La problemática del ajuste en la etapa de la calibración

En es e abajo se pasa e is a a los ac o es que in luyen en el p oceso de calib ado en el análisis químico. Los pos ulados en los que se basa la aplicación del mé odo de los míni- mos cuad ados, la bondad del ajus e del modelo empleado y el análisis de esiduales son obje o de conside ación. Es e úl imo ópico cons i uye una pode osa he amien a que pe mi e comp oba las suposiciones en las que se basa el modelo y adop a decisiones con espec o a la independencia u homogeneidad (homocedas icidad) de los da os. En casos de a ianza no uni o me (he e ocedas icidad) se p ocede a la ponde ación, o a la ans o - mación de los da os, en su caso. Se analizan ambién es a egias a aplica en si uaciones más complejas ales como cu as de calib ación no lineales con a ianza no uni o me. Po úl imo, se conside a el uso de unciones acionales y ajus e po unciones splines. The ac o s, which exe an in luence o e he calib a ion p ocess in chemical analysis, a e subjec o conside a ion. The pos ula es in which he leas squa es me hod a e based; he goodness-o - i o he model and he esidual analysis a e subjec o s udy. This las opic is a powe ul ool, which allowschecking he assump ions assumed, as well as aking decisions conce ning da a independence o homogenei y (homocedas ici y). When he a iance is non-uni o m (he e ocedas ici y), da a a e ei he weigh ed o a ans o ma ion is ca ied ou . The s a egies o be applied in mo e complex cases such as non-linea cali- b a ion cu es wi h non-uni o m a iance a e also analysed. Finally, he use o a ional o spline unc ions a e conside ed. Palab as cla e: calib ación, análisis químico, a ianzas uni o me y no uni o me, cu as de calib ado no lineales. Key wo ds: calib a ion, chemical analysis, uni o m and non-uni o m a iances, non-linea calib a ion cu es. Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 A.G. GONZÁLEZ,ANA SAYAGO yAGUSTÍN G. ASUERO Co eo elec ónico: [email p o ec ed] Depa amen o de Química Analí ica, Facul ad de Fa macia, Uni e sidad de Se illa El calib ado, al como lo de ine Sha a y col. (1986), es esencialmen e un p oceso median e elcual, la espues ade un sis emade medida (señalanalí ica) puedeexp esa seen é minos de una cualidad o can idad de in e és (concen ación de anali o). De mane a ma emá ica, podemos asimila lo a una unción y= (x)donde yes la espues a analí ica co espondien e alaconcen aciónx. Elaspec o de mayo in e és analí ico consis e en encon a la o ma de esa unción de espues a. En el análisis adicional po mé odos químicos como la olume- ía y g a ime ía, la can idad de anali o es á elacionada linealmen e con el olumen del agen e alo an e o con el peso de la o ma de pesada que cons i uyen un modelo lineal de espues a (1) x = F ( ac o g a imé ico) ×y (peso de la o ma de pesada) (2) x = N (no malidad) ×Peso equi alen e ×y (Volumen de alo an e) Pe o, es en análisis ins umen al donde más se emplea la noción de unción de espues- a, exis iendo en algunos casos elaciones eó icas (Ag ende bos, 1979; Penninckx y col., 1996; Kleijbu g y Pijpe s, 1985; Wagenaa y col., 1974; And ews y Jowe , 1982; O’Connell y col., 1990) que pe mi en p onos ica és a (Tabla 1). Sin emba go, en o as muchas si uaciones, la unción de espues a ha de es ablece se empí icamen e midien- do p oblemas ic icios, es o es, u ilizando disoluciones pa ones (di e en es concen a- ciones conocidas de anali o p esen es en la misma ma iz). Bajo ales condiciones, la se- ñal ins umen al es á de inida po la can idad de anali o y el uido de ondo. Tabla 1. Funciones de espues a empleadas en análisis ins umen al Función de espues a Nomb e Técnica (ejemplos) y=A+Bx y=A+Blog x y=Ax B y=A+Bx+Cx 2 y=A+B[1–exp (–C x)] yAD x C D B =- +æ è çö ø ÷ + 1 Ley de Bee Ne ns