Influencia de la resistencia a imipenen y de diferentes mecanismos de virulencia en acinetobacter baumannii en la colonización o infección de vías respiratorias y la mortalidad en pacientes con ventilación mecánica en cuidados intensivos

1 DEPARTAMENTO DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE SEVILLA INFLUENCIA DE LA RESISTENCIA A IMIPENEM Y DE DIFERENTES MECANISMOS DE VIRULENCIA EN ACINETOBACTER BAUMANNII EN LA COLONIZACIÓN O INFECCIÓN DE VÍAS RESPIRATORIAS Y LA MORTALIDAD EN PACIENTES CON VENTILACIÓN MECÁNICA EN CUIDADOS INTENSIVOS. TESIS DOCTORAL de Mª ROCÍO ÁLVAREZ MARÍN Directores: Jerónimo Pachón Díaz Rafael López Rojas Enero 2016 2 D. Jerónimo Pachón Díaz y D. Rafael López Rojas CERTIFICAN Que el trabajo de investigación INFLUENCIA DE LA RESISTENCIA A IMIPENEM Y DE DIFERENTES MECANISMOS DE VIRULENCIA EN ACINETOBACTER BAUMANNII EN LA COLONIZACIÓN O INFECCIÓN DE VÍAS RESPIRATORIAS Y LA MORTALIDAD EN PACIENTES CON VENTILACIÓN MECÁNICA EN CUIDADOS INTENSIVOS ha sido realizado bajo nuestra dirección por la Licenciada Dª Mª del Rocío Álvarez Marín, y reúne las condiciones de calidad necesarias para ser leído y defendido como Tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Para que conste a los efectos oportunos, expiden la presente certificación en Sevilla, a 21 de Enero de 2016. Rafael López Rojas Jerónimo Pachón Díaz DIRECTOR DIRECTOR 3 AGRADECIMIENTOS Son muchas las personas que han contribuido a que este proyecto avance, y a las que quisiera transmitir mi más profundo y sincero agradecimiento. En primer lugar, quiero agradecer este proyecto finalizado a mis padres, Emilio e Inma, por su ejemplo, su dedicación y su amor. Ellos encarnan los valores del médico y la persona que quiero ser. Igualmente, agradezco a cada uno de mis hermanos su presencia y su cariño, y a mis abuelos esa capacidad de hacer suyas mis alegrías. A mis directores de tesis, sin los que este proyecto no habría sido posible. A Jerónimo, por su impulso imprescindible, por compartir su maestría y por ser inasequible a mis desalientos. A Rafa, por su extraordinaria generosidad, y por enseñarme casi todo lo que sé sobre investigación básica. Gracias por remar conmigo. Agradezco su preciosa colaboración a todas las instituciones y personas que han participado, directa o indirectamente en este proyecto. Al Instituto de Salud Carlos III que encontrara pertinente financiarlo. A los pacientes, por su participación altruista. A todo el equipo profesional del Hospital Virgen del Rocío (intensivistas, personal de enfermería, microbiólogos, técnicos y celadores) que contribuyeron al desarrollo del proyecto. Sin ellos habría sido imposible llevarlo a cabo. A todas las personas del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas que han colaborado conmigo para llevar adelante este proyecto. A Juan, por estar siempre dispuesto a ayudar y por el tiempo dedicado, especialmente durante el largo periodo de recogida de muestras. A Younes y Marina, por su imprescindible ayuda con el estudio de factores de virulencia. A Mike, por iniciarme en los estudios moleculares. A todos los demás compañeros: Fernando, Gema, Mª Eugenia, Meritxell y todos aquellos de los que tanto he aprendido. Muchas y muy sinceras gracias, nunca me ha faltado colaboración cuando la he necesitado. A los doctores Álvaro Pascual y Felipe Fernández Cuenca, y a Francisco Javier Caballero junto con los demás compañeros del Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla, por abrirme las puertas de su laboratorio para los estudios de clonalidad. A todos mis compañeros del Servicio de Enfermedades Infecciosas del Hospital Virgen del Rocío. A José Miguel, por su extraordinaria capacidad de transmitir el entusiasmo y demostrar que sí se puede. A mis tutoras durante el periodo MIR, Manu y Marta, por su buena guía. A mis compañeros de interconsultas, Jose Molina, Julia, nuevamente Manu, María Jesús y Elisa, por ayudarme en el reparto de tareas. Muy especialmente a Julia, que me acompaña y anima en todas mis empresas. No conozco mayor suerte. A ellos y a todos los demás: sois un ejemplo para mí. A mis profesores y maestros de todas las etapas, que siempre alentaron mi curiosidad científica. A Manu, siempre. Por la compañía constante, la paciencia y el amor. Por recogerme a horas intempestivas del laboratorio. Por el tiempo que se ha dejado robar. Cualquier proyecto que yo emprenda y acabe, es de los dos. 4 ÍNDICE GENERAL I. INTRODUCCIÓN 11 1. IMPORTANCIA CLÍNICA DE ACINETOBACTER BAUMANNII. 12 1.1 EL GÉNERO ACINETOBACTER. ACINETOBACTER BAUMANNII. 12 1.2 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS DE A. BAUMANNII DE MAYOR INTERÉS EN LA CLÍNICA. 12 1.2.1 SUPERVIVENCIA EN EL MEDIO AMBIENTE. 12 1.2.2 DESARROLLO DE RESISTENCIAS A MÚLTIPLES ANTIMICROBIANOS. 13 1.3.1 RESERVORIOS, MECANISMOS DE TRANSMISIÓN Y SITUACIÓN EPIDEMIOLÓGICA DE LAS INFECCIONES POR ACINETOBACTER. 13 1.3.2 MANIFESTACIONES CLÍNICAS MÁS FRECUENTES. 15 1.3.2.1 INFECCIONES RESPIRATORIAS. 15 1.3.2.2 BACTERIEMIA. 16 1.4 PRONÓSTICO DE LAS INFECCIONES PRODUCIDAS POR ACINETOBACTER BAUMANNII. 17 1.4.1 MORTALIDAD Y MORBILIDAD ASOCIADAS A LA NEUMONÍA POR ACINETOBACTER. FACTORES PRONÓSTICOS. 17 1.4.2 MORTALIDAD Y MORBILIDAD ASOCIADAS A LA BACTERIEMIA POR ACINETOBACTER. FACTORES PRONÓSTICOS. 18 2. TRATAMIENTO DE LAS INFECCIONES POR A. BAUMANNII EN LA SITUACIÓN EPIDEMIOLÓGICA ACTUAL. 19 2.1 PERSPECTIVA HISTÓRICA DEL DESARROLLO DE RESISTENCIAS EN ACINETOBACTER BAUMANNII Y SITUACIÓN EPIDEMIOLÓGICA ACTUAL. 19 2.2. ANTIBIÓTICOS CON ACTIVIDAD FRENTE A A. BAUMANNII MULTIRRESISTENTE (MDR). 20 2.2.1. CARBAPENEMAS. 20 2.2.2. SULBACTAM. 21 2.2.3. COLISTINA. 21 2.2.4. TIGECICLINA. 22 2.2.5. OTROS. 22 2.2.6. TRATAMIENTO COMBINADO. 22 2.3. TERAPIAS EMERGENTES. 23 3. MECANISMOS DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN ACINETOBACTER BAUMANNII. 23 3.1 IMPORTANCIA DE LA RESISTENCIA A CARBAPENEMAS EN ACINETOBACTER BAUMANNII. 24 3.2 PRINCIPALES MECANISMOS DE RESISTENCIA A CARBAPENEMAS EN ACINETOBACTER BAUMANNII. 25 5 3.2.1 CARBAPENEMASAS. 25 3.2.2 CAMBIOS EN LA PERMEABILIDAD DE MEMBRANA. 27 3.2.3 ALTERACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LAS PBP. 27 3.2.4 SISTEMAS DE EXPULSIÓN ACTIVA: BOMBAS DE EFLUJO. 27 4. MECANISMOS DE PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA DE ACINETOBACTER BAUMANNII. 28 4.1 ADHERENCIA Y FORMACIÓN DE BIOFILM. 28 4.2 MOTILIDAD EN SUPERFICIE Y ADHERENCIA. 31 4.3 ADQUISICIÓN DE HIERRO. 33 4.4 HEMOLISINAS. 34 4.5 OMPA. 34 4.6. OTROS MECANISMOS. 35 4.7. IMPORTANCIA CLÍNICA DE LOS MECANISMOS DE VIRULENCIA. 36 5. RELACIÓN ENTRE MECANISMOS DE PATOGENICIDAD Y FACTORES DE VIRULENCIA, Y MECANISMOS DE RESISTENCIA. 37 5.1. PRODUCCIÓN DE BIOFILM Y RESISTENCIA A CARBAPENEMAS. 38 5.2. OMPA Y RESISTENCIA A CARBAPENEMAS. 39 II. HIPÓTESIS. 41 III. OBJETIVOS. 43 IV. MATERIAL Y MÉTODOS. 45 4.1.1. DISEÑO. 46 4.1.2. ÁMBITO Y POBLACIÓN DE ESTUDIO. 46 4.1.3. PERIODO DE ESTUDIO. 46 4.1.4. CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN. 46 4.1.4.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN. 46 4.1.4.2. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN. 46 4.1.5. DEFINICIONES. 47 4.1.5.1. DEFINICIÓN DE CASO. 47 4.1.6. FUENTES DE INFORMACIÓN. 48 4.1.6.1. IDENTIFICACIÓN DE CASOS. 48 4.1.6.2. RECOGIDA DE INFORMACIÓN. 48 4.1.6.3. SEGUIMIENTO DE LOS CASOS. 48 4.1.7. VARIABLES Y PROTOCOLO DE RECOGIDA DE DATOS. 48 4.1.7.1. VARIABLES DEMOGRÁFICAS BASALES. 48 6 4.1.7.2. VARIABLES CLÍNICAS. 49 4.2. OBJETIVOS 2 Y 3 50 4.2.1. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y CULTIVOS CUANTITATIVOS. 50 4.2.1.1. PROCESAMIENTO INICIAL DE LAS MUESTRAS DE ATB. 50 4.2.1.2. CULTIVOS CUANTITATIVOS. 50 4.2.1.3. PROCESAMIENTO DE LOS HEMOCULTIVOS. 51 4.2.1.4. IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLADOS. 51 4.2.1.5. SELECCIÓN DE AISLADOS DE ACINETOBACTER BAUMANNII. 51 4.2.2. ESTUDIO DE LA RELACIÓN CLONAL DE LAS CEPAS. 51 4.2.2.1. REP-PCR. 51 4.2.2.2. ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO (PFGE). 52 4.2.3. DETERMINACIÓN DE FACTORES DE VIRULENCIA. 54 4.2.3.1. FORMACIÓN DE BIOFILM. 54 4.2.3.2. MOTILIDAD EN SUPERFICIE. 55 4.2.3.3. EXPRESIÓN DE OMPA. 56 4.2.3.4. CAPACIDAD DE ADQUISICIÓN DE HIERRO. 59 4.2.3.5. PRODUCCIÓN DE HEMOLISINAS. 59 4.3.1. ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS. 61 4.3.1.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) DE AMIKACINA, CEFTAZIDIMA, CIPROFLOXACINO, COLISTINA, IMIPENEM, RIFAMPICINA, SULBACTAM Y TIGECICLINA. 61 4.3.1.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA (CMB) DE AMIKACINA, CEFTAZIDIMA, CIPROFLOXACINO, COLISTINA, IMIPENEM, RIFAMPICINA, SULBACTAM Y TIGECICLINA. 62 4.3.1.3. DETERMINACIÓN DE LA CMI DE MEROPENEM Y DETECCIÓN FENOTÍPICA DE METALOBETALACTAMSAS (MBL). 63 4.3.2. DETERMINACIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A CARBAPENEMAS. 63 4.3.2.1. SELECCIÓN DE AISLADOS. 63 4.3.2.2. DETERMINACIÓN DE OXACILINASAS. 63 4.3.2.3.DETERMINACIÓN DE METALOBETALACTAMASAS. 65 4.3.2.4. EXPRESIÓN DE PORINAS. 66 4.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 68 4.4.1. VARIABLES. 68 4.4.2. ANÁLISIS DESCRIPTIVO. 68 4.4.3. ANÁLISIS BIVARIANTE. 68 7 4.4.4. ANÁLISIS MULTIVARIANTE. 69 4.4.5. EXPRESIÓN DE RESULTADOS. 69 4.4.6. PAQUETE ESTADÍSTICO. 69 V. RESULTADOS. 70 5.1.1. ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO. DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN DE ESTUDIO. 71 5.1.1.1. VARIABLES DEMOGRÁFICAS. 72 5.1.1.2. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS BASALES AL INGRESO EN LA UCI Y COMPLICACIONES DURANTE EL INGRESO. 72 5.1.1.3. DIAGNÓSTICO DE COLONIZACIÓN RESPIRATORIA, NAVM Y BACTERIEMIA POR A. BAUMANNII. 75 5.1.1.4. TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO. 76 5.1.1.5. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS. 78 5.1.1.5.1. CONCENTRACIÓN BACTERIANA. 78 5.1.1.5.2. OTROS AISLAMIENTOS MICROBIOLÓGICOS. 79 5.1.1.6. EVOLUCIÓN CLÍNICA Y PRONÓSTICO. 80 5.1.1.6.1. MORTALIDAD. 80 5.1.1.6.2. ESTANCIA EN UCI. 81 5.1.1.6.3. ESTANCIA HOSPITALARIA. 81 5.1.2. FACTORES RELACIONADOS CON LA MORTALIDAD Y ESTANCIA EN UCI. 81 5.1.2.1. FACTORES RELACIONADOS CON LA MORTALIDAD. ANÁLISIS BIVARIANTE Y MULTIVARIANTE. 81 5.1.2.2. FACTORES RELACIONADOS CON LA ESTANCIA EN UCI. ANÁLISIS BIVARIANTE Y MULTIVARIANTE. 86 5.2.1. RELACIÓN CLONAL DE LAS CEPAS. 88 5.2.1.1. ELECCIÓN DE LAS CEPAS. 88 5.2.1.2. RELACIÓN CLONAL SEGÚN REP-PCR. 88 5.2.1.3. RELACIÓN CLONAL SEGÚN PFGE. 89 5.2.2.FACTORES DE VIRULENCIA. 91 5.2.2.1. FORMACIÓN DE BIOFILM. DISTRIBUCIÓN SEGÚN LA CLONALIDAD Y ORIGEN DE LAS CEPAS. 91 5.2.2.2. MOTILIDAD EN SUPERFICIE. DISTRIBUCIÓN SEGÚN LA CLONALIDAD Y ORIGEN DE LAS CEPAS. 93 5.2.2.3. ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE HEMOLISINAS. 94 5.2.2.4. CAPACIDAD DE ADQUISICIÓN DE HIERRO. 94 8 5.2.2.5. EXPRESIÓN DE OMPA. 94 5.2.2.5.1. ELECCIÓN DE CEPAS. 94 5.2.2.5.2. EXPRESIÓN DE OMPA SEGÚN LA CLONALIDAD. 94 5.2.2.5.3. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE OMPA CON OTROS FACTORES DE VIRULENCIA. 95 5.3.1. RELACIÓN DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA CON EL DESARROLLO DE NAVM. 96 5.3.1.1. RELACIÓN DE LA FORMACIÓN DE BIOFILM CON EL DESARROLLO DE NAVM. 96 5.3.1.2. RELACIÓN DE LA MOTILIDAD EN SUPERFICIE CON EL DESARROLLO DE NAVM. 96 5.3.1.3. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE OMPA CON EL DESARROLLO DE NAVM Y NAVM BACTERIÉMICA. ANÁLISIS BIVARIANTE Y MULTIVARIANTE. 97 5.3.2. RELACIÓN DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA CON LA MORTALIDAD. 98 5.3.2.1. RELACIÓN DE LA FORMACIÓN DE BIOFILM CON LA MORTALIDAD. 98 5.3.2.2. RELACIÓN DE LA MOTILIDAD EN SUPERFICIE CON LA MORTALIDAD. 100 5.3.2.3. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE OMPA CON LA MORTALIDAD. 101 5.4.1. MECANISMOS DE RESISTENCIA A CARBAPENEMAS. 103 5.4.1.1. ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS. 103 5.4.1.2. CARACTERIZACIÓN DE CARBAPENEMASAS. 104 5.4.1.2.1. PRESENCIA DE CARBAPENEMASAS Y RELACIÓN CON LA CMI DE IMIPENEM. DISTRIBUCIÓN CLONAL. 104 5.4.1.3. ESTUDIO DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA EXTERNA Y EXPRESIÓN DE PORINAS. 106 5.4.1.3.1. CARACTERIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE PORINAS Y RELACIÓN CON LA CMI DE IMIPENEM. DISTRIBUCIÓN CLONAL. 106 5.4.1.4. RELACIÓN ENTRE LOS MECANISMOS DE RESISTENCIA Y LOS FACTORES DE VIRULENCIA. DISTRIBUCIÓN CLONAL. 107 VI. DISCUSIÓN. 109 6.1.1. ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO. DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN DE ESTUDIO. 110 6.1.1.1. VARIABLES DEMOGRÁFICAS. 110 6.1.1.2. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS BASALES AL INGRESO EN LA UCI Y COMPLICACIONES DURANTE EL INGRESO. 111 6.1.1.3. TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO. 113 6.1.1.4. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS. 114 6.1.1.4.1. CONCENTRACIÓN BACTERIANA. 114 6.1.1.5.2. OTROS AISLAMIENTOS MICROBIOLÓGICOS. 116 6.1.1.6. EVOLUCIÓN CLÍNICA Y PRONÓSTICO. 117 6.1.1.6.1. MORTALIDAD. 117 9 6.1.1.6.2. ESTANCIA EN UCI Y ESTANCIA HOSPITALARIA. 119 6.1.2. FACTORES RELACIONADOS CON LA MORTALIDAD Y ESTANCIA EN UCI. 119 6.1.2.1. FACTORES RELACIONADOS CON LA MORTALIDAD. ANÁLISIS BIVARIANTE Y MULTIVARIANTE. 119 6.1.2.2. FACTORES RELACIONADOS CON LA ESTANCIA EN UCI. ANÁLISIS BIVARIANTE Y MULTIVARIANTE. 121 6.2.1. RELACIÓN CLONAL DE LAS CEPAS. 122 6.2.2. FACTORES DE VIRULENCIA. 124 6.2.2.1. FORMACIÓN DE BIOFILM. DISTRIBUCIÓN SEGÚN LA CLONALIDAD Y ORIGEN DE LAS CEPAS. 124 6.2.2.2. MOTILIDAD EN SUPERFICIE. DISTRIBUCIÓN SEGÚN LA CLONALIDAD Y ORIGEN DE LAS CEPAS. 125 6.2.2.3. ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE HEMOLISINAS. 125 6.2.2.4. CAPACIDAD DE ADQUISICIÓN DE HIERRO. 126 6.2.2.5. EXPRESIÓN DE OMPA. 126 6.2.2.5.1. EXPRESIÓN DE OMPA SEGÚN LA CLONALIDAD. 126 6.2.2.5.3. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE OMPA CON OTROS FACTORES DE VIRULENCIA. 126 6.3.1. RELACIÓN DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA CON EL DESARROLLO DE NAVM. 127 6.3.1.1. RELACIÓN DE LA FORMACIÓN DE BIOFILM CON EL DESARROLLO DE NAVM. 127 6.3.1.2. RELACIÓN DE LA MOTILIDAD EN SUPERFICIE CON EL DESARROLLO DE NAVM. 129 6.3.1.3. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE OMPA CON EL DESARROLLO DE NAVM Y NAVM BACTERIÉMICA. ANÁLISIS BIVARIANTE Y MULTIVARIANTE. 129 6.3.2. RELACIÓN DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA CON LA MORTALIDAD. 131 6.3.2.1. RELACIÓN DE LA FORMACIÓN DE BIOFILM CON LA MORTALIDAD. 131 6.3.2.2. RELACIÓN DE LA MOTILIDAD EN SUPERFICIE CON LA MORTALIDAD. 132 6.3.2.3. RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE OMPA CON LA MORTALIDAD. 132 6.4.1. MECANISMOS DE RESISTENCIA A CARBAPENEMAS. 134 6.4.1.1. ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS. 134 6.4.1.2. CARACTERIZACIÓN DE CARBAPENEMASAS. 135 6.4.1.2.1. PRESENCIA DE CARBAPENEMASAS Y RELACIÓN CON LA CMI DE IMIPENEM. DISTRIBUCIÓN CLONAL. 135 6.4.1.3. ESTUDIO DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA EXTERNA Y EXPRESIÓN DE PORINAS. 138 6.4.1.3.1. CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PORINAS Y RELACIÓN CON CMI DE IMIPENEM. DISTRIBUCIÓN CLONAL. 138 16 En el entorno nosocomial, también es frecuente la traqueobronquitis por A. baumannii. Durante los últimos años, se ha venido prestando mayor atención a la traqueobronquitis asociada a ventilación mecánica como entidad clínica, aunque los criterios diagnósticos no están completamente consensuados y su impacto clínico está relacionado, en muchas ocasiones, con el ulterior desarrollo de una neumonía (45). Por otra parte, entre los pacientes en los que se aísla A. baumannii durante la hospitalización, un número importante representan colonizaciones. Así, en una cohorte multicéntrica española con 221 aislamientos clínicos de A. baumannii, el 52,9% eran causantes de infección, mientras que el 47,1% eran colonizantes (46). Más allá de su papel como paso previo a la infección respiratoria, se desconoce si la colonización por A. baumannii tiene algún impacto clínico por sí misma. El comportamiento de la colonización respiratoria por A. baumannii está pobremente descrito en la literatura. 1.3.2.2 Bacteriemia. La bacteriemia es la segunda infección nosocomial en frecuencia producida por A. baumannii (9). La neumonía constituye el foco clínico más frecuentemente asociado a ella (44), seguido por los catéteres intravenosos (47)(48). Otros orígenes, como el tracto urinario, las infecciones de piel y partes blandas, la meningitis nosocomial o las infecciones intraabdominales son focos menos frecuentes (47)(48). Hasta en el 44% de los episodios, el origen de la bacteriemia es desconocido (49). La frecuencia de bacteriemias por A. baumannii es un parámetro que puede servir de expresión del aumento de infecciones por este microorganismo en los últimos años. En un estudio realizado en nuestro centro durante 1993, A. baumannii fue el microorganismo responsable del 27% de las bacteriemias por bacilos gramnegativos (48). Los pacientes con mayor riesgo de tener una bacteriemia por A. baumannii son aquellos que están ingresados en UCI, tanto de adultos como pediátrica, y los que tienen un índice de Charlson >3 puntos, hospitalizaciones previas, nutrición parenteral total, tratamiento quimioterápico o han recibido antibioterapia durante el ingreso, especialmente β-lactámicos o carbapenemas (26)(47)(48)(49)(50)(51). Entre los factores de riesgo para padecer una bacteriemia por A. baumannii, se encuentran en lugar preferente la presencia de dispositivos o procedimientos invasivos como ventilación mecánica, catéter intravascular, sonda vesical o sonda nasogástrica, según ha reflejado múltiples estudios y la reciente revisión sistemática realizada por Zhou et al. (52). 17 1.4 Pronóstico de las infecciones producidas por Acinetobacter baumannii. La mortalidad cruda y la morbilidad asociadas a las infecciones por A. baumannii, aunque varían en función del tiempo de infección y de otros factores, son elevadas. En muchas ocasiones, no obstante, es difícil conocer la mortalidad atribuible, al producirse mayoritariamente en pacientes con enfermedades graves subyacentes o situaciones críticas. En los últimos años, abundan los estudios sobre factores relacionados con el pronóstico de las infecciones por A. baumannii, habiéndose identificado como tales aspectos relativos al huésped (gravedad de la enfermedad basal, situación funcional previa, ventilación mecánica, neoplasia maligna, inmunosupresión), factores relacionados con la infección (localización de la misma, scores de gravedad, shock séptico, distrés respiratorio), eficacia del tratamiento empleado y, finalmente, también características del microorganismo, como la infección por un clon específico o las resistencias antibióticas (53)(54)(55). La resistencia a carbapenemas es uno de los factores que con más frecuencia se ha asociado con un exceso de mortalidad en las infecciones producidas por A. baumannii (56)(57), cuantificado con una OR=2,22 (IC95% 1,66-2,98) en el metaanálisis que llevaron a cabo Lemos et al. (57). Sin embargo, los estudios al respecto son bastante heterogéneos y no está aclarado hasta qué punto existen factores de confusión, como la proporción de tratamiento inapropiado. 1.4.1 Mortalidad y morbilidad asociadas a la neumonía por Acinetobacter. Factores pronósticos. La mortalidad cruda de la neumonía por A. baumannii es elevada, alcanzando hasta el 40%-70% en la neumonía asociada a la ventilación mecánica (NAVM) (46)(58). No obstante, respecto a la NAVM, se han comunicado resultados contradictorios sobre el impacto de A. baumannii como agente etiológico, por lo que el debate científico sobre la mortalidad atribuible a estas infecciones y, consecuentemente, si los pacientes fallecen por o con la infección causada por esta bacteria, es causa de controversia (59)(46)(60). Revisiones relativamente recientes han descrito una mortalidad atribuible del 8-23% para la neumonía nosocomial por A. baumannii y del 10-46% para la NAVM (61)(62). La relevancia clínica de la colonización, al menos cuando ocurre en vías aéreas, no se conoce, pero necesita ser dilucidada a tenor de los datos derivados de un estudio realizado en pacientes colonizados en vías aéreas por P. aeruginosa, el 18 cual mostró que la mortalidad era significativamente superior en pacientes con alta concentración de bacterias en el aspirado endotraqueal, aún sin NAVM, que en aquellos con NAVM. En este sentido, es de interés constatar que un estudio retrospectivo de casos y controles, que comparó todos los pacientes colonizados o infectados por A. baumannii MDR con aquellos colonizados o infectados por P. aeruginosa MDR mostró un aumento de mortalidad en el grupo de A. baumannii (p=0,0002) (63). Se han identificado múltiples factores de riesgo de mortalidad de la neumonía nosocomial por A. baumannii: las enfermedades crónicas subyacentes, la gravedad clínica de la neumonía o de la situación basal medida con distintos scores, el tratamiento empírico inapropiado o el uso de antimicrobianos en los 28 días previos son los más importantes (54)(64)(65). La resistencia a carbapenemas se ha relacionado con la mortalidad en algunos estudios, como el de Zheng et al. (54), en el que los pacientes con neumonía nosocomial por A. baumannii resistente a carbapenemas presentaban una mortalidad superior a aquellos con neumonías por A. baumannii sensible (45,6% vs. 29,9%, p=0,02); en este caso, sin embargo, la resistencia de la cepa causal no se seleccionó como factor de riesgo de mortalidad en el análisis multivariante, mientras que sí lo hizo el tratamiento inapropiado, sugiriendo que la dificultad para establecer un tratamiento adecuado es lo que aumenta la mortalidad de las infecciones por A. baumannii resistente a carbapenemas. 