicas de bacterias Gram negativas 2a A Serina Penicilinasa Penicilinas + - Penicilinasas de bacterias Gram positivas 2b A Serina Betalactamasas de espectro ampliado Penicilinas Cefalosporinas 1ª gen. + - TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be A Serina Betalactamasas de espectro extendido Penicilinas Cefalosporinas 1ª-3ª gen. Monobactamas + - Numerosas variantes de SHV y TEM, CTX-M, PER, VEB, GES-1, IBC-1 2br A Serina Betalactamasas de espectro extendido resistentes a los inhibidores Penicilinas, Cefalosporinas de 1ª, 2ª y 3ª G (bajo nivel) - - TEM-50 (CMT-1), TEM-68 (CMT-2), TEM-89 (CMT-3) 2c A Serina Penicilinasa y Carbenicilinasa Penicilinas, Carbenicilina + - PSE-1, PSE-3 a 5 Serina Penicilinasas de espectro reducido Penicilinas y Cloxacilina +/- - Numerosas variantes OXA Serina Betalactamasas de espectro extendido Penicilinas, Cloxacilina, Betalactámicos de espectro extendido, a veces Monobactamas ó Cefalosporinas 3ª gen. +/- - Algnunas derivadas de OXA-2 y OXA- 10, OXA-18, 29, 30, 31, 32 y 45 2d D Introducción 51 Serina Carbapenemasas Penicilinas, Oxacilina y Carbapenemas + - OXA-23 a 27, 40, 48, 54 2e A Serina Penicilinasa y Cefalosporinasa Penicilinas y Cefalosporinas 1ª-3ª gen. + - Betalactamasa cromosómica de B. fragilis, B. uniformis, B. vulgatus, C. diversus, P. mirabilis, Y. enterocolitica, C. koseri y C. sedlakii 2f A Serina Carbapenemasa Penicilinas, Cefalosporinas 1ª-4ª gen., Carbapenemas + - NMC-A, SME-1 a 3, IMI-1, KPC-1 a 3, GES-2 3 B Zinc Carbapenemasa Penicilinas, Cefalosporinas 1ª-4ª gen. y Carbapenemas - + IMP-1 a 13, VIM-1 a 7, SPM-1, algunas enzimas cromosómicas de bacterias Gram negativas (AmpC) 4 NI* Serina Penicilinasa Penicilinas - - Enzima cromosómica de Burkholderia cepacia *NI: No incluido CLA: ácido clavulánico EDTA: ácido etilendiaminotetraacético Las dos betalactamasas más frecuentemente encontradas en las enterobacterias son las penicilinasas TEM-1 y SHV-1. La enzima TEM-1 está presente en más del 40% de los aislamientos de E. coli, y es responsable de más del 90% de la resistencia a ampicilina en este microorganismo. Debido a que se encuentra en plásmidos y en transposones se ha facilitado su diseminación a otras especies y se ha extendido por todo el mundo en numerosas especies bacterianas como P. aeruginosa, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoea, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, etc. [36] . SHV-1 está codificada en el cromosoma de la mayoría de aislamientos de K. pneumoniae [10, 48] , aunque también puede ser de origen plasmídico. Ambas enzimas son capaces de hidrolizar las penicilinas y tienen poca actividad sobre las cefalosporinas [193, 224] . El amplio uso de cefalosporinas de tercera generación desde mediados de los años 80 ha ejercido una gran presión antibiótica que ha provocado la producción de mutaciones puntuales en los genes que codifican estas betalactamasas. En general Introducción 52 las posiciones en las que se producen las mutaciones dando lugar a una nueva betalactamasa son limitadas, existen posiciones en las que ocurren con mayor frecuencia. Dichas mutaciones dan lugar a modificaciones en la secuencia de aminoácidos, con la consiguiente redistribución y cambios en la estructura terciaria de la enzima (estructura tridimensional), que afectan a su centro activo y, por tanto, a su perfil de sustrato y a su punto isoeléctrico. Estas mutaciones, que afectan de uno a seis aminoácidos de la secuencia de la betalactamasa, pueden determinar que ésta aumente su espectro y sea capaz de hidrolizar penicilinas y betalactámicos de amplio espectro, como cefalosporinas de tercera generación, monobactamas y cefalosporinas de cuarta generación, aunque no afecta a cefamicinas ni a carbapenemas. Todas estas características unidas a la inactivación por inhibidores de las serina-betalactamasas, como el ácido clavulánico, han determinado la denominación de estas betalactamasas como betalactamasas de espectro extendido (BLEE) [167] . Además de estas BLEE surgidas mediante la aparición de mutaciones en betalactamasas de menor espectro, otras BLEE han surgido de manera independiente. 1.5.2. Βetalactamasas de espectro extendido (BLEE) Las BLEE son betalactamasas plasmídicas que se denominan así debido a su capacidad de hidrolizar un rango de antibióticos betalactámicos más amplio que las denominadas de espectro ampliado (TEM-1, TEM-2 y SHV-1), en concreto los antibióticos oxi-imino-β-lactámicos (cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima) y aztreonam [36] . No son activas frente a las cefamicinas y son inhibidas también por los inhibidores de las betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam). Son producidas con mayor frecuencia por enterobacterias [168] y son estructuralmente diferentes de las betalactamasas tipo AmpC cromosómicas inducibles producidas por otros microorganismos como Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp. y P. aeruginosa, que no se inhiben por los inhibidores de betalactamasas, y además son activas frente a cefamicinas. Se describieron inicialmente en Europa a principio de los años 80, extendiéndose posteriomente por todo el mundo, fundamentalmente producidas inicialmente por cepas de K. pneumoniae [40, 251] . La primera BLEE, SHV-2, fue Introducción 53 descrita en Alemania en 1983 en una cepa de Klebsiella ozaenae aislada en el Hospital Universitario de Frankfurt [111] . En España, la primera cepa productora de BLEE se identificó en 1988 en un aislado de E. coli de la UCI infantil del Hospital Ramón y Cajal de Madrid. Desde entonces el número de nuevas BLEE descritas ha ido aumentando paulatinamente y actualmente existen más de 170 betalactamasas tipo TEM, más de 120 betalactamasas tipo SHV y más de 65 tipo CTX-M; en general en la actualidad existen más de 300 BLEE descritas. En la última década y prácticamente en todo el mundo, se ha producido un incremento de infecciones producidas por E. coli productor de BLEE, productor mayoritariamente de enzimas tipo CTX-M [29, 185, 211] , como después se explica con más detalle. Asimismo, en los últimos años han aumentado las cepas productoras de BLEE de otras enterobacterias, como Enterobacter, Salmonella, etc. [167] Los organismos productores de BLEE suelen ser microorganismos multirresistentes, por asociar frecuentemente resistencia a trimetoprimsulfametoxazol y aminoglucósidos [167] , debido a que con frecuencia, los plásmidos que vehiculizan los genes bla pueden incluir determinantes de resistencia para otros antibióticos. Además, con frecuencia son resistentes a quinolonas. En el caso de E. coli productor de BLEE es aún más relevante ya que muchas de estas cepas son frecuentemente resistentes a la mayoría de antimicrobianos recomendados para el tratamiento de infecciones de adquisición en la comunidad causadas por esta bacteria. Bush y Jacoby recogen todas las betalactamases descritas en un registro web que se actualiza periódicamente (http://www.lahey.org/Studies/), agrupadas por familias y mostrando las mutaciones con respecto a la betalactamasa de la que derivan, así como su punto isoeléctrico. 1.5.2.1. BLEE tipo TEM Las BLEE tipo TEM se originan por mutaciones en la secuencia de las betalactamasas TEM-1 y TEM-2 (que son betalactamasas que confieren resistencia a ampicilina, pero no a cefalosporinas de tercera generación). Estas betalactamasas están compuestas por 286 aminoácidos, las sustituciones más frecuentemente descritas hasta ahora ocurren en las posiciones 21, 39, 104, 164, 238, 240 y 265. Introducción 54 Dichas sustituciones conducen a un fenotipo de BLEE, las producidas en las posiciones 104, 238 y 240 son particularmente importantes en la modificación del espectro de la actividad de la enzima [101] . El punto isoeléctrico (pI) de las BLEE tipo TEM, determinado por el cambio estructural de la enzima que causan las mutaciones en la secuencia de estas betalactamasas, oscila entre 5,2 y 6,5. La primera BLEE tipo TEM descrita fue TEM-3 en 1984 en Francia [225] , que se diferencia de TEM-2 por los cambios Glu104Lys y Gly238Ser, que elevan el pI a 6,3 y favorecen la hidrólisis de cefalosporinas de amplio espectro. Una de las BLEE tipo TEM más estudiada es TEM-24, ha estado implicada en importantes brotes en Francia [20, 59] , Italia [178] y España [219] . Otra BLEE tipo TEM ampliamente descrita en los últimos años y en diferentes partes del mundo es TEM-52 [59, 100, 178] , tiene la peculiaridad de hidrolizar moxalactam. Las BLEE tipo TEM, junto con las SHV, hasta hace unos años eran las más frecuentes, tanto en EE.UU. como en el resto del mundo [101] . Otras variantes de TEM son las IRTs (Inhibitor Resistant TEM, TEM resistente a inhibidores de betalactamasas), que no se inactivan con clavulánico ni sulbactam y por tanto, no son consideradas BLEE. También se han descrito cinco enzimas derivadas de TEM-1 no consideradas BLEE, que comparten características de BLEE y de IRT (TEM-50, TEM-68, TEM-89, TEM-121 y TEM-125) y que han sido denominadas complejo de enzimas mutantes (Complex Mutant Enzymes, CME). 1.5.2.2. BLEE tipo SHV El gen bla que codifica la betalactamasa SHV-1, de la que derivan las BLEE tipo SHV, se encuentra en el cromosoma de más del 90% de las cepas de K. pneumoniae [10, 48, 126] y en bajo porcentaje en los plásmidos que codifican resistencia a betalactámicos en enterobacterias [67, 143] . Existe un número menor de BLEE tipo SHV. La mutación más común en las BLEE derivadas de SHV-1 se produce en las posiciones 238 y 240, los cambios de aminoácidos en estas dos posiciones son críticos para una hidrólisis eficaz de ceftazidima y cefotaxima respectivamente. SHV-2 tiene una única sustitución con respecto a SHV-1 que no altera su pI pero que produce un aumento en la capacidad de hidrolizar ceftazidima. Esta enzima Introducción 55 fue la primera BLEE que se describió en España [12] y la implicada en la primera epidemia española de resistencia a cefalosporinas de tercera generación [75] . SHV-5 fue identificada en Chile en un paciente con una bacteriemia por K. pneumoniae en 1987 [89] , desde entonces esta enzima se ha diseminado por todo el mundo [16, 38, 71, 152, 187, 238] incluida España; donde Briñas y cols. [38] describieron un brote causado por K. pneumoniae productor de SHV-5 en una UCI neonatal durante un año. Una de las BLEE más extendida en la actualidad derivada de SHV-1 es SHV- 12, con el cambio de aminoácido en la posición 35 y un pI de 8,2. Esta enzima fue descrita por Nuesch-Inderbinen y cols. [158] en un estudio multicéntrico realizado en Suiza durante 2 años (1993-1995). Durante años, tanto en la cuenca Mediterránea como en países asiáticos, a orillas del Pacífico, la BLEE hallada más frecuentemente fue SHV-12 [19, 46, 114, 118, 156, 249, 258] . En Canadá se realizó un estudio multicéntrico [148] donde encontraron que SHV-12 era la BLEE más frecuente en aislados de E. coli y K. pneumoniae en todos los hospitales participantes, supuso el 39% de todas las BLEE detectadas. En España SHV-12 se había descrito fundamentalmente en cepas de E. coli que producían infecciones en animales [39, 231] , y posteriormente ha ido hallándose en pacientes. En un estudio multicéntrico realizado en España en el año 2000 la enzima SHV-12 fue la segunda BLEE más frecuentemente hallada, aisladas de 16 hospitales distintos localizados en nueve comunidades autónomas diferentes [93] . Asimismo, empezaron a describirse casos en los que un aislado producía dos tipos de BLEE, siendo comúnmente una de esas enzimas SHV-12 [41, 63, 93, 202, 203, 205] . También se ha descrito una variante de SHV-1 resistente a inhibidores (SHV- 10), activa frente a penicilinas y considerablemente reducida actividad sobre cefalosporinas. 