Caracterización molecular de ácaros rinonísidos

Caracterización Molecular de Ácaros Rinonísidos María Rodríguez Plá Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla Trabajo experimental. Línea de investigación: Biología Molecular de Parásitos Trabajo Fin de Grado. Grado en Farmacia “Caracterización Molecular de Ácaros Rinonísidos” Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla MARÍA RODRÍGUEZ PLÁ Tutor: Manuel de Rojas Álvarez Sevilla, 4 de Julio de 2016 ABSTRACT Mites of the family Rhinonyssidae are permanent parasites of the nasal cavities of birds. They are obligate hematophagous endoparasites. The family Rhinonyssidae currently includes about 500 described species arranged in eight genera. In the present work a complete morphobiometrical study of two populations of the genus Tinaminyssus isolated from Streptopelia turtur and Streptopelia decaocto (Aves: Columbiformes) were carried out. Furthermore, the complete internal transcribed spacer 1, 5.8S gene and internal transcribed spacer 2 (ITSs) of the ribosomal DNA, and a fragment of the mitochondrial gene cytochrome oxidase I (COI) from five taxa belonging to Tinaminyssus (Tinaminyssus sp. from S. turtur, Tinaminyssus sp. from S. decaocto, Tinaminyssus melloi, Tinaminyssus columbae and Tinaminyssus minisetosum) were sequenced to examine the level of sequence variation and its utility in phylogeny estimation. Our data show that these molecular markers can help to discriminate between species and populations included in the “melloi complex” (T. streptopeliae and T. streptopelioides), which are morphologically very close and difficult to separate by classic methods. A comparative study with sequences from other rhinonyssid mites previously published was also carried out. The resulting phylogenetic tree inferred from the ITSs and a fragment of the mitochondrial gene COI sequences obtained in this work, shows differences between populations of Tinaminyssus sp. from S. turtur and S. decaocto, so we can considerer they are different species. Our study suggests the usefulness of COI to address taxonomic and phylogenetic questions in this group of mites. Key words: mites, molecular systematics, phylogeny, cytochrome oxidase, ITSs. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES….………………….…………… 1 2. OBJETIVOS………………………….…………………………………....... 9 3. MATERIAL Y MÉTODOS………………………….…………………….. 10 3.1 MATERIAL………………………………………………………….…... 10 3.2 MÉTODOS………………………………………………………………. 10 3.2.1 ESTUDIO MORFOLÓGICO………………………………….. 10 3.2.2 ESTUDIO MOLECULAR…………………………….…….….. 13 4. RESULTADOS……….……………………………………........................ 19 4.1 ESTUDIO MORFOLÓGICO Y BIOMÉTRICO………………..…… 19 4.1.1 ESTUDIO MORFOLÓGICO…………………………….……. 19 4.1.2 ESTUDIO BIOMÉTRICO…………………………………..…. 23 4.2 ESTUDIO MOLECULAR……………………………………………… 24 5. DISCUSIÓN……………………………………………………………..…… 31 6. CONCLUSIONES…………………………………………………………... 34 7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………. 35 - 1 - 1. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES Los ácaros rinonísidos (familia Rhinonyssidae) son endoparásitos hematófagos que se localizan en las fosas nasales de las aves, si bien en ocasiones alcanzan el aparato respiratorio de éstas, las cuales sufren daños como consecuencia de los hábitos alimenticios de los ácaros. Se encuentran preferentemente en la membrana que recubre los cornetes nasales, sin embargo, a menudo se encuentran también en la porción anterior de los sacos nasales, laringe, tráquea, pulmón, conjuntiva y sacos aéreos (Amaral y Rebouças, 1974). En la actualidad la familia Rhinonyssidae comprende ocho géneros, que incluyen alrededor de 500 especies (Morelli y Spicer, 2007; Knee, 2008). El encuadramiento taxonómico de cada una de ellas se ha llevado a cabo, tradicionalmente, teniendo en cuenta sus características morfológicas (Strandtmann, 1951; Fain, 1957; Fain, 1960; Feider y Mironescu, 1972; Pence, 1975; Butenko, 1984; Dimov, 2012; Bernardon y cols., 2013). No obstante, el valor taxonómico de estos caracteres cambia considerablemente en función del género o el grupo de especies de que se trate (Fain, 1960). También es frecuente que en grupos de especies que parasitan hospedadores relacionados taxonómica o incluso ecológicamente, ciertos caracteres muestren una gran variabilidad por lo que las especies parecidas entre sí llegan a constituir una gradación entre extremos que hace muy difícil el encuadramiento taxonómico correcto, y provocan los denominados complejos de especies como el "grupo coniventris" del género Rhinonyssus (Fain, 1963), "grupo melloi" del género Tinaminyssus (Fain, 1962) o el "grupo sairae" del género Ptilonyssus (Pence y Casto, 1976). Se deduce, por lo tanto, que la identificación de especies en esta familia es, en algunos casos, difícil y en otros, en que la similitud morfológica es muy marcada, casi imposible, por lo que la sistemática de estos ácaros es a veces complicada y muchas de las especies de la familia presentan problemas de clasificación. Este hecho se debe a que la taxonomía clásica de estos parásitos se apoya en criterios exclusivamente morfológicos. Por ello, es fácil que surjan importantes dificultades en la clasificación, sobre todo cuando el taxónomo se enfrenta a grupos de especies muy parecidas, que proceden de hospedadores muy próximos entre sí o incluso comparten la misma especie hospedadora. A partir de la década de los noventa del pasado siglo, los ácaros parásitos han sido objeto de estudios encaminados a la resolución de problemas taxonómicos y al establecimiento de relaciones filogenéticas mediante técnicas moleculares. Los ixódidos, debido a su interés sanitario, han