1.4.2 Mortalidad y morbilidad asociadas a la bacteriemia por Acinetobacter. Factores pronósticos. La mortalidad cruda de la bacteriemia por A. baumannii es elevada, habiéndose comunicado cifras que varían en estudios recientes entre el 20% y el 69,9%, según la serie y la distribución de factores de riesgo (54)(58)(68) (67)(91)(68). Su pronóstico es peor que el de la bacteriemia por otras genoespecies del género Acinetobacter. A este respecto, Lee et al. (69) detectaron una mortalidad cruda a 30 días del 29,7% para la bacteriemia por A. baumannii, con una OR=2,23 (IC95%1,053-4,821) respecto a la mortalidad de las bacteriemias por otras especies de Acinetobacter. Respecto a la mortalidad atribuible existen resultados discordantes. En un estudio retrospectivo de casos y controles, Blot et al. (70), no encontraron diferencias significativas en la mortalidad; en cambio, otro estudio retrospectivo que comparó pacientes con bacteriemia por A. baumannii con controles sin bacteriemia, encontró una mortalidad atribuible del 36,5% (71). 19 Se han identificado múltiples factores de riesgo asociados a la mortalidad de la bacteriemia por A. baumannii, entre los que se cuentan factores similares a los comentados previamente: enfermedad subyacente grave, (en forma de índice de Charlson>3, de neoplasia maligna o de otras enfermedades como EPOC o enfermedad cerebrovascular) de alto grado de dependencia, niveles bajos de albúmina sérica, ingreso en UCI previo a la bacteriemia, cirugía previa o trasplante de órgano sólido en el mismo ingreso, ventilación mecánica, sepsis grave, APACHE II elevado, tratamiento definitivo inapropiado, resistencia a carbapenemas (54)(58)(69)(68)(67)(91)(68) (72). Un estudio que analizó específicamente pacientes con bacteriemia por A. baumannii resistente a carbapenemas mostró una mortalidad a los 30 días del 48%. En este estudio, la gravedad de la enfermedad basal y la presencia de inmunosupresión fueron los únicos factores predictores de mortalidad (73). Este estudio no evaluó la sensibilidad a sulbactam, mientras que en el estudio de Chopra et al. (68) este aspecto se reveló importante; así, la mortalidad de la bacteriemia por A. baumannii resistente a carbapenemas y sulbactam fue del 43% y la producida por A. baumannii sensible a alguno de estos β-lactámicos fue del 20%. Nuevamente, el pronóstico parece estar relacionado con las oportunidades de un tratamiento eficaz. 2. Tratamiento de las infecciones por A. baumannii en la situación epidemiológica actual. En la actualidad, la resistencia a la mayoría de los antibióticos disponibles es la norma en los aislados clínicos de A. baumannii en hospitales de todo el mundo. Desde su descubrimiento en 1985, las carbapenemas fueron durante mucho tiempo el tratamiento de elección para las cepas de A. baumannii multirresistente, pero la diseminación de su uso se ha seguido rápidamente de la aparición y diseminación global de cepas resistentes a estos fármacos. Esto ha motivado que se vuelvan a utilizar fármacos antiguos, desechados inicialmente por su toxicidad, como la colistina, y que se esté dando impulso a la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas. 2.1 Perspectiva histórica del desarrollo de resistencias en Acinetobacter baumannii y situación epidemiológica actual. En cuanto a la prevalencia de aislamientos de A. baumannii resistentes en España, desde el punto de vista de la resistencia a carbapenemas, un análisis de los resultados del proyecto EPINE en España (1999-2005), mostró unas tasas medias del 20 34,5%, que además fueron mayores en las UCIs (en las que llegaba al 43,8%), siendo los aislamientos más frecuentes los procedentes de vías respiratorias (41% del total) (74). En un estudio multicéntrico realizado en España en 2010, en 43 centros hospitalarios, entre 456 aislamientos clínicos consecutivos de A. baumannii, el 82% de los mismos no eran suceptiblen a imipenem (75), mientras que en un estudio similar realizado en 2000, no lo eran el 47,5% de los aislados (76). Tabla 1. Porcentaje de resistencias a distintos antimicrobianos a lo largo de las dos últimas décadas. Vila(77) 1993 Seifert(78) 1993 Shi(79) 1996 Friedland (80) 2003 Fernández- Cuenca(76) 2004 Morfin- Otero(81) 2004 Falagas(82) 2007 Hoban (83) 2007 Morfin- Otero(81) 2009 Sader(84) (USA) 2014 Sader(84) (Europa) 2014 Amikacina 28 64 28 13 66 16 86 22 48 51 66 Ampicilina 98 91 88 - 98 - - - - - - Ampicilina+ Sulbactam 48 - 34 21 54 - 49 - - - - Ceftazidima 45 32 42 45 85 48 88 97 61 68 82 Ciprofloxacino /Levofloxacino 30 94 4 57 90 44 93 97 55 72 82 Colistina - - - - - - - - - 5 3 Imipenem /Meropenem - - 2 5 48 - 71 38 47 66 72 Minociclina /Doxiciclina 2 - - - 35 3 - 7 9 35 37 Piperacilina+ Tazobactam 67 36 72 - 95 32 - - 61 70 80 Tigeciclina - - - - - - - - - 9 2 Tobramicina 50 98 - 25 79 - - - - - - 2.2. Antibióticos con actividad frente a A. baumannii multirresistente (MDR). 2.2.1. Carbapenemas. Las carbapenemas (imipenem, meropenem y doripenem) son los fármacos de elección para los aislados de A. baumannii MDR que conservan sensibilidad a carbapenemas (85). Imipenem es el más potente in vitro y ha demostrado actividad en modelos animales frente a cepas con una sensibilidad intermedia (CMI = 8 mg/l) (86). Doripenem ha mostrado mayor actividad que meropenem e imipenem frente a cepas de A. baumannii con la carbapenemasa blaOXA-58 y permanece como opción terapéutica en algunas cepas resistentes a imipenem (87). Sin embargo, la experiencia clínica con este fármaco es aún muy limitada. El parámetro farmacocinético/farmacodinámico que mejor se relaciona con la eficacia de las carbapenemas es el tiempo por encima de la CMI (88). Por este motivo, se han estudiado la infusión prolongada como estrategia para mejorar este índice (88). 21 2.2.2. Sulbactam. Sulbactam posee una actividad inhibidora intrínseca frente a A. baumannii y ofrece múltiples ventajas: tiene un buena penetración en tejidos, su perfil de seguridad es excelente y se tolera incluso en dosis elevadas, y la ausencia de actividad en monoterapia frente a la mayoría de otros microorganismos amortigua significativamente la presión antibiótica (89)(90). La eficacia de sulbactam frente a A. baumannii en clínica se sostiene en varios estudios no aleatorizados que, en pacientes con infecciones graves (neumonía asociada a ventilación mecánica, bacteriemia y meningitis, entre otras), han comunicado tasas de éxito terapéutico del 61-67,5% (91). Una revisión sistemática concluyó que los tratamientos con sulbactam tienen la misma eficacia que las terapias basadas en otros antimicrobianos en infecciones por A. baumannii (92). Por este motivo, junto con las ventajas referidas previamente, se considera el tratamiento de elección para infecciones por cepas de A. baumannii resistentes a carbapenemas y sensibles a sulbactam. 2.2.3. Colistina. La colistina o polimixina E es un antibiótico polipeptídico, habitualmente disponible en clínica en forma de colistimetato sódico (93). Aunque fue descubierto en la década de 1940, su uso se abandonó al sustituirlo por fármacos menos tóxicos, pero se ha recuperado en los últimos años ante la ausencia de tratamientos disponibles para infecciones por bacilos gramnegativos multirresistentes (94). Colistina mantiene el nivel más alto de sensibilidad in vitro frente a Acinetobacter baumannii. No obstante, la emergencia de cepas resistentes a colistina es preocupante y se han comunicado brotes por cepas de A. baumannii pan-resistente (95)(96), así como aparición de aislados con heterorresistencia a colistina (94)(97). Su relevancia en clínica no está aclarada, pero estudios in vitro han mostrado que el desarrollo de heterorresistencia se relaciona con concentraciones subterapéuticas de colistina (98)(99). Entre los mecanismos de resistencia a colistina, se han descrito mutaciones que producen pérdida del lipopolisacárido (lpxA, lpxC, lpxD) y otras que lo inactivan mediante la adición de fosfoetanolamina (pmrAB) (100). Los estudios que han evaluado la eficacia de colistina son numerosos pero muy heterogéneos, y la mayoría proporcionan una evidencia de baja calidad. En la revisión sistemática realizada por Yahav et al. (94) en 2010 se incluyeron todos los estudios que habían comparado la eficacia de colistina, sola o en combinación, con otros 22 antibióticos en infecciones diversas y por distintos microorganismos. El análisis global favorecía a los comparadores. Más recientemente, Liu et al. (101) llevaron a cabo un meta-análisis para evaluar específicamente los datos de eficacia y seguridad de las polimixinas en el tratamiento de las infecciones por A. baumannii. En dicho análisis, las tasas de respuesta clínica y microbiológica, la mortalidad y la duración de la estancia hospitalaria presentaron una diferencia no significativa a favor del uso de polimixinas. La dosificación está en proceso de revisión, ya que la actualmente recogida en ficha técnica se ha demostrado inapropiada en términos de eficacia y selección de cepas resistentes (102)(103). En los últimos años, diversos estudios farmacocinéticos han puesto de manifiesto que se necesitan dosis de carga y una dosis diaria de al menos 9 MU, repartidos en 2-3 veces al día, para alcanzar el objetivo farmacodinámico en aislados clínicos sensibles con las CMI habituales (103)(104). 2.2.4. Tigeciclina. Tigeciclina es un antibiótico de amplio espectro del grupo de las glicilciclinas. Presenta actividad frente a la mayoría de los aislados de A. baumannii extremadamente resistentes, incluidos los resistentes a carbapenemas. Basándose en ensayos clínicos, su uso está aprobado para infecciones de piel y partes blandas, infecciones intraabdominales y neumonías adquiridas en la comunidad (105). Cuando se ha utilizado para tratar otras infecciones, como la neumonía asociada a ventilación mecánica, el éxito terapéutico ha sido variable (106)(107). 2.2.5. Otros. Los aminoglucósidos mantienen una porcentaje moderado de cepas sensibles. No se consideran tratamiento de primera línea por su escasa penetración en algunos tejidos (pulmón, sistema nervioso central) (108), su toxicidad renal y ototoxicidad, y por su menor eficacia en monoterapia respecto a otros antimicrobianos (109). La rifampicina mantiene elevada actividad in vitro frente a Acinetobacter. Existen datos de eficacia in vivo procedente de modelos animales, pero no hay estudios clínicos que la avalen(110)(111). 2.2.6. Tratamiento combinado. Se han propuesto múltiples combinaciones, pero los estudios realizados son heterogéneos y el nivel de evidencia es bajo. La mayoría de los estudios son ensayos 23 in vitro y en modelos animales (112). Los meta-análisis realizados a partir de estudios clínicos no han demostrado beneficio de la terapia combinada respecto a la monoterapia con fármacos de primera línea, cuando estos están disponibles (113)(114). Aunque los resultados podrían ser diferentes para cepas con resistencia a antimicrobianos de primera línea (115), los resultados obtenidos con terapia combinada de rescate durante un brote de A. baumannii multirresistente no apoyan buenos resultados con la misma (95). 2.3. Terapias emergentes. Urge encontrar alternativas terapéuticas, dada la emergencia de cepas resistentes. Entre ellos destacan los péptidos con actividad antimicrobiana y la terapia de base imunitaria. Los péptidos son un componente natural de la inmunidad innata (116). Aunque algunas moléculas presentan un efecto prometedor en estudios experimentales, hay muchos aspectos por desarrollar (seguridad, dosificación) antes de llevarlos a la práctica clínica. La inmunización activa o pasiva ha comenzado a investigarse como una terapia alternativa para A. baumannii (117). Su principal interés potencial es que el efecto sería independiente del perfil de resistencia de las cepas. Hasta la fecha, solo se han llegado a realizar modelos animales. Sus resultados prometedores indican que podría ser una terapia relevante en los próximos años. Actualmente, está en ritmo creciente la búsqueda de moléculas que bloqueen factores de virulencia. 3. Mecanismos de resistencia a antimicrobianos en Acinetobacter baumannii. Una de las características que hace de A. baumannii un patógeno nosocomial de notable importancia es su capacidad para desarrollar múltiples resistencias antibióticas, siendo MDR la mayoría de las cepas clínicas que se aíslan en la actualidad. Los mecanismos que contribuyen a este fenotipo de multirresistencia son variados: reducción de la permeabilidad de las proteínas de membrana externa, sobreexpresión de bombas de eflujo y adquisición de elementos genéticos portadores de determinantes de resistencia, como plásmidos, integrones, transposones e islas de resistencia. 24 Tabla 2. Mecanismos de resistencia de A. baumannii. Grupo antibiótico Mecanismo de resistencia Ejemplos β-lactámicos Inactivación enzimática β-lactamasas (AmpC, TEM, VEB*, PER, CTX-M, SHV) Carbapenemasas (OXA-23, -40, -51, -58 -143-like; VIM, IMP, NDM-1; -2, ADC-68) Expresión reducida de proteínas de membrana externa CarO, 33–36 kDa, OprD-like Alteración en la expresión de las PBPs PBP2 Bombas de eflujo AdeABC Fluorquinolonas Diana modificada Mutaciones en gyrA y parC Bombas de eflujo AdeABC, AdeM Aminoglucósidos Enzimas modificadoras de aminoglucósidos AAC, ANT, APH Bombas de eflujo AdeABC, AdeM Metilación ribosomal ArmA Tetraciclinas Bombas de eflujo AdeABC, TetA, TetB Protección ribosomal TetM Glicilciclinas Bombas de eflujo AdeABC Polimixinas (colistina) Diana modificada Mutaciones en PmrA/B (modificación LPS), mutaciones en los genes de biosíntesis de LPS Tabla modificada de McConnell et al. (118) 3.1 Importancia de la resistencia a carbapenemas en Acinetobacter baumannii. Imipenem ha sido la terapia estándar para A. baumannii. Sin embargo, desde el final del siglo XX, la frecuencia de las infecciones causadas por A. baumannii resistente a carbapenemas ha aumentado de manera alarmante (119). Como comentábamos en el epígrafe 1.4, esta resistencia se relaciona con un peor pronóstico de los pacientes con infecciones por A. baumannii, aunque en ocasiones no sea fácil 25 interpretar si ello es debido a la mayor probabilidad de un tratamiento incorrecto o a mayor virulencia de las cepas resistentes. 3.2 Principales mecanismos de resistencia a carbapenemas en Acinetobacter baumannii. Entre los mecanismos de resistencia a imipenem descritos en A. baumannii se encuentran la síntesis de carbapenemasas, la disminución en la permeabilidad de la membrana externa causada por una disminución en la expresión de las porinas y la alteración en la expresión de las proteínas de unión a penicilina (PBPs). La producción de carbapenemasas es el mecanismo más común (120). 3.2.1 Carbapenemasas. En la mayoría de los casos, la resistencia a carbapenemas en A. baumannii está asociada con la síntesis de las oxacilinasas con actividad frente a este grupo de fármacos. En A. baumannii se han identificado cinco grupos filogenéticos de estas carbapenemasas: blaOXA-58, blaOXA-24/40, blaOXA-23, blaOXA-51/69 y la más recientemente descrita OXA-143 (55). Con una frecuencia inferior, se han descrito cepas productoras de metalo-β-lactamasas (MBL) tipo IMP, VIM, SIM y NDM (121)(122). La primera carbapenemasa en ser descrita fue blaOXA-23, a partir de un plásmido de un aislado de A. baumannii en Escocia (123), seguida de blaOXA-24/40, que se describió en el genoma cromosómico de un aislado clínico español de A. baumannii (124). El tercer cluster de oxacilinasas adquiridas en ser descrito fue blaOXA-58; su gen suele encontrarse en plásmidos, lo que explica su amplia distribución por todo el mundo (125). La última en ser identificada fue blaOXA-143, a partir de una aislado de A. baumannii de Brasil (31). Experimentos con cepas knockout y plásmidos portadores de los genes de estas carbapenemasas han confirmado que estas confieren resistencia a carbapenemas, siendo de mayor nivel para blaOXA- 23 y blaOXA-40 que para blaOXA-58 (127)(128). La carbapenemasa blaOXA-51 es constitutiva de A. baumannii: todos sus homólogos son codificados por el genoma bacteriano y están presentes en todas las cepas. Sin embargo, los niveles de expresión basal de blaOXA-51 no son suficientes para conferir resistencia a carbapenemas. La inserción de una secuencia ISAba1 (la más frecuente), ISAba9 o ISAba825 delante de blaOXA-51 aumenta su síntesis hasta niveles que sí generan resistencia a carbapenemas (129)(130)(131). En algunos 32 Figura 1. Motilidad en superficie de A. baumannii sobre medio semi-sólido. Las suspensiones contenían a) la cepa ATCC 19606 (no móvil) y b-d) distintos aislados clínicos clonalmente distintos. grado de conservación de la secuencia del gen que codifica la subunidad pilA y el fenotipo de motilidad que exhibían las cepas (171). En otro estudio, Clemmer et al. (172) encontraron que la inactivación del gen pilT, que codifica una ATPasa relacionada con la retracción de los pili en otras bacterias (173), se asoció una reducción del 54% de la motilidad en una cepa de A. baumannii. No obstante, el hecho de que aún persistiera una cierto grado de motilidad sugiere que existen otros mecanismos responsables diferentes a los pili, aún no bien identificados. Wilharm et al. encontraron que A. baumannii adquiere ADN del medio durante el movimiento sobre las superficies. Esta es una de las principales características de A. baumannii: la adquisición e integración de ADN, que le permiten desarrollar fácilmente resistencias antibióticas. Según los resultados de este estudio, ambos mecanismos dependerían del correcto funcionamiento de los pili IV (174). La motilidad de A. baumannii es un fenotipo lábil que se ve muy influenciado por las condiciones del medio externo. En estudios in vitro, solamente se produce 33 sobre medios semisólidos, y disminuye según aumenta la concentración de agar o agarosa en los medios de cultivo (154)(172). La disponibilidad de hierro libre en el medio (171), la densidad celular o la luz también influyen significativamente sobre la motilidad (172). Si la motilidad tiene o no un rol significativo en la patogenicidad o virulencia de A. baumannii en el huésped humano es una cuestión por aclarar. No todos los aislados clínicos de A. baumannii la presentan cuando se analiza in vitro y faltan datos de modelos animales que puedan esclarecer las posibles diferencias entre cepas con y sin motilidad. 4.3 Adquisición de hierro. Debido a la escasez de hierro férrico en los medios biológicos, un ión fundamental para el crecimiento bacteriano, la mayoría de las bacterias aerobias han desarrollado sistemas de alta afinidad de captación de hierro, que fundamentalmente incluyen la producción, emisión al medio y recaptación de quelantes conocidos como sideróforos (175). A. baumannii puede adquirir iones en estado férrico a través de sideróforos, siendo acinetobactina el sistema mejor caracterizado (176)(177)(178). Análisis genómicos recientes sugieren, no obstante, que A. baumannii podría contener más de un locus implicado en la biosíntesis de sideróforos, como sugieren algunos análisis genómicos (169)(179). Se ha demostrado además que A. baumannii tiene la capacidad de utilizar el grupo hemo como fuente de hierro (180), así como sistemas para captar y utilizar iones en estado ferroso (66). Respecto a la relación entre la captación de hierro y la capacidad de producir infección, un estudio mostró que el sistema mediado por acinetobactina juega un papel crítico en la capacidad de A. baumannii ATCC 19606 de persistir, causar daño celular y muerte animal utilizando modelos con células humanas epiteliales, con Galleria mellonella y con ratón, indicando que las funciones de adquisición de hierro juegan un papel crítico en la virulencia (181). La escasez de hierro en forma férrica en el medio estimula la producción de sideróforos. En el estudio llevado a cabo por Modarresi et al. (182) con cepas clínicas, esta escasez también estimulaba a otros factores de virulencia, incluida la producción de biofilm, ayudando a que el microorganismo sobreviviera en situaciones de escasez de nutrientes. En cambio, esta asociación no es constante, como demuestran los resultados de otros autores. No existe hasta la fecha ningún estudio que relacione la capacidad de captar hierro con los mecanismos de resistencia a imipenem. Este mecanismo, o bien si el 34 resto de sistemas de adquisición de hierro se relacionan con la virulencia o proporcionan ventajas ecológicas para la persistencia de Acinetobacter en nichos determinados, son cuestiones interesantes pendientes de respuesta (11). 4.4 Hemolisinas. A. baumannii se ha clasificado históricamente como una bacteria no hemolítica, probablemente por su incapacidad para producir hemólisis en eritrocitos de bovino, contenidos en los medios de cultivo con sangre habituales (90). No obstante, en ensayos hechos con medios con sangre de caballo, algunas cepas de A. baumannii presentan actividad hemolítica (184). Esto se correlaciona con la presencia de varios genes codificantes de hemolisinas encontrados en las cepas de A. baumannii secuenciadas hasta la fecha, aunque su impacto en la virulencia y la patogenicidad de Acinetobacter en el huésped humano no está determinada. 