1.5.2.3. BLEE tipo CTX-M Parece ser que los genes que codifican la betalactamasa CTX-M habrían “saltado” del cromosoma de Kluyvera a uno o varios plásmidos, y posteriormente una vez integrados en éstos habrían diseminado a otras especies [29] . Introducción 56 Los aminoácidos más importantes para la actividad tipo BLEE se encuentran en las posiciones 237 (serina) y 276 (arginina); el pI de esta familia de enzimas oscila entre 7,5 y 9. Se inhiben mejor con tazobactam que con clavulánico o sulbactam, a diferencia de las betalactamasas de las familias TEM y SHV, con las que tienen solamente un 40% de homología en su secuencia. Sin embargo se ha encontrado una homología superior al 90% entre los genes bla CTX-M de las enzimas plasmídicas de CTX-M y determinados genes presentes en el cromosoma de especies de Kluyvera. La primera betalactamasa tipo CTX-M se describió en 1989, cuando Bauernfeind y cols. [15] informaron de una cepa de E. coli que producía una BLEE que no era TEM ni SHV, a la que llamaron CTX-M-1 ya que hidrolizaba cefotaxima. Antes, en 1986 Matsumoto había descrito en Japón [137] una BLEE que no era de los tipos TEM ni SHV y que fue denominada FEC-1, posteriormente se vio que la secuencia de dicha enzima era prácticamente igual a otra denominada CTX-M-3. En 1998 se reconoció a las enzimas CTX-M como una familia independiente de BLEE [85] . Desde entonces han tenido una rápida diseminación por el mundo entre una gran variedad de enterobacterias, hecho favorecido por la existencia de elementos genéticos, como es el caso de secuencias de inserción en el entorno del gen que codifica CTX-M [186] . Las BLEE tipo CTX-M se caracterizan por hidrolizar más intensamente cefotaxima (de ahí su nombre, cefotaximasas) que ceftazidima; sin embargo, han ido surgiendo variantes con mutaciones puntuales que les conferían mayor capacidad de hidrólisis sobre ceftazidima que las enzimas de las que derivaban [29] . Las BLEE de la familia CTX-M se han dividido en 6 grupos filogenéticos de acuerdo con la similitud de sus secuencias de aminoácidos (los integrantes de cada grupo tienen más del 94% de similitud entre ellos y menos del 90% con las demás enzimas CTX-M). Cada grupo parece tener orígenes filogenéticos diferentes; debido a los hallazgos de genes en diferentes especies de Kluyvera hasta el momento se piensa que el grupo CTX-M-1 procede de la betalactamasa cromosómica de clase A de Kluyvera ascorbata, el grupo CTX-M-2 de la de K. cryocrescens, el grupo CTX-M-8 de K. georgiana y el grupo CTX-M-9 podría proceder también de K. georgiana [159] . Los orígenes de CTX-M-25 y CTX-M-45 aún permanecen sin identificar, pero probablemente sean otros miembros del género Kluyvera [213] . Las similitudes en dichas secuencias son desde un 80 al 100% de homología (Tabla 8). Introducción 57 Tabla 8. Clasificación de las BLEE tipo CTX-M en función del grupo al que pertenecen en base a su secuencia aminoacídica [213] . GRUPO ENZIMAS INTEGRANTES CTX-M-1 CTX-M-1, -3, -10, -11, -12, -15, -22, -23, -28, -29, -30, -32, -33, -34, -36, -37, -42, -52, -53, -54, -57, -58, -60, y -61 CTX-M-2 CTX-M-2, -4, -5, -6, -7, -20, -31, -35, -43 y -44 CTX-M-25 CTX-M-25, -26, -39 y -41 CTX-M-8 CTX-M-8, -40 y -63 CTX-M-9 CTX-M-9, -13, -14, 16, -17, -18, -19, -21, -24, -27, -38, -46, -47, -48, -49, -50, -51, -55 y -65 CTX-M-45 CTX-M-45 CTX-M-2 y CTX-M-3, son las que se han descrito en más especies distintas de enterobacterias: Salmonella, E. coli, K. pneumoniae, V. cholerae, P. mirabilis, Enterobacter, C. freundii, S. marcescens, M. morganii, K. oxytoca, Aeromonas y Shigella. CTX-M-9 fue identificada por Sabaté y cols. [215] en España en 1996 en una cepa de E. coli resistente a cefotaxima. Esta enzima se diseminó rápidamente, encontrándose en otros países como Brasil, Francia, Reino Unido, China y otros países asiáticos [14, 30, 45, 218] . El gen que codifica CTX-M-9 se ha detectado formando parte de integrones que facilitarían esta diseminación [226] . Una enzima del grupo CTX-M-9 muy extendida es CTX-M-14; se trata de una variante de CTX-M-9 que se diferencia por la sustitución Ala231Val. Se describió prácticamente de forma simultánea en Corea [164] , Francia [69] , China [45] y Japón [131] en aislamientos de E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae y S. sonnei. En algunos países es la BLEE más frecuente del grupo de las CTX-M. En estudios de China y Calgary (Canadá) el 50% o más de las BLEE CTX-M producidas por enterobacterias eran CTX-M-14 a finales de los años noventa y principios del nuevo siglo [149] . En España Bou y cols. [33] identificaron esta enzima en cepas de E. coli no relacionadas clonalmente y causantes principalmente de infecciones del tracto urinario. En 2004, Romero y cols. [212] , describieron la primera cepa de S. enteritidis productora de CTX-M-14 en España. La Introducción 64 llegar a los humanos. Entre ellos se han estudiado y encontrado en aves de corral [248] , en nuestro medio se ha encontrado E. coli BLEE en el 67% de muestras de carne de pollo [65] . En Dinamarca en 2009 se investigó la prevalencia de E. coli productora de cefalosporinasas de expectro extendido tanto en cerdos de matadero daneses como en carnes de venta al por menor, de origen danés e importada, concluyendo que el uso de cefalosporinas en los cerdos puede incrementar la prevalencia de E. coli con cefalosporinasas en cerdos [2] . Finalmente, en cuanto a las características de los pacientes, la mayor edad, que a su vez conlleva más enfermedades de base, con más atención hospitalaria y más cuidados que conducen a la exposición del paciente son factores que favorecen la adquisición de microorganismos productores de BLEE. Muchos de estos factores concurren en las residencias de ancianos o centros de cuidados de larga duración, además de otros factores como el reservorio intestinal, los fómites etc; convirtiendo a estas instituciones por sí mismas en un reservorio importante de BLEE que conlleva la reintroducción de la bacteria en los hospitales [31, 32, 37, 220, 250] . Un factor de riesgo importante, sobre todo en áreas no endémicas, es el hecho de viajar a otros países que sí lo son [179] . Ya hemos comentado que los primeros microorganismos productores de BLEE en España se describieron en 1988 en una paciente de la UCI pediátrica del Hospital Ramón y Cajal, que tuvo dos aislamientos de E. coli productor de SHV-2 [12] . Posteriormente en un estudio retrospectivo de la Clínica Puerta de Hierro de Madrid se halló una cepa de K. pneumoniae de 1985 y dos de E. coli en 1987 con fenotipo compatible con la producción de enzimas plasmídicas tipo BLEE. Asimismo, la primera epidemia por cepas productoras de BLEE en el país ocurrió en Madrid entre los años 1988 y 1990 en el Hospital Clínico San Carlos, incluyó 59 aislamientos en total de varias bacterias: K. pneumoniae, S. marcescens, K. oxytoca y E. coli. Todas las cepas expresaban una betalactamasa compatible con SHV-2 [75] . En un estudio posterior en el que se analizó la resistencia a cefalosporinas de amplio espectro en aislados de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli en un hospital de Barcelona entre 1994 y 1996, hallaron una prevalencia muy baja de producción de BLEE, 0,14% en E. coli (10 cepas) y 0,17% en K. pneumoniae (1 cepa). La BLEE expresada por mayor número de aislamientos fue CTX-M-9 (6 de 10) [216] . El incremento de producción de BLEE, la sustitución de K. pneumoniae por E. coli y de enzimas de la familia SHV y TEM por CTX-M se pudo comprobar en España y en nuestra zona mediante varios estudios. Diestra y cols. hallaron una alta Introducción 65 producción de enzimas BLEE de la familia CTX-M, el 80%, en un estudio multicéntrico en el primer trimestre de 2004, siendo predominate la CTX-M-14 (46%) seguida de CTX-M-9 (21%) y por último de SHV-12 (22%). Ninguna de las cepas producía enzimas de la familia TEM ni de otro tipo de SHV, asimismo había una gran diversidad de la familia mayoritaria [63] . En el área norte de Sevilla se investigó la presencia de aislados productores de BLEE en E. coli y K. pneumoniae a lo largo de 9 años, 1995-2003 [211] . El porcentaje de producción de BLEE aumentó en E. coli de 0,31% en 1995 a 4,8% en 2003 mientras que disminuyó en los aislados de K. pneumoniae de 7,2 a 2,5% respectivamente. El tipo de BLEE producido pasó de 100 a 66% de SHV para Klebsiella y del 100% de SHV al 61% de CTX-M para E. coli. Precisamente en nuestra zona la primera BLEE de la familia CTX-M (CTX-M-9) producida por E. coli fue detectada en 1999 en este trabajo. Asimismo se hallaron otras diferencias epidemiológicas entre las dos bacterias, las cepas de E. coli presentaron una gran diversidad clonal y entre las de K. pneumoniae se encontraron algunas cepas epidémicas predominantes. La mayoría de las cepas de K. pneumoniae se aislaron en pacientes ingresados, aproximadamente la mitad de E. coli se aislaron en este tipo de pacientes. Se hallaron datos similares en un estudio multicéntrico español realizado en el año 2000 [93] . En un centro hospitalario de Sevilla se investigó durante cuatro años la producción de BLEE en pacientes con bacteriemias por E. coli, donde el 70% de dichas enzimas fueron de tipo CTX-M [202] . En algunos trabajos se han encontrado diferentes características epidemiológicas según el tipo de BLEE; en un estudio realizado en el Hospital Universitario Virgen Macarena con cepas nosocomiales de E. coli productor de BLEE se apreció que los aislados productores de CTX-M no tenían relación clonal y probablemente habían sido importados de la comunidad, mientras que los aislados productores de BLEE tipo SHV y TEM sí eran clonales y de más clara adquisición nosocomial [203] . Los resultados con cepas comunitarias son contradictorios [41, 204] . Introducción 66 1.7.1. Enterobacterias productoras de BLEE de adquisición comunitaria Como hemos comentado, inicialmente prácticamente la totalidad de los aislamientos de microorganismos productores de BLEE eran de origen nosocomial, y fundamentalmente de K. pneumoniae. Posteriormente se produjo un aumento de enterobacterias BLEE positivas distintas a esta bacteria, sobre todo E. coli, y un incremento en los aislamientos de origen comunitario. Las cepas de E. coli productora de BLEE, y particularmente las productoras de BLEE tipo CTX-M, están diseminadas por todo el mundo. De forma global aproximadamente la mitad de los casos de infección por E. coli productor de BLEE afectan a pacientes no hospitalizados [182, 185, 204, 211, 254] . En ellos, el tipo más frecuente de infección es la infección del tracto urinario [185, 204, 206] . Las bacteriemias causadas por E. coli productor de BLEE son la consecuencia clínicamente más grave de este problema [17, 180, 202, 208] . En nuestro área hospitalaria durante los primeros años de la década del 2000, el 12% de las infecciones causadas por E. coli productor de BLEE en pacientes no hospitalizados [204] y el 16% de las ocurridas en pacientes hospitalizados fueron bacteriémicas, respectivamente [203] . Esta situación supone un reto asistencial puesto que los antimicrobianos habitualmente recomendados como terapia empírica para el tratamiento de la sepsis comunitaria y nosocomial originadas en el tracto urinario, cefalosporinas y quinolonas, no son activos frente a la mayoría de estos aislados. Se han realizado diversos estudios para identificar los factores de riesgo para infecciones por microorganismos productores de BLEE en pacientes no hospitalizados, y específicamente para las del tracto urinario. Los resultados hallados en uno de los primeros de estos estudios, realizado en Israel, fueron que haber estado ingresado en los tres meses previos, haber recibido tratamiento antibiótico en ese periodo, ser mayor de 60 años y varón, ser diabético, que la infección fuera por K. pneumoniae y haber sido tratado previamente con cefalosporinas de segunda o tercera generación, quinolonas y penicilina, predisponen a una infección por bacterias productoras de BLEE [54] . En estudios específicos para infecciones por E. coli productores de BLEE en la comunidad realizados en nuestro medio se encontró la diabetes mellitus, la infección relacionada con los cuidados sanitarios, la infección urinaria de repetición, y el haber recibido recientemente aminopencilinas, quinolonas o cefalosporinas eran factores de riesgo [41, 203, 204] . Introducción 67 La colonización con cepas multirresistentes, incluyendo las productoras de BLEE, constituye un riesgo e incluso un prerrequisito para la infección por estos microorganismos [242] . En España se ha comprobado el aumento de portadores fecales de E. coli BLEE. En Barcelona analizaron a lo largo de tres periodos diferentes entre 2001 y 2002 la presencia de enterobacterias productoras de BLEE positivas en heces de pacientes no hospitalizados [144] . Hallaron un incremento en el porcentaje de portadores fecales de cepas productoras de BLEE del 2,1 al 7,5%. El mismo hecho se descubrió en Madrid donde analizaron la presencia de enterobacterias productoras de BLEE en muestras de heces recogidas de pacientes ingresados o no en los años 1991 y 2003 [242] . La prevalencia de portadores fecales de cepas BLEE en el primer periodo fue 0,7% en los pacientes ambulatorios y 0,3% en los hospitalizados. Mientras que en 2003 la prevalencia de los primeros fue 5,5% y de los segundos 11,8%, se había invertido según el origen del paciente, pero aumentado en general en número, así como en variedad de tipo de BLEE. Más recientemente en Sevilla se calculó la prevalencia de portadores fecales en pacientes con infecciones del tracto urinario por E. coli BLEE de adquisición comunitaria, siendo 67,9%. A su vez la investigaron en familiares convivientes de dichos pacientes y en familiares no convivientes, siendo las prevalencias 27,4 y 15,6% respectivamente. También hallaron una prevalencia del 7,4% en un grupo control de pacientes de urgencias no relacionados con los primeros. En dicho estudio se concluyó que tanto la adquisición común, debida tal vez a la alimentación o hábitos alimenticios, como la transmisión persona a persona pueden contribuir a la diseminación de las BLEE [197] . 