Papel de TDRD9 en oncogénesis

Caracterización y función de TDRD9 en carcinogénesis Trabajo realizado en el Departamento de Biología del Genoma, CABIMER, para optar al grado de Doctora en Biología por la Licenciada Macarena Guijo Molero, siguiendo el programa de doctorado BIOLOGÍA MOLECULAR, BIOMEDICINA E INVESTIGACIÓN CLÍNICA de la Universidad de Sevilla, y bajo la dirección del Doctor José Carlos Reyes Rosa. Sevilla, Noviembre 2016 El director de la Tesis José Carlos Reyes Rosa Tutora de la Tesis Rosa Mª Luna Varo La Doctoranda Macarena Guijo Molero ÍNDICE Índice 5 ABREVIATURAS ...................................................................................................... 9 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS ........................................................................... 11 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 12 1. CROMATINA Y EPIGENÉTICA 15 2. METILACIÓN DEL DNA 16 2.1. Control de la metilación en el desarrollo 20 2.1.1. Reprogramación en la línea germinal 20 2.1.2. Reprogramación de la metilación en el embrión temprano 22 3. FUNCIONES Y ELEMENTOS REGULADOS POR METILACIÓN 23 3.1. Islas CpG (CGIs) 23 3.2. Repeticiones pericentroméricas 25 3.3. Elementos transponibles (TEs) 26 3.3.1. LINE-1 26 4. IMPLICACIÓN DE LA METILACIÓN DE DNA EN CÁNCER 27 4.1. Hipometilación en cáncer 27 4.2. Hipermetilación en cáncer 28 5. PIRNAS Y PROTEÍNAS PIWIS 29 6. TDRD9 33 OBJETIVOS ............................................................................................................ 39 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 43 1. ORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO 45 1.1. Organismos 45 1.2. Condiciones de cultivo bacteriano 46 1.3. Condiciones de cultivo de levadura 46 1.4. Condiciones de cultivo de líneas celulares animales 46 2. OLIGONUCLEÓTIDOS Y PLÁSMIDOS 47 3. MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DEL DNA 48 Índice 6 3.1. Aislamiento de DNA plasmídico bacteriano 48 3.2. Aislamiento de DNA plasmídico de levaduras 49 3.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa 50 3.4. Purificación, cuantificación y secuenciación de DNA 50 3.5. Amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la 50 polimerasa 3.6. Transformación de bacterias 51 3.7. Transformación de levaduras 51 3.8. Transfección transitoria de líneas celulares animales con DNA plasmídico 52 3.9. Aislamiento de DNA genómico de células animales 52 3.10. Manipulación enzimática 53 4. MANIPULACIÓN DEL RNA 53 4.1. Aislamiento y cuantificación del RNA de líneas celulares animales 53 4.2. Aislamiento y cuantificación del RNA de tejidos humanos 53 4.3. Reacción de retrotranscripción a partir de RNA seguido de amplificación 54 de cDNA mediante PCR 4.4. Transfección de RNA de interferencia 54 5. SÍNTESIS, PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 55 5.1. Obtención de extractos proteicos de líneas celulares animales 55 5.2. Obtención de extractos de proteínas insolubles de líneas celulares animales 55 5.3. Electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida 56 5.4. Cuantificación de proteínas 56 5.5. Sistema de doble híbrido en levaduras 57 6. MÉTODOS INMUNOLÓGICOS 58 6.1. Anticuerpos 58 6.2. Ensayo de Western Blot 59 6.2.1. Detección por quimioluminiscencia 59 6.2.2. Detección por fluorescencia 60 6.3. Inmunofluorescencia 60 7. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA 61 8. ANÁLISIS DE CICLO CELULAR 62 8.1. Curvas de crecimiento 62 8.2. Análisis del ciclo celular y apoptosis por citometría de flujo 62 9. INDUCCIÓN DEL DAÑO CELULAR MEDIANTE IRRADIACIÓN 63 10. ENSAYOS DE SUPERVIVENCIA 63 Índice 7 11. ANÁLISIS DE METILACIÓN DE DNA MEDIANTE LA CONVERSION DE CITOSINAS CON BISULFITO 64 12. TRATAMIENTOS CON 5´AZA-2-DEOXYCITIDINA (5-Aza) 66 13. DETERMINACIÓN DE FOCOS DE -H2A.X: IF Y CONTEO 67 14. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE MICROMATRICES (MICROARRAY) 67 15. ANÁLISIS DE DATOS DE TUMORES Y ESTADÍSTICA 68 RESULTADOS ........................................................................................................ 69 1. TDRD9 EN CÁNCER 71 1.1. TDRD9 se expresa en adenocarcinomas de pulmón y en melanomas 71 1.2. La Isla CpG de TDRD9 está hipometilada en cáncer 75 1.3. La depleción de TDRD9 afecta a la proliferación de células que expresan TDRD9 80 1.4. TDRD9 no controla la expresión de LINE-1 82 1.5. Caracterización de cambios transcripcionales producidos por la bajada de expresión de TDRD9 86 1.6. La depleción de TDRD9 provoca una acumulación de daño en el DNA 87 2. BÚSQUEDA DE INTERACTORES DE TDRD9 MEDIANTE ESCRUTINIO DE DOBLE HÍBRIDO 90 2.1. Análisis de los positivos obtenidos en el escrutinio de doble Híbrido 91 2.2. Localización celular de TDRD9 y ensayos de coexpresión con interactores positivos del ensayo de doble híbrido 93 DISCUSIÓN .......................................................................................................... 101 1. TDRD9 EN CÁNCER 103 1.1. TDRD9 como diana terapéutica 107 2. LOCALIZACIÓN E INTERACTORES PROTEICOS DE TDRD9 108 CONCLUSIONES .................................................................................................. 113 Índice 8 ANEXO ................................................................................................................. 117 1. Genes en común que cambian significativamente su expresión tras silenciar TDRD9 119 BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................... 123 Abreviaturas 9 ABREVIATURAS APS Persulfato de amonio ATP Adenosín trifosfato BER Reparación por escisión de bases bp Pares de bases BSA Albúmina de suero bovino BP-GO GO de procesos biológicos ºC Grado centígrado CB Cuerpos cromatoides cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario CGI Isla CpG cm Centímetro CTs Cancer testis DAPI 4´,6-Diamino-2-fenilindol diclorhidrato DMEM Medio de Eagle modificado por Dulbecco DNA Ácido desoxirribonucleico DNMT Transferasa de DNA de grupos metilos dNTPs Desoxirribonucleótidos trifosfato D.O Densidad óptica EDTA Ácido etilendiaminotetraacético. EGTA Ácido etilenglicol-bis [-aminoetil éter]N,N,N´,N´ tetraacético. FBS Suero fetal bovino g Aceleración gravitatoria terrestre GAPDH Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa GO Procesos Ontológicos h Hora HEPES Ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil-(1)) etanosulfónico. IPTG Isopropil--D-1-tiogalactopiranósido kb Kilobase kDa Kilodalton l litro LA Adenocarcinoma de pulmón LB Medio Luria-Bertani LINE-1 Long Interspersed nuclear elements M Molar MF-GO GOs de procesos funcionales min Minuto ml Mililitro mM Milimolar mol Moles mRNA RNA mensajero NSCLC Carcinoma de pulmón de células no pequeñas nt nucleótidos PB P-Body like granules PBS Solución salina fosfato PCR Reacción en cadena de la polimerasa PGC Células germinales primordiales piPB PBs enriquecidos en piRNAs piRNAs PIWI interacting RNA PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PTM Modificaciones post traduccionales qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa RNA Ácido ribonucleico RPMI Medio Roswell Park Memorial Institute RT Temperatura ambiente Introducción 16 El término “epigenética”, el cual literalmente significa “fuera de la genética convencional”, hace referencia a cambios heredables en la función génica que ocurren sin alterar la secuencia de DNA (Goldberg et al. 2007, Kietrys et al. 2016). Los procesos epigenéticos son esenciales para el desarrollo y la diferenciación y pueden estar influenciados por el ambiente (nutrición, estrés, toxinas y los antecedentes médicos) (Skinner et al. 2010). Los tres mecanismos epigenéticos más importantes son: i) Las modificaciones postraduccionales de histonas (PTMs), capaces de cambiar la estructura de la cromatina, están asociadas a activaciones y represiones transcripcionales. En general, las modificaciones de histonas incluyen principalmente la acetilación, la metilación, fosforilación y ubiquitinación (Jenuwein et al. 2001, Gelato et al. 2008). ii) RNAs no codificantes, capaces de regular la expresión de un gen diana por múltiples vías moleculares. La más estudiada es la degradación de mRNA, muy importante en procesos como apoptosis, proliferación celular, diferenciación y metabolismo (He et al. 2004, Bandiera et al. 2010) y iii) la metilación del DNA (Goldberg et al. 2007). 2.-METILACIÓN DEL DNA Una de las modificaciones epigenéticas mejor estudiadas es la metilación del DNA. Ésta, está presente en la mayoría de plantas y animales (Feng et al. 2010). En bacterias también se dan procesos de metilación, en adenosinas o citosinas (Arber et al. 1962, Wion et al. 2006). En mamíferos, la metilación del DNA ocurre mayoritariamente en pares CpG simétricos y se estima que están metilados alrededor del 70-80% de ellos. El resto de pares CpG que no están metilados se concentran en regiones ricas en C+G cercanas a promotores denominados Islas CpG (CGIs) (Suzuki et al. 2008, Cedar et al. 2009). La metilación de las CGIs reprime la transcripción de los genes asociados (Figura I2) e interviene en la regulación de promotores alternativos. Se ha descrito también que la metilación del DNA desarrolla un papel en la actividad de los enhancers (Ehrlich et al. 2013, Kulis et al. 2013). La metilación del DNA también está implicada en la modificación de grandes estructuras génicas, tales como inactivación del cromosoma X, el control de las Introducción 17 regiones de impronta (ICR), compactación de la heterocromatina y el mantenimiento de la estabilidad genética (Alberti et al. 1994, Nasr et al. 2003). El proceso de metilación consiste en la unión covalente de un grupo metilo (CH3) al carbón 5 del anillo de la citosina, dando como resultado 5-metilcitosina (5- mC). Este proceso está controlado por una familia de enzimas denominadas DNA metiltransferasas (DNMTs). Se requieren tres DNMTs para establecer o mantener los patrones de metilación (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B) y otra enzima adicional con idénticas funciones (DNMTL) (Okano et al. 1999, Suetake et al. 2004, Chen et al. 2005). El mantenimiento de la metilación del DNA ocurre durante el proceso de replicación y es dependiente, principalmente, de la DNMT1. Esta metiltransferasa está asociada con los lugares de replicación para restaurar la metilación completa en la hebra naciente que no está metilada (Kim et al. 2009). La DNMT1 se recluta al lugar de replicación mediante una interacción con el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) que es un componente de la maquinaria de replicación (Chuang et al. 1997) y con la proteína UHRF1 (ubiquitin-like plant homeodomain and RING finger domain 1), la cual se requiere para la asociación de la DNMT1 con la cromatina (Figura I3) (Bostick et al. 2007, Sharif et al. 2007, Arita et al. 2008, Avvakumov et al. 2008, Hashimoto et al. 2008, Qian et al. 2008, Law and Jacobsen 2010). Por otro lado, la metilación de novo es llevada a cabo esencialmente por las DNMT3A, DNMT3B y DNMTL en pares CpG. Figura I2. Representación de la CGI del promotor asociado a un gen. Como representa la imagen, la metilación de los pares CpG de la CGI de un promotor, está asociada con la represión de la expresión del gen asociado a dicho promotor. Los círculos en blanco representan pares CpG desmetilados, mientras que los negros son pares CpG metilados. Expresión del gen Represión del gen Introducción 18 Los procesos de metilación y desmetilación son igualmente importantes ya que están acoplados, requiriéndose una acción balanceada entre ambos para un control correcto de la expresión génica. La desmetilación del DNA consiste en la eliminación del grupo metilo de la base nitrogenada metilada y puede ser activa o pasiva, o incluso ser una mezcla de ambas. Desmetilación activa: es el proceso por el que se elimina el grupo metilo de la citosina metilada (5-mC) de forma independiente a la replicación. Ocurre en varios pasos: la 5-mC se procesa a 5-hidroximetilcitosina (5-hmC). La 5-hmC es convertida a 5-formilcitosina (5-fC) y posteriormente a 5-carboxilcitosina (5-caC). Todas estas conversiones están mediadas por la dioxigenasa ten-eleven translocation (TET) (Tahiliani et al. 2009, Ficz et al. 2011). Es ahora cuando la timina DNA glicosidasa (TDG) escinde la 5-fC y la 5-caC originando un sitio abásico que es posteriormente corregido mediante la ruta BER (base excision repair). A veces, la 5- mC experimenta desaminaciones. Las enzimas AID y APOBEC catalizan el procesamiento de la citosina que la lleva a ser desaminada. Esto ocurre predominantemente en los residuos de 5-hmC y 5-mC, convirtiéndolos en 5- hidroximetiluracilo (5-hmU) y timina (T) respectivamente. Consecuentemente, se generan desapareamientos U:G y T:G que son eficientemente reparados por la ruta TDG/BER (Figura I4-A) (He et al. 2011, Song et al. 2013, Trerotola et al. 2015). DNA completamente metilado Replicación del DNA DNA hemimetilado Figura I3. Mantenimiento de la metilación del DNA. Modelo que representa el mantenimiento de la metilación de CGs durante la replicación. La DNMT1 (DNA metiltransferasa 1) es reclutada al lugar de la replicación a través de las interacciones con UHFR (RING finger domain 1) y con PCNA (proliferating cell nuclear antigen). Tras el reclutamiento, la DNMT1 metila completamente las cadenas hemimetiladas nacientes. Los círculos grises y blancos, representan citosinas metiladas y desmetiladas respectivamente. Adaptado de (Law et al. 2010). Replisoma Introducción 19 Desmetilación pasiva: esta desmetilación también puede darse por el procesamiento de la 5-mC en 5-hmC (Tahiliani et al. 2009, Ficz et al. 2011). La metilasa de mantenimiento DNMT1, a diferencia de DNMT3A y DNMT3B, no reconoce la 5-hmC. Por el momento no se ha descrito ningún mantenimiento de la 5-hmC tras ciclos de replicación. Por tanto la 5-hmC se va perdiendo en cada replicación, diluyéndose así la metilación del DNA (Figura I4-B) (Sarkar 2016). Por otro lado, se han descrito procesos de desestabilización de la DNMT1, así como de exclusión de la DNMT1 del núcleo (Petrussa et al. 2014) Figura I4. Mecanismos de metilación/desmetilación. A) Los grupos metilos (CH3) son transferidos al carbono 5 de la citosina para originar la 5-mC, proceso catalizado por la DNMT. En la desmetilación activa, TET, desmetilasa de DNA, convierte la 5-mC en 5-hmC, la cual es totalmente procesada a 5-fC y posteriormente a 5-caC. Estos lugares son dianas para TDG/BER que escinden la 5-fC y la 5-caC dando lugar a un sitio abásico. La desmetilación del DNA también puede ocurrir a través de una desaminación expontánea de la citosina, lo cual es catalizado por las enzimas AID/APOBEC. Los desapareamientos U:G y T:G son reparados por la ruta TDG/BER. B) La metilación de novo y mantenimiento ocurre usando DNA completamente desmetilado y la cadena naciente hemimetilada tras la replicación respectivamente, por acción de las enzimas DNMT. En ausencia de metilación de mantenimiento, se origina una desmetilación pasiva por dilución de la 5-mC en sucesivos ciclos de replicación. Adaptado de (Trerotola et al. 2015). A B Desaminación de citosinas Desmetilación activa Desmetilación pasiva