4.5 OmpA. El factor de virulencia mejor caracterizado para A. baumannii hasta la fecha es la proteína de membrana externa OmpA. La primera evidencia de que la proteína OmpA contribuye a la virulencia se obtuvo de una random transposon mutagenesis screen que detectó que las cepas de A. baumannii mutantes con un déficit de OmpA no eran capaces de inducir la apoptosis de células epiteliales de laringe humana como sus homólogos salvajes (185). En este estudio, se localizó además OmpA purificada en la mitocondria, donde induce la apoptosis a partir de la liberación de moléculas proapoptóticas del citocromo c y del factor inductor de la apoptosis, sugiriendo que esta podría ser la vía mediante la que A. baumannii induce daño en las células epiteliales humanas durante la infección. Esta proteína juega un papel en la formación de biofilm, así como en la adherencia e invasión de células epiteliales, pudiendo participar en la diseminación de A. baumannii durante la infección, como se ha demostrado en modelos animales con ratón (186). Su contribución a la formación de biofilm y la motilidad podría facilitar la persistencia y supervivencia de A. baumannii como se ha mencionado previamente (167)(160). Igualmente, OmpA juega un papel en la adherencia e invasión de células epiteliales, lo que puede contribuir a la diseminación de A. baumannii durante la infección. La carga bacteriana en sangre de ratones con neumonía por A. baumannii 35 inducida experimentalmente fue significativamente mayor en ratones infectados con una cepa salvaje que en aquellas infectados con un mutante (186). La proteína OmpA contribuye asimismo a la capacidad de Acinetobacter de persistir y crecer en suero humano, ya que interacciona con los inhibidores solubles de la vía alternativa del complemento, permitiendo a la bacteria evitar la lisis mediada por el complemento (187). No obstante, es poco probable que OmpA sea el único factor que contribuye a la resistencia sérica, ya que diferentes cepas de A. baumannii, que contenían genes putativos de ompA, tienen diferentes capacidades de crecimiento y supervivencia en el suero humano (184). Debido a las múltiples funciones de OmpA en la patogénesis de A. baumannii, constituye una diana atractiva para el desarrollo de nuevos tratamientos y estrategias preventivas. A pesar, no obstante, de sus múltiples funciones en la patogénesis y virulencia de A. baumannii, la relación entre la expresión de ompA en cepas clínicas y la capacidad para producir infección, especialmente bacteriemia dado su efecto sobre la supervivencia en suero, no ha sido determinada. 4.6. Otros mecanismos. Como se ha comentado previamente, no todos los mecanismos precisos implicados en el establecimiento y progresión de las infecciones producidas por Acinetobacter están claros. Además de los mencionados, los principales mecanismos conocidos hasta la fecha son: a) La presencia del lipopolisacárido (LPS) de la pared celular y el lípido A, comunes a otros bacilos gramnegativos, es responsable de producir en modelos experimentales toxicidad letal en ratones y fiebre elevada en conejos (188). La producción de endotoxina in vivo es probablemente la responsable de los síntomas que ocurren durante la sepsis por Acinetobacter. El LPS actúa sinérgicamente con los exopolisacáridos capsulares, y se ha visto que está envuelto en la resistencia al complemento en el suero humano. Aproximadamente el 30% de las cepas de Acinetobacter producen exopolisacáridos que se cree que protegen a la bacteria de las defensas del huésped. Estudios experimentales sugieren que cepas productoras de exopolisacáridos son más patógenas que las no productoras (189). En un modelo con ratón, se ha demostrado que el LPS de A. baumannii es el principal componente inmunoestimulador que activa la respuesta inflamatoria durante la neumonía (31). 36 b) La producción de distintas enzimas que pueden dañar el tejido graso, como la fosfolipasa D y la fosfolipasa C (184). c) La presencia de una cápsula formada por L-rhamnosa, D-glucosa, D- glucuronato y D-manosa, que hace a la superficie más hidrofílica (190)(191). d) El quorum sensing, un mecanismo regulador en bacilos gramnegativos implicado en importantes funciones bacterianas, tales como formación de biofilm y biosíntesis de enzimas, antibióticos y factores de virulencia extracelulares (192). En cepas clínicas de Acinetobacter se han descrito 4 moléculas señales diferentes de quorum sensing. Esto podría estar implicado en un mecanismo de autoinducción de múltiples factores de virulencia (189), y podría ser responsable del control de varios procesos metabólicos, incluyendo la formación de biofilm (189). e) Las vesículas de membrana externa, de unos 200 nm, están compuestas por lipopolisacáridos, proteínas de membrana externa, lípidos y ácidos nucleicos. Estas vesículas, liberadas durante el crecimiento celular, participan en el quorum sensing, transportan factores de virulencia, inhiben la maduración de los macrófagos y transfieren material genético (193). OmpA es un componente importante de estas vesículas (186). d) Las penicillin binding proteins (PBPs), enzimas que catalizan la síntesis de peptidoglucano, el componente principal de la pared celular, son necesarias para el crecimiento y mantenimiento celular. Aunque su papel no está totalmente aclarado, contribuyen a la resistencia de A. baumannii a la lisis por el complemento (134). 4.7. Importancia clínica de los mecanismos de virulencia. La mayoría de los estudios realizados sobre factores de virulencia de A. baumannii son, como se ha comentado, estudios in vitro destinados a identificar factores concretos y determinar su mecanismo de actuación. Tenemos hasta la fecha poca información del impacto clínico sobre pacientes de la infección por aislados con mecanismos de patogenicidad y virulencia concretos. Algunos datos reflejan, no obstante, cómo la variabilidad en estos mecanismos puede determinar el pronóstico clínico. En el estudio de Nutman et al. (54), uno de los factores que se relacionó con la mortalidad de la bacteriemia fue el clon de A. baumannii que la produjo, lo que hace suponer que existen diferencias en la virulencia de los distintos clones. Un estudio recientemente publicado describe un clade de A. baumannii de comportamiento clínico altamente virulento, ya que produjo un brote con un 100% de mortalidad en seis pacientes, la mayoría de ellos sin inmunodepresión importante 37 (149). Aunque se trataba de aislados extremadamente resistentes, todos los pacientes recibieron tratamiento dirigido apropiado. Este clade pertenecía al clon MLST ST10, relativamente infrecuente. A pesar de estar genéticamente relacionadas y del comportamiento clínico similar, los aislados presentaban un genoma heterogéneo en cuanto a factores de virulencia y una virulencia en modelo de ratón variable. Es preciso profundizar en el conocimiento entre la relación entre factores de virulencia y repercusión clínica, para aclarar qué factores específicos se relacionan con el paso de colonización a infección y con la letalidad de las infecciones. 5. Relación entre mecanismos de patogenicidad y factores de virulencia, y mecanismos de resistencia. Existe un debate mantenido acerca de la virulencia de las bacterias multirresistentes en general y de Acinetobacter baumannii en particular, partiendo de la creencia común de que la adquisición de resistencia mediante mutaciones o adquisición de nuevos genes se asocia con un alto coste biológico en forma de pérdida de fitness y virulencia (194)(195). Por ejemplo, Fernandez-Cuenca et al. (196), investigando la virulencia de un aislado de A. baumannii panresistente, encontraron asociación entre una virulencia atenuada y la baja expresión de los genes que codificaban las porinas CarO y OprD-like. Los autores atribuyeron la virulencia atenuada al coste biológico que produce la pérdida de ciertas proteínas de membrana externa. Sin embargo, los datos in vitro y procedentes de modelos animales no son homogéneos (56). Se han observado en diversos estudios procesos destinados a estabilizar el impacto de la adquisición de resistencias sobre el fitness, incluyendo evoluciones bacterianas en la que el coste de éste se ve aminorado por mutaciones adicionales sin la pérdida de la resistencia. Ejemplo de esto es el trabajo de Moya et al. (197), que observaron que la posesión de varios genes ampD (ampDh2 y ampDh3) confiere a P. aeruginosa un mecanismo de resistencia a β-lactámicos biológicamente eficiente. En cuanto a A. baumannii, existen estudios que demuestran cambios en la expresión de proteínas al adquirir resistencia a colistina (94)(199), así como una disminución en el fitness bacteriano de la cepa resistente, pero poco es conocido aun sobre la influencia de los mecanismos de resistencia a imipenem sobre la virulencia y el fitness de A. baumannii. 38 Dentro de los factores de virulencia descritos, la formación de biofilm y la proteína OmpA son los que ofrecen datos más sólidos de relación con la resistencia a carbapenemas. 5.1. Producción de biofilm y resistencia a carbapenemas. Las cepas de A. baumannii que se encuentra conformando un biofilm suelen presentar resistencia a antimicrobianos a los que son sensibles en su forma planctónica (200). Más allá de esta ventaja, existen algunos estudios en los que las cepas de A. baumannii productoras de biofilm, en su forma planctónica, presentaban un nivel más alto de resistencias que las no productoras (201)(202). La capacidad de formar biofilm de A. baumannii podría estar relacionada con la presencia y expresión de algunos mecanismos de resistencia antibiótica, como el gen blaPER-1. El papel de éste es controvertido. Mientras que Lee et al. (158) encontraron una correlación positiva entre el nivel de expresión de este gen, la cantidad de biofilm formado sobre plástico y la adherencia a células epiteliales, en el estudio de Rao et al. (203) solo algunas de las cepas estudiadas que portaban blaPER-1 presentaron mayor cantidad de biofilm comparadas con cepas sin dicho gen. Con respecto a la resistencia a imipenem en Acinetobacter, varios trabajos han intentado relacionarla con la formación de biofilm. Wroblewska et al. (204) concluyeron que no había relación entre la resistencia a carbapenemas y la capacidad de formar biofilm, si bien es cierto que su muestra era pequeña (de 34 cepas estudiadas, siete eran resistentes). En otro estudio llevado a cabo por Rao et al. (203) tampoco se halló relación entre la formación de biofilm (que se produjo en 34 de 55 cepas estudiadas) y la resistencia a imipenem (el 100% de las cepas eran resistentes), aunque sí se asoció a resistencias a otros antibióticos como amikacina, cefotaxima, ciprofloxacino y aztreonam. En cambio, en el trabajo realizado por Rodríguez-Baño et al. (205) las cepas formadoras de biofilm (63% de las estudiadas) fueron menos resistentes a imipenem que las no formadoras (25% vs. 47%, p=0,04). Dada esta disparidad de resultados, es necesario profundizar en el conocimiento de la relación entre la formación de biocapas y los distintos mecanismos de resistencia a imipenem en A. baumannii. 39 5.2. OmpA y resistencia a carbapenemas. A. baumannii posee una membrana externa muy poco permeable, característica que se relaciona directamente con su resistencia intrínseca a muchos antimicrobianos. A tenor de los resultados del estudio de Sugararawa et al. (206), OmpA es una porina lenta y la principal responsable de difusión inespecífica a través de la membrana externa de A. baumannii. No obstante, este mecanismo no afecta a la sensibilidad a imipenem, como mostró el estudio de Smani et al. (207), en el que mutantes knock-out sin expresión de ompA presentaron un incremento de la CMI de ácido nalidíxico, aztreonam y cloranfenicol, pero no de imipenem, tetraciclina, tigeciclina, eritromicina, trimetroprim, kanamicina y ceftazidima. En P. aeruginosa, cuya OprF tiene un comportamiento parecido a la OmpA de A. baumannii, imipenem utiliza el canal OprD para difundir dentro de la célula (208). A. baumannii parece utilizar un mecanismo similar, en el que está implicado la proteína de membrana externa CarO, según se mencionó antes, y posiblemente también otros canales no tipificados hasta la fecha (206)(209). En resumen, A. baumannii es un patógeno nosocomial que coloniza e infecta, fundamentalmente, a pacientes debilitados, con dispositivos invasivos y antibioterapia previa. La neumonía, especialmente la asociada a ventilación mecánica, y la bacteriemia, sobre todo la asociada a foco respiratorio, son las infecciones que ocasiona con mayor frecuencia este microorganismo. En un número importante de casos clínicos, se produce colonización sin llegar a desarrollar infección, no siendo conocida la relevancia clínica de la colonización respiratoria por A. baumannii. Existen resultados controvertidos en cuanto a la mortalidad atribuible de la neumonía asociada a ventilación mecánica por A. baumannii y de la relevancia en términos de mortalidad de las infecciones causadas por aislados resistentes a carbapenemas, que son mayoría en la actualidad. Aunque los factores que más se han asociado a desarrollo de infección clínica y a mortalidad en las infecciones por A. baumannii son aquellos relacionados con el huésped (situación basal debilitada y gravedad clínica), estudios recientes sugieren que diferencias en la virulencia de los aislados pueden explicar los disparejos resultados en términos de mortalidad de las distintas series. No obstante, existen pocos datos disponibles sobre la relación entre factores de virulencia y resultados clínicos. En el entorno actual de predominio de cepas extremadamente resistentes con resistencia a carbapenemas, la relación entre los mecanismos de resistencia a imipenem y los factores de patogenicidad y virulencia de A. baumannii 40 necesita ser bien caracterizada. Por todo lo anterior, diseñamos este proyecto en el que nos proponemos conocer diversos aspectos relacionados con las cepas de A. baumannii que producen colonización frente a las que producen infección en vías respiratorias y la capacidad de producir bacteriemia entre las que producen infección, así como la virulencia, relacionándolo con los mecanismos de resistencia a imipenem que presenten las mismas. 41 II. HIPÓTESIS. 48 4.1.6. Fuentes de información. Se pueden diferenciar dos etapas en la recogida de información. 4.1.6.1. Identificación de casos. Se realizó una búsqueda activa los días laborables de todas las semanas del periodo de estudio mediante entrevista diaria con los médicos responsables de las UCIs para identificar a los posibles candidatos. Tras la obtención del consentimiento informado, se procedía a recoger los datos basales y tomar una muestra de ATB para cultivo, y se iniciaba el seguimiento. 4.1.6.2. Recogida de información. Se realizó a partir del análisis de la historia clínica de los pacientes mediante un formulario estandarizado. En caso de valores faltantes o dudosos, se procedía a entrevista con el médico responsable. 4.1.6.3. Seguimiento de los casos. Los pacientes fueron seguidos hasta transcurridos 30 días desde la fecha de inclusión, o hasta la muerte o la extubación si se produjeron antes. El seguimiento incluía una extracción de ATB para cultivo cada 3 días y recogida de información. Si en alguna de estas muestras se aislaba A. baumannii, el paciente era definitivamente incluido en la cohorte. Todas las decisiones clínicas eran tomadas por los médicos responsables de los pacientes, incluida la extracción de otras muestras biológicas, como los hemocultivos, y la prescripción de tratamiento antibiótico. 4.1.7. Variables y protocolo de recogida de datos. Se diseñó un formulario de recogida de datos que incluía las variables a continuación especificadas con sus correspondientes categorías y que fue cumplimentado por el equipo de trabajo a partir de las fuentes de información descritas. 4.1.7.1. Variables demográficas basales. - Fecha de inclusión. - Fecha de ingreso en UCI. - Fecha de intubación. - Edad (años). - Sexo. 49 4.1.7.2. Variables clínicas. a) Variables recogidas a su ingreso en el estudio: - Diagnóstico que motiva su ingreso en UCI: estos diagnósticos se recogieron según la definición literal de los médicos responsables de cada paciente. Posteriormente fueron categorizados siguiendo la clasificación de Knauss (211). - Gravedad clínica al ingreso en UCI: mediante el score APACHE II (212). - Comorbilidades previas al ingreso en UCI: mediante el índice de Charlson (213). b) Variables recogidas durante el seguimiento: - Diagnóstico respecto al aislamiento de A. baumannii: diagnóstico de colonización de vías respiratorias o NAVM, según los criterios descritos, y fecha del mismo. En caso de que el paciente tuviera una bacteriemia por A. baumannii concomitante al diagnóstico de NAVM, se recogió este hecho, así como la fecha del mismo. - Antibioterapia recibida, especificando fármacos, dosis, vía, fecha de inicio y fecha de finalización. En los pacientes con NAVM por A. baumannii, se clasificó la antibioterapia como apropiada o inapropiada en función de su actividad in vitro frente a los aislados de A. baumannii. - Desarrollo de shock séptico de cualquier origen: se utilizaron los criterios estándar de shock séptico (214). - Desarrollo de fracaso renal agudo de cualquier causa: se utilizaron los criterios AKIN (215). - Resultados de los cultivos de ATB, especificando la fecha de toma de la muestra, el resultado, los microorganismos aislados en los cultivos positivos y la concentración de microorganismos expresada en log10 UFC/ml. c) Variables recogidas tras finalizar el seguimiento: - Mortalidad: definida como muerte por cualquier causa en los primeros 30 días tras el primer aislamiento en ATB de A. baumannii en los pacientes colonizados y muerte en los primeros 30 días tras el diagnóstico de NAVM por A. baumannii en los pacientes con NAVM. - Estancia en UCI: número de días transcurridos desde el primer aislamiento en ATB de A. baumannii hasta el día de alta de UCI. No se recogió en los pacientes que fallecieron durante el ingreso en UCI. 50 - Estancia hospitalaria: número de días transcurridos desde el primer aislamiento en ATB de A. baumannii hasta el día del alta hospitalaria. No se recogió en los pacientes que fallecieron durante el ingreso en el hospital. 4.2. OBJETIVOS 2 Y 3 OBJETIVO 2: Comparar la presencia de determinados factores de virulencia entre las cepas clínicas colonizantes y productoras de infección: formación de biofilm, motilidad, expresión de ompA, adquisición de hierro y presencia de hemolisinas. OBJETIVO 3: Evaluar la presencia de infección respiratoria, el desarrollo de bacteriemia y la mortalidad en los pacientes críticos con ventilación mecánica relacionados con la adquisición de cepas con distintos factores de virulencia bacteriana, anteriormente caracterizados. 4.2.1. Procesamiento de las muestras y cultivos cuantitativos. 4.2.1.1. Procesamiento inicial de las muestras de ATB. Todas las muestras de ATB se remitían de manera inmediata tras su toma al Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital Universitario Virgen del Rocío. Allí eran procesadas según el protocolo habitual, cuyo primer paso es tinción de Gram de frotis de la muestra y cuantificación del número de células epiteliales y de polimorfonucleares por campo para evaluar la calidad de la misma. 4.2.1.2. Cultivos cuantitativos. Para el recuento bacteriano de las muestras obtenidas, se realizaron diluciones seriadas en PBS (Phosphate-buffered saline, Sigma-Aldrich Química S.L., Madrid) y posterior siembra en placas de agar-sangre (Francisco Soria Melguizo S.A., Madrid). En el caso en el que la consistencia de la muestra no fuera la adecuada para realizar las diluciones y siembras, éstas fueron diluidas con Sputasol (Oxoid S.A., Madrid) y la dilución realizada fue tenida en cuenta en el recuento final. La concentración bacteriana se expresó en logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mililitro de muestra (Log UFC/ml). 51 4.2.1.3. Procesamiento de los hemocultivos. Todos fueron procesados mediante el sistema BACTEC NR860™ (Becton Dickinson, Cockeysville, Md.) en el Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital. 4.2.1.4. Identificación de los aislados. La identificación de los aislados se realizó mediante alguna de siguientes técnicas: a) tests bioquímicos automatizados con el sistema multitest MicroScan WalkawayTM (Baxter HC, West Sacramento, California), b) MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption ionization–time-of-flight), utilizando un biotyper MALDI (Bruker Daltonics®). 4.2.1.5. Selección de aislados de Acinetobacter baumannii. Se seleccionaron para los experimentos pertenecientes a este objetivo el primer aislado obtenido en una muestra de ATB en cada paciente. En aquellos pacientes que estuvieron colonizados antes de desarrollar una NAVM, se seleccionó para su análisis también el primer aislado concomitante con el diagnóstico de NAVM o inmediatamente posterior. Además, se analizaron también los aislados procedentes de hemocultivos. De este grupo de aislados, se realizó una subselección para el estudio de la expresión de ompA especificada en el apartado 4.2.3.3. 4.2.2. Estudio de la relación clonal de las cepas. Para analizar la relación clonal entre los aislados se utilizaron dos técnicas: REP-PCR y electroforesis en campo pulsado. 4.2.2.1. REP-PCR. Se realizó por duplicado sobre cada uno de los aislados seleccionados según la técnica de Martín-Lozano et al. (216). Se realizó siembra de cada uno de los aislados en una placa de agar Columbia (agar Columbia con sangre de carnero al 5%, Francisco Soria-Melguizo SA, Madrid, Ref. 770418), cultivándose durante 18 horas a 37ºC para aislar colonias individuales. Tras la incubación, entre cuatro y cinco colonias de cada placa eran resuspendidas en 50 μl de agua destilada en tubos de microcentrífuga de 1 ml. Para producir la lisis celular y la obtención del ADN, estos tubos se calentaban a 95ºC durante 10 minutos en termobloque (AccuBlock, Digital Dry Bath, Labnet International, Inc.) y, después, se enfriaban directamente en hielo. Tras este proceso, se centrifugaban durante 60 segundos a 6.000 revoluciones por minuto (rpm) en microcentrífuga (Centrifuge, 52 Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro 21 R) con el objetivo de depositar los detritus celulares y separarlos de la suspensión de ADN. Estos extractos se guardaban en hielo para su uso inmediato en porciones de 10 μl, que eran incluidas en la mezcla para la realización de PCR sin ulterior purificación. Se utilizaron los cebadores REP 1 (5’-IIIGCGCCGICATCAGGC-3’) y REP 2 (5’- ACGTCTTATCAGGCCTAC-3’) (Invitrogen). Para la amplificación, se realizó una mezcla que incluía: 10 μl de extracto de ADN, 10 μl de triton al 0,1% (Triton, Sigma- Aldrich, Ref. X-100), 5 μl de tampón (10x PCR Rxn Buffer, P/N 402028, Invitrogen), 3 μl de MgCl2 (MgCl2 50 mM P/N 402016, Invitrogen), 1 μl de dNTPs (dNTPs Mix 40mM, Promega Corporation, ref. U1515, Madison, EEUU), 1 μl de cebador REP-1, 1 μl de cebador REP-2, 0,4 μl de Taq-polimerasa (Taq DNA Polymerase, Cat#18038-042, Invitrogen) y agua destilada hasta completar 50 μl. En todas las tandas de PCR, se realizó un control negativo para detectar posibles contaminaciones de los reactivos a partir de una mezcla que contenía todos los componentes de la mezcla, a excepción del extracto de ADN, que era sustituido por 10 μl de agua destilada. La amplificación se realizó en termociclador (Thermal Cycler, Ref. 2720, Applied Biosystems) con el esquema: 10 minutos a 94ºC, seguidos de treinta ciclos compuestos por 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 45ºC y 2 minutos a 72ºC, y finalmente 16 minutos a 72ºC. Tras la amplificación, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1% (1 g de agarosa D1 Low EEO, [Pronadisa; Cat#8014] y 100 ml de tampón 1x (Ultrapure 10x, TAE buffer, Invitrogen, Ref. 15558-026) conteniendo 10 μl de bromuro de etidio (10mg/ml) por cada 100 ml de gel (Promega Corporation, ref. H541, Madison, EEUU). Para ello, se depositó una alícuota de 15 μl de cada muestra, incluido el control negativo. El marcador molecular utilizado fue (Lamba Hind-III digested Cat#AM7720, Ambion). El resultado de la electroforesis de los geles fue fotografiado utilizando una cámara (Kodak, Image Station, 4000 mm). 