1.7.2. Enterobacterias productoras de BLEE de adquisición nosocomial Los brotes nosocomiales de K. pneumoniae productor de BLEE pueden estar causados por la diseminación de un plásmido entre distintas especies de enterobacterias o más frecuentemente por la diseminación de un clon [133, 165, 170] . Las enzimas más frecuentemente producidas por estas cepas epidémicas habían sido TEM y SHV hasta los años 90, pero en la última década predominan los productores de enzimas CTX-M. El consumo elevado de cefalosporinas puede favorecer la selección de estos clones, algunos de los cuales se diseminan con particular facilidad en centros o servicios hospitalarios mediante transmisión cruzada entre pacientes de Introducción 68 riesgo [40, 142, 168, 175, 192, 250] . También se han descrito brotes de Enterobacter spp. productores de BLEE [42, 241] , así como situaciones complejas producidas por K. pneumoniae multiclonal [241] . En el caso de E. coli, las infecciones nosocomiales han sido causadas principalmente por cepas no relacionadas clonalmente, pero también se han hallado en el medio hospitalario casos esporádicos, sugiriéndose que podrían haber sido importados de la comunidad al hospital [17, 91, 203] , aunque en otros puede haber existido transmisión horizontal dentro del hospital y en centros de larga estancia [8, 203, 250] . Otro factor a tener en cuenta y que facilita la dispersión es que la estancia de estos pacientes en el hospital suele ser prolongada, hecho que aumenta la exposición a la flora nosocomial [97, 186] . El hecho de que el personal no cumpla estrictamente las medidas de higiene de manos entre distintos pacientes favorece la transmisión de estas bacterias entre enfermos ingresados a través de las manos del personal sanitario [4, 84] . Ante la aparición de brotes de microorganismos productores de BLEE en el hospital hay que poner en marcha medidas específicas de control, como la búsqueda activa de pacientes colonizados, la limpieza ambiental exhaustiva, la instauración de precauciones de contacto con los pacientes colonizados o infectados y la restricción del uso de cefalosporinas de tercera generación, como se ha demostrado en diversos trabajos [9, 36, 97, 175] ; también se ha planteado la sustitución de cefalosporinas por betalactámicos con inhibidores de betalactamasas [171, 192] . 1.8. Relevancia clínica y pronóstica de las infecciones causadas por microorganismos productores de BLEE Como se ha comentado anteriormente, la producción de BLEE tiene implicaciones clínicas. Diferentes autores han estudiado el impacto de la producción de BLEE en el curso clínico de los pacientes con infecciones graves. La infección por enterobacterias productoras de BLEE conlleva un retraso significativo en el inicio del tratamiento antibiótico efectivo, la hospitalización es más prolongada y el coste hospitalario global es mayor [113, 115, 222] . Introducción 69 Además, en dos meta-análisis se ha demostrado que sufrir una infección por un microorganismo productor de BLEE es un factor independiente asociado con la mortalidad en bacteriemias, como se explicará más adelante [214, 221] . 1.8.1. Bacteriemias por enterobacterias productoras de BLEE Como se ha comentado, los procesos bacteriémicos por enterobacterias productoras de BLEE son muy frecuentes en la actualidad, fundamentalmente los producidos por E. coli productor de enzimas de la familia CTX-M. Aunque se han realizado distintos trabajos epidemiológicos para estas infecciones [32, 68, 110, 220, 253] , existen diferencias importantes en la epidemiología en función de la localización geográfica y en los criterios de inclusión de casos. En los años en que se realizó este trabajo se publicaron algunos trabajos sobre bacteriemias productoras de BLEE en Turquía, China, Corea y el Reino Unido sobre bacteriemias por E. coli BLEE [22, 102, 139, 141] . En estos, los orígenes más frecuentes de las infecciones bacteriémicas fueron urinario, biliar y desconocido; la mortalidad cruda varió entre el 0 y el 61%, un rango muy amplio debido a las diferencias metodológicas de los estudios. Desde la perspectiva de la totalidad de las bacteriemias, un estudio multicéntrico realizado en Andalucía entre 2006 y 2007 mostró que, entre las bacteriemias por E. coli, las cepas productoras de BLEE fueron el 19% de las nosocomiales, el 8% de las relacionadas con los cuidados sanitarios y el 9% de las estrictamente comunitarias [208] . En trabajos específicos sobre los factores de riesgo para las bacteriemias causadas por E. coli productor de BLEE, había muy poca información cuando se publicaron los resultados de este trabajo. Así, en un estudio realizado en Hong Kong durante 3 años, la enfermedad de base grave, la infección nosocomial y el origen urinario fueron factores de riesgo [95] . En otro estudio realizado solo en nuestro hospital durante algo más de 4 años encontramos el seguimiento del paciente en consultas externas previo al episodio bacteriémico, el catéter urinario y la exposición a fluorquinolonas y OIBL [195] . Se ha analizado la implicación de la producción de BLEE en el pronóstico en pacientes con bacteriemia por enterobacterias. En 2007 se publicó un meta-análisis en el que se evaluó el pronóstico de las bacteriemias por organismos productores de Introducción 70 BLEE en comparación con los no productores de BLEE [221] . La bacteriemia por enterobacterias productoras de BLEE se asoció con una mayor mortalidad (RR=1,85; IC 95%: 1,39-2,47); asimismo se relacionó la producción de BLEE con retraso en el inicio de la terapia adecuada (RR = 5,56; IC 95%: 2,95-10,51), aunque sólo un estudio de los 16 analizados realizó análisis multivariante dando como resultado que la producción de BLEE era una variable asociada de manera independiente con la mortalidad [222] . Recientemente, otro meta-análisis ha mostrado resultados similares [214] . En un amplio estudio multicéntrico europeo se evaluó el impacto pronóstico de resistencia a cefalosporinas de tercera generación en bacteriemias por E. coli, de forma que se realizó la comparación de dos cohortes de casos con bacteriemias por E. coli, una de ellas con dicha resistencia y otra no, con controles sin bacteriemia. Concluyeron que las bacteriemias por E. coli resistentes a cefalosporinas conllevan un aumento en la mortalidad y en la estancia en el hospital, con el consiguiente aumento de gastos [60] . En Roma, en un estudio de cohortes retrospectivo de bacteriemias por enterobacterias productoras de BLEE los predictores de mortalidad fueron el tratamiento empírico inadecuado y la bacteriemia de origen desconocido [236] . 1.8.2. Tratamiento de las infecciones causadas por microorganismos productores de BLEE Las opciones terapéuticas para tratar estas infecciones son muy limitadas puesto que se trata con frecuencia de bacterias multirresistentes. Por otra parte hay que tener en cuenta que las tasas de resistencia a los diferentes antimicrobianos varían entre países, entre ciudades e incluso entre hospitales, por lo que las guías de tratamiento empírico deben elaborarse en función de estas características para cada zona geográfica. En la actualidad el CLSI y EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) recomiendan en sus guías que las cepas productoras de BLEE sean informadas tal como resulten tras aplicar los puntos de corte establecidos en sus guías, sensible o resistentes. Anteriormente se recomendaba informarlas siempre Introducción 71 como resistentes a los OIBL en el momento que se detectase una enzima de este tipo, independientemente de los valores de CMI in vitro hallados [51, 72] . Las cefamicinas presentan actividad in vitro frente a estos microorganismos, pero su uso como tratamiento en infecciones por éstos puede producir selección de mutantes con alteración en la expresión de proteínas de membrana externa. Esto conlleva una disminución de la permeabilidad celular, que dificulta el acceso de los betalactámicos a la membrana citoplásmica y, por tanto, provoca la resistencia a su acción. Además, el uso de cefamicinas también puede provocar la aparición de resistencia mediada por AmpC plasmídica [135, 136] . Los antimicrobianos que muestran más frecuentemente actividad in vitro frente a enterobacterias productoras de BLEE son las carbapenemas y algunas combinaciones de betalactámicos con inhibidores de betalactamasas (BLIBL), particularmente piperacilina-tazobactam [33, 95, 204, 212] . Las carbapenemas son consideradas los fármacos de elección en el medio hospitalario para infecciones graves por enterobacterias BLEE debido a su estabilidad y actividad frente a estas betalactamasas. En cualquier caso, se plantea un importante dilema para el clínico, que puede verse en la necesidad de utilizar carbapenemas (antimicrobianos de muy amplio espectro habitualmente reservados para infecciones nosocomiales causadas por microorganismos multirresistentes) para el tratamiento de sepsis comunitarias y nosocomiales en las que pueda estar implicado E. coli, ante la incertidumbre de que este pueda ser productor de BLEE, situación que conduciría a una sobreutilización de estos antimicrobianos con consecuencias imprevisibles, como está ocurriendo, puesto que se están hallando cepas resistentes a carbapenemas y cepas productoras de carbapenemasas. Las combinaciones de BLIBL son activas frente a microorganismos productores de BLEE. Sin embargo en el caso de que además hiperproduzca una betalactamasa cromosómica (SHV-1) o exista la producción simultánea de más de una BLEE, hecho cada vez más frecuente, puede aparecer resistencia a estos antimicrobianos. Además, piperacilina-tazobactam presenta efecto inóculo, como ocurre con las cefalosporinas [217] , lo que no ocurre con amoxicilina-clavulánico [128] . En un estudio reciente de Rodríguez-Baño y cols. obtuvieron datos que refuerzan la utilización de combinaciones de BLIBL en el tratamiento de infecciones por E. coli productora de BLEE [199] . En infecciones no complicadas del tracto urinario producidas por estos microorganismos puede utilizarse amoxicilina-clavulánico como tratamiento de segunda elección en cepas sensibles in vitro [167, 206] . Introducción 72 Fosfomicina es adecuada frente a muchos de estos microorganismos y es útil para las cistitis por E. coli BLEE [206] . Su uso ha ido aumentando. Desde 2004 a 2008 aumentó el consumo de fosfomicina en un 50% y ha comenzado a apreciarse un incremento de resistencia en los microorganismos productores de BLEE. La resistencia pasó de 2,2 a 21,7% en un estudio realizado en Madrid, siendo la mayoría de las BLEE de tipo CTX-M-15 [162] . Lo mismo ocurrió en un estudio multicéntrico realizado en España en el que la resistencia aumentó de 4,4 a 11,4% en 4 años (2005-2009) [161] . No existe experiencia publicada en el tratamiento de bacteriemias. En un alto porcentaje estos microorganismos productores de BLEE también presentan resistencia a las quinolonas y aminoglucósidos [18] . Tumbarello y cols. comprobaron que 8 de 16 pacientes con bacteriemia por enterobacterias productoras de BLEE tratados con ciprofloxacino fallecieron [236] . Las CMI a este antibiótico fueron entre 0,5 y 1 µg/mL, es decir, estaban en el límite de sensibilidad. Otra opción para el tratamiento empírico de la sepsis urinaria es el uso de un aminoglucósido, amikacina fundalmentalmente, ya que es el más activo frente a estas bacterias. Aunque esta recomendación depende de los patrones locales de sensibilidad del organismo productor de BLEE, y hay que tener en cuenta que no se recomienda la terapia prolongada de aminoglucósidos para pacientes de edad avanzada. 3. MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 83 3.1. Diseño del estudio Para investigar la incidencia y las características clínicas y pronósticas de la bacteriemia por E. coli productor de BLEE, así como el pronóstico (objetivos 1, 3 y 4) se realizó un estudio de cohortes multicéntrico prospectivo. Para investigar los factores de riesgo para la bacteriemia por E. coli BLEE (objetivo 2) se diseñó un estudio de casos (formado por los pacientes de la cohorte anterior) y dobles controles. 3.1.1. Distribución geográfica, hospitales y poblaciones referencia El estudio fue de ámbito nacional, coordinado por la Red Española de Investigación en Patología Infecciosa (REIPI), en el que participaron trece hospitales pertenecientes a dicha red y un centro asociado. El estudio no pretendía ser representativo del territorio nacional. Los centros participantes se distribuían en 5 áreas geográficas de España: norte, sur, este, centro y noroeste; siendo la comunidad catalana la más representada con 6 hospitales seguida de Madrid y Andalucía con 2 hospitales cada una (Tabla 9). El conjunto de hospitales atendía a una población superior a 7 millones de habitantes (Tabla 13). El periodo de estudio fue desde el 14 de octubre de 2004 al 17 de enero de 2006 (15 meses). Casi la totalidad de los hospitales eran de tipo universitario y todos tenían unidad de cuidados intensivos. El número de camas por hospital fue desde 282 hasta 1.702, siendo la media de 955 camas. No había equivalencia entre número de camas y población atendida, puesto que en algunas áreas sanitarias hay centros concertados de forma que no toda la población adjudicada a estos hospitales acude a ellos, pasando estos hospitales participantes a realizar funciones de centros de referencia. Material y métodos 84 Tabla 9. Nombre de los hospitales participantes, abreviaturas empleadas, ciudad y comunidad autónoma de ubicación de los mismos. HOSPITAL ABREVIATURA CIUDAD COMUNIDAD AUTÓNOMA Hospital Universitario Virgen Macarena HUV Macarena Sevilla Andalucía Hospitales Universitarios Virgen del Rocío HHUUV Rocío Sevilla Andalucía Hospital Universitari de Bellvitge HU Bellvitge Barcelona Cataluña Corporació Sanitària Clínic CS Clínic Barcelona Cataluña Corporació Sanitària Parc Taulí CS Parc Taulí Sabadell Cataluña Hospital de la Santa Creu i Sant Pau HSC Sant Pau Barcelona Cataluña Hospital Universitari Germans Trias i Pujol HUG Trias i Pujol Badalona Cataluña Hospital Universitari Vall d´Hebron HUV Hebron Barcelona Cataluña Hospital Universitario de la Ribera* HU Ribera Alzira Comunidad Valenciana Hospital Universitari Son Espases HU Son Espases Palma de Mallorca Islas Baleares Hospital General Universitario Gregorio Marañón HGU Gregorio Marañón Madrid Madrid Hospital Universitario Ramón y Cajal HU Ramón y Cajal Madrid Madrid Hospital Universitario Marqués de Valdecilla HUM Valdecilla Santander Cantabria * En el periodo de estudio no era Universitario. La detección de los casos y controles fue realizada mediante la revisión diaria de los hemocultivos en los laboratorios de microbiología. A partir de un posible caso se procedía a su confirmación microbiológica mediante las técnicas utilizadas en cada laboratorio, una vez confirmado se procedía a su inclusión en el estudio si tras revisar su historia clínica cumplía los requisitos de la definición de caso. Una vez incluido un caso en el estudio se procedía a seleccionar de forma aleatoria cuatro controles en base a los criterios que se especificarán a continuación. Los pacientes caso fueron reclutados de forma prospectiva por la revisión diaria de los resultados del cultivo de sangre de los centros participantes. Caso: Criterios de inclusión de casos: pacientes adultos (14 años ó más) con bacteriemia documentada por E. coli productor de BLEE clínicamente significativa. Criterios de exclusión de casos: edad menor de 14 años; bacteriemia causada por E. coli no productor de BLEE (ver en sección de estudios microbiológicos); bacteriemia no clínicamente significativa (aislamiento en hemocultivo del Material y métodos 85 microorganismo sin presencia de signos ó síntomas de infección sistémica); recidiva (episodio causado por la misma cepa de E. coli productor de BLEE en función del estudio de epidemiología molecular que ocurre antes de 60 días desde que se suspendió el tratamiento antimicrobiano del episodio inicial). Estos casos además formaron la cohorte prospectiva de pacientes para contestar a los objetivos 1, 3 y 4. Controles: Para la elección de los controles, se consideraron dos poblaciones base de estudio, una de pacientes con hemocultivos realizados (del que se obtuvieron los controles A) y que se denominó “población sepsis”, y otro de pacientes con bacteriemias por E. coli (del que se obtuvieron los controles B) (Figura 1). Controles A (2 por caso): Pacientes de 14 ó más años, ingresados en el mismo tipo de servicio ó unidad asistencial que el caso correspondiente (Tabla 10), a los que se habían realizado hemocultivos por sospecha de sepsis (ver definiciones), en los cuales no se aisló E. coli productor de BLEE (podían ser positivos para otro microorganismo ó negativos). Controles B (2 por caso): Pacientes de 14 años ó más, ingresados en el mismo tipo de servicio ó unidad que el caso correspondiente, y con episodio de bacteriemia clínicamente significativa causado por E. coli no productor de BLEE. Para estos controles regían los mismos criterios de inclusión y exclusión que para los casos con la salvedad de la etiología de la bacteriemia. Los pacientes control de ambas poblaciones fueron emparejados por frecuencia a los pacientes caso por hospital, tipo de servicio, adquisición (nosocomial ó comunitaria) y periodo de tiempo. Fueron seleccionados al azar de entre los pacientes elegibles por un método automatizado utilizando los números de registro de los cultivos de sangre en el laboratorio de microbiología de cada hospital participante. Material y métodos 86 Figura 1: Representación gráfica de la población base de estudio*. *Extraído de: Jesús Rodríguez-Baño, Encarnación Picón, Paloma Gijón et al. Community-Onset Bacteremia Due to Extended-Spectrum β-Lactamase-Producing Escherichia coli: Risk Factors and Prognosis. Clin Infect Dis 2010: 50; 40-48. [207] Tabla 10: Áreas de los servicios hospitalarios para los casos nosocomiales. TIPO DE SERVICIOS ÁREAS Médicos Medicina Interna, Neurología, Nefrología, Gastroenterología, Neumología, Enfermedades Infecciosas, Oncología, Hematología, Reumatología, Alergología, Geriatría. Quirúrgicos Cirugía General y Digestiva, Neurocirugía, Oftalmología, Otorrinolaringología, Cirugía Maxilofacial, Dermatología, Cirugía Plástica, Unidades de quemados (salvo que se consideren como Intensivos), Cirugía de Tórax, Cirugía Cardíaca, Cirugía Vascular, Traumatología. Cuidados Intensivos Unidades de Cuidados Intensivos generales, quirúrgicas, médicas, coronarias. Material y métodos 87 3.1.1.1. Incidencias de casos Para el cálculo de incidencias y obtención de los denominadores de los mismos fue necesaria la recogida de datos globales de cada hospital. Estos datos fueron obtenidos a través de los servicios centrales de cada uno de los hospitales y registrados en un protocolo previamente definido (Anexo I). Se realizaron los cálculos como sigue: Incidencia de bacteriemias de presentación comunitaria por E. coli BLEE se evaluó en base a las siguientes definiciones: o (Nº de casos / Nº de pacientes atendidos en urgencias en el periodo estudiado) X 1.000 o (Nº de casos / Nº de bacteriemias de presentación comunitaria en el periodo estudiado) X 100 o (Nº de casos / Nº de casos de bacteriemias comunitarias por E. coli en el periodo estudiado) X 100 Incidencia de bacteriemias de presentación nosocomial por E. coli BLEE se expresó como: o (Nº de casos / Nº de ingresos en el periodo estudiado) X 100 o (Nº de casos / Nº de estancias en el periodo estudiado) X 1.000 o (Nº de casos / Nº de casos de bacteriemias nosocomiales por E. coli en el periodo estudiado) X 100 Incidencia poblacional: (Nº de casos totales / Nº población atendida) X 100.000 habitantes. Los datos se extrapolaron a un año. Incidencia anual: (Nº de casos totales / año) Material y métodos 88 3.2. Protocolo de datos epidemiológicos. Definiciones y variables 3.2.1. Protocolo de datos epidemiológicos Una vez seleccionados los casos y controles se procedió a cumplimentar un protocolo diseñado y estructurado previamente en el que quedaban recogidos los datos epidemiológicos (Anexo II). Datos como las características demográficas y factores predisponentes se obtuvieron por revisión de las historias clínicas y entrevistas a los pacientes o sus parientes cercanos. Los datos clínicos y pronósticos se recogieron prospectivamente. Los pacientes fueron seguidos durante 30 días o el fallecimiento, si éste ocurría antes. Todos los protocolos una vez cumplimentados se trasladaron a una base de datos online de acceso restringido disponible sólo a los investigadores de cada centro del estudio, estando dicha base en la página web de la REIPI. Una vez terminada la inclusión de datos en la base se procedió a su revisión por parte del hospital de referencia, realizándose las correcciones necesarias por los centros a los que les fue requerido. 3.2.2. Definiciones - Bacteriemia: aislamiento del microorganismo en al menos una extracción sanguínea. - Bacteriemia clínicamente significativa: bacteriemia que se produce en el contexto de síntomas y signos clínicos sugestivos de afectación sistémica ó síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (ver después). - Bacteriemia transitoria: se considera como tal aquella bacteriemia cuya clínica desaparece de manera espontánea en menos de 12 horas. - Adquisición: se utilizarán los criterios de Friedman [77] : o Bacteriemia de origen nosocomial: aquella con hemocultivo positivo obtenido de un paciente que había sido hospitalizado durante 48 horas o más. Material y métodos 89 o Bacteriemia de origen comunitario relacionado con los cuidados sanitarios: aquella con un hemocultivo positivo obtenido de un paciente en el momento del ingreso en el hospital o dentro de las 48 horas del ingreso si el paciente cumple cualquiera de los siguientes criterios: • Recibió terapia intravenosa en el domicilio, recibió cuidado de las heridas o cuidados de enfermería especializada a través de agencia sanitaria, familia o amigos; o autoadministración de terapia médica intravenosa en los 30 días antes de la infección del torrente sanguíneo. Los pacientes cuyo tratamiento en el domicilio sólo fue el uso de oxígeno están excluidos. • Asistió a un hospital o clínica de hemodiálisis o recibió quimioterapia por vía intravenosa en los 30 días antes de la infección del torrente sanguíneo. • Fue hospitalizado en un hospital de cuidados intensivos durante 2 o más días en los 90 días antes de la infección del torrente sanguíneo. • Residía en un hogar de ancianos o centro de cuidados de larga duración. o Bacteriemia de origen estrictamente comunitario: aquella con un hemocultivo positivo obtenido en el momento de la admisión en el hospital o dentro de las 48 horas del ingreso para los pacientes que no se ajustan a los criterios de bacteriemias relacionadas con los cuidados sanitarios. - Origen de la bacteriemia: se utilizarán los criterios del CDC [81] para la localización de infecciones. 