sido quizá el grupo más ampliamente tratado. En estos trabajos, las regiones del ADN más utilizadas para la resolución de las diferentes problemáticas planteadas, resultaron ser - 2 - distintos genes del ADN mitocondrial (16S, 12S y COI) y los genes ribosómicos nucleares (18S, 5.8S y 28S) junto con los espaciadores internos transcritos (ITS1 y ITS2). En 1994 se publica el primer trabajo sobre ácaros donde se utilizan marcadores mitocondriales para inferir filogenia. Black y Piesman, 1994, proponen el uso de la variación de la secuencia del gen mitocondrial 16S ADNr para el estudio filogenético de especies de garrapatas pertenecientes a las familias Ixodidae y Argasidae. Estudian sus secuencias e infieren una filogenia usando métodos de distancias y de máxima parsimonia. El análisis del ADNmt se convierte en una herramienta útil para el estudio de poblaciones animales. Navajas y cols., 1994, estudian la diversidad intraespecífica entre ácaros de la especie Mononychellus progresivus (Acari: Tetranychidae) de distintas zonas geográficas, en base a caracteres morfológicos, comportamiento debido al factor ambiental y compatibilidad reproductora, junto con el análisis de marcadores más variables como es el caso del gen mitocondrial de la COI y el ITS2 nuclear ADNr. En 1995, Rich y cols., realizan un análisis de la distribución geográfica en Norteamérica de las garrapatas pertenecientes al complejo Ixodes ricinus, transmisoras de la enfermedad de Lyme y de la babesiosis humana. Para ello, se basan en el análisis del gen 16S ADNr mitocondrial de las garrapatas recolectadas en distintas regiones del país. Los criterios morfológicos usados para distinguir las casi 250 especies del género Ixodes son, en muchos casos, ambiguos. En 1995, Caporaley cols., estudian la filogenia de 9 especies pertenecientes a ese género. Para ello secuencian el gen 16S ADNr mitocondrial y construyen la filogenia usando los métodos de máxima parsimonia y neighbour-joining, obteniendo árboles con topologías similares. Norris y cols., 1996, examinaron las variaciones en las secuencias de los genes mitocondriales 16S y 12S, para establecer relaciones filogenéticas entre poblaciones de Ixodes scapularis de distintas zonas del este de Estados Unidos. Estas poblaciones mantienen entre ellas variaciones morfológicas y biológicas. Tras el análisis filogenético llegaron a la conclusión de la existencia de dos poblaciones genéticamente diferentes, una de ellas limitada siempre a la zona sur del país. Asimismo se dedujo que no existía evidencia de aislamiento reproductivo entre las dos poblaciones. Navajas y cols., 1996, secuenciaron parte del gen que codifica para la citocromo oxidasa I (COI) mitocondrial en 20 especies de ácaros fitófagos de gran importancia económica, pertenecientes a 9 géneros y 2 familias (Tetranychidae y Tenuipalpidae). Por un lado compararon las secuencias usando el método de máxima verosimilitud, y por otro estudiaron los caracteres morfológicos y la forma de vida de dichos ácaros como la reproducción y adaptación a la planta hospedadora. Concluyen que aunque - 3 - existe una correlación entre los datos moleculares obtenidos y la clasificación tradicional basada en caracteres morfológicos, deben realizarse revisiones taxonómicas. En ese mismo año, la utilidad del gen mitocondrial que codifica para la COI también fue demostrada por Salomone y cols., 1996. Estos autores estudiaron la variación en la secuencia del gen para cuatro poblaciones de ácaros esteganacáridos, dos de las cuales corresponden a Steganacarus anomalus, una a S. magnus y otra a S. hirsutres. El estudio sugirió que S. magnus y S. anomalus no eran especies distintas ya que una de las poblaciones de S. anomalus era más similar a la población de S. magnus que las de S. anomalus entre sí. Norris y cols., 1997, amplificaron aproximadamente 300 pares de bases del gen 16S del ADN mitocondrial, de especímenes pertenecientes a Ixodes spinipalpis e Ixodes neotomae, y vectores de Borrelia burgdorferi, en el noreste de América. En 1998, Black y Roehrdanz secuencian completamente el genoma mitocondrial de una garrapata Prostriata (Ixodes hexagonus) y de otra Metastriata (Rhipicephalus sanguineus). Crosbie y cols., 1998, también secuencian unos 300 pares de bases del gen mitocondrial 16S ADNr de 28 garrapatas, representantes de 9 especies, pertenecientes al género Dermacentor. Hasta 1998 no aparece el primer trabajo de autores españoles sobre estudios filogenéticos de ácaros. Es realizado por Mangold y cols., 1998b, y el objeto del mismo fue establecer relaciones filogenéticas entre especies de garrapatas europeas pertenecientes a la familia Ixodidae: Metastriata. En este mismo año, Navajas y cols., 1998, estudian la influencia del aislamiento geográfico en la diversidad molecular. Para ello analizan la variación de dos marcadores genéticos (el ITS2 ribosómico y el gen mitocondrial que codifica para la COI) en poblaciones de una misma especie con diferente procedencia, ya que distintas regiones del genoma pueden tener diferentes modos de evolución y divergencia molecular. Toda y cols., 2000, analizan la secuencia del gen que codifica para la COI de cuatro especies de Panonychus recogidas en Japón, con el fin de inferir relaciones filogenéticas. Beati y cols., 2001, determinan las relaciones filogenéticas entre 36 especies de garrapatas duras pertenecientes a 7 géneros. Ese mismo año, Dabert y cols., 2001, estudian las relaciones filogenéticas entre ácaros de la subfamilia Avenzoariinae basándose en 41 caracteres morfológicos y 246 caracteres moleculares del fragmento del gen mitocondrial 16S ADNr. Gylfe