4.2.2.2. Electroforesis en campo pulsado (PFGE). Se realizó sobre cada uno de los aislados seleccionados según la técnica de Gautom et al. (217). Se realizó siembra de cada uno de los aislados en placas de agar sangre y se incubaron durante 18 horas a 37ºC en estufa (D-6450, Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland). Los bloques para la realización de PFGE están compuestos por una mezcla de suspensión bacteriana, agarosa (8016, Pronadisa, Madrid) y proteinasa K (03115879001, Roche, Madrid). Se preparó una solución de agarosa al 1% con SDS (Sodium Dodecil Sulphate, L3771, Sigma-Aldrich, Madrid) al 1% pesando 0,2 g de 53 agarosa y resuspendiéndola en 19 ml de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 10 mM, pH 8), a lo que se le añadía 1 ml de SDS al 20%. Esta mezcla se calentaba hasta que quedara homogénea y se mantenía en un baño (Unitronic 320 OR, P-selecta, Barcelona) a 55ºC hasta su utilización. La suspensión bacteriana se realizaba utilizando tubos de 10 ml con 2 ml de tampón de suspensión (Tris 100 mM, EDTA 100 mM, pH8). Se ajustaba el espectrofotómetro (Génesis 20, Thermo Spectronic, Barcelona) a 620 nm de longitud de onda y se realizaba una suspensión bacteriana de cada aislado hasta lograr una absorbancia de 0,85-0,9, correspondiente a la concentración objetivo de unas 109 células/ml. Posteriormente se transferían 500 μl de la suspensión bacteriana ajustada a un tubo de microcentrífuga (610-201, Greiner Bioone, Carolina del Norte, EEUU) y se dejaban 10 minutos a 55ºC. Tras este periodo de calentamiento, se le añadían 25 μl de proteinasa K a 20 mg/ml y 500 μl de la agarosa preparada. Los bloques se preparaban introduciendo la mezcla correspondiente a cada aislado en los pocillos de un peine Plug Mold (170-3706, BioRad, Alcobendas) y dejándolos solidificar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se prepararon tres bloques por cada aislado. La segunda fase es la de lisis celular y lavados. Se preparaban tantos tubos falcon de 50 ml (210-261, Greiner Bio-one, Carolina del Norte, EEUU) como aislados a estudiar, y añadimos una solución compuesta por 5 ml de tampón de lisis (Tris 50 mM, EDTA 50 mM, pH 8, sarcosil 1%) y 25 μl de proteinasa K (20 mg/ml). En cada tubo se introducían los tres bloques de cada aislado preparados anteriormente, y se incubaban en un baño a 55ºC en agitación vigorosa (100U/min) durante 2 horas con el nivel del agua por encima de la mezcla de los tubos. Pasadas las dos horas, se eliminaba la mezcla y se recuperaban los bloques, que se introducían nuevamente en su tubo Falcon correspondiente, añadiendo 10 ml de agua ultrapura precalentada a 55ºC y se dejaban en el baño a 55ºC con agitación suave durante 15 minutos. Este lavado con agua se repetía una segunda vez. Posteriormente, se eliminaba el agua conservando los bloques, y se añadían 10 ml de tampón TE, realizando otro ciclo de 15 minutos en el baño a 55ºC con agitación suave, tras el cual se eliminaba el tampón TE conservando los bloques. Este lavado con tampón TE se repetía tres veces. Al finalizar la última, se añadían 5 ml de tampón TE a temperatura ambiente en los que se conservaban los bloques a 4ºC hasta su utilización. La tercera fase del proceso es la digestión del ADN. Para ello, se preparaba en primer lugar tampón de restricción 1x, diluyendo 20 μl del buffer A de la enzima 10x (ApaI, 10899208001, Roche, Madrid) en 180 μl de agua ultrapura (200 μl por aislado) 54 y seroalbúmina bovina BSA (100 μl/ml; B9000S, New England Biolabs, L'Hospitalet de Llobregat) utilizando 2 μl por aislado. Posteriormente, se cortaba la mitad de cada bloque y se añadía en un tubo de microcentrífuga con tampón 1x, incubándolo posteriormente a 25ºC durante 15 minutos. Pasado este tiempo, se retiraba el tampón utilizado con pipeta y se añadía una mezcla de solución de restricción con endonucleasa ApaI (10 U/μl, 10899208001, Roche, Madrid). Por cada aislado, la mezcla contenía: 175 μl de agua ultrapura, 20 μl de tampón 10x, 3 μl de ApaI y 2 μl de BSA. El tubo con el bloque suspendido en esta mezcla era incubado durante 4 horas a 25ºC con agitación suave. En cuarto lugar, se realizaba la electroforesis. Para ello, se preparaba un gel de agarosa al 1% mezclando 2 g de agarosa para PFGE (161-3101, BioRad, Alcobendas) y TBE 0,5x (preparado previamente con 10 ml de TBE comercial (1 666 703, Roche, Madrid) 10x y 190 ml de agua destilada) y vertiendo la mezcla en un molde con 15 pocillos. Tras solidificar, en cada uno de ellos se introducía un bloque (previa estabilización de los mismos en 1 ml de TBE 0,5x a 4ºC durante 15 minutos). La electroforesis se realizaba en un equipo CHEF-DR® II (BioRad, Alcobendas) con las siguientes condiciones: pulsos de 5-20 segundos, con un tiempo total de 19 horas, un voltaje de 6 V/cm y un ángulo de 120º. Una vez realizada la electroforesis, se pasaban los geles a un recipiente con bromuro de etidio (H5041, Promega, Alcobendas) (60 μl en 600 ml de agua destilada) para su tinción durante 30 minutos. Se realizó una fotografía del gel mediante el sistema (Gel Logic 200 Imaging System, Kodak, Madrid). Para cada uno de los geles, se utilizó como referencia en el primer y último pocillo la cepa A. baumannii ATCC 19606. La lectura de las fotografías se realizó mediante el programa Fingerprinting 3.0 software (Bio-Rad, Hercules, CA). Los aislados se asignaron a los distintos grupos clonales siguiendo los criterios de Tenover et al. (218). 4.2.3. Determinación de factores de virulencia. 4.2.3.1. Formación de biofilm. Para el estudio de la formación de biofilm se utilizó un experimento de expresión fenotípica in vitro. En primer lugar, se realizaba siembra de cada uno de los aislados en placas de agar sangre y se incubaban durante 18 horas a 37ºC en estufa. Posteriormente, se suspendían 4-5 colonias de cada placa en 10 ml de medio LB (Luria broth, Cat#1231.00, Pronadisa) y se incubaban nuevamente durante 18 horas a 37ºC en 55 estufa. Transcurrido este tiempo, se realizaba una dilución 1:100 de cada uno de estos cultivos en medio LB. Posteriormente, se realizaba cultivo en placas de 96 pocillos con fondo en U, utilizando 4-5 pocillos para cada uno de los aislados y dejando 4-5 pocillos solo con medio de cultivo como control negativo. En cada pocillo se añadían 200 μl de la dilución realizada. En cada placa, se utilizaban como controles positivo y negativo una cepa productora y otra no productora de biofilm. Las placas se incubaban durante 24 horas a 37ºC. Tras este periodo, se descartaba el sobrenadante y, tras varios lavados con agua estéril por inmersión, se realizaba tinción del biofilm mediante adición de 200 μl de cristal violeta al 0,4% (Ref. HT90132, Sigma-Aldrich) a cada pocillo e incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, se lavaba nuevamente con agua destilada y se realizaba dilución del biofilm teñido mediante adición de 200 μl de etanol al 95%, manteniéndolo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla era entonces homogeneizada con pipeta multicanal y el volumen resultante transferido a una placa de 96 pocillos con fondo plano para su lectura. La lectura se realizaba mediante espectrofotometría, (Biochrom Asys UVM340) con longitud de onda 580 nm. El valor utilizado era el correspondiente a la media del valor obtenido por todos los pocillos correspondientes al mismo aislado. Aquellas cepas que presentaron una producción de biofilm dos o más veces superior a su control positivo fueron clasificadas como hiperproductoras de biofilm. 4.2.3.2. Motilidad en superficie. La determinación de la motilidad se realizará mediante estudio fenotípico según el método descrito por Clemmer et al. (172). En primer lugar, se realizó cultivo en placas de agar sangre de cada uno de los aislados, de una cepa control positivo (A. baumannii ATCC 19606) y una cepa control negativo (A. baumannii GEIH 8, de la colección de aislados clínicos propia AbGEIH2010) mediante la siembra e incubación durante 18 horas a 37ºC. Posteriormente, se preparaba el medio de cultivo específico LB con agarosa al 0,3%. Para un litro de medio se utilizaba: 1 litro de agua destilada, 20 g de LB y 3 g de agarosa. Esta mezcla se autoclavaba y se mantenía en estufa a 60ºC hasta su utilización. Para hacer las placas, se vertían 25 ml de medio en placas de Petri de 15 cm en campana de flujo laminar y se dejaban secar a temperatura ambiente durante una hora. La siembra se realizaba tomando una pequeña cantidad de una colonia crecida en las placas de agar sangre con una punta de pipeta y tocando con ella el centro de 56 una placa con LB-agarosa. Las placas se incubaban con la tapadera hacia arriba en ambiente saturado de humedad a 37ºC durante 24 horas. Se realizó cultivo de cada aislado por triplicado. La lectura se realizó mediante comparación visual con estándares positivo y negativo (figura 2). Figura 2. Placas utilizadas como estándar positivo y negativo, respectivamente, para el estudio de la motilidad bacteriana. 4.2.3.3. Expresión de OmpA. Se analizó la expresión del gen ompA en una selección de aislados, eligiéndose varios representantes de cada clon obtenido en función de criterios clínicos para incluir aislados colonizantes, productores de NAVM no bacteriémica y productores de NAVM bacteriémica. Se realizó por triplicado para cada cepa mediante RT-PCR en tiempo real. En primer lugar, se realizó cultivo en 20 ml de LB a 37ºC durante 18 horas con agitación a 180 rpm de cada uno de los aislados seleccionados y de la cepa A. baumannii ATCC 17978, que se utilizaba como cepa control para calibrar la expresión normalizada de ompA. 400 µl de este cultivo se resuspendían en 20 ml de LB y se incuban durante 4 horas a 37ºC con agitación a 180 rpm para alcanzar fase de crecimiento exponencial (OD600 = 0,6). A partir de estos cultivos, se aisló el RNA bacteriano usando el kit comercial TRIzol® MaxTM Bacterial Insolation Kit; (Invitrogen, España). Para ello, se transferían 1,5 ml de estos cultivos a tubos de microcentrífuga y se centrifugaban a 6.000 g durante 5 minutos a 4ºC en microcentrífuga. Tras la centrifugación, se descartaba el sobrenadante y se resuspendía el pellet bacteriano en 200 μl de Max Bacterial Enhancement Reagent precalentado a 95ºC, y se incubaba durante 4 minutos a 95ºC en termobloque para provocar la lisis celular. Posteriormente 57 se mezclaba con 1 ml de TRIzol Reagent y se incubaba a temperatura ambiente durante 5 minutos. Tras esta fase, se añadían 0,2 ml de cloroformo frío y se incubaba la mezcla durante 2-3 minutos a temperatura ambiente, para después centrifugarlas a 12.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Tras esta centrifugación, la mezcla queda separada en tres fases: una inferior roja correspondiente a fenol-cloroformo, una intermedia y una superior de aspecto acuoso que es la que contiene el ARN y contiene unos 400 μl. Para precipitar el ARN, se extraía esta fase acuosa y se transfería a un tubo nuevo, mezclándolo con 0,5 ml de isopropanol frío e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras esta incubación se centrifugaba a 15.000 g durante 10 minutos a 4ºC. Tras esta centrifugación se quedaba un pellet tipo gel formado en los laterales y el fondo del tubo. Se retiraba el sobrenadante cuidadosamente y se resuspende el pellet en 1 ml de etanol al 75%, centrifugándolo a 7.500xg durante 5 minutos a 4ºC. Se descartaba el sobrenadante y se secaba al aire. Este pellet se resuspendía en 50 μl en agua libre de ARNsa y se incubaba durante 10 minutos a 60ºC. Después, se incuba el ARN con DNAasa y su buffer (5 µl del 10x DNAasa buffer y 2 µl de DNAasa (4-6 U) a 37ºC durante 1 hora. A esta mezcla se añaden 5 µl de inactivador de DNAasa, se incuban durante 5 min a temperatura ambiente, y se centrifugan a 10.000xg durante 2 minutos para luego guardar el sobrenadante que contiene el ARN a -80ºC. Para determinar la cantidad de ARN purificado, se transfiere 1 µl de la muestra en el Nano Drop (Nano pro 2000) y se mide la absorbancia de la muestra a 260 nm. Una vez extraído y cuantificado, el RNA se convertía en cADN mediante el kit comercial QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen, España) según las normas del fabricante. Todo el procedimiento se realizaba en hielo en un área libre de ARN. En primer lugar, se realizaba una mezcla con 2 μl de gDNA Wipeout Buffer 7x, un volumen ajustado de la mezcla que contuviera 1 μg de ARN y agua purificada libre de ARN hasta completa 14 μl. Esta mezcla era incubada durante 2 minutos a 42ºC y después enfriada inmediatamente en hielo. A continuación, se mezclaban 1 μl de Quantiscript Reverse Transcriptase, 4 μl de Quantiscript RT Buffer 5x y 1 μl de RT Primer Mix por cada muestra de ARN que se fuera a analizar. Seis μl de esta mezcla se añadían a los 14 μl de la anterior y se incubaba a 42ºC durante 30 minutos y, posteriormente, a 95ºC durante 3 minutos (para inactivar la transcriptasa inversa). Una vez finalizado este proceso, se procedía a la realización de la RT-PCR. La RT-PCR en tiempo real se realizó mediante el sistema MX3005P (Stratagene, La Jolla, CA) usando los cebadores específicos descritos en la tabla 4. En 64 (224). Se realizó extracción de ADN mediante calor, según la técnica descrita en el apartado 4.2.2.1. Los cebadores utilizados son los enumerados en la tabla 8. Para la amplificación, se realizó una mezcla que incluía: 10 μl de extracto de ADN, 10 μl de triton al 0,1%, 5 μl de buffer, 3 μl de MgCl2, 1 μl de dNTPs, 1 μl de la suspensión de cada uno de los cebadores, 0,4 μl de Taq-pol y agua destilada hasta completar 50 μl. En todas las tandas de PCR, se realizó un control negativo para detectar posibles contaminaciones de los reactivos a partir de una mezcla que contenía todos los componentes de la mezcla, a excepción del extracto de ADN, que era sustituido por 10 μl de agua destilada. Se realizó amplificación en termociclador. Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 25 segundos a 94ºC, 40 segundos a 52ºC y 50 segundos a 72ºC, y un periodo de elongación final a 72ºC durante 6 minutos. Tras la amplificación, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1%, siguiendo la misma técnica explicada en el apartado 4.2.2.1. El resultado de la electroforesis de los geles fue fotografiado utilizando una cámara Kodak Image Station 4000 mm. Tabla 8. Secuencias de los cebadores a utilizar en la caracterización de carbapenemasas tipo OXA. Cebadores Secuencias (5’-3’) OXA-51-likeF TAATGCTTTGATCGGCCTTG OXA-51-likeR TGGATTGCACTTCATCTTGG OXA-23-likeF GATCGGATTGGAGAACCAGA OXA-23-likeR ATTTCTGACCGCATTTCCAT OXA-24-likeF GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA OXA-24-likeR AGTTGAGCGAAAAGGGGATT OXA-58-likeF AAGTATTGGGGCTTGTGCTG OXA-58-likeR CCCCTCTGCGCTCTACATAC La expresión de blaOXA-51 se estudió de forma indirecta valorando la presencia de la secuencia ISAba1 en el promotor del gen de OXA-51. Esto se realizó mediante PCR, basándonos en la técnica y los hallazgos descritos por Ruiz et al. (225). Los cebadores a utilizar son los expuestos en la tabla 9. Tras la amplificación, 65 se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1% (D1 Low EEO). Tabla 9. Secuencias de los cebadores a utilizar en el estudio de la presencia de la secuencia ISAba1 asociada al gen de OXA-51. Cebadores Secuencias (5’-3’) ISAba1F CATTGGCATTAAACTGAGGA OXA-51-likeR TGGATTGCACTTCATCTTGG 4.3.2.3.Determinación de metalobetalactamasas. Se estudió la presencia de las MBL IMP y VIM mediante PCR multiplex según la técnica descrita por Ellington et al. (226) Se realizó extracción de ADN mediante calor, según la técnica descrita en el apartado 4.2.2.1. Los cebadores utilizados son los enumerados en la tabla 10. Para la amplificación, se realizó una mezcla que incluía: 10 μl de extracto de ADN, 10 μl de triton al 0,1%, 5 μl de buffer, 3 μl de MgCl2, 1 μl de dNTPs, 1 μl de la suspensión de cada uno de los cebadores, 0,4 μl de Taq-pol y agua destilada hasta completar 50 μl. En todas las tandas de PCR, se realizó un control negativo para detectar posibles contaminaciones de los reactivos a partir de una mezcla que contenía todos los componentes de la mezcla, a excepción del extracto de ADN, que era sustituido por 10 μl de agua destilada. Se realizó amplificación en termociclador. Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 36 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 40 segundos a 52ºC y 50 segundos a 72ºC, y un periodo de elongación final a 72ºC durante 5 minutos. Tras la amplificación, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1%, siguiendo la misma técnica explicada en el apartado 4.2.2.1. El resultado de la electroforesis de los geles fue fotografiado utilizando una cámara Kodak Image Station 4000 mm. Tabla 10. Secuencias de los cebadores a utilizar en la caracterización de MBL. Cebadores Secuencias (5’-3’) IMP-F GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC IMP-R CCAAACYACTASGTTATCT VIM-F GATGGTGTTTGGTCGCATA VIM-R CGAATGCGCAGCACCAG 66 4.3.2.4. Expresión de porinas. Se analizaron las proteínas de membrana externa por duplicado sobre todos los aislados seleccionados, tras comprobar CMI a imipenem ≥8 mg/l. Las proteínas de la membrana externa se extrajeron por sonicación y se evaluaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% según el método descrito por Fernández Cuenca et al. (227). En primer lugar, se tomaban 3-4 colonias de cada aislado previamente cultivados en placas de agar sangre y se incubaban durante 18 horas a 37ºC en 10 ml de MHB. Estos 10 ml se resuspendían en 40 ml de MHB, que eran incubados durante 4 horas a 37ºC en agitación, con el objetivo de conseguir que le cepa alcanzase la fase exponencial de crecimiento. Mientras tanto, se preparaba 1 litro de tampón fosfato sódico (10 mM, pH 7,2) con la mezcla de 6,84 ml de Na2HPo4 (1 M), 3,16 ml NaH2Po4 (1 M) y 990 ml de agua destilada. Finalizada la incubación de 4 horas, los cultivos se centrifugaban a 5.000xg durante 10 minutos a 4ºC. Posteriormente se retiraba el sobrenadante, se resuspendía el pellet bacteriano en 20 ml de tampón fosfato sódico y se volvía a centrifugar a 5.000xg durante 10 minutos a 4ºC. Tras la segunda centrifugación, se retiraba el sobrenadante y se resuspendía el pellet en 5 ml de tampón fosfato. Esta suspensión era la utilizada para la lisis celular por sonicación. Esta se realizaba por sonicación en hielo (Vibra Cell 75115, Bioblock Scientific, Illkirch, Francia), realizando siete ciclos de 30 segundos, con amplitud al 21%. Tras la sonicación, se centrifugaba n los tubos a 5.000xg durante 5 minutos a 4ºC. Desechando el pellet de bacterias no lisadas, se repartía el sobrenadante, que contenía las bacterias lisadas, en tubos de microcentrífuga y estos se centrifugaban a 13.000xg durante 45 minutos a 4ºC. El pellet resultante, formado por membranas bacterianas externas e internas, era conservado a -20ºC hasta su utilización. El siguiente paso era la purificación del extracto de proteínas de membrana. Para ello, se descongelaban a temperatura ambiente los tubos que contenía los pellet y se resuspendían estos en 500 μl de N-Lauril-Sarcosinato sódico al 2% (Ref. L5125, Sigma-Aldrich), incubándolos a temperatura ambiente durante 30 minutos para romper la membrana interna y permitir la solubilización de las proteínas de membrana. Pasado este periodo, esta solución era centrifugada a 13.000xg durante 45 minutos a 4ºC. Se retiraba posteriormente el sobrenadante y se añadía 1 ml de Tris-HCl (62,5 mM, pH 6,8) en cada tubo, resuspendiendo con pipeta. Esta mezcla volvía a centrifugarse a 13.000xg durante 45 minutos a 4ºC. El sobrenadante era completamente retirado con 67 ayuda de micropipeta y se añadía 15 μl de Tris-HCl en cada tubo, mezclando bien y transfiriendo todo el contenido a un mismo tubo de microcentrífuga. Estos tubos eran conservados a 4ºC o utilizados inmediatamente. A continuación se preparaban los geles de poliacrilamida que se iba a utilizar para realizar la electroforesis de las proteínas de membrana externa. En primer lugar, se preparaba el gel de migración o Resolving gel con un 10% de acrilamida, mezclando los siguientes componentes por cada gel: 2 ml de agua destilada, 1,25 ml de 1,5M Tris-HCL (pH8,8), 50 , mezclando los siguientes componen30% Bis/Acrilamida, 25 µl de 10% APS y 2,5 µl de TEMED. Esta mezcla se vertía en la cubeta y se aplanaba con agua. Mientras tanto, se hacía la mezcla del gel de concentración o Stacking gel, que contenía por cada gel: 1,35 ml de agua destilada, 250 µl de 1M Tris-HCl pH 6,8, 20 µl de 10% SDS, 325 µl de 30% Bis/Acrilamida, 20 µl de 10% APS y 2 µl de TEMED. Esta mezcla se vertía en la cubeta sobre el Resolving gel, se colocaba encima el peine y se dejaba solidificar a temperatura ambiente. La concentración de proteínas se medía mediante Bradford con el objetivo de obtener una concentración final para el gel de 4 µg de proteína. Para ello, se mezclaban 400 µl de agua, 100 µl de Bradford y 5 µl de extracto de proteínas en una cubeta de espectrofotometría. Se realizaba la medición con el espectrofotómetro (Eppendorf Bio Photometer, BioRad) en modo Bradford Micro, que daba un valor en µg/ml. A partir de este valor, y teniendo en cuenta que procedía de una dilución 1:100 de la muestra, se calculaba la concentración de proteínas en el extracto y la cantidad de este que hacía falta para conseguir 4 µg de proteína. Esta cantidad calculada se mezclaba con 5 µl de tampón de carga 6x y con agua destilada hasta conseguir un volumen final de 30 µl. Esta cantidad se incubaba a 95ºC durante 5 minutos y posteriormente se introducía en un pocillo del gel. El primero de los pocillos se utilizaba para colocar 10 µl de marcador de peso. Este gel se corría a 100 V durante 3- 4 horas (el tiempo necesario para que se completara la electroforesis a lo largo de todo el gel. Una vez corrido el gel, se realizaba una tinción con Coomasie (SimplyBlueTM SafeStain, Ref. LC6060, Invitrogen). Para ello, se colocaba el gel en una cubeta con 100 ml de agua ultrapura y se calentaba en microondas durante 45 segundos. Posteriormente, se agitaba durante 2 minutos en el agitador orbital. El agua se desechaba y se añadían otros 100 ml de agua ultrapura, repitiendo el procedimiento anterior en tres ocasiones. A continuación, tras desechar el agua, se añadían 30 ml de SimplyBlueTM SafeStain y se calentaba en microondas durante 45 segundos. Se agitaba en agitador orbital durante 10 minutos y se desechaba el líquido. 