3.2.3. Variables - Demográficas: edad en años, sexo. - Características intrínsecas: o Enfermedades de base:  Diabetes mellitus: cuando conste en la historia, o cuando el paciente esté en tratamiento con antidiabéticos orales o insulina, o cuando se objetive glucemia igual o superior a 145 mg/dL en pacientes no Material y métodos 96 3.5. Aislamiento e identificación bacteriana 3.5.1. Medios de cultivo y reactivos • Agar MacConkey (Oxoid, Reino Unido) • Agar Sangre (AS, bioMèrieux, Francia) • Agar Mueller-Hinton (MHA, Difco, EE.UU.) con Ampicilina 100 mg/L (AMP, Sigma-Aldrich, España) • Solución salina fisiológica (agua con 0,9 g/L ClNa) • Galería API20E (bioMèrieux) • Caldo de tripticasa soja (TSB, Difco) • Glicerol (Difco) 3.5.2. Procedimiento Durante un periodo de 15 meses, desde el 14 de octubre de 2004 a 17 de enero de 2006, fueron incluidos todos los aislados clínicos de E. coli productores de BLEE procedentes de los laboratorios de Microbiología de 13 hospitales españoles de diferentes zonas geográficas que produjeron una bacteriemia clínicamente significativa. Como criterio de selección se tomó la CMI de dichos aislamientos a diferentes antimicrobianos, siendo seleccionados aquellos cuyas CMIs fueran iguales o superiores a 2 µg/mL de al menos uno de los betalactámicos siguientes: ceftazidima, cefotaxima, cefepima y aztreonam; excluyéndose aquellos obtenidos del mismo paciente y misma muestra cuando el antibiograma de rutina no evidenciara diferencias de más de dos diluciones en las CMIs de los distintos grupos de antimicrobianos. En aquellos centros en los que la técnica utilizada era la difusión en disco para el estudio de sensibilidad, se seleccionaron aquellos aislamientos en los que se observó sinergia entre amoxicilina-clavulánico y alguna cefalosporina de 3ª o 4ª generación o aztreonam. Se descartaron los aislamientos de E. coli con CMI de Material y métodos 97 cefoxitina superior a 16 µg/mL o diámetro de halo inferior a 15 mm, debido a la alta probabilidad de producción de betalactamasa AmpC y no de BLEE. Asimismo, la identificación de los microorganismos fue realizada en primera instancia según la metodología de cada laboratorio. Todos los aislados se conservaron a -30 ºC hasta su envío al laboratorio de referencia. En el centro de referencia fueron estudiados todos los aislamientos de E. coli procedentes de hemocultivos de los casos incluidos seleccionando sólo un aislamiento por paciente, debiendo ser el primero que se obtuvo. A continuación se procedió a su aislamiento y comprobación de pureza utilizando para ello diferentes medios de cultivo y se continuó con la confirmación de su identificación mediante el sistema API20E. Posteriormente se procedió a su congelación en viales de TSB-Glicerol al 10% a - 80 ºC hasta su procesamiento. 3.6. Confirmación de producción de BLEE 3.6.1. Material • Discos antimicrobianos (Becton Dickinson, EE.UU.) :  Ceftazidima, 30 µg  Cefotaxima, 30 µg  Ceftazidima 30 µg + Ácido clavulánico 10 µg  Cefotaxima 30 µg + Ácido clavulánico 10 µg • Agar Mueller-Hinton con Ampicilina 100 mg/L (AMP, Sigma-Aldrich). 3.6.2. Procedimiento La producción de BLEE se confirmó en el centro de referencia mediante la técnica de difusión en disco siguiendo las normas del NCCLS [153, 154] (actualmente CLSI) usando placas de agar de Mueller-Hinton y discos conteniendo 30 µg de Material y métodos 98 cefotaxima o ceftazidima, con y sin ácido clavulánico, siguiendo las instrucciones del fabricante. Considerándose cepas productoras de BLEE aquellas en las que la diferencia entre los diámetros de los halos de inhibición en al menos uno de los dos antibióticos era mayor o igual a 5 mm, entre el disco del antibiótico con ácido clavulánico respecto del mismo antibiótico sin clavulánico. Para evitar la pérdida del plásmido codificante del la BLEE todos los cultivos de mantenimiento de las bacterias se realizaron en MHA suplementando con ampicilina a una concentración de 100 mg/L (MHA + AMP). 3.7. Estudio de relación clonal 3.7.1. REP PCR 3.7.1.1. Material • Reactivos: • Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs, Invitrogen, Francia) • Tampón de PCR (Invitrogen) • Cloruro magnésico (MgCl 2 , Invitrogen) • Taq ADN polimerasa (Invitrogen) • Cebadores (TIB MOLBIOL Syntheselabor GMBH, Francia) REP-1: III GCG CCG ICA TCA GGC REP-2: ACG TCT TAT CAG GCC TAC • Agua destilada (Braun Medical, España) • Solución TBE (10x) para 1L: 55 g Ácido bórico 180 g Trizma base 40 mL EDTA 0,5 M pH=8 • Marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Invitrogen) Material y métodos 99 • Agarosa Grade Molecular Biology (Promega, España) • Bromuro de etidio (Sigma-Aldrich) • Azul de bromofenol (Amersham Pharmacia Biotech, España) • Equipos: • Microcentrífuga Biofuge fresco (Heraeus, Alemania) • Cabina de seguridad BIO-II-A (Telstar, España) • Termociclador Gene Cycler (Bio-Rad, España) • Cubetas de electroforesis Sub-Cell GT (Bio-Rad) • Fuente de alimentación modelo 1000/500 (Bio-Rad) • Cámara de fotos digital Kodak DC290 (Eastman Kodak, EE.UU.) • Sistema de análisis digital de imágenes Kodak 1D EDAS 290 (Eastman Kodak) 3.7.1.2. Procedimiento El estudio de la relación clonal de los aislados se realizó en primer lugar por la distribución de secuencias repetitivas de ADN, mediante el análisis de los elementos palindrómicos repetitivos extragénicos (REP-PCR). Este análisis consiste en la amplificación mediante una PCR utilizando unos iniciadores diseñados para hibridar con dichas secuencias repetidas intercaladas en el genoma, de forma que se obtienen patrones de amplificación de diferentes fragmentos de ADN que permiten establecer una relación clonal entre las distintas cepas. El ADN bacteriano se extrajo a partir de un cultivo fresco de microorganismo en MHA + AMP, varias colonias se resuspendieron en 2 mL de agua destilada estéril hasta alcanzar una densidad óptica de 2 a 620 nm. Una vez se obtuvo la muestra se calentó a 100 ºC durante 10 minutos. Posteriormente se centrifugó esta suspensión durante 1 min a 13.000 rpm, del sobrenadante se hizo una dilución al 1:10 en agua destilada estéril siendo esta nueva suspensión la utilizada para la amplificación. Se mezclaron 23,5 µL de extracto de ADN, 26,5 µL de una mezcla maestra que contenía: tampón para Taq polimerasa, MgCl 2 3 mM, desoxinucleótidos trifosfato 400 µM, iniciadores REP-1 y REP-2 a 1 µM y, 0,5 µL de Taq polimerasa (2,5 U). Esta mezcla se amplificó con el siguiente programa: 1 paso inicial de activación de la Taq de 3 min a Material y métodos 100 94 ºC seguido de 30 ciclos que incluían los pasos: 1 min a 94 ºC de desnaturalización del ADN, 1 min a 40 ºC de hibridación y 8 min a 65 ºC de extensión; finalizando con una extensión final de 16 min a 65 ºC. El producto de la PCR (15 µL) se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% usando como tampón TBE 0,5X durante 5 h a 90 V. Posteriormente se realizó un baño del gel en 500 mL de agua destilada con bromuro de etidio a 0,50 µg/mL y posterior enjuague. Se utilizó el sistema de análisis digital de imágenes Kodak 1D EDAS 290 (Eastman Kodak) para comparar los distintos patrones de REP-PCR obtenidos. Se consideraron patrones idénticos de REP-PCR y, por tanto, cepas pertenecientes al mismo clon, aquellos que presentaban el mismo número de bandas y en la misma localización. Fueron consideradas cepas relacionadas clonalmente aquellas que tuvieran una o dos bandas de diferencia en su patrón, los aislamientos con más de dos bandas de diferencia en los patrones de REP-PCR fueron considerados no relacionados clonalmente; según los criterios de Bou y cols. [33] 3.7.2. PFGE 3.7.2.1. Material 1. PCR • Reactivos: • Lisozima (Sigma-Aldrich) • SmaI (Roche, España) • Buffer A (Roche) • XbaI (Roche) • Buffer H (Roche) • Lisoestafina (Sigma-Aldrich) • RNasa (Roche) • Proteinasa K (Roche) Material y métodos 101 • Agarosa Pulse Field (Bio-Rad) • Low Melting Agarosa (Bio-Rad) • Solución PIV: Para 1 L: 10 mL Tris 1M pH=8 200 mL NaCl 5 M 790 mL agua bidestilada • Solución básica de lisis: Para 100 mL: 0,6 mL Tris pH=8 20 mL NaCl 5 M 20 mL EDTA 0,5 M pH=8 2 mL Desoxicolato sódico 10% 5 mL Sarcosil 10% • Solución ES: Para 100 mL: 90 mL EDTA 0,5 M pH=8 10 mL Sarcosil 10% • Solución TE: Para 1 L: 2 mL EDTA 0,5 M pH=8 10 mL Tris 1 M pH=7,5 988 mL agua bidestilada • Solución TBE (10x): Para 1 L: 55 g Ácido bórico 180 g Trizma base 40 mL EDTA 0,5 M pH=8 2. ELECTROFORESIS • Reactivos: • Marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Invitrogen) • Agarosa Grade Molecular Biology (Promega) • Bromuro de etidio (Sigma-Aldrich) • Tampón de electroforesis Tris-Acético-EDTA (TAE; Sigma-Aldrich) • Tampón de electroforesis Tris-Borato-EDTA (TBE; Sigma-Aldrich) • Azul de bromofenol (Amersham Pharmacia Biotech) • Equipos: • Cubetas de electroforesis Sub-Cell GT (Bio-Rad) • Fuente de alimentación modelo 1000/500 (Bio-Rad) Material y métodos 102 • Equipos de captura y análisis de la imagen: • Cámara de fotos digital Kodak DC290 (Eastman Kodak) • Sistema de análisis digital de imágenes Kodak 1D EDAS 290 (Eastman Kodak) 3.7.2.2. Procedimiento A aquellos aislados que mediante REP-PCR estaban clonalmente relacionados se les realizó el estudio de clonalidad mediante la electroforesis en campo pulsante (PFGE) para su confirmación, ya que esta técnica posee mayor capacidad de discriminación. A partir de un cultivo fresco se tomó un asa de crecimiento y se suspendió en 500 µL de PIV, tras una centrifugación a 13.000 rpm durante 1 min y eliminación del sobrenadante se añadió 200 µL del mismo reactivo a la suspensión hasta conseguir una suspensión de 0,9-1 de densidad óptica a 620 nm de radiación. A 100 µL de esta suspensión se añadió 100 µL de agarosa (Low Melting Agarosa al 2% en buffer SE mantenida a 80 ºC) y se procedió a la obtención de bloques de agarosa conteniendo el ADN. A continuación se hizo la lisis bacteriana con lisozima 50 mg/mL y RNAsa 10 mg/mL a razón de 2 µL y 5 µL por mililitro de reacción, utilizando 500 µL/cepa bacteriana de buffer ST. La lisis se realizó a 37 ºC durante 5 h. Transcurrido el tiempo se retiró el líquido y se le añadió 500 µL de buffer ES y se enjuagaron los bloques, se tiró el buffer y se le añadió proteinasa K 20 mg/mL para destruir las proteínas. Esta enzima se añadía en concentración 1 mg/mL de reacción habiendo 500 µL/cepa de solución de lisis formada por la enzima de restricción y la solución ES, se mantuvo a 50 ºC durante 18 h. Una vez terminada esta fase el bloque se cambió a un nuevo tubo con 2 mL de buffer TE, tras agitar durante 30-45 min a Tª ambiente se eliminó el TE y se procedió a realizar este paso de lavado de 4 a 5 veces. Para el proceso de digestión del ADN se introdujo el bloque en 100 µL de buffer H al 1x y 40 U de enzima XbaI 10 U/µL, previamente atemperada la mezcla a Material y métodos 103 37 ºC durante 25 min, dejando durante toda la noche a 37 ºC que se produjera la digestión. Cada bloque obtenido mediante moldes se colocó en el peine del soporte de electroforesis. Tras colocar de forma vertical el peine se vertió la solución de agarosa Pulse Field (1,7 g de agarosa en TBE 0,5X) dejando solidificar el gel. Posteriormente se retiró el peine de forma que el bloque de agarosa conteniendo el ADN quedó incluido en el gel dejando un pocillo hueco, que se procedió a rellenar con la agarosa restante. Se dejó enfriar durante 20 min a 4 ºC. Paralelamente se preparó un control de peso molecular y una cepa control de Staphyloccoccus aureus de igual forma pero con la enzima SmaI y buffer A. La escalera comercial usada fue en forma de bloque, se tomaron 500 µL de buffer TBE 0,5X y se pusieron en un éppendorf, se cortó un trozo pequeño de escalera y se dejó 10 min a 45 ºC; hasta su colocación en el peine junto con los bloques se mantuvo en hielo. El aparato de electroforesis se cubrió de TBE 0,5X y se puso a circular a 4 ºC antes de iniciar el proceso. El programa de electroforesis utilizado fue: - 6 V/cm 2 , 14 ºC y 999 de tiempo Bloque 1: 1” a 10” durante 10 h Bloque 2: 10” a 35” durante 12 h Se preparó un baño de bromuro de etidio a concentración de 1 µg/mL en agua destilada. Se introdujo el gel una vez terminado el programa y se dejó durante 30 min. Se lavó a continuación con agua destilada durante 1 h. Se realizó la observación y análisis del gel mediante fotografías a diferentes distancias, tiempos de exposición e intensidades de luz UV. Para su interpretación se siguieron los criterios de Tenover y cols. [230] considerando cepas indistinguibles aquellas cuyo patrón de bandas era igual, estrechamente relacionadas cuando hubiera 2 o 3 bandas diferentes, posiblemente relacionadas cuando hubiera de 4 a 6 bandas distintas y no relacionadas cuando el número de bandas diferentes fuera igual o superior a 7. Material y métodos 104 3.8. Caracterización de BLEE Para caracterizar las BLEE se procedió a realizar: conjugación, microdilución en placa, isoelectroenfoque, PCR y secuenciación. 