y cols., 2001, intentan estudiar la dispersión de Borrelia garinii y las relaciones filogeográficas de la garrapata Ixodes uriae. Para ello utilizan el análisis de parsimonia de las secuencias del gen mitocondrial 16S ADNr y del segundo espaciador interno transcrito (ITS2), de especímenes recolectados tanto del hemisferio norte como del sur. - 4 - Söller y cols., 2001, establecen relaciones filogenéticas de 17 especies de ácaros terrestres (Acari: Prostigmata: Parasitengona) analizando unos 408 pares de bases del gen mitocondrial que codifica para la citocromo oxidasa I. En 2002, Salomone y cols., usan el gen COI mitocondrial para reconstruir relaciones filogenéticas en representantes del género Steganacarus en las Islas Canarias. Un año más tarde, Navajas y cols., 2003, estudian dos regiones del ADN, una mitocondrial (COI) y otra nuclear (ITS2), de dos especies de ácaros estrechamente relacionados, pero aislados desde el punto de vista reproductivo, Tetranychus urticae y T. turkestani. Tras su estudio, concluyen que las dos especies tienen un origen monofilético cuando analizan el ADN ribosomal nuclear y parafilético con el análisis del ADN mitocondrial. Xu y cols., 2003, para estudiar la filogenia de los representantes del complejo Ixodes ricinus, secuencian dos fragmentos del gen mitocondrial 16S ADNr de once especies del complejo y de otras especies pertenecientes al género Ixodes. En lo que respecta a los genes ribosómicos, éstos han sido los más usados en estudios filogenéticos de ácaros, ya que incluyen zonas muy conservadas (18S, 5.8S y 28S) y otras muy variables como los ITSs, por lo que constituyen marcadores muy versátiles. Así, Navajas y cols., en 1992 es una de las primeras investigadoras en acometer el estudio filogenético de ácaros prostigmatas, para lo que analiza el nivel de variabilidad de las secuencias del ITS2 en seis especies de Tetranychidae pertenecientes a dos géneros. Ese mismo año, Wesson y cols., 1992, estudian la secuencia y estructura secundaria del gen 5.8S ARNr de la garrapata Ixodes scapularis. En 1994, Osakabe y Sakagami, analizan la longitud de los fragmentos de restricción del ADNr de tres especies de ácaros del género Panonychus. Y en un trabajo publicado en 1995, Mc Lain y cols., investigan la evolución dentro de la secuencia ITS2 para garrapatas pertenecientes a las especies Ixodes scapularis e I. pacificus, miembros del complejo I. ricinus. Zahler y cols., 1995, estudian la variabilidad genética comparando las secuencias del segundo espaciador interno transcrito (ITS2) de Dermacentor reticulatus y D. marginatus (Acari: Ixodida), con iguales características morfológicas, lo que sugiere una posible coespecificidad entre ambas. Fenton y cols., 1996, utilizan la PCR/RFLP, que consiste en la amplificación por PCR de un fragmento de ADN y posterior digestión con enzimas de restricción, para estudiar diferentes especies de ácaros del género Cecidophyopsis parásitos de distintos tipos de vides. Para ello amplifican la región del ADN ribosómico que incluye ITS1, 5.8S e ITS2 y digieren el - 5 - fragmento obtenido con las enzimas de restricción Dde I y Mbo I, obteniendo distintos patrones de bandas para las diferentes especies. Barker y cols., 1998, basándose en la secuencia del ITS2 estudian 16 poblaciones de garrapatas de 5 especies muy cercanas, pertenecientes a dos géneros económicamente importantes: Rhipicephalus y Boophilus, morfológicamente muy parecidos. Tras el estudio de las secuencias y análisis filogenético, pudieron distinguir todas las poblaciones y especies de los géneros Boophilus y Rhipicephalus. Los autores españoles Mangold y cols., 1998a, publican un trabajo donde estudian las relaciones filogenéticas de ixódidos. Para ello secuencian el gen 18S ADNr de seis especies (Rhipicephalus pusillus, Boophilus anulatus, Dermacentor marginatus, Hyalomma lusitanicum, Haemaphysalis punctata e Ixodes ricinus) y realizan el alineamiento con las secuencias, obtenidas de Genbank, de otras trece especies. Demuestran la utilidad de este gen para estudios taxonómicos y filogenéticos a nivel supraespecífico y comparan sus resultados con los obtenidos por otros autores en este mismo grupo analizando otros genes. En 1999, numerosos investigadores se dedican de nuevo al estudio evolutivo dentro de la clase Acarina, utilizando la información genética. Así, basándose en el gen 18S ADNr, Dobson y cols., 1999, analizan las secuencias de 36 taxones (20 obtenidas de la base de datos de GenBank). También en 1999, Lava Kumar y cols., aplicaron la técnica de la PCR múltiple para la identificación de ácaros del género Cecidophyopsis. En 1999, Essig y cols., utilizaron el ITS2 para la diferenciación de 14 poblaciones de ácaros pertenecientes al género Chorioptes (Acari: Psoroptidae). Estas poblaciones fueron aisladas de distintos hospedadores procedentes de distintas zonas geográficas. Los genotipos obtenidos, implican la existencia de 2 grupos de poblaciones claramente diferenciadas e identificadas como C. texanus y C. bovis. Navajas y cols., 2000, estudian las diferencias genéticas entre poblaciones de Tetranychus urticae procedentes de distintas plantas hospedadoras y distintas zonas geográficas, incluyendo países como España, Francia, Túnez, Italia y Grecia. Se basaron en la electroforesis de aloenzimas, en la secuencia del ITS2 y en experimentos de compatibilidad reproductiva, comparando los resultados obtenidos con los ya existentes sobre T. urticae recogidos en plantas de otros países. De los resultados pudo deducirse que las poblaciones de España, Francia y Túnez eran genéticamente diferentes de las procedentes de los países del oeste del Mediterráneo (Italia y Grecia) y del resto estudiado anteriormente. Además existen niveles variables de incompatibilidad reproductiva entre ambos grupos, desde parcial hasta un total aislamiento reproductivo. - 12 - Figura 1.