Sitio abásico Metilación de novo Replicación del DNA Metilación de mantenimiento DNA metilado DNA desmetilado DNA metilado DNA desmetilado DNA hemimetilado Introducción 20 2.1 Control de la metilación en el desarrollo (Figura I5) El desarrollo de mamíferos comienza con el zigoto totipotente, el cual posee un potencial capaz de generar un organismo completo. Este estado totipotente no es generado exclusivamente por las características genéticas ya que, salvo alguna excepción, todas las células que forman el zigoto presentan la misma secuencia de DNA. Las características epigenéticas (o la falta de ellas) puede definir el potencial de desarrollo del zigoto y promueve la diferenciación de las células en futuras generaciones (Hemberger et al. 2009). La metilación es una de las características epigenéticas más importantes, implicadas en el desarrollo. En la línea germinal existen dos oleadas de desmetilaciones del DNA: i) inmediatamente después de la fertilización en el zigoto, y ii) durante el establecimiento de las células germinales primordiales (PGC), que son los precursores directos de ovocitos y espermatozoides. Estos cambios dramáticos en el estado epigenético conducen al borrado de las marcas epigenéticas que provienen desde los gametos (con la excepción de la impronta). De la misma manera, la reprogramación epigenética de PGCs está asociada con la restauración de la totipotencialidad y el borrado de las marcas de impronta parentales (Seisenberger et al. 2013). La metilación puede ir perdiéndose de manera pasiva por dilución, o activamente por eliminación de las 5-mC. 2.1.1 Reprogramación en la línea germinal En ratón, las células germinales primordiales (PGC) son confinadas en el embrión en los días 6,5 (E.6,5) en el epiblasto proximal, donde se silencian genes somáticos. En los días 7,5 (E.7,5) las PGCs migran para formar las gónadas. En estos estadíos tempranos hay establecidas marcas epigenéticas que están presentes en las células del epiblasto, incluyendo niveles significativos de metilación del DNA. Como consecuencia de ello, las PGCs necesitan reprogramar sus patrones epigenéticos ya que estos darán lugar a los gametos que tendrán la capacidad de originar un zigoto totipotente en la siguiente generación (Ginsburg et al. 1990, Seki et al. 2005, Ohinata Introducción 21 et al. 2009). A partir de los días E10,5-11,5 ocurre una oleada de desmetilaciones que puede suponer una situación muy delicada en relación con el salto de elementos transponibles, (TEs) que son controlados por metilación. (Hajkova et al. 2010). Inmediatamente después de la desmetilación, ocurre una metilación de novo para controlar los TEs, establecer la impronta y controlar regiones pericentroméricas. La metilación de novo en PGCs masculinas tiene lugar unos días después de que el borrado se haya completado, entre los días E14,5 y E16,5 y continúa hasta prospermatogonia (Ueda et al. 2000, Kato et al. 2007). En la línea germinal femenina, el establecimiento de la metilación del DNA tiene lugar después del nacimiento en el ovocito en crecimiento (Lucifero et al. 2004, Hiura et al. 2006, Smallwood et al. 2011). El resultado de la metilación de novo es un patrón de metilación de DNA que refleja las características del sexo del embrión. Las responsables de la metilación de novo en PGCs de embriones masculinos y femeninos son Dnmt3a, Dnmt3b y la Dnmt3l. Un fallo en el restablecimiento de la metilación del DNA en gametos masculinos provoca defectos en espermatogénesis y esterilidad. En los gametos femeninos no ocurre esto, pero si ocurren aberraciones por el defecto en la impronta. Ovocitos y espermatocitos tienen grandes diferencias en sus estados de metilación sobre todo en los TEs. Por ejemplo, los elementos LINE-1 están hipermetilados generalmente en espermatozoides, mientras en ovocitos la regulación de este retrotransposón ocurre probablemente por otra vía (Bourc'his et al. 2001, Kobayashi et al. 2012). En esta metilación originada en TEs, intervienen los Piwi-interacting RNAs (piRNAs) (descritos más adelante). El restablecimiento de la metilación global para células germinales masculinas y femeninas son diferentes: el esperma se remetila casi por completo (85% de CGs) mientras que los ovocitos presentan una remetilación moderada (alrededor del 30%) (Popp et al. 2010, Smallwood et al. 2011, Smith et al. 2012). 2.1.2 Reprogramación de la metilación en el embrión temprano Los patrones de metilación del DNA establecidos en espermatozoides y ovocitos son reprogramados una vez más cuando las dos células germinales se unen para formar el zigoto tras la fertilización. Entre los pronúcleos, femenino y Introducción 22 masculino, se observa una asimetría en la dinámica de desmetilación del DNA. El genoma paterno es despojado de la gran parte de su metilación mediante un proceso activo que ocurre en dos fases, antes y durante la replicación del DNA y es completada tras la primera división celular (Santos et al. 2002, Wossidlo et al. 2010). El genoma materno es pasivamente desmetilado tras las siguientes divisiones celulares debido a la exclusión del núcleo de la DNA metiltransferasa de mantenimiento DNMT1o (Howell et al. 2001). Se ha demostrado que en el pronúcleo paterno se eliminan las 5-mC de lugares como los retrotransposones LINE-1 y algunos LTRs, aunque otros lugares escapan de la oleada de desmetilación, como los genes de impronta paternales y algunos retrotransposones IAP. Una progresión exitosa del desarrollo temprano depende del mantenimiento de la metilación en estos lugares (Howlett et al. 1991, Oswald et al. 2000, Smith et al. 2012). Esta desmetilación global llega a mínimos tras convertirse el embrión en blastocito, momento en el cual podemos diferenciar dos grupos celulares: i) las células del trofodermo, que muestran bajos niveles de metilación del DNA; y ii) las células de la masa interna (ICM) que dará lugar al embrión propiamente dicho y Figura I5.Reprogramación de la metilación del DNA en el ciclo de vida de mamíferos. La metilación del DNA representa una barrera epigenética en el desarrollo de mamíferos que es demolida cuando el potencial del desarrollo comienza y posteriormente reconstruída para generar las características particulares de cada célula. En primer lugar, esto ocurre inmediatamente después de la fertilización, cuando la metilación del DNA de los gametos parentales es borrada en dos oleadas de desmetilaciones. En la primera oleada, el pronúcleo paterno (azul) experimenta una rápida desmetilación en el zigoto, la cual es seguida por una pérdida pasiva de la metilación del DNA en el genoma materno (rojo). El restablecimiento de la metilación del DNA comienza en la ICM del embrión. Las PGCs (verde) heredan las características epigenéticas desde el epiblasto, volviendo a ocurrir otra oleada de desmetilaciones que restaura el potencial del desarrollo. Adaptado de ( Seisenberger et al. 2013) Días tras fertilización Metilación global Alta Baja Zigoto ICM Epiblasto PGC Gametos Nacimiento Introducción 23 donde comienza a darse la metilación de novo (Wossidlo et al. 2010). Los patrones de metilación vuelven a ser restaurados por DNMT3A junto con UHRF1. En comparación con las PGCs, en el embrión temprano se muestra una mayor estabilidad en la metilación del DNA lo cual proporciona características específicas para la expresión de genes del desarrollo y diferenciación celular (Lane et al. 2003). 3.- FUNCIONES Y ELEMENTOS REGULADOS POR METILACIÓN 3.1 Islas CpG (CGIs) Ya ha sido comentado en el apartado de la metilación que la mayoría de pares CpGs en mamíferos están químicamente modificados por metilación, sin embargo aproximadamente un 10% de pares CpG se agrupan en regiones de aproximadamente 1 Kb denominadas Islas CpG (CGIs). Estas agrupaciones se encuentran en muchos promotores de genes constitutivos o en genes de desarrollo y están permanentemente hipometiladas. Cerca de la mitad de CGIs desmetiladas identificadas en el genoma de mamíferos no están en promotores conocidos, son las CGIs huérfanas. También encontramos CGIs intragénicas las cuales están normalmente hipermetiladas durante el desarrollo y se han asociado a promotores alternativos (Illingworth et al. 2010). Para mantener el estado hipometilado de una CGI asociada a promotor, se necesita que las DNA metiltransferasas estén excluidas. Según estudios publicados, el estado de desmetilación de las CGIs de promotores está fuertemente influenciado por la unión de factores de transcripción. De hecho, si se eliminan estos factores de transcripción del lugar de unión, la CGI podría adquirir un estado hipermetilado y heredable (Figura I6) (Brandeis et al. 1994, Macleod et al. 1994, Illingworth and Bird 2009). La transferencia de un lugar de unión del factor de transcripción SP1 en un lugar endógeno metilado conduce a una desmetilación parcial del locus, confirmando así la dominancia de la unión de los factores de transcripción sobre la metilación del DNA en este contexto (Brandeis, Frank et al. 1994). Introducción 24 Se ha visto que la modificación de las histonas y sus variantes son también muy importantes para la regulación de la metilación del DNA. Los lugares ricos en pares CGs desmetilados están unidos a CFP1 (CXXC finger protein 1, también conocida como CXXC1), la cual recluta H3K4 metiltranferasas. La unión de H3K4 metiltranferasas, como MLL, proteje a los promotores de genes del desarrollo de la metilación del DNA, aparentemente mediante su dominio CXXC (Erfurth et al. 2008). Las enzimas DNMT3 que reconocen H3 no modificada, son alostéricamente inhibidas por la metilación de H3K4 (Ooi et al. 2007, Otani et al. 2009). La diferencia de metilación de CGIs en tejidos y tipos celulares puede proporcionar grandes diferencias y marcar la función celular en algunos casos (Laddy et al. 2007, Irizarry et al. 2009). Por ejemplo, en la línea germinal masculina se expresa una familia de genes denominada MAGE (Melanoma-associated antigen) cuyos promotores poseen sus CGIs desmetiladas, siendo por tanto, expresados en estas células. Sin embargo, están silenciados en todas las células somáticas. En células somáticas, la desmetilación de las CGIs del promotor de estos genes, puede dar origen a la aparición de varios tipos de cáncer. Este y otros diversos estudios han determinado que la metilación de CGIs es el principal mecanismo de silenciamiento de genes específicos de la línea germinal en células somáticas (De Smet et al. 1999, Honda et al. 2004, Straussman et al. 2009) Células de tejidos somáticos, también presentan una metilación de DNA específica. Generalmente son genes implicados en procesos de desarrollo los que son principalmente controlados por la metilación de las CGIs de sus promotores. Un Figura I6. Posible mecanismo para mantener las CGIs hipometiladas. La maquinaria de transcripción (RNA-polII y los factores de transcripción [TF]) junto con la trimetilación de la histona H3 en la lisina 4 (H3K4me3), excluyen a las DNMTs del lugar de inicio de la transcripción. CpG metilado se muestra como un círculo negro y en blanco desmetilado. Adaptado de (Illingworth et al. 2009) Introducción 25 ejemplo de ello lo tenemos con los miembros de la familia HOX, cuya función es dictar el posicionamiento celular dentro del embrión (Kleinjan et al. 2004, Straussman et al. 2009) 3.2 Repeticiones pericentroméricas En mamíferos, la mayoría de la secuencia genómica no es codificante, sin embargo tienen un potencial transcripcional latente que hay que controlar. Entre estas secuencias están las repeticiones pericentroméricas y elementos parásitos repetidos (que veremos en el siguiente apartado). La metilación del DNA tiene un papel muy importante en el control, mediante represión, de estos elementos. Los satélites menor y mayor pericentroméricos están repartidos por todo el centrosoma en decenas de miles de copias en tándem (Lehnertz et al. 2003). Como decíamos con anterioridad estos elementos tienen un potencial transcripcional latente cuya represión es esencial para el alineamiento de los cromosomas, la segregación y la integridad durante la mitosis, lo cual es esencial para el correcto desarrollo del ciclo celular. Un ejemplo de la importancia de la regulación de estos elementos lo tenemos en el síndrome de inestabilidad centromérica y anomalía facial (ICF) el cual es causado por una mutación sin sentido en la DNMT3B (Xie et al. 1999, Xu et al. 1999). 3.3 Elementos transponibles (TEs) Cerca del 40% del genoma de mamíferos está constituido por elementos transponibles. Estos tienen la capacidad de integrarse por sí mismos en el genoma. Se han identificado en las células eucariotas dos tipos principales de elementos transponibles: los retrotransposones (clase I), que utiliza un intermediario de RNA; y los transposones de DNA (clase II) que se transposicionan directamente sin necesidad de un intermediario de RNA. Los retrotransposones se clasifican, mayoritariamente, en tres grupos: Long interspersed nuclear elements (LINEs), short interspersed nuclear elements (SINEs) y long terminal repeat (LTR) provenientes de Introducción 32 están aún bien descritos. Sin embargo la hipometilación de DNA en los mutantes Piwi es específica de retrotransposones, indicando que debe haber algún mecanismo para su discriminación como diana (Bourc'his et al. 2004, Aravin et al. 2007, Aravin et al. 2007, Carmell et al. 2007, Aravin et al. 2008, Kuramochi-Miyagawa et al. 2008) Las proteínas PIWI y los piRNAs son los componentes efectores de la maquinaria piwi-RNA, pero ellos no actúan solos. Estos forman parte de un gran complejo ribonucleoproteico (RNP) con otros componentes funcionales localizados en gránulos, que están en contacto directo con los poros de la envuelta nuclear. Las primeras proteínas que se identificaron que interaccionaban con las proteínas PIWI, A. Biogénesis primaria B. Biogénesis secundaria (ciclo ping-pong) Figura I8. Rutas de biogénesis para generar piRNAs. A) Modelo de biogénesis primaria de piRNAs. Los precursores de piRNAs son transcritos desde clusters de piRNAs y son procesados como intermediarios de piRNAs. El intermediario de piRNA con una uridina en el extremo 5´es cargado en la proteína PIWI. La parte 3´ del intermediario del piRNA digerido por una nucleasa desconocida. Tras esto, el extremo 3´ es 2´-O metilado por una metiltransferasa (Hen1). B) Modelo de biogénesis secundaria de piRNAs. El complejo PIWI/piRNA corta el RNA del retrotransposón entre la posición 10 y 11 del piRNA. La región 3´del RNA cortado es incorporado a las proteínas PIWI. La región 5´ es expulsada de la proteína PIWI gracias a chaperonas y es posteriormente degradada. La décima posición del RNA incorporado está enriquecida en adenina, que es complementaria a la primera posición del piRNA enriquecido en uridina. El RNA incorporado es entonces procesado a piRNA secundario maduro, de forma similar a como lo es el primario. Adaptado de (Watanabe et al. 2014). Cluster de piRNA Precursor de piRNA Intermediario de piRNA Digestión y modificación piRNA primario Digestión y modificación piRNA Secundario Introducción 33 fueron las de la familia Tudor. Más concretamente, Mili interacciona con Tdrd1, Miwi2 se acompleja con Tdrd9 y Miwi con Tdrd6 (Pillai and Chuma 2012). 