3.8.1. Conjugación 3.8.1.1. Material • Agar sangre (AS, bioMèrieux) • Caldo Mueller-Hinton (MHB, Difco) • Agar MacConkey (Oxoid) • Agar Mueller-Hinton (MHA, Difco) • Caldo tripticasa-soja con 10% de glicerol (TSB, Difco) • Caldo nutritivo LB: (ClNa, Panreac; Bacto Triptosa, Difco; Extracto de levadura, Difco). • Caldo A: sulfato amónico (1 g/L), fosfato monopotásico (4,5 g/L), fosfato dipotásico (13,1 g/L) y citrato sódico (0,5 g/L). • Medio deficiente en prolina y metionina (Medio Pro-Met-) formado por: Caldo A al 1x (1 L) más 1 mL de sulfato magnésico heptahidratado a 1 M, 10 mL de glucosa al 20 % y 15 g de agar. • Azida sódica (AZ, Sigma-Aldrich) • Rifampicina (RIF, Sigma-Aldrich) • Cefotaxima (CTX, Sigma-Aldrich) • Ceftazidima (CAZ, Sigma-Aldrich) • Agar Mueller-Hinton + Azida o Rifampicina • Medio de cultivo sin Prolina ni Metionina (Medio Pro-Met-) CEPAS BACTERIANAS RECEPTORAS • Escherichia coli J53 resistente a azida • Escherichia coli J53 resistente a rifampicina Material y métodos 105 3.8.1.2. Procedimiento Realizamos la técnica de conjugación con cada una de las cepas con el fin de obtener transconjugantes, para demostrar la transferencia de plásmidos en los que se encontraban los genes bla de las cepas clínicas a la cepa receptora. Se confirmó la presencia de BLEE en los transconjugantes obtenidos mediante la técnica de difusión en placa. Posteriormente, los transconjugantes junto con las cepas originales se estudiaron para ver si los patrones de sensibilidad a antimicrobianos coincidían, y confirmar que dichos genes bla se encontraban en plásmidos y se habían transferido de forma horizontal de las cepas originales (donadoras, E. coli BLEE) a las transconjugantes (receptoras, E. coli J53) y presentaban los mismos perfiles de sensiblidad así como CMIs similares. A partir de un cultivo de 18 h se procedió a inocular en 4 mL de medio líquido LB, por separado el aislado a estudiar y la cepa receptora E. coli J53 resistente a azida, e incubarlos a 37 ºC en agitación durante 18 h. A continuación se tomaron 0,5 mL de cada caldo de cultivo de aislado (célula donadora) y 0,5 mL de la bacteria receptora, transfiriéndolos a 4 mL de LB. Tras un periodo de incubación de 18 h, a 37 ºC en reposo e inclinación para facilitar un mayor contacto entre las células y asimismo el proceso de la conjugación, se tomaron 100 µL y se sembraron en una placa de MHA conteniendo 200 mg/L de azida y 2 mg/L de cefotaxima o de ceftazidima, dependiendo de si la cepa originariamente era resistente a cefotaxima o ceftazidima respectivamente. Realizamos la misma operación para una dilución 1/100 del caldo cultivado. Tras un periodo de incubación de 24 h a 37 ºC en el caso de existir colonias de crecimiento se tomó una y se sembró en una placa de MHA conteniendo azida a 200 mg/L, para facilitar que sólo creciera la cepa receptora en el caso de existir cepas donadoras mezcladas. Igualmente se sembró en placa de medio Pro-Met-, en este medio no puede crecer E. coli J53 resistente a azida, siendo por tanto útil para saber si las colonias que crecieron de la mezcla de conjugación en las placas con azida-cefotaxima o azida-ceftazidima eran en principio la cepa receptora con el plásmido que le permitió crecer con la cefalosporina (cepa transconjugante). En el caso de sí crecer en medio Pro-Met-, se trataba de la cepa donante (cepa original) y por tanto no fue válido el proceso de conjugación. A las cepas consideradas transconjugantes se procedió a realizar la detección y confirmación de BLEE, técnica ya explicada anteriormente. En el caso de ser Material y métodos 112 Tabla 11. Características de las fases de cada ciclo de PCR para cada tipo de familia de BLEE, tras desnaturalización previa de 95 ºC durante 3’. TEM SHV CTX-M-9 CTX-M-1 Desnaturalización 94 ºC 45” 94 ºC 45” 95 ºC 30” 95 ºC 1’ Anillamiento 58 ºC 30” 60 ºC 30” 62 ºC 30” 64 ºC 1’ Extensión 72 ºC 1’30” 72 ºC 1’30” 72 ºC 1’15” 72 ºC 2’ Extensión final 72 ºC 10’ 72 ºC 10’ 72 ºC 10’ 72 ºC 7’ El producto de la PCR obtenido se visualizó a través de electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % en TAE 1X y teñido con bromuro de etidio 0,5 µg/mL. En cada pocillo se cargaron 3 µL de producto de PCR y 2 µL de marcador de avance (azul de bromofenol). Se utilizó como marcador de peso molecular la 100 pb DNA Ladder. Se utilizó para el análisis de la imagen el mismo aparato y programa antes mencionado. 3.8.5. Secuenciación de los genes que codifican BLEE 3.8.5.1. Material • Reactivos: • Kit de purificación de ADN Sephaglas BandPrep (Pharmacia) • Kit de purificación de ADN: Microsep TM Centrifugal Devices (PALL Life Sciences, EE.UU.) • Equipos: • Secuenciador ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, EE.UU.) • Analizadores genéticos multicapilares modelo ABI Prism 3.130XL (Applied Biosystems) • Bioinformática: los análisis informáticos se llevaron a cabo empleando los siguientes softwares: Material y métodos 113 • La página web http://www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI: National Center for Biotechnology Information), BLAST [3] , BLASTX [83] • Traduction Multiple (Infobiogen, www.infobiogen.fr/ services/ana lyseq/cgi-bin /traduc_in.pl) • Página del EBI-European Bioinformatics Institute, EMBL Outstation (http://www.ebi.ac.uk) [11] • Los programas: o ClustalW2 de EMBL-EBI v 1.81 [232] o Chromas versión 1.34 3.8.5.2. Procedimiento Los productos de PCR específicos de BLEE fueron purificados con el kit de purificación de ADN Sephaglas BandPrep o kit Microsep siguiendo las instrucciones de los fabricantes para la secuenciación directa de éstos. Las secuencias se determinaron en la Unidad de Genómica del Servicio Central de Apoyo a la Investigación (Universidad de Córdoba) con el analizador ABI Prism 310 y 2 analizadores genéticos multicapilares. Posteriormente fueron analizadas con un programa informático de análisis de secuencias Chromas Pro y con los softwares de Internet NCBI BLAST, Traduction Multiple y ClustalW2 de EMBL-EBI. 3.8.5.3. Otros equipos • Vórtex Reax 2000 (Heidolph, Alemania) • Agitador Agimatic-N (J. P. Selecta, España) • Pipetum Pipet-Aid XP (Drummond, EE.UU.) • Pipetas Digital Colors (Thermo Labsystems, Bélgica) • Pipeta multicanal Titertek (Labsystems, Finlandia) • Espectrofotómetro Spectronic 501 (Bausch & Lomb, EE.UU.) • Espectrofotómetro Termo Spectronic Genesys 20 (Termo Fisher Scientific, EE.UU.) Material y métodos 114 • Espectrofotómetro Termo Electronic Corporation BioMate (Thermo Spectronic, EE.UU.) • Congelador - 80 ºC Revco ULT-2586-5 (Revco Scientific, EE.UU.) • Frigorífico Liebherr FKS-3600-1 (Liebherr, Alemania) • Estufa 37 ºC Heraeus B6420 (Heraeus, Alemania) • Estufa orbital ORBI-SAFE (Gallenkump, Reino Unido) • Balanzas electrónicas AND modelos EW-300A y ER-120A (A&D, Japón) • Microondas Sanyo EM-G4760 (Sanyo Electrics, Reino Unido) • Máquina de hielo AF10 (Scotsman, EE.UU.) 4. RESULTADOS Resultados 119 Durante el periodo de estudio (14 de octubre de 2004 a 17 de enero de 2006) se comunicaron 209 casos de bacteriemias clínicamente significativas por E. coli productor de betalactamasas de espectro extendido en los 13 hospitales participantes en el mismo. De los 209 casos se excluyeron 18 (8 por no disponer del aislado, 4 por comprobarse en el centro de referencia que no eran productoras de BLEE, y 6 por no disponer de información clínica). Por tanto, se trabajó con los aislados y los datos clínicos de 191 casos para el estudio de casos-controles para la investigación de factores de riesgo. La contribución de casos al estudio por cada hospital tuvo un rango de 7 a 29 (Tabla 13). 4.1. Incidencias La incidencia global poblacional de los centros participantes en función de los casos obtenidos en el estudio fue 2,62 casos por cada 100.000 habitantes durante el periodo estudiado, siendo 0,02 casos/100 ingresos la incidencia nosocomial y 0,04 casos/1.000 urgencias la incidencia de casos comunitarios (Tabla 12). Resultados 120 Tabla 12. Incidencias globales de las bacteriemias nosocomiales y comunitarias en el periodo estudiado e incidencia global poblacional. INCIDENCIAS MEDIA MEDIANA RANGO CASOS COMUNITARIOS Casos/1.000 urgencias atendidas 0,13 0,03 0,01-1,18 Casos/100 bacteriemias comunitarias 2,18 0,96 0,13-12,37 Casos/100 bacteriemias E. coli 4,88 3,08 0,36-14,12 CASOS NOSOCOMIALES Casos/100 ingresos 0,02 0,01 0,01-0,04 Casos/1.000 estancias 0,34* 0,02* 0,01-0,10* Casos/1.000 bacteriemias E. coli 6,8 5 0,86-21,43 POBLACIONAL Casos/100.000 habitantes/año 2,03 *Datos referidos a 12 hospitales Tabla 13. Características, datos globales, distribución de casos totales incluidos en el estudio y en función del tipo de adquisición, comunitaria y nosocomial, e incidencias por hospital. Los datos de bacteriemias E. coli BLEE se expresan como N (%). HSC Sant Pau HU Bellvitge HUV Hebron CS Clínic HUG Trias i Pujol CS Taulí HGU Gregorio Marañón HU Ramón y Cajal CARACTERÍSTICAS HOSPITAL Tipo U U G, U U U G G, U U Unidades UCI, N, T UCI, T UCI, N, T UCI, T UCI, N, T UCI, N UCI, N, T UCI, T Nº camas 723 906 1.200 839 638 795 1.702 1.165 Población de referencia 431.828 1.288.518 450.000 500.000 679.517 407.763 738.481 478.617 DATOS* Nº ingresos 34.023 35.099 64.499 58.858 41.265 25.534 96.342 42.509 Nº estancias 214.642 305.333 584.341 348.150 248.153 189.698 683.097 41.219 Nº hemocultivos urgencias 4.013 15.007 16.514 1.651 1.316 5.810 2.339 8.885 Nº urgencias 109.232 153.803 335.834 146.977 144.928 5.938 402.153 188.289 Nº bacteriemias comunitarias Totales 561 1040 1594 629 662 893 2016 636 Comunitarias E. coli 184 427 557 260 241 278 413 290 Nº bacteriemias nosocomiales Totales 476 909 5122 943 411 220 5831 806 Nosocomiales E. coli 81 154 928 155 76 58 915 157 Bacteriemias E. coli BLEE Casos totales 8 (3,8) 18 (8,6) 16 (7,7) 15 (7,2) 12 (5,7) 9 (4,3) 30 (14,4) 22 (10,5) Casos procesados 7 (3,7) 18 (9,4) 10 (5,2) 15 (7,9) 12 (6,3) 9 (4,7) 29 (15,2) 14 (7,3) Casos comunitarios 3 (43) 10 (56) 2 (20) 8 (53) 4 (33) 7 (78) 18 (62) 10 (71) Casos nosocomiales 4 (57) 8 (44) 8 (80) 7 (47) 8 (67) 2 (22) 11 (38) 4 (29) Resultados 128 2 y 4 cepas cada uno. Hubo 7 hospitales (54%) con cepas relacionadas clonalmente. En el HU Bellvitge, 3 cepas mostraron un patrón indistinguible, y otra cepa un patrón estrechamente relacionado con las anteriores (Figura 4, A: clon 2A); además se apreció otro cluster de 2 cepas. En este hospital, el 33% de las cepas aisladas tenían relación clonal con otras. En el HGU Gregorio Marañón, 3 cepas mostraron patrones indistinguibles mediante REP (Figura 5, A: clon 7C), pero no fueron tipables por PFGE; otras 5 también mostraron un patrón idéntico por REP (Figura 5, A: clon 7B) pero mediante PFGE solo 4 resultaron relacionadas, mientras que el otro aislado mostró un patrón de PFGE totalmente diferente (Figura 5, B: clones 7B, 7B1, 7B2, 7B3 y 7E); otros 2 aislados estaban relacionados (Figura 5, A: clon 7A y Figura 5, B: clones 7A y 7A1) y los 2 últimos aislados eran iguales por REP y no tipables por PFGE (Figura 5, A: clon 7D). En este hospital, el 38% de las cepas tenían relación clonal con otras. En el HU Son Espases se encontraron 2 aislados estrechamente relacionados (Figura 4, B: clon 10A). Tanto en el HUG Trias i Pujol como en los HHUUV Rocío hubo 2 cepas relacionadas clonalmente, siendo iguales en las de los segundos. En el HUV Macarena hubo 3 cepas relacionadas, siendo iguales por REP y relacionadas por PFGE 2 de ellas mientras que la tercera no era tipable por dicha técnica. En el HU Ribera hubo 2 cepas que mostraron solamente por REP ser estrechamente relacionadas. Figura 4. Patrones de PFGE de aislados relacionados clonalmente. A) Aislados relacionados del HU Bellvitge formado por 6 aislados: 3 aislados indistinguibles con patrón de bandas del clon 2A y 1 aislado estrechamente relacionado con patrón 2A1; y 2 aislados estrechamente relacionados con patrones de bandas 2B y 2B1. 