- Parámetros considerados para el estudio biométrico dorsal. Figura 2.- Parámetros considerados para el estudio biométrico ventral. - 13 - 3.2.2 Estudio molecular Como se ha expuesto en la introducción, podría cuestionarse la validez de los caracteres morfológicos utilizados en la clasificación específica. Este ha sido el motivo que nos ha impulsado a ensayar marcadores moleculares que nos permitan la diferenciación de especies muy próximas desde el punto de vista morfológico así como establecer relaciones filogenéticas en el grupo objeto de estudio. Con objeto de establecer el status taxonómico de T. streptopeliae y T. streptopelioides y establecer relaciones filogenéticas entre especies de la familia Rhinonyssidae, en este estudio se han amplificado los marcadores moleculares ITSs y COI de dos poblaciones de Tinaminyssus sp., procedentes de la tórtola común y de la tórtola turca. Para el estudio molecular de estas poblaciones, aisladas de hospedadores procedentes de varias zonas geográficas se ha procedido de la siguiente manera: 1. Extracción de ADN Cada tubo eppendorf de 1.5 ml que contenía los parásitos fue extraído del congelador, y con ayuda de un pistilo de plástico estéril, los especímenes fueron pulverizados. La extracción de ADN genómico de cada adulto se llevó a cabo mediante el protocolo del kit de extracción de DNA, RNA, and protein purification (MACHEREY-NAGEL). 2. Amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Para la amplificación del fragmento ITSs del ADNr se empleó la técnica de PCR utilizando el termociclador “Eppendorf AG”. Se fueron variando las concentraciones de los reactivos hasta llegar a las condiciones óptimas de la reacción (Tabla 1). REACTIVOS VOLUMEN CONCENTRACION FINAL ADN diana 8 µl --- Agua bidestilada c.s.p. 50 µl --- Tampón PCR (10X) 10 µl 1X MgCl₂ ( 50 mM) 6 µl 6 mM dNTPs (10 mM) 1 µl 0.2 mM Cebador directo (10 µM?) 1.5 µl 0.3 µM Cebador reverso (10 µM?) 1.5 µl 0.3 µM taq ADN polimerasa 0.5 µl 2.5 U Tabla 1.- Protocolo utilizado en la PCR para la amplificación del fragmento ITSs del ADNr. - 14 - Las condiciones utilizadas para la PCR han sido las de Rojas y cols., 2002 (Figura 3). Figura 3.- Representación esquemática de los distintos pasos de la PCR llevada a cabo para la amplificación del fragmento ITSs del ADNr. Igualmente, para la amplificación del fragmento del gen mitocondrial COI se empleó la técnica de PCR utilizando el termociclador “Eppendorf AG”. Se fueron variando las concentraciones de los reactivos hasta llegar a las condiciones óptimas de la reacción (Tabla 2). Tabla 2.- Protocolo utilizado en la PCR para la amplificación del fragmento del gen mitocondrial COI. Las condiciones utilizadas para la PCR han sido las de Kaewmongkol y cols., 2011, modificando la temperatura y tiempo de hibridación (Figura 4). Figura 4.- Representación esquemática de los distintos pasos de la PCR llevada a cabo para la amplificación del fragmento del gen mitocondrial COI. REACTIVOS VOLUMEN CONCENTRACION FINAL ADN diana 10 µl --- Agua bidestilada c.s.p. 50 µl --- Tampón PCR (10X) 5 µl 1X MgCl₂ ( 50 mM) 3 µl 3 mM dNTPs (10 mM) 1 µl 0.2 mM cada uno Cebador directo (10 µM) 5 µl 1 µM Cebador reverso (10 µM) 5 µl 1 µM taq ADN polimerasa 0.5 µl 2.5 U 94 ºC 72 ºC 53 ºC 94 ºC 72 ºC 4 ºC 45 seg 20 seg 30 seg 2 min 7 min 35 ciclos Desnaturalización Hibridación Elongación 96ºC 72 ºC 42 ºC 94 ºC 72 ºC 4 ºC 1 min 30 seg 30 seg 2 min 7 min 40 ciclos Desnaturalización Hibridación Elongación Figura 4.- Representación esquemática de los distintos pasos de la PCR llevada a cabo para la amplificación del fragmento del gen mitocondrial COI. - 15 - Los cebadores usados para la amplificación del marcador ITSs de los rinonísidos objeto de estudio fueron los descritos en Navajas y cols., 1999. - Cebador directo: FORITS, con secuencia: 5´AGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAG 3´ - Cebador reverso: REVITS, con secuencia: 5´ATATGCTTAAATTCAGGGGG 3´ Los cebadores usados para la amplificación del marcador molecular COI de los rinonísidos objeto de estudio fueron diseñados basándose en Folmer y cols., 1994. - Cebador directo: LCO1490, con secuencia: 5´GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3´ - Cebador reverso: HCO2198, con secuencia: 5´TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3´ En cada proceso de amplificación se incluye un control negativo de extracción y un control negativo de PCR (sin ADN) para detectar posibles contaminaciones. El patrón de pesos moleculares que se utilizó fue el DNA Molecular Weight Marker IX (72-1353 bp) que permite calcular los tamaños de los fragmentos obtenidos. Una vez finalizada la reacción de PCR, los productos obtenidos son visualizados en un gel de agarosa-TBE a una concentración del 2%. Finalmente, el gel obtenido se fotografía, para visualizar los fragmentos de ADN amplificados, sobre un transiluminador de luz ultravioleta a una longitud de onda de 360 nm, con una cámara digital Kodak (Gel Logic 100 Imagen System) asociada al programa Kodak 1D 3.6. 3. Purificación del ADN La purificación del producto de PCR se realizó utilizando el Kit de Promega, Qwizard®SV Gel and PCR Clean-Up System, que nos permitió extraer y purificar el ADN a partir del producto de PCR directamente. 