68 Posteriormente, se realizaban tantos lavados con 100 ml de agua, según el procedimiento previo, como fuera preciso para que esta quedara completamente limpia tras el lavado. Finalmente, se realizaba una fotografía del gel mediante transiluminación en la cámara Kodak Image Station 4000 mm. 4.4. Análisis estadístico. 4.4.1. Variables. La variables resultado seleccionadas fueron la mortalidad, la estancia en UCI y la estancia hospitalaria, según las definiciones del apartado 4.1.7.2. Las variables independientes consideradas fueron todas las demás variables demográficas y clínicas, según lo descrito en el mismo apartado, siendo especialmente relevante la variable referente al tipo de infección por A. baumannii (NAVM +/- bacteriemia) o colonización respiratoria y los datos obtenidos a partir de la determinación de mecanismos de virulencia, estudio de sensibilidad y mecanismos de resistencia a imipenem de las cepas estudiadas. 4.4.2. Análisis descriptivo. Las variables cualitativas están expresadas como frecuencias absolutas y porcentajes. En las variables cuantitativas se utilizaron como medidas de tendencia central y dispersión la media ± desviación estándar o la mediana y el rango intercuartílico (IQR) según se considerara apropiado. Los cálculos sobre estancias hospitalaria o en UCI se realizaron solamente sobre aquellos pacientes que sobrevivieron hasta el alta hospitalaria o de la UCI, respectivamente. Estas variables no presentaban una distribución normal, por lo que se realizó una transformación logarítmica para su análisis. 4.4.3. Análisis bivariante. Las diferencias entre variables categóricas se analizaron mediante el test de la Chi-cuadrado con la corrección de Yates, utilizándose la prueba exacta de Fisher cuando alguna de las frecuencias esperadas era inferior a cinco. Las diferencias entre variables cuantitativas se analizaron mediante el test de Student o el análisis de la varianza cuando se compararon más de dos variables. Cuando no se cumplieron las condiciones para las pruebas paramétricas, se utilizaron las pruebas no paramétricas correspondientes (U de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis). Para el análisis bivariante de los factores asociados con la mortalidad y el cálculo de las OR y sus intervalo de confianza al 95% se utilizó regresión logística. 69 Los análisis de supervivencia se realizaron mediante las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. 4.4.4. Análisis multivariante. El análisis multivariante de los factores relacionados con la mortalidad se realizó mediante un modelo de regresión logística tipo paso a paso hacia delante. Para el de los factores relacionados con la duración de las estancias en UCI y en el hospital se utilizaron modelos de regresión lineal. Para evitar asociaciones espurias, las variables introducidas en los modelos multivariantes fueron aquellas estadísticamente significativas en el análisis bivariante y las consideradas clínicamente relevantes. 4.4.5. Expresión de resultados. Los resultados se han presentado como odds ratio (OR) e intervalo de confianza al 95% (IC95%). El umbral para considerar la significación estadística fue definido como p<0,05. 4.4.6. Paquete estadístico. El protocolo de recogida de datos se informatizó en formato SPSS (versión 12, SPSS, Chicago, IL, EEUU). Para el análisis se emplearon los programas R (R Core Team [2015] R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL http://www.R-project.org/) y SPSS. 70 V. RESULTADOS. 71 5.1. OBJETIVO 1. Evaluar la mortalidad asociada a la colonización de vías respiratorias por A. baumannii vs. la de las infecciones respiratorias por esta bacteria, con o sin bacteriemia, en los pacientes críticos con ventilación mecánica. 5.1.1. Estudio epidemiológico. Descripción de la población de estudio. Durante el periodo de estudio se reclutaron 285 pacientes, de los cuales 100 cumplieron todos los criterios de inclusión y quedaron definitivamente incluidos en el estudio. De estos 100, 43 fueron clasificados como colonización de vías respiratorias y 57 desarrollaron una neumonía asociada a ventilación mecánica (NAVM) por Acinetobacter baumannii; 15 de los casos de NAVM tuvieron una bacteriemia por A. baumannii concomitante al diagnóstico de NAVM. El plazo de tiempo que tardaron los pacientes en presentar el primer cultivo de ATB positivo para A. baumannii fue de 9 (5-14) días. El diagnóstico de NAVM desde el inicio del seguimiento se produjo a los 11 (7-17,75) días. Figura 3. Diagrama de flujo de la selección de pacientes incluidos. 72 5.1.1.1. Variables demográficas. La edad mediana de los pacientes con NAVM fue 51 (43,5-69,5) años y la de los pacientes colonizados fue 66 (43-70) años. Del grupo de los colonizados, 17 (39,5%) eran mujeres y 26 (60,5%) eran varones. En los pacientes con NAVM, 22 (38,6%) eran mujeres y 35 (61,4%), varones. La edad mediana de las mujeres fue 55 (41-65) años y la de los hombres fue 61 (45,5-72) años. No hubo diferencias significativas en la distribución de la edad por sexos en cada uno de los grupos. Gráfico 1. Distribución de la edad en los pacientes con colonización y NAVM. 5.1.1.2. Características clínicas basales al ingreso en la UCI y complicaciones durante el ingreso. Los pacientes con NAVM tenían un índice de Charlson de 0 (0-2) y una puntuación en el score APACHE II al ingreso en UCI de 17 (13-20) puntos, mientras que el índice de Charlson de los colonizados fue de 1 (0-2) y su puntuación en el APACHE II de 17 (12-21,25) puntos. Las comorbilidades más frecuentes fueron: insuficiencia cardiaca, EPOC, diabetes mellitus y antecedente de neoplasia maligna sin metástasis (Tabla 12). todas las comorbilidades analizadas se distribuyeron de manera similar en ambos grupos de pacientes. 73 Tabla 11. Características demográficas y clínicas de los pacientes con NAVM o colonización de vías respiratorias por A. baumannii. Colonización (n=43) NAVM (n=57) p OR (95%CI) Edad Años. md (IQR) 66 (43-70) 51 (43,5-69,5) 0,186 - Mujer n (%) 17 (39,5) 22 (38,6) 0,920 - Charlson score md (IQR) 1 (0-2) 0 (0-2) 0,529 - APACHE II md (IQR) 17 (12-21,25) 17 (13-20) 0,947 - Fracaso renal agudo n (%) 13 (30,2) 27 (47,4) 0,085 2,07 (0,90-4,77) Shock séptico n (%) 17 (39,5) 30 (52,6) 0,194 - Cirugía n (%) 19 (44,2) 38 (66,7) 0,025 2,52 (1,11-5,71) Tabla 12. Comorbilidad previa de los pacientes con NAVM o colonización de vías respiratorias por A. baumannii. Colonizados (n=43) NAVM (n=57) p Índice de Charlson 1 (0—2) 0 (0-2) 0,529 Cardiopatía isquémica 1 (2,3) 1 (1,8) 0,840 Insuficiencia cardiaca 7 (16,3) 6 (10,5) 0,397 E. vascular periférica 1 (2,3) 2 (3,5) 0,731 E. cerebro-vascular 3 (6,9) 2 (3,5) 0,431 EPOC(1) 5 (11,6) 6 (10,5) 0,862 Demencia 0 1 (1,8) 0,383 Conectivopatía 1 (2,3) 0 0,247 Ulcus péptico 2 (4,6) 0 0,100 Hepatopatía leve 0 2 (3,5) 0,215 Hepatopatía moderadagrave 1 (2,3) 2 (3,5) 0,731 DM(2) sin LOD(3) 8 (18,6) 9 (15,8) 0,711 DM(2) con LOD(3) 1 (2,3) 2 (3,5) 0,731 Hemiplejia 0 0 - E. renal crónica 1 (2,3) 2 (3,5) 0,731 Neoplasia maligna 5 (11,6) 4 (7) Neoplasia maligna con metástasis 0 0 - Leucemia 2 (4,6) 0 0,100 Linfoma 0 0 - SIDA 0 1 (1,8) 0,383 (1) Enfermedad pulmonar obstructiva crónica. (2) Diabetes mellitus. (3) Lesión de órgano diana. 80 Streptococcus milleri (2), E. cloacae (1), M. morganii (1), Neisseria meningitidis (1), Listeria monocytogenes (1), y Candida spp. (3); cuatro pacientes tuvieron más de un aislamiento microbiológico. Gráfico 7. Evolución temporal de la proporción de aislamientos microbiológicos y la concentración bacteriana de A. baumannii a lo largo del seguimiento. 5.1.1.6. Evolución clínica y pronóstico. 5.1.1.6.1. Mortalidad. En el grupo de los pacientes con colonización respiratoria, fallecieron 12 (27,9%) pacientes en el plazo de 30 días, mientras que en el grupo con NAVM, lo hicieron 14 (24,6%) (p=0,7). La mediana de tiempo transcurrido desde el diagnóstico de NAVM hasta la muerte fue de 17 (7-21) días. En el análisis de supervivencia entre pacientes con colonización respiratoria y pacientes con NAVM no se encontraron diferencias (p=0,34) (Figura 4). 81 Figura 4. Supervivencia en pacientes con colonización o NAVM. 5.1.1.6.2. Estancia en UCI. La estancia en UCI mediana fue de 17 (8-33) días para el conjunto de los pacientes, siendo de 9 (6-22) días en los pacientes colonizados y de 21,5 (11,5-42,75) días en los pacientes con NAVM (p=0,004), 5.1.1.6.3. Estancia hospitalaria. La duración de la estancia hospitalaria fue de 53 (20-73) días para el conjunto de los pacientes, siendo de 28 (15,75-52,75) días para los colonizados y de 35 (25-56) días para los pacientes con NAVM (p=0,5). 5.1.2. Factores relacionados con la mortalidad y estancia en UCI. 5.1.2.1. Factores relacionados con la mortalidad. Análisis bivariante y multivariante. Los factores relacionados con una mayor mortalidad a 30 días en la población global aparecen reflejados en la tabla 15. El índice de Charlson y el desarrollo de shock séptico se comportaron como factores independientes de mortalidad (tabla 16). 82 Tabla 15. Factores asociados con mortalidad en la muestra global (análisis bivariante). Variable Fallecidos (n=26) Supervivientes (n=74) p OR (IC95%) Sexo femenino n (%) 9 (34,6) 17 (65,4) 0,595 0,776 (0,306-1,971) Edad mediana (IQR) 61,4 (48,5-73) 53,6 (43-66) 0,040 1,03 (1,002-1,06) Índice de Charlson mediana (IQR) 2,07 (1-3) 0,71 (0-1) <0,001 2,21 (1,47-3,31) APACHE II mediana (IQR) 19,48 (17-20) 16,26 (12-19,5) 0,048 1,07 (1,00-1,14) Ingreso por causa médica n (%) 16 (61,5) 30 (40,5) 0,068 2,34 (0,939-5,867) Ingreso por causa quirúrgica n (%) 7 (26,9) 18 (24,3) 0,792 1,14 (0,415-3,167) Ingreso por causa traumatológica n (%) 3 (11,5) 26 (35,1) 0,031 0,241 (0,066-0,879) Shock séptico n (%) 20 (76,9) 27 (36,5) 0,001 5,802 (2,076-16,217) Fallo renal agudo n (%) 19 (73,1) 21 (28,4) <0,001 6,85 (2,512-18,68) Tto. con colistina n (%) 20 (76,9) 46 (62,2) 0,177 2,029 (0,727-5,662) NAVM n (%) 14 (53,8) 43 (58,1) 0,706 0,841 (0,342-2,066) Bacteriemia n (%) 6 (23,1) 9 (12,2) 0,187 2,16 (0,687-6,830) Tabla 16. Factores asociados con la mortalidad en la muestra global: análisis multivariante mediante regresión logística. Muerte (n=26) p OR (IC95%) Índice de Charlson mediana (IQR) 2,07 (1-3) <0,001 2,44 (1,5-3,97) Shock séptico n (%) 20 (76,9) 0,001 7,21 (2,18-23,83) NAVM n (%) 14 (53,8) 0,709 0,81 (0,26-2,44) Entre los pacientes que desarrollaron NAVM, las variables que se relacionaron con una mayor mortalidad en el análisis bivariante fueron el índice de Charlson, el shock séptico, el fracaso renal agudo y el ingreso por causa distinta a la traumatológica (Tabla 17). 83 Tabla 17. Factores relacionados con la mortalidad en pacientes con NAVM por A. baumannii: análisis bivariante y multivariante mediante regresión logística. Variable Fallecidos (n=14) Supervivientes (n=43) Bivariante Multivariante OR (IC95%) p OR (IC95%) p Sexo femenino n (%) 7 (50) 15 (34,9) 1,87 (0,55-6,33) 0,316 Edad mediana (IQR) 58 (43,25- 76,75) 49 (43-65) 1,03 (0,99-1,07) 0,154 Índice de Charlson mediana (IQR) 2 (0,75-2,25) 0 (0-1) 1,8 (1,1-2,9) 0,019 1,76 (1,02- 3,05) 0,042 APACHE II mediana (IQR) 19,5 (17,75- 20,25) 15,5 (12,25-19,5) 1,05 (0,96-1,14) 0,294 Ingreso por causa médica n (%) 8 (57,1) 14 (32,6) 2,76 (0,8-9,5) 0,107 Ingreso por causa quirúrgica n (%) 5 (35,7) 12 (27,9) 1,43 (0,4-5,16) 0,580 Ingreso por causa traumatológica n (%) 1 (7,1) 17 (39,5) 0,12 (0,01-0,98) 0,048 Shock séptico n (%) 11 (78,6) 19 (44,2) 4,63 (1,13- 18,99) 0,033 Fracaso renal agudo n (%) 11 (78,6) 16 (37,2) 6,18 (1,49- 25,56) 0,012 7,66 (1,43- 41,01) 0,017 Antibioterapia apropiada n (%) 13 (92,9) 40 (93,0) 0,97 (0,09-10,2) 0,983 Bacteriemia n (%) 6 (42,9) 9 (20,9) 2,83 (0,78- 10,28) 0,113 5,91(1,14- 30,51) 0,034 La bacteriemia no alcanzó diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos en el análisis bivariante, pero sí lo hizo tras ajustar en el multivariante por el fracaso renal agudo y el índice de Charlson, siendo este el modelo más parsimonioso para explicar la mortalidad. El análisis de supervivencia que comparó pacientes con NAVM bacteriémica y no bacteriémica reveló una menor supervivencia en los primeros (p=0,027) (Figura 5). Esta diferencia se mantenía en el análisis multivariante mediante regresión de Cox, en el que además se observa cómo el tratamiento con colistina es un factor protector de mortalidad (HR []). 84 Figura 5. Supervivencia en pacientes con NAVM con y sin bacteriemia. Tabla 18. Factores relacionados con la supervivencia en pacientes con NAVM por A. baumannii: análisis bivariante y multivariante mediante regresión de Cox. Variable Fallecidos (n=14) Supervivientes (n=43) Bivariante Multivariante HR (IC95%) p HR (IC95%) p Sexo femenino n (%) 7 (50) 15 (34,9) 1,22 (0,42-3,48) 0,710 Edad mediana (IQR) 58 (43,25- 76,75) 49 (43-65) 1,01 (0,97-1,04) 0,580 Índice de Charlson mediana (IQR) 2 (0,75-2,25) 0 (0-1) 1,27 (0,95-1,7) 0,107 APACHE II mediana (IQR) 19,5 (17,75- 20,25) 15,5 (12,25- 19,5) 1,01 (0,95-1,08) 0,632 Ingreso por causa médica n (%) 8 (57,1) 14 (32,6) 2,27 (0,79-6,57) 0,129 Ingreso por causa quirúrgica n (%) 5 (35,7) 12 (27,9) 1,38 (0,46-4,13) 0,563 Ingreso por causa traumatológica n (%) 1 (7,1) 17 (39,5) 0,15 (0,02-1,12) 0,064 Shock séptico n (%) 11 (78,6) 19 (44,2) 2,26 (0,63-8,13) 0,212 Fracaso renal agudo n (%) 11 (78,6) 16 (37,2) 3,5 (0,97-12,54) 0,055 3,88 (1,06-14,21) 0,04 Colistina n (%) 13 (92,9) 40 (93,0) 0,03 (0,002-0,47) 0,013 0,02 (0,001-0,72) 0,033 Bacteriemia n (%) 6 (42,9) 9 (20,9) 4,49 (1,52-13,3) 0,007 4,67 (1,53-14,25) 0,007 85 Entre los pacientes colonizados que no desarrollaron NAVM, las variables que se relacionaron con una mayor mortalidad en el análisis bivariante fueron el sexo masculino, el índice de Charlson, la puntuación APACHE II al ingreso, el shock séptico, el fracaso renal agudo y el tratamiento con colistina (tabla 19). Tabla 19. Factores relacionados con la mortalidad en pacientes con colonización respiratoria por A. baumannii (análisis bivariante). Variable Fallecidos (n=12) Supervivientes (n=31) p OR (IC95%) Sexo femenino n (%) 2 (16,7) 15 (48,4) 0,070 0,213 (0,04-1,137) Edad mediana (IQR) 68,5 (53,5-73) 62 (43-70) 0,146 1,038 (0,987-1,091) Índice de Charlson mediana (IQR) 2,5 (1-3,75) 0 (0-1) 0,003 3,117 (1,47-6,612) APACHE II mediana (IQR) 19 (16-24) 15 (10-21) 0,065 1,12 (0,993-1,264) Ingreso por causa médica n (%) 8 (66,7) 16 (51,6) 0,376 1,875 (0,446-7,54) Ingreso por causa quirúrgica n (%) 2 (16,7) 6 (19,4) 0,839 0,833 (0,143-4,845) Ingreso por causa traumatológica n (%) 2 (16,7) 9 (29) 0,411 0,489 (0,089-2,689) Shock séptico n (%) 9 (75) 8 (25,8) 0,006 8,625 (1,859-40,009) Fracaso renal agudo n (%) 8 (66,7) 5 (16,1) 0,003 10,4 (2,24-48,275) Tratamiento con colistina n (%) 7 (58,3) 6 (19,4) 0,017 5,833 (1,364-29,941) Tabla 20. Factores asociados con la mortalidad en los pacientes con colonización respiratoria por A. baumannii (análisis multivariante). Muerte (n=14) p OR (IC95%) Índice de Charlson mediana (IQR) 2,5 (1-3,75) 0,004 3,29 (1,45-7,47) Fallo renal agudo n (%) 8 (66,7) 0,011 12,8 (1,77-92,23) Respecto a los modelos multivariantes realizados mediante regresión logística, cabe destacar que el shock séptico y el fracaso renal agudo se comportaron como variables colineales, siendo seleccionadas en todos los modelos construidos (para la 86 muestra global, para la de pacientes colonizados y para la de pacientes con NAVM) como factores de riesgo de mortalidad cuando se analizaron por separado, con mínimas diferencias en la capacidad discriminativa de los distintos modelos. 5.1.2.2. Factores relacionados con la estancia en UCI. Análisis bivariante y multivariante. Los factores relacionados con la estancia en UCI en el conjunto de los pacientes estudiados aparecen recogidos en la tabla 21. El desarrollo de NAVM por A. baumannii (p=0,004) y una mayor edad (p=0,01) se relacionaron de forma independiente con una estancia en UCI más prolongada. La duración de la estancia entre el ingreso en UCI y el desarrollo de colonización o NAVM por A. baumannii no se relacionaron con la duración de la estancia en UCI (p=0,1). Los factores relacionados con la estancia prolongada en los subgrupos de pacientes con colonización respiratoria o NAVM aparecen reflejados en las tablas 22 y 23, respectivamente. Tabla 21. Factores asociados con estancia en UCI prolongada en la muestra global de pacientes incluidos (n=67). Variable Análisis bivariante Análisis multivariante p OR (IC95%) p OR (IC95%) NAVM 0,007 1,81 (1,18-2,79) 0,004 1,88 (1,23-2,88) Edad 0,041 1,01 (1,00-1,03) 0,010 1,01 (1,00-1,03) Sexo femenino 0,097 1,45 (0,93-2,26) - - Índice de Charlson 0,257 1,45 (0,90-1,44) - - APACHE II 0,03 1,04 (1,00-1,07) 0,47 1,01 (0,98-1,05) Shock séptico 0,011 1,80 (1,15-2,81) 0,204 1,35 (0,85-2,15) Fracaso renal agudo 0,015 1,84 (1,13-3,01) 0,107 1,5 (0,91-2,47) Bacteriemia 0,98 0,99 (0,50-1,97) - - 87 Tabla 22. Factores asociados con mayor estancia en UCI en los pacientes con NAVM (n=40). Variable Análisis bivariante Análisis multivariante p OR (IC95%) p OR (IC95%) Edad 0,058 1,02 (0,99-1,04) 0,077 1,02 (0,99-1,03) Sexo femenino 0,219 1,43 (0,80-2,57) - - Índice de Charlson 0,410 1,12 (0,85-1,46) - - APACHE II 0,365 1,02 (0,98-1,06) - - Shock séptico 0,176 1,46 (0,84-2,56) - - Fracaso renal agudo 0,067 1,70 (0,96-3,00) 0,088 1,61 (0,92-2,82) Bacteriemia 0,381 0,73 (0,36-1,48) - - Tabla 23. Factores asociados con estancia en UCI prolongada en el grupo de pacientes con colonización respiratoria (n=27). Variable Análisis bivariante Análisis multivariante p OR (IC95%) p OR (IC95%) Edad 0,120 1,01 (0,99-1,03) - - Sexo femenino 0,042 1,92 (1,03-3,59) 0,049 1,78 (1,00-3,22) Índice de Charlson 0,934 1,02 (0,52-2,04) - - APACHE II 0,022 1,06 (1,01-1,12) 0,027 1,05 (1,00-1,10) Shock séptico 0,078 1,99 (0,91-4,31) - - Fracaso renal agudo 0,640 1,28 (0,43-3,80) - - 88 5.2. OBJETIVO 2. Comparar la presencia de determinados factores de virulencia entre las cepas clínicas colonizantes y productoras de infección: formación de biofilm, motilidad, expresión de ompA, adquisición de hierro y presencia de hemolisinas. 5.2.1. Relación clonal de las cepas. 5.2.1.1. Elección de las cepas. Para los estudios de virulencia, se eligió la primera cepa procedente de un cultivo de ATB en cada paciente. De estas, 59 pertenecían a pacientes con colonización respiratoria y 41 a pacientes con NAVM. Dieciséis de los colonizados desarrollaron ulteriormente una NAVM: en estos casos se tomó también la primera muestra de ATB del mismo día o inmediatamente posterior a la fecha del diagnóstico de neumonía. No obstante, en tres de estos pacientes el diagnóstico de NAVM se produjo sin que hubiera una muestra de ATB concomitante o en las primeras 72 horas (basándose en la presencia de colonización previa y de un hemocultivo coincidente con el diagnóstico de NAVM); por tanto, solo se añadieron 13 cepas a las 100 previas. Las 15 cepas procedentes de hemocultivos también fueron seleccionadas para su análisis. 5.2.1.2. Relación clonal según REP-PCR. Se obtuvieron 3 clones mediante la técnica de REP-PCR, denominados clones A, B y C. El 98,5% de los aislados pertenecía al clon A. Figura 6. Patrón de bandas en electroforesis de REP-PCR de varias cepas analizadas. Las 12 primeras pertenecen al clon A, mientras que la última pertenece al clon C. 89 5.2.1.3. Relación clonal según PFGE. Se obtuvieron siete clones diferentes mediante esta técnica, a los que se denominó con cifras del 1 al 7. El clon 5 se correspondió con el clon B por REP-PCR y el clon 1, se correspondió con el clon C por REP-PCR. La distribución de cepas en los mismos fue la que se representa en la tabla 24. Tabla 24. Distribución por PFGE de las cepas analizadas. Clon por PFGE Tipo de cepa 1 2 3 4 5 6 7 Colonizantes - 16 1 32 - 3 5 NAVM 1 12 5 30 1 2 4 Bacteriémica - 3 1 9 - - 2 TOTAL 1 31 7 71 1 5 11 Gráfico 8. Distribución temporal y espacial de los distintos clones de A. baumannii según PFGE aislados. 