2A 2A 2A 2A1 2B 2B1 B) HU Son Espases: dos aislados estrechamente relacionados clonalmente, patrón de bandas del clon 10A y 10A1. 10A 10A1 Figura 5. Patrones de PFGE de aislados relacionados clonalmente del HGU Gregorio Marañón. A) Fotografías correspondientes a la técnica de REP-PCR, con 4 grupos de aislados correspondientes a 4 clones: 7A, 7B, 7C y 7D. 7A 7A 7B 7B 7C 7C 7C 7B 7B 7B 7D 7D B) Patrones de PFGE de los aislados anteriores, dando como resultado 4 grupos de aislados correspondientes a 4 clones: 7A y 7A1 relacionados; B: 7B, 7B1, 7B2 y 7B3 relacionados clonalmente entre sí y; el clon 7E. Los clones resultantes de REP-PCR 7C y 7D no eran tipables por PFGE. 7A 7A1 7B3 7B1 7B2 7B 7B3 7B 7E (repetición) Resultados 131 4.3.4. Caracterización de las BLEE 4.3.4.1. Conjugación Se obtuvieron transconjugantes en 141 aislados (74%). 4.3.4.2. Determinación de sensibilidad a antimicrobianos Los valores de CMI 50 , CMI 90 y categoría clínica se detallan en la Tabla 14. El 100% de las cepas fueron sensibles a las tres carbapenemas estudiadas (imipenem, meropenem y ertapenem) y a tigeciclina. Los antimicrobianos que les siguieron en número de aislados sensibles fueron fosfomicina (96%), piperacilinatazobactam (92%) y los aminoglucósidos (amikacina, 98%; tobramicina, 82%; y gentamicina, 80%). El porcentaje de sensibilidad a amoxicilina-clavulánico fue bastante inferior (62%), hecho debido al alto porcentaje de aislados con sensibilidad intermedia al mismo (32%). El número de cepas sensibles a las cefalosporinas estudiadas fue inferior, siendo en orden decreciente: ceftazidima (63%), cefepime (35%) y cefotaxima (4%). El resto de antimicrobianos estudiados presentó atividad frente a menos del 50% de los aislados. Los porcentajes de sensibilidad de los transconjugantes fueron muy similares a los de las cepas originales, a excepción de las quinolonas y trimetoprimsulfametoxazol. Así, fueron sensibles a ciprofloxacino el 34% de las cepas originales y el 100% de los transconjugantes; en el caso de ácido nalidíxico, las cifras fueron del 15 y del 99%, respectivamente; y en el caso de trimetoprim-sulfametoxazol, el 39 y el 15%, respectivamente. Resultados 132 Tabla 14. Valores de CMI 50 , CMI 90 y categoría clínica de diferentes antimicrobianos. Sensible Intermedia Resistente N (%) N (%) N (%) CMI 50 CMI 90 Ciprofloxacino 62 (32) 7 (4) 122 (64) 8 64 Ácido nalidíxico 26 (14) - 165 (86) 1024 1024 Piperacilina-tazobactam 175 (92) 10 (5) 6 (3) 2 16 Amoxicilina-clavulánico 118 (62) 61 (32) 12 (6) 8/4 16/8 Ticarcilina-clavulánico 33 (17) 72 (38) 86 (45) 64/4 256/4 Ceftazidima 121 (63) 6 (3) 64 (34) 4 128 Cefotaxima 7 (4) 26 (14) 158 (83) 256 256 Cefepime 67 (35) 12 (6) 112 (59) 64 64 Amikacina 188 (98) 2 (1) 1 (1) 4 16 Gentamicina 152 (80) 8 (4) 31 (16) 1 64 Tobramicina 157 (82) 6 (3) 28 (15) 1 32 Imipenem 191 (100) 0 (0) 0 (0) 0,25 0,5 Meropenem 191 (100) 0 (0) 0 (0) 0,03 0,06 Ertapenem 191 (100) 0 (0) 0 (0) 0,03 0,125 Tigeciclina 191 (100) 0 (0) 0 (0) 0,06 0,06 Trimetoprim-sulfametoxazol 75 (39) - 116 (61) 256/4864 512/9728 Fosfomicina 184 (96) 1 (1) 6 (3) 8 32 4.3.4.3. Isoelectroenfoque Se realizó la técnica de IEF de los extractos enzimáticos crudos para determinar los pIs de las betalactamasas a todas las cepas originales productoras de BLEE y, a los transconjugantes obtenidos para poder analizar la transferencia de los genes por conjugación en éstos. A partir de esta técnica pudimos ver cuántas betalactamasas expresaba cada cepa productora de BLEE y clasificarlas de forma preliminar en las distintas familias en función de los pIs. Entre las cepas originales, se obtuvieron 115 cepas con bandas de pI en el rango de 5,2 a 6,5, clasificadas preliminarmente como posibles betalactamasas de la familia TEM. Hubo 259 cepas con pI entre 7,0 y 8,2, que se consideraron inicialmente Resultados 133 como posibles betalactamasas tipo SHV a excepción de aquellas con pI de 8,0 y 8,1, que se clasificaron preliminarmente como de la familia CTX-M. Finalmente, se obtuvieron 276 bandas con pI entre 8,0 y > 8,2, clasificadas inicialmente como CTX- M. 4.3.4.4. Caracterización de BLEE mediante PCR Una vez realizada la técnica de IEF y obtenidos los pIs de cada una de las cepas, se procedió a realizar la técnica de PCR utilizando cebadores específicos de cada familia según la clasificación preliminar del tipo de blea en función del pI obtenido. Hubo aislados con pI diferentes a los encontrados en su cepa transconjugante, por lo que se iniciaron las PCRs en las cepas transconjugantes; en aquellas que no se obtuvo resultado positivo se realizó posteriormente en la cepa original. En muchos casos no se obtuvieron los productos de PCR que inicialmente se esperaban, por lo que se procedió a someter dichos aislados a PCR con cebadores específicos no realizados inicialmente por no haber pI indicativo de existencia de ese tipo de BLEE. Asimismo, a todas aquellas parejas de transconjugante y original que presentaron pI indicativo de grupo TEM, aquellas que sólo tenían pI de rango TEM y aquellas que no habían amplificado inicialmente con cebadores de otras familias se les realizó PCR con cebadores específicos de la familia TEM. Por PCR se obtuvieron 169 (83%) BLEE de la familia CTX-M, 34 (17%) de la familia SHV, y una sola BLEE de la familia TEM (0,5%). 4.3.4.5. Secuenciación de los genes codificantes de BLEE Una vez obtenidos los elementos amplificados se analizaron las secuencias para caracterizar específicamente las enzimas expresadas en los aislados (Tabla 15). Las enzimas mayoritarias fueron del grupo CTX-M-9 (123, el 64%) seguidas del Resultados 134 grupo CTX-M-1 (41 aislados) y SHV (33 aislados). En 7 aislados (3,7%) se detectaron dos BLEE diferentes. Tabla 15. Distribución de enzimas BLEE producidas por los aislados del estudio según la familia y grupo de enzima al que pertenecen, Nº (%). Las combinaciones de dos BLEE estaban formadas por una de la familia CTX-M y una de la familia SHV o dos de la familia CTX-M, cada enzima de un grupo distinto, una del grupo 9, CTX-M-14, y otra del grupo 1. La distribución de enzimas producida por cada hospital se encuentra representada en la Figura 6. N (%) FAMILIA CTX-M, GRUPO CTX-M-9 123 (64) CTX-M-14 97 (49) CTX-M-9 25 (13) CTX-M-19 1 (0,5) FAMILIA CTX-M, GRUPO CTX-M-1 41 (22) CTX-M-15 23 (12) CTX-M-32 15 (8) CTX-M-1 3 (1,5) FAMILIA TEM 1 (0,5) TEM-52 1 (0,5) FAMILIA SHV 33 (17) SHV-12 30 (15) SHV-2 3 (1,5) DOS TIPOS DE BLEE 7 (4) CTX-M-14 y CTX-M-1 1 (0,5) CTX-M-14 y CTX-M-15 1 (0,5) CTX-M-14 y CTX-M-32 1 (0,5) CTX-M-14 y SHV-12 3 (1,5) CTX-M-14 y SHV-2 1 (0,5) Resultados 135 Figura 6. Porcentaje de distribución de cada tipo de BLEE producida por cada uno de los centros hospitalarios participantes. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HSC Pau HU Bellvitge HUV Hebron CS Clínic HUG Trias i Pujol CS Parc Taulí HGUG Marañón HU Ramón y Cajal HU Ribera HU Son Espases HHUUV Rocío HUV Macarena HUM Valdecilla CTX-M-14 CTX-M-9 CTX-M-19 CTX-M-15 CTX-M-32 CTX-M-1 SHV-12 SHV-2 TEM-52 4.3.4.6. Sensibilidad a antimicrobianos en función del grupo de BLEE producida En la Tabla 16 se muestran los datos de sensibilidad de los 191 aislados del estudio a los antimicrobianos más relevantes, y en función del grupo de BLEE: CTX- M-9, CTX-M-1 y SHV, de aquellos aislados que produjeron solo una BLEE (116, 38 y 29 aislados respectivamente). En función de los puntos de corte del CLSI 2009 todos los aislados serían resistentes a las cefalosporinas, mientras que por los criterios del CLSI 2010 y EUCAST 2011 habría un 58,6 y 14,7% de sensibilidad a ceftazidima y, 35,1 y 14,7% a cefepime respectivamente. Para el resto de antimicrobianos no supone grandes diferencias el hecho de utilizar unos criterios u otros, a excepción de ertapenem, al que algunos aislados presentan resistencia según los puntos de corte Resultados 136 del CLSI 2010; a imipenem y meropenem todos los aislados son sensibles en función de los tres criterios comparados. El patrón de sensibilidad para algunos antibióticos fue diferente según la enzima producida. En general, las cepas productoras de CTX-M-15 mostraron menor sensibilidad a ciprofloxacino, BLIBL, tobramicina y trimetoprim-sulfametoxazol. Como era de esperar, las cepas productoras de BLEE tipo SHV presentaron peores cifras de sensibilidad a ceftazidima, mientras que un alto porcentaje de cepas productoras de CTX-M-14 y CTX-M-9 eran sensibles a este antibiótico. Tabla 16. Sensiblidad de los aislados de E. coli BLEE a los antimicrobianos más relevantes, según los criterios del CLSI 2009, CLSI 2010 y EUCAST 2011, y por el grupo de BLEE producido. Datos expresados como número de aislados (%). Todos los aislados están incluidos en los totales, los 191. De los grupos CTX-M-9, CTX-M-1 y SHV se incluyeron los aislados que sólo produjeron una BLEE (116, 38 y 29 aislados respectivamente). BLEE CLSI 2009 CLSI 2010 EUCAST 2011 Cefotaxima Total 0 0 0 Grupo CTX-M-9 0 0 0 Grupo CTX-M-1 0 0 0 Grupo SHV 0 0 0 Ceftazidima Total 0 112 (58,6) a 28 (14,7) d Grupo CTX-M-9 0 103 (88,8) a 27 (23,3) d Grupo CTX-M-1 0 8 (21,1) b 1 (2,6) e Grupo SHV 0 0 0 Cefepime Total 0 67 (35,1) a 28 (14,7) d Grupo CTX-M-9 0 31 (26,7) a 3 (2,6) d Grupo CTX-M-1 0 8 (21,1) b 4 (10,5) Grupo SHV 0 26 (89,7) a 19 (65,5) f Amoxicilina-clavulánico Total SC 118 (61,8) 118 (61,8)* Grupo CTX-M-9 SC 41 (35,3) 41 (35,3)* Grupo CTX-M-1 SC 23 (60,5) 23 (60,5)* Grupo SHV SC 6 (20,7) 6 (20,7)* Piperacilina-tazobactam Total SC 175 (91,6) 164 (85,9) g Grupo CTX-M-9 SC 110 (94,8) 108 (93,1) Grupo CTX-M-1 SC 31 (81,6) 23 (60,5) h Grupo SHV SC 27 (93,1) 27 (93,1) Resultados 137 Ertapenem Total 191 (100) 187 (97,9) c 191 (100) i Grupo CTX-M-9 116 (100) 114 (98,3) 116 (100) Grupo CTX-M-1 38 (100) 36 (94,7) 38 (100) Grupo SHV 29 (100) 29 (100) 29 (100) Imipenem Total 191 (100) 191 (100) 191 (100) Grupo CTX-M-9 116 (100) 116 (100) 116 (100) Grupo CTX-M-1 38 (100) 38 (100) 38 (100) Grupo SHV 29 (100) 29 (100) 29 (100) Ciprofloxacino Total SC 62 (32,5) 59 (30,9) Grupo CTX-M-9 SC 40 (34,5) 38 (32,8) Grupo CTX-M-1 SC 6 (15,8) 6 (15,8) Grupo SHV SC 12 (41,4) 11 (37,9) Gentamicina Total SC 152 (79,6) 145 (75,9) Grupo CTX-M-9 SC 96 (82,8) 89 (76,7) Grupo CTX-M-1 SC 27 (71,1) 27 (71,1) Grupo SHV SC 23 (79,3) 23 (79,3) Tobramicina Total SC 175 (91,6) 164 (85,9) j Grupo CTX-M-9 SC 106 (91,4) 102 (87,9) Grupo CTX-M-1 SC 18 (47,4) 17 (44,7) Grupo SHV SC 27 (93,1) 24 (82,8) Amikacina Total SC 188 (98,4) 171 (75,9) d Grupo CTX-M-9 SC 116 (100) 113 (97,4) Grupo CTX-M-1 SC 35 (92,1) 23 (60,5) d Grupo SHV SC 29 (100) 28 (96,6) *Ninguno resistente. SC: sin cambios en los puntos de corte en la versión de 2010. Valores de p para las comparaciones entre CLSI 2010 y CLSI 2009 (chi-cuadrado excepto donde se especifica): a <0,001; b 0,002 (test de Fisher); c 0,06 (test de Fisher). Valores de p para la comparación entre CLSI 2010 y EUCAST 2011 (chi-cuadrado excepto donde se especifica): d <0,001; e 0,007; f 0,02; g 0,07; h 0,04; i 0,06 (test de Fisher); j 0,07. El resto de comparaciones >0,1. 