4. Secuenciación Una vez que los fragmentos de ADN amplificados se purificaron, las muestras se enviaron a la empresa Stab Vida (Portugal) para que se procediera a la secuenciación de los mismos mediante un secuenciador automático (Licor) (Tabla 3 y 4). - 16 - Especie Nº Acceso Genbank Hospedador Tinaminyssus melloi H1 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus melloi H2 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus melloi H3 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus melloi H3 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia turtur (Osuna) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia turtur (Osuna) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia turtur (Osuna) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia decaocto (Sevilla) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia decaocto (Sevilla) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia decaocto (Sevilla) Tinaminyssus columbae H1 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus columbae H1 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Sternostoma turdi Pendiente Sturnus vulgaris (Portugal) Metaseiulus occidentalis NC_009093 --- Varroa destructor NC_004454 --- Especie Nº Acceso Genbank Hospedador Tinaminyssus columbae H1 AJ421829.1 Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus columbae H1 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus minisetosum H1 AJ421832.1 Columba palumbus (Badajoz) Tinaminyssus minisetosum H1 Pendiente Columba palumbus (Badajoz) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia turtur (Candón) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia turtur (Alcalá) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia turtur (Osuna) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia turtur (Osuna) Tinaminyssus sp. H2 Pendiente Streptopelia turtur (Osuna) Tinaminyssus sartbaebi AJ421831.1 Columba palumbus (Badajoz) Tinaminyssus melloi H1 Pendiente Columba livia domestica (Sevilla) Tinaminyssus melloi H2 Pendiente Columba livia domestica (Canarias) Tinaminyssus melloi H1 Pendiente Columba livia domestica (Utrera) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia decaocto (Sevilla) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia decaocto (Sevilla) Tinaminyssus sp. H1 Pendiente Streptopelia decaocto (Sevilla) Tinaminyssus sp. H2 Pendiente Streptopelia decaocto (Sevilla) Rhinonyssus vanellus AM238441.1 Vanellus vanellus (Isla Mayor) Rhinonyssus tringae AJ421838.1 Tringa totanus (Isla Mayor) Rhinonyssus neglectus AM238442.1 Calidris alpina (Isla Mayor) Rhinonyssus echinipes AM238443.1 Charadrius alexandrinus (Isla Mayor) Rhinonyssus echinipes AM238444.1 Pluvialis squatarola (Isla Mayor) Dermanyssus gallinae LC034953.1 --- Amblyseius tsugawai AB618063.1 --- Tabla 4.- Lista de taxa considerados en este estudio para el análisis de los fragmentos de COI, incluyendo los números de acceso en Genbank e información del hospedador. H: Haplotipo. Tabla 3.- Lista de taxa considerados en este estudio para el análisis de los fragmentos ITSs, incluyendo los números de acceso en Genbank e información del hospedador. H: Haplotipo. - 17 - Análisis de las secuencias El alineamiento y los análisis de las secuencias se llevaron a cabo utilizando el programa Clustal W 1.83 y Clustal X versión 2.0 (Larkin y cols., 2007), y MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versión 5.0 (Tamura y cols., 2011). Estas aplicaciones permitieron la comparación de las secuencias obtenidas entres sí, así como entre secuencias obtenidas de bases de datos de ADN (Genbank). Por otra parte de cada una de estas secuencias se han determinado sus longitudes en pares de bases, composición en bases nucleotídicas (mutaciones y gaps) y el porcentaje de variabilidad. Análisis filogenéticos A partir de los alineamientos de las diferentes secuencias se seleccionan los modelos evolutivos más adecuados al paquete de secuencias mediante el programa jModelest versión 0.1.1. (Posada, 2008) llevándose a cabo la selección de un modelo mediante el hierarchical likelihood ratio test (hLTRTs). A partir de estos resultados se reconstruyeron los árboles filogenéticos. Los métodos de reconstrucción filogenética pueden dividirse en dos categorías en base al tipo de datos que emplean (caracteres discretos o distancias) y si usan un método algorítmico o un criterio de optimización para encontrar la topología. Los métodos de distancia convierten los alineamientos de secuencias en una matriz de distancias genéticas en base al modelo evolutivo seleccionado, la cual es usada por el método algorítmico de reconstrucción para calcular el árbol (UPGMA y NJ). Estos métodos poseen la ventaja de que son muy rápidos. Para este tipo de análisis se utilizó el método del “vecino más próximo” (Neighbour- Joining) (Saitou y Nei, 1987). Este método agrupa a los OTUs (Operational Taxonomic Unit) más próximos y luego adiciona progresivamente los otros taxones alejados. Sin embargo, en cada paso del análisis, nuevas matrices de distancias se van originando a partir de la matriz original, de manera que la divergencia entre cada par de OTUs es ajustada basándose en la divergencia promedio de ellas con respecto al resto de los taxones. Para llevar a cabo este análisis se utilizó el programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versión 5.0 (Tamura y cols., 2011). Por su parte, los métodos basados en caracteres consideran cada sitio del alineamiento directamente y se construyen siguiendo dos pasos lógicos: - 18 - 1. Definir el criterio de optimización para evaluar cada posible topología, asignándole una puntuación con la que poder comparar cuantitativamente la fiabilidad de cada árbol en base al criterio de optimización. 