Scheibe-Lomakin Wagenaa y col. And ews y col. Rodba d Espec oscopía de abso ción Elec oquímica Espec oscopía emisión Abso ción a ómica “ Radioimmunoensayo De los modelos ma emá icos empleados pa a de e mina la unción de espues a, el li- neal es el más sencillo, más es udiado y ácil de a a . Muchas unciones de espues a p esen an zonas lineales gene almen e a bajas concen aciones de anali o y o as donde apa ece cu a u a, e incluso, a eces, egiones donde la señal de espues a es indepen- dien e (Mc Dowell, 1981) de la concen ación de anali o. El analis a es á in e esado en la po ción de la unción de espues a donde la a iación de la señal ins umen al con la A.G. González, Ana Sayago y Agus ín G. Asue o Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 concen ación de anali o con iene in o mación ú il. El segmen o de unción de es- pues a con in e és analí ico pa a es ablece el calib ado y de e mina el con enido de anali o en unamues a desconocida ecibe el nomb e de cu a de calib ado,es imándose, a pa i de ella, la concen ación desconocida po in e polación(mé odo de pa ones ex e - nos). Cualquie ex apolación puede conduci a esul ados some idos a g andes e o es. Como ya hemos indicado, si la po ción de la cu a de calib ado es lineal ( ec a de cali- b ado), an o mejo . En casos de espues as no lineales es común e ec ua ans o ma- ciones pa a linealiza las (Ca oll y Rupe , 1988). El ajus e de los modelos ma emá icos a losda osde lacalib ación (Cuad os-Rod íguezycol., 2001) pa aes ablece la cu ade calib ado es una a ea que puede, hoy día, lle a a cabo el analis a de mane a sis emá i- ca, sin ol ida la igu osidad. En lo que sigue a a emos el ajus e del modelo de la cali- b ación a los da os cuando la señal esponde a un solo anali o y el e o se asocia a la a- iable x. El análisis mul icomponen e, aunque ambién es a able po el mé odo de pa ones ex e nos, quizás sea más lógico abo da lo desde las pe spec i as del mé odo de la adición es ánda gene alizada (Jochum y col., 1981; He e o y col., 1994) y no se á a ado aquí, al igual que la calib ación en aquellos casos en que en ambas a iables xeyes án suje- as a e o (Ripley and Thompson, 1987; González y Asue o, 1993). La écnica más usual pa a es ablece una cu a de calib ado po ajus e de pun os esla de los mínimos cuad ados, pe o pa a pode aplica la jus i icadamen e deben de cumpli se, en e o os (Ag e denbos, 1979; Sayago y col., 2004) es equisi os undamen ales: i) Que la a- iable xseencuen eexen adee o .ii)Queele o eiasociadoala a iabley1se encuen e no malmen e dis ibuido con media ce o y a ianza ss ii N 22 0;(, ) . iii) Que la des iaciónob- se ada en los alo es de ypa a un alo ijo de x( eplicaciones) pe manezca cons an e en odo el in e alo de concen aciones. (Pos ulado de la uni o midad de la a ianza u homocedas icidad). En calib ación, la concen ación de anali o se conoce, den o de unos má genes, con g an exac i ud y p ecisión y, po lo an o, podemos admi i que (i) se cumple. Muchos analis as dan po supues o que la condición (ii) de no malidad se cumple y a as eces lo comp ueban. Sin emba go, Clancey (1947), ya en la década de lo 40, examinó 250 dis ibuciones basadas en 50.000 análisis químicos y encon ó que menos de un 15% de aquellos podían conside a se no males con el p opósi o de aplica las écnicas es adís i- cas comunes. Es o nos ecue da la sen encia soca ona de Schmi (1969) de que “La dis ibución no mal es la menos no mal de las dis ibuciones”. Los analis as han p es ado mucha más a ención al pos ulado de homocedas icidad (iii). En si uaciones de a ianza no cons an e (he e ocedas icidad),la écnicadelosmínimoscua - d ados aún puede emplea se, pe o u ilizando ac o es de ponde ación (Go y Hooge b ug- ge, 1995; Desimoni, 1999). Ga den y col. (1980) y Schwa