4.4. Análisis de potenciales diferencias clínicoepidemiológicas en función de la BLEE producida Se realizó una comparativa entre las características clínico-epidemiológicas en función del tipo de BLEE, encontrándose los siguientes resultados referidos Resultados 144 4.5. Estudio descriptivo de la cohorte de casos 4.5.1. Variables demográficas Las distintas características se presentarán en el global de la serie y en función de la adquisición (Tablas 18 y 19). La proporción de bacteriemias de E. coli BLEE fue muy similar para ambos sexos, siendo ligeramente superior el número de hombres afectados, 56%. No hubo diferencias en la frecuencia por sexos en función de la adquisición. La edad media fue de 66,6 años y la mediana de 71; el rango de edades estaba comprendido entre 20 y 93 años. La media de edad de los casos comunitarios fue 72 años, 10 más que para los nosocomiales. Comparando el porcentaje de pacientes mayores de 65 años entre el grupo nosocomial (47%) y el grupo relacionado con los cuidados sanitarios (74%), la diferencia fue significativa, pero no entre el grupo nosocomial y el estrictamente comunitario (70%). La distribución por grupos de edad se muestra en la Figura 8. Figura 8. Distribución del número de pacientes por edad en grupos de diez años en función de la adquisición de la bacteriemia. 0 5 10 15 20 25 30 35 14-24 25-34 35-44 45-54 55-64 65-74 75-84 85-94 Comunitaria Nosocomial Tabla 18. Características demográficas y factores predisponentes de los pacientes con bacteriemia por E. coli BLEE globales y en función de la adquisición de la infección. Los datos se expresan como Nº (%), excepto donde se especifica. GLOBAL ESTRICTAMENTE COMUNITARIA (EC) RELACIONADA CON CUIDADOS SANITARIOS (RCS) NOSOCOMIAL (N) N=191 N=23 N=72 N=96 Casos 191 (100) 23 (24) 72 (76) 96 (50) Hombres 107 (56) 11 (48) 42 (58) 54 (56) Edad (mediana y rango) 71 (20-93) 75 (21-93) 76 (31-93) 63 (20-89) Edad > 65 años 114 (60) 16 (70) 53* (74) 45 (47) SERVICIOS Urgencias 68 (36) 15 (65) 53 (74) 0 Médicos 76 (40) 8 (35) 18 (25) 50 (52) Quirúrgicos 33 (17) 0 1 (1) 32 (33) UCI 14 (7) 0 0 14 (15) ENFERMEDADES DE BASE Diabetes 52 (27) 7 (30) 17 (24) 28 (29) EPOC 34 (18) 5 (22) 13 (18) 16 (17) Insuficiencia cardíaca 24 (13) 1 (4) 10 (14) 13 (14) Neoplasia 55 (29) 0** 24 (33) 31 (32) Insuficiencia renal crónica 28 (15) 3 (13) 7 (10) 18 (19) Enfermedad neurológica discapacitante 24 (13) 2 (9) 17* (24) 5 (5) Enfermedad o tratamiento inmunosupresor 27 (14) 1 (4) 6* (8) 20 (21) Uropatía obstructiva crónica 43 (23) 7 (30) 20 (28) 16 (17) Patología digestiva crónica 16 (8) 1 (4) 7 (10) 8 (8) Cirrosis 18 (9) 1 (4) 9 (13) 8 (8) Enfermedad vía biliar y pancreática 18 (9) 0 8 (11) 10 (10) Litiasis biliar no complicada 6 (3) 1 (4) 2 (3) 3 (3) Neutropenia 10 (5) 0 4 (6) 6 (6) ÍNDICES McCabe No fatal 106 (56) 21** (91) 36 (50) 49 (51) Rápidamente fatal 16 (8) 1 (4) 6 (8) 9 (9) Charlson (media) 3 1 3 3 Charlson > 2 86 (45) 4** (17) 42* (58) 40 (42) PROCEDIMIENTOS INVASIVOS PREVIOS Catéter venoso 79 (41) 0* 20* (28) 53 (55) Catéter central 53 (28) 0* 8* (11) 45 (47) Ventilación mecánica (1 semana antes) 8 (4) 0 0* 8 (8) Sonda urinaria transitoria 48 (25) 2* (9) 7* (10) 39 (41) Sonda urinaria permanente 18 (9) 2 (9) 12* (17) 4 (4) Prótesis biliar actual 11 (6) 0 4 (6) 7 (7) Cirugía (un mes previo) 45 (24) 0* 11* (15) 33 (34) Cirugía vía biliar previa 5 (3) 0 3 (4) 2 (2) Procedimiento endoscópico (1 semana antes) 10 (5) 0 1 (1) 9 (9) Procedimiento urológico (un mes previo) 10 (5) 0 1 (1) 9 (9) TERAPIA ANTIMICROBIANA PREVIA Terapia combinada 60 (31) 1 (4) 15 (21) 44 (46) Un antibiótico sólo 48 (25) 5 (22) 18 (25) 25 (26) Dos antibióticos 37 (19) 1 (4) 9 (13) 27 (28) Tres antibióticos 23 (12) 0 6 (8) 17 (18) Cuatro o más antibióticos 10 (5) 0 3 (4) 7 (7) Penicilinas 20 (11) 0 7 (10) 13 (14) Amoxicilina-clavulánico 18 (9) 0 6 (8) 12 (13) Quinolonas 49 (26) 4 (17) 20 (28) 25 (26) Cefalosporinas 53 (28) 2* (9) 11* (15) 40 (42) *Diferencias significativas: *N versus RCS: Edad > 65 (p=0,001), Charlson > 2 (p=0,032), enfermedad neurológica discapacitante (p<0,001), enfermedad o tratamiento inmunosupresor (p=0,027), sondas urinarias (transitoria p<0,001 y permanente p=0,006), catéteres (venoso y central p<0,001), ventilación mecánica (p=0,011), cirugía un mes previo (p=0,005) y uso previo de cefalosporinas (p<0,001). *N versus EC: Charlson > 2 (p=0,03), Mc Cabe no fatal (p<0,001), neoplasia (p=0,002), sonda urinaria transitoria (p=0,004), catéteres (venoso p=0,012, central p<0,001), cirugía un mes previo (p=0,004) uso previo de cefalosporinas (p=0,003). *RCS versus EC: Charlson > 2 (p=0,001), Mc Cabe no fatal (p<0,001) y neoplasia (p=0,001). Tabla 19. Características clínicas y pronósticas de los pacientes con bacteriemia por E. coli BLEE globales y en función de la adquisición de la infección, datos expresados en Nº (%), excepto donde se indica. GLOBAL ESTRICTAMENTE COMUNITARIA (EC) RELACIONADA CON CUIDADOS SANITARIOS (RCS) NOSOCOMIAL (N) N=191 N=23 N=72 N=96 CLÍNICA Origen de la bacteriemia Desconocido 25 (13) 1 (4) 6 (8) 18 (19) Urinario 90 (47) 15* (65) 40* (56) 35 (37) Intraadominal 48 (25) 4 (17) 20 (28) 24 (25) Neumonía 6 (3) 1 (4) 1 (1) 4 (4) Otras respiratorias 4 (2) 1 (4) 1 (1) 2 (2) Catéter 9 (5) 0 1 (1) 8 (8) Gastroenteritis 1 (1) 0 1 (1) 0 Aparato genital 1 (1) 1 (4) 0 0 Piel y partes blandas 3 (2) 0 1 (1) 2 (2) Osteoarticular 3 (2) 0 1 (1) 2 (2) Otras 1 (1) 0 1 (1) 1 (1) Síntomas y signos Fiebre > 39 ºC 65 (34) 7 (30) 19 (26) 39 (41) Hipotermia (< 35,5 ºC) 3 (2) 0 2 (3) 1 (1) Leucocitosis > 12.000 73 (38) 10 (44) 29 (40) 34 (35) Leucopenia < 4.000 21 (11) 0 7 (10) 14 (15) Coagulopatía 3 (2) 0 0 3 (3) Insuficiencia renal aguda 23 (12) 2 (9) 8 (11) 13 (14) Gravedad de la infección Sepsis grave 22 (12) 0* 12 (17) 10 (10) Shock séptico 28 (15) 3 (13) 8 (11) 17 (18) Síndrome de disfunción multiorgánico 8 (4) 0 3 (4) 5 (5) Índice Pitt Índice Pitt > 3 22 (12) 1 (4) 9 (13) 9 (10) Índice Pitt [media (rango)] 1,6 (0-14) 1,3 (0-14) 1,7 (0-7) 1,6 • (0-11) PRONÓSTICO Éxitus a los 30 días 47 (24,6) 3 (13) 15 (21) 29 (30) Éxitus a los 14 días 40 (85) 3 (13) 13 (18) 24 (25) • Tres valores perdidos. *Diferencias significativas: *N versus RCS: Origen urinario (p=0,014). *N versus EC: Origen urinario (p=0,012). *RCS versus EC: Sepsis grave (p=0,035). Resultados 149 En cuanto a los casos nosocomiales, el 52% de los pacientes estaban ingresados en servicios médicos, el 33% en servicios quirúrgicos y el 15% en UCI (Figura 9). Los casos de origen comunitarios fueron principalmente detectados en los servicios de urgencias (72%) y en segundo lugar en los servicios médicos (27%). Figura 9. Porcentaje de casos nosocomiales en función del servicio hospitalario donde se encontraba el paciente cuando se detectó la bacteriemia. 52% 33% 15% Médicos Quirúrgicos UCI En la Figura 10 se muestra la distribución de los casos a lo largo del periodo de estudio. El rango de casos por mes fue desde 2 en enero de 2006 a 20 casos en octubre de 2005, con una media de 12 casos por mes. Desde el inicio del estudio hasta noviembre de 2005 se observó una tendencia creciente. En diciembre de 2005 y enero de 2006 se apreció un descenso brusco, en relación con el hecho de que solo una minoría de centros continuaron incluyendo casos en el estudio en estos dos meses. Resultados 150 Figura 10. Número de casos ocurridos en cada mes del estudio en función del tipo de adquisición de la bacteriemia. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 OCT 2004 NOV 2004 DIC 2004 ENE 2005 FEB 2005 MAR 2005 ABR 2005 MAY 2005 JUN 2005 JUL 2005 AGO 2005 SEP 2005 OCT 2005 NOV 2005 DIC 2005 ENE 2006 Estrictamente comunitaria Relacionada con cuidados sanitarios Nosocomial Resultados 151 4.5.1.1. Enfermedades de base Las enfermedades de base más frecuentes fueron la neoplasia, diabetes y uropatía obstructiva. Los datos se muestran en la Tabla 18. La comparación entre casos nosocomiales y comunitarios no arrojó grandes diferencias en las enfermedades de base; los porcentajes fueron similares con algunas excepciones. La enfermedad neurológica discapacitante y uropatía obstructiva crónica fueron más frecuentes entre los comunitarios. La mayoría de los casos comunitarios con enfermedad neurológica discapacitante eran relacionados con los cuidados sanitarios. El porcentaje de pacientes con enfermedad o tratamiento inmunosupresor fue mayor entre los casos nosocomiales. Entre los casos comunitarios todos los casos de neoplasia, cirrosis y neutropenia se dieron en aquellos que estaban relacionados con los cuidados sanitarios. Entre las uropatías, la más frecuente fue la hiperplasia benigna de próstata seguida de la litiasis renal (42 y 26% respectivamente). En cuanto a la gravedad de las enfermedades de base, el 56% de los pacientes padecía una enfermedad no fatal, el 36% de los pacientes tenía enfermedad últimamente fatal y el 8% restante rápidamente fatal. Medida la gravedad de la enfermedad de base mediante el índice de Charlson, el 55% de los pacientes tuvo un valor entre 0 y 2, por tanto, enfermedades de baja gravedad; el 29% tuvo valores de índice entre 3 y 5 y tan sólo un 3% tuvo entre 8 y 10. Los datos de los dos índices, Mc Cabe y Charlson fueron en general coincidentes. La mediana del índice de Charlson y el porcentaje de casos con índice de Charlson > 2 fueron inferiores para los casos estrictamente comunitarios que para los casos relacionados con los cuidados sanitarios y nosocomiales. Resultados 152 4.5.1.2. Utilización de procedimientos invasivos El procedimiento más utilizado fue el catéter venoso, en el 41% de los pacientes, seguido del catéter central, sonda urinaria transitoria y cirugía. La ventilación mecánica fue empleada en el 4% de los pacientes. El 5% de los pacientes sufrieron un procedimiento endoscópico en la semana previa al hemocultivo, 9 pacientes de origen nosocomial y 1 comunitario. Prótesis biliar tuvieron el 6% de los pacientes, 7 nosocomiales y 4 comunitarios. Comparando los casos nosocomiales frente a los comunitarios relacionados con los cuidados sanitarios se encontraron diferencias estadísticamente significativas (como era de esperar) en el empleo de sonda urinaria transitoria, catéter venoso, catéter central, cirugía un mes previo, sonda urinaria permanente, ventilación mecánica y procedimiento endoscópico una semana antes del hemocultivo. 4.5.1.3. Utilización de antimicrobianos previos Entre los 191 casos, hubo 108 (57%) que recibieron al menos un antimicrobiano durante los dos meses previos al hemocultivo en el que se aisló E. coli productor de BLEE (Tabla 19). Hubo 48 pacientes que recibieron sólo un antibiótico, 60 recibieron 2, 23 pacientes recibieron 3 antibióticos diferentes y 10 fueron tratados con al menos 4 antibióticos. De los casos nosocomiales, el 72% había recibido tratamiento antimicrobiano en los dos meses previos, mientras que de los casos comunitarios fue el 41% (específicamente, 46% entre los relacionados con los cuidados sanitarios y 26% entre los estrictamente comunitarios). Las familias de antimicrobianos más empleadas fueron las cefalosporinas en el 28% de los pacientes, las quinolonas (26%) y las penicilinas (11%). Esto fue así también entre los casos nosocomiales, mientras que entre los casos relacionados con los cuidados sanitarios y estrictamente comunitarios, las quinolonas fueron los antibióticos más frecuentemente recibidos. El uso previo de cefalosporinas fue significativamente más frecuente en los casos nosocomiales que en los relacionados Resultados 153 con los cuidados sanitarios y los estrictamente comunitarios (42, 15 y 9%, respectivamente). 4.5.2. Clínica 4.5.2.1. Origen de la bacteriemia El origen de la bacteriemia predominante fue el urinario seguido del intraabdominal (47 y 25% respectivamente) (Figura 11 y Tabla 19). De las infecciones con causa intraabdominal fueron mayoritarias las de origen biliar con la mitad de los casos. El origen urinario fue significativamente más frecuente entre las bacteriemias estrictamente comunitarias y relacionadas con los cuidados sanitarios que entre las nosocomiales. Como se observa en la Figura 11, la distribución de orígenes fue mayor en las nosocomiales y menor en las estrictamente comunitarias. Figura 11. Número de casos según el origen de la bacteriemia en función de la adquisición de la infección. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Estrictamente comunitaria Relacionada con cuidados sanitarios Nosocomial Desconocido Tracto respiratorio Intraabdominal Catéter Tracto urinario Otros