2. Usar algoritmos de búsqueda específicos para calcular el valor de la función de objetividad y para encontrar el/los árboles con la mejor puntuación acorde a este criterio. Estos métodos son mucho más lentos que aquellos basados solo en algoritmos de agrupamiento debido a que tienen que hacer búsquedas en el inmenso espacio de topología para encontrar la(s) mejor(es). Sin embargo, aportan una mejor aproximación heurística para encontrar un árbol de evolución. Como método para la obtención de los soportes estadísticos de los arboles filogenéticos se realizó un muestreo repetitivo entre 100 y 1000 réplicas (bootstrap), el cual nos servirá para evaluar la fiabilidad de los árboles filogenéticos obtenidos. En el presente trabajo se usaron dos métodos basados en caracteres:  Método de máxima verosimilitud (ML, Maximum Likelihood): Este método es probabilístico, evalúa una hipótesis filogenética en términos de la probabilidad de que un determinado modelos evolutivo propuesto haya dado lugar o explique los datos observados (secuencias de nucleótidos) (Huelsenbeck y Rannala, 1997). Para llevar a cabo este análisis se utilizó el programa PHYML package (Guindon y Gascuel, 2003).  Inferencia bayesiana (IB): La inferencia bayesiana se basa en la relación cuantitativa existente entre la función de verosimilitud y las distribuciones anteriores y posteriores de probabilidad. Esta relación viene dada por el teorema de Bayes, así la inferencia bayesiana representa la probabilidad de que un árbol sea correcto. Para llevar a cabo este análisis se utilizó el programa MrBayes 3.1.2 (Ronquist y Huelsenbeck, 2003). - 19 - 4. RESULTADOS 4.1ESTUDIO MORFOLÓGICO Y BIOMÉTRICO 4.1.1 Estudio Morfológico Las especies del género Tinaminyssus parásitas de columbiformes presentan una gran uniformidad morfológica. Algunas especies son tan parecidas que su identificación morfológica es extraordinariamente difícil por métodos clásicos. Este es el caso de Tinaminyssus streptopeliae y T. streptopelioides que se han descrito sobre distintas especies de tórtolas. En este estudio se han considerado dos poblaciones aisladas de Streptopelia turtur y Streptopelia decaocto y de las cuales se ha realizado un estudio morfobiométrico completo. Así, se han tenido en cuenta características como el número, disposición y forma de los escudos dorsales y de los escudos genitales y/o anales, así como la quetotaxia dorsal y ventral del idiosoma (Figuras 7 y 8). Tynaminyssus sp. (Hospedador: S. turtur) En el vientre se observan tres escudos: esternal, muy reducido y en algunos especímenes casi imperceptible; genital, alargado y rodeado de estrías longitudinales; y anal, de aspecto piriforme y con tres sedas. La quetotaxia cuticular ventral del idiosoma la componen de 7 a 12 pares de sedas simples, con el ápice muy fino y de diferente longitud (Figura 5). Dorsalmente presenta dos escudos: podosomal y opistosomal. El podosomal es casi ovalado, mientras que el opistosomal presenta un contorno más irregular y de forma casi triangular siendo la parte inferior la más estrecha (Figura 5). Tynaminyssus sp. (Hospedador: S. decaocto) La morfología ventral y dorsal de esta población es casi idéntica a la de la anterior. Sólo pudo observarse una ligera variación en la quetotaxia ventral del idiosoma ya que el número de sedas ventrales varió entre 7 y 10 pares según el ejemplar (Figura 6). En ambas poblaciones hemos observado una amplia variabilidad tanto en la morfología ventral (Figura 7) como dorsal (Figura 8). - 20 - A 100 µm 100 µm 100 µm 100 µm Figura 5.- Tinaminyssus sp. (S. turtur) Hembra. A: ventral. B: dorsal. A B B Figura 6.- Tinaminyssus sp. (S. deaocto) Hembra. A: ventral. B: dorsal. - 21 - 100 µm 100 µm 100 µm 100 µm 100 µm 100 µm A B C D E F Figura 7.- Variabilidad en la morfología ventral de las hembras de Tinaminyssus sp. (S. turtur) (A, B y C) y Tinaminyssus sp. (S. deaocto) (D, E y F). - 28 - Los árboles filogenéticos generados con las secuencias de ITSs por el método de distancia Neighbour-joining (NJ) y los métodos de Máxima verosimilitud (ML) e Inferencia Bayesiana (IB) mostraron una topología similar, utilizándose la topología del árbol ML como consenso (Figura 9). Todas las especies del género Tinaminyssus se presentaron agrupadas en una rama bien apoyada. Además otros dos clados agrupan las especies pertenecientes al “grupo melloi” y otra a los del “grupo columbae” respectivamente. Dentro del “grupo melloi” se incluyen las poblaciones de Tinaminyssus aisladas de S. turtur y S. decaocto, las cuales aparecen separadas en dos ramas con un alto apoyo de boostrap. Por otra parte, las especies del género Rhinonyssus se presentan claramente separadas de las del género Tinaminyssus. De igual forma fueron obtenidos árboles filogenéticos con las secuencias de COI, presentándose la topología del árbol ML como consenso (Figura 10). En este caso, lo más significativo sigue siendo la diferenciación de los grupos “melloi” y “columbae” y la separación, en dos ramas bien apoyadas, de las poblaciones de Tinaminyssus aisladas de S. turtur y S. decaocto - 29 - Figura 9.