z (1979) han conside ado el p o- blemadela a ianzanouni o meenlacons uccióndecu asdecalib ado. LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 Comenza emos po es udia el modelo de ajus e más sencillo –y aplicado– que el ana- lis a puede ensaya : El lineal. Supongamos que en e dos a iables exis e (Hun e , 1981) la elación lineal (3) hb bx=+ 01 donde b0yb1sonlos alo esdela o denadaen el o igen y la pendien ede la ec a,yhyx,los alo es e dade os desconocidos de la espues a analí ica y la concen ación de anali o cali- b ado, elacionados con los alo es expe imen ales según (4) hexl=+ =+yx siendo eyluna medida del e o alea o io asociado a nues o in en o de medi hyx. Una ez es ablecido el con ol de calidad en el p oceso de medida, los e o es ipo “blunde ”, pé didas no alea o ias de con ol y e o es sis emá icos (Blanco y Ce dá, 1988) no se con emplan. A o unadamen e, como ya hemos indicado, la medida de la concen ación del anali o puede conside a se exen a de e o (i) y, po an o, l»0ome- jo le,con lo cual el modelo po ajus a se ía (5) yx ii 101 =+ +bb e Po o a pa e, si acep amos la dis ibución no mal del e o en la yi(ii), la unción de dis- ibución de un alo cualquie a yial ededo del alo e dade o end á dada po la campa- na de Gauss (6) sp h s (y y i ii i )exp () =-- æ è ç ç ö ø ÷ ÷ 1 22 1 2 2 La dis ibución conjun a independien emen e de odos los alo es de yse á (7) sp h s (y y y ii n ii i )() () exp () == -- æ è ç ç ö ø ÷ ÷ PP 1 22 1 2 2 pues o que (8) eh iii y 22 =-() y si exis e homocedas icidad (iii) (9) ss s 1 22 22 ===K con lo cual (10) sp e s (y nn i )() exp=- æ è çö ø ÷ æ è ç ç ö ø ÷ ÷ å 1 2 1 2 2 2 Nos in e esa ajus a el modelo a los da os, de mane a que la dis ibución conjun a ome un alo máximo, es deci , se des íe lo mínimo de los alo es e dade os. Pa a ello bas a A.G. González, Ana Sayago y Agus ín G. Asue o Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 con que ei 2 åsea mínimo. Desg aciadamen e, abajamos con una mues a de amaño ini o y desconocemos los alo es de b0,b1,hi, po lo que debemos con en a nos con sus es imacionesb0,b1,yi. De es e modo, en luga de hace mínima la suma ei 2 å, debe hace se mínima la can idad ($)yy ii i -= åå 22.Alnúme o i, di e encia en e el da o expe imen- alyiyel alo es imado $ yi,selellama esidualy,pa anues os p opósi os, debe á dis ibui - se al como ei.Asípues,como (11) Qybbx ii =-- å() 01 2 de la condición necesa ia de mínimo (12) ¶ ¶ ¶ ¶ Q b Q b 01 00== ob enemos las ecuaciones no males de la eg esión lineal, de las que se calcula ácil- men e los es imado es (13) bxxyy xx ii i 12 =-- - åå ()() () (14) bybx 01 =- Sin emba go, las cosas no siemp e son an sencillas. A eces, los da os se acomodan apa en- emen ea unalínea ec acuandoenla ealidad adolecende cu a u a. El ojo humano eco- noce con mucha más acilidad que cualquie écnica de p ocesado ma emá ico la p esencia de conduc as di e en es en e g upos de pun os en una g an can idad de casos. Po ello, la ep esen ación g á ica de la unción de espues a es un paso esencial pa a de ec a cu a u- as. De odos modos, la bondad del ajus e debe con on a se con algún p ocedimien o ma- emá ico. Los analis as, pa a es ima la bondad del ajus e han u ilizado demasiado a menu- do el coe icien e de co elación de inido po (15) xxyy xx yy ii ii =-- -- å åå ()() ()() 22 es ando los alo es de comp endidos (Koch, 1984) en e –1 y +1. Sin emba go, el empleo an di undidodel coe icien e deco elación ha sido ne as o, de- bido al poco alo eal de es e pa áme o pa a de ec a cu a u a (AMC, 1988; Thomp- son, 1990; Asue o y col., 2006). Como indica Hun e (1981), en la eo ía es adís ica, la co elación es la medida de la asociación en e dos a iables alea o ias pe o, en nues o caso, xyhes án uncionalmen e elacionados. Co elación, en su