6.- TDRD9 TDRD9 (Tudor domain containing 9) posee ortólogos en ratón, humanos y otros vertebrados, y en varios invertebrados como Drosophila. TDRD9 en Drosophila se denomina spindle-E/homeless (spn-E/hls). Este gen fue identificado en dos escrutinios diferentes de mutaciones en Drosophila. Pronto se puso de manifiesto que las mutaciones spn-E y hls, estaban en el mismo gen. Como el mutante spn-E se describió con anterioridad al hls se ha adoptado spn-E como nombre del gen. En 1995 Gillespie y colaboradores, obtuvieron una línea de hembras estériles que ponían muy pocos huevos y que además no estaban fertilizados. En una disección del ovario, observaron que el ovocito no se encontraba, como debía ser habitual, en la parte posterior del huevo. Además un 95% de las cámaras de huevos fueron ventralizadas (frente a la posición dorsal normal) y se encontraban, la mayoría de ellas, en estado de degeneración. Denominaron al gen responsable de esta mutación como homeless (hls), en parte por la deslocalización del ovocito y en parte por la deslocalización de la expresión de los RNAs mensajeros responsables de la formación de los ejes antero-posterior y dorso-ventral. La identificación del gen donde estaba la mutación demostró que hls codificaba para una proteína similar a una helicasa de unión a RNA con dominio DEx-H. (Gillespie et al. 1995). Anteriormente se habían identificado cinco genes spindle: spn-A, spn-B, spn- C, spn-D, spn-E haciendo un rastreo de genes del cromosoma 3 con efecto materno (Tearle and Nüsslein-Volhard, 1987). Las mutaciones en este gen ocasionan un patrón de formación aberrante de los ejes antero/posterior y dorso/ventral en los huevos de Drosophila. Además Spn-E y la proteína Aubergine (Aub) (PiwiL1 en ratón) colocalizan en unos gránulos, denominados nuage que están en la periferia de las células germinales de los huevos. Esta colocalización se ve interrumpida en los mutantes spn-E, siendo más drástico el fenotipo cuanto más severa es la modificación de los ejes de distribución del huevo. Por otro lado, una deleción de spn-E ocasiona una disminución muy severa de los niveles de piRNAs, siendo Introducción 34 imposible generar el mecanismo ping-pong de biogénesis de piRNAs. Por este motivo, los retrotransposones, escapan de la regulación originando daños en las células. Algunos autores sostienen que al tratarse de una helicasa de RNA, es posible que Spn-E cambie la estructura haciendo que el RNA quede más accesible a otras proteínas de la ruta de los piRNAs, como por ejemplo a chaperonas o nucleasas (Gonzalez-Reyes et al. 1994, Gillespie and Berg 1995, Ott et al. 2014). Hay pocos estudios de TDRD9 en mamíferos hasta la fecha. Estudios en ratón han descrito que Tdrd9 codifica para una proteína de unos 150 kDa perteneciente a la superfamilia de las helicasas de RNA, que contiene un dominio helicasa/ATPasa DExH-box altamente conservado entre especies; y un dominio TUDOR. El dominio TUDOR tiene unos 60 aminoácidos de longitud y forma una estructura de 4 cadenas -antiparalelas. Este dominio tiene propiedades de unión a grupos metilos y contiene un anillo aromático que facilita la interacción proteína-proteína dependiente de metilo. Las proteínas con dominios TUDOR pueden unir proteínas con motivos de lisinas metiladas o de argininas metiladas. Tdrd9 es una de las proteínas que contiene un dominio TUDOR que reconoce motivos de argininas metiladas. Por ejemplo, el dominio TUDOR de Tdrd9 une motivos RG/RGG (repeticiones de argininas que se dimetilan simétricamente). Estos motivos están presentes en la proteína Miwi2, con la que interacciona. La mayor parte de las proteínas que poseen estos dominios tienen capacidad de unión a RNA (Thandapani et al. 2013). Por estudios inmunohistológicos en ratón, se sabe que Tdrd9 se localiza en espermatogonia mitótica, espermatocitos meióticos (en estadío paquiteno), espermátidas haploides en testículos y en ovocitos en crecimiento en el ovario. La expresión de Tdrd9 es localizada en el núcleo y en el citoplasma de espermátidas, más concretamente en nuage. Nuage, es una denominación genérica, la cual, engloba varios subtipos de gránulos de RNA: i) P-body like granules (PBs), ii) pi- Body (piBs) y iii) Cuerpos cromatoides (CBs). En ovocitos, Tdrd9 fue también observada en el núcleo y citoplasma, pero no se observó una localización restringida en ningún dominio subcelular concreto (Liu et al. 2005, Shoji et al. 2009). Tdrd9, Miwi2 y Mael (Maelstron en Drosophila) colocalizan en gránulos que están enriquecidos en marcadores de PBs somáticos (DDX6 y GW182) y que se Introducción 35 denominan piP-bodies (piPBs) que indican la presencia simultánea de la ruta de procesamiento de piRNAs y de los componentes de los PB. (Aravin et al. 2009). Por otro lado, Mili (PIWIL2), Tdrd1 y Gasz también están formando agregados citoplásmicos denominados pi-bodies (piBs) que son distintos de los piPBs. Estos gránulos desaparecen si alguna de las tres proteínas está ausente. Mili, Gasz y Tdrd1, no sólo controlan su localización sino que también regula la localización de Miwi2- Mael-Tdrd9 en piPBs (Kuramochi-Miyagawa et al. 2010, Tanaka et al. 2011). A veces colindan ambos gránulos sugiriendo que estos dos compartimentos que poseen dos complejos distintos de proteínas TDRD-PIWI cooperan próximamente en prospermatogonia fetal (Shoji et al. 2009). En 2009, el grupo de Shoji y colaboradores, originaron una línea de ratón mutante en Tdrd9 (Tdrd9-/-). Vieron que los espermatocitos de ratones Tdrd9-/- son capaces de iniciar la recombinación de DNA y formar estructuras en leptoneno, sin embargo la sinapsis de cromosomas homólogos falla y la espermatogénesis se bloquea originando ratones machos estériles. En estos mutantes, es muy característico el aumento de fosforilación de la histona H2A.X, que es un marcador de roturas de doble cadena (DSBs). Además, se da una degeneración de los espermatocitos, con vacuolización y desorganización intracelular formando agregados citoplásmicos. En testículos de Tdrd9-/- postnatales (P12 y P25) existe un claro aumento de los transcritos de retrotransposones LINE-1. Tdrd9 genera un silenciamiento preferencial de este retrotransposón ya que otros retrotransposones estudiados no cambian y a diferencia de otros represores de retrotransposones (Dnmt3L, Mili, Miwi2) que tienen un perfil de silenciamiento más amplio (Bourc'his and Bestor 2004, Aravin et al. 2007, Carmell et al. 2007, Kuramochi-Miyagawa et al. 2008). Se ha identificado una mayor abundancia de ORF1p de LINE-1 en espermatocitos de Tdrd9-/- que en los controles, acumulándose mucho más en el núcleo en comparación con los controles cuya localización preferente es el citoplasma. Esta acumulación en el núcleo, origina una mayor fosforilación de la histona H2A.X indicando que la integridad del genoma es severamente perturbada. Por tanto, existe una correlación directa entre un exceso de activación de retrotransposones y la integridad nuclear de espermatocitos meióticos. Sin embargo, en los ovocitos de hembras silvestres y mutantes de Tdrd9, el nivel de Introducción 36 ORF1p de LINE-1 es el mismo y no se muestra ninguna diferencia en la progresión de la meiosis ni defectos celulares. Además las hembras mutantes en Tdrd9 desarrollan una fertilidad normal. En el análisis de expresión de piRNAs específicos de LINE-1 se observa una disminución de piRNAs en los mutantes de Tdrd9 respecto del control. Los testículos de fetos y los postnatales de ratones mutantes, están enriquecidos en piRNAs de LINE-1 sentido respecto de los ratones silvestres. La disminución de los piRNAs de LINE-1 antisentido no es una consecuencia directa del aumento del mRNA del restrotransposón. Lo que está ocurriendo es que la mutacion de Tdrd9 afecta a la producción de piRNAs secundarios por la falta de interacción con Miwi2, que carga preferentemente piRNAs secundarios para amplificar el silenciamiento mediante el mecanismo ping-pong (Aravin et al. 2008). La localización de Mili y Tdrd1 no se ve afectada en los mutantes de Tdrd9 y tampoco en los mutantes Miwi2, sin embargo la mutación de Mili y Tdrd1 sí deslocaliza claramente a Tdrd9 y Miwi2. Todas las observaciones corroboran que Mili-Tdrd1 tienen un papel esencial y central en la biogénesis primaria de piRNAs, siendo complementaria y necesaria la biogénesis secundaria de piRNAs originados por el mecanismo ping-pong donde toma un papel principal el complejo formado por Miwi2-Tdrd9 (Reuter et al. 2009, Shoji et al. 2009, Vagin et al. 2009). Durante el estadío de pro-espermatogonia, ocurre una de las metilaciones de novo del DNA y la pérdida de Mili o Miwi2 afecta a las marcas epigenéticas de los retrotransposones, probablemente, debido al impacto ocasionado en el perfil de piRNAs. Las células germinales fetales de los mutantes de Tdrd9 no muestran diferencias en la metilación del DNA en LINE-1 en comparación con el control. En este momento la metilación está aún siendo establecida. Sin embargo en testículos postnatales, los mutantes de Tdrd9 presentan una clara desmetilación de LINE-1 antes y después de que el defecto meiótico comience. Esta desmetilación de LINE-1 no se debe a cambios globales en la metilación del DNA o por la desregulación de las DNMTs ya que la metilación de otros TEs no se afecta en los mutantes Tdrd9. Por análisis de metilación por bisulfito y secuenciación se sabe que los mutantes en Tdrd9 poseen la región promotora de LINE-1 altamente desmetilada en comparación con los controles. Además, esta diferencia de metilación no se observa Introducción 37 en los promotores de otro TEs, lo cual indica que el control de Tdrd9 sobre LINE-1 es muy específico. La pérdida de función de Tdrd9 afecta al estado epigenético del genoma de la línea germinal, lo cual podría imponer a largo plazo un desilenciamiento de LINE-1 (Tanaka et al. 1997, Morison et al. 2001, Shoji et al. 2009). En resumen, Tdrd9 es una molécula esencial, que está muy conservada y que actúa contra los retrotransposones, LINE-1, en la línea germinal. Durante el desarrollo de la línea germinal masculina, Tdrd9 participa, junto a otros complejos ribonucleoproteicos, en el control del perfil de piRNAs y en el establecimiento correcto de la metilación (represión) de LINE-1. 38 39 OBJETIVOS 40 Objetivos 41 Estudios recientes han puesto de manifiesto un posible papel de los piRNAs y proteínas implicadas en su biogénesis en cáncer. Así mismo, resultados preliminares de nuestro laboratorio sugerían que TDRD9 podía estar expresándose en algunas líneas celulares tumorales, lo cual era sorprendente conociendo que TDRD9 tiene una expresión mayoritariamente restringida en la línea germinal. En el momento de comenzar esta tesis, nada se conocía del papel de TDRD9 en cáncer. Con estos precedentes propusimos los siguientes objetivos: 1.- Investigar y caracterizar la función de TDRD9 en líneas celulares y tumores. 2.-Búsqueda de interactores proteicos de TDRD9. Materiales y Métodos 48 Tabla M5. Plásmidos utilizados no construídos en este trabajo PLÁSMIDO ANTIBIÓTICO SELECCIÓN PROMOTOR APLICACIÓN EN LA TESIS REFERENCIA pDBLeu Kanamicina ADH1 Expresión de proteínas de fusión al dominio de unión al DNA de GAL4 en la estirpe de levadura MaV203 Invitrogen pPC86 Ampicilina ADH1 Expresión de proteínas al dominio de transactivación de GAL4 en la estirpe de levadura MaV203 Invitrogen pN-Flag-mTDRD9 Ampicilina CMV Expresión de TDRD9 en las líneas celulares HeLa o Cos7 Dr. Alexei Aravin, California pRNG105-mRFP1 (CAPRIN1) Kanamicina CMV Expresión de CAPRIN1 en líneas celulares HeLa o Cos7 Nobuyuki Shiina, Japón. pG3BP-GFP Kanamicina CMV Expresión de G3BP en líneas celulares HeLa o Cos7 Nobuyuki Shiina, Japón. pGEM-T Ampicilina - Análisis de metilación Promega IMAGp998G0610753 Q Ampicilina - Contiene el cDNA de TDRD9 RZPD Tabla M6: plásmidos construídos en este trabajo Tabla M7. siRNAs utilizados GEN siRNA SECUENCIA (5´-3´) Luciferasa siControl CGUACGCGGAAUACUUCGAUU TDRD9 siTDRD9-1 GCAACUUGGUAAACUCAUA TDRD9 siTDRD9-2 AGCGCACCAUCCUUCUACUA 3.- MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DEL DNA 3.1 Aislamiento de DNA plasmídico bacteriano El aislamiento de DNA plasmídico a pequeña escala se llevó a cabo mediante lisis alcalina. Las células contenidas en 2 ml de cultivo se recogieron por centrifugación a 9000 g durante 5 min. El precipitado se resuspendió en 100 ml de la PLÁSMIDO INSERTO VECTOR (Digestión) IMAGp998G0 610753Q-SalI Utilizando los oligos Hls-DH se ha sustituido el fragmanto original SacII-SacII de p998, dejando así dianas nuevas SalI-StuI con las que extraer TDRD9 y ser clonado en pDBLeu en fase. IMAGp998G0610753Q pDBLeu- TDRD9 Fragmento obtenido por digestión del plásmido IMAGp998G0610753Q-SalI con SalI/StuI pDBLeu Materiales y Métodos 49 solución 1 y tras 5 min a temperatura ambiente (RT) se añadieron 200 ml de la solución 2, invirtiendo la mezcla varias veces e incubando posteriormente 5 min en hielo. Tras la adición de 150 ml de las solución 3, la mezcla resultante se invirtió varias veces y posteriormente se incubó 5 min en hielo. Las proteínas, el DNA cromosómico y los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 13000 g durante 5 min. La precipitación del DNA plasmídico se llevó a cabo añadiendo dos volúmenes de estanol puro, incubando 10 min a -20 ºC y centrifugando posteriormente a 13000 g durante 5 min. Al precipitado obtenido se añadió etanol al 70 % para eliminar las sales. Se volvió a centrifugar y finalmente el precipitado resultante se resuspendió en TE. Para la obtención de DNA plasmídico más puro a mediana y gran escala, se utilizaron los sistemas comerciales Favorgene y JET Star (Genomed) siguiendo las instrucciones del fabricante. Solución 1: 50 mM de Glucosa; 25 mM de Tris-HCl pH 8,0 y 10 mM de EDTA pH 8,0. Solución 2: 0,2 M NaOH; 1 % SDS. Solución 3: 3 M KAc; 11,5 % ácido acético glacial. TE: 10 mM tris-HCl; pH 8,0 y 1 mM EDTA pH 8,0. 3.2 Aislamiento de DNA plasmídico de levaduras Las células cultivadas en 2 ml de medio selectivo a 30ºC durante 12-14 h se recogieron por centrifugación a 3000 g durante 5 min y se resuspendieron en 100 l de tampón STET. Se añadió 0,2 g de perlas de vidrio de 0,45 mm y la mezcla se agitó vigorosamente durante 5 min. Tras añadir otros 100 l de STET, se hirvió a 100 ºC durante 3 min y posteriormente se centrifugó a 13000 g durante 10 min a 4 ºC. A 150 l del sobrenadante obtenido se le añadió 75l de acetato de amonio 7,5 M y tras incubar 1 h a -20 ºC, se centrifugó a 13000 g durante 10 min a 4 ºC. La precipitación del DNA plasmídico presente en la fase acuosa se llevó a cabo utilizando dos volúmenes de etanol puro, incubando 10 min a -20 ºC y centrifugando posteriormente. Al precipitado obtenido se añadió etanol al 70 % y se resuspendió en agua Milli Q. Debido a que los vectores aislados eran de bajo número de copias, el DNA extraído necesitó ser amplificado en E. coli. STET: 8 % de sacarosa; 50 mM tris-HCl pH 8,0; 50 mM EDTA pH 8,0; 5 % Tritón X-100. Materiales y Métodos 50 3.3 Electroforesis de DNA en geles de agarosa La separación de fragmentos se hizo según el método de Sambrook (Sambrook, 1989). Los geles de agarosa se prepararon en tampón TBE 0,5X a una concentración del 1,5 %. A los geles se les añadió bromuro de etidio (5 g/ml) que permitió visualizar el DNA exponiéndolo a la luz ultravioleta. A las muestras se les añadió 1/10 volumen de tampón de carga. Para determinar el tamaño de los fragmentos, se empleó un patrón comercial. La electroforesis se realizó en sistemas horizontales Wide Mini-Sub Cell GT (Biorad). TBE 1X: tris 18,78 g/l; ácido bórico 5,5 g/l; EDTA disodium·2H20 0,74 g/l. Tampón de carga de DNA: 0,25 % azul de bromofenol; 0,25 % xileno-cianol; 30 % glicerol 3.4 Purificación, cuantificación y secuenciación de DNA Para la extracción de DNA de la agarosa se usó el sistema comercial Favorgene siguiendo las indicaciones del fabricante. La concentración de DNA en solución se estimó por espectrofotometría (ND-1000; nanodrop). La secuenciación de fragmentos de DNA la realizó la empresa Secugen (Madrid, España). 