- Árbol filogenético generado con las secuencias de ITSs de la familia Rhynonissidae. La historia evolutiva fue inferida usando los métodos de neighbourjoining (NJ), máxima verosimilitud (ML) e inferencia bayesiana (IB). El porcentaje de réplicas de árboles en los cuales los taxa de asocian juntos en el mismo clúster en el bootstrap se han generado con 1000 réplicas. La probabilidad bayesiana se ha convertido en porcentajes. Estos valores se muestran encima de las ramas en el siguiente orden NJ/ML/IB. H: Haplotipo. Tinaminyssus sp. (S. turtur) Osuna) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) Osuna) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Alcalá) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Candón) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Osuna) H2 A. tsugawai 100/100/- 73/74/100 100/99/76 T. melloi (Utrera) H T. melloi (Sevilla) H 70/71/- T. melloi (Canarias) H 98/91/98 T. sartbaebi (Badajoz) T. columbae (Sevilla) T. columbae (Sevilla) H1 T. minisetosum (Sevilla) T. minisetosum (Sevilla) H1 R. vanellus (Isla Mayor) R. tringae (Isla Mayor) R. neglectus (Isla Mayor) R. echinipes (C. alexandrinus) R. echinipes (P. squatarola) D. gallinae -/67/97 100/100/100 88/69/- /100/- 100/100/100 100/99/100 98/93/71 100/98/78 53/52/55 100/100/100 69/65/99 100/-/78 Tinaminyssus sp. (S.decaocto) (Sevilla) H1 Tinaminyssus sp. (S. decaocto) (Sevilla) H2 Tinaminyssus sp. (S.decaocto) (Sevilla) H2 Tinaminyssus sp. (S. decaocto) (Sevilla) H2 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Osuna) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Osuna) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Alcalá) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Candón) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Osuna) H2 A. tsugawai R. neglectus (Isla Mayor) R. tringae (Isla Mayor) R. vanellus (Isla Mayor) T. minisetosum (Sevilla) T. minisetosum (Sevilla) T. columbae (Sevilla) H1 T. columbae (Sevilla) H1 T. sartbaebi (Badajoz) T. melloi (Utrera) H1 T. melloi (Sevilla) H1 T. melloi (Canarias) H2 30 Figura 10.- Árbol filogenético generado con las secuencias de COI de la familia Rhynonissidae. La historia evolutiva fue inferida usando los métodos de neighbourjoining (NJ), máxima verosimilitud (ML) e inferencia bayesiana (IB). El porcentaje de réplicas de árboles en los cuales los taxa de asocian juntos en el mismo clúster en el bootstrap se han generado con 1000 réplicas. La probabilidad bayesiana se ha convertido en porcentajes. Estos valores se muestran encima de las ramas en el siguiente orden NJ/ML/IB. H: Haplotipo. p T. melloi (Sevilla) H3 T. melloi (Sevilla) H3 T. melloi (Sevilla) H1 T. melloi (Sevilla) H2 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Sevilla) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Sevilla) H1 Tinaminyssus sp. (S. turtur) (Sevilla) H1 T. streptopeliae (Sevilla) H1 Tinaminyssus sp. (S. decaocto) (Sevilla) H1 Tinaminyssus sp. (S. decaocto) (Sevilla) H1 Tinaminyssus sp. (S. decaocto) (Sevilla) H1 T. columbae (Sevilla) H1 T. columbae (Sevilla) H1 S. turdi (Portugal) 100/100/100 78/70/78 99/99/100 94/90/100 80/80/100 Metaseiulus occidentalis Varroa destructor 100/100/100 100/100/100 100/100/100 - 31 - 5. DISCUSIÓN La familia Rhinonyssidae incluye ocho géneros cuya diferenciación se realiza en función de la morfobiometría de los quelíceros de las hembras, contabilizándose alrededor de 500 especies (Morelli y Spicer, 2007). La clasificación de estas especies es en muchos casos difícil debido a la gran similitud morfológica, lo que ha obligado en ocasiones a la distribución de especies próximas en grupos de especies. Uno de estos casos son las especies del género Tinaminyssus parásitas de columbiformes en las que las características discriminatorias específicas son variables según el grupo de especies considerado solapándose en algunos casos entre individuos de diferentes especies próximas (Fain, 1962). Esta dificultad se pone de manifiesto cuando se trata de clasificar las especies T. melloi, T. streptopeliae, T. streptopelioides incluidas en el denominado “grupo melloi” y T. columbae y T. minisetosum que forman parte del “grupo columbae”. Así, T. streptopeliae fue descrita por Fain sobre Streptopelia semitorquata en 1962 como una subespecie de T. melloi y sobre la que realiza la descripción. No obstante, también localiza poblaciones sobre Streptopelia capicola tropica, Streptopelia l. lugens, Streptopelia d. decaocto, Streptopelia s. senegalensis y Streptopelia lugens hoggara procedentes de Ruanda Urundi, pero no sobre Streptopelia turtur. Ya en este estudio, Fain describe variaciones morfológicas entre los ácaros procedentes de distintos hospedadores si bien no indica si localizó ácaros con mezcla de fenotipos. Posteriormente se elevó a la categoría de especie y Butenko en 1984 describió T.streptopelioides, una especie localizada sobre Streptopelia turtur. En este estudio se han considerado poblaciones aisladas de S. turtur y S. decaocto De cada una de ellas se ha realizado un estudio morfobiométrico completo de ejemplares localizados sobre diferentes individuos hospedadores. No obstante, se ha detectado una gran variabilidad morfológica que hace muy difícil su identificación por sus características morfobiométricas (Figuras 7 y 8). Así, en el dorso se observan diferencias en la morfología de los escudos podosomal y opistosomal y en el vientre del escudo anal. Respecto a la quetotaxia, se muestra una gran variabilidad en el número de sedas opistosomales ventrales de los distintos individuos independientemente de la población a la que pertenecen, ya que su número varió entre 7 y 12 pares. Incluso caracteres como la longitud de la tercera seda impar anal, que es utilizada por Butenko, 1984 como carácter específico presenta variabilidad. Respecto a la biometría, es de destacar que Butenko utiliza la relación longitud/anchura del escudo opistomal como carácter discriminatorio entre T. streptopelioides - 32 - (con relación 1,1:1) y T.streptopeliae (con relación 1,5:1). Sin embargo, al comparar esta relación con las calculadas por Rodríguez y cols., 1990 y Fain, 1962 para T. streptopeliae y Butenko, 1984 para T. streptopelioides con las calculadas