96 5.3.1. Relación de los factores de virulencia con el desarrollo de NAVM. 5.3.1.1. Relación de la formación de biofilm con el desarrollo de NAVM. Siete (12,5%) cepas procedentes de ATB de pacientes colonizados, 9 (15,8%) procedentes de ATB de pacientes con NAVM y 2 (13,3%) procedentes de hemocultivos fueron hiperproductoras de biofilm (p=0,87) (Gráfico 15). Gráfico 15. Distribución de la producción de biofilm según el origen de la muestra. Entre los pacientes con NAVM, 10 (17,5%) tuvieron aislados hiperproductores de biofilm, frente a 6 (13,9%) de los pacientes que solo tuvieron colonización respiratoria (p=0,59). Tres de los pacientes con NAVM tuvieron bacteriemia y un aislado hiperproductora de biofilm, sin que ambos hecho presentaran asociación significativa. 5.3.1.2. Relación de la motilidad en superficie con el desarrollo de NAVM. No se encontró asociación entre ningún fenotipo de motilidad y el desarrollo de NAVM. Ocho (13,5%) cepas procedentes de ATB de pacientes colonizados, 5 (9,2%) procedentes de ATB de pacientes con NAVM y 1 (6,6%) procedentes de hemocultivos no presentaban motilidad en superficie (p=0,35), el resto de cepas sí la presentaron. Seis (10,5%) de los pacientes que desarrollaron NAVM y 6 (13,9%) de los pacientes colonizados tenían cepas sin motilidad (p=0,35). 97 5.3.1.3. Relación de la expresión de ompA con el desarrollo de NAVM y NAVM bacteriémica. Análisis bivariante y multivariante. La expresión de ompA fue diferente en pacientes colonizados y pacientes con NAVM: 0,39 (0,2-0,69) vs. 1,64 (1,18-2,37); p<0,001 (Gráfico 16). Gráfico 16. Distribución de la expresión de OmpA en pacientes colonizados o con NAVM. La distribución fue diferente también entre pacientes con NAVM sin bacteriemia, con expresión mediana de 1,43 (1,4-1,9) y NAVM bacteriémica, con expresión mediana de 2,37 (2,33-2,94); p<0,001 (Gráfico 17). Gráfico 17. Distribución de la expresión de OmpA en pacientes colonizados, con NAVM no bacteriémica o con NAVM bacteriémica. 98 Tabla 25. Factores asociados con la expresión de OmpA. Análisis bivariante y multivariante. Bivariante Multivariante p B (IC95%) p Clon1 0,980 -0,05 (-019 – 0,09) 0,459 Biofilm2 0,332 - - Motilidad1 0,443 - - Diagnóstico*1 <0,001 1,063 (0,75-1,37) <0,001 * Colonización, NAVM o NAVM bacteriémica. 1 Variables cualitativas 2 Variables cuantitativas 5.3.2. Relación de los factores de virulencia con la mortalidad. La relación de los distintos factores de virulencia con la mortalidad solo se estudió en pacientes con NAVM. 5.3.2.1. Relación de la formación de biofilm con la mortalidad. La producción de biofilm no se asoció con la mortalidad en el conjunto de la muestra, en el grupo de pacientes con colonización respiratoria ni en el conjunto de los pacientes con NAVM. El fenotipo hiperproductor de biofilm se asoció con la mortalidad (p=0,044) en el análisis bivariante en el subgrupo de pacientes con NAVM bacteriémica. Esta asociación no se encontró en la muestra global, en los pacientes con colonización respiratoria ni en el conjunto de pacientes con NAVM. (Gráfico 18) No obstante, esta asociación no alcanzó la significación estadística al comparar el valor de producción de biofilm entre supervivientes (0,10 [0,05-0,14]) y fallecidos (0,11 [0,07- 0,28]) en el grupo de pacientes con NAVM bacteriémica (p=0,283). Dado el reducido tamaño del grupo de pacientes con NAVM bacteriémica, no se pudo ajustar el valor de la producción de biofilm por otras variables relacionadas con la mortalidad en un análisis multivariante. 99 Gráfico 18. Asociación entre la producción de biofilm y la mortalidad en el conjunto global de los pacientes y en pacientes con colonización respiratoria, con NAVM o con NAVM bacteriémica. 100 5.3.2.2. Relación de la motilidad en superficie con la mortalidad. El fenotipo de la motilidad en superficie no se asoció con la mortalidad en el conjunto de los pacientes ni tampoco en ninguno de los subgrupos (colonizados, pacientes con NAVM y pacientes con NAVM bacteriémica), como se observa en el gráfico 19. Gráfico 19. Asociación entre la motilidad de las cepas y la mortalidad en el conjunto global de los pacientes y en pacientes con colonización respiratoria, con NAVM o con NAVM bacteriémica. 101 5.3.2.3. Relación de la expresión de ompA con la mortalidad. La expresión de ompA se relacionó con la mortalidad en los pacientes con NAVM, siendo de 2,37 (2,33.3,28) en los pacientes fallecidos (n=5) y de 1,21 (1,05- 1,73) en los supervivientes (n=8), con un valor de p=0,019. (Gráfico 20) Gráfico 20. Distribución de la expresión de ompA en pacientes fallecidos o supervivientes en a) Muestra global, b) Pacientes con NAVM. Esta asociación entre expresión de ompA y mortalidad permanecía en los pacientes con NAVM no bacteriémica (p=0,004) (Gráfico 21), mientras que en la NAVM bacteriémica se pierde dicha asociación (p=0,45) (Gráfico 22). Gráfico 21. Distribución de la expresión de ompA en pacientes con NAVM sin bacteriemia fallecidos o supervivientes. 102 Gráfico 22. Distribución de la expresión de ompA en pacientes con NAVM bacteriémica fallecidos o supervivientes. Se realizó un análisis multivariante ajustando por el índice de Charlson, al ser el factor más constantemente relacionado con la mortalidad en el conjunto de la muestra. Aunque en ningún caso (muestra global, grupo de pacientes con colonización respiratoria o grupo de pacientes con NAVM) la expresión de ompA llegó a demostrar relación estadísticamente significativa, su valor dentro del modelo varía respecto al índice de Charlson como predictor de mortalidad en pacientes colonizados o con NAVM (tablas 26-28). Tabla 26. Factores relacionados con la mortalidad en la muestra global (análisis multivariante). p OR (IC95%) Índice de Charlson 0,028 3,55 (1,143-11,039) Expresión de ompA 0,088 2,77 (0,858-8,985) n=29 Tabla 27. Factores relacionados con la mortalidad en pacientes con colonización respiratoria (análisis multivariante). p OR (IC95%) Índice de Charlson 0,062 7,11 (0,903-56,114) Expresión de ompA 0,517 0,35 (0,015-8,220) n=16 103 Tabla 28. Factores relacionados con la mortalidad en pacientes con NAVM (análisis multivariante). p OR (IC95%) Índice de Charlson 0,303 4,37 (0,264-72,40) Expresión de ompA 0,084 32,25 (0,62-1663,75) n=13 5.4. OBJETIVO 4. Estudiar la asociación entre la presencia de mecanismos de resistencia a imipenem (baja expresión de porinas y presencia de carbapenemasas) y los factores de virulencia en la colección de cepas caracterizadas a partir del objetivo primero. 5.4.1. Mecanismos de resistencia a carbapenemas. 5.4.1.1. Estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. Las CMI y CMB de imipenem. amikacina. ceftazidima. ciprofloxacino. colistina. rifampicina. sulbactam y tigeciclina frente a los 126 aislados de A. baumannii seleccionados aparecen reflejadas en la Tabla 29. En el estudio mediante Etest, todas las cepas fueron resistentes a meropenem, con un punto de corte superior a 8 mg/l (límite de detección de la técnica) excepto un aislado, que tuvo una CMI de 0,38 mg/l. (Figura 9). Tabla 29. Sensibilidad in vitro de los aislados de A. baumannii elegidos para el estudio a los antibióticos seleccionados. Antimicrobiano Rango de CMI CMI50 CMI90 CMB50 CMB90 % cepas sensibles Imipenem 0,25-256 16 128 32 128 0,79 Meropenem 0,38->8 >8 >8 - - 0,79 Amikacina 0,25-64 8 32 8 64 74,6 Ceftazidima 16-256 64 128 64 128 0 Ciprofloxacino 0,5 32 128 64 128 0 Colistina 0,06-0,12 0,06 0,12 0,06 0,12 100 Rifampicina 1-128 32 128 64 256 15,87 Sulbactam 2-64 4 16 8 32 58,73 Tigeciclina 0,06-0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 100 104 Imagen 1. Imagen 2. Figura 9. La imagen 1 muestra el resultado del Etest de la única cepa sensible a meropenem, con una CMI de 0,38 mg/l. La imagen 2 muestra el resultado de el resto de estudios que se realizaron, en los que se detectó una CMI superior a 8 mg/l. 5.4.1.2. Caracterización de carbapenemasas. 5.4.1.2.1. Presencia de carbapenemasas y relación con la CMI de imipenem. Distribución clonal. En el estudio fenotípico mediante Etest MP/MPI, ningún aislado presentó criterios de presencia de MBL. En la PCR para determinación de oxacilinasas, todas las cepas contenían en gen de blaOXA-51, aunque solo en 11 (8,7%) estaba precedida por la secuencia ISAba1. No se encontró ninguna cepa productora de blaOXA-23 ni de las MBL IMP o VIM. La presencia de otras oxacilinasas (blaOXA-40 y blaOXA-58) fue variable, como refleja la Tabla 30. Tabla 30. Distribución clonal y CMI de imipenem de las cepas productoras de distintas carbapenemasas. Carbapenemasa CLON Total Imipenem Meropenem 1 2 3 4 5 6 7 CMI50 Rango CMI50 blaOXA-23 - - - - - - - 0 - - - blaOXA-40 1 - 3 2 - 4 11 21 128 8-256 >8 blaOXA-58 - 31 4 68 - 1 - 104 16 8-64 >8 ISAbaI –blaOXA-51 - - - 1 - 3 7 11 128 8-256 >8 Ninguna - - - - 1 - - 1 0,25 - 0,38 IMP - - - - - - - 0 - - - VIM - - - - - - - 0 - - - 105 Tabla 31. Patrones de carbapenemasas y su relación con la CMI de imipenem. Patrón de carbapenemasas n CMI50 imipenem [OXA-58]- [OXA-40]- [ISAba1 OXA-51]- 1 0,25 [OXA-58]+ [OXA-40]- [ISAba1 OXA-51]- 103 16 [OXA-58]+ [OXA-40]- [ISAba1 OXA-51]+ 1 32 [OXA-58]- [OXA-40]+ [ISAba1 OXA-51]- 11 64 [OXA-58]- [OXA-40]+ [ISAba1 OXA-51]+ 10 128 La distribución de estos patrones fue desigual entre los distintos clones (p<0,001), como puede observarse en el gráfico 23. Gráfico 23. Distribución clonal de los distintos patrones de carbapenemasas. Los aislados productores de blaOXA-58 presentaron valores CMI de imipenem significativamente inferiores a los aislados productores de blaOXA-40 (p<0,001) (Gráfico 24). Dentro de los aislados productores de blaOXA-40, aquellos con ISAbaI OXA-51 tendían a tener valores superiores, sin que se encontraran diferencias estadísticamente significativas respecto a los aislados que no expresaban OXA-51 (p=0,113) (Gráfico 25). 112 La duración de la ventilación mecánica invasiva es un factor de riesgo conocido de adquisición de A. baumannii y de desarrollo de NAVM (229)(232). En esta cohorte, la duración fue más prolongada que en otras series (229), pero no se encontraron diferencias significativas entre colonizados y pacientes con NAVM. La extubación precoz es una factor protector de desarrollo de NAVM, y está recomendada como medida preventiva de la misma (233). La densidad de incidencia de NAVM por A. baumannii en los pacientes incluidos en el estudio fue de 28,5 casos/1000 días de ventilación mecánica. En nuestro entorno, la incidencia global de NAVM se encuentra en torno a 15 episodios/1000 días de ventilación, según los datos recabados en más de 100 UCIs españolas de 2000 a 2009 por el Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial (ENVIN) (234). Esta cifra sigue siendo elevada en comparación con otros países: en Estados Unidos, el sistema de vigilancia nacional United States National Healthcare Safety Network reportó una tasa de incidencia de 3,7 casos por cada 1000 días de ventilación mecánica en 2006-2008 (235). Por este motivo, se han desarrollado iniciativas en nuestro país destinadas a reducir la incidencia de NAVM, como el proyecto “Neumonía-Zero”, cuyo objetivo es alcanzar una tasa por debajo de 9 casos de NAVM/1000 días de ventilación mecánica en nuestro país (233). Los resultados de nuestro estudio, con una tasa de NAVM por A. baumannii que duplica la media nacional de NAVM por cualquier causa, sugieren que la adquisición de A. baumannii en la vía respiratoria podría elevar notablemente la posibilidad de desarrollar esta infección, pero su diseño impide afirmarlo, ya que desconocemos la incidencia global de NAVM por cualquier causa durante el mismo periodo. La adquisición se bacterias MDR, incluyendo la de A. baumannii, se ha considerado un factor de riesgo de incremento de infecciones nosocomiales. Esta afirmación se basa fundamentalmente en estudios de casos y controles (236)(237). Sin embargo, en algunos, como el realizado por Playford et al. (230), la incidencia de infección nosocomial no fue superior en el grupo de pacientes con A. baumannii que en los controles. En dicho estudio, que no describe específicamente cuántas de las infecciones eran NAVM, los factores de riesgo asociados al desarrollo de infección por A. baumannii fueron la densidad de colonización, descrita como la ratio entre el número de muestras positivas para A. baumannii respecto a las muestras solicitadas, y las transfusiones de sangre. Son escasos los estudios de seguimiento en los que se parte de la colonización por A baumannii, se observa cuántos pacientes desarrollan infección clínica y se 113 analizan los factores asociados a ello. Diseños diferentes a este impiden que la incidencia se describa en forma de tasa, como es NAVM/1000 días de ventilación mecánica, que al ajustar por los días en riesgo, permite analizar con más precisión las diferencias entre grupos que la incidencia acumulada. El estudio de cohortes más importante realizado al respecto es reciente (238). En él se analizó la aparición de infección clínica por A. baumannii en pacientes ingresados en una UCI a los que se les habían realizado cultivos de vigilancia. Los pacientes con aislamiento de A. baumannii en dichos cultivos tenían un riesgo 8,4 veces superior de padecer una infección clínica por este microorganismo, el 47% de las cuales fueron NAVM, que aquellos con cultivos negativos. Las muestras utilizadas para los cultivos de vigilancia habían sido frotis rectales o secreciones respiratorias, pero el artículo no revela si los que desarrollaron neumonía habían tenido cultivos positivos en muestras respiratorias, frotis rectal o ambos. 6.1.1.3. Tratamiento antimicrobiano. El consumo de antimicrobianos previo a la adquisición de A. baumannii fue muy elevado, tanto en pacientes colonizados como en pacientes con NAVM. Sin embargo, cualitativamente existieron diferencias en el patrón de prescripción de ambos grupos: los pacientes con NAVM recibieron con más frecuencia tratamiento con β-lactámicos de amplio espectro (cefepima, piperacilina-tazobactam y carbapenemas) y con vancomicina, mientras que los colonizados recibieron más levofloxacino. La UCI es una de las áreas del hospital donde se produce un mayor consumo de antimicrobianos y éste constituye uno de los factores de riesgo clave para la adquisición de microorganismos MDR, incluyendo A. baumannii (43)(9)(38). El uso previo de carbapenemas es un factor de riesgo muy relevante y ampliamente reflejado en la literatura para la adquisición de A. baumannii resistente a carbapenemas (239)(240). Sin embargo, no hemos encontrado ningún estudio en el que se compare específicamente el consumo de antimicrobianos entre pacientes con infección y colonización por este microorganismo. Nuestros resultados sugieren que el consumo previo de antibioterapia de amplio espectro, especialmente carbapenemas, no sólo aumenta la probabilidad de adquirir A. baumannii por selección de cepas resistentes, sino la probabilidad de padecer una infección por el mismo. La patogenia de este efecto estaría por aclarar. Una posible explicación sería que algunos factores de virulencia se sobreexpresen o se seleccionen en presencia de antibióticos de amplio espectro, como sabemos que ocurre con la producción de biofilm en medio con 114 concentraciones subinhibitorias de imipenem (241) o la expresión de ompA en presencia de meropenem (200). La mayoría de los pacientes con NAVM recibió tratamiento con colistina intravenosa a dosis de 2 MU cada 8 horas. En el apartado de resultados 5.4.4.1. se muestra la sensibilidad de los aislados estudiados, en la que se puede apreciar que la totalidad de ellos eran susceptibles a colistina y prácticamente todos, resistentes a carbapenemas. Colistina ha emergido como herramienta terapéutica, tras muchos años de desuso, debido a la situación epidemiológica de bacilos gramnegativos, con A. baumannii a la cabeza, en los que no existe otra opción válida de tratamiento. Sin embargo, la dosis óptima está por definir, ya que la estándar (2 MU/8 h) parece ser insuficiente a tenor de los resultados de múltiples estudios farmacocinéticos (104)(103). Los aislados de A. baumannii obtenidos en este estudio fueron extraordinariamente sensibles a colistina, con una CMI90 de 0,12 mg/l. Esta circunstancia explicaría la eficacia del tratamiento. 6.1.1.4. Aspectos microbiológicos. 6.1.1.4.1. Concentración bacteriana. La mayoría de los aislados de A. baumannii presentó una concentración elevada, superior a 6 log10 UFC/ml. Aunque unos pocos casos de colonización tuvieron valores inferiores, los resultados muestran una clara similitud en la concentración bacteriana en ATB entre pacientes colonizados o con NAVM por A. baumannii, que también fue similar entre diferentes clones. Entre los pacientes colonizados, tanto los que permanecieron en dicho estado como los que desarrollaron ulteriormente una NAVM por A. baumannii, la carga bacteriana fue elevada desde la primera muestra, no existiendo diferencias entre ellos ni una concentración a partir de la cual se pudiera predecir el desarrollo de NAVM. La carga bacteriana fue similar en todos los clones incluidos. Por consiguiente, estos resultados sugieren que A. baumannii tiene la capacidad de colonizar con elevada carga bacteriana la vía respiratoria de los pacientes ventilados, y que por tanto dicha carga no es útil para diferenciar entre infección y colonización. En el diagnóstico microbiológico de la NAVM continúan siendo motivo de controversia la validez de los distintos tipos de muestra y la utilidad de los cultivos cuantitativos. Fundamentalmente, existen dos clases de estrategias diagnósticas 115 opuestas: la estrategia “no invasiva” o “clínica”, basada en cultivos de secreciones traqueales, habitualmente cualitativos; y la “invasiva”, fundamentada en el uso de cultivos cuantitativos de muestras obtenidas del tracto respiratorio inferior, habitualmente mediante broncoscopia. Una revisión sistemática publicada por la Cochrane Collaboration encontró que la estrategia clínica no era inferior a la invasiva en lo que respecta al pronóstico clínico de la NAVM (242). No obstante, algunos autores consideran que las técnicas invasivas con cultivos cuantitativos presentan ventajas en lo que respecta a mayor grado de confianza del clínico en los resultados, a la contribución al uso racional de antimicrobianos y a un valor predictivo negativo, y las recomiendan como prueba estándar para el diagnóstico de NAVM, tanto con fines clínicos como de vigilancia epidemiológica (243). Otros, en cambio, afirman que esta recomendación no está suficientemente avalada por la literatura ni exenta de problemas (244). El principal es la falta de reproducibilidad de los métodos, tanto en la toma de las muestras (en la concentración del LBA pueden influir factores como la cantidad de suero instilado, el área pulmonar explorada o la exposición a antimicrobianos), como en el procesamiento de la mismas. El aspirado de secreciones endotraqueales es un procedimiento más sencillo que la toma de muestras invasivas, lo que motiva que muchos clínicos continúen eligiéndolo. El umbral de concentración en esta muestra para el diagnóstico de NAVM se encuentra en 5-6 log10 UFC/ml. Esta cifra procede de varios estudios bastante heterogéneos en su selección de pacientes y en sus criterios diagnósticos de NAVM (245). La correlación entre la concentración de ATB y la de LBA no está suficientemente aclarada. Berdal et al.(246) llevaron a cabo un estudio de seguimiento que analizó la dinámica de colonización respiratoria en pacientes ventilados con varias muestras consecutivas de frotis faríngeo, ATB y LBA. Estos autores detectaron una elevada correlación en los microorganismos encontrados en las tres localizaciones, hasta el punto de que si un patógeno respiratorio no estaba presente en la faringe, tampoco lo estaba en el LBA. Sin embargo, no aportan la concentración bacteriana en ATB, por lo que no es posible correlacionarla con la del LBA. Cabe destacar que, en este estudio, no hubo asociación entre el aislamiento de patógenos en LBA con una concentración ≥4 log10 UFC/ml y la presencia o no de infiltrado radiológico compatible con una NAVM. En nuestro estudio, no existió relación entre la exposición a antibioterapia y la concentración bacteriana. Esta relación sí se ha puesto de manifiesto en estudios previos, como el mencionado de Berdal et al. (246), en el que se detectó que los 116 pacientes que estaban recibiendo antibioterapia presentaban cultivos positivos por encima de 4 log10 UFC/ml con una frecuencia muy inferior a la de aquellos sin tratamiento antimicrobiano (OR 0,31 [IC95% 0,11-0,91]). Este estudio no menciona si la concentración bacteriana en ATB presentó un comportamiento similar. Es plausible que la elevada concentración bacteriana en las muestras de nuestro estudio esté en relación con la presencia de material extraño (tubo endotraqueal), habida cuenta de que este proporciona una superficie sobre la que los patógenos pueden formar biopelícula, siendo un factor de riesgo conocido de persistencia de colonización, si bien su efecto sobre la concentración bacteriana no está bien descrito (247). En nuestro caso, menos del 25% de las muestras con A. baumannii presentaba una carga bacteriana inferior a 6 log10 UFC/ml. Desde la primera muestra con A. baumannii, la mayoría de los pacientes ya presentaban una carga elevada. La colonización es, fisiopatológicamente, el paso previo a la infección. Buen ejemplo de ello en infecciones por A. baumannii es el estudio de Latibeaudiere et al. (238) mencionado previamente, que demostró relación entre el desarrollo de infección clínica y la colonización previa por A. baumannii. Sin embargo, en dicho estudio se diagnosticó la colonización mediante cultivos cualitativos, lo cual impide saber si la concentración bacteriana aumentó progresivamente hasta alcanzar un inóculo capaz de producir infección, o bien el desarrollo de esta depende de otros factores. El fenómeno de la elevada concentración bacteriana no se puede atribuir a una característica clonal, ya que las distintas clonas estudiadas presentaban un comportamiento similar. 