sen ido ma emá ico-es- adís iconoexis e,ylos alo esde p óximos a+1 o–1 p opo cionan un ambien e de es- pe abilidad, pe o no mucho más. Las cu as de calib ado analí icas dan a menudo un alo muy p óximo a = 1,000 aunque haya di e encia signi ica i a en e los pun os de la lineali- dad. Gene almen e, se conside a que 100 2p opo ciona una es imación del %de a iación LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 de los pun os expe imen ales a la linealidad (K älse h, 1985). Así, un alo de = 0.980 in- dica que el 96% de la a iación es á explicado po el modelo, pe o debemos eco da , sin emba go, que ese 4% es an e de la a iación no explicada pod ía concen a se en una pe- queña po ción de la cu a. En consecuencia, el coe icien e de co elación es un medio poco sensible pa a es ima la calidad del ajus e de una ec a de calib ado, y su uso disc iminado puede conduci a conclusiones e óneas. Algunos analis as u ilizan ensayos es adís icos pa a sabe si el coe icien e de co elación es signi ica i o, como el de S uden (Mille and Mille , 2000) (16) n =- - 2 12 o la ans o mación de Fische (Akhnaza o a y Ka a o , 1982) (17) z =- 1 21 In 1+ pe o no po ello se conju a el pelig o, pues puedenindica co elación cuando no la hay. Más in e esan e es el análisis de la a ianza del ajus e (Sha a y col., 1986; Aknaza o a y Ka a o , 1982; AMC, 1994), calculando la a ianza debida al modelo y la a ianza esi- dual. Se puede aplica el c i e io Fpa a ensaya la bondad del ajus e. En el caso de una ec a sin e o F = ¥y en el caso de independencia en e yyx,F=0. Sin emba go, es e en- sayo po sí mismo no es e idencia (Sha a , 1986) de que el modelo sea el adecuado. Elanalis a necesi a, pues, algunosmedios, pa a comp oba si las suposicionesii y iiise cum- plen, así como pa a asegu a se de que el modelo escogido es el que mejo se ajus a a los da- os expe imen ales. Pa a ello cuen a con una he amien a muy álida, el análisis de esidua- les (D ape y Smi h, 1998; Meloun y col., 2002). Si es udiamos el compo amien o de los esiduales después de habe ob enido la ec a de eg esión lineal y ep esen amos ales esi- duales en e a los alo es de x, pueden obse a se cua o si uaciones (Bello o y Sokoloski, 1985) ( igu a 1). El compo amien o I indica que el modelo u ilizado e a el adecuado y los esiduales se han dis ibuido a lo la go del in e alo de medida con media ce o y des iación cons an- e. El compo amien o II apa ece cuando la ecuación u ilizada pa a el ajus e no es la adecuada y pod ía necesi a p obablemen e, é minos de o den supe io pa a el ajus e comple o. La si uación III es ípica cuando no exis e uni o midad en la a ianza de y.El sis ema es he e ocedás ico, y la dispe sión disminuye con x, como indica la igu a, aunque ambién pod ía aumen a o oma la o ma de una paja i a. El compo amien o IV se e ie- e a una si uación en la que los e o esdependen de alguna a iable que aún no ha sido des- cubie a, ulne ando la suposición de independencia del e o . Pa a co egi es a endencia deben conside a se o as a iables que áci amen e pudie an in e eni en el p oceso. De odos modos, a eces, las si uaciones eales no son an cla as como las que idealmen e se A.G. González, Ana Sayago y Agus ín G. Asue o Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 mues an en la igu a. El compo amien o I ya hemos dicho que co esponde al caso de un ajus e pe ec o en que los esiduales se dis ibuyen según Ni (, )02 s. Pa a examina ma emá icamen e si los esiduales se dis ibuyen como hemos supues o exis en nume osos ensayos. Los más sencillos consis en en ep esen a la cu a de e- cuencia acumula i a (%) en e al alo del esidual, que da la amilia cu a en o ma de So una ec a si se aza sob e papel de p obabilidadno mal (Mille y Mille , 2000; Shapi- o, 1990). Mé odos más especí