en este estudio, observamos que tanto para los ejemplares aislados de S. turtur como de S. decaocto la relación fue de 1,1:1. Por tanto, no encontramos ninguna característica morfobiométrica que sea útil para diferenciar estas dos poblaciones. No obstante, cuando se comparan las secuencias de ITSs de ejemplares de la misma población los porcentajes de homología apenas presentan diferencias, pero si se comparan entre sí, estos porcentajes varían entre el 94% y el 94,30%. Estos valores son similares a los que se observan entre especies próximas pero claramente diferenciadas del mismo género como Rhinonyssus echinipes y R. neglectus (95,9%). Estos resultados corroboran los obtenidos por de Rojas y cols., 2012 para otras especies de rinonísidos. Estas diferencias son más evidentes cuando se consideran los porcentajes de homología entre las secuencias de COI. En este caso, el porcentaje de homología entre las dos poblaciones consideradas fue de 80,65%. Estos resultados son similares a los obtenidos para distintas especies del género Demodex por de Rojas y cols., 2012 usando este mismo marcador. Por otra parte, esta diferenciación se ve apoyada cuando se analizan los árboles filogenéticos obtenidos con los dos marcadores moleculares considerados en este estudio. Así, cuando se considera la topología del árbol construido con la matriz de secuencias de los ITSs se observa que todas las especies del género Tinaminyssus se encuentran agrupadas en un clado y separadas de las del género Rhinonyssus. Además, en el género Tinaminyssus se agrupan de forma independiente las especies que se incluyen en el “grupo columbae” y en el “grupo melloi”. Por último, las dos poblaciones de Tinaminyssus aisladas de S. turtur y S. decaocto se presentan claramente separadas con fuerte apoyo de bootstrap. De forma análoga, la topología del árbol obtenido con las primeras secuencias disponibles de COI de rinonísidos apoyan los resultados anteriores diferenciándose una rama con la única especie incluida en el “grupo columbae” y agrupando en otra los representantes del “grupo melloi”. También en este árbol filogenético aparecen claramente diferenciadas las dos poblaciones de Tinaminyssus aisladas de tórtola común y tórtola turca. Estos resultados parecen confirmar que la separación de estas poblaciones en diferentes hospedadores ha hecho que presenten diferencias genéticas pero todavía muestren escasas diferencias morfológicas, si bien los datos moleculares parecen suficientes para considerarlas como especies diferentes: T. streptopeliae y T. streptopelioides. - 33 - Puesto que la especie que fue descrita en primer lugar sobre Streptopelia decaocto fue Tinaminyssus streptopeliae, consideraremos que la especie presente en la tórtola turca es T. streptopeliae y la especie presente en la tórtola común es T. streptopelioides. No obstante, deben realizarse nuevos estudios considerando un mayor número de poblaciones de diferentes hospedadores y de marcadores moleculares. Finalmente, este estudio confirma que la región ITS1-5.8S-ITS2 es útil para la resolución de problemas taxonómicos y el establecimiento de relaciones filogenéticas en ácaros rinonísidos como ya ha sido publicado por de Rojas y cols., 2002 y de Rojas y cols. 2007. Además, este trabajo demuestra la utilidad del marcador molecular COI para abordar esas mismas cuestiones en la familia Rhinonyssidae, siendo las secuencias que aquí se presentan los primeros datos de este marcador en esta familia de ácaros. - 34 - 6. CONCLUSIONES 1. Tras los estudios morfobiométricos realizados en dos poblaciones de ácaros del género Tinaminyssus aisladas de diferentes ejemplares de Streptopelia turtur y Streptopelia decaocto, se observa una alta variabilidad en caracteres usados como criterio diagnóstico específico como el número de sedas opistosomales ventrales o la longitud de la seda postanal. Lo mismo ocurre cuando se comparan diferentes parámetros biométricos de ambas poblaciones, los cuales en muchos casos se solapan. Por estos motivos no se reconocen caracteres que permitan la diferenciación de ambas poblaciones. 2. El análisis de la topología de los árboles filogenéticos basados en los marcadores ITS1- 5.8S-ITS2 y COI nos permite diferenciar claramente dos clados dentro del género Tinaminyssus. Una de estas ramas incluye especies pertenecientes al “grupo columbae” y la otra, especies pertenecientes al “grupo melloi”. Lo que concuerda con las observaciones morfológicas. 3. En todos los árboles filogenéticos analizados las dos poblaciones de Tinaminyssus aisladas de S. turtur y S. decaocto se presentan claramente separadas con fuerte apoyo de bootstrap. Además, los porcentajes de similitud son similares a los obtenidos entre especies de Tinaminyssus con claras diferencias morfológicas, por lo que se considera que debe tratarse de especies diferentes en las que sus características fenotípicas aún no se han diferenciado. 4. Las secuencias de COI de ácaros rinonísidos que se presentan en este estudio constituyen la primera aportación para la caracterización de este marcador molecular en este grupo de arácnidos. Por otra parte, de la inferencia filogenética obtenida con estas secuencias se deduce su utilidad en la resolución de problemas taxonómicos y filogenéticos en la familia Rhinonyssidae. - 35 - 7. BIBLIOGRAFÍA Amaral V, Rebouças MM. Métodos para o estudo de ácaros Rinonissídeos. Instituto Biológico de São Paulo. 1974; 31. Barker SC. Distinguishing species and populations of rhipicephaline ticks with ITS-2 ribosomal RNA. J. Parasitol. 1998; 84(5): 887-892. Beati L, Keirans JE. 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