3.5 Amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa Para la amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó el termociclador T-personal (Biometra). Los oligonucleótidos utilizados como cebadores en la reacción (Tabla M4) fueron sintetizados por SIGMA. Para cada reacción se utilizaron las siguientes condiciones estándar: 5 l de tampón comercial 10X, 2l de MgCl2, 1l de una mezcla de dNTP, 1 l de cada oligonucleótido concentrados a 10 M, 2,5 U de la polimerasa de DNA (Ecotaq), entre 20-50 ng de DNA molde y agua hasta un vol final de 50 l. Para alcanzar una elevada fiabilidad en la síntesis se utilizó la polimerasa del sistema comercial Expand High Fidelity PCR System (Roche). La reacción tipo constó de 1 Materiales y Métodos 51 ciclo de 5 min a 95 ºC; 20-30 ciclos de 1 min a 94 ºC seguido de 1 min a la temperatura de apareamiento de los oligonucleótidos al DNA molde y posteriormente 1 min/Kb de DNA a amplificar a 72 ºC para finalizar, 1 ciclo de 10 min a 72 ºC. 3.6 Transformación de bacterias La transformación de E.coli (estirpe DH5) se llevó a cabo mediante transformación por choque térmico. En este proceso, 100 l de solución de células competentes preparadas en la unidad “Servicio de Organismos Modelo” de CABIMER utilizando el protocolo descrito por Hanahan (Hanahan 1983). se mezclaron con 50 ng de DNA. Dicha mezcla se incubó en hielo 30 min y a continuación se sometió a un choque térmico 45 s a 42 ºC. Posteriormente se añadió 1 ml de LB a la mezcla que se incubó entre 60-90 min a 37 ºC en agitación. Transcurrido este tiempo se recogieron las células por centrifugación y se sembraron en medio LB sólido con su correspondiente antibiótico para seleccionar aquellas bacterias portadoras del plásmido que contenga el gen de la resistecia. 3.7 Transformación de levaduras La transformación de levaduras se llevó a cabo siguiendo el método descrito por Ito (Ito et al. 1983) y posteriormente modificado por Gietz (Gietz et al. 1992). Dicho método se utilizó en el escrutinio de doble híbrido y en la posterior verificación y análisis de las interacciones. Para transformaciones rutinarias se cultivó biomasa de la estirpe Mav203 en medio YPAD líquido durante 16 h a 30 ºC. Tras medir su densidad óptica a 600 nm (D0600), se inoculó un cultivo del mismo medio a una D0600 de 0,4. Una vez alcanzada la D0600 deseada, el cultivo se centrifugó a 3000 g durante 5 min y el precipitado se resuspendió en agua Milli Q (1/5 del volumen del cultivo inicial). Tras centrifugar a 3000 g durante 5 min, el precipitado se resuspendió en 1/100 del vol de TE/LiAc obteniendo así células competentes. Por transformación se mezclaron 100 l de células competentes con 0,5 g de DNA de esperma de salmón y 600 l de PEG/TE/LiAc. Tras una incubación de 30 min a 30 ºC, Materiales y Métodos 52 la mezcla se sometió a choque térmico durante 15 min a 42 ºC, se centrifugó a 15000 g durante 30 s y finalmente el precipitado resultante se resuspendió en 100 l de agua Milli Q estéril procediendo a su siembra en placas de medio selectivo. Las placas se incubaron 48-72 a 30 ºC. TE/LiAc: 10 mM tris-HCl pH 7,5; 1 mM EDTA pH 7,5; 0,1 M LiAc PEG/TE/LiAc: 10 mM tris-HCl pH 7,5; 1 mM EDTA pH 7,5; 0,1 M LiAc; 40 % PEG-3350 al 50 %. 3.8 Transfección transitoria de líneas celulares animales con DNA plasmídico Las células se transfectaron utilizando FuGENE® 6 Transfection Reagent. Este reactivo es una mezcla de lípidos y otros componentes diluídos en etanol al 80 %, que permite transfectar DNA en una gran variedad de líneas celulares con una alta eficiencia y baja toxicidad. El día previo a la transfección, se cultivó la cantidad de células necesarias para que al día siguiente éstas estuvieran al 70-80 % de confluencia. Se procedió a realizar la mezcla de la transfección, como indica el fabricante. Se añadió la mezcla de la transfección sobre las células con medio renovado. Al día siguiente se volvió a refrescar el medio para eliminar la mezcla de transfección y se cultivó otras 24 h más. Posteriormente se procedió al análisis de las muestras. 3.9 Aislamiento de DNA genómico de células animales Las células previamente cultivadas y con un porcentaje de confluencia del 80 % aproximadamente, se recogieron mecánicamente en 1 ml de PBS frío. Se centrifugaron un minuto a máxima velocidad a temperatura ambiente y se resuspendió el pellet en 600 l del Buffer 2X de la Proteinasa K. Se añadió 12 l de proteinasa K a 10 mg/ml y se incubó 12 h a 55 ºC. Se le añadió 2 l de RNAsa A 10 mg/ml y se incubó durante 1 h a 37ºC, fenolizando posteriormente. El DNA se precipitó con 3 ml de etanol al 96 % y 1/10 vol de AcNa 3 M a -20 ºC toda la noche. Al día siguiente se lavó el pellet con etanol 70 %. Una vez seco el pellet se Materiales y Métodos 53 resuspendió en agua Milli Q. La concentración de DNA en solución se estimó por espectrofotometría (ND-1000; nanodrop) Buffer 2X proteinasa K: 100 mM Tris pH 7,5; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 1 % SDS. 3.10 Manipulación enzimática Las diferentes enzimas empleadas en la manipulación del DNA tales como endonucleasas de restricción (Takara; GE Healthcare, New England Biolabs), polimerasa de DNA, Klenow, fosfatasa alcalina (Roche) y la ligasa T4 (Invitrogen) se utilizaron según las instrucciones del fabricante. 4.- MANIPULACIÓN DEL RNA 4.1 Aislamiento y cuantificación del RNA de líneas celulares animales El aislamiento de RNA se llevó a cabo con el sistema RNAeasy mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de RNA en solución se estimó por espectrofotometría (ND-1000; nanodrop). La visualización de RNA se llevó a cabo en geles de agarosa al 0,8 % en tampón TBE 0,5X teñidos con Bromuro de etidio (5 g/ml). 4.2 Aislamiento y cuantificación del RNA de tejidos humanos Los tejidos usados para esta tesis fueron, testículo y pulmón humanos. Los cuales se homogeneizaron con un disgregador de tejidos de 3 ml “Potter-elvehjem PTFE pestle and glass tube” de Sigma-aldrich para su posterior extracción de RNA con el kit RNeasy mini Kit (QIAGEN) siguiendo el protocolo de extracción de RNA desde tejidos. Materiales y Métodos 54 4.3 Reacción de retrotranscripción a partir de RNA seguido de amplificación de cDNA mediante PCR Este protocolo se llevó a cabo en dos etapas. La primera consistió en obtener cDNA total a partir de RNA (1 g/ reacción) mediante la acción de la enzima retrotranscriptasa utilizando el sistema Super-ScriptTM First Strand Synthesis for RTPCR (invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Como control, una de las reacciones careció de la enzima. La segunda etapa consistió en una reacción de PCR utilizando 5 l la reacción obtenida en el paso anterior y previamente diluída en agua hasta llegar a un volumen final de 50 l. Las reacciones de PCR cuantitativas (qPCR) se realizaron con un termociclador de PCR en tiempo real (7500 Real Time PCR System, Applied Biosystem, 7500 System software V1.4.0). Los oligonucleótidos empleados (diseñados en el programa primer3plus) presentan eficiencias de amplificación prácticamente idénticas (Tabla M4). Para testarlos se realizó una recta patrón a partir de diluciones seriadas de una muestra de cDNA por cada par de oligonucleótido y se comprobó si las pendientes de las rectas eran paralelas y si tenían un valor cercano a -3.3 y 3.4. Para cada reacción de PCR cuantitativa relativa se utilizaron las siguientes condiciones estándar: 1,5 l de una mix de primers a 10 M (Forward y reverse), 3,5 l de agua Milli Q, 5 l de la solución de cDNA y 10 l Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystem) que contiene el fluorocromo SYBR® Green, la ampliTaq Gold DNA polimerasa, la DNA polimerasa LD, dNTPs con mezcla de dUTP/dTTP, el fluorocromo ROX como referencia pasiva y un tampón optimizado para la reacción. La reacción tipo constó de 1 ciclo de 10 min a 95 ºC; 40 ciclos de 15 s a 95 ºC seguido de 1 min a 65 ºC; 1 ciclo de disociación que consiste en 15 s a 95 ºC; 1 min a 65 ºC; 15 s a 95 ºC y 15 s a 60 ºC. Los valores fueron normalizados respecto a la expresión del gen humano GAPDH. 4.4 Transfección de RNA de interferencia Para inhibir la síntesis de TDRD9 se utilizó “Small Interfering RNA” (siRNA) suministrados por SIGMA. La transfección transitoria en líneas celulares se llevó a cabo utilizando LipofectamineTM RNAiMAX de Invitrogen. El día previo a la Materiales y Métodos 55 transfección se plaqueó el número de células correspondientes al diámetro de placa usado y que especifica las instrucciones del fabricante, alcanzando un 20-30 % de confluencia al momento de transfectar. Así pues, para placas multi pocillos de 6 se cultivó 150000 células. Para transfectar las células se hicieron dos mezclas. A) Se mezcló 0,5 l de siRNA a 100 M junto con 250 l de optimem, la mezcla B) 5 l de RNAiMAX junto con 245 l de optimem. Se mezcló A+B y se incubó 20 min a temperatura ambiente. Se cambió el medio de cultivo de las células a Optimem (500 l por pocillo). Transcurridos los 20 min la mezcla A+B se depositó gota a gota sobre las células. Entre 4-6 horas más tarde, se sustituyó el medio de transfección por medio de cultivo completo y 72 horas más tarde se procesaron las muestras. 5.-SÍNTESIS, PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 5.1 Obtención de extractos de proteínas solubles de líneas celulares animales Para la obtención de un extracto proteico, formado por proteínas nucleares y citoplásmicas, las células en cultivo se recogieron mecánicamente en PBS 1X y se centrifugaron a 3000 g durante 5 min. Los precipitados obtenidos se resuspendieron en Tampón IP (106 células/ 50 l de tampón) y se incubaron 10 min en agitación suave. El sobrenadante obtenido tras centrifugar el lisado a 16000 g durante 15 min correspondió al extracto de proteínas solubles. 5.2 Obtención de extractos de proteínas insolubles de líneas celulares animales Para la obtención de extractos enriquecidos en proteínas no solubles o agregados se añadió al pellet, resultante del paso anterior, 200 l de Laemmli 4X con Mercaptoetanol y DTT en concentración final de 7 mM y 2 mM respectivamente. Tampón IP: 50 mM tris-HCl pH 8,0; 150 mM NaCl; 1,5 mM EDTA; 1 % Tritón X-100; 1 mM PMSF; inhibidores de proteasas COMPLETE (Roche). PMSF: 17,42 g/l disuelto en isoporpanol. Materiales y Métodos 56 Laemmli Buffer 4X: 0,5 M tris-HCl pH 6,8; 16 % glicerol; SDS 10 %; 1,28 mM Mercaptoetanol y azul de bromofenol (0,05 %). 5.3 Electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida La electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes se llevó a cabo según el protocolo descrito por Laemmli (Laemmli 1970) para geles discontinuos de poliacrilamida, utilizando el sistema Mini-Potean IITM (BioRad). Los geles constaban de dos partes: la de empaquetamiento, que favorecía la correcta migración de las muestras; y la de separación, donde las proteínas migraban según su peso molecular. En este trabajo se usaron geles en los que su zona de separación contenía poliacrilamida al 6 % o 12 % según el peso molecular de las proteínas a estudiar. Una vez cargados los geles, migraron a 200 V a temperatura ambiente y durante 50-60 min. Las muestras se prepararon en laemmli buffer 1X, se hirvieron durante 5 min a 95 ºC y se cargaron en el gel. Como patrón de masas moleculares se usó una mezcla de proteínas comerciales, PageRulerTM prestained protein ladder, que son de bajo peso molecular (hasta 170 KDa) o bien Spectra Multicolor High Range Protein Ladder, para proteínas con alto peso molecular (hasta 315 KDa). Ambas de Thermo Scientific. Tras finalizar la electroforesis las proteínas presentes en los geles de poliacrilamida fueron transferidas a filtros de PVDF (si se quería revelar con quimioluminiscencia) o a Immobilon® FL (si el análisis iba a ser por fluorescencia usando el sistema Odyssey). 5.4 Cuantificación de proteínas La determinación de proteínas en extractos libres de membrana se llevó a cabo mediante el método de Bradford (Bradford 1976), usando el reactivo de Bradford (BioRad) y utilizando como recta patrón cantidades crecientes conocidas de seroalbúmina bovina (BSA). Materiales y Métodos 57 5.5 Sistema de doble híbrido en levaduras El sistema de doble híbrido en levaduras se llevó a cabo con el objetivo de identificar proteínas que interaccionen con TDRD9 que ayuden a esclarecer su posible función en células cancerosas. Para ello se utilizó el sistema ProQuest Two-Hybrid System (Invitrogen) basado en la reconstrucción del factor transcripcional GAL4 al interaccionar la proteína de estudio fusionada al dominio de unión al DNA (GBD) de GAL4 (cebo) con la proteína desconocida fusionada al dominio de transactivación (GAD) de GAL4 (presa). Esta reconstrucción activa la transcripción de los genes reporteros HIS3 y LacZ integrados en copia única en el genoma de la estirpe MaV203 de S. cerevisiae. El primero codifica una enzima implicada en la síntesis de His, cuya inhibición dependiente de la dosis por el 3-Amino-1,2,4-Triazol (3AT) impide la biosíntesis de dicho aminoácido, mientras que el segundo codifica la enzima -galactosidasa capaz de metabolizar el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indol--galactopiranósido (X-Gal) formando un precipitado azul. Antes de comenzar el escrutinio se determinaron las concentraciones de 3AT requeridas para anular el nivel de activación basal del gen HIS3 en la estirpe MaV203, previamente transformada con pDBLeu-TDRD9 y pPC86, que fueron de 25 mM y 50 mM. Para llevar a cabo este ensayo se clonó el cDNA de TDRD9 en el plásmido pDBLeu de forma que quedara en fase con la secuencia que codifica el dominio de unión al DNA de GAL4 presente en este vector. El plásmido pDBLeu contiene también el gen LEU2, cuya expresión permite el crecimiento de la levadura en medio sin leucina. El escrutinio se llevó a cabo por transformación de la construcción pDBLeu-TDRD9 (GBD-TDRD9) y una genoteca de cDNA de embrión de ratón de 8,5 días de desarrollo clonada en el vector pPC86 (GAD-Y), en la estirpe MaV203. El plásmido pPC86 contiene también el gen TRP1 cuya expresión permite el crecimiento de la levadura en medio sin triptófano. La reconstrucción del factor de activación GAL4, gracias a la interacción GBD-TDRD9/GAD-Y, permitió la selección de los clones positivos mediante crecimiento en medio selectivo (SC-Leu-Trp- His+3AT). El DNA plasmídico de los clones positivos crecidos en medio selectivo fue aislado, amplificado en E. coli DH5 y analizado mediante secuenciación. Materiales y Métodos 64 se retiró el medio de cultivo, se lavó con PBS y se tiñeron las células con una solución que contenía 0,5 % de cristal violeta y 20 % de etanol. Unos 30 min después se lavaron las placas con agua y se contaron las colonias una vez estaban secas referenciándose el número de colonias a las obtenidas con las no irradiadas o con las del tratamiento con DMSO (100 %). Se hicieron tres réplicas por ensayo. 