icos son el de Kolmogo o -Smi no (Mille y Mille , 2000; Ka eman y Pijpe s, 1993), el de Bowman yShen on de lospa áme os de sime ía y ku osis (Bowman y Shen on, 1975) y el de Ande son-Da ling (Pe i , 1977) de los pe cen iles. Un es nopa amé ico muyú il pa a comp oba silos esiduales se ajus anbiena lassuposicio- nes de una dis ibución al aza , y que se usa mucho pa a de ec a cu a u as en ec as de ca- lib ados, es el de Wald-Wol owi z (Mille y Mille , 2000). Se de ine “ is a” ( un en la li e a- u a anglosajona) como cada secuencia de signos dis in os que apa ecen sepa ados cuando seobse aelsignodelos esidualesa alo esc ecien esdex(Thompson,1982). Así, enla si- guien e se ie de esiduales: ++++------++ hay es is as. E iden emen e, si exis e una secuencia no alea o ia de signos + y - apa ece á un núme o meno de is as que en el caso de dis ibución alea o ia (o en algún caso, mucho mayo , como sucede en las a iaciones sis emá icas pe iódicas). El ensayo an e io nos indica si los esiduales se dis ibuyen al aza . No obs an e, puede se que aunquesudis ibución seaalea o ia, no seano mal. Yahemosindicado quemu- chos expe imen os conducen a dis ibuciones no no males del e o . Los es udios Mon- e-Ca lo indican que el es imado decen alización en mínimos cuad ados,la media, es uno de los más pob es es imado es en e a la a iedad de dis ibuciones de e o di e- en es a la no mal (S aud e y Shea he , 1990; Rousseeuw, 1991). La pues a a pun o de los es imado es de mínimos cuad ados cuando se iola la imposición de no malidad ba- sados en es adís icas obus as es de una g an impo ancia (Rousseeuw, 1991; Walczak y Massa , 1998; Massa y col., 1986; Danza , 1989; Thompson, 1989). Un es imado se llama obus o (Rousseeuw, 1991) cuando es insensible a des iaciones sua es de las su- posiciones es ablecidas, y solo es lige amen e ine icien e ela i o a los mínimos LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 Figu a 1. Rep esen ación de los esiduales en e a alo es de la a iable cuad ados cuando las suposiciones se cumplen. Así, los mé odos obus os p opo cionan p o ección en e a las dis ibuciones no no males y son además esis en es a la p esen- cia de esul ados sospechosos (ou lie s en la li e a u a anglosajona) en los da os (Walczak y Massa , 1998). Si después de habe ajus ado nues o modelo a los da os obse amos una dis ibución de los esiduales como en el caso III nos encon amos an e una iolación del pos ulado de homocedas icidad. En ales casos, la aplicación di ec a de la écnica con encional de los mínimos cuad ados puede conduci a conclusiones e á icas (D ape and Smi h, 1998). Es po ello que se econoce en la li e a u a química que usualmen e la a ianza no es cons an e en análisisquímico (Ga den y col., 1980). Como indica Schwa z(1979), aun- que la suposición de homocedas icidad es álida pa a muchos p ocesos analí icos, hay algunas ípicamen e he e ocedás icas, que incluyen odos los mé odos basados en las medidas de cuen as, así como los mé odos o omé icos y c oma og á icos en cie os casos. E ec i amen e, en de e minadas ocasiones, la he e ocedas icidad puede apa e- ce en cualquie mé odo analí ico, como en espec o o ome ía de abso ción y ol ame- ía de edisolución anódica, c oma og a ía, elec o o esis capila (Baumann y Wä zig, 1995), espec oscopía deplasmaacoplado po inducción(Ke ka yBzik, 2000), yo os. Una ez hemos obse ado dicha endencia en los esiduales, se comp ueba la he e oce- das icidad (a la ez que se soslaya) median e eplicado de los alo es de pa a un alo dado de x. Los ensayos de Ba le o Coch an (Akhnaza o a y Kaa o , 1982; Sayago and Asue o, 2004; UNE 82009-2, 1999), son su icien emen e igu osos. Analicemos aho a la si uación co espondien e al caso IV en la que se obse a una enden- cia de los esiduales cuya