6.1.1.5.2. Otros aislamientos microbiológicos. Además de A. baumannii, aproximadamente la mitad de los pacientes incluidos presentaron múltiples aislamientos microbiológicos, en ATB y/o en sangre, durante el seguimiento. El significado clínico de estos aislamientos es variable. Algunos forman parte del motivo de ingreso (como S. pneumoniae, L. monocytogenes o N. meningitidis). La mayoría, en cambio, aparecen durante el transcurso de la estancia en UCI y, especialmente los procedentes de ATB, son reflejo de la presión antibiótica. Entre ellos hay 7 aislamientos en ATB de Candida spp., 2 de P. acnes y 2 de estafilococos coagulasa-negativo (SCN), que no tienen un papel patogénico en vías respiratorias bajas, aunque sí lo tengan aislamientos equivalentes en hemocultivos (15 bacteriemias por SCN y 3 candidemias). En cambio, también hay otros con una notable importancia como patógenos nosocomiales, como S. aureus (12 aislamientos 117 en ATB y 4 en hemocultivos), P. aeruginosa (14 aislamientos en ATB) y múltiples enterobacterias (17 aislamientos en ATB y 7 en sangre). El impacto que cada uno de estos aislamientos ha tenido sobre el pronóstico de los pacientes es difícil de conocer con los datos de los que disponemos. No obstante la diversidad de aislamientos microbiológicos, A. baumannii es el que predomina durante todo el seguimiento, apareciendo en más del 50% de los cultivos de ATB desde la primera muestra tomada a los pacientes. Estos resultados reflejan la importante presión de colonización existente en las áreas estudiadas. Se considera habitualmente que A. baumannii es un patógeno que causa NAVM tardía (248). Sin embargo, en esta cohorte, algunos pacientes tuvieron NAVM causada por A. baumannii al tercer día de ventilación mecánica. 6.1.1.6. Evolución clínica y pronóstico. 6.1.1.6.1. Mortalidad. En nuestra cohorte, la mortalidad de los pacientes con NAVM por A. baumannii fue del 24,6%. Esta cifra es inferior a la descrita en la mayor parte de estudios al respecto, tanto para la NAVM de cualquier etiología como para la causada por A. baumannii, para la que se describe una mortalidad cruda que oscila entre 34,5 y 84% (232)(249)(60)(54)(65)(250)(59)(251)(46). La mortalidad de los pacientes colonizados fue similar a la de los pacientes con NAVM: 27,9% (p=0,7), al igual que los resultados del análisis de supervivencia entre ambos grupos (p=0,34). Existen pocos estudios que hayan comparado el pronóstico de la NAVM por A. baumannii respecto a la colonización respiratoria. Con un diseño similar al de este estudio, Zhuo et al. (252) describieron una mayor mortalidad en pacientes colonizados con un elevada carga bacteriana por P. aeruginosa que en aquellos con una NAVM producida por el mismo patógeno con menos concentración bacteriana en ATB, con una HR=. La explicación a este fenómeno no es fácil de dilucidar, ya que los pacientes no presentan diferencias clínicas significativas en otros parámetros con posible valor pronóstico (comorbilidades previas, diagnóstico al ingreso, gravedad clínica, complicaciones durante la estancia en UCI). Esto plantea la cuestión de que la colonización con elevado inóculo por bacilos gramnegativos no fermentadores pueda ser deletérea per se para pacientes con ventilación mecánica, aun no produciendo neumonía. Los autores sostienen la hipótesis de que ello sea secundario a la adquisición de cepas más virulentas, basándose en los niveles elevados de la toxina 118 de P. aeruginosa PcrV. Las principales limitaciones de este estudio son el reducido tamaño muestral, que le permite una potencia de solo el 56%, y que no tiene en cuenta algunas situaciones clínicas que explicarían los resultados, como la posibilidad de una infección grave por P. aeruginosa de localización distinta a la respiratoria o datos de deterioro inmunológico que explicarían tanto la facilidad de P. aeruginosa para proliferar como la mayor mortalidad. Los resultados de nuestro estudio no sugieren un papel patogénico de la colonización de alto inóculo, a pesar de que la mortalidad sea similar en pacientes colonizados y con NAVM. En primer lugar, no hemos detectado relación entre la concentración bacteriana de los pacientes colonizados y la mortalidad. En segundo lugar, lo que observamos no es un incremento de mortalidad en los pacientes colonizados, sino, como señalábamos antes, una mortalidad cruda de la NAVM por A. baumannii inferior a la descrita en otros estudios. Numerosos autores han estudiado el impacto de A. baumannii sobre la mortalidad de pacientes con NAVM (249)(60)(251)(46). Kollef et al.(251) identificaron a los bacilos gramnegativos no fermentadores, incluyendo casos de A. baumannii, como una etiología de alto riesgo, pero no analizaron separadamente a cada una de las especies. En una cohorte de 163 pacientes con NAVM se describió a A. baumannii como un factor de riesgo independiente de mortalidad (OR 3,3 [IC95% 1,12-9,7]), llegando a alcanzar una mortalidad cruda del 61%(60). Mao et al.(249) encontraron que la NAVM producida por A. baumannii tenía una mortalidad superior a la producida por otros patógenos. No obstante, en un 15,4% de los controles de este estudio, los microorganismos aislados fueron Candida spp. y estafilococos cogulasa-negativo, que no tienen un rol patogénico en vías respiratorias inferiores. Un estudio con 60 casos (pacientes con NAVM producida por A. baumannii) y 60 controles apareados (entre los que se encontraban pacientes con NAVM causada por otros microorganismos y pacientes sin NAVM) no encontró diferencias de mortalidad cruda entre casos y controles. Sin embargo, se realizó un sub-análisis que reveló diferencias significativas de mortalidad entre aquellos casos con NAVM producida por A. baumannii resistente a carbapenemas y sus controles apareados (44% vs. 24%)(46). La heterogeneidad de resultados en cuanto a mortalidad de la NAVM por A. baumannii podría estar explicada por una distribución desigual de los factores de riesgo entre diferentes muestras de pacientes, como se discutirá más adelante. 119 6.1.1.6.2. Estancia en UCI y estancia hospitalaria. La NAVM por A. baumannii fue uno de los factores que se relacionaron de manera independiente con una estancia en UCI más prolongada. Este es un efecto conocido del conjunto de las infecciones nosocomiales (44). No obstante, estudios previos han mostrado que las infecciones por A. baumannii se relacionan con una mayor estancia en UCI que otras infecciones nosocomiales (60). 6.1.2. Factores relacionados con la mortalidad y estancia en UCI. 6.1.2.1. Factores relacionados con la mortalidad. Análisis bivariante y multivariante. Los factores relacionados con la mortalidad fueron la presencia de una situación basal deteriorada (medida con el índice de Charlson) y las complicaciones graves durante el ingreso (shock séptico o fracaso renal agudo), tanto en el global de la muestra como en los pacientes colonizados o con NAVM analizados separadamente. Estas son variables que se relacionan habitualmente con mal pronóstico en pacientes críticos, con o sin NAVM (60). Ello subraya la elevada complejidad de los pacientes atendidos en la UCI, con factores heterogéneos que influencian su pronóstico y dificultan la interpretación del verdadero impacto de la NAVM sobre la mortalidad. Aunque no llegó a seleccionarse como factor independiente, en el análisis bivariante se observa que los pacientes con un motivo de ingreso traumatológico menor mortalidad que los ingresados por otra causa, tanto en pacientes colonizados como infectados. Estos resultados son concordantes con un estudio multicéntrico realizado en 27 UCIs europeas, en el que la mortalidad de la NAVM en pacientes traumatológicos fue inferior a la de pacientes ingresados en UCI por otro motivo (42,6% vs. 17,2%)(253). Aunque achacarse esta diferencia a la menor edad y escasa comorbilidad que suelen presentar estos pacientes, cabe destacar que en el estudio mencionado se conservaba la diferencia tras ajustar por sexo, edad y gravedad al ingreso en UCI (253). En los pacientes con NAVM, además de los referidos, observamos dos factores con un impacto relevante sobre el pronóstico: la presencia de bacteriemia por A. baumannii y el tratamiento apropiado. Este último solo aparece como factor protector en el modelo de Cox. El tratamiento apropiado es un factor pronóstico clave común todas las infecciones graves cuyo impacto también se ha demostrado en la NAVM producida por 120 A. baumannii (254). Un meta-análisis que incluyó 24.186 pacientes procedentes de 44 estudios observacionales (255) encontró que la NAVM se asociaba a mayor mortalidad (OR 1,96 [IC95% 1,26-3,04]) que los grupos con los que se comparaba. Esta asociación, sin embargo, no se produjo en el subgrupo de pacientes con tratamiento inicial correcto. La elevada mortalidad descrita en los pacientes infectados por cepas más resistentes se relaciona probablemente con la menor probabilidad de recibir tratamiento apropiado (60)(46)(57). Por este motivo, a pesar del elevado nivel de resistencia de los aislados incluidos en este estudio, la elevada proporción de pacientes que recibieron tratamiento apropiado y la baja CMI de colistina de las cepas estudiadas, han contribuido a una tasa de mortalidad cruda inferior a la descrita en estudios previos para pacientes con NAVM producida por A. baumannii resistente a carbapenemas (46)(60). Probablemente, la causa de la elevada proporción de pacientes con tratamiento apropiado haya que buscarla en el conocimiento de la ecología local por parte de los clínicos, ya que en pocos pacientes se podían basar en cultivos de colonización previos. El tratamiento utilizado de manera generalizada para tratar a estos pacientes fue colistina en forma de colistimetato sódico (CMS) a dosis de 2 MU cada 8 horas, que es la recogida en la ficha técnica del fármaco. Esta dosis no está sustentada por estudios de farmacocinética y farmacodinámica (PK/PD) como los requeridos en la actualidad para lanzar un antibiótico al mercado. Estudios PK/PD poblacionales han mostrado que una dosis de CMS de 2 MU cada 8 horas tardaría 48 horas en alcanzar una concentración plasmática de 2 mg/l, que es la CMI hasta la que se considera sensible a A. baumannii (103)(256). Sin embargo, estos mismos estudios muestran que con una sola dosis de 2 MU se alcanzan niveles plasmáticos por encima de 0,5 mg/l. Por tanto, es probable que la eficacia clínica de colistina que observamos en nuestra cohorte esté motivada por la extrema sensibilidad de las cepas incluidas (CMI90=0,25 mg/l). La correlación entre CMI de colistina y eficacia no ha sido puesta de manifiesto en estudios clínicos. La mayoría de los que han testado la efectividad de colistina en infecciones producidas por A. baumannii no describen la CMI de los aislados, o lo hacen de manera agregada (91)(257)(258)(259). El estudio que aporta más datos al respecto es el estudio observacional llevado a cabo por Markou et al. (260), en el que se analiza la respuesta clínica de infecciones graves (NAVM o bacteriemia) por bacilos gramnegativos tratadas con colistina 3 MU cada 8 horas. De 10 pacientes con infecciones por A. baumannii, 7 alcanzaron la curación clínica: 6 de ellos tenían un 121 aislado de A. baumannii con una CMI ≤0,5 mg/l y uno tenía una CMI =2 mg/l, pero era también sensible a meropenem y fue tratado concomitantemente con este fármaco. De los que fallaron, dos tenían una CMI=1 mg/l y uno, un valor de CMI ≤0,5 mg/l. Este último fue tratado simultáneamente con cinco fármacos, lo que hace suponer que el fallo pudiera estar explicado por una infección concomitante y/o una situación clínica crítica. La bacteriemia se presenta como un factor de riesgo de mortalidad relevante. Su efecto se aprecia mejor en el análisis de supervivencia, alcanzando un HR ajustado de 4,67. Tal y como este valor y la gráfica de supervivencia reflejan, los pacientes con bacteriemia fallecen más y más precozmente que los que no la presentan. Se puede considerar que la presencia de bacteriemia concomitante a la NAVM alerta de la invasividad y gravedad de la neumonía. La relación entre neumonía bacteriémica y mortalidad está sostenida por datos profusos en la literatura (261)(262), al igual que la elevada mortalidad cruda de la bacteriemia por A. baumannii, que oscila entre el 19% (en una cohorte que incluía pacientes críticos y no críticos)(51) y el 70% (262)(263)(66)(67)(68)(72)(69)(264). En nuestra cohorte, los pacientes con bacteriemia por A. baumannii presentaron una mortalidad cruda del 40%. El factor que más regularmente se relaciona con la mortalidad de la bacteriemia por A. baumannii es el tratamiento inapropiado (67)(72)(69). 6.1.2.2. Factores relacionados con la estancia en UCI. Análisis bivariante y multivariante. La NAVM por A. baumannii fue el factor más sólidamente relacionado con la estancia en UCI. Al desglosar por grupos (pacientes con NAVM o colonizados), se obtienen factores diversos como predictores de la estancia, lo cual aporta una idea de la variedad de factores que pueden influir en dicha estancia y refuerzan la importancia de que la NAVM por A. baumannii sea uno de ellos. Esto es especialmente importante teniendo en cuenta que no se ha ajustado por otras posibles infecciones nosocomiales que tuvieran los pacientes incluidos durante su ingreso. En estudios previos, se han descrito múltiples factores como predictores de estancia prolongada en UCI, que pueden agruparse fundamentalmente en cuatro: situación basal (edad y comorbilidades), situación al ingreso (tipo de patología y gravedad clínica), tipo de tratamientos y soporte utilizados, y complicaciones durante la estancia en la UCI (265)(266). Dentro del último grupo, las infecciones nosocomiales ocupan un lugar destacado como factores que prolongan la estancia en UCI (60), habiéndose 128 iniciativas orientadas a reducir la probabilidad de adhesión y formación de biofilm sobre estos dispositivos, como la fabricación de tubos recubiertos por antimicrobianos, aunque hasta el momento ninguna se ha generalizado (281). Sin embargo, no hay datos previos que sugieran claramente una relación entre la producción de biofilm y la mayor incidencia de NAVM por A. baumannii en comparación con pacientes intubados y con colonización respiratoria por el mismo microorganismo. Algunos estudios han detectado que la capacidad de producir biofilm de aislados de A. baumannii procedentes de infecciones invasivas (muestras como sangre o líquido cefalorraquídeo), es superior a la de aislados procedentes de infecciones superficiales, como úlceras (274). Sin embargo, en otros estudios, tanto experimentales como clínicos, esta relación no aparece (152) o incluso se da la asociación opuesta. Kempf et al. (282) estudiaron los factores de virulencia de dos cepas de A. baumannii aisladas del mismo paciente y que presentaban un comportamiento muy diferente en modelos murinos de neumonía. En la primera, que formaba colonias de aspecto mucoide y era hipervirulenta en ratón, se detectó una producción de biofilm notablemente inferior a la de la segunda cepa, mucho menos virulenta en el modelo. De forma análoga, en un estudio realizado por Zhang et al. (283) con 121 aislados clínicos de A. baumannii procedentes de muestras respiratorias, se encontró que la totalidad de los aislados era productora de biofilm, aunque sólo una proporción de ellos (27,3%) correspondía a aislados hiperproductores. Este fenotipo se asoció con menos incidencia de infección clínica, así como con la estancia en la UCI y el uso previo de antimicrobianos. Estos resultados parecen contradecir la teoría generalizada de que la combinación de tubo endotraqueal con bacterias productoras de biofilm facilita la aparición de NAVM. Sin embargo, ambas observaciones no tienen por qué ser contradictorias. Por un lado, la producción de biofilm sobre el tubo lo que facilitaría sería la colonización respiratoria, mientras que la ulterior aparición de infección invasiva probablemente dependa de otros factores de virulencia y de la situación del huésped. Por otro lado, no se ha establecido un umbral de producción de biofilm a partir del cual sea más probable la infección invasiva. Al ser prácticamente todas nuestras cepas productoras de biofilm, no podemos comparar la incidencia de NAVM con aislados no productores, sino sólo entre cepas con diferentes grados de producción. Ello podría estar diluyendo el posible efecto de este factor. 129 6.3.1.2. Relación de la motilidad en superficie con el desarrollo de NAVM. Las cepas de A. baumannii sin motilidad se distribuyeron de manera homogénea en muestras procedentes de pacientes colonizados o con NAVM. Estos resultados sugieren que no existe relación entre este factor y la capacidad de producir infección de A. baumannii. Los estudios realizados sobre motilidad de A. baumannii hasta la fecha han estado mucho más orientados a conocer los mecanismos que la producen que su posible papel en la capacidad de A. baumannii de producir infecciones en el huésped humano. Con la información de la que disponemos, no podemos asegurar que la motilidad sea un factor de patogenicidad o virulencia. En primer lugar, es un fenotipo obtenido in vitro en condiciones diferentes a las que se producen en el huésped, cuya extrapolación al comportamiento in vivo es difícil de interpretar. No se han realizado hasta la fecha estudios preclínicos apropiados comparando cepas con y sin motilidad, que podrían aclarar mejor el papel de este factor en la producción de infección (118). 6.3.1.3. Relación de la expresión de OmpA con el desarrollo de NAVM y NAVM bacteriémica. Análisis bivariante y multivariante. Los aislados procedentes de pacientes con neumonía presentaron una mayor producción de OmpA que los de pacientes colonizados. Igualmente, los que procedían de pacientes con neumonía bacteriémica tuvieron mayor expresión de OmpA que el resto de aislados. Esta relación entre expresión de ompA e invasividad clínica se conserva tras ajustar en un modelo multivariante por la clonalidad de los aislados. Estos resultados clínicos son concordantes con los datos procedentes de estudios experimentales in vitro y modelos preclínicos que muestran un rol patogénico de OmpA en la infección pulmonar y la bacteriemia, sugiriendo que esta proteína es fundamental para la patogénesis y virulencia de A. baumannii en vías respiratorias y que juega un papel clave en la diseminación a otros órganos y a través del tracto sanguíneo. La incubación ex vivo de A. baumannii en muestras de lavado broncoalveolar y macrófagos, simulando las condiciones del tracto respiratorio, se relacionaba con un aumento de la producción de OmpA. El gen ompA se ha identificado como un gen necesario para la persistencia de A. baumannii en modelos de neumonía (284). Son varios los modelos murinos que han encontrado que la producción de OmpA por K. pneumoniae y A. baumannii juega un papel importante en la progresión de la neumonía (285)(286)(287)(288). 130 También en otras especies se ha demostrado un papel similar de esta proteína o de sus equivalentes. En E. coli, se demostró que era necesaria la expresión de ompA para cruzar la barrera hematoencefálica y para inducir bacteriemia de alto inóculo (289)(290). En P. aeruginosa, la ausencia de OprF se traduce en una falta de virulencia, ya que disminuye la adhesión a células eucariotas, la secreción de exotoxinas y las producción de factores de virulencia dependientes del quorumsensing (291). Existen otras proteínas de membrana externa asociadas con la aparición de bacteriemia. Es el caso de OmpT, una proteasa de membrana externa que podría contribuir a la virulencia de E. coli mediante la inactivación de las proteína de las defensas de huésped y lisando péptidos de las superficies celulares eucariotas (292). OmpT se identificó como el principal factor de virulencia predictor de bacteriemia por E. coli en una cohorte de pacientes veteranos (293). La proteína P2, una porina de H. influenzae, se ha asociado con la producción de bacteriemia en crías de rata tras inocularlo intraperitonealmente (294). Se ha descrito que las condiciones del medio pueden influir sobre la expresión de ompA. La expresión de ompA en E. coli fue diferente según la concentración de glucosa del medio (295). También, como se ha comentado antes, el hecho de cultivar las cepas en un medio similar al lavado broncoalveolar hacía de OmpA se produjera más (284). Sin embargo, podemos constatar que en nuestro estudio la expresión de ompA no está determinada por las condiciones del medio, ya que estas fueron las mismas para todas las cepas. Por tanto, este fenotipo corresponde a cambios estables en las cepas de A. baumannii, aunque hasta el momento no se han identificado las bases moleculares de estos cambios ni qué circunstancias del medio han podido producir dichos cambios. La principal limitación para la interpretación de estos resultados es el reducido tamaño muestral. No obstante, dada su coherencia mostrada con los datos experimentales previos, podemos afirmar que se trata de la primera descripción de un factor de virulencia de A. baumannii que tiene correlación clínica con una mayor invasividad en forma de neumonía y bacteriemia. 131 6.3.2. Relación de los factores de virulencia con la mortalidad. 