11.- ANÁLISIS DE METILACIÓN DE DNA MEDIANTE LA CONVERSIÓN DE CITOSINAS CON BISULFITO Esta técnica es también conocida en inglés como “bisulfito mapping”, mediante la cual hemos estudiado el estado de metilación de la isla CpG que contiene TDRD9 en la región promotora. El bisulfito actúa desaminando las citosinas del DNA convirtiéndolas en uracilo. La base del método es que el bisulfito por sus propiedades físico-químicas es incapaz de actuar sobre las citosinas que se encuentren metiladas, que son conocidas como 5-metilcitosina. Para la realización de esta técnica se usó el kit “EZ DNA Methylation-GoldTM Kit” de ZYMO RESEARCH. En primer lugar se extrajo el DNA genómico de las líneas celulares mediante la técnica descrita en el punto 3.9. El DNA obtenido se trató con el CT conversión Reagent que contiene bisulfito, con el cual las citosinas no metiladas se convierten a uracilos, mientras que las metiladas no cambian. A continuación se hizo una PCR utilizando la polimerasa Hot start “My TaqTMHS DNA polymerase” de Bioline. Se tomó como molde el DNA ya tratado con bisulfito para amplificar un fragmento concreto de la isla CpG del promotor de TDRD9 con los oligonucleótidos de TDRD9 Bi-S descritos en la Tabla M4. Estos cebadores se diseñaron con el programa “Meth Primer DB” con los siguientes requisitos: debían ser oligonucleótidos de entre 24 y 32 bases, que no incluyeran pares CpGs. Todas las citosinas debían considerarse timinas, ya que tras el proceso de conversión las citosinas aisladas se convertirán en uracilos. Por ejemplo para la secuencia 5´-AACCTTACAGGCAC-3 el correspondiente primer ha de ser 5´-AATTTTATAGGTAT-3 Materiales y Métodos 65 El resultado de la PCR se cargó en un gel de agarosa. El fragmento amplificado, de 343 pb, se extrajo y se purificó (según protocolo indicado en el punto 3.4). Este fragmento se insertó en pGEM-T, plásmido linearizado que interrumpe el gen lacz. En el extremo 3´contiene una Timina que facilita la inserción del fragmento, el cual, posee una cola de poli Adeninas aportada por la Hot Start. Con esta construcción se transformó a E. coli DH5como se detalla en el punto 3.6). La transformación se cultivó en medio solido con LB-ampicilina, X-GAL e IPTG y se incubó a 37ºC durante toda la noche. Las colonias que internalizaron el inserto fueron blancas por interrupción del gen lacZ contenido. Mientras que las que no lo tenían fueron azules por hidrólisis del X-GAL resultado del gen lacZ operativo por religación del plásmido. Se eligieron 20 colonias blancas por cada línea celular problema y se cultivaron en 2 ml de medio LB con ampicilina. Se incubó a 37ºC toda la noche y se extrajo DNA plasmídico como se detalla en el punto 3.1. Este DNA plasmídico se digirió con la enzima PvuII liberando un fragmento de 773 pb en el caso de ser correcta la inserción. Estas preparaciones positivas se purificaron según el protocolo del punto 3.4 y se enviaron a secuenciar a SECUGEN. El análisis se hizo mediante alineación de las secuencias de cada uno de los clones de cada línea. En la figura M1 se muestra un ejemplo de alineación con los clones de la línea H1299. Figura M1.Procedimiento para el análisis de los clones. A) Alineación de las secuencias de los clones. B) Ordenación de pares CpG metilados (negros) y no metilados (blanco). CLUSTAL 1299 1299-7 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-10 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-8 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-9 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-13 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-12 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-16 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-6 TTCGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-14 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTTGGCAGGTTTA 60 1299-1 TTTGTTTGGGGTGGTGGTTTTCGGTAGGTTTA 60 1299-18 TTCGTTCGGGGTGGTGGTTTTTGGTAGGTTTA 60 1299-4 TTTGTTTGGGGTGGCGGTTTTCGGTAGGTTTA 60 ORIGINAL CTCGCTCGGGGCGGCGGCTCCCGGCAGGCCTA 60 A B Materiales y Métodos 66 Se eligieron los pares CpG en el fragmento original, que no está sometido a conversión (señalados en amarillo) y se analizaron las citosinas de los clones, observándose si habían cambiado a Timina (citosina no metilada) o habían permanecido como Citosina (citosina metilada) Para calcular el porcentaje de metilación de la isla en cada línea, se contaron los pares CpG que había en el fragmento amplificado, se multiplicaron por el número de clones. De ellos vimos cuántos están metilados. Así elaboramos una gráfica (figura M1-B) en la que un círculo negro denota un par CpG metilado y uno blanco un par CpG no metilado. Cada línea corresponde a un clon. 12.- TRATAMIENTOS CON 5´AZA-2-DEOXYCITIDINA (5-Aza) Hicimos este ensayo para ver si la expresión de TDRD9 es, posiblemente, controlada por la metilación de la isla CpG de su promotor. Se trataron dos líneas de adenocarcinoma de pulmón que no expresaban TDRD9 (A549 y H1264) y otras dos que sí lo hacían (H1299 y H1993) con 5´Aza-2-deoxycitidina que es un agente bloqueante de la enzima DNMT1, principal metiltransferasa en células de mamíferos. Esta enzima metila las cadenas de DNA nacientes en la replicación, por tanto su bloqueo conlleva a una desmetilación generalizada en sucesivas divisiones celulares. Para ello se cultivaron a baja confluencia las líneas de adenocarcinoma de pulmón que no expresan TDRD9, A549 y H1264; y H1299 y H1993 que si expresan TDRD9, como control, y se trataron durante 72 h con 5´Aza-2-deoxycitidina a una concentración de 0,5 M. Como control de tratamiento se añadió el mismo volumen del vehículo (agua). Pasado este tiempo se recogieron las células y se analizó la expresión de TDRD9 por qPCR. Por otro lado, quisimos ver qué ocurría con la expresión de TDRD9 a lo largo del tiempo una vez que eliminamos el tratamiento con 5´Aza-2-deoxycitidina. Para ello, elegimos la línea H1264 que no expresa TDRD9 y se cultivó a baja confluencia. Cada tres días se hicieron diluciones 1/10 recogiendo el pellet sobrante y guardándolo a -80 ºC. Así hasta 5 pases. Una vez se tuvieron todas las muestras se procesaron para analizar la expresión de TDRD9 por qPCR. Materiales y Métodos 67 13.-DETERMINACIÓN DE FOCOS DE -H2A.X: IF y conteo Para realizar este experimento se cultivaron 100000 células de H1993 y H1299 en placas multipocillos de 6 con lamelas de vidrio. Al día siguiente se procedió a la transfección transitoria del siTDRD9-1 y el siControl con RNAiMAX. 72 h después se hicieron las IF utilizando como anticuerpo primario anti -H2A.X (ser139) y como secundario Alexa Flúor 488 (verde). Las muestras se analizaron en el microscopio Axio-IMAGER APOTOME.2 y posteriormente fueron procesadas con el software Zen 2 blue. El conteo se llevó a cabo contando células con más de 10 focos de -H2A.X frente a células que carecían de ellos. Representándose en tanto por ciento (%). El experimento fue realizado tres veces, contando en cada análisis 1600 células por cada condición. 14.- ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE MICROMATRICES (MICROARRAY) Para hacer este experimento se llevó a cabo el silenciamiento de TDRD9 en la línea de adenocarcinoma de pulmón H1993 con los siTDRD9-1 y siTDRD9-2 usando como control células transfectadas con siControl. 72 h después se aisló RNA como se indica en el apartado 4.1 comprobándose la pureza y la calidad del mismo con el sistema RNA 6000 Nano assay on a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa 6 Clara, CA). Se usó 100 ng de RNA para originar DNA de cadena sencilla marcado con biotina las cuales fueron utilizadas para hibridar con los oligonucleótidos del microarray usando el sistema GeneChip® PrimeView Gene Expression Array (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El array fue analizado utilizando el sistema GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix). Los datos crudos fueron normalizados usando el método Robust Multichip Average (RMA). Los análisis estadísticos que comparan los resultados del control frente a los de los siTDRD9 fueron hechos con el paquete de programas LIMMA (Ritchie et al. 2015) a través de oneChannelGUI (Sanges et al. 2007). Tras estos análisis se Materiales y Métodos 68 seleccionaron los genes que cambiaban más de 2 veces (Cambio lineal) y con FDR < 0,01. Para hacer el resto de estudios se seleccionaron los genes que cambiaban de manera similar con los dos siRNAs de TDRD9. Analizamos las categorías de los Gene Ontology (GOs) con los programas DAVID (https://david-d.ncifcrf.gov/ (Huang da et al. 2009) o WebGestalt https://david-d.ncifcrf.gov/ (Wang et al. 2013) La significancia del enriquecimiento se hizo aplicando Bonferroni ajustado al P-valor del test hipergeométrico. 15.- ANÁLISIS DE DATOS DE TUMORES Y ESTADÍSTICA Los datos de microarray de expresión de tumores, fueron obtenidos de la base de datos ONCOMINE https://www.oncomine.org/resource/login.html (Rhodes et al. 2004). Los P-valor fueron calculados usando una t-Student de doble cola con un intervalo de confianza del 95 % usando el programa GraphPad Prism versión 5.0. Usando la siguiente aplicación http://scistatcalc.blogspot.com.es/2013/10/shapirowilk-test-calculator.html se hizo un test Shapiro-Wilk para verificar la normalidad de los datos. Los datos de expresión de RNA-seq fueron obtenidos de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) y los datos médicos acerca de pacientes con adenocarcinoma de pulmón y de piel se obtuvieron de cBioPortal (Gao et al. 2013). Las gráficas de regresión y la determinación del coeficiente de Pearson se hicieron utilizando el programa Excel. Las gráficas de supervivencia y los test Logrank se hicieron con el programa GraphPad Prism versión 5.0. 69 RESULTADOS 70 Resultados 71 1.- TDRD9 EN CÁNCER En los últimos años ha sido descrita la expresión aberrante de genes específicos de la línea germinal masculina en diferentes tipos de tumores. Por su localización original en testículos y de forma patológica en tumores, han sido nombrados como Cancer Testis (CTs) (Loriot et al. 2003). Estos genes están generalmente regulados por la metilación del DNA, confirmado por el efecto ocasionado al tratar con el agente desmetilante 5-aza-2´-deoxycytidine. Muchos de los CTs descritos se han relacionado con el metabolismo de los RNAs, como TDRD1, que se expresa en tumores de próstata o mama (Loriot et al. 2003). Además otras proteínas relacionadas con el metabolismo de los piRNAs en la línea germinal (proteínas PIWI) así como los propios piRNAs, se han relacionado con algunos tumores como el de mama, próstata o melanomas (Krishnan et al. 2016). Debido a que estos genes tienen una localización específica y muy restringida se hacen ideales como diana terapéutica en cáncer (Gjerstorff et al. 2015). Antes de comenzar este estudio, no sabíamos nada del papel que TDRD9 pudiera tener en cáncer, pero debido a la relación que guarda con los CTs y con la interacción con proteínas implicadas en diversos tumores, decidimos investigar su papel en carcinogénesis. 1.1 TDRD9 se expresa en adenocarcinomas de pulmón y en melanomas El primer paso que dimos para investigar un posible papel de TDRD9 en cáncer fue explorar la base de datos UniGene, donde pudimos ver que en humanos TDRD9 tiene una localización en tejidos sanos restringida mayoritariamente a testículos. Sin embargo, cuando analizamos las bases de datos de expresión en tumores, como por ejemplo ONCOMINE observamos que TDRD9 aparece sobreexpresado en algunos tipos de cáncer, entre ellos pulmón y piel. Analizamos datos de expresión de TDRD9 procedentes de dos estudios de adenocarcinomas de pulmón (Okayama et al. 2012, Selamat et al. 2012) y dos de melanomas de piel (Haqq et al. 2005, Riker et al. 2008), encontrando que los valores no siguen una distribución normal (Gausiana) (Shapiro-Wilk P < 0,00001), sugiriendo que los Resultados 72 0 50 100 150 200 250 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 0 100 200 300 400 D Tiempo (meses) Supervivencia log-rank P-valor = 0.0022 TDRD9 -positivo TDRD9- negativo Tiempo (meses) E log-rank P-valor = 0.1686 TDRD9 -positivo TDRD9- negativo Figura R1. Expresión de TDRD9 en adenocarcinoma de pulmón y en melanoma de piel. A) análisis de la expresión de TDRD9 en adenocarcinoma de pulmón y en melanoma de piel. Se ha realizado una t-Student de los valores 2 veces por encima de la mediana para comparar con el nivel de expresión de TDRD9 en tejidos sanos (P-valor < 0,0001). B) Análisis de datos de expresión de RNA-seq normalizados de cohortes de adenocarcinoma de pulmón (TCGA-LUAD) (Cancer Genome Atlas Research, 2014) y C) de melanoma de piel (TCGA-SKCM) (Cancer Genome Atlas, 2015); ambos provenientes de The Cancer Genome Atlas a través de c-BioPortal. En rojo se observan los tumores con expresión de TDRD9 (TDRD9-positivas), en contraste con los puntos azules que indican tumores sin expresión de TDRD9 (TDRD9-negativa). D) Curva de supervivencia Kaplan-Meier en pacientes TCGA-LUAD. En rojo podemos observar la supervivencia de los pacientes con tumores TDRD9- positivos. Mientras en azul se muestra la supervivencia en pacientes con tumores TDRD9-negativos. E) En esta figura se muestra un estudio idéntico al realizado en la figura 2R.D pero con pacientes TCGASKCM. El P-valor, mostrado en la figura, se realizó según el test log-rank. Tumores clasificados por expresión deTDRD9 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0100 200 300 400 500 74 tumores (15%) TCGA Adenocarcinoma pulmón Expresión TDRD9 Expresión TDRD9 0 1000 2000 3000 4000 5000 0100 200 300 400 500 149 tumores (31%) TCGA Melanoma Tumores clasificados por expresión deTDRD9 B C Tumores clasificados por expresión de TDRD9 Tumores clasificados por expresión de TDRD9 TDRD9 -positivo TDRD9- negativo TDRD9 -positivo TDRD9- negativo Adenocarcinoma pulmón Adenocarcinoma pulmón Melanoma Melanoma Resultados 73 valores elevados encontrados no son el resultado de una varianza aleatoria. El 13-15 % de las muestras de adenocarcinoma de pulmón analizadas y el 25-30 % de las muestras analizadas de melanoma de piel presentan un nivel de TDRD9 mayor de dos veces la mediana. Cuando estos tumores se comparan con el tejido normal, encontramos que la expresión de TDRD9 está significativamente aumentada, con un valor de significación estadística para una t-Student de P<0.0001 (Figura R1-A). Por otro lado, también analizamos datos de expresión de RNA-seq de dos cohortes de la base de datos TCGA (The Cancer Genome Atlas) a través de cBioPortal (Gao et al. 2013). Uno de los grupos analizados fue de adenocarcinoma de pulmón (TCGA-LUAD) (Cancer Genome Atlas Research, 2014) y el otro de melanoma de piel (TCGA-SKCM) (Cancer Genome Atlas Research, 2015). La figura R1-B muestra que la mayoría de los tumores TCGA-LUAD no expresan o expresan un bajo nivel de TDRD9 (tumores TDRD9-negativo). Sin embargo, 74 de los 491 tumores estudiados (15%) poseen altos niveles de expresión de TDRD9 (más de 5 veces respecto de la mediana) (tumores TDRD9-positivo). De la misma manera, la mayoría de las muestras analizadas de tumores TCGA-SKCM, no expresan o expresan poco TDRD9. Pero 149 tumores de los 471 analizados (31%) expresan altos niveles de TDRD9 (más de 5 veces respecto de la mediana) (Figura R1-C). Por tanto, nuestros análisis indican que TDRD9 está sobreexpresado en un conjunto de adenocarcinomas de pulmón y en melanomas de piel. Para ver el impacto sobre la supervivencia de los pacientes con adenocarcinomas de pulmón positivo o negativo en expresión de TDRD9, hicimos una curva de Kaplan-Meier utilizando los datos de supervivencia obtenidos del TCGA. Los datos revelaron que los pacientes con tumores positivos en TDRD9 tienen una esperanza de vida más corta (32 meses) en comparación con los pacientes que poseen tumores negativos en TDRD9 (49,2 meses), (log-rank P-valor = 0,0022) (Figura R1-D). Sin embargo, no se encontraron diferencias de supervivencia entre pacientes con tumores TCGA-SKCM positivos o negativos en expresión de TDRD9 (Log-rank P-valor = 0,1686) (Figura R1-E). Estos datos indican que la expresión de TDRD9 podría considerarse un marcador para evaluar la prognosis del adenocarcinoma de pulmón. Resultados 80 1.3 La depleción de TDRD9 afecta a la proliferación de células que expresan TDRD9 Ya hemos observado que la desmetilación de la CGI de TDRD9 está asociada a la expresión del gen en algunas líneas de cáncer de pulmón. Así que decidimos ver cuál era el papel de TDRD9 en la proliferación de estas líneas celulares. Para ello diseñamos dos siRNAs que bajaran la expresión de TDRD9 (siTDRD9-1 y siTDRD9-2) y que se localizan en las posiciones de nucleótidos 1845-1864 y 1718-1738 TCGA Adenocarcinoma de Pulmón TCGMelanoma B C P < 0.0001 P < 0.0001 Chr14:103,200,000 Chr14:105,400,000 Metilación del DNA A Figura R7. Estado de metilación de los genes vecinos a TDRD9. A) Contexto génico en el que se localiza TDRD9. Nivel de metilación de los genes vecinos de TDRD9 en tumores TCGA-LUAD (B) y TCGA-SKCM (C), TDRD9-positivos (rojo) o TDRD9-negativo (azul). Se observa una diferencia significativa de metilación del DNA entre tumores que expresan TDRD9 (rojo) y los que no (azul), no siendo significativa en ninguno de los otros casos; con un P-valor<0,0001. Metilación del DNA Resultados 81 respectivamente, del cDNA de TDRD9. En la Figura R8-A, podemos ver el efecto de los siTDRD9-1 y siTDRD9-2 en la expresión de TDRD9 en líneas H1299 y H1993, que expresan TDRD9. Para hacer las curvas de crecimiento (ver materiales y métodos, punto 8.3) sembramos 50000 células que fueron transfectadas 24h después (tiempo 0). Posteriormente a la transfeccion, las células se contaron cada 24h hasta llegar a 120h. La depleción de TDRD9, generó un defecto en la proliferación celular en líneas que expresan TDRD9, en comparación con las células transfectadas con el siControl (Figura R8-B). Como control del experimento, hicimos lo mismo con H1264, una línea celular que no expresa TDRD9. Observamos que la transfección con los siTDRD9-1 y siTDRD9-2, no ocasionaba ningún efecto deletéreo en la modificación de estas células. Tras estos resultados, decidimos investigar el ciclo celular en células transfectadas con siTDRD9-1 cultivadas durante 72h, mediante citometría de flujo (materiales y métodos, punto 8.2). La depleción de TDRD9 en líneas que expresan (H1299, H1993 y H441) ocasionó un aumento del porcentaje de células detenidas en la fases S del ciclo celular. Sin embargo, no ocurrió lo mismo en H1264 transfectadas con siTDRD9-1 (no expresa TDRD9), cuyo ciclo celular permaneció igual al control. Esto nos sugiere que la disminución en la proliferación puede ser debida a una parada parcial o un enlentecimiento de la fase S del ciclo celular (Figura R8-C). Además, en células H1299 y H1993 que expresan TDRD9, hemos observado un aumento (de 3 a 4 veces) del porcentaje de apoptosis (medido como la población de células con contenido de DNA sub G1) 72 horas después de transfectar con el siTDRD9-1. Esto no ocurrió en H1264, que no expresa TDRD9 (Figura R8-D). 1.4 TDRD9 no controla la expresión de LINE-1 En ratón, Tdrd9 interacciona con la proteína Miwi2, una de las proteínas de la familia PIWI (Vagin et al. 2009). Se ha propuesto que el complejo formado por Tdrd9 y Miwi2 está involucrado en el control de la expresión del retrotransposón LINE-1 a través de la hipermetilación mediada por piRNAs en células de la línea germinal (Shoji et al. 2009). Se ha relacionado el salto e inserción de retrotransposones en el Resultados 82 DNA en una gran cantidad de enfermedades, entre ellas el cáncer (Belancio et al. 2010). En una primera aproximación para analizar el posible papel de TDRD9 en el control de la expresión de LINE-1 en células cancerosas, analizamos el nivel de expresión de las proteínas PIWI en líneas celulares de cáncer de pulmón y en tejidos control mediante RT-PCR convencional (Figura R9-A). Los cuatro tipos de proteínas PIWI fueron fuertemente expresadas en testículos, como ya esperábamos. PIWIL1, A B C Figura R8. La depleción de TDRD9 en células que expresan TDRD9, ocasiona una pérdida de proliferación y un cúmulo de células en fase S. A) Expresión de TDRD9 en H1299 y H1993 tras ser transfectadas con dos siRNAs diferentes contra TDRD9 (siTDRD9-1 y siTDRD-2) o con un siRNA control (siControl). B) Curvas de crecimiento de tres líneas celulares de cáncer de pulmón transfectadas con los tres siRNAs por separado. Se contaron las células cada 24 h durante 5 días. H1299 y H1993 son células que expresan TDRD9. Como control se usó H1264 que no expresa TDRD9. C) Ciclo celular de líneas de cáncer de pulmón transfectadas con siControl o con siTDRD9-1 y cultivadas durante 72h. Se visualiza la intensidad emitida por el Ioduro de Propidio (IP). De nuevo como control se utilizó H1264. D) Inducción de apoptosis, analizada por citometría de flujo, en células transfectadas con siControl y con siTDRD9-1 y cultivadas durante 72 h. En A, B y D se representan valores promedios ± la desviación estándar obtenidas de tres experimentos diferentes. IP (Intensidad) 0 10 20 30 % Apoptosis H1299 H1993 H1264 siControl siTDRD9-1 Resultados 83 GAPDH TDRD9 PIWIL1 PIWIL2 PIWIL3 PIWIL4 no se expresó en ninguna otra línea o tejido analizado. PIWIL2, fue levemente expresada en algunas líneas celulares, incluyendo aquellas que no tienen expresión de TDRD9. PIWIL3, se expresó en HeLa además de testículos. Y finalmente PIWIL4 (el homólogo de Miwi2), se expresó en la mayoría de las muestras a excepción de H441 y HeLa (ambas expresan TDRD9). En conclusión, no existe una perfecta correlación entre las líneas que expresan TDRD9 y la expresión de las proteínas PIWIL. Para completar el estudio, analizamos la correlación de expresión de TDRD9 y las proteínas PIWIL en tumores TCGA-LUAD, observando la misma falta de correlación de expresión que en líneas (Figura R9-B). Posteriormente, determinamos el nivel de expresión de LINE-1 en las líneas que expresan y que no expresan TDRD9. Para ello diseñamos unos oligonucleótidos con los que amplificamos mediante RT-PCR cuantitativa, un fragmento del 5´UTR del retrotransposón LINE-1 (Figura R10-A). Quisimos investigar si existía una expresión diferencial de LINE-1 entre líneas que expresan o que no expresan TDRD9. Como se observa en la figura R10-B, no existe ninguna correlación entre la expresión de TDRD9 y el nivel de expresión del transcrito de LINE-1. Finalmente, también TDRD9 Pearson = 0.017 TDRD9 Pearson = 0.024 PIWIL2 PIWIL3 TDRD9 Pearson = 0.27 PIWIL4 TDRD9 Pearson = 0.0002 PIWIL1 A B Figura R9. No existe correlación entre la expresión de los genes PIWI y TDRD9. A) Nivel de expresión de los genes PIWI en líneas celulares de cáncer de pulmón y en tejidos control mediante RT-PCR convencional. Los paneles correspondientes a la GAPDH y a TDRD9, son los mismos que se representan en la figura R2. B) Correlación entre la expresión de TDRD9 y genes PIWIs en tumores TCGA-LUAD. Datos de RNA-seq normalizados obtenidos de TCGA. Resultados 84 mostramos que la depleción de TDRD9 en líneas celulares que expresan TDRD9, no afecta al nivel de transcripción de LINE-1 (Figura R10-C). En conclusión, estos datos sugieren que TDRD9 no controla la expresión de LINE-1 en células de cáncer de pulmón. Figura R10. TDRD9 no controla la expresión de LINE-1 en células de cáncer de pulmón. A) Esquema del retrotransposón LINE-1. Se indican los cebadores utilizados para realizar las PCRs cuantitativas (qPCR). B) qPCR para ver la expresión de LINE-1 en células que expresan y que no expresan TDRD9. C) Cada gráfica muestra la expresión de LINE-1 cuando deplecionamos TDRD9 mediante siTDRD9-1. H1993, H1299 y H1975 son líneas celulares que expresan TDRD9; frente a A549 que no expresa. Hemos comparado los datos de expresión entre la situación control y la de depleción de TDRD9 en cada línea, con un t-Student, siendo no significativo en todos los casos. Los valores se encuentran relativizados al control, siendo éste 1. Los datos representados en B y C corresponden al promedio ± la desviación estándar obtenida a partir de tres experimentos independientes. 5´UTR 3´UTR LINE-1 ORF1 ORF2 Expresan TDRD9 No Expresan TDRD9 A B C Resultados 85 -Log10 P-valor Log2 (veces de cambio) -Log10 P-valor Log2 (veces de cambio siTDRD9-2 vs.siControl) -Log10 P-valor (probabilidad) 0 2 4 6 8 10 GO:0044822~poly(A) RNA binding GO:0003723~RNA binding GO:0003676~nucleic acid binding GO:0005515~protein binding GO:0005488~binding GO:0003682~chromatin binding -Log10 P-valor (probabilidad) 0 1 2 3 4 GO:0006281~DNA repair GO:0051301~cell division GO:0000278~mitotic cell cycle GO:0007062~sister chromatid cohesion GO:0019827~stem cell maintenance GO:0007067~mitotic nuclear division -Log10 P-valor (probabilidad) R²=0.40197 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -3 -2 -1 0 1 2 3 r=0.63 Log2 (veces de cambio siTDRD9-1 vs.siControl) Log2 (veces de cambio siTDRD9-2 vs.siControl) A C D Categorías GO (Procesos Biológicos) Categorías GO (Función Molecular) E < F Figura R11. Caracterización de cambios en el transcriptoma por depleción de TDRD9 en células H1993. A) Diagrama de correlación entre cambios en los niveles de expresión debidos a los siRNAs siTDRD9-1 y siTDRD9-2 respecto del control. B) Ordenamiento de genes mediante el diagrama Volcano. Selección de genes que cambian más de 2 veces (Log2(2)=1) con un P-valor<0,01 (-Log 0,01=2). Esta selección de genes está localizada dentro del cuadro amarillo. C) Diagrama de Venn de dos conjuntos formados por los cambios transcripcionales originados por el siTDRD9-1 (267 genes) y por el siTDRD9-2 (311 genes). En la intersección de ambos podemos observar los genes en común que cambian cuando se depleciona TDRD9 con ambos siRNAs (138 genes). D) Comprobación de los genes TDRD9, AXL, CCND2 y CTGF, pertenecientes a los 138 genes desregulados de la intersección del diagrama de Venn, mediante RT-qPCR. Se representan valores promedios +/- la desviación estándar proveniente de tres experimentos diferentes. E) y F) Análisis de significación biológica mediante Ontología de Genes (GO). Se utilizaron los 138 genes desregulados comunes y fueron ordenados por categorías: E) procesos biológicos y F) por función molecular. Se representan los P-valores ajustados por Bonferroni. B Resultados 86 1.5 Caracterización de cambios transcripcionales producidos por la bajada de expresión de TDRD9 Para esclarecer las consecuencias transcripcionales de la depleción de TDRD9 en células que expresan TDRD9, llevamos a cabo un perfil de expresión de RNA de células H1993 transfectadas con siTDRD9-1, siTDRD9-2 o siControl durante 72h. Para ello utilizamos micromatrices de DNA de Affymetrix que se hibridaron y procesaron en la unidad de Genómica de CABIMER. Los dos siRNAs contra TDRD9 produjeron cambios transcripcionales similares respecto al siControl con un coeficiente de Pearson, r=0,634 (Figura R11-A). En la representación Volcano se muestra la distribución de los valores de cambio de expresión respecto a su significación estadística. Se consideran significativos, cambios de más de 2 veces al alza o a la baja con un FDR ≤ 0,01 (área amarilla de la figura R11-B). En la figura R11-C, vemos los cambios transcripcionales generados por el siTDRD9-1 (267 genes), los originados por el siTDRD9-2 (311) y en la intersección, los comunes a los dos siRNAs (138 genes). Este estudio fue realizado para genes que cambian al menos 2 veces respecto del control. De los genes elegidos, 122 fueron sobreexpresados, mientras que 16 fueron desregulados a la baja (tabla A1). Comprobamos mediante RT-qPCR, la desregulación de la expresión de tres genes (AXL, CCND2 y CTGF) afectados por la depleción de TDRD9. Los niveles de expresión de TDRD9 fueron determinados como control del experimento (Figura R11-D). Por otro lado, investigamos en bases de datos de anotación funcional e hicimos análisis de Ontología de Genes (GOs) con los genes seleccionados para ver si éstos tenían funciones similares o si están involucrados en procesos parecidos. El análisis de los GO de procesos biológicos (BP-GO), muestra que los genes sobreexpresados tras la depleción de TDRD9 se agrupaban en categorías funcionales relacionadas con reparación de DNA, ciclo celular y división celular mitótica (Figura R11-E). Cuando analizamos las funciones moleculares (MF-GO) encontramos que estaba enriquecida la categoría de unión a RNA (Figura R11-F). Por otra parte analizamos las rutas metabólicas enriquecidas en este conjunto de genes usando la base de datos Pathway Commons. Rutas como la Fase M (Ajuste por Bonferroni P-valor=0,0005), replicación de DNA (P-valor=0,0008), metabolismo Resultados 87 de RNA (P-valor= 0,0013) y ciclo celular mitótico (P-valor=0,0029) fueron también enriquecidas en los genes sobreexpresados. La tabla R1, muestra algunos genes de reparación de DNA y de ciclo celular cuyos niveles de transcrito aumenta tras la depleción de TDRD9. Como ejemplo de algunos genes sobreexpresados tras la depleción de TDRD9 tenemos aquellos que codifican subunidades de los complejos de la condensina o cohesinas (SMC1A, SMC2, SMC3 y ESCO1), componentes estructurales de los centrosomas (CEP250, CEP290, CEP350), reguladores del ciclo celular (CCND2, CDC27, CDCA2) y marcadores de proliferación como Ki-67 (MKI67), los cuales están normalmente aumentados en las fases del ciclo S o G2/M. En resumen, los análisis transcriptómicos, junto con los datos descritos de ciclo celular y proliferación indican que una disminución de los niveles de TDRD9 provoca una parada en las fases S 1.6 La depleción de TDRD9 provoca una acumulación de daño en el DNA Muchos de los genes sobreexpresados tras la depleción de TDRD9, son genes involucrados en respuesta a daño en el DNA. Por ejemplo PRKDC, que codifica para la subunidad catalítica de la proteín kinasa dependiente de DNA (DNA- PKcs), aumentó su expresión más de 4 veces en la línea H1993 con TDRD9 silenciado. La proteína DNA-PK es un regulador central de la respuesta a rotura de doble cadena (DSB) que cataliza la fosforilación de la histona H2A.X en la Serina 139 (-H2A.X). -H2A.X se requiere para la acumulación de numerosas proteínas de reparación de daño en el DNA y de complejos remodeladores de cromatina alrededor de las DSBs (Paull et al. 2000, Marechal et al. 2013, Davis et al. 2014). Además, coordina la cascada de transducción de señales para una eficiente reparación (Lukas et al. 2004). Decidimos investigar si la reducción de los niveles de TDRD9 produce un aumento de DSBs manifestado por el aumento del nivel de DNA-PKcs fosforilada (activada) y de -H2A.X. Lo primero que hicimos fue estimar la cantidad de proteína mediante Western Blot. Para ello cultivamos 300000 células de las líneas H1993 y H1299, las cuales fueron transfectadas con los siControl y siTDRD9-1. 