causa es la dependencia de una a iable aún no analizada. Se a a de una si uación que po su cu iosidad e impo ancia amos a acla a con un ejemplo. Cuando se es udia la solubilidad del Diazepan en p opilenglicol (Bello o y Sokoloski, 1985), la elación ob enida en e la concen ación y la abso bancia (ley de Bee ) ue: C = –0,034084 + 0,117424 A ( = 0,999).Sinemba go,al ep esen a los esiduales espec- o al o den numé ico en que cada mues a ue medida, se obse a una si uación ípica del casoIV. Si al ep esen a los esiduales en e a una a iable conside ada o no, se obse a una endencia como és a, debe sospecha se la dependencia de una a iable ocul a o no, elacio- nadacon lasan e io es.Enel caso delDiazepam, es a ep esen ación sugie e que los e o es no son independien es, pudiendo es a elacionados con el iempo de alguna mane a des- conocida, ya que los esiduales pa ecen se unción del o den de las medidas. Si el iempo se incluyeenelmodelo,seob ienelaecuaciónC = –0,071217 + 0,118201 A + 0,0003625566 ( = 1,00). Los esiduales así ob enidos ep esen ados en eala a iable iemposiguen una ep esen ación ípica de adecuación al modelo como el caso I. G acias al análisis de esiduales se de ec a la in luencia de la a iable iempo que de o o modo hubiese pasado inad e ida. Un modelo esidual dependien e del iempo, como el que hemos is o, puede indica que se es á p oduciendo una se ia A.G. González, Ana Sayago y Agus ín G. Asue o Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 con aminación, o que la uen e de luz decae con el iempo. El modelo esidual indica que exis e una a iable dependien e del iempo, pe o no indica po qué exis e esa dependencia. Cuando los esiduales ob enidos al ajus a el modelo lineal a nues os da os mues a un compo amien o como II, es o nos indica, desa o unadamen e, que el modelo suge i- do no se adecua a la ealidad y que son necesa ios é minos adicionales en xpa a asegu- a el ajus e a los da os analí icos. En es e caso, los esiduales no se dis ibuyen al aza , sino que mues an una disposición cónca a o con exa. El ensayo de Wald-Wol owi z (Mille and Mille , 2000) nos suge i ía que exis e una cu a u a, y que nues a unción de espues a no es lineal en x. Si aplicamos la condición de mínimo a la dis ibución conjun a en el caso en que las a ian- zas no son cons an es, la exp esión a minimiza se ía (/)es ii 2 å. En si uaciones eales, a ando con esiduales, es con enien e de ini (Asue o and González, 1989) una can idad denominada peso o ac o de ponde ación, que deno a emos po wi, asociado con una obse - ación yi, y de inido po (18) wi i =s s 0 2 2 El peso de una obse ación es in e samen e p opo cional a la a ianza. El é mino s0 2es simplemen e un ac o de p opo cionalidad que coincide con la a ianza de peso uni- dad, y que muchos analis as (Cuad o-Rod íguez y col., 2001) oman a bi a iamen e como unidad. El obje o de in oduci los pesos es es abiliza la a ianza de los esidua- les. En el caso del modelo ponde ado end íamos (19) wy w w w ii i i ii =++bbe 01 y po an o (20) () a a ( )ww w c e ii i i ii i i ees s sss===== 20 2 2 20 2 Aho a, la condición de minimización es (21) Qwyy ii i =-= å($)min 2 que conduce a exp esiones simila es a las deducidas pa a la eg esión lineal simple (22) bxxyy xx ii i 12 =-- - åå ()() () (23) bybx 01 =- donde LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 (59) VxP x P x Px k ikiki ki - -- - =åå 1 12 1 2 () () () Los alo es de ajse calculan ácilmen e (60) ayP x Px j ij i ji =å å () () 2 Pa a encon a la ecuación de eg esión po el mé odo de ap oximaciones sucesi as, se calculan las a ianzas esiduales pa a la eg esión de o den kdonde Qkes la suma de los cuad ados de los esiduales, que se calcula po la ecu encia: (61) QQ a Px kk k k i =- -å 122 () El p e equisi o (Akhnaza o a