6.3.2.1. Relación de la formación de biofilm con la mortalidad. La hiperproducción de biofilm no se relacionó con la mortalidad, salvo en el subgrupo de pacientes con NAVM bacteriémica. Incluso esta asociación debe ser tomada con cautela: por una parte, el reducido tamaño muestral impide realizar un análisis multivariante y sugiere que la muestra podría no ser lo suficientemente representativa; por otra parte, esta asociación desaparece cuando se analiza la variable “producción de biofilm” con su valor neto, en lugar de clasificado como hiperproductor o no. Cabe destacar que existía agrupación clonal en dos de los tres aislados hiperproductores de biofilm procedentes de pacientes con NAVM bacteriémica que fallecieron. Esto sugiere que podría existir otro factor de virulencia que explicase una mayor virulencia. Existen pocos estudios que permitan conocer la relación entre la producción de biofilm y el pronóstico de la neumonía producida por A. baumannii. Como comentábamos en el epígrafe 6.3.1.1, se demostró una asociación inversa entre la producción de biofilm y la virulencia en dos cepas de A. baumannii extraídas del mismo paciente (282). No obstante, lo único que se puede extrapolar de estos resultados es que la producción de biofilm no es un mecanismo imprescindible para la virulencia. La capacidad intrínseca de producir biofilm podría no ser tan importante como que el inóculo infectante proceda de bacterias formando biofilm o de bacterias en fase planctónica, según los resultados de un modelo con Galleria mellonella en el que se estudiaron distintos aislados clínicos de A. baumannii. En este modelo, los aislados que procedían de cultivos en biofilm producían mayor letalidad que aquellos en fase planctónica (296). Los datos clínicos al respecto son escasos. En un estudio de seguimiento de pacientes ventilados, el aislamiento de bacterias productoras de biofilm se relacionó con mayores tasas de persistencia microbiana, fallos de tratamiento y recaídas en aquellos pacientes que padecieron una NAVM. No se describe, en cambio, una mayor mortalidad entre los infectados por cepas productoras de biofilm. La interpretación de estos resultados está limitada por el reducido tamaño muestral: 14 pacientes desarrollaron una NAVM, 6 de las cuales estuvieron causadas por A. baumannii (280). En nuestro estudio, la interpretación del pronóstico asociado a la producción de biofilm de las cepas estudiadas podría estar limitada por un tiempo de seguimiento insuficiente y por la elección de las variables resultado. Es posible que, siendo la producción de biofilm un factor que se relaciona con la persistencia en el tiempo, 132 aumente la posibilidad de padecer neumonías u otras infecciones a medio plazo, y con ello la morbimortalidad. El diseño de nuestro estudio impide conocer estos resultados. 6.3.2.2. Relación de la motilidad en superficie con la mortalidad. En el presente estudio no se detectó relación entre la motilidad de los aislados y la mortalidad de los pacientes. Hasta donde sabemos, no existe ningún dato previo que ponga en relación la motilidad de aislados de A. baumannii con el pronóstico clínico de las infecciones que producen. Nuestros datos sugieren que dicha relación no existe, no comportándose la motilidad como un factor de virulencia directo. No obstante, como ya comentábamos en el epígrafe 6.3.1.2, está por esclarecer qué relación guardan los resultados de motilidad in vitro con el comportamiento in vivo de A. baumannii y si este factor tiene algún papel en la patogenicidad o virulencia en el huésped humano. 6.3.2.3. Relación de la expresión de OmpA con la mortalidad. El nivel de expresión de ompA se asoció con la mortalidad en los pacientes con NAVM, y no lo hizo ni en el conjunto de la muestra ni en los pacientes colonizados. Este resultado es coherente con la fisiopatología plausible: en el caso de que la expresión de ompA se relacione con una mayor mortalidad de los pacientes que adquieren A. baumannii en la vía respiratoria, lo hará a través de provocar una infección por las cepas con dicha mayor expresión. Dentro de los pacientes con NAVM, la expresión de ompA se distribuyó de manera desigual entre fallecidos y supervivientes en el grupo de pacientes con NAVM sin bacteriemia que en el grupo de los que tuvieron una NAVM bacteriémica. En los primeros, las fallecidos tuvieron un nivel de expresión notablemente superior, con una mediana que duplica la de los supervivientes. En el caso de los pacientes con bacteriemia, fallecidos y supervivientes tuvieron un índice de expresión de ompA similar. Este fue, como ya se ha comentado en apartados anteriores, superior al del conjunto de los pacientes con NAVM sin bacteriemia. Cabe destacar en ambos casos que el tamaño muestral es muy reducido, lo que dificulta extrapolar las conclusiones. También en el análisis multivariante las distintas poblaciones (muestra global, colonizados y pacientes con NAVM) muestran un comportamiento diferente. En estos análisis se ha excluido la variable “bacteriemia”, por la colinealidad que presenta con la variable “expresión de ompA”. La relación de ompA con la mortalidad está ajustada por 133 el índice de Charlson, uno de los principales factores clínicos predictores de mortalidad seleccionados en el análisis clínico y con ninguna correlación plausible ni estadística con la expresión de ompA, a diferencia de las variables “shock séptico” o “bacteriemia”, también seleccionadas en el análisis clínico. Podemos observar en las tablas que, si bien no alcanzan la significación estadística, el índice de Charlson es la variable que mejor explica la mortalidad en los pacientes colonizados, mientras que en los pacientes con NAVM, la expresión de ompA es la más se relaciona con la mortalidad. Nuevamente, el reducido tamaño muestral limita la potencia estadística y la interpretación de los resultados. Los resultados obtenidos, aun con sus limitaciones, concuerdan con los datos procedentes de estudios preclínicos. Aunque la literatura previa es menos profusa que para la producción de neumonía o bacteriemia, varios modelos experimentales de infección por bacilos gramnegativos han indicado el papel significativo que tiene OmpA en la mortalidad producida por estas infecciones. La delección del gen de ompA convertía a cepas de A. baumannii en defectuosas para causar la muerte en sendos modelos murinos de sepsis peritoneal y neumonía (286)(285). Las mutaciones en el loop1 y el loop2 de ompA en E. coli y una cepa knock-out para el gen de ompA de Enterobacter sakazakii se relacionaron con una supervivencia significativamente mejor que las cepas salvajes en ratones recién nacidos (297)(298). Como comentábamos previamente sobre la relación existente entre la producción de OmpA y el desarrollo de NAVM, la novedad que aportan estos datos es la correlación entre la expresión de ompA in vitro y el pronóstico vital que tiene la infección por estos aislados. Esta constatación cobra especial relevancia en una cohorte en la que los principales factores relacionados con la mortalidad son clínicos. En resumen, la expresión de ompA se relaciona con la presencia de infección invasiva, alcanzando su máximo nivel de expresión en aislados procedentes de pacientes con NAVM bacteriémica, seguido por los que proceden de pacientes con NAVM sin bacteriemia y, finalmente, por los de pacientes colonizados. Del mismo modo, en pacientes con NAVM, la expresión de ompA se relaciona con la mortalidad. Esta diferencia se aprecia especialmente en pacientes con NAVM sin bacteriemia, no existiendo diferencias en el grupo de pacienes con NAVM bacteriémica, en el que todos tienen una expresión de ompA elevada. La producción de biofilm y la motilidad en superficie no se relacionan con el comportamiento clínico. 134 6.4. OBJETIVO 4. Estudiar la asociación entre la presencia de mecanismos de resistencia a imipenem (baja expresión de porinas y presencia de carbapenemasas) y los factores de virulencia en la colección de cepas caracterizadas a partir del objetivo primero. 6.4.1. Mecanismos de resistencia a carbapenemas. 6.4.1.1. Estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. El estudio de sensibilidad a los antimicrobianos seleccionados detectó un perfil general de aislados extremadamente resistentes (XDR), siendo la práctica totalidad de ellos resistente a carbapenemas. Todos conservan, no obstante, la sensibilidad a tigeciclina y colistina; destacando una CMI90 de colistina muy baja. Estos resultados son concordantes con la epidemiología nacional revelada por un estudio multicéntrico en el que estudiaron 446 aislados clínicos de A. baumannii procedentes de 43 hospitales españoles (75). Nuestro hospital contribuyó al mismo con 94 aislados, que se recolectaron entre febrero y marzo de 2010, coincidiendo con el inicio de este estudio. De ellos, el 98% presentaba resistencia a imipenem y hubo un aislado resistente a colistina. En la colección completa, 83% de los aislados fue resistente a carbapenemas, con una CMI90 de meropenem superior a 64 mg/l, mientras que el 97% fue sensible a colistina, siendo su CMI50 ≤0,5 mg/l y su CMI90=1 mg/l. También los resultados de actividad de otros antimicrobianos están próximos a los nuestros, con una proporción de aislados resistentes a sulbactam del 65%, a amikacina del 49%, a ciprofloxacino del 94% y a rifampicina del 23,9%. La principal diferencia la constituye tigeciclina, con un 23,9% de aislados resistentes, utilizando los mismos criterios de punto de corte (≤1 mg/l, sensible) que el presente estudio. Considerando los criterios de resistencia propuestos por Magiorakos et al. (299), el 94% de los aislados presentó multirresistencia, de ellos el 12% correspondió a aislados estrictamente MDR, el 86% fueron aislados XDR y el 2% correspondió a aislados panresistentes (PDR). Este corte de prevalencia contrasta con los resultados de un estudio similar realizado en el año 2000 (76), en el que 52,5% y 46,7% de los aislados fue sensible a imipenem y meropenem, respectivamente. En este caso no se testó la actividad de colistina sino la de polimixina B, con un 100% de aislados sensibles. Las diferencias encontradas entre ambas colecciones de aislados es muy reveladora del claro incremento en la resistencia a algunos antimicrobianos, 135 especialmente carbapenemas, con las dificultades para seleccionar un tratamiento empírico en las infecciones nosocomiales que ello conlleva. Nuestros resultados revelan una epidemiología local de avanzada resistencia a carbapenemas. Dentro del ámbito internacional, aunque la tendencia general se dirige hacia un escenario similar, con cada vez más cepas de A. baumannii resistentes a carbapenemas, la mayoría de estudios de prevalencia muestran un porcentaje de sensibilidad superior al nuestro (300)(301). De una colección de 4.686 aislados clínicos de Acinetobacter spp. procedentes de 157 hospitales de América, Europa y Asia entre 2006 y 2009, el 99,2% fue sensible a colistina y el 55,7%, a imipenem (301). No obstante, existen numerosas descripciones de brotes de A. baumannii resistente a carbapenemas, que se ha convertido en endémico en centros de todo el mundo (302)(303)(304)(305). De la misma forma, aunque mucho menos numerosos, se han descrito brotes de cepas resistentes a colistina (303)(306). Uno de ellos, producido por cepas PDR, tuvo lugar en nuestro hospital en el año 2008, pero fue erradicado en un corto periodo de tiempo mediante un programa de intervención multifacético, sin que ello evitara la persistencia de una endemia de A. baumannii sensible a colistina (95). El consumo de antimicrobianos destaca como un factor de riesgo clave en la aparición de A. baumannii MDR (68)(240)(48)(49). En nuestra cohorte de pacientes, una amplia mayoría había recibido antibioterapia de amplio espectro, con un uso de carbapenemas elevado. Este perfil de prescripción, en un entorno con elevada presión de colonización por A. baumannii, favorece la selección y diseminación de clonas con mecanismos de resistencia a carbapenemas. 6.4.1.2. Caracterización de carbapenemasas. 6.4.1.2.1. Presencia de carbapenemasas y relación con la CMI de imipenem. Distribución clonal. En la colección de aislados de A. baumannii estudiada, el mecanismo de resistencia a carbapenemas mayoritario fue blaOXA58. Se encontró blaOXA-40 en una proporción inferior de casos y la secuencia ISAbaI –blaOXA51 en el 8,7% de los aislados, siempre asociada a otra carbapenemasa. No se detectó ningún aislado con blaOXA-23 o MBL. La cepa sensible a imipenem y meropenem no presentaba mecanismos de resistencia a carbapenemas. Las oxacilinasas OXA-58 y OXA-40 son los mecanismos de resistencia a carbapenemas que predominan en nuestro entorno, como han puesto de manifiesto algunos estudios realizados con aislados clínicos de A. baumannii procedentes de 136 hospitales españoles en la última década (138)(225). En cambio, las comunicaciones sobre aislados clínicos de A. baumannii portadores de blaOXA-23 en España son escasas y recientes, y solo una de ellas corresponde a un brote con más de un caso (139)(140)(307). No se han comunicado brotes por cepas portadoras de esta carbapenemasa en España. Esta epidemiología difiere de la de otros países europeos, como es el caso de Italia, donde OXA-23 está ampliamente diseminada y constituye el mecanismo de resistencia a carbapenemas más frecuente entre los aislados clínicos de A. baumannii, seguida de OXA-58 (308). En ninguno de nuestros aislados se detectó la presencia concomitante de blaOXA-40 y blaOXA-58. Hasta donde sabemos, no se ha comunicado ningún caso en el que coexistan ambas carbapenemasas adquiridas en la misma cepa de A. baumannii. En cambio, blaOXA-23 sí puede coexistir con ella, como se ha demostrado al caracterizar algunos brotes de A. baumannii resistente a carbapenemas (309). A nivel global, las MBL no son un mecanismo de resistencia tan importante como las oxacilinasas para A. baumannii. Como comentábamos previamente, se han comunicado casos de aislados portadores de IMP, VIM, SIM y NDM en todos los continentes, pero hasta la fecha no se ha descrito en ninguno procedente de hospitales españoles. Por tanto, la epidemiología encontrada es similar a la esperable según los datos de que disponemos. Existió tendencia a la agrupación clonal de los genes codificadores de carbapenemasas, especialmente en el clon 7 (todos los aislados eran portadores de blaOXA-40 y el 63% de ISAbaI –blaOXA-51) y en los clones 2 y 4 (todos, salvo dos, eran portadores del gen de blaOXA58). Esta ausencia de concordancia entre clonalidad y mecanismos de resistencia es similar a la detectada en estudios previos . En otros, en cambio, existe una elevada concordancia entre la relación clonal determinada por PFGE y las oxacilinasas que portan los aislados de A. baumannii (269). La ausencia de concordancia observada en nuestra colección de aislados estaría explicada por la transferencia de mecanismos de resistencia entre distintas cepas, probablemente a través de plásmidos, ya que es el mecanismo principal de transmisión de genes de carbapenemasas (134). Una técnica de tipado de elementos móviles podría aclarar la secuencia temporo-espacial de transmisión de los mismos (270). Aunque todos los aislados productores de carbapenemasas eran resistentes a carbapenemas, la CMI50 de imipenem fue dos diluciones superior en los aislados portadores de blaOXA-40 que en los portadores de blaOXA-58, a igualdad de 137 expresión de blaOXA-51. Asimismo, aquellas con la secuencia ISAba1-blaOXA-51 aumentaban en una dilución su CMI50 en una dilución respecto a aislados con la misma carbapenemasa (blaOXA-40 o blaOXA-58) y sin expresión de blaOXA-51. Estos resultados son similares a lo previamente descrito (138)(134). Algunos autores han comunicado, incluso, aislados de A. baumannii que a pesar de ser portadores de blaOXA-58 eran sensibles a imipenem (310). Héritier et al.(128) realizaron un estudio exhaustivo de los cambios en la sensibilidad a carbapenemas con cepas knock-out y experimentos de transformación usando plásmidos, tanto naturales como recombinantes, que contenían blaOXA-23, blaOXA-40 o blaOXA-58. Estos experimentos mostraron que las carbapenemasas adquiridas contribuían significativamente al fenotipo de resistencia, produciendo OXA-40 y OXA-23 mayor impacto sobre la resistencia a carbapenemas que OXA-58. La disparidad de la CMI de imipenem en aislados con el mismo patrón de carbapenemasas podría estar explicada por la presencia de elementos reguladores cuya presencia o actividad desconocemos al no haber sido determinados en nuestro estudio. En el estudio de Héritier et al.(128) mencionado previamente, los autores observaron que las oxacilinasas expresadas a partir de plásmidos naturales aumentaban la resistencia a carbapenemas en mayor medida que las expresadas a partir de plásmidos recombinantes. Ello refuerza la teoría de que los elementos reguladores próximos a los genes de oxacilinasas tienen gran importancia como potenciadores de su expresión y del nivel de resistencia a carbapenemas. Las secuencias de inserción son los elementos reguladores de oxacilinasas más frecuentemente reportados en A. baumannii. Para blaOXA-58, se describieron inicialmente ISAba1, ISAba2, ISAba3 e IS18 como secuencias de inserción promotoras (311)(137). Más recientemente, varios autores han mostrado también el papel regulador sobre blaOXA-58 de ISAba825 (312)(131). De manera análoga, la regulación de blaOXA-23 se ha asociado con las secuencias de inserción promotoras ISAba1 e ISAba4 (313). En cambio, blaOXA-40 no se relacionado con secuencias de inserción. Merino et al.(314) secuenciaron varios plásmidos procedentes de aislados de A. baumannii en los que se encontró el gen blaOXA-40, flanqueado en todos los casos por el sistema XerC/XerD, cuya función no está relacionada con la promoción de la expresión sino con la recombinación y movilización de fragmentos de ADN. En el caso de blaOXA-51, es imprescindible la presencia de un elemento que potencie su expresión para que confiera resistencia a carbapenemas. Además de ISAba1, otras secuencias de inserción (como ISAba825 e ISAba9) también pueden participar en su 144 comorbilidad previa (índice de Charlson) y las complicaciones graves durante el ingreso (shock séptico o fracaso renal agudo). En pacientes con NAVM por A. baumannii, la bacteriemia concomitante por A. baumannii se añade como factor de riesgo de mortalidad a la comorbilidad previa (índice de Charlson) y las complicaciones durante el ingreso (fracaso renal agudo). 6. Los pacientes con NAVM bacteriémica por A. baumannii presentan una supervivencia menor que aquellos con NAVM no bacteriémica, que persiste tras ajustar por otros factores (HR 4,67). El tratamiento apropiado con colistina es un factor asociado a buen pronóstico (HR 0,02). La elevada tasa de tratamiento apropiado explicaría que la mortalidad de los pacientes con NAVM por A. baumannii de nuestra cohorte sea inferior a la de otras series y similar a la de pacientes colonizados. 7. La NAVM por A. baumannii prolonga la estancia en UCI de los pacientes respecto a la colonización respiratoria (OR 1,88). En cambio, los pacientes con NAVM no tienen mayor tiempo de ventilación mecánica ni una estancia hospitalaria superior. 8. Los aislados de A. baumannii se agruparon en 3 clones por REP-PCR y en 7 clones por PFGE. La distribución es desigual, perteneciendo la mayoría de aislados a los pulsotipos nombrados como 4 y 2 (56% y 24,5%, respectivamente). Los aislados pertenecientes a ambos clones aparecen de manera regular durante todo el periodo de estudio, mientras que el resto son esporádicos o se agrupan en forma de brotes. 9. La mayoría de los aislados estudiados eran productores de biofilm en algún grado, pero sólo el 13,5% de ellos presentaba un fenotipo hiperproductor. El grado de formación de biofilm se relaciona con la clonalidad, agrupándose la mayoría de aislados hiperproductores en dos clones. El 89% de los aislados de A. baumannii estudiados presentaba motilidad en superficie, no existiendo distribución clonal de la misma. No se detectó producción de hemolisinas ni diferencias en la capacidad de captación de hierro en los aislados estudiados. 10. La expresión de OmpA de los aislados se relaciona con un comportamiento clínico con gravedad diferente; los aislados procedentes de pacientes con NAVM bacteriémica presentan el nivel de expresión de OmpA más elevado, seguido de los pacientes con NAVM no bacteriémica y, finalmente, de los colonizados. 145 11. La expresión de OmpA de A. baumannii es un factor predictor de mortalidad en los pacientes con NAVM por este microorganismo. Esta relación se observa, especialmente, en pacientes con NAVM no bacteriémica, mientras que se pierde en los que tuvieron NAVM y bacteriemia por A. baumannii. El resto de factores de virulencia estudiados (producción de biofilm y motilidad) no presentan relación con la mortalidad de los pacientes. 12. Los aislados de A. baumannii estudiados presentaban un fenotipo general MDR o XDR. Solo uno de ellos fue sensible a carbapenemas y todos fueron sensibles a tigeciclina y colistina, teniendo una CMI90 de colistina muy baja (0,12 mg/l). Ello justifica la elevada eficacia clínica de la colistina empleada en la mayoría de los pacientes con NAVM, a pesar de haberse utilizado dosis inferiores a las actualmente recomendadas. 13. Todos los aislados resistentes a carbapenemas eran portadores de una oxacilinasa adquirida. En nuestro medio, la oxacilinasa más prevalente es blaOXA-58, seguida de blaOXA-40, no estando presentes ni blaOXA-23 ni ninguna MBL. En una proporción menor, y siempre acompañada por otra carbapenemasa, existen algunos aislados de A. baumannii en los que la sobreexpresión de blaOXA-51 debido a la presencia en su promotor de la secuencia ISAba1 contribuye a incrementar la resistencia a carbapenemas. OXA-40 confiere mayor nivel de resistencia que OXA-58. Aunque algunos aislados presentan ausencia de la porina CarO en su membrana externa, ello no contribuye a incrementar la resistencia a carbapenemas, como se ha observado en estudios anteriores. 146 VIII. REFERENCIAS. 147 1. Allen DM, Hartman BJ. Acinetobacter Species. En: Mandell, GL, Bennett JE, Dolin R editores. Principles and Practice of Infectious Diseases. Philadelphia: Churchill Livingstone; 2000, p 2339-2344. 2. http://www.bacterio.net/acinetobacter.html. Consultado: 24 septiembre 2015. 3. Starakis I, Blikas A, Siagris D, Marangos M, Karatza C and Bassaris H. Prosthetic valve endocarditis caused by Acinetobacter lwoffi: a case report and review. Cardiol Rev 2006; 14: 45-9. 4. Crawford PM, Jr., Conway MD and Peyman GA. Trauma-induced Acinetobacter lwoffi endophthalmitis with multi-organism recurrence: strategies with intravitreal treatment. Eye (Lond) 1997; 11 (6): 863-4. 5. 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