72h después se recogieron las células para hacer los extractos proteicos. El Western Blot fue Resultados 88 Gen Nombre completo Cambios FC siTDRD9-1 Cambios FC siTDRD9-2 CEP250 Centrosomal protein 250kda 4.12 3.75 MKI67 Marker of proliferation Ki-67 4.10 3.18 PRKDC Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide, DNA-PKcs 4.02 4.13 ESCO1 Establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 1 3.23 3.54 CEP350 Centrosomal protein 350kda 2.98 2.84 CDK11A Cyclin-dependent kinase 11A 2.91 3.21 SMC1A Structural maintenance of chromosomes 1A 2.89 3.00 BOD1L1 Biorientation of chromosomes in cell division 1-like 1 2.79 3.56 ATRX Alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked 2.76 3.18 SMC3 Structural maintenance of chromosomes 3 2.74 2.95 CDC27 Cell division cycle 27 2.67 2.76 SMC2 Structural maintenance of chromosomes 2 2.54 2.39 ERCC6L2 Excision repair cross-complementation group 6-like 2 2.26 2.49 RIF1 Replication timing regulatory factor 1 2.15 2.28 CCND2 Cyclin D2 2.12 3.16 PARP1 Poly (ADP-ribose) polymerase 1 2.11 2.47 CDCA2 Cell division cycle associated 2 2.05 2.15 CEP290 Centrosomal protein 290kda 2.05 2.15 MAP4 Microtubule-associated protein 4 2.03 2.01 Tabla R1. Genes sobreexpresados tras la depleción de TDRD9 en células H1993 Resultados 89 A H1993 C E F G H Figura R12. La depleción de TDRD9 causa acumulación de daño en el DNA. Se hicieron extractos totales obtenidos a partir de células H1993 y H1299 se analizaron mediante Western Blot utilizando los anticuerpos contra P- DNA-PKcs y -Tubulina como control (A), o bien con-H2A.X y  -Tubulina (B). Tanto el análisis como la cuantificación de fluorescencia fue realizado utilizando el sistema ODYSSEY. Se analizaron 40  g de proteínas. C) Focos de  -H2A.X en células H1299 y H1993 transfectadas con siTDRD9-1 y siControl. Para el análisis se usó el anticuerpo primario anti  -H2A.X hecho en ratón, y el secundario Alexa Fluor 488 (verde). D) Cuantificación de los focos en condiciones control y de depleción de TDRD9. Se toma como células con focos aquellas con más de 3. E) Comparación de mitosis normales en células control vs mitosis aberrantes en células H1299 en ausencia de TDRD9. F) Comparativa de la morfología nuclear, en células H1299 y H1993, en condiciones control y de depleción de TDRD9. G) Cuantificación de núcleos anormales multilobulados en células H1299 y H1993 transfectadas con siTDRD9-1, comparadas con las control. En todos los casos el DNA fue teñido con DAPI. En las figuras A y B, se representan valores promedios ± la desviación estándar obtenidas de tres experimentos diferentes, mientras que las figuras D y G son provenientes de dos experimentos diferentes. Escalas 10 m. D DAPI DAPI H1993 % células con focos H1299 % núcleos anormales H1299 B A g-H2A.X TUB siControl siTDRD9-1 s i C on tr o l s i TDRD 9 - 1 0 1 2 3 Fold induction H1993 Cantidad relativa de proteínas g-H2A.X TUB siControl siTDRD9-1 siCo n t r o l s i T D R D9 - 1 0 1 2 3 4 5 Fold induction H1299 Cantidad relativa de proteínas P-DNA-PKcs TUB siControl siTDRD9-1 si Co ntro l si T D R D9-1 0 1 2 3 4 Fold induction H1993 Cantidad relativa de proteínas s i Control s i TD RD 9 - 1 0 10 20 30 40 siControl TUB siTDRD9-1 P-DNA-PK H1299 Protein levels (arbitrary units) Cantidad relativa de proteínas -H2A.X TUB -H2A.X TUB Resultados 96 Es conocido que múltiples proteínas que forman parte de gránulos de RNA son altamente insolubles. Un ejemplo de estas estructuras son los gránulos de estrés. Es interesante resaltar que en el ensayo de doble híbrido hemos identificado algunos interactores de TDRD9 que forman parte de estos gránulos de estrés, como por ejemplo Ews, Ilf3 y Caprin 1 (Shiina and Nakayama 2014, Kedersha et al. 2016). Figura R15. TDRD9 se localiza en el citoplasma de células HeLa, formando agregados insolubles. A) Inmunofluorescencia de la sobreexpresión de TDRD9 mediante la transfección del plásmido pN- Flag-TDRD9 en células HeLa. Localización citoplásmica del mismo. Como anticuerpo primario se utilizó-Flag M2 y como secundario Alexa flúor 488 (verde). El plásmido pDEST (esqueleto de pN- Flag-TDRD9) se utilizó como control negativo. B) Ensayo de Western Blot utilizando los extractos de células HeLa transfectadas con los plásmidos pDEST (Ct) o pN-Flag-TDRD9 (T). C) Fraccionamiento de extractos proteicos en fracción soluble e insoluble de células transfectadas con pDEST (Ct) o pN-Flag- TDRD9 (T). Para este experimento se usó células HeLa. En ambos Westerns se cargaron 40  g de extracto total de proteínas. Ambos Western Blots fueron analizados utilizando el anticuerpo  -Flag M2 como primario y como secundario un anti IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano. Como control de carga usamos la tubulina. Barra de escala 10 m. C B 170kDa 130kDa 55kDa -Flag M2 pDEST/ DAPI pN-Flag-TDRD9 DAPI 170kDa 130kDa 100kDa Resultados 97 Así que, lo siguiente que hicimos fue investigar si TDRD9 se encuentra formando parte de estructuras similares colocalizando con algunos de los interactores hallados en el doble híbrido. Elegimos para este experimento a TDRD9 Figura R16. La sobreexpresión de TDRD9 en células HeLa, forma gránulos en el citoplasma. A) Distribución de G3BP sobreexpresado mediante transfección del plásmido pG3BP-GFP (verde). En el panel de arriba se observa la distribución citoplásmica y homogénea de G3BP en ausencia de arsenito (-As). En el panel inferior vemos gránulos de estrés originados por una sobreexpresión de G3BP en presencia de arsenito (+As). B) Distribución de CAPRIN1 sobreexpresada mediante la transfección del plásmido pRNG105-mRFP (rojo) en ausencia (-As) o presencia (+As) de arsenito. Las imágenes superiores muestran la distribución homogénea de CAPRIN1 en ausencia de estrés, mientras que las inferiores muestran gránulos de estrés de CAPRIN1 por la presencia de arsenito. C) Localización de TDRD9 sobreexpresado por la transfección del plásmido pN-Flag-TDRD9 en ausencia (-As) o presencia (+As) de arsenito mediante inmunofluorescencia. En el panel superior se muestra una distribución homogénea en el citoplasma, de TDRD9 transfectado, en ausencia de estrés. En el panel inferior, la presencia de arsenito desencadena una señal granulada en el citoplasma en una gran proporción de células. Como anticuerpo primario se usó un  -Flag M2 y como secundario Alexa Flúor (488) (verde). D) Se contaron alrededor de 1600 células de cada condición en dos experimentos independientes. Tratamiento con arsenito: 500  M durante 1 hora. Barra de escala 10 m. D -As +As pG3BP-GFP pG3BP-GFP/ DAPI pRNG105-mRFP pRNG105-mRFP DAPI A B -As +As pN-Flag-TDRD9 pN-Flag-TDRD9 DAPI -Flag M2 -Flag M2 C Resultados 98 CAPRIN1, la cual se ha descrito que forma gránulos de estrés típicos y G3BP como marcador canónico de gránulos de estrés (Shiina and Nakayama 2014). Se ha descrito que la asociación G3BP-CAPRIN1, es necesaria para formar gránulo de estrés. Sin embargo, una sobreexpresión de CAPRIN1 es suficiente para la nucleación del gránulo (Kedersha et al. 2016). Lo primero que hicimos fue ver la estructura de los gránulos en cada caso. En la figura R16, podemos ver gránulos de estrés típicos de G3BP y de CAPRIN1, en presencia de 500 M de arsenito, agente inductor de estrés oxidativo. De la misma manera hicimos el ensayo sobreexpresando TDRD9 (Figura R16-C), observando un aumento de células con gránulos cuando éstas son sometidas a estrés por arsenito (Figura R16-D), esto podría indicar una posible función en la célula frente a estrés. Se muestran imágenes del experimento realizado con células HeLa. También se utilizó la línea celular Cos7, con las que se obtuvieron los mismos resultados. El experimento de coexpresión (Figuras R17-A y B) se llevó a cabo utilizando la línea celular Cos7, pero en HeLa obtuvimos similares resultados. En la figura R17- A, podemos ver en el panel superior la coexpresión de TDRD9 con G3BP en ausencia de arsenito. En este caso vemos que G3BP-GFP y Flag-TDRD9, no están nucleados en gránulos y presentan una distribución homogénea similar. Sin embargo, al tratar las células con arsenito podemos ver que G3BP-GFP, no sólo no está colocalizando con Flag-TDRD9, sino que TDRD9 está siendo excluído del lugar donde está el gránulo formado por G3BP. Por otro lado, Flag-TDRD9 y mRFP-CAPRIN1, en ausencia de arsenito, también tienen una distribución muy parecida (Figura R17-B) sin embargo, cuando sometemos las células a estrés por arsenito, de nuevo mRFP- CAPRIN1 nuclea en gránulos excluyendo a Flag-TDRD9 del lugar donde se localiza. En muy baja proporción, vemos Flag-TDRD9 formando gránulos cuando cotransfectamos. La función, etiología o composición de los complejos o gránulos que TDRD9 forma en el citoplasma, es desconocida por el momento. No podemos descartar que los corpúsculos citoplásmicos en los que aparece TDRD9 exógeno sea simplemente efecto de la sobreexpresión. Lo que sí sabemos es que en presencia de arsenito, el número de células que los presentan aumentan. Igual que ocurre con los gránulos de estrés canónicos. Resultados 99 Figura R17. TDRD9 sobreexpresado no colocaliza con G3BP ni CAPRIN1 sobreexpresados en células Cos7. A) Experimento de cotransfección de los plásmidos pG3BP-GFP (verde) y pN-Flag-TDRD9 (rojo) en ausencia (-As) o presencia (+As) de arsenito (500  M, durante 1 hora). Las flechas marcan gránulos de estrés de G3BP y los huecos que se originan en la localización de TDRD9. B) Cotransfección de los plásmidos pN-Flag-TDRD9 (verde) y pRNG105 mRFP (CAPRIN1) (rojo) en ausencia (-As) o presencia (+As) de arsenito (500  M, durante 1 hora). Las flechas marcan gránulos de estrés de CAPRIN1 y los huecos que se originan en la localización de TDRD9. Para visualizar la expresión de TDRD9 mediante el plásmido pN- Flag-TDRD9, utilizamos un anticuerpo primario -Flag M2 y como secundario, Alexa Fluor 568 (rojo) en el experimento de coexpresión con G3BP y Alexa Fluor 488 (verde) en la coexpresión con RNG105 (CAPRIN1). Barra de escala 10 m. A pG3BP-GFP pN-Flag-TDRD9 pG3BP-GFP/ pN-Flag-TDRD9/ DAPI -As +As -Flag M2 -Flag M2 -As +As -Flag M2 -Flag M2 pN-Flag-TDRD9 pRNG105-mRFP pN-Flag-TDRD9/ Prng105-mRFP/ DAPI B 100 101 DISCUSIÓN Discusión 102 1.- TDRD9 EN CÁNCER Hemos descrito en esta tesis que TDRD9 se expresa en un conjunto de tumores de pulmón y que la esperanza de vida de los pacientes que padecen estos tumores, se ve significativamente disminuída. Por otro lado, hemos visto una sobreexpresión de TDRD9 en un subconjunto de líneas de adenocarcinoma de pulmón (LA) y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) debido a la hipometilación de la CGI asociada al promotor de TDRD9. Todo esto, junto con datos previos, nos sitúa a TDRD9 como un posible gen Cancer Testis (CTs). Estos genes se caracterizan por presentar una expresión normal restringida a la línea germinal masculina, pero que pueden activarse de forma aberrante en algunos tumores como resultado de la desmetilación de su promotor (De Smet et al. 1999, Old 2001, Coulie et al. 2002). Otros genes relacionados con el metabolismo de los piRNAs, han sido catalogados como CTs. Por ejemplo, TDRD1 que está involucrado en el silenciamiento de LINE-1 en la línea germinal, junto con TDRD9 y las proteínas de la familia PIWI, es frecuentemente expresado en tumores de próstata y de mama (Loriot et al. 2003). En ratón, Mael es otro claro ejemplo de gen CT. Este se localiza en los nuage en células germinales y también es esencial para el mantenimiento de la línea germinal silenciando LINE-1 mediante piRNAs junto con Miwi2 y Tdrd9 en piPBs (Aravin et al. 2009). En humanos, se restringe también la expresión de MAEL a la línea germinal masculina. Sin embargo, se ha encontrado expresado de manera aberrante en varios tipos de tumores como el de mama o en cáncer colorectal, activándose por hipometilación de su CGI (Hofmann et al. 2008, Janic et al. 2010, Xiao et al. 2010, De Smet et al. 2013, Kim et al. 2013). Además, TDRD9 ha sido propuesto como un posible gen CTs en un análisis transcriptómico de tumores colorectales (Yokoe et al. 2008). Todos estos datos apoyan nuestra hipótesis sobre que TDRD9 es un posible gen CTs que puede encontrarse expresado de forma aberrante en cáncer de pulmón por desmetilación de su CGI. La expresión de genes específicos de la línea germinal en cáncer, a veces es explicado por procesos de desdiferenciación que pueden ocurrir durante la transformación celular (Whitehurst 2014). Sería por lo tanto posible que TDRD9 se sobreexpresara como parte de un proceso general de desdiferenciación que 103 involucrara a muchos genes del grupo CTs. Sin embargo, observamos mediante análisis informático, que el nivel de expresión de TDRD9 y los genes MAGE (A1, A2, A3 y A4), que son CTs que se expresan en adenocarcinoma de pulmón y en melanomas, no correlacionan entre sí (datos no mostrados). Es decir, la activación de TDRD9 no ocurre por una activación generalizada de genes CTs. Los patrones de metilación en cáncer, a menudo, son modificados en las células tumorales. Una hipometilación de ciertas zonas del genoma, podría contribuir al origen y progresión del tumor por activación de oncogenes. A veces, estas desmetilaciones ocurren englobando amplias regiones génicas (De Smet et al. 1999, Weiser et al. 2001, Coral et al. 2002). Sabiendo esto investigamos si TDRD9 se encuentra en una de esas regiones hipometiladas. Observamos que TDRD9 es el único gen de una amplia región génica que sufre una hipometilación en tumores con expresión de TDRD9. Por tanto, todos estos datos nos indican que la hipometilación y desrepresión de TDRD9 no es consecuencia de una hipometilación generalizada, sino de una activación específica que puede aportar una ventaja selectiva a las células tumorales. Además, vimos que al tratar con 5-aza- 2´deoxycytidine (un agente desmetilante) células de la línea H1264 (que no expresa TDRD9), se activa la expresión de TDRD9. Sin embargo, esta desrepresión no es estable. Esto nos sugiere que la expresión de TDRD9 no aporta ventaja selectiva a todas las células tumorales de pulmón. Es posible que la ventaja funcional, aportada por la expresión de TDRD9, sea salvada mediante otros cambios de expresión o mutaciones en los tumores que no expresan TDRD9. Es interesante destacar que spn-E (homólogo a TDRD9 en Drosophila) y otros factores implicados en el metabolismo de los piRNAs, como piwi y aub, se han encontrado aberrantemente expresados en tumores malignos de cerebro en Drosophila (Janic et al. 2010). Se han publicado muchos trabajos acerca de la expresión aberrante de las proteínas PIWIL en tumores humanos de diferentes orígenes, sin embargo, se conoce muy poco sobre los mecanismos por los cuales las proteínas PIWIL contribuyen a la proliferación celular en tumores. Los genes PIWILs se han propuesto también como genes CTs por su localización en la línea germinal y de forma ectópica en diversos tumores (Costa et al. 2007, Cheng et al. 2011). Por ejemplo, en el trabajo publicado por Xiaohan en 2015, se ha descrito que Discusión 104 PIWIL2 está involucrada en la progresión del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) actuando como oncogén (Qu et al. 2015). Algo parecido a lo que puede estar ocurriendo con TDRD9 en este tipo de tumores. Una posibilidad obvia es que las proteínas PIWI estén controlando el metabolismo de los piRNA y silenciando transposones en células tumorales. Sin embargo, no hay evidencias de que esto ocurra. En el reciente trabajo publicado por Wang y colaboradores, se describe que la expresión ectópica de PIWIL4 en cáncer de mama no afecta significativamente a la biosíntesis de piRNAs (Wang et al. 2016). La fuerte activación de LINE-1 observada en mutantes en Tdrd9, nos hizo pensar que TDRD9 junto con los piRNAs, podían estar controlando la activación de LINE-1 en tumores, los cuales pueden derivar en inestabilidad genómica y afectar los niveles de expresión de oncogenes o supresores de tumores. Sin embargo, cuando observamos el patrón de expresión de LINE-1 en las líneas celulares de cáncer de pulmón, LA y NSCLC, no se observó ninguna correlación entre la expresión de TDRD9 y de LINE-1. Tampoco la depleción de TDRD9 afectó al transcrito de LINE-1. Todos estos datos nos indican que la función de TDRD9 en células tumorales no está relacionada con el control de la expresión de LINE-1. Según nuestros datos, una depleción de TDRD9 en células tumorales de pulmón que lo expresan, ocasiona una pérdida de proliferación de las mismas, un acúmulo en la fase S del ciclo celular y un aumento de la apoptosis. Entonces si no es mediante el control de LINE-1 ¿cómo puede favorecer la expresión de TDRD9 al mantenimiento de la célula tumoral? Hemos encontrado que la depleción de TDRD9 en líneas celulares que lo expresan, provoca un gran aumento de -H2A.X, que es un marcador de roturas de cadena sencilla (SSBs) pero sobre todo de roturas de cadena doble (DSBs). También identificamos un aumento de la proteína DNA-PKcs, que es una kinasa que junto con ATM y ATR, fosforilan a H2A.X y son responsables de generar la respuesta a daño en el DNA. (Gaillard et al. 2015). Debido a las lesiones en el DNA, acumuladas por la depleción de TDRD9, podrían estar dándose enlaces intercatenarios (ICLs), que suelen bloquear la horquilla de replicación conduciendo a la incapacidad completa del cromosoma para duplicarse, originando una catástrofe mitótica (Deans et al. 2011). Además la presencia de loci no replicados completamente o no 105 reparados pueden resultar en una mitosis con no disyunción de cromosomas y puentes de anafase (Gisselsson et al. 2000). De acuerdo con esto, al deplecionar TDRD9 en células de cáncer de pulmón TDRD9 positivas origina, se produce un aumento considerable del número de núcleos celulares anómalos y mitosis aberrantes, con la presencia de puentes de anafase típicos originados por fallos replicativos (Hewett et al. 1998, Sofueva et al. 2011). La proteína DNA-PKcs, está implicada mayoritariamente en la ruta de reparación de NHEJ (unión de extremos no homólogos). Dicha ruta es minoritaria en fase S, en la que actúa principalmente la ruta de reparación por recombinación homóloga. En células con bajos niveles de TDRD9, observamos que existen altos niveles de DNA-PKcs activo, sin embargo las células están bloqueadas en S, lo cual resulta paradógico. Podría ocurrir que por algún motivo desconocido, la depleción de TDRD9 provoque un aumento de la ruta NHEJ en condiciones en las que no debería estar activa, lo cual resultaría deletéreo para las células (Gaillard et al. 2015). Por otro lado, las células con TDRD9 deplecionado, no presentan hipersensibilidad a radiación-, lo cual puede sugerir que TDRD9 no está implicado de manera general en la reparación de DSBs. Sin embargo, sí muestran hipersensibilidad al tratamiento con afidicolina, un inductor de estrés replicativo. La afidicolina es un inhibidor de la replicación que causa parada de la horquilla de replicación (Levenson et al. 1993), activa el checkpoint en fase S y aumenta las DSBs (Brown et al. 2003). El estrés replicativo se caracteriza por presentar una replicación defectuosa del DNA que podría desencadenar mutaciones o bloqueos de la replicación que pueden originar roturas, reordenaciones y una segregación anómala de los cromosomas. El daño en el DNA es uno de los motivos por los que la horquilla de replicación puede pararse o bloquearse desencadenando la activación del checkpoint en la fase S. Ha sido ampliamente descrito en la bibliografía que el estrés replicativo es una de las principales causas que conduce a la inestabilidad genómica, una clara característica encontrada en las células tumorales (Gaillard et al. 2015). Teniendo en cuenta que una depleción de TDRD9 ocasiona una parada en fase S, hipersensibilidad a afidicolina y catástrofes mitóticas, proponemos que TDRD9 está protegiendo a la célula de cáncer de pulmón del estrés replicativo, de alguna manera que desconocemos por el momento. Sabemos que TDRD9, es una Conclusiones 112 CONCLUSIONES Conclusiones 113 1.- En humanos, el gen TDRD9 tiene una expresión mayoritariamente restringida a testículos, sin embargo de forma aberrante lo encontramos sobreexpresado en un grupo de tumores de pulmón y en melanomas de piel; así como en un subconjunto de líneas de adenocarcinoma de pulmón y de carcinoma de pulmón de células no pequeñas. 2.- En adenocarcinoma de pulmón, la supervivencia de los pacientes que presentan tumores con expresión de TDRD9 es menor que los que presentan tumores sin expresión del mismo. 3.- La razón por la que TDRD9 se sobreexpresa en tumores y en líneas celulares de cáncer de pulmón, no es debida a amplificaciones génicas, sino por una hipometilación de la Isla CpG (CGI) asociada a su promotor, que conlleva a una activación de la expresión del gen. Además encontramos que esta hipometilación es exclusiva de TDRD9, ya que los genes adyacentes a éste no presentan diferencias de metilación en tumores positivos o negativos para la expresión de TDRD9. 4.- La depleción de TDRD9 en líneas celulares de cáncer de pulmón que lo expresan (H1299 y H1993), afecta negativamente a la proliferación de las mismas, posiblemente por una parada parcial en la fase S del ciclo celular. Además, una bajada de los niveles de expresión de TDRD9 genera un aumento de la apoptosis en dichas líneas. 5.- No encontramos ninguna relación entre la expresión de TDRD9 y el transcrito de LINE-1 en células de cáncer de pulmón. Además, la abundancia del transcrito de LINE-1 no se ve afectada por la depleción de TDRD9. 6.- La depleción de TDRD9 provoca una acumulación de daño en el DNA que se pone de manifiesto por un aumento de focos de -H2A.X, una sobreexpresión de la proteína DNA-PKcs y la presencia de núcleos y mitosis aberrantes con numerosos puentes de anafase. Conclusiones 114 7.- Las células de cáncer de pulmón con TDRD9 silenciado, presentan una hipersensibilidad a afidicolina, pero no a radiación gamma. Lo cual nos sugiere que las células a las que se les depleciona TDRD9, presentan un cúmulo de estrés replicativo. Todo esto nos sugiere que TDRD9 alivia el estrés replicativo de células de cáncer de pulmón que lo expresan. 8.- Mediante ensayos de doble híbrido hemos visto que TDRD9 interacciona con las proteínas Coil, Ewsr1, Sorbs1, Caprin1, Ilf3, Paics, Fam120a, Ppp1r10, Rinr1, Tes y 1110037F02Rik mediante el dominio TUDOR y con C1qtnf1 mediante un dominio desconocido. La mayor parte de los interactores identificados de TDRD9 presentan RG/RGG. 9.- TDRD9-Flag, se localiza en el citoplasma homogéneamente y en determinadas ocasiones formando gránulos en el citoplasma. Esta localización granular se ve aumentada cuando tratamos a las células con arsenito. Al no colocalizar con CAPRIN1-mRFP ni G3BP-GFP que codifican para proteínas de gránulos de estrés (SG) canónicos, TDRD9-Flag podría estar formando gránulos pero de naturaleza desconocida. 115 ANEXO 116 Anexo 117 Gen Fold Change lineal siTDRD9-1 FDR siTDRD9-1 Fold Change lineal siTDRD9-2 FDR siTDRD9-2 HIST1H1E 6,137037 0,000016 8,092675 0,000010 CEP250 4,123602 0,000016 3,753805 0,000021 MKI67 4,104273 0,000012 3,178555 0,000025 PRKDC 4,018385 0,000014 4,128275 0,000013 PPFIBP1 3,716059 0,000327 3,460815 0,000401 DHX9 3,713348 0,000081 4,769726 0,000025 CCDC186 3,678924 0,000115 3,080763 0,000195 ZNF480 3,665226 0,000004 2,794001 0,000012 HIST1H1D 3,564621 0,000393 3,748467 0,000275 BDP1 3,419956 0,002566 4,533129 0,000659 RASSF8 3,388318 0,008930 4,245262 0,003149 EIF4G1 3,363923 0,000052 2,810413 0,000083 ESCO1 3,227598 0,000239 3,538456 0,000140 DCAF16 3,209233 0,000012 2,490618 0,000030 AFF4 3,187563 0,000311 2,706667 0,000652 SAFB2 3,182146 0,000043 3,113412 0,000030 CENPF 3,151546 0,000012 2,972437 0,000016 MIS18BP1 3,142988 0,000134 3,360121 0,000073 SETD2 3,104407 0,000012 3,434487 0,000010 PHLDB2 3,090040 0,000194 3,573388 0,000082 TPR 3,068202 0,000052 3,540176 0,000025 DIO2 3,011904 0,000012 2,615816 0,000017 ZKSCAN1 3,010654 0,000239 2,569947 0,000522 CLSTN1 2,988485 0,000098 3,503457 0,000040 CEP350 2,984088 0,000058 2,835914 0,000052 DDX6 2,975762 0,000156 2,659110 0,000248 MDN1 2,958562 0,000102 3,014026 0,000069 SPAG9 2,953673 0,001768 2,916261 0,001617 RBAK 2,941415 0,000047 3,190971 0,000025 NCEH1 2,938313 0,000012 2,308193 0,000036 CDK11A 2,911368 0,000076 2,373561 0,000275 NBPF10 2,905483 0,000052 2,762820 0,000046 PPARGC1A 2,904933 0,002491 4,359782 0,000317 SMC1A 2,888978 0,001009 2,995331 0,000729 ALG11 2,885799 0,000047 2,579984 0,000051 BCLAF1 2,880999 0,000019 2,785873 0,000021 ABLIM1 2,867801 0,000052 2,851999 0,000025 ARHGAP21 2,858023 0,000052 2,611025 0,000060 HIST2H2AC 2,828874 0,000097 2,821218 0,000070 MBNL1 2,815370 0,002036 2,451492 0,003865 TMTC3 2,809596 0,000940 2,602600 0,001296 BOD1L1 2,794557 0,000025 3,561783 0,000010 GNG12 2,778197 0,000019 2,524505 0,000025 NSD1 2,767886 0,000052 3,846242 0,000012 ATRX 2,758749 0,001229 3,179563 0,000498 SMC3 2,742036 0,000092 2,949086 0,000047 KIAA0430 2,732432 0,000167 2,390707 0,000317 INPP4B 2,722216 0,000087 2,449907 0,000111 PAPOLA 2,717324 0,000746 2,592825 0,000852 FMR1 2,698689 0,000168 3,301495 0,000052 PSME4 2,688513 0,000215 3,513606 0,000051 LMAN1 2,678235 0,000225 2,983866 0,000108 CDC27 2,669280 0,000115 2,755328 0,000070 AGGF1 2,616101 0,000148 2,878406 0,000070 ATF7IP 2,611648 0,001076 3,555546 0,000187 MBTD1 2,588423 0,001048 2,550020 0,001026 BAZ1B 2,586348 0,000163 2,666626 0,000112 SMC2 2,540893 0,000872 2,394674 0,001119 Tabla A1. Genes en común que cambian significativamente su expresión tras silenciar TDRD9 Anexo 118 PI4K2A 2,521928 0,000124 2,590079 0,000077 PRRC2C 2,518765 0,000320 2,721543 0,000290 VAPB 2,515897 0,000148 2,321261 0,000206 SF3B1 2,508589 0,001096 2,323103 0,001617 TCERG1 2,443081 0,000062 2,437341 0,000046 NOL8 2,442451 0,000090 2,607832 0,000046 UFL1 2,437804 0,000901 2,145739 0,001948 ASXL1 2,435216 0,001557 2,717309 0,000680 ILF3 2,435062 0,002562 2,973529 0,000669 MLEC 2,429584 0,001583 2,651994 0,000787 H2AFV 2,394201 0,004856 2,428052 0,003886 MYO5C 2,382100 0,000618 2,893570 0,000128 ZCCHC6 2,374932 0,001972 2,147318 0,003325 MOB1A 2,373134 0,000090 2,301539 0,000073 MGEA5 2,371677 0,000135 2,516809 0,000072 WNK1 2,328344 0,000212 2,366919 0,000168 GOLIM4 2,323337 0,001566 2,150697 0,002362 NUFIP2 2,316398 0,006450 2,239149 0,007236 CDC42SE2 2,310569 0,000135 2,322785 0,000335 CBL 2,308368 0,000101 2,278418 0,000074 FYB 2,294524 0,000226 2,501807 0,000111 CCPG1 2,294155 0,000162 2,757716 0,000047 RHOV 2,272442 0,000202 2,007550 0,000463 ERCC6L2 2,260668 0,000149 2,486703 0,000068 PDE4DIP 2,258734 0,000517 3,113382 0,000068 IQGAP1 2,254701 0,000193 2,086389 0,000301 AGAP10 2,230499 0,002900 2,515465 0,001127 CDC42BPA 2,218959 0,000434 2,174438 0,000447 ZBTB7A 2,193982 0,000391 2,124801 0,000438 PUS7L 2,191387 0,000437 2,355782 0,000234 MYO6 2,173894 0,000389 2,494224 0,000133 SUCO 2,173891 0,000342 2,063357 0,000447 SLMAP 2,162071 0,004696 2,080040 0,005539 SPTBN1 2,160406 0,000168 2,043112 0,000222 RIF1 2,150271 0,000325 2,277366 0,000187 CADM2 2,138113 0,002251 2,109220 0,002153 TBC1D14 2,125100 0,000325 2,341349 0,000142 CCND2 2,121948 0,003629 3,164530 0,000264 TPM4 2,117626 0,000058 2,082605 0,000047 ZNF644 2,115918 0,000853 2,274073 0,000436 BCOR 2,115220 0,000543 2,285993 0,000269 PARP1 2,113304 0,000148 2,467614 0,000046 IFNGR1 2,105463 0,000685 2,160697 0,000485 HECTD3 2,101275 0,000203 2,079952 0,000195 CNNM1 2,095617 0,001992 2,105489 0,001625 ND1 2,094361 0,009373 2,344034 0,003902 KIAA1033 2,084294 0,000105 2,333222 0,000040 XRN1 2,078785 0,000234 2,095888 0,000195 PPP1R3B 2,071202 0,005545 2,720434 0,000790 U2SURP 2,070873 0,000793 2,196765 0,000438 PPFIA1 2,059080 0,000681 2,074194 0,000544 MIER1 2,054042 0,000354 2,257453 0,000151 CDCA2 2,053806 0,000817 2,146648 0,000496 ZC3H11A 2,052134 0,000157 2,089051 0,006355 CEP290 2,048745 0,001375 2,149407 0,000820 SCLT1 2,045186 0,003880 2,250147 0,001644 PRDM2 2,040283 0,008578 2,311335 0,003149 MTG2 2,034363 0,001288 2,245622 0,000522 SLC38A1 2,031828 0,000225 2,342332 0,000070 CCDC132 2,026323 0,000676 2,044500 0,000527 Anexo 119 MAP4 2,026165 0,000124 2,011356 0,000098 BOLA2 2,022929 0,000123 2,272761 0,000044 EHMT1 2,022477 0,000283 2,188235 0,000137 TMEM45B 2,016873 0,003095 2,053516 0,002333 UACA 0,492046 0,000101 2,008550 0,000299 MATN3 0,490494 0,000124 0,390922 0,000025 EIF5A2 0,482247 0,000604 0,367529 0,000077 CTSV 0,477250 0,000191 0,496991 0,000232 PPP3R1 0,465589 0,006747 0,408025 0,002459 QKI 0,456233 0,000105 0,325572 0,000017 ZFR 0,444196 0,000119 4,108997 0,000037 KAT2B 0,441423 0,000317 0,490407 0,000612 CTGF 0,423042 0,001100 0,326065 0,000210 ETV7 0,416413 0,001554 0,476165 0,003440 DLEU2 0,413770 0,000226 0,320155 0,000106 HOXB8 0,398110 0,002411 0,448174 0,004501 PBX2 0,377054 0,002784 0,425887 0,005087 ASPH 0,364570 0,002348 0,312949 0,000888 SHISA2 0,318156 0,000051 0,467912 0,000297 AXL 0,235947 0,000461 0,217931 0,000296 En rojo, se muestran los genes regulados a la alta y en verde los regulados a la baja en condiciones de depleción de TDRD9 120 121 BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 128 Illingworth, R. 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