y Ka a o , 1982) es queQyy i 02 =- å() . Cuando al aumen- a el g ado del polinomial,ss kk+> 1 22 ,median eelensayoF,sedapo e minadoelp oceso. Alse o ogonaleslospolinomiales,lama izde co a ianza esdiagonalysus é minosson (62) Vs sC jj aj kjj == -221 Haciendoun esumende lo is o has a aho a, elmé odo delossegmen os ec ilíneospuede se ú il en los casos de da os al amen e p ecisos y cu as de calib ado de poca cu a u a. El mé odo de los es pa áme os es siemp e in ínsecamen e inexac o pa a cu as no lineales de ele ada cu a u a, a menos que se sepa la o ma co ec a de las unciones. En gene al, el mé odo de ajus e polinomial p opo ciona lamayo con ianzapo queu ilizael es Fpa a ajus a ap opiadamen e los pun os, aunque se a a, sin luga a dudas, del modelo más complicado. A pesa de las g andes en ajas y nume osísimas aplicaciones de los polinomiales o ogona- les, no son enabsolu o el a ma de ini i a. Rice (1964) ha p opues o unciones polinomiales del ipo (63) Fx ax bx ii ii ()=å å que ienen un g ado de lexibilidad mucho mayo que los polinomiales, pues una un- ción acional de g ado ela i amen e bajo puede ajus a se a una o ma que nunca po- d ía ap oxima se de mane a e ec i a median e el uso de polinomiales de g ado bajo o medio. Es e ipo de unción es más di ícil de e alua que un polinomial, siendo necesa- io el uso de la eg esión no lineal. O o mé odo de ajus e poco usado pe o muy ecomendable (Jos y Rock, 1954) es el de los polinomiales o ogonales discon inuos de Ve in, análogos a los de Legend e, que se exp esan siemp e en unción de un pa áme o que es la longi ud en e pun os A.G. González, Ana Sayago y Agus ín G. Asue o Re is a Tumbaga (2006), 1, 107-128 equidis an es. Se a a de un p ocedimien o muy simila al de la Se ie de Fou ie solo que u iliza un núme o ini o de pun os. El incon enien e es la necesidad de conoce los pun os equidis an es, pe o es o puede soslaya se median e lec u a a ojo de la cu a diseñada. Es os dos úl imos ipos de ajus e si en pa a cu as de calib ado, donde se supe ponen dos o más enómenos. A í ulo de ejemplo, en luo ime ía, las ep esen aciones de la in ensidad de emisión en e a la concen ación son p ác icamen e lineales en disolu- ción diluida, pe o mues an cu a u a nega i a a al as concen aciones debido a la p e- sencia de a e ac os óp icos o a la no adecuación del modelo que p edecía linealidad. Comoambos e ec ossonindependien es, en lap ác ica pueden apa ece cu asdemuy di e en easpec o, ya que sesupe ponendos omás p ocesos. Eslógico pensa que noha- b á ninguna unción algeb aica que, po sí sola, sea capaz de ajus a comple amen e los da os. La mejo solución se ía al ez ajus a los pun os a una cu a que consis ie a en a ias secciones unidas de di e en e o ma ma emá ica. És e es exac amen e el undamen o del ajus e po unciones Spline (P ice y Simonnen, 1962; Ahlbe g y col., 1967; Hwang y Wine o ne , 1988). En la p ác ica, los Splines cúbicos (F igie i y Rossi, 1979) son los más empleados, y ap oximan los da os a una se ie de ecuaciones cúbicas. Es os “eslabo- nes” cúbicos se supe ponen en ppun os de in e polación (Kno s en la li e a u a anglosajo- na) y es esencial que los Splines mues en una ansición con inua en ales pun os. Es a con inuidad debe segui la an o la unción como sus m–1 p ime as de i adas. Un Spline Cúbico comple o iene p–1 eslabones, cada uno de ellos con coe icien es (S=a+bx+cx 2 +dx 3). Así, es necesa io calcula 4x (p – 1) coe icien es. Es e p ocedimien o ha sido u iliza- do exi osamen e en adioinmunoensayo, c oma og a ía gas-líquido y espec ome ía de ab- so ción a ómica (Mille and Mille , 2000). Ag e denbos,J.(1979).Calib a ionin quan i a i e-analysis.1.Gene al